KR20190039978A - 단백질 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; (b) 아르기닌과 커플링된 양이온 교환 (CEX) 수지 상에 혼합물을 로딩하는 단계; 및 (c) 수지로부터 관심 단백질을 용리시켜, 그에 의해 CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 8월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/374,337의 이익을 주장하며, 그의 내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.
모노클로날 항체 (mAb) 및 그의 유도체 생성물 (예를 들어, Fc-융합 단백질)은 이들 유형의 생물제제의 안전성, 효능 및 고품질로 인해 가장 도전이 되는 인간 질환 중 일부를 치료하는데 있어서 중요한 역할을 한다 [1]. 모노클로날 항체 시장은 유의하게 빠르게 성장하고 있고, 모노클로날 항체 생성물의 합산 전세계 판매는 2020년까지 대략 $125십억에 이를 것으로 추정된다 [2]. 따라서, 강건한 상업적 크로마토그래피 정제 방법의 개발은 환자에게 매우 중요하다 [3]. 정제 방법은 전형적으로, 포획에 이은 1 또는 2회의 연마 단계를 위해 단백질 A 크로마토그래피를 사용한다 [4]. 염기성 등전점 (pI)을 보유하는 그러한 mAb 및 Fc-융합 단백질의 경우에, 양이온-교환 크로마토그래피 (CEX)는 주로, 상대적으로 단순한 칼럼 거동, 생성물-관련 불순물 (예를 들어, HMW)의 효율적 제거, 및 일반적으로 정전기적 상호작용의 단백질 구조에 대한 미미한 영향으로 인해, 연마 단계를 위한 바람직한 옵션으로 전통적으로 간주되어 왔다 [5, 6]. 그에 비해, 단백질은 종종 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 매질의 표면 상에의 흡착 시 부분적 언폴딩을 겪는다 [7-9].
최근 수년간, 오히려 CEX에서 비통상적인 단백질 결합 및 용리 거동을 보고한 사례의 수가 증가하고 있다. 예를 들어, 문헌 [Voitl et al.] [10, 11]은 프락토겔 EMD SE 하이캡 상에서의 인간 혈청 알부민의 선형 염 구배 동안 2-피크 용리 프로파일을 보고하였다. 2개의 용리 피크에서 어떠한 HMW 증가도 관찰되지 않았기 때문에, 단백질이 완전한 용리를 위해 상이한 염 농도를 필요로 하는 2개의 상이한 입체형태로 수지에 결합되어 있는 것으로 가설화되었다. 문헌 [Gillespie et al.] [12]은 선형 염 구배를 사용한 여러 CEX 수지에서의 불안정한 비-글리코실화된 IgG1에 대한 2-피크 용리 프로파일, 및 후기 용리물 피크가 초기 용리물 피크보다 더 많은 응집체를 함유하였음을 보고하였다. 수소-중수소 교환 및 푸리에 변환 적외선 분광분석법 (FTIR) 결과는 제2 피크가 수지-유도된 항체 변성에 의해 유래되었고, 이는 우선적으로 배제된 용질, 예컨대 아르기닌의 사용에 의해 완화될 수 있다는 것을 나타내었다 [13-15]. 연구는 CEX 작업과 관련된 많은 인자를 평가하였지만, 응집 메카니즘은 상세하게 논의되지 않았다. 문헌 [Guo and Carta] [16-18]은 글리코실화된 IgG2에 대한 2-피크 CEX 용리 거동을 보고하였다. 이러한 효과는 중합체-관능화된 수지 프락토겔 EMD SO3 -의 경우 현저하였지만, 그라프팅된 중합체가 없는 거대다공성 수지 (예를 들어 우노스피어 래피드 S(UNOsphere Rapid S))의 경우 실질적으로 부재하였고, 이는 촉수형 중합체를 통한 단백질 확산이 단백질 구조를 탈안정화하고 응집체 형성을 유발한다는 가설로 이어졌다. 2-피크 용리 거동은 결합된 단백질이 연장된 기간 동안 유지되는 경우에만 관찰된다는 것에 주목하였다. 문헌 [Luo et al.] [19]은 IgG2의 염 용리 시의 2-피크 용리 거동을 보고하였다. 작업은 IgG2가 높은 염 및 높은 단백질 농도에서 가역적 자기-회합 (RSA)을 형성할 수 있고, RSA 종은 단량체보다 수지에 더 강하게 결합하여 피크 분할에 기여할 수 있다는 것을 시사하였다. 또 다른 연구에서, 문헌 [Luo et al.] [20]은 IgG4의 경우의 분할 피크 현상을 보고하였고, 이를 히스티딘-양성자화-기반 전하 변이체의 분리와 연결시켰다.
생물학적 치료제의 다양화된 칼럼 거동은 궁극적으로 그의 복잡한 분자 특성에 기인할 수 있다. 예를 들어, mAb 및 Fc-융합 단백질은 유사한 결정화가능 단편 (Fc) 영역을 공유하지만, 그의 용액 특성은 고도로 가변성인 상보성 결정 영역 (CDR) 및 Fc 영역의 글리코실화로 인해 유의하게 상이할 수 있다 [21]. 일부 mAb는 낮은 pH (pH 2-4) 및 높은 염 농도에서 변성 및 응집되기 쉬운 것으로 보고되어 있다 [22]. 문헌 [Buchner et al.] [23]은 이뮤노글로불린이 낮은 pH (<3) 하에 "A-상태"를 형성할 수 있고, 이는 높은 염에서 증가된 소수성 및 천천히 응집되는 추세를 갖는 높은 정도의 2차 구조를 특징으로 한다고 보고하였다. 문헌 [Latypov et al.] [24, 25]은 인간 IgG1 및 IgG2에 대해, Fc 영역에 위치하는 CH2 도메인의 안정성에 의해 주로 결정되는 산-유도된 언폴딩 및 응집에 대한 광범위한 연구를 수행하였다. 용액 조건에 따라, 단백질 예컨대 mAb는 부분적으로 언폴딩될 수 있고, 그의 천연 구조를 유지하면서 서로 비가역 응집체 또는 가역 클러스터를 형성할 수 있다 [26, 27]. 가역적 또는 비가역적 mAb 회합은 종종, 특히 높은 단백질 농도에서의 mAb 표면 상의 불균질 전하 분포에 주로 기인하는 단백질-단백질 인력에 의해 구동되는 반면에 [28-30], 전해질의 존재 하에서의 이량체 IgG1 mAb 마이크로구조의 형성에 대한 최근 보고는 또한 중요한 비-정전기적 기여, 예컨대 소수성 상호작용을 시사한다 [26]. Fc-융합 단백질은 분자간 및 분자내 도메인 안정성의 결여로 인해 완전 mAb와 비교하여 입체형태적 변화를 겪을 가능성이 심지어 더 크다. 문헌 [Fast et al.] [31]은 40℃에서 pH를 7.5에서 6.0으로 낮출 경우의 Fc-융합 단백질, 아바타셉트 (오렌시아(Orencia))의 신속한 응집을 보고하였다. 입체형태적 변화 및 응집체 형성은 언폴딩되어 응집되기 쉬운 용융된 구상체-유사 구조를 형성하는 CDR (CTLA-4) 및 CH2 도메인의 불안정성에 기인한다.
또한, 단백질이 CEX 칼럼에서 노출되는 용액 조건은 이동상 및 고정상 사이의 복잡한 이온 평형으로 인해 결정하기 어려울 수 있다. 그 결과, 복잡한 칼럼 현상을 이해하는데 있어서 단백질 용액 특성의 영향이 크로마토그래피 공정의 영향과 뒤얽히는 상황이 발생할 수 있다. 예를 들어, 완충제 염 이온 및 H+/OH- 이온 사이의 경쟁적 평형으로 인해 염 용리 동안 CEX에서 예상하지 못한 pH 강하가 발생할 수 있는 것으로 보고되었다 [32-34]. 높은 염 완충제가 용리 단계에 도입될 경우, 이동상의 양이온은 고정상에서 H+ 이온을 대체한다. 이들 방출된 H+ 이온은 이어서 이동상 내로 진입하고, 용리액의 일시적 pH 감소를 유발한다. 높은 염 및 낮은 pH의 국부 환경이, 용리 시 높은 세공내 단백질 농도에 더하여, 단백질 변성 및 응집을 유발할 수 있는 이러한 일시적 조건에서 불안정한 단백질에 대해서는 추가의 주의가 필요할 것이다.
따라서, 단백질 정제 공정 동안 응집 형성을 감소시키는데 사용될 수 있는 개선된 단백질 정제 방법에 대한 필요가 관련 기술분야에 존재한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; (b) 아르기닌과 커플링된 양이온 교환 (CEX) 수지 상에 혼합물을 로딩하는 단계; 및 (c) 수지로부터 관심 단백질을 용리시켜, 그에 의해 CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 혼합물은 정화된 벌크 또는 세포 배양물 상청액 (예를 들어, 포유동물, 박테리아 또는 진균 세포 배양물로부터의 상청액)을 포함한다. 구체적 예에서, 혼합물은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물로부터의 상청액이다. 예시를 위해, 오염물은 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 대사물, 숙주 세포 구성 단백질, 핵산, 내독소, 바이러스, 생성물 관련 오염물, 지질, 배지 첨가제 및 배지 유도체로부터 선택된다. 예시를 위해, 관심 단백질은 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 및 키메라 항체로부터 선택된 모노클로날 항체), 항체 단편, 및 Fc 융합체로부터 선택된다.
특정 측면에서, 본 발명의 CEX 수지의 기본 매트릭스 물질은 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 폴리(메타크릴레이트), 아크릴 중합체, 및 폴리(스티렌-디비닐-벤젠)으로부터 선택된다. CEX 수지는 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸 및 오르토포스페이트로부터 선택된 양이온 교환 리간드 관능기를 사용하여 제조된다. 구체적 실시양태에서, 아르기닌과 커플링된 CEX 수지는 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 수지 (예를 들어, 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 아가로스 수지)이다.
특정 측면에서, CEX 크로마토그래피 단계 전에, 혼합물은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 친화성 크로마토그래피에 의해 제조된다. 임의로, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 친화성 크로마토그래피이다. 특정 측면에서, 본 발명의 방법은 추가로 하나 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스, 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 아르기닌과 커플링된 양이온 교환 (CEX) 수지를 제공한다. 예를 들어, CEX 수지의 기본-매트릭스 물질은 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 폴리(메타크릴레이트), 아크릴 중합체, 및 폴리(스티렌-디비닐-벤젠)으로부터 선택된다. 예를 들어, CEX 수지는 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸 및 오르토포스페이트로부터 선택된 양이온 교환 리간드 관능기를 사용하여 제조된다. 구체적 실시양태에서, 아르기닌과 커플링된 CEX 수지는 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 수지 예컨대 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 아가로스 수지이다.
도 1a는 염-단계 용리를 사용한 SP SFF의 크로마토그램을 보여준다. CEX 칼럼에 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하고, 50 mM Na아세테이트, pH 5.0으로 세척하고, 각각 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 6.3 (a) 또는 50 mM Na아세테이트, pH 8.3 (b)으로 용리시켰다.
도 1b는 pH-단계 용리를 사용한 SP SFF의 크로마토그램을 보여준다. CEX 칼럼에 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하고, 50 mM Na아세테이트, pH 5.0으로 세척하고, 각각 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 6.3 (a) 또는 50 mM Na아세테이트, pH 8.3 (b)으로 용리시켰다.
도 2는 염-단계 및 pH-단계 용리액 (SP SFF 상), 로드 물질 (50 mM Na아세테이트, pH 4.5 완충제 중), 및 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 4.5 완충제 중 대조군 용액 샘플의 SEC 프로파일을 보여준다.
도 3은 응집 및 해리 공정의 제안된 메카니즘을 보여준다.
도 4는 SP SFF의 경우의 용리액 응집체 수준에 대한 칼럼 로딩 효과를 보여준다. pH-단계 용리 당시 (t=0 d) 및 4℃에서의 5일 인큐베이션 후에 (t=5 d) SEC 시험을 수행하였다.
도 5는 천연 단일-쇄 및 유리 단일-쇄의 SAP 스코어를 보여준다. 적색 및 청색은 각각 소수성 및 친수성 표면적을 나타낸다.
도 6a는 pH-단계 용리액의 응집체 수준의 시간-의존성을 보여준다. 모든 칼럼을 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하였다.
도 6b는 상이한 수지의 경우의 응집 가역성의 시간-의존성을 보여준다. 모든 칼럼을 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하였다.
도 7은 Arg-SP 혼합 모드 아가로스 비드의 개략적 도면을 보여준다.
도 8은 상이한 수지에 의한 pH-단계 용리액의 응집체 수준을 보여준다. CEX 칼럼에 pH 4.5에서 10g/L 수지로 로딩하고, 50 mM Na아세테이트, pH 8.3 완충제로 용리시켰다.
도 9는 상이한 시점에서의 SP SFF 용리 풀 (pH 4.5에서 30 g/L 수지 로딩)의 SEC를 보여준다. 용리 시 4℃에서 0, 2, 4, 6, 8, 24 및 120시간 인큐베이션 후에 pH-단계 용리액을 검정하였다. 로드 물질의 응집체 수준은 1.5%였다.
도 10은 표면 상의 정전기 전위를 계산함으로써 수행된 상이한 pH에서의 전하 모델링을 보여주며; 표면 상의 음성 패치는 pH 증가에 의해 증가한다.
도 11은 각각의 잔기에서 pH 4에서의 값과 비교하여 계산된 단백질 전하 전위 변화를 보여준다.
도 12는 상이한 pH 조건에서의 SP SFF, CM SFF, 및 결합된 단백질에 대한 DSF 결과를 보여준다.
도 13은 SP SFF에 결합된 경우 CEX 로드 pH, 용리액 응집체 수준, 단백질 알짜 전하, 및 단백질 용융 온도 (Tm) 사이의 상관관계를 보여준다.
도 14는 수지 소수성을 보여주는 시프로 오렌지(Sypro Orange) 염료 실험을 보여준다. 수지를 25mM Na아세테이트, pH 5 중에서 시프로 오렌지 염료와 인큐베이션하였다. 모든 샘플을 롤러 혼합기 상에 180 rpm에서 5분 동안 뒤집어 둔 다음, 중력 침강시킨 후 사진을 찍었다. 실험 조건은 표 4를 참조한다.
도 1b는 pH-단계 용리를 사용한 SP SFF의 크로마토그램을 보여준다. CEX 칼럼에 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하고, 50 mM Na아세테이트, pH 5.0으로 세척하고, 각각 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 6.3 (a) 또는 50 mM Na아세테이트, pH 8.3 (b)으로 용리시켰다.
도 2는 염-단계 및 pH-단계 용리액 (SP SFF 상), 로드 물질 (50 mM Na아세테이트, pH 4.5 완충제 중), 및 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 4.5 완충제 중 대조군 용액 샘플의 SEC 프로파일을 보여준다.
도 3은 응집 및 해리 공정의 제안된 메카니즘을 보여준다.
도 4는 SP SFF의 경우의 용리액 응집체 수준에 대한 칼럼 로딩 효과를 보여준다. pH-단계 용리 당시 (t=0 d) 및 4℃에서의 5일 인큐베이션 후에 (t=5 d) SEC 시험을 수행하였다.
도 5는 천연 단일-쇄 및 유리 단일-쇄의 SAP 스코어를 보여준다. 적색 및 청색은 각각 소수성 및 친수성 표면적을 나타낸다.
도 6a는 pH-단계 용리액의 응집체 수준의 시간-의존성을 보여준다. 모든 칼럼을 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하였다.
도 6b는 상이한 수지의 경우의 응집 가역성의 시간-의존성을 보여준다. 모든 칼럼을 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하였다.
도 7은 Arg-SP 혼합 모드 아가로스 비드의 개략적 도면을 보여준다.
도 8은 상이한 수지에 의한 pH-단계 용리액의 응집체 수준을 보여준다. CEX 칼럼에 pH 4.5에서 10g/L 수지로 로딩하고, 50 mM Na아세테이트, pH 8.3 완충제로 용리시켰다.
도 9는 상이한 시점에서의 SP SFF 용리 풀 (pH 4.5에서 30 g/L 수지 로딩)의 SEC를 보여준다. 용리 시 4℃에서 0, 2, 4, 6, 8, 24 및 120시간 인큐베이션 후에 pH-단계 용리액을 검정하였다. 로드 물질의 응집체 수준은 1.5%였다.
도 10은 표면 상의 정전기 전위를 계산함으로써 수행된 상이한 pH에서의 전하 모델링을 보여주며; 표면 상의 음성 패치는 pH 증가에 의해 증가한다.
도 11은 각각의 잔기에서 pH 4에서의 값과 비교하여 계산된 단백질 전하 전위 변화를 보여준다.
도 12는 상이한 pH 조건에서의 SP SFF, CM SFF, 및 결합된 단백질에 대한 DSF 결과를 보여준다.
도 13은 SP SFF에 결합된 경우 CEX 로드 pH, 용리액 응집체 수준, 단백질 알짜 전하, 및 단백질 용융 온도 (Tm) 사이의 상관관계를 보여준다.
도 14는 수지 소수성을 보여주는 시프로 오렌지(Sypro Orange) 염료 실험을 보여준다. 수지를 25mM Na아세테이트, pH 5 중에서 시프로 오렌지 염료와 인큐베이션하였다. 모든 샘플을 롤러 혼합기 상에 180 rpm에서 5분 동안 뒤집어 둔 다음, 중력 침강시킨 후 사진을 찍었다. 실험 조건은 표 4를 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; (b) 아르기닌과 커플링된 양이온 교환 (CEX) 수지 상에 혼합물을 로딩하는 단계; 및 (c) 수지로부터 관심 단백질을 용리시켜, 그에 의해 CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 아르기닌과 커플링된 CEX 수지는 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 수지, 예컨대 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 아가로스 수지이다. 예를 들어, 혼합물은 정화된 벌크 또는 세포 배양물 상청액을 포함한다. 예시를 위해, 관심 단백질은 항체, 항체 단편, 및 Fc 융합체로부터 선택된다. 임의로, CEX 크로마토그래피 단계 전에, 혼합물은 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피)에 의해 제조된다. 임의로, 본 발명의 방법은 추가로 하나 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스, 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 아르기닌과 커플링된 양이온 교환 (CEX) 수지를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 아르기닌과 커플링된 CEX 수지는 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 수지, 예컨대 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 아가로스 수지이다.
정의
본원에 사용된 용어 "정제하는" 및 "분리하는"은 상호교환가능하게 사용되고, 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 함유하는 혼합물로부터의 오염물의 제거를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "관심 단백질"은 그의 가장 넓은 의미로 정제를 목적으로 하는, 혼합물 중에 존재하는 임의의 단백질 (천연 또는 재조합)을 포함하는 것으로 사용된다. 이러한 관심 단백질은, 비제한적으로, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 이뮤노글로불린 (예를 들어, 항체), 및 이뮤노글로불린-유사 도메인-함유 분자 (예를 들어, 안키린 또는 피브로넥틴 도메인-함유 분자), 및 Fc-융합 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "Fc-융합 단백질"은 이뮤노글로불린-유래 모이어티 (즉, Fc 모이어티) 및 제2, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터 유래된 모이어티를 포함하는 치료 단백질을 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "혼합물"은 관심 단백질 (정제를 목적으로 하는 것) 및 1종 이상의 오염물, 즉 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 관심 단백질을 (자연적으로 또는 재조합적으로) 발현하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 생산된다. 이러한 혼합물은 예를 들어 세포 배양물, 세포 용해물, 및 정화된 벌크 (예를 들어, 정화된 세포 배양물 상청액)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "오염물"은 그의 가장 넓은 의미로 혼합물 내의 임의의 바람직하지 않은 성분 또는 화합물을 포괄하는 것으로 사용된다. 세포 배양물, 세포 용해물 또는 정화된 벌크 (예를 들어, 세포 배양물 상청액)에서, 오염물은 예를 들어 세포 배양 배지에 존재하는 숙주 세포 핵산 (예를 들어, DNA) 및 숙주 세포 단백질, 관심 단백질 관련 단백질 또는 유래 단백질 (예를 들어, 단백질분해 단편) 및 다른 생성물 관련 오염물 (예를 들어, 관심 단백질의 말단절단된 버전 및 응집된 버전)을 포함한다. 숙주 세포 오염물 단백질은, 비제한적으로, 숙주 세포에 의해 자연적으로 또는 재조합적으로 생산되는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "세척"은 양이온 교환 수지를 통해 또는 그 상에 적절한 완충제를 통과시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "용리"는 완충제가 이온 교환 물질 상의 하전된 부위에 대해 분자와 경쟁하도록 양이온 교환 수지 주위의 완충제의 pH 및/또는 이온 강도를 변경시킴으로써, 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 양이온 교환 수지로부터 제거하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "세포 배양물"은 관심 단백질을 생산하는 액체 배지 중의 세포를 지칭한다. 세포는 예를 들어 박테리아, 진균, 포유동물 또는 식물을 포함한 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 적합한 액체 배지는 예를 들어 영양 배지 및 비-영양 배지를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "정화된 벌크"는 미립자 물질 (예를 들어, 세포)이 실질적으로 제거된 혼합물을 지칭한다. 정화된 벌크는 세포 또는 세포 파편이 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 실질적으로 제거된 세포 배양물 상청액, 또는 세포 용해물을 포함한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 이뮤노어드헤신, 항체-이뮤노어드헤신 키메라, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 단일-쇄 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 하이브리드 항체, 돌연변이된 항체, 그라프팅된 항체, 또는 시험관내 생성된 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 공지된 항체의 임의의 유형을 포괄하는 것으로 사용된다. 항체는 전장 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 임의의 공지된 항체 이소형, 예를 들어, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM으로부터 선택될 수 있다. 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 (예를 들어, 삼량체 또는 오량체)일 수 있다.
"항체 단편"은 전장 항체의 적어도 일부 및 전형적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일-쇄 항체 분자; 디아바디; 선형 항체; 및 조작된 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "모노클로날 항체"는 통상적인 의미로 집단을 구성하는 개별 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하도록 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는 것으로 사용된다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 이는 항원의 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 다양한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적이며, 반면에 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 항체를 기재하는데 있어서 용어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 것으로서의 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 생산될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 모노클로날 항체는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]; 및 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; 5,427,908 5,580,717; 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 및 6,593,081에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에 기재된 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 및 "인간화" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
본원에 기재된 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 인간 환자의 혈액을 포함한 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있거나 또는 트랜스제닉 동물을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있는 "인간" 항체를 포함한다. 이러한 트랜스제닉 동물의 예는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 갖는 KM-마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.), 뉴저지주 프린스턴) (WO 02/43478 참조), 제노마우스(Xenomouse)® (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.), 캘리포니아주 프리몬트; 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재됨) 및 HuMAb-마우스® (메다렉스, 인크.; 예를 들어, 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851], 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; 5,545,807; 및 PCT 공개 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962, WO 01/14424 (Korman et al.)에 기재됨)를 포함한다. 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "크로마토그래피"는 공정의 특정한 완충 조건 하에, 용질의 특성, 예컨대 pI, 소수성, 크기 및 구조로 인해 용질을 보다 더 또는 보다 덜 강하게 흡착하거나 보유하는 흡착제를 통한 혼합물의 퍼콜레이션에 의해, 혼합물 중 관심 용질, 예를 들어 관심 단백질을 혼합물 중 다른 용질로부터 분리하는 공정을 지칭한다.
용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 관심 이온화가능한 용질 (예를 들어, 혼합물 중 관심 단백질)이 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물보다 하전된 화합물과 더 또는 덜 비-특이적으로 상호작용하도록, pH 및 전도성의 적절한 조건 하에, 관심 용질이 고체 상 이온 교환 물질에 (예를 들어, 공유 부착에 의해) 연결된 반대로 하전된 리간드와 상호작용하는 크로마토그래피 공정을 지칭한다. 혼합물 중 오염 용질은 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 세척될 수 있거나, 또는 관심 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 수지에 결합하거나 수지로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피"는 구체적으로 양이온 교환 (CEX), 음이온 교환, 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.
"양이온 교환 수지" 또는 "CEX 수지"는 음으로 하전되고, 고체 상 위로 또는 고체 상을 통해 통과하는 수용액 중 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체 상을 지칭한다. 양이온 교환 수지를 형성하는데 적합한 고체 상에 부착된 임의의 음으로 하전된 리간드, 예를 들어 카르복실레이트, 술포네이트가 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 양이온 교환 수지는, 예를 들어 술포네이트계 기 (예를 들어, 모노S, 미니S, 소스 15S 및 30S, SP 세파로스 패스트 플로우(SP Sepharose Fast Flow)™, SP 세파로스 하이 퍼포먼스 (지이 헬스케어(GE Healthcare)), 토요펄 SP-650S 및 SP-650M (도소(Tosoh)), 마크로-프렙 하이 S (바이오라드(BioRad)), 세라믹 하이퍼D S, 트리스아크릴 M 및 LS SP 및 스페로덱스 LS SP (폴 테크놀로지스(Pall Technologies))); 술포에틸계 기 (예를 들어, 프락토겔 SE (EMD), 포로스 S-10 및 S-20 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))); 술포프로필계 기 (예를 들어, TSK 겔 SP 5PW 및 SP-5PW-HR (도소), 포로스 HS-20, HS 50 (써모 사이언티픽)); 술포이소부틸계 기 (예를 들어, 프락토겔 EMD SO3 - (EMD)); 술포에틸계 기 (예를 들어, SE52, SE53 및 익스프레스-이온 S (와트만(Whatman))), 카르복시메틸계 기 (예를 들어, CM 세파로스 패스트 플로우 (지이 헬스케어), 히드로셀 CM (바이오크롬 랩스 인크.(Biochrom Labs Inc.)), 마크로-프렙 CM (바이오라드), 세라믹 하이퍼D CM, 트리스아크릴 M CM, 트리스아크릴 LS CM (폴 테크놀로지스), 매트렉스 셀루파인 C500 및 C200 (EMD-밀리포어(Millipore)), CM52, CM32, CM23 및 익스프레스-이온 C (와트만), 토요펄 CM-650S, CM-650M 및 CM-650C (도소)); 술폰산 및 카르복실산계 기 (예를 들어, 베이커본드(BAKERBOND) 카르복시-술폰 (제이.티. 베이커(J.T. Baker))); 카르복실산계 기 (예를 들어, WP CBX (제이.티 베이커), 다우엑스 MAC-3 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈(Dow Liquid Separations)), 앰버라이트 약 양이온 교환체, 다우엑스 약 양이온 교환체, 및 디아이온 약 양이온 교환체 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 프락토겔 EMD COO- (EMD)); 술폰산계 기 (예를 들어, 히드로셀 SP (바이오크롬 랩스 인크.), 다우엑스 미세 메쉬 강산 양이온 수지 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈), 우노스피어 S, WP 술포닉 (제이.티. 베이커), 사르토빈드 S 막 (사르토리우스(Sartorius)), 앰버라이트 강 양이온 교환체, 다우엑스 강 양이온 및 디아이온 강 양이온 교환체 (시그마-알드리치)); 및 오르토포스페이트계 기 (예를 들어, P11 (와트만))를 갖는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
관심 단백질을 함유하는 혼합물
본 발명의 방법은 단백질(들)을 함유하는 임의의 혼합물로부터 1종 이상의 관심 단백질(들)을 정제하기 위해 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 혼합물은 정제하고자 하는 단백질을 발현하는 살아있는 세포로부터 수득되거나 또는 그에 의해 생산된다 (예를 들어, 자연적으로 또는 유전자 조작에 의해). 단백질을 생산하도록 세포를 유전자 조작하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)] 및 미국 특허 번호 5,534,615 및 4,816,567을 참조하고, 각각은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다. 이러한 방법은 단백질을 코딩하고 그의 발현을 가능하게 하는 핵산을 살아 있는 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 이들 숙주 세포는 배양물에서 성장된 박테리아 세포, 진균 세포, 또는, 바람직하게는, 동물 세포일 수 있다. 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 이. 콜라이 균주의 예는 HB101, DH5α, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, 및 외래 DNA를 절단하는데 실패한 임의의 이. 콜라이 균주를 포함한다. 사용될 수 있는 진균 숙주 세포는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 동물 세포주의 몇몇 예는 CHO, VERO, DXB11, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, NS0 및 WI138이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 형질전환, 바이러스 감염 및/또는 선택에 의해) 새로운 동물 세포주를 확립할 수 있다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질 (예를 들어, 항체)은 CHO 세포에서 생산된다 (예를 들어, WO 94/11026 참조). 다양한 유형의 CHO 세포, 예를 들어, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB11, CHO/dhfr- 및 CHO-S가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
혼합물의 제조는 초기에 단백질의 발현 방식에 의존한다. 일부 세포 시스템은 단백질 (예를 들어, 항체)을 세포로부터 주위 성장 배지로 직접 분비하는 한편, 다른 시스템은 항체를 세포내 보유한다. 세포내 생산된 단백질의 경우에, 세포는 임의의 다양한 방법, 예컨대 기계적 전단, 삼투 쇼크, 및 효소 처리를 사용하여 파괴될 수 있다. 파괴는 세포의 전체 내용물을 균질물로 방출하고, 또한 세포하 단편을 생산하며, 이는 원심분리에 의해 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 더 적은 정도이기는 하지만, 직접 분비되는 단백질의 경우에도 세포의 자연 사멸 및 단백질 생산 실행 과정 동안 세포내 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 유사한 문제가 발생한다.
한 실시양태에서, 세포 또는 세포 파편을 혼합물로부터 제거하여 예를 들어 정화된 벌크를 제조한다. 본 발명의 방법은 세포 또는 세포 파편을 제거하기 위해 원심분리, 접선 흐름 여과 또는 심층 여과를 포함한 임의의 적합한 방법론을 사용할 수 있다.
단백질 정제
본 발명의 방법은 혼합물로부터 관심 단백질 (예를 들어, 항체 또는 Fc 융합 단백질)을 CEX 정제하기 위한 개선된 기술을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 (a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; (b) 아르기닌과 커플링된 CEX 수지 상에 혼합물을 로딩하는 단계; 및 (c) 수지로부터 관심 단백질을 용리시켜, 그에 의해 CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 아르기닌과 커플링된 CEX 수지는 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 아가로스 수지이다. 그러나, 통상의 기술자는 상기 언급된 방법의 단계 전에, 후에 또는 그 사이에 추가의 정제가 수행될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 아르기닌과 커플링된 CEX 수지의 사용은, 아르기닌과 커플링되지 않은 CEX 수지의 사용과 비교하여, 관심 단백질의 응집 형성을 감소시킨다.
양이온 교환 수지에의 관심 단백질 (예를 들어, 항체)의 결합은 정제될 단백질의 가장 산성 이소형의 pI 미만의 임의의 pH에서 수행될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 관심 단백질은 약 pH 4 내지 약 pH 8 (예를 들어, 약 pH 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 및 8)에서 수지에 결합된다. 하나의 예시된 실시양태에서, 관심 단백질은 약 pH 6.2에서 수지에 결합된다. 또 다른 예시된 실시양태에서, 관심 단백질은 약 pH 4.5에서 수지에 결합된다.
관심 단백질이 양이온 교환 수지에 결합되면, 오염물 (예를 들어, HCP)은 수지를 완충제로 세척하는 것에 의해 제거된다. 수지를 세척하기 위한 최적 pH는 정제된 단백질의 순도 및 수율을 모니터링함으로써 각각의 관심 단백질에 대해 실험적으로 결정될 수 있다. 세척 완충제는 오염물, 예를 들어, DNA 및 내독소 오염물을 추가로 제거하기 위해 세제 또는 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트)로 강화될 수 있다.
양이온 교환 수지를 세척한 후에, 완충제를 사용하여 관심 단백질을 용리시킨다. 일반적으로, 용리는 용리 완충제의 pH를 증가시키는 것에 의해 또는 용리 완충제의 이온 강도를 결합 완충제에 비해 증가시키는 것에 의해, 예를 들어, 용리 완충제에 염 (예를 들어, 염화나트륨)을 첨가하는 것에 의해 용이해진다. 또한, 단백질 응집 및 보다 고분자량의 종의 형성을 감소시키기 위해 폴리에테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 용리 완충제에 첨가할 수 있다.
아르기닌과 커플링된 CEX 수지의 제조
특정 실시양태에서, 본 발명은 아르기닌과 커플링된 CEX 수지를 제공한다. CEX 수지와 아르기닌의 커플링은 아민-반응성 화학, 예를 들어, 비제한적으로, NHS 에스테르, 이미도에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 히드록시메틸 포스핀 등을 통해 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
하기 작업 실시예에 예시된 바와 같이, SP 아가로스 수지는 3-아미노-1-프로판술폰산의 1급 아민 기를 NHS-활성화된 아가로스 비드와 커플링시키는 것에 의해 제조될 수 있다. Arg-SP 아가로스 수지는 NHS-활성화된 아가로스 비드에 L-아르기닌 및 3-아미노-1-프로판술폰산을 순차적으로 커플링시키는 것에 의해 제조될 수 있다. NHS-활성화된 아가로스 슬러리를 먼저 DI수로 완전히 세척하여 아세톤 저장 용액을 제거한 후, 0.2 μm 필터 페이퍼가 구비된 필터 플라스크를 사용하여 0.1 M 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.2의 커플링 완충제로 세척한다. SP 아가로스 수지를 제조하기 위해, 이어서 아가로스 비드를 300 mM 3-아미노-1-프로판술폰산과 1:2의 부피 비로 실온에서 2시간 동안 혼합할 수 있다. Arg-SP 아가로스 수지를 제조하기 위해, 아가로스 비드를 먼저 300 mM L-아르기닌과 5분 동안 혼합하고, 커플링 완충제로 세척한 다음, 300 mM 3-아미노-1-프로판술폰산과 또 다른 2시간 동안 실온에서 혼합한다. 커플링 반응의 대략 80%는 처음 0.5시간 내에 일어난다. 리간드-고정된 아가로스 비드를 커플링 완충제로 광범위하게 세척한 후, 1 M 에탄올아민, pH 7.4 용액을 첨가하여, 미반응 NHS 관능기를 캡핑한다. 최종적으로, 관능화된 아가로스 비드를 칼럼 패킹을 위해 커플링 완충제로 다시 세척한다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고 문헌, 특허, 및 공개 특허 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 명백하게 포함된다.
실시예 1
구조적으로 불안정한 Fc-융합 단백질의 양이온 교환 크로마토그래피에서의 응집체 형성 및 해리를 이해하는데 있어서의 통찰
물질 및 방법
1. 화학물질, 수지 및 단백질
모든 화학물질은 달리 나타내지 않는 한 제이.티. 베이커 (미국 뉴저지주 필립스버그)에서 입수하였다. 3-아미노-1-프로판술폰산 (3APS) 및 에탄올아민은 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)에서 구입하였다. SP 세파로스 패스트 플로우 (SP SFF) 및 CM 세파로스 패스트 플로우 (CM SFF) 수지는 지이 헬스케어 사이언시스(GE Healthcare Sciences) (스웨덴 웁살라)에서 입수하였다. 포로스 XS 수지 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)-활성화된 아가로스 슬러리는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) (미국 매사추세츠주 월섬)에서 구입하였다. 우노스피어 래피드 S 및 겔 여과 표준물은 바이오-라드 (펜실베니아주 필라델피아)에서 구입하였다. 이러한 작업에 사용된 Fc-융합 단백질은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되었고, 브리스톨-마이어스 스큅 캄파니(Bristol-Myers Squibb, Co.)에서 생산되었다. 이러한 Fc-융합 단백질의 전체 분자량은 78 kDa이다. 실험 pI (등전점)는 7.2로, 제타 전위 측정에 의해 결정되었다. 앞서 언급된 바와 같이, 힌지 영역 및 이러한 Fc-융합 단백질의 2개의 단일 쇄 사이 어느 곳에서도 디술피드 결합은 존재하지 않는다. 본 연구에 사용된 단백질 로드 물질은 단백질 A 정제된 풀을 표적 용액 조건으로 완충제 교환함으로써 수득하였다.
2. 크로마토그래피 기기 및 방법
모든 크로마토그래피 실행은 유니콘 소프트웨어 버전 6.3이 설치된 지이 헬스케어 악타 아반트 시스템 (미국 뉴욕주 피스카타웨이)을 사용하여 수행하였다. SP SFF, CM SFF 및 포로스 XS 수지를 지이 헬스케어 (미국 뉴욕주 피스카타웨이)에서 구입한 C10/10 칼럼 (1.0 cm I.D x 10 cm 베드 높이) 내에 패킹하였다. 패킹되고 조건화된 칼럼을 5 칼럼 부피 (CV)의 50 mM Na아세테이트, pH 4.0-5.5로 평형화한 후, 6-분 체류 시간 (달리 나타내지 않는 한)을 사용하여 상응하는 pH에서 단백질 로딩하였다. 이어서 칼럼을 3 CV의 50 mM Na아세테이트, pH 5.0으로 세척하였다. 결합된 Fc-융합 단백질을 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 6.3 또는 50 mM Na아세테이트, pH 8.3으로 용리시켰고, 최대 생성물 회수를 달성하기 위해 피크의 각각의 측에서 흡광도 0.15 OD 사이의 분획으로 용리액을 수집하였다. 용리 pH 조건 (pH 6.3, 8.3)은 통상적인 아세테이트 완충 용량을 벗어난다는 것에 주목한다. 이는 완충제 매트릭스 (예를 들어, MES 또는 포스페이트)를 바꾸거나 추가의 이온 유형을 도입하는 것 없이 용액 조성을 단순화하기 위해 여기서 주로 선택되었다. 이러한 작업의 주요 초점은 CEX 단계와 연관된 응집 현상의 기계적 이해를 획득하는 것이며, 따라서 단량체 정제를 달성하기 위해 정교한 피크-절단 전략은 사용되지 않았다. 각각의 실행 후 3 CV의 2 M NaCl을 사용하여 칼럼을 재생시키고, 3 CV의 1 M NaOH로 소독하고, 마지막으로 0.1 M NaOH 중에서 저장하였다. 단백질 농도는 써모 피셔 사이언티픽 (미국 델라웨어주 윌밍톤)으로부터 구입한 나노드롭 2000을 사용하여 측정하였다. 모든 실행은 실온에서 수행하였다.
3. 응집체 분석을 위한 SEC 방법
분석 SEC를, 워터스 코포레이션(Waters Corporation) (미국 매사추세츠주 밀포드)으로부터의 워터스 HPLC 시스템 상에 설치된 도소 바이오사이언스 (미국 펜실베니아주 킹 오브 프러시아)로부터의 TSK겔 G3000SWXL 칼럼을 사용하여 수행하였다. 방법은 100 mM 인산나트륨, 100 mM 황산나트륨, pH 6.8을 1 mL/분의 유량으로 사용하였고, 총 주입 단백질 질량은 100 μg으로 일정하였다. 용리되는 단백질을 UV 280 nm에 의해 모니터링하였다.
4. 시프로 오렌지 염료 실험
SP SFF, CM SFF 및 포로스 XS 수지를 25 mM Na아세테이트, pH 5.0 완충제로 완충제 교환하고, 50% (v/v) 중력-침강 슬러리로 조정하였다. 염료-함유 샘플을 위해, 400 μL 수지 슬러리를 98.5 μL의 25 mM Na아세테이트, pH 5.0 완충제 및 인비트로젠(Invitrogen) (영국 스코틀랜드 페이즐리)에서 구입한 1.5 μL의 시프로 오렌지 염료 (5000X)와 혼합하였다. 비-표지 대조군 샘플을 위해, 400 μL 수지 슬러리를 100 μL의 25 mM Na아세테이트, pH 5.0 완충제와 혼합하였다. 모든 샘플을 롤러 혼합기 상에 180 rpm에서 5분 동안 뒤집어 둔 다음, 중력 침강시킨 후 사진을 찍었다.
5. 시차 주사 형광측정 (DSF) 연구
수지, SP SFF 및 CM SFF를 상응하는 완충제 (50 mM Na아세테이트, pH 4.0-5.5)로 완충제 교환하고, 50% (v/v) 중력-침강 슬러리로 조정하였다. 실험은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (영국 체셔 워링턴)로부터의 7500 실시간 PCR (RT-PCR) 시스템 (소프트웨어 버전 1.4.1)을 사용하여 수행하였다. 간략하게, 수지 (최종 10% v/v), 단백질 (최종 1 g/L), 시프로 오렌지 염료 (최종 15X), 및 상응하는 pH의 완충제를 미리-계산된 비로 혼합하고, 고속 광학 96 웰 반응 플레이트 (어플라이드 바이오시스템즈)에 20 μL/웰의 최종 부피로 첨가하였고, 각각의 조건은 이중으로 준비하였다. 어플라이드 바이오시스템즈에서 구입한 광학 접착 필름으로 밀봉한 후, 플레이트를 RT-PCR에서 직접 분석하였다. 가열 사이클은 2분 동안 4℃ 사전-냉각 단계 및 30초 동안 각각 0.5℃ 경사로 4℃에서 53℃로의 99 단계 후속 구배로 구성되었다. 시프로 오렌지 염료를 검출하기 위해 보정 설정 (λex 490 nm; λem 580 nm)을 사용하여 데이터를 수집하고, 형광 데이터를 변형된 클라크 및 퍼시트 방정식 [35]에 피팅하여 분석하였다.
여기서 I(T)는 형광 강도이고; T는 각각의 형광 데이터 포인트의 실제 온도이고; Tm은 용융 온도이고; αF 및 βF는 각각 폴딩된 상태에 대한 절편 및 기준선의 기울기이고; αA 및 βA는 각각 고온에서의 형광 켄칭 단계의 절편 및 기울기이고; m은 겉보기 용융 온도에서의 전이의 기울기와 연관된 지수 인자이다. αF, βF αA, βA , m 및 Tm의 값은 최소 제곱 방법을 사용하여 DSF 데이터를 피팅시켜 수득하였다.
6. 사내 수지 제조
SP 아가로스 수지는 3-아미노-1-프로판술폰산의 1급 아민 기를 NHS-활성화된 아가로스 비드와 커플링시켜 제조하였다. Arg-SP 아가로스 수지는 L-아르기닌 및 3-아미노-1-프로판술폰산을 NHS-활성화된 아가로스 비드에 순차적으로 커플링시켜 제조하였다. NHS-활성화된 아가로스 슬러리를 먼저 DI수로 완전히 세척하여 아세톤 저장 용액을 제거한 후, 0.2 μm 필터 페이퍼가 구비된 필터 플라스크를 사용하여 0.1 M 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.2의 커플링 완충제로 세척하였다. SP 아가로스 수지를 제조하기 위해, 이어서 아가로스 비드를 300 mM 3-아미노-1-프로판술폰산과 1:2의 부피 비로 실온에서 2시간 동안 혼합하였다. Arg-SP 아가로스 수지를 제조하기 위해, 아가로스 비드를 먼저 300 mM L-아르기닌과 5분 동안 혼합하고, 커플링 완충제로 세척한 다음, 300 mM 3-아미노-1-프로판술폰산과 또 다른 2시간 동안 실온에서 혼합하였다. 커플링 반응의 대략 80%는 판매업체 제공된 프로토콜에 따르면 처음 0.5시간 내에 일어난다. 리간드-고정된 아가로스 비드를 커플링 완충제로 광범위하게 세척한 후, 1 M 에탄올아민, pH 7.4 용액을 첨가하여, 미반응 NHS 관능기를 캡핑하였다. 최종적으로, 관능화된 아가로스 비드를 칼럼 패킹을 위해 커플링 완충제로 다시 세척하였다. 이러한 작업에서 제조된 Arg-SP 아가로스 수지를 5 mm i.d. AP 미니 글라스 칼럼 (워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 대략 5 cm의 베드 높이로 패킹하였다.
7. 모델링 방법론
단백질 3D 구조를 바이오비아 디스커버리 스튜디오(BIOVIA Discovery Studio) 소프트웨어 내의 상동성 모델링을 사용하여 수득하였다 [36]. 단백질 구조에 기초하여, 공간상-응집-성향 (SAP) 모델을 사용하여, 디스커버리 스튜디오 내의 상동성-모델링된 구조를 사용하여 응집-경향 소수성 영역을 결정하였다. 단백질 내 각각의 원자에 대한 SAP 값은 하기와 같이 규정된다 [37].
여기서, 반경 (R) 10 Å 내의 측쇄 원자의 SAA (용매 접근가능 구역)가 산출되고, 여기서 완전히 노출된 잔기의 측쇄의 SAA는 트리펩티드의 완전히 연장된 입체형태에서 중간 잔기의 측쇄의 SAA를 계산함으로써 수득된다. 잔기 소수성은 글리신이 소수성 0을 갖도록 정규화한 소수성 척도로부터 수득된다 [38]. 따라서, 글리신보다 더 소수성인 그러한 아미노산은 소수성 척도에서 양수이고, 글리신보다 덜 소수성인 것은 음수이다. 잔기에 대한 SAP는 모든 그의 구성 원자의 SAP를 평균하여 수득하였다. 단백질 표면의 전체 소수성을 제공하는 단백질 SAP 스코어는 양수 SAP 스코어를 갖는 모든 잔기에 대한 SAP 값을 합하여 수득하였다.
상이한 pH 조건에서의 단백질 전하를 디스커버리 스튜디오 소프트웨어의 단백질 이온화 프로토콜에 기초하여 계산하였다. 전하는 단백질 구조 내의 적정가능한 아미노산 잔기 중 각각 1개에 대한 pK1 /2 및 적정 곡선을 예측하는 것에 기초하였다. 정전기 전위는 디스커버리 스튜디오 내의 델피 프로그램을 사용하여 계산하였다. 델피 프로그램은 유한-차분 기술을 사용하여 입방 격자에서 포아송-볼츠만 방정식을 푼다. CHARMM 완전 원자 역장 [39]을 이들 전하 및 전위 계산에 사용하였다. 계산된 전위를 갖는 분자 표면을 착색하여 정전기 전위를 시각화하였다. 평균 잔기 전위는 그의 구성 원자에서의 정전기 전위의 값을 평균하여 계산하였다.
결과 및 논의
1. CEX에서의 Fc-융합 단백질의 응집 거동
SP SFF 칼럼 상에서 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 6.3을 사용한 염-단계 용리 동안 다중-피크 용리 프로파일 (도 1a)이 관찰되었다. SEC 분석에 기초한 용리액 응집체 수준 (8.6%)은 로드 물질에 대한 것 (1.5%)보다 훨씬 더 컸고, CEX 단계 동안 유의한 응집체 형성을 나타내었다. 도 1a에서 트레이서는 용리 전반부와 공동으로 일어나는 염 전이 동안의 일시적 pH 강하 (< pH 4.5까지)를 나타내었고, 이는 일시적으로 낮은 pH 및 높은 염 환경을 야기하였다. 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl, pH 5.6의 용리 완충제는 pH 6.3의 아세테이트와 유사한 pH 전이 현상을 나타내었다. 형성되는 응집체의 보다 우수한 정량화를 위해 단백질 회수를 최대화하기 위해 pH 6.3의 아세테이트를 염-단계 용리에 사용하였다. 염-단계 용리 동안 유사한 pH 전이 현상이 다른 연구에서 보고되었다 [32-34]. 낮은 pH 및 높은 염은 용액-중 단백질 안정성 연구에 기초하여 응집 및 침전을 유발한다는 것이 발견되었다. 용리 분별증류를 사용한 별개의 연구 (제시되지 않음)는 또한, 이전의 보고와 유사하게, 후기 용리물 피크가 더 높은 응집체 수준을 함유한다는 것을 확인시켜주었다 [12]. 반대로, 50 mM Na아세테이트, pH 8.3을 사용한 pH-단계 용리는 단일-피크 용리 및 완만한 pH 전이를 발생시켰다 (도 1b). 그럼에도 불구하고, 주요 응집체 형성이 또한 용리액에서 관찰되었다 (6.1%). 단일-피크 용리 프로파일은 pH-단계 용리 동안 형성된 단량체 및 응집체가 유사한 용리 특성을 갖는다는 것을 나타낸다. 별개의 연구에서 평가된 단백질 용액-중 안정성 (실온에서 24시간)에 기초하면 (데이터는 제시되지 않음), 단백질은 pH 4.0-8.0의 낮은 염 농도의 용액에서 안정하였고, 검사된 조건에서 어떠한 응집체 생성도 관찰되지 않았다. 이러한 연구는 pH-단계 용리 연구에서 관찰된 응집 현상의 근본 원인으로서 단백질 용액 특성을 배제하는 충분한 증거를 제공하였다.
2가지 상이한 용리 조건 동안 형성되는 응집체 종을 더 잘 이해하기 위해, 염-단계 및 pH-단계 용리 풀의 SEC 프로파일을 로드 물질 (50 mM Na아세테이트 중, pH 4.5) 및 50 mM Na아세테이트, 250 mM NaCl을 사용하여 pH 4.5에서 제조된 단백질 용액의 것과 비교하였다. 단백질 용액 샘플의 완충 조건은 용리 시 칼럼 내부의 완충제 전이 영역에서의 것을 모방하도록 선택하였다 (도 1a). 피크 최대에서의 단백질 농도 및 용액 조건이 칼럼에서 용리가 진행됨에 따라 달라지고 완충제 전이 영역에서 단백질 질량은 총 용리된 단백질의 단지 한 분획임을 고려하면, 용리 샘플과 실제로 대등한 용액 샘플에 대한 조건을 확인하는 것은 사실상 불가능하다. 따라서, 단백질 용액 샘플은 실제 CEX 용리 동안 겪은 조건의 반-정량적 비교만을 제공할 수 있다. 도 2에 제시된 바와 같이, SEC 프로파일에서 2개의 개별 피크가 관찰되었다. 이들 2개의 피크의 체류 시간을 바이오-라드의 겔 여과 표준물의 크로마토그램과 비교한 것은 HMW1 및 HMW2가 각각 이량체 및 올리고머 종에 대략적으로 상응한다는 것을 시사한다. 올리고머 종은 용액 샘플 중 현저하였고, SEC 분석 전 CEX 단계의 지속기간 (도 2)과 대등한 기간 (≤4시간) 동안 유지되었다. 유사한 SEC 프로파일이 염-단계 용리액에서 또한 관찰되었고, 이는 용리 시 일시적으로 낮은 pH 및 높은 염 환경이 또한 단백질 응집을 유발하고 유사한 HMW 종을 생성할 수 있다는 것을 시사한다. 염-단계 용리액에서의 더 낮은 응집체 수준은 아마도, 도 1a에 제시된 바와 같이, 완충제 전이 영역에서의 용리액의 약간 더 낮은 염 농도로 인한 것일 것이다. pH-단계 용리에서 형성되는 응집체의 대부분은 이량체였고, 이는 염-단계 용리 동안 낮은 pH 및 높은 염 조건에서 형성되는 응집체와 상이하다. pH 용리가 단백질에 대해 바람직하지 않은 용액 환경을 생성하지 않기 때문에, 증가된 응집체 수준은 CEX에서의 단백질-수지 상호작용의 결과일 가능성이 가장 높다.
pH-단계 용리를 사용하여 CEX 단계 동안 형성된 응집체의 특성에 대한 단백질-수지 상호작용의 영향을 평가하였고, 이러한 용리 모드는 단백질이 불안정해지는 용액 조건 (예를 들어, 낮은 pH 및 높은 염)을 효과적으로 피할 수 있기 때문이다. 이러한 접근법을 사용하여, 4℃로 유지된 샘플에 대한 주기적 SEC 분석을 통해 CEX 용리액 중 응집체의 안정성을 연구하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, 응집체 피크의 크기는 유지 시간의 증가에 따라 감소하였고, 이는 SP SFF의 경우 CEX 단계 동안 형성된 일부 응집체 종의 가역적 속성을 시사한다. 용리액 응집체 수준은 용리 시 처음 8시간 내에 6.1%에서 4.1%로 감소하였고, 5일 후 2.1%까지 계속해서 감소하였다. 결과는 응집체 해리 동역학이 실질적으로 샘플 유지 시간에 의존하여 용리액 응집체 함량 수준에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, CEX에서의 응집체 형성 및 응집 가역성에 대한 기여 인자의 기계적 이해는 강건하고 고수율의 CEX 정제 공정을 개발하기 위해 특히 중요하다.
2. 제안된 가설
다른 보고된 연구 [16-18]와 상이하게, 응집체 형성은 결합된 단백질에 대해 과도한 유지 시간을 필요로 하지 않았고, 용리액 응집체 수준은 시간-의존적 자기-해리 공정과 연결될 수 있다. 여기서 관찰된 현상은 복잡한 응집 메카니즘을 시사하였고, CEX 동안 형성된 응집체가 아마도 가역적 입체형태적 변화를 보유하는 그러한 분자들 사이의 일시적으로 바람직한 단백질-단백질 상호작용으로 인한 것일 수 있다는 가설을 제기하였다. 주목할 것으로, 응집체 해리는 최대 수일의 시간척도 내에 천연 입체형태가 점차적으로 복구되는 동안 동역학적으로-구동되는 공정인 것으로 보였다.
제안되는 가설의 개략적 표현을 도 3에 제시한다. 가설은 CEX 흡착 및 탈착 동안의 단순한 2-단계 응집 공정 뿐만 아니라 CEX 용리액 중 응집체 해리 공정을 설명한다. 제안되는 응집 메카니즘에 따르면, CEX 용리액 중 응집체 수준 (Air+Ar)은 2종의 기여 인자: 결합된 단백질의 입체형태적 변화 및 탈착 시 이들 부분적으로 언폴딩된 분자 (
)의 농도의 결과이다. 2종의 인자는 CEX 용리액에서 검출된 응집체의 특성 (Air 또는 Ar) 및 품질을 함께 결정한다. 일반적으로, 
의 높은 정도의 입체형태적 변화 및 
의 높은 농도는 이들 언폴딩된 분자가 서로 마주치고 결과적으로 응집체를 형성하여 높은 용리액 응집체 수준을 야기할 높은 확률로 이어질 것이다. 응집체 형성은 주로 구조적 섭동을 갖는 분자의 쌍별 및 보다 높은 차수의 분자간 상호작용에 기인하며, 여기서 단백질 정전기 상보성 및 달라진 소수성은 비-천연 응집을 용이하게 할 수 있다 [40]. 따라서, 모든 부분적으로 언폴딩된 분자가, 특히 
의 낮은 농도에서, 궁극적으로 응집으로 이어지는 그러한 분자 충돌에 수반되지는 않을 것이다. 구조적 변화에 따라, 일부 응집체는 가역적일 수 있고 (Ar), 열역학적 평형에 도달하는데 충분한 시간이 주어지면 궁극적으로 천연 단백질 (N)로 복귀할 수 있다.
3. 기계론적 연구
1) 칼럼 로딩의 효과
SP SFF 용리액에서의 응집체 수준에 대한 칼럼 로딩의 영향을 연구하였다. 모든 용리액 샘플을 용리 당시 및 5일 후 (4℃에서 저장) 다시 SEC에 대해 검정하였다. t=0 d에서의 용리액 응집체 수준은 비교적 광범위한 칼럼 로딩 (1-50 g/L 수지) 내에서 유의하게 달랐다. SP SFF의 동적 결합 능력은 50 g/L 수지 초과였다. 모든 실험이 매우 높은 전체 생성물 회수율을 가졌기 때문에 (≥98%), SEC 결과를 여기서 상이한 로딩 조건에서 직접 비교하였다. 도 4에 제시된 바와 같이, 용리액 응집체 수준은 먼저 증가한 다음 약간 감소하였고, 최대 응집체 수준은 대략 30 g/L 수지에서 달성되었다. 궁극적으로, 모든 용리액 샘플은 5일 후 (t=5 d)에 사실상 동일한 응집체 수준을 나타내었다. 결과는 초기 응집체 수준에 대한 칼럼 로딩의 영향을 시사하는 반면에, SP SFF 용리액 중 비가역적 응집체의 양은 시험된 특정 조건에서 로딩 조건에 본질적으로 비의존적인 것으로 보였다. 칼럼 로딩과 용리액 응집체 수준 (t=0 d) 사이의 비선형 상관관계는 흡착 동안 단백질 입체형태적 변화 (
) 및 탈착 시 
의 농도를 연결시킴으로써 제안되는 메카니즘의 프레임워크를 사용하여 정성적으로 이해할 수 있다. 칼럼 로딩은 탈착 시 
의 농도 및 이들 응집-경향 단백질 분자가 마주쳐서 응집체를 형성할 확률에 영향을 미친다. 낮은 로딩 시 용리액에서 관찰되는 비교적 낮은 응집체 수준은, 응집체 형성 확률에 대한 로딩의 영향을 고려하면, 주로 용리 동안의 낮은 
의 농도에 기인한 것이다. 또한, 도 4에서의 오목한 내림세는 
의 입체형태적 변화의 정도에 대한 칼럼 로딩의 영향을 시사하는 것으로 보이며, 여기서 보다 높은 로딩은 아마도 입체 장애 및 척력 단백질-단백질 상호작용으로 인해 감소된 단백질 입체형태적 변화를 유발할 수 있다. 
의 입체형태적 변화는 통상적으로 단백질 소수성 표면 구역의 노출 [41] 및 단백질 응집을 위한 에너지적으로 유리한 조건 [42]으로 이어진다. 
의 입체형태적 변화의 감소하는 수준 및 
농도의 증가하는 수준은 도 4에서 관찰되는 비선형 패턴을 발생시켰고, 여기서 중간 로딩 수준에서 최대 용리 풀 HMW가 달성되었다.
2) 로드 pH의 효과
용리액 응집체 수준에 대한 로드 pH (4.0에서 5.5)의 효과를 평가하기 위해 SP SFF 상에서 일련의 실험을 수행하였다. 상이한 pH 조건에서의 로드 전도도는 매우 작은 범위 내에서만 달랐다 (2.0-2.5 mS/cm). 표 1은 용리액 응집체 수준이 로드 pH의 증가에 의해 유의하게 감소되었음을 보여주며, 추세는 전체 인력 단백질-수지 상호작용과 일치한다. 단백질의 정전기 전위는 상이한 pH 조건 하의 전하 분포를 예시하기 위해 방법 섹션에 기재한 상동성 모델링 도구를 사용하여 계산하였다. 전하 모델링 (도 10)은, 특히 CDR 및 Fc 영역에서의 단백질 표면이 pH 증가에 따라 보다 음으로 하전된 패치를 나타낸다는 것을 보여준다. 단백질 상의 이들 음성 표면 구역은 수지 상의 음이온성 리간드와 상호작용할 경우 척력 환경을 생성하여 전체적인 결합 강도 및 단백질 입체형태적 변화를 감소시킬 수 있다. 또한, 도 11에서의 전하 전위차는 아미노산 잔기의 전하 전위가 작은 pH 변화 시 현저한 변화를 겪는 위치를 분명하게 보여준다. 창(Chang) 및 렌호프(Lenhoff)는 단백질-수지 상호작용이 대부분 단백질 구조 내의 적은 수의 아미노산 잔기에 의해 결정될 수 있다고 보고하였고 [43], 이는 결합된 단백질의 입체형태적 완전성을 보존하고 결과적으로 용리액 응집체 수준을 감소시키는데 있어서의 로드 pH 조건의 영향을 설명하는데 도움이 될 수 있다. 문헌 [Chaudhri et al.] [44]은 코스-그레인드 컴퓨터 모델을 사용하여 mAb-mAb 회합 성향이 단지 소수의 아미노산만이 상이한 돌연변이체에서 유의하게 상이할 수 있다는 것을 확인시켜주었다. CEX에서 단백질 구조적 안정성에 특히 중요한 특정 아미노산 잔기를 확인하는 것은 단백질 1차 서열에서 생물학적으로 중요하지 않은 변화를 만드는 것을 통해 [46] 응집-저항성 분자를 조작하는데 도움이 될 수 있다 [45]. 분명히, 제조-친화적 생물학적 분자의 합리적 설계는 잠재적인 단백질 입체형태적 변화에 대한 단백질-단백질 및 단백질-수지 상호작용의 영향을 고려하기 위해 추가의 모델링 노력을 필요로 하며, 이는 본 작업의 범주에서 벗어난다.
표 1. 용리액 응집체 수준에 대한 로드 pH의 효과 (pH-단계 용리). SP SFF 칼럼을 상이한 pH 조건에서 30 g/L 수지로 로딩하였다. SEC 분석은 용리 당시에 수행하였다.
직교 실험 도구로서, DSF를 사용하여 추가로 단백질 입체형태적 변화의 존재 및 심각성을 연구하고, CEX 조건을 용리액 응집체 수준과 상관시켰다. DSF 연구는 연구 대상 (예를 들어, 단백질)의 소수성 표면에 결합 시 형광을 활성화할 수 있는 메로시아닌 염료의 구성원인 시프로 오렌지 염료를 사용하여 수행하였다 [47-49]. 상이한 pH에서 CM 및 SP 세파로스와 결합된 단백질에 대한 DSF 결과를 도 12에 제시하였다. 온도를 점차적으로 증가시키는 동안의 제조된 샘플의 형광을 기록한 안정성 곡선을 Eq. 1에 피팅하여 용융 온도 (Tm)를 추정하였다. Tm은 단백질 입체형태적 완전성의 열적 안정성을 설명하기 때문에, 여기서는 이것을 검사된 용액 조건에서의 단백질 입체형태적 안정성에 대한 대용물 지표로서 사용하였다.
표 2에 제시된 바와 같이, 결합된 단백질 및 유리 단백질 둘 다의 피팅된 Tm 값은 pH 감소에 따라 감소하였고, 이는 단백질이 보다 낮은 pH에서 입체형태적으로 덜 안정하게 되었음을 시사한다. 유리 용액에서, 단백질의 Tm 값은 pH 5.5에서 pH 4.5까지 단지 매우 미미한 감소만을 나타내었지만, 단백질이 감소된 구조적 강성을 가질 수 있고/거나 주요 입체형태적 변화를 겪을 수 있는 pH 4에서 이는 유의하게 감소되었다. 결합된 단백질의 경우, 둘 다의 수지에 대한 Tm에서의 유의한 감소는 보다 높은 pH 약 pH 4.5-5.0에서 일어났다. 결과는, 상응하는 조건에서, 결합된 단백질이 더 많은 소수성 구역을 노출하고, 유리 용액에서보다 덜 입체형태적으로 안정하게 된다는 것을 분명하게 보여준다. 또한, SP SFF에 결합된 단백질의 Tm 값은 CM SFF에 대한 것보다 일관되게 더 낮은 것으로 나타났고, 이는 SP SFF에의 결합 시의 단백질의 보다 낮은 구조적 안정성을 시사한다. 둘 다의 수지가 동일한 아가로스 기본 매트릭스 및 유사한 세공 형태를 갖기 때문에 [50], 이러한 관찰된 패턴은 아마도 전체 리간드 특성 (예를 들어, 유형, 밀도, 링커 가요성 등)과 연관될 것이다. 상이한 수지의 CEX 거동을 이하에서 보다 상세하게 논의한다. 전하 모델링과 DSF 결과를 조합하면, 보다 낮은 로드 pH에서의 증가된 결합 강도가 보다 높은 정도의 단백질 입체형태적 변화, 보다 소수성인 표면 노출 및 보다 낮은 단백질 구조적 안정성을 유발하였고, 이는 추가로 CEX에서 보다 많은 응집체 형성으로 이어졌다는 것을 관찰할 수 있다. 도 13에 제시된 바와 같이, 로드 pH는 계산되고 측정된 생물물리학적 특성, 뿐만 아니라 CEX 용리액 응집체 수준과 합리적으로 잘 상관되었다.
표 2. 상이한 pH 조건에서 CEX 수지의 존재 및 부재 하에서의 DSF 결과로부터 피팅된 용융 온도 (Tm)
a 둘 다의 SP SFF 및 CM SFF에 대한 수지 로딩은 10 g/L 수지임
연구된 단백질에 대하여, CEX 단계에서 나타난 입체형태적 불안정성은 2개의 단일 쇄 사이의 디술피드 결합의 결여로 인한 것일 수 있다. 단백질 2차 및 3차 구조가 CEX 수지 표면 상에서 여전히 대부분 보존되어 있더라도 국재화된 입체형태적 변화가 발생할 수 있다는 것이 보고되어 있다 [16]. 여기서는 SAP 모델링을 사용하여 단백질 소수성에 대한 작은 입체형태적 변화의 잠재적 영향을 연구하였다. 이러한 모델은 용매-노출된 단백질 표면 상의 소수성 영역의 정도를 추정한다 [37]. 가정된 단순한 시나리오는 수지 표면 상에의 단백질 흡착 시 2개의 단일 쇄가 작은 옹스트롬 (Å)의 갭에 의해 서로 분리될 수 있다는 것이었다. 갭이 용매 접근성을 허용할 경우, 단백질 표면의 소수성은 변화될 것으로 예상된다. 단일 쇄의 표면 소수성을 천연 단백질 구조에서, 뿐만 아니라 2개의 단일 쇄가 ≥10 Å의 갭에 의해 사실상 분리된 극단적 경우를 모방하기 위해 다른 단일 쇄가 존재하지 않는 조건에서 계산하였다. SAP 모델링에서 둘 다의 경우에, 단일 쇄의 2차 및 3차 구조는 동일하게 유지되었다. 도 5에서, 2개의 시나리오는 노출된 소수성 구역의 분포에서 인지가능한 차이를 보여준다. 2개의 단일 쇄가 완전한 용매 접근성을 허용하는 단지 작은 갭에 의해 개방된 경우에, SAP 스코어는 75에서 93으로 증가하고, 이는 단백질 소수성에서의 24% 증가를 나타낸다. 단백질 구조가 흡착 시 어떻게 변경될 수 있는지에 대한 많은 가능성에도 불구하고, 도 5의 단순한 시나리오는 CEX에서의 응집 메카니즘에 대해 제안된 가설 (도 3), 및 결합된 단백질이 유리 용액 중의 단백질보다 더 소수성인 것으로 보인다는 DSF 실험과 정성적으로 잘 일치한다. SAP 계산은 단지 단백질 소수성에 대한 2개의 단일 쇄 사이의 갭의 영향만을 보여주며 심지어 단백질 2차 및 3차 구조에 영향을 미치는 다른 입체형태적 변화는 고려하지 않았음에 주목한다.
3) 로딩 동안 체류 시간 (RT)의 효과
결합된 단백질에서 입체형태적 변화가 일어나는 시간척도를 연구하기 위해 용리액 응집체 수준에 대한 로딩 RT의 영향을 연구하였다. 로딩 RT (즉, 유량)를 달리하고/거나 단백질을 CEX 칼럼 상에 로딩한 후 정적 유지를 부가함으로써 총 단백질/수지 접촉 시간을 다르게 하였다. 이 연구에서 용리 RT는 일정하게 유지시켰다. 표 3에 제시된 바와 같이, 결합된 단백질/수지 접촉 시간의 12분에서 36분으로의 증가와 상응하게 로딩 RT를 2분에서 6분으로 변화시킨 경우, 용리액 응집체 수준은 4.5%에서 6.1%로 중간 정도로 증가하였다. 보다 긴 로딩 RT는 보다 긴 접촉 시간으로 인해 보다 많은 단백질 입체형태적 변화를 야기할 수 있을 뿐만 아니라, CEX 동안 입자내 물질 전달의 덜 유의한 역할로 인해 용리 시 보다 높은 단백질 농도로 이어질 수 있고, 이들 둘 다는 증가된 용리액 응집체 수준에 기여할 수 있다. 이러한 현상은 단백질-단백질 상호작용, 단백질 입체형태적 안정성, 및 응집률을 단백질 농도의 함수로서 상관시킨 용액 연구와 잘 일치한다 [26]. 주목할 것으로, 용리액 응집체 수준은 6분 로딩 RT 및 추가의 12시간 정적 유지에 의해 17.7%까지 증가하였고, 이는 Fc-융합 단백질에서 심각한 입체형태적 변화를 유발하는데 있어서의 단백질/수지 접촉 시간의 유의한 영향을 보여준다. 이러한 관찰은 또한 다른 곳에서 IgG1 및 IgG2에 대해서도 보고되었다 [12, 18]. 흡착 시 구조적 변화를 겪는 단백질의 동역학적 시간척도는 통상적인 CEX 작업과 사실상 관련된다는 것에 주목한다. 따라서, 로딩 RT는 CEX 단계에서 용리액 응집체 수준을 제어하는 것을 돕는 주요 인자이고, 느린 로딩 및 불필요한 유지는 이러한 작업에서 연구된 것과 같은 구조적으로 불안정한 단백질에 대해서는 가능한 한 피해야 한다. 또한 이는, 심지어 결합된 생성물의 예상외의 칼럼-상 유지에 의해서도 강건한 칼럼 성능을 보장하기 위해 CEX 공정 개발 동안 광범위한 단백질/수지 접촉 시간을 시험하는 것의 중요성을 강조한다. 흥미롭게도, 사실상 관련성이 있는 상이한 용리 RT 조건에서 용리액 응집체 수준에서의 주요 차이가 전혀 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 이는 용리 동안의 응집 동역학이 흡착 시 입체형태적 변화를 겪는 단백질의 동역학보다 훨씬 더 빠르다는 것을 나타낸다.
표 3. pH-단계 용리에서 용리액 응집체 수준에 대한 로딩 동안의 체류 시간의 효과. SP SFF 칼럼을 pH 4.5에서 30 g/L 수지로 로딩하였다. SEC 분석은 용리 당시에 수행하였다.
4) CEX 수지 유형의 효과
단백질 구조적 변화는 거의 항상 필연적으로 단백질 표면 소수성에서의 변화로 이어진다는 것을 고려하여, 수지 특성, 특히 고정상 소수성 및 이온화가능한 리간드 유형의 영향을 평가하기 위해 SP SFF, CM SFF, 및 포로스 XS를 유사한 조건에서 연구하였다. 포로스 XS 및 SP SFF의 지지 매트릭스는 각각 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 및 가교 아가로스이다. CM SFF는 SP SFF와 동일한 기본 매트릭스를 갖지만, 수지가 CO3 - 리간드로 관능화되었다.
도 6a에 제시된 바와 같이, 초기 용리액 응집체 수준은 3개의 수지 사이에서 인지가능하게 달랐고, 감소되는 순서는 포로스 XS (7.2%), SP SFF (6.1%) 및 CM SFF (3.7%)였다. 포로스 XS로부터의 단백질 회수는 단지 89%로, SP SFF (≥98%) 및 CM SPP (≥98%)보다 훨씬 더 낮다는 것에 주목한다. 로딩된 나머지 단백질은 단지 가성 세정 단계 동안 포로스 XS 칼럼으로부터 제거될 수 있고, 이는 사실상 비가역적 결합을 발생시킨 매우 강력한 단백질-수지 상호작용을 시사한다. 수지 특성에서의 차이를 더 잘 이해하기 위해, 시프로 오렌지 염료 용액을 신선한 수지 입자와 표 4에 열거된 조건으로 혼합하였다. 도 14에 제시된 바와 같이, CM SFF 및 SP SFF는 염료 첨가 전 및 후 수지 상에서의 연한 색 변화에 기초하여 매우 미미한 염료 결합을 나타내었고, 이는 아마도, 주로 아가로스 기본 매트릭스의 공지된 친수성 속성으로 인한 것이다. 반대로, 포로스 XS는 수지 색에서의 변화에 의해 시사되는 바와 같이, 유의한 염료 결합을 나타내었다. 이는, 그의 친수성 코팅에도 불구하고, 포로스 XS가 소수성 염료에 결합하는데 여전히 충분히 소수성이라는 것을 분명하게 보여준다. CM SPP 및 SP SFF와 비교하여, 포로스 XS는 단백질과 수지 사이의 2차 소수성 상호작용을 통해, 결합된 단백질과 더 강력하게 상호작용할 수 있고, 이는 또한 보다 높은 백분율의 비가역적 결합 및 포로스 XS 용리액에서의 응집체 형성을 설명한다. 그러나, 상이한 리간드 밀도, 링커 특성, 세공 구조, 및 기본 매트릭스의 소수성의 영향이 상이한 수지에 대한 혼재 변수이기 때문에 관찰된 추세가 특정 인자(들)에 기여한다고 보는 것은 곤란하다는 것에 주목한다.
표 4. 시프로 오렌지 염료 실험의 표지 조건
도 6에서의 또 다른 관찰사항은 연구된 3개의 수지에 대한 응집 가역성의 비교이다. 도 6a에 제시된 바와 같이, CM SFF 및 SP SFF의 경우 용리액 응집체 수준은 2% 미만으로 감소된 반면에, 포로스 XS에 대한 것은 심지어 120시간 후에도 여전히 약 4%였다. 또한, 포로스 XS 용리 동안 형성된 응집체는 도 6b에 제시된 바와 같이 유의하게 더 적은 정도로 (열역학적 측면) 및 훨씬 더 느린 속도로 (동역학적 측면) 단량체로 복귀하였다. CM SFF 및 SP SFF 용리액 중 응집체는 유사한 정도의 가역성을 나타내었고, 이는 아마도 유사한 생물물리학적 특성을 시사한다. 포로스 XS 및 다른 2개의 수지 사이의 응집 가역성에 있어서의 분명한 차이는 포로스 XS 상에서의 훨씬 더 강력한 전체 단백질-수지 상호작용 (단백질/리간드 및 단백질/수지 표면 포함)을 반영하며, 이는 형성되는 응집체 종의 상이한 분자 특성으로 이어진다.
4. 제안된 메카니즘의 실험적 검증
CEX 단계에서 응집체 형성을 감소시키거나 방지하기 위해 다양한 전략을 시험하였다. 어떠한 그라프팅된 중합체도 없는 거대다공성 수지, 예컨대 우노스피어 래피드의 사용은 mAb의 경우 CEX-유도된 생성물 언폴딩 및 응집을 감소시키는데 효과적인 것으로 발견되었다 [17]. 그러나, 이러한 수지는 이러한 작업에서 평가된 조건 하에 응집체 형성을 완화시킬 수 없었다 (데이터는 제시되지 않음). 로딩/세척/용리 용액에 부형제 (예를 들어, 아르기닌, 글리신 및 수크로스)를 첨가하는 것도 또한 비효과적인 것으로 입증되었다. 이들 결과는 다른 초기 연구들과 상이한 응집 메카니즘을 암시한다. 제안된 가설에 따르면, 응집체 형성은 결합된 단백질에서의 입체형태적 변화의 심각성 및 용리 시 응집-경향 단백질의 농도의 결과이다. 따라서, 높은 로드 pH, 짧은 단백질/수지 접촉 시간, 친수성 수지 표면, 및 약한 이온화가능한 리간드와 같은 척도는 응집체 형성을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 노력 중 어떠한 것도 본 연구에서 응집체 형성을 완전히 막을 수는 없었다.
상기 평가된 용이하게 적용가능한 척도에 더하여, 제안된 응집 가설을 검사하고 분자 수준에서의 응집 현상의 기계적 이해를 획득하기 위해 수지 변형을 수행하였다. 수지 표면에 가까이 근접하여 2차 단백질-아르기닌 상호작용을 생성하기 위한 수지 표면에의 아르기닌의 추가적 고정의 존재 및 부재 하에, 비교적 낮은 SP 리간드 밀도에서 맞춤-제작 수지 (SP 및 Arg-SP 리간드로 관능화됨)를 사내 제조하였다. 완전히 관능화된 SP 아가로스 수지에 대한 동적 결합 능력은 30 g/L 수지로, 이는 동일한 조건에서 측정한 경우의 SP SFF (≥50g/L 수지)에 대한 것보다 더 낮았다. 제조된 Arg-SP 아가로스 수지에 대한 동적 결합 능력은 고정된 아르기닌의 약한 효과로 인해 20g/L 수지이다. 용액 중 단백질 안정화제로서 그의 광범위한 용도에도 불구하고, 아르기닌은 영구적 2차 단백질-아르기닌 상호작용에 의해 1차 단백질-수지 인력을 조정하기 위해 수지 표면 상에 고정되지 않았다. 도 7은 Arg-SP 변형된 혼합-모드 아가로스 비드의 개략적 도면을 보여준다.
2개의 맞춤-제작된 것을 포함한 여러 상이한 수지의 비교를 도 8에 제시한다. SP 아가로스 수지로부터의 응집체 형성은 SP SFF와 비교하여 더 적다는 것을 관찰할 수 있다. 다양한 클러스터링 조건에서 확률론적 리간드 분포가 심지어 화학적으로 동일한 리간드에 대해서도 상이한 단백질 흡착 특성으로 이어진다는 최신 분자-규모 조사에 의해 시사된 바와 같이, 이는 주로 맞춤-제작 SP 아가로스 수지에서의 비교적 보다 낮은 리간드 밀도로 인한 것으로 여겨진다 [51]. 보다 낮은 리간드 밀도는 결합된 단백질당 보다 적은 수의 상호작용 리간드를 생성하였고, 응집체 형성을 특정 정도로 감소시키는 것을 도왔다. Arg-SP 아가로스 수지의 경우, 용리액에서 어떠한 인지가능한 응집체 증가도 관찰되지 않았다. 이는 단백질-수지 상호작용에 대한 고정된 아르기닌의 약한 효과로 인한 것일 수 있다. 고정된 아르기닌은 사실상 혼합-전하 리간드 (즉, 음으로 하전된 카르복실 기 및 양으로 하전된 구아니딘 기)로서의 역할을 할 수 있고, 이는 결합된 단백질과 수지 표면 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 방해할 수 있다. 고정된 아르기닌에서 양으로 하전된 구아니딘 기는 보다 약한 결합 강도 및 보다 적은 단백질 입체형태적 변화에 기여할 수 있다. 단백질-수지 상호작용에 대한 아르기닌의 약한 효과는 아르기닌이 수지 표면 상에 고정되어, 여기서 이것이 유리 용질 대신 혼합-모드 리간드로서 기능하는 경우에만 효과적인 것으로 보인다는 것에 주목한다. 아르기닌의 영향에서의 차이는 CEX에서 구조적으로 불안정한 단백질에 대한 응집 문제를 완화시키기 위해 혼합-모드 리간드로서 아르기닌을 사용하는 것의 고유한 장점을 시사할 수 있다. 고정된 아르기닌 상의 구아니딘 기가, 단백질 용액에 아르기닌을 첨가한 경우에 관찰된 것과 유사한 추가의 단백질 안정화 효과를 갖는지 여부는 분명하지 않다 [52]. 이러한 질문에 대한 답은 이러한 작업 범주를 벗어나고, 적절하게 선택된 관능기를 갖는 상이한 분자의 고정화를 수반하는 추가의 연구를 필요로 할 것이다. 고정화 절차는 결합 능력을 개선시키고 HMW 완화 능력을 유지시키기 위해 추가로 최적화되고 있고 (별개의 노력), 본원에서 수득된 결과는 제안된 가설을 지지하는 증거를 제공한다.
결론
본 작업은 CEX 단계에서 구조적으로 불안정한 Fc-융합체의 응집 거동을 조사하였다. 염-단계 용리를 사용한 다중-피크 용리 프로파일은 칼럼내 완충제 전이 동안 단백질 안정성 특성에 의해 유발된 응집체 형성과 연관된 것으로 확인되었다. pH-단계 용리를 사용하는 것에 의해 단일-피크 용리가 달성된 반면에, 결합된 단백질의 입체형태적 변화에 기인한 상이한 메카니즘을 통해 응집이 발생하였다. pH-단계 용리 데이터는 분자가 안정할 용액 조건에서 단백질 입체형태적 안정성 및 응집 성향에 대한 CEX 결합/용리 공정의 영향을 명시적으로 보여준다. 형성된 응집체는 열역학적으로 바람직하지 않을 수 있고 연구된 조건에서 수일 내에 천연 입체형태로 부분적으로 복귀될 수 있다. 비교적 느린 응집체 해리 동역학은 대표적이고 재현가능한 분석 결과를 보장하기 위해 샘플링, 샘플 저장, 및 분석 시험의 적절하고 일관된 실시의 중요성을 강조한다. 응집체 형성은 CEX 칼럼 로딩에 감수성인 것으로 확인되었고, 이는 결합된 단백질에 대한 입체형태적 변화의 심각성 및 용리 시 응집-경향 단백질의 농도에 영향을 미쳤다. 이들 2가지 인자는 칼럼 로딩의 함수로서 용리액 응집체 수준의 비선형 패턴에 함께 기여하였다.
CEX 용리액 중에서의 응집체 형성 및 안정성은 또한 다른 작업 조건 (예를 들어, pH, 유량 등) 뿐만 아니라 수지 특성에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 단백질 결합 강도 및 단백질-수지 접촉 시간을 감소시키기 위한 그러한 작업 척도는, DSF 결과에 의해 확인되는 바와 같이, 결합된 단백질에서의 보다 적은 입체형태적 변화로 인해 보다 낮은 응집체 수준으로 이어질 수 있다. 바람직한 수지 특성은 약한 이온화가능한 리간드 (예를 들어, CM 관능성), 친수성 수지 표면, 및 보다 낮은 리간드 밀도를 포함한다. 사내 제조된 Arg-SP 아가로스 수지를 사용한 연구는 CEX 단계에서 관찰된 응집 거동에 대한 제안된 가설의 실험적 검증을 제공한다. 수지 표면 상에 아르기닌을 고정하는 것은, 심지어 평가된 모든 다른 CEX 수지를 사용하여도 단백질이 구조적 불안정성 및 높은 용리액 응집체 수준을 나타내는 낮은 pH 조건에서, 단백질과 수지 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 효과적으로 최소화하였다. 이러한 작업은 CEX 단계에서 구조적으로 불안정한 Fc-융합 단백질에 대한 응집체 형성의 기계적 이해를 증진시키는데 실마리를 제공할 뿐만 아니라, 본원에서 연구된 것과 같은 특별한 적용을 위해 새로운 수지를 설계하는데 일부 흥미로운 방향을 제공한다. 마지막으로, 용액 중에서 관찰된 단백질 안정성 특성과 크로마토그래피 공정에서의 그의 응집 성향 사이의 불일치는 제조-친화적 생물학적 분자를 설계하는데 있어서, 및 강건한 CEX 연마 공정을 개발하는데 있어서 분자의 하류 가공성 정보 (즉, 이러한 연구)를 획득하는 것의 중요성을 강조한다.
참고문헌:
Claims (21)
- (a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
(b) 아르기닌과 커플링된 양이온 교환 (CEX) 수지 상에 혼합물을 로딩하는 단계; 및
(c) 수지로부터 관심 단백질을 용리시켜,
그에 의해 CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 단계
를 포함하는, CEX 크로마토그래피에서 응집 형성이 감소된 수준으로 관심 단백질을 정제하는 방법. - 제1항에 있어서, 혼합물이 정화된 벌크를 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 정화된 벌크가 세포 배양물 상청액을 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상청액이 포유동물, 박테리아 또는 진균 세포 배양물로부터의 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 상청액이 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물로부터의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 오염물이 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 대사물, 숙주 세포 구성 단백질, 핵산, 내독소, 바이러스, 생성물 관련 오염물, 지질, 배지 첨가제 및 배지 유도체로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 관심 단백질이 항체, 항체 단편, 및 Fc 융합 단백질로부터 선택된 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 관심 단백질이 Fc 융합 단백질인 방법.
- 제7항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
- 제9항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간, 인간화 및 키메라 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, CEX 수지가 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 폴리(메타크릴레이트), 아크릴 중합체, 및 폴리(스티렌-디비닐-벤젠)으로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, CEX 수지가 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸 및 오르토포스페이트로부터 선택된 양이온 교환 리간드를 사용하여 제조된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 아르기닌과 커플링된 CEX 수지가 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 관능화 수지인 방법.
- 제1항에 있어서, 혼합물이 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 친화성 크로마토그래피에 의해 제조된 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피인 방법.
- 제1항에 있어서, 추가로 하나 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스를 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 하나 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스가 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 혼합-모드 크로마토그래피로부터 선택된 것인 방법.
- 아르기닌과 커플링된 양이온 교환 (CEX) 수지.
- 제18항에 있어서, 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 폴리(메타크릴레이트), 아크릴 중합체, 및 폴리(스티렌-디비닐-벤젠)으로부터 선택된 CEX 수지.
- 제18항에 있어서, 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸 및 오르토포스페이트로부터 선택된 양이온 교환 리간드를 사용하여 제조된 CEX 수지.
- 제18항에 있어서, 아르기닌과 커플링된 CEX 수지가 아르기닌-술포프로필 (Arg-SP) 관능화 수지인 CEX 수지.
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