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KR20190011247A - 에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체 - Google Patents

에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체 Download PDF

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KR20190011247A
KR20190011247A KR1020187034832A KR20187034832A KR20190011247A KR 20190011247 A KR20190011247 A KR 20190011247A KR 1020187034832 A KR1020187034832 A KR 1020187034832A KR 20187034832 A KR20187034832 A KR 20187034832A KR 20190011247 A KR20190011247 A KR 20190011247A
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시아먼 유니버시티
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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체), 상기와 같은 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 및 담체 단백질을 포함하는 재조합 단백질, 및 상기와 같은 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 및 재조합 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기와 같은 에피토프 펩타이드에 대한 항체, 상기 항체를 생산하는 세포주, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 더욱 또한, 본 발명은 각각 본 발명의 재조합 단백질 또는 항체를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 치료하거나 경감시키기 위한 백신 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체{POLYPEPTIDES AND ANTIBODIES FOR TREATING HBV INFECTION AND RELATED DISEASES}
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학 분야, 특히 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료와 관련된 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HBV 감염을 치료하기 위한 에피토프 펩타이드 또는 (그의 돌연변이체), 상기 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 및 담체 단백질을 포함하는 재조합 단백질, 및 상기 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 및 상기 재조합 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 에피토프 펩타이드에 대한 항체, 상기 항체를 생산하는 세포주, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각각 상기 재조합 단백질 또는 항체를 포함하는, HBV 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 치료하거나 경감시키기 위한 백신 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
HBV 감염, 특히 만성 HBV 감염은 세계적으로 가장 중요한 공중 위생 문제 중 하나이다(Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2;359(14):1486-1500). 만성 HBV 감염은 일련의 간질환, 예를 들어 만성 B형 간염(CHB), 간경변증(LC) 및 간세포 암종(HCC)을 유발할 수 있다(Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet 2009 Feb 14;373(9663): 582-592). 현재 전 세계에서 약 20억명이 HBV에 감염되고 약 3억5천만명이 만성 HBV에 감염된 것으로 보고되고 있다. 이들 감염자 중, HBV 감염과 관련된 간질환으로 최종적으로 사망할 위험성은 15% 내지 25%에 달하며, 전 세계에서 백만명이 넘는 사람이 매년 이 질병으로 사망한다(Dienstag JL. 상기 참조; 및 Liaw YF et al., 상기 참조).
현재 만성 HBV 감염에 대한 치료제는 주로 인터페론(IFN)과 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 유사체(NA)로 나뉠 수 있다(Dienstag JL., 상기 참조；Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011 May; 8(5): 275-284; 및 Liaw YF et al., 상기 참조). 상기 인터페론은 보통의 인터페론(IFN) 및 Peg-인터페론(Peg-IFN)을 포함하며, 이들은 주로 환자에서 전반적인 면역능력을 증대시킴으로써 HBV를 억제하고 CHB를 치료하는 효과를 성취하고; 상기 유사체는 주로 라미뷰딘(LMV), 아데포비어 디피복실(ADV), 엔테카비어(ETV), 텔비뷰딘(LdT) 및 테노포비어를 포함하며, 이들은 주로 HBV의 폴리머라제 활성을 직접 억제함으로써 상기 HBV 복제를 억제한다. HBV 감염된 사람(예를 들어 CHB 환자)의 경우, 상기 작용제들은 단독으로 또는 함께 이미 생체내에서 바이러스 복제를 유효하게 억제하고 HBV DNA 수준을 크게 감소시켰으며; 특히 52주 이상 동안 상기와 같은 치료 후에, 환자에서 HBV DNA 수준이 검출 한계보다 낮은 반응률(바이러스학적 반응)은 40 내지 80%에 달하였다(Kwon H et al., 상기 참조). 그러나, 상기 작용제 단독 또는 병용 치료는 감염된 사람에게서 HBV 바이러스를 완전하게 제거할 수 없으며, HBsAg의 음성 전환비 또는 HBsAg 혈청 전환의 반응률(환자에서 HBV 바이러스의 완전한 제거를 가리키는 마커)은 일반적으로 5% 미만이다(Kwon H et al., 상기 참조). 따라서, HBV 바이러스를 보다 유효하게 제거할 수 있는, 특히 HBV 감염 환자를 위해 HBsAg를 제거할 수 있는 신규의 치료 방법 및 치료제를 개발할 필요가 시급하다.
당해 분야에서 중요한 연구 방향 중 하나는 면역학적 수단을 근거로 만성 HBV 감염을 치료하기 위한 신규 작용제를 개발하는 것이다. 만성 HBV 감염의 면역요법을 일반적으로는 2 가지 방식으로, 즉 수동 면역요법(항체 등의 형태의 약제에 해당한다) 및 능동 면역요법(백신 등의 형태의 약제에 해당한다)으로 수행한다. 수동 면역요법(일례로서 항체에 의한)은 치료 항체를 HBV 감염 환자에게 투여하고 항체-매개된 바이러스 중화에 의해 HBV 감염으로부터, 어떠한 치료도 받지 않은 간세포를 보호하거나, 또는 생체내에서 항체-매개된 면역 제거에 의해 바이러스 및 감염 간세포를 제거하여 치료 효과를 성취하는 과정을 지칭한다. 현재, B형 간염 백신 또는 HBV 감염의 회복제(rehabilitee)로 면역된 반응자의 혈청/혈장으로부터 획득한 항-HBs 다클론 항체, 즉 고역가 B형 간염 면역글로불린(HBIG)이, HBV의 모자 수직 감염의 차단, 만성 HBV 감염 환자의 간이식후 HBV 재감염으로부터의 예방, 및 HBV에 우발적으로 노출된 사람들의 감염 예방에 널리 적용되어 왔다. 그러나, HBIG의 HBV-감염 환자(예를 들어 CHB 환자)에의 직접 투여에 관한 요법은 그다지 치료 효과가 없으며, HBIG는 다수의 태양에서, 예를 들어 고역가 혈장의 비교적 적은 공급원, 고비용, 불안정한 성질, 및 잠재적인 보안 문제로 제한된다. 능동 면역요법은 치료 백신(단백질 백신, 폴리펩타이드 백신, 핵산 백신 등을 포함한)을 투여하고, HBV에 대한 세포 면역반응(CTL 효과 등) 또는/및 체액 면역반응(항체 등)을 일으키도록 만성 HBV-감염 유기체를 자극하여 HBV를 억제하거나 제거하는 목적을 성취하는 과정을 지칭한다. 현재, 만성 HBV 감염의 치료에 확실히 유효하고 유용한 능동 면역요법을 위한 작용제/백신이 아직 없다.
따라서, HBV 감염 환자를 위해 HBV 감염을 보다 유효하게 치료할 수 있는 신규의 치료법 및 치료제를 개발할 필요가 시급하다.
HBV 바이러스의 다양한 단백질들상에 다수의 B 세포 반응(항체 반응) 에피토프들이 존재하지만, 임의의 에피토프에 대한 항체가 HBV 감염의 치료에 반드시 유용한 것은 아니다. 따라서, HBV 감염의 치료에 유효한 면역요법제/방법 개발의 핵심은 생체내에서 바이러스 및 바이러스에 의해 감염된 세포의 유효한 제거를 유도할 수 있는 표적(에피토프)의 식별 및 상기 표적(에피토프)에 대한 항체의 획득에 있다.
본 발명은 상기와 같은 표적(에피토프)을 식별하고, 따라서 HBV 감염의 치료에 유용한 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체), 상기 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 및 담체 단백질을 포함하는 재조합 단백질, 및 상기 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 및 재조합 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 상기와 같은 에피토프 펩타이드/에피토프에 대한 항체, 상기 항체를 생산하는 세포주, 및 이들의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 각각 본 발명에 따른 재조합 단백질 또는 항체를 포함하는, HBV 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 치료 또는 경감에 유용한 백신 또는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학기술 용어들은 당해 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 더욱이, 본 발명에 사용되는 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험실 작업은 상응하는 분야에서 널리 사용되는 통상적인 작업들이다. 한편, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해서, 관련 용어들의 정의 및 설명을 하기와 같이 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "HBsAg"란 용어는 당해 분야의 숙련가에게 널리 알려진 B형 간염 바이러스(HBV)의 표면 항원 단백질을 지칭한다(예를 들어 NCBI GENBANK 데이터베이스 수납 번호: AAF24729.1을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같이, HBsAg의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 39에 설명된 서열에 의해 개시된다. 예를 들어, "HBsAg의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 39에 설명된 폴리펩타이드의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 돌연변이 또는 변이(비제한적으로, 예를 들어 상이한 유전자형 또는 상이한 유전자 하위유형의 HBsAg의 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다)가 천연으로 발생하거나 또는 HBsAg의 아미노산 서열에 그의 생물학적 성질에 영향을 미치지 않으면서 인공적으로 도입될 수도 있음을 안다. 따라서, 본 발명에서, "HBsAg"란 용어는, 예를 들어 서열번호 39에 설명된 폴리펩타이드를 포함하여 모든 상기와 같은 폴리펩타이드 및 그의 천연 또는 인공 돌연변이체를 포함하고자 한다. 또한, HBsAg의 서열 단편을 개시하는 경우, 상기 단편은 서열번호 39의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 돌연변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "HBsAg의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 39의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기 및 그의 돌연변이체(천연 또는 인공 돌연변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따라, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이란 표현은 상기 서열들에 최적화된 정렬이 가해질 때, 즉 상기 서열들이 최고의 일치율을 획득하도록 정렬될 때 상기 서열들의 같은 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "HBcAg"란 용어는 당해 분야의 숙련가에게 널리 알려진 B형 간염 바이러스(HBV)의 코어 항원 단백질을 지칭한다(예를 들어 NCBI GENBANK 데이터베이스 수납 번호: AAO63517.1을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같이, HBcAg의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 40에 설명된 서열에 의해 개시된다. 예를 들어, "HBcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 40에 설명된 폴리펩타이드의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 돌연변이 또는 변이(비제한적으로, 예를 들어 상이한 유전자형 또는 상이한 유전자 하위유형의 HBcAg의 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다)가 천연으로 발생하거나 또는 HBcAg의 아미노산 서열에 그의 생물학적 성질에 영향을 미치지 않으면서 인공적으로 도입될 수도 있음을 안다. 따라서, 본 발명에서, "HBcAg"란 용어는, 예를 들어 서열번호 40에 설명된 폴리펩타이드를 포함하여 모든 상기와 같은 폴리펩타이드 및 그의 천연 또는 인공 돌연변이체를 포함하고자 한다. 또한, HBcAg의 서열 단편을 개시하는 경우, 상기 단편은 서열번호 40의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 돌연변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "HBcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 40의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기 및 그의 돌연변이체(천연 또는 인공 돌연변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따라, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이란 표현은 상기 서열들에 최적화된 정렬이 가해질 때, 즉 상기 서열들이 최고의 일치율을 획득하도록 정렬될 때 상기 서열들의 같은 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "WHcAg"란 용어는 당해 분야의 숙련가에게 널리 알려진 우드척 간염 바이러스 코어 항원을 지칭한다(예를 들어 NCBI GENBANK 데이터베이스 수납 번호: ADE19018.1을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같이, WHcAg의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 41에 설명된 서열에 의해 개시된다. 예를 들어, "WHcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 41에 설명된 폴리펩타이드의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 돌연변이 또는 변이(비제한적으로, 예를 들어 상이한 유전자형 또는 상이한 유전자 하위유형의 WHcAg의 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다)가 천연으로 발생하거나 또는 WHcAg의 아미노산 서열에 그의 생물학적 성질에 영향을 미치지 않으면서 인공적으로 도입될 수도 있음을 안다. 따라서, 본 발명에서, "WHcAg"란 용어는, 예를 들어 서열번호 41에 설명된 폴리펩타이드를 포함하여 모든 상기와 같은 폴리펩타이드 및 그의 천연 또는 인공 돌연변이체를 포함하고자 한다. 또한, WHcAg의 서열 단편을 개시하는 경우, 상기 단편은 서열번호 41의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 돌연변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "WHcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 41의 79 내지 81 번 위치의 아미노산 잔기 및 그의 돌연변이체(천연 또는 인공 돌연변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따라, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이란 표현은 상기 서열들에 최적화된 정렬이 가해질 때, 즉 상기 서열들이 최고의 일치율을 획득하도록 정렬될 때 상기 서열들의 같은 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "CRM197(교차-반응 물질 197)"이란 용어는 디프테리아 독소(DT)의 무독성 돌연변이체를 지칭하며, 52 번 위치의 아미노산 잔기(Gly에서 Glu로 변화됨)에 의해 야생형 디프테리아 독소와 상이하다(G. Giannini, R.Rappuoli, G. Ratti et al., Nucleic Acids Research. 1984. 12: 4063-4070). 디프테리아 독소는 당해 분야의 숙련가에게 널리 알려져 있으며(예를 들어 문헌[Choe S, Bennett M, Fujii G, et al., Nature. 1992. 357:216-222]을 참조하시오), 그의 아미노산 서열은 예를 들어 GenBank 데이터베이스 수납 번호: AAV70486.1을 참고로 찾을 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, CRM197의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 42에 설명된 서열에 의해 개시된다. 예를 들어, "CRM197의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 42의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 돌연변이 또는 변이(비제한적으로, 예를 들어 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다)가 천연으로 발생하거나 또는 서열번호 42에, CRM197의 생물학적 성질에 영향을 미치지 않으면서 인공적으로 도입될 수도 있음을 안다. 따라서, 본 발명에서, "CRM197"란 용어는, 예를 들어 서열번호 42에 설명된 폴리펩타이드를 포함하여 모든 상기와 같은 폴리펩타이드 및 그의 천연 또는 인공 돌연변이체를 포함하고자 한다. 또한, CRM197의 서열 단편을 개시하는 경우, 상기 단편은 서열번호 42의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 돌연변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "CRM197의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 42의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기 및 그의 돌연변이체(천연 또는 인공)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따라, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이란 표현은 상기 서열들에 최적화된 정렬이 가해질 때, 즉 상기 서열들이 최고의 일치율을 획득하도록 정렬될 때 상기 서열들의 같은 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 일반적으로 두 쌍의 폴리펩타이드 쇄(각각 경(L)쇄 및 중(H)쇄를 갖는다)로 이루어지는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체의 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 및 ε으로 분류될 수 있고, 이들은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 항체의 아이소타입들을 한정한다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역은 약 12 개 이상의 아미노산의 "J" 영역을 통해 불변 영역에 결합하고, 중쇄는 약 3 개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 추가로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL으로 이루어진다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 고전 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 또한 고가변 영역들(상보성 결정 영역(CDR)이라 칭한다)(이들 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 비교적 보존적인 영역들에 의해 사이가 이격되어 있다)로 분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 3 개의 CDR과 4 개의 FR로 이루어진다: N-말단에서부터 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항원 결합 부위를 형성한다. 다양한 영역 또는 도메인에서 아미노산의 분포는 면역학적으로 중요한 단백질들의 카밧 서열의 정의에 따른다(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)), 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883). "항체"란 용어는 항체의 임의의 특정한 생성 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 특히 재조합 항체, 단클론 항체 및 다클론 항체를 포함한다. 항체는 상이한 항체 아이소타입, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "항원 결합 단편"(또한 "항원 결합 부분"으로서 공지됨)이란 용어는 완전-길이 항체의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하며, 상기 완전-길이 항체가 특이적으로 결합하고/하거나, 동일한 항원에 결합하기 위해서 상기 완전-길이 항체와 경쟁하는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., the second edition, Raven Press, N.Y. (1989)](모든 목적을 위해서 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 항체의 항원 결합 단편을 재조합 DNA 기법에 의해서 또는 완전 항체의 효소 또는 화학 절단에 의해서 생성시킬 수 있다. 일부 조건 하에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단쇄 항체(예를 들어 scFv), 키메릭 항체, 다이아바디, 및 상기 폴리펩타이드상에 특이적인 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 상기와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Fd 단편"이란 용어는 VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭하고; "Fv 단편"이란 용어는 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭하며; "dAb 단편"이란 용어는 VH 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭하고(Ward et al., Nature 341:544 546 (1989)); "Fab 단편"이란 용어는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 지칭하며; "F(ab')2 단편"이란 용어는 힌지 영역상에서 다이설파이드 가교(들)를 통해 서로 연결된 2 개의 Fab 단편들을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.
일부 조건 하에서, 항체의 항원 결합 단편은 단쇄 항체(예를 들어 scFv)이며, 여기에서 VL 및 VH 도메인은 짝을 이루어, 단일 폴리펩타이드 쇄를 생성할 수 있게 하는 링커를 통해 1가 분자를 형성한다(예를 들어 문헌[Bird et al., Science 242:423 426 (1988)] 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883 (1988)]을 참조하시오). 상기와 같은 scFv 분자는 일반적으로 공통 구조: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 갖는다. 종래 기술에서 적합한 링커들은 반복되는 GGGGS 아미노산 서열 또는 그의 변체로 이루어진다. 예를 들어, 아미노산 서열(GGGGS)4를 갖는 링커를 사용할 수 있으며, 그의 변체를 또한 사용할 수 있다(Holliger et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 발명에 사용될 수 있는 다른 링커들은 하기의 문헌들에 개시되어 있다: Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al., (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al., (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al., (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al., (2001), Cancer Immunol.
일부 조건 하에서, 항체의 항원 결합 단편은 다이아바디, 즉 2가 항체일 수 있으며, 여기에서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄상에서 발현되지만, 상기 사용된 링커는 같은 쇄상에서 상기 두 도메인의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧아, 상기 도메인들은 2 개의 항원 결합 부위를 생성시키기 위해서 또 다른 쇄상에서 상보성 도메인과 짝을 이루어야 한다(예를 들어 문헌[Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993)], 및 [Poljak R. J. et al., Structure 2:1121 1123 (1994)]을 참조하시오).
항체의 항원 결합 단편(예를 들어 상술한 바와 같은 항체 단편)을 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 통상적인 기법(예를 들어 재조합 DNA 기법 또는 효소 또는 화학 절단 방법)에 의해서 주어진 항체(예를 들어 본 발명에 제공된 단클론 항체 E6F6)로부터 획득할 수 있으며, 완전 항체를 선별하는 동일한 방식으로 특이성에 대해 선별할 수 있다.
본 발명에서, 명백히 명시되지 않는 한, "항체"란 용어가 언급되는 경우, 이는 완전 항체뿐만 아니라 상기 항체의 항원 결합 단편들을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "MAb" 및 "단클론 항체"란 용어는 고도로 상동성인 항체 분자의 집단, 즉 자발적으로 발생할 수 있는 천연 돌연변이를 제외하고, 완벽하게 동일한 항체 분자의 집단으로부터의 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 단클론 항체는 항원의 단일 에피토프에 대해 높은 특이성을 갖는다. 다클론 항체는 단클론 항체에 비해, 일반적으로 항원상의 상이한 에피토프들을 인식하는 적어도 2 개 이상의 상이한 항체를 일반적으로 포함한다. 단클론 항체를 일반적으로는, 최초로 코흘러(Kohler) 등(Nature, 256:495, 1975)에 의해 보고된 하이브리도마 기법에 의해 획득하며, 또한 재조합 DNA 기법(예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호를 참조하시오)에 의해 획득할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 번호와 함께 언급된 단클론 항체들은 동일한 번호를 갖는 하이브리도마로부터 획득된 단클론 항체와 동일하다. 예를 들어 단클론 항체 HBs-E6F6(간략히 E6F6), HBs-E7G11(간략히 E7G11), HBs-G12F5(간략히 G12F5) 및 HBs-E13C5(간략히 E13C5)는 각각 하이브리도마 세포주 HBs-E6F6(간략히 E6F6) 또는 그의 서브클론 또는 자손 세포, HBs-E7G11(간략히 E7G11) 또는 그의 서브클론 또는 자손 세포, HBs-G12F5(간략히 G12F5) 또는 그의 서브클론 또는 자손 세포, 및 HBs-E13C5(간략히 E13C5) 또는 그의 서브클론 또는 자손 세포로부터 획득된 항체들과 동일하다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "키메릭 항체"란 용어는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부가 항체(특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정한 항체 유형 또는 하위유형에 속한다)로부터 유래하고 그의 경쇄 및/또는 중쇄의 다른 부분은 또 다른 항체(동일하거나 상이한 종으로부터 기원하거나 동일하거나 상이한 항체 유형 또는 하위유형에 속한다)로부터 유래하나, 단 관심 항원에 대한 결합 활성을 여전히 유지하는 상기와 같은 항체를 지칭한다(캐빌리(Cabilly) 등의 미국특허 제 4,816,567 호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
본 발명에 사용된 바와 같이, "인간화된 항체"란 용어는 인간 면역글로불린(수용자 항체)의 모든 CDR 영역 또는 CDR 영역들의 일부가 비-인간 항체(공여자 항체)의 CDR 영역으로 교체된 항체 또는 항체 단편을 지칭하며, 여기에서 상기 공여자 항체는 기대하는 특이성, 친화성 또는 반응성을 갖는 비-인간(예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼) 항체일 수 있다. 또한, 수용자 항체의 프레임워크 영역(FR)의 일부 아미노산이 또한, 상기 항체의 성질들을 개선시키거나 최적화하기 위해서, 비-인간 항체의 상응하는 아미노산 잔기, 또는 또 다른 항체의 아미노산 잔기에 의해 교체될 수도 있다. 인간화된 항체와 관련된 보다 상세한 내용에 관하여, 예를 들어 하기의 문헌들을 참조하시오: Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); 및 Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000).
본 발명에 사용된 바와 같이, "중화 항체"란 용어는 관심 바이러스의 독성(예를 들어 세포를 감염시키는 능력)을 제거하거나 현저하게 감소시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상의 부분을 지칭한다. "에피토프"는 또한 "항원 결정인자"로서 공지되어 있다. 에피토프 또는 항원 결정인자는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성 표면 그룹들로 이루어지며, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 독특한 입체 형태("선형"이거나 또는 "입체형태적"일 수 있다)로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산을 포함한다. 예를 들어 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조하시오. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들어 항체) 간의 모든 상호작용 부위들은 상기 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 입체형태적 에피토프에서, 상기 상호작용 부위들은 하나의 단백질에서 서로 분리된 아미노산 잔기들에 걸쳐 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "에피토프 펩타이드"란 용어는 에피토프로서 작용하는 항원상의 펩타이드 단편을 지칭한다. 일부 조건 하에서, 에피토프 펩타이드는 단독으로 상기 에피토프에 대한 항체에 의해 특이적으로 인식/결합될 수 있다. 일부 다른 조건 하에서, 에피토프 펩타이드를 상기 에피토프가 항체에 의해 특이적으로 인식되는 것을 촉진하는 담체 단백질에 융합시켜야 한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "담체 단백질"이란 용어는 에피토프 펩타이드의 담체로서 작용할 수 있는 상기와 같은 단백질을 지칭한다, 즉 상기 에피토프 펩타이드는, 상기 펩타이드가 제공될 수 있고 따라서 항체 또는 면역계에 의해 인식될 수 있도록 특정 위치(예를 들어 상기 단백질의 내부, N-말단 또는 C-말단)에서 상기 단백질에 삽입될 수 있다. 상기와 같은 담체 단백질, 예를 들어 HPV L1 단백질(상기 단백질 내로 상기 에피토프 펩타이드가 상기 단백질의 130 내지 131 번 위치의 아미노산 또는 426 내지 427 번 위치의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다, 문헌[Slupetzky, K. et al., Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops[J]. J Gen Virol, 2001, 82: 2799-2804]；[Varsani, A. et al., Chimeric human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16[J]. J Virol,2003, 77: 8386-8393]을 참조하시오), HBV 코어 항원(상기 단백질의 79 내지 81 번 위치로부터의 아미노산이 상기 에피토프 펩타이드로 교체될 수 있다, 문헌[Koletzki, D., et al. HBV core particles allow the insertion and surface exposure of the entire potentially protective region of Puumala hantavirus nucleocapsid protein [J]. Biol Chem,1999, 380: 325-333]을 참조하시오), 우드척 간염 바이러스 코어 단백질(상기 단백질의 79 내지 81 번 위치로부터의 아미노산이 상기 에피토프 펩타이드로 교체될 수 있다, 문헌[Sabine Konig, Gertrud Beterams and Michael Nassal, J. Virol. 1998, 72(6):4997)]을 참조하시오), 및 CRM197 단백질(상기 에피토프 펩타이드를 상기 단백질 또는 그의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킬 수 있다)이 당해 분야의 숙련가에 의해 널리 공지되어 있다. 임의로, 링커(예를 들어 강성 또는 가요성 링커)를 에피토프 펩타이드와 담체 단백질 사이에 사용하여 각각 이들의 폴딩을 촉진시킬 수도 있다.
항체를 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 통상적인 기법에 의해 동일한 에피토프에 대한 결합의 경쟁력에 따라 선별할 수 있다. 예를 들어, 경쟁 또는 교차-경쟁에 대한 연구를 수행하여 항원(예를 들어 HBsAg 단백질)에의 결합에 대해 서로 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체들을 획득할 수 있다. 교차-경쟁을 근거로, 동일 에피토프에 결합하는 항체들을 획득하기 위한 대량처리 방법이 국제 특허 출원 WO 03/48731에 개시되어 있다. 따라서, HBsAg 단백질 상의 동일 에피토프에의 결합에 대해 본 발명에 따른 단클론 항체(예를 들어 단클론 항체 E6F6)와 경쟁하는 항체 및 그의 항원 결합 단편(즉 항원 결합 부분)을 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 통상적인 기법에 의해 획득할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "단리된"이란 용어는 인공 수단에 의해 천연 상태로부터 획득되는 상태를 지칭한다. 어떤 "단리된" 물질 또는 성분이 자연에 존재하는 경우는 그의 천연 환경이 변하거나 또는 상기 물질이 천연 환경으로부터 단리되거나, 또는 이들 둘 모두 때문에 가능하다. 예를 들어 어떤 단리되지 않은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 어떤 살아있는 동물 체내에 천연으로 존재하며, 상기와 같은 천연 상태로부터 단리된 높은 순도의 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드라 칭한다. "단리된"이란 용어는 혼합된 인공 또는 합성 물질도, 상기 단리된 물질의 활성에 영향을 미치지 않은 다른 불순한 물질도 배제하지 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "이 콜라이 발현 시스템"이란 용어는 이 콜라이(균주) 및 벡터로 이루어지는 발현 시스템을 지칭하며, 여기에서 상기 이 콜라이(균주)는 상업적으로 입수할 수 있는 균주, 예를 들어 비제한적으로 GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), 및 BLR (DE3)으로부터 유래한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "벡터"란 용어는 상기 중에 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 상기 벡터가 상기 중에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라 칭한다. 상기 벡터는 숙주 세포로의 형질전환, 형질도입, 또는 형질감염에 의해 상기 숙주 세포에서 발현되는 운반된 유전 물질 요소를 가질 수 있다. 벡터, 예를 들어 비제한적으로 플라스미드, 파지, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들어 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유도 인공 염색체(PAC); 파지, 예를 들어 λ 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스가 당해 분야의 숙련가에 의해 널리 공지되어 있다. 벡터로서 사용될 수 있는 상기 동물 바이러스는 비제한적으로 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어 헤르페스 단순 바이러스), 폭스 바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 파포바 바이러스(예를 들어 SV40)를 포함한다. 벡터는 발현을 조절하기 위한 다수의 요소들, 예를 들어 비제한적으로 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인헨서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기원을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 벡터가 도입될 수 있는 세포, 예를 들어 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스, 및 진균 세포, 예를 들어 효모 세포 또는 아스퍼질러스, 곤충 세포, 예를 들어 S2 드로소필라 세포 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예를 들어 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "일치성"이란 용어는 2 개의 폴리펩타이드 사이 또는 2 개의 핵산 사이의 합치 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2 개의 서열이 어떤 부위에서 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛을 갖는 경우(예를 들어 2 개의 DHA 분자가 각각 어떤 부위에서 아데닌을 갖거나, 또는 2 개의 폴리펩타이드가 각각 어떤 부위에서 리신을 갖는 경우), 상기 두 분자는 상기 부위에서 일치한다. 2 개 서열간의 일치성 퍼센트는 비교를 위한 전체 부위의 수에 걸쳐 상기 두 서열에 의해 공유되는 동일한 부위의 수 x 100의 함수이다. 예를 들어 2 개 서열의 10 개 부위 중 6 개가 합치되는 경우, 이들 두 서열은 60%의 일치성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 일치성을 공유한다(6 개의 부위 중 3 개가 합치된다). 일반적으로, 2 개 서열의 비교를 최대의 일치성을 생성시키는 방식으로 수행한다. 상기와 같은 정렬을 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 얼라인(Align) 프로그램(DNAstar, Inc.)(니들맨(Needleman) 등의 방법(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)에 근거한다)을 사용하여 수행할 수 있다. 2 개 아미노산 서열간의 일치성 퍼센트를 이 마이어스(E. Meyers) 및 더블유 밀러(W. Miller)의 연산(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))(PAM120 가중치 잔기 표, 12의 중단 길이 벌점 및 4의 중단 벌점을 사용하여, 상기 얼라인 프로그램(버전 2.0)에 넣었다)을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 2 개 아미노산 서열간의 일치성 백분율을 니들맨과 분취(Needleman and Wunsch)의 연산(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))(블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 중단 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 입수할 수 있다)의 GAP 프로그램에 넣었다)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "보존적 치환"이란 용어는 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 필수적인 성질에 불리한 영향을 미치지 않거나 상기 성질을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지향 돌연변이 및 PCR-매개된 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 상응하는 아미노산 잔기에 물리적으로 또는 작용적으로 유사한(예를 들어 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 포함한 화학적 성질 등) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 계열은 당해 분야에서 정의되었다. 이들 계열은 알칼리성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 아스파트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기를 바람직하게는 동일한 측쇄 계열로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킨다. 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)]; [Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)]; 및 [Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같이, "면역원성"이란 용어는 유기체에서 특이 항원 또는 감작된 림프구의 형성을 자극하는 능력을 지칭한다. 상기는, 최종적으로 항체 및 감작된 림프구와 같은 면역학적 효과기 물질을 생성시키기 위해서 특정한 면역세포를 활성화하고, 증식하고 분화하도록 자극하는 항원의 성질을 지칭할 뿐만 아니라, 항원으로 유기체 자극 후 상기 유기체의 면역계에 항체 또는 감작된 T 림프구를 형성시킬 수 있는 특이적인 면역 반응을 지칭한다. 면역원성은 항원의 가장 중요한 성질이다. 항원이 숙주에서 면역 반응의 생성을 성공적으로 유도할 수 있는지의 여부는 3 가지 인자, 항원의 성질, 숙주의 반응성, 및 면역화 수단에 따라 변한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합하는"이란 용어는 비-무작위 방식으로, 예를 들어 항체와 항원간의 반응이 향하는 방식으로 2 개의 분자가 결합함을 지칭한다. 일부의 실시태양에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체(또는 항원에 특이적인 항체)는 상기 항원에 약 10-5 M 미만, 예를 들어 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 그 이하의 친화성(KD)으로 결합하는 항체를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "KD"란 용어는 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 개시하는데 사용되는, 특이적인 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다. 일반적으로, 항체(예를 들어 본 발명에 따른 단클론 항체 E6F6)는 항원에, 예를 들어 BIACORE 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된, 약 10-5 M 미만, 예를 들어 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 그 이하의 KD로 결합한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "단클론 항체"란 용어 및 "MAb"란 용어는 동일한 의미를 가지며 호환적으로 사용되고; "다클론 항체"란 용어 및 "PAb"란 용어는 동일한 의미를 가지며 호환적으로 사용되고; "폴리펩타이드"란 용어 및 "단백질"이란 용어는 동일한 의미를 가지며 호환적으로 사용된다. 더욱이, 본 발명에서, 아미노산을 단일 문자 암호 또는 3 문자 암호로 나타낸다. 예를 들어 알라닌은 A 또는 Ala로 나타낼 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "하이브리도마"란 용어 및 "하이브리도마 세포주"란 용어는 호환적으로 사용될 수 있다. "하이브리도마"란 용어 및 "하이브리도마 세포주"란 용어가 언급되는 경우, 이들은 또한 하이브리도마의 서브클론 및 자손 세포를 포함한다. 예를 들어 하이브리도마 세포주 E6F6이 언급되는 경우, 이는 또한 하이브리도마 세포주 E6F6의 서브클론 및 자손 세포를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"란 용어는 환자 및 당해 분야에 널리 공지된 활성제와 약물학적으로 및/또는 생리학적으로 상용성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하며(예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995]을 참조하시오), 비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제 및 이온 강도 향상제를 포함한다. 예를 들어, 상기 pH 조절제는 비제한적으로 포스페이트 완충제를 포함하고; 상기 계면활성제는 비제한적으로 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈-80을 포함하며; 상기 이온 강도 향상제는 비제한적으로 염화 나트륨을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "항원보강제"란 용어는 항원과 함께 유기체에 전달되거나 또는 상기 유기체에 미리 전달되는 경우, 상기 유기체에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 증대시키거나 또는 상기 면역 반응의 유형을 변화시킬 수 있는 비-특이적인 면역강화제를 지칭한다. 다양한 항원보강제, 예를 들어 비제한적으로 알루미늄 항원보강제(예를 들어 수산화 알루미늄), 프로인트 항원보강제(예를 들어 프로인트 완전 항원보강제 및 프로인트 불완전 항원보강제), 코리네 박테리움 파르븀, 리포폴리사카라이드, 사이토킨 등이 존재한다. 프로인트 항원보강제가 현재 동물 실험에서 가장 통상적으로 사용되는 항원보강제이다. 수산화 알루미늄 항원보강제는 임상 시험에 보다 통상적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "단백질 백신"이란 용어는 임의로 항원보강제를 포함하는, 폴리펩타이드-기재 백신을 지칭한다. 백신 중 폴리펩타이드는 유전 공학 기법에 의해서 또는 화학 합성 방법들에 의해 획득될 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "핵산 백신"이란 용어는 임의로 항원보강제를 포함하는, DNA 또는 RNA-기재 백신(예를 들어 플라스미드, 예를 들어 발현 플라스미드)을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "유효량"이란 용어는 기대되는 효과를 성취하거나 또는 적어도 부분적으로 성취하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 질병(예를 들어 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병)의 예방에 유효한 양은 질병(예를 들어 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병)의 발생을 방지하거나, 억제하거나 또는 지연시키기에 유효한 양을 지칭한다. 질병의 치료에 유효한 양은 질병에 걸린 환자에서 상기 질병 및 상기 질병의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 차단하기에 유효한 양을 지칭한다. 상기와 같은 유효량의 측정은 당해 분야의 숙련가의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료용으로 유효한 양은 치료하려는 질병의 중증도, 환자의 면역계의 일반적인 상태, 환자의 일반적인 조건, 예를 들어 연령, 체중 및 성별, 약물의 투여 수단, 동시에 사용되는 추가적인 요법 등에 따라 변한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드의 생물학적 작용은 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함한다:
1) 항체 E6F6, E7G11, G12F5 또는 E13C5에 대한 특이적인 결합;
2) 환자에서(임의로, 담체 단백질에 에피토프 펩타이드를 융합시킨 후에) HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키는 능력;
3) 생체내에서(임의로, 담체 단백질에 에피토프 펩타이드를 융합시킨 후에) HBV 및 HBV-감염된 세포의 유효한 제거의 항체 반응을 유도하는 능력; 및
4) 환자에게서(임의로, 담체 단백질에 에피토프 펩타이드를 융합시킨 후에) HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병을 치료하는 능력.
따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 HBsAg 단백질의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드, 또는 그의 돌연변이체를 제공하며, 여기에서 상기 돌연변이체는 단지 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4)의 아미노산 잔기의 보존적 치환만이 상기 에피토프 펩타이드와 상이하며 상기 에피토프 펩타이드의 생물학적 작용은 유지한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 HBsAg 단백질의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기를 서열번호 1에 나타낸다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이체의 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타낸다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 HBsAg 단백질의 113 내지 135 번 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드, 또는 그의 돌연변이체를 제공하며, 여기에서 상기 돌연변이체는 단지 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9)의 아미노산 잔기의 보존적 치환만이 상기 에피토프 펩타이드와 상이하며 상기 에피토프 펩타이드의 생물학적 작용은 유지한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 HBsAg 단백질의 113 내지 135 번 위치의 아미노산 잔기를 서열번호 6에 나타낸다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 HBsAg 단백질의 4 내지 38의 연속 아미노산 잔기로 이루어지고 HBsAg 단백질의 121 내지 124 번 위치의 아미노산 잔기를 포함하는 단리된 에피토프 펩타이드, 또는 그의 돌연변이체를 제공하며, 여기에서 상기 돌연변이체는 단지 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9)의 아미노산 잔기의 보존적 치환만이 상기 에피토프 펩타이드와 상이하며 상기 에피토프 펩타이드의 생물학적 작용은 유지한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 HBsAg 단백질의 121 내지 124 번 위치의 아미노산 잔기를 서열번호 10에 나타낸다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드는 HBsAg 단백질의 38 이하, 예를 들어 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4의 연속 아미노산 잔기로 이루어진다. 예를 들어 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체는 서열번호 1 내지 7 및 10으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
특히, 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체를 담체 단백질에 융합시켜, 상기 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체가 유기체 중의 면역계에 의해 인식될 수 있고 생체내에서 바이러스 및 바이러스-감염된 세포의 유효한 제거의 항체 반응을 유도할 수 있도록 상기 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체의 면역원성을 증대시킬 수 있다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체, 및 담체 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 제공하며, 여기에서 상기 재조합 단백질은 천연 단백질 또는 그의 단편이 아니다. 상기 재조합 단백질에서, 상기 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체는, 사용되는 담체 단백질에 따라, 상기 담체 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되어 상기 담체 단백질에 삽입되거나, 또는 상기 담체 단백질의 아미노산 서열의 일부를 교체하는데 사용될 수 있다. 또한, 임의로, 상기 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체를 링커(강성 또는 가요성 링커, 예를 들어 (GGGGS)3)를 통해 상기 담체 단백질에 결합시킬 수도 있다. 본 발명의 재조합 단백질을 임의의 방법에 의해서, 예를 들어 유전공학 방법(재조합 기법)에 의해서 또는 화학 합성 방법에 의해서 생성시킬 수 있다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 담체 단백질은 CRM197 단백질 또는 그의 단편, HBcAg 및 WHcAg로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 담체 단백질은 CRM197 단백질 또는 그의 단편이고, 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 또는 그의 돌연변이체는 임의로 링커를 통해, CRM197 단백질 또는 그의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 결합된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 CRM197 단백질의 단편은 CRM197의 aa 1-190(aa는 아미노산을 나타내고; aa가 n 앞에 놓일 때, 이는 n 위치의 아미노산을 가리키며(예를 들어 aa 1-190은 1-190 위치의 아미노산을 나타낸다); aa가 n 뒤에 놓일 때, 이는 폴리펩타이드가 n 아미노산의 길이(하기와 같다)를 가짐을 가리킨다)을 포함한다, 예를 들어 CRM197의 aa 1-389를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 CRM197 단백질의 단편은 CRM197의 aa 1-190 또는 aa 1-389(각각 본 발명의 CRM A 및 CRM 389로서 나타낸다)로 이루어진다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 링커의 아미노산 서열을 서열번호 46에 설명한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 서열번호 74-97로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 담체 단백질은 HBcAg 또는 그의 단편이고, 상기 HBcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산이 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드로 교체된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 에피토프 펩타이드를 HBcAg 또는 그의 단편에 링커를 통해 결합시킨다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 HBcAg의 단편은 HBcAg의 aa 1-149를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 서열번호 47-53, 56 및 58-65로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 담체 단백질은 WHcAg 또는 그의 단편이며, 상기 WHcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산은 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드로 교체된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 에피토프 펩타이드를 WHcAg 또는 그의 단편에 링커를 통해 결합시킨다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 WHcAg의 단편은 WHcAg의 aa 1-149를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 서열번호 66-73으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 에피토프 또는 그의 돌연변이체 또는 본 발명에 따른 재조합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 벡터는 클로닝 벡터, 또는 발현 벡터일 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등일 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 벡터는 환자(예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간)에서 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 또는 돌연변이체 또는 본 발명에 따른 재조합 단백질을 발현할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기와 같은 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이 세포, 및 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 마우스 세포, 인간 세포 등)를 포함한다. 본 발명에 따른 세포는 세포주, 예를 들어 293T 세포일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 숙주 세포를 적합한 조건 하에서 배양하고, 상기 세포 배양물로부터 본 발명에 따른 재조합 단백질을 회수함을 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 또는 재조합 단백질, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제(예를 들어 항원보강제)를 포함하는 단백질 백신을 제공한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 단백질 백신은 본 발명에 따른 하나 이상의 에피토프 펩타이드를 포함하며, 여기에서 상기 에피토프 펩타이드는 분리되거나 나란하거나, 변형되거나 변형되지 않거나, 또 다른 단백질에 결합되거나 결합되지 않을 수도 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체), 재조합 단백질 또는 단백질 백신을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 치료하기 위한 단백질 백신의 제조에서 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 또는 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 치료하기 위한 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체) 또는 재조합 단백질을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제(예를 들어 항원보강제)를 포함하는 유전자 백신을 제공한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 유전자 백신은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 DNA 또는 RNA는 네이키드이거나 또는 전달 및/또는 보호 작용을 갖는 외피로 캡슐화될 수도 있다. 하나의 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 외피는 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 등의 외피이거나, 또는 화학적 방법에 의해 합성되고 유사한 작용을 발휘할 수 있는 또 다른 물질일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 유전자 백신 또는 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 치료하기 위한 유전자 백신의 제조에서 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 벡터의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 치료하기 위한 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체), 재조합 단백질, 단리된 핵산 분자, 또는 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제(예를 들어 항원보강제)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 에피토프 펩타이드를 포함하며, 여기에서 상기 에피토프 펩타이드는 분리되거나 나란하거나, 변형되거나 변형되지 않거나, 또 다른 단백질에 결합되거나 결합되지 않을 수도 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 감소가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명에 따른 약학 조성물, 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체), 재조합 단백질, 단리된 핵산 분자, 또는 벡터를 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체), 재조합 단백질, 단리된 핵산 분자, 또는 벡터의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키기 위한, 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드(또는 그의 돌연변이체), 재조합 단백질, 단리된 핵산 분자, 또는 벡터를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 단클론 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기에서 상기 단클론 항체는 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편, 단쇄 항체(예를 들어 scFv), 마우스 항체, 토끼 항체, 인간화된 항체, 완전-인간 항체, 키메릭 항체(예를 들어 인간 마우스 키메릭 항체), 및 이중특이성 또는 다중특이성 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 또는 HBsAg 단백질에 약 10-5 M 미만, 예를 들어 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 그 이하의 KD로 결합한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 비-CDR 영역을 포함하며, 상기 비-CDR 영역은 쥐 종 이외의 종으로부터의 것이다, 예를 들어 인간 항체로부터의 것이다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 환자에게서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 하기의 단클론 항체로부터 유래하거나 또는 하기의 항체들 중에서 선택된다:
1) 하이브리도마 세포주 HBs-E6F6에 의해 생성된 단클론 항체(여기에서 상기 하이브리도마 세포주 HBs-E6F6은 CCTCC NO.C201270의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁되어 있다);
2) 하이브리도마 세포주 HBs-E7G11에 의해 생성된 단클론 항체(여기에서 상기 하이브리도마 세포주 HBs-E7G11은 CCTCC NO.C201271의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁되어 있다);
3) 하이브리도마 세포주 HBs-G12F5에 의해 생성된 단클론 항체(여기에서 상기 하이브리도마 세포주 HBs-G12F5는 CCTCC NO.C201272의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁되어 있다); 및
4) 하이브리도마 세포주 HBs-E13C5에 의해 생성된 단클론 항체(여기에서 상기 하이브리도마 세포주 HBs-E13C5는 CCTCC NO.C201273의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁되어 있다).
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 또는 HBsAg 단백질의, 하이브리도마 세포주 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5 또는 HBs-E13C5에 의해 생성된 항체에의 결합을 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상까지 차단할 수 있는 단클론 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기에서 상기 하이브리도마 세포주 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5 및 HBs-E13C5는 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 각각 CCTCC NO.C201270, CCTCC NO.C201271, CCTCC NO.C201272 및 CCTCC NO.C201273의 기탁 번호로 기탁되어 있다.
상기와 같은 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프는 단클론 항체 E6F6, E7G11, G12F5 또는 E13C5에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 또는 공간적으로 겹치며, 따라서 상기와 같은 단클론 항체는 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 또는 HBsAg 단백질에의 단클론 항체 E6F6, E7G11, G12F5 또는 E13C5의 결합을 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상까지 감소시킬 수 있다.
HBsAg 단백질에 대한 공지된 단클론 항체의 결합을 감소시키는, 시험하려는 단클론 항체의 능력을 통상적인 방법, 예를 들어 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 개시된 방법에 의해 측정할 수 있다. 하나의 예시적인 방법은 미세웰 플레이트에 항원을 사전-코팅하고, 주어진 농도의 공지된 표지된 단클론 항체와 함께 시험하려는 일련의 희석된 표지되지 않은 항체를 상기 사전-코팅된 미세웰 플레이트에 첨가하고 배양을 수행하고, 이어서 세척후, 상기 시험하려는 상이하게 희석된 항체의 존재 하에서 상기 플레이트에 결합된 상기 공지된 항체들의 수를 측정함을 포함한다. 공지된 항체가 결합하는 항원에 대한 결합에 대해서 상기 공지된 항체와 경쟁하는 상기 시험하려는 항체의 능력이 강할수록, 상기 항원에 결합하는 상기 공지된 항체의 능력은 약하고 상기 플레이트에 결합되는 상기 공지된 항체는 적다. 일반적으로, 항원을 96-웰 미세웰 플레이트상에 코팅하고, 시험하려는 단클론 항체를 방사성 표지화 방법 또는 효소 표지화 방법에 의해, 공지된 표지된 단클론 항체를 차단하는 그의 능력에 대해 시험할 수 있다.
단클론 항체를, 코흘러 등에 의해 보고된 하이브리도마 제조 방법(Nature 256: 495(1975))에 의해 제조할 수 있다. 먼저, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물을 면역원의 주사에 의해(필요한 경우 항원보강제를 첨가한다) 면역시킨다. 상기 면역원 또는 항원보강제의 주사 수단은 일반적으로 피하 다점 주사 또는 복강내 주사이다. 일부 공지된 단백질(예를 들어 혈청 알부민)에의 면역원의 사전-접합은 숙주 중 항원의 면역원성을 촉진시킬 수 있다. 항원보강제는 프로인트 항원보강제 또는 MPL-TDM 등일 수 있다. 동물의 면역화 후, 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 림프구가 상기 동물에서 생성된다. 관심 림프구를 수거하고 적합한 융합제(예를 들어 PEG)를 사용하여 골수종 세포에 융합시켜, 하이브리도마 세포를 획득한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996).
상기 제조된 하이브리도마 세포를 적합한 배양 배지에 시딩하고 상기 배지에서 생육시키며, 상기 배양 배지는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 생육을 억제할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함한다. 예를 들어, 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 모 골수종 세포의 경우에, HGPRT-결핍 세포의 생육을 상기 배양 배지에 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티민(HAT 배양 배지)과 같은 물질을 첨가하여 억제시킨다.
바람직한 골수종 세포는 높은 융합률, 안정한 항체 분비 능력, HAT 배양 배지에 대한 민감성 등을 가져야 한다. 골수종 세포의 첫 번째 선택은 쥐 골수종, 예를 들어 MOP-21 및 MC-11 마우스 종양 유래된 세포주(더 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(THE Salk Institute Cell Distribution Center), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 및 SP-2/0 또는 X63-Ag8-653 세포주(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)이다. 또한, 인간 골수종 및 인간-마우스 이종 골수종 세포주를 사용하여 인간 단클론 항체를 제조할 수도 있다(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
하이브리도마 세포의 생육을 위한 배양 배지를 사용하여 특이 항원에 대한 단클론 항체의 생성을 검출한다. 하기의 방법들을 사용하여 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 측정할 수 있다: 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 및 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA). 예를 들어 문헌[Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980)]에 개시된 스캐차드(Scatchard) 분석을 사용하여 단클론 항체의 친화성을 측정할 수도 있다.
하이브리도마에서 생산된 항체의 특이성, 친화성 및 반응성을 측정한 후에, 관심 세포주를 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996]에 개시된 제한 희석 방법에 의해 서브클로닝할 수도 있다. 적합한 배양 배지는 DMEM 또는 RPMI-1640 등일 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물체에서 복수 종양의 형태로 생육할 수도 있다.
면역글로불린의 정제를 위한 전통적인 방법, 예를 들어 단백질 A 아가로스 젤, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써, 서브클론 세포에 의해 분비된 단클론 항체를 세포 배양물, 복수 또는 혈청으로부터 단리할 수 있다.
단클론 항체를 유전 공학 재조합 기법에 의해 획득할 수 있다. MAb 중쇄 및 경쇄 유전자에 특이적으로 결합하는 핵산 프라이머들에 PCR 증폭을 가하여, 하이브리도마 세포로부터 MAb 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 분자를 단리시킨다. 상기 획득된 DNA 분자를 발현 벡터에 삽입하고, 숙주 세포(예를 들어 이 콜라이 세포, COS 세포, CHO 세포, 또는 면역글로불린을 생산하지 않는 다른 골수종 세포)를 상기로 형질감염시키고, 재조합 발현에 의해 관심 항체를 획득하기에 적합한 조건 하에서 배양한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 상기와 같은 핵산 분자를 하이브리도마 세포로부터 단리하거나, 또는 유전 공학 재조합 기법 또는 화학 합성 방법에 의해 획득할 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단클론 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단클론 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 벡터는 클로닝 벡터, 또는 발현 벡터일 수 있다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기와 같은 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이 세포, 및 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 마우스 세포, 인간 세포 등)를 포함한다. 본 발명에 따른 세포는 세포주, 예를 들어 293T 세포일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 숙주 세포를 적합한 조건 하에서 배양하고, 상기 세포 배양물로부터 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수함을 포함하는, 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하기 중에서 선택된 하이브리도마 세포주를 제공한다:
1) CCTCC NO.C201270의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁된 하이브리도마 세포주 HBs-E6F6;
2) CCTCC NO.C201271의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁된 하이브리도마 세포주 HBs-E7G11;
3) CCTCC NO.C201272의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁된 하이브리도마 세포주 HBs-G12F5; 및
4) CCTCC NO.C201273의 기탁 번호로 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 기탁된 하이브리도마 세포주 HBs-E13C5.
다양한 항체 중에 포함된 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR의 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오타이드 서열을 통상적인 방법에 의해 단클론 항체 E6F6, E7G11, G12F5 및 E13C5로부터 측정할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 마커를 또한 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 키트는 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 2차 항체는 검출 가능한 마커를 추가로 포함한다. 상기와 같은 검출 가능한 마커(당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다)는 비제한적으로 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 발색 물질 및 효소(예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제) 등을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 샘플 중 HBsAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용함을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능한 마커를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검출하기 위해 검출 가능한 마커를 갖는 2차 항체를 사용함을 추가로 포함한다. 상기 방법은 진단용으로 또는 비-진단용으로(예를 들어 상기 샘플은 환자로부터의 샘플이기보다는 세포 샘플이다) 사용될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자로부터의 샘플 중 HBsAg 단백질의 존재를 검출하기 위해 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용함을 포함하는, 환자가 HBV에 의해 감염된 여부를 진단하는 방법을 제공한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 검출 가능한 마커를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검출하기 위해 검출 가능한 마커를 갖는 2차 항체를 사용함을 추가로 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 샘플 중 HBsAg의 존재 또는 수준을 검출하거나 또는 환자가 HBV에 의해 감염된 여부를 진단하기 위한 키트의 제조에서 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 환자에게 예방학적 또는 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방하거나 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)을 예방하거나 치료하기 위한 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 감소가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명에 제공된 백신(단백질 백신 및 유전자 백신), 약제 및 약학 조성물을 단독으로 또는 함께 사용하거나, 또는 또 다른 약학적 활성제(예를 들어 인터페론제, 예를 들어 인터페론 또는 peg화된 인터페론)와 함께 사용할 수도 있다.
종래 기술에 비해, 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 및 상기 에피토프 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질은 중요한 이점들을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드 및 재조합 단백질은 HBV 및 HBV-감염된 세포의 유효 제거에 관하여 항체 반응을 유도할 수 있으며, 이에 의해 환자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있고 환자에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 치료에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드를 특이적으로 인식하고/하거나 상기에 결합할 수 있는 단클론 항체 및 그의 항원 결합 단편을 또한 제공한다. 상기와 같은 단클론 항체 및 그의 항원 결합 단편은 환자에서 HBV DNA 및/또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킬 수 있고, 생체내에서 HBV 및 HBV-감염된 세포를 유효하게 제거할 수 있으며, 따라서 환자에서 HBV 감염 또는 HBV 감염과 관련된 질병(예를 들어 B형 간염)의 치료에 유용하다.
본 발명에 따른 에피토프 펩타이드는 또한 상기 에피토프 펩타이드에 대한 단클론 항체 및 다클론 항체가 환자(예를 들어 HBV 트랜스제닉 마우스)에서 HBsAg 수준 및 HBV DHA 수준을 현저하게 감소시킬 수 있고 다른 에피토프 대한 항체에 비해 보다 오랜 기간 동안 치료에 계속 유효할 수 있다는 이점을 갖는다. 본 발명에 따른 에피토프 펩타이드는 또한 환자(예를 들어 HBV 트랜스제닉 마우스)를 활성 성분으로서 상기를 포함하는 백신으로 면역화시킬 때, HBsAg 수준 및 HBV DNA 수준을 상기 환자에거 오랫동안 감소시킬 수 있다는 이점을 갖는다.
도 1은 HBV 트랜스제닉 마우스의 치료에서 상이한 마우스 단클론 항체들의 효능 평가이다.
도 2 내지 도 4는 HBV 트랜스제닉 마우스의 치료에서 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5, 0.9%NS 및 엔테카비어(ETV)의 효능 평가이다. 상기 도면에 나타낸 값들은 각 실험 그룹에서 4 마리 마우스의 평균값들이다. 도 2: 각각 마우스 단클론 항체 및 엔테카비어(ETV)에 의한 HBV 트랜스제닉 마우스 처리 후 혈청 중 HBsAg 수준의 감소; 도 3: 각각 마우스 단클론 항체 및 엔테카비어(ETV)에 의한 HBV 트랜스제닉 마우스 처리 후 혈청 중 HBV DNA 수준의 감소; 도 4: 각각 마우스 단클론 항체 및 엔테카비어(ETV)에 의한 HBV 트랜스제닉 마우스 처리 후 혈청 중 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준의 변화.
도 5는 HBs-E6F6의 주사후 HBV DNA 및 HBsAg의 동적인 변화이다. 도 5A: HBs-E6F6에 의한 HBV 트랜스제닉 마우스 주사 후 혈청 중 HBsAg 수준의 감소; 도 5B: HBs-E6F6에 의한 HBV 트랜스제닉 마우스 주사 후 혈청 중 HBV DNA 수준의 감소.
도 6은 HBV 트랜스제닉 마우스의 치료에서 키메릭 항체의 효능 평가이다.
도 7 및 도 8은 9 개의 재조합 단백질들의 구조, 발현, 정제 및 전자 현미경 관찰이다. 도 7: pC149-SEQ 클론의 구조 지도; 도 8: 9 개의 재조합 단백질들의 SDS-PAGE 검출 및 전자 현미경 관찰 결과.
도 9는 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, 및 HBs-E13C5의 에피토프들에 대한 분석이다.
도 10은 에피토프 펩타이드 SEQ1의 아미노산 돌연변이에 대한 HBs-E6F6/HBs-E7G11의 민감성의 분석이며, 여기에서 "Ref."는 HBsAg가 항체 반응성을 가리키는 기준 항원으로서 사용됨을 의미하고, "-"는 상기 반응성이 HBsAg의 경우와 동일함을 의미하고, "++"는 상기 반응성이 HBsAg의 경우보다 2 정도의 크기(log10)까지 낮음을 의미하고, "++++"은 상기 반응성이 HBsAg의 경우보다 4 정도의 크기(log10)까지 낮음을 의미한다.
도 11 및 도 12는 에피토프 펩타이드를 포함하는 5 개의 재조합 단백질의 제조 및 이들의 면역원성의 평가이다. 도 11: 상기 5 개의 재조합 단백질의 SDS-PAGE 검출 및 전자 현미경 관찰의 결과. 도 12: 상기 5 개의 재조합 단백질에 의한 BALB/C 마우스의 면역화 후 혈청 중 항체 역가의 변화.
도 13은 마우스 혈액-유래된 다클론 항체의 치료 효과의 평가이다.
도 14는 HBV 트랜스제닉 마우스의 치료에서 상기 5 개의 재조합 단백질의 효과의 평가이다.
도 15 및 도 16은 에피토프 펩타이드를 포함하는 3 개의 재조합 단백질의 제조 및 이들의 치료 효과의 평가이다. 도 15: 상기 3 개의 재조합 단백질의 SDS-PAGE 검출 및 전자 현미경 관찰의 결과. 도 16: 상기 3 개의 재조합 단백질에 의한 HBV 트랜스제닉 마우스의 면역화 후, 마우스에서 혈청 HBsAg 수준, 혈청 HBV DNA 수준, 항-HBsAg 항체 수준, 및 항-담체 단백질 항체 수준의 변화.
도 17은 CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6, CRMA-SEQ6 재조합 단백질의 예시이다.
본 발명의 실시태양들을 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 개시한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 하기의 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정하기보다는 단지 본 발명을 예시하고자 함을 알 것이다. 하기의 도면 및 바람직한 실시태양의 상세한 설명에 따라, 본 발명의 다양한 목적 및 이점들이 당해 분야의 숙련가에게 자명하다.
서열 정보
본 발명에 관련된 서열들에 대한 정보를 하기 표 1에 제공한다.
서열번호 명칭 서열정보
1 SEQ1 GPCKTCT
2 SEQ2 GPCRTCT
3 SEQ3 STTTSTGPCKTCTTP
4 SEQ4 TTSTGPCKTCT
5 SEQ5 CKTCTTPAQ
6 SEQ6 SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
7 SEQ7 PGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCT
8 SEQ8 STTTSTGPC
9 SEQ9 STGPCKT
10 SEQ10 CKTC
11 SEQ11 TCTTPAQGNSMFPAQ
12 S1 MENIASGLLGPLLVL
13 S2 LGPLLVLQAGFFLLT
14 S3 AGFFLLTKILTIPQS
15 S4 ILTIPQSLDSWWTSL
16 S5 DSWWTSLNFLGGTPV
17 S6 FLGGTPVCLGQNSQS
18 S7 LGQNSQSQISSHSPT
19 S8 ISSHSPTCCPPICPG
20 S9 CPPICPGYRWMCLRR
21 S10 RWMCLRRFIIFLCIL
22 S11 IIFLCILLLCLIFLL
23 S12 LCLIFLLVLLDYQGM
24 S13 LLDYQGMLPVCPLIP
25 S14 PVCPLIPGSSTTSTG
26 S15 SSTTSTGPCKTCTTP
27 S16 CKTCTTPAQGTSMFP
28 S17 QGTSMFPSCCCTKPT
29 S18 CCCTKPTDGNCTCIP
30 S19 GNCTCIPIPSSWAFA
31 S20 PSSWAFAKYLWEWAS
32 S21 YLWEWASVRFSWLSL
33 S22 RFSWLSLLVPFVQWF
34 S23 VPFVQWFVGLSPTVW
35 S24 GLSPTVWLSVIWMMW
36 S25 SVIWMMWFWGPSLYN
37 S26 WGPSLYNILSPFMPL
38 S27 LSPFMPLLPIFFCLWVYI
39 HBsAg MENIASGLLGPLLVLQAGFFLLTKILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTPVCLGQNSQSQISSHSPTCCPPICPGYRWMCLRRFIIFLCILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWFWGPSLYNILSPFMPLLPIFFCLWVYI
40 HBcAg MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
41 WHcAg MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSEQVRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVIRRRGGARASRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPSANC
42 CRM197 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
43 C149/mut MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
44 C183/mut MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
45 WHC149/mut MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
46 Linker GGGGSGGGGSGGGGS
47 C149-SEQ1 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSGPCKTCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
48 C149-SEQ2 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSGPCRTCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
49 C149-SEQ3 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSSTTTSTGPCKTCTTPEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
50 C149-SEQ4 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSTTSTGPCKTCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
51 C149-SEQ5 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSCKTCTTPAQEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
52 C149-SEQ6 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
53 C149-SEQ7 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
54 C149-SEQ8 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSSTTTSTGPCEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
55 C149-SEQ9 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSSTGPCKTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
56 C149-SEQ10 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSCKTCEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
57 C149-SEQ11 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSTCTTPAQGNSMFPAQEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
58 C183-SEQ1 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSGPCKTCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
59 C183-SEQ2 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSGPCRTCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
60 C183-SEQ3 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSSTTTSTGPCKTCTTPEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
61 C183-SEQ4 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSTTSTGPCKTCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
62 C183-SEQ5 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSCKTCTTPAQEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
63 C183-SEQ6 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
64 C183-SEQ7 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
65 C183-SEQ10 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSCKTCEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPHRRRSQSRESQC
66 WHC149-SEQ1 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSGPCKTCTEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
67 WHC149-SEQ2 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSGPCRTCTEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
68 WHC149-SEQ3 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSSTTTSTGPCKTCTTPEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
69 WHC149-SEQ4 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSTTSTGPCKTCTEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
70 WHC149-SEQ5 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSCKTCTTPAQEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
71 WHC149-SEQ6 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
72 WHC149-SEQ7 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
73 WHC149-SEQ10 MDIDPYKEFGSSYQLLNFLPLDFFPDLNALVDTATALYEEELTGREHCSPHHTTIRQALVCWDELTKLIAWMSSNITSGGGGSGGGGTGSCKTCEFGGGGSGGGGSRTIIVNYVNDTWGLKVRQSLWFHLSCLTFGQHTVQEFLVSFGVWIRTPAPYRPPNAPILSTLPEHTVI
74 CRM197-SEQ1 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSGGGGSGGGGSGGGGSGPCKTCT
75 CRM197-SEQ2 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSGGGGSGGGGSGGGGSGPCRTCT
76 CRM197-SEQ3 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSGGGGSGGGGSGGGGSSTTTSTGPCKTCTTP
77 CRM197-SEQ4 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSGGGGSGGGGSGGGGSTTSTGPCKTCT
78 CRM197-SEQ5 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSGGGGSGGGGSGGGGSCKTCTTPAQ
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80 CRM197-SEQ7 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSGGGGSGGGGSGGGGSPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCT
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생물 물질의 기탁에 대한 설명본 발명은 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC, 중국 우한 우한대학)에 기탁된 하기의 생물 물질들에 관한 것이다:1) 2012년 6월 7일자로 기탁된, 기탁 번호 CCTCC NO.C201270의 하이브리도마 세포주 HBs-E6F6;
2) 2012년 6월 7일자로 기탁된, 기탁 번호 CCTCC NO.C201271의 하이브리도마 세포주 HBs-E7G11;
3) 2012년 6월 7일자로 기탁된, 기탁 번호 CCTCC NO.C201272의 하이브리도마 세포주 HBs-G12F5; 및
4) 2012년 6월 7일자로 기탁된, 기탁 번호 CCTCC NO.C201273의 하이브리도마 세포주 HBs-E13C5.
본 발명을 수행하기 위한 구체적인 방식
본 발명을 하기의 실시예들(단지 예시를 위해 사용되며 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다)을 참조하여 예시한다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자 생물학적 실험 방법 및 면역학적 분석을 실질적으로 문헌[Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 및 [F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]에 개시된 바와 같은 방법에 따라 수행하며; 제한 효소들은 제품의 제조사에 의해 권장되는 조건 하에서 사용된다. 본 발명에 사용되는 시약들(이들의 제조사는 나타내지 않는다)은 당해 분야의 통상적인 제품이거나 상업적으로 입수할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 이들 실시예가 본 발명을 예시하기 위해 사용되지만, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 안다.
실시예 1: 마우스 단클론 항체의 제조 및 성질 분석
목적: HBsAg에 특이적인 마우스 단클론 항체의 획득
1.1 항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 제조
1.1.1 마우스의 면역화
1.1.1.1 면역원의 제조:
면역원은 CHO에 의해 발현된 재조합 HBV 표면 항원 단백질이었다(HBsAg, 베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드(BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD.)로부터 구입). 상기 재조합 단백질을 0.4 ㎎/㎖의 농도로 희석하고, 같은 부피의 프로인트 항원보강제와 혼합하여 유중 수적형 유화액을 형성시켰다(상기 혼합된 용액이 완전히 유화되었는지의 여부를 측정하는 방법: 상기 혼합된 용액 한 방울을 깨끗한 물의 액체 표면상에 떨어뜨리고, 상기 혼합된 용액이 응집되고 분산되지 않았다면, 상기 용액은 실질적으로 균질하게 혼합된 것으로 생각할 수 있다). 프로인트 완전 항원보강제를 1차 면역화에 사용하였으며, 프로인트 불완전 항원보강제를 후속의 추가 면역화에 사용하였고, 융합 72 시간 전에 수행된 최종 추가 면역화의 경우 항원보강제를 첨가하지 않았다.
1.1.1.2 마우스의 기초 면역화:
6 내지 8주된 BALB/c 암컷 마우스를 시간당 마우스당 400 ㎕의 양의 상기 면역원의 피하 다점 주사에 의해 면역화하고, 200 ㎕의 안구 정맥혈을 역가 분석을 위해 각 면역화 전에 수거하였다. 추가 면역화를 매 2주마다 수행하였다. 간접 ELISA를 사용하여 혈청 역가를 측정하였으며, 상기 마우스의 혈청 역가가 평탄역에 있을 때, 마우스의 면역화를 멈추고 2 개월 동안 휴지후 융합을 수행하였다.
1.1.1.3 융합 72 시간 전 최종 추가 면역화:
비장의 최종 추가 면역화를 마우스 비장 세포 및 마우스 골수종 세포의 융합 72 시간 전에 수행하였으며, 상기 추가 면역화를 위한 면역원은 항원보강제를 포함하지 않았으며, 100 ㎕의 0.5 ㎎/㎖ 재조합 단백질의 주사를 수행하였다. 비장의 면역화 전에, 마우스를 에테르로 마취시키고, 복벽의 피부를 절개하여 복강을 열어 비장을 꺼내고, 상기 비장에 100 ㎕의 항원을 수직으로 주사하고, 상기 복벽 피부상의 절개부를 외과적으로 신속히 봉합하였다.
1.1.2 융합된 하이브리도마의 제조 및 선별
융합 72 시간 전에 수행된 최종 추가접종 후, 마우스 비장을 꺼내어 세포 현탁액으로 제조하고 여기에 마우스 골수종 세포 Sp2/0과의 세포 융합을 수행하여 하이브리도마 세포를 획득하였다. 이에 앞서, 배양보조 세포(feeder cell)를 제조하였다. 상기 하이브리도마 세포의 배양 동안 다수의 골수종 세포 및 비장세포가 융합후 1640-HAT 배양 배지에서 잇따라서 죽었으며, 단일 세포 또는 소수의 산발된 세포는 생존하기 쉽지 않았고, 이들을 생존시키기 위해서 다른 세포를 첨가해야 했다. 상기 첨가된 살아있는 세포가 배양보조 세포로서 공지되었다. 실험실은 배양보조 세포로서 13-일된 마우스의 마우스 복막 대식세포 또는 흉선세포를 사용하였다.
1.1.2.1 하기의 단계들을 포함한 마우스 대식세포의 제조.
(i) 6-주 된 BALB/c 마우스를 경부 탈구에 의해 죽였다. 상기 마우스를 흐르는 물로 세척하고, 75% 에탄올 용액에 5 분간 입욕시키고; 상기 마우스를 슈퍼클린 벤치상에 복부를 위로하여 놓고; 상기 마우스의 복부 피부를 한 쌍의 족집게로 들어올리고; 작은 구멍을 절개하고; 상기 피부를 보다 큰 쌍의 족집게로 위아래로 찢어 복부를 충분히 노출되게 하였다. (ii) 한 쌍의 무균 안과용 족집게를 사용하여 상기 복막을 들어올리고, 또 다른 쌍의 가위로 상기 복막의 가운데에 작은 구멍을 절개하고, 1 ㎖ 피펫을 사용하여 적합한 양의 배양 배지를 상기 구멍을 통해 상기 복강내로 주사하고, 상기 용액을 상기 복강내에서 상기 피펫으로 조심스럽게 젓고, 상기 배양 배지를 흡입하여 원심분리 튜브에 넣었다. (iii) 상기 복강으로부터의 세포 용액을 HAT 배양 배지 또는 HT 배양 배지에 용해시켜 2 x 105 세포/㎖의 농도로 대식성 배양보조 세포를 획득하였다. (iv) 0.1 ㎖의 배양보조 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 가하고, 배양기에서 배양하거나; 또는 융합 세포와의 혼합 후에 96-웰 세포 배양 플레이트에 가하였다.
1.1.2.2 하기의 단계들을 포함한 마우스 흉선세포의 제조.
(i) 13-주 된 BALB/c 마우스를 경부 탈구에 의해 죽였다. 상기 마우스를 흐르는 물에 세척하고 75% 에탄올 용액 중에 5 분간 입욕시키고; 상기 마우스를 슈퍼클린 벤치 상에 복부를 위로하여 놓았다. (ii) 상기 마우스 복부의 피부를 한 쌍의 족집게로 들어올리고, 상기 복부 및 흉부의 바깥 피부를 절개하였다. (iii) 또 다른 쌍의 깨끗한 가위를 사용하여 흉강을 절개하고, 유백색 흉선을 한 쌍의 족집게로 꺼내어, 분쇄후, 생성 혼합물을 200-메쉬 셀 체에 통과시켜 흉선 배양보조 세포 용액을 획득하였다.
1.1.2.3 하기의 단계들을 포함하는 마우스 골수종 세포의 제조.
(i) 마우스 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14(Sp2/0)는 현재, 배양이 용이하고 높은 융합률을 갖기 때문에 가장 이상적인 융합 세포였으나; Sp2/0 골수종 세포주는 NS-1에 비해 상기 배양 조건에 더 민감하였으며, 과잉-희석되고(3 x 105/㎖ 미만의 밀도로) 염기성 pH(7.3 초과의 pH)에 있을 때 잘 생육하지 않았다. (ii) 대수 증식기의 세포를 융합을 위해 선택하였다. (iii) 융합 전에, 골수종 세포를 배양 플라스크로부터 원심분리 튜브로 제거하고, RPMI-1640 배양 배지로 3 회 세척하고(1000 rpm x 5 분); 상기 세포를 RPMI-1640 배양 배지에 재현탁하고; 상기 세포를 카운트하였다. (iv) 일반적으로, 마우스 골수종 세포를 융합 5일 전에 해동시켰으며, 각각의 융합을 위해 약 6 병의 35 ㎠ Sp2/0 세포가 필요하였다.
1.1.2.4 하기의 단계들을 포함한 면역학적 비장세포의 제조.
(i) 융합시키려는 BALB/C 마우스를 사용하였으며, 안구를 제거하고 상기 마우스를 방혈시켜 죽이고, 채혈된 혈액을 사용하여 항혈청을 제조하고 이를 항체 검출을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. 상기 마우스를 흐르는 물로 세척하고 75% 에탄올 용액 중에 5 분간 입욕시키고; 상기 마우스를 오른쪽으로 가로뉘여 슈퍼클린 벤치상에 놓았다. (ii) 복강을 열고 비장을 무균 작업에 의해 꺼내고, 상기 비장을 작은 조각들로 절단하고, 상기 작은 조각들을 200-메쉬 셀 체 상에 놓고 압착시키고 취관으로 RPMI-1640 배양 배지를 적가하면서 분쇄 막대(플런저)에 의해 분쇄시켰다. (iii) 적합한 양의 RPMI-1640 배양 배지를 가하고, 상기 혼합물을 3 내지 5 분간 정치시키고, 상기 현탁액의 상부 2/3을 50 ㎖ 플라스틱 원심분리 튜브로 제거하고; 상기 작업을 2 내지 3 회 반복하였다. (iv) 상기 세포를 RPMI-1640 배양 배지로 3 회 세척하였다(1000 rpm x 10 분). (v) 상기 세포를 RPMI-1640 배양 배지에 재현탁시키고, 세포수를 카운트하였다.
1.1.2.5 하기의 단계들을 포함한 PEG 융합유도물질을 사용하는 융합에 의한 하이브리도마의 제조.
(i) 융합 전에, 1 ㎖ PEG-1500 및 10 ㎖ RPMI-1640 무혈청 배양 배지 및 200 ㎖ 완전 배지를 37 ℃로 예열하였다. (ii) 상기 제조된 골수종 세포 및 비장세포를 50 ㎖ 원심분리 튜브(1 x 108 비장세포 + 1 x 107 골수종 세포, 약 10:1)에서 혼합하고, 1500 rpm x 8 분으로 원심분리시키고; 원심분리 후에 상기 튜브의 바닥을 찰싹 쳐서 세포를 느슨하게 하고 페이스트로 만들었다. (iii) 1 ㎖ 흡입 피펫을 사용하여 가벼운 교반 하에서 0.8 ㎖(1 x 108 비장세포 + 0.8 ㎖ PEG)을 원심분리 튜브로 제거하고, PEG의 첨가를 60s 이내에 마친 다음, 순한 교반 하에서 37 ℃로 예열한 10 ㎖ RPMI-1640 완전 배지를 첨가하였다. 최종적으로, RPMI-1640 배양 배지를 40 ㎖로 가하고, 1000 rpm x 5 분에서 원심분리를 수행하였다. (iv) 상등액을 버리고, 소량의 HT 배양 배지를 사용하여 상기 세포를 조심스럽게 분출시키고, 상기 세포를 제조된 HT 배양 배지로 제거하고 웰당 0.1 ㎖로 96-웰 세포 배양 플레이트에 가하고; CO2 배양기에서 배양하였다. (v) 12 시간 후에, 적합한 양의 HAT 완전 배지를 제조하고, 0.1 ㎖의 상기 배지를 각 웰에 가하고; 5일 후에, HT 완전 배지를 사용하여 웰 중 세포 상등액의 50 내지 100%를 교체하고; 약 9 내지 14일 후에, 상기 상등액을 검출을 위해 취하였다.
1.1.2.6 하이브리도마의 선별:
간접 ELISA 선별에 의해, 상기 플레이트를 재조합 항원 HBsAg 100 ng/웰로 코팅하고 50 uL 세포 상등액을 가하고, 양성 클론 웰을 골랐다.
1.1.2.7 하이브리도마 세포의 클로닝:
제한 희석 분석을 사용하였으며, 세포를 먼저 주어진 농도 구배로 희석하고, 이어서 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 시딩하였으며, 이때 각 웰에서 하나의 세포를 가능한 한 멀게 생육시켰다. 하이브리도마 단클론 양성 세포주를 일반적으로 2 내지 3 회 반복해서 클로닝해야했으며, 상기 세포주는 100% 양성에 도달할 때까지 안정한 클론주로서 간주되었다.
1.1.3 MAb 복수의 제조
2 내지 3 마리의 BALB/c 마우스를 사용하였으며 0.5 ㎖ 삭솔을 복강에 주사하였다. 1주일 후에, 대수 증식기의 하이브리도마 세포를 1000 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 상등액은 버렸다. 상기 하이브리도마 세포를 무혈청 배양 배지에 현탁시키고, 세포의 수를 (1 내지 2) x 106/㎖로 조절하고, 0.5 ㎖의 상기 현탁액을 각 마우스의 복강에 주사하였다. 7 내지 10일 후에, 복강이 명백히 팽창했을 때 마우스를 경부 탈구에 의해 죽였다. 상기 마우스를 흐르는 물로 세척하고, 입욕시키고 75% 에탄올 중에 5 분간 입욕시켰다. 상기 마우스의 복부를 위로 향하게 하고, 사지를 주사 바늘을 사용하여 해부대상에 고정시켰다. 상기 마우스 복부의 피부를 한 쌍의 족집게로 들어올리고, 작은 구멍을 절개하고, 이어서 상기 피부를 양면 모두에서부터 상기 마우스의 등까지 절개하였다. 상기 피부를 보다 큰 쌍의 족집게로 위아래로 찢어 충분한 복부 노출을 보장하였다. 한 쌍의 무균 안과용 족집게를 사용하여 상기 복막을 들어올리고, 작은 구멍을 상기 복막의 가운데에 절개하고, 이어서 1 ㎖ 피펫을 사용하여 상기 복강으로부터 모든 복수를 채취하였다. 상기 수거된 복수를 혼합하고 3000 rpm에서 20 분간 원심분리 튜브에서 원심분리시켰다. 상등액을 원심분리후에 수거하였다.
1.1.4 MAb 복수의 정제
암모늄 설페이트 침전 및 단백질 A 친화성 크로마토그래피(US GE Co.로부터 구입) 후에, 정제된 단클론 항체를 획득하였다.
1.2 항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 성질에 대한 분석
1.2.1 폴리펩타이드의 합성
HBV 서열(GenBank ID: AAF24729.1)을 기준 서열로서 사용하였으며, 27 개의 폴리펩타이드를 합성하였다(지아멘 징주 바이올로지 사이언스 캄파니 리미티드(XiaMen Jingju Biology Science Co., Ltd.)에 의해 합성됨). 상기 27 개 폴리펩타이드(S1-S27)는 함께 HBsAg의 완전 길이 226 아미노산을 포함하였다. 폴리펩타이드 S1-S27에 대한 정보를 표 2에 나타내었다. HBsAg의 완전 길이 아미노산 서열을 서열번호 42에 설명하였다.
폴리펩타이드 S1-S27에 대한 정보
명칭 아미노산 위치 아미노산 서열
S1 HBsAg-aa1-aa15 MENIASGLLGPLLVL
S2 HBsAg-aa9-aa23 LGPLLVLQAGFFLLT
S3 HBsAg-aa17-aa31 AGFFLLTKILTIPQS
S4 HBsAg-aa25-aa39 ILTIPQSLDSWWTSL
S5 HBsAg-aa33-aa47 DSWWTSLNFLGGTPV
S6 HBsAg-aa41-aa55 FLGGTPVCLGQNSQS
S7 HBsAg-aa49-aa63 LGQNSQSQISSHSPT
S8 HBsAg-aa57-aa71 ISSHSPTCCPPICPG
S9 HBsAg-aa65-aa79 CPPICPGYRWMCLRR
S10 HBsAg-aa73-aa87 RWMCLRRFIIFLCIL
S11 HBsAg-aa81-aa95 IIFLCILLLCLIFLL
S12 HBsAg-aa89-aa103 LCLIFLLVLLDYQGM
S13 HBsAg-aa97-aa111 LLDYQGMLPVCPLIP
S14 HBsAg-aa105-aa119 PVCPLIPGSSTTSTG
S15 HBsAg-aa113-aa127 SSTTSTGPCKTCTTP
S16 HBsAg-aa121-aa135 CKTCTTPAQGTSMFP
S17 HBsAg-aa129-aa143 QGTSMFPSCCCTKPT
S18 HBsAg-aa137-aa151 CCCTKPTDGNCTCIP
S19 HBsAg-aa145-aa159 GNCTCIPIPSSWAFA
S20 HBsAg-aa153-aa167 PSSWAFAKYLWEWAS
S21 HBsAg-aa161-aa175 YLWEWASVRFSWLSL
S22 HBsAg-aa169-aa183 RFSWLSLLVPFVQWF
S23 HBsAg-aa169-aa183 VPFVQWFVGLSPTVW
S24 HBsAg-aa169-aa183 GLSPTVWLSVIWMMW
S25 HBsAg-aa193-aa207 SVIWMMWFWGPSLYN
S26 HBsAg-aa201-aa215 WGPSLYNILSPFMPL
S27 HBsAg-aa209-aa226 LSPFMPLLPIFFCLWVYI
1.2.2 항-HBsAg 마우스 단클론 항체와 폴리펩타이드 S1-S27과의 반응성에 대한 분석(1.2.2.1) 반응 플레이트의 제조상기 폴리펩타이드들을 pH 9.6 50 mM CB 완충제(NaHCO3/Na2CO3 완충제, 50 mM의 최종 농도, pH 9.6)로 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 희석하고; 96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰에, 100 ㎕ 코팅 용액을 가하고, 상기 코팅을 2 내지 8 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 수행하고, 이어서 37 ℃에서 2 시간 동안 수행하였다. 상기 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈20)으로 1 회 세척하고; 이어서 200 ㎕의 차단 용액(pH 7.4, 20% 소 태아 혈청 및 1% 카제인을 함유하는 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 완충제)을 각 웰에 가하고, 상기 차단을 37 ℃에서 2 시간 동안 수행하고; 상기 차단 용액을 버렸다. 건조 후에, 상기 플레이트를 알루미늄 호일 주머니에 패키징하고, 추후의 사용을 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
(1.2.2.2) 항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 ELISA
1.1에서 획득한 25 개 항-HBsAg 마우스 단클론 항체를 정성적인 ELISA를 위해 20% 갓난 송아지 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하였다.
샘플 반응: 100 ㎕의 희석된 샘플을 폴리펩타이드로 코팅된 27 개 ELISA 플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 30 분간 배양기에 넣었다.
효소 표지 반응: 샘플 반응 단계를 마친 후에, 상기 ELISA 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1%트윈20)으로 5 회 세척하고, 100 ㎕ HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG(GAM)(베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드로부터 구입)를 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 30 분간 배양기에 두었다.
발색 반응: 상기 효소 표지 반응 후에, 상기 ELISA 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1%트윈20)으로 5 회 세척하고, 50 ㎕ TMB 발색 시약(베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드로부터 구입)을 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 15 분간 배양기에 두었다.
정지 반응 및 값 판독: 상기 발색 반응 단계를 마친 후에, 50 ㎕ 정지 완충제(베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드로부터 구입)를 상기 ELISA 플레이트의 각 웰에 가하고, OD450/630 값을 각 웰에 대해 ELIASA로 판독하였다.
항-HBsAg 마우스 단클론 항체와 27 개 폴리펩타이드와의 반응성의 측정: 상기 반응성을 상기 판독치에 의해 측정하였다. 시험값/배경값이 5 이상인 경우, 상기 샘플을 양으로 간주하였다.
(1.2.2.3) 항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 인식 성질 분석
결과를 표 3에 나타내었다. 25 개 항-HBsAg 마우스 단클론 항체에 의해 인식된 유형들을 5 개의 그룹(인식 성질에 따라), 즉 sA, sB, sC, sD, sE로 분류할 수 있으며, 여기에서 sA 그룹의 항체는 폴리펩타이드 S15 및 S16을 인식하였고, sB 그룹의 항체는 폴리펩타이드 S16을 인식하였고, sC 그룹의 항체는 상기 27 개 폴리펩타이드와의 반응에서 음성으로 나타났으며; sD 그룹의 항체는 폴리펩타이드 S18을 인식하였고, sE 그룹의 항체는 폴리펩타이드 S8을 인식하였다.
항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 성질 분석
그룹 인식된 폴리펩타이드 항체명 항체 서브유형
sA S15, S16 HBs-E7G11 IgG1
sA S15, S16 HBs-G12F5 IgG1
sA S15, S16 HBs-E6F6 IgG1
sA S15, S16 HBs-E13C5 IgG1
sA S15, S16 HBs-3E9 IgG1
sA S15, S16 HBs-77D1 IgG2a
sA S15, S16 HBs-86H6 IgG2b
sA S15, S16 HBs-4D12 IgG2b
sA S15, S16 HBs-32H10 IgG1
sA S15, S16 HBs-70A6 IgG1
sA S15, S16 HBs-6C10 IgM
sA S15, S16 HBs-61B1 IgG1
sA S15, S16 HBs-37E12 IgG2b
sA S15, S16 HBs-85D12 IgG1
sA S15, S16 HBs-H8D9 IgG1
sA S15, S16 HBs-E11E4 IgG2a
sA S15, S16 HBs-83H12 IgG1
sB S16 HBs-127D7 IgG1
sC no HBs-2C1 IgG1
sC no HBs-S1A IgG2a
sC no HBs-5F11 IgG2a
sC no HBs-20A2 IgG2b
sD S18 HBs-42B6 IgG1
sD S18 HBs-A13A2 IgG2b
sE S8 HBs-45E9 IgG3
실시예 2: HBV 트랜스제닉 마우스의 처리에서 항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 효능 평가목적: HBV 트랜스제닉 마우스의 처리에서 항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 효능 평가2.1 HBsAg의 변성-화학발광 정량분석의 확립
처리 후, 다수의 항체들이 혈청 중에 존재하였으며, 따라서 HBsAg의 측정은 항원-항체 복합체에 의해 방해될 수도 있다. 따라서, 항체로부터의 간섭 없이 HBsAg의 정량적인 측정 방법을 확립시킬 필요가 있다. 발명자들은 항체로부터의 간섭을 배제하고 HBsAg의 정확한 정량분석을 수행하기 위해서 변성 방법에 의해 상기 항원-항체 복합체를 샘플 중에 용해시켰다.
2.1.1 반응 플레이트의 제조
마우스 단클론 항체 HBs-45E9를 pH 7.4 20 mM PB 완충제(Na2HPO4/NaH2PO4 완충제, 50 mM의 최종 농도, pH 7.4)로 2 ㎍/㎖의 최종 농도로 희석하고; 96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰에, 100 ㎕ 코팅 용액을 가하고, 상기 코팅을 2 내지 8 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 수행하고, 이어서 37 ℃에서 2 시간 동안 수행하였다. 상기 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈20)으로 1 회 세척하고; 이어서 200 ㎕의 차단 용액(pH 7.4, 20% 소 태아 혈청 및 1% 카제인을 함유하는 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 완충제)을 각 웰에 가하고, 상기 차단을 37 ℃에서 2 시간 동안 수행하고; 상기 차단 용액을 버렸다. 건조 후에, 상기 플레이트를 알루미늄 호일 주머니에 패키징하고, 추후의 사용을 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
2.1.2 HBsAg의 변성-화학발광 정량분석
샘플 희석: 마우스 혈청을 20% 갓난 송아지 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 2 개의 구배 농도, 즉 1:30 및 1:150으로 희석하였다.
샘플 변성: 15 ㎕의 상기 희석된 샘플을 7.5 ㎕의 변성 완충제(15% SDS, 20 mM PB7.4에 용해됨)와 혼합하고, 상기 혼합된 용액을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하고, 이어서 90 ㎕ 중화 완충제(4% CHAPS, 20 mM PB7.4에 용해됨)를 상기 혼합된 용액에 가하고, 생성 용액을 균질하게 혼합하였다.
샘플 반응: 100 ㎕의 상기 변성 처리에 의해 획득된 혼합된 용액 샘플을 상기 반응 플레이트에 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 60 분간 배양기에 넣었다.
효소 표지 반응: 샘플 반응 단계를 마친 후에, 상기 화학발광 반응 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1%트윈20)으로 5 회 세척하고, 100 ㎕ HBs-A6A7-HRP 용액(베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드로부터 구입)을 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 60 분간 배양기에 두었다.
발광 반응 및 측정: 효소 표지 반응 단계를 마친 후에, 상기 화학발광 반응 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1%트윈20)으로 5 회 세척하고, 발광 용액(베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드로부터 구입)을 빛의 세기를 측정하기 위해 가하였다.
시험하려는 샘플 중 HBsAg 농도의 획득: 표준 물질을 동일한 실험에 사용하였으며, 표준 곡선을 상기 표준 물질의 결과와 함께 플롯팅하고(상기 빛의 세기 값 및 농도 값의 선형 회귀); 상기 표준 곡선에 따라, 상기 시험하려는 샘플 중 HBsAg 농도를 계산에 의해 획득하였다.
2.2 HBV DNA의 실시간 형광 정량분석
HBV DNA의 실시간 형광 정량분석 키트를 샹하이 케후아 바이오엔지니어링 캄파니 리미티드(SHANGHAI KEHUA BIO-ENGINEERING CO.,LTD.)로부터 구입하였으며, HBV DNA의 실시간 형광 정량분석을 상기 키트의 설명서에 따라 수행하였다.
2.3 HBV 트랜스제닉 마우스의 처리에서 항-HBsAg 마우스 단클론 항체의 효능
실시예 1에서 획득된 25 개 항체를 HBV 트랜스제닉 마우스의 미정맥에 20 ㎎/㎏의 단일 용량으로 주사하였다. 식염수(0.9% NS)를 주사한 HBV 트랜스제닉 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다. 각 그룹은 4 마리의 HBV 트랜스제닉 마우스를 포함하였으며, 두 마리는 수컷이고 다른 두 마리는 암컷이었다. 마우스 혈액을 안와 정맥총으로부터 채혈하고, 마우스 혈청 중 HBsAg 및 HBV DNA 수준을 모니터하였다.
결과를 도 1에 도시하였다. 상기 결과는 HBV 트랜스제닉 마우스를 상이한 에피토프들에 대한 5 개의 항-HBsAg 마우스 단클론 항체 그룹으로 처리한 후에, sA 및 sD 그룹의 항체가 현저한 바이러스 제거 효과를 나타내었고; HBsAg 및 HBV DNA 수준이 상기 2 개의 항체 그룹을 사용한 처리 그룹으로부터의 마우스의 혈청에서 현저하게 감소하였으며; 다른 3 개의 항체 그룹으로 처리후, HBsAg 및 HBV DNA 수준이 마우스 혈청에서 그다지 감소하지 않았음을 나타내었다. 상기 sA 및 sD 그룹의 항체들 중에서, 혈청 중 HBsAg 및 HBV DNA 수준은 sD 그룹의 항체로 처리한 경우에 비해 sA 그룹의 항체로 처리한 후 더 큰 정도로 감소하였으며, 가장 긴 억제 지속기간을 갖는 4 개의 항체(각각 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5)는 sA 그룹의 항체에 속하였다.
실시예 3: HBV 트랜스제닉 마우스의 처리에서 sA 그룹의 마우스 단클론 항체의 효능 및 부작용
목적: HBV 트랜스제닉 마우스의 처리에서 sA 그룹의 마우스 단클론 항체의 효능 및 부작용 평가, 단일 용량의 항체로 처리 후 바이러스의 유효 억제 지속기간의 모니터링 및 ALT의 모니터링.
실시예 2에서 선별된 바와 같이, 최상의 치료 효과를 갖는 4 개 항체 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5를 상기 실험을 위해 선택하였으며, HBV 트랜스제닉 마우스의 미정맥에 20 ㎎/㎏의 단일 용량으로 주사하였다. 식염수(0.9% NS)로 처리한 HBV 트랜스제닉 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였으며, 위내 경로에 의해 투여된 3.2 ㎎/㎏/d의 엔테카비어(ETV)로 처리한 HBV 트랜스제닉 마우스를 유효 약물 대조군으로서 사용하였다. 각 그룹은 4 마리의 HBV 트랜스제닉 마우스를 포함하였으며, 두 마리는 수컷이고 다른 두 마리는 암컷이었다. 마우스 혈액을 안와 정맥총으로부터 채혈하고, 마우스 혈청 중 HBsAg, HBV DNA, ALT 수준을 모니터하였다.
실시예 2에 개시된 방법에 따라, HBsAg 및 HBV DNA 수준을 측정하고, ALT를 베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드에 의해 제공된 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 분석 키트에 의해 측정하였다.
HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5, 0.9% NS 또는 엔테카비어(ETV)로 HBV 트랜스제닉 마우스를 처리한 결과를 도 2 및 도 4에 나타내었다(상기 값들은 각 실험 그룹의 4 마리 마우스의 평균값들이었다). 상기 결과는 단일 용량의 단클론 항체 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, 또는 HBs-E13C5로 처리후, HBsAg 및 HBV DNA 수준이 HBV 트랜스제닉 마우스의 혈청 중에서 현저하게 감소함을 가리켰으며, 여기에서 상기 항체 처리 그룹은 HBV DNA 수준의 감소에 관하여 ETV 처리 그룹에 필적하였다. 대조적으로, HBsAg 수준은 ETV 처리 그룹의 마우스의 혈청에서 그다지 감소하지 않은 반면, HBsAg 수준은 항체 처리 그룹의 혈청 중에서 현저하게 감소하였다. 또한, 상기 항체들 중 임의의 항체에 의한 처리 동안 ALT의 감소는 관찰되지 않았다.
실시예 4: HBs-E6F6의 주사후 HBV DNA 및 HBsAg의 동적인 변화
목적: 단클론 항체가 최대 효능을 발휘하는데 걸리는 최단 시간에 대한 연구
최상의 효과를 갖는 마우스 단클론 항체 HBs-E6F6을 실시예 3에 사용된 4 개의 항체 중에서 선택하고 HBV 트랜스제닉 마우스의 미정맥에 20 ㎎/㎏의 단일 용량으로 주사하였다. 실험에서, 4 마리의 수컷 마우스를 사용하였으며, 마우스 혈청 중 HBV DNA 및 HBsAg의 동적인 변화를 모니터하였다.
실시예 2에 개시된 방법에 따라, 혈청 중 HBsAg 및 HBV DNA 수준을 측정하였다.
결과를 도 5에 나타내었다. 결과는 마우스 혈청 중 HBsAg 및 HBV DNA 수준이 상기 주사후 1 내지 24 시간 이내에 최대 억제 수준으로 감소함을 가리켰다.
실시예 5: 인간-마우스 키메릭 항체 HBs-E6F6 및 HBs-E7G11의 치료 효과의 평가
목적: 키메릭 항체의 치료 효과의 평가
HBs-E6F6 및 HBs-E7G11 항체의 Igv 유전자를 인간 항체 불변 영역을 암호화하는 Igc 유전자에 결합시키고, 키메릭 항체 HBs-E6F6 및 키메릭 항체 HBs-E7G11을 CHO 세포에서의 재조합 발현 및 정제를 통해 획득하였다. 상기 키메릭 항체들을 HBV 트랜스제닉 마우스의 미정맥에 10 ㎎/㎏의 단일 용량으로 주사하였다. 마우스 혈청 중 HBV DNA 및 HBsAg의 동적인 변화를 모니터하였다. 결과를 도 6에 나타내었다. 결과는 상기 키메릭 항체 HBs-E6F6 및 상기 키메릭 항체 HBs-E7G11이 모두 마우스에서 HBsAg 및 HBV DNA를 유효하게 제거할 수 있음을 가리켰다.
실시예 6: sA 그룹의 항체에 의해 인식된 에피토프의 확인
목적: sA 그룹의 항체에 의해 인식된 에피토프의 확인 및 상기 인식된 코어 아미노산 서열의 측정
6.1 pC149-SEQ 클론의 제작
HBcAg를 담체 단백질로서 사용한 경우, 완전 길이 HBcAg 단백질 또는 그의 단편(예를 들어 HBcAg 단백질의 N-말단 aa 1-149)을 사용할 수도 있다(문헌[Yang Haijie et al., Construction of Peptide Display Vector Based on HBV Core Protein, JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE), 2004.05, Vol. 43, No. 4]을 참조하시오). 이 실험에서, HBcAg 단백질의 단편(aa 1-149)을 담체 단백질로서 사용하여 일련의 클론을 제작하였다.
HBcAg aa79-81을 암호화하는 서열을 부위-지향 돌연변이에 의해 HBcAg 단백질의 단편(aa 1-149)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로부터 결실시켰으며, 2 개의 링커를 상기 결실부의 2 개 단부에 별도로 도입시키고, BamHI/EcoRI 절단 부위를 상기 두 링커 사이로 설계하고, 따라서 담체 단백질 C149/mut를 암호화하는 서열(C149/mut의 아미노산 서열을 서열번호 43에 설명하였으며, 상기는 HBc (1-78)-G4SG4T-GS-G4SG4-HBc (82-149)의 구조를 가졌고; C149/mut에서, HBcAg의 3 개 아미노산(aa 79-81)이 Gly가 풍부한 가요성 링커, G4SG4T-GS-G4SG4로 교체되었다)을 획득하였다. C149/mut를 암호화하는 서열을 pTO-T7 원핵생물 발현 벡터(Luo Wenxin, et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57)내로 클로닝시켜, 재조합 플라스미드 pC149/mut를 획득하였으며, 이는 단백질 C149/mut를 암호화하였다. 나중에, BamHI/EcoRI 절단 부위를 사용함으로써, 관심 폴리펩타이드(도 7에서 SEQ로 나타냄)를 암호화하는 서열을 상기 가요성 링커들 사이에 클로닝시켜 재조합 벡터 pC149-SEQ[재조합 단백질 C149-SEQ(담체 단백질 C149/mut 및 관심 폴리펩타이드 SEQ를 포함한다)를 암호화하였다]를 획득하였다. 상기 재조합 벡터 pC149-SEQ의 클론 설계 및 구조를 도 7에 나타내었다.
표 4에 나타낸 9 개 폴리펩타이드의 유전자 서열들을 별도로 상기 재조합 플라스미드 pC149/mut에 연결시켜 9 개의 pC149-SEQ 재조합 벡터(pC149-SEQ1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11)(각각 재조합 단백질 C149-SEQ1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11를 암호화하였다)를 획득하였다.
C149/mut로 나타내는 관심 폴리펩타이드들
폴리펩타이드명 폴리펩타이드 위치 아미노산 서열
SEQ1 HBsAg-aa119-aa125 GPCKTCT
SEQ3 HBsAg-aa113-aa127 STTTSTGPCKTCTTP
SEQ4 HBsAg-aa115-aa125 TTSTGPCKTCT
SEQ5 HBsAg-aa121-aa129 CKTCTTPAQ
SEQ6 HBsAg-aa113-aa135 STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
SEQ8 HBsAg-aa113-aa121 STTTSTGPC
SEQ9 HBsAg-aa117-aa123 STGPCKT
SEQ10 HBsAg-aa121-aa124 CKTC
SEQ11 HBsAg-aa123-aa137 TCTTPAQGNSMFPAQ
6.2 C149-SEQ 단백질의 발현 및 정제재조합 단백질의 발현 및 정제를 일례로서 C149-SEQ6을 사용하여 개시하였다.(6.2.1) 고효율 발현 균주의 획득:
6.1에 개시된 방법에 따라, 관심 벡터 pC149-SEQ9의 벡터를 제작하고, DNA 서열분석에 의해 확인한 후에, 상기 관심 벡터를 이 콜라이 ER2566 균주(이 콜라이, ER2566)내로 형질전환시켜 발현 균주를 획득하였다.
(6.2.2) C149-SEQ6 단백질의 발현:
상기 발현 균주를 삼각 플라스크(500 ㎖)에 시딩하고, OD가 약 1.0일때까지 37 ℃에서 진탕 테이블상에서 배양하였다. 아이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.5 mM의 최종 농도로 가하고, 25 ℃에서 6 시간 동안 진탕하에 발현을 유도하였다.
(6.2.3) C149-SEQ6 단백질의 정제:
(6.2.3.1) 세균의 초음파처리:
6.2.2의 세균을 원심분리에 의해 수거하고; 세균에 초음파처리를 가하였으며, 상기 초음파처리 완충제는 20 mM 포스페이트 완충제(pH 6.0) + 300 mM NaCl 성분을 포함하였다.
(6.2.3.2) 관심 단백질의 1차 정제:
관심 단백질들은 내열성이므로, 상기 초음파처리된 혼합물을 65 ℃ 수욕에 30 분간 넣고, 원심분리후 상등액을 수거하였다. 상기 상등액을 1:1의 부피비로 포화된 암모늄 설페이트 용액에 가하고, 원심분리후 침전물을 수거하였다. 적합한 부피의 완충제를 가하여 상기 침전물을 재현탁시켜 첫째로 정제된 관심 단백질을 획득하였으며, 여기에서 상기 완충제는 20 mM 포스페이트 완충제(pH 7.4) + 150 mM NaCl을 포함하였다.
(6.2.3.3) 관심 단백질의 크로마토그래피 정제:
6.2.3.2에서 획득된 단백질을 세파로스 4FF(GE) 분자체 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 정제된 관심 단백질을 획득하였다. 상기 정제된 관심 단백질에 SDS-PAGE를 수행하고 상기 관심 단백질의 입자들의 조립 상태를 투과형 전자 현미경(TEM)에 의해 관찰하였다.
도 8은 상기 9 개 재조합 단백질의 SDS-PAGE 및 TEM 결과를 나타내었다. 상기 결과는 상기 9 개 재조합 단백질이 95% 이상의 순도를 가지며 균일한 크기의 단백질 입자들로 조립될 수 있음을 가리켰다.
6.2 상기 9 개 재조합 단백질과 sA 그룹의 항체와의 반응성 평가
6.2.1 반응 플레이트의 제조
실시예 1-1.2에 개시된 방법에 따라, 반응 플레이트를 제조하였으며, 코팅 항원은 관심 폴리펩타이드를 제공하는 상기 9 개 재조합 단백질이다.
6.2.2 ELISA에 의한 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5와 상기 재조합 단백질과의 반응성의 측정
실시예 1-1.2에 개시된 방법에 따라, HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5와 상기 재조합 단백질과의 반응성을 측정하였다.
6.2.3 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5에 의해 인식된 에피토프에 대한 분석
6.2.2의 ELISA 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 결과는 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5가 폴리펩타이드 SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ5, SEQ6, SEQ10을 제공하는 재조합 단백질과 양호한 반응성을 갖지만, 폴리펩타이드 SEQ8, SEQ9, SEQ11을 제공하는 재조합 단백질과는 반응성을 갖지 않음을 가리켰다. 이들 폴리펩타이드의 서열 분석은 상기 폴리펩타이드 SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ5, SEQ6, SEQ10의 공통적인 특징이 HBsAg aa121-aa124를 포함함에 있으며, SEQ8, SEQ9, SEQ11의 공통적인 특징은 완전 HBsAg aa121-124를 포함하지 않음에 있음을 보였다. 따라서, HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5가 동일한 에피토프를 인식하고, 이들에 의해 인식된 가장 짧은 에피토프의 아미노산 서열은 HBsAg aa121-124, 즉 CKTC라는 결론을 내릴 수 있었다. ELISA 결과는 상기 재조합 단백질 C149-SEQ1 및 3-6이 필적하는 항체와의 반응성을 가지며, C149-SEQ10보다 높은 반응성을 가짐을 보였다. 따라서, 상기 폴리펩타이드 SEQ1 및 3-6이 항체 HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5에 의해 인식되는 바람직한 에피토프 펩타이드였다. 또한, SEQ1의 서열은 SEQ3-6보다 짧기 때문에, SEQ1이 바람직한 코어 에피토프로서 간주되었다.
실시예 7: 에피토프 펩타이드 SEQ1의 아미노산 돌연변이에 대한 HBs-E6F6 및 HBs-E7G11의 민감성에 대한 분석
SEQ1(GPCKTCT)에 아미노산 점-돌연변이를 가하고, 7 개의 돌연변이체를 제조하였다. 상기 7 개 돌연변이 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 표 5에 나타내었다. 실시예 6에 개시된 방법에 따라, 상기 돌연변이 폴리펩타이드 및 C149/mut를 포함하는 재조합 단백질들을 제조하였으며, HBs-E6F6 및 HBs-E7G11을 상기 7 개 폴리펩타이드와 그들의 반응성에 대해 평가하였다.
돌연변이 폴리펩타이드의 아미노산 서열
명칭 돌연변이된 아미노산 아미노산 서열
M1 P120S GSCKTCT
M2 P120T GTCKTCT
M3 C121S GPSKTCT
M4 K122R GPCRTCT
M5 T123I GPCKICT
M6 C124S GPCKTST
M7 C121S/C124S GPSKTST
SEQ1 HBsAg aa119-aa125 GPCKTCT
상기 결과를 도 10에 나타내었다. 상기 결과는 돌연변이 M1(P120S), 돌연변이 M2(P120T), 돌연변이 M4(K122R)이 항체 HBs-E6F6 및 HBs-E7G11에 대한 결합에 관하여 에피토프 펩타이드 SEQ1에 필적하는 반면, 상기 항체들에 대한 다른 돌연변이체의 결합은 현저하게 감소됨을 가리켰다. 상기 결과는 P120S, P120T, K122R 돌연변이가 HBs-E6F6 및 HBs-E7G11과 에피토프 SEQ1과의 반응성에 영향을 미치지 않는 반면, C121S, C124S, C121S/C124S, T123I 돌연변이는 HBs-E6F6 및 HBs-E7G11과 에피토프 SEQ1과의 반응성을 현저하게 감소시킴을 가리켰다.실시예 8: 에피토프 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질의 제조 및 그의 면역원성의 평가8.1 에피토프 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질의 제조
실시예 6에 개시된 방법에 따라, C149/mut를 담체 단백질로서 사용하여 에피토프 펩타이드 SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ6, SEQ7을 제공하였으며, 여기에서 SEQ3, SEQ4, SEQ6, SEQ7은 바람직한 코어 에피토프 SEQ1(즉 코어 에피토프 SEQ1을 포함하는)의 N 및/또는 C-말단의 연장에 의해 획득된 폴리펩타이드였고, 상기로부터 뉴클레오캡시드-유사 입자(CLP)를 형성할 수 있는 5 개의 재조합 단백질들(면역화를 위한 항원으로서 사용됨)을 제조하였다.
실시예 6에 개시된 바와 같이, 5 개의 재조합 단백질 C149-SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ6, SEQ7을 제조하였으며, 상기 5 개의 재조합 단백질에 SDS-PAGE를 수행하고 이를 투과형 전자 현미경에 의해 관찰하였다. 상기 결과를 도 11에 나타내었다. 상기 결과는 상기 5 개 재조합 단백질이 95% 이상의 순도를 가지며 균일한 크기의 단백질 입자로 조립될 수 있음을 가리켰다.
8.2 에피토프 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질의 면역원성의 평가
8.2.1 마우스의 면역화
BALB/C 마우스를 상기 5 개 재조합 단백질 및 담체 단백질 C149/mut(대조군으로서)로 각각 면역시켰다. 면역항원보강제는 수산화 알루미늄 항원보강제였으며, 면역화 용량은 3 ㎍/용량이었고, 면역화 경로는 측부 뒷다리 허벅지의 근육내 주사이었으며, 면역 과정은 하기와 같았다: 추가 면역화를 1차 면역화후 매 2주마다 수행하였으며; 면역화를 4 회 수행하였다.
8.2.2 혈청 중 항-HBs 항체 역가의 측정
8.2.2.1 반응 플레이트의 제조
실시예 1-1.2에 개시된 방법에 따라, 상기 반응 플레이트를 제조하였으며, 상기 코팅 항원은 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 B형 간염 표면 항원 단백질(HBsAg)이었다.
8.2.2.2 혈청 중 항-HBs 항체 역가의 ELISA
샘플 희석: 마우스 혈청을 20% 갓난 송아지 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 7 개 구배 농도, 즉 1: 100, 1: 500, 1:2500, 1: 12500, 1: 62500, 1: 312500, 1:1562500으로 희석하였다.
샘플 반응: 100 ㎕의 희석된 샘플을 코팅된 반응 플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 30 분간 배양기에 넣었다.
효소 표지 반응: 샘플 반응을 마친 후에, 상기 ELISA 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1%트윈20)으로 5 회 세척하고, 100 ㎕ GAM-HRP 용액을 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 30 분간 배양기에 두었다.
발색 반응: 효소 표지 반응 후에, 상기 ELISA 플레이트를 PBST 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1%트윈20)으로 5 회 세척하고, 50 ㎕ TMB 발색 시약(베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드로부터 구입)을 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 15 분간 배양기에 두었다.
정지 반응 및 값 판독: 상기 발색 반응 단계를 마친 후에, 50 ㎕ 정지 완충제(베이징 완타이 바이올로지 파머시 캄파니 리미티드로부터 구입)를 상기 ELISA 플레이트의 각 웰에 가하고, OD450/630 값을 각 웰에 대해 ELIASA로 판독하였다.
혈청 중 항-HBsAg 항체 역가의 계산: 0.2 내지 2.0의 판독치를 갖는 샘플들의 희석 인자 및 상기 판독치와 함께 회귀 곡선을 플롯팅하고, 상기 판독치가 배경값의 두배인 상기 샘플의 희석 인자를 계산하고, 상기 희석 인자를 혈청 중 항-HBsAg 항체 역가로서 사용하였다.
8.2.3 혈청 중 항-C149/mut 항체 역가의 측정
8.2.3.1 반응 플레이트의 제조
실시예 1-1.2에 개시된 방법에 따라, 반응 플레이트를 제조하였으며, 코팅용 항원은 융합 담체 단백질 C149/mut였다.
8.2.3.2 ELISA에 의한 혈청 중 항-C149/mut 항체 역가의 측정
실시예 8.2.2.2에 개시된 방법에 따라, 샘플 희석, 샘플 반응, 효소 표지 반응, 발색 반응, 정지 반응 및 값 판독을 수행하고, 혈청 중 항-C149/mut 항체 역가를 계산하였다.
8.2.4 에피토프 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질의 면역원성 분석
상기 단계들을 수행함으로써, 혈청 중 항-HBsAg 항체 역가 및 항-C149/mut 항체 역가를 획득하였다. 상기 결과를 도 12에 나타내었다. 상기 결과는 상기 에피토프 펩타이드 SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ6, SEQ7을 포함하는 재조합 단백질이 BALB/C 마우스에서 항-HBsAg의 높은 역가를 유도한 반면, C149/mut는 단독으로 항-HBsAg의 높은 역가를 유도할 수 없음을 가리켰다.
실시예 9: 마우스 혈액-유래 항-SEQ6 다클론 항체의 치료 효과의 평가
9.1 마우스 혈액-유래 항-SEQ6 다클론 항체의 제조
9.1.1 마우스의 면역화
실시예 8-8.2.1에 개시된 방법에 따라, BALB/C 마우스를 SEQ6을 포함하는 재조합 단백질(C149-SEQ6)인 면역원으로 면역화시켰다.
9.1.2 마우스 혈액-유래 항-SEQ6 다클론 항체의 정제
면역 과정을 완료한 후, 마우스의 혈청 중 항-HBsAg 항체의 역가는 높은 수준에 도달하였으며, 안와 정맥총으로부터 수회 채혈하였다. 암모늄 설페이트 침전 및 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제 후에, 정제된 다클론 항체를 획득하였다.
9.2 마우스 혈액-유래 항-SEQ6 다클론 항체의 치료 효과의 평가
마우스 혈액-유래 항-SEQ6 다클론 항체를 HBV 트랜스제닉 마우스의 미정맥에 주사하고, 혈청 중 HBV DNA 및 HBsAg의 변화를 모니터하였다. 결과를 도 13에 나타내었다. 상기 결과는 C149-SEQ6에 의한 마우스의 면역화에 의해 획득된 다클론 항체가 HBV 트랜스제닉 마우스에서 HBV DNA 및 HBsAg 수준을 현저하게 감소시켰으며, HBV 제거에 유효함을 가리켰다.
실시예 10: HBV 트랜스제닉 마우스의 처리에서 재조합 단백질의 효과
10.1 마우스의 면역화
HBV 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 상기 실시예 8에서 획득한 5 개 재조합 단백질(C149-SEQ1, C149-SEQ3, C149-SEQ4, C149-SEQ6, C149-SEQ7)의 치료 효과를 평가하고, 담체 단백질 C149/mut를 대조용으로서 사용하였다. 면역항원보강제는 수산화 알루미늄 항원보강제였으며, 면역화 용량은 12 ㎍/용량이었고, 면역화 경로는 측부 뒷다리 허벅지의 근육내 주사이었으며, 면역 과정은 하기와 같았다: 추가 면역화를 1차 면역화후 2주 수행한 다음, 매주 추가 면역화를 수행하였다, 즉 면역화를 0, 2, 3, 4, 5 주째에 수행하였다, 즉 면역화를 5 회 수행하였다.
10.2 혈청 중 항체 역가의 측정
실시예 8-8.2.2 및 8.2.3에 개시된 방법에 따라, 항-HBsAg 및 항-C149/mut의 혈청 항체 역가를 측정하고, 마우스의 혈청 중 바이러스 지수, HBV DNA 및 HBsAg 수준을 모니터하였다.
10.3 재조합 단백질의 치료 효과에 대한 분석
결과를 도 14에 나타내었다. 상기 결과는 재조합 단백질의 면역요법을 받은 그룹에서, 항-HBsAg 및 항-C149/mut가 마우스의 혈청 중에서 검출되고, 마우스의 혈청 중 HBV DNA 및 HBsAg 수준이 상이한 정도로 감소함을 가리켰다. 대조적으로, 대조군에서, 마우스의 혈청 중 항-HBsAg가 생성되지 않았으며, 혈청 중 HBV DNA 및 HBsAg 수준이 감소하지 않았다. 상기 예는 본 발명에 의해 확인된 에피토프 및 에피토프 펩타이드가 HBV 감염의 치료에 유효한 표적임을 나타낸다. 이들 에피토프 및 에피토프 펩타이드를 기본으로 생성된 재조합 단백질은 만성 HBV 감염의 치료에 가능성을 갖는다. 특히, 에피토프 펩타이드 SEQ1-SEQ7을 포함하는 재조합 단백질들을 단백질 백신으로서 사용하여 HBV 트랜스제닉 마우스에서 HBV에 대한 면역관용 상태를 변화시키고, 유효하고, 특이적이며 치료학적인 항-HBV 면역 반응을 유도할 수 있다.
실시예 11: 상이한 담체 단백질 및 SEQ6를 기본으로 하는 재조합 단백질의 제작 및 평가
11.1 3 개의 융합 발현 벡터의 제작
실시예 6에 개시된 방법에 따라, 3 개의 담체 단백질(각각 C149/mut (서열번호 43), C183/mut (서열번호 44), WHC149/mut (서열번호 45))을 제작하였다. C149/mut를 HBV 코어 단백질의 N-말단에서 149 아미노산 잔기를 가공하여 획득하고, C183/mut를 완전 길이 HBV 코어 단백질의 183 아미노산 잔기를 가공하여 획득하고, WHC149/mut를 우드척 간염 바이러스 코어 단백질의 N-말단에서 149 아미노산 잔기를 가공하여 획득하였다(상기 가공 방법은 6.1에 개시되었다). SEQ6을 상기 3 개의 벡터에 연결시켜 각각 재조합 단백질 C149-SEQ6, C183-SEQ6, 및 WHC149-SEQ6을 획득하였다.
11.2 3 개의 상이한 담체 재조합 SEQ6 백신의 발현 및 정제
6.2에 개시된 방법에 따라, 3 개의 재조합 단백질(C149-SEQ6, C183-SEQ6, 및 WHC149-SEQ6)을 발현 및 정제하였다. 상기 획득된 관심 단백질에 SDS-PAGE를 수행하고, 상기 단백질 입자의 조립 상태를 투과형 전자 현미경에 의해 확인하였다. 상기 결과를 도 15에 나타내었다. 상기 결과는 상기 획득된 3 개의 재조합 단백질이 95% 이상의 순도를 가지며, 균일한 크기의 단백질 입자로 조립될 수 있음을 가리켰다.
11.3 HBV 트랜스제닉 마우스의 처리에서 상기 3 개 재조합 단백질의 효과
HBV 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여, 단백질 백신으로서 11.2에서 획득된 상기 3 개의 재조합 단백질의 치료 효과를 평가하였다. 면역항원보강제는 수산화 알루미늄 항원보강제였으며, 면역화 용량은 12 ㎍/용량이었고, 면역 과정은 하기와 같았다: 추가 면역화를 1차 면역화후 2주 수행한 다음, 매주 추가 면역화를 수행하였다, 즉 면역화를 0, 2, 3, 4, 5 주째에 수행하였다, 즉 면역화를 5 회 수행하였다.
실시예 8-8.2.2 및 8.2.3에 개시된 방법에 따라, 항-HBsAg 및 항-담체의 혈청 항체 역가를 측정하고, 마우스의 혈청 중 바이러스 지수, HBV DNA 및 HBsAg 수준을 모니터하였다.
결과를 도 14에 나타내었다. 상기 결과는 재조합 단백질의 면역요법을 받은 그룹에서, 항-HBsAg 및 항-담체 항체가 마우스의 혈청 중에서 검출되고, 마우스의 혈청 중 HBV DNA 및 HBsAg 수준이 상이한 정도로 감소함을 가리켰다. 대조적으로, 대조군에서, 마우스의 혈청 중 항-HBsAg가 생성되지 않았으며, 혈청 중 HBV DNA 및 HBsAg 수준이 감소하지 않았다. 상기 예는 상이한 담체 단백질들을 사용하여 본 발명에 의해 확인된 에피토프 및 에피토프 펩타이드를 제공할 수 있으며, 이로부터 생성된 재조합 단백질이 만성 HBV 감염의 치료에 가능성을 가짐을 나타내었다. 상기와 같은 재조합 단백질들을 단백질 백신으로서 사용하여 HBV 트랜스제닉 마우스에서 HBV에 대한 면역관용 상태를 변화시키고, 유효하고, 특이적이며 치료학적인 항-HBV 면역 반응을 유도할 수 있다.
유사하게, C149/mut (서열번호 43), C183/mut (서열번호 44), WHC149/mut (서열번호 45), 및 SEQ1-5, 7 및 10을 기본으로, 재조합 단백질 C149-SEQ1-5, 7, 10; C183-SEQ1-5, 7, 10; 및 WHC149-SEQ1-5, 7, 10을 또한 설계하고 제작하였다. 이들 재조합 단백질의 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예 12: CRM197 또는 그의 단편을 기본으로 한 재조합 단백질의 제작 및 발현
실시예에서, 일련의 재조합 단백질을 CRM197 또는 그의 단편 및 SEQ6을 기본으로 설계하고 제작하였다.
CRM197의 아미노산 서열은 서열번호 42(535 개 아미노산으로 이루어진다)에 설명된다. CRM197의 예시적인 단편은, CRM197의 N-말단에서 389 아미노산으로 이루어지는 CRM 389이다. CRM197의 또 다른 예시적인 단편은 CRM197의 N-말단에서 190 아미노산으로 이루어지는 CRM A이다.
도 17에 도시된 바와 같이, SEQ6을 링커를 통해 CRM197, CRM389 또는 CRMA의 C-말단에 결합시켰으며, 여기에서 상기 링커의 아미노산 서열은 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 46)이었다. 상기 링커의 주요 작용은 상기에 의해 결합된 2 개 펩타이드의 비교적 독립적인 폴딩을 촉진하여 높은 생물 활성을 획득하는 것이었다. 상기와 같이 획득된 재조합 단백질을 각각 CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6 및 CRMA-SEQ6으로서 나타내었다.
CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6 및 CRMA-SEQ6을 암호화하는 관심 유전자를 제작하였으며, 상기 관심 유전자들을 pTO-T7 원핵생물 발현 벡터(Luo Wenxin et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57)에 별도로 연결시키고, ER2566 세균내로 형질환시켰으며; 플라스미드를 추출하고, 관심 유전자 단편을 포함하는 양성 발현 클론을, NdeI/SalI 효소 절단에 의해 확인후 획득하였다.
3 개의 재조합 단백질 CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6 및 CRMA-SEQ6을 실시예 6-6.2에 개시된 방법에 따라 발현 및 정제하고, 상기 3 개의 재조합 단백질의 치료 효과를 실시예 11에 개시된 방법에 의해 평가하였다.
유사하게, CRM197 또는 그의 단편뿐만 아니라 SEQ1-5, 7 및 10을 기본으로, 재조합 단백질 CRM197-SEQ1-5, 7, 10; CRM389-SEQ1-5, 7, 10; 및 CRMA-SEQ1-5, 7, 10을 또한 설계하고 제작하였다. 이들 재조합 단백질의 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
본 발명의 특정한 실시태양들을 상세히 개시하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 상기 개시된 모든 교시들에 따라, 다양한 변형 및 변화를 일반적으로 개시된 바와 같은 본 발명의 진의 또는 범위로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있고, 상기와 같은 변형 및 변화가 본 발명의 범위 내에 있음을 알 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 의해 제공된다.
중국 미생물 균주 보관기관(China Center for Type Culture Collection (CCTCC)) CCTCCC201270 20120607 중국 미생물 균주 보관기관(China Center for Type Culture Collection (CCTCC)) CCTCCC201271 20120607 중국 미생물 균주 보관기관(China Center for Type Culture Collection (CCTCC)) CCTCCC201272 20120607 중국 미생물 균주 보관기관(China Center for Type Culture Collection (CCTCC)) CCTCCC201273 20120607
<110> XIAMEN UNIVERSITY <120> Polypeptides and antibodies for treating HBV infection and related diseases <130> IEC120078 <150> CN 2012-10190329 <151> 2012-06-11 <160> 97 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ1 <400> 1 Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ2 <400> 2 Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ3 <400> 3 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ4 <400> 4 Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ5 <400> 5 Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 1 5 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ6 <400> 6 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro 20 <210> 7 <211> 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Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys 405 410 415 Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys 420 425 430 Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr 435 440 <210> 89 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM389-SEQ10 <400> 89 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Ser Cys Lys Thr Cys 405 <210> 90 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRMA-SEQ1 <400> 90 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Cys 195 200 205 Lys Thr Cys Thr 210 <210> 91 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRMA-SEQ2 <400> 91 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Cys 195 200 205 Arg Thr Cys Thr 210 <210> 92 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRMA-SEQ3 <400> 92 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr Thr 195 200 205 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro 210 215 220 <210> 93 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRMA-SEQ4 <400> 93 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Ser 195 200 205 Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr 210 215 <210> 94 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRMA-SEQ5 <400> 94 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Lys Thr 195 200 205 Cys Thr Thr Pro Ala Gln 210 <210> 95 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRMA-SEQ6 <400> 95 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 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Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 225 230 235 240 Asn Cys Thr <210> 97 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRMA-SEQ10 <400> 97 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Lys Thr 195 200 205 Cys

Claims (28)

  1. 환자에게서 HBV DNA 또는 HBsAg의 혈청 수준을 감소시킴으로써 HBV에 감염된 환자를 치료하는 용도로 사용하기 위한 약학 조성물로써, 상기 약학 조성물은 하기를 포함하는 약학 조성물:
    (a)단리된 에피토프 펩타이드
    (ⅰ)
    (1) HBsAg 단백질의 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 또는 7의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열 또는
    (2) 상기 (1)의 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 잔기의 보존적 치환을 가지며 상기 (1)의 아미노산 서열의 생물학적 작용은 유지하는 아미노산 서열로 이루어지며;
    HBsAg 단백질의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기를 포함하는, 에피토프 펩타이드; 또는
    (ⅱ) 서열번호 5에 명시된 아미노산으로 이루어지거나, GSCKTCT 또는 GTCKTCT의 아미노산 서열로 이루어지는, 에피토프 펩타이드;
    (b) 상기 (a)의 에피토프 펩타이드 및 담체 단백질을 포함하며, 천연 단백질 또는 그의 단편이 아닌, 재조합 단백질;
    (c) 상기 (a)의 에피토프 펩타이드 또는 상기 (b)의 재조합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 또는
    (d) 상기 (c)의 단린된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a)(ⅰ)(1)의 아미노산 서열은 하기 중 어느 하나로 이루어지는 서열인, 약학 조성물:
    (a) HBsAg 단백질의 119 - 125 번 위치의 아미노산 잔기;
    (b) HBsAg 단백질의 113 - 127 번 위치의 아미노산 잔기;
    (c) HBsAg 단백질의 115 - 125 번 위치의 아미노산 잔기;
    (d) HBsAg 단백질의 113 - 135 번 위치의 아미노산 잔기; 및
    (e) HBsAg 단백질의 111 - 148 번 위치의 아미노산 잔기.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 HBsAg 단백질은 서열번호 39에 명시된 아미노산 서열을 가지는, 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 HBsAg 단백질의 119 내지 125 번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 1 또는 2에 명시된 것과 같은, 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 에피토프 펩타이드는 서열번호 1-7로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 에피토프 펩타이드가 링커를 통하거나 링커를 통하지 않고 상기 담체 단백질에 결합되는, 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 담체 단백질이 CRM197 단백질 또는 그의 단편이고, 그리고 에피토프 펩타이드가 링커를 통하거나 링커를 통하지 않고 CRM197 단백질 또는 그의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는, 약학 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 CRM197 단백질의 단편이 CRM197의 aa 1-190 또는 aa 1-389를 포함하거나 이루어지는, 약학 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    담체 단백질이 HBcAg 또는 그의 단편이고, 상기 HBcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산이 상기 에피토프 펩타이드로 교체되고, 상기 에피토프 펩타이드가 HBcAg 또는 그의 단편에 링커를 통하거나 링커를 통하지 않고 결합되는, 약학 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 HBcAg의 단편이 HBcAg의 aa 1-149를 포함하거나 또는 이루어지는, 약학 조성물.
  11. 제 6 항에 있어서,
    상기 담체 단백질이 WHcAg 또는 그의 단편이고, 상기 WHcAg의 79 내지 81 번 위치의 아미노산이 에피토프 펩타이드로 교체되고, 상기 에피토프 펩타이드가 WHcAg 또는 그의 단편에 링커를 통하거나 링커를 통하지 않고 결합되는, 약학 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 WHcAg의 단편이 WHcAg의 aa 1-149를 포함하거나 또는 이루어지는, 약학 조성물.
  13. 제 6항에 있어서,
    서열번호 47-53, 56 및 58-97로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 약학 조성물.
  14. 제 7항에 있어서,
    상기 CRM197은 서열번호 42에 명시된 것과 같은 서열을 가지는, 약학 조성물.
  15. 제 9항에 있어서,
    HBcAg가 서열번호 40에 명시된 것과 같은 서열을 가지는, 약학 조성물.
  16. 제 11항에 있어서,
    WHcAg가 서열번호 41에 명시된 것과 같은 서열을 가지는, 약학 조성물.
  17. 제 6항에 있어서,
    상기 링커가 강성 링커 또는 가요성 링커인, 약학 조성물.
  18. 제 6항에 있어서,
    상기 링커는 (GGGGS)3인, 약학 조성물.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는 약학 조성물.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 항원보강제인, 약학 조성물.
  21. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 단백질 백신이며, 상기 조성물은 (a)의 에피토프 펩타이드 또는 (b)의 재조합 단백질, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 단백질 백신은 상기 에피토프 펩타이드 중 하나 이상을 포함하는, 약학 조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 에피토프 펩타이드는 분리되거나 나란하거나, 변형되거나 변형되지 않거나, 또는 다른 단백질에 결합되는, 약학 조성물.
  24. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 (c)의 핵산 또는 (d)의 백터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 핵산 백신인, 약학 조성물.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 핵산 백신은 DNA 또는 RNA를 포함하는, 약학 조성물.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 DNA 또는 RNA는 네이키드이거나 또는 전달 및/또는 보호 작용을 갖는 외피로 캡슐화된, 약학 조성물.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 외피는 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 렌티바이러스, 또는 레트로바이러스의 외피인, 약학 조성물.
  28. 제 21항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 항원보강제인, 약학 조성물.
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