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KR20180130534A - 암을 표적하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

암을 표적하는 키메라 항원 수용체 Download PDF

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KR20180130534A
KR20180130534A KR1020187030812A KR20187030812A KR20180130534A KR 20180130534 A KR20180130534 A KR 20180130534A KR 1020187030812 A KR1020187030812 A KR 1020187030812A KR 20187030812 A KR20187030812 A KR 20187030812A KR 20180130534 A KR20180130534 A KR 20180130534A
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seq
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nucleic acid
antigen
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프릿 엠. 차우다리
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유니버시티 오브 써던 캘리포니아
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Abstract

K13-vFLIP, MC159-vFLIP, cFLIP-L, cFLIP-p22, HTLV1-Tax 및 HTLV2-Tax로부터 선택된 하나 이상의 신호전달 단백질 및 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 세포를 포함하는, 조성물이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 CAR은 a) 세포외 항원 특이적 도메인, b) 막관통 도메인 및 c) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 c)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 공-자극 도메인을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 기재된 조성물을 사용하는 질환의 치료 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다.

Description

암을 표적하는 키메라 항원 수용체
연방 지원된 연구 또는 개발에 관한 서술
본 발명은 국립 건강 연구원에 의해 수여된 과제 번호 DE019811하에 정부 지원으로 실시되었다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은, 이의 내용이 참고로 그 전체가 편입되는 2016년 3월 29일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/314,864의 35 U.S.C. §19(e)하에 우선권의 이점을 주장한다.
발명의 분야
암 치료용 키메라 항원 수용체가 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에서 모든 공보는 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 편입되는 것으로 나타난 것처럼 동일한 정도로 참고로 편입된다. 하기 설명은 본 발명의 이해에서 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 임의의 정보가 선행기술이거나 현재 청구된 발명에 관련되는 것, 또는 구체적으로 또는 전적으로 언급된 임의의 공보가 선행기술인 것이 인정되지 않는다.
입양 T-세포 면역요법은 암에 대하여 치료 접근법의 선두로 올라왔다. T 세포는 종양 관련된 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체 (CARs)의 유전자를 발현시키기 위해 조작될 수 있다. CARs은, 종양 세포를 선택적으로 사멸시키기 위해 T 세포를 재유도할 수 있는, 합성 면역-수용체이다. 암 면역요법에서 이의 용도에 대하여 일반적인 전제는 종양-표적된 T 세포를 빠르게 생성시켜, 활성 면역화의 장벽 및 증분적 동력학을 우회시키고 그렇게 함으로써 '살아있는 약물'로서 작용하는 것이다. HLA-펩타이드 복합체를 관여시키는, 생리적 T-세포 수용체 (TCR)과 달리, CARs는 펩타이드 가공 또는 HLA 발현이 인식되도록 요구하지 않는 분자를 관여시킨다. CARs는 따라서, 환자의 일배체형에 매칭될 필요가 있는, TCRs와 대조적으로, 임의의 HLA 배경에서 항원을 인식한다. 게다가, CARs는, TCR-매개된 면역력으로부터 종양 탈출에 기여하는 2 기전인, 하향-조절된 HLA 발현 또는 프로테아솜 항원 가공을 갖는 종양 세포를 표적할 수 있다. CARs의 넓은 적용가능성의 또 다른 피쳐는, 잠재 표적의 범위를 재차 팽창시키는, 단백질에 뿐만 아니라 탄수화물 및 당지질 구조에 결합하는 그들의 능력이다.
초기 제1-세대 CARs는, CD3-ζ 또는 Fc 수용체 γ 쇄에서 유래된 세포질 신호전달 도메인에 연결된, 불활성 CD8 막관통 도메인에 scFv (단일 쇄 단편 가변형)-기반 항원 결합 도메인의 융합을 통해 작제되었다 (도 1).
CD3-ζ 쇄 응집이 T-세포의 용해성 활성을 가능화하는데 충분하여도, 이들은, 인터류킨-2 (IL-2)를 포함하는, 강력한 사이토카인 반응을 유도하는데, 그리고 항원에 반복된 노출시 T-세포 팽창을 지지하는데 실패하였다. 최적의 활성화 및 증식을 위하여, T 세포는 양쪽 T-세포 수용체 참여 및 신호전달, 뿐만 아니라 어느 한쪽 표적된 종양 세포 또는 항원-제시 세포에 의해 발현된 동족 리간드 (즉, CD80/86, 4-1BBL, OX-40L)에 결합하는 T 세포상의 공자극 수용체 (즉, CD28, 4-1BB, OX-40)을 통한 공자극 신호전달이 필요하다. T-세포 공-자극의 부족을 극복하기 위해, 제1 세대 CARs는 T-세포 공자극 수용체의 세포질 신호전달 도메인 편입에 의해 추가로 변형되었다. 이들 제2-세대 CARs (도 1)은 변형된 T 세포의 신호전달 강도 및 지속성을 향상시켜, 우월한 항종양 활성으로 이어졌다. 그러나, 제2-세대 CAR이 최상인 것은 공지되지 않고 각각의 것은 그들 자신의 강점 및 약점을 갖는다. 예를 들어, 임상에서 4-1BB 설계는, 대다수의 환자에서 적어도 6　개월에 검출 제거가능한 CD19-CAR T　세포로, 지속성을 선호하는 것처럼 보이고, 반면에 CD19 CAR T　세포를 함유하는 CD28 공자극 도메인은 3　개월 지나서 전형적으로 검출불가능하였지만, 덜 중증 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 더 낮은 CD19-음성 재발률은 CD28-기반 CAR T 세포를 사용하여 관측되었다.
CAR-T 세포로 성공에도 불구하고, 이 접근법에 몇 개의 제한이 있다. 조작된 CAR T 세포에 반응하는 다수의 환자에서, 전염증 사이토카인의 과도한 방출은 발열, 저혈압, 저산소혈증, 심장 기능이상, 신부전 및 전해질 비정상, 집합적으로 일명 "사이토카인 방출 증후군' (CRS)로서 포함하는 증상을 야기시킨다. 일부 경우에, CAR 요법은 떨림, 발작을 포함하는 신경 증상으로 이어질 수 있고 치명적일 수 있다. CRS 및 신경적 합병증을 무효화하기 위한 전략은, IL-6 수용체에 대한 단클론성 항체인, 토실리주맙 및 면역억제제 (예를 들면, 스테로이드)를 포함한다. 그러나, 이들 전략은 균일하게 성공적이지 않다. 본 발명은 상기 합병증을 예방 및/또는 CAR-T 세포의 활성을 제어하기 위한 신규한 접근법을 제공한다.
현행 임상 용도에서 CAR 작제물은 이들이 몇 개의 상이한 단백질의 융합을 나타냄에 따라 설계에서 인공적이다. 특히, CAR 작제물에서 공자극 도메인의 봉입체는 수용체를 통해 비-생리적 신호전달을 초래하고, 이는 차례로 그것의 독성에 기여할 수 있다. 일부 CARs는 긴장성 항원-독립적 신호전달을 보여주고, 이는 미절제된 세포 활성화를 유발시켜, 결국 세포자멸사, 동족 항원과 독립적으로 과도한 사이토카인 방출, 및 면역적 기능소실을 초래한다. Frigault 등은 CD28 및 CD3z 탠덤 신호전달 도메인을 함유하는 일부 CARs의 발현이 열등한 생체내 효능에 관련되었던 형질도입된 1차 인간 T 세포의 구성적 활성화 및 증식을 유발시킨다는 것을 실증하였다 (Frigault 등, Cancer immunology research 3:356-67, 2015). 연속 T-세포 증식으로 CARs의 표현형을 초래하는 것으로 밝혀진 하나의 기전은 세포 표면에서 CARs의 고 밀도이었다 (Frigault 등, Cancer immunology research 3:356-67, 2015). Long 등은 초기 T 세포 기능소실이 CAR-발현 T 세포의 항종양 효능을 제한하는 1차 인자인 것 그리고 CAR 구조가 만성 활성화 및 기능소실에 CAR T 세포의 사전조치에서 중추적 역할을 갖는다는 것을 실증하였다 (Long 등, Nat Med 21:581-90, 2015). 이들은, CAR 단일-쇄 가변형 단편의 항원-독립적 클러스터링에 의해 유발된, 긴장성 CAR CD3-z 인산화가 항종양 효능을 제한하는 CAR T 세포의 초기 기능소실을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다 (Long 등, Nat Med 21:581-90, 2015). 따라서, 과도한 독성, 예컨대 CRS의 위험 없이 CAR 변형된 T 세포의 장기간 지속성을 달성하기 위해 CAR 설계의 개선이 필요하다.
현행 임상시험에서 대부분의 CAR 작제물은 쥣과 단클론성 항체에 기반된다. 이들 쥣과 단클론성 항체 기반된 작제물의 면역원성은 그것의 생체내 지속성 및 효능을 제한하는 것으로 또한 상정되었다. 이 문제는 인간 또는 인간화된 항체에 기반되는 본 명세서에서 기재된 CAR 작제물의 용도로 극복될 수 있다.
면역 반응의 다클론성 성질은 다양한 감염의 제어에서 이의 성공에 열쇠이다. 그에 반해서, 현행 CAR 요법은 단일 항원의 단일 에피토프 및/또는 단일 항원의 표적화에 일반적으로 의존한다. 표적된 항원 또는 표적된 에피토프의 손실은 현행 CAR 요법의 실패의 빈번한 원인이다. 이 제한을 극복하기 위해, 본 발명은 다중 항원에 그리고 단일 항원의 다중 에피토프에 CAR을 대비한다. 이들 CARs는 질환, 예컨대 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 알러지성 질환 및 퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 다클론성 적응성 면역 반응을 제공하기 위해 적합한 조합으로 사용될 수 있다.
CD19가 면역요법에 대하여 매력적인 표적인 것은 대다수의 B-세포 악성종양에 의해 균일하게 발현되고, 정상 비-조혈 조직에 의해, 그리고 조혈 세포 중에서 발현되지 않고, B-계통 림프양 세포에 의해 단지 발현되기 때문이다. 초기 실험은 항-CD19 CARs가 CD19-특이적 방식이 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 실증하였다. 이들 CARs를 발현시키기 위해 유전적으로 변형된 T 세포는 시험관내 CD19+ 1차 백혈병 세포를 사멸시킬 수 있고 쥣과 이종이식 모델에서 CD19+ 표적 세포를 제거시킬 수 있다. 제1-세대 CD19-표적된 CAR-변형된 T 세포로 초기 임상 결과가 실망이었다 해도, 제2-세대 CARs를 발현시키기 위해 조작된 T 세포는 수많은 B-세포 악성종양에 대하여 환자 결과에서 상당한 개선으로 인상적인 임상 효능을 실증하였고, 주목할 만한 것은 재발된 B-세포 ALL을 가진 환자에서 관측된 극적인 임상 반응이다.
개념증명으로서 항-CD19 CART 요법은 B 세포에 CD19의 조직 제한으로 인해 그리고 장기적인 B-세포 고갈의 임상 내성에 의해 부분적으로 성공적이었다. 그러나, 다른 설정에서, 정상 조직에 의한 저 수준에서 발현된 항원의 CART-기반 표적화는 상당한 독성으로 이어졌다. 골수성 악성종양, 예컨대 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 골수이형성 증후군 MDS에서 널리-특성규명된, 진정으로 종양-특이적 표면 항원의 부족은 정상 조직, 예컨대 골수에 또한 영향을 줄 수 있는 CAR-T 종양-표적 전략의 고려를 필요로 하였다.
요약
하기 구현예 및 이의 측면은, 범위에서 제한하지 않는, 예시적이고 설명적인 것을 의미하는 시스템, 조성물 및 방법과 함께 기재되고 설명된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 암, 감염성, 자가면역 및 퇴행성 질환의 치료를 위하여 입양 세포 요법에서 사용될 수 있는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전적으로 조작된 이펙터 세포 (예컨대 NK 세포 및 T 세포)를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인 (ASD), 세포외 힌지 또는 스페이서 영역 (HR), 막관통 도메인 (TMD), 공자극 도메인 (CSD) 및 세포내 신호전달 도메인 (ISD)를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CARs)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 항원 결합 도메인은 표 21에서 제시된 표적의 어느 하나 이상을 표적한다. 일 구현예에서, CAR은 CD19를 표적하고 표 21에서 기재된 그리고 서열번호: 1470 및 서열번호: 3215에서 제시된 Bu12의 VL 및 VH를 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 CD19를 표적하고 표 21에서 기재된 그리고 서열번호: 1471 및 서열번호: 3216에서 제시된 MM의 VL 및 VH를 포함한다.
일부 구현예에서, 임의의 종래의 CARs (표 1) 및 백본 1-62 (표 2)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 각각의 백본은 종래의 CAR 요소 (표 1) 그리고 표 2에서 나타낸 바와 같이 하나 이상의 액세서리 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 백본의 종래의 CAR 요소 및 하나 이상의 액세서리 요소는 단일 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 종래의 CAR 요소는 제1 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩되고 하나 이상의 액세서리 모듈은 제2 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩된다. 종래의 CAR 요소 및 1 초과 액세서리 모듈을 포함하는 백본, 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 분자는 종래의 CAR 요소를 인코딩하고, 제2 폴리뉴클레오타이드 분자는 제1 액세서리 분자를 인코딩하고 제3 폴리뉴클레오타이드 분자는 제2 액세서리 분자를 인코딩한다. 예를 들어, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본 1은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 또는 2 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩될 수 있고, 여기서 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 분자는 종래의 CAR I을 인코딩하고 제2 폴리뉴클레오타이드 분자는 K13-vFLIP를 인코딩한다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 종래의 CARs I 내지 III (표 1)의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 백본 (표 2)는 하나 이상의 항원 특이적 도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VL (또는 vL) 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VH (또는 vH) 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 표적 세포 예컨대 암 세포에서 항원에 특이적인 하나 이상의 scFVs (또는 scFvs)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 (Fab')2 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체 (SDAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 낙타과 VHH (또는 vHH) 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 비-면역글로불린 스캐폴드 예컨대 DARPIN, 아피바디, 아필린, 아드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 파미노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센타이린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, 자가항원, 수용체 또는 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 리간드를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공된다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 종래의 CARs I 내지 III (표 1)의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 백본 (표 2)에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 하나 이상의 항원 특이적 도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VL (또는 vL) 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VH (또는 vH) 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 표적 세포 예컨대 암 세포에서 항원에 특이적인 하나 이상의 scFVs를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 (Fab')2 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체 (SDAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 낙타과 VHH (vHH) 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 비-면역글로불린 스캐폴드 예컨대 DARPIN, 아피바디, 아필린, 아드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 파미노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센타이린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, 자가항원, 수용체 또는 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 리간드를 포함한다.
임의의 종래의 CARS I 내지 III (표 1)을 인코딩하는 핵산 또는 백본 1-62 (표 2)를 포함하는 하나 이상의 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공된다. 일부 구현예에서, 각각의 백본의 모든 요소는 단일 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 백본의 각각의 요소는 상이한 벡터에 의해 인코딩된다. 예를 들어, 종래의 CAR 요소 및 단일 액세서리 모듈을 포함하는 백본에서, 제1 벡터는 종래의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 제2 벡터는 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 종래의 CAR 요소 및 1 초과 액세서리 모듈을 포함하는 백본에서, 제1 벡터는 종래의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 제2 벡터는 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 대안적으로, 제1 벡터는 종래의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 벡터는 제1 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 제3 벡터는 제2 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 종래의 CARs I 내지 III의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 백본을 인코딩하는 벡터는 하나 이상의 항원 특이적 도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VL 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VH 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 표적 세포 예컨대 암 세포에서 항원에 특이적인 하나 이상의 scFVs를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 (Fab')2 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체 (SDAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 낙타과 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 비-면역글로불린 스캐폴드 예컨대 DARPIN, 아피바디, 아필린, 아드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 파미노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센타이린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, 자가항원, 수용체 또는 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 리간드를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 백본 1-62를 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 종래의 CARs I 내지 III의 CARs 또는 백본은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 항원 특이적 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 항원 특이적 도메인에 의해 인코딩되는 이들 각각의 VL 단편, VH 단편, VHH 도메인, scFvs, Fv 단편, Fab 단편, (Fab')2 단편, 단일 도메인 항체 (SDAB) 단편, 및/또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 통해 표적 세포 예컨대 암 세포에서 항원을 표적한다.
일부 구현예에서, CARs의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VL 단편을 포함한다. 예시적 구현예에서, 하나 이상의 VL 단편은 표 4에서 기재된다. 일부 구현예에서, 하나 더 VL 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 11-249의 어느 하나 이상에서 제시된 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 VL 단편을 인코딩하는 폴리펩타이드는 서열번호: 1785-2023의 어느 하나 이상에서 제시된 서열 또는 서열번호: 1785-2023의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 1785-2023의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 3 상보성 결정 영역 (CDRs)에서 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 1785-2023의 어느 하나 이상에서 제시된 서열로서 표적 항원에서 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 항원에 결합하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, CARs의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 VH 단편을 포함한다. 예시적 구현예에서, 하나 이상의 VH 단편은 표 6에서 기재된다. 일부 구현예에서, 하나 더 VH 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 259-498의 어느 하나 이상에서 제시된 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 VH 단편을 인코딩하는 폴리펩타이드는 서열번호: 2028-2268의 어느 하나 이상에서 제시된 서열 또는 서열번호: 2028-2268의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2028-2268의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 3 상보성 결정 영역 (CDRs)에서 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2028-2268의 어느 하나 이상에서 제시된 서열로서 표적 항원에서 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 항원에 결합하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다.
일부 구현예에서, CARs의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 나노바디 (VHH 도메인)을 포함한다. 예시적 구현예에서, 하나 이상의 VHH 도메인은 표 7에서 기재된다. 일부 구현예에서, 하나 더 VHH 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 499-523의 어느 하나 이상에서 제시된 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 VHH 단편을 인코딩하는 폴리펩타이드는 서열번호: 2269-2293의 어느 하나 이상에서 제시된 서열 또는 서열번호: 2269-2293의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2269-2293의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 3 상보성 결정 영역 (CDRs)에서 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2269-2293의 어느 하나 이상에서 제시된 서열로서 표적 항원에서 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 항원에 결합하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다.
일부 구현예에서, CARs의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 포함한다. 예시적 구현예에서, 하나 이상의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드는 표 8에서 기재된다. 일부 구현예에서, 하나 더 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 524-528의 어느 하나 이상에서 제시된 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 인코딩하는 폴리펩타이드는 서열번호: 2294-2298의 어느 하나 이상에서 제시된 서열 또는 서열번호: 2294-2298의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2294-2298의 어느 하나 이상에서 제시된 서열로서 표적 항원에서 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 항원에 결합하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다.
일부 구현예에서, CARs의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 리간드를 포함한다. 예시적 구현예에서, 리간드는 표 10에서 기재된다. 일부 구현예에서, 하나 더 리간드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 553-563의 어느 하나 이상에서 제시된 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 리간드 결합 도메인을 인코딩하는 폴리펩타이드는 서열번호: 2323-2333의 어느 하나 이상에서 제시된 서열 또는 서열번호: 2323-2333의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2323-2333의 어느 하나 이상에서 제시된 서열로서 표적 항원에서 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 항원에 결합하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다.
일부 구현예에서, CARs의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 scFvs를 포함한다. 예시적 구현예에서, scFv 단편은 표 11에서 기재된다. 일부 구현예에서, 하나 더 scFv 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 564-798의 어느 하나 이상에서 제시된 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 scFv 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 2334-2568의 어느 하나 이상에서 제시된 폴리펩타이드 서열에 대하여 인코딩하는 또는 서열번호: 2334-2568의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 6 상보성 결정 영역 (CDRs)에서 80-99% 동일성을 가진 폴리펩타이드 서열에 대하여 인코딩하는 또는 서열번호: 2334-2568의 어느 하나 이상에서 제시된 서열로서 표적 항원에서 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 항원에 결합하는 폴리펩타이드 서열에 대하여 인코딩하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 scFv 단편을 인코딩하는 폴리펩타이드는 서열번호: 2334-2568의 어느 하나 이상에서 제시된 서열 또는 서열번호: 2334-2568의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2334-2568의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 6 상보성 결정 영역 (CDRs)에서 80-99% 동일성을 가진 서열 또는 서열번호: 2334-2568의 어느 하나 이상에서 제시된 서열로서 표적 항원에서 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 항원에 결합하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다.
일부 구현예에서, 종래의 CAR (표 1)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 표 2에서 본 명세서에서 기재된 바와 같이 임의의 백본 1-62가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 각각의 백본은 종래의 CAR 요소 (표 1) 및 표 2에서 나타낸 바와 같이 하나 이상의 액세서리 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 백본의 종래의 CAR 요소 및 하나 이상의 액세서리 요소는 단일 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 종래의 CAR 요소는 제1 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩되고 하나 이상의 액세서리 모듈은 제2 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩된다. 종래의 CAR 요소 및 1 초과 액세서리 모듈을 포함하는 백본, 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 분자는 종래의 CAR 요소를 인코딩하고, 제2 폴리뉴클레오타이드 분자는 제1 액세서리 분자를 인코딩하고 제3 폴리뉴클레오타이드 분자는 제2 액세서리 분자를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 종래의 CAR (표 1)을 인코딩하는 폴리펩타이드 및 표 2에서 본 명세서에서 기재된 바와 같이 임의의 백본 1-62가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 각각의 백본은 종래의 CAR 요소 (표 1) 및 표 2에서 나타낸 바와 같이 하나 이상의 액세서리 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 백본의 종래의 CAR 요소 및 하나 이상의 액세서리 모듈 요소를 인코딩하는 폴리펩타이드는 단일 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 종래의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리펩타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩되고 하나 이상의 액세서리 모듈은 제2 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 각각의 백본의 종래의 CAR 요소 및 하나 이상의 액세서리 모듈 요소를 인코딩하는 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 종래의 CAR 요소를 인코딩하는 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드 분자에 의해 인코딩되고 하나 이상의 액세서리 모듈은 제2 이상 폴리펩타이드 분자에 의해 인코딩된다. 종래의 CAR 요소 및 1 초과 액세서리 모듈을 포함하는 백본, 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 분자는 종래의 CAR 요소를 인코딩하고, 제2 폴리뉴클레오타이드 분자는 제1 액세서리 분자를 인코딩하고 제3 폴리뉴클레오타이드 분자는 제2 액세서리 분자를 인코딩한다. 종래의 CAR 요소 및 1 초과 액세서리 모듈을 포함하는 백본, 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 분자는 종래의 CAR 요소를 인코딩하고, 제2 폴리펩타이드 분자는 제1 액세서리 분자를 인코딩하고 제3 폴리펩타이드 분자는 제2 액세서리 분자를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 하나 더 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 850-904의 어느 하나 이상에서 제시된 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 2613-2667의 어느 하나 이상에서 제시된 대로 폴리펩타이드 서열에 대하여 인코딩하는 또는 서열번호: 2613-2667의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 70-99% 동일성으로 폴리펩타이드 서열에 대하여 인코딩하는 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 일부 구현예에서, 하나 더 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리펩타이드는 서열번호: 2613-2667의 어느 하나 이상에서 제시된 서열 또는 서열번호: 2613-2667의 어느 하나 이상에서 제시된 서열에 70-99% 동일성을 가진 서열을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다.
예시적 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산, 여기서 관심의 CAR 표적 항원의 항원 특이적 도메인은 표 19에서 기재된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 그리고 표 19에서 기재된 바와 같이 관심의 항원을 표적하는 백본-1을 인코딩하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 927-1196에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 그리고 표 19에서 기재된 바와 같이 관심의 항원을 표적하는 백본-1을 인코딩하는 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 2672-2941에서 제시된다. 서열번호: 927-1196에서 핵산 서열 및 서열번호: 2672-2941에서 폴리펩타이드 서열은 또한, 단편이 세포를 선택하는데 사용될 수 있지만 CAR의 기능에 비필수적인, 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제 (PuroR) 단편에 대하여 인코딩한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 그리고 K13-vFLIP를 공발현하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 927-941에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 그리고 K13-vFLIP를 공발현하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 2672-2686에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD19를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 564-577 및 서열번호: 2334-2347에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL 또는 트롬보포이에틴 수용체를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, MPL을 표적하는 그리고 K13-vFLIP를 공발현하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1117-1124에서 제시된다. 예시적 구현예에서, MPL을 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 2862-2869에서 제시된다. 일부 구현예에서, MPL을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 729-736 및 서열번호: 2499-2506에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, Lym1을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1109에서 제시된다. 예시적 구현예에서, Lym1을 표적하는 단리된 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2854에서 제시된다. 일부 구현예에서, Lym1을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 723 및 서열번호: 2493에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, Lym2를 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1110에서 제시된다. 예시적 구현예에서, Lym2를 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 2855에서 제시된다. 일부 구현예에서, Lym2를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 724 및 서열번호: 2494에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, GRP-78을 표적하는 단리된 핵산의 서열은 서열번호: 1078에서 제시된다. 예시적 구현예에서, GRP-78을 표적하는 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 2823에서 제시된다. 일부 구현예에서, GRP-78을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 703 및 서열번호: 2473에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD79b를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 995-996에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD79b를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2740-2741에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD79b를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 628 및 서열번호: 2398에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 ALK를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, ALK를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 946-947에서 제시된다. 예시적 구현예에서, ALK를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2691-2692에서 제시된다. 일부 구현예에서, ALK를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 582-583 및 서열번호: 2352-2353에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 ALK를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 ALK를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 ALK를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, BCMA를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 951-957에서 제시된다. 예시적 구현예에서, BCMA를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2696-2702에서 제시된다. 일부 구현예에서, BCMA를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 586-592 및 서열번호: 2356-2362에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD20을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD20을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 964-976에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD20을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2709-2721에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD20을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 596-597;599-610 및 서열번호: 2366-2367;2369-2380에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD20을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD20을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD20을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD22를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD22를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 977-980 및 서열번호: 1192-1196에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD22를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2722-2725 및 서열번호: 2937-2941에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD22를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 598, 611-613 및 서열번호: 2368, 2381-2384에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD22를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD22를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD22를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD30을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD30을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 981-982에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD30을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2726-2727에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD30을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 614-615 및 서열번호: 2384-2385에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD30을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD30을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD30을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD32를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD32를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 983에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD32를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2728에서 제시된다 일부 구현예에서, CD32를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 616 및 서열번호: 2386에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD32를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD32를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD32를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD33을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD33을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 984-991에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD33을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2729-2736에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD33을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 617-624 및 서열번호: 2387-2394에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD33을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD33을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD33을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD123을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD123을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 998-1010에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD123을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2743-2755에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD123을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 630-642 및 서열번호: 2400-2412에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD123을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD123을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD123을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD138을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD138을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1011에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD138을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2756에서 제시된다 일부 구현예에서, CD138을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 643 및 2413에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD138을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD138을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD138을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CLL1을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CLL1을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1024-1029에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CLL1을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호:2769-2774에서 제시된다. 일부 구현예에서, CLL1을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 655-660 및 서열번호: 2425-2430에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CLL1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CLL1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CLL1을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CS1을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CS1을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1031-1039에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CS1을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호:2776-2784에서 제시된다. 일부 구현예에서, CS1을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 662-670 및 서열번호: 2432-2440에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CS1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CS1을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CSF2RA를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CSF2RA를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1040-1041에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CSF2RA를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2785-2786에서 제시된다. 일부 구현예에서, CSF2RA를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 671-672 및 서열번호: 2441-2442에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CSF2RA를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CSF2RA를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CSF2RA를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, DLL3을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1044-1045에서 제시된다. 예시적 구현예에서, DLL3을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2789-2790에서 제시된다. 일부 구현예에서, DLL3을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 673-674 및 서열번호: 2443-2444에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GPRC5D를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, GPRC5D를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1070-1073에서 제시된다. 예시적 구현예에서, GPRC5D를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2815-2818에서 제시된다. 일부 구현예에서, GPRC5D를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 695-674 및 서열번호: 2465-2468에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GPRC5D를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GPRC5D를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GPRC5D를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 959, 1089-1092에서 제시된다. 예시적 구현예에서, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2704, 2834-2837에서 제시된다. 일부 구현예에서, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 581, 705-708 및 서열번호: 2351, 2475-2478에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL11Ra를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, IL11Ra를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1099에서 제시된다. 예시적 구현예에서, IL11Ra를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2844에서 제시된다 일부 구현예에서, IL11Ra를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 715 및 24에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL11Ra를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL11Ra를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL11Ra를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL13Ra2를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, IL13Ra2를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1101-1102에서 제시된다. 예시적 구현예에서, IL13Ra2를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2846-2847에서 제시된다. 일부 구현예에서, IL13Ra2를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 716-717 및 서열번호: 2486-2487에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL13Ra2를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL13Ra2를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 IL13Ra2를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LAMP1을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, LAMP1을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1104-1105에서 제시된다. 예시적 구현예에서, LAMP1을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2849-2850에서 제시된다. 일부 구현예에서, LAMP1을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 719-720 및 서열번호: 2489-2490에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LAMP1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LAMP1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LAMP1을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 NY-BR1을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, NY-BR1을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1131에서 제시된다. 예시적 구현예에서, NY-BR1을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2876에서 제시된다 일부 구현예에서, NY-BR1을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 742 및 2512에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 NY-BR1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 NY-BR1을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 NY-BR1을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TIM1/HAVCR을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, TIM1/HAVCR을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1160-1161에서 제시된다. 예시적 구현예에서, TIM1/HAVCR을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2905-2906에서 제시된다. 일부 구현예에서, TIM1/HAVCR을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 770-771 및 서열번호: 2540-2541에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TIM1/HAVCR을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TIM1/HAVCR을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TIM1/HAVCR을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TROP2를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, TROP2를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1165-1166에서 제시된다. 예시적 구현예에서, TROP2를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2910-2911에서 제시된다. 일부 구현예에서, TROP2를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 774-775 및 서열번호: 2544-2545에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TROP2를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TROP2를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TROP2를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSHR을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, TSHR을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1167-1170에서 제시된다. 예시적 구현예에서, TSHR을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2912-2914에서 제시된다. 일부 구현예에서, TSHR을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 776-778 및 서열번호: 2546-2548에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSHR을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSHR을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSHR을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSLPR을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, TSLPR을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1171에서 제시된다. 예시적 구현예에서, TSLPR을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2916에서 제시된다 일부 구현예에서, TSLPR을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 779 및 2549에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산 단편에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSLPR을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSLPR을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TSLPR을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH19를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CDH19를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1019 및 1180에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CDH19를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2764 및 2925에서 제시된다 일부 구현예에서, CDH19를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 651, 788 및 서열번호: 2421 및 2558에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH19를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH19를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH19를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH6을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CDH6을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1017-1018에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CDH6을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2761-2762에서 제시된다. 일부 구현예에서, CDH6을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 648-649 및 서열번호: 2418-2419에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH6을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH6을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH6을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, CD324를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1014-1015에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD324를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2759-2760에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD324를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 646-647 및 서열번호: 2416-2417에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCR 감마-델타 (TCRgd)를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, TCR 감마-델타 (TCRgd)를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1155에서 제시된다. 예시적 구현예에서, TCR 감마-델타 (TCRgd)를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2900에서 제시된다 일부 구현예에서, TCR 감마-델타 (TCRgd)를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 765 및 서열번호: 2535에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCR 감마-델타 (TCRgd)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCR 감마-델타 (TCRgd)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로-조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCR 감마-델타 (TCRgd)를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB1 (TCR 베타 1 불변 쇄)를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, TCRB1 (TCR 베타 1 불변 쇄)를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1151-1152에서 제시된다. 예시적 구현예에서, TCRB1 (TCR 베타 1 불변 쇄)를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2896-2897에서 제시된다. 일부 구현예에서, TCRB1 (TCR 베타 1 불변 쇄)를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 761-762 및 서열번호: 2531-2532에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB1 (TCR 베타 1 불변 쇄)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB1 (TCR 베타 1 불변 쇄)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB1 (TCR 베타 1 불변 쇄)를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB2 (TCR 베타 2 불변 쇄)를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, TCRB2 (TCR 베타 2 불변 쇄)를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1153-1154에서 제시된다. 예시적 구현예에서, TCRB2 (TCR 베타 2 불변 쇄)를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2898-2899에서 제시된다. 일부 구현예에서, TCRB2 (TCR 베타 2 불변 쇄)를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 763-764 및 서열번호: 2533-2534에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB2 (TCR 베타 2 불변 쇄)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB2 (TCR 베타 2 불변 쇄)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 TCRB2 (TCR 베타 2 불변 쇄)를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1182-1183에서 제시된다. 예시적 구현예에서, LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2927-2928에서 제시된다. 일부 구현예에서, LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 790-791 및 서열번호: 2560-2561에서 제시된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다 (표 19). 예시적 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 961-962에서 제시된다. 예시적 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2707-2708에서 제시된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는 수용체는 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인 (FCGR3A) 또는 이의 변이체 V158 또는 이의 변이체 F158을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다. 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다. CAR의 항원 특이적 도메인이 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포는 항체 의존적 세포 매개된 세포독성을 향상시키는데 및/또는, US 2015/0139943A1에 기재된 바와 같이, 항체 기반된 면역요법, 예컨대 암 면역요법을 향상시키는데 사용될 수 있다.
예시적 구현예에서, CAR의 항원 특이적 도메인이 관심의 항원을 표적하는, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산은 표 20에서 기재된다. 표 20에서 기재된 바와 같이 관심의 표적 항원 그리고 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1197-1466에서 제시된다. 표 20에서 기재된 바와 같이 관심의 표적 항원 그리고 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 2942-3211에서 제시된다. 서열번호: 1197-1466에서 핵산 서열 그리고 서열번호: 2942-3211에서 폴리펩타이드 서열은, 단편이 세포를 선택하는데 사용될 수 있고 CAR의 기능에 필수적이지 않은, 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제 (PuroR) 단편에 대하여 또한 인코딩한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다 (표 20). 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 VL-VH의 핵산 서열은 서열번호: 1197-1211에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 VL-VH의 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 2942-2956에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD19를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 564-577 및 서열번호: 2334-2347에서 제시된다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 포함하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다 (표 20). 예시적 구현예에서, MPL을 표적하는 VL-VH의 핵산 서열은 서열번호: 1387-1394에서 제시된다. 예시적 구현예에서, MPL을 표적하는 VL-VH의 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 3132-3139에서 제시된다. 일부 구현예에서, MPL을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 729-736 및 서열번호: 2499-2506에서 제시된다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다 (표 20). 예시적 구현예에서, Lym1을 표적하는 VL-VH의 핵산 서열은 서열번호: 1379에서 제시된다. 예시적 구현예에서, Lym1을 표적하는 VL-VH의 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 3124에서 제시된다. 일부 구현예에서, Lym1을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 723 및 서열번호: 2493에서 제시된다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다 (표 20). 예시적 구현예에서, Lym2를 표적하는 VL-VH의 핵산 서열은 서열번호: 1380에서 제시된다. 예시적 구현예에서, Lym2를 표적하는 VL-VH의 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 3125에서 제시된다. 일부 구현예에서, Lym2를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 724 및 서열번호: 2494에서 제시된다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다 (표 20). 예시적 구현예에서, GRP-78을 표적하는 VL-VH의 핵산 서열은 서열번호: 1348에서 제시된다. 예시적 구현예에서, GRP-78을 표적하는 VL-VH의 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 3093에서 제시된다. 일부 구현예에서, GRP-78을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 703 및 서열번호: 2473에서 제시된다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP-78을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다 (표 20). 예시적 구현예에서, CD79b를 표적하는 VL-VH의 핵산 서열은 서열번호: 1381에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD79b를 표적하는 VL-VH의 폴리펩타이드 서열은 서열번호: 3126에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD79b를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 628 및 서열번호: 2398에서 제시된다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다 (표 20). 예시적 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1232-1233에서 제시된다. 예시적 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 2977-2978에서 제시된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는 수용체는 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인 (FCGR3A) 또는 이의 변이체 V158 또는 이의 변이체 F158을 포함하거나, 상기로 구성되거나 본질적으로 상기로 구성된다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다. 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역을 표적한다. CAR의 항원 특이적 도메인이 면역글로불린의 Fc 영역을 표적하는, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포는 항체 의존적 세포 매개된 세포독성을 향상시키는데 및/또는, US 2015/0139943A1에서 기재된 바와 같이, 항체 기반된 면역요법, 예컨대 암 면역요법을 향상시키는데 사용될 수 있다.
예시적 구현예에서, 핵산은 CAR의 항원 특이적 도메인이 관심의 항원을 표적하는 종래의 CAR II를 인코딩한다 (표 21). 표 21에서 기재된 바와 같이 관심의 표적 항원 그리고 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1467-1730에서 제시된다. 표 21에서 기재된 바와 같이 관심의 표적 항원 및 종래의 CAR II를 포함하는 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3212-3475에서 제시된다. 서열번호: 1467-1730에서 핵산 서열 및 서열번호: 3212-3475에서 폴리펩타이드 서열은 또한, 단편이 세포를 선택하는데 사용될 수 있고 CAR의 기능에 필수적이지 않은, 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제 (PuroR) 단편에 대하여 인코딩한다. 유사하게, 표 22에서 기재된 몇 개의 CAR 작제물은, 이들 CAR 작제물의 기능에 필수적이지 않지만 이들 CAR 작제물을 발현시키는 세포를 풍부화 또는 선택하는데 사용될 수 있는, PuroR 또는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)에 대하여 인코딩한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1470-1481, 1772에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3215-3225, 3517에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD19를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 566-577 및 서열번호: 2336-2347에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL 또는 트롬보포이에틴 수용체를 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, MPL을 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1657-1664, 1731-1737에서 제시된다. 예시적 구현예에서, MPL을 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3402-3409, 3476-3484에서 제시된다. 일부 구현예에서, MPL을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 729-736 및 서열번호: 2499-2506에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, Lym1을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1649에서 제시된다. 예시적 구현예에서, Lym1을 표적하는 단리된 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 3394에서 제시된다. 일부 구현예에서, Lym1을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 723 및 서열번호: 2493에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, Lym2를 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1650에서 제시된다. 예시적 구현예에서, Lym2를 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3395에서 제시된다. 일부 구현예에서, Lym2를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 724 및 서열번호: 2494에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, DLL3을 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1314-1315에서 제시된다. 예시적 구현예에서, DLL3을 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3059-3060에서 제시된다. 일부 구현예에서, DLL3을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 673-674 및 서열번호: 2443-2444에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, CD324를 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1554-1555에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD324를 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3299-3300에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD324를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 646-647 및 서열번호: 2416-2417에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324를 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD276을 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, CD276을 표적하는 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1553에서 제시된다. 예시적 구현예에서, CD276을 표적하는 단리된 폴리펩타이드 단편의 서열은 서열번호: 3298에서 제시된다. 일부 구현예에서, CD276을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 645 및 서열번호: 2415에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD276을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD276을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 CD276을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 PTK7을 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, PTK7을 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1683-1684에서 제시된다. 예시적 구현예에서, PTK7을 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3428-3429에서 제시된다. 일부 구현예에서, PTK7을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 753-754 및 서열번호:2523-2524에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 PTK7을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 PTK7을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 PTK7을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1485에서 제시된다. 예시적 구현예에서, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3230에서 제시된다. 일부 구현예에서, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호: 581 및 서열번호: 2351에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120을 표적한다.
일 구현예에서, 종래의 CAR II를 인코딩하는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MHC 부류 I 복합체와 관련하여 티로시나제-유도된 펩타이드를 표적한다 (표 21). 예시적 구현예에서, MHC 부류 I 복합체 (HLA-A2)와 관련하여 티로시나제-유도된 펩타이드를 표적하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열번호: 1712-1714에서 제시된다. 예시적 구현예에서, MHC 부류 I 복합체 (HLA-A2)와 관련하여 티로시나제-유도된 펩타이드를 표적하는 단리된 폴리펩타이드의 서열은 서열번호: 3457-3459에서 제시된다. 일부 구현예에서, MHC 부류 II (HLA-A2) 복합체와 관련하여 티로시나제-유도된 펩타이드를 표적하는 scFv 단편은 표 11에서 기재되고 서열번호:780-782 및 서열번호: 2550-2552에서 제시된다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MHC 부류 I 복합체 (HLA-A2)와 관련하여 티로시나제-유도된 펩타이드를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공되고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MHC 부류 I 복합체 (HLA-A2)와 관련하여 티로시나제-유도된 펩타이드를 표적한다. 종래의 CAR II를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR 표적의 항원 특이적 도메인은 MHC 부류 I 복합체 (HLA-A2)와 관련하여 티로시나제-유도된 펩타이드를 표적한다. 예시적 구현예에서, MHC 부류 I 복합체 (HLA-A2)와 관련하여 CAR에 의해 표적되는 티로시나제-유도된 펩타이드의 서열은 -YMDGTMSQV-이다 (표 23).
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 (종래의 CARs 및 액세서리 모듈을 포함하는) 신규한 백본 또는 종래의 CARs를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 예시적 구현예에서, 벡터는 임의의 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 한 구현예에서, 벡터는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 렌티바이러스 벡터이다. 한 구현예에서, 벡터는 pLENTI-EF1α (서열번호: 905)이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 pLenti-EF1a-DWPRE (서열번호: 906)이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 MSCV-Bgl2-AvrII-Bam-EcoR1-Xho-BstB1-Mlu-Sal-ClaI.I03 (서열번호: 907)이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터는 pSBbi-Pur (서열번호: 908)이다. 일 구현예에서, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 프로모터의 비-제한 예는 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1α 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 또는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터로부터 포함한다. 일 구현예에서, 프로모터는 EF-1 프로모터 (서열번호: 909)이다. 일 구현예에서, 프로모터는 상기 발현이 요구되는 경우 작동가능하게 연결되는 종래의 CARs I 내지 III 및 백본 1-62를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현의 켜짐, 또는 발현이 요구되지 않는 경우 발현의 꺼짐을 할 수 있는 분자 스위치를 제공하는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 예는, 비제한적으로 메탈로티오닌 유도성 프로모터, 글루코코르티코이드 유도성 프로모터, 프로게스테론 유도성 프로모터, 및 테트라사이클린 유도성 프로모터를 포함한다. RheoSwitch® 시스템 (Agarwal 등, 2012, AACR-NCI-EORTC international conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics)는 본 발명의 백본 1-62 및 종래의 CARs의 발현 제어를 위하여 또 다른 전사 조절자 플랫폼을 표시한다. 일 구현예에서, 1 항원용 합성 노치 수용체가 CARs의 활성 제어를 위하여 최근에 기재된 바와 같이 제2 항원을 표적하는 백본 1-62 또는 종래의 CAR의 발현을 유도하는 조합으로 활성화된 T 세포 회로는 조작될 수 있다 (Roybal KT 등, Cell, 164:1-10 2016). 일 구현예에서, 벡터는 본 명세서에서 기재된, 시험관내 전사 벡터 (예를 들어, DNA 분자로부터 RNA를 전사하는 벡터)이다. 일 구현예에서, 벡터에서 핵산 서열은 폴리(A) 테일, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된, 예를 들면, 약 100-150 아데노신 염기를 포함하는 폴리 A 테일을 추가로 포함한다. 예를 들어, 약 150 아데노신 염기를 포함하는 폴리(A) 테일 (서열번호: 922)가 본 명세서에서 고려된다. 일 구현예에서, 벡터에서 핵산 서열은 3'UTR, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된, 예를 들면, 인간 베타-글로불린에서 유래된 3'UTR의 적어도 하나의 반복부를 포함하는 3' UTR을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 하나 이상의 억제 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려된 억제 분자의 비-제한 예는 하기를 포함한다: inhKIR 세포질 도메인; 막관통 도메인, 예를 들면, KIR 막관통 도메인; 및 억제제 세포질 도메인, 예를 들면, ITIM 도메인, 예를 들면, inhKIR ITIM 도메인. LAILR1의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 예시적 억제 분자는 서열번호: 849 및 2612로 표시된다. 상이한 항원을 표적하는 백본 1-62 및 종래의 억제 CARs는 LAILR1 (서열번호: 849 및 2612)의 막관통 및 세포질 도메인에 표 11에서 기재된 scFv 단편을 결합시킴으로써 쉽게 작제될 수 있다. 그와 같은 억제 CARs는 활성화 CARs, 예컨대 표 19-22에서 기재된 CARs와 조합으로 또는 단독으로 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs의 ASD는, 표적 항원에 대하여, 10-4　M 내지 10-8　M, 10-5　M 내지 10-7　M, 10-6　M 또는 10-7　M의 결합 친화도 (KD)를 갖는다.
유전적으로 조작된 세포 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 핵산, 폴리펩타이드 또는 벡터를 포함하는 줄기 세포 (예를 들면, 조혈모세포, 말초 혈액 줄기 세포, 골수 유래된 줄기 세포, 면역 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포 또는 iPSC) 및/또는 면역 이펙터 세포, (예를 들면, 세포의 모집단, 예를 들면, 면역 이펙터 세포의 모집단)이 본 명세서에서 또한 제공된다.
일 구현예에서, 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 면역 세포의 비-제한 예는 T-세포 및 NK-세포를 포함한다. 또한, T-세포의 비-제한 예는 Tregs, CD8+ T 세포, 및 CD4+ T 세포를 포함한다. 면역 세포, (예를 들면, T 세포 및 NK 세포)는, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 가슴샘 조직, 감염의 부위로부터 조직, 복수, 늑막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함하는, 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는, 본 발명의 신규한 백본 및 CARs의 발현에 앞서 및/또는 발현 후 시험관내 팽창 및 배양될 수 있는, 조직 상주 감마-델타 T 세포 또는 종양 침윤 림프구 (TILs)일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 개 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 원숭이 세포이다.
일 구현예에서, 세포는 T 세포이고 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 쇄의 하나 이상에서 결핍된다. 본 발명에 따라 기능성 TCR의 발현이 안정적으로 부족한 T 세포는 다양한 접근법을 사용하여 예컨대 내인성 T 세포 수용체 쇄를 표적하는 Zn 핑거 뉴클레아제 (ZFN), CRISP/Cas9 및 shRNA를 사용하여 생산될 수 있다. shRNAs에 관한 비-제한 예시적 방법은 US 2012/0321667 A1에서 기재된다. TCRs의 α 및 β 쇄의 불변 영역을 표적하는 ZFNs를 사용하여 내인성 TCR 발현의 제거에 관한 또 다른 비-제한 예시적 방법은 기재되어 있다 (Torikai H 등,Blood 119:24, 2012).
일 구현예에서, 세포는 줄기 세포이고 줄기 세포는 내인성 T 세포 수용체 쇄의 하나 이상에서 결핍된다. 또 다른 구현예에서, 세포는 CAR의 하나 이상의 표적 항원이 CAR에 의해 더이상 인식되지 않는 형태로 결실 또는 돌연변이된 줄기 세포이다. 비-제한 예에서, CD19를 표적하는 CAR은 그와 같은 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포가 CD19-표적 CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 제거되지 않도록 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 CD19에서 결핍되도록 만들어진 줄기 세포에서 발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, CD19를 표적하는 CAR은 그와 같은 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포가 CD19-표적 CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 제거되지 않도록 CAR에 의해 표적되지 않는 형태로 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 내인성 CD19 유전자가 돌연변이된 줄기 세포에서 발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, CAR은 면역 이펙터 세포에서 발현되고 자가조직 또는 동종이계 공여체로부터 줄기 세포는 유전적으로 조작되어 어느 한쪽 CAR의 표적 항원의 발현이 부족하거나 CAR에 의해 인식되지 않는 CAR의 표적 항원의 돌연변이된 형태를 발현시킨다. 또 다른 비-제한 예에서, CD19를 표적하는 CAR은 그와 같은 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포가 CD19-표적 CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 제거되지 않도록 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 CD19에서 결핍되게 만들어진 자가조직 또는 동종이계 조혈모세포와 함께 환자에 주입되는 T 세포에서 발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, CD19를 표적하는 CAR은 그와 같은 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포가 CD19-표적 CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 제거되지 않도록 CAR에 의해 표적되지 않는 형태로 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 내인성 CD19 유전자가 돌연변이된 자가조직 또는 동종이계 조혈모세포와 함께 환자에 주입되는 T 세포에서 발현된다. 다른 비-제한 예에서, CRISP/Cas9, Zn 핑거 뉴클레아제 또는 siRNA/shRNA 접근법은 이들 항원이 질환-관련된 또는 질환 유발 세포에서 발현되는 특이적 질환의 치료를 위하여 이들 항원을 표적하는 CAR-T 세포를 받는 대상체내 줄기 세포에서 다른 내인성 항원 (예를 들면, MPL, CD33, CD123 등)을 돌연변이 또는 제거하는데 사용된다. 비-제한 예에서, MPL을 표적하는 CAR은 그와 같은 줄기 세포에 의해 생산된 혈액 세포가 MPL-표적 CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 제거되지 않도록 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 MPL에서 결핍되게 만들어진 줄기 세포에서 발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, MPL (예를 들면, 서열번호: 1657-1660)을 표적하는 CAR은 그와 같은 줄기 세포에 의해 생산된 혈액 세포가 MPL-표적 CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 제거되지 않도록 MPL-유도된 CAR에 의해 표적되지 않는 형태로 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 내인성 MPL 유전자가 돌연변이된 줄기 세포에서 발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, MPL을 표적하는 CAR은 내인성 MPL 유전자가 CAR에 의해 표적되지 않는 형태로 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 돌연변이된 자가조직 또는 동종이계 조혈모세포와 함께 환자에 주입되는 T 세포에서 발현된다. 예시적 구현예에서 MPL-유도된 CAR에 의해 표적되지 않는 형태로 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제에 의해 돌연변이용으로 표적되는 MPL 유전자의 영역은 펩타이드 서열 -PWQDGPK-에 대하여 인코딩한다.
다양한 구현예에서, CARs는 이환-유발 또는 질환-관련된 세포, 예컨대 암 세포에서 1, 2, 3, 4 또는 초과 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 1 초과 ASD를 포함하는 CARs는 이환-유발 또는 질환-관련된 세포에서 동일한 항원을 표적한다. 또 다른 구현예에서, 1 초과 ASD를 포함하는 CARs는 이환-유발 또는 질환-관련된 세포에서 상이한 항원을 표적한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 액세서리 모듈을 인코딩하는 핵산, 폴리펩타이드 또는 벡터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 액세서리 모듈은 CARs와 관련된 독성을 감소 또는 예방한다. 일부 구현예에서, 액세서리 모듈은 사이토카인 또는 케모카인의 억제제, 예를 들어, 관여된 사이토카인 및/또는 케모카인에 대한 siRNA (어느 한쪽 shRNA 또는 Mir 기반된 shRNAs)이고 동일한 벡터로부터 CAR로서 발현된다. 예를 들어, 어느 하나 이상의 IL6, IL10 및 IFNγ는 표적될 수 있다. 일부 구현예에서, 케모카인 또는 사이토카인의 발현은 케모카인 또는 사이토카인 또는 이의 수용체를 표적하는 차단 scFv 단편의 발현에 의해 차단될 수 있다. 그와 같은 액세서리 모듈의 비-제한 예는 하기를 포함한다: IL6R-304-vHH (서열번호: 884 및 2647), IGHSP2-IL6R-304-VHH-ALB8-VHH (서열번호: 886 및 2649), CD8SP2-PD1-4H1-scFv (서열번호: 889 및 2652), CD8SP2-PD1-5C4-scFv CD8SP2-CTLA4-이필리무맙-scFv (서열번호: 891 및 2654), CD8SP2-PD1-4H1-Alb8-vHH (서열번호: 892 및 2655), CD8SP2-PD1-5C4-Alb8-vHH (서열번호: 893 및 2656), CD8SP2-CTLA4-이필리무맙-Alb8-vHH (서열번호: 894 및 2657), IgSP-IL6-19A-scFV (서열번호: 899 및 2662), CD8SP2-sHVEM (서열번호: 901 및 2664), CD8SP2-sHVEM-Alb8-vHH (서열번호: 902 및 2665), hTERT (서열번호: 903 및 2666), 헤파리나제 (서열번호: 904 및 2667), IL12F (서열번호: 863 및 2626), 41BB-L (서열번호: 864 2627), CD40L (서열번호: 865 2628) 및 shRNA 표적 Brd4 (서열번호: 919). 본 발명의 신규한 백본 1-62 및 종래의 CARs를 클로닝하는데 사용될 수 있는 H1 프로모터-유도된 shRNA 표적 Brd4를 발현시키는 예시적 벡터는 pLenti-EF1a-shRNA-BRD4-DWPRE (서열번호: 920)이다. shRNA 표적 Brd4를 공발현시키는 백본 1에서 예시적 CAR은 pLenti-EF1a-CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC-H1-prom-shRNA-BRD4-DWPRE (서열번호: 921)이다.
모세관 누출 증후군은 CARs의 또 다른 주요 합병증이다. 피브린의 천연 플라스민 소화 생성물, 펩타이드 BB15-42 (또한 FX06으로 불림)은 혈관 누출을 상당히 감소시키는 것으로 나타났다 (Groger 등, PLoS ONE 4:e5391, 2009). FX06 펩타이드는 모세관 누출을 차단하는 것으로 나타났다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, FX06 (서열번호: 900 및 2663)은 CAR 요법과 관련된 모세관 누출을 저감시키기 위해 동일한 벡터로부터 본 명세서에서 기재된 CARs와 공발현될 수 있다. 핵산 그리고 예시적 CAR 공-발현 FX06의 단백질 서열은 서열번호: 1764 및 3509, 각각으로 표시된다.
T 세포로 입양 세포 요법에 대하여 현행 기술의 제한은, 환자에 주입된 경우, 유전적으로 변형된 T 세포, 예컨대 CAR-T 세포의 제한된 수명이다. 유전적으로-변형된 T 세포의 수명을 연장시키기 위해, T 세포의 증식을 자극하는 및/또는 활성화-유도된 세포사로부터 이들을 보호하는 수많은 바이러스 및 세포 단백질과 함께 CARs를 발현시키는 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 이들 단백질의 용도는, 그러나, CAR-발현 T 세포에 제한되지 않고 이들은, 비제한적으로 임의의 T 세포 (예를 들면, 자가조직 T 세포 또는 동종이계 T 세포), T 세포 서브셋 (예를 들면, CD8, CD4, TILs), 특이적 종양 항원 또는 감염원에 관한 T 세포, 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 T 세포 (즉, TCR 유전자 요법), 및 합성 또는 키메라 T 세포 수용체를 발현시키는 T 세포를 포함하는, 입양 면역요법의 목적을 위하여 사용되어야 하는 임의의 면역 세포의 수명을 연장시키는데 사용될 수 있다. CAR-발현 T 세포의 증식 및 생존을 촉진시킬 수 있는 몇 개의 단백질의 DNA 및 단백질 서열은 서열번호; 862-882 및 서열번호: 2625-2645, 각각에서 제공된다 (표 16). 예시적 구현예에서, 이들 단백질은 어느 하나 이상의 바이러스성 단백질 K13-vFLIP (서열번호: 866 및 2629) 및 MC159-vFLIP (서열번호: 867 및 2630)을 본 명세서에서 기재된 바와 같이 포함한다. 추가 구현예에서, 이들 단백질은 cFLIP-L/MRIT-알파 (서열번호: 873 및 2636) 및 cFLIP-p22 (서열번호: 874 및 2637)을 포함한다. 추가 구현예에서, 이들 단백질은 인간 T 세포 백혈병/림프종 바이러스 (HTLV-1 및 HTLV-2) (서열번호: 875-877 및 서열번호: 2638-2640)으로부터 Tax 및 Tax-돌연변이체, 헤르페스 바이러스 아텔레스로부터 Tio 단백질, 헤르페스 바이러스 사이미리로부터 stpC Tip의 어느 1, 2 또는 초과를 포함한다. T 세포의 생존 및 증식을 촉진시키기 위한 바이러스 및 세포 단백질의 용도는, 그러나, CAR-발현 T 세포에 제한되지 않는다. 추가 구현예에서, 이들 바이러스 및 세포 단백질은, 외인성 T 세포 수용체 또는 합성 T 세포 수용체를 발현시키는 것을 포함하는, 임의의 T 세포의 생존 및 증식을 촉진시키는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, T 세포의 증식을 자극하는 것 및/또는 활성화-유도된 세포사로부터 이들을 보호하는 것으로 공지되는 바이러스 및 세포 단백질은 CAR-발현 세포에서 구성적으로 발현될 수 있다. 또 다른 구현예에서, T 세포의 증식을 자극하는 것 및/또는 활성화-유도된 세포사로부터 이들을 보호하는 것으로 공지되는 바이러스 및 세포 단백질은, 예를 들어, 유도성 프로모터를 사용하여 유도성 방식으로 CAR-발현 세포에서 발현될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는, 비제한적으로 메탈로티오닌 유도성 프로모터, 글루코코르티코이드 유도성 프로모터, 프로게스테론 유도성 프로모터, 및 테트라사이클린 유도성 프로모터를 포함한다. RheoSwitch® 시스템은 본 발명의 CAR의 발현 제어용 또 다른 전사 조절자 플랫폼을 표시한다 (Agarwal 등, 2012, AACR-NCI-EORTC international conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics). 또 다른 구현예에서, T 세포의 증식을 자극하는 것 및/또는 활성화-유도된 세포사로부터 이들을 보호하는 것으로 공지되는 바이러스 및 세포 단백질의 활성은 이량체화 도메인와 융합으로 이들의 발현에 의해 제어된다. 이량체화 도메인의 비-제한 예는 FKBP (서열번호: 857-858 및 서열번호: 2620 및 2621), FKBPx2 (서열번호: 859 및 2622) 및 Myr-FKBP를 포함한다. FKBP 도메인과 융합으로 몇 개의 바이러스 및 세포 단백질의 비-제한 예는 서열번호: 878-882 및 서열번호: 2641 내지 2645에서 제공된다 (표 16). FKBP 이량체화 도메인(들)과 융합으로 바이러스성 단백질을 공발현시키는 예시적 CAR 작제물의 DNA 및 단백질 서열은 서열번호: 1755 내지 1758 및 서열번호: 3500 내지 3503에서 제공된다.
또한, Src 억제제는 CAR-발현 세포의 투여와 관련된 독성을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, Src 억제제는 유전적으로 변형된 T 세포 (예를 들면, CAR 또는 외인성 TCR 또는 키메라 TCR를 발현시키는 T 세포), 이중특이적 T 세포 연관체 (BiTE) 및 DARTs (이중 친화도 Re-표적 단백질)의 용도와 관련된 사이토카인 방출 증후군 및 신경적 합병증의 치료에 특히 유용하다.
하나 이상의 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량, 하나 이상의 CARs 및 적어도 하나의 액세서리 모듈을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량 (백본 1-62), 하나 이상의 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 치료적 유효량, 하나 이상의 CARs 및 적어도 하나의 액세서리 모듈을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 치료적 유효량 (백본 1-62), 하나 이상의 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량, 또는 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 하나 이상의 종래의 CARs 및 적어도 하나의 액세서리 모듈을 인코딩하는 핵산 (백본 1-62)를 포함하는, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료 방법이 본 명세서에서 또한 제공된다. 일 구현예에서, 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 및 유전적으로 변형된 세포는 종래의 CAR II를 포함한다. 일 구현예에서, 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 및 유전적으로 변형된 세포는, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-1을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 및 유전적으로 변형된 세포는, 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-32를 포함한다. 일 구현예에서, CAR에 의해 치료된 또는 예방된 질환은 암이다. 다른 구현예에서, CARs에 의해 치료된 또는 예방된 질환은 감염성 질환, 알러지성 질환, 자가면역 질환, 퇴행성 질환, 또는 이의 조합이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 종래의 CARs를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료, 억제, 증증도 감소, 전이 예방 및/또는 재발 감소 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 본 명세서에서 기재된 바와 같이종래의 CAR II를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 CARs 및 적어도 하나의 액세서리 모듈을 인코딩하는 핵산 (백본 1-62)를 포함하는 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 암의 치료, 억제, 증증도 감소, 전이 예방 및/또는 재발 감소 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-1을 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-32를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, CARs를 인코딩하는 벡터는 암 세포에서 2, 3 또는 초과 항원을 표적한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 CARs를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 세포의 투여에 의해 치료된 또는 예방된 질환은 암이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 CARs를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 세포의 투여에 의해 치료된 또는 예방된 질환은 감염성 질환, 알러지성 질환, 자가면역 질환, 퇴행성 질환, 또는 이의 조합이다.
예시적 구현예에서, 암은 하기이다: 임의의 결장 암, 직장 암, 신장-세포 암종, 간 암, 폐의 비-소 세포 암종, 소장의 암, 식도의 암, 흑색종, 골 암, 췌장 암, 피부 암, 두경부의 암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 항문 영역의 암, 위 암, 고환 암, 자궁 암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 소아기의 고체 종양, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 원발성 삼출 림프종, 종양 혈관신생, 척추 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피모양 암, 편평상피 세포 암, T-세포 림프종, 환경적으로 유도된 암, 상기 암의 조합, 및 상기 암의 전이성 병변.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 혈액 암의 치료, 억제, 증증도 감소, 전이 예방 및/또는 재발 감소 방법이 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 상기 유전적으로 변형된 세포는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 종래의 CAR II를 인코딩하는 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 혈액 암의 치료, 억제, 증증도 감소, 전이 예방 및/또는 재발 감소 방법이 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 세포는, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-1을 인코딩하는 벡터 또는, CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-32를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, CAR의 ASD는 MPL을 표적한다. 예시적 구현예에서, MPL를 표적하는 종래의 CAR II는 표 21 및 22에서 기재되고 서열번호: 1657-1664 및 1731-1739에서 제시된 핵산 서열을 포함하고 서열번호: 3402-3409 및 3476-3484에서 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 예시적 구현예에서, MPL을 표적하는 종래의 CAR I 및 공발현 K13-vFLIP (백본 1)은 표 19에서 기재되고 서열번호: 1117-1124 및 1747에서 제시된 핵산 서열을 포함하고 서열번호: 2862-2869 및 3492에서 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 예시적 구현예에서, MPL를 표적하는 종래의 CAR II 및 공발현 K13-vFLIP (백본 32)는 표 20 및 22에서 기재되고 서열번호: 1387-1394 및 1747에서 제시된 핵산 서열을 포함하고 서열번호: 3132-3139 및 3492에서 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. MPL를 표적하는 CARs를 발현시키는 세포의 투여에 의해 치료된 또는 예방된 혈액 암의 비-제한 예는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 CD19를 발현시키는 암 (예를 들면, B 세포 급성 림프구성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프구성 백혈병, 미만성 큰 세포 림프종, 무통성 림프종)의 치료, 억제, 증증도 감소, 전이 예방 및/또는 재발 감소 방법이 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 세포는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 CD19를 표적하는 종래의 CAR II를 인코딩하는 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 CD19 발현 암의 치료, 억제, 증증도 감소, 전이 예방 및/또는 재발 감소 방법이 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 세포는, CD19 및 K13-vFLIP를 표적하는 종래의 CAR I을 포함하는, 백본-1을 인코딩하는 벡터 또는, CD19 및 K13-vFLIP를 표적하는 CAR II를 포함하는, 백본-32를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 종래의 CAR II는 표 21에서 기재되고 서열번호: 1470-1480에서 제시된 핵산 서열을 포함하고 서열번호: 3215-3225에서 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 종래의 CAR I 및 공발현 K13-vFLIP (백본 1)은 표 19에서 기재되고 서열번호: 927-941에서 제시된 핵산 서열을 포함하고 서열번호: 2672-2686에서 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 예시적 구현예에서, CD19를 표적하는 종래의 CAR II 및 공발현 K13-vFLIP (백본 32)는 표 20 및 22에서 기재되고 서열번호: 1197-1211 및 1759에서 제시된 핵산 서열을 포함하고 서열번호: 2942-2956 및 3504에서 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 GRP-78 발현 암의 치료, 억제, 증증도 감소, 전이 예방 및/또는 재발 감소 방법이 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 세포는, 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-1을 인코딩하는 벡터 또는, CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는, 백본-32를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, CAR의 ASD는 GRP-78을 표적한다. 예시적 구현예에서, GRP-78 및 액세서리 모듈을 표적하는 CARs는 표 22에서 기재되고 서열번호: 1771 및 1775에서 제시된 핵산 서열을 포함하고 서열번호: 3516 및 3520에서 제시된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명으로 사용하기 위한 추가의 항원 표적, CAR 작제물 및 액세서리 모듈은 종래 기술의 숙련가에 분명할 것이다. 예시적 구현예는 표 2-22에서 제시된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 치료적 유효량은, 그 범위 내에 모든 정수 값을 포함하는, 104 내지 109 세포/kg 체중, 일부 사례에서 105 내지 106 세포/kg 체중의 투약량으로 투여된다. T 세포 조성물은 또한 이들 투약량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 통상적으로 공지되는 주입 기술 사용에 의해 투여될 수 있다 (참고, 예를 들면, Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). 세포는 병변의 부위에 주사 (예를 들면, 종양내 주사)로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료 방법은 대상체에, 순차적으로 또는 동시에, 현존하는 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 현존하는 암 치료의 예는, 비제한적으로, 활성 감시, 관찰, 수술 개입, 화학요법, 면역요법, 방사선 요법 (예컨대 외부 빔 방사선, 뇌정위적 방사선수술 (감마 나이프), 및 분획화된 뇌정위적 방사선요법 (FSR)), 초점 요법, 전신 요법, 백신 요법, 바이러스성 요법, 분자 표적된 요법, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료 방법은 대상체에, 순차적으로 또는 동시에, 어느 하나 이상의 키나제 억제제, BTK 억제제, mTOR 억제제, MNK 억제제, BRD4 억제제 또는 이중 PI3K/mTOR 억제제, 또는 이의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 키나제 억제제는 Src 계열 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙이다.
일 구현예에서, 키나제 억제제는, 리보시클립, 아베마시클립 및 팔보시클립으로부터 선택된, CDK4 억제제, 예컨대 CDK4/6 억제제이다.
일 구현예에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어, 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI-027이다. mTOR 억제제는, 예를 들어, mTORCl 억제제 및/또는 mTORC2 억제제일 수 있다.
일 구현예에서, 키나제 억제제는 MNK 억제제, 예를 들어, 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로 [3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제제는, 예를 들어, MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b의 억제제일 수 있다. 이중 PI3K/mTOR 억제제는, 예를 들면, PF-04695102일 수 있다.
일 구현예에서, 억제제는 US 20140256706 A1에서 기재된 바와 같이 JQ1, MS417, OTXO15, LY 303511 및 Brd4 억제제로부터 선택된 Brd4 억제제 및 이의 임의의 유사체이다.
본 명세서에서 기재된 방법의 일 구현예에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들면, 팔보시클립 (PD0332991)이고, 팔보시클립은 일정한 기간 동안 매일, 예를 들면, 28 일 사이클의 14-21 일 동안 매일, 또는 21 일 사이클의 7-12 일 동안 매일 약 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (예를 들면, 75 mg, 100 mg 또는 125 mg)의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 팔보시클립의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 초과 사이클이 투여된다.
본 명세서에서 기재된 방법의 일 구현예에서, 키나제 억제제는 이브루티닙 (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제제이다. 일 구현예에서, BTK 억제제는 인터류킨- 2-유도성 키나제 (ITK)의 키나제 활성을 감소 또는 억제시키지 않고, GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된다. 본 명세서에서 기재된 방법 또는 용도의 일 구현예에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들면, 이브루티닙 (PCI-32765)이고, 이브루티닙은 일정한 기간 동안 매일, 예를 들면, 21 일 사이클 동안 매일, 또는 28 일 사이클 동안 매일 약 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (예를 들면, 250 mg, 420 mg 또는 560 mg)의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 이브루티닙의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 초과 사이클이 투여된다.
본 명세서에서 기재된 방법 또는 용도의 일 구현예에서, 키나제 억제제는 ITK, 예를 들면, RN-486의 키나제 활성을 억제시키지 않는 BTK 억제제이고, RN-486은 일정한 기간 동안 매일, 예를 들면, 28 일 사이클 매일 약 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, 220 mg, 230 mg, 240 mg, 250 mg (예를 들면, 150 mg, 200 mg 또는 250 mg)의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, RN-486의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 초과 사이클이 투여된다.
본 명세서에서 기재된 방법의 일 구현예에서, 키나제 억제제는 하기로부터 선택된 mTOR 억제제이다: 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디하이드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.0]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시사이클로헥실 디메틸포스피네이트, 또한 AP23573 및 MK8669로서 공지됨; 에버롤리무스 (RAD001); 라파마이신 (AY22989); 시마피모드; (5-{2,4-비스[(35")-3-메틸모폴린-4-일]피리도[2,3-(i]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[이란5-4-(2-하이드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-J|피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-a-아스파르틸L-세린-, 분자내 염 (SF1126); 및 XL765.
본 명세서에서 기재된 방법 또는 용도의 일 구현예에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들면, 라파마이신이고, 라파마이신은 일정한 기간 동안 매일, 예를 들면, 21일 사이클 동안 매일, 또는 28 일 사이클 동안 매일 약 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (예를 들면, 6 mg)의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 라파마이신의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 초과 사이클이 투여된다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들면, 에버롤리무스이고 에버롤리무스는 일정한 기간 동안 매일, 예를 들면, 28 일 사이클 동안 매일 약 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (예를 들면, 10 mg)의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 에버롤리무스의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 초과 사이클이 투여된다.
본 명세서에서 기재된 신규한 백본에서 CARs 또는 종래의 CARs를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 유전적으로 조작된 세포의 제조 방법이 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 이펙터 세포, 예컨대 인간 T 세포 또는 인간 NK 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생기게 하는 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 자가조직 인간 T 세포 또는 자가조직 인간 NK 세포 또는 자가조직 인간 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 동종이계 인간 T 세포 또는 동종이계 인간 NK 세포 또는 동종이계 인간 줄기 세포이다.
일 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 제조 방법은 세포의 모집단 수득 그리고, 예를 들어 CD25에 특이적인 항체를 사용함으로써 CD25+ T 조절 세포의 세포 고갈을 포함한다. 세포의 모집단으로부터 CD25+ T 조절 세포의 고갈 방법은 종래 기술의 숙련가에 분명할 것이다. 일부 구현예에서, Treg 고갈된 세포는 30%, 20%, 10%, 5% 또는 미만 Treg 세포보다 적게 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs를 인코딩하는 벡터는 Treg 고갈된 세포에 형질감염된다.
일부 구현예에서, 형질감염에 앞서, Treg 고갈된 세포는 체크포인트 억제제를 발현시키는 세포가 추가로 고갈된다. 체크포인트 억제제는 PD-1, LAG-3, TIM3, B7-H1, CD160, P1H, 2B4, CEACAM (예를 들면, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), TIGIT, CTLA-4, BTLA, 및 LAIR1의 어느 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 체크포인트 억제제를 발현시키는 30%, 20%, 10%, 5% 또는 미만 세포보다 적게 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs를 인코딩하는 벡터는 Treg 고갈된 및 체크포인트 억제제 고갈된 세포에 형질감염된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 제조 방법은 세포의 모집단 수득 그리고 CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO의 어느 하나 이상을 발현시키는 세포 선택을 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 면역 이펙터 세포의 모집단은 CD3+ 및/또는 CD28+이다.
일 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 제조 방법은 세포의 모집단 수득 그리고, 예를 들어 CD25에 특이적인 항체를 사용함으로써, CD25+ T 조절 세포 풍부화를 포함한다. 세포의 모집단으로부터 CD25+ T 조절 세포 풍부화 방법은 종래 기술의 숙련가에 분명할 것이다. 일부 구현예에서, Treg 풍부한 세포는 30%, 20%, 10%, 5% 또는 미만 비-Treg 세포보다 적게 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs를 인코딩하는 벡터는 Treg-풍부한 세포에 형질감염된다. CAR을 발현시키는 Treg 풍부한 세포는 CAR에 의해 표적된 항원에 유도된 내성에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 본 명세서에서 기재된 CARs를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 세포 속에 형질감염된 후 세포의 모집단을 팽창시키는 것을 추가로 포함한다. 구현예에서, 세포의 모집단은 8 일 이하의 기간 동안 팽창된다. 특정 구현예에서, 세포의 모집단은 5 일 동안 배양물에서 팽창되고, 수득한 세포는 동일한 배양 조건 하에 9 일 동안 배양물에서 팽창된 동일한 세포보다 더 강하다. 다른 구현예에서, 5 일 동안 배양물에서 팽창된 세포의 모집단은 동일한 배양 조건 하에 9 일 동안 배양물에서 팽창된 동일한 세포에 비교된 경우 항원 자극시 세포 배증에서 적어도 1, 2, 3 또는 4 배수 증가를 보여준다. 일부 구현예에서, 세포의 모집단은, 유세포측정에 의해 측정된 경우, 14 일 팽창 기간 동안 세포에서 적어도 200-배, 250-배, 300-배, 또는 350-배 증가를 초래하는 하나 이상의 인터류킨을 포함하는 적절한 배지에서 팽창된다.
다양한 구현예에서, 팽창된 세포는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 CARs를 포함한다. 일부 구현예에서, 팽창된 세포는 1, 2, 3 또는 초과 ASDs와 하나의 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 팽창된 세포는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 액세서리 모듈 및 치료 대조군을 추가로 포함한다.
K13-vFLIP, MC159-vFLIP, cFLIP-L, cFLIP-p22, HTLV1-Tax 및 HTLV2-Tax로부터 선택된 신호전달 단백질의 하나 이상 그리고 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR은 a) 세포외 항원 특이적 도메인, b) 막관통 도메인 및 c) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 c)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 공-자극 도메인을 추가로 포함한다.
K13-vFLIP 신호전달 단백질 그리고 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR은 a) 세포외 항원 특이적 도메인, b) 막관통 도메인 및 c) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 c)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 공-자극 도메인을 추가로 포함한다.
MC159-vFLIP 신호전달 단백질 그리고 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포가 본 명세서에서 또한 제공되고, 여기서 CAR은 a) 세포외 항원 특이적 도메인, b) 막관통 도메인 및 c) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 c)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 공-자극 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 세포는 MC159-vFLIP 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 IL6 및/또는 IL6 수용체 알파를 표적하는 scFvs를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 CAR 요법과 관련된 모세관 누출을 저감시키기 위해 펩타이드 FX06을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달 단백질은 FKBP 도메인의 하나 이상의 카피와 융합으로 발현된다. 일부 구현예에서, 신호전달 단백질의 활성은 이량체화제의 존재 하에 FKBP 도메인의 이량체화에 의해 번역후에 제어된다. 일부 구현예에서, 이량체화제는 AP20187이다.
예시적 구현예에서, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 2 항원을 표적하고, 여기서 상기 2 항원은 MPL 및 CD123이다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19, CD23, Lym1, Lym2, CLEC5A, CDH179b, FLT3, GCC, Muc1, CSF2RA, GFRa4, CD32, IL11Ra, IL13Ra, NYBR1, SLea, 　CD200R, TGFBetaR2, CD276, TROP2, LAMP1, PTK7, DLL3, CDH1, CDH6, CDH17, CDH19, TSHR 및 티로시나제를 표적한다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL을 표적하고 161 (서열번호: 2500 및 2501), 175 (서열번호: 2499), 178 (서열번호: 2503), 111 (서열번호: 2502), AB317 (서열번호: 2404), 12E10 (서열번호: 2505) 또는 huVB22Bw5 (서열번호: 2506)으로부터 선택된 하나 이상의 scFv 단편 또는 hTPO (서열번호: 2323) 또는 mTPO (서열번호: 2323)의 세포외 수용체 결합 도메인으로부터 선택된 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19를 표적하고 CD19Bu12 또는 CD19MM으로부터 선택된 하나 이상의 scFv 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 세포는 T-림프구 (T-세포)이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다.
청구항의 CAR을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 그리고 K13-vFLIP 신호전달 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산이 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 MC159-vFLIP 신호전달 단백질을 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 본 명세서에서 기재된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 그리고 본 명세서에서 기재된 핵산을 인코딩하는 벡터가 본 명세서에서 또한 제공된다.
본 명세서에서 기재된 세포, 본 명세서에서 기재된 핵산, 본 명세서에서 기재된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 또는 본 명세서에서 기재된 핵산, 그리고 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 추가로 제공된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 세포의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 MPL-발현 암의 치료 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CAR은 MPL을 표적한다. 일부 구현예에서, 암은 혈액 암이고, 여기서 혈액 암은 어느 하나 이상의 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 림프종, 다발성 골수종 및 급성 림프구성 백혈병이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 티로신 키나제 억제제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 억제제는 키나제의 Src 계열을 억제시킨다. 일부 구현예에서, 억제제는 Lck를 억제시킨다. 일부 구현예에서, 억제제는 어느 하나 이상의 다사티닙, 포나티닙 또는 A-770041이다.
예시적 구현예는 언급된 도에서 설명된다. 본 명세서에서 개시된 구현예 및 도가 제한적보다는 설명적인 것으로 간주되도록 의도된다.
도 1은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, CARs의 3 생성을 도시한다. 녹색으로 scFv 분절 그리고 적색, 청색 및 황색으로 다양한 TCR 신호전달 요소를 가진 제1, 제2, 및 제3 생성 키메라 항원 수용체의 도시 (Casucci, Monica and Attilio Bondanza (2011). Journal of Cancer. 2: 378-382)
도 2A-도 2D는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 하기를 도시한다, 도 2A: 정상 조직에서 MPL 유전자 발현. MPL은 정상 조직에서 매우 제한된 발현을 갖는다; 도 2B: 급성 골수성 백혈병의 542 환자 샘플에서 MPL 유전자 발현. MPL은 대부분의 AML 샘플에서 발현된다; 도 2C: 골수이형성 증후군 (MDS)의 206 샘플에서 MPL 유전자 발현. MPL은 대부분의 MDS 샘플에서 발현된다. 도 2D: CML의 76 샘플에서 MPL 유전자 발현. MPL은 대부분의 CML 샘플에서 발현된다.
도 3A-도3B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 내인성으로 MPL의 상당한 발현을 시사하는 HEL.92.1.7-Gluc-벡터 세포에서 관측된 161-GGSG-NLuc-AcV5와 강한 결합을 도시한다.
도 4A-도 4B는 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 293FT 세포에서 CAR의 발현을 측정하기 위한 NLuc 검정을 도시한다. 미형질감염된 293FT 세포, 그리고 CAR CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] 및 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] CAR로 형질감염된 것은 물질 및 방법 부문에서 기재된 바와 같이 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5[서열번호: 926] 및 MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5[서열번호: 925]상청액으로 인큐베이션되었고 이어서 PBS로 세정되었고 PBS에서 희석된 코엘레오엔트라진 (CTZ; Nanolight)에 의해 NLuc 활성이 측정되었다. 발광은 BioTek 플레이트 리더를 이용하여 정량화되었다. 데이터는 삼중 웰의 평균 값 +/- 표준 편차 (SD)를 표시한다.
도 5는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, hTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-U04)[서열번호:1738] 및 mTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-V03)[서열번호:1739] 작제물로 형질감염된 MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 내지 293FT 세포의 보통의 결합 그리고 대조군 CAR 작제물로 형질감염된 세포 또는 미형질감염된 세포에 비교된 경우 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] 작제물로 형질감염된 293FT 세포에 강한 결합을 도시한다.
도 6은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포 (UI)에 비교된 경우 APC-Myc로 증가된 염색 및 증가된 EGFP 형광에 의해 결정된 바와 같이 T 세포의 표면에서 MPL CARs의 발현을 도시한다.
도 7은, 본 발명의, 다양한 구현예에 따르면, NLuc 검정에 의해 측정된 경우 MPL-GGSG-NLuc AcV5 상청액에 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735] 및 CD8SP-12E10-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-S03)[서열번호:1736]을 발현시키는 T 세포의 보통의 결합 그리고 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], 및 CD8SP-MPL-VB22Bw4-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-B06)[서열번호:3536] CARs를 발현시키는 T 세포의 강한 결합을 도시한다. 서열번호 925는 MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5를 포함한다. 서열번호: 926은 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5를 포함한다. 서열번호: 1734는 CD8SP-178-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-R04)를 포함한다. 서열번호: 3534는 CD8SP-4C3-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-Pac(031615-W05)를 포함한다.
도 8은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 상이한 MPL-CAR-T 세포에 의해 표적 세포의 용해를 나타내는 미감염된 T 세포에 비교된 경우 MPL-특이적 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732]를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후 GLuc 활성에서 증가를 도시한다.
도 9는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] PBMC 또는 미감염된 PBMC에 비교된 경우 PBMC를 발현시키는 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] CAR에 의한 HEL-GLuc 세포의 증가된 사멸을 도시한다.
도 10은, 본 발명의 구현예에 따르면, 미감염된 PBMC에 비교된 경우 PBMC를 발현시키는 CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733] CAR에 의한 HEL-GLuc 세포의 증가된 사멸을 도시한다.
도 11은, 본 발명의 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포에 비교된 경우 CD8SP-178-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-R04)[서열번호:1734] 작제물로 보통이었고 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], 및 CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735] 작제물로 더 강하였던, MPL-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-발현 이후, 표적 세포의 용해를 나타내는, GLuc 활성에서 증가를 도시한다.
도 12는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포에 비교된 경우 CD8SP-178-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-R04)[서열번호:1734] 및 CD8SP-VB22Bw4-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-B06)[서열번호:3536] 작제물로 보통이었고 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735], 및 CD8SP-12E10-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-S03)[서열번호:1736] 작제물로 더 강하였던, MPL-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-발현 이후, 표적 세포의 용해를 나타내는, GLuc 활성에서 증가를 도시한다.
도 13은, 본 발명의 구현예에 따르면, MPL-특이적 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732] CAR을 발현시키는 NK92MI 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 나타내는, GLuc 활성에서 증가를 도시한다.
도 14는, 본 발명의 구현예에 따르면, MPL-특이적 CARs를 발현시키는 NK92MI 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 나타내는, GLuc 활성에서 증가를 도시한다.
도 15는, 본 발명의 구현예에 따르면, 대조군으로서 사용된 미감염된 T 세포에 비교된 경우 HEL 세포로 MPL을 표적하는 CAR을 발현시키는 T 세포의 공배양시 TNFα의 증가된 분비를 도시한다.
도 16은, 본 발명의 구현예에 따르면, CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732] 발현 NK92MI 세포가 주어진 마우스의 중앙 생존이 31.5 일이었고, 이는 비변형된 NK92MI 세포가 주어진 마우스 (28.5 일; p = 0.03) 또는 대조군 CD8SP-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(100814-K06)[서열번호:3537] CAR을 발현시키는 NK92MI 세포가 주어진 것 (28 일; p=.04)보다 상당히 더 높았다.
도 17은, 본 발명의 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포 (UI; 점선으로 표시됨)에 비교된 경우 APC-Myc로 염색에 의해 결정된 바와 같이 T 세포의 표면에서 (회색 선으로 표시된) 상이한 CD19 CARs의 증가된 발현을 도시한다. 도시된 작제물은 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]; CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470]; CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]; CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643]을 포함한다.
도 18은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 [서열번호:2671] 상청액에 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470], CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471] 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] CAR 작제물을 발현시키는 Jurkats의 강한 결합을 도시하고, 반면에 상당한 결합은 친계 세포 또는 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643] 대조군 CAR을 발현시키는 것에서 관측되지 않았다.
도 19는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 [서열번호:2671] 상청액에 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470], CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471] 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] CAR 작제물을 발현시키는 T 세포의 강한 결합을 도시하고, 반면에 상당한 결합은 친계 세포 또는 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643] 대조군 CAR을 발현시키는 것에서 관측되지 않았다.
도 20은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포 (T-UI) 또는 대조군 CAR 4C3을 발현시키는 것에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, RAJI 표적 세포의 용해를 나타내는, GLuc 활성에서 증가를 도시한다. 도시된 작제물은 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]; CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]; CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470]; CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643]을 포함하고; (-)는 CAR-형질도입된 T 세포가 푸로마이신 선택 없이 사용되었다는 것을 나타내고; (+)는 CAR-형질도입된 T 세포가 푸로마이신 선택과 함께 사용되었다는 것을 나타낸다.
도 21은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포 (T-UI) 또는 대조군 CAR 4C3을 발현시키는 것에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, RAJI 표적 세포의 용해를 나타내는, GLuc 활성에서 증가를 도시한다. 도시된 작제물은 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]; CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]; CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643]을 포함하고; (-)는 CAR-형질도입된 T 세포가 푸로마이신 선택 없이 사용되었다는 것을 나타내고; (+)는 CAR-형질도입된 T 세포가 푸로마이신 선택과 함께 사용되었다는 것을 나타낸다.
도 22는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 특이적 그룹에서 마우스의 생존을 도시한다.
도 23은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포에 비교된 경우 K13-발현 T 세포에서 FITC-FLAG 항체로 증가된 염색을 도시한다. K13 불멸화된 T 세포는 CD8+/CD4- (49%), CD8-/CD4+ (21%) 및 CD8+/CD4+ (29%)이다.
도 24는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 푸로마이신으로 선택된 T-세포를 발현시키는 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467], 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(111014-Y11)[서열번호:1197]이 Gluc 검정에 의해 측정된 경우 RS411 세포의 특이적 용해를 유도한다는 것을 도시한다.
도 25는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 미감염된 T 세포 (T-UI) 또는 대조군 CAR 4C3을 발현시키는 것에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 나타내는, GLuc 활성에서 증가를 도시한다.
도 26은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, K13, MC159 또는 HTLV2-Tax (Tax2)의 편입이 41BB 공자극 도메인의 존재로 또는 존재 없이 CARs의 사멸 능력에 부정적으로 영향을 미치지 않는 것을 확인한다, 도시한다.
도 27은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, MC159 및 HTLV2-Tax를 공-발현시킨 CAR 작제물을 발현시키는 T 세포가 배양물에서 2 개월 후 세포독성을 계속해서 발휘하고 반면에 MC159 및 HTLV2-Tax가 부족한 작제물을 발현시키는 T 세포가 이 능력을 상실한다는 것을 도시한다.
도 28A-도 28B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, AP20187로 치료가 K13 및 HTLV2-Tax 돌연변이체가 FKBP와 융합으로 발현된 모든 작제물내 K13- 및 HTLV2-Tax RS 돌연변이체-유도된 NF-κB-Luc 활성에서 증가로 이어졌다는 것을 도시한다. 도 28A에서 도시된 작제물은 FKBPX2-K13[서열번호: 879]; CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-EGFP(112614-B06)[서열번호:1755]; CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-FKBP-K13-Flag-T2A-EGFP(112614-E05)[서열번호:1744]; CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBPx2-K13-FLAG-T2A-EGFP(120314-J03)[서열번호:1756]; 및 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-Myr-FKBPx2-K13-FLAG-T2A-EGFP(120314-N07)[서열번호:1757]을 포함한다. 도 28B에서 도시된 작제물은 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-FKBPx2-FLAG-TAX2U2RS-T2A-eGFP-M03(012315-03)[서열번호:3539]; 및 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-FKBPx2-HTLV2-Tax-RS-T2A-EGFP(012315-O01)[서열번호:1758]을 포함한다.
도 29A-도 29B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, AP20187의 첨가로 K13-매개된 NF-κB 활성의 활성화가 FKBP-K13을 공발현시키는 CAR 작제물에 의해 유도된 세포 사멸에 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 도시한다. 도 29A에서 도시된 작제물은 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-PAC(112316-S06)[서열번호:1770]을 포함한다. 도 29B에서 도시된 작제물은 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-PAC(112916-U06)[서열번호: 1741]을 포함한다.
도 30A-도 30B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, K13, MC159, HTLV2-Tax 또는 HTLV2-Tax RS 돌연변이체를 공발현시키는 상이한 MPL-유도된 및 CD32-유도된 CAR 작제물에 의한 표적 세포사의 유도를 도시한다.
도 31은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, K13을 공발현시키는 TROP2-유도된 종래의 CAR I 작제물에 의한 PC3-표적 세포사의 유도를 도시한다.
도 32A-도 32B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, K13을 공발현시키는 상이한 LAMP1-유도된 CAR 작제물에 의한 표적 세포사의 유도를 도시한다.
도 33은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, AP20187 화합물의 첨가로 FKBP-K13 융합 단백질을 발현시키는 T 세포에서 K13 신호전달의 활성화가 CAR-유도된 NFAT 신호전달의 활성화에 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 도시한다.
도 34는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 야생형 K13 및 다양한 K13 돌연변이체에 의한 NF-κB 리포터 활성을 도시한다.
도 35는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 50nM 및 100nM 다사티닙에 의한 CAR CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]-유도된 세포사의 억제를 보여주고, 반면 이마티닙은 효과가 없다는 것을 도시한다.
도 36은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 상이한 CD19-CAR-T 세포에 의한 표적 세포의 용해 그리고 지시된 용량으로 다사티닙 및 포나티닙에 의한 이의 억제를 나타내는 미감염된 T 세포 (T-UI)에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] 및 CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]을 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후 GLuc 활성에서 증가를 도시한다.
도 37은, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 다사티닙이 GLuc 검정에 의해 결정된 경우 CD8SP-CD22-m971-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(091515-A02)[서열번호:1519] CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 RAJI-GLuc 세포의 사멸을 효과적으로 차단시킨다는 것을 도시한다.
도 38A-도 38B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 도 38A: 다사티닙이 Gluc 검정에 의해 결정된 경우 K562 세포의 NK92 세포 매개된 사망을 차단하고 도 38B: 다사티닙이 Gluc 검정에 의해 결정된 경우 NK92MI 세포를 발현시키는 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(070814-D06)[서열번호:3535]에 의해 RAJI-GLuc 세포의 사망을 차단한다는 것을 도시한다.
도 39A-도 39B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 도 39A: T 세포의 존재 하에 블리나투모맙으로 치료가 100nM 다사티닙에 의해 효과적으로 차단되는 RAJI-GLuc 세포의 사망의 강한 유도를 초래한다는 것 그리고 도 39B: T 세포의 존재 하에 블리나투모맙과 RAJI-GLuc 세포의 공-배양이 100nM 다사티닙에 의해 효과적으로 차단되는 IFNγ 생산의 강한 유도를 초래한다는 것을 도시한다.
도 40A-도 40C는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 하기를 도시한다: 도 40A는 CAR T 세포로 공-배양되지 않은 RAJI-pLenti-Gluc 세포에서 다양한 약물의 상당한 독성 효과를 보여주지 못한다. 도 40B는 배지 (Med) 단독 (도 40A)로 치료된 세포에 비교된 경우 룩솔리티닙, 포사타마티닙 및 알리세팁에 의해 RAJI-pLenti-GLuc 세포의 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470] CAR-T 세포-유도된 사망의 온화한 내지 보통의 억제를 보여준다. 다사티닙은 양성 대조군으로서 사용되었다. 도 40C는 상기 화합물이 지시된 농도에서 T 세포에 의해 매개된 블리나투모맙 유도된 세포사에서 단지 최소 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
도 41A-도 41C는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 하기를 도시한다: 도 41A는 임의의 CAR-T 세포 없이 배지 단독의 존재 하에 지시된 약물로 치료된 세포에서 Gluc의 방출을 보여준다. 도 41B는 100nM 및 200nM로 A-770041에 의한 RAJI-pLenti-GLuc 세포의 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470] CAR-T 세포-유도된 사망의 거의 완전한 억제를 보여주고 반면 사라카티닙은 상당한 효과가 없었다. 아바시마이브는 CAR-T 세포 유도된 세포사에서 100nM로 상당한 효과가 없었지만 1μM로 완전히 차단시켰다. 도 41C는 100nM A770041로 치료가 T 세포와 블리나투모맙의 조합에 의해 유도된 세포사를 부분적으로 차단시켰고 반면 200nM A770041로 치료가 완전한 억제로 이어졌다는 것을 보여준다.
도 42A-도 42B는, 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, RAJI 세포와 CD8SP-FMC63(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6R-M83(vL-vH)-Flag-T2A-PAC(011315-K04)[서열번호:1763]을 발현시키는 Jurkat 세포의 공배양이 RAJI 세포에 노출되지 않았던 세포에 비교된 경우 EGFP 발현에서 증가로 이어졌다는 것을 도시한다 (도 42A). 이것은 NFAT 신호전달의 활성화를 나타낸다. EGFP 발현에서 증가는 RAJI로 배양 없이 또는 배양으로 친계 Jurkats (J-N-G-P)에서 관측되지 않았다 (도 42B).
본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 완전하게 제시된 것처럼 그 전문이 참고로 편입된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. Allen 등, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22 nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012); Hornyak 등, Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3 rd ed., Wiley-Blackwell (November 28, 2012); 및 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)는 본원에서 사용된 많은 용어에 일반적인 안내로 당해 분야의 숙련가에 제공한다. 항체의 제조 방법에 관한 참조문헌에 대하여, 참고 Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013); Koehler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9; Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, 미국 특허 번호 5,585,089 (1996 Dec); 및 Riechmann 등, Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7..
당해 분야의 숙련가는, 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는, 본 명세서에서 기재된 것과 유사한 또는 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 본 발명의 다른 피쳐 및 이점은, 예로써, 본 발명의 구현예의 다양한 피쳐를 설명하는, 수반되는 도면과 함께 하여, 하기 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다. 사실상, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 제한되지 않는다. 편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구항에서, 여기에서 이용된 특정 용어는 여기에서 수집된다.
달리 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 암시되지 않는 한, 하기 용어 및 어구는 아래 제공된 의미를 포함한다. 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 분명하지 않는 한, 아래 용어 및 어구는 용어 또는 어구가 그것이 관련하는 당해 분야에서 획득되었다는 의미를 배제하지 않는다. 정의는 특정 구현예 기재를 돕기 위해 제공되고, 청구된 발명을 제한하는 의도가 아닌 것은, 본 발명의 범위가 청구항에 의해서만 제한되기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
키메라 항원 수용체 (CAR)은, 입양 세포 전이로 불리는 기술을 이용하는, 암에 대한 요법으로서 조사중인 인공 T 세포 수용체이다. 조혈 세포는 환자로부터 제거되고 변형되어서 이로써 이들은 암의 특정한 형태에 특이적인 단백질을 인식하는 수용체를 발현시킨다. 그 다음 암 세포를 인식 및 사멸시킬 수 있는, 세포는 환자에 재도입된다. 인간 CD19 항원을 표적하는 CAR은 B 세포 계통 인간 혈액 암, 예컨대 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 림프종에 대해 인상적인 활성을 보여주었고 몇 개의 회사에 의해 상용 개발 중이다. 그러나, 비-림프양 세포에서 발현되는 항원을 표적하는 CAR을 개발하기 위한 필요성이 있다. 본 발명은 몇 개의 그와 같은 항원을 표적하는 CARs에 관한 것이다.
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는, 유용하든 아니든, 구현예에 유용하지만, 불특정된 요소의 봉입체에 개방하지 않은, 조성물, 방법, 및 이의 각각의 요소(들)과 관련하여 사용된다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어가 "개방형" 용어로서 일반적으로 의도되는 것이 당해 분야 내의 것에 의해 이해될 것이다 (예를 들면, 용어 "포함하는"은 "비제한적으로 포함하는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "비제한적으로 포함하다", 등으로서 해석되어야 한다).
달리 언급되지 않는 한, 본원의 특정 구현예 기재의 문맥에서 (특히 청구항의 문맥에서) 사용된 단수 용어 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 유사한 지칭은 양쪽 단수 및 복수를 포함하도록 해석될 수 있다. 본 명세서에서 값의 범위의 인용은 그 범위 내에 해당하는 각 별개의 값을 개별적으로 지칭의 속기 방법으로서 제공하도록 단지 의도된다. 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한, 각 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 편입된다. 본 명세서에서 기재된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 달리 명확히 반박하지 않는 한 임의의 적합한 차례로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 특정 구현예에 관하여 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적 언어 (예를 들어, "예컨대")의 용도는 본원을 단지 더 잘 명확하게 하기 위해 의도되고 달리 청구된 본원의 범위에서 제한을 두지 않는다. 약어, "예를 들면"은 라틴어 exempli gratia에서 유래되고, 비-제한 예를 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들면"은 용어 "예를 들어"와 동의어이다. 명세서에서 언어가 본원의 실시에 필수적인 임의의 비-청구된 구성요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 측정가능한 값 예컨대 양, 지속 시간, 및 기타 동종을 지칭하고, 지정된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 ±0.1%의 변화를 포괄한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 또는 "CARs"는, 세포 (예를 들어 T 세포 예컨대 미접촉 T 세포, 중심 메모리 T 세포, 이펙터 메모리 T 세포 또는 이의 조합)에 항원 특이성을 그라프팅하는, 조작된 수용체를 지칭한다. CARs는 인공 T-세포 수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 키메라 면역수용체로서 또한 공지된다. 다양한 구현예에서, CARs는 항원-특이적 도메인 (ASD), 힌지 영역 (HR), 막관통 도메인 (TMD), 공-자극 도메인 (CSD) 및 세포내 신호전달 도메인 (ISD)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드이다.
"항원-특이적 도메인" (ASD)는 표적 세포에서 항원을 특이적으로 결합시키는 CAR의 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 임의의 백본을 포함하는 CARs의 ASD는 항체 또는 이의 기능성 등가물 또는 이의 단편 또는 이의 유도체를 포함한다. 표적화 영역은 전장 중쇄, Fab 단편, 단일 쇄 Fv (scFv) 단편, 2가 단일 쇄 항체 또는 디아바디를 포함할 수 있고, 이들 각각은 표적 항원에 특이적이다. 그러나, 수많은 대안, 예컨대 (사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식을 유발시키는) 연결된 사이토카인, 아피바디, 자연 발생 수용체로부터 리간드 결합 도메인, (예를 들어 종양 세포에서) 수용체용 가용성 단백질/펩타이드 리간드, 펩타이드, 및 면역 반응을 유발시키기 위한 백신이 있고, 이들 각각은 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 고 친화도를 가진 주어진 항원을 결합시키는 거의 모든 분자는, 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되는 바와 같이, ASD으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, ASD는 T 세포 수용체 (TCRs) 또는 이의 부분을 포함한다. 예시적 구현예에서, scFVs를 포함하는 ASDs를 인코딩하는 핵산은 서열번호: 564-798에서 본 명세서에서 제시된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "힌지 영역" (HR)은 ASD와 TMD 사이인 친수성 영역을 지칭한다. 힌지 영역은 비제한적으로 항체의 Fc 단편 또는 이의 단편 또는 유도체, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 또는 이의 조합을 포함한다. 힌지 영역의 예는 비제한적으로 CD8a 힌지, 그리고 예를 들어, IgGs (예컨대 인간 IgG4)의 Gly3 또는 CH1 및 CH3 도메인만큼 작을 수 있는 폴리펩타이드로 만들어진 인공 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 (i) IgG4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (ii) IgG4의 힌지 영역, (iii) IgG4의 힌지 및 CH2, (iv) CD8a의 힌지 영역, (v) IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (vi) IgG1의 힌지 영역 또는 (vi) IgG1의 힌지 및 CH2 영역의 어느 하나 이상이다. 다른 힌지 영역은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "막관통 도메인" (TMD)는 원형질막을 교차하는 CAR의 영역을 지칭한다. 본 발명의 CAR의 막관통 도메인은 막관통 단백질 (예를 들어 유형 I 막관통 단백질)의 막관통 영역, 인공 소수성 서열 또는 이의 조합이다. 다른 막관통 도메인은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 임의의 백본을 포함하는 TMD 인코딩된 CAR은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD1 1a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "공-자극 도메인" (CSD)는 메모리 세포의 증식, 생존 및/또는 발달을 향상시키는 본 명세서에서 기재된 임의의 백본을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 본 발명의 CARs는 하나 이상의 공-자극 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 공-자극 도메인은, 예를 들어, TNFR 상과, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이의 조합의 구성원의 어느 하나 이상의 공자극 도메인을 포함한다. (예를 들면, 다른 단백질로부터) 다른 공-자극 도메인은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "세포내 신호전달 도메인" (ISD) 또는 "세포질 도메인"은 이펙터 기능 신호를 변환시키는 그리고 이의 특화된 기능을 수행하도록 세포를 유도하는 본 명세서에서 기재된 임의의 백본을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 이펙터 기능 신호를 변환시키는 도메인의 예는 비제한적으로 T-세포 수용체 복합체 또는 임의의 이의 동족체의 z 쇄 (예를 들면, h 쇄, FceR1g 및 b 쇄, MB1 (Iga) 쇄, B29 (Igb) 쇄, 등), 인간 CD3 제타 쇄, CD3 폴리펩타이드 (D, d 및 e), syk 계열 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70, 등), src 계열 티로신 키나제 (Lck, Fyn, Lyn, 등) 및 T-세포 형질도입에 관여된 다른 분자, 예컨대 CD2, CD5 및 CD28을 포함한다. 다른 세포내 신호전달 도메인은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "링커" (L) 또는 "링커 도메인" 또는 "링커 영역"은, 본 발명의 CAR의 임의의 도메인/영역을 함께 연결하는, 길이 약 1 내지 100 아미노산의 올리고- 또는 폴리펩타이드 영역을 지칭한다. 링커는 인접한 단백질 도메인이 서로에 비해 자유롭게 움직이도록 글리신 및 세린 같은 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 2 인접한 도메인이 서로 입체적으로 방해하지 않는다는 것을 확보하는 것이 바람직한 경우 더 긴 링커는 사용될 수 있다. 링커는 절단가능성 또는 비-절단가능성일 수 있다. 절단가능성 링커의 예는 2A 링커 (예를 들어 T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능성 등가물 및 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 피코르나바이러스성 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스 (P2A)의 CHYSEL 서열, 토세아 아시그나 바이러스 (T2A) 또는 이의 조합, 변이체 및 기능성 등가물을 포함한다. 다른 구현예에서, 링커 서열은, 2A 글리신과 2B 프롤린 사이 절단을 초래하는, Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B) 모티프를 포함할 수 있다. 몇 개의 예시적 절단가능 링커의 핵 서열은 서열번호: 831 내지 서열번호: 836에서 제공되고 몇 개의 예시적 링커의 아미노산 서열은 서열번호: 2598 내지 서열번호: 2602에서 제공된다. 다른 링커는 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다. 한 구현예에서, Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) 모티프 (서열번호: 837-838 및 서열번호: 2603)은 절단의 효율을 향상시키기 위해 절단가능성 링커 서열의 업스트림으로 또한 첨가된다. 절단가능성 링커의 잠재적인 단점은 N-말단 단백질의 마지막에 위치한 작은 2A 태그가 단백질 기능에 영향을 줄 수 있거나 단백질의 항원성에 기여할 수 있다는 가능성이다. 이러한 제한을 극복하기 위해, 일부 구현예에서, 푸린 절단 부위 (RAKR) (서열번호: 839-841 및 서열번호: 2604)는 번역 이후 잔존 2A 펩타이드의 절단을 용이하게 하기 위해 SGSG 모티프의 업스트림으로 첨가된다.
"이펙터 기능"은 분화된 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T-세포의 이펙터 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하여 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
"인핸서"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 발현되는 핵산 서열에 관련하여 이의 위치 및 배향에 무관한 핵산 서열의 전사를 확대하는, 개선하는 또는 완화시키는 서열 요소를 언급한다. 인핸서는 단일 프로모터로부터 또는 동시에 1 초과 프로모터로부터 전사를 향상시킬 수 있다. 전사 개선의 이러한 기능성 (예를 들면, 야생형 활성, 즉, 전장 서열의 활성의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%)가 유지되거나 실질적으로 유지되는 한, 야생형 인핸서 서열의 임의의 절단된, 돌연변이된 또는 달리 변형된 변이체는 또한 상기 정의 이내이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "액세서리 모듈" 또는 "액세서리 모듈"은 CAR 또는 CAR-발현 세포의 발현 또는 활성을 증가, 감소, 조절 또는 변형시키기 위해 CAR과 공-발현되는 구성요소를 지칭한다. 예시적 구현예에서, 액세서리 모듈은 비제한적으로 표 16에서 기재된 예를 포함한다. 일 구현예에서, 액세서리 모듈은 K13-vFLIP를 포함한다 (표 16). 또 다른 구현예에서, 액세서리 모듈은 MC159-vFLIP를 포함한다 (표 16). 추가 구현예에서, 액세서리 모듈은, 이의 활성이 이량체화제 분자의 투여에 의해 제어될 수 있는, FKBP((FK506 결합 단백질)-융합 단백질, 예컨대 FKBP-K13을 포함한다 (표 16).
본 명세서에서 사용된 바와 같이"스위치 도메인," 또는 "이량체화 도메인"은, 이량체화 분자의 존재 하에, 또 다른 스위치 도메인과 회합하는, 폴리펩타이드-기반 독립체를 전형적으로 지칭한다. 회합은, 제1 스위치 도메인에 연결된, 예를 들면, 융합된 제1 독립체, 및 제2 스위치 도메인에 연결된, 예를 들면, 융합된 제2 독립체의 기능성 커플링을 초래한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 집합적으로 이량체화 스위치로 지칭된다. 구현예에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 동일하고, 예를 들면, 이들은 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고, 집합적으로 동종이량체화 스위치로서 지칭된다. 구현예에서, 스위치는 세포내이다. 구현예에서, 스위치 도메인은 폴리펩타이드-기반 독립체, 예를 들면, FKBP (FK506 결합 단백질)이고, 이량체화 분자는 소 분자, 예를 들면, AP20187이다.
용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "이량체화 분자"는 제1 스위치 도메인의 제2 스위치 도메인과의 회합을 촉진시키는 분자를 지칭한다. 구현예에서, 이량체화 분자는 대상체에서 자연 발생하지 않거나, 상당한 이량체화를 초래할 농도로 발생하지 않는다. 구현예에서, 이량체화 분자는 소 분자, 예를 들면, 라파마이신 또는 라팔로그, 예를 들어, RAD001 또는 AP20187이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "치료 대조군"은 CAR 발현 세포의 활성 제어를 위하여 사용된 구성요소를 지칭한다.. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR 발현 세포의 활성 제어용 치료 대조군은 하기의 어느 하나 이상을 포함한다: 절단된 표피 성장 인자 수용체 (tEGFR), 절단된 표피 성장 인자 수용체 viii (tEGFRviii), 절단된 CD30 (tCD30), 절단된 BCMA (tBCMA), 절단된 CD19 (tCD19), 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 전달효소, 인간 카스파제 8, 인간 카스파제 9, 유도성 카스파제 9, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/글루코스 옥시다제, 데옥시리보뉴클레오사이드 키나제, 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP)/인돌-3-아세트산 (IAA), 감마-글루타밀시스테인 합성효소, CD20/알파CD20, CD34/티미딘 키나제 키메라, 독스-의존성 카스파제-2, 돌연변이체 티미딘 키나제 (HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체 (CCR), 선택 마커, 및 이의 조합. 몇 개의 치료 대조군의 핵산 서열은 서열번호: 850 내지 서열번호: 856 및 서열번호: 883에서 제공된다 (표 16).
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "유전적으로 변형된 세포에 의해 표적된 질환"은, 유전적으로 변형된 세포가 치료적으로 유익한 결과를 유발시키기 위해 이환 세포 또는 건강한 세포를 표적하는지 여부와 무관하게, 본 발명의 유전적으로 변형된 세포에 의해 임의의 질환에서 임의의 방식으로 관여된 임의의 세포의 표적화를 포괄한다. 유전적으로 변형된 세포는 비제한적으로 유전적으로 변형된 T-세포, NK 세포, 조혈모세포, 만능 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포를 포함한다. 유전적으로 변형된 세포는, CARs가 표적 세포의 표면에서 발현된 임의의 항원을 표적할 수 있는, 본 발명의 액세서리 모듈과 종래의 CARs를 함유하는 신규한 백본 그리고 종래의 CARs를 발현시킨다. 표적될 수 있는 항원의 예는 비제한적으로 B-세포에서 발현된 항원; 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 세균 세포 종양, 및 모세포종에서 발현된 항원; 다양한 면역 세포에서 발현된 항원; 및 다양한 혈액성 질환, 자가면역 질환, 및/또는 염증성 질환과 관련된 세포에서 발현된 항원을 포함한다. 표적될 수 있는 다른 항원은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 이의 대안적 구현예에 관련되어 본 발명의 CARs에 의해 표적될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "공-발현한다"는 2 이상 유전자의 동시 발현을 지칭한다. 유전자는, 예를 들어, 단일 단백질 또는 키메라 단백질을 단일 폴리펩타이드 쇄로서 인코딩하는 핵산일 수 있다. 일 구현예에서, 동시 발현은 면역 반응을 조절하는 단백질 및 CAR을 인코딩하는 단일 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 동시 발현은 CAR을 인코딩하는 제1 벡터 그리고 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "자가조직" 세포는 세포가 나중에 재-투여되는 것에 관하여 동일한 개체로부터 유래된 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "유전적으로 변형된 세포", "재유도된 세포", "유전적으로 조작된 세포" 또는 "변형된 세포"는 본 발명의 CAR을 발현시키는 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 동일한 벡터에서 하나 이상의 액세서리 분자 및 CAR을 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 제1 벡터 그리고 액세서리 분자를 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 제1 벡터 그리고 1 초과 액세서리 분자를 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 제1 벡터 그리고 제1 액세서리 분자를 인코딩하는 제2 벡터 그리고 제2 액세서리 분자를 인코딩하는 제3 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "백본"은 종래의 CARs (표 1) 및 표 2에서 기재된 바와 같은 액세서리 모듈의 특정 조합을 지칭한다. 예시적 구현예에서, 다양한 백본을 포함하는 CARs 및 액세서리 모듈의 특정 조합은 표 2에서 기재된다. 일 구현예에서, CAR 및 액세서리 모듈은 단일 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, CAR은 제1 핵산 분자에 의해 인코딩되고 액세서리 모듈은 제2 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 액세서리 모듈은, 액세서리 모듈에서 요소의 수에 의존하여, 1 초과 핵산 분자에 의해 인코딩된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "면역 세포"는 비제한적으로 항원 제시 세포, B-세포, 호염기구, 세포독성 T-세포, 수지상 세포, 호산구, 과립구, 헬퍼 T-세포, 백혈구, 림프구, 대식세포, 비만 세포, 메모리 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 중성구, 식균세포, 혈장 세포 및 T-세포를 포함하는 포유동물 면역계의 세포를 지칭한다.
CAR-함유 세포의 용어 "면역 이펙터 기능"은 자극 분자에 의한 자극시 CAR-발현 세포에 의해 보여진 임의의 활성을 지칭한다. 예를 들면, CAR-T 세포에서, 면역 이펙터 기능의 예는, 사이토카인의 분비를 포함하여, 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "면역 이펙터 세포"는 T 세포 및 자연 살해 (NK) 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "면역 반응"은 비제한적으로 선천적인 면역력, 체액성 면역, 세포 면역력, 면역력, 염증 반응, 획득된 (적응성) 면역력, 자가면역 및/또는 과민성 면역력을 포함하는 면역성을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "CD4 림프구"는 CD4를 발현시키는 림프구, 즉, CD4+인 림프구를 지칭한다. CD4 림프구는 CD4를 발현시키는 T 세포일 수 있다.
용어 "T-세포" 및 "T-림프구"는 교환가능하고 본 명세서에서 동의어로 사용된다. 예는 비제한적으로 미접촉 T 세포, 중심 메모리 T 세포, 이펙터 메모리 T 세포 또는 이의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는, "Fc 단편" 또는 "Fc 도메인"으로서 본 명세서에서 지칭된, Fc (결정화가능 단편) 영역 또는 Fc 영역의 FcRn 결합 단편을 가진 온전한 면역글로불린 또는 단클론성 또는 다클론성 항원-결합 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 항원-결합 단편은, 특히, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 디아바디 및 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 면역글로불린의 적어도 한 부분을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. Fc 도메인은 항체의 2 또는 3 부류에 기여하는 2 중쇄의 부분을 포함한다. Fc 도메인은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 효소 (예를 들면 파파인 절단)에 의해 또는 온전한 항체의 화학적 절단을 통해 생산될 수 있다.
용어 "항체 단편"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 온전한 항체의 항원 결합 부위를 일반적으로 포함하고 따라서 항원을 결합시키는 능력을 보유하는, 온전한 항체의 한 부분만을 포함하는 단백질 단편을 지칭한다. 본 정의에 의해 포괄된 항체 단편의 예는 하기를 포함한다: (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는, Fab 단편; (ii) CH1 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인, Fab' 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (iv) CH1 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 시스테인 잔기 그리고 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd' 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward 등, Nature 341, 544-546 (1989)); (vii) 단리된 CDR 영역; (viii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (ix) 단일 쇄 항체 분자 (예를 들면, 단일 쇄 Fv; scFv) (Bird 등, Science 242:423-426 (1988); 및 Huston 등, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) 동일한 폴리펩타이드 쇄에서 경쇄 가변형 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변형 도메인 (VH)를 포함하는, 2 항원 결합 부위를 가진 "디아바디" (참고, 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체" (Zapata 등. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); 및 미국 특허 번호 5,641,870).
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "단일 쇄 가변형 단편", "단일-쇄 항체 가변형 단편" 또는 "scFv" 항체는, 링커 펩타이드에 의해 연결된, 단지 중 (VH) 쇄 및 경 (VL) 쇄의 가변 영역을 포함하는 항체의 형태를 지칭한다. scFvs는 단일 쇄 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. scFvs는 유래되는 온전한 항체의 특이성을 보유한다. 경쇄 및 중쇄는, 표적 항원에 scFv의 특이성이 유지되는 한, 임의의 순서, 예를 들어, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "상보성 결정 영역" (CDR)은 영역이 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체의 가변 영역 이내 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 경쇄 가변 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에서 3 CDRs 그리고 각각의 중쇄 가변 영역 (HCD1, HCDr2 및 HCDR3)에서 3 CDRs가 있다. CDRs의 경계는 "카밧" 넘버링 체계 및/또는 "초티아" 넘버 체계 (카밧 등. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Services, National Institutes of Health, Bethesda, MD; Al-Lazikani　등, (1997) JMB　273,927-948)을 포함하는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 적어도 10-6　M의 결합 친화도로 항체와 항원 사이 접촉을 의미한다. 특정 측면에서, 항체는 적어도 약 10-7M, 및 바람직하게는 10-8　M, 10-9　M, 10-10　M, 10-11　M, 또는 10-12　M의 친화도로 결합한다.
"로서 동일한 에피토프를 결합한다"는 표적에 결합하기 위한 그리고 예시된 항체, scFv, CAR의 항원 특이적 도메인 또는 다른 결합제와 동일한 에피토프를 갖는 항체, scFv, CAR의 항원 특이적 도메인 또는 다른 결합제의 능력을 의미한다. 예로서, 예시된 항체, scFv, 또는 다른 결합제 및 다른 항체의 에피토프는 표준 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 당해 분야에서 널리 공지된, 에피토프 맵핑 기술은 하기를 포함한다: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들면, 단백질 분자의 부분에 상응하는 펩타이드인, 고형 지지체에서 다수의 펩타이드의 동시 합성, 그리고 펩타이드가 지지체에 여전히 부착되는 동안 항체와 펩타이드의 반응에 의해 결정될 수 있다. 그와 같은 기술은 당해 기술에 공지되어 있고, 예를 들면, 하기에서 기재된다: 미국 특허 번호 4,708,871 ; Geysen 등, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen 등, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen 등, (1986) Mol. lmmunol. 23: 709-715. 유사하게, 형태적 에피토프는 아미노산의 공간적 형태 결정에 의해 예컨대, 예를 들면, 수소/중수소 교환, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명에 의해 쉽게 확인된다. 참고, Epitope Mapping Protocols, 상동. 단백질의 항원성 영역은 또한 표준 항원성 및 수치료법 플롯, 예컨대, 예를 들면, Oxford Molecular Group으로부터 이용가능한 Omiga 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것을 사용하여 확인될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 Hopp/Woods method, Hopp 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828을; 항원성 프로파일의 결정을 위하여, 그리고 Kyte-Doolittle 기술, Kyte 등, (1982) J.Mol. Bioi. 157: 1 05-132를; 수치료법 플롯 (FROM MORPHOSYS CD19 특허 WO 2013/024097)을 위하여 사용한다. 표적 (예를 들면, CD19)에 대한 선택된 단클론성 항체가 특유의 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 각각의 항체는 상업적으로 입수가능한 시약 (Pierce, Rockford, Ill.)을 사용하여 바이오티닐화될 수 있다. 비표지된 단클론성 항체 및 비오틴화된 단클론성 항체를 사용하는 경쟁 연구는 상기 기재된 바와 같이 CD19-세포외 도메인 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오틴화된 mAb 결합은 스트렙-아비딘-알칼리성 포스파타제 탐침으로 검출될 수 있다.
CAR에 의해 인식된 에피토프는 또한 CAR을 포함하는 scFv에 의해 인식된 에피토프로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, MPL을 표적하는 CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호: 1658 및 서열번호: 3403)의 항원 특이적 도메인이 scFv MPL-161-(vL-vH) (서열번호: 730 및 서열번호: 2500)으로 구성되기 때문에, CAR이 scFv이 유래되는 친계 항체 및 scFv와 동일한 에피토프를 표적할 것으로 기대된다. 본 발명의 백본 및 CARs의 작제에서 사용된 몇 개의 scFv 및/또는 그것의 친계 항체에 의해 인식된 에피토프는 당해 기술에 공지되어 있다. 대안적으로, (백본의 파랏으로서 존재하는 CARs를 포함하는) CAR에 의해 표적된 에피토프는 이의 표적 항원의 일련의 돌연변이체 생성 그리고 CAR-발현 세포에 결합하는 돌연변이체의 능력 시험에 의해 결정될 수 있다. 예로서, MPL을 표적하는 CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호: 1658 및 서열번호: 3403)에 의해 인식된 에피토프는 MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5 융합 작제물 (서열번호: 925 및 서열번호: 2670)의 돌연변이체의 패널 생성에 의해 결정될 수 있다. 돌연변이체 작제물은 상이한 돌연변이체 MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5 융합 단백질이 상청액에서 분비되고 있다는 것을 확인하기 위해 NLuc 활성에 대하여 분석된 및 수집된 융합 단백질을 함유하는 상청액 그리고 적합한 세포주 (예를 들면, 293FT 세포) 속에 형질감염될 것이다. 후속적으로, 융합 단백질은 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호: 1658 및 서열번호: 3403) CAR 작제물을 발현시키는 세포 (예를 들면, Jurkat 세포 또는 T 세포)에 결합하는 그것의 능력에 대하여 시험될 것이다. CAR-발현 세포에 결합하지 못한 돌연변이체는 MPL-특이적 CAR에 의해 표적된 에피토프를 함유하기 위한 후보이다. 특정 CAR에 의해 인식된 에피토프를 결정하기 위한 대안적 접근법은 상이한 시험 항체를 가진 기능성 경쟁적 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호: 1658 및 서열번호: 3403) CAR을 발현시키는 T 세포는 상이한 시험 MPL 항체의 증가 농도의 부재 및 존재 하에 MPL (예를 들면, HEL 세포)를 발현시키는 세포주로 공-배양될 것이다. 시험 MPL 항체에 의해 인식된 에피토프가 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호: 1658 및 서열번호: 3403) CAR에 의해 인식된 에피토프와 중첩하는 사례에서, 시험 항체는 용량-의존적 방식으로 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호: 1658 및 서열번호: 3403) CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 유도된 사이토카인 생산 및 표적-세포 사멸을 차단하는 것으로 기대될 것이다. 시험 항체와 동일한 아이소타입의 비-특이적 항체는 대조군으로서 포함될 것이고 CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 유도된 사이토카인 생산 및 표적-세포 사멸에서 효과가 없는 것으로 기대될 것이다. 유사하게, 특이적 CAR은 Jurkat-NFAT-EGFP 세포에서 발현될 수 있고 표적 세포주로 공배양시 CAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포에 의한 EGFP 유도를 차단하는 시험 항체의 능력은 시험 항체에 의해 인식된 에피토프가 상기 CAR에 의해 인식된 에피토프와 중첩하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "치료제"는, 예를 들어, 질환을 치료, 질환을 억제, 질환을 예방, 질환의 효과를 완화, 질환의 중증도를 감소, 질환 발생의 가능성을 감소, 질환의 진행을 둔화 및/또는 질환을 치유하는데 사용되는 제제를 지칭한다. 치료제에 의해 표적된 질환은 비제한적으로 감염성 질환, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 세균 세포 종양, 모세포종, 다양한 면역 세포에서 발현된 항원, 및 다양한 혈액성 질환, 및/또는 염증성 질환과 관련된 세포에서 발현된 항원을 포함한다.
"암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서 생리적 병태를 지칭하거나 기재한다. 용어 "암"은, 조직병리적 유형 또는 침입의 단계와 무관하게, 암성 성장 또는 종양발생 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 전환된 세포, 조직, 또는 기관의 모든 유형을 포함하는 의미이다. 고체 종양의 예는 악성종양, 예를 들면, 다양한 기관계의 육종, 선암종, 및 암종, 예컨대 간, 폐, 유방, 림프양, 위장 (예를 들면, 결장), 비뇨생식관 (예를 들면, 신장, 요상피 세포), 전립선 및 인두를 감염시키는 것을 포함한다. 선암종은 악성종양 예컨대 대부분의 결장 암, 직장 암, 신장-세포 암종, 간 암, 폐의 비-소 세포 암종, 소장의 암 및 식도의 암을 포함한다. 일 구현예에서, 암은 흑색종, 예를 들면, 진전된 단계 흑색종이다. 상기 언급된 암의 전이성 병변은 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. 치료될 수 있는 다른 암의 예는 하기를 포함한다: 골 암, 췌장 암, 피부 암, 두경부의 암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 항문 영역의 암, 위 암, 고환 암, 자궁 암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아기의 고체 종양, 림프구성 림프종, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피모양 암, 편평상피 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 것을 포함하는 환경적으로 유도된 암, 및 상기 암의 조합. 전이성 암, 예를 들면, PD-L1을 발현시키는 전이성 암의 치료 (Iwai 등. (2005) Int. Immunol. 17:133-144)는 본 명세서에서 기재된 항체 분자를 사용하여 영향받을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "폴리뉴클레오타이드"는 비제한적으로 DNA, RNA, cDNA (상보적 DNA), mRNA (메신저 RNA), rRNA (리보솜 RNA), shRNA (작은 헤어핀 RNA), snRNA (작은 핵 RNA), snoRNA (짧은 핵소체 RNA), miRNA (microRNA), 게놈 DNA, 합성 DNA, 합성 RNA, 및/또는 tRNA를 포함한다.
본 개시내용이 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 항체 또는 이의 단편에 관련하는 경우, 상기의 등가물 또는 생물학적으로 등가물이 본 개시내용의 범위 내로 의도되는 것이 명백한 인용 없이 그리고 달리 의도되지 않는 한 추론되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이의 생물학적 등가물"은 참조 단백질, 항체 또는 이의 단편, 폴리펩타이드 또는 핵산을 지칭하는 경우 "이의 등가물"과 동의어인 것으로 의도되고, 원하는 구조 또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소 상동성을 갖는 것을 의도한다. 본 명세서에서 구체적으로 인용되지 않는 한, 임의의 상기가 또한 이의 등가물을 포함하는 것이 고려된다. 예를 들어, 등가물은 적어도 약 70% 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80% 상동성 또는 동일성 및 대안적으로, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 퍼센트 상동성 또는 동일성을 의도하고 참조 단백질, 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 단편 또는 핵산에 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드를 지칭하는 경우, 이의 등가물은 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체로 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 대안적으로, 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭하는 경우, 이의 등가물은 참조 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체로 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질이다.
또 다른 서열에 "서열 동일성"의 특정 백분율 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)를 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은, 정렬된 경우, 염기 (또는 아미노산)의 백분율이 2 서열 비교에서 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당해 분야에서 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에 기재된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터는 정렬을 위하여 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은, 디폴트 파라미터를 사용하는, BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은, 하기 디폴트 파라미터를 사용하는, BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 암호=표준; 필터=없음; 가닥=양쪽; 컷오프=60; 기대=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50 서열; 분류=HIGH SCORE; 데이터베이스=비-중복적인, 유전자은행+EMBL+DDBJ+PDB+유전자은행 CDS 번역+SwissProtein+SPupdate+PIR. 이들 프로그램의 세부사항은 하기 인터넷 주소에서 찾아질 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "단리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물제제 또는 세포 물질을 지칭한다. 일 측면에서, 용어 "단리된"은, 천연 공급원에서 존재하는 다른 DNAs 또는 RNAs, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관, 각각으로부터 분리된, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체 또는 이의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 장기를 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 경우 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지가, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드를 지칭한다. 또한, "단리된 핵산"은 단편으로 자연 발생하지 않는 핵산 단편을 포함하는 의미이고 자연 상태에서 찾지 못할 것이다. 용어 "단리된"은 다른 세포 단백질로부터 단리되는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 또한 사용되고 양쪽 정제된 및 재조합 폴리펩타이드를 포괄하는 의미이다. 용어 "단리된"은 다른 세포 또는 조직으로부터 단리되는 세포 또는 조직을 지칭하기 위해 본 명세서에서 또한 사용되고 양쪽, 배양된 및 조작된 세포 또는 조직을 포괄하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "네이키드 DNA"는 발현용 적절한 배향으로 적합한 발현 벡터에서 클로닝된 CAR을 인코딩하는 DNA를 지칭한다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 비제한적으로 SIN 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 발포성 바이러스 벡터, 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 벡터, 하이브리드 벡터 및/또는 플라스미드 트랜스포존 (예를 들어 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템) 또는 인테그라제 기반된 벡터 시스템을 포함한다. 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있는 다른 벡터는 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "표적 세포"는 질환에 관여되는 세포를 지칭하고 (비제한적으로 유전적으로 변형된 T-세포, NK 세포, 조혈모세포, 만능 줄기 세포, 및 배아 줄기 세포를 포함하는) 본 발명의 유전적으로 변형된 세포에 의해 표적될 수 있다. 다른 표적 세포는 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다.
용어 "T-세포" 및 "T-림프구"는 교환가능하고 본 명세서에서 동의어로 사용된다. 예는 비제한적으로 미접촉 T 세포, 중심 메모리 T 세포, 이펙터 메모리 T 세포 또는 이의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들면 외래 유전자)가, 숙주를 형질전환시키기 위해 그리고 도입된 서열의 발현 (예를 들면 전사 및 번역)을 촉진시키기 위해, 숙주 세포에 도입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 등을 포함한다.
"유도체" 또는 "변이체" 또는 "단편"과 함께 사용된 경우 용어 "기능성"은 유도체 또는 변이체 또는 이의 단편인 분자 또는 독립체의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 소유하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는"은 원하는 부위에 제제의 적어도 부분적인 국재화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 대상체 속에 본 명세서에서 개시된 바와 같이 제제의 배치를 지칭한다.
"유익한 결과"는, 비제한적으로, 질환 상태의 중증도 감소 또는 경감, 악화로부터 질환 상태 예방, 질환 상태 치유, 발생으로부터 질환 상태 보호, 질환 상태를 발생시키는 환자의 기회 저하 그리고 환자의 수명 또는 기대 수명 연장을 포함할 수 있다. 비-제한 예로서, "유익한 결과" 또는 "원하는 결과"는 하나 이상의 증상(들)의 경감, 암 진행의 결손된, 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태의 정도의 약화, 전이 또는 침입의 지연 또는 둔화, 및 암과 관련된 증상의 완화 또는 일시적 처방일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는", 또는 "완화"는 치료적 처치를 지칭하고, 여기서 본 목적은 질환 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전, 경감, 완화, 억제, 둔화 또는 중단시키는 것이다. 용어 "치료하는"은 병태, 질환 또는 장애, 예컨대 암의 증상 또는 적어도 하나의 역효과 감소 또는 경감을 포함한다. 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소되면 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 대안적으로, 질환의 진행이 감소 또는 중지되면 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선 뿐만 아니라, 치료의 부재 하에 기대될 증상의 악화 또는 진행의 적어도 둔화의 중단을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 비제한적으로, 검출가능하거나 검출불가능하든 아니든, 하나 이상의 증상(들)의 경감, 질환 정도, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태의 약화, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 완화 또는 일시적 처방, 및 (부분적이거나 전체적이든 아니든) 차도를 포함한다. 용어 질환의 "치료"는 또한 (일시적 처방 치료를 포함하는) 질환의 부작용 또는 증상으로부터 완화 제공을 포함한다. 일부 구현예에서, 암의 치료는 종양 용적 감소, 암 세포의 수 감소, 암 전이 억제, 기대 수명 증가, 암 세포 증식 감소, 암 세포 생존 감소, 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리적 증상의 완화를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "병태" 및 "질환 상태"는 암, 종양 또는 감염성 질환을 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, 상기 병태는 비제한적으로 악성 신생물성 세포 증식성 장애 또는 질환의 임의의 형태를 포함한다. 예시적 구현예에서, 병태는 신장 암, 흑색종, 전립선 암, 유방 암, 교모세포종, 폐 암, 결장 암, 또는 방광 암의 어느 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은, 질환 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 하나 이상의 펩타이드 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물의 양을 지칭하고, 원하는 효과를 제공하기 위해 약리적 조성물의 충분한 양에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 어구 "치료적 유효량"은 임의의 의료 치료에 적용가능한 합리적인 유익/유해 비율로 장애를 치료하기 위해 조성물의 충분한 양을 의미한다.
증상에서 치료적으로 또는 예방적으로 상당한 감소는 본 명세서에서 기재된 올리고펩타이드 투여에 앞서 대조군 또는 비-치료된 대상체 또는 대상체의 병태에 비교된 경우 측정된 파라미터에서 예를 들면 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150% 또는 초과이다. 측정된 또는 측정가능한 파라미터는 질환의 임상적으로 검출가능한 마커, 예를 들어, 생물학적 마커의 상승된 또는 하강된 수준, 뿐만 아니라 증상의 임상적으로 허용된 척도에 관련된 파라미터 또는 당뇨병용 마커를 포함한다. 그러나, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 조성물 및 제형의 총 1일 사용량이 건전한 의료 판단의 범위 내에 주치의에 의해 결정될 것이 이해될 것이다. 요구된 정확한 양은 인자 예컨대 치료될 질환의 유형, 대상체의 성별, 연령, 및 중량에 의존하여 다양할 것이다.
어구 "제1 라인" 또는 "제2 라인" 또는 "제3 라인"은 환자에 의해 받아지는 치료의 차례를 지칭한다. 제1 라인 요법 레지멘은 먼저 주어진 치료이고, 반면에 제2 또는 제3 라인 요법은 제1 라인 요법 후 또는 제2 라인 요법 후, 각각 주어진다. 국립 암 연구소는 제1 라인 요법을 "질환 또는 병태용 제1 치료로서 정의한다. 암을 가진 환자에서, 1차 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 또는 이들 요법의 조합일 수 있다. 제1 라인 요법은 또한 당해 분야의 숙련가에 "1차 요법 및 1차 치료"로서 지칭된다. 참고 2008년 5월 1일 마지막 방문하였던, 국립 암 연구소 웹사이트 www.cancer.gov. 전형적으로, 환자가 제1 라인 요법에 양성 임상 또는 하위-임상 반응을 보여주지 않았거나 제1 라인 요법이 중단되었기 때문에 환자는 후속 화학요법 레지멘이 주어진다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "포유동물"은, 비제한적으로, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가정용 포유동물 예컨대 개 및 고양이; 설치류 예컨대 마우스, 랫트 및 기니아 피그를 포함하는 실험실 동물, 그리고 기타 동종을 포함하는, 포유동물강의 임의의 구성원을 지칭한다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 언급하지 않는다. 따라서, 숫컷이든 암컷이든, 성체 및 신생 대상체, 뿐만 아니라 태아는 이 용어의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
키메라 항원 수용체
암을 포함하는, 질환을 치료하기 위해 CAR 및 액세서리 모듈을 포함하는 조성물 그리고 이의 사용 방법이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 종래의 CARs (표 1) 및 표 2에서 기재된 바와 같이 액세서리 모듈의 특이적 조합은 '백본'을 정의한다 (표 2).
표 1: 종래의 CAR 구조. 제1 세대 종래의 CARs (종래의 CAR I)은 세포내 신호전달 (ISD) 도메인 (예를 들면 CD3z)를 갖고 공자극 도메인은 없다. 제2 세대 종래의 CARs (종래의 CAR 2 또는 CAR II)는 1 공자극 도메인 (예를 들면 41BB 또는 CD28) 및 세포내 신호전달 (ISD) 도메인 (예를 들면 CD3z)를 갖는다. 제3 세대 종래의 CARs (종래의 CAR 3 또는 CAR III)은 2 공자극 도메인 (예를 들면 41BB 및 CD28) 및 세포내 신호전달 (ISD) 도메인 (예를 들면 CD3z)를 갖는다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
CAR 요소의 예시적 구현예는 표 1-6, 8, 11, 및 15에서 기재된다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 다양한 백본은 CAR 요소 및 액세서리 모듈을 포함한다. 액세서리 모듈의 예시적 구현예는 표 16에서 기재된다.
일부 구현예에서, 조성물은 종래의 CARs I-III을 인코딩하는 핵산을 포함하고 (표 1), 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 표 21 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 인코딩된 CAR의 항원 특이적 도메인이 본 명세서에서 그리고 표 19, 20 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 특이적 항원을 표적하는 어느 하나 이상의 백본 1-62 (표 2)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 백본-1에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 19 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-2를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 백본-2에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-32를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 백본-32에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 20 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-33을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 백본-33에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 다양한 구현예에서, 핵산은 암의 치료에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 백본의 CAR 요소를 인코딩하는 핵산은 각각의 항원 특이적 도메인이 인접하고 동일한 CAR에서 다른 항원 특이적 도메인과 동일한 해독틀에 있는 1 초과 항원 특이적 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 임의의 종래의 CARs 1-III을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 21 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 인코딩된 CAR의 항원 특이적 도메인이 본 명세서에서 그리고 표 20 내지 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 특이적 항원을 표적하는 어느 하나 이상의 백본 1-62 (표 2)를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 백본-1에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 19 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-2를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 백본-2에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-32를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 백본-32에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 20 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-33을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 백본-33에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩타이드는 암의 치료에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 백본의 CAR 요소를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 각각의 항원 특이적 도메인이 인접하고 동일한 CAR에서 다른 항원 특이적 도메인과 동일한 해독틀에 있는 1 초과 항원 특이적 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 임의의 종래의 CARs I-III을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 21 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 인코딩된 CAR의 항원 특이적 도메인이 본 명세서에서 그리고 표 20 내지 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 특이적 항원을 표적하는 어느 하나 이상의 백본 1-62 (표 2)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하고, 여기서 백본-1에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 19 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-2를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하고, 여기서 백본-2에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하고, 여기서 백본-32에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-33을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하고, 여기서 백본-33에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 다양한 구현예에서, 벡터는 암의 치료에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 백본의 CAR 요소 또는 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 각각의 항원 특이적 도메인이 인접하고 동일한 CAR에서 다른 항원 특이적 도메인과 동일한 해독틀에 있는 1 초과 항원 특이적 도메인을 포함한다
일부 구현예에서, 조성물은 인코딩된 CAR의 항원 특이적 도메인이 본 명세서에서 그리고 표 19 내지 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 특이적 항원을 표적하는 백본 1-62 (표 2) 또는 어느 하나 이상의 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함하고, 여기서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 그리고 표 19 및 22에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함하고, 여기서 백본-1에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-2를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함하고, 여기서 백본-2에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-32를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함하고, 여기서 백본-32에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백본-33을 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함하고, 여기서 백본-33에서 CAR의 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암 특이적 항원을 표적한다. 다양한 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 암의 치료에서 사용된다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 암 세포에서 1 초과 항원을 표적한다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 백본의 CAR 요소를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 1, 2, 3 또는 초과 항원 특이적 도메인을 인코딩한다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 백본의 CAR 요소를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 1, 2, 3 또는 초과 공-자극 도메인을 인코딩한다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 백본의 CAR 요소를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 1, 2, 3 또는 초과 세포내 신호전달 도메인을 인코딩한다.
본 명세서에서 기재된 CARs 및 액세서리 모듈의 원하는 요소에 대하여 인코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에서 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 핵산 분자를 발현시키는 세포로부터 라이브러리 스크리닝에 의해, 동일한 것을 포함하도록 공지된 벡터로부터 핵산 분자 유도화에 의해, 또는 표준 기술을 사용하여, 동일한 것을 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심의 핵산은, 클로닝되기 보다는, 합성으로 생산될 수 있다. 예시적 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs 및 액세서리 모듈의 원하는 요소에 대하여 인코딩하는 핵산 서열은 표 3-22에서 기재된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs 및 액세서리 요소를 발현시키는 본 명세서에서 기재된 유전적으로 변형된 세포는 또한 CARs의 독성을 감소시키는 제제를 발현시킨다. 예시적 구현예에서, 그와 같은 제제는 표 16에서 제시된다. 예시적 구현예에서, 그와 같은 제제는 비제한적으로 IL-6 (예를 들어, 서열번호: 899)에 대한 scFv, IL-6 수용체 알파 (예를 들어, 서열번호: 884)에 대한 낙타과 vHH, 이중특이적 낙타과 vHH 표적화 IL-6 수용체 알파 및 알부민 (서열번호: 886), Fx06 펩타이드 (서열번호: 900), 또는 이의 조합의 임의의 1, 2, 3 또는 초과를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs 및 액세서리 요소를 발현시키는 본 명세서에서 기재된 유전적으로 변형된 세포는 또한 CARs의 활성을 향상시키는 제제를 발현시킨다. 예시적 구현예에서, 그와 같은 제제는 표 16에서 제시된다. 예시적 구현예에서, 그와 같은 제제는 비제한적으로 hTERT (서열번호: 903), 헤파리나제 (서열번호: 904), 가용성 HVEM (서열번호: 901), 가용성 HVEM 및 낙타과 vHH 표적화 알부민 (서열번호: 902)를 함유하는 융합 단백질, scFvs 표적화 PD1 (서열번호: 889 및 890), scFv 표적화 CTLA4 (서열번호: 894), 이중특이적 단백질 표적화 PD1 및 알부민 (서열번호: 892 및 893), 이중특이적 단백질 표적화 CTLA4 및 알부민 (서열번호: 894) 또는 이의 조합의 임의의 1, 2, 3 또는 초과를 포함한다. 이중특이적 단백질에서 표적화 알부민용 근거는 그것의 비교적 작은 크기로 인해 신장으로 달리 빠르게 절단되는 scFvs 및 vHH 단편의 반감기를 연장하는 것이다.
특이적 구현예에서, CD3z 활성화 도메인을 함유하는 종래의 CAR I을 포함하고 K13-vFLIP 액세서리 모듈을 공발현시키는, 백본-1을 함유하는 예시적 작제물은 표 19에서 제시된다.
특이적 구현예에서, 41BB 공자극 도메인, CD3z 활성화 도메인을 함유하는 종래의 CAR II를 포함하고 K13-vFLIP 액세서리 모듈을 공발현시키는, 백본-32를 함유하는 예시적 작제물은 표 20에서 제시된다.
특이적 구현예에서, 41BB 공자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인을 함유하는 예시적 종래의 CAR II 작제물은 표 21에서 기재된다.
특이적 구현예에서, 본 발명의 다양한 구현예에서 예시적 CAR 작제물은 표 22에서 기재된다.
항원 특이적 도메인
본 명세서에서 기재된 바와 같이 다양한 백본을 포함하는 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 암 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 ASD를 포함하는 CARs를 포함한다. ASD의 서열은 CAR의 나머지를 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 해독틀과 인접하고 상기에 있다.
일 구현예에서, 각각의 항원 특이적 영역은, VH 도메인 단독이 항원-특이성 ("단일-도메인 항체")를 부여하기에 충분하면, VH, CH1, 힌지, 및 CH2 및 CH3 (Fc) Ig 도메인을 갖는 (표적 항원에 특이적인) 전장 IgG 중쇄를 포함한다. 전장 IgG 중쇄는 공-자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 적절한 막관통 도메인을 통해 연결될 수 있다. 양쪽, VH 및 VL 도메인이 완전하게 활성 항원-특이적 표적화 영역을 생성하는데 필요하면, VH-함유 CAR 및 전장 람다 경쇄 (IgL)은 모두 활성 항원-특이적 표적화 영역을 생성하기 위해 세포 속에 도입된다.
일부 구현예에서, 인코딩된 CAR 분자의 항원 특이적 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체 (SDAB), VH 또는 VL 도메인, 또는 낙타과 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 유래되는 scFv의 쥣과 서열에 비교하여 인간화되는 scFv 항체 단편이다.
일부 사례에서, scFvs는 당해 분야에서 공지된 방법 (예를 들어, Bird 등, (1988) Science 242:423-426 및 Huston 등, (1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)에 따라 제조될 수 있다. ScFv 분자는 가요성 폴리펩타이드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 가진 링커 (예를 들면, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호작용하는 방법에 크게 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 짧은 폴리펩타이드 링커 (예를 들어, 5-10 아미노산)이 이용되면 사슬내 폴딩은 예방된다. 사슬간 폴딩은 2 가변 영역을 함께 기능성 에피토프 결합 부위를 형성하게 하도록 또한 요구된다. 링커 배향 및 크기의 예에 대하여 참고, 예를 들면, 본 명세서에서 참고로 편입되는, Hollinger 등. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715.
scFv는 이의 VL 및 VH 영역 사이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 초과 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커 서열은 하기를 포함한다: 글리신 및 세린 반복부의 세트 예컨대 (Gly4Ser)n, 식중 n은 1 동등 또는 초과의 양의 정수임 (서열번호:252, 서열번호:253). 일 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)3 (서열번호:254, 서열번호:254) 또는 (Gly4Ser)3 (서열번호:250 - 서열번호:255)일 수 있다. 링커 길이에서 변화는 활성을 보유 또는 향상시킬 수 있어서, 활성 연구에서 우월한 효능을 발생시킨다.
또 다른 측면에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체 ("TCR"), 또는 이의 단편, 예를 들어, 단일 쇄 TCR (scTCR)이다. 그와 같은 TCRs를 제조하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 참고, 예를 들면, Willemsen RA 등, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T 등, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen 등, Gene Ther. 19(4):365- 74 (2012) (참조문헌은 이의 전체로 본 명세서에서 편입된다). 예를 들어, 링커 (예를 들면, 가요성 펩타이드)에 의해 연결된 T 세포 클론으로부터 Vα 및 vβ 유전자를 함유하는 scTCR은 조작될 수 있다. 이러한 접근법은 자체가 세포내인 암 관련된 표적에 매우 유용하지만, 그러나, 그와 같은 항원 (펩타이드)의 단편은 MHC에 의해 암 세포의 표면에서 제시된다
일 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 본 명세서에서 열거된 항체의 1, 2 또는 모두 3 중쇄 (hc) CDRs, hcCDRl, hcCDR2 및 hcCDR3, 및/또는 본 명세서에서 열거된 항체의 1, 2 또는 모두 3 경쇄 (lc) CDRs, lcCDRl, lcCDR2 및 lcCDR3을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 인간화된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 측면에서, 항체의 특이적 서열 또는 영역이 인간에서 천연적으로 생산된 항체 또는 이의 단편에 유사성을 증가시키기 위해 변형되는 경우, 비-인간 항체는 인간화된다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다. 인간화된 항체는, 비제한적으로, CDR-그라프팅 (참고, 예를 들면, 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호　WO　91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089, 이들 각각은 본 명세서에서 이의 전체가 참고로 편입됨), 베니어링 또는 재표면화 (참고, 예를 들면, 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka 등, 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; 및 Roguska 등, 1994, PNAS, 91:969-973, 이들 각각은 본 명세서에서 이의 전체가 참고로 편입됨), 쇄 셔플링 (참고, 예를 들면, 본 명세서에서 이의 전체가 참고로 편입되는, 미국 특허 번호 5,565,332)를 포함하는, 당해 분야에서 공지된 다양한 기술, 그리고, 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호　WO　9317105, Tan 등, J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas 등, Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea 등, Methods, 20(3):267- 79 (2000), Baca 등, J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska 등, Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto 등, Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto 등, Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen 등, J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994) (이들 각각은 본 명세서에서 이의 전체가 참고로 편입됨)에서 개시된 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 표적 항원에 대하여 고 친화도 및 다른 양호한 생물학적 특성의 유지로 인간화된다
일부 구현예에서, 항원 특이적 도메인은 표적 항원에 특이적인 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체의 단편이고, 여기서 상기 단편은 표적 항원에 대하여 특이성을 보유한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR의 항원 특이적 도메인은 scFv 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 scFv 항체 단편은 이들이 유래되는 IgG 항체와 동일한 또는 비교할만한 친화도를 가진 동일한 항원을 결합시킨다는 점에서 기능성이다. 다른 구현예에서, 항체 단편은 유래되는 항체에 비교하여 항원에 더 낮은 결합 친화도를 갖지만 본 명세서에서 기재된 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능성이다. 일 구현예에서, CAR 분자는 표적 항원에 대하여 10-4　M 내지 10-8　M, 10-5　M 내지 10-7　M, 10-6　M 또는 10-8　M의 결합 친화도 KD를 갖는 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR의 항원 특이적 도메인은 MHC 제시된 펩타이드에 결합한다. 정상적으로, 내인성 단백질로부터 유래된 펩타이드는 주조직 적합성 복합체 (MHC) 부류 I 분자의 포켓을 채우고, CD8+ T 림프구에서 T 세포 수용체 (TCRs)에 의해 인식된다. MHC 부류 I 복합체는 모든 유핵의 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 암에서, 바이러스-특이적 및/또는 종양-특이적 펩타이드/MHC 복합체는 면역요법용 세포 표면 표적의 특유의 부류를 나타낸다. 인간 백혈구 항원 (HLA)-A1 또는 HLA-A2의 문맥에서 바이러스 또는 종양 항원에서 유래된 펩타이드를 표적하는 TCR-유사 항체는 기재되어 왔다 (참고, 예를 들면, Sastry 등, J Viral. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva 등, Blood, 2011117(16):4262-4272; Verma 등, Jlmmunol2010 184(4):2156-2165; Willemsen 등, Gene Ther20018(21) :1601-1608; Dao 등, Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33; Tassev 등, Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). 예를 들어, TCR-유사 항체는 라이브러리, 예컨대 인간 scFv 파아지 표시된 라이브러리 스크리닝으로부터 확인될 수 있다. HLA-A2와 관련하여 WT1을 표적하는 TCR-유사 항체에 기반되는 예시적 CARs는 서열번호: 1176 내지 서열번호: 1179에 의해 표시된다. 본 발명에서, CARs는 몇 개의 HLA-A2 제한된 세포내 펩타이드에 대한 항체 같은 TCR에서 유래된 항원 결합 도메인을 사용하여 생성되었다. 표적 단백질 항원, 펩타이드 단편 및 펩타이드의 서열은 표 23에서 보여진다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 (scFv 단편을 포함하는) 항체의 기능성 단편을 포함하는 CARs가 표적 항원을 결합시키는 경우, 생물학적 반응 예컨대 면역 반응의 활성화, 이의 표적 항원에서 기원하는 신호-형질도입의 억제, 키나제 활성의 억제, 및 기타 동종은, 숙련가에 의해 이해될 바와 같이, 유도된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 단독으로 또는 액세서리 모듈과 발현된 경우 CARs에 의해 표적될 수 있는 질환에 특이적인 항원은 비제한적으로 하기를 포함한다: 어느 하나 이상의 D19, CD22, CD23, MPL, CD123, CD32, CD138, CD200R, CD276, CD324, CD30, CD32, FcRH5, CD99, 조직 인자, 아밀로이드, 면역글로불린의 Fc 영역, CD171, CS-1, CLL-1 (CLECL1), CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL11Ra, 메소텔린, PSCA, VEGFR2, Lewis Y, CD24, PDGFR-베타, PRSS21, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gpl00, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLea, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, TCR-베타1 불변 쇄, TCR 베타2 불변 쇄, TCR 감마-델타, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WTl, NY-ESO-1, LAGE-la, 레구마인, HPV E6, E7, HTLV1-Tax, KSHV K8.1 단백질, EBB gp350, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120, MAGE-Al, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련된 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-l/갈렉틴 8, MelanA/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, DLL3, TROP2, PTK7, GCC, AFP, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, RUl, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 융모성 성선자극호르몬 호르몬 수용체 (CGHR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 융모성 성선자극호르몬 호르몬 수용체 (CGHR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, 또는 이의 조합.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 단독으로 또는 액세서리 모듈과 발현된 경우 CARs에 의해 표적될 수 있는 질환에 특이적인 항원은 비제한적으로 하기를 포함한다: 어느 하나 이상의 4-1BB, 5T4, 선암종 항원, 알파-태아단백, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산탈수소효소 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CD123, CEA, CNTO888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 파이브로넥틴 추가의 도메인-B, 폴레이트 수용체 1, GD2, GD3 강글리오사이드, 당단백질 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란검출기 인자 수용체 키나제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, LAMP1, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N-글라이콜릴뉴라민산, NPC-1C, PDGF-R α, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나스신 C, TGF 베타 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, 비멘틴 또는 이의 조합. 암에 특이적인 다른 항원은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 단독으로 또는 액세서리 모듈과 발현된 경우 CARs에 의해 표적될 수 있는 암에 특이적인 항원은 비제한적으로 어느 하나 이상의 MPL,CD19, FLT3, GRP-78, CD79b, Ly-1, Lym2, CD23, CD179b, CDH1, CDH6, CDH19, CDH17, DLL3, PTK7, TROP2, TIM1, LAMP1 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, MPL, CD19, FLT3, GRP-78, CD79b, Lym1, Lym2, CD23, CDH1, CDH6, CDH19, CDH17, DLL3, PTK7, TROP2, TIM1, LAMP1에 특이적인 CARs의 항원 특이적 도메인은 표 11에서 제시된 scFv 서열을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이 단독으로 또는 액세서리 모듈과 사용된 경우 CAR은 질환-지지 항원 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 질환-지지 항원)에 결합하는 항원 결합 도메인 (예를 들면, 항체 또는 항체 단편)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 질환-지지 항원은 질환 유발 세포의 생존 및 증식을 지지하는 세포에서 존재하는 항원이다. 일부 구현예에서, 질환-지지 항원은 기질 세포 또는 골수성-유래된 억제제 세포 (MDSC)에서 존재하는 항원이다. 기질 세포는 성장 인자 및 사이토카인을 분비시켜 세포 증식을 미세환경에서 촉진시킬 수 있다. MDSC 세포는 T 세포 증식 및 활성화를 차단시킬 수 있다. 이론에 의해 구속되기의 바램 없이, 일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 질환-지지 세포를 파괴하고, 그렇게 함으로써 간접적으로 질환 유발 세포의 성장 또는 생존을 차단시킨다.
구현예에서, 기질 세포 항원은 하나 이상의 하기로부터 선택된다: 골수 기질 세포 항원 2 (BST2), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP) 및 테나스신. 한 구현예에서, FAP-특이적 항체는 시브로투주맙과 동일한 CDRs이거나, 상기와 결합에 대하여 경쟁하거나, 상기를 갖는다. 구현예에서, MDSC 항원은 하나 이상의 하기로부터 선택된다: CD33, CD11b, C14, CD15, 및 CD66b. 따라서, 일부 구현예에서, 질환 지지 항원은 하나 이상의 하기로부터 선택된다: 골수 기질 세포 항원 2 (BST2), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP) 또는 테나스신, CD33, CD11b, C14, CD15, 및 CD66b.
추가 구현예에서, CAR의 각각의 항원 특이적 영역은 2가 (또는 2가) 단일-쇄 가변형 단편 (디-scFvs, 비-scFvs)를 포함할 수 있다. 디-scFVs를 포함하는 CARs에서, 각각의 항원에 대하여 특이적인 2 scFvs는 2 VH 및 2 VL 영역으로 단일 펩타이드 쇄를 생산함으로써 함께 연결되어, 탠덤 scFvs를 수득한다. (Xiong, Cheng-Yi; Natarajan, A; Shi, XB; Denardo, GL; Denardo, SJ (2006). "Development of tumor targeting anti-MUC-1 multimer: effects of di-scFv unpaired cysteine location on PEGylation and tumor binding". Protein Engineering Design and Selection 19 (8): 359-367; Kufer, Peter; Lutterb
Figure pct00004
se, Ralf; Baeuerle, Patrick A. (2004). "A revival of bispecic antibodies". Trends in Biotechnology 22 (5): 238-244). 적어도 2 항원-특이적 표적화 영역을 포함하는 CARs는 각각의 2 항원에 특이적인 2 scFvs를 발현시킬 것이다. 수득한 ASD는 공-자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 힌지 영역 및 막관통 도메인을 통해 연결된다. 대안적으로, 2 항원 특이적 표적화 영역을 포함하는 CARs는 각각의 2 항원 또는 동일한 항원의 2 에피토프에 특이적인 2 vHH를 발현시킬 것이다. 2 항원을 표적하는 예시적 CARs는 서열번호: 1042, 1043, 1049, 1050 및 1087에 의해 표시된다.
추가의 구현예에서, CAR의 각각의 ASD는 디아바디를 포함한다. 디아바디에서, scFvs는, scFvs를 이량체화하도록 구동하는, 2 가변 영역이 함께 폴딩하기에 너무 짧은 링커 펩타이드로 창출된다. 여전히 더 짧은 링커 (1 또는 2 아미노산)은 삼량체, 소위 트리아바디 또는 트리바디의 형성으로 이어진다. 테트라바디는 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR의 ASD는 표 4에서 기재된 바와 같이 VL 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 ASD는 표 6에서 기재된 바와 같이 VH 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 ASD는 표 7에서 기재된 바와 같이 VHH 단편 (나노바디)를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 ASD는 표 8에서 기재된 바와 같이 아피바디를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 ASD는 표 10에서 기재된 바와 같이 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 ASD는 표 11에서 기재된 바와 같이 scFv 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 항원 결합 부분, 예를 들면, 표 4 및 6, 각각에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 vL 및 vH 단편의 CDRs이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 항원 결합 부분, 예를 들면, 표 7에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 vHH 단편의 CDRs이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 표 8에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 비-면역글로불린 스캐폴드의 항원 결합 부분이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 이 표적 항원을 결합시키도록 공지된 수용체의 항원 결합 부분이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 결합 특이적 도메인은 이 표적 항원을 결합시키도록 공지된 리간드의 항원 결합 부분이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 항원 결합 부분, 예를 들면, 표 11에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 scFV의 vL 및 vH 단편의 CDRs이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 CARs로서 표 19-22에서 기재된 상이한 표적에서 동일한 에피토프에 결합하는 CARs (즉, 본 발명의 임의의 CARs를 가진 상이한 표적에 결합에 대하여 교차-경쟁하는 능력을 갖는 CARs)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이들 CARs의 항원 특이적 도메인은 항체의 vL 단편, vH 단편 또는 scFv 단편에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 표 19-22에서 기재된 본 발명의 CAR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 항체는 서열번호: 2334-2568 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다. 예시적 구현예에서, 서열번호: 2334에 의해 표시되는 참조 scFv FMC63(vL-vH)는 표 19-22에서 기재된 본 발명 (서열번호:2672, 2942, 3212, 3495-3515)의 백본 및 FMC63-기반 종래의 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표 19-22에서 기재된 본 발명의 CAR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 vHH 단편은 서열번호: 2269-2293 (표 7)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 vHH 단편이다. 일부 구현예에서, 표 19-22에서 기재된 본 발명의 CAR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 교차-경쟁 연구용 참조 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드는 서열번호: 2294-2298 (표 8)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드이다. 일부 구현예에서, 표 19-22에서 기재된 본 발명의 CAR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 리간드는 서열번호: 2323-2333 (표 10)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 리간드이다. 일부 구현예에서, 상이한 표적에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 2672-2941 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1117-1125)의 MPL-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 항체는 특허 출원 US 2012/0269814 A1에서 기재된 항체 mAb-1.6, mAb-1.111, mAb-1.75, mAb-1.78, mAb-1.169, 및 mAb-1.36이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1117-1125)의 MPL-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2499-2506 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1117-1125)의 MPL-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 리간드는 서열번호: 2323-2324 (표 10)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 리간드이다.
한 구현예에서, 본 발명의 MPL-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1117-1125 및 1164 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 MPL-표적 CAR은 펩타이드 서열 -PWQDGPK-에 상응하는 또는 상기와 중첩하는 MPL-에피토프에 결합한다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 930-941)의 CD19-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2336-2347 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CD19-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 930-941 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 964-977)의 CD20-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2366-2380 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CD20-표적 CARs에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 964-977 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 CD20-표적 CARs는 하나 이상의 서열 -PAGIYAPI-, -FLKMESLNFIRAHTP-, -HFLKMESLNFIRAHTPY-, -YNAEPANPSEKNSPSTQY-, -YNAEPANPSEKNSPST- 및 -YNCEPANPSEKNSP-에 상응하는 에피토프에 결합한다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1044-1045)의 DLL3-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2443-2444 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 DLL3-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1044-1045 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1104-1105)의 LAMP1-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2489-2490 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 LAMP1-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1104-1105 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 2910-2911)의 TROP2-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2544-2545 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 TROP2-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 2910-2911 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1143-1144)의 PTK7-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2523-2524 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 PTK7-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1143-1144 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, CD23-표적 CAR (예를 들면, 서열번호: 2932)에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFv는 서열번호: 2565 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFv이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CD23-표적 CAR에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CAR은 서열번호: 2932 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CAR이다.
한 구현예에서, TCR-감마-델타-표적 CAR (예를 들면, 서열번호: 1155)에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2535 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFv이다.
한 구현예에서, 본 발명의 TCR-감마-델타-표적 -표적 CAR에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CAR은 서열번호: 1155 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CAR이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1016-1017)의 CDH6-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2418-2419 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CDH6-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1016-1017 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1019 및 1180)의 CDH19-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2421 및 2558 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CDH19-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs은 서열번호: 1019 및 1180 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1014-1015)의 CD324-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2416-2417 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CD324-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1014-1015 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, CD276-표적 CAR (예를 들면, 서열번호: 2578)에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFv는 서열번호: 2415 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFv이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CD276-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CAR은 서열번호: 2578 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CAR이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1066-1067)의 GFRa4-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2461-2462 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 GFRa4-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1066-1067 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1040-1041)의 CSF2RA-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2441-2442 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CSF2RA-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1040-1041 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 2929-2930)의 B7H4-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2562-2563 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 B7H4-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 2929-2930 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
한 구현예에서, NY-BR1-표적 CAR (예를 들면, 서열번호: 1131)에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFv는 서열번호: 2512 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFv이다.
한 구현예에서, 본 발명의 NY-BR1-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CAR은 서열번호: 1131 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CAR이다.
한 구현예에서, CD200R-표적 CAR (예를 들면, 서열번호: 1190)에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFv는 서열번호: 2568 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFv이다.
한 구현예에서, 본 발명의 CD200R-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CAR은 서열번호: 1190 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CAR이다.
한 구현예에서, HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120-표적 CAR (예를 들면, 서열번호: 945)에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFv는 서열번호: 2512 (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFv이다.
한 구현예에서, 본 발명의 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120-표적 CAR에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CAR은 서열번호: 945 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CAR이다.
한 구현예에서, TSHR-표적 CAR (예를 들면, 서열번호: 1167)에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 리간드는 서열번호: (표 11)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 리간드이다.
한 구현예에서, 본 발명 (예를 들면, 서열번호: 1168-1170)의 TSHR-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 scFvs는 서열번호: 2333 (표 10)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 scFvs이다.
한 구현예에서, 본 발명의 TSHR-표적 CARs에 대한 교차-경쟁 연구용 참조 CARs는 서열번호: 1167-1170 (표 19)에서 나타낸 바와 같이 서열을 갖는 CARs이다.
일부 구현예에서, gp100, MART, 티로시나제, hTERT, MUC1, CMV-pp65, HTLV1-Tax, HIV1-gag, NY-ESO, WT1, AFP, HPV-16-E7, PR1을 표적하는 CARs는 MHC 부류 I (HLA-A2)를 가진 복합체에서 표 23에 나타낸 표적 펩타이드에 결합한다. 링커
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 CARs의 2 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 분리된다. 링커는, 본 발명의 CAR의 임의의 도메인/영역을 함께 연결하는, 길이 약 1 내지 100 아미노산의 올리고- 또는 폴리펩타이드 영역이다. 일부 구현예에서, 링커는 예를 들어 길이 5-12 아미노산, 길이 5-15 아미노산 또는 길이 5 내지 20 아미노산일 수 있다. 링커는 인접한 단백질 도메인이 서로에 비해 자유롭게 움직이도록 글리신 및 세린 같은 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 더 긴 링커, 예를 들어 100 초과 아미노산은 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있고, 예를 들어, 2 인접한 도메인이 서로를 입체적으로 방해하지 않는다는 것을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 예시적 구현예에서, 링커는 서열번호: 250-258 (표 5)에서 기재된다.
힌지 영역
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 (백본의 일부를 형성하는) CARs는 항원 특이적 도메인과 막관통 도메인 사이 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 항체 또는 이의 기능성 등가물, 단편 또는 유도체의 인간 CD8α 또는 Fc 단편, 인간 CD8α 또는 항체 또는 이의 기능성 등가물, 단편 또는 유도체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 및 이의 조합의 어느 하나 이상을 포함한다. 예시적 구현예에서, 힌지 영역은 (i) IgG4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (ii) IgG4의 힌지 영역, (iii) IgG4의 힌지 및 CH2 영역, (iv) CD8α의 힌지 영역, (v) IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (vi) IgG1의 힌지 영역, (vi) IgG1의 힌지 및 CH2 영역, 또는 (vii) 이의 조합의 어느 하나 이상을 포함한다.
막관통 도메인
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 (백본의 일부를 형성하는) CARs는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은, 임의의 유형 I, 유형 II 또는 유형 III 막관통 단백질을 포함하는, 막관통 도메인을 갖는 임의의 단백질로부터 막관통 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 막관통 도메인은 또한 인공 소수성 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 CARs의 막관통 도메인은 막관통 도메인이 이량체화하지 않도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 임의의 백본을 포함하는 TMD 인코딩된 CAR은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD1 1a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다
막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가의 아미노산, 예를 들면, 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산 (예를 들면, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 최대 15 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래되는 단백질의 세포내 영역과 관련된 하나 이상의 추가의 아미노산 (예를 들면, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 최대 15 아미노산)을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 막관통 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 하나와 인접한다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 신호전달 도메인, 공자극 도메인 또는 힌지 도메인이 유래되는 동일한 단백질 출신일 수 있다. 또 다른 측면에서, 막관통 도메인은 CAR의 임의의 다른 도메인이 유래되는 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다.
키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 (백본의 일부를 형성하는) CARs는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 도메인은 세포질일 수 있고 이펙터 기능 신호를 전달할 수 있고 이의 특화된 기능을 수행하기 위해 세포를 유도할 수 있다. 세포내 신호전달 도메인의 예는, 비제한적으로, T-세포 수용체 또는 임의의 이의 동족체, CD3 폴리펩타이드 (Δ, δ 및 ε), syk 계열 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70, 등), src 계열 티로신 키나제 (Lck, Fyn, Lyn, 등) 및 T-세포 형질도입에서 관여된 다른 분자, 예컨대 CD2, CD5 및 CD28의 ξ 쇄 (예를 들면, η 쇄, FcεR1γ 및 β 쇄, MB1 (Igα) 쇄, B29 (Igβ) 쇄, 등)을 포함한다. 구체적으로, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 쇄, FcγRIII, FcεRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 세포질 수용체를 보유하는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 또는 이의 조합일 수 있다. 추가의 세포내 신호전달 도메인은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 쇄, FcgRIII, FceRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 세포질 수용체를 보유하는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 및 이의 조합의 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함한다.
공-자극 도메인
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 (백본의 일부를 형성하는) CARs는 공-자극 도메인을 포함한다. 예시적 구현예에서, 공-자극 도메인은 CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 및 이의 조합의 어느 하나 이상으로부터 신호전달 도메인을 포함한다.
절단가능 링커
본 명세서에서 기재된 바와 같이 절단가능 링커는 2A 링커 (예를 들어 T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능성 등가물 및 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 피코르나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스의 CHYSEL 서열 (P2A), 토세아 아시그나 바이러스 (T2A) 또는 이의 조합, 변이체 및 기능성 등가물을 포함한다. 다른 구현예에서, 링커 서열은, 2A 글리신과 2B 프롤린 사이 절단을 초래하는, Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B) 모티프를 포함할 수 있다. 몇 개의 예시적 절단가능 링커의 핵 서열은 서열번호: 831 내지 서열번호: 836에서 제공되고 몇 개의 예시적 링커의 아미노산 서열은 서열번호: 2598 내지 서열번호: 2602에서 제공된다. 다른 링커는 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이고 본 발명의 대안적 구현예에 관련되어 사용될 수 있다. 한 구현예에서, Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) 모티프 (서열번호: 837-838 및 서열번호: 2603)은 또한 절단의 효율을 향상시키기 위해 절단가능 링커 서열의 업스트림 첨가된다. 절단가능 링커의 잠재적인 단점은 N-말단 단백질의 마지막에 위치한 작은 2A 태그가 단백질 기능에 영향을 줄 수 있거나 단백질의 항원성에 기여할 수 있다는 가능성이다. 이러한 제한을 극복하기 위해, 일부 구현예에서, 푸린 절단 부위 (RAKR) (서열번호: 839-841 및 서열번호: 2604)는 번역 이후 잔존 2A 펩타이드의 절단을 용이하게 하기 위해 SGSG 모티프의 업스트림 첨가된다. 한 구현예에서, 절단가능 링커는 CAR을 인코딩하는 폴리펩타이드와 액세서리 모듈을 인코딩하는 폴리펩타이드 사이 배치된다. 절단가능 링커의 부위에서 절단은 2 폴리펩타이드의 분리를 초래한다.
액세서리 모듈
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "액세서리 모듈"은 CARs의 치료 반응이 향상되도록 CARs와 관련된 독성을 감소시키거나 CARs를 발현시키는 T 세포의 활성을 향상, 감소 또는 변형시키는 제제를 지칭한다.
일부 구현예에서, CARs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 (i) CARs를 발현시키는 T 세포의 수명을 연장시키는, (ii) T 세포 증식을 자극시키는 및/또는 (iii) 세포자멸사로부터 CARs를 발현시키는 T 세포를 보호하는 바이러스 및 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 예시적 구현예에서, 그와 같은 단백질은 비제한적으로 카포시 육종 관련된 헤르페스 바이러스로부터 vFLIP-K13 (서열번호: 866), 전염성 연속종 바이러스로부터 MC159 (서열번호: 867), cFLIP-L/MRITα (서열번호: 873), cFLIP-p22 (서열번호: 874) 및 인간 T 세포 백혈병/림프종 바이러스 (HTLV-1 및 HTLV-2)로부터 Tax (서열번호: 875 및 서열번호: 876) 및 HTLV-2로부터 Tax-RS 돌연변이체 (서열번호: 877)을 포함한다.
일 구현예에서, CARs를 인코딩하는 벡터는 vFLIP-K13을 추가로 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, CARs를 인코딩하는 벡터는 MC159를 추가로 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, CARs를 인코딩하는 벡터는 HTLV1-Tax를 추가로 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, CARs를 인코딩하는 벡터는 HTLV2-Tax를 추가로 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, CARs를 인코딩하는 벡터는 cFLIP-L/MRITα를 추가로 인코딩한다.
일부 구현예에서, 액세서리 분자는 본 명세서에서 기재된 CARs에 의해 인코딩하는 벡터로부터 구별되는 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, CARs를 인코딩하는 벡터를 포함하는 이펙터 세포는 또한 액세서리 분자를 인코딩하는 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, CARs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 전염성 연속종 바이러스로부터 액세서리 분자 vFLIP MC160, 말 헤르페스 바이러스 2로부터 vFLIP E8, 인간 헤르페스 바이러스 사이미리로부터 vFLIP, 소 헤르페스 바이러스 (BHV) 4로부터 vFLIP, 메카카 헤르페스 바이러스로부터 vFLIP 및/또는 인간 세포 FLICE 억제 단백질 (cFLIP-L/MRITα 또는 cFLIP-p22)의 전장 또는 N-말단 단편을 추가로 발현시킨다. (표 16).
일부 구현예에서, CARs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 사이토카인에 특이적인 siRNA 또는 scFv를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 예시적 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-6, IFNγ 또는 이의 조합의 어느 하나 이상이다. 일부 구현예에서, CARs는 IL6 수용체 α 및 인간 혈청 알부민에 결합하는 분비된 이중특이적 항체 단편으로 공-발현된다. 일부 구현예에서, CARs는 IL6에 결합하는 분비된 scFv 단편으로 공-발현된다. 일부 구현예에서, CARs는 CAR 요법과 관련된 모세관 누출을 완화시키기 위해 펩타이드 FX06으로 공발현된다.
추가 구현예에서, CARs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 내인성 TCR-α, TCR-β, TCR-γ, TCR-델타, CD3감마, CD3제타, CD3엡실론, CD3-델타를 표적하는 뉴클레아제 또는 siRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
추가 구현예에서, CARs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 선별 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 예시적 구현예에서, 선별 마커는 약물 저항 유전자, 예컨대 푸로마이신 또는 칼시뉴린 억제제 (예를 들면 CNB30; 서열번호: 852)에 저항을 부여하는 유전자를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 인간 CD30, CD20, CD19 (서열번호: 854), BCMA (서열번호: 855), EGFR (서열번호: 853), CD34, 또는 세포 표면에서 발현되는 임의의 단백질 또는 단백질 단편의 세포외 및 막관통 도메인에 대하여 인코딩할 수 있고 이의 표적 항원을 발현시키는 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 항체에 의해 인식될 수 있다. 예시적 구현예에서, 항-EGFR 단클론성인, 세툭시맙은 절단된 EGFR (서열번호: 853)을 공발현시키는 본 발명의 CAR-발현 세포를 제거하는데 사용된다. 선별 마커(들)은 CAR을 발현시키는 세포에 대하여 풍부하게 하는데, CAR의 높은 수준을 발현시키는 세포에 대하여 선택하는데 및/또는 CAR을 발현시키는 세포의 클론 다양성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 추가 구현예에서, CARs을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CARs의 세포외 도메인에서 발현되는 에피토프 태그에 대하여 인코딩할 수 있고 CAR을 발현시키는 세포에 대하여 풍부하게 하는데, CAR의 높은 수준을 발현시키는 세포에 대하여 선택하는데 및/또는 CAR을 발현시키는 세포의 클론 다양성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 그와 같은 태그의 비-제한 예는 서열번호: 553-563 및 3526-3530 (표 12)에서 제공된다. CARs를 발현시키는 동종이계 T 세포의 클론 다양성 감소는 차례로 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 감소된 발병률로 이어질 것이고, 그렇게 함으로써 CAR-T 세포 요법에 대하여 동종이계 T 세포의 용도를 허용한다.
폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드
본 명세서에서 기재된 백본 1-62의 어느 하나 이상 또는 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다 (표 2).
종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, CARs의 항원-특이적 도메인은 표적 세포, 예컨대 암 세포에서 1, 2, 3 또는 초과 항원에 특이적이다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, CAR의 각각의 요소는 인접하고 CAR의 각각의 다른 요소를 가진 동일한 해독틀에 있다. 일부 구현예에서, 백본을 포함하는 CAR에서 1 초과 항원 특이적 도메인을 포함하고, 각각의 항원 특이적 도메인은 인접하고 동일한 CAR에서 다른 항원 특이적 도메인과 동일한 해독틀에 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 백본-1을 포함하는 CAR의 항원-특이적 도메인은 표적 세포, 예컨대 암 세포에서 1, 2, 3 또는 초과 항원에 특이적이다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, CAR의 각각의 요소는 인접하고 백본-1을 포함하는 CAR의 각각의 다른 요소를 가진 동일한 해독틀에 있다. 일부 구현예에서, 백본-1을 포함하는 CAR에서 1 초과 항원 특이적 도메인을 포함하고, 각각의 항원 특이적 도메인은 인접하고 동일한 CAR에서 다른 항원 특이적 도메인과 동일한 해독틀에 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이 종래의 CAR II 및 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩타이드가 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 백본-32를 포함하는 CAR의 항원-특이적 도메인은 표적 세포, 예컨대 암 세포에서 1, 2, 3 또는 초과 항원에 특이적이다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, CAR의 각각의 요소는 인접하고 CAR의 각각의 다른 요소를 가진 동일한 해독틀에 있다. 일부 구현예에서, 백본-32를 포함하는 CAR에서 1 초과 항원 특이적 도메인을 포함하고, 각각의 항원 특이적 도메인은 인접하고 동일한 CAR에서 다른 항원 특이적 도메인과 동일한 해독틀에 있다.
다양한 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 2, 3 또는 초과 항원 특이적 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 2, 3 또는 초과 공-자극 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 2, 3 또는 초과 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 2, 3 또는 초과 바이러스 및/또는 세포 신호전달 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 CARs의 원하는 요소에 대하여 인코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에서 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 핵산 분자를 발현시키는 세포로부터 라이브러리 스크리닝에 의해, 동일한 것을 포함하도록 공지된 벡터에서 핵산 분자의 유래에 의해, 또는 표준 기술을 사용하여, 동일한 것을 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심의 핵산은 클로닝되기 보다는 합성으로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 표 19-22에서 기재된 바와 같이 표적에 특이적이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 표 4 및 6, 각각에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 vL 및 vH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들면, CDRs이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 표 7에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 vHH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들면, CDRs이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 표 8에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 비-면역글로불린 스캐폴드의 항원 결합 부분이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 이 표적 항원에 결합하도록 공지된 수용체의 항원 결합 부분이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 결합 특이적 도메인은 이 표적 항원에 결합하도록 공지된 리간드의 항원 결합 부분이다.
일 구현예에서, 표적 항원에 대한 CAR의 항원 특이적 도메인은 표 11에서 나타낸 바와 같이 이 항원을 표적하는 scFV의 vL 및 vH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들면, CDRs이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 표 19-22에서 기재된 표적에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 트롬보포이에틴 수용체, MPL에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD19에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD20에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD22에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD23에 특이적이다
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD30에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD32에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD33에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD123에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD138에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD200R에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD276에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD324에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 BCMA에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CS1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 ALK1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 ROR1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CDH6에 특이적이다
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CDH16에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CDH17에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CDH19에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 EGFRviii에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Her2에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Her3에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 메소텔린에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 폴레이트 수용체 알파에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 폴레이트 수용체 베타에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CLL-1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CLEC5A에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 NY-ESO/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 WT1/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 WT1/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 AFP/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 HPV16-E7/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 gp100/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 hTERT/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 MART1/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 HTLV1-Tax/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 PR1/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 HIV1-gag/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 HIV1-엔벨로프 gp120에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 DLL3에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 PTK7에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TROP2에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 LAMP1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Tim1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TCR 감마-델타에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TCR 베타1 불변 쇄에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TCR 베타2 불변 쇄에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 GCC에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 B7H4에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 LHR에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TSHR에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Tn-Muc1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TSLPR에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 조직 인자에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 SSEA-4에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 SLea에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Muc1/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Muc16에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 NYBR-1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 IL13Ra2에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 IL11Ra에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 L1CAM에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 EpCAM1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 gpNMB에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 GRP78에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 GPC3에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 GRPC5D에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 GFRa4에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 FITC에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD79b에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Lym1에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Lym2에 특이적이다.
일부 구현예에서, 종래의 CARs I 내지 III의 일부이거나 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 CARs를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 항체의 Fc 부분 (즉 Ig Fc)에 특이적이다. Ig Fc에 특이적인 항원-특이적 도메인을 가진 예시적 CAR은 서열번호: 2708에 의해 표시되고 CD16-V158의 세포외 도메인을 항원 특이적 도메인으로서 함유한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs 및/또는 액세서리 분자를 인코딩하는 핵산 분자는 메신저 RNA (mRNA) 전사체로서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CARs 및/또는 액세서리 분자를 인코딩하는 핵산 분자는 DNA 작제물로서 제공된다.
본 명세서에서 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 렌티바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 세포 속에 직접적으로 형질도입될 수 있는 CAR 및 액세서리 분자를 발현시키는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물을 포함한다.
본 발명은 또한 세포 속에 직접적으로 형질감염될 수 있는 RNA 작제물을 포함한다. 형질감염에서 사용하기 위한 mRNA 생성 방법은 특별히 설계된 프라이머로 템플레이트의 시험관내 전사 (IVT), 이어서 폴리A 첨가를 포함하여, 3' 및 5' 미번역된 서열 ("UTR") (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 5' 캡) 및/또는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 IRES), 발현되는 핵산, 및 폴리A 꼬리를 함유하는 작제물을, 전형적으로 길이 50-2000 염기 (서열번호:922)로 생산한다. 그렇게 생산된 RNA는 세포의 상이한 종류를 효율적으로 형질감염시킨다. 일 구현예에서, 템플레이트는 CAR용 서열을 포함한다. 한 구현예에서, RNA CAR 벡터는 세포, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포 속에, 전기천공으로 형질도입된다. 또 다른 구현예에서, RNA CAR 벡터는 세포, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포 속에, 특허 출원 WO 2013/059343 A1 (PCT/US2012/060646)에서 기재된 바와 같이 미세유체 디바이스를 사용하는 세포 막에서 일시적 작은 변화 유발에 의해 형질도입된다. 원하는 분자에 대하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에서 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 유전자를 발현시키는 세포로부터 라이브러리 스크리닝에 의해, 동일한 것을 포함하도록 공지된 벡터에서 유전자 유래에 의해, 또는 표준 기술을 사용하여, 동일한 것을 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심의 유전자는 클로닝되기 보다는 합성으로 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 CARs를 인코딩하는 DNA가 삽입되는 벡터를 제공한다. 레트로바이러스 예컨대 렌티바이러스에서 유래된 벡터는 이들이 딸 세포에서 이의 번식 그리고 이식유전자의 장기간, 안정한 통합을 허용하기 때문에 장기간 유전자 도입을 달성하기에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 이들이 비-증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스 예컨대 쥣과 백혈병 바이러스에서 유래된 벡터에 대해 부가된 장점을 갖는다. 이들은 또한 저 면역원성의 부가된 장점을 갖는다. 예시적 렌티바이러스 벡터는 서열번호: 905-906에서 제공된다. 레트로바이러스 벡터는 또한, 예를 들면, 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는, 예를 들면, 프로모터, 패키징 신호 (ψ), a 프라이머 결합 부위 (PBS), 하나 이상의 (예를 들면, 2) 긴 말단 반복부 (LTR), 및 관심의 이식유전자, 예를 들면, CAR을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 바이러스 구조적 유전자 예컨대 gag, pol, 및 env가 부족할 수 있다. 예시적 감마레트로바이러스 벡터는 쥣과 백혈병 바이러스 (MLV), 비장-병소 형성 바이러스 (SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스 (MPSV), 및 거기에서 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터는, 예를 들면, 하기에서 기재된다: Tobias Maetzig 등, "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713. 예시적 레트로바이러스 벡터는 서열번호: 907에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 원하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터 (A5/35)이다.
CARs를 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 CAR 폴리펩타이드 또는 이의 부분을 인코딩하는 핵산의 프로모터에의 작동가능하게 연결, 그리고 작제물의 발현 벡터 속에 편입에 의해 전형적으로 달성된다. 벡터는 진핵생물의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 본 발명의 발현 작제물은, 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여, 핵산면역화 및 유전자 요법에 또한 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 참고, 예를 들면, 그 전체가 본 명세서에서 참고로 편입된, 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466.
클로닝 및 발현 방법은 종래 기술의 숙련가에 분명할 것이고 하기에서 기재된 바와 같을 수 있다: WO 2015/142675; Sambrook 등, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY; June 등. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716; WO　01/96584;　WO　01/29058; 미국 특허 번호 6,326,193, 이들 각각의 내용은 본 명세서에서 제시된 것처럼 그 전문이 참고로 본 명세서에서 편입됨.
숙주 세포 속에 폴리뉴클레오타이드의 물리적 도입 방법 예컨대 인산칼슘 형질감염 및 기타 동종은 당해 분야에서 널리 공지되고 종래 기술의 숙련가에 분명할 것이다. 예시적 구현예에서, 그와 같은 방법은 하기에서 제시된다: Sambrook 등, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY); 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362, 이들 각각의 내용은 본 명세서에서 제시된 것처럼 그 전문이 참고로 본 명세서에서 편입됨. 또 다른 구현예에서, CAR 벡터는 세포, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포 속에, 하기에서 기재된 바와 같이 미세유체 디바이스를 이용하여 세포 막에서 일시적 작은 변화 유발에 의해 형질도입된다: 특허 출원 WO 2013/059343 A1 (PCT/US2012/060646) 및 Ding X 등, Nat. Biomed. Eng. 1, 0039 (2017) 이들 각각의 내용은 본 명세서에서 제시된 것처럼 그 전문이 참고로 본 명세서에서 편입됨.
유전적으로 조작된 세포
다양한 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포를 포함하는, 본 명세서에서 기재된 CARs를 가진 변형물에 대한 세포는 대상체 요망 요법으로부터 수득될 수 있다. T 세포는, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 가슴샘 조직, 감염의 부위로부터 조직, 복수, 늑막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함하는, 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는, CAR의 발현에 앞서 시험관내 배양 및 팽창될 수 있는, 조직 상주 감마-델타 T 세포일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 질환-관련된 항원, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 종양 항원에 특이적 결합을 위하여 조작된 항원 결합 도메인 (예를 들면, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편)을 포함하는 수많은 키메라 항원 수용체 (CAR)을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은 CAR을 발현시키기 위해 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 제공하고, 여기서 조작된 면역 이펙터 세포는 치료 특성을 나타낸다. 일 측면에서, 본 발명은 CAR을 발현시키기 위해 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 제공하고, 여기서 조작된 면역 이펙터 세포는 항암 특성을 나타낸다 일 측면에서, 세포는 CAR로 형질전환되고 CAR은 세포 표면에서 발현된다. 일부 구현예에서, 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 그와 같은 구현예에서, 세포는 CAR을 안정적으로 발현시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는, CAR을 인코딩하는, 핵산, 예를 들면, mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 일부 그와 같은 구현예에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명은 이환 세포 또는 질환-관련된 세포, 예컨대 암 세포에 면역 이펙터 세포를 유도하는 하나 이상의 CARs를 함유하도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 제공한다. 이것은 암 관련된 항원에 특이적인 CAR에서 항원 결합 도메인을 통해 달성된다. 본 발명의 CARs에 의해 표적될 수 있는 암 관련된 항원 (종양 항원)의 2 부류가 있다: (1) 암 세포의 표면에서 발현되는 암 관련된 항원; 및 (2) 자체가 세포내이지만, 그러나, 그와 같은 항원 (펩타이드)의 단편이 MHC (주조직 적합성 복합체)에 의해 암 세포의 표면에서 제시되는 암 관련된 항원.
게다가, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 종양 항원 또는 질환 관련된 항원을 발현시키는 세포 또는 조직을 포함하는, 다른 질환 중에서, 암 또는 임의의 악성종양 또는 자가면역 질환 또는 감염성 질환 또는 퇴행성 질환 또는 알러지성 질환의 치료용 방법 또는 약제에서 이의 용도 그리고 CARs 및 CAR-발현 세포를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현시키기 위해 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 제공하고, 여기서 조작된 면역 이펙터 세포는 항-질환 특성, 예컨대 항종양 특성을 나타낸다. 바람직한 항원은 본 명세서에서 기재된 암 관련된 항원 (즉, 종양 항원)이다. 일 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 부분적으로 인간화된 항체 단편을 포함한다. 일 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 부분적으로 인간화된 scFv를 포함한다. 따라서, 본 발명은 인간화된 항원 결합 도메인을 포함하고 세포, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포 속에 조작되고, 입양 요법을 위한 이의 사용 방법이다.
본 명세서에서 기재된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 키메라 항원 수용체를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포가 본 명세서에서 추가로 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 T-림프구 (T-세포)이다. 일부 구현예에서 세포는 미접촉 T 세포, 중심 메모리 T 세포, 이펙터 메모리 T 세포, 조절 T 세포 (Treg) 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 세포는 자연 살해 (NK) 세포, 조혈모세포 (HSC), 배아 줄기 세포, 또는 a 만능 줄기 세포이다. 본 발명의 CARs를 포함할 수 있고 발현시킬 수 있는 유전적으로 조작된 세포는, 비제한적으로, 치료적으로 관련된 자손을 야기시킬 수 있는 T-림프구 (T-세포), 미접촉 T 세포 (TN), 메모리 T 세포 (예를 들어, 중심 메모리 T 세포 (TCM), 이펙터 메모리 세포 (TEM)), 자연 살해 세포, 조혈모세포 및/또는 만능 배아/유도된 줄기 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 자가조직 세포이다. 한 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 동종이계 세포이다. 예로써, 본 발명의 개별 T-세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4-/CD8- 또는 CD4+/CD8+일 수 있다. T-세포는 CD4+/CD8- 및 CD4-/CD8+ 세포의 혼합된 모집단 또는 단일 클론의 모집단일 수 있다. 본 발명의 CD4+ T-세포는 표적 항원을 발현시키는 세포 (예를 들어 CD20+ 및/또는 CD19+ 종양 세포)로 시험관내 공-배양된 경우 IL-2, IFNγ, TNFα 및 다른 T-세포 이펙터 사이토카인을 생산할 수 있다. 본 발명의 CD8+ T-세포는 표적 세포로 시험관내 공-배양된 경우 항원-특이적 표적 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD45RA+ CD62L+ 미접촉 세포, CD45RO+ CD62L+ 중심 메모리 세포, CD62L- 이펙터 메모리 세포 또는 이의 조합의 어느 하나 이상일 수 있다 (Berger 등, Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity. Curr Opin Immunol 2009 21(2)224-232). 유전적으로 변형된 세포는 본 발명의 CAR을 인코딩하는 DNA로 세포를 안정적으로 형질감염시킴으로써 생산될 수 있다.
다양한 방법은 본 발명의 CAR을 발현시키는 안정한 감염체를 생산한다. 일 구현예에서, 세포를 안정적으로 형질감염 및 재-유도시키는 방법은 네이키드 DNA를 사용하는 전기천공에 의한 것이다. 네이키드 DNA를 사용함으로써, 재유도된 세포를 생산하기 위해 요구된 시간은 상당히 감소될 수 있다. 본 발명의 CAR을 인코딩하는 네이키드 DNA를 사용하여 세포를 유전적으로 조작하는 추가의 방법은 비제한적으로 (예를 들면, 인산칼슘, 덴드리머, 리포좀 및/또는 양이온성 폴리머를 사용하는) 화학적 전환 방법, 비-화학적 전환 방법 (예를 들면, 전기천공, 광학 전환, 유전자 전기도입, 세포 막에서 일시적 작은 변화 및/또는 유체역학적 전달) 및/또는 입자-기반 방법 (예를 들면, 유전자 건을 사용하는, 임페일펙션 및/또는 자기주입법)을 포함한다. 단일 통합된 비-재배열된 벡터의 존재 및 CAR의 발현을 입증하는 형질감염된 세포는 생체외 팽창될 수 있다. 일 구현예에서, 생체외 팽창을 위하여 선택된 세포는 CD8+이고 항원-특이적 표적 세포를 구체적으로 인식하고 용해하는 수용력을 입증한다.
바이러스 형질도입 방법은 본 발명의 CAR을 발현시키는 재유도된 세포를 생성하는데 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 CAR을 발현시키는 유전적으로 변형된 세포를 생성하는데 사용될 수 있는 세포 유형은 비제한적으로 치료적으로 관련된 자손을 야기시킬 수 있는 T-림프구 (T-세포), 자연 살해 세포, 조혈모세포 및/또는 만능 배아/유도된 줄기 세포를 포함한다.
적절한 조건 하에 항원에 의한 T-세포의 자극은 세포의 증식 (팽창) 및/또는 IL-2의 생산을 초래한다. 본 발명의 CAR을 포함하는 세포는 CAR의 항원-특이적 표적 영역에 하나 이상의 항원의 결합에 반응하여 숫자상으로 팽창할 것이다. 본 발명은 또한 CAR을 발현시키는 세포의 제조 및 팽창 방법을 제공한다. 상기 방법은 CAR을 발현시키는 벡터로 세포를 형질감염 또는 형질도입시키는 단계 그리고, T-세포를 제조 및 팽창시키기 위해, 세포를 증식하게 하도록 수용체에 표적 항원, 재조합 표적 항원, 또는 항체를 발현시키는 세포로 상기 세포를 자극시키는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 세포는 치료적으로 관련된 자손을 야기시킬 수 있는 T-림프구 (T-세포), 자연 살해 (NK) 세포, 조혈모세포 (HSCs) 또는 만능 배아/유도된 줄기 세포의 어느 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 유전적으로 조작된 세포는 본 명세서에서 기재된 다양한 백본을 발현시키고, 여기서 백본의 CAR 요소는 CAR의 항원 특이적 도메인에 기반된 표적 특이성을 결정한다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 MPL에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD19에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD20에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 BCMA에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD22에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD30에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD33에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD123에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CD138에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CLL1에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TCR-베타1 불변 쇄에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TCR-베타2 불변 쇄에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 ALK에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 PTK7에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 DLL3에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TROP2에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Tim1에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 LAMP1에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 CS1에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Lym1에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 Lym2에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 TSHR에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 NY-ESO/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 WT1/MHC 부류 I 복합체에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 HIV1 엔벨로프 당단백질 gp120에 특이적이다.
일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원-특이적 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역에 특이적이다.
다양한 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 종래의 CARs I 내지 III 또는 본 명세서에서 기재된 백본, 예컨대 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33의 일부인 종래의 CARs I 내지 III을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 CARs의 항원 특이적 도메인은 표 4, 7, 8, 11, 19, 20, 21 또는 22에서 기재된 항원을 표적한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이 CARs 및/또는 인핸서를 포함하는 면역 이펙터 세포 예컨대 T 세포 및 NK 세포는, 예를 들어, 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에서 기재된 바와 같은 방법을 일반적으로 사용하여 활성화 및 팽창될 수 있다.
치료 방법
질환-관련된 항원 또는 암 관련된 항원의 발현과 관련된 질환의 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 항원-특이적 CAR 단독 또는 항원 특이적 CAR 및 액세서리 분자를 발현시키도록 조작되는 본 명세서에서 기재된 유전적으로 변형된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)의 치료적 유효량을 대상체에 투여함으로써 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 항원은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 질환 특이적 항원이고, 여기서 질환 유발 또는 질환-관련된 세포는 질환-특이적 항원을 발현시킨다.
일 구현예에서, 항원-특이적 CAR 단독 또는 항원 특이적 CAR 및 액세서리 분자를 발현시키도록 조작되는 본 명세서에서 기재된 유전적으로 변형된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)의 치료적 유효량을 대상체에 투여함으로써 그것을 필요로 하는 대상체에서 암의 치료 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 항원은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 암 특이적 항원이고, 여기서 암 세포는 종양 항원을 발현시킨다.
일 구현예에서, 암 특이적 항원은 양쪽 정상 세포 및 암 세포에서 발현되지만, 정상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항원 특이적 CAR이 암 세포를 결합 및 사멸시키게 하는 친화도로 관심의 암 특이적 항원을 결합시키는 CAR을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 CAR은 암 세포를 사멸시키지만 암 항원을 발현시키는 정상 세포의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 미만보다 적게 사멸시킨다. 예시적 구현예에서, 항원 특이적 CARs에 의해 사멸된 세포의 백분율은 본 명세서에서 기재된 세포사 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 종래의 CARs I 내지 III을 발현시키도록 조작되는 유전적으로 변형된 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 CARs의 ASD는 암 세포에서 발현되는 항원에 특이적이다 (예를 들어, 항원은 암 세포에 비해 정상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현된다).
일부 구현예에서, 본 발명은 종래의 CARs I 및 액세서리 모듈 K13-vFLIP를 포함하는 백본-1을 발현시키도록 조작되는 유전적으로 변형된 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 CARs의 ASD는 암 세포에서 발현되는 항원에 특이적이다 (예를 들어, 항원은 암 세포에 비해 정상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현된다).
일부 구현예에서, 본 발명은 종래의 CARs I 및 액세서리 모듈 MC159-vFLIP를 포함하는 백본-2를 포함시키도록 조작되는 유전적으로 변형된 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 CARs의 ASD는 암 세포에서 발현되는 항원에 특이적이다 (예를 들어, 항원은 암 세포에 비해 정상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현된다).
일부 구현예에서, 본 발명은 종래의 CAR II 및 액세서리 모듈 K13-vFLIP를 포함하는 백본-32를 포함시키도록 조작되는 유전적으로 변형된 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 CARs의 ASD는 암 세포에서 발현되는 항원에 특이적이다 (예를 들어, 항원은 암 세포에 비해 정상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현된다).
일부 구현예에서, 본 발명은 종래의 CAR II 및 액세서리 모듈 MC159-vFLIP를 포함하는 백본-33을 포함시키도록 조작되는 유전적으로 변형된 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 CARs의 ASD는 암 세포에서 발현되는 항원에 특이적이다 (예를 들어, 항원은 암 세포에 비해 정상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현된다).
예시적 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료 방법에 대하여 표적될 수 있는 항원은 비제한적으로 하기의 임의의 1, 2, 3, 4 또는 초과를 포함한다: CD19; CD123; CD22; CD23, CD30; CD32, CD99; 조직 인자; MPL; CD171; CS-1 (또한 CD2 서브셋 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 칭함); C-유형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 부류 일원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1 (ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련된 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 암종배아 항원 (CEA); 상피성 세포 접착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파 (IL-1 1Ra); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 관련된 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 접착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 돌연변이된 신장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산탈수소효소 IX (CAFX); 프로테아솜 (Prosome, Macropain) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gp100); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과 백혈병 바이러스성 종양유전자 동족체 1 (Ab1)로 구성되는 종양유전자 융합 단백질 (bcr-ab1); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 접착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1- 4)bDGlcp(l-l)Cer); 트랜스루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종-관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련된 (TEM7R); 크라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질- 커플링된 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 열린 해독틀 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라미드의 육당류 부분 (GloboH); 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 아넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51 E2 (OR51E2); TCR 감마 대안 해독틀 단백질 (TARP); 윌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련된 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한, ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 계열, 구성원 1A (XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원- 1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 생존한; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원- 1 (PCTA-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식된 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 세포자멸사의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코스아미닐-전달효소 V (NA17); 쌍으로 된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포종 바이러스성 종양유전자 신경교세포종 유래된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 부류 일원 C (RhoC); 티로시나제-관련된 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator of Imprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식된 편평상피 세포 암종 항원 (SART3); 쌍으로 된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구- 특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 활막 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진전된 당화반응 최종생성물용 수용체 (RAGE-1); 신장 편재 1 (RU1); 신장 편재 2 (RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카복실 에스테라제; 돌연변이된 열충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 하위부류 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 부류 일원 f (CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 계열 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신- 유사 호르몬 수용체- 유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLL1), PTK7, LAMP1, TROP2, Tim1 및 HIV1-엔벨로프 당단백질 gp120.
예시적 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료 방법에 대하여 표적될 수 있는 항원은 비제한적으로 하기의 임의의 1, 2, 3, 4 또는 초과를 포함한다: TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, MUC1, EGFR, NCAM, CAIX, LMP2, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련된 항원 1, p53 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1.
예시적 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료 방법에 대하여 표적될 수 있는 항원은 비제한적으로 하기의 임의의 1, 2, 3, 4 또는 초과를 포함한다: WT-1, hTERT, PRAME, HMMR/Rhamm, PR1, CG1, CD33, 사이클린-A1, NY-ESO-1, MAGE, HA-1, ACC1, T4A, LB-LY75-IK, BCR-ABL, FLT3-ITD, B-세포 수용체 개체특이형, HTLV-I Tax 단백질, CD19, 루이스 Y, CD22 및 ROR1.
예시적 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료 방법에 대하여 표적될 수 있는 항원은 비제한적으로 표 4, 7, 8, 11, 19, 20, 21 또는 22에서 기재된 표적의 임의의 1, 2, 3, 4 이상을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 MPL에 특이적인 종래의 CARs I 내지 III 또는 백본 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 암 세포는 MPL을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 암은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 골수이형성 증후군이다. 일 구현예에서, MPL 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 180-187에서 기재된 바와 같이 VL 단편, 서열번호: 427-434에서 기재된 바와 같이 VH 단편 및/또는 서열번호: 729-736에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 CD19에 특이적인 종래의 CARs I 내지 III 또는 백본 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 암 세포는 CD19를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 암은 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, , B 세포 악성종양, 비-호지킨 림프종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 또는, 다발성 골수종이다. 일 구현예에서, CD19 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 40-55에서 기재된 바와 같이 VL 단편, 서열번호: 288-303에서 기재된 바와 같이 VH 단편 및/또는 서열번호: 564-577에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 GRP-78에 특이적인 백본 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 암 세포는 GRP-78을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 암은 유방 암이다. 일 구현예에서, GRP-78 CAR을 발현시키는 면역 이펙터 세포가 또한 MPL CAR을 발현시키는 경우, 치료되는 암은 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 미만성 큰 B-세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 골수이형성 증후군 또는 다발성 골수종이다. 일 구현예에서, GRP-78 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 703에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일 구현예에서, MPL 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 180-187에서 기재된 바와 같이 VL 단편, 서열번호: 427-434에서 기재된 바와 같이 VH 단편 및/또는 서열번호: 729-736에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 CD79b에 특이적인 백본 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암, 자가면역 또는 알러지성 질환의 치료 방법을 제공하고, 여기서 암 세포는 CD79b를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 암은 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 미만성 큰 B-세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 골수이형성 증후군 또는 다발성 골수종이다. 일 구현예에서, CD79b 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 92-93에서 기재된 바와 같이 VL 단편, 서열번호: 340-341에서 기재된 바와 같이 VH 단편 및/또는 서열번호: 628에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 ROR-1 (수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1)에 특이적인 종래의 CARs I 내지 III 또는 백본 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암, 자가면역 또는 알러지성 질환의 치료 방법을 제공하고, 여기서 질환 관련된 또는 질환 유발 세포는 ROR-1을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 치료되는 암은 만성 림프구성 백혈병 또는 고형 장기 종양이다. 일 구현예에서, ROR-1 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 454-455에서 기재된 바와 같이 VH 단편 및/또는 서열번호: 755-756에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 Lym-1에 특이적인 백본 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암, 자가면역 또는 알러지성 질환의 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 치료받는 또는 예방되는 암은 B 세포 악성종양이다. 일 구현예에서, Lym-1 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 175에서 기재된 바와 같이 VL 단편, 서열번호: 421에서 기재된 바와 같이 VH 단편 및/또는 서열번호: 723에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 Lym-2에 특이적인 종래의 CAR I 내지 III 또는 백본 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암, 자가면역 또는 알러지성 질환의 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료되는 암은 혈액 암, 난소 암, 전립선 암 또는 췌장 종양이다. 일 구현예에서, Lym-2 특이적 CAR의 항원 특이적 도메인은 서열번호: 176에서 기재된 바와 같이 VL 단편, 서열번호: 422에서 기재된 바와 같이 VH 단편 및/또는 서열번호: 724에서 기재된 바와 같이 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD123-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD123을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 AML 또는 골수이형성 증후군 (MDS)이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD22-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD22를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 B 세포 악성종양이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 면역 질환 또는 알러지성 질환이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD23-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD23을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 B 세포 악성종양이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 면역 질환 또는 알러지성 질환이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CS-1-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CS-1을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 면역 질환 또는 알러지성 질환이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 혈장 세포 악성종양 또는 다발성 골수종 또는 원발성 삼출 림프종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 BCMA-CAR을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 BCMA를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 면역 질환 또는 알러지성 질환이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 혈장 세포 악성종양 또는 다발성 골수종 또는 원발성 삼출 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 면역 질환이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CLL-1-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CLL-1을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 AML 또는 MDS이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD30-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD30을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 림프종 또는 백혈병이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD33-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD33을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 AML 또는 MDS이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 IL-13Ra2-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 IL-13Ra2를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 교모세포종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 IL-11Ra-CAR을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 IL-11Ra를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 골육종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD20-CAR을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD20을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 B 세포 악성종양, 예컨대 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 미만성 큰 세포 림프종, 여포성 림프종 또는 맨틀 세포 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 면역 질환 또는 알러지성 질환이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 폴레이트 수용체 알파-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 폴레이트 수용체 알파를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 난소 암, NSCLC, 자궁내막 암, 신장 암, 또는 다른 고체 종양이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 TSHR-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 TSHR (갑상선 자극 호르몬 수용체)를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 갑상선 암, 또는 다발성 골수종 또는 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GPRC5D-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 GPRC5D를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암, 면역 또는 알러지성 질환이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 혈장 세포 장애, 다발성 골수종 또는 원발성 삼출 림프종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 ALK-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 ALK를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 NSCLC, ALCL (역형성 큰 세포 림프종), IMT (염증성 근섬유아세포 종양), 또는 신경교세포종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 HAVCRl-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 HAVCR1을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 신장 암이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 WT1/MHC I 복합체-특이적 CAR을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 MHC 부류 I 복합체에 관련하여 WT1을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 AML 또는 골수종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 NY-ESO-1/MHC 1 복합체-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 MHC 부류 I 복합체에 관련하여 NY-ESO-1을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 골수종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 PTK7-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 PTK7을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 흑색종, 폐 암 또는 난소 암이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 DLL3-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 DLL3을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 흑색종, 폐 암 또는 난소 암이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GCC-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 GCC를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 위장 암이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CCR4-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CCR4를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 T 세포 백혈병 또는 림프종이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CDH1/CD324-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CDH1/CD324를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD200R-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD200R을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CDH19-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CDH19를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 고체 종양이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CDH17-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CDH17을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 고체 종양이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CDH6-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CDH6을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 고체 종양이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GFRa4-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 GFRa4를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 갑상선 수질 암이다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 활성은 본 명세서에서 기재된 면역 이펙터 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로, 다사티닙, 포나티닙 및/또는 A-770041을 사용하여 제어될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 LHR-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 LHR (황체형성 호르몬 수용체)를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 전립선 암, 난소 암 또는 유방 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 FHR-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 FHR (여포성 호르몬 수용체)를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 전립선 암, 난소 암 또는 유방 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 GR-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 GR (성선자극호르몬 수용체)를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 전립선 암, 난소 암 또는 유방 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD45-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD45를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 혈액 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD32-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD32를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 혈액 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 TROP2-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 TROP2를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 유방 또는 전립선 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 LAMP-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 LAMP1을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 백혈병, 림프종 또는 골수종이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD32-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CD32를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 TCRB1-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 TCRB1 (T 세포 수용체 베타1 불변 쇄)를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 또는 자가면역 갑상선염이다.
일 측면에서, 본 발명은 TCRB2-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 TCRB2 (T 세포 수용체 베타2 불변 쇄)를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암 또는 면역 장애이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 또는 자가면역 갑상선염이다.
일 측면에서, 본 발명은 T 세포 수용체 감마-델타-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 T 세포 수용체 감마-델타를 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 암 또는 면역 장애이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 또는 자가면역 갑상선염이다.
일 측면에서, 본 발명은 HLA-A2-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 이식편 대 숙주 질환이다.
일 측면에서, 본 발명은 HIV 엔벨로프 당단백질 gp120에 대한 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)에서 HIV1-CAR을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 HIV1 엔벨로프 당단백질 gp120을 발현시킨다. 일 구현예에서, 치료되는 또는 예방되는 질환은 HIV1/AIDS이다.
일 측면에서, 본 발명은 CMV-특이적 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 CMV (사이토메갈로바이러스) 감염 또는 관련된 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 CMV로 감염된다. 일 측면에서 CMV CAR 및 백본은 CMV pp65 단백질에 관한 것이다. 일 측면에서, CMV-관련된 질환은 폐렴, 결장염 또는 뇌수막염이다.
일 측면에서, 본 발명은 EBB-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 EBB 감염 또는 EBB 감염과 관련된 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 EBB로 감염된다. 일 측면에서 EBB-특이적 CARs 및 백본은 EBB EBNA3c 단백질에 관한 것이다. 일 측면에서, EBB-특이적 CARs 및 백본은 EBB에 대한 광범위하게 중화하는 항체를 포함한다. 일 측면에서, EBB-관련된 질환은 림프종이다.
일 측면에서, 본 발명은 KSHV-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 KSHV 감염 또는 KSHV 감염과 관련된 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 KSHV로 감염된다. 일 측면에서, KSHV 관련된 질환은 카포시 육종 또는 원발성 삼출 림프종 또는 다중심 캐슬만병이다.
일 측면에서, 본 발명은 HTLV1-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 HTLV1 감염 또는 HTLV1 감염과 관련된 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 HTLV1로 감염된다. 일 측면에서, HTLV1-특이적 종래의 CAR 또는 백본은 HTLV1 Tax 단백질/MHC 부류 I 복합체를 표적한다. 일 측면에서, HTLV1 질환은 인간 T 세포 백혈병 또는 림프종이다.
일 측면에서, 본 발명은 인플루엔자A-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 인플루엔자 A 감염 또는 인플루엔자 A 감염과 관련된 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포는 인플루엔자 A로 감염된다. 일 측면에서, 인플루엔자A-특이적 종래의 CAR 또는 백본은 인플루엔자 A 혈구응집소 (HA), 예컨대 MEDI8852에 대한 광범위하게 중화하는 항체에서 유래된 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 CAR의 CD16 도메인에 이의 Fc 영역을 통해 그리고 이의 가변 (vL 및/또는 vH) 영역을 통해 질환 관련된 세포에서 발현된 항원에서 결합하는 항체 또는 항체 단편과 함께 CD16V158 또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이체 단편을 인코딩하는 보편적인 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알러지성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일 측면에서 질환 관련된 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 혈장 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
일 측면에서, 본 발명은 질환 관련된 세포에서 발현된 항원에 결합하는 FITC-표지된 항체 또는 항체 단편과 함께 FITC-특이적 종래의 CAR 또는 백본 1-62 (예를 들어, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33)을 발현시키도록 조작되는 면역 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알러지성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일 측면에서 질환 관련된 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 혈장 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
성장이 억제될 수 있는 예시적 암은 면역요법에 전형적으로 반응성인 암을 포함한다. 치료용 암의 비-제한 예는 흑색종 (예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장 암 (예를 들면 투명 세포 암종), 전립선 암 (예를 들면 호르몬 난치성 전립선 선암종), 유방 암, 결장 암 및 폐 암 (예를 들면 비-소 세포 폐 암)을 포함한다. 추가로, 난치성 또는 재발성 악성종양은 본 명세서에서 기재된 분자를 사용하여 치료될 수 있다.
예시적 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 방법으로 치료되는 암은, 다양한 기관계의, 고체 종양 예컨대 육종, 선암종, 및 암종, 예컨대 간, 폐, 유방, 림프양, 위장 (예를 들면, 결장), 비뇨생식관 (예를 들면, 신장, 요상피 세포), 전립선 및 인두를 감염시키는 것을 포함한다. 선암종은 악성종양 예컨대 대부분의 결장 암, 직장 암, 신장-세포 암종, 간 암, 폐의 비-소 세포 암종, 소장의 암 및 식도의 암을 포함한다. 일 구현예에서, 암은 흑색종, 예를 들면, 진전된 단계 흑색종이다. 상기 언급된 암의 전이성 병변은 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다.
치료될 수 있는 다른 암의 예는 하기를 포함한다: 골 암, 췌장 암, 피부 암, 두경부의 암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 항문 영역의 암, 위 암, 고환 암, 자궁 암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아기의 고체 종양, 림프구성 림프종, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계의 신생물 (CNS), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피모양 암, 편평상피 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 것을 포함하는 환경적으로 유도된 암, 및 상기 암의 조합. 전이성 암, 예를 들면, PD-L1을 발현시키는 전이성 암의 치료 (Iwai 등. (2005) Int. Immunol. 17:133-144)는 본 명세서에서 기재된 항체 분자를 사용하여 영향받을 수 있다. 추가로 발현 본 명세서에서 기재된 바와 같이 암 관련 항원과 관련된 질환은, 비제한적으로, 예를 들면, 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성종양, 전암성 병태 또는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 암 관련 항원의 발현과 관련된 증식성 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포는, 음성 대조군에 비해 세포를 발현시키는, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 암 관련된 항원과 관련된 또 다른 암 또는 혈액 암을 가진 대상체에서 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%만큼 세포 및/또는 암 세포의 수량, 수, 양 또는 백분율을 감소시킨다. 일 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일 구현예에서, 본 발명은 트롬보포이에틴 수용체 (MPL)에 특이적인 항원 특이적 CARs를 포함하는 백본 또는 종래의 CARs를 발현시키도록 조작되는 유전적으로 변형된 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 그것을 필요로 하는 대상체에 제공함으로써 혈액 암의 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 혈액 암은 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암은 다발성 골수종이다. 다발성 골수종은, 골수에서 혈장 세포 클론의 축적을 특징으로 하는, 혈액의 암이다. 다발성 골수종을 위한 현행 요법은, 비제한적으로, 탈리도마이드의 유사체인, 레날리도마이드로 치료를 포함한다. 레날리도마이드는 항-종양 활성, 혈관신생 억제, 및 면역조절을 포함하는 활성을 갖는다. 일반적으로, 골수종 세포는 유세포측정에 의해 발현 본 명세서에서 기재된 바와 같이 암 관련 항원에 대하여 음성인 것으로 생각된다. 따라서, 일부 구현예에서, BCMA CAR (서열번호: 951-957)은 골수종 세포를 표적하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명 요법의 CARs는 하나 이상의 추가의 요법, 예를 들면, 레날리도마이드 치료와 조합으로 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CAR-T가 항원에 반응하여 활성화되고 질환 유발 또는 질환 관련된 세포를 표적하도록 액세서리 모듈을 가진 CAR (즉, 백본 1-62) 또는 종래의 CAR을 발현시키는 본 발명의 유전적으로 변형된 세포와 질환 유발 또는 질환 관련된 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 질환 (예를 들면, 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 또는 알러지성 질환 또는 퇴행성 질환)의 성장 억제 방법에 관한 것이고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포의 성장은 억제된다. 일 측면에서, 본 발명은 CAR-T가 항원에 반응하여 활성화되고 질환 유발 또는 질환 관련된 세포를 표적하도록 본 발명의 CAR-발현 세포를 생성할 수 있는 세포 또는 CAR-발현 세포를 질환의 위험에 처한 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 예방 방법에 관한 것이고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련된 세포의 성장은 예방된다. 일 측면에서 질환은 암, 감염성 질환, 면역 질환, 알러지성 질환, 또는 퇴행성 질환이다.
본 발명의 구현예는 이펙터 세포를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 이펙터 세포 (예컨대 T 세포 및 NK 세포)가 유전적으로 변형되어 본 명세서에서 기재된 바와 같이 CAR을 발현시키고 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포가 그것을 필요로 하는 수령체에 주입되는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수령체에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 다양한 측면에서, 환자, 또는 그것의 자손에 투여된 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 환자에 T 세포 또는 NK 세포의 투여 후 적어도 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월, 14 개월, 15 개월, 16 개월, 17 개월, 18 개월, 19 개월, 20 개월, 21 개월, 22 개월, 23 개월, 2 년, 3 년, 4 년, 또는 5 년 동안 환자에서 지속한다.
본 발명은 또한 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)가, 예를 들면, 시험관내 전사된 RNA에 의해, 변형되어 액세서리 모듈을 가진 종래의 CAR (예를 들면, 백본 1-62) 또는 종래의 CAR을 일시적으로 발현시키는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. T 세포 또는 NK 세포는 그것을 필요로 하는 수령체에 주입된다. 주입된 세포는 수령체에서 질환 관련된 세포 (예를 들면, 종양 세포 또는 바이러스성으로 감염된 세포)를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면에서, CAR-발현 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는, 환자에 T 세포 또는 NK 세포의 투여 후 1 개월 미만, 예를 들면, 3 주, 2 주, 1 주 동안 지속한다.
본 발명은 또한 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 (예를 들면, 조혈모세포 또는 림프양 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포, 또는 유도된 만능 줄기 세포)가 액세서리 모듈을 가진 종래의 CAR (예를 들면, 백본 1-62) 또는 종래의 CAR을 발현시키도록 변형되고 그것을 필요로 하는 수령체에 투여되는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 투여된 줄기 세포는 수령체에 이식 후 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)를 유발시키고, 이는 (즉 면역 이펙터 세포는) 수령체에서 질환 관련된 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면에서, CAR-발현 줄기 세포의 투여 후 환자에서 생산되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 환자에 유전적으로 변형된 줄기 세포의 투여 후 적어도 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월, 14 개월, 15 개월, 16 개월, 17 개월, 18 개월, 19 개월, 20 개월, 21 개월, 22 개월, 23 개월, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 10 년 또는 20 년 동안 환자에서 지속한다. 본 발명은 또한 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)를 유발시킬 수 있는 줄기 세포가 변형되어 액세서리 모듈을 가진 종래의 CAR (예를 들면 백본 1-62) 또는 종래의 CAR을 발현시키고 시험관내 분화되어 그것을 필요로 하는 수령체에 주입되는 면역 이펙터 세포를 생성하는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 수령체에 주입 후 주입된 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)는 수령체에서 질환 관련된 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면에서, 환자에 투여되는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월, 14 개월, 15 개월, 16 개월, 17 개월, 18 개월, 19 개월, 20 개월, 21 개월, 22 개월, 23 개월, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 10 년 또는 20 년 동안 환자에서 지속한다.
본 발명은 또한 조절 면역 이펙터 세포 (예를 들면, TREG, 또는 CD25+ T 세포)가 변형되어 특이적 항원을 표적하는 액세서리 모듈을 가진 종래의 CAR (예를 들면, 백본 1-62) 또는 종래의 CAR을 발현시키는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 그와 같은 CAR-TREG는 특이적 항원에 대한 면역 반응을 억압하기 위해 환자에 투여된다. CAR-TREG는 자가면역 질환을 예방 및 치료하는데 그리고 면역 내성을 향상시키는데 사용될 수 있다.
CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)에 의해 유발된 항-종양 면역력 반응은 능동적 또는 수동적 면역 반응일 수 있거나, 대안적으로 직접적인 대 간접적인 면역 반응에 기인될 수 있다. 일 측면에서, CAR-형질도입된 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 질환 관련 항원을 발현시키는 인간 이환 세포 (예를 들면, 암 또는 감염된 세포)에 반응하여 특이적 전-염증 사이토카인 분비 및 강력한 세포용해 활성, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 레지스트 가용성 질환 관련 항원, 매개 방관자 사멸 및, 암을 포함하는, 확립된 인간 질환의 매개 퇴행을 나타낸다.
본 발명은 또한 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)를 유발시킬 수 있는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 및 NK 세포)가 액세서리 모듈을 가진 종래의 CAR (예를 들면, 백본 1-62) 또는 종래의 CAR을 발현시키도록 변형되고 생체외 사용되어 질환-관련된 세포 (예를 들면 암 세포)의 골수 또는 말초 혈액 조혈모세포를 퍼징하는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 예로서, CD19-특이적 CAR을 발현시키는 T 세포는 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 제조에서 존재하는 임의의 백혈병 또는 림프종 세포를 사멸 제거시키기 위해 급성 림프구성 백혈병 또는 비-호지킨 림프종을 가진 환자로부터 취득된 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 샘플로 공배양된다. 6 시간 내지 며칠의 범위일 수 있는, 시험관내 (생체외) 배양의 적합한 지속기간 후, 퍼징된 골수 및 말초 혈액 샘플은 환자에서 자가조직 이식에 사용된다.
조혈 모세포 및 선조 세포의 생체외 팽창은 미국 특허 번호 5,199,942에 기재되어 있고, 본 명세서에서 참고로 편입되고, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 비제한적으로 세포의 생체외 팽창의 임의의 특정 방법이고 당해 분야에서 공지된 다른 적합한 방법은 이용될 수 있다. 간단히, 조혈모세포의 생체외 배양 및 팽창은 하기를 포함한다: (1) 말초 혈액 수확물 또는 골수 외식편에서 포유동물로부터 CD34+ 조혈 모세포 및 선조 세포의 수집; 및 (2) 생체외 상기 세포의 팽창. 미국 특허 번호 5,199,942에서 기재된 세포 성장 인자에 더하여, 다른 인자 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-키트 리간드는 세포의 배양 및 팽창에 사용될 수 있다.
생체외 면역화에 관하여 세포-기반 백신의 사용에 더하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 관하여 면역 반응을 유도하기 위한 생체내 면역화용 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 완전하게-인간 CAR-변형된 유전적으로 변형된 세포 (예컨대 T 세포, NK 세포)는 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법용 백신의 한 유형일 수 있다. 생체외 면역화에 관하여, 적어도 하나의 하기는 포유동물 속에 세포의 투여에 앞서 시험관내 발생한다: i) 세포의 팽창, ii) 세포에 CAR을 인코딩하는 핵산의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존. 생체외 절차는, 예를 들어, 본 명세서에서 참고로 편입된, 미국 특허 번호 5,199,942에서 기재된 바와 같이, 당해 분야에서 널리 공지된다.
생체외 면역화에 관하여 세포-기반 백신의 사용에 더하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 관하여 면역 반응을 유도하기 위한 생체내 면역화용 조성물 및 방법을 제공한다.
환자에 투여된 경우 CAR-T 세포 및 이중특이적 T 세포 연관체 (BiTE) (예컨대 블린사이토 또는 블리나투모맙)의 활성 제어 방법이 본 명세서에서 추가로 기재된다. 일부 구현예에서 이들 방법은 CAR-T 세포 및 BiTE의 부작용, 예컨대 사이토카인 방출 증후군, 모세관 누출 증후군 및 신경적 합병증을 제어하는데 사용될 수 있다. 조작된 CAR T 세포 및 블리나투모맙에 반응하는 다수의 환자에서, 전염증 사이토카인의 과도한 방출은 발열, 저혈압, 저산소혈증, 심장 기능이상, 신부전 및 전해질 비정상, 집합적으로 일명 "사이토카인 방출 증후군' (CRS)로서 포함하는 증상을 유발시킨다. 수많은 이들 환자는 압력 지원 및 인공 환기를 위하여 집중 치료실에 입원을 요구한다. 상당한 수의 사례에서, CAR T 세포 및 블리나투모맙 요법은 떨림, 발작을 포함하는 신경 증상으로 이어질 수 있고 치명적일 수 있다. 스테로이드 및 IL6 수용체 항체를 포함하는, 수많은 치료 접근법이 이들 장애의 치료를 위하여 사용되어도, 수많은 환자는 상기 요법에 난치성이다. 본 발명은, 비제한적으로 CAR-T 세포 및 이중특이적 T 세포 연관체 (BiTE)를 포함하는, 입양 세포 요법의, 합병증, 예컨대 사이토카인 방출 증후군 및 신경적 합병증의 신규한 치료 및 예방 방법을 제공한다. 일부 구현예에서 상기 방법은 티로신 키나제, 특히 Scr 계열 키나제, 및 특히 Lck 키나제의 억제제의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은, p56Lck (Lck)를 포함하는, Abl 및 Src 계열 티로신 키나제 (SFK)의 경구 소 분자 억제제인, 다사티닙의 투여를 포함한다 (Lee KC 등, Leukemia (2010) 24, 896-900). 다사티닙은 항원-특이적 이펙터 T 세포 기능을 차단하는 것으로 이전에 나타났다 (Weichsel R 등, Clin Cancer Res 2008;14(8), 2484). 그러나, CAR-T 세포 및 이중특이적 T 세포 연관체의 기능을 차단하는 능력에 대하여 전혀 시험되어 오지 않았다. CAR-발현 T 세포는 신경적 합병증을 앓고 있는 환자의 뇌척수액 (CSF)에서 검출되어 왔다 (Hu, Y 등, Journal of Hematology & Oncology20169:70). CAR-T 세포 및 BiTE에 의해 야기된 사이토카인 방출 증후군 및 신경적 합병증의 치료 및 예방에 대하여 다사티닙의 특히 중요한 장점은 임상적으로 허용가능한 용량으로 투여된 경우 뇌에서 효과적인 농도를 달성하는 그리고 혈액-뇌 장벽을 교차하는 이의 능력이다 (Porkka K 등, Blood. 2008 Aug 15;112(4):1005-12). 따라서, 다사티닙은, 혈액 뇌 장벽을 교차하였던 CAR-T 세포의, 사이토카인 방출을 포함하는, 이펙터 기능을 차단하는 것으로 기대된다.
일 구현예에서, Src 키나제 억제제는 CAR-발현 세포의 활성을 제어 또는 종결시키기 위해 CAR-발현 세포의 투여 후 환자에 투여된다. 일 구현예에서, Lck 억제제는 CAR-발현 세포의 활성을 제어 또는 종료시키기 위해 CAR-발현 세포의 투여 후 환자에 투여된다. 일 구현예에서, Lck 억제제는 A-770041이다.
일 구현예에서, 다사티닙은 CAR-발현 세포의 활성을 제어 또는 종결시키기 위해 CAR-발현 세포의 투여 후 환자에 투여된다. 일 구현예에서, 다사티닙은 적어도 10 mg/일, 20 mg/일, 40mg/일, 60mg/일, 70mg/일, 90 mg/일, 100mg/일, 140mg/일, 180mg/일, 210mg/일, 250mg/일 또는 280mg/일의 용량으로 경구로 투여된다.
일 구현예에서, 포나티닙은 CAR-발현 세포의 활성을 제어 또는 또는 종결시키기 위해 CAR-발현 세포의 투여 후 환자에 투여된다. 일 구현예에서, 포나티닙은 적어도 15 mg/일, 30 mg/일, 45mg/일, 60mg/일의 용량으로 경구로 투여된다.
T 림프구는 이들이 말단으로 분화된 상태에 도달하는 때까지 제한된 복제 수명을 갖고 그 다음 나이가 들어감에 따라 말단소체의 진행성 손실로 인해 복제 노화에 진입한다. 인간 T 림프구는 시험관내 배양된 경우 약 30-50 모집단 배증의 제한된 수명을 표시한다.
입양 세포 요법의 목적을 위하여 면역 세포 (예를 들면, 림프구 및 NK 세포)의 수명을 연장시키기 위해 그것의 복제 노화의 예방 방법 그리고 말초 혈액 단핵 세포 및 T 세포의 생존 및 증식의 촉진 방법이 본 명세서에서 추가로 고려된다. 상기 방법은 생존 및 증식을 촉진시키는 그리고 활성화 유도된 세포사를 차단시키는 바이러스 및 세포 단백질의 이소성 발현을 수반한다. 이러한 목적에 적합한 예시적 바이러스성 단백질은 (또한 인간 헤르페스바이러스 8로서 공지된) 카포시 육종 관련된 헤르페스바이러스에 의해 인코딩된 바이러스 FLICE 억제 단백질 (vFLIP) K13, 전염성 연속종 바이러스 (MCV)로부터 MC159-vFLIP 및 MC160 vFLIP, 말 헤르페스바이러스 2 (EHV2)로부터 E8-vFLIP, 소 헤르페스바이러스 4 인코딩된 vFLIP (BHV-vFLIP), 헤르페스바이러스 메카카에 의해 인코딩된 vFLIP, 헤르페스바이러스 사이미리에 의해 인코딩된 vFLIP 및 HTLV1-인코딩된 Tax, HTLV2-인코딩된 Tax 및 HTLV2-인코딩된 Tax-RS 돌연변이체를 포함한다. 이러한 목적에 적합한 예시적 세포 단백질은 cFLIP-L 동형체 또는 MRIT-α, cFLIP-p22 결실 돌연변이체 또는 MRIT-p22를 포함한다 (Bertin 등, Proc Natl Acad Sci U S A 94:1172-6, 1997; Hu 등, J Biol Chem 272:9621-4, 1997; Thome 등, Nature 386:517-21, 1997). 일부 구현예에서, 상기 바이러스 및 세포 단백질은 그것의 원상태 또는 운반하는 작은 에피토프 태그내 면역 세포 (예를 들면, T 세포 및 NK 세포)에서 발현되고 구성적 방식에서 기능적 활성이다. 다른 구현예에서, 상기 바이러스 및 세포 단백질은 스위치 도메인 (또는 이량체화 도메인), 예컨대 FKBP (서열번호: 2620 및 2621) 및 FKBPx2 (서열번호: 2622)의 하나 이상의 카피와 융합으로 면역 세포 (예를 들면, T 세포 및 NK 세포)에서 발현된다. 다른 구현예에서, FKBP 또는 FKBP-x2 도메인은 세포 막에 융합 단백질을 고정시키기 위해 N-말단 미리소틸화 (Myr) 서열을 추가로 운반할 수 있다. Myr 서열을 운반하는 예시적 FKBPx2-K13 융합 단백질의 서열은 서열번호: 2623에서 제시된다. 스위치 도메인을 운반하는 융합 단백질은 그것의 기초 상태에서 기능적으로 불활성이지만 이량체화제 제제, 예컨대 AP20187의 첨가시 활성화된다.
한 구현예에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들면, T 세포는 K13-vFLIP (서열번호: 2629), MC159-vFLIP (서열번호: 2630), MC160-vFLIP (서열번호: 2631), E8-vFLIP (서열번호: 2632), BHV-vFLIP (서열번호: 2635), 메카카 vFLIP (서열번호: 2634), 헤르페스바이러스 사이미리 vFLIP (서열번호: 2633), cFLIP-L/MRITα (서열번호: 2636), cFLIP-p22 (서열번호: 2637), HTLV1-Tax (서열번호: 2638), HTLV2-Tax (서열번호: 2639), HTLV2-Tax-RS 돌연변이체 (서열번호: 2640) 또는 상기 단백질 (서열번호: 2629 내지 2640)의 아미노산 서열에 70-99% 동일성을 가진 단백질의 그룹으로부터 선택된 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 이소적으로 발현시킨다.
한 구현예에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들면, T 세포는, 하나 이상의 스위치 도메인, 예를 들면, FKBP (서열번호: 2620-2621), FKBPx2 (서열번호: 2622) 또는 Myr-FKBP를 함유하는 융합 단백질, 그리고 K13-vFLIP (서열번호: 2629), MC159-vFLIP (서열번호: 2630), MC160-vFLIP (서열번호: 2631), E8-vFLIP (서열번호: 2632), BHV-vFLIP (서열번호: 2635), 메카카 vFLIP (서열번호: 2634), 헤르페스바이러스 사이미리 vFLIP (서열번호: 2633), cFLIP-L/MRITα (서열번호: 2636), cFLIP-p22 (서열번호: 2637), HTLV1-Tax (서열번호: 2638), HTLV2-Tax (서열번호: 2639), HTLV2-Tax-RS 돌연변이체 (서열번호: 2640) 또는 서열번호: 2629 내지 2640의 아미노산 서열에 70-99% 동일성을 가진 단백질의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 이소적으로 발현시킨다. 하나 이상의 스위치 도메인 및 바이러스성 신호전달 단백질을 함유하는 예시적 융합 단백질은 서열번호: 2641-2645에 의해 표시된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, K13-vFLIP (서열번호: 2629), MC159-vFLIP (서열번호: 2630), MC160-vFLIP (서열번호: 2631), E8-vFLIP (서열번호: 2632), BHV-vFLIP (서열번호: 2635), 메카카 vFLIP (서열번호: 2634), 헤르페스바이러스 사이미리 vFLIP (서열번호: 2633), cFLIP-L/MRITα (서열번호: 2636), cFLIP-p22 (서열번호: 2637), HTLV1-Tax (서열번호: 2638), HTLV2-Tax (서열번호: 2639), HTLV2-Tax-RS 돌연변이체 (서열번호: 2640) 또는 서열번호: 2629 내지 2640의 아미노산 서열에 70-99% 동일성을 가진 단백질의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 입양 세포 요법에 적합한 면역 이펙터 세포의 생산 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 하나 이상의 스위치 도메인, 예를 들면, FKBP (서열번호: 2620-2621), FKBPx2 (서열번호: 2622) 또는 Myr-FKBP를 함유하는 융합 단백질, 그리고 K13-vFLIP (서열번호: 2629), MC159-vFLIP (서열번호: 2630), MC160-vFLIP (서열번호: 2631), E8-vFLIP (서열번호: 2632), BHV-vFLIP (서열번호: 2635), 메카카 vFLIP (서열번호: 2634), 헤르페스바이러스 사이미리 vFLIP (서열번호: 2633), cFLIP-L/MRITα (서열번호: 2636), cFLIP-p22 (서열번호: 2637), HTLV1-Tax (서열번호: 2638), HTLV2-Tax (서열번호: 2639), HTLV2-Tax-RS 돌연변이체 (서열번호: 2640) 또는 서열번호: 2629 내지 2640의 아미노산 서열에 70-99% 동일성을 가진 단백질의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 발현시키는 인코딩하는 핵산과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 입양 세포 요법에 적합한 면역 이펙터 세포의 생산 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 입양 세포 요법에 적합한 세포는 천연 또는 합성 면역 수용체를 발현시킨다. 예시적 상기 면역 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR), 키메라 T 세포 수용체 (cTCR), 합성 T 세포 수용체 및 합성 노치 수용체를 포함한다. 한 구현예에서, 세포는 천연 또는 합성 면역 수용체를 인코딩하는 작제물과 접촉되기 전, 이와 동시, 또는 후 바이러스 및 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산과 접촉될 수 있다. 한 구현예에서, 세포는 천연 또는 합성 면역 수용체를 인코딩하는 작제물과 접촉되기 전, 이와 동시, 또는 후 스위치 또는 이량체화 도메인을 함유하는 바이러스 및 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산과 접촉될 수 있다.
일 측면에서, 본 개시내용은 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 모집단의 제조 방법을 특징으로 삼는다. 한 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다: 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)의 모집단 제공, 면역 수용체 및 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질 공-발현을 허용하는 조건 하에, 면역 수용체 (예를 들면, CAR, TCR, 합성 TCR)을 인코딩하는 핵산과 면역 이펙터 세포의 모집단 접촉 그리고 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산과 면역 이펙터 세포의 모집단 접촉.
한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산은 DNA이다. 한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산은 바이러스 및 세포 신호전달 단백질의 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터를 함유한다. 한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 그리고 면역 수용체를 인코딩하는 핵산은 동일한 벡터로부터 발현된다. 한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산 그리고 면역 수용체를 인코딩하는 핵산은 별개의 벡터로부터 발현된다. 한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질 (서브유닛 1)을 인코딩하는 핵산 그리고 면역 수용체 (서브유닛 2)를 인코딩하는 핵산은 제2 서브유닛의 번역을 허용하는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)를 허용하는 동일한 폴리뉴클레오타이드 단편으로부터 발현된다. 한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질 (서브유닛 1)을 인코딩하는 핵산 그리고 면역 수용체 (서브유닛 2)를 인코딩하는 핵산은 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드 단편으로부터 발현되고 상이한 서브유닛은 절단가능 링커 (예를 들면, 서열번호: 831-836)에 의해 분리된다.
한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산은 시험관내 전사된 RNA이다. 한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질 (서브유닛 1) 그리고 면역 수용체 (서브유닛 2)는 제2 서브유닛의 번역을 허용하는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)를 함유하는 동일한 RNA로부터 발현된다. 한 구현예에서, 서열번호: 2629-2645의 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질 (서브유닛 1) 그리고 면역 수용체 (서브유닛 2)는 단일 RNA로부터 발현되고 상이한 서브유닛은 절단가능 링커 (예를 들면, 서열번호: 831-836)에 의해 분리된다.
조합 요법
본 명세서에서 기재된 치료 방법은 본 명세서에서 기재된 CARs를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물을 사용하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 치료 방법은 현존하는 요법 및 제제와 조합될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 CARs를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함하는, 본 명세서에서 기재된 치료 조성물은 적어도 하나의 추가의 공지된 요법 또는 치료제와 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 조성물 그리고 추가의 요법 또는 치료제는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 조성물 그리고 추가의 요법 또는 치료제는 동시에 투여된다. 본 명세서에서 기재된 조성물 및 현존하는 요법의 최적의 투여 차례는 종래 기술의 숙련가, 예컨대 의사에 분명할 것이다.
본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 또는 별개의 조성물에서, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위하여, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 첫번째로 투여될 수 있고, 추가의 제제가 두번째로 투여될 수 있거나, 투여의 차례는 역전될 수 있다.
조합 요법은 질환의 지속기간 동안 대상체에 투여될 수 있다. 질환의 지속기간은 진단부터 치료의 종료까지 포함하고, 여기서 상기 치료는 증상의 감소 및/또는 증상의 제거를 초래한다. 다양한 구현예에서, 2 치료의 효과는 부분적으로 부가적, 전체적으로 부가적, 또는 부가적 초과일 수 있다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달되는 때 여전히 검출가능한 정도일 수 있다.
CAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 활성 장애의 기간 동안, 또는 차도 또는 더 적은 활성 질환의 기간 동안 투여될 수 있다. CAR 요법은 다른 치료 전, 치료와 동시에, 치료후, 또는 장애의 차도 동안 투여될 수 있다.
조합으로 투여된 경우, CAR 요법 및 추가의 제제 (예를 들면, 제2 또는 제3 제제), 또는 모두는 개별적으로, 예를 들면, 단일요법으로서 사용된 각각의 제제의 양 또는 투약량보다 더 많은, 더 적은 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR 요법, 추가의 제제 (예를 들면, 제2 또는 제3 제제), 또는 모두의 투여된 양 또는 투약량은 개별적으로, 예를 들면, 단일요법으로서 사용된 각각의 제제의 양 또는 투약량보다 더 적다 (예를 들면, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 구현예에서, 원하는 효과 (예를 들면, 암의 치료)를 초래하는 CAR 요법, 추가의 제제 (예를 들면, 제2 또는 제3 제제), 또는 모두의 양 또는 투약량은, 동일한 치료 효과를 달성하도록 요구된, 개별적으로, 예를 들면, 단일요법으로서 사용된 각각의 제제의 양 또는 투약량보다 적다 (예를 들면, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 적다).
추가 방법 측면은, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성을 증가시키는 제제와 조합하여 선택적으로, 각각의 세포가 CAR 분자를 포함하는, 세포, 예를 들면, 면역 이펙터 세포, 또는 이의 모집단의 유효량을 대상체에 투여하는 것에 관한 것이다. 추가 측면에서, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성을 증가시키는 제제는 하나 이상의 하기이다: (i) 단백질 포스파타제 억제제; (ii) 키나제 억제제; (iii) 사이토카인; (iv) 면역 억제 분자의 억제제; 또는 (v) TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제; vi) CAR-변형된 세포의 증식 및/또는 지속성을 증가시키는 제제 vii) 케모카인 viii) CAR의 발현을 증가시키는 제제 ix) CAR의 발현 또는 활성의 조절을 허용하는 제제 x) CAR-변형된 세포의 생존 및/또는 지속성에 대한 제어를 허용하는 제제 xi) CAR-변형된 세포의 부작용을 제어하는 제제 xii) Brd4 억제제 xiii) 질환의 부위에 치료제 (예를 들면 sHVEM) 또는 예방제를 전달하는 제제 xiv) CAR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제; xv) 아데노신 A2a 수용체 길항제
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 유전적으로 변형된 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 조사, 펩타이드 백신, 예컨대 Izumoto 등. 2008 J Neurosurg 108:963-971에서 기재된 것과 조합으로 치료 레지멘에서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 화학치료제와 조합으로 사용될 수 있다. 예시적 화학치료제는 하기를 포함한다: 안트라사이클린 (예를 들면, 독소루비신 (예를 들면, 리포좀 독소루비신)), 빈카 알카로이드 (예를 들면, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제 (예를 들면, 사이클로포스파마이드, 데카바진, 멜팔란, 이포스파마이드, 테모졸로마이드), 면역 세포 항체 (예를 들면, 알렘투자맙, 젬투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙), 항대사물질 (예를 들면, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제 (예를 들면, 플루다라빈) 포함), mTOR 억제제, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련된 단백질 (GITR) 효능제, 프로테아솜 억제제 (예를 들면, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉), 면역조절물질 예컨대 탈리도마이드 또는 탈리도마이드 유도체 (예를 들면, 레날리도마이드).
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 사이클로포스파마이드 및 플루다라빈과 조합으로 대상체에 투여된다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 벤다무스틴 및 리툭시맙과 조합으로 대상체에 투여된다. 구현예에서, 대상체는 CLL을 갖는다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및/또는 코르티코스테로이드 (예를 들면, 프레드니손)과 조합으로 대상체에 투여된다. 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손 (R-CHOP)와 조합으로 대상체에 투여된다. 구현예에서, 대상체는 미만성 큰 B-세포림프종 (DLBCL)을 갖는다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 및/또는 리툭시맙과 조합으로 대상체에 투여된다. 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 및 리툭시맙 (EPOCH-R)과 조합으로 대상체에 투여된다. 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 용량 조정된 EPOCH-R (DA-EPOCH-R)과 조합으로 대상체에 투여된다. 구현예에서, 대상체는 B 세포 림프종, 예를 들면, Myc-재배열된 공격성 B 세포 림프종을 갖는다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙과 조합으로 대상체에 투여된다. 브렌툭시맙은 항-CD30 항체 및 모노메틸 아우리스타틴 E의 항체-약물 콘주게이트이다. 구현예에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL), 예를 들면, 재발한 또는 난치성 HL을 갖는다. 구현예에서, 대상체는 CD30+ HL을 포함한다. 구현예에서, 대상체는 자가조직 줄기 세포 이식 (ASCT)를 경험하였다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 CD20 억제제, 예를 들면, 항-CD20 항체 (예를 들면, 항-CD20 모노- 또는 이중특이적 항체) 또는 이의 단편과 조합으로 대상체에 투여된다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR 발현 세포는 mTOR 억제제, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 mTOR 억제제, 예를 들면, 라팔로그 예컨대 에버롤리무스와 조합으로 대상체에 투여된다. 일 구현예에서, mTOR 억제제는 CAR-발현 세포에 앞서 투여된다. 예를 들어, 일 구현예에서, mTOR 억제제는 세포의 분리반출법에 앞서 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 대상체는 CLL을 갖는다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 키나제 억제제와 조합으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 CDK4 억제제, 예를 들면, CD4/6 억제제, 예컨대, 예를 들면, 6-아세틸-8-사이클로펜틸-5-메틸-2-(5-피페라진-1-일-피리딘-2-일아미노 )-8H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온, 하이드로클로라이드 (또한 팔보시클립 또는 PD0332991로 칭함)이다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 BTK 억제제, 예컨대, 예를 들면, 이브루티닙이다. 일부 구현예에서, 이브루티닙은, 예를 들면, 경구로 약 300-600 mg/일 (예를 들면, 약 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/일, 예를 들면, 약 420 mg/일 또는 약 560 mg/일)의 투약량으로 투여된다. 구현예에서, 이브루티닙은 일정한 기간 동안 매일, 예를 들면, 21일 사이클 동안 매일, 또는 28 일 사이클 동안 매일 약 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (예를 들면, 250 mg, 420 mg 또는 560 mg)의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 이브루티닙의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 초과 사이클이 투여된다. 이론에 의한 구속됨 없이, 이브루티닙의 첨가가 T 세포 증식성 반응을 향상시키고 T-헬퍼-2 (Th2)부터 T-헬퍼-1 (Th1) 표현형까지 T 세포를 이동시킬 수 있다고 생각된다. Th1 및 Th2는, 상이한 면역 반응 경로를 유도하는 Th1 대 Th2로, 헬퍼 T 세포의 표현형이다. Th1 표현형은, 예를 들면, 세포, 예컨대 세포내 병원체/바이러스 또는 암성 세포 사멸을 위하여, 또는 자가면역 반응 영속화를 위하여 전염증 반응과 관련된다. Th2 표현형은 호산구 축적 및 항-염증 반응과 관련된다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 mTOR 억제제, 예컨대, 예를 들면, 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI- 027이다. mTOR 억제제는, 예를 들면, mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제일 수 있다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 MNK 억제제, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 MNK 억제제, 예컨대, 예를 들면, 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로 [3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제제는, 예를 들면, MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b 억제제일 수 있다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 본 명세서에서 기재된 이중 PI3K/mTOR 억제제, 예컨대, 예를 들면, PF-04695102이다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 Src 키나제 억제제이다. 일 구현예에서, 키나제 억제제는 다사티닙이다. 일 구현예에서, Src 키나제 억제제는 CAR-발현 세포의 활성을 제어 또는 종료시키기 위해 CAR 발현 세포의 투여 후 환자에 투여된다. 일 구현예에서, 다사티닙은 CAR-발현 세포의 활성을 제어 또는 종료시키기 위해 CAR 발현 세포의 투여 후 환자에 투여된다. 일 구현예에서, 다사티닙은 적어도 10 mg/일, 20 mg/일, 40mg/일, 60mg/일, 70 mg/일, 90 mg/일, 100mg/일, 140 mg/일, 180 mg/일 또는 210 mg/일의 용량으로 경구로 투여된다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제와 조합으로 대상체에 투여된다. 예시적 ALK 키나제는 비제한적으로 크리조티닙 (Pfizer), 세리티닙 (Novartis), 알렉티닙 (Chugai), 브리가티닙 (또한 일명 AP26113; Ariad), 엔트렉티닙 (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 (Tesaro) (참고, 예를 들면, 임상시험 식별자 번호 NCT02048488), CEP-37440 (Teva), 및 X-396 (Xcovery)를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 고체 암, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 고체 암, 예를 들면, 폐 암을 갖는다.
어느 한쪽 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제시키는 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)을 억제시키는 약물 (Liu 등, Cell66:807-815, 1991; Henderson 등, Immun. 73:316-321, 1991; Bierer 등, Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)은 또한 사용될 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 화학요법 제제 예컨대, 플루다라빈을 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 사이클로포스파마이드, 및/또는 항체 예컨대 OKT3 또는 CAMP ATH와 함께 (예를 들면, 이전, 동시에 또는 이후) 환자에 투여될 수 있다. 일 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 절제 요법 예컨대 CD20, 예를 들면, 리툭산과 반응하는 제제 이후 투여된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 대상체는 고용량 화학요법으로 표준 치료 이어서 말초 혈액 줄기 세포 이식을 경험할 수 있다. 특정 구현예에서, 이식 이후, 대상체는 본 발명의 팽창된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 구현예에서, 팽창된 세포는 수술 이전 또는 이후 투여된다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 자가조직 줄기 세포 이식, 동종이계 줄기 세포 이식, 자가조직 골수 이식 또는 동종이계 골수 이식과 조합으로 대상체에 투여된다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 미세이식 또는 HLA 불인치된 동종이계 세포 요법과 조합으로 대상체에 투여된다 (Guo M 등, J Clin Oncol. 2012 Nov 20;30(33):4084-90).
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제와 조합으로 대상체에 투여된다.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 골수성-유래된 억제제 세포 (MDSCs)의 모듈레이터와 조합으로 대상체에 투여된다. MDSCs는 많은 고체 종양의 주변에서 그리고 종양 부위에서 축적한다. 이들 세포는 T 세포 반응을 억제시키고, 그렇게 함으로써 CAR-발현 세포 요법의 효능을 방해한다. 이론에 의한 구속됨 없이, MDSC 모듈레이터의 투여가 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 향상시킨다고 생각된다. 한 구현예에서, 대상체는 고체 종양, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 고체 종양, 예를 들면, 교모세포종을 갖는다. MDSCs의 예시적 모듈레이터는 비제한적으로 MCSllO 및 BLZ945를 포함한다. MCSllO은 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF)에 대한 단클론성 항체 (mAb)이다. 참고, 예를 들면, 임상시험 식별자 번호 NCT00757757. BLZ945는 집락 자극 인자 1 수용체 (CSF1R)의 소 분자 억제제이다. 참고, 예를 들면, Pyonteck 등. Nat. Med. 19(2013):1264-72.
구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 Brd4 또는 BET (브로모도메인 및 추가의-말단 모티프) 억제제와 조합으로 대상체에 투여된다. BET 단백질 BRD4는, 이펙터 메모리 표현형 속에 T 세포의 분화와 관련되었던, CD8+ T 세포내 전사 인자 BATF의 발현을 직접적으로 조절하였다. 브로모도메인 및 추가의-말단 모티프 (BET) 단백질의 억제제인, JQ1은 줄기 세포-유사 및 중심 메모리 T 세포의 기능성 특성을 가진 CD8+ T 세포를 유지시켰다. CAR-발현 세포와 조합으로 투여될 수 있는 예시적 Brd4 억제제는 비제한적으로 US 20140256706 A1에서 기재된 바와 같이 JQ1, MS417, OTXO15, LY 303511 및 Brd4 억제제 그리고 이의 임의의 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포는 인터류킨-15 (IL-15) 폴리펩타이드, 인터류킨-15 수용체 알파 (IL-15Ra) 폴리펩타이드, 또는 양쪽 IL-15 폴리펩타이드 및 IL-15Ra 폴리펩타이드의 조합 예를 들면, hetiL-15 (Admune Therapeutics, LLC)와 조합으로 대상체에 투여된다. hetiL- 15는 IL-15 및 IL-15Ra의 헤테로이량체성 비-공유 복합체이다. hetiL-15는, 본 명세서에서 참고로 편입된, 예를 들면, U.S. 8,124,084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, 및 U.S. 201110081311에서 기재된다. 구현예에서, het-IL-15는 피하로 투여된다. 구현예에서, 대상체는 암, 예를 들면, 고체 암, 예를 들면, 흑색종 또는 결장 암을 갖는다. 구현예에서, 대상체는 전이성 암을 갖는다.
일 구현예에서, 대상체는 CAR-발현 세포의 투여와 관련된 부작용을 감소 또는 완화시키는 제제가 투여될 수 있다. CAR-발현 세포의 투여와 관련된 부작용은 비제한적으로 CRS, 및 혈구포식세포 림프조직구증 (HLH), 또한 일명 대식세포 활성화 증후군 (MAS)를 포함한다. CRS의 증상은 고열, 메스꺼움, 일시적 저혈압, 저산소증, 및 기타 동종을 포함한다. CRS는 임상 구성적 징후 및 증상 예컨대 열, 피로, 식욕부진, 근육통, 관절통, 메스꺼움, 구토, 및 두통을 포함할 수 있다. CRS는 임상 피부 징후 및 증상 예컨대 발진을 포함할 수 있다. CRS는 임상 위장 징후 및 증상 예컨대 메스꺼움, 구토 및 설사를 포함할 수 있다. CRS는 임상 호흡 징후 및 증상 예컨대 빠른호흡 및 저산소혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상 심혈관 징후 및 증상 예컨대 빈맥, 넓어진 펄스 압력, 저혈압, 증가된 심장 출력 (초기) 및 잠재적으로 줄어든 심장 출력 (후기)를 포함할 수 있다. CRS는 출혈과 함께 또는 출혈 없이 임상 응고 징후 및 증상 예컨대 상승된 d-이량체, 저섬유소원혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상 신장 징후 및 증상 예컨대 질소혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상 간 징후 및 증상 예컨대 고트란스아미나제혈증 및 과빌리루빈혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상 신경 징후 및 증상 예컨대 두통, 정신 상태 변화, 혼란, 섬망, 환어 곤란 또는 명백한 실어증, 환각, 떨림, 측정장애, 변경된 보행, 및 발작을 포함할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 기재된 방법은 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포를 대상체에 투여하는 것 그리고 CAR-발현 세포으로 치료에서 비롯하는 가용성 인자의 상승된 수준을 관리하기 위해 하나 이상의 제제를 추가로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에서 상승된 가용성 인자는 IFN-y, TNFa, IL-2 및 IL-6의 하나 이상이다. 한 구현예에서, 대상체에서 상승된 인자는 IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 및 프라크탈킨의 하나 이상이다. 따라서, 이 부작용을 치료하기 위해 투여된 제제는 이들 가용성 인자의 하나 이상을 중화시키는 제제일 수 있다. 일 구현예에서, 이들 가용성 형태의 하나 이상을 중화시키는 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 그와 같은 제제의 예는, 비제한적으로 스테로이드 (예를 들면, 코르티코스테로이드), Src 억제제 (예를 들면, 다사티닙) TNFa의 억제제, 및 IL-6의 억제제를 포함한다. TNFa 억제제의 예는 항-TNFa 항체 분자 예컨대, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 및 골리무맙이다. TNFa 억제제의 또 다른 예는 융합 단백질 예컨대 엔타네르셉트이다. IL-6 억제제의 예는 항-IL-6 항체 분자 또는 항-IL-6 수용체 항체 분자 예컨대 토실리주맙 (toe), 사릴루맙, 엘실리모맙, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, 및 FM101이다. 일 구현예에서, 항-IL-6 수용체 항체 분자는 토실리주맙이다. 일 구현예에서, IL-6 억제제는 IL6R 및 인간 혈청 알부민 (예를 들면, IL6R-304-Alb8) (서열번호: 2649)에 결합하는 낙타과 이중특이적 항체이다. IL-1R 기반된 억제제의 예는 아나킨라이다. 일 구현예에서, CAR-발현 세포의 부작용을 치료하기 위해 투여된 제제는 Src 억제제 (예를 들면, 다사티닙)이다. 일 구현예에서, CAR-발현 세포의 부작용을 치료하기 위해 투여된 제제는 Src 억제제 다사티닙이다. 구현예에서, 다사티닙은 약 10 mg/일 내지 240 mg/일 (예를 들면, 10mg/일, 20mg/일, 40mg/일, 50mg/일, 70 mg/일, 80mg/일, 100mg/일, 110mg/일, 120mg/일, 140mg/일, 180mg/일, 210 mg/일, 240mg/일 또는 300mg/일)의 용량으로 투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 CAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제가 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제제는 억제 분자를 억제시키는 제제일 수 있다. 억제 분자, 예를 들면, 프로그래밍된 사망 1 (PD-1)은, 일부 구현예에서, 면역 이펙터 반응을 탑재하기 위해 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD-1, PDL1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (예를 들면, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들면, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 억제에 의한, 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화시킬 수 있다. 구현예에서, 억제 핵산, 예를 들면, 억제 핵산, 예를 들면, dsRNA, 예를 들면, siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적으로 공간사이의 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR), 전사-활성제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)은, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, CAR-발현 세포에서 억제 분자의 발현을 억제시키는데 사용될 수 있다. 한 구현예에서 억제제는 shRNA이다. 한 구현예에서, 억제 분자는 CAR-발현 세포 내에 억제된다. 이들 구현예에서, 억제 분자의 발현을 억제시키는 dsRNA 분자는 CAR의 요소, 예를 들면, 모든 요소를 인코딩하는 핵산에 연결된다. 일 구현예에서, 억제 신호의 억제제는, 예를 들면, 억제 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 제제는 PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4 (예를 들면, 이필리무맙 (또한 MDX-010 및 MDX-101로 칭해지고, Yervoy®; 브리스톨-메이어 스큅; 트레멜리무맙 (Pfizer로부터 이용가능한, 틸실리무맙, CP-675,206으로서 예전에 공지된 IgG2 단클론성 항체)로서 시판됨.)에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 한 구현예에서, 제제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 한 구현예에서, 제제는 CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5)에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 한 구현예에서, 제제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 수용체의 CD28 계열의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수성 세포에서 발현된다. PD-1, PD-L1 및 PD-L2에 대한 2 리간드는 PD-1에 결합시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다. PD-L1은 인간 암에서 풍부하다. 면역 억제는 PD-L1과 PD-1의 국부 상호작용 억제에 의해 역전될 수 있다. PD-1, PD-L1 및 PD-L2의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제제는 당해 분야에서 이용가능하고 본 명세서에서 기재된 본 발명의 CAR과 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, (또한 BMS-936558 또는 MDX1106; 브리스톨-메이어 스큅으로 칭하는) 니볼루맙은 PD-1을 구체적으로 차단시키는 완전하게 인간 IgG4 단클론성 항체이다. PD-1에 특이적으로 결합하는 니볼루맙 (클론 5C4) 및 다른 인간 단클론성 항체는 US 8,008,449 및 W02006/121168에서 개시된다. 피딜리주맙 (CT-011; Cure Tech)는 PD-1에 결합하는 인간화된 IgG1k 단클론성 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화된 항-PD-1 단클론성 항체는 W02009/101611에서 개시된다. (예전에 람브롤리주맙으로서 공지되고, 또한 MK03475; Merck로 칭하는) 펨브롤리주맙은 PD-1에 결합하는 인간화된 IgG4 단클론성 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화된 항-PD-1 항체는 US 8,354,509 및 W02009/114335에서 개시된다. MEDI4736 (Medimmune)은 PDL1에 결합하는, 그리고 PD1과 리간드의 상호작용을 억제시키는 인간 단클론성 항체이다. MDPL3280A (Genentech I Roche)는 PD-L1에 결합하는 인간 Fe 최적화된 IgG1 단클론성 항체이다. PD-L1에 대한 MDPL3280A 및 다른 인간 단클론성 항체는 미국 특허 번호: 7,943,743 및 미국 공개 번호: 20120039906에서 개시된다. 다른 구현예에서, CAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제는 CEACAM 억제제 (예를 들면, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5 억제제)이다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 CAR-기재된 활성을 향상시키는 제제는 CAR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 또 다른 제제이다. 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포를 받는 대상체에 투여될 수 있는 제제는 하기를 포함한다: 삼산화 비소, ATRA (전체-트랜스-레틴산), 의 화합물 27, 40, 49 (Du 등, Blood; 2016년 10월 12일 온라인 사전공개됨), IDH2 억제제 (예를 들면, AG-221) 또는 이의 조합. 한 구현예에서, 제제는 CAR-발현 세포의 투여에 앞서, 이와 동시에 또는 이후 투여된다. 바람직한 구현예에서 이들 제제는 CAR-발현 세포의 투여에 앞서 투여된다. 바람직한 구현예에서, 상기 제제와 함께 투여되는 CAR 발현 세포는 B 세포 항원 (예를 들면, CD19, CD20, 또는 CD22 등.)을 표적한다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR의 활성을 향상시키는 제제는 가용성 수용체이다. 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포를 받는 대상체에 투여될 수 있는 가용성 수용체는 하기를 포함한다: sHVEM (서열번호: 2664), sHVEM-Alb8-vHH 융합 단백질 (서열번호: 2665), 또는 이의 조합. 가용성 수용체는 1일 1회 또는 1일 1회 초과, 예를 들면, 1일 2회, 1일 3회, 또는 1일 4회 투여될 수 있다. 가용성 수용체는 1 초과 일 동안 투여될 수 있고, 예를 들면 가용성 수용체는 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 또는 4 주 동안 투여된다. 예를 들어, 가용성 수용체는 7 일 동안 1일 1회 투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 정상 조직에서 CAR-발현 세포의 독성에 대해 보호하는 제제가 투여될 수 있다. CAR-T 세포 요법의 제한 중 하나는 정상 조직에서 독성일 수 있다. 예를 들어, CAR 표적 CD19는, CD19 항원을 또한 발현시키는, 정상 B 세포의 장기간 고갈로 이어질 수 있다. 일 구현예에서, CD19 CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 CD19의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 내인성 CD19의 넉아웃 또는 돌연변이는 CRIPS/Cas9, Talons 또는 당해 기술에 공지되어 있는 다른 적합한 유전자 편집 방법을 사용하여 달성된다. 현행 임상 용도에서 CD19 CAR-T 세포에 의해 결합된 CD19의 에피토프는 엑손2-4에 맵핑되어 왔다. 일 구현예에서, 미스센스 또는 논센스 돌연변이는 CRISP/Cas9, Zn 핑거 뉴클레아제, Talons 또는 당해 분야에서 공지된 다른 방법을 사용하여 자가조직 또는 동종이계 조혈모세포의 엑손 2 (또는 CD19 표적된 CAR T-세포에 의해 인식되는 다른 적합한 엑손/영역)에서 생성된다. 일 구현예에서, 대상체는 CD19 고갈된/돌연변이된 조혈모세포를 사용하여 그의/그녀의 질환 및 자가조직 또는 동종이계 줄기 세포 이식을 제어하기 위해 주어진 CD19 CART 세포 주입이다. 변형된 줄기 세포로부터 기원할 B 세포가 CD19-CAR-T 세포에 의해 표적되지 않을 것임에 따라, 환자는 CD19 CAR-T 세포의 흔한 부작용인 B 세포 무형성증을 벗어날 것이다. 또 다른 구현예에서, MPL CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 MPL의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 또 다른 구현예에서, CD123 CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 CD123의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 또 다른 구현예에서, CD33 CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 CD33의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 또 다른 구현예에서, CD20 CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 CD20의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 또 다른 구현예에서, CD22 CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 CD22의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 또 다른 구현예에서, CD1 CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 CD1의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 또 다른 구현예에서, BCMA CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포에서 내인성 BCMA의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 또 다른 구현예에서, CD45 CAR-T 세포 요법은 정상 조혈모세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)에서 내인성 CD45의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 본질적으로, 유사한 접근법은 CAR에 의해 표적된 항원이 정상 조혈모세포 또는 이의 자손 중 하나에서 또한 발현되는 정상 조직에 대한 CAR-T 세포의 독성을 완화시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, CAR-T 세포 요법은 면역 이펙터 세포를 유발시키는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)에서 CAR에 의해 표적된 단백질 또는 내인성 유전자의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합된다. 예를 들어, CD45가 모든 조혈 세포에서 발현되기 때문에, CD45를 표적하는 CAR-T 세포는 이들이 인접하는 CD45-CART 세포에 의해 사멸 제거될 것임에 따라 생성하기 어려울 것이다. 그러나, 그와 같은 세포는 T 세포에서 CD45 CAR의 발현이 CD45 CAR이 발현 중인 T 세포에서 내인성 CD45의 넉다운 또는 결실과 조합되면 생성될 수 있다. 본질적으로 유사한 접근법은 면역 이펙터 세포에서 발현되는 다른 항원을 표적하는 CAR을 생성하는데 사용될 수 있다. 예시적 그와 같은 항원은, 비제한적으로, NK 세포에서 발현된 CD5, TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, 전TCRα 및 다양한 수용체를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포를 받는 대상체에 투여될 수 있는 사이토카인은 하기를 포함한다: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18, LIGHT, 및 IL-21, 또는 이의 조합. 바람직한 구현예에서, 투여된 사이토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21, IL12F, 또는 이의 조합이다. 사이토카인은 1일 1회 또는 1일 1회 초과, 예를 들면, 1일 2회, 1일 3회, 또는 1일 4회 투여될 수 있다. 사이토카인은 1 초과 일 동안 투여될 수 있고, 예를 들면 사이토카인은 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 또는 4 주 동안 투여된다. 예를 들어, 사이토카인은 7 일 동안 1일 1회 투여된다. CAR-발현 세포 요법에 아-최적의 반응을 갖는 대상체에 사이토카인의 투여는 CAR-발현 세포 효능 또는 항-암 활성을 개선한다. 바람직한 구현예에서, CAR-발현 세포의 투여 후 투여된 사이토카인은 IL-7이다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 CAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제는 하기에서 기재된 바와 같이 Brd4 억제제 또는 siRNA 또는 an shRNA 표적 BRD4이다: (Tolani, B 등, Oncogene, 29; 33(22):2928-37. PMID: 23792448)(Tolani, Gopalakrishnan, Punj, Matta, & Chaudhary, 2014).
약제학적 조성물
본 명세서에서 기재된 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 벡터, 바이러스, 및/또는 유전적으로 조작된 세포 및/또는 화학적 화합물 그리고 약제학적으로 허용가능한 캐리어의 어느 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 또한 제공된다. 그와 같은 조성물은 완충액 예컨대 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 및 기타 동종; 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 산화방지제; 킬레이트제 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트 (예를 들면, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일 측면에서 정맥내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료되는 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는, 적절한 투약량이 임상시험에 의해 겨정될 수 있어도, 환자의 상태, 그리고 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
"치료적 유효량"이 지시되는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정밀량은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 상태를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 유전적으로 변형된 세포 (T 세포, NK 세포)를 포함하는 약제학적 조성물이, 그 범위 이내 모든 정수 값을 포함하는, 104　내지 109　세포/kg 체중, 일부 사례에서 105　내지 106　세포/kg 체중의 투약량으로 투여될 수 있다는 것이 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투약량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 통상적으로 공지되는 주입 기술을 사용함으로써 투여될 수 있다 (참고, 예를 들면, Rosenberg 등., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).
일부 구현예에서, 대상체에 활성화된 유전적으로 변형된 세포 (T 세포, NK 세포)를 투여하고 그 다음 후속적으로 혈액을 재채혈 (또는 분리반출법을 수행), 거기로부터 유전적으로 변형된 세포를 활성화 그리고 이들 활성화된 및 팽창된 유전적으로 변형된 세포로 환자에 재주입하는 것이 요구될 수 있다. 이 과정은 몇 주마다 여러 번 수행될 수 있다. 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 10cc 내지 400cc의 혈액 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 또는 100cc의 혈액 채혈로부터 활성화된다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제"는 일반적으로 안전한, 비-독성인, 및 바람직한 약제학적 조성물 제조에서 유용한 부형제를 의미하고, 수의적 용도로 뿐만 아니라 인간 약제학적 용도로 허용가능한 부형제를 포함한다. 그와 같은 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는, 에어로졸 조성물의 사례에서, 기체성일 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 임의의 투여 경로를 통해 전달용으로 제형화될 수 있다. "투여 경로"는, 비제한적으로 에어로졸, 비강, 경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 흡입, 경점막, 경피, 비경구, 이식가능 펌프, 연속 주입, 국소 도포, 캡슐 및/또는 주사를 포함하는, 당해 분야에서 공지된 임의의 투여 경로를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 임의의 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 바디의 하나의 조직, 장기, 또는 부분부터 바디의 또 다른 조직, 장기, 또는 부분까지 관심의 화합물의 운반 또는 수송에 관여되는 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클을 지칭한다. 예를 들어, 캐리어는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질, 또는 이의 조합일 수 있다. 캐리어의 각각의 요소는 제형의 다른 성분과 양립가능해야 한다는 점에서 "약제학적으로 허용가능"해져야 한다. 이의 치료 이점보다 과도하게 더 큰 독성, 자극, 알러지성 반응, 면역원성, 또는 임의의 다른 합병증의 위험을 운반하지 않아야 하는 것을 의미하는, 접촉될 수 있는 임의의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용에 또한 적합해져야 한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 경구 투여용 에멀젼 또는 시럽에서 캡슐화, 정제화 또는 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 캐리어는 조성물을 향상 또는 안정화시키기 위해, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다. 액체 캐리어는 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 글리세린, 염수, 알코올 및 물을 포함한다. 고체 캐리어는 전분, 락토스, 황산칼슘, 이수화물, 백토, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴을 포함한다. 캐리어는 또한 지속 방출 물질 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를, 단독 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다
약제학적 제제는, 정제 형태를 위하여, 필요할 때, 밀링, 혼합, 과립화, 및 압축; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태를 위하여 밀링, 혼합 및 충전을 포함하는 종래의 조제 기술에 따라 제조된다. 액체 캐리어가 사용되는 경우, 제제는 시럽, 엘릭시르, 에멀젼 또는 수성 또는 비-수성 현탁액의 형태일 것이다. 그와 같은 액체 제형는 직접적으로 p.o. 투여될 수 있거나 연질 젤라틴 캡슐 속에 충전될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 치료적 유효량으로 전달될 수 있다. 정확한 치료적 유효량은 주어진 대상체에서 치료의 효능에 관하여 가장 효과적인 결과를 산출할 조성물의 양이다. 이 양은, 비제한적으로 (활성, 약동학, 약력학, 및 생체이용률을 포함하는) 치료 화합물의 특징, (연령, 성별, 질환 유형 및 단계, 일반적인 신체 조건, 주어진 투약량에 대한 반응성, 및 약물의 유형을 포함하는) 대상체의 생리적 병태, 제형에서 캐리어 또는 약제학적으로 허용가능한 캐리어의 성질, 및 투여 경로를 포함하는, 다양한 인자에 의존하여 다양할 것이다. 임상 및 약리적 기술분야에서 숙련가는 일상적인 실험과정을 통해, 예를 들어, 화합물의 투여에 대한 대상체의 반응 모니터링 및 따라서 투약량 조정에 의해 치료적 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 추가의 안내에 대하여, 참고 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA) (2000).
대상 조성물의 투여는, 에어로졸 흡입, 주사, 수혈, 주입 또는 이식을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 조성물은 환자에 경동맥으로, 피하로, 진피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내, 근육내로, 정맥내 (i.v.) 주사로, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 환자에 진피내 또는 피하 주사로 투여된다. 일 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 i. v. 주사로 투여된다. 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 조성물은 감염의 종양, 림프절, 또는 부위에 직접적으로 주사될 수 있다.
특정 예시적 측면에서, 대상체는 백혈구분리반출법을 경험할 수 있고, 여기서 백혈구는 생체외 수집, 농축, 또는 고갈되어 관심의 세포, 예를 들면, T 세포를 선택 및/또는 단리할 수 있다. 이들 T 세포 단리물은 본 발명의 하나 이상의 CAR 작제물이 도입될 수 있도록 당해 분야에서 공지된 방법으로 팽창될 수 있고 치료될 수 있어서, 그렇게 함으로써 본 발명의 CAR T 세포를 창출한다. 그것을 필요로 하는 대상체는 고용량 화학요법 이어서 말초 혈액 줄기 세포 이식으로 표준 치료를 후속적으로 경험할 수 있다. 특정 측면에서, 이식 이후 또는 이와 동반하여, 대상체는 본 발명의 팽창된 CAR T 세포의 주입을 받는다. 추가의 측면에서, 팽창된 세포는 수술 이전 또는 이후 투여된다.
일 구현예에서, CAR은, 예를 들면, 시험관내 전사를 사용하여, 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포) 속에 도입되고, 대상체 (예를 들면, 인간)은 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 초기 투여, 그리고 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 하나 이상의 후속 투여를 받고, 여기서 상기 하나 이상의 후속 투여는 이전의 투여 후 15 일 미만, 예를 들면, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 일 투여된다. 일 구현예에서, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 1 초과 투여는 주당 대상체 (예를 들면, 인간)에 투여되고, 예를 들면, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 2, 3, 또는 4 투여는 주당 투여된다. 일 구현예에서, 대상체 (예를 들면, 인간 대상체)는 주당 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 1 초과 투여 (예를 들면, 주당 2, 3 또는 4 투여) (또한 본 명세서에서 사이클로서 지칭됨)을 받고, 이어서 1주의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포) 투여 없음이고, 그 다음 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 하나 이상의 추가의 투여 (예를 들면, 주당 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 1 초과 투여)가 대상체에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 대상체 (예를 들면, 인간 대상체)는 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)의 1 초과 사이클을 받고, 각각의 사이클 사이 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3 일 미만이다. 일 구현예에서, CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 주당 3 투여로 하루 걸러 투여된다. 일 구현예에서, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 주 또는 초과 동안 투여된다.
일시적으로 발현하는 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포)를 사용하여 (특히 쥣과 scFv 보유 CAR-Ts로) 치료되는 환자에서 발생할 수 있는 잠재적인 사안은 다중 치료후 과민증이다.
상기 이론에 의해 구속됨 없이, 그와 같은 과민성 반응이 체액성 항 -CAR 반응을 발생시키는 환자, 즉, 항-IgE 아이소타입을 갖는 항-CAR 항체에 의해 야기될 수 있다고 여겨진다. 환자의 항체 생산 세포가 항원에 10 내지 14 일 노출 중단이 있는 IgE 아이소타입에 (과민증을 유발시키지 않는) IgG 아이소타입으로부터 부류 스위치를 경험한다고 생각된다.
환자가 CAR 요법의 과정 동안 IgE 유형 CAR 항체 반응을 생성하거나 CAR 요법에 과민성 반응을 생성하는 고위험이면, 오말리주맙 (Xolair)은 CAR 요법 이전 또는 동안 투여될 수 있다.
환자가 일시적 CAR 요법 (예컨대 RNA 형질도입에 의해 생성된 것) 동안 항-CAR 항체 반응을 생성하는 고위험이면, CART 주입 파괴는 10 초과 14 일 지속하지 않을 수 있다.
키트
본 발명을 실시하기 위한 키트는 또한 제공된다. 예를 들어, 대상체에서 암 치료 키트, 또는 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 CARs를 발현시키는 CAR T 세포의 제조 키트. 키트는 면역 이펙터 세포 속에 핵산을 도입하기 위한 방법과 함께 CAR을 인코딩하는 벡터 또는 CAR을 인코딩하는 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자를 포함할 수 있다. 키트는, 바이러스 형질도입을 향상시키기 위해, CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 및 화학물질, 예컨대 폴리브렌을 포함할 수 있다. 키트는 CAR 발현시키기 위한 T 세포의 단리용 요소를 함유할 수 있다. 대안적으로, 키트는 CAR을 발현시키는 줄기 세포 또는 면역 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)를 함유할 수 있다. 1 초과의 개시된 CAR은 키트에서 포함될 수 있다. 키트는 컨테이너 그리고 컨테이너상에 또는 이와 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다.
적합한 컨테이너는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 등을 포함한다. 컨테이너는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 전형적으로 하나 이상의 핵산 분자, 바이러스, 벡터, CAR을 발현시키는 T 세포를 포함하는 조성물을 보유한다. 몇 개의 구현예에서 컨테이너는 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 컨테이너는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있다). 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정한 병태 치료에 사용되는 것을 명시한다. 표지 또는 포장 삽입물은 전형적으로 추가로, 예를 들어, CAR T 세포의 제조 방법 또는 종양의 치료 또는 예방 방법에서, 개시된 핵산 분자, CARs 또는 CAR을 발현시키는 T 세포의 사용 지침을 표함할 것이다. 포장 삽입물은 전형적으로 그와 같은 치료 제품의 사용에 관한 징후, 용법, 투약량, 투여, 사용금지사유 및/또는 경고에 대하여 정보를 함유하는 치료 제품의 상업적 패키지에서 관례상 포함된 지침을 포함한다. 지침용 자료는 전자 형태 (예컨대 컴퓨터 디스켓 또는 컴팩트 디스크)로 기록될 수 있거나, 시각적일 수 있다 (예컨대 비디오 파일). 키트는 또한 키트가 설계되는 특정한 적용을 용이하게 하기 위해 추가의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 키트는 추가로 T 세포에서 CAR의 발현 측정용 수단 또는 CAR을 발현시키는 T 세포의 수 또는 백분율의 결정 수단 또는 CART 세포의 기능성의 결정 수단을 함유할 수 있다. 키트는 추가로 특정 방법의 실시를 위하여 일상적으로 사용된 다른 시약 및 완충액을 포함할 수 있다. 그와 같은 키트 및 적절한 함량은 당해 분야의 숙련가에 널리 공지된다.
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실시예
하기 예는 본 발명의 청구항의 범위를 제한하는 의도가 아니고, 특정 구현예의 예시적이도록 다소 의도된다. 숙련가에 발생하는 예시된 방법에서 임의의 변화는 본 발명의 범위 내에 해당하도록 의도된다.
CAR-T 세포 요법용 표적으로서 MPL (TPO 수용체)
트롬보포이에틴 및 이의 동족 수용체, c-Mpl은 거대핵세포형성의 1차 분자 조절자이다 (Zhan 등, Monoclonal antibodies in immunodiagnosis and immunotherapy 32:149-61, 2013). 세포 표면 c-Mpl에 TPO의 결합은 거핵구성 선조 세포의 증식 및 분화 그리고 궁극적으로 혈소판 생산을 초래하는 신호전달 사건의 캐스케이드를 활성화시킨다. TPO 및 c-Mpl은 또한 조혈모세포 자기-재생을 조절한다. 거핵구성 계통에서 TPO의 이들 생물학적 기능과 일치하는, c-Mpl 발현은 비-림프양 조혈 조직으로 대부분 제한된다. c-Mpl mRNA 및 세포 표면 단백질은 인간 CD34+ 세포, 거핵구, 혈소판, 골수성 기원의 1차 백혈병 샘플, 및 거핵구성 및 적혈구 백혈병 세포주에서 확인되어 왔다. c-Mpl mRNA은 대부분의 정상 비-조혈 조직에서 또는 림프양 세포주에서 검출되어 오지 않았다.
우리는 MPL 발현용 공공 유전자 발현 데이터베이스를 검사하였다. 도 2A-도 2D에서 나타낸 바와 같이, 우리는, 저 수준 발현을 보여주는 단 하나의 장기로, 정상 조직내 MPL의 극도로 제한적인 발현을 확인하였다. 그에 반해서, MPL은 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수이형성 증후군 (MDS) 및 만성 골수성 백혈병 (CML)의 대부분의 환자 샘플에서 상당히 발현되었다. 이들 결과는 MPL이, 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포를 사용하여, 골수성 악성종양, 예컨대 AML, MDS 및 CML을 가진 환자에 대하여 탁월한 치료 표적이라는 것을 시사한다.
세포주 및 세포
본 발명에서 사용된 세포주 및 그것의 성장 배지는 표 24에서 보여진다. 세포는 37℃에 5% CO2 가습된 인큐베이터에서 배양되었다. 세포주는 ATCC, NIH AIDS 시약 프로그램으로부터 수득되었거나 우리의 실험실에서 이용가능하였거나 다른 실험실로부터 수득되었다.
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NFAT-의존적 EGFP (또는 GFP) 리포터 유전자로 조작된 Jurkat 세포주　(클론 E6-1)은 샌프란시스코 캘리포니아 대학교의 아더 와이즈 박사로부터 기증이었고 CAR-신호전달을 연구하는데 설명되었다 ((Wu, CY 등, Science 350:293-302,2015).　Jurkat 세포는 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지되었다.
MPL에 대한 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터의 생성
pLENTI-Blast 벡터는 LacZ 유전자의 제거에 의해 pLenti6v5gw_lacz 벡터 (Invitrogen; ThermoFisher Scientific)으로부터 유래되었다. pLenti-MP2는 Pantelis Tsoulfas (Addgene 플라스미드 # 36097)로부터 기증이었고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 인간 EF1α 프로모터로 CMV 프로모터의 대체에 의해 pLenti-EF1a 또는 pLenti-EF1α [서열번호:905] 렌티바이러스 벡터를 생성하는데 사용되었다. pLenti-EF1a-DWPRE [서열번호:906]은 WPRE 서열의 결실에 의해 pLENTI-EF1α 벡터로부터 유래되었다. psPAX2 벡터는 Didier Trono (Addgene 플라스미드 # 12260)으로부터 기증이었다. pLP/VSVG 외피 플라스미드 및 293FT 세포는 Invitrogen (ThermoFisher Scientific)으로부터 수득되었다. 레트로바이러스 전이 벡터 MSCVneo, MSCVhygro, 및 MSCVpac 그리고 패키징 벡터 pKAT는 Dr. Robert Illaria's laboratory로부터 수득되었다. phRGTK 레닐라 루시퍼라아제 플라스미드는 Promega제이었다.
인간 MPL을 표적하는 몇 개의 단클론성 항체는 기재되어 왔다 (US20120269814A1, US 6,342,220 B1, EP1616881A1 및 WO 02568109). US20120269814A1에서 기재된 1.6.1 단클론성 항체의 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8 분자 [서열번호: 1-4], vL 단편, (Gly4Ser)x3 링커 및 vH 단편에서 유래된 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 5'에서 3' 말단까지 구성되는 이의 상응하는 scFV 단편의 합성에 사용되었다. scFV 단편의 서열은 GeneArtTM 또는 통합된 DNA 기술 (IDT)에 의해 합성된 최적화된 서열을 인코딩하는 유전자-단편 및 GeneArtTM 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 코돈 최적화되었다. 유전자 단편은 NheI 및 MluI 제한 효소 부위를 함유하는 구입 프라이머를 사용하여 PCR 반응에서 템플레이트로서 사용되었고 그 다음 표준 분자 생물학 기술에 의해 CAR 카셋트의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인을 함유하는 변형된 pLenti-EF1a 벡터에서 클로닝되었다. CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732] 명명된 최종 CAR 작제물은, 인간 MPL [서열번호:730]에 대한 단클론성 항체 1.6.1, Myc 에피토프 태그 [서열번호:553], 인간 CD8 [서열번호:842]의 힌지 및 막관통 도메인, 인간 41BB (CD137) 수용체 [서열번호:845]의 세포질 도메인, 인간 CD3z [서열번호:846]의 세포질 도메인, T2A 리보솜 스킵 서열 [서열번호:832] 및 cDNA 인코딩 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)에서 유래된 scFv (vL-vH) 단편에 인프레임 융합된, 인간 CD8 신호 펩타이드 (hCD8SP)로 구성된다. CAR 작제물 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658]은 푸로마이신 저항 유전자 (서열번호: 850)의 변이체를 인코딩하는 cDNA에 의해 EGFP cDNA가 대체되는 것을 제외하고 상기와 거의 동일하다. CAR 작제물 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731]에서, 인간 CD8의 힌지 및 막관통 도메인 그리고 인간 41BB (CD137) 수용체의 세포질 도메인은 인간 CD28-힌지, -막관통 및 -세포질 도메인 (서열번호: 848)에 의해 대체된다. 본질적으로 유사한 접근법은 161 scFv 단편이 상이한 항원을 표적하는 항체의 scFv 단편에 의해 대체된 다중 항원에 대한 몇 개의 추가의 CARs를 생성하는데 사용되었다. 뉴클레오타이드의 서열번호 그리고 상이한 scFv 단편의 단백질 서열 및 그것의 표적 항원의 명칭은 표 11에서 제공된다. 추가로, scFv 영역이 인간 및 마우스 트롬보포이에틴 (TPO) (서열번호: 553 및 554)의 세포외 도메인에 의해 대체된 MPL를 표적하는 2 작제물은 제조되었다. 이들 작제물, hTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-U04)[서열번호:1738] 및 mTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-V03)[서열번호:1739]는 CD28-힌지, -막관통 및 -세포질 도메인 및 CD3z 세포질 도메인에 융합된 인간 및 마우스 트롬보포이에틴 (TPO)의 세포외 수용체 결합 도메인으로 구성되었다. 뉴클레오타이드의 서열번호 그리고 CAR을 생성하는데 사용될 수 있는 상이한 낙타과 vHH 단편, 비-면역글로불린 결합 스캐폴드 및 리간드의 단백질 서열 및 그것의 표적 항원의 명칭은 표 7, 8 및 10에서 제공된다.
CAR 작제물 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-P2A-K13-Flag-T2A-EGFP(022415-T02)[서열번호:1747]에서, 카복시-말단 플래그 에피토프 태그를 함유하는 카포시 육종 관련된 헤르페스바이러스로부터 cDNA 인코딩 K13-vFLIP는 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 다운스트림 삽입되고 P2A 절단가능 링커를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 그것으로부터 분리된다. CAR 작제물 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:1388]은 CD8 힌지 및 막관통 도메인 및 41BB 공자극 도메인을 함유하는 것을 제외하고 서열번호: 1747과 설계에서 유사하다. 본질적으로, 유사한 접근법은, CAR-인코딩 렌티바이러스 벡터에서, 다른 액세서리 모듈, 예컨대 MC159-vFLIP, cFLIP-L, HTLV1-Tax 및 HTLV2-Tax를 클로닝하는데 사용되었다. 작제물 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:1388]은 41BB 공자극 도메인 (BB) 및 CD3z 활성화 도메인 (z)를 함유하는 CAR을 포함한다. 이 작제물은 또한 CAR-인코딩 서열의 K13-vFLIP 다운스트림 태깅된 및 P2A 절단가능 링커에 의해 그것으로부터 분리된 플래그-에피토프를 공-발현시킨다. 작제물 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(111516-N05)[서열번호:1118]은 41BB 공자극 도메인이 부족한 것을 제외하고 서열번호: 1388과 설계에서 유사하다. 뉴클레오타이드의 서열번호 그리고 상이한 CAR 작제물의 단백질 서열 및 그것의 표적 항원의 명칭은 표 19-22에서 제공된다. 모든 CAR 작제물은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생성되었고 그것의 서열은 자동화 서열분석을 사용하여 확인되었다.
렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터
렌티바이러스는 이전에 기재된 바와 같이 본질적으로 293FT 세포내 인산칼슘 기반된 형질감염에 의해 생성되었다 (Matta H 등, Cancer biology and therapy. 2(2):206-10. 2003). 293FT 세포는 10% FCS 4 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 비-필수적인 아미노산, 및 1 mM MEM 나트륨 피루베이트 (이로써 DMEM-10으로 칭함)을 가진 DMEM에서 성장되었다. 렌티바이러스의 생성을 위하여, 293FT 세포는 이들이 형질감염의 날에 대략 80 융합성일 수 있도록 10 cm 조직 배양판에서 항생제 없이 10 mL의 DMEM-10 배지에서 플레이팅되었다. 다음 날, 세포는 상이한 유전자를 인코딩하는 10 μg의 렌티바이러스 발현 플라스미드, 7.5 μg의 PSPAX2 플라스미드 및 2 μg의 PLP/VSVG 플라스미드를 사용하여 인산칼슘 형질감염 방법에 의해 형질감염되었다. 형질감염 대략 15-16 시간 후, 9 ml의 배지는 제거되었고 5 ml의 신선한 배지로 대체되었다. 대략, 형질감염 48 시간 후, 5 ml의 상청액은 수집되었고 (제1 수집) 신선한 5 ml 배지로 대체되었다. 형질감염 대략 72 시간 후, 모든 배지는 수집되었다 (제2 수집, 일반적으로 대략 6 ml). 수집된 상청액은 풀링되었고 1000 rpm으로 1 분 동안 원심분리되어 임의의 세포 잔해 및 비-부착 세포를 제거하였다. 무세포 상청액은 0.45 μm 주사기 필터를 통해 여과되었다. 일부 경우에, 상청액은 4oC에서 2 시간 동안 18500 rpm으로 초고-원심분리에 의해 추가로 농축되었다. 바이러스 펠렛은 XVIVO 배지내 초기 용적의 1/10에 재-현탁되었다. 바이러스는 표적 세포를 감염시키기 위해 신선하게 사용되었거나 -80℃에서 분취액내 냉동 저장되었다.
T 세포 및 PBMC의 감염
버피 코트 세포는 로스엔젤레스의 소아 병원에서 혈액 은행으로부터 건강한 비식별된 성인 공여체로부터 수득되었고 피콜-하이팩 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리시키는데 사용되었다. PBMC는 그대로 사용되었거나 CD3 자기 마이크로비드 (Miltenyi Biotech)를 사용하여 그리고 제조자의 지침에 따라 T 세포를 단리시키는데 사용되었다. PBMC 또는 단리된 T 세포는 10 ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2로 대체된 XVIVO 배지 (Lonza)에 재-현탁되었다. 세포는 37℃에서, 5% CO2 가습된 인큐베이터에 배양되었다. 세포는 렌티바이러스 벡터로 감염에 앞서 1 일 동안 상기 배지에서 활성화되었다. 일반적으로, 1차 세포 (예를 들면 T 세포)는 8 μg/ml의 폴리브렌® (Sigma, 카탈로그 번호 H9268)의 존재 하에 XVIVO 배지에 재-현탁되었던 300 μl의 농축된 바이러스로 37℃에서 90 분 동안 스핀-감염 (1800 rpm을 사용하여 아침에 감염되었다. 배지는 저녁에 변화되었고 감염은 총 3 감염을 위하여 2일 더 반복되었다. 제3 감염 후, 세포는 펠렛화되었고 10ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2를 함유하는 신선한 XVIVO 배지에서 재현탁되었고 (나타난 경우) 각각의 항생제로 보충되었고, 달리 나타내지 않는 한 선택용 세포 배양 플라스크에 배치한다. 세포는 약물 선택이 사용되지 않았던 경우 10-15 일 동안 그리고 약물-선택이 사용된 경우 20-30 일 동안 상기 배지에서 배양되었다. 세포가 렌티바이러스 발현 EGFP로 감염된, 사례에서, 이들은 EGFP-발현 세포를 농축시키기 위해 유동-분류되었거나 약물-선택 없이 팽창되었다. 암 세포주의 감염을 위하여, 대략 500,000 세포는 폴리브렌® (Sigma, 카탈로그 번호 H9268)로 3 ml의 총 용적에서 2 ml의 비-농축된 바이러스성 상청액으로 감염되었다. 그 다음 다음 날 아침, 세포는 펠렛화되었고 각각의 항생제를 가진 배지에서 재현탁되었고 선택용 세포 배양 플라스크에서 배치한다.
렌티바이러스 벡터 생산에 대하여 상기 기재된 바와 본질적으로 유사한 절차는 293FT 세포가 10 μg의 레트로바이러스 작제물, 4μg의 pKAT 및 2μg의 VSVG 플라스미드를 사용하는 10 ml의 DMEM-10 배지의 10 cm 조직 배양판에서 일반적으로 형질감염되었던 것을 제외하고 레트로바이러스 벡터의 생성에 사용되었다. 바이러스 수집 및 표적 세포의 감염은 렌티바이러스 벡터에 대하여 상기 기재된 바와 같이 본질적으로 수행되었다.
항체 및 약물
블리나투모맙은 Amgen으로부터 수득되었다. 디기토닌은 Sigma (Cat. no D141)로부터 구매되었고 100mg/ml의 모액은 DMSO에서 제조되었다. 1 mg/ml의 희석된 스톡은 PBS에서 제조되었다. 세포 용해에 사용된 디기토닌의 최종 농도는 달리 나타내지 않는 한 30μg/ml이었다.
ELISA
인간 IL2, IFNγ, IL6 및 TNFα는 R&D 시스템 (Minneapolis, MN) 및 BD Biosciences로부터 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트를 사용하여 그리고 제조자의 권고에 따라 24 내지 96 시간 동안 특이적 표적 세포주로 공-배양된 T 세포 또는 CAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 이펙터 세포의 세포 배양 상청액에서 측정되었다.
CAR의 발현 검출용 FACS 분석
마우스 항-인간 c-Myc APC-접합된 단클론성 항체 (카탈로그 # IC3696A)는 R&D Systems　(Minneapolis, MN)제이었다. 비오틴화된 단백질 L은 GeneScript (Piscataway, NJ)로부터 구매되었고, 1 mg/ml로 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 재구성되었고 4℃에서 저장되었다. 스트렙타비딘-APC (SA1005)는 ThermoFisher Scientific으로부터 구매되었다.
Myc 염색을 사용하는 CARs의 검출을 위하여, 1 × 106 세포는 수확되었고 4% 소 혈청 알부민 (BSA) 세정 완충액을 함유하는 3 mL의 빙랭 1 × PBS로 3회 세정되었다. 세정 후, 세포는 10 μl의 APC-접합된 Myc 항체를 함유하는 0.1 ml의 빙랭 세정 완충액에서 재현탁되었고 암실에서 1 시간 동안 인큐베이션되었고 이어서 빙랭된 세정 완충액으로 2회 세정되었다.
단백질 L 염색을 사용하는 CARs의 검출을 위하여, 1 × 106 세포는 수확되었고 4% 소 혈청 알부민 (BSA) 세정 완충액을 함유하는 3 mL의 빙랭 1 × PBS로 3회 세정되었다. 세정 후, 세포는 1 시간 동안 4℃에서 1 μg의 단백질 L을 함유하는 0.1 ml의 빙랭 세정 완충액에서 재현탁되었다. 세포는 빙랭 세정 완충액으로 3회 세정되었고, 그 다음 30 분 동안 0.1 ml의 세정 완충액내 10μg의 APC-접합된 스트렙타비딘으로 (암실에서) 인큐베이션되었고 이어서 빙랭된 세정 완충액으로 2회 세정되었다. FACS는 BD Biosciences로부터 FACSVerse 분석기를 사용하여 실시되었다.
세포사 검정
세포사를 측정하기 위해, Gluc, NLuc 및 다른 루시퍼라아제의 이소성 세포질 발현에 기반된 신규한 검정은 미국 특허 가출원 62/396,650 "비-방사성 세포독성 검정"에서 기재된 바와 같이 이용되었다. 본 방법은 건강한 세포 내에 우선적으로 유지되지만 죽은 및 죽어가는 세포로부터 방출되도록 하는 방식으로 또는 활성이 죽은 및 죽어가는 세포에서 우선적으로 측정될 수 있는 방식으로 표적 세포에서 리포터의 발현을 포함한다. 이 검정에 바람직한 리포터는 하기이다: 1) 요각류, 예컨대 가우시아 프린셉스, 플레우로맘마 아브도미날리스, 메트리디아 파시피카, 메트리디아 쿠르티카우다, 메트리디아 아시메트리카, 메트리디아 옥호텐시스, 메트리디아 롱거, 루시쿠티아 오발리포르미스, 헤테로르하브두스 탄네리, 및 플레우로맘마 스쿠툴라타 2) 심해 새우, 예컨대 NanoLuc으로부터 조작된 루시퍼라아제 리포터. 몇 개의 그와 같은 예시적 리포터 벡터의 서열은 서열번호: 912 내지 서열번호: 918에서 제공된다. 상기 벡터는 적절한 항생제로 선택 이후 GLuc, NLuc, 또는 TurboLuc를 안정적으로 발현시키는 몇 개의 표적 세포주의 다클론성 모집단을 생성하는데 차례로 사용된 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 생성하는데 사용되었다. 달리 나타내지 않는 한, 상이한 루시퍼라아제를 안정적으로 발현시키는 표적 세포는 표적 세포 성장에 사용된 배지에서 384 웰 플레이트에 3중으로 플레이팅되었다. 현탁액에서 성장하는 표적 세포는 2-3 x 104 / 웰의 농도로 일반적으로 플레이팅되었고, 반면 부착 단일층으로서 성장하는 표적 세포는 1-2 x 104 / 웰의 농도로 플레이팅되었다. 달리 나타내지 않는 한, 표적 세포는 4 시간 내지 96 시간 동안 1:1 내지 10:1 다양한 이펙터:표적 (E:T) 비에서 유전적으로 변형된 T 세포 (즉 CAR을 발현시키는 것)로 공배양되었다. 표적 세포가 부착 세포 (예를 들면, HeLa 세포)로서 성장하는 경우에서, 이들은 밤새 웰의 바닥에 부착하게 된 다음 T 세포는 첨가되었다. 표적 세포의 용해의 T 세포 매개된 유도는 아래 기재된 바와 같이 원상태 코엘로엔트라진 (Nanaolight)를 함유하는 0.5 x CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 상승효과 플레이트 리더에 의해 측정된 경우 루시퍼라아제 활성의 증가에 의해 분석되었다.
CTZ 검정
원상태 코엘렌테라진 (CTZ; Nanolight, cat # 303)의 100X 모액은 경시적으로 CTZ의 산화를 피하기 위해 30μl의 6N HCl로 보충된 1.1 ml의 100% 메탄올내 1mg의 동결건조된 CTZ 분말을 용해시킴으로써 제조되었다. CTZ 검정 완충액을 제조하기 위해, CTZ의 100X 모액은 PBS내 0.5X 농도로 희석되었다. 달리 나타내지 않는 한, (상기 제조된 바와 같이) 15μl의 CTZ 검정 완충액의 총 용적은 배지의 대략 50-60μl 용적내 루시퍼라아제의 비-분비성 형태를 발현시키는 세포를 함유하는 384-웰 백색 플레이트 (Greiner, 384 웰 백색 플레이트 cat # 781075)의 각각의 웰에 첨가되었고 플레이트는 BioTek synergyH4 플레이트 리더를 사용하여 종점 방식으로 발광에 대하여 판독되었다. 96 웰 플레이트를 위하여, 세포는 200μl의 배지에서 플레이팅되었고 대략 50μl의 0.5X CTZ 검정 완충액은 첨가되었다. 달리 나타내지 않는 한, 0.5X CTZ 검정 완충액은 GLuc, TurboLuc16, 및 MLuc7의 활성 검정에 사용되었다. (0.125X 농도로 희석된) CTZ 검정 완충액은 또한 일부 실험에서 NLuc 활성의 측정에 사용되었다. 일반적으로, 달리 나타내지 않는 한, 첨가된 0.5X CTZ 검정 완충액의 용적은, 0.5X CTZ 검정이 1:1 용적으로 세포를 함유하는 배지에 첨가된 경우 검정이 또한 작업하였어도, 세포를 함유하는 웰에서 액체의 용적의 대략 1/4이었다. 배지 단독 (Med)를 함유하는 웰에서 그리고 표적 세포가 임의의 SIR 작제물 (T-UI)로 감염되지 않았던 T 세포로 인큐베이션된 웰에서 Gluc 활성은, 지시된 경우, 대조군으로서 사용되었다.
NLuc 검정:
Nano-Glo® 루시퍼라아제 검정 시스템 (Promega)는 제조자의 지침에 따름으로써 NLuc 활성의 측정에 사용되었다. 간단히, Nano-Glo 시약은 1ml의 Nano-Glo 검정 완충액 (Promega)내 5μl의 Nano-Glo 기질 첨가에 의해 제조되었다. 달리 나타내지 않는 한, 상기 제조된 15μl의 Nano-Glo 시약은 60μl의 배지 및 플레이트내 세포를 함유하는 384-웰 백색 플레이트의 각각의 웰에 직접적으로 수작업으로 첨가되었다. 96 웰 플레이트에 대하여, 세포는 200μl의 배지에서 플레이팅되었고 대략 50μl의 검정 완충액은 첨가되었다.
플레이트는 사전 세포 용해 없이 BioTek synergyH4 플레이트 리더를 사용하여 종점 방식으로 발광에 대하여 판독되었다. 일부 실험에서, NLuc 활성은 CTZ 검정 완충액을 사용하여 측정되었지만 여기에서 완충액은 0.125X의 최종 농도로 희석되었다. CTZ 검정 완충액이 NLuc 활성의 측정에 사용된 경우, 0.125X CTZ 검정 완충액의 (달리 나타내지 않는 한) 대략 15μl의 총 용적은 대략 50-60μl 용적의 배지내 세포를 함유하는 384-웰 백색 플레이트 (Greiner, 384 웰 백색 플레이트 cat # 781075)의 각각의 웰에 주사기로 첨가되었고 플레이트는 BioTek synergyH4 플레이트 리더를 사용하여 종점 방식으로 발광에 대하여 판독되었다. 96 웰 플레이트에 대하여, 세포는 200μl의 배지에서 일반적으로 플레이팅되었고 대략 50μl의 0.125X CTZ 검정 완충액은 첨가되었다.
표적 세포에서 항원의 발현을 검출하기 위한 검정
(또한 트롬보포이에틴 수용체 또는 TPO-R로서 공지된) 양쪽 CD19 및 MPL은 조혈 세포에서 발현되지만 상이한 계통의 세포에서 차별적인 발현을 보여준다. FMC63은 인간 CD19를 구체적으로 인식하는 널리 특성규명된 마우스 단클론성 항체이다. 유사하게, (또한 1.6.1로서 지정된) 161은 인간 MPL을 인식하는 그리고 미국 특허 출원 US 2012/0269814 A1에서 기재되는 단클론성 항체이다. 우리는 FMC63 vL 및 vH 단편의 공지된 서열에 기반된 FMC63 단일 쇄 Fv (scFv) 단편을 생성하였다. FMC63 scFv 단편을 인코딩하는 cDNA는 인간 CD8 분자, FMC63 vL 단편, (Gly4Ser)x3 링커 및 FMC63-vH 단편에서 유래된 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 5'에서 3' 말단까지 구성되었다. FMC63 scFv 단편을 인코딩하는 cDNA는 그 다음 Gly-Gly-Ser-Gly 링커를 통해 AcV5-태깅된 NLuc를 인코딩하는 cDNA에 이의 3' 말단에서 인프레임 융합되어 FMC63-GGSG-NLuc를 생성하였다. 수득한 단편은 그 다음 렌티바이러스 벡터 pLenti-EF1a (서열번호: 905) 속으로 인간 EF1α 프로모터의 다운-스트림 클로닝되어 작제물 Plenti-EF1a-FMC63(vL-vH)-GGSG-NLuc-AcV5-U09를 제조하였다. 삽입 단편의 DNA 및 PRT 서열은 서열번호: 923 및 서열번호: 2668, 각각에서 제공된다. 161-GGSG-NLuc를 인코딩하는 작제물은 MPL에 대한 1.6.1 단클론성 항체의 vL 및 vH 단편을 사용하여 유사하게 생성되었다. 삽입 단편의 DNA 및 PRT 서열은 서열번호: 924 및 서열번호: 2669, 각각에서 제공된다. pLenti-EF1a-FMC63(vL-vH)-GGSG-NLuc-AcV5 및 pLenti-EF1a-161(vL-vH)-GGSG-NLuc-AcV5 플라스미드는 인산칼슘 공동침전 방법에 의해 293FT 세포 속에 형질감염되었다. 형질감염 대략 20 시간 후, 세포 배양 배지는 XVIVO 배지로 대체되었다. 분비된 FMC63(vL-vH)-GGSG-NLuc-AcV5 (또한 FMC63-GGSG-NLuc-AcV5로 칭함) 및 161(vL-vH)-GGSG-NLuc-AcV5 (또한 161-GGSG-NLuc-AcV5로 칭함) 단백질을 함유하는 컨디셔닝된 배지는 48-72 시간 이후 수집되었다.
FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 및 161-GGSG-NLuc-AcV5 단백질을 함유하는 상청액은 인간 c-MPL cDNA를 발현시키는 렌티바이러스 벡터 또는 비어있는 벡터로 이들 세포를 형질도입시킴으로써 c-MPL cDNA를 발현시키도록 조작된 Jurkat, K562, RAJI, RS-4-11 (RS411) 및 HEL.92.1.7 (HEL) 세포의 표면에서 CD19 및 MPL의 발현을 검출하는데 사용되었다. 세포는 또한 이의 신호 펩타이드가 부족한 인간화된 Gluc cDNA를 발현시켰다. 벡터- 및 MPL-발현 Jurkat-Gluc, K562-Gluc, HEL.92.1.7-Gluc, RAJI-Gluc 및 RS411-Gluc 세포는 1 시간 동안 4℃에서 FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 및 161-GGSG-NLuc-AcV5 상청액으로 인큐베이션되었고 이어서 0.1% BSA로 보충된 차가운 PBS로 광범위하게 세정되었다. 세포는 차가운 PBS에 재-현탁되었고 30μl의 세포 현탁액은 3중으로 편평한 바닥 384 웰 플레이트 (Greiner, 384 웰 백색 플레이트 cat. # 781075)에서 웰당 플레이팅되었다. NLuc 기질로서 원상태 코엘렌테라진 (CTZ) (PBS에서 희석된 30μl/웰의 원상태 코엘렌테라진)을 함유하는 NLuc 검정 완충액은 BioTek 상승효과 H4 플레이트 리더를 사용하여 웰 방식으로 자동 분배기에 의해 각각의 웰에 첨가되었고 NLuc 활성의 측정으로서 발광은 측정되었다. 도 3A는 161-GGSG-NLuc-AcV5와 강한 결합이 내인성으로 MPL의 상당한 발현을 시사하는 HEL.92.1.7-Gluc-벡터 세포에서 관측되었다는 것을 보여준다. HEL.92.1.7-Gluc-MPL 세포에서 MPL의 이소성 발현은 161-GGSG-NLuc-AcV5 결합에서 보통의 증가로 이어졌다. 그에 반해서, 161-GGSG-NLuc-AcV5와 매우 약한 결합은 벡터-발현 Jurkat, RAJI 및 RS411 세포에서 관측되었고 MPL의 이소성 발현시 단지 약하게 증가되었다. 마지막으로, 161-GGSG-NLuc-AcV5의 약하지만 더 강한 결합은 K562-벡터 세포에서 관측되었고, K562-MPL 세포에서 상당히 증가되었다. 161-GGSG-NLuc-AcV5와 대조적으로, FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 상청액은 벡터- 및 MPL-발현 RAJI 세포에서 가장 강한 결합, RS411 세포에서 약하게 강한 결합 그리고 다른 세포에서 매우 약한 내지 무시할만한 결합을 보여주었다.
CD19 및 MPL (트롬보포이에틴 수용체)를 표적하는 키메라 항원 수용체의 발현을 검출하기 위한 검정
키메라 항원 수용체의 분야에서 빈번한 문제는 키메라 항원 수용체를 발현시키는 세포를 검출할 수 있는 감수성 및 특이적 검정의 부족이다. CD19 및 MPL을 표적하는 CAR의 발현을 검출하기 위해, 우리는, Gly-Gly-Ser-Gly 링커, NLuc (분비성 신호 없이) 및 AcV5 에피토프 태그를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가진 프레임 내, 그것의 신호 펩타이드를 포함하는, 인간 CD19 및 인간 MPL의 세포외 도메인 (ECD)를 융합시켰다. CD19 작제물의 경우에서, FLAG 태그는 신호 펩타이드와 세포외 도메인의 시작 사이에 삽입되었다. 전체의 카셋트는 렌티바이러스 벡터 pLenti-EF1 속으로 인간 EF1α 프로모터의 다운스트림 클로닝되어 작제물 pLenti-EF1-FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 및 pLenti-EF1-MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5, 각각을 제조하였다. 삽입 단편의 핵산 서열은 서열번호: 926 및 서열번호: 925, 각각에서 제공된다. 삽입 단편의 단백질 서열은 서열번호: 2671 및 서열번호: 2670, 각각에서 제공된다. 작제물은 인산칼슘 공동침전 방법에 의해 293FT 세포 속에 형질감염되었다. 형질감염 대략 20 시간 후, 세포 배양 배지는 신선한 배지로 대체되었다. 분비된 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 (또한 CD19-GGSG-NLuc-AcV5로 칭함) 및 MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 (또한 MPL-GGSG-NLuc-AcV5로 칭함) 단백질을 함유하는 컨디셔닝된 배지는 48-72 시간 이후 수집되었다.
293FT-세포는 인산칼슘 공-형질감염 방법을 사용하여 키메라 항원 수용체 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467], CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] 또는 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731]을 발현시키는 렌티바이러스 작제물로 (24-웰 플레이트, 500μl 용적에서) 일시적으로 형질감염되었거나 형질감염되지 않은채 방치되었다. 다음 날 아침, 형질감염 대략 18 시간 후, 세포는 1.5 ml 튜브에서 상하로 피펫팅에 의해 수집되었다. 튜브는 5 분 동안 1500 RPM으로 스핀 다운되었다. 그 다음 세포는 세정 완충액 (PBS내 1% FBS)로 1회 세정되었고, 이어서 GGS NLuc 상청액의 100μl의 지시된 분비성 형태로 인큐베이션되었다. 세포는 1 시간 동안 4℃에서 인큐베이션되었다.
인큐베이션 후, 세포는 세정 완충액으로 5회 세정되었다 (1 ml 각 세정). 마지막으로 펠렛은 200μl 세정 완충액에서 재현탁되었다. 재현탁된 세포는 3중으로 (25μl 각각의) 384 웰 플레이트에서 배치되었다. 루시퍼라아제 활성은 각각의 웰 (한번에 하나)에 직접적으로 원상태 코엘렌테라진 (25μl 각각의 웰)을 함유하는 NLuc 검정 완충액 (Promega)의 첨가 후 BioTek 상승효과 H4 플레이트 리더를 사용하여 측정되었다.
도 4A에서 나타낸 바와 같이, CD19를 표적하는 CAR CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]을 발현시키는 293FT 세포는 NLuc 검정에 의해 측정된 경우 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5[서열번호: 926]에 강한 결합을 실증하였고 반면에 매우 적은 결합은 미감염된 T 세포 (UI) 또는 대조군 CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658]을 발현시키는 것에서 보여졌다. 유사하게, CAR CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731]을 발현시키는 293FT 세포는 비-형질감염된 293FT 세포 또는 CAR CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]로 형질감염된 것과 비교된 경우 MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5[서열번호: 925] 상청액과 강한 결합을 보여주었다 (도 4B).
상이한 CAR 작제물로 형질감염된 293FT 세포에서 MPL (트롬보포이에틴 수용체)를 표적하는 키메라 항원 수용체의 발현을 검출하기 위한 검정
작제물 hTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-U04)[서열번호:1738], mTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-V03)[서열번호:1739], CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] 및 무관한 항체에서 유래된 scFv를 함유하는 대조군 CAR 작제물은 293FT 세포 속에 일시적으로 형질감염되었고 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 본질적으로 MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5[서열번호: 925] 상청액으로 인큐베이션되었다. 도 5는 hTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-U04)[서열번호:1738] 및 mTPO-(1-187)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031915-V03)[서열번호:1739] 작제물로 형질감염된 293FT 세포에 MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5의 보통의 결합 그리고 대조군 CAR 작제물로 형질감염된 세포 또는 형질감염되지 않은 세포와 비교된 경우 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] 작제물로 형질감염된 293FT 세포에 강한 결합을 보여준다.
MPL-CARs는 T 세포의 표면에서 발현된다
정제된 T 세포는 MPL을 표적하는 상이한 Myc-태깅된 CAR 작제물을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염되었다. 작제물은 또한 EGFP를 공-발현시켰다. T 세포에서 CAR의 발현은 APC-접합된 Myc-항체로 EGFP 형광 및 면역형광 염색으로 검사되었고 이어서 BD 절 흐름 세포측정기에서 FACS 분석되었다.
도 6은 미감염된 T 세포 (UI)와 비교된 경우 APC-Myc로 증가된 염색 및 증가된 EGFP 형광에 의해 결정된 바와 같이 T 세포의 표면에서 MPL CARs의 발현을 보여준다.
MPL CARs를 발현시키는 T 세포는 MPL-GGSG-NLuc 융합 단백질을 결합시킬 수 있다
상이한 MPL CAR 작제물을 발현시키는 T 세포는 MPL-GGSG-NLuc-AcV5 및 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액으로 인큐베이션되었고 광범위한 세정 후 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 본질적으로 NLuc 활성에 대하여 분석되었다. 도 7은 MPL-GGSG-NLuc AcV5 상청액에 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], CD8SP-MPL-VB22Bw4-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-B06)[서열번호:3536] CARs를 발현시키는 T 세포의 강한 결합 그리고 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735] 및 CD8SP-12E10-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-S03)[서열번호:1736]을 발현시키는 T 세포의 보통의 결합을 보여주고, 반면 대조군 CAR CD8SP-4C3-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-Pac(031615-W05)[서열번호:3534]를 발현시키는 것 또는 미감염된 T 세포에서 상당한 결합은 관측되지 않았다. 유사하게, 특이적 결합은 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액으로 임의의 MPL CAR-T 세포에서 관측되지 않았고, 그렇게 함으로써 검정의 특이성을 실증하였다.
MPL CARs는 항원 자극시 Jurkat 세포에서 T 세포 신호전달을 활성화시킨다.
NFAT-EGFP 리포터 작제물을 안정적으로 발현시키는 Jurkat 세포는 MPL을 표적하는 상이한 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스 벡터로 안정적으로 형질도입되었고 이어서 푸로마이신으로 선택되었다. 세포는 후속적으로 MPL-발현 HEL.92.1.7 (HEL) 세포로 공-배양되었다. HEL 세포로 Jurkat-NFAT-EGFP 세포를 발현시키는 MPL-CAR의 공-배양은, 공-배양 후 4 시간만큼 일찍 분명하였던, FACS 분석에 의해 결정된 경우 EGFP 발현에서 증가를 초래하였다. EGFP 발현에서 증가는 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658], CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731] 및 CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733] 작제물을 발현시키는 Jurkat-NFAT-EGFP 세포에서 가장 강하였다. 독립적 실험에서, 상당한 EGFP 유도는 또한 HEL 세포로 CD8SP-2-MPL-111-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(041316-A03)[서열번호:1660] CAR 작제물을 발현시키는 Jurkat-NFAT-EGFP 세포의 배양시 관측되었다. 실험은, 약한 MPL 발현을 갖는, RAJI 세포로, 또는 인간 MPL 수용체를 이소적으로 발현시키도록 조작된 RAJI-MPL 세포로 Jurkat-NFAT-EGFP 세포의 공-배양에 의해 반복되었다. MPL에 관하여 CAR을 발현시키는 Jurkat-NFAT-EGFP 세포는 RAJI-벡터 세포와 비교된 경우 RAJI-MPL 세포로 인큐베이션된 때 EGFP 발현에서 더욱 증가를 보여주었다. EGFP 발현에서 증가는 재차 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658], CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731] 및 CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733] 작제물을 발현시키는 Jurkat-NFAT-EGFP 세포에서 가장 강하였다.
Figure pct00069
MPL CAR을 발현시키는 T 세포는 MPL-발현 표적 백혈병 세포에서 세포독성을 유도한다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 MPL을 표적하는 CAR 작제물 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732]를 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었거나 미감염된 (UI)채 방치되었다. GLuc를 안정적으로 발현시키는 HEL 세포의 표시된 수는 4 시간 동안 1:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 384 웰 플레이트에서 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732]를 발현시키는 T 세포로 공배양되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 원상태 코엘로엔트라진 (Nanaolight)를 함유하는 0.5X CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 상승효과 플레이트 리더에 의해 측정된 경우 GLuc 활성의 증가에 의해 부석되었다. 도 8은 상이한 MPL-CAR-T 세포에 의해 표적 세포의 용해를 표시하는 미감염된 T 세포와 비교된 경우 MPL-특이적 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732] CAR을 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후 GLuc 활성에서 증가를 보여준다.
MPL CAR을 발현시키는 PBMC는 MPL을 발현시키는 표적 백혈병 세포의 용해를 유도한다
말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 단리시키기 위한 혈액 샘플은 건강한 비-식별된 성인 공여체로부터 수득되었다. PBMC는 피콜-하이팩 구배 원심분리에 의해 버피 코트로부터 단리되었고 10 ng/ml 가용성 항-CD3, 10 ng/ml 가용성 항-CD28 및 100 IU 재조합 인간-IL2로 대체된 XVIVO 배지 (Lonza)에 재-현탁되었다. PBMCs는 각각의 렌티바이러스 벡터로 감염 이어서 푸로마이신으로 선택에 의해 CD19를 표적하는 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] 및 MPL을 표적하는 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658]CAR을 발현시키도록 조작되었다. 표시된 CARs를 발현시키는 PBMC 및 미감염된 PBMC는 4 시간 동안 HEL-GLuc 표적 세포로 공-배양되었고 표적 세포의 용해는 상기 기재된 바와 같이 0.5X CTZ 검정 완충액을 주사함으로써 단일-단계 균질한 GLuc 검정에 의해 측정되었다. 도 9는 FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]CAR-발현 PBMC 또는 미감염된 PBMC에 비교된 경우 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] CAR-발현 PBMC에 의한 HEL-GLuc 세포의 증가된 사멸을 보여준다.
MPL CAR을 발현시키는 PBMC는 MPL을 발현시키는 표적 백혈병 세포의 용해를 유도한다
말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 단리시키기 위한 혈액 샘플은 건강한 비-식별된 성인 공여체로부터 수득되었다. PBMC는 피콜-하이팩 구배 원심분리에 의해 버피 코트로부터 단리되었고 10 ng/ml 가용성 항-CD3, 10 ng/ml 가용성 항-CD28 및 100 IU 재조합 인간-IL2로 대체된 XVIVO 배지 (Lonza)에 재-현탁되었다. PBMCs는 렌티바이러스 벡터로 감염 이어서 푸로마이신으로 선택에 의해 MPL을 표적하는 CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733]CAR을 표적하도록 조작되었다. 표시된 CAR을 발현시키는 PBMCs 및 미감염된 PBMCs는 4 시간 동안 HEL-GLuc 표적 세포로 공-배양되었고 표적 세포의 용해는 상기 기재된 바와 같이 0.5X CTZ 검정 완충액으로 주사함으로써 단일-단계 균질한 GLuc 검정에 의해 측정되었다. 도 10은 미감염된 PBMC에 비교된 경우 PBMC를 발현시키는 CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733] CAR에 의해 HEL-GLuc 세포의 증가된 사멸을 보여준다.
CD28 공자극 도메인을 발현시키는 MPL CARs를 발현시키는 T 세포는 MPL-발현 표적 백혈병 세포에서 세포독성을 유도한다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 MPL을 표적하는 CAR 작제물 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], CD8SP-178-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-R04)[서열번호:1734], 및 CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735]를 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다.. 세포는 푸로마이신으로 선택되었고 팽창되었다. GLuc를 안정적으로 발현시키는 HEL 세포는 4 시간 동안 10:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 CARs를 발현시키는 T 세포로 공배양되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 11은, 미감염된 T 세포에 비교된 경우 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], 및 CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735] 작제물로 더 강하였고 CD8SP-178-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-R04)[서열번호:1734] 작제물로 보통이었던, MPL-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 표시하는, GLuc 활성에서 증가를 보여준다.
CD28 공자극 도메인을 발현시키는 MPL CARs를 발현시키는 T 세포는 MPL-발현 표적 백혈병 세포에서 세포독성을 유도한다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 MPL을 표적하는 CAR 작제물 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], CD8SP-178-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-R04)[서열번호:1734], CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735], CD8SP-12E10-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-S03)[서열번호:1736] 및 CD8SP-VB22Bw4-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-B06)[서열번호:3536]을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포는 푸로마이신으로 선택되었고 팽창되었다. MPL 및 GLuc를 안정적으로 발현시키는 Jurkat 세포는 4 시간 동안 10:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 CARs를 발현시키는 T 세포로 공배양되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 원상태 코엘로엔트라진 (Nanaolight)를 함유하는 0.5 x CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 상승효과 플레이트 리더에 의해 측정된 경우 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 12는, 미감염된 T 세포에 비교된 경우 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731], CD8SP-175-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-Q04)[서열번호:1733], CD8SP-AB317-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-T04)[서열번호:1735], 및 CD8SP-12E10-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-S03)[서열번호:1736] 작제물로 더 강하였고 CD8SP-178-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-R04)[서열번호:1734] 및 CD8SP-VB22Bw4-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(031615-B06)[서열번호:3536] 작제물로 보통이었던, MPL-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 표시하는, GLuc 활성의 증가를 보여준다.
MPL-특이적 161-CAR을 발현시키는 NK92MI 세포는 K562 및 HEL.92.1.7 세포에서 세포독성을 유도한다
자연 살해 세포 유래된 NK92MI (ATCC) 세포는 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732] 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(070814-D06)[서열번호:3535]를 표적하는 표시된 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스 벡터로 안정적으로 형질도입되었다. 세포는 후속적으로 GLuc를 발현시키도록 조작된 HEL.92.1.7 세포로 밤새 공-배양되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-발현 NK92MI 세포-매개된 유도는 원상태 코엘로엔트라진 (Nanaolight)를 함유하는 0.5X CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 측정된 경우 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 13은, MPL-특이적 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732]CAR을 발현시키는 NK92MI 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 표시하는, GLuc 활성에서 증가를 보여준다.
MPL-특이적 CARs를 발현시키는 NK92MI 세포는 K562-MPL 세포에서 세포독성을 유도한다
자연 살해 세포 유래된 NK92MI (ATCC) 세포는 MPL을 표적하는 표시된 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스 벡터로 안정적으로 형질도입되었고 이어서 푸로마이신으로 선택되었다. 세포는 후속적으로 MPL 및 GLuc를 발현시키도록 조작된 K562 세포로 밤새 공-배양되었다. 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 5:1이었다. 표적 세포의 용해의 MPL-CAR-발현 NK92MI 세포-매개된 유도는 원상태 코엘로엔트라진 (Nanaolight)를 함유하는 0.5X CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 측정된 경우 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 14는, MPL-특이적 CARs를 발현시키는 NK92MI 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 표시하는, GLuc 활성에서 증가를 보여준다.
MPL을 발현시키는 표적 세포에 노출시 MPL-특이적 CAR 작제물을 발현시키는 T 세포에 의한 사이토카인 생산
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 MPL을 표적하는 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(021015-R07)[서열번호:1658] 및 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD28z-T2A-PAC(021715-Z07)[서열번호:1731] CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포는 푸로마이신으로 선택되었고 팽창되었다. HEL 세포는 대략 96 시간 동안 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양되었고 상청액에서 TNFα의 분비는 ELISA에 의해 측정되었다. 도 15는 대조군으로서 사용된 미감염된 T 세포에 비교된 경우 HEL 세포로 MPL를 표적하는 CAR을 발현시키는 T 세포의 공-배양시 TNFα의 증가된 분비를 보여준다.
백혈병에 대한 MPL CAR-발현 면역 이펙터 세포의 생체내 효능
HEL 백혈병 세포주 모델에 대한 MPL CAR-발현 NK92MI 세포의 생체내 효능은 NOD/SCID/γ -!- (NSG) 마우스 모델에서 시험되었다. 0 일째, NSG 마우스 (Jackson Lab)은 275 cGy의 용량으로 아-치사적으로 조사되었다. 조사 후 24 시간 (1 일째), 마우스는 정맥내로 1 x 106 HEL 세포로 주사되었다. 9 일째 및 19 일째, 마우스는 정맥내로 표시된 CAR 작제물을 발현시키는 2 백만 NK92MI 세포로 치료되었고 생존으로 이어졌다. 도 16은 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-CD8TM-BBz-T2A-EGFP(090814-C03)[서열번호:1732]-발현 NK92MI 세포 주어진 마우스의 중앙 생존이 31.5 일이었고, 이는 비변형된 NK92MI 세포 (28.5 일; p = 0.03) 주어진 마우스 또는 대조군 CAR CD8SP-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(100814-K06)[서열번호:3537]; 28 일; p=.04)를 발현시키는 NK92MI 세포 주어진 것보다 상당히 더 높았었다는 것을 보여준다.
인간화된 CD19 항체에서 유래된 scFV 단편으로 CD19를 표적하는 키메라 항원 수용체
현행 임상시험에서 CD19 CARs는 쥣과 단클론성 항체에서 유래된 scFV 단편을 함유한다. 쥣과 항체 단편에 대한 항체의 개발은 그와 같은 CARs를 발현시키는 T 세포의 지속성의 부족에 기여하고 뿐만 아니라 또한, 과민증을 포함하는, 알러지성 반응으로 이어질 수 있다. 이 제한을 극복하기 위해, CD19 CARs는 PCT/US2008/080373에서 기재된 인간화된 CD19 단클론성 항체 huCD19-Bu12 (또는 Bu12)에서 유래된 scFv 단편 (서열번호: 566)을 함유하여 생성되었다. 또 다른 CAR은 US7112324에서 기재된 쥣과 항체에서 유래된 scFv (서열번호: 567) 단편을 함유하여 작제되었고 CD19MM으로 지정되었다.
CD19-Bu12 및 CD19MM에 기반된 scFV 단편은 인간 CD8 분자, vL 단편, (Gly4Ser)x3 링커 및 vH 단편에서 유래된 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 5'에서 3' 말단까지 구성되어 설계되었다. scFV 단편의 서열은 GeneArtTM 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 코돈-최적화되었고 최적화된 서열을 인코딩하는 유전자-단편은 상업적 판매인을 사용하여 합성되었다. 유전자 단편은 구입 프라이머를 사용하는 PCR 반응에서 템플레이트로서 사용되었고 그 다음 표준 분자 생물학 기술에 의해 CAR 카셋트의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인을 함유하는 변형된 pLENTI-EF1α 벡터에서 클로닝되었다. 최종 CAR 작제물 CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]은, CD19MM scFv 단편 (서열번호: 567), Myc 에피토프 태그, 인간 CD8 (서열번호: 842)의 힌지 및 막관통 도메인, 인간 41BB (CD137) 수용체 (서열번호: 845)의 세포질 도메인, 인간 CD3z (서열번호: 846)의 세포질 도메인, T2A 리보솜 스킵 서열 (서열번호: 832) 및 푸로마이신 저항 유전자 (서열번호: 850)의 변이체를 인코딩하는 cDNA에 프레임내 융합된, 인간 CD8 신호 펩타이드로 구성되었다. CD19Bu12 scFv 단편 (서열번호: 566)에 기반된 CAR 작제물 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470]은 유사하게 설계되었다. CAR 작제물 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]은 마우스 단클론성 항체 FMC63에서 유래된 scFV 단편 (서열번호: 564)를 함유하는 이전에 기재된 CD19 CAR에 기반하여 설계되었다. 마지막으로, CAR 작제물 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643]은 KSHV 인코딩된 K8.1 단백질에 대한 항체에서 유래된 scFV 단편 (서열번호: 718)을 함유하고 음성 대조군으로서 사용되었다. 상기 CARs를 인코딩하는 렌티바이러스는 293FT를 사용하여 생성되었고 MPL CARs에 대하여 이전에 기재된 바와 같이 T 세포를 감염시키는데 사용되었다.
CD19-CARs는 T 세포의 표면에서 발현된다
정제된 T 세포는 MPL (CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467], CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470], CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471] 및 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643])을 표적하는 상이한 Myc-태깅된 CAR 작제물을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염되었고 푸로마이신으로 선택되었다. T 세포 (양쪽 선택된 및 선택되지 않은 푸로마이신)에서 CAR의 발현은 이전에 기재된 바와 같이 APC-접합된 Myc-항체로 면역형광 염색 이어서 FACS 분석에 의해 검사되었다. 도 17은 미감염된 T 세포 (UI; 점선으로 표시됨)에 비교된 경우 APC-Myc로 염색에 의해 결정된 바와 같이 T 세포의 표면에서 (회색 선으로 표시된) 상이한 CD19 CARs의 증가된 발현을 보여준다. 상이한 CAR 작제물의 발현은 푸로마이신 선택 이후 추가로 증가되었다.
CD19 CARs를 발현시키는 Jurkat 세포는 CD19-GGSG-NLuc 융합 단백질을 결합시킬 수 있다
Jurkat-NFAT-Luc 세포는 상이한 CD19 표적된 CAR 작제물로 안정적으로 형질도입되었고 푸로마이신에서 선택되었다. 세포는 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 [서열번호:2671] 상청액으로 인큐베이션되었고 광범위한 세정 후 이전에 기재된 바와 같이 본질적으로 NLuc 활성에 대하여 분석되었다. 도 18은 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 [서열번호:2671] 상청액에 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470], CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471] 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467], 및 CD19Bu12(vL-vH)-Myc-BBz-PAC-P08 CAR 작제물을 발현시키는 Jurkats의 강한 결합을 보여주고, 반면 상당한 결합은 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643] 대조군 CAR을 발현시키는 것 또는 친계 세포에서 관측되지 않았다.
CD19 CARs를 발현시키는 T 세포는 CD19-GGSG-NLuc 융합 단백질을 결합시킬 수 있다
정제된 T 세포는 상이한 CD19-표적된 CAR 작제물로 안정적으로 형질도입되었고 푸로마이신에서 선택되었다. 세포는 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 [서열번호:2671] 상청액으로 인큐베이션되었고 광범위한 세정 후 이전에 기재된 바와 같이 본질적으로 NLuc 활성에 대하여 분석되었다. 도 19는 FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 [서열번호:2671] 상청액에 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470], CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471] 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467], 및 CD19Bu12(vL-vH)-Myc-BBz-PAC-P08 CAR 작제물을 발현시키는 T 세포의 강한 결합을 보여주고, 반면 상당한 결합은 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643] 대조군 CAR을 발현시키는 것 또는 미감염된 T 세포 (UI)에서 관측되지 않았다.
CD19 CARs를 발현시키는 T 세포는 CD19-발현 RAJI 림프종 세포에서 세포독성을 유도한다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 CD19를 표적하는 표시된 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포는 선택되지 않은 채 방치되었거나 푸로마이신으로 선택되었고 팽창되었다. GLuc를 안정적으로 발현시키는 RAJI 세포는 96 시간 동안 10:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 CARs를 발현시키는 T 세포로 공배양되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 20은, 대조군 CAR 4C3을 발현시키는 것 또는 미감염된 T 세포 (T-UI)에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 표시하는, GLuc 활성에서 증가를 보여준다. 증가된 세포사는 푸로마이신으로 선택된 CD19 CAR-발현 T 세포 뿐만 아니라 선택되지 않았던 것에서 보여졌다.
CD19 CARs를 발현시키는 T 세포는 CD19-발현 RAJI 림프종 세포에서 세포독성을 유도한다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 CD19를 표적하는 표시된 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포는 선택되지 않은 채 방치되었거나 푸로마이신으로 선택되었고 팽창되었다. GLuc를 안정적으로 발현시키는 RAJI 세포는 4 시간 동안 표시된 이펙터:표적 (E:T) 비로 CARs를 발현시키는 T 세포로 공배양되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 21은, 대조군 CAR 4C3을 발현시키는 것 또는 미감염된 T 세포 (T-UI)에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 표시하는, GLuc 활성에서 증가를 보여준다. 이전의 부문에서 결과와 대조적으로, 증가된 세포사는 푸로마이신으로 선택된 CD19 CAR-발현 T 세포에서 주로 보여졌다. 이것은 세포사가 이전의 실시예에서 96 시간의 공-배양 후 측정되었다는 사실에 기인될 수 있고 반면 현행 실시예에서 단지 4 시간 후 측정되었다.
CD19MM-BBz 및 CD19Bu12-BBz CAR T 세포의 생체내 효능
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 CD19를 표적하는 표시된 CAR 작제물 또는 대조군 CAR (4C3)을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었고 푸로마이신 선택으로 (푸로와 함께) 또는 없이 (푸로 없음) 시험관내 팽창되었다. NSG 마우스 (Jackson Lab)은 175 cGy의 용량으로 아-치사적으로 조사되었다. 조사 24 시간 후 (2 일째), 마우스는 꼬리-정맥을 통해 2.5 x 104 RAJI 세포로 주사되었다. 3 일째, 마우스 (각각의 그룹에 대하여 n = 5)는 렌티바이러스를 인코딩하는 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470], CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]로 감염된 1 백만 T 세포로 치료되었고 푸로마이신으로 (푸로와 함께) 선택되었거나 선택되지 않은채 (푸로 없음) 방치되었다. 대조군 마우스 (n =5)는 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643] CAR을 발현시키는 1 백만 T 세포로 주사되었거나 T 세포가 주어지지 않았다. 도 22는 각각의 그룹에서 마우스의 생존을 보여준다. RAJI 세포 단독 및 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643]CAR-T 세포 주어진 마우스의 중앙 생존은 17 일 및 21 일 각각이었다. 그에 반해서, 푸로마이신 선택과 함께 그리고 선택 없이 CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471] CAR-T 세포를 받았던 마우스의 중앙 생존은 26 및 30 일, 각각이었다. 유사하게, 푸로마이신 선택과 함께 그리고 선택 없이 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470] CAR-T 세포를 받았던 마우스의 중앙 생존은 30 및 31 일, 각각이었다. 따라서, CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470], CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471] CARs를 발현시키는 T 세포의 주입은 T 세포가 주어지지 않은 마우스 또는 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(042315-N01)[서열번호:1643] 대조군 CAR을 발현시키는 T 세포 주어진 것에 비교된 경우 림프종의 이러한 RAJI 이종이식 모델에서 마우스의 생존에서 통계적으로 상당한 개선으로 이어진다.
다른 전략과 조합으로 또는 단독 사용된 경우 항-CD19 인간화된 CAR 작제물의 적용
본 발명의 인간화된 CARs는 그것의 안전성 및 효능을 향상시키기 위해 하기 방식으로 발현될 수 있다:
우리가 인간화된 CARs의 렌티바이러스 발현 방법을 사용하였어도, 대안적 방법 예컨대 세포 막에서 전기천공에 의한 또는 일시적 작은 변화에 의한 mRNA/DNA 형질감염의 용도는 표적 세포에서 이들을 발현시키는데 사용될 수 있다. mRNA 형질감염은 발현의 장수를 향상시키기 위해 천연 또는 안정화 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 유전자 전달용 대안적 방법, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련된 바이러스 벡터의 용도는 문헌에서 널리 기재되어 왔고 당해 분야의 숙련가에 공지된다. CMV, MSCV 등을 포함하는 인간화된 CAR의 발현용 대안적 프로모터는 문헌에서 기재되어 왔다.
본 발명의 CARs는, 환자 속에 주입을 위하여 사용되기 전 최종 T 세포 생성물의 클론 다양성을 감소시키기 위해 그리고 CAR-발현 세포를 양성으로 선택하기 위해, 적합한 선택 마커, 예컨대 EGFR, tEGFR, CD19, BCMA (서열번호: 853-856)의 세포외 도메인 서열로 또한 발현될 수 있다. CAR-T 세포 생성물의 클론-다양성에서 감소는 생성물에서 숙주-반응성 T 세포 클론의 개연성 및 수를 감소시킬수록 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 발병률 및 중증도에서 감소로 이어질 것이다. 칼시뉴린 억제제에 저항을 부여하는, 대안적 저항 유전자, 예컨대 CNB30 (서열번호: 852)는 GVHD의 발병률을 감소시키기 위해 환자 속에 주입을 위하여 사용되기 전 CAR-발현 세포를 양성으로 선택하기 위해 그리고 최종 T 세포 생성물의 클론 다양성을 감소시키기 위해 포함될 수 있다.
CD19 CAR-T 세포 요법의 제한 중 하나는, CD19 항원을 또한 발현시키는, 정상 B 세포의 장기간 고갈이다. 이러한 문제를 피하기 위해, cCD19 CAR-T 세포 요법은 CRIPS/Cas9, TALONS 또는 당해 기술에 공지되어 있는 다른 적합한 유전자 편집 방법을 사용하여 정상 조혈모세포에서 내인성 CD19의 넉아웃 또는 돌연변이와 조합될 수 있다. 현행 임상 용도에서 CD19 CAR-T 세포에 의해 결합된 CD19의 에피토프는 엑손 2-4에 맵핑되어 왔다. 따라서, 미스센스 또는 논센스 돌연변이는 CRISP/Cas9, Zn 핑거 뉴클레아제, Talons 또는 당해 분야에서 공지된 다른 방법을 사용하여 자가조직 또는 동종이계 조혈모세포의 엑손 2 (또는 CD19Bu12 및 CD19MM CAR T-세포에 의해 인식되는 다른 적합한 엑손/영역)에서 생성될 수 있다. 환자는 그의/그녀의 질환을 제어하기 위해 CD19 CAR-T 세포 주입 그리고 CD19 결실된/돌연변이된 조혈모세포를 사용하는 자가조직 또는 동종이계 이식이 주어질 수 있다. 변형된 줄기 세포로부터 기원할 B 세포가 CD19-CAR-T 세포에 의해 표적되지 않을 것임에 따라, 환자는 CD19 CAR-T 세포의 흔한 부작용인 B 세포 무형성증을 벗어날 것이다.
본 발명의 CD19 표적된 인간화된 CARs는 또한, CD19 항원의 손실로 인한 저항을 극복하기 위해, 다른 항원, 예컨대 CD22 및 CD20을 표적하는 CAR과 조합될 수 있다. 그와 같은 이중특이적 CARs는 문헌에서 기재되어 있고 당해 분야의 숙련가에 공지된다.
본 발명의 인간화된 CAR 작제물은 T 세포에서 뿐만 아니라 T 세포의 정의된 서브셋 예컨대 CD4 및 CD8 T 세포, 중심 메모리 T 세포, 미접촉 T 세포 및 조절 T 세포에서 발현될 수 있다. 이들은 또한 NK 세포, NK92 세포주, 조혈모세포, 및 iPSC 유래된 줄기 세포에서 발현될 수 있다.
그것의 활성을 제어하기 위해, 본 발명의 인간화된 CAR은 당해 분야에서 공지된 바와 같이 유도성 방식으로 발현될 수 있다 (Roybal 등, Cell 164:770-9, 2016; Wu 등, Curr Opin Immunol 35:123-30, 2015; Wu 등, Science 350:aab4077, 2015)). 대안적으로, 자살 유전자 (예컨대 이카스파제 9)는 생체내 CAR-T 세포의 활성을 제어하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 CAR-T 세포의 활성은 다양한 신호전달 경로, 예컨대 mTOR 및 PI3-AKT 경로의 억제제의 사용에 의해 추가로 조절될 수 있다. 게다가, 다양한 사이토카인, 케모카인 및 그것의 수용체, 및 공자극 리간드 (예를 들면 41BB) 및 그것의 수용체 (예를 들면 41BB-수용체 또는 CD137)은 본 발명의 인간화된 CAR로 공발현될 수 있다.
바이러스 및 세포 신호전달 단백질을 발현시키는 신규한 키메라 항원 수용체
이전에 논의된 바와 같이, 임상시험에서 CAR 작제물은 41BB, CD28 또는 양쪽에서 유래된 하나 이상의 공자극 도메인을 포함한다. 이들 공자극 도메인은 TNF (종양 괴사 인자) 계열 수용체의 세포질 신호전달 도메인에서 일반적으로 유래되고, 생체내 그것의 팽창 및 지속성을 초래하는, CAR-T 세포의 증가된 증식 및 생존에 기여한다고 믿어지는, 신호전달 경로, 예컨대 NF-κB 및 AKT를 활성화시킨다고 믿어진다. 그러나, 인공 수용체, 예컨대 CAR의 일부로서 발현된 경우 이들 공자극 도메인을 통한 긴장성 신호전달은 생리적이지 않고 이들이 유래되는 TNF 계열 수용체를 통해 신호전달을 제어하기 위해 정상적으로 존재하는 피드백 조절 기전의 제어 하에 있지 않는다. 따라서, 현행 CAR 작제물에서 존재하는 공자극 도메인에 의한 신호전달 경로의 강력한 및 지속적 활성화가, 현행 CAR-T 세포 기반된 요법의 주요 부작용인, 사이토카인 방출 증후군 및 신경적 독성에 기여한다는 것은 상상할 수 있다. 이러한 문맥에서 사이토카인 방출 증후군이 CD28 초-효능제 항체의 인간 임상시험에서 주요 부작용이었다는 것이 중요하다.
본 발명은 공자극 도메인 결실에 의해 현행 CAR 벡터의 상기 제한을 회피한다. 공자극 기능은 대신 다양한 예비-생존 신호전달 경로 및/또는 블록 세포사를 구성적으로 활성화시킨다고 공지되는 바이러스 및 세포 단백질에 의해 제공된다. 이러한 목적에 적합한 바이러스 단백질은 하기를 포함한다: (또한 인간 헤르페스바이러스 8로서 공지된) 카포시 육종 관련된 헤르페스바이러스에 의해 인코딩된 바이러스 FLICE 억제 단백질 (vFLIP) K13, 전염성 연속종 바이러스 (MCV)로부터 vFLIP MC159 및 MC160, 말 헤르페스바이러스 2 (EHV2)로부터 E8, 소 헤르페스바이러스 4에 의해 인코딩된 vFLIP, 헤르페스바이러스 메카카에 의해 인코딩된 vFLIP, 헤르페스바이러스 사이미리에 의해 인코딩된 vFLIP, cFLIP-L 동형체 또는 MRIT-α, cFLIP-p22 결실 돌연변이체 또는 MRIT-p22 , HTLV1-Tax, HTLV2-Tax 및 HTLV2-Tax-RS 돌연변이체 (Jeang, Cytokine Growth Factor Rev 12:207-17., 2001; Sieburg 등, J Virol 78:10399-409, 2004). 오늘 날 흔한 사용으로 CAR 작제물의 요소인 공자극 도메인에 의해 제공된 예비-생존 신호의 인공 및 비-생리적 성질과 대조적으로, 이들 신호전달 단백질은 이들이 발현되는 세포에 구성적 예비-생존 신호를 제공하도록 진화하였다.
KSHV-인코딩된 바이러스 FLICE 억제 단백질 K13은 T 세포를 불멸화시킨다
vFLIP K13은 본래 사망 수용체-유도된 세포자멸사로부터 KSHV-감염된 세포를 보호한다고 믿어졌다 (Bertin 등, Proc Natl Acad Sci U S A 94:1172-6, 1997; Hu 등, J Biol Chem 272:9621-4, 1997; Thome 등, Nature 386:517-21, 1997)). 그러나, K13이 IKK1/IKKα, IKK2/IKKβ 및 NEMO/IKKγ (Chaudhary 등, Oncogene 18:5738-46, 1999; Liu 등, J Biol Chem 277:13745-51., 2002)로 구성되는 ~700 kDa IkB 키나제 (IKK) 복합체와 상호작용함으로써 선택적으로 NF-κB 경로 (Chaudhary 등, Oncogene 18:5738-46, 1999; Chugh 등, Proc Natl Acad Sci U S A 102:12885-90, 2005)를 활성화시킨다는 것이 후속적으로 보고되었다. HTLV1-인코딩된 Tax 단백질은 NEMO/IKKγ에 결합시킴으로써 NF-κB 경로를 활성화시킨다고 또한 공지된다. Tax는 또한 T 세포를 불멸화시키는 것으로 나타났다 (Ren 등, J Biol Chem 287:34683-93, 2012; Robek and Ratner, J Virol 73:4856-65, 1999).
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), CD3+ve T 세포 및 CD3-ve 세포 (지정된 B 세포)는 10ng/ml 가용성 항-CD3, 10 ng/ml 가용성 항-CD28 및 100 IU 재조합 인간-IL2로 대체된 XVIVO 배지 (Lonza)에서 배양되었다. 세포는 37℃에, 5% CO2 가습된 인큐베이터에서 배양되었고, 1 일 후 블라스티사이딘 저항 유전자를 운반하는 비어있는 렌티바이러스 벡터 (pLENTI) 및 C-말단 플래그-태깅된 K13을 발현시키는 렌티바이러스 벡터 (pLENTI-K13-FLAG), NF-κB 활성 (Matta 등, Oncogene 27:5243-53, 2008)이 부족한 것으로 공지되는 K13의 결실 돌연변이체 (pLENTI-K13△45-48-FLAG), 및 HTLV1-Tax 단백질 (pLENTI-Tax)로 감염되었다. K13의 뉴클레오타이드 및 단백질 서열은 서열번호: 866 및 2629, 각각에서 제공된다. 감염 대략 1 일 후, 세포는 블라스티사이딘으로 선택되었다. 선택 후, 세포는 XVIVO 배지에서 성장되었고 IL2는 제거되었다. 표 26은 양쪽 PBMC 및 T 세포가 IL2 회수 후 오래 배양물에서 계속 증식되는 K13-Flag 및 HTLV1-Tax 인코딩 벡터로 감염시켰고, 반면 장기간 증식 세포가 비어있는 렌티바이러스 벡터로 감염된 배양물 또는 K13△45-48-FLAG 인코딩 벡터로 감염된 것으로 수득되지 않았다는 것을 보여준다. 이들 결과는 HTLV1-Tax와 유사한, K13이 1차 T 세포 및 PBMC의 장기간 증식 및 불멸화를 촉진시킬 수 있고 이의 NF-κB 활성이 이 과정에 필수적인 것을 입증한다.
Figure pct00070
T 세포의 생존한 배양물에서 K13-FLAG의 발현은 FITC-접합된 FLAG 항체로 면역형광 염색 이어서 FACS 분석에 의해 검사되었다. 도 23은 미감염된 T 세포에 비교된 경우 K13-발현 T 세포에서 FITC-FLAG 항체로 증가된 염색을 보여준다. K13 불멸화된 T 세포의 면역표현형은 CD4 및 CD8 항체로 염색에 의해 검사되었다. 도 23은 K13 불멸화된 T 세포가 CD8+/CD4- (49%), CD8-/CD4+ (21%) 및 CD8+/CD4+ (29%)인 것을 보여준다. 그에 반해서, 배양물에서 지속하는 대다수의 미감염된 T 세포는 CD8+/CD4- (94%)이었다. 미감염된 및 K13-불멸화된 T 세포 사이 CD69의 발현에서 유의차는 없었다.
K13을 발현시키는 FMC63 CAR은 RS4;11 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 수용력을 보유한다
T 세포는 GFP, CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(070814-D06)[서열번호:3535], CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467], 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(111014-Y11)[서열번호:1197]을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었다. PAC 함유 벡터로 감염된 세포는 푸로마이신으로 선택되었거나 선택되지 않은 채 방치되었다. 도 24는 푸로마이신으로 선택된 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467], 및 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(111014-Y11)[서열번호:1197]-발현 T 세포가 Gluc 검정에 의해 측정된 경우 RS411 세포의 특이적 용해를 유도한다는 것을 보여준다.
K13, MC159 또는 Tax2를 함유하는 CAR을 발현시키는 T 세포는 RAJI-Gluc 세포의 특이적 용해를 유도한다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 CD19를 표적하는 하기 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다. 작제물의 피쳐는 아래와 같다:
CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467]: 푸로마이신 저항 유전자로부터 T2A 서열에 의해 분리된 CD3z 도메인 및 41BB 공자극 도메인을 함유하는 표준 FMC63 기반된 종래의 CAR II.
CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-T2A-PAC(111214-D05)[서열번호:3538]: 41BB 공-자극 도메인이 부족하고 CD3z 활성화 도메인을 함유하는 FMC63-기반 종래의 CAR I.
[CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(111014-Y11)[서열번호:1197]: 41BB 공자극 도메인 및 CD3z 도메인, P2A 절단가능 링커, K13-Flag 서열, T2A 절단가능 링커, 및 푸로마이신 저항 유전자를 함유하는 표준 FMC63 기반된 종래의 CAR II.
CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(111614-B05)[서열번호:927]: CD3z 도메인, P2A 절단가능 링커, K13-Flag 서열, T2A 절단가능 링커, 및 푸로마이신 저항 유전자를 함유하는 표준 FMC63 기반된 종래의 CAR I.
CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-MC159-Flag-T2A-PAC(111014-Z13)[서열번호:1751]: 41BB 공자극 도메인 및 CD3z 도메인, P2A 절단가능 링커, MC159-Flag 서열, T2A 절단가능 링커, 및 푸로마이신 저항 유전자를 함유하는 표준 FMC63 기반된 종래의 CAR II.
CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-MC159-Flag-T2A-PAC(112614-C06)[서열번호:1750] CD3z 도메인, P2A 절단가능 링커, MC159-Flag 서열, T2A 절단가능 링커, 및 푸로마이신 저항 유전자를 함유하는 표준 FMC63 기반된 종래의 CAR I.
CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-Flag-HTLV2-TAX-RS-T2A-PAC(010100-N01)[서열번호:1752]: 41BB 공자극 도메인 및 CD3z 도메인, P2A 절단가능 링커, HTLV2-인코딩된 TAX의 RS 돌연변이체, T2A 절단가능 링커, 및 푸로마이신 저항 유전자를 함유하는 표준 FMC63 기반된 종래의 CAR II.
세포는 선택되지 않은 채 방치되었거나 푸로마이신으로 선택되었고 팽창되었다. Gluc를 안정적으로 발현시키는 RAJI 세포는 4 시간 동안 10:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 CARs를 발현시키는 T 세포로 공발현되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 25는, 4C3 (서열번호: 1643)을 표적하는 대조군 CAR을 발현시키는 것 또는 미감염된 T 세포 (T-UI)에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후, 표적 세포의 용해를 표시하는, GLuc 활성에서 증가를 보여준다. 이들 결과는 K13, MC159 또는 HTLV2-Tax (Tax2)의 편입이 41BB 도메인의 존재와 함께 또는 존재 없이 CARs의 사멸 능력에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
상기 실험은 1:1의 E:T 비로 반복되었고 세포사는 48 시간 후 분석되었다. 도 26은 K13, MC159 또는 HTLV2-Tax (Tax2)의 편입이 41BB 도메인의 존재와 함께 또는 존재 없이 CARs의 사멸 능력에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 확인한다.
실험은 푸로마이신으로 선택된 세포로 반복되었고 대략 2 개월 동안 배양물에 있었다. 도 27은 MC159 및 HTLV2-Tax를 함유하는 CAR을 발현시키는 T 세포가 배양물에서 2 개월 후 세포독성을 계속해서 발휘하고 반면 다른 CARs를 발현시키는 T 세포가 이 능력을 상실하였다는 것을 보여준다.
vFLIPs 및 Tax를 함유하는 CAR T 세포의 생체내 효능
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 CD19를 표적하는 표시된 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다. NSG 마우스 (Jackson Lab)는 175 cGy의 용량으로 아-치사적으로 조사되었다. 조사 24 시간 후 (2 일), 마우스는 꼬리-정맥을 통해 2.5 x 104 RAJI 세포로 주사되엇다. 3 일째, 마우스 (각각의 그룹에 대하여 n =3)은 CAR 인코딩 렌티바이러스로 감염된 1 백만 T 세포로 치료되었다. 표 27은 각각의 그룹에서 마우스의 생존을 보여준다. 이들 결과는 최고 생존 (38 일)이 41BB 공자극 도메인이 부족하지만 K13을 발현시키는 FMC63 기반된 CAR CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(111614-B05)[서열번호:927]을 발현시키는 T 세포로 주사된 마우스에서 관측되는 것을 입증한다.
Figure pct00071
FKBP로 융합에 의한 K13의 유도성 발현
K13의 발현을 제어하기 위해, 상이한 벡터는 N-말단 FKBP-기반 스위치 또는 이량체화 도메인의 1 또는 2 카피와 융합으로 K13을 발현시켜 생성되었다. 또한, FKBP 도메인의 2 카피가 미리소틸화 신호로 N-말단에서 그리고 K13으로 C-말단에서 융합된 작제물은 작제되었다. K13의 상기 작제물은 단독으로 또는 상이한 CAR 작제물을 발현시키는 작제물에서 발현되었다.
NF-κB 리포터 검정은 기재된 바와 같이 본질적으로 수행되었다 (Chaudhary 등, Oncogene 18:5738-46, 1999). 표시된 작제물은 NF-κB 결합 부위의 4 카피에 의해 유도된 루시퍼라아제 리포터 작제물 및 RSV-LacZ 리포터 작제물과 함께 293FT 세포에서 일시적으로 형질감염되었다. 세포는 미치료된채 방치되었거나, K13 신호전달의 활성화를 초래하는, FKBP 도메인을 이량체화하는, AP20187로 치료되었다. 대략 24 시간 후, 세포는 용해되었고 NF-κB-Luc 및 LacZ 활성은 세포 용해물에서 측정되었다. NF-κB-Luc 활성은 LacZ 활성에 비해 정규화되어 형질감염 효율에서 차이에 대하여 제어하였다. 도 28A에서 나타낸 바와 같이, AP20187 (100 nM)로 치료는 K13이 FKBP와 융합하여 발현되었던 모든 작제물에서 K13-유도된 NF-κB-Luc 활성의 증가로 이어졌다. 본질적으로 유사한 결과는 HTLV2 인코딩된 Tax의 RS 돌연변이체가 FKBP와 융합하여 발현된 경우 수득되었다 (도 28B). 따라서, K13 및 Tax의 활성은 이들이 단독 또는 CAR 작제물의 일부로서 발현되는 경우 FKBP와 융합 및 AP20187의 후속 투여에 의해 제어될 수 있다.
AP20187에 의한 K13 활성의 활성화는 세포사를 유도하기 위한 CARs의 능력을 손상시키지 않는다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 작제물 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-PAC(112316-S06) [서열번호:1770] 및 CD8SP-161-(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-PAC(112916-U06) [서열번호: 1741]을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었고 이전에 기재된 바와 같이 푸로마이신으로 선택되었다. Gluc를 안정적으로 발현시키는 RAJI 및 HEL 세포는 100nM AP20187 (AP) 화합물의 부재 및 존재 하에 4 시간 동안 10:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 표시된 작제물 [서열번호:1770] 및 [서열번호: 1741], 각각을 발현시키는 T 세포 또는 미감염된 T 세포 (UI)로 공감염되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 29A 및 29B는 AP20187의 첨가에 의한 K13-매개된 NF-κB 활성의 활성화가 FKBP-K13을 공발현시키는 2 CAR 작제물에 의해 유도된 세포 사멸에 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다.
K13, MC159, HTLV2-Tax 및 HTLV2-Tax RS 돌연변이체를 공발현시키는 CARs I 및 II의 세포독성 활성
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 MPL을 표적하는 CAR I 및 II를 발현시키는 표시된 작제물을 발현시키는 그리고 상이한 액세서리 모듈을 공발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다 (도 30A). 세포는 이전에 기재된 바와 같이 푸로마이신으로 선택되었다. Gluc를 안정적으로 발현시키는 HEL 세포는 4 시간 동안 10:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 표시된 작제물을 발현시키는 T 세포 또는 미감염된 T 세포 (UI)로 공배양되었다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 GLuc의 증가에 의해 분석되었다. 도 30A는 K13, MC159, HTLV2-Tax 및 HTLV2-Tax RS 돌연변이체를 공발현시키는 상이한 MPL-유도된 CAR 작제물에 의한 표적 세포사의 유도를 보여준다.
본질적으로 유사한 실험은 CD32를 표적하는 CAR I을 발현시키는 그리고 K13을 공발현시키는 작제물 (서열번호: 983)으로 수행되었다. 도 30B는 Gluc 검정에 의해 측정된 경우 이러한 작제물을 발현시키는 T 세포에 의한 HEL 세포사의 효과적인 유도를 보여준다.
TROP2를 표적하는 종래의 CARs I을 포함하는 그리고 K13을 공발현시키는 백본 1 작제물의 세포독성 활성
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 TROP2를 표적하는 작제물 CD8SP-TROP2-h7E6-SVG-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(052616-D04)[서열번호:1166]을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었고 푸로마이신으로 선택되었고 이전에 기재된 검정을 사용하여 GLuc를 발현시키는 PC3 (전립선 암) 세포를 사멸시키기 위한 능력에 대하여 시험되었다. 도 31은 CD8SP-TROP2-h7E6-SVG-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(052616-D04)[서열번호:1166] 작제물을 발현시키는 T 세포에 의한 PC3 세포의 효과적인 사멸을 보여준다.
LAMP1을 표적하는 종래의 CARs I을 포함하는 그리고 K13을 공발현시키는 백본 1 작제물의 세포독성 활성
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 LAMP1을 표적하는 표시된 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었고 푸로마이신으로 선택되었다. 세포는 이전에 기재된 검정을 사용하여 GLuc를 발현시키는 L363 및 U266 세포를 사멸시키기 위한 능력에 대하여 시험되었다. 도 32A 및 32B는 CD8SP-LAMP1-humab1-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(051716-T05)[서열번호:1104] 및 CD8SP-LAMP1-Mb4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(051916-B07)[서열번호:1105] 작제물을 발현시키는 T 세포에 의한 L363 및 U266 세포의 효과적인 사멸을 보여준다.
CD19-유도된 CAR을 발현시키는 그리고 FKBP-K13 융합 단백질을 공발현시키는 Jurkat 세포에서 AP20187의 첨가에 의한 K13 신호전달의 활성화
CAR-유도된 NFAT 신호전달에서 K13 유도된 NF-κB 활성의 유도의 효과는, Jurkat-NFAT-GFP 세포 (JP)에서, CD19를 표적하는 종래의 CAR I을 인코딩하는 그리고 FKBP-K13-FLAG 융합 단백질을 발현시키는, 작제물 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-PAC(112316-S06)[서열번호:1770]을 안정적으로 발현시킴으로써 연구되었다. 친계 Jurkat-NFAT-GFP 세포 (JP) 세포 및 작제물 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-PAC(112316-S06)[서열번호:1770]을 발현시키는 것은 대략 18 시간 동안 100 nM AP20187의 부재 및 존재 하에 RAJI 세포로 공배양되었고 NFAT-유도된 GFP 발현의 유도는 이전에 기재된 바와 같이 FACS 분석에 의해 검사되었다. 도 33은 AP20187 화합물의 부재 (38.7% GFP-발현 세포) 및 존재 (45.85% GFP 발현 세포) 하에 RAJI 세포로 공배양시 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-z-P2A-FKBP-K13-FLAG-T2A-PAC(112316-S06)[서열번호:1770] 작제물을 발현시키는 Jurkat 세포에서 GFP 발현의 효과적인 유도를 보여준다. 그에 반해서, 상당한 GFP 유도는 AP20187 화합물의 부재 또는 존재 하에 RAJI 세포로 친계 Jurkat-NFAT-GFP 세포 (JP) 세포의 공-배양시 관측되지 않았다. 이들 결과는 AP20187 화합물의 첨가에 의해 FKBP-K13 융합 단백질을 발현시키는 T 세포에서 K13 신호전달의 활성화가 CAR-유도된 NFAT 신호전달의 활성화에 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 입증한다.
NF-κB 활성의 다양한 수준을 가진 K13 돌연변이체의 생성
입양 세포 요법 및 기타 적용의 목적을 위하여 NF-κB 활성의 다양한 수준을 가진 K13의 신규한 돌연변이체를 갖는 것이 유용할 것이다. 부위-유도된 돌연변이유발은 K13 (서열번호:2629)의 상이한 아미노산이 돌연변이된 K13의 몇 개의 점 돌연변이체를 생성하기 위해 Quickchange 부위-유도된 키트 (Stratagene)을 사용하여 수행되었다. 예를 들어, 돌연변이체 K19A에서 위치 19에 아미노산 라이신은 알라닌으로 돌연변이된다. 야생형 및 다양한 돌연변이체 작제물은 NF-κB 결합 부위의 4 카피에 의해 유도된 루시퍼라아제 리포터 작제물 그리고 기재된 (Chaudhary 등, Oncogene 18:5738-46, 1999) 바와 같이 본질적으로 RSV-LacZ 리포터 작제물과 함께 293FT 세포에서 형질감염되었다. 대략 24 시간 후, 세포는 용해되었고 NF-κB-Luc 및 LacZ 활성은 세포 용해물에서 측정되었다. NF-κB-Luc 활성은 LacZ 활성에 비해 정규화되어 형질감염 효율에서 차이에 대하여 제어하였다 (Chaudhary 등, Oncogene 18:5738-46, 1999). 도 34는 많은 돌연변이체가 야생형 K13에 비교된 경우 NF-κB 활성에서 증가 (예를 들면 E48A 돌연변이체) 또는 감소 (예를 들면, E47A 돌연변이체)를 갖는 것을 보여준다. 이들 돌연변이체는 NF-κB 활성의 다양한 수준이 요구되는 입양 세포 요법 및 기타 적용에서 응용할 것이다. 따라서, 돌연변이체 E48A는 강한 NF-κB 활성이 바람직한 CAR 작제물에서 공발현될 수 있고 반면 돌연변이체 R50A는 단지 보통의 NF-κB 활성이 바람직한 CAR 작제물에서 공발현될 수 있다. 이들 돌연변이체의 활성은 또한 야생형 K13에 대하여 상기 기재된 바와 같이 FKBP 도메인 (서열번호: 2621 및 2622)와 이들의 융합에 의해 제어될 수 있다.
Src 억제제 다사티닙, 포나티닙 및 A-770041로 CAR-T 세포, 이중특이적 T 세포 연관체 (BiTEs) 및 DARTs (이중 친화도 Re-표적 단백질)의 활성의 억제 방법
CAR
CARs는 항체 결합 특이성을 T 세포 기능성과 조합하는 합성 수용체이다. CARs는 T 세포 이펙터 기능의 활성화를 가능하게 하기 위해 T 세포 수용체의 CD3z 쇄의 세포내 신호전달 요소로 원하는 종양 항원의 특이적 인식을 언급하는 단일 쇄 항체 (scFv)의 융합에 의해 생성된다. CAR에 의한 TAA의 HLA- 독립적 인식은 내성 유도 기전을 최소화하고 뿐만 아니라, 세포 표면에서 비-단백질 모이어티를 포함하는 사실상 임의의 항원을 인식하는 CARs의 다용도 설계를 허용한다. CARs가 CD3z 쇄를 통해 T 세포를 활성화시켜도, CARs를 통한 신호전달은 이들이 TCR 복합체의 요소 모두를 관여시키지 않음에 따라 정상 T 세포 수용체 (TCR)을 통한 신호전달과 상이하다. 예를 들어, 정상 TCR을 통한 신호전달은 몇 개의 분자, 예컨대 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, 및 CD4 또는 CD8 뿐만 아니라 그것의 관련된 다운스트림 신호전달 단백질, 예컨대 Lck, LAT, ZAP70 및 SLP-76 (Chakraborty, AK and Weiss, A Nat Immunol 15:798-807,2014)의 참여를 초래한다. 임의의 이들 수용체 및 신호전달 중간체가 키메라 항원 수용체 (CAR)를 통해 신호전달에서 관여되는지는 불확실하다. CAR을 통한 신호전달이 정상 TCR을 통한 신호전달과 구별된다는 언급은 CAR의 주입 이후 관측된 부작용 대 환자내 TCR의 주입 후 관측된 것으로부터 분명하다. 사이토카인 방출 증후군 (CSR) 및 신경적 합병증이 CAR-T 세포의 주입 이후 빈번하게 관측되는 반면, 이들은 특정 항원, 예컨대 NY-ESO에 대한 TCR을 발현시키도록 조작된 T 세포의 주입 후 또는 종양 침윤 림프구의 주입 이후 보여지지 않는다 (Brentjens, Blood 118:4817-28, 2011; Rapoport 등, Nat Med 21:914-21, 2015; Robbins 등, Clin Cancer Res 21:1019-27, 2015; Sadelain 등, Curr. Opin. Immunol. 21:215-23, 2009; Turtle 등, Curr. Opin. Immunol. 24:633-39, 2012).
이중특이적 T 세포 연관체 (BiTE)
이중특이적 T 세포 연관체 (BiTE®) 항체 작제물은 악성 세포를 검출 및 표적하기 위해 바디의 면역계를 도움으로써 암과 싸우기 위하여 조사되고 있는 면역요법의 한 유형이다. 변형된 항체는 2 상이한 표적을 동시에 연관시키도록 설계되어, 그렇게 함으로써 T 세포 (위협으로서 감지된 다른 세포를 사멸시킬 수 있는 백혈구의 한 유형)을 암 세포에 병치시킨다. BiTE® 항체 작제물은, T 세포에 독소 주사하게 하고 암 세포를 죽도록 유발시킬 (세포자멸사) 의도로, 표적된 세포의 범위 내에 T 세포 배치를 돕는다. BiTE® 항체 작제물은 다양한 암을 치료하기 위한 그것의 잠재력에 대하여 현재 조사중이다. 블린사이토 (블리나투모맙)은 B-계통 기원의 세포의 표면에서 발현된 CD19 그리고 T 세포의 표면에서 발현된 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 CD19-유도된 CD3 T 세포 연관체 (BiTE®) 항체 작제물이다. BiTEs, 예컨대 블리나투모맙이 T 세포를 활성화시켜도, 이들은 TCRα 및 TCRβ 쇄보다 TCR의 CD3 쇄에 결합하고, 따라서 BiTEs를 통한 신호전달은 생리적이지 않고 정상 T 세포를 통한 신호전달과 동일하지 않다.
CAR T 세포 및 이중특이적 항체의 제한
조작된 CAR T 세포 및 블리나투모맙에 반응하는 다수의 환자에서, 전염증 사이토카인의 과도한 방출은 열, 저혈압, 저산소혈증, 심장 기능이상, 신부전 및 전해질 비정상, 집합적으로 일명 "사이토카인 방출 증후군' (CRS)으로서 포함하는 증상을 야기시킨다. 수많은 이들 환자는 압력 지지 및 인공 환기를 위하여 집중 치료실에 접근을 요구한다. 상당한 수의 사례 (최대 50%)에서, CAR T 세포 및 블리나투모맙 요법은 떨림, 발작을 포함하는 신경 증상으로 이어질 수 있고 치명적일 수 있다. 예를 들어, 임상시험에서 블리나투모맙을 받는 환자의 대략 50%는 신경적 독성을 경험하였다. 중증, 생명 위협, 또는 치명적 신경적 독성은, 뇌병증, 경련, 말 장애, 의식의 장애, 혼란 및 방향감각상실, 및 협응 및 밸런스 장애를 포함하여, 환자의 대략 15%에서 발생하였다. CRS를 무효화하기 위한 전략은 사이토카인 방출 및/또는 활성을 차단하기 위해 사이토카인에 대한 항체 및 면역억제제로 치료를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 치료-관련된 사망은 많은 협회에서 발생하였다. 따라서, CAR T 세포 및 블리나투모맙의 활성을 제어하기 위해 신규한 약물/제제에 대한 미충족 및 긴급한 필요성이 있다.
생리적 T 세포 및 NK 기능의 억제제로서 다사티닙
이중 BCR-ABL/Src 키나제 억제제 다사티닙은 만성 골수성 백혈병 및 Ph+ 급성 림프아구성 백혈병의 치료를 위하여 FDA 승인된다. Src 키나제는 생리적 T-세포 활성화에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지된다. 이와 일치하여, 다사티닙은 항원 특이적 생리적 T-세포 활성화, 증식, 사이토카인 생산, 및 용량-의존적 방식으로 탈과립화를 완전히 억제시키는 것으로 나타났다 (Schade 등, Blood 111:1366-77, 2008; Weichsel 등, Clin Cancer Res 14:2484-91, 2008). 다사티닙은 또한 NK 세포의 활성화를 억제시키는 것으로 나타났다. 그러나, CAR 변형된 T 세포 및 BiTE가 생리적 T 세포 수용체 (상기 참고)를 연관시키지 않기 때문에, 다사티닙이 BiTE를 통해 활성화된 T 세포 및 CAR-T 세포의 활성을 조절하는데 사용될 수 있는지는 명확하지 않다.
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 표시된 CAR 작제물 targeting CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었고 푸로마이신으로 선택되었다. CAR-T 세포는 37℃에서 대략 30 분 동안 다사티닙 및 이마티닙의 표시된 농도로 사전-인큐베이션되었다. 약물-처리된 및 미처리된 T 세포는 백색 384-세포 플레이트에서 플레이팅되었다. GLuc를 안정적으로 발현시키는 RAJI 세포는 30K 세포/30μl/ 웰의 농도로 T 세포를 함유하는 웰에 첨가되어 E:T 비 5:1을 제공하였다. 다사티닙 (Das) 및 이마티닙 (Imat)는 웰에 첨가되어 최종 농도를 표시된 대로 유지시켰다. 공-배양의 4 시간 후, 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 원상태 코엘로엔트라진을 함유하는 0.5X CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 도 35는 50nM 및 100nM 다사티닙에 의한 CAR CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]-유도된 세포사의 억제를 보여주고, 반면 이마티닙은 효과가 없다.
CAR 변형된 T 세포에 의해 유도된 세포사에서 상이한 티로신 키나제 억제제의 효과
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 인간 andCD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] 및 CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471])을 표적하는 표시된 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었다. GLuc를 안정적으로 발현시키는 RAJI 세포는 상기 기재된 바와 같이 본질적으로 티로신 키나제 억제제 (TKI) 다사티닙, 이마티닙, 닐로티닙, 포나티닙 및 악시티닙의 표시된 농도의 존재 및 부재 하에 CARs를 발현시키는 T 세포로 대략 4 시간 동안 공-배양되었다. 이들 억제제 중에서, 다사티닙 및 포나티닙은 Src 키나제에 대한 활성을 갖는 것으로 보고되었고, 반면 다른 것들은 이 활성이 부족하다. 표적 세포의 용해의 CAR-T 세포 매개된 유도는 원상태 코엘로엔트라진 (Nanolight)를 함유하는 0.5X CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 상승효과 플레이트 리더에 의해 측정된 경우 GLuc 활성의 증가에 의해 분석되었다. 최대 세포사의 측정을 위하여, 세포는 Gluc 활성의 측정에 앞서 대략 90 분 동안 30μl의 디기토닌 (최종 농도 30 μg/ml)로 치료되었다. % 특이적 용해는 디기토닌-유도된 세포사를 100%로서 그리고 미치료된 세포를 0%로서 취함으로써 계산되었다. % 특이적 용해 계산의 식은 하기이다: % 특이적 용해 = 100 x [(실험적 데이터) - (자발적인 세포사))] / [(최대 세포사) - 자발적인 세포사)]. 도 36은 상이한 CD19-CAR-T 세포에 의해 표적 세포의 용해를 표시하는 미감염된 T 세포 (T-UI)에 비교된 경우 CD19-특이적 CARs CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(112014-A13)[서열번호:1467] 및 CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(062915-D03)[서열번호:1471]을 발현시키는 T 세포로 공-배양 이후 GLuc 활성에서 증가를 보여준다. 그러나, CD19-CAR-T 세포 유도된 세포사는 50nM 다사티닙으로 치료에 의해 부분적으로 차단되었고 100nM 다사티닙으로 치료에 의해 완전히 차단되었다. 유사하게, CD19-CAR-T 세포-유도된 세포사는 100 nM 포나티닙으로 치료에 의해 부분적으로 차단되었다. 그러나, 이마티닙 (50nM 및 500nM), 닐로티닙 (10nM 및 100nM), 및 악시티닙 (1μM 및 10μM)의 표시된 용량으로 치료는 CAR-T 세포 유도된 세포사에서 효과가 없었다. 이들 결과는 Src에 대한 활성을 가진 TKI가 CAR-T 세포 유도된 세포사를 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 입증한다. 상기 연구에서 사용된 것보다 더 높은 용량의 이마티닙 및 닐로티닙으로 치료가 CAR-T 세포-유도된 세포사를 차단할 수 있다는 것이 또한 가능하다.
다사티닙은 CD22를 표적하는 CAR에 의해 유도된 세포사를 차단한다
CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포는 인간 CD22 (CD8SP-CD22-m971-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(091515-A02)[서열번호:1519])를 표적하는 CAR 작제물을 발현시키는 렌티바이러스로 감염되었고 푸로마이신으로 선택되었다. RAJI-GLuc 세포의 푸로마이신 선택된 CD22 CAR-T 세포 유도된 사망에서 다사티닙의 효과는 이펙터 및 표적 세포의 공-배양의 96 시간 후 검사되었다. 도 37은 다사티닙이 GLuc 검정에 의해 결정된 경우 CD8SP-CD22-m971-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(091515-A02)[서열번호:1519] CAR을 발현시키는 T 세포에 의해 RAJI-GLuc 세포의 사멸을 효과적으로 차단시킨다는 것을 보여준다.
다사티닙은 CAR을 발현시키기 위해 변형된 것 그리고 친계 NK92MI 세포에 의해 유도된 세포독성을 차단한다
NK92 세포는 수많은 암의 치료를 위하여 임상 개발 중이다. 다사티닙이 NK92 세포의 활성을 차단할 수 있는지를 시험하기 위해, NK92MI 세포 (IL2를 발현시키는 NK92 세포의 유도체)는 다사티닙의 표시된 농도의 부재 및 존재 하에 K562-Gluc 세포로 공-배양되었다. 표적 세포는 흑색 96-세포 플레이트에서 100K 세포/100μl/ 웰의 농도로 플레이팅되었고 미치료된 채 방치되었거나 30 분 동안 다사티닙의 2 상이한 용량 (50nM 및 100nM)로 치료되었고 이어서 4 시간 동안 0.5:1의 E:T 비로 NK92MIMI 이펙터 세포와 표적 세포가 공-배양되었다. 도 38A는 다사티닙이 Gluc 검정에 의해 결정된 경우 K562 세포의 NK92 세포 매개된 사망을 차단한다는 것을 보여준다.
다사티닙이 CAR을 발현시키도록 조작된 NK92 세포에 의해 유도된 세포사를 또한 차단할지를 시험하기 위해, NK92MI 세포는 CD19를 표적하는 CAR CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(070814-D06)[서열번호:3535]를 발현시키도록 조작되었다. CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(070814-D06)[서열번호:3535] CAR을 발현시키는 NK92MI 세포는 4 시간 동안 다사티닙의 부재 및 존재 하에 CD19 양성 RAJI-GLuc 표적 세포로 공-배양되었고 세포사는 GLuc 검정에 의해 측정되었다. 도 38B는 다사티닙이 Gluc 검정에 의해 결정된 경우 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-EGFP(070814-D06)[서열번호:3535] CAR-발현 NK92MI 세포에 의해 RAJI-GLuc 세포의 사망을 차단한다는 것을 보여준다.
다사티닙은 블리나투모맙 (블린사이토) 유도된 세포사 및 사이토카인 생산을 차단한다
(Miltenyi Biotech로부터 CD3 마이크로비드에 의해 단리된) 이펙터 T-세포는 미치료된 채 방치되었거나 37℃에서 1 시간 동안 50nM 또는 100nM 다사티닙으로 사전인큐베이션되었고 이어서 U-바닥 96-웰 플레이트에서 세포가 플레이팅되었다. RAJI-MSCVhygro-Gluc 표적 세포는 PBS/2% FBS에서 37℃에 30 분 동안 100ng/106 세포로 이중특이적 항체 (블리나투모맙 또는 블린사이토; AMGEN)으로 인큐베이션되었다. 다음으로, 블리나투모맙-치료된 RAJI-Gluc 또는 미치료된 (대조군) RAJI-Gluc 세포는 PBS에서 3회 세정되었고, XVIVO 배지에 재-현탁되었고 100 μl (100K) 세포는 다사티닙의 표시된 농도의 부재 및 존재 하에 96-웰 U-최하부 플레이트의 웰당 플레이팅되었다 (1:1의 이펙터:표적 비). 각각의 웰에서 총 용적은 배지로 200 μl로 조정되었다. 플레이트는 빠르게 원심분리되어 세포를 침강시켰고, 96 시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에 인큐베이션되었다. 최대 세포사를 위하여, GLuc 세포사 검정 실시에 1 시간 앞서, 디기토닌 (스톡 1mg/ml, Sigma)의 6 μl의 총 용적은 표적 세포를 단독 함유하는 웰에 첨가되어 디기토닌의 30μg/ml의 최종 농도를 달성하였다. 플레이트는 1,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리되었고 50μl의 상청액은 Greiner 384-웰 편평한 바닥 백색 불투명한 플레이트에 전달되었다. 루시퍼라아제 활성은 웰 방식으로 384 웰 플레이트 속에 원상태 코엘로엔트라진 (Nanaolight)를 함유하는 0.5X CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 상승효과 플레이트 리더에 의해 측정되었다. 도 39A는 T 세포의 존재 하에 블리나투모맙으로 치료가 100nM 다사티닙에 의해 효과적으로 차단되는 RAJI-GLuc 세포의 사망의 강한 유도를 초래한다는 것을 보여준다. 상기 실험으로부터 상청액은 ELISA에 의해 IFNγ 생산의 측정을 위하여 또한 분석되었다. 도 39B는 T 세포의 존재 하에 블리나투모맙으로 RAJI-GLuc 세포의 공-배양이 100nM 다사티닙에 의해 효과적으로 차단되는 IFNγ 생산의 강한 유도를 초래한다는 것을 보여준다.
CAR T 세포 및 블리나투모맙 유도된 세포사에서 룩솔리티닙, 포사타마티닙 및 알리세팁의 효과
RAJI-pLenti-GLuc 세포의 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470] -발현 CAR T 세포- 및 블리나투모맙-유도된 사망에서 룩솔리티닙 (JAK-1/2 억제제), 포사타마티닙 (syk 억제제) 및 알리세팁 (아우라라 키나제 억제제)의 효과는 상기 기재된 바와 같이 검정을 사용하여 연구되었다. 도 40A는 CAR T 세포로 공-배양되지 않았던 RAJI-pLenti-Gluc 세포에서 다양한 약물의 상당한 독성 효과 없음을 보여준다. RAJI--pLenti-Gluc 세포가 CAR-T 세포로 인큐베이션되는 경우, 도 40B는, Gluc 활성에서 증가에 의해 측정된 경우, 세포사의 상당한 유도를 보여준다. 도 40B는 또한 배지 (Med) 단독으로 치료된 세포에 비교된 경우 룩솔리티닙, 포사타마티닙 및 알리세팁에 의한 RAJI-pLenti-GLuc 세포의 -CAR-T 세포-유도된 사망의 온화한 내지 보통의 억제를 보여준다. 다사티닙은 양성 대조군으로서 사용되었고 RAJI 세포의 CAR-T 세포-유도된 사망의 상당한 억제로 이어졌다. 도 40C는 상기 화합물이 표시된 농도로 T 세포에 의해 매개된 블리나투모맙 유도된 세포사에서 단지 최소 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
CAR T 세포- 및 블리나투모맙-유도된 세포사에서 A-770041, 사라카티닙, 아바시마이브의 효과
A-770041은, T 세포 활성화 및 IL2 생산에 요구되는, src 계열의 8 구성원 중 하나인, LCK의 선택적 소 분자 억제제이다 (Burchat 등, Bioorg Med Chem Lett 16:118-22, 2006). A770041은 Lck의 147 nM 억제제 (1 mM ATP)이고 Fyn에 대해 300 배 선택적이고, 다른 src 계열 키나제는 T 세포 신호전달에 관여하였다. 사라카티닙 (AZD0530)은 경구로 투여될 수 있는 src 계열이다. 아바시마이브는, CD8 세포의 항-종양 반응을 확대하는 것으로 나타났던 핵심 콜레스테롤 에스테르화 효소인, ACAT1의 억제제이다.
RAJI-pLenti-GLuc 세포의 CD19Bu12(vL-vH)-BBz-Pac-P08 발현 CAR T 세포- 및 블리나투모맙-유도된 사망에서 A-770041, 사라카티닙 및 아바시마이브의 효과는 상기 기재된 바와 같이 검정을 사용하여 다음에 연구되었다. 도 41A는 임의의 CAR-T 세포 없이 배지 단독의 존재 하에 표시된 약물로 치료된 세포에서 Gluc의 방출을 보여준다. 도41B는 100nM 및 200nM로 A-770041에 의한 RAJI-pLenti-GLuc 세포의 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470] CAR-T 세포 유도된 사망의 거의 완전한 억제를 보여주고 반면 사라카티닙은 상당한 효과가 없었다. 다사티닙은 상기 실험에서 양성 대조군으로서 사용되었고 CAR-T 세포 유도된 세포사를 기대된 대로 차단시켰다. 아바시마이브는 100nM로 CAR-T 세포 유도된 세포사에서 상당한 효과가 없었지만 1μM로 완전히 차단되었다. 도 41C는 100nM A770041로 치료가 T 세포와 블리나투모맙의 조합에 의해 유도된 세포사를 부분적으로 차단시켰고 200nM A770041로 치료가 완전한 억제로 이어졌다는 것을 보여준다. 유사하게, 1μM 아바시마이브로 치료가 T 세포에 의해 매개된 블리나투모맙 유도된 세포사를 차단시켰다. 집합적으로, 상기 연구는 LCK 키나제의 억제제가 CAR-T 세포 및 블리나투모맙의 효과를 차단시킬 수 있고 따라서 CAR-T 세포 및 블리나투모맙으로 치료와 관련된 사이토카인 방출 증후군 및 신경적 합병증의 치료에 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
IL6R 및 IL6R을 표적하는 scFv를 공발현시키는 CAR 작제물의 생성
CAR 요법의 주요 제한 중 하나는 사이토카인 방출 증후군 (CRS)이다. CRS를 제어하기 위해 임상 실시에서 현재 사용중인 하나의 접근법은 항-IL-6R 단클론성 항체 토실리주맙의 투여이다. CAR과 관련된 CRS를 제어하기 위해, 우리는, C-말단 Flag 태그와 함께, IL6R, 지정된 M83에 대한 scFv를 발현시키는 CD19 (CD8SP-FMC63(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6R-M83(vL-vH)-Flag-T2A-PAC(011315-K04)[서열번호:1763]) ) 및 MPL (CD8SP-161(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6R-M83(vL-vH)-Flag-T2A-EGFP(012015-I29)[서열번호:1746]))에 대한 예시적 CARs를 작제하였다. CRS를 제어하기 위해, 우리는 또한 IL6, 지정된 IL6-19A에 대한 scFv를 공-발현시키는 CD19 (CD8SP-FMC63(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6-19A(vL-vH)-Flag-T2A-PAC(011315-H06)[서열번호:1762]) 및 MPL (CD8SP-161(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6-19A(vL-vH)-Flag-T2A-EGFP(011315-F02)[서열번호:1745])에 대한 예시적 CARs를 작제하였다. 이들 작제물에서 scFv 단편은 P2A 절단가능 링커에 의해 CAR 단편으로부터 분리된다. Jurkat-NFAT-EGFP (J-N-G) 세포는 CAR 작제물 CD8SP-FMC63(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6-19A(vL-vH)-Flag-T2A-PAC(011315-H06)[서열번호:1762] 및 CD8SP-FMC63(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6R-M83(vL-vH)-Flag-T2A-PAC(011315-K04)[서열번호:1763]을 인코딩하는 렌티바이러스로 안정적으로 형질도입되었다. 친계 및 CAR-발현 Jurkats는 후속적으로 RAJI 세포로 공배양되었고 EGFP 발현의 유도는 4 시간 후 FACS 분석으로 모니터링되었다. 도 42A는 RAJI로 CD8SP-FMC63(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6-19A(vL-vH)-Flag-T2A-PAC(011315-H06)[서열번호:1762]를 발현시키는 Jurkat 세포의 공배양이 RAJI 세포에 노출되지 않았던 세포에 비교된 경우 EGFP 발현에서 증가로 이어졌다는 것을 보여준다. 본질적으로 유사한 결과는 CAR 작제물 CD8SP-FMC63(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-IL6R-M83(vL-vH)-Flag-T2A-PAC(011315-K04)[서열번호:1763]을 발현시키는 Jurkats로 수득되었다. EGFP 발현에서 증가는 RAJI로 배양 없이 또는 배양으로 친계 Jurkats (J-N-G-P)에서 관측되지 않았다 (도 42B). 따라서, CAR은 활성의 손실 없이 단일 벡터로부터 IL6 및 IL6R에 대한 scFV로 공발현될 수 있다.
그것의 작은 크기로 인해, scFv의 제한 중 하나는 신장에 의한 그것의 신속 청소능에 기인한 그것의 짧은 반감기이다. 따라서, 우리는 또한 인간 혈청 알부민 (Alb8)에 대한 단일 쇄 낙타-유래된 항체 (vHH)에 (GGGGS)x3 링커를 통해 융합되는 낙타-유래된 IL6R 단일 쇄 항체 (vHH) 지정된 304로 구성되는 이중특이적 항체를 발현시키는 MPL (161)에 대한 CAR을 작제하였다. IL6R-Alb8 카셋트는 N-말단에서 인간 IgH 신호 펩타이드 및 C-말단에서 Flag 에피토프 태그를 운반한다. 분비된 이중특이적 IL6R-304-Alb8 항체는, 신장을 통해이의 배출을 예방할 그리고 그렇게 함으로써 이의 반감기를 연장시킬, 이의 Alb8 영역을 통해 인간 혈청 알부민에 결합할 것이다.
CRS동안 증가된 혈관 누출을 차단하기 위해 Fx06 펩타이드를 발현시키는 CAR
모세관 누출 증후군은 CARs의 또 다른 주요 합병증이다. 피브린의 천연 플라스민 소화 생성물, 펩타이드 Bβ15-42 (또한 FX06로 칭함)은 혈관 누출을 상당히 감소시키는 것으로 나타났다 (Groger 등, PLoS ONE 4:e5391, 2009). 우리는 FX06 펩타이드와 CD19 또는 MPL를 표적하는 CARs를 공발현시키는 벡터를 생성하였다. FX06의 세포외 분비를 용이하게 하기 위해, 인간 IgH에서 유래된 신호 펩타이드는 이의 N-말단에 융합되었다. CARs와 FX06 펩타이드의 공동발현은 CAR 변형된 T 세포의 주입 이후 사이토카인 방출 증후군의 일부로서 보여진 모세관 누출 증후군을 완화시키기에 도움이 될 것이다.
Jurkat-NFAT-EGFP 세포는 FX06과 함께 CD19에 대한 FMC63 CAR을 발현시키는 렌티바이러스 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-Fx06-Flag-T2A-PAC(012115-N04)[서열번호:1764]로 안정적으로 형질도입되었다. 친계 및 CAR 발현 Jurkats는 후속적으로 RAJI 세포로 공배양되었고 EGFP 발현의 유도는 유세포측정으로 모니터링되었다. RAJI로 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-BBz-P2A-IgHSP-Fx06-Flag-T2A-PAC(012115-N04)[서열번호:1764]를 발현시키는 Jurkat-NFAT-EGFP 세포의 공배양은 RAJI 세포에 노출되지 않았던 세포에 비교된 경우 EGFP 발현에서 증가로 이어졌다. 본질적으로 유사한 결과는 Bv173 및 NALM6 세포로 배양시 수득되었다. 따라서, CAR은 활성의 손실 없이 단일 벡터로부터 FX06과 함께 발현될 수 있다.
다중 다양한 항원을 표적하는 CARs
우리는 다음으로 암 및 다른 이환 유발 또는 질환 관련된 세포에서 과발현되는 많은 다양한 항원을 표적하는 CARs에 대하여 인코딩하는 렌티바이러스 작제물을 생성하였다. 렌티바이러스는 생성되었고 Jurkat-NFAT-EGFP 리포터 세포주를 주사하기 위해 사용되었다. Jurkat-NFAT-GFP 세포는 상이한 항원을 표적하는 백본 및 상이한 CARs를 발현시키도록 조작되었고 그것의 각각의 표적 항원을 발현시키는 표적 세포로 공배양시 NFAT-의존적 EGFP 리포터를 활성화시키는 그것의 능력에 대하여 시험되었다. Jurkat-NFAT-EGFP (친계) 세포는 대조군으로서 사용되었다. 상이한 CARs로 결과는 하기 요약 표 28에서 요약된다. CAR은 친계 Jurkat-NFAT-GFP 세포에 비교된 바와 같이 표적 세포주로 배양된 경우 더 큰 % GFP 양성 세포를 CAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 보여주는 경우에 검정에서 양성으로 간주된다. 따라서, CAR CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-P2A-cFLIP-L-Flag-T2A-PAC(092215-A06)[서열번호:1754]를 발현시키는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 RAJI 세포로 공-배양시 친계 Jurkat-NFAT-EGFP 세포에서 유도된 EGFP 발현에 비교된 바와 같이 RAJI 세포로 공-배양된 경우 EGFP 발현의 더 큰 유도를 보여주었다. 이들 결과는 또한, 활성화 유도된 세포사를 차단하는 것으로 공지된 제제인, cFLIP-L이 이의 신호전달 활성에 부정적으로 영향화 없이 CAR로 공-발현될 수 있다는 것을 입증한다. 표 28에서 결과는 41BB 공자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인을 포함하는 그리고 신규한 항원, 예컨대 PTK7, DLL3, cMET, TSHR, CD22, Muc1/MHC 부류 I 복합체, 티로시나제/MHC 부류 I 복합체를 표적하는 몇 개의 종래의 CAR II 작제물의 기능성 활성을 입증한다. 표 28에서 데이터는 또한 종래의 CAR I 및 K13-vFLIP를 포함하는 그리고 신규한 항원, 예컨대 CD34, CD179b, CLEC5A, CSF2RA, CD200R, LAMP1, TROP2, TnAg, CDH6, CDH17, CDH19, GD3, GFRalpha4, Her2, IL11Ra, IL13Ra2, NYBR-1, Slea, 및 TGFBR2를 표적하는 몇 개의 백본 1 작제물의 기능성 활성을 입증한다. 추가로, 몇 개의 이중특이적 작제물, 예컨대 EGFR 및 CEA를 표적하는 것 그리고 cMet 및 Her3을 표적하는 것은 이 검정에서 양성이었다. 본질적으로 유사한 실험적 접근법은 표 19-22에서 기재된 백본 및 다른 CARs의 기능성 활성을 시험하는데 사용될 수 있다.
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
종래의 CARs 및 백본 1-62를 발현시키는 T 세포를 팽창시키기 위한 PI3K 억제제의 용도
인간 말초 혈액 T 세포는 CD3 자기 비드를 사용하여 단리될 것이고 CD19를 표적하는 CAR 작제물 (서열번호: 111614-B05)를 발현시키는 렌티바이러스로 감염될 것이다. 세포는 선택되지 않은 채 방치될 것이거나 푸로마이신으로 선택될 것이고 CD3/CD28 비드를 사용하여 그러나 이중 PI3K/mTOR 억제제 PF-04691502 (0.10 μM 내지 0.5 μM)의 부재 또는 존재 하에 이전에 기재된 표준 프로토콜을 사용하여 팽창될 것이다. NSG 마우스 (Jackson Lab)은 175 cGy의 용량으로 아-치사적으로 조사될 것이다. 조사 24 시간 후 (2 일), 마우스는 꼬리-정맥을 통해 2.5 x 104 RAJI 세포로 주사될 것이다. 3 일째, 마우스 (각각의 그룹에 대하여 n =5)는 표시된 CAR 인코딩 렌티바이러스로 감염된 5 백만 T 세포로 치료될 것이고 PF-04691502의 부재 또는 존재 하에 팽창될 것이다. 대조군 마우스 (n =5)는 5 백만 미감염된 T 세포로 주사될 것이다. 마우스는 대조군 그룹내 모든 마우스의 사망까지 격일로 인간 IL2 (400 IU i.p.)가 주어진다. PI3K/AKT 억제제의 존재 하에 팽창된 CAR-T 세포를 받았던 마우스의 중앙 생존은 PI3K/AKT 억제제의 부재 하에 팽창된 CAR-T 세포를 받았던 마우스보다 더 높은 것으로 기대된다.
CAR-T 세포와 함께 IL7의 용도
연구는 CAR-T 세포의 주입 1 일 후 시작하여, 마우스가 3회 복강내 주사로 200 ng/마우스의 투약량으로 외인성 재조합 인간 IL-7이 투여될 것이고, 반면 대조군 마우스는 정상 염수를 받을 것을 제외하고 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 수행될 것이다. IL-7을 받는 마우스는 그것의 종양을 거부하고 대조군 마우스보다 더 오래 생존하는 것으로 기대된다.
입양 세포 요법을 위한 자가조직 CAR-T 세포의 용도
본 발명의 CAR-T 세포는 입양 세포 요법을 위하여 사용될 수 있다. 예로서, 재발한 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 또는 고위험 중간 등급 B-세포 림프종을 가진 환자는 CD19를 표적하는 입양으로 전달된 자가조직 CAR-T 세포로 면역요법을 받을 수 있다. 각각의 환자로부터 수집된 백혈구분리반출법 생성물은 Miltenyi Biotec으로부터 CliniMACS Prodigy® System을 사용하여 그리고 제조자의 권고에 따라 CD3-양성 T 림프구의 선택을 거칠 것이다.. 세포는 임상-등급 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(082815-P08)[서열번호:1470]으로 형질도입될 것이다. 대안적으로, 임상 등급 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:930] 바이러스는 사용될 것이다. CAR-T 세포의 선택 및 팽창은 폐쇄계에서 발생할 것이다. 수득한 세포 생성물이 (멸균 및 종양 특이적 세포독성 시험을 포함하는) 품질관리 시험을 거친 후, 이들은 동결보존될 것이다. 그 동안에, 백혈구분리반출법 이후, 연구 참가자는 림프구고갈 화학요법 (30 mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500 mg/m2/일 사이클로포스파마이드 x 3 일)로 시작할 것이다. 그것의 림프구고갈 레지멘의 완료 1 일후, 이전에 저장된 CAR-T 세포 생성물은 환자의 침대쪽에서 수송, 해동 및 주입될 것이다. 연구 참가자는 또한 내성까지 매 8 시간 정맥내로 주입된 CAR-형질도입된 림프구 이어서 고-용량 (720,000 IU/kg) IL-2 (알데스류킨; Prometheus, San Diego, CA)를 받을 수 있다. CAR-T 생성물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 104 CAR+ve CD3 세포/kg 내지 5 x 109 CAR+ve CD3 세포/kg으로 다양할 것이다. CAR-T 생성물은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여될 수 있다. 연구 참가자는 15 mg/kg의 아세트아미노펜 P.O. (최대 650 mg.) 및 디펜히드라민 0.5-1 mg/kg I.V. (최대 용량 50 mg)으로 T 세포 주입에 앞서 적어도 30 분 사전-약물투여될 것이다. 연구 참가자는 선택적으로 인간 IL-2의 매일 주사를 받을 것이다. 임상 및 실험실 상관적인 후속조치 연구는 그 다음 의사의 재량으로 수행될 것이고, CD19-발현 ALL/림프종 세포 및/또는 입양으로 전달된 T 세포의 존재; FDG-PET 및/또는 CT 스캔; 질환 특이적 병리적 평가용 골수 시험; 림프절 생검; 및/또는 유전자 전이 연구에 응용하는 FDA의 생물학적 반응 조절자 자문 위원회에 의해 제시된 지침에 따른 장기간 후속조치에 대하여 정량적 RT-PCR 연구를 포함할 수 있다. 본질적으로 유사한 접근법은 본 발명의 종래의 CARs 또는 질환 유발 또는 질환-관련된 세포에서 발현된 항원 또는 항원들을 CAR이 표적하는 액세서리 모듈 (즉 백본 1-62)를 가진 종래의 CARs을 발현시키도록 조작된 자가조직 면역 세포 (예를 들면, T 세포)를 사용하여 다른 질환을 치료하는데 사용될 것이다.
입양 세포 요법용 다중 항원을 표적하는 백본 1-62 및 종래의 CARs를 발현시키는 자가조직 T 세포의 용도
감염성 질환 (예를 들면, HIV1, EBB, CMV, HTLV1, etc), 퇴행성 질환 (예를 들면, 알츠하이머병), 알러지성 질환 (예를 들면, 만성 특발성 두드러기) 및 다중 암을 포함하는, 많은 상이한 질환을 가진 환자는 상이한 질환 유발 또는 질환-관련된 항원을 표적하는 K13-vFLIP (백본 1)을 공발현시키는 입양으로 전달된 자가조직 CAR-T 세포를 가진 면역요법의 IRB 승인된 I 기 임상시험에서 등록될 것이다. 상이한 질환용 CAR은 질환 유발 또는 질환-관련된 세포에서 그것의 표적 항원의 공지된 발현에 기반하여 선택될 것이다. 가능하다면, 질환 유발 또는 질환 관련된 세포에서 CAR 표적의 발현은 CAR의 항원 결합 도메인이 가요성 링커를 통해 NLuc 단백질의 비-분비성 형태로 융합되는 항원 결합 도메인-GGS-NLuc 융합 단백질과 결합에 의해 확인될 것이다. 대안적으로, 상업적으로 입수가능한 항체를 사용하는 면역조직화학 또는 유세포측정은 질환 유발 또는 질환-관련된 세포에서 CAR의 표적 항원의 발현을 확인하는데 사용될 것이다. T 세포는 백혈구분리반출법을 사용하여 대상체로부터 수집될 것이고, 적절한 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 것이고 폐쇄계에서 CD3/CD28 비드를 사용하여 생체외 팽창될 것이다. 수득한 세포 생성물이 (멸균 및 종양 특이적 세포독성 시험을 포함하는) 품질관리 시험을 거친 후, 이들은 동결보존될 것이다. CAR-T 세포 생성물은 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 대상체에 투여될 것이다. 임상 및 실험실 상관적인 후속조치 연구는 그 다음 의사의 재량으로 수행될 수 있다.
종래의 CARs 및 백본 1-62를 발현시키는 T 세포와 조합으로 mTOR 억제제 RAD001의 용도
연구는 CAR -T 세포의 주입 1 일후 시작하여, 연구 참가자가 표적 최저치 0.1 내지 3 ng/ml를 제공하는 투약량으로 mTOR 억제제, 예를 들면, 알로스테릭 억제제, 예를 들면, RAD001이 투여될 것을 제외하고 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 수행되고, 여기에서 최저치"는 다음 용량 직전 혈장내 약물의 농도, 또는 2 용량 사이 최소 약물 농도를 지칭한다.
종래의 CARs 및 백본 1-62를 발현시키는 T 세포와 조합으로 이브루티닙의 용도
연구는 CAR-T 세포의 주입 1 일후 시작하여, 연구 참가자가 140 mg/d 내지 420 mg/d의 용량으로 이브루티닙이 경구 투여될 것을 제외하고 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 수행될 것이다. 이브루티닙을 받는 연구 참가자가 이브루티닙 없이 CAR-T 세포를 받았던 참가자에 비교된 경우 중증 사이토카인 방출 증후군의 더 낮은 발병률을 가질 것이 기대된다.
CAR-T 세포 간 동맥 주입
정맥내 주입에 더하여, 본 발명에서 기재된 종래의 CARs 및 백본 1-62를 발현시키는 T 세포는 질환과 관여된 국부 영역 또는 장기에서 고 농도의 CAR-T 세포를 제공하기 위해 동맥내로 주입될 수 있다. 하기 실시예에서, 이러한 접근법은 폴레이트 수용체 알파 (FR1)을 발현시키는 위장 암으로부터 간 전이를 가진 환자의 경우에서 사용된다. 본질적으로 유사한 접근법은 다른 종양 항원을 표적하는 백본 1-62 및 종래의 CARs를 발현시키는 T 세포의 동맥내 주입을 위하여 사용될 수 있다.
맵핑 혈관조영은 오른쪽 총 대퇴 동맥 접근법을 통해 수행될 것이다. 위십이지장 및 오른쪽 위 동맥은, 간외 관류의 다른 잠재적인 공급원에 더하여, 마이크로코일로 색전될 것이다. 동일한 동맥 접근 절차는 작제물 CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:1060]을 발현시키는 T 세포의 투여를 위하여 수행될 것이다. T 세포는 환자로부터 0 일째 수집될 것이고 작제물 CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:1060]을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염될 것이고 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 팽창될 것이다. CAR-T 세포는 14 일째 (107 CAR-T 세포), 28 일째 (108 CAR-T 세포) 및 44 일째 (109 CAR-T 세포) 용량 상승하는 방식으로 주어질 것이다. CAR- T 세포는 <2 cc/초의 비로 60cc 주사기를 통해 수작업으로 주사될 것이다. 주입의 총 용적은 대략 100 cc일 것이다. 보정된 콘트라스트 비를 가진 혈관조영술은 50 cc의 제1 주입 후 그리고 CAR-T 주입의 완료에서 수행되어 보존된 동맥 유동을 확인할 것이다. 주입은 가능한 경우 적절한 간 동맥 속에 전달될 것이다. 특정 환자는, 오른쪽 또는 왼쪽 간 동맥이 적절한 간 동맥으로부터 생기지 않는, 비정상적인 간 동맥 해부학을 가질 수 있다. 그와 같은 경우에 CAR-T 세포의 용량은 대엽 용적 계산에 기반하여 분할될 것이다. 그와 같은 경우에, 분할 용량은 오른쪽 또는 왼쪽 간 동맥에 별도로 전달되어 양쪽 간 엽에 비례하는 CAR-T 전달을 보장할 것이다.
CAR-T 세포의 복강내 투여
CAR-T 세포는 또한, 본질적으로 Koneru M 등 (Journal of Translational Medicine; 2015; 13:102)에서 기재된 바와 같이, 복강내로 투여될 수 있다. 하기 실시예에서, 이러한 접근법은 폴레이트 수용체 알파 (FR1)을 발현시키는 난소 암과 복막 관여를 가진 환자에서 사용된다. 본질적으로 유사한 접근법은 다른 종양 항원을 표적하는 CAR-T 세포의 복막내 주입을 위하여 사용될 수 있다.
스크리닝 고지에 의한 동의는 FR1의 발현에 대하여 그것의 암을 시험하기 위해 재발성 고-등급 장액 난소 암을 가진 환자에 제공될 것이다. FR1의 발현이 면역조직화학에 의해 확인된 후, 환자는 말초 혈액으로부터 수득된 백혈구분리반출법 생성물을 가질 것이다. 과잉의 혈소판 및 적혈구 오염은 백혈구분리반출법 생성물로부터 제거될 것이고 생성물은 냉동될 것이다. 연구의 치료 단계에서, 백혈구분리반출법 생성물은 해동 및 세정될 것이다. 후속적으로, CD3+ T 세포는 CD3/CD28 비드를 사용하여 자기 분리에 의해 해동된 백혈구분리반출법 생성물로부터 단리될 것이다. 활성화된 T 세포는 CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:1060] 작제물로 렌티바이러스적으로 형질도입될 것이고 CD3/CD28 비드 팽창 프로토콜을 사용하여 추가로 팽창될 것이다.
보존된 (파라핀 포매된) 또는 새롭게 생체검사된 종양의 면역조직화학 (IHC) 분석에 의해 확인된 FR1 항원을 발현시키기 위해 나타난 재발성 고-등급 장액 난소, 1차 복막 또는 나팔관 암종을 가진 환자는 잠재적으로 연구에 적격일 것이다.
I 기 용량-단계적 확대 투약은 실험에서 사용될 것이다. 3-6 환자의 집단은 최대 내성 용량 (MTD)를 확립시키기 위해 변형된 T 세포의 상승 용량으로 주입될 것이다. 4 계획된 용량 수준이 있을 것이다: 3 × 105, 1 × 106, 3 × 106, 및 1 × 107 CAR-T 세포/kg. 집단 I 및 II는 3 × 105 CAR-T 세포/kg으로 치료될 것이지만 집단 II에서 환자는 또한 림프구고갈 사이클로포스파마이드를 받을 것이다. 집단 II-V는 사이클로포스파마이드로 사전치료 이후 변형된 T 세포의 상승 용량을 받을 것이다. 750 mg/m2로 투약된 림프구고갈 사이클로포스파마이드는 초기 T 세포 주입에 앞서 2-4 일 투여될 것이다. 표준 3 + 3 용량 단계적 확대 스킴은 뒤따를 것이다.
IP 카테터는 T 세포 주입에 앞서 배치될 것이다. 환자는 CAR T 세포의 그것의 제1 주입에 앞서 병원의 입원환자 병동에 입원될 것이고 CAR T 세포의 제2 주입 후 적어도 3 일까지 여전히 입원될 것이다. 치료되는 환자의 제1 집단, 및 각각의 후속 집단에서 치료된 제1 환자는 집중 치료실 (ICU)에 입원될 것이고; 후속 환자는 (치료 의사의 임상 판단을 거치는) 의료 종양학 입원환자 서비스에 입원될 수 있다.
환자는 CAR-변형된 T 세포의 초기 치료에 앞서 2 내지 4 일 림프구고갈 사이클로포스파마이드 (750 mg/m2 IV) 화학요법의 단일 용량을 받을 것이다. 형질도입된 T 세포는 주입에 앞서 수, 순도, 생존력, 및 멸균에 대하여 시험된 품질일 것이다. 모든 환자는 정맥내로 유전적으로 변형된 T 세포 용량의 50%를 받을 것이다. 환자는 독성에 대하여 면밀히 모니터링될 것이다. 1 내지 3 일 후, T 세포의 잔존 용량은 IP 주입으로서 투여될 것이다. 적어도 3 환자는, 각각의 용량 수준 이내 2 이하 환자 / 개월의 증가분으로, 용량 수준 1로 치료될 것이다. 이전의 집단에서 치료된 모든 환자는 단계적 확대 전 초기 T 세포 주입의 날부터 다음 집단이 발생하는 때까지 최소의 4 주 동안 관측될 것이다. 혈액 샘플은 유전적으로 변형된 T 세포의 독성, 치료 효과, 및 생존을 평가하기 위해 치료에 앞서 및 이후 모든 환자로부터 수득될 것이다.
종양내 주사용 CAR-T 세포의 용도
CAR-T 세포는 또한, 본질적으로 Brown CE, 등, Clin Cancer Res. 2015 September 15; 21(18): 4062-4072에서 기재된 바와 같이, 종양내로 투여될 수 있다. 하기 실시예에서, 이러한 접근법은 IL13Ra2를 발현시키는 재발성 교모세포종 (GBM)을 가진 환자의 경우에서 사용될 것이다. 본질적으로 유사한 접근법은 다른 종양 항원을 표적하는 액세서리 모듈 (백본 1-62)를 발현시키는 종래의 CARs 또는 종래의 CARs를 발현시키는 T 세포의 종양내 주사를 위하여 사용될 수 있다.
파일럿 안전성 및 실행성 연구는 재발성 GBM에서 T 세포를 발현시키는 CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(050516-F04)[서열번호:1102]를 시험하기 위해 수행될 것이다. 모든 참여 환자는 서면 고지에 의한 동의를 제공하도록 요구될 것이다. 임상 프로토콜은 University of Southern California Institutional Review Board에 의해 승인될 것이고 Investigational New Drug Application 하에 수행될 것이고, ClinicalTrials.gov에 등록될 것이다. 적격 환자는 종양이 심실/CSF 경로와 소통을 보여주지 않고 절제를 잘 받아들이는 재발성 또는 난치성 단초점 천막상 등급 III 또는 IV 신경아교종을 가진 성인 (18-70 세)를 포함할 것이다. 이 실험에 참여는 IL13R (또는 IL13Ra2) 종양 항원 상태에 독립적일 것이다. 환자는 고-등급 신경아교종의 초기 진단 (WHO 등급 III 또는 IV) 이후 등록될 것이고, 어느 시점에 이들은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 수집용 백혈구분리반출법을 겪을 것이다. 이들 세포는 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 상응하는 렌티바이러스 벡터로 감염 이후 푸로마이신 저항 유전자 (PAC)를 함유하는 작제물 CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC(050516-F04)[서열번호:1102]를 발현시키기 위해 T 세포를 조작하는데 사용될 것이다. 대안적으로, CAR-T 세포는 레트로바이러스 벡터로 감염 이후 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 사용하여 또는 IVT mRNA의 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 후속적으로, 방출 시험된 치료 CAR-T 세포는 나중 사용을 위하여 동결보존 및 저장될 것이다. 종양의 제1 재발의 시간에, 연구 참가자는 Rickham 저장소/카테터의 배치와 함께 종양의 절제를 경험할 것이다. 동시에, 치료 CAR-T 세포는 해동될 것이고, CD3/CD28 비드 기반된 신속 팽창 프로토콜을 사용하여 재-팽창될 것이다. 수술로부터 회복 그리고 후 기준치 MR 이미지형성 이후, CAR-T 세포는, 본질적으로 기재된 바와 같이 (Brown CE, 등, Clin Cancer Res. 2015 21(18): 4062-4072), 내재 카테터를 통해 절제 공동 속에 직접적으로 투여될 것이다. 세포는 5-10 분에 걸쳐 2 mL 용적을 전달하기 위해 21 게이지 나비 바늘을 이용하여 Rickham 저장소 속에 수작업으로 주사될 것이고, 이어서 5 분에 걸쳐 보존제 없는 정상 염수로 2 mL 플러싱될 것이다. 프로토콜 치료 계획은 매주 치료 사이클로 구성된 5 주 기간에 걸쳐 두개내로 투여된 12 CAR T 세포 용량의 표적으로 환자내 용량 단계적 확대 스케줄을 특정할 것이다. 사이클 1, 2, 4 및 5 동안, T 세포 주입은 사이클 주의 1, 3 및 5 일째 수행될 것이고, 주 3 은 나머지 사이클일 것이다. 안전을 위하여, 사이클 1에서 환자내 용량 단계적 확대 전략은, 1, 3 및 5 일째 각각에서 투여된 주입당 107, 5 × 107 및 108 세포의 CAR T 세포 용량으로, 사용될 것이고 이것은 4 주에 걸쳐 108 세포의 9 추가의 CAR T 세포 주입이 뒤따를 것이다. 반응을 평가하기 위한 이미지형성은 주 3 나머지 사이클 동안 및 주 5 후 수행될 것이다. NCI 공통 독성 기준 버전 2.0 (https://ctep.ifo.nih.gov/l)에서 제공된 지침은 독성의 모니터링 및 유해 사례 리포팅에 대하여 뒤따를 것이다.
이식에 앞서 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포의 생체외 퍼징용 CAR-T 세포의 용도
CAR T 세포는 줄기 세포 이식에 앞서 암 세포의 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포를 퍼징하는데 사용될 수 있다. 하기 실시예에서, T 세포를 발현시키는 CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:1032]는 자가조직 줄기 세포 (또는 골수) 이식에 앞서 다발성 골수종을 가진 환자로부터 수득된 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포를 퍼징하는데 사용될 것이다.
환자는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수집하기 위해 백혈구분리반출법을 경험할 것이다. T 세포는 CD3 비드를 사용하여 정제될 것이다. 이들 세포는 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 상응하는 렌티바이러스 벡터로 감염 이후 CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC[서열번호:1032] CAR을 발현시키기 위해 T 세포를 조작하는데 사용될 것이다. 후속적으로, 방출-시험된 치료 CAR-T 세포는 동결보존될 것이고 나중에 사용을 위하여 저장될 것이거나 신선하게 사용될 것이다. 골수 세포 및 말초 혈액 선조 세포 생성물은 표준 절차에 따라 다발성 골수종을 가진 환자로부터 수집될 것이다. 말초 혈액 줄기 세포의 동원을 위하여, 환자는 분리반출법이 완료되는 때까지 사이클로포스파마이드 후 24 시간 시작하는 하루 하루 피하로 사이클로포스파마이드, 3 gm/m2 이어서 G-CSF, 10 마이이크로g/kg을 받을 것이다. 말초 혈액 줄기 세포는 말초 혈액 CD34+-세포 카운트가 15 세포/μl이면 수집될 것이다. 수집 목표는 최소의 2.0 배 106 CD34+ 세포/kg이 가공후 도달되는 때까지 날마다 3 혈액 용적을 가공할 것이다. 골수 및 말초 혈액 줄기 세포 생성물은 선택적으로 Miltenyi Biotec으로부터 CliniMACS Prodigy® System을 사용하여 그리고 제조자의 권고에 따라 CD34 발현 세포가 농축될 것이고/것이거나 적혈구가 고갈될 것이다. 생성물은 신선한 생체외 퍼징에 사용될 것이거나 동결보존될 것이다. 퍼징을 위하여, 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 생성물은 100 IU 재조합 인간-IL2로 대체된 XVIVO 배지 (Lonza)에서 4 내지 24 시간 동안 5:1 내지 30:1 범위의 이펙터 대 표적 비에서 해동된 CAR-T 세포로 공배양될 것이다. 세포는 37℃에, 5% CO2 가습된 인큐베이터에서 배양될 것이다. 공배양 기간의 마지막에, 세포의 분취액은 (CFU-GM용 측정 그리고 CD34 및 CD138 양성 세포용 유세포측정을 포함하는) 멸균 및 품질 시험을 위하여 취득될 것이다. 잔존 샘플은 골수절제 화학요법 (예를 들면, 140 mg/m2의 총용량에 대하여 70 mg/m2의 2 분할 용량으로 고용량 멜팔란)을 이전에 받았던 환자에 정맥내로 투여될 것이다.
참고문헌
상기 기재된 다양한 방법 및 기술은 본원을 실시하기 위한 수많은 방식을 제공한다. 물론, 반드시 기재된 모든 목적 또는 이점이 본 명세서에서 기재된 임의의 특정 구현예에 따라 달성될 수 없다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 당해 분야의 숙련가는 본 방법이 본 명세서에서 교시된 또는 제안된 바와 같이 다른 목적 또는 이점의 반드시 달성 없이 본 명세서에서 교시된 바와 같이 이점의 그룹 또는 하나의 이점을 달성 또는 최적화하는 방식으로 수행될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다양한 대안은 본 명세서에서 언급된다. 일부 바람직한 구현예가 구체적으로 하나, 또 다른, 또는 몇 개의 피쳐를 포함하고, 동시에 기타는 구체적으로 하나, 또 다른, 또는 몇 개의 피쳐를 배제하고, 동시에 여전히 기타는 하나, 또 다른, 또는 몇 개의 유리한 피쳐의 봉입체에 의한 특정 피쳐를 저감시키는 것이 이해되어야 한다
게다가, 숙련가는 상이한 구현예로부터 다양한 피쳐의 적용가능성을 인식할 것이다. 유사하게, 상기 논의된 다양한 요소, 피쳐 및 단계, 뿐만 아니라 각각의 그와 같은 요소, 피쳐 또는 단계에 대하여 다른 공지된 등가물은 본 명세서에서 기재된 원리에 따라 방법을 수행하기 위해 본 기술에서 숙련가에 의해 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 다양한 요소, 피쳐, 및 단계 중에서 일부는 구체적으로 포함될 것이고 기타는 구체적으로 다양한 구현예에서 배제될 것이다.
본원이 특정 구현예 및 실시예의 문맥에서 개시되어 있어도, 본원의 구현예가 구체적으로 개시된 구현예를 넘어 다른 대안적인 구현예 및/또는 이의 용도 및 변형 및 등가물까지 연장한다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 것이다.
본원의 바람직한 구현예는, 본원 실시를 위하여 본 발명자들에 공지된 최상의 방식을 포함하여, 본 명세서에서 기재된다. 그들 바람직한 구현예에서 변화는 전술한 설명 판독시 당해 분야의 숙련가에 분명해질 것이다. 숙련가가 적절한 경우 그와 같은 변화를 사용할 수 있다는 것, 그리고 본원이 본 명세서에서 구체적으로 기재된 것 이외 달리 실시될 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 본원의 많은 구현예는 적용가능한 법에 의해 허용된 바와 같이 본원에 첨부된 청구항에서 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 이의 모든 가능한 변화에서 상기-기재된 요소의 임의의 조합은 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 달리 명확히 반박하지 않는 한 본원에 의해 포괄된다.
본 명세서에서 언급된, 모든 특허, 특허 출원, 특허 출원의 공보, 및 다른 자료, 예컨대 물품, 서적, 사양, 공보, 문서, 사물, 및/또는 기타 동종은, 동일한 것과 관련된 임의의 소송 파일 이력, 본 문서와 불일치하는 또는 상충하는 임의의 동일한 것, 또는 본 문서와 현재 또는 나중에 관련된 가장 넓은 청구항의 범위에 관해 제한 영향을 가질 수 있는 임의의 동일한 것을 제외하고, 모든 목적을 위해 그 전문이 이 참조로 본 명세서에서 이로써 편입된다. 예로써, 임의의 편입된 자료와 관련된 용어의 설명, 정의, 및/또는 용도와 본 문서와 관련된 것, 우세할 본 문서에서 용어의 설명, 정의, 및/또는 용도 사이 임의의 불일치 또는 상충이 있을 수 있다.
본 명세서에서 개시된 본원의 구현예가 본원의 구현예의 원리를 설명한다는 것이 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본원의 범위 내일 수 있다. 따라서, 예로써, 제한 없이, 본원의 구현예의 대안적인 배치형태는 본 명세서에서 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본원의 구현예는 정확하게 보여진 및 기재된 바와 같은 것에 제한되지 않는다.
본 발명의 다양한 구현예는 상세한 설명에서 상기 기재된다. 이들 설명이 직접적으로 상기 구현예를 기재하면서, 당해 분야의 숙련가가 본 명세서에서 보여진 및 기재된 특이적 구현예에 변형 및/또는 변화를 구상할 수 있다는 것이 이해된다. 이 설명의 범위에 해당하는 임의의 그와 같은 변형 또는 변화는 또한 거기에 포함되도록 의도된다. 구체적으로 언급되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 단어 및 어구가 적용가능한 기술(들)에서 통상적인 기술의 정도로 통상적인 및 익숙한 의미로 주어진다는 것이 본 발명자들의 의도이다.
본원의 출원시 본 출원인에 공지된 본 발명의 다양한 구현예의 전술한 설명은 제시되어 왔고 실례 및 설명의 목적으로 의도된다. 본 설명은 개시된 정확한 형태로 본 발명을 제한하지도 소모적이도록 의도되지 않고 많은 변형 및 변화는 상기 교시의 면에서 가능하다. 기재된 구현예는 본 발명의 원리 및 이의 실제적인 적용을 설명하는데 그리고 다양한 구현예에서 및 고려된 특정 용도에 적합한 바와 같이 다양한 변형으로 당해 분야에서 숙련가를 본 발명을 이용하도록 하는데 도움이 된다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하기 위하여 개시된 특정한 구현예에 제한되지 않는 것이 의도된다.
본 발명의 특정 구현예가 나타나고 기재되는 동안, 본 명세서에서 교시에 기반하여, 변화 및 변형이 본 발명 및 이의 더 넓은 측면에서 이탈 없이 실시될 수 있다는 것 그리고, 따라서, 첨부된 청구항이 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내인 것처럼 모든 그와 같은 변화 및 변형을 그것의 범위 내에 포괄하는 것이 당해 분야의 숙련가에 명백할 것이다.
본원 및 발명은 추가로하기 넘버링된 항목의 주제를 포함한다.
1. 하기를 포함하는 키메라 항원 수용체: 항원-특이적 표적 도메인; 힌지 영역; 막관통 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인, 여기서 각각의 항원-특이적 표적 영역은 항원-특이적 단일 쇄 Fv (scFv) 단편 또는 항원 특이적 리간드를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
2. 항목 1에 있어서, 하나 이상의 공-자극 도메인을 추가로 포함하는, 키메라 항원 수용체.
3. 항목 1에 있어서, 항원-특이적 표적 도메인이 MPL 수용체, CD19, GRP-78, CD79b, Lym-1, Lym-2, FLT3 또는 이의 조합의 어느 하나 이상을 표적하는, 키메라 항원 수용체.
4. 항목 1에 있어서, 힌지 영역이 인간 CD8 힌지 영역, 항체 또는 이의 기능성 등가물, 단편 또는 유도체의 Fc 단편, 항체 또는 이의 기능성 등가물, 단편 또는 유도체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 및 이의 조합의 어느 하나 이상을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
5. 항목 4에 있어서, 힌지 영역이 (i) IgG4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (ii) IgG4의 힌지 영역, (iii) IgG4의 힌지 및 CH2 영역, (iv) CD8α의 힌지 영역 (v) IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (vi) IgG1의 힌지 영역, (vi) IgG1의 힌지 및 CH2 영역, 또는 (vii) 이의 조합의 어느 하나 이상을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
6. 항목 1에 있어서, 막관통 도메인이 T 세포 수용체 복합체, CD28, CD8a, 및 이의 조합의 제타 쇄의 막관통 도메인의 어느 하나 이상을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
7. 항목 2에 있어서, 공-자극 도메인이 CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 및 이의 조합의 어느 하나 이상으로부터 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
8. 항목 1에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 인간 CD3 제타 쇄, FcgRIII, FceRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 세포질 수용체를 보유하는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 및 이의 조합의 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
9. 항목 1에 있어서, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 특이적인 scFv 또는 vHH 또는 이중특이적 항체로 추가로 공발현된, 키메라 항원 수용체.
10. 항목 9에 있어서, 공발현된 사이토카인 또는 사이토카인 수용체가 IL-6, IL6R, IFNγ, TNFα 또는 이의 조합의 어느 하나 이상인, 키메라 항원 수용체.
11. 항목 1에 있어서, CAR 요법과 관련된 모세관 누출을 저감시키기 위해 펩타이드 FX06을 추가로 공발현시키는, 키메라 항원 수용체.
12. 항목 1에 있어서, T 세포 활성화, 증식을 자극시키기 위해 및/또는 T 세포 활성화 유도된 세포사를 차단시키기 위해 바이러스 또는 세포 신호전달 단백질을 추가로 공발현시키는, 키메라 항원 수용체.
13. 항목 12에 있어서, 신호전달 단백질이 vFLIP K13, vFLIP MC159, vFLIP MC160, vFLIP E8, HSV vFLIP, BHV vFLIP, 헤르페스 바이러스 메카카 vFLIP, cFLIP/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV1- Tax RS 돌연변이체, HTLV2 Tax RS 돌연변이체, Tio, StpC, Tip 또는 돌연변이체 또는 이의 조합의 어느 하나 이상인, 키메라 항원 수용체.
14. 항목 12에 있어서, 신호전달 단백질이 구성적 또는 유도성 방식으로 발현되는, 키메라 항원 수용체.
15. 항목 12에 있어서, 신호전달 단백질의 활성이 화합물의 투여로 번역후 수준에서 제어되는, 키메라 항원 수용체.
16. 항목 12에 있어서, 신호전달 단백질이 FKBP 도메인의 하나 이상의 카피와 융합하여 발현되는, 키메라 항원 수용체.
17. 항목 16에 있어서, 단백질의 활성이 FKBP 도메인의 이량체화를 유도하는 화학적 화합물의 치료적 유효량의 투여로 번역후 수준에서 제어되는, 키메라 항원 수용체.
18. 항목 1 또는 3에 있어서, MPL을 표적하는 항원 특이적 표적 도메인이 161, 175, 178, AB317, 12E10, 또는 VB22 또는 인간 TPO 또는 마우스 TPO의 scFV 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
19. 항목 1 또는 3에 있어서, CD19를 표적하는 항원 특이적 표적 도메인이 CD19Bu12 또는 CD19MM의 scFV 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
20. 항목 1 또는 3에 있어서, CD79b를 표적하는 항원 특이적 표적 도메인이 huMA79bv28 또는 CD79b-2F2의 scFV 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
21. 항목 1 또는 3에 있어서, FLT3을 표적하는 항원 특이적 표적 도메인이 NC7의 scFV 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
22. 항목 1 또는 3에 있어서, Lym1 항원을 표적하는 항원 특이적 표적 도메인이 Lym1의 scFV 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
23. 항목 1 또는 3에 있어서, Lym2 항원을 표적하는 항원 특이적 표적 도메인이 Lym2의 scFV 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
24. 항목 1 또는 3에 있어서, GRP-78을 표적하는 항원 특이적 표적 도메인이 GRP78-GC18의 scFV 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
25. 항목 1, 12 및 18-24 중 어느 하나의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
26. 항목 25의 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는, 폴리펩타이드.
27. 항목 25의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
28. 항목 25의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 바이러스.
29. 바이러스가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 렌티바이러스, 폭스 바이러스 또는 헤르페스 바이러스인, 항목 25의 바이러스.
30. 항목 25의 폴리뉴클레오타이드 또는 항목 1의 키메라 항원 수용체를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포.
31. 항목 30에 있어서, 세포가 T-림프구 (T-세포)인, 유전적으로 조작된 세포.
32. 항목 31에 있어서, 세포가 미접촉 T 세포, 중심 메모리 T 세포, 이펙터 메모리 T 세포, Treg 또는 이의 조합인, 유전적으로 조작된 세포.
33. 세포가 자연 살해 (NK) 세포, 조혈모세포 (HSC), 배아 줄기 세포, 또는 만능 줄기 세포인, 항목 21의 유전적으로 조작된 세포.
34. 하기를 포함하는, 약제학적 조성물: 항목 1의 키메라 항원 수용체, 항목 25의 폴리뉴클레오타이드, 항목 26의 폴리펩타이드, 항목 27의 벡터, 항목 28의 바이러스, 항목 30의 유전적으로 조작된 세포 및 이의 조합의 어느 하나 이상; 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어.
35. 하기 단계를 포함하는 암의 치료 방법: 항목 34의 조성물을 제공하는 단계; 및 암을 치료하기 위해 대상체에 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계.
36. 항목 35에 있어서, 암이 혈액 암인, 방법.
37. 항목 36에 있어서, 혈액 암이 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종 및 급성 림프구성 백혈병의 어느 하나 이상인, 방법.
38. 티로신 키나제의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 항목 1의 CAR을 발현시키는 T 세포의 활성 제어 방법으로서, 키나제가 키나제의 src 계열로부터 선택되는, 방법.
39. 티로신 키나제의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CAR-T 세포로 치료와 관련된 CRS의 치료 방법으로서, 키나제가 키나제의 src 계열로부터 선택되는, 방법.
40. 티로신 키나제의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CAR-T 세포로 치료와 관련된 신경적 합병증의 치료 방법으로서, 키나제가 키나제의 src 계열로부터 선택되는, 방법.
41. 항목 38, 39 또는 40에 있어서, 억제제가 src 키나제 Lck인, 방법.
42. 항목 41에 있어서, 억제제가 다사티닙인, 방법.
43. 항목 41에 있어서, 억제제가 포나티닙인, 방법.
44. 항목 41에 있어서, 억제제가 A-770041인, 방법.
45. 티로신 키나제의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, BiTE에 의해 활성화된 T 세포의 활성 제어 방법으로서, 키나제가 키나제의 src 계열로부터 선택되는, 방법.
46. 티로신 키나제의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, BiTE로 치료에 의해 야기된 CRS의 치료 방법으로서, 키나제가 키나제의 src 계열로부터 선택되는, 방법.
47. 티로신 키나제의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, BiTE로 치료에 의해 야기된 신경적 합병증의 치료 방법으로서, 키나제가 키나제의 src 계열로부터 선택되는, 방법.
48. 항목 45, 46 또는 47에 있어서, BiTE가 블리나투모맙 (블린사이토)인, 방법.
49. 항목 45, 46 또는 47에 있어서, 억제제가 src 키나제 Lck를 억제시키는, 방법.
50. 항목 49에 있어서, 억제제가 다사티닙인, 방법.
51. 항목 49에 있어서, 억제제가 포나티닙인, 방법.
52. 항목 49에 있어서, 억제제가 A-770041인, 방법.
53. 티로신 키나제의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CAR 및 BiTE의 합병증의 치료 방법으로서, 키나제가 키나제의 src 계열로부터 선택되는, 방법.
54. 항목 53에 있어서, BiTE가 블리나투모맙 (블린사이토)인, 방법.
55. 항목 53에 있어서, 억제제가 src 키나제 Lck를 억제시키는, 방법.
56. 항목 55에 있어서, 억제제가 다사티닙인, 방법.
57. 항목 55에 있어서, 억제제가 포나티닙인, 방법.
58. 항목 55에 있어서, 억제제가 A-770041인, 방법.
59. 아바시마이브의 치료 유효량의 투여로 CAR-T 세포 및 BiTE의 CRS, 신경적 합병증 및 다른 합병증의, 치료 방법.
60. 세포에서 vFLIP K13 발현에 의한 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 T 세포의 불멸화 방법.
61. 항목 60에 있어서, vFLIP K13이 구성적으로 발현되는, 방법.
62. 항목 60에 있어서, vFLIP K13이 전사 또는 번역후 수준에서 이의 활성의 제어를 허용하는 방식으로 발현되는, 방법.
63. 항목 60에 있어서, vFLIP K13이 FKBP의 하나 이상의 도메인과 융합하여 발현되는, 방법.
64. 항목 63에 있어서, FKBP-vFLIP-K13 융합 단백질이 N-말단 미리스토일화 서열을 추가로 포함하는, 방법.
65. 항목 64에 있어서, FKBP-vFLIP-K13 융합 단백질의 활성이 FKBP 도메인의 이량체화 및 K13 유도된 NF-kB 신호전달의 활성화를 유도하는 화학물질에 의해 제어되는, 방법.
66. 항목 65에 있어서, K13 또는 FKBP-K13 융합 단백질을 발현시키는 말초 혈액 단핵 세포 및/또는 T 세포가 환자에 투여되는, 방법.
67. 항목 65에 있어서, K13 또는 FKBP-K13 융합 단백질을 발현시키는 말초 혈액 단핵 세포 및/또는 T 세포가 또한 키메라 항원 수용체, 원상태 T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체를 공-발현시키는, 방법.
68. 세포에서 HTLV2 Tax 단백질 발현에 의한 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 T 세포의 불멸화 방법.
69. 세포에서 HTLV2 Tax RS 돌연변이체 단백질 발현에 의한 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 T 세포의 불멸화 방법.
70. 항목 68 또는 69에 있어서, HTLV2 Tax 및 이의 RS 돌연변이체가 FKBP의 하나 이상의 도메인과 융합하여 발현되는, 방법.
71. 항목 70에 있어서, FKBP-Tax 융합 단백질이 N-말단 미리스토일화 서열을 추가로 포함하는, 방법.
72. 항목 71에 있어서, FKBP-Tax 및 FKBP-Tax-RS 융합 단백질의 활성이 FKBP 도메인의 이량체화 및 Tax 유도된 NF-kB 신호전달의 활성화를 유도하는 화학물질에 의해 제어되는, 방법.
73. 항목 72에 있어서, HTLV2 Tax HTLV2 Tax-RS 돌연변이체, FKBP-Tax, 또는 FKBP-Tax-RS 돌연변이체 단백질을 발현시키는 말초 혈액 단핵 세포 및/또는 T 세포가 환자에 투여되는, 방법.
74. 항목 72에 있어서, HTLV-Tax 또는 FKBP-Tax 융합 단백질을 발현시키는 말초 혈액 단핵 세포 및/또는 T 세포가 키메라 항원 수용체, 원상태 T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체를 추가로 공-발현시키는, 방법.

Claims (27)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 K13-vFLIP 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포로서, 상기 CAR이 a) 세포외 항원 특이적 도메인, b) 막관통 도메인 및 c) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; c)가 상기 키메라 수용체의 상기 C-말단에 위치하는, 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, MC159-vFLIP 신호전달 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR이 하나 이상의 공-자극 도메인을 추가로 포함하는, 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포가 scFvs 표적 IL6 및/또는 IL6 수용체 알파를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 세포.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, CAR 요법과 관련된 모세관 누출을 완화시키기 위해 펩타이드 FX06을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 세포.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 단백질이 FKBP 도메인의 하나 이상의 카피와 융합으로 발현되는, 세포.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 신호전달 단백질의 상기 활성이 이량체화제의 존재 하에 상기 FKBP 도메인의 이량체화에 의해 번역 후 제어되는, 세포.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 이량체화제가 AP20187인, 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR의 상기 항원 특이적 도메인이 MPL을 표적하는, 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항원 특이적 도메인이 2 항원을 표적하는, 세포.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 2 항원이 MPL 및 CD123인, 세포.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR의 상기 항원 특이적 도메인이 CD19, CD23, Lym1, Lym2, CLEC5A, CDH179b, FLT3, GCC, Muc1, CSF2RA, GFRa4, CD32, IL11Ra, IL13Ra, NYBR1, SLea,　CD200R, TGFBetaR2, CD276, TROP2, LAMP1, PTK7, DLL3, CDH1, CDH6, CDH17, CDH19, TSHR 및 티로시나제를 표적하는, 세포.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 CAR의 상기 항원 특이적 도메인이 MPL을 표적하고 161 (서열번호: 2500 및 2501), 175 (서열번호: 2499), 178 (서열번호: 2503), 111 (서열번호: 2502), AB317 (서열번호: 2404), 12E10 (서열번호: 2505) 또는 huVB22Bw5 (서열번호: 2506)으로부터 선택된 하나 이상의 scFv 단편 또는 hTPO (서열번호: 2323) 또는 mTPO (서열번호: 2323)의 세포외 수용체 결합 도메인으로부터 선택된 리간드를 포함하는, 세포.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 CAR의 상기 항원 특이적 도메인이 CD19를 표적하고 CD19Bu12 또는 CD19MM으로부터 선택된 하나 이상의 scFv 단편을 포함하는, 세포.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 세포가 T-림프구 (T-세포)인, 세포.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 세포가 자연 살해 (NK) 세포인, 세포.
  17. 청구항 1의 상기 CAR을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 청구항 1의 상기 신호전달 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 MC159-vFLIP 신호전달 단백질을 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 핵산.
  19. 청구항 17 또는 18의 상기 핵산에 의해 인코딩된, 폴리펩타이드.
  20. 청구항 17 또는 18의 핵산을 포함하는, 벡터.
  21. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 상기 세포, 청구항 17 또는 18의 핵산, 청구항 19의 폴리펩타이드 또는 청구항 20의 벡터, 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는, 약제학적 조성물.
  22. 청구항 13의 상기 세포의 치료적 유효량을, 대상체에 투여하는 것을 포함하는, MPL-발현 암의 치료 방법.
  23. 청구항 23에 있어서, 상기 암이 혈액 암인, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 혈액 암이 어느 하나 이상의 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 림프종, 다발성 골수종 및 급성 림프구성 백혈병인, 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 상기 대상체에 티로신 키나제 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 억제제가 키나제의 상기 src 계열을 억제시키는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 억제제가 Lck를 억제시키는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 억제제가 어느 하나 이상의 다사티닙, 포나티닙 또는 A-770041인, 방법.
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