KR20180081538A - 전도성 중합체들을 이용한 겔 전기영동 및 전달 조합 및 사용 방법 - Google Patents
전도성 중합체들을 이용한 겔 전기영동 및 전달 조합 및 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
단백질 분석을 위한 겔 전기영동 및 멤브레인 전달에서 사용하기 위한 프리 캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛, 및 이의 사용 방법이 개시된다. 투명한 전기 전도성 중합체 플레이트(들)는 전기영동 겔과 면역 블로팅 멤브레인을 수용한다. 상기 겔 및 멤브레인은 전기 전도성 층 또는 필름을 갖는 2 개의 플레이트들 또는 전도성 중합체의 2 개의 플레이트 사이에 위치한다. 전기 영동 단계에서, 전류가 단백질을 통해 이동하여 단백질이 분리되게 한다. 그 다음, 겔 또는 장치를 제거하거나 또는 재배향하지 않고, 전기 흐름이 도전성 중합체를 통해 겔을 통해 흐를 수 있도록 전기 접촉이 전환되며, 이로서, 단백질이 동일한 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛 내에 수용된 멤브레인으로 전달되게 된다. 본 장치를 통해 사용자는 전기 영동 단계 및 전달 단계 사이에서 겔을 이동시키지 않고 단백질 분리 단계 및 단백질 전달 단계를 시각화할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2016년 11월 10일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/348,803에 대한 우선권 및 이득을 주장하며, 미국 특허 출원 번호 15/348,803은 2016년 2월 5일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/017,540의 일부 계속 출원(continuation-in-part)이며, 상기 미국 특허 출원 번호 15/017,540은 2015년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 62/253,143에 대한 우선권 및 이점을 주장하며, 이러한 선행 출원된 미국 특허 출원들 3 개 모두는 본 명세서에서 그 전체 내용이 참조로서 인용된다.
본 발명은 일반적으로 거대분자들의 겔 전기영동(electrophoresis) 및 거대분자들의 전달(transfer)에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 투명한 도전성 중합체들을 갖는 단일 프리캐스트(precast) 겔 및 멤브레인 조합 유닛을 사용하는 것에 관한 것이다.
웨스턴 블로팅(western blotting)은 일반적인 기술이지만, 전달 단계로부터 발생하는 많은 문제들이 여전히 존재한다. 이러한 문제들로서, 멤브레인들의 상에 겔들을 위치시킬 때 기포들이 도입되고, 필요로 하는 단백질의 양을 줄이기 위해 겔들이 더 얇아짐에 따라, 사용자가 프리캐스트 세팅(precast setting)으로부터 블로팅 멤브레인으로 겔들을 이동시킬 때 겔들의 찢어짐(tearing)이 발생한다. 이러한 문제들은 제한된 양의 단백질 분석이 필요한 경우, 특히 단백질이 더 이상 없거나 단백질이 검체(clinical specimen)인 경우 특히 치명적일 수 있다. 또한, 단백질 분리 및 단백질 전달 조합 유닛의 개념은, 프리캐스트 겔들을 수용하기 위한 절연 플라스틱들의 현재의 사용에 의해 방해받고 있다. 또한, 연구자들은 전기영동 중에 단백질 분리를 보는 것을 종종 선호하는데, 이는 불투명한 물질들을 겔 지지 구조용 플레이트들(gel supporting structural plates)로서 사용하는 것을 제한한다.
전통적인 2 단계 과정(단백질 분리 및 단백질 전달)을 단일 단계로 줄이며 전기영동용 및 단백질 전달용 별도의 장치들 대신에 단일 장치를 사용하여 웨스턴 블로팅 기술을 간소화한다. 그러나, 단일 조합 겔 전기영동 및 단백질 전달 유닛을 제조하는 한 가지 도전은 사용자가 전기영동 중에 단백질 분리 정도를 보며 이후에 겔을 멤브레인으로 물리적으로 전달하지 않으며 단백질들을 블로팅 멤브레인으로 전달할 수 있는 장치를 만드는 것과 관련된다. 전기영동 및 단백질 전이 모두를 수행하는 이러한 장치에 있어서, 플레이트들은 겔에 대한 구조적 지지체를 형성해야 하나, 또한 겔 지지 플레이트들을 통하여 전류를 블로팅 멤브레인으로 전달할 수 있어야 한다. 문제는 단백질들을 블로팅 멤브레인에 전달하는 데 필요한 전류가 전기영동 중에 단백질들을 분리하는 데 필요한 전류에 수직으로 흘러야 한다는 것이다.
다양한 장치들 및 기술들을 사용하여 단백질들 및 다른 거대분자들의 분리 및 전달을 단순화하려는 많은 시도들이 있어 왔다. 평판 겔 전기영동 및 블로팅 모두는 대향하는 수직 벽들을 따라서 있는 분리 전극들(separation electrodes) 및 겔의 높이의 위 및 아래에 수평적으로 배치된 블로팅 전극들(blotting electrodes)을 갖는 단일 탱크 셀 내부에서 수행된다. 셀은 분리(separatory) 모드 및 블로팅(blotting) 모드로 작동되며, 상기 셀에서 분리 전극 및 블로팅 전극은 개별적으로 에너지가 공급된다. Fernwood는 전계가 멤브레인을 통과할 수 있도록 하는 다공성 겔 지지체들이 필요하며, 분리 국면에서 상부 플레이트 전달 전극은 완충 용액과의 접촉으로부터 제거되어야 한다. Fernwood는 또한 전기영동용 및 단백질들의 전달용 겔-지지 플레이트들을 사용하는 데 따른 몇 가지 문제점들에 대해서도 논의한다. 분리 국면 동안 겔의 양 말단들 사이에서 전위차가 유지되어야 하므로, 분리하는 동안 완충 용액과 접촉한 도전성 블로팅 전극들은 겔 주위의 장을 무효화(nullify)하여, 이로써 단백질 이동(migration) 및 단백질 분리를 방지한다. Fernwood는 와이어 어레이(wire array)를 하부 블로팅 전극으로 사용함으로써 이러한 문제를 해결하며, 장 무효화를 피하기 위해 전극은 탱크 내의 완충액 높이보다 높이거나 낮춰야 한다. 제공되는 다른 해결책은 전극 플레이트의 높이가 고정될 수 있으며, 완충 높이가 필요에 따라 상승 및 하강되어서 겔 지지 플레이트와의 전기 접촉을 설정하거나 끊을 수 있다는 것이다. 전기영동 국면 및 전달 국면 사이에서 플레이트 또는 완충액을 높이거나 낮추려면 전달되는 단백질들을 블로팅 멤브레인으로 분리하는 장치들 및 방법들에 대한 추가적인 수준의 복잡성이 필요하다.
Dutertre에 허여된 미국 특허 제 5,102,524호는 겔 플레이트들을 통한 거대분자들의 이동(migration)을 제어하는 전기영동 장치 및 전기영동 방법을 기술하며, 이러한 장치 및 방법에서는 거대분자들(예를 들어, 단백질들)을 먼저 분리하고 그 다음 상기 분자들을 블로팅 멤브레인으로 전달하는 2-단계 과정에 상이한 세트들의 전극들이 사용된다.
Cognard에 허여된 미국 특허 제 5,593,561호는 거대분자들을 제어된 방식으로 이동시켜서 용기 내의 멤브레인으로 거대분자를 전달하기 위한 전기영동 장치 및 전기영동 방법을 기술한다. 전극들 사이에 형성된 제 1 전계는 겔 내에서 거대분자 분리를 위한 수단을 제공하며, 제 1 전계와 수직인 제 2 전계는 거대분자를 멤브레인 상으로 전달하는 수단을 제공한다. 기술된 방법에서, 전극들 및 블로팅 멤브레인들은 용기 내에 모이며, 상기 용기는 이어서 겔로 채워진다. 겔은 액화되어 멤브레인을 제거한다. Cognard의 장치는 사전-제조된 겔 및 멤브레인 유닛없이 사용하기 위한 것이다.
Margalit에 허여된 미국 특허 제 8,173,002호에는 단백질들을 블로팅 멤브레인 상에 전달하는 드라이 블로팅 시스템이 개시된다. 시스템은 전기영동 장치를 포함하지 않으므로, 사용자는 단일 장치 내에서 단백질들의 분리 및 블로팅을 보지 못한다. 장치는 사용자가 겔을 블로팅 장치 상의 블로팅 멤브레인에 전달하도록 존재할 것을 요구한다. Margalit의 특허는 전기 도전성 중합체들의 사용을 교시하지만, 단백질들을 분리하여 단백질들을 블로팅 멤브레인으로 전달할 수 있는 단일 장치와 함께 조합되지는 않는다. Margalit은 투명한 겔 지지 플레이트들의 사용을 교시하지 않으므로, 사용자는 전기영동 중에 단백질 분리를 볼 수 있다.
Ohse가 출원인인 미국 특허 출원 공개 제2006/0042951호는 미세 홈(fine grove), 전달 전극 및 약 0.1㎛의 두께를 갖는 투명 도전성 물질을 사용하여 단백질들을 분리 및 전달시키는 장치를 개시한다. 상기 장치는 시료 내의 물질을 경로를 따라 이동시키는 한 쌍의 분리 전극들 및 시료 내의 물질을 전기영동에 의해 포획 물질로 전달시키는 한 쌍의 전달 전극들을 포함한다. 투명 도전성 물질은 약 0.1㎛의 두께로 인해 지지 구조체가 될 수 없으며, 약 0.1㎛의 두께는 겔에 대한 지지 벽들로서 작용하기에 충분한 강성을 갖지 않을 것이다. 분리 및 블로팅은 전기영동 완충액 내에서 수행되며, 겔 평판(gel slab) 또는 겔 평판 어셈블리(gel slab assembly)를 사용하지 않으며, 상기 겔 평판 및 겔 평판 어셈블리는 웨스턴 블롯들을 위해 일반적으로 사용되는 것들이다.
Serikov에 허여된 미국 특허 제 6,602,391호는 거대분자들의 모세관 분리 및 분리-후 블로팅을 위한 장치 및 방법을 개시한다. 그러나, Serikov는 사용자가 거대분자의 분리를 볼 수 있으며 웨스턴 블로팅을 위해 블로팅 멤브레인으로 거대분자를 전달할 수 있는 평판 겔의 사용을 개시하지 않는다.
도전성 폴리머들은 이전에 기술되었지만 전기영동 및 블로팅과 관련되지는 않는다. Ates 등은 "Conducting Polymers and their Applications"(Current Physical Chemistry, 2012, 2, 224-240)에서 도전성 폴리머들의 수많은 응용들을 설명한다. Jung에 허여된 국제 특허 출원 제 PCT/EP2013/065163호은 도전성 중합체 조성물 및 정전방지 층용 투명 전극이 개시되어 있다. Kim에 허여된 국제 특허 출원 제 PCT/KR2008/002236호에는 투명 전극으로 사용하기 위한 도전성 중합체 및 잉크젯 분사 방법을 사용하여 전극을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 출원 제 13/616,804호에는 투명 전극을 제조하기 위해 도전성 중합체 층이 형성된 투명 패널 및 투명 패널 제조 방법이 개시되어 있다.
도전성 중합체들을 사용하는 투명한 도전성 플레이트들은 전기영동 및 블로팅 장치들에 사용되지 않았으며, 이러한 장치들에서 도전성 플레이트들이 겔 지지 구조체들로 사용되어 프리캐스트 겔 및 그의 도전성 중합체 하우징이 단백질 분리 후 겔을 제거하지 않으면서 전기영동 및 블로팅을 위해서 사용될 수 있으며, 상기 도전성 플레이트들은 단백질들이 블로팅 멤브레인으로 전달될 때에 겔 지지 구조체로도 사용될 수 있다.
단일 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛에서 겔 전기영동 및 단백질 전달을 수행할 수 있는 장치들 및 관련 방법들에 대한 요구가 여전히 존재한다. 또한 연구원들은 전기영동 국면동안 전기영동 단계들을 보는 것을 선호하기 때문에 시각화가 가능한 겔 구조 지지 플레이트들을 개발할 필요가 있지만, 웨스턴 블롯의 전기영동 국면과 단백질 전달 국면에도 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 배경 및 설명에 개시된 모든 특허들, 특허 출원들 및 비특허 출원들은 그들의 전체들이 모든 목적들을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 도전성 중합체들을 사용하여 하나의 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛을 이용하여 겔 전기영동 및 겔 전달을 제공함으로써, 유리하게 상기 언급된 결점들을 제거하며, 이로써 핸즈프리 단백질 분리를 수행하고 이어서 블로팅 멤브레인으로의 단백질들의 효율적인 전달을 수행하는 신속하고 신뢰할 수 있으며, 용이한 방법을 제공한다.
본 발명은, 블로팅 멤브레인이 겔과 인접하여 위치되며, 이로써, 단백질 분리 국면 동안 전류가 겔을 통해 한 방향으로 흐르도록 하며, 단백질 분리 국면이 완료된 후, 전류는 도전성 플레이트 또는 반도전성 플레이트를 분리 국면 동안의 전류의 흐름의 방향에 수직인 방향으로 흐르는, 전기 영동 겔을 지지하기 위한 디디바이스의 구조체 내에서 임의의 도전성, 반도전성 및/또는 분산(dissipative) 재료의 임의의 사용에 관한, 임의의 기법, 발명, 노하우, 방법, 구성, 장치, 기계, 제품, 소모품, 제형 및 이들의 임의의 조합으로 규정된다. 이는 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛으로부터 겔을 제거하지 않고 달성된다.
본 발명은 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛에서 겔 전기영동 및 단백질 전달 방법을 포함한다. 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛은 웨스턴 블롯에 사용하기 위한 도전성/반도전성 중합체 외장들, 전기영동 겔 및 블로팅 멤브레인으로 구성된다. 겔 및 멤브레인 쌍은 두 장의 도전성 고분자 사이에 끼어 있다. 겔은 전류가 겔의 y-축의 대향 측면들 상의 전극들 사이를 흐를 때 겔 내에서 크기별로 단백질들을 크기에 따라 분리할 수 있다. 블로팅 멤브레인은 단백질 분리 후 겔을 블로팅 멤브레인으로 물리적으로 전달하지 않고 단백질 분리 후 겔로부터 전달된 단백질들을 고정시킬 수 있다.
본 발명은 또한 겔과 멤브레인 사이의 도전성이 낮은 겔(즉, 높은 퍼센트의 폴리아크릴아미드)의 얇은 층; 폴리아크릴아미드, 비스-트리스, 트리스-아세테이트 등으로 제조된 것들을 포함하는 상이한 유형들의 전기영동 겔들; 니트로셀룰로스 및 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride; PVDF)로 제조 된 것들을 포함하는 상이한 면역블로팅(immunoblotting) 멤브레인들; 상이한 도전성 중합체 물질들; 플라스틱 절연체들; 완충액 탱크 및 완충액 뚜껑; 전극들이 있는 프리캐스트 겔 및 멤브레인 홀더 카세트; 음극 챔버; 양극 챔버; 전극 조립체; 애노드 및 캐소드 완충액들; 냉각 유닛; 및 프로그램밍-가능 전원 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명은 웨스턴 블로팅(western blotting) 응용들에서 특정 저항성을 갖는 혁신적인 도전성 중합체들을 사용하여 현재의 방법들에서의 근본적인 문제들을 해결하고, 편리한 1-단계 전기영동 및 전달 방법들을 가능케 한다는 점에서 독특하다. 보다 구체적으로, 본 발명이 도전성/반도전성 중합체들을 사용하여 프리캐스트 겔 및 블로팅 멤브레인 조합 을 수용하며, 상기 프리캐스트 겔 및 블로팅 멤브레인 조합은 한 시나리오(전기영동)에서 절연체로서 작용하며, 또다른 시나리오(단백질 전달)에서는 전극은, 한 쌍의 전극들을 이용해 한 방향으로 크기에 따라 단백질들을 분리하며, 상이한 한 쌍의 전극들을 이용해 수직으로 블로팅 멤브레인에 단백질들을 전달하는 장치에 있어서 유리하다는 사실에서 본 발명은 독창성이 있다. 프리캐스트 겔을 구조적으로 지지하는 데 사용되는 도전성 중합체들은 투명하므로 사용자는 전기영동 중에 단백질 분리를 볼 수 있다.
본 발명의 목적은 종래의 용액들과 관련된 문제점들 또는 결점들을 겪지 않는 도전성 중합체들을 사용하는 단일의 프리캐스트 겔 및 블로팅 멤브레인 조합 유닛으로 겔 전기영동 및 전달을 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 전기영동 분리 및 블로팅을 위한 장치가 있다. 상기 장치는 투명 도전성 중합체로 제조된 제 1 전기적 반도전성 플레이트 및 상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트와 실질적으로 평행한 제 2 전기적 반도전성 플레이트를 갖는다. 상기 장치는 전기영동 겔 및 블로팅 막을 가지며, 상기 전기영동 겔은 상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트 및 상기 블로팅 멤브레인 사이에 위치한다. 블로팅 멤브레인은 전기영동 겔 및 제 2 전기적 반도전성 플레이트 사이에 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 장치는 또한 상기 제 2 전기적 반도전성 플레이트 및 상기 블로팅 멤브레인 사이에 저 도전성(고 저항성) 겔을 포함한다. 실시예는 또한 상기 제 2 전기적 반도전성 플레이트 및 상기 블로팅 멤브레인 사이에 여과지를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 제 1 투명 전기 도전성 플레이트는 어레이 또는 그리드로 배열되어 상기 플레이트 전체에 전류/전하를 분산시킨다.
또 다른 실시예에서, 상기 제 1 플레이트는 비-전기 도전성 정전-분산성 물질로 형성된다. 상기 장치는 투명 중합체로 제조된 제 1 플레이트, 상기 제 1 플레이트와 인접한 전기적 반도전성 투명 층, 상기 제 1 플레이트와 실질적으로 평행한 제 2 플레이트, 전기영동 겔 및 블로팅 멤브레인을 갖는다. 이러한 실시예에서, 비-전기 도전성 정전-분산성 플레이트는, 적어도 제 1 플레이트의 내측 표면에 배치되어 블로팅 국면 동안 플레이트 전극으로 작용하고 전기영동 중에 절연 플레이트로서 작용하는, 얇은 투명한 전기적 도전성 중합체 층 또는 얇은 투명한 전기적 도전성 필름을 갖는다.
또 다른 실시예에서, 상기 장치는 분리 국면용 전극을 각각 갖는 상측 완충액 챔버 및 하측 완충액 챔버를 갖는 액체 용기 탱크를 포함한다. 탱크는 또한 분리 국면용 전극들로부터 생성된 전계가 블로팅 국면용 전극들로부터 생성된 전계에 실질적으로 수직이 되도록 배열된 한쌍의 블로팅 국면용 전극들을 갖는다. 상기 장치는 단백질들의 분리 단계 후에, 분리 국면용 전극들과 블로팅 국면용 전극들을 간을 자동 또는 수동으로 스위칭하며 이들에 전압을 인가하도록 구성된 전력 공급부를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 거대분자들의 분리 및 분리 후 거대분자들을 블로팅 멤브레인으로 전달하는 방법이 있다. 사용자는 액체 용기 탱크 내에 제 1 배향의 장치를 제공한다. 상기 장치는 투명 도전성 중합체, 제 1 전기적 도전성 플레이트와 실질적으로 평행한 제 2 전기적 도전성 플레이트, 전기영동 겔, 및 블로팅 멤브레인으로 제조된 제 1 전기적 반도전성 플레이트를 갖는다. 전기영동 겔은 상기 제 1 도전성 플레이트 및 상기 블로팅 멤브레인의 사이에 있으며, 상기 블로팅 멤브레인은 상기 전기영동 겔 및 상기 제 2 전기적 도전성 플레이트 사이에 위치한다. 사용자는 한 쌍의 분리 전극들에 제 1 전기 구동력을 인가함으로써 장치의 겔을 따라 거대분자들(예를 들어, 단백질들)을 분리하며, 상기 제 1 구동력은 겔의 y-축을 따라 전류를 흐르게 한다. 전압은 겔 내에서 생체분자들이 크기에 따라 분리되도록 하며, 즉, 더 큰 분자들은 더 작은 분자들보다 y-축을 따라 더 천천히 이동한다. 분리 전극들에 인가된 전력은 그 후 중단된다. 액체 용기 탱크로부터 겔 및 전달 멤브레인을 제거하지 않으며, 또한 액체 용기 탱크 내의 겔 및 멤브레인의 동일한 배향을 유지하면서, 제 2 전기 구동력이 제 1 전기 구동력과 실질적으로 수직인 한 쌍의 블로팅 전극들에 인가된다. 겔 및 멤브레인 유닛의 방향은 분리 전극들 및 블로팅 전극들에 대해 유지된다. 제 2 전기 구동력은 제 1 방향으로 겔의 z-축을 따라 전류가 흐르게 한다. 두 번째 전기 추진력은 생체분자들을 겔로부터 겔에 인접한 블로팅 멤브레인으로 이동시킨다. 생체분자들의 분리 및 블로팅 멤브레인으로의 생체분자들의 이동 단계들은 탱크로부터 유닛을 제거하지 않으며 수행되므로, 상기 분리 단계 및 전달 단계 사이에서 상기 겔 및 멤브레인 조합 유닛을 재배향할 필요 없이 단일 액체 용기 탱크 내에서 상기 전기 영동 및 단백질들의 전달 단계들이 결합된다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명이 보다 상세하게 설명외는데, 이는 본 요약, 상세한 설명, 및 구체적으로 논의되거나 달리 개시된 임의의 바람직한 실시예 및/또는 특정 실시예와 관련하여 읽히도록 의도된다. 그러나, 본 발명은 많은 상이한 형태들로 구체화될 수 있으며, 본 명세서에 설명 된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며; 오히려, 이러한 실시예들은 단지 설명을 위해 제공되는 것으로, 본 개시는 철저하고 완전하며 본 발명의 전체 범위를 당업자들에게 완전히 전달할 것이다.
본 발명의 이러한 특징들 및 다른 특징들 및 이점들은 본 명세서의 명세서, 청구 범위들 및 도면들을 참조하면 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 전기영동 및 전달을 위한 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일반적인 배치의 측면도를 도시한다.
도 2는 종래 기술에서 공지된 바와 같은 전기영동에 전형적으로 사용되는 전형적인 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 정면도를 도시한다.
도 3은 전기영동 및 전달 탱크 내의 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 측 단면도를 도시한다.
도 4는 탱크 내에 위치된 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛이 없는 전기영동 및 전달 탱크의 사시도를 도시한다.
도 5는 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 정면도를 도시한다.
도 6은 전기영동 겔과 접촉하는 도전성 와이어 메쉬 및 얇은 도전성 중합체 또는 필름을 갖는 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 측면도를 도시한다.
도 7은 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 사시도를 도시한다.
도 8은 겔 및 멤브레인용 갭을 생성하기 위해 하나의 플레이트 상에 돌출부들을 갖는 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 평면도를 도시한다.
도 9는 도 8의 실시예의 사시도를 도시한다.
도 1은 전기영동 및 전달을 위한 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일반적인 배치의 측면도를 도시한다.
도 2는 종래 기술에서 공지된 바와 같은 전기영동에 전형적으로 사용되는 전형적인 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 정면도를 도시한다.
도 3은 전기영동 및 전달 탱크 내의 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 측 단면도를 도시한다.
도 4는 탱크 내에 위치된 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛이 없는 전기영동 및 전달 탱크의 사시도를 도시한다.
도 5는 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 정면도를 도시한다.
도 6은 전기영동 겔과 접촉하는 도전성 와이어 메쉬 및 얇은 도전성 중합체 또는 필름을 갖는 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 측면도를 도시한다.
도 7은 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 사시도를 도시한다.
도 8은 겔 및 멤브레인용 갭을 생성하기 위해 하나의 플레이트 상에 돌출부들을 갖는 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 일 실시예의 평면도를 도시한다.
도 9는 도 8의 실시예의 사시도를 도시한다.
본 발명은 이하에서 첨부된 도면들을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이며, 첨부된 도면들에는 본 발명의 실시예들이 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 다양한 상이한 형태들로 구체화될 수 있으며, 본 명세서에서 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이러한 실시예들이 제공되어 본 발명이 철저하고 완전하게 이루어지며, 당업자들에게 본 발명의 범위를 완전하게 전달할 것이다.
구성요소가 다른 구성요소 "상에(on)" 존재한다고 언급될 때, 구성 요소가 다른 구성요소 상에 직접 존재할 수 있거나 사이에 끼워지는 구성요소들이 그 사이에 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는(and/or)"이라는 용어는 하나 이상의 관련되어 나열된 항목들의 임의의 및 모든 조합들을 포함한다.
비록 용어들, 제 1, 제 2, 제 3 등이 다양한 구성요소들, 성분들, 구역들, 층들 및/또는 영역들을 설명하는 데에 본 명세서에서 사용될 수 있더라도, 이러한 구성요소들, 성분들, 구역들, 층들 및/또는 영역들이 이런 용어에 의해 한정되어서는 안된다는 것이 이해될 것이다. 이러한 용어들은 단지 하나의 구성요소, 성분, 구역, 층 및/또는 영역을 다른 구성요소, 성분, 구역, 층 또는 영역과 구별하는 데에만 사용된다.
도면들에 도시된 구성요소들, 성분들, 구역들, 층들 및 영역들은 반드시 일정한 비율로 그려진 것은 아니라는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 용어는 오직 특정 실시예들을 설명하기 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않았다. 본 명세서에 사용된, "일", "하나의" 및 "상기"라는 단수형은 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않은 이상 복수형도 포함하는 것으로 의도된 것이다. 본 명세서에 사용될 때 용어 "포함하다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하다(includes)" 및/또는 "포함하는(including)"은 정해진 특징부들, 구역들, 완전체들, 단계들, 작동들, 구성요소들 및/또는 성분들의 존재를 명시하나, 하나 이상의 다른 특징부들, 구역들, 완전체들, 단계들, 작동들, 구성요소들 및/또는 성분들의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
또한, 본 명세서에서, 상대적인 용어들, 예를 들어 "하측(lower)" 또는 "하면(bottom)" 및 "상측(upper)" 또는 "상면(top)" 및 “좌측(left)”또는 “우측(right)”은 도면들에서 도시된 바와 같이 다른 구성요소(들)에 대한 일 구성요소의 관계를 설명하는 데 사용될 수 있다. 상대적인 용어는 도면들에서 도시된 배향(orientation) 이외에 장치의 상이한 배향을 포함하는 것으로 의도되는 것이 이해될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전들에서 정의된 용어들과 같은 용어들은 관련된 기술 및 본 발명의 맥락에서의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로서 해석되어야만 하며, 본 명세서에서 분명하게 정의되지 않는다면 이상화되거나 너무 형식적인 의미로 해석되지 않을 것이라는 것이 더 이해될 것이다.
예시적인 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들을 참조하여 본 명세서에서 설명된다. 이러한 바와 같이, 예를 들어, 제조 기술들 및/또는 공차들의 결과로서 도면들의 형상들로부터의 변형들이 기대되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 본 명세서에서 도시된 바와 같은 구역들의 특정 형상들로 한정되는 것으로서 구성되어서는 안되나, 예를 들어, 제조로부터 기인된 형상들에 있어 편차들을 포함하는 것이다. 본 명세서에 예시적으로 개시된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소들이 없는 경우에 적합하게 실시될 수 있다.
본 발명은 도전성 중합체들을 사용하는 하나의 프리캐스트(precast) 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)을 이용한 겔 전기영동(gel electrophoresis) 및 전달에 관한 것이다. 전기영동은 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)(SDS-PAGE)을 포함하나 이에 한정되지는 않는 다양한 방법들을 사용하여 수행될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 다음의 구성요소들로 이루어진다: 2 개의 도전성 중합체들의 시트들(2,4) 사이에 끼여 있는 겔(6) 및 전달/블로팅(blotting) 멤브레인(12)을 포함하는 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10). 또한, 도전도가 낮은 겔(8)은 겔(6)과 멤브레인(12)을 분리시킨다.
도 1은 전기영동 및 전달용 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)의 일반적인 구성의 일 실시예의 측면도를 도시한다. 일반적으로, 겔(6) 및 멤브레인(12)은 도전성/반도전성 중합체들로 구성된 2 개의 반도전성 플레이트들 또는 시트들(2,4) 사이에 끼여 있다. 또한, 겔(6) 및 멤브레인(12)은 낮은 도전성(즉, 높은 퍼센트의 폴리아크릴아미드) 겔(8)의 얇은 층에 의해 분리 될 수 있다. 분리 모드(separation mode) 중에, 전류는 겔(6)의 상측 표면(20)으로부터 겔(6)의 하측 표면(18)으로 흐른다. 블로팅 모드(blotting mode)(즉, 단백질 전달 모드) 중에, 전류는 제 1 반도전성 플레이트(2)로부터 제 2 반도전성 플레이트(4)로 흐른다.
제 1 반도전성 플레이트(2)는 투명한 도전성 재료로 제조된다. 이러한 도전성 재료들은 폴리아닐린들, 폴리피롤들(polypyrroles), 폴리티오펜들 또는 이하에서 더욱 상세히 설명되는 다른 투명한 도전성 중합체들의 조성물들을 포함한다. 제 1 도전성 플레이트(2)는 외측 표면(22) 및 내측 표면(14)을 갖는다. 제 2 도전성 플레이트(4)는 또한 도전성 재료로 만들어지지만, 투명할 필요는 없는데, 이는 사용자가 겔의 일 측면을 단지 봄으로써 단백질 전달을 볼 수 있기 때문이다. 불투명한 도전성 재료 대신에 투명한 도전성 재료를 포함하는 시스템을 사용하는 것의 이점은 사용자가 전기영동 중에 단백질 이동/분리 정도를 시각적으로 결정하기 위해 전기영동의 분리 국면을 보는 것을 종종 선호한다는 것이다. 일반적인 플레이트 전극들은 금속이므로 불투명하다. 그러나, 일반적인 금속 플레이트 전극들을 겔의 표면을 따라 사용하면, 사용자들은 전기영동 중에 단백질들이 어느 정도 분리되었는지를 판단할 수 없다. 일 실시예에서, 단지 단일의 도전성 플레이트(2)만이 투명할 필요가 있으며, 결과적으로 사용자는 얼마나 많은 양의 단백질의 이동이 발생했는지를 시각적으로 판단할 수 있으며, 이는 단백질의 이동이 겔의 일 측면을 봄으로써 관찰될 수 있기 때문이다. 겔(6)의 제 2 측면은 전달/블로팅 멤브레인(12)에 의해 시야가 차단될 것이다. 바람직한 실시예에서, 도전성 플레이트(2)에 사용되는 중합체는 103ohm-cm 내지105ohm-cm의 범위의 체적 저항률을 가지나, 108ohm-cm만큼 높을 수 있다. 플레이트들(2, 4)은 겔을 지지하기 위해 다양한 크기들일 수 있다. 일반적인 겔 지지 플레이트들은 약 10cm x 10cm이지만, 플레이트들은 겔을 수용 하기 위한 임의의 크기일 수 있다.
103ohm-cm 내지 105ohm-cm의 범위 이상의 체적 저항률을 갖는 플레이트들을 사용하면, 전류가 겔의 수직 단부들 근처의 전류들에 인가될 때 전계 무효화가 방지되며, 이는 플레이트들이 플레이트들(2,4)이 둘러싸고 있는 전기영동 겔보다 더 높은 체적 저항률(통상적으로 10ohm-cm 내지 300ohm-cm 사이임)을 갖기 때문이다.
반도전성 플레이트들(2,4)가 무효화 전계를 방출하지 않으면서, 전류가 최소 저항의 경로를 취하며, 상단 분리 전극(separation electrode)으로부터 겔을 통해 하단 분리 전극으로 이동하기 때문에, 무효화 전계(nullifying electric field)가 방지된다.
일반적으로, 전기영동 겔들에 대한 지지 구조체들을 생성하는 데 사용되는 중합체들은 고분자들이며, 따라서 전기 절연성이다. 그러나 반도체들보다 훨씬 높은 수준들(1000S/cm까지)에서 본질적으로 전기를 도전하는 특수한 종류의 중합체들이 있으며, 상기 특수한 종류의 중합체들의 도전율들/저항률들은 다양한 생산 방법들을 통해 제어될 수 있다. 도전성 중합체들은 전기를 도전하는 유기 중합체들이다. 특히, 상기 유기 중합체들은 금속보다 더 낮은 전기 전도도를 제공하며, 투명성과 같은 플라스틱들 특성들을 가질 수 있다. 전기적 특성들(즉, 비저항)은 유기 합성 방법들 및 분산 기술들을 사용하여 미세 조정될 수 있다. 유기 도전성 중합체들의 종류들은 폴리아세틸렌, 폴리(피롤)들(PPY), 폴리아닐린들, 폴리(티오펜)들(PT), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(PEDOT), 폴리(p-페닐렌 설파이드(PPS), 폴리(아세틸렌)들(PAC), 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV) 및 이들의 유도체들을 포함한다. 도전성 중합체들은 도전성 중합체들의 조합들 또는 중합체들의 유도체들의 조합들 및 도전성 중합체들과 비도전성 중합체들의 조합으로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 중합체의 전기 전도도는 도핑에 의해서 고분자의 공액 π궤도(conjugated π-orbital)로부터 전자를 제거하고, 중합체 골격(backbone)을 따라서 전자들을 비편재화(delocalization)시킴으로써, 형성된다.
전계 도전성 플레이트들 전체를 따라 고르게 분포되도록 하기 위해, 플레이트들의 조성은 높은 정전-분산(static-dissipative) 특성들을 가져야 한다. 각각의 도전성 플레이트의 모든 영역들로부터 나오는 실질적으로 동일한 전계를 보장하기 위해, 도전성 플레이트의 외측 표면은 제 1 전기적 반도전성 플레이트 상 또는 내부에 배치된 하나 이상의 얇은 전기적 도전성 와이어들(또는 나노와이어들)을 가질 수 있다. 와이어들은 어레이 또는 격자형 또는 메쉬로 배열될 수 있다. 사용자가 전기영동 중에 단백질 분리를 모니터할 수 있도록 와이어들은 방해가 되지 않으며(unobtrusive) 따라서 와이어들은 사용자가 와이어들 및 도전성 플레이트를 통해 겔을 보는 것을 막지 않는다. 0.5 cm 내지 1.0 cm 사이의 간격으로 이격된 와이어들 또는 와이어들의 그리드들을 갖는 바람직한 실시예들은 그 표면으로부터 나오는 실질적으로 균일한 전계를 갖는 플레이트 전극을 생성하기에 충분할 수 있다.
다시 도 1을 참조하면, 제 1 도전성 플레이트(2)의 내측 표면(14)에 인접하여 전기영동 겔(6)이 있다. 전기영동 겔(6)은 전형적인 평판(slab) 겔이다. 겔(6)은 아가로스, 폴리아크릴아미드, 트리스-글리신, 비스-트리스 및 트리스-아세테이트를 포함하는 당 업계에 공지된 임의의 수의 조성물들로 제조될 수 있다. 아가로스 겔들은 일반적으로 DNA 및 RNA 분석에 사용되며, 폴리아크릴아미드 겔들, 트리스-글리신, 비스-트리스, 트리스-아세테이트는 단백질 분석에 사용된다. 단백질 분석을 위한 전형적인 분해 겔들은 6 %와 15 % 사이의 폴리아크릴아미드로 제조된다. 바람직한 실시예들에서, 비스-트리스 겔은 10% 내지 12%의 범위 내에 있으며, 트리스-아세테이트 겔은 7% 내지 10%의 범위 내에 있으나, 시료에서 분석하거나 조사하고자 하는 단백질의 크기에 따라 값들은 이러한 범위들의 밖일 수 있다. 예를 들어, 거대분자(macromolecule)의 공지된 무게가 더 작을수록 더 높은 비율의 겔이 사용되어야 한다. 전기영동 겔(6)의 치수들은 전형적으로 직사각형이며, 바람직한 실시예에서 대략 10cm x 10cm이나, 동시에 진행될 시료의 수, 시료의 유형 및 시료의 체적에 따라 변할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)은 1cm 미만의 두께이지만, 더 두껍게 설계될 수도 있다. 전기영동 겔(6)의 대향 측면 상에는 저 도전성(즉, 높은 퍼센티지) 겔(8)이 있다.
저 도전성 겔(8)에 인접하여 전달(transfer) 멤브레인(12)이 있다. 고정(immobilization) 멤브레인으로도 알려져 있는 전달 멤브레인은 당업자들에게 잘 알려진 처리된(treated) 또는 유도체화된(derivatized) 형태의 물질들뿐 아니라 블로팅 페이퍼, 니트로셀룰로스, PVDF, 나일론 및 다른 물질들과 같은 넓은 범위의 블로팅 물질들 중 임의의 것일 수 있다. 멤브레인(12)의 사용 및 거대분자들이 전기영동 겔(6)로부터 저 도전성 겔(8)을 통해 멤브레인(12)으로 전달되는 방법은 하기에서 보다 상세히 논의된다. 전달 멤브레인(12)과 전기영동 겔(6) 사이의 저 도전성 겔(8)은 전기영동 중에 전기영동 겔(6)과의 전달 멤브레인(12)의 직접 접촉을 방지한다. 단백질들은 웨스턴 블롯(western blot) 전달 멤브레인들(12)과 높은 친화도를 가지므로, 저 도전성 겔(8)은 전기영동 중에 단백질들이 멤브레인(12)의 표면에 결합하는 것을 방지한다.
전달 멤브레인(12)에 인접하여 여과지(60)가 있다. 여과지(60)는 고 도전성 겔(8)과 제 2 도전성 플레이트(4) 사이에 끼워져 있다. 여과지(60)는 습윤시에 이온 저장소(ion reservoir)로 작용하여, 거대분자들이 멤브레인(12)으로 전달되는 것을 돕는다. 또한, 여과지는 전달 멤브레인(12)이 젖은 채로 있도록 보장한다. 전달 멤브레인(12) 및 여과지(60)는, 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)의 조립 이전에, 메탄올 용액, 다른 습윤 완충액으로 사전-습윤될 수 있거나, 여과지(60)는 전기영동 및 블로팅 국면들에 사용된 완충액으로 습윤될 수 있다. 전달 멤브레인-습윤 완충액은 일반적으로 메탄올을 포함한다.
도 1의 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)은, 투명한 제 1 도전성 플레이트(2)와 제 2 도전성 플레이트(4) 사이에 모두 끼워진 전기영동 겔(6), 저 도전성 겔(8), 전달 멤브레인(12) 및 여과지(60)를 포함한다. 저 도전성 겔(8) 및/또는 여과지(60)가 없는 실시예들은 또한 거대분자들을 분리하며 거대분자들을 전달 멤브레인(12)으로 전달하는 역할 모두를 할 수 있다.
도 2는 전기영동 및 단백질 전달을 위한 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)의 정면도를 도시한다. 전기영동 분리 국면 중에서, 단백질들은 겔의 상면(20)으로부터 겔의 하면(18)까지 수직으로 아래로 이동한다. 전기영동 중에, 더 큰 단백질들(상측 밴드들(62)로 표시됨)은 더 작은 단백질(하측 밴드들(64)로 표시됨)보다 겔(6)을 통해 더 느리게 이동한다. 일 실시예에서, 두 개의 비전도성 절연 플라스틱 스트립들(26, 28)이 있으며, 이러한 스트립들은 겔(6)의 측면들 상에 위치하지만, 또한 도전성 플라스틱/중합체 시트들(2,4) 사이에 끼워져 있어, 전기영동 단계 동안에, 겔(6)을 통해 전류의 흐름을 유도한다. 이러한 스트립들은 또한 카세트(cassette)에 구조적인 지지 및 강성을 제공한다. 전달/블로팅 단계 동안 단백질들의 이동은 y축을 따른 단백질 분리 방향에 수직 인 z축을 따른다.
프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)과 함께인 도 3의 탱크 장치(30)는 전기영동 분리 국면 및 전달 국면 모두에 대한 시스템으로서 기능한다. 탱크 장치(30)는 전방 패널(32), 후방 패널(68), 제 1 측면 패널(70), 제 2 측면 패널(72), 하면 패널(66), 후방 패널(68)상의 립(lip)(58) 및 뚜껑(도시되지 않음)을 포함하는 액체 용기이다. 립(58)은 다양한 형상들일 수 있지만, 바람직한 실시예에서는 탱크 장치(30)의 제 1 및 제 2 측면 패널들(70, 72)의 내측 벽들을 따라 실질적으로 U자-형이다.
단백질 분리 및 전달용 겔들은 일반적으로 탱크 장치(30) 내의 트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액과 같은 완충 용액을 함유하는 전해질 내에 잠긴다. 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)에 사용된 겔의 유형에 따라 다른 완충제들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 트리스-아세테이트 완충액은 트리스-아세테이트 겔들에 사용되는 반면, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰 산(MES) 또는 3-(N-모르폴리노)프로판술폰 산(MOPS) 완충액들은 비스-트리스 겔들에 사용될 수 있다. 이러한 시스템 내의 완충액은 전기영동 국면 및 전달 국면 모두에 효율적이어야 한다. 탱크 장치(30)는 상측 챔버(34) 및 하측 챔버(36)를 갖는다. 제 1 분리 국면용 음극 전극(음극)(38)은 상측 챔버(34) 내에 배치된다. 제 2 분리 국면용 양극 전극(양극)(40)은 하측 챔버(36) 내에 배치된다. 제 1 및 제 2 분리 국면용 전극들(38, 40)은 분리 국면용 전극들(38, 40)에 전력을 공급하기 위해 프로그램-가능한 전원(도시되지 않음)에 각각 연결된다. 전기영동 및 블로팅에 사용하기 위한 탱크 장치용 전원들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 제 1 및 제 2 분리 국면용 전극들(38, 40) 간의 요구되는 전압은 80 내지 150 볼트 사이이다. 전원은 상기 블로팅, 전달 전극들(50, 52)으로부터 상기 분리 국면용 전극들(38, 40)의 전기적 절연을 위한 스위칭 수단을 이용한다.
상측 챔버(34) 및 하측 챔버(36)는 각각 완충 용액(56)으로 채워지며, 전기 도전성 겔/멤브레인 조합 유닛(10)을 통해 서로 전기적으로 연결되며, 상기 전기 도전성 겔/멤브레인 조합 유닛(10)은 제 1 분리 전극(38)으로부터 상측 챔버(34) 내의 완충액(56)을 통해, 겔(6)을 통해, 하측 챔버(36)의 완충액(56)을 지나, 제 2 분리 전극(40)으로 음 전하들이 이동하게 한다. 이는 적어도 부분적으로 다음 때문에 달성된다: 도전성 폴리머들은 이들이 수용하는 겔보다 더 높은 저항을 갖는 겔을 수용한다. 후방 패널(68)은 그의 하측 영역에 하나 이상의 개구들(74)을 가지며, 하측 챔버(36)로부터의 완충 용액(56)이 겔(6)의 하측 표면(18)까지 채워지도록 하여 제 2 분리 전극(40)으로부터 겔(6)로 전기적 연결을 제공한다. 상측 챔버(34) 및 하측 챔버(36) 내의 완충 용액(56)은 동일한 완충 용액일 수 있거나 상이한 완충 용액들일 수 있으며, 일부 실시예들에서 상측 챔버(34) 내의 완충 용액(56)은 항산화제를 포함할 수 있다.
와이어들은 버퍼 용액(56)을 전화(electrify)하여 상측 챔버(34) 내의 용액이 음극(-)으로 작용하게 하고, 하측 챔버(36)의 용액이 양극(+)으로 작용하게 한다. 도데실 황산 나트륨(SDS)를 함유하는 시료 완충액 또는 당 업계에 잘 공지되어 있는 다른 완충액들 내의 단백질들은 단백질들이 음의 순 전하를 띠게 하여, 단백질들이 겔(6) 내에 있을 때, 단백질들은 당 업계에 공지된 바와 같은 전원으로부터 생성된 기전력(EMF)에 의해 음극(-)(38)으로부터 양극(+)(40)으로 이동한다. 겔 내의 웰들(84) 내에 단백질들을 넣고 전계를 가하면, 단백질들은 단백질들의질량에 따라 크게 달라지는 레이트들(rates)로 겔(6)을 통과하여 이동한다. 따라서, 제 1 분리 전극(38) 및 제 2 분리 전극(40)은 단백질들 및 다른 거대분자들을 크기에 따라 분리하는 전기영동 국면동안 각각 음극 및 양극으로 작용한다.
상측 챔버(34) 및 하측 챔버(36) 내의 완충 용액(56)은 서로 액체 접촉하지 않지만, 서로 전기 접촉하고 있다. 각각의 챔버(34, 36) 내의 완충 용액(56)은 완충 용액(56)이 탱크 장치(30)의 전체를 채우는 것을 방지하는 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10) 및 개스킷들(44, 46)에 의하여 접촉으로부터 방지된다. 탱크 장치(10)의 후방 패널(68)의 내측 표면에는 후방 패널 개스킷(46)이 배치되어 있다. 후방 패널 개스킷(46)은 완충액(56)이 블로팅 전극(52)과 접촉하는 것을 방지하며, 상기 블로팅 전극과의 접촉은 분리 국면 동안 원하지 않는 전류 흐름을 일으킨다. 또한, 립(58)의 외측 표면을 따라 배치된 립 개스킷(44)이 있다. 립 개스킷(44)은 분리 국면에 필요한 완충 용액(56)이 냉각 챔버(42)에서 사용되는 냉각 용액(54)과 접촉하는 것을 방지한다. 냉각 챔버는 물, 완충액 또는 다른 유형의 냉각제로 채워질 수 있다. 바람직한 실시예들에서의 개스킷들은 고무, 실리콘, 또는 액체 누출을 방지하는 밀봉부들을 형성하는 당 업계에 일반적으로 공지된 다른 재료들로 제조된다.
후방 패널 개스킷(46)이 배치되어 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)이 탱크 장치(30) 내에 배치될 때, 제 2 도전성 플레이트(4)의 외측 표면(24)이 개스킷(46)에 접촉하여 가압된다. 립 개스킷(44)이 배치되어 제 1 도전성 플레이트(2)의 내측 표면이 립 개스킷(44)에 대해 가압된다. 도 4에 도시된 바와 같이, 후방 패널 개스킷(46)은 후방 패널(68)의 내측 표면을 따른 연속적인 루프(continuous loop)이다. 립 개스킷(44)은 두 개의 측면 영역들(루프 개스킷을 형성하기 위한 상면 영역이 없음)에 연결된 하면 영역을 갖는 개방된 형상이다. 상면 상에 고무 밀봉 구조가 없기 때문에 완충액(56)은 겔(6)의 상면(20)과 전기적으로 접촉하게 된다. 요약하면, 개스킷들(44,46)이 다음과 같이 배치된다: 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)이 탱크 장치(30) 내에 정확하게 위치될 때, 개스킷들(44,46)이 밀봉(seal)을 형성하여 단백질 전달 국면 동안 요구되는 냉각 챔버(42) 및 다른 구조체들로부터 (전기영동 국면에 필요한) 상측 챔버(34) 및 하측 챔버(36)가 분리되게 한다. 챔버들(34, 36, 42)이 서로 액체 및/또는 전기적으로 접촉하는 것을 방지하는 또 다른 특징은 제 1 도전성 플레이트(2)가 제 2 도전성 플레이트(4)보다 크다는 것이다. 바람직한 실시예에서, 제 1 도전성 플레이트는 대략 12cm x 12cm이며, 제 2 도전성 플레이트(4)는 대략 10cm x 10cm(대략 겔(6)과 동일한 치수들)이다. 보다 큰 제 1 도전성 플레이트(2)는 제 1 도전성 플레이트(2)가 립 개스킷(44)과 접촉하며 보다 작은 제 2 도전성 플레이트(4)가 후방 패널 개스킷(46)과 접촉하게 한다. 보다 작은 제 2 도전성 플레이트(4)는, 완충 용액(56)이, 상측 챔버(34) 내 및 하측 챔버(36) 내에서 각각 제 2 도전성 플레이트(4)의 위 및 아래를 지나서 겔(6)에 도달하지만 보다 큰 도전성 플레이트(2)를 통과하지는 못하게 한다. 제 1 도전성 플레이트(2)는 완충 용액(56)이 냉각 챔버(42) 내로 들어가며, 전달/블로팅 국면 동안 사용되는 전달 전극들(50, 52)과 접촉하는 것을 방지한다.
상측 및 하측 분리 전극들(38, 40)에 의해 생성된 전계로 인해 단백질들이 겔(6)을 따라 수직으로 분리되는 분리 국면 후에, 전류는 분리 전극들(38, 40)로부터 전달 전극들(50, 52)로 전달/블로팅 국면에서 사용하기 위해 이동되며, 상기 전달/블로팅 국면은 단백질들이 전달 전극들(50,52)에 의해 제 1 도전성 플레이트(2) 및 제 2 도전성 플레이트(4)로 공급되는 EMF를 통해 겔(6)로부터 멤브레인(12)으로 이동하게 한다. 제 1 도전성 플레이트(2)는 전원에 연결된 제 1 전달 전극(50)과 전기적으로 접촉하며, 제 2 도전성 플레이트(4)는 제 2 전달 전극(52)과 전기적으로 접촉한다. 제 1 및 제 2 도전성 플레이트들(2, 4)이 도전성 플라스틱들로 제조되기 때문에, 전달 전극들(50, 52)에 전류가 인가될 때 도전성 플레이트들(2, 4)은 플레이트 전극들로 작용한다.
도 3에 도시된 실시예에서, 제 1 전달 전극(50)은 아크형 금속 브레이스(brace)으로, 상이한 챔버들(34,36,42)을 형성하기 위해 개스킷들(44,46)에 대해 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)을 제 위치에 고정하기에 충분한 장력을 제공한다. 전달 전극(50)은 또한 탱크(30) 내의 다양한 개스킷들(44,46)에 대하여, 탱크(30) 내측의 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)을 타이트하게/팽팽하게 체결하는 구조체와는 별개의 요소일 수 있다. 다른 실시예들에서, 제 1 전달 전극(50)은 둘 이상의 브래킷들(brackets)(즉, 좌 측면 상에 하나, 우 측면 상에 하나)로 분리될 수 있어, 사용자가 겔(6)을 여전히 볼 수 있으나, 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)은 제 자리에 여전히 견고하게 유지될 것이다. 전달 전극(50)으로부터 제 1 도전성 플레이트로의 장력 및 전기적 접촉이 있는 한 본 발명의 정신을 벗어나지 않으면서 다른 유형들의 브레이스들/브래킷들/텐셔너들(tensioner)이 냉각 챔버(42) 내에 배치될 수도 있다.
제 2 전달 전극(52)은 후방 패널(68)의 내측 표면을 따라 배치되며, 단백질 전달/블로팅 모드 동안 양극(+)으로 작용한다. 도 3에 도시된 실시예에서, 제 2 전달 전극(52)은 스프링 또는 반동(recoil) 작용을 가져 전달 전극(52)이 제 2 도전성 플레이트(4)와 충분히 접촉하도록 한다. 다른 실시예들에서, 전달 전극(52)은 스프링 또는 반동 작용을 갖는 요소와 별개의 요소일 수 있으며 대향 브레이싱 부재에 대하여 탱크(30) 내부의 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)을 보강하는 것을 돕는다. 전원은 제 1 전달 전극(50)과 제 2 전송 전극(52)을 연결하며, 전달 전극들(50,52)로 인가되어 전달/블로팅 국면 중에 제 1 도전성 플레이트(2)가 음극(-)으로 작용하고 제 2 도전성 플레이트가 양극(+)으로 작용하게 된다. 전원은 제 2 도전성 플레이트(4)를 향한 단백질들이 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10) 내에 수용된 전달 멤브레인(12)으로 충분하게 전달되도록 하는 두 플레이트 전극들 사이에 전압 차를 달성하기에 충분한 전기를 제공해야 한다. 블로팅 모드 동안 인가되는 전형적인 전압은 약 30 볼트이다.
도 4는 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)이 없는 탱크 장치(30)의 사시도이다. 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)은 립 개스킷(44)을 갖는 립(58)에 인접하여(좌 측면 상에)에 배치된다. 제 1 도전성 플레이트(2)가 제 2 도전성 플레이트(4)보다 크기 때문에, 전기영동 겔(6), 저 도전성 겔(8), 전달 멤브레인(12) 및 여과지(60)는 립(58)의 내측 구멍 내에 있으며 제 2 도전성 플레이트(4)가 후방 패널 개스킷(46)에 대하여 가압되는 동안, 제 1 도전성 플레이트(2)는 립의 외측 표면 상에 놓인다.
도 5는 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)의 정면도이다. 전술한 바와 같이, 제 1 도전성 플레이트(2)는 제 2 도전성 플레이트(4)보다 크다. 겔(6), 저 도전성 겔(8), 전달 멤브레인(12) 및 여과지(60)(제 2 도전성 플레이트(4)에 의해 차단됨에 따라 도 5에서는 보이지 않음)는 모두 제 1 및 제 2 도전성 플레이트들(2,4)의 사이에 끼워져 있다. 도 5의 실시예에서, 겔(6), 저 도전성 겔(8), 전달 멤브레인(12) 및 여과지(60)는 거의 동일한 높이를 갖지만, 겔(6)의 측면들을 둘러싸는 절연성 플라스틱 스트립들(26, 28)의 삽입을 허용하도록 약간 더 작은 폭을 가질 수 있다. 겔(6) 내의 웰들(84)은 단백질들이 침전될 수 있는 겔의 형성 동안 겔 콤(comb)에 의해 생성될 수 있다.
도 6 내지 도 7은 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)의 또 다른 실시예를 도시한다. 제 1 플레이트(2)가 도전성 중합체로 전체적으로 제조되는 대신에, 제 1 플레이트는 약 108ohm-cm 내지 1010ohm-cm 범위의 체적 저항률을 갖는 정전 분산(static dissipative) 성질들을 갖는 투명한 플라스틱으로 제조된다. 제 1 플레이트(2)의 내측 표면 상에 또는 제 1 플레이트(2) 내에 내장되는 것은 복수의 도전성 와이어들 또는 메쉬(76)이며, 상기 와이어들 또는 메쉬는 그리드 또는 어레이로 배열될 수 있다. 메쉬(76)는 제 1 플레이트(2)의 내측 표면을 따라 전류를 분배한다. 또한, 얇은 투명한 도전성 층(78)이 제 1 플레이트(2)의 내측 표면을 따라 배치되며, 메쉬(76)와 전기적으로 접촉하며, 이러한 얇은 투명한 도전성 층(78)은 대략 104ohm-cm 내지 105ohm-cm의 범위의 체적 저항률을 갖는 투명한 도전성 중합체 또는 투명한 도전성 필름(TCF)(78)으로 제조된다. TCF들은 본 기술 분야에서 공지되어 있으며, 도 6 내지 도 7의 실시예들에서, 제 1 플레이트(2)는 TCF 필름(76) 또는 투명 도전성 중합체 층으로 코팅되어 플레이트 전극을 형성한다. 와이어 메쉬(76)는 전하가 필름(78) 또는 얇은 투명 도전성 중합체를 따라 고르게 퍼짐을 보장한다. TCF는 도전성 중합체일 수 있지만, ITO(indium tin oxide), FTO(fluorine doped tin), 도핑된 산화 아연, 알루미늄-도핑된 산화 아연(AZO)을 포함하나 이에 제한되지 않는 투명 도전성 금속일 수 있다. 바람직한 실시예에서, TCF는 ITO가 습기에 화학적으로 내성이기 때문에 ITO이며, ITO는 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)의 장기 저장에 유리하다.
투명한 도전성 중합체의 얇은 피막으로 TCF들을 사용하는 시스템의 한가지 가능한 이점은 심지어 공지된 투명 도전성 중합체들 중에서도 두께가 증가함에 따라 도전성 폴리머의 투명성이 감소된다는 것이다. 제 1 강성 도전성 플레이트(2)의 도전 영역을 플레이트의 얇은 영역(또는 플레이트(2)의 상면에 적층됨)으로 제한함으로써, 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)은 높은 투명성 및 높은 강성을 유지하여 전기영동 겔(6)의 구조적 지지체를 형성한다. 인듐 주석 산화물의 얇은 필름은 투명하며 도전성이 있다. 그러나, (겔 지지 플레이트들의 경우와 같이) 두께와 강성이 모두 요구되는 경우, 인듐 주석 산화물의 두꺼운 플레이트들은 그들의 투명성을 상실하므로, 인듐 주석 산화물의 두꺼운 플레이트들은 도전성 플레이트의 전체를 형성하는 데에는 이상적이지 않으며, 이는 플레이트가 전기영동 중에 사용자가 단백질 분리를 시각화할 수 없게 한다. 제 1 전기적 반도전성 플레이트는 정전-분산성 플라스틱 위에 놓이는(overlying) 외측 전기적 반도전성 투명 층을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 외측 전기적 반도전성 투명 층은 매우 얇을 수 있다(1mm 미만, 또는 심지어100μm 미만).
도 6 내지 도 7은 제 1 플레이트(2), 와이어 메쉬(76), TCF 또는 얇은 투명 도전성 중합체(78), 전기영동 겔(6), 전달 멤브레인(12), 제 2 플레이트(4) 및 제 2 플레이트(4)의 외측 표면 상에 배치된 추가적인 와이어 메쉬(76) 각각의 측면도 및 사시도를 도시한다. 제 2 플레이트(4)의 외측 표면을 따라 배치된 와이어 메쉬(76)는 후방 플레이트(4)를 따라 전류를 효율적으로 분배하여 거대분자들을 겔(6)로부터 전달 멤브레인(12)으로 보다 효율적으로 전달한다.
도 8 내지 도 9는 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)의 다른 예를 도시한다. 도 8은 평면도이며, 도 9는 프리캐스트 겔/멤브레인 조합 유닛(10)의 사시도이다. 이러한 실시예는 후방 플레이트(4)의 내측 표면에 인접하는 비도전성 정전 분산성 전방 플레이트(2)의 두 개의 받침대 돌출부들(pedestal projections)(80)을 포함한다. 제 2 플레이트(4)는 받침대들(80) 위에 놓여서 제 1 플레이트(2)의 내측 표면과 제 2 플레이트(4)의 내측 표면 사이에 갭을 형성한다. 갭은 겔의 두께에 따라 달라질 수 있다. 일 실시예에서, 갭은 약 0.1cm 내지 약 0.5cm의 범위일 것이다. 상기 갭은 전기영동 겔(6), 저 도전성 겔(8), 전달 멤브레인(12) 및 여과지(60)와 같은 상기 기술된 바와 같은, 거대분자들의 적절한 분리 및 블로팅에 필요한 다양한 성분들을 보유한다. 이러한 실시예에서, 제 1 플레이트(2) 전체는 투명하지만 고 도전성은 아니다. 제 1 플레이트의 내측 표면을 따른 도전성은, 제 1 플레이트(2)를 통한 겔(6)의 시야를 시각적으로 방해하지 않는 제 1 와이어 메쉬(76)에 중첩되거나 연결되는, 얇은 전도성 폴리머 층 또는 다른 유형의 투명한 도전성 필름(78)을 사용하여 달성된다. 제 1 와이어 메쉬(76)는 도전성 중합체 층(78)의 전체를 따라 실질적으로 균등하게 전하를 분포시키므로, 얇은 도전성 중합체 층(78) 상에 전계가 생성되며, 상기 도전성 중합체 층(78)은 이후에 플레이트 전극으로서 작용한다. 바람직한 실시예에서, 필름 또는 얇은 투명 중합체는 1mm 미만의 두께를 가지며 104ohm-cm 내지 105ohm-cm 사이의 체적 저항률을 갖는다. 후방 플레이트(4)는 제 2 와이어 메쉬(82)를 가지며, 상기 제 2 와이어 메쉬(82)는 후방 플레이트(4)의 전체를 따라 실질적으로 균일한 전하를 생성하여, 실질적으로 균일한 전계를 생성하며, 블로팅 국면 동안 거대분자들은 효율적으로 및 균일하게 겔(6)로부터 전달 멤브레인(12)으로 전달된다.
바람직한 실시예에서, 분리/절달 완충액(56)은 약 10ohm-cm 내지 200ohm-cm의 체적 저항률을 가질 것이다. 도전성 플라스틱 전방 플레이트(2) 및 후방 플레이트(4)는 103ohm-cm 내지 105ohm-cm 범위의 체적 저항률을 가질 것이다. 전방 플레이트(2)의 내측 표면 상에 얇은 도전성 코팅 또는 필름(78)을 사용하는 실시예에서, 코팅 또는 필름의 체적 저항률은 104ohm-cm 내지 105ohm-cm의 범위에 있고, 전방 플레이트(2)는 체적 저항률이 108ohm-cm 내지 1010ohm-cm인 정전- 분산성 투명 플라스틱으로 제조될 것이다. 이러한 범위들은 전원이 전방 및 후방 플레이트들(2, 4)을 통하는 것이 아니라, 분리 전극들(38, 40)에 인가되는 분리 국면 동안 전류가 겔을 통해 흐를 수 있게 한다. 그 후, 전원이 50 및 52 또는 76 및 52에 인가될 때, 전류는 전방 플레이트(2)로부터 겔의 길이에 실질적으로 수직으로, 겔들(6, 8) 및 멤브레인(12)을 통해 흐르며, 블로팅 국면 동안 단백질들이 블로팅 멤브레인(12) 상에 매립되도록 한다. 이러한 범위들은 예시적인 실시예들과 관련하여 설명되었지만, 다음이 이해되어야 한다: 상기 범위들은 비한정적이지만, 완충액(56) 및 겔(6)이 이들을 수용하는 도전성 중합체들(즉, 플레이트들(2, 4))보다 적절하게 낮은 저항률을 갖는 임의의 실시예, 및 도전성 폴리머(즉, 플레이트 2, 4)는 완충액(56) 및 겔(6)보다 적절하게 높은 도전성을 갖는 실시예에서는 전술한 분리 및 전달 국면들이 실현될 것이다.
겔 지지 플레이트들에 사용하기 위한 도전성/반도전성 중합체들의 성질들
본 발명의 중합체들과 관련하여 용어 "도전성"은 절연성인 대부분의 중합체들에서 발견되는 전기 도전성의 부족과 관련이 있다. 도전성 중합체들은 금속들보다 도전성이 낮기 때문에 반도전성이지만, "도전성 중합체"라는 용어는 여전히 일반적으로 사용되며 일반적으로 반도전성으로 간주되는 범위에 속하는 모든 중합체들을 의미한다. 폴리피롤들은 전형적으로 103S/m 내지 7.5x105S/m 사이의 도전도를 갖는다. 폴리티오펜들은 101S/m 내지 103S/m 사이의 도전도를 갖는다. 폴리페닐렌 및 그 유사체들인 폴리(파라페닐렌)은 104S/cm 내지 105S/cm 사이의 도전도를 갖는다. 폴리(p-페닐렌 비닐렌)은 3S/m 내지 5x105S/m 사이의 도전도를 가지며, 폴리아닐린들은 3x103S/m 내지 2x104S/m 사이의 도전도를 갖는다. 도전도는 분자들을 첨가하여 중합체를 p-도핑(p-dope) 또는 n-도핑(n-dope)(예를 들어, I2, AsF5, Na, K로의 도핑)함으로써 증가할 수 있다. 폴리티오펜들(polythiophenes) 및 폴리아세틸렌들(polyacetylenes)과 같은 도핑되지 않은 도전성 중합체들은 일반적으로 도전도가 약 10-8S/m 내지 10-6S/m이다. 재료들의 특성들을 설명하기 위해 일반적으로 사용되는 비저항은 도전도의 수학적 역(inverse)이다.
도전성 중합체들의 도전도는 10-11S/m 내지 10-15S/m사이의 도전도를 갖는 유리와 같은 일반적인 절연체들보다 10의 몇 승만큼 도전도가 높다. 유사하게, 고무는 약 10-14S/m의 도전도를 갖는다. 절연체들과 달리, 대부분의 금속들의 도전도는 도전성 고분자들의 도전도보다 10의 몇 승만큼 더 높다. 은, 구리, 금, 알루미늄, 텅스텐 또는 대부분의 다른 금속들은 약 106S/m 내지 107S/m의 도전도를 갖는다. 도전성 중합체들의 중간 도전성 특성은 이러한 도전성 중합체들이 그들에 인가된 전하 및 도전성 중합체들을 둘러싸는 조성물들에 따라 절연체들 또는 도전체들로서 작용할 수 있게 한다. 플레이트들의 반도전성 특성은 플레이트들이 무효화 전계에 기여하지 못하게 하며, 상기 무효화 전계는 플레이트들을 지지하는 겔이 금속들과 같이 고 도전성인 경우 발생한다.
겔 지지 플레이트들의 투명성
투명한 도전성 중합체들을 논의할 때 당 업계에서 이해되는 "투명"이라는 용어는 100% 광학적으로 투명한 중합체들을 포함할 뿐만 아니라, 반투명하며 중합체를 통해 약간의 빛을 투과시키는 중합체들을 포함한다. 투명 도전성 중합체들의 두께가 증가함에 따라, 일부 감쇠(attenuation) 및 분광 흡수가 일어나지만, 중합체들은 여전히 상당한 양의 광을 충분히 큰 강도로 전송해 사용자가 투명 플레이트 내의 겔 측방부를 볼 수 있도록 한다. 따라서, 용어 "투명 도전성 중합체"또는 "투명 반도전성 중합체"는 사용자가 플레이트를 통해 염료 측방부를 볼 수 있게 하는 충분한 광이 플레이트를 통과해 투과할 수 있도록 하는 중합체들로 제조된 중합체들 및 플레이트들을 포함한다.
예시적인 프로토콜
겔 전기영동
1.
단백질 시료들(세포 용해물들, 면역침강제들, 재조합 단백질들 등)은 다음과 같이 준비된다:
a.
10㎕ 4X 도데실 황산 나트륨(SDS) 시료 완충액[예를 들어, 250 mM 트리스-염화수소; 8 % SDS; 40 % 글리세롤; 4 % β-머캅토에탄올; 50 mM 에틸렌디아민테트라아세트 산(EDTA); 0.8 % w/v 브로모페놀 블루]를 30㎕ 단백질 시료에 첨가한다.
b.
70°°C에서 10분 동안 시료들을 배양한다.
2.
약 20μL의 시료들은 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)을 구성하는 두 개의 도전성/반도전성 플라스틱 플레이트들(2, 4) 사이에 함께 있는 멤브레인(12)에 인접한 겔(6)(예를 들어, 10% 폴리아크릴아미드) 상에 실린다.
3.
약 10μμL의 사전-염색된 단백질 사다리가 겔 상에 실린다. 전방 플레이트가 투명하기 때문에 사전-염색된 단백질 사다리는 임의의 웰에 실릴 수 있다.
4.
단백질들은 분리 국면용 전극들(38, 40)에 걸쳐 일정한 전압에서 전기영동에 의해 분리된다. 분리에 사용되는 전압 및 시간은 표적 단백질(들)의 크기, 표적 단백질(들)의 원하는 분리 정도 및 겔의 백분율에 달려있다(예를 들어, 10% 폴리아크릴아미드 겔의 경우 60분 동안 150V). 전방 플레이트가 투명하기 때문에, 사용자는 단백질 시료들로부터 사전-염색된 단백질 사다리 및 염료의 진행을 육안으로 평가함으로써 전방 플레이트를 통한 상대적 분리 정도를 모니터할 수 있다.
분리된 시료들을
멤브레인들의
상으로 전달
1.
분리된 단백질들은 전달 전극들(50, 52)에 걸쳐 일정한 암페어 수(amperage)로 멤브레인(12) 상에 전기-전달된다. 사용된 암페어 수 및 시간은 전달될 표적 단백질(들)의 크기에 의존한다(예를 들면, 500mA, 30분). 이러한 암페어 수를 달성하는 데 필요한 전압은, 저항이 높을수록 금속 플레이트 전극들을 사용하는 표준 전송 장치들에 비해 전압이 높기 때문에, 최종 전압과 암페어 수는 사용된 중합체의 저항과 전원의 전압 및 암페어 수 성능들에 따라 달라진다.
분리된 시료들 및 전달된 시료들의 표지(probing)
1.
프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(10)은 분리된 단백질들이 있는 멤브레인을 제거하기 위해 분해된다.
2.
멤브레인을 블로킹 완충액[1% 트윈 20(TBST)가 첨가된 Tris-완충 식염수 중 5 % 탈지 분유] 내에서 실온에서 1 시간 동안(또는 대안적으로 4 ℃에서 밤새) 배양된다.
3.
멤브레인(12)은 실온에서 1시간 동안(또는 대안적으로 밤새 4℃에서) 블로킹 완충액 중의 1차 항체의 적절한 희석액과 함께 (예를 들어, 많은 상업적으로 이용가능한 항체들에 대해 1:200 내지 1:1000) 배양된다.
4.
멤브레인(12)은 TBST로 3 회, 각각 5분씩 세척된다.
5.
멤브레인(12)은 실온에서 1시간 동안 블로킹 완충액 중의 공액 2차 항체의 권장 희석액(예를 들어, 1 mg/mL에서 HRP-접합체들에 대해 1:5000)과 함께 배양된다.
6.
멤브레인은 TBST로 3회, 각각 5분씩 세척된다.
7.
시그널 개선을 위해, 기판 제조업체의 권장사항들이 사용된다.
8.
이미지들은 화학발광을 위한 표준 암실 현상 기법들 또는 비색(colorimetric) 검출을 위한 일반적인 이미지 스캐닝 기법들을 사용하여 수집된다.
반도전성 플레이트 조성물들의 예들
투명 중합체들의 수많은 제제들이 겔 지지 플레이트들로서 사용될 수 있다. 투명 도전성/반도전성 중합체 플레이트들은 폴리(피롤)들(PPY), 폴리아세틸렌, 폴리아닐린들(PANi), 폴리(티오펜)들(PT), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(PEDOT), 폴리(p-페닐렌 설파이드)(PPS), 폴리(아세틸렌)들(PAC) 및 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV) 및 이들의 복합체들로 제조될 수 있다. 예를 들어, 가장 잘-특성화된 도전성/반도전성 중합체들 중 하나인 PPY는, 아크릴 중합체들"Surface Characterization of Conductive Poly(m ethyl methacrylate)/Polypyrrole Composites," Journal of Materials Science 35 (2000) 1743- 1749 참조), 셀룰로오스("A Nano cellulose Polypyrrole Composite Based on Tunicate Cellulose," International Journal of Polymer Science, Volume 2013, Article ID 175609 참조), 폴리스티렌("Synthesis and Characterization of Nano sized Polypyrrole Polystyrene Composite Particles," Journal of Applied Polymer Science, Vol. 91, 1360-1367 (2004) 참조), 폴리우레탄"Polypyrrole composites for shielding applications," Synthetic Metals 151 (2005) 211-217 참조), 폴리디메틸실록산들"Flexible and Conducting Composites of Polypyrrole and Polydimethylsiloxane," Journal of Applied Polymer Science, Vol. 93, 736-741 (2004) 참조), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)("Studying the Characteristics of Polypyrrole and its Composites," World Journal of Chemistry 2 (2: 67-74, 2007) 참조) 및 폴리(아크릴로니트릴-코-비닐 아세테이트)("Characterization of Conductive Poly(Acrylonitrio-co- Vinyl Acetate Composites: Matrix Polymerization of Pyrrole Derivatives," Fibers and Polymers 2011, Vol.12, No.2, 151-158 참조)를 포함하는 종래의/절연 중합체들과의 복합체로 통합되었다. 중요하게, PPy 복합체들은 이러한 종래의 공중합체들로 제조되었으며, 복합체 재료들은 종래의 재료의 기계적 및 물리적 특성들 및 도전성 중합체의 전기 도전성을 보유한다("Chemical in situ polymerization of polypyrrole on poly(methyl methacrylate) substrate," Thin Solid Film 515 (2007) 5324-5328 참조). 이러한 복합체들은 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛의 전달 국면에 필요한 체적 저항률 범위 내 또는 그 미만을 갖도록 일관되게 제조되었으며, 이는 종래의 공중합체들을 갖는 복합체에서 PPy의 낮은 비율이 전기영동 중의 분리 국면에서 사용하기에 충분히 높은 저항률을 가지며, 이로써, 무효화 전계 효과가 발생하지 않은 것을 보여주며, 또한 종래의 공중합체들을 갖는 복합체에서 PPy의 낮은 비율이, 단백질들을 플레이트들 사이에 끼워진 겔로부터 블로팅 멤브레인으로 전달하기 위한 전달 국면 동안에 충분한 도전성을 가짐을 나타낸다.
전도도는 PPy에 첨가된 단량체 개시제(initiator) 농도의 양을 변화시킴으로써 조절될 수 있다("The Regulation of Osteogenesis Using Electroactive Polypyrrole Films. Polymers, 2016; 8(7): 258 참조). PPy는 종래의 플라스틱들과 혼합되어 PPy의 전기 전도도 뿐만 아니라 종래의 플라스틱들의 투명성 및 강성을 유지할 수 있다. 99% 폴리우레탄(통상적인 중합체) 및 1% PPy-Ni(반도전 성질들을 갖는 PPy 니켈 복합체)를 갖는 복합체들은 전기영동 단백질 분리 및 블로팅 모두에 사용되는 겔 플레이트에 충분한 도전성을 갖는다("Polypyrrole Composites for Shielding Applications," Synthetic Metals 151 (2005) 211-217 참조). 2mm 두께의 95%의 통상적인 중합체, 5% PPy 중합체(또는 1mm 두께의 플레이트인 90%의 통상적인 중합체, 10% PPy 복합체)는 본 실시예들에서 사용하기에 충분히 단단하고 투명하며 도전성이 있다. 종래의 중합체가 본 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 수치의 강성 및 투명성 요건들을 충족시키는 한, 0.5mm 내지 4mm 또는 그 이상 사이의 두께 범위들의 편차들이 본 실시예에서 사용하기 위해 또한 생성될 수 있다. 1 % 내지 10 % PPy의 복합체들로 인해서, 제 1 전기적 반도전성 플레이트가 단백질 분리 국면 동안 절연 플레이트 역할을 할 정도의 충분한 체적 저항률을 가지며, 단백질들이 단백질 전달 동안 겔로부터 블로팅 멤브레인으로 전달되도록 하기에 충분한 도전성을 상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트가 갖게 된다.
반도전성 플레이트들이 플레이트 전체에 걸쳐 반도전성 중합체로 이루어지지 않은 실시예들에서, PPy 층은 동일한 목적을 달성하기 위해 사용될 수 있는 플레이트와 PPy 사이에 있는 얇은 와이어 메쉬와 함께 정전-분산성 강성 플라스틱 시트들에 도포될 수 있다. 100μμm PPy 층만큼 얇거나 그보다 얇은 층들 충분한 투명도를 유지할 수 있어 사전-염색된 단백질 사다리 및 염료(염료 측방부) 적재 시료가 투명한 정전-분산성 플레이트를 코팅할 때 보이도록 한다.
투명한 반도전성 플레이트들에 사용하기 위한 또 다른 조성물은 폴리아닐린(PANI) 복합체들을 포함하며, 상기 포릴아닐린 복학체들은 인가된 전압에 따라 전기변색(electrochromic)성이며, 색/투명성을 변화시킨다("Electrochromic Properties of Polyaniline-Based Hybrid Organic/Inorganic Materials," J. Braz. Chem. Soc, Vol. 27, No. 10, 1847-1857, 2016" 참조). 예를 들어, 복합체에 전압이 인가되지 않을 때, PANI 복합체는 투명한 황색이다. 전압이 인가되면 복합체는 녹색/파란색으로 바뀐다. 이러한 중합체를 사용할 때, 장치가 작동 중일 때, 복합체는 불투명할 것이며 낮은 광 투과율을 가질 것이지만, 사용자가 전압을 끄면 사용자는 전기영동 실행 중에 언제든지 단백질 분리의 정도를 평가할 수 있으며, 전류를 재인가하여 단백질 분리를 계속할 수 있다. PANI의 얇은 층들은 투명한 정전 분산성 시트들에 도포될 수 있으나, PANI는 다른 중합체들과 혼합되어 더 높은 두께들의 무-전압 상태에서 황색 투명성을 유지할 수 있다.
투명성이 요구되지 않을 때(즉, 투명성을 요구하지 않는 후방 플레이트 용) 사용되는 다른 종류의 물질들은 혼합된 이온-전기 도전체들(MIECs)이다. 이온-전기 도전체 물질들은 이온 전도성 및 전기 도전성을 모두 갖는다. 예를 들어, 또한 이온 도전체인 불투명한 전기 도전성/반도전성 플레이트는 나노 피브릴화 셀룰로오스-폴리[3,4-에틸렌디옥시티오펜](NFC-PEDOT)로 제조될 수 있다("An Organic Mixed Ion-Electron Conductor for Power Electronics," Advanced Science 2016, 3, 1500305 참조). NFC-PEDOT은 분리 국면 및 전달 국면 동안 사용하기에 일관된 전기적 특성들을 가지며, NFC-PEDOT이 또한 이온 저장소로 작용하기 때문에 전달 국면의 효율을 향상시킨다. 플레이트들을 만드는 데 사용될 수 있는 다른 불투명한 도전성/반도전성 고분자들은 상업적으로 이용가능한 Tivar® EC, Tecaform® ELS, 30% 탄소 충전 폴리-에테르-에테르-케톤(PEEK), Tecapeek® ELS를 포함한다. Boedeker Plastics, Inc.(텍사스)를 통해 이용가능한, Tempalux® CN 도전성 폴리에테르이미드(PEI), 도전성 폴리에테르설폰(PES CN), 정전-제어 Kynar® PVDF CN(폴리비닐리덴 불소), Pomalux® 정전-제어 아세탈, Propylux® 정전-제어 폴리프로필렌, Absylux® 정전-제어 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌(ABS) 및 Zelux® 정전-제어 폴리카보네이트.
본 발명이 예시적인 실시예들과 관련하여 설명되었지만, 본 명세서에서 사용된 단어들은 설명의 단어들이며 제한의 단어들이 아니라는 것이 이해될 것이다.
당업자들이라면 이해될 수 있는 바와 같이, 다음의 청구 범위들에 의해 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정들을 가할 수 있으며, 이러한 청구 범위들은 그들의 완전하고, 상당한 범위로 주어진다.
Claims (18)
- 전기영동 분리(separation) 및 블로팅(blotting)을 위한 장치로서, 상기 장치는:
투명 도전성 중합체로 이루어진 제 1 전기적 반도전성(semi-conductive) 플레이트;
반도전성 중합체로부터 이루어진 제 2 전기적 도전성 플레이트로서, 상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트와 실질적으로 평행한, 상기 제 2 전기적 반도전성 플레이트;
전기영동 겔; 및,
블로팅 멤브레인;을 포함하며,
상기 전기영동 겔은 상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트 및 상기 블로팅 멤브레인 사이에 위치하며; 및
상기 블로팅 멤브레인은 상기 전기영동 겔 및 제 2 전기적 반도전성 플레이트 사이에 위치하는, 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 전기영동 겔보다 더 낮은 도전성을 갖는 저 도전성 겔로서, 상기 저 도전성 겔은 상기 전기영동 겔 및 블로팅 멤브레인 사이에 존재하며, 상기 저 도전성 겔은 거대분자 분리 국면 동안, 거대분자들이 이동하여 상기 전기영동 겔로부터 멀어지게 확산되어 상기 블로팅 멤브레인에 부착되는 것을 방지하는, 상기 저 도전성 겔;
상기 제 2 반도전성 플레이트 및 상기 블로팅 멤브레인 사이의 여과지(filter paper)로서, 상기 여과지는 습윤시 이온 저장소로서 작용하며 이로써 상기 블로팅 멤브레인 및 상기 제 2 도전성 플레이트 사이의 실질적인 전기 접촉을 제공하여 상기 전기영동 겔로부터 상기 저 도전성 겔을 통해 상기 블로팅 멤브레인으로 거대분자들을 전달하는 것을 보조하는, 상기 여과지;를 더 포함하며,
상기 블로팅 멤브레인은 니트로셀룰로스 멤브레인, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 또는 나일론 멤브레인 중 적어도 하나인, 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트 상에 또는 내부에 배치된 전기적 도전성 와이어들을 더 포함하며,
상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트는 정전-분산성(static-dissipative) 플라스틱과 중첩되는 외측 전기적 반도전성 투명 층을 갖는, 장치. - 제 3 항에 있어서,
상기 외측 전기적 반도전성 투명 층은 1mm 미만이며 상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트의 내측 표면 상에 배치되며,
상기 외측 전기적 반도전성 투명 층은 인듐 주석 산화물, 불소 도핑 된 주석, 도핑된 산화 아연 및 알루미늄-도핑 된 산화-아연 중 적어도 하나를 포함하는, 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트는 폴리아세틸렌, 폴리(피롤)들(PPy), 폴리아닐린들, 폴리티오펜, 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(p-페닐렌) 설파이드, 폴리(p-페닐렌 비닐렌), 및 그들의 유도체들로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 투명 도전성 중합체들을 포함하는 중합체로 이루어지며,
상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트는 103ohm-cm 및 108ohm-cm 사이의 체적 저항률을 갖는, 장치. - 제 5 항에 있어서,
상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트는 적어도 1mm의 두께를 가지며,
상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트는 투명 도전성 중합체 및 비도전성 투명 중합체의 복합체로 구성되는, 장치. - 제 6 항에 있어서,
상기 복합체는 1% 내지 10% PPy 복합체이며,
상기 PPy 복합체로 인해,
상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트는,
단백질 분리 국면 동안 절연 플레이트로서 작용하기에 충분한 체적 저항률을 가지며,
단백질들을 단백질 전달 국면 동안 상기 블로팅 멤브레인으로 이동시키기에 충분한 도전성을 가지며,
상기 전기영동 겔을 지지하기 위한 충분한 강성을 가지며,
사용자가 상기 제 1 전기적 반도전성 플레이트를 통해 염료 전방부를 볼 수 있도록 하는 충분한 투명성을 갖는, 장치. - 제 7 항에 있어서,
상기 PPy 복합체는 반도전성 특성들을 갖는 PPy 니켈 복합체인, 장치. - 거대분자들을 전기영동 분리하여 블로팅하기 위한 장치로서,
투명 중합체로 제조된 제 1 플레이트;
상기 제 1 플레이트에 인접한 전기적 반도전성 투명 층;
상기 제 1 플레이트와 실질적으로 평행한 제 2 플레이트;
전기영동 겔; 및,
블로팅 멤브레인;을 포함하며,
상기 전기영동 겔은 상기 전기적 반도전성 투명 층 및 상기 블로팅 멤브레인 사이에 위치하며; 및,
상기 블로팅 멤브레인은 상기 전기영동 겔 및 상기 제 2 플레이트 사이에 있는, 장치. - 제 9 항에 있어서,
상기 제 1 플레이트 및 상기 전기적 반도전성 투명 층과 접촉하는 제 1 전기적 도전성 와이어 어레이;를 더 포함하며,
상기 제 1 전기 도전성 와이어 어레이는 상기 전기적 반도전성 투명 층을 따라 전하를 분배하는, 장치. - 제 10 항에 있어서,
상기 전기적 반도전성 투명 층은 상기 제 1 플레이트의 내측 표면 상에 배치된 전기적 도전성 필름이며,
상기 전기적 반도전성 필름은 인듐 주석 산화물, 불소 도핑 된 주석, 도핑 된 산화 아연, 알루미늄-도핑 된 산화-아연 및 이들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유형의 도전성 투명 금속들을 함유하는 필름으로 이루어진, 장치. - 제 9 항에 있어서,
상기 제 1 플레이트는 폴리아세틸렌, 폴리(피롤)들(PPy), 폴리아닐린들, 폴리티오펜, 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(p-페닐렌) 설파이드, 폴리(p-페닐렌 비닐렌) 및 이들의 유도체들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유형들의 투명 도전성 중합체들을 함유하는 중합체로부터 제조된, 장치. - 제 9 항에 있어서,
상기 투명 도전성 층은 104ohm-cm 및 105ohm-cm 사이의 체적 저항률을 가지며,
상기 제 1 플레이트는 108ohm-cm 및 1010ohm-cm 사이의 체적 저항률을 갖는, 장치. - 제 9 항에 있어서,
상기 제 2 플레이트에 인접한 제 2 전기적 도전성 와이어 어레이를 더 포함하며,
상기 제 2 전기적 도전성 와이어 어레이는 상기 제 2 플레이트를 따라 전하를 분배하는, 장치. - 거대분자들을 전기영동 분리하고 블로팅하기 위한 시스템으로서,
상측 완충액 챔버 및 하측 완충액 챔버, 전방 패널, 후방 패널 및 하단을 갖는 액체 용기 탱크;
상기 상측 완충액 챔버 내의 제 1 분리 국면용 전극;
상기 하측 완충액 챔버 내의 제 2 분리 국면용 전극;
제 1 블로팅 국면용 전극;
제 2 블로팅 국면용 전극;
프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛(precast gel and membrane combination unit)로서, 상기 조합 유닛은, (i) 투명 도전성 중합체로 제조된 제 1 전기적 도전성 플레이트, (ii) 도전성 중합체로 제조된 제 2 전기적 반도전성 플레이트로서, 상기 제 1 전기적 도전성 플레이트와 실질적으로 평행한, 상기 제 2 전기적 반도전성 플레이트, (ⅲ) 전기영동 겔, 및 (ⅳ) 블로팅 멤브레인을 포함하는, 상기 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛;
전력 공급부를 포함하며,
상기 전력 공급부는 상기 제 1 분리 국면용 전극 및 제 2 분리 국면용 전극에 전압을 인가하여서 상기 전기영동 겔을 따라 거대분자들의 전기영동 분리를 수행하게 구성되며,
상기 전력 공급부는 상기 제 1 및 제 2 분리 국면용 전극들로부터 상기 제 1 및 제 2 블로팅 국면용 전극들로 전압을 자동적으로 스위칭하도록 구성되며, 상기 전압의 스위칭은 사용자가 단백질의 전기영동 분리 및 상기 블로팅 멤브레인 상으로의 단백질들의 전달을 수행할 수 있게 하는, 시스템. - 제 15 항에 있어서,
상기 액체 용기 탱크는,
상기 제 1 블로팅 국면용 전극을 수용하는 냉각 챔버; 및,
상기 액체 용기 탱크의 후방 패널 상에 배치되는 개스킷으로서, 상기 개스킷은 상기 프리캐스트 겔 및 멤브레인 조합 유닛이 상기 액체 용기 탱크 내에 위치될 때 상기 상측 챔버로부터 상기 하측 챔버로 액체가 유동하는 것을 방지하는, 상기 개스킷을 더 포함하는, 시스템. - 거대분자들을 분리하여 분리된 거대분자들을 블로팅 멤브레인으로 전달하기 위한 방법으로서,
액체 용기 탱크 내에 제 1 배향으로 장치를 제공하는 단계로서,
상기 장치는 (i) 투명 도전성 중합체로 제조된 제 1 전기적 도전성 플레이트, (ii) 도전성 중합체로 제조된 제 2 전기적 반도전성 플레이트로서, 상기 제 1 전기적 도전성 플레이트와 실질적으로 평행한, 상기 제 2 전기적 반도전성 플레이트, (ⅲ) 전기영동 겔, 및 (ⅳ) 블로팅 멤브레인을 포함하며, 상기 전기영동 겔은 상기 제 1 반도전성 플레이트 및 상기 블로팅 멤브레인 사이에 있으며, 상기 블로팅 멤브레인은 상기 전기영동 겔 및 상기 제 2 전기적 반도전성 플레이트 사이에 있는, 상기 액체 용기 탱크 내에 제 1 배향으로 장치를 제공하는 단계;
한 쌍의 분리 전극들에 제 1 전기 구동력을 인가함으로써 상기 장치의 상기 겔을 따라 거대분자들을 분리하는 단계로서, 상기 겔을 따라 상기 거대분자들을 분리하는 단계는 상기 장치의 제 1 배향에서 발생하는, 상기 분리하는 단계;
상기 한 쌍의 분리 전극들로의 상기 제 1 전기 구동력의 인가를 중단시키는 단계; 및
상기 장치의 상기 제 1 배향을 유지하면서, 상기 제 1 전기 구동력에 실질적으로 수직인 제 2 전기 구동력을 인가함으로써, 상기 겔을 통해 상기 블로팅 멤브레인으로 거대분자들을 전달하는 단계를 포함하며,
이로써, 상기 분리 단계 및 전달 단계 간에서 상기 장치를 재배향할 필요 없이, 단일 액체 용기 탱크 내에서, 상기 거대분자를 분리하는 단계 및 상기 블로팅 멤브레인으로 거대분자를 전달 단계가 서로 결합되는, 방법. - 제 17 항에 있어서,
상기 제 1 전기 구동력을 인가하도록 전력 공급부를 사전-프로그래밍하는 단계; 및
상기 제 1 전기 구동력 인가를 중단하고, 상기 제 1 전기 구동력에 실질적으로 수직인 상기 제 2 전기 구동력을 인가하도록 전력 공급부를 사전-프로그래밍하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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