KR20180073641A - 적응 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세균의 성장에 전반적으로 관계한다. 더욱 특정하게는, 본 발명은 혐기성 미생물의 산화 환경 적응을 위한 방법 및 새로운 프로바이오틱스를 개발함에 있어서 이들의 용도에 관계한다. 특히, 본 발명은 혐기성 미생물의 적응 및 산소에 더욱 내성인 혐기성 미생물의 선별을 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화와 함께 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 새로운 균주 역시 제공된다.
Description
발명의 분야
본 발명은 세균의 성장에 전반적으로 관계한다. 더욱 특정하게는, 본 발명은 혐기성 미생물의 산화 환경 적응을 위한 방법 및 새로운 프로바이오틱스를 개발함에 있어서 이들의 용도에 관계한다. 본 발명의 방법에 의해 획득된 새로운 (적응된) 균주 역시 제공된다.
발명의 배경
성체 소화관 미생물 균총은 체성 세포 및 생식 세포의 총수의 10 배에 맞먹는 최대 100 조의 미생물로 구성된다. 우리의 소화관 미생물의 집합적인 유전체 (마이크로바이옴)는 우리 자체 유전체보다 150 배 이상 많은 유전자를 내포할 수 있고, 그리고 우리가 자체적으로는 진화할 수 없었을 생리학적 능력을 우리에게 부여한다. 하지만, 이들 공동체는 주로 자연히 터득된 상태로 남아있고, 인간 발달, 생리학, 면역성, 영양 및 건강에 대한 그들의 영향에 관해 거의 완전하게 알려진 바가 없다. 미생물 공동체는 숙주 생물학에 영향을 주는 막대한 능력을 갖고, 그리고 비타민 및 호르몬 생산을 위한 공급원이 되는 것에 더하여, 우리의 면역계의 발달, 만약 그렇지 않으면 비소화성인 식이 다당류를 처리하는 능력 등에 근본적이다. 대장 내에 미생물 공동체는 소화관 건강의 조절 및 여러 질환의 발병에서 필수적인 역할을 갖는다.
전통적인 미생물학은 단리된 단위로서 개별 종의 연구에 집중하였다. 하지만, 대부분은 아닐지라도 많은 종이 아마도, 그들의 성장이 실험적으로 재현되지 않는 특정한 미세환경에 의존하기 때문에, 분석을 위한 생존가능한 검체로서 성공적으로 단리되지 않았다. DNA 염기서열결정 기술에서 진전은 미생물 공동체, 심지어 배양할 수 없는 생물체로 구성된 것들의 포괄적인 검사를 허용하는, 메타유전체학으로 불리는 새로운 연구 분야를 창출하였다. 실험실에서 성장된 개별 세균 균주의 유전체를 조사하는 대신에, 메타유전체학 접근법은 자연 환경으로부터 수확된 완전한 미생물 공동체로부터 유래된 유전 물질의 분석을 허용한다.
인간 소화관 마이크로바이옴은 유익한 미생물, 잠재적 프로바이오틱스의 자원으로서 역할을 한다. 질환, 예를 들면, 염증성 장 질환, 심혈관 질환, 당뇨병 및 자폐증 스펙트럼 장애에서 소화관 미생물 균총의 예방 및 증진 역할 둘 모두에도 불구하고, 가용한 어떤 치료도 여러 메타유전체학 연구에 의해 지시된 바와 같은 신규한 프로바이오틱스 또는 이른바 차세대 프로바이오틱스를 내포하지 않는다. 심지어 성공적으로 단리되는 경우에도, 소화관으로부터 단리된 많은 미생물은 성장을 위해 엄격한 혐기성 조건을 필요로 하고, 그리고 주위 공기에 노출될 때 몇 분 이상 생존할 수 없다. 이것은 안정되고 견실한 프로바이오틱 제제를 개발하는 것을 어렵게 만든다. 이런 이유로, 산소에 더욱 내성인 혐기성 미생물이 요구되고, 그리고 본 발명은 혐기성 미생물의 적응 방법, 그리고 이런 방법을 이용하여 획득된 미생물의 새로운 균주를 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 혐기성 미생물의 산화 환경 적응을 위한 방법을 제공하고, 따라서 이런 생물체이 주위 공기에 노출될 때, 산소에 상대적으로 더욱 내성이 될 수 있게 한다. 이것은 미생물의 향상된 배양 및 보관, 예를 들면, 더욱 긴 기간 동안 보관을 실시가능하게 하는 추가 이점을 갖는다.
모의된 인간 장관 산화환원 모형 (SHIRM)이 본원에서 제공되는데, 여기서 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화가 일어난다.
산소는 혐기성 미생물에게 치명적이고, 따라서 산화 스트레스에 이용된 용존 산소 (산소 농도)는 증가되지만 준치사 농도에서 유지될 것이고, 반면 항산화제/산화된 대응물 커플은 환경의 산화환원 상태를 조정하는데 이용된다. 산화 스트레스는 또한, 적용 전압을 통해 유도된다. 산화 스트레스는 산화 환경에 대한 세균 내성을 증가시키고, 그리고 미생물이 상대적으로 더욱 긴 기간 동안 주위 공기에서 계속 생존하는 것을 가능하게 만든다.
적절한 준치사 산소 농도 (존재하는 모든 세균의 사멸을 유발하지는 않는 농도, 또는 다시 말하면, 세균 중에서 전체가 아닌 일부만 사멸되는 농도)는 예로서, 최소한 일부 (하지만 일반적으로 전부가 아님) 세균이 생존할 수 있도록 쉽게 결정될 수 있고, 그리고 이후, 이들 방법에서 다음 단계로 가도록 선별될 수 있다. 생존 세균은 이후, 다시 한 번 최소한 일부 (하지만 일반적으로 전부가 아님) 세균이 생존할 수 있도록, 예로서 증가된 산화 스트레스 (예로서, 용존 산소 농도를 증가시킴으로써)에서 다시 한 번 성장되고, 그리고 이후, 이들 방법에서 다음 단계로 가도록 선별될 수 있다. 산화 스트레스를 증가시키는 이러한 단계는 이후, 산소에 더욱 내성인 미생물을 달성하기 위해 필요한 또는 원하는 만큼 많은 횟수로 다시 반복될 수 있다.
본 발명은 혐기성 미생물의 적응 및 산소에 더욱 내성인 혐기성 미생물의 선별을 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태의 단계별 변화와 함께 상기 미생물을 배양 단계를 포함하고, 여기서 바람직하게는, 산화환원 상태의 단계별 변화는 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화를 이용하여 발생한다.
본 발명은 혐기성 미생물의 적응 (또는 훈련) 및 산소에 더욱 내성인 (가령, 산소에 상대적으로 더욱 내성인) 혐기성 미생물의 선별을 위한 방법을 제공하고, 여기서 이들 미생물은 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화의 조합과 함께 배양된다.
본 발명은 혐기성 미생물의 증강된 생산을 위한 방법을 더욱 제공하고, 여기서 이들 미생물은 일정한 산화 전위/적용 전압, 산소 확산 및 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 조합과 함께 배양되고, 따라서 도태 압력을 실시가능하게 하고 일정한 미생물 균주의 높은 수율을 유발한다. 상기 배양은 최적 세팅에 있거나, 또는 다시 말하면, 일정한 산화 전위/적용 전압, 산소 확산 및 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 조합이 혐기성 미생물의 생산을 위해 최적화되었다.
도면의 설명
도면 1은 인간 소화관 내강의 산화환원 풀을 보여준다. 식품의 섭취를 통한 산소의 연속적 유입 및 소화관 점막층으로부터 확산이 있다는 사실에도 불구하고, 소화관의 순 산화환원 전위는 음성, ca -300mV 상태로 남아있다.
도면 2는 산화 스트레스에 의해 유발된 산소 민감한 효소에 대한 잠재적 피해 및 회복 기전을 보여준다.
도면 3은 인간 소화관 내에 소화관 미생물 균총에 의해 이용되는 주요 발효 경로를 보여준다.
도면 4a
맞춤 제작된 3개의 챔버가 있는 모의된 인간 장관 산화환원 모형 (SHIRM).
도면 4b
SHIRM에서 전자 수용체를 향하여 세균 세포로부터 전자 흐름의 계통도 표현. (Eo') 볼트에서 계측된 산화환원 전위 (환원 전위 및 산화 전위).
도면 4c
세균 세포로부터, 산화환원 전위를 포함하는 전자 수용체로의 전자 전달에 관련된 중간체의 SHIRM 계통도 표현.
도면 5.
SHIRM 작업의 기본 작업 흐름.
도면 6.
작은 베드 용적 ca 100ml 산소 주입기에 연계된 SHIRM 애노드 챔버의 표현.
도면 7.
공기 호흡 SHIRM: 측면 팔을 통해, 공기로부터 애노드 챔버 내로 직접적인 산소 확산.
도면 8.
SHIRM 작업의 작업 흐름, 10 단계
도면 9.
적응된 균주의 선별
도면 10.
적응된 균주의 산소 내성 프로필을 탐구하기 위한 전략.
도면 1은 인간 소화관 내강의 산화환원 풀을 보여준다. 식품의 섭취를 통한 산소의 연속적 유입 및 소화관 점막층으로부터 확산이 있다는 사실에도 불구하고, 소화관의 순 산화환원 전위는 음성, ca -300mV 상태로 남아있다.
도면 2는 산화 스트레스에 의해 유발된 산소 민감한 효소에 대한 잠재적 피해 및 회복 기전을 보여준다.
도면 3은 인간 소화관 내에 소화관 미생물 균총에 의해 이용되는 주요 발효 경로를 보여준다.
도면 4a
맞춤 제작된 3개의 챔버가 있는 모의된 인간 장관 산화환원 모형 (SHIRM).
도면 4b
SHIRM에서 전자 수용체를 향하여 세균 세포로부터 전자 흐름의 계통도 표현. (Eo') 볼트에서 계측된 산화환원 전위 (환원 전위 및 산화 전위).
도면 4c
세균 세포로부터, 산화환원 전위를 포함하는 전자 수용체로의 전자 전달에 관련된 중간체의 SHIRM 계통도 표현.
도면 5.
SHIRM 작업의 기본 작업 흐름.
도면 6.
작은 베드 용적 ca 100ml 산소 주입기에 연계된 SHIRM 애노드 챔버의 표현.
도면 7.
공기 호흡 SHIRM: 측면 팔을 통해, 공기로부터 애노드 챔버 내로 직접적인 산소 확산.
도면 8.
SHIRM 작업의 작업 흐름, 10 단계
도면 9.
적응된 균주의 선별
도면 10.
적응된 균주의 산소 내성 프로필을 탐구하기 위한 전략.
본 발명의 상세한 설명 및 이의 바람직한 구체예
정의
"적응"은 동적 진화 과정, 예를 들면, 자연 도태의 결과인데, 여기서 생물체는 이의 기생부위 또는 기생부위들에서 더욱 우수하게 생존할 수 있게 된다. 미생물의 적응 (또는 훈련)의 과정은 또한, 유리하게는 비선천적/인공/시험관내 환경에서, 예를 들면, 본 발명의 방법에서 실행될 수 있다.
"항산화제"는 유리 라디칼을 스캐빈징함으로써 또는 손상된 분자를 수복하거나 또는 제거함으로써 반응성 산소, 질소, 히드록실 및 지질 종의 형성을 예방하는 작용제이다. 항산화제는 종종, 환원제로서 직접적으로 행동할 수 있다.
"환원제"는 산화환원 화학 반응에서 전자를 다른 작용제에 상실하는 (또는 "기증하는") 물질, 요소 또는 화합물이다. 환원제가 전자를 상실하기 때문에, 이것은 산화된 것으로 일컬어진다.
"산화된 대응물"은 다른 종으로부터 전자의 제거를 유발하는 화학물질이다. 산화된 대응물은 항산화제의 산화된 형태이다.
"산화환원 매개체" 또는 전자 셔틀은 가역성 산화환원 반응을 겪을 수 있고, 그리고 세균으로 및 세균으로부터 전자 전달/셔틀을 조장하는 화합물이다.
"적용 전압", "외부 전압", "산화 전위", "적용 전기 산화 전위", "적용 전극 전위", "전압" 및 "전위 전압"은 교체가능하게 이용될 수 있고, 그리고 생물반응기 내에 챔버에 적용된 전압을 지칭한다.
"산소 확산"은 높은 농도로부터 낮은 농도로 산소 분자의 이동이다.
"산소 플럭스"는 챔버, 예를 들면, 미생물을 내포하는 애노드 챔버 내로 시간 단위당 전달된 산소의 양이다.
식이 산화환원 활성 화합물 및 전자 공여자, 예를 들면, 탄수화물 및 단백질과 함께 소화관 미생물 균총은 소화관에서 환원 환경을 유지하는데 일정한 역할을 수행한다. 이것은 소화관 미생물 균총이 소화관 내강 내에 용존 산소 유입에 대처하도록 적응된다는 것을 의미한다 (도면 1). 높은 농도에서 용존 산소는 다수의 소화관 미생물에게 치명적일 수 있고, 그리고 환원 환경은 산화 손상으로부터 회복하는데 도움을 준다 (도면 2). 더욱 상세하게는, 도면 3은 인간 소화관 내에 소화관 미생물 균총에 의해 이용되는 주요 발효 경로를 보여준다. 혐기성 성장 동안 전자 불균형은 여러 산 발효 및 가스 생산에 의해 균형화된다. 일부 미생물은 전자를 세포외 전자 수용체, 예를 들면, 질산염, 황산염 또는 불용성 금속성 복합체로 호흡한다. 게다가, 산소는 간접적인 전자 수용체로서 행동할 수 있는데, 그 이유는 소화관 미생물 중에서 일부가 소량의 산소를 소비할 수 있기 때문이다. 산화환원 활성 화합물, 예를 들면, 갈산염, 루틴, 레스베라트롤, 카페인 및 플라빈은 통상적인 식이 내에 존재하고, 아마도 소화관에서 산화되면, 전자 수용체로서 또한 행동할 수 있다 (도면 1). 소화관의 산화환원 상태는 일정한 약물 또는 대사산물의 생체이용률에 영향을 줄 수 있다. 식품의 섭취를 통한 산소의 연속적 유입 및 소화관 점막층으로부터 확산이 있다는 사실에도 불구하고, 소화관의 순 산화환원 전위는 음성, ca -300mV 상태로 남아있다. 이러한 산소 결핍성 환원 환경은 소화관 내강 내에 엄격한 혐기성 미생물의 성장에 우호적이다.
산소에 대한 높은 감수성은 많은 소화관 미생물의 홀마크인데, 이로 인해, 이들 미생물은 긴 기간에 걸쳐 배양하고 보관하기가 극히 어렵다. 새로운 가능성 있는 프로바이오틱스를 개발하기 위해 소화관 미생물 균총 중에서 대표적인 것들을 단리하고 배양할 때 다른 장애물은 상이한 생태적 적소 및 기생부위의 면에서 소화관 환경의 복잡성이다. 프로바이오틱 제제는 주위 공기에서 수개월 동안 안정되어야 하지만, 이것은 많은 소화관 미생물의 산소 감수성으로 인해 어려운 과제이다. 여러 소화관 미생물은 다른 미생물로부터 이종 교배이고, 그리고 또한, 숙주로부터 일부 성장 인자를 필요로 할 수 있는데, 이것은 이들 조건을 시험관내에서 모의하는 것을 어렵게 만든다.
페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii)는 다양한 대사성 질환에서 항염증성 성질을 갖는 가능성 있는 프로바이오틱의 실례이다. 이것은 인간 장 내에 세균 중에서 5 % 이상을 나타내는데, 이로 인해, 이것은 장관 미생물 균총에서 가장 풍부한 세균 중에서 한 가지이다. 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii)는 상대적으로 많은 양의 부티르산염을 생산하는데, 이것은 소화관 생리학에서 주요한 역할을 수행하고 결장 내강에서 주요 대사산물이다. 부티르산염은 또한, 세포 증식을 자극하고 결장 점막층으로부터 점액 분비를 증진한다. 페칼리박테리움 프라우스니치이 (f. prausnitzii)는 산소에 극히 민감한 세균이고 주위 공기에 노출될 때 단지 몇 분만 생존한다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도, 혐기성 미생물의 산소 적응을 위한 새로운 방법을 발견하였고, 그리고 상기 산소 적응을 위한 방법을 본원에서 개시하고, 따라서 이런 생물체가 산소에 상대적으로 더욱 내성이 되고, 그리고 따라서, 프로바이오틱 균주로서 및 포유동물에서 개입을 위한 프로바이오틱 제제 또는 조성물에서 보관 및 이용을 위해 안정되고 견실하게 되는 것을 가능하게 한다. 상기 새로운 방법은 산업 규모 생산을 관용하고, 그리고 산화 스트레스가 주요 홀마크인 소화관 장애 하에 있는 인간 소화관 환경에 적응할 수 있는, 견실한 특징을 갖는 프로바이오틱 균주로서 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii)의 개발 및 이용을 특이적으로 허용할 것이다.
본 발명은 혐기성 미생물의 적응 및 산소에 상대적으로 더욱 내성인 혐기성 미생물의 선별을 위한 방법을 제공하는데, 여기서 이들 미생물은 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화의 조합에서 배양된다. 본 발명의 방법은 따라서, 일반적으로 시험관내에서 실행된다.
산화 스트레스의 이중 유도는 산화 환경에 대한 미생물의 내성을 증가시키고, 따라서 미생물이 산소 (가령, 주위 공기에 노출될 때)에 더욱, 또는 상대적으로 더욱 내성이 될 수 있게 한다. 산소 (가령, 주위 공기에 노출될 때)에 더욱 (또는 상대적으로 더욱) 내성인 미생물은 본 발명의 적응 방법에서 이용된 시작 균주(들) (또는 부모 균주(들))와의 비교를 편의하게 지칭할 수 있다.
증가된 산소 내성은 미생물이 상대적으로 더욱 긴 기간 동안 주위 공기에서 계속 생존하는 것을 가능하게 만드는데, 이것은 명확하게 유리하다.
적용 전압 또는 적용 외부 전압은 일반적으로, 예로서 퍼텐시오스타트를 통해, 애노드에, 예를 들면, 흑연, 흑연 펠트 또는 탄소 펠트 또는 탄소 섬유 애노드에 적용되고, 그리고 단계별로 증가된다. 전압이 미생물에 적용되는 경우에, 이들은 편의하게, 전압이 적용되는 적절한 애노드 챔버 또는 다른 용기, 예를 들면, 생물반응기에서 제공된다. 가령, 셀 회로는 바람직하게는, 이온 교환 막 (가령, 양이온 선택적 막 또는 양성자 교환 막)에 의해 분리된, 애노드 챔버의 한쪽 팔을 통해, 캐소드 챔버를 애노드 챔버에 연결함으로써 완결된다. 적용 전압은 최대 0.6V, 더욱 특정하게는 Ag/AgCl과 대비하여 0.6V까지 증가될 수 있다 (바람직하게는, 단계별 증가에 의하여).
편의하게는, 이들 방법은 예로서, 미생물에 산소 플럭스의 적용에 의해 산소 확산의 이용을 수반한다. 산소 플럭스 (가령, 애노드 챔버를 통한 산소 플럭스)는 원하는 용존 산소 농도 (특히, 미생물과 접촉 시에 원하는 용존 산소 농도)가 달성되도록 하기 위해, 산소 주입기를 순수한 산소 가스 또는 공기로 일소함으로써 유지될 수 있다. 용존 산소는 산소 주입기를 통해 애노드 챔버로 확산하고, 따라서 설명된 방법의 산소 확산 (또는 산소 플럭스)을 창출할 것이다. 가령, 산소 플럭스 (또는 확산)은 예로서, 애노드 챔버, 예를 들면, 상이한 산소 확산 상수를 갖는 가변적 중격 (가령, 가변적 막, 예를 들면, 반투막)을 통해 분리된, 애노드 챔버의 다른 측면 팔에 산소 주입기 또는 다른 산소 공급원을 연결함으로써, 임의의 적절한 수단에 의해 제어될 수 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 산소 플럭스는 산소 주입기의 베드 용적을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 가령 100ml 및 250ml 산소 주입기가 도면에서 도시된다 (도면 6 및 4a를 참조한다). 산소 주입기는 또한, 예로서 도면 7에서 보여 지는 바와 같이, 애노드 챔버 내로 산소의 직접적인 확산을 허용하기 위해 제거될 수 있다. 애노드 챔버 및 산소 주입기 (또는 산소 공급원) 사이에 막, 예를 들면, 중격 막은 산소 주입기로부터 애노드 챔버로 산소의 더욱 우수한 제어된 확산을 허용하기 위해 점액소 한천으로 더욱 코팅될 수 있다.
추가적으로, 배지 내에 존재하는 환원제 또는 항산화제는 용존 산소를 스캐빈징하고, 그리고 따라서, 산소 확산 동역학 및 이에 따른 산소 플럭스에 충격을 줄 것이다. 가령, 본 발명의 방법에서, 미생물 배양 배지 내에 존재하는 항산화제 (특히, 항산화제의 양 또는 수준)가 산소를 스캐빈징하는데 이용될 수 있고, 그리고 따라서, 미생물 배양액 내에 존재하는 산소 (용존 산소)의 수준 또는 양 또는 농도를 제어하는 수단으로서 이용될 수 있다. 가령, 미생물 배양액에서 낮은 (또는 더욱 낮은) 수준의 항산화제는 일반적으로, 더욱 많은 산소가 가용하다 (또는 더욱 많은 산화 스트레스가 있다)는 것을 의미할 것이고, 반면 높은 (또는 더욱 높은) 수준의 항산화제는 일반적으로, 더욱 적은 산소 (또는 낮은 수준의 산소)가 가용하다 (또는 더욱 적은 산화 스트레스가 있다)는 것을 의미할 것이다.
산소 확산 또는 플럭스, 또는 이들의 조합의 제어를 위한 이들 방법 중에서 한 가지가 미생물 배양 배지에서 용존 산소의 원하는 양 또는 농도를 달성하고, 그리고 따라서, 본 발명의 방법에서 산화 스트레스를 유도하는데 이용된 산소 확산, 산소 플럭스 또는 용존 산소 농도 (또는 용존 산소의 양 또는 수준)에서 단계별 변화 (바람직하게는 단계별 증가)를 달성하는데 쉽게 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서, 시작 조건은 바람직하게는 낮은 (또는 제로) 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)이고, 그리고 이들 방법은 예로서, 높은 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)까지 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)에서 단계별 증가를 포함한다. 제로 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)는 미생물 배양 배지 (가령, 애노드 챔버) 내에 존재하는 0 몰의 산소를 지칭한다. 예시적인 낮은 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)는 미생물 배양 배지 (가령, 애노드 챔버) 내에 존재하는 약 10 μM의 용존 산소를 지칭하는데, 이것은 예로서, 1 시간 내에 (시간당) 미생물 배양 배지/애노드 챔버 내로 확산한다. 예시적인 높은 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)는 미생물 배양 배지 (가령, 애노드 챔버) 내에 존재하는 약 50 μM 내지 약 250 μM의 용존 산소를 지칭하는데, 이것은 예로서, 1 시간 내에 (시간당) 미생물 배양 배지/애노드 챔버 내로 확산한다.
산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)에 의해 산출된 실제 산화 스트레스는 또한, 성장 배지 내에 항산화제의 존재에 의존한다. 가령, 높은 항산화제가 있으면, 높은 산소 플럭스가 더욱 적은 산화 스트레스를 산출할 것이다. 배지 내에 매우 낮은 항산화제가 있으면, 작은 산소 플럭스가 높은 산화 스트레스를 산출할 수 있다. 다시 한 번, 이들 조건의 제어는 산화 스트레스의 단계별 유도를 달성하기 위해, 당업자의 능력 범위 내에 있다.
용존 산소의 시작 농도를 제어하기 위해 (가령, 산소의 시작 농도를 낮은 (또는 제로) 수준까지 감소시키기 위해), 성장 배지는 예로서, 산소 없는 질소로 일소함으로써 산소가 탈기될 수 있다.
항산화제는 미생물을 치명적인 농도의 산소로부터 보호하고 소화관 산화환원 환경을 모의하기 위해 배양 배지 내에 포함된다. 가령, 항산화제는 시스테인, 글루타티온, 아스코르브산, 디티오트레이톨 또는 갈산일 수 있다. 항산화제, 예를 들면, 시스테인 또는 임의의 다른 적합한 항산화제는 산화환원 전위 또는 산화환원 상태에 영향을 주거나 또는 이를 조정하기 위해 이용될 것이다. 많은 세균은 시스테인을 황의 공급원으로서 필요로 한다. 본 발명의 방법 중에서 일부에서처럼, 시스테인이 환원될 때, 이것은 성장 배지의 감소된 전체 황 풀을 야기할 것이다. 상기 감소를 보상하기 위해, 산화된 대응물, 예를 들면, 시스틴 (시스테인의 경우에)이 첨가된다. 다른 산화된 대응물 (가령, 상기 열거된 항산화제의 경우에)은 타당하면, 글루타티온-산화된 상태, 디히드로아스코르브산염, 산화된 디티오트레이톨 또는 산화된 갈산일 수 있다. 추가적으로, 적합한 산화환원 매개체 또한, 배양 배지 내에 포함될 수 있다.
성장 환경의 산화환원 상태를 조정하기 위해 산화환원 상태의 단계별 변화, 예를 들면, 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화가 수행된다. 산화환원 전위는 Nernst 방정식 (a)에 따라 계산될 수 있다. 이것은 임의의 적합한 항산화제 및 이의 산화된 대응물에 이용될 수 있다 .
여기서:
Eh = 산화환원 전위 = V
Eo = (환원제/항산화제)/산화된 대응물 커플의 표준 산화환원 전위
R = 일반적인 가스 상수 = 8.31451 J K-1 몰-1
F = 패러데이 상수 = 96.485 C/mol
T = 절대 온도 (K)
n = 관련된 전자의 숫자
임의의 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 산화환원 전위는 따라서, 당업자에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 실례로서, 다양한 농도의 시스테인/시스틴 산화환원 커플에 대해 계산된 산화환원 전위 (Eh) 값은 표 1에서 제시된다.
시스틴/시스테인 커플에 대한 Eo = pH 7.4 및 n = 2에서 0.25V.
시스테인/시스틴을 항산화제/산화된 대응물 커플로서 이용하면, 시스테인의 바람직한 시작 농도는 반응 화학식 (b)에 근거하여 계산될 수 있었다.
4R-SH + O2 → 2R-SS-R + H2O (b)
방정식 (b)에 따르면, 4 몰의 시스테인 (R-SH)이 1 몰의 산소와 반응하여 2 몰의 시스틴 (R-SS-R)을 생산한다.
25℃에서 물에서 용존 산소 농도는 대략 200 μM이고, 그리고 성장 배지가 실험에 앞서 질소로 일소되지 않으면, 대략 800 μM의 시스테인이 200 μM의 산소와 반응하여 400 μM의 시스틴이 산출될 것이다.
따라서 8mM의 시스테인을 갖는 성장 배지의 경우에, 대략 -223 mV의 초기 산화환원 전위가 관찰될 것이다. 하지만, 산소 없는 질소로 성장 배지 내에 산소의 완전한 탈기는 소화관 내강 산화환원 전위 (대략 -300mV)에 가까운 대략 -283mV의 산화환원 전위를 제공한다. 따라서, 시스테인/시스틴이 커플로서 이용되는 경우에, 시스테인 (또는 다른 항산화제 대응물 커플)의 바람직한 시작 농도는 8mM이다. 이것은 시스테인/시스틴이 커플로서 이용되는 높은 농도의 항산화제의 실례이지만, 동등한 높은 농도의 항산화제가 다른 커플에 대해 쉽게 계산될 수 있을 것으로 인지될 것이다. 이에 더하여, 시스틴 (또는 다른 산화된 대응물 커플)의 바람직한 시작 농도는 원하는 시작 산화환원 전위를 달성하기 위해, 0mM 또는 만약 그렇지 않으면 낮은 농도이다. 이용된 성장 배지는 산소가 완전하게 탈기되는 (또는 산소가 성장 배지로부터 완전하게 제거되는) 것이 또한 바람직하다. 다시 말하면, 바람직한 조건은 방법의 시작 시점에서 가능한 한 -300mV의 소화관 내강 산화환원 전위에 가깝도록 선택된다. 이들 방법을 실행할 때, 산화된 대응물의 농도에서 단계별 증가와 합동된 항산화제의 농도에서 단계별 감소가 발생하여, 산화환원 전위에서 전반적인 단계별 증가를 유발하는 것이 바람직하다. 편의하게는, 시스테인/시스틴 (또는 다른 항산화제/산화된 대응물 커플)의 경우에 이것은 시스테인의 농도에서 1mM의 단계별 감소 및 시스틴의 농도에서 1mM의 증가일 수 있다. 하지만, 산화환원 상태에서 단계별 변화가 발생한다면, 상이한 단계별 증가/감소 또한 이용될 수 있다.
이러한 추론은 임의의 적합한 항산화제/산화된 대응물 커플에 맞춤될 수 있다. 항산화제 농도를 감소시킬 때, 이것은 등가량의 상응하는 산화된 대응물로 균형화된다.
상기 방법은 적합한 생물반응기에서 편의하게 실행될 수 있고, 그리고 일반적으로, 세균 배양액의 여러 단계의 재접종 (가령, 새로운 배양 배지 내로)을 수반한다. 본 발명의 일부 바람직한 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 단계별 변화 또는 유도의 각 단계, 예를 들면, 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화, 예를 들면, 산화된 대응물의 농도에서 단계별 증가, 적용 전압에서 단계별 증가 및 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)에서 단계별 증가와 합동된 항산화제의 농도에서 단계별 감소의 각 단계는 재접종을 수반할 수 있다. 재접종은 또한, 본원에서 계대배양 단계 또는 배양 단계로서 지칭될 수 있다.
처음에는, 세균의 단일 집락이 당해 분야에서 공지된 바와 같은 적절한 배양 배지 내로 접종되고, 그리고 배양이 정지기에 도달할 때까지 성장하도록 허용될 수 있다. 시작 조건은 낮은 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도), 바람직하게는 제로 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도), 낮은 적용 전압, 바람직하게는 0.1 V, 더욱 특정하게는 Ag/AgCl과 대비하여 0.1V, 높은 농도의 항산화제 (상기 Nernst 방정식 계산을 참조한다), 낮은 농도 또는 제로 농도의 산화된 대응물 (상기 Nernst 방정식 계산을 참조한다) 중에서 하나 또는 그 이상, 또는 모두일 수 있다. 다음 재접종을 위해, 항산화제 농도의 단계별 감소, 산화된 대응물의 증가, 증가된 적용 전압, 그리고 증가된 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도)가 실행될 수 있다.
미생물의 성장이 유의미하게 감소될 때, 이들 조건은 균주가 적응하도록 하기 위해, 각각 3mM 시스테인, 5 mM 시스테인, Ag/AgCl과 대비하여 0.6 V 및 0.2nmolesml-1min-1으로 구현될 수 있는, 도달된 최적화된 (또는 최종) 조건에서 일정하게 유지될 수 있다 (도면 5 및 8를 참조한다). 다시 말하면, 일단 단계별 변화가 유의미하게 감소되는 미생물의 성장을 유발하면, 이들 단계별 변화는 중지되고, 그리고 미생물은 단계별 변화의 종결점에서 도달된 조건에 상응하는 일정한 조건 (또는 최적화된 또는 최종 조건)을 이용하여 하나 또는 그 이상의 단계 동안 배양된다. 이들 일정한 단계는 균주가 적응하도록 허용한다. 일정한 조건에서 반복된 접종 후, 일단 균주가 적응하면, 일부 구체예에서 접종은 항산화제 농도의 추가 단계별 감소, 산화된 대응물의 증가, 증가된 적용 전압, 그리고 증가된 산소 플럭스 (또는 산소 확산 또는 산소 농도) 중에서 하나 또는 그 이상 (또는 바람직하게는 모두)으로 지속될 수 있다 (도면 5를 참조한다).
상기 방법의 각 단계로부터 획득된 모든 계대배양액이 최고 적응된 균주를 선별하기 위해 한꺼번에 분석될 수 있거나, 또는 하나의 계대배양액이 접종이 지속되어야 하는 지의 여부를 결정하기 위해 회수 직후에 분석될 수 있다. 계대배양액이 적응되지 않았으면, 접종을 계속하는 것이 적절할 것이고, 만약 그렇지 않고, 균주가 적응하였으면, 상기 균주는 선별될 수 있고, 그리고 상기 방법은 중지될 수 있다 (가령, 도면 8을 참조한다). 가령, 획득된 계대배양액은 산소 내성에 대해 분석될 수 있고, 그리고 만약 이들이 원하는 수준의 산소 내성, 예를 들면, 유관한 대조 균주 (가령, 시작 균주 또는 부모 균주)와 비교하여 증가된 (바람직하게는 유의미하게 증가된) 수준의 산소 내성, 또는 산소 (가령, 주위 공기에서)에 노출될 때 충분한 수준의 안정성 (가령, 보관 시간)을 보여주면, 상기 균주는 적응하였고 선별될 수 있다. 산소 내성의 편의한 척도는 호기성 조건 (가령, 주위 공기에 노출)에서 미생물의 성장을 사정함으로써 획득될 수 있다. 가령, 균주가 산소에 노출될 때, 예로서 CFU/ml의 척도의 형태에서 집락 형성 단위 (CFUs)의 숫자의 척도가 만들어질 수 있다. 예시적인 적응된 (산소 내성) 균주는 산소, 예를 들면, 주위 공기에 노출될 때, 최소한 1x102 또는 1x103 CFU/ml, 바람직하게는 최소한 1x104 또는 1x105 CFU/ml를 가질 것이다. 적절한 방법은 실시예에서 설명된다 (가령, 표 3을 참조한다). 만약 균주가 적응되지 않았으면, 접종이 지속될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 시작 조건은 8mM 시스테인 (또는 당량 농도의 대안 항산화제), 0mM 시스틴 (또는 대안적 산화된 대응물), 0.1V의 적용 전압, 그리고 제로 또는 낮은 산소 플럭스 중에서 하나 또는 그 이상, 또는 모두에서 선택된다. 이런 구체예에서, 단계별 변화는 3mM의 최소 시스테인 농도 (또는 당량 농도의 대안 항산화제), 5mM의 최대 시스틴 농도 (또는 당량 농도의 대안 산화된 대응물), 0.6 V의 최대 적용 전압, 그리고 높은 산소 플럭스 중에서 하나 또는 그 이상, 또는 모두일 때까지 지속될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 방법에서, 적용 전압은 0.6 V를 초과하지 않고, 및/또는 시스테인 농도는 3mM보다 낮지 않고, 및/또는 시스틴 농도는 5mM보다 높지 않고, 및/또는 배양 배지에서 용존 산소 농도는 준치사 농도에서 유지된다.
상기 논의로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 일부 구체예에서, 일단 단계별 변화가 완결되면, 상기 방법은 단계별 변화 후 도달된 적용 전압, 산소 확산 (산소 플럭스 또는 산소 농도) 및 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 최종 (최적화된 또는 일정한) 조건 하에, 상기 미생물을 배양 (계대배양)하는 하나 또는 그 이상의 추가 단계를 포함한다 (가령, 도면 8을 참조한다).
다른 구체예에서, 상기 방법은 차후 단계를 더욱 포함하는데, 여기서 추가 단계 변화가 실행된다 (가령, 도면 5를 참조한다).
실행되는 단계별 변화의 단계의 숫자를 결정하는 것은 미생물이 적응을 겪고 있는 동안, 미생물의 행동을 모니터링하거나 또는 미생물을 선별검사함으로써 (가령, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이), 당업자에 의해 결정될 수 있다. 가령, 본 발명 방법의 바람직한 구체예는 단계별 변화의 최대 5 또는 6 단계, 예를 들면, 단계별 변화의 3, 4, 5 또는 6 단계, 또는 단계별 변화의 최소한 5 단계, 예를 들면, 단계별 변화의 최대 10 단계, 예를 들면, 7, 8, 9 또는 10 단계를 수반할 수 있다.
혐기성 미생물의 적응 및 산소에 더욱 내성인 혐기성 미생물의 선별을 달성하기 위해 단계, 예를 들면, 배양 단계 (단계별 변화의 단계 및 일정한 또는 최적화된 조건 하에 실행되는 단계 포함)의 총수를 결정하는 것은 미생물이 적응을 겪고 있는 동안, 미생물의 행동을 모니터링하거나 또는 미생물을 선별검사함으로써 (가령, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이), 당업자에 의해 결정될 수 있다. 가령, 본 발명 방법의 바람직한 구체예는 최대 6, 7, 8, 9, 10 또는 12 단계, 또는 최대 15, 20, 25, 30 또는 35 단계를 수반할 수 있다.
일정한 또는 최적화된 조건 하에 실행되는 배양 단계를 수반하는 방법에서, 실행되는 단계, 예를 들면, 배양 단계의 숫자를 결정하는 것은 미생물이 적응을 겪고 있는 동안, 미생물의 행동을 모니터링하거나 또는 미생물을 선별검사함으로써 (가령, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이), 당업자에 의해 결정될 수 있다. 가령, 본 발명 방법의 바람직한 구체예는 일정한 또는 최적화된 조건 하에 실행되는 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 12 단계, 또는 최대 15, 20, 25, 30 또는 35 단계를 수반할 수 있다.
일부 구체예에서, 혐기성 미생물의 적응 및 산소에 더욱 내성인 혐기성 미생물의 선별은 일정한 또는 최적화된 조건 하에 실행된 이들 단계의 종결점에서 (또는 실제로 때때로, 단계별 변화의 단계의 종결점에서) 달성될 수 있다. 따라서, 당업자는 예로서, 유의미한 또는 충분한 또는 최대 적응 (산소 내성)이 일어나는 때를 모니터링함으로써, 실행되는 이런 단계의 숫자를 쉽게 결정할 수 있다.
상기 방법은 또한, 적응되고 선별된 균주의 생산 (가령, 상기 방법에 의해 선별된 미생물의 생산 또는 성장)에 이용될 수 있다. 이런 방법에서 배양 조건은 최적 세팅, 예를 들면, 본 발명의 전술한 방법을 이용하여 확립된 바와 같은 최적화된 (또는 일정한) 조건, 예를 들면, 3mM 항산화제, 5mM 산화된 대응물, 0.6 V 및 0.2nmolesml-1min-1에서 일정하게 유지된다. 이것은 선별된 세균 균주의 높은 수율을 유발한다.
상기 방법은 '모의된 인간 장관 산화환원 모형' (SHIRM)으로 불리는 생물반응기에서 편의하게 실행된다 (도면 4a, b 및 c). SHIRM에서 이중 산화 스트레스는 외부 전압 (적용 전압) 및 산소 확산 (산소 플럭스)을 통해 적용되고, 그리고 상기 시스템의 산화환원 전위/산화환원 상태는 항산화제/산화된 대응물 커플에 의해 제어된다. 산소가 배양된 생물체에게 치명적이기 때문에, 용존 산소는 증가되지만 준치사 농도에서 유지될 것이고, 반면 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화는 환경의 산화환원 상태를 조정하는데 이용된다 (가령, 다른 항산화제/산화된 대응물 커플에 쉽게 맞춤될 수 있는 예시적인 시스테인/시스틴 농도를 보여주는 도면 5 또는 도면 8을 참조한다). 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스는 산화 환경에 대한 세균 내성을 증가시키고, 그리고 이들 세포는 새로운 산화 조건에 반복적으로 도전된다 (가령, 도면 5 또는 도면 8). 적응된 또는 진화된 균주는 산소 내성에 대해 선별검사된다. 균주는 또한, 최고 적응된 균주를 선별하기 위해, 물질대사 특징, 예를 들면, 지방산 프로필 (가령, 부티르산염 생성균, 예를 들면, 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii)의 경우에 부티르산염 생산 및 성장 동역학의 사정에 대해 선별검사될 수 있다. 적응된 또는 진화된 균주는 따라서, 산소 내포 환경에 더욱 우수하게 내성이 되도록 (가령, 유관한 시작 미생물 또는 부모 미생물보다), 또는 스트레스 조건, 예를 들면, 주위 공기 (산화 스트레스) 또는 예로서 담즙산염에 노출에 더욱 우수하게 내성이 되도록 적응된다. 따라서, 예로서 균주가 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii)인 경우에, 물질대사 특징, 예를 들면, 부티르산염 생산, 또는 다른 지방산 생산이 유지되거나 또는 향상되는 균주가 선별되지만, 이들 균주는 향상된 산소 내성을 보여준다 (가령, 유관한 시작 또는 부모 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii) 균주와 비교하여).
바람직한 구체예에서, 본 발명은 혐기성 미생물의 적응 및 산소에 상대적으로 더욱 내성인 혐기성 미생물의 선별을 위한 방법을 제공하고, 여기서 이들 미생물은 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화의 조합에서 배양된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 혐기성 미생물의 산소 적응을 위한 방법이 모의된 인간 장관 산화환원 모형 (SHIRM)으로 불리는 생물반응기를 이용하여 실행되고, 그리고 다음의 단계를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다:
a) 세균 세포를 치명적인 농도의 산소로부터 보호하고 소화관 산화환원 환경을 모의하기 위해, 적합한 산화환원 매개체 및 환원제를 포함하는 배양 배지 (당해 분야에서 공지된 바와 같음)에서 세균의 단일 집락의 접종.
b) 배양액이 후기 지수 증식기에 도달할 때, 배양액의 한 부분이 분석에 이용될 수 있고, 그리고 다른 부분은 SHIRM 반응기 내로 가능한 재접종에 이용될 수 있다.
c) 최초 단리에서 이용된 것과 동일한 배양 배지를 내포하는 SHIRM 반응기에서 배양액의 접종 및 세균 균주의 일과적인 배양. 상기 성장 배지는 여기에서 Shirm Bed 배양 배지 (SBCM)로 불린다.
I. 예로서 하지만 제한 없이 시스테인, 글루타티온, 아스코르브산, 디티오트레이톨 및 갈산에 대한 환원제/항산화제 농도는 감소되고, 그리고 등가량의 상응하는 "산화된 대응물", 예로서 하지만 제한 없이 시스틴, 글루타티온-산화된 상태, 디히드로아스코르브산염, 산화된 디티오트레이톨 및 산화된 갈산으로 균형화된다.
II. 적용 전기 산화 전위는 예로서, 퍼텐시오스타트를 통해 흑연, 흑연 펠트 또는 탄소 펠트 또는 탄소 섬유 애노드에서 외부 전압을 통해 유지된다. 셀 회로는 예로서, 양성자 교환 막에 의해 분리된 애노드 챔버의 한쪽 팔에 캐소드 챔버를 연결함으로써 완결된다.
III. 산소 플럭스는 상이한 산소 확산 상수를 갖는 가변적 중격을 통해 분리된 애노드 챔버의 다른 측면 팔에 산소 주입기를 연결함으로써 제어된다. 즉각적인 산소 플럭스는 예로서, Clark의 유형 DO 프로브에 의해 계측된다 (도면 4a를 참조한다).
IV. 산소 플럭스는 산소 주입기를 순수한 산소 가스 또는 공기로 일소함으로써 유지되고, 그리고 원하는 용존 산소 농도는 가스 용해도의 Henry 법칙에 따라서 달성된다. 용존 산소는 이후, 산소 주입기를 통해 애노드 챔버로 확산한다.
V. 추가적으로, 산소 플럭스는 산소 주입기의 베드 용적을 변화시킴으로써 제어된다. 산소 주입기는 또한, 애노드 챔버 내로 산소의 직접적인 확산을 허용하기 위해 제거될 수 있다.
VI. 애노드 챔버 및 산소 주입기 사이에 중격 막은 산소 주입기로부터 애노드 챔버로 산소의 더욱 우수한 제어된 확산을 허용하기 위해 점액소 한천으로 더욱 코팅될 수 있다.
VII. SHIRM은 Shirm Bed 배양 배지 (SBCM)를 내포하는데, 이것은 용존 산소를 제거하기 위해 산소 없는 질소로 일소된다.
VIII. SHIRM 생물반응기는 배양액이 정지기에 도달할 때까지 이행된다.
d). 첫 번째 계대배양액의 한 부분이 SHIRM 반응기에서 접종에 이용된다.
e). 단계별 감소된 항산화제 농도, 증가된 산화된 대응물 농도 및 증가된 적용 전압 (최대 0.6V)을 갖는 SHIRM 반응기에서 재접종이 시작된다. 더욱 적은 항산화제는 더욱 적은 산소를 스캐빈징할 것이고, 이런 이유로 더욱 많은 산소가 가용할 것이고, 그리고 세포는 더욱 많은 산화 스트레스를 경험한다. 산소 주입기는 산소 확산 플럭스를 더욱 조절한다. 이러한 단계는 성장이 감소될 때까지 반복된다.
f). 모든 조건을 일정하게 유지하면서, 재접종이 반복되고, 그리고 새로운 계대배양액이 비교 물질대사 특징화, 성장 동역학, 안정성 및 내성에 대해 분석된다. 분석이 만족스러우면, 이러한 계대배양액은 선별되고, 그리고 만약 그렇지 않으면 단계 f)가 반복된다.
이런 방법에서 각 계대배양액은 차후 재접종 전 (또는 각 단계 후) 분석될 수 있고, 그리고 상기 방법은 균주가 산소에 적절하게 적응할 때 중지된다. 이러한 균주는 이후, 선별된다. 이런 방법에서, 최대 약 30 계대배양액, 또는 최대 약 10 계대배양액 (또는 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 다른 숫자의 계대배양액)이 상기 방법이 중지되기 전에 분석될 수 있다.
상기 단계 중에서 하나 또는 그 이상이 타당하면, 본원에서 설명된 바와 같은 발명의 방법 중에서 한 가지에서 이용될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 약 30 계대배양액 회수되거나 (가령, 도면 5를 참조한다), 또는 약 10 계대배양액이 회수되거나 (가령, 도면 8을 참조한다), 또는 다른 숫자의 계대배양액이 회수되고 (본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이), 그리고 이후, 최고 적합한 균주를 찾기 위해 이들 모두 분석된다. 이러한 방식으로, 예로서 어떤 계대배양액이 산소에 가장 적응되거나 또는 내성인 지를 사정하기 위해, 각 단계 후 계대배양액을 분석할 필요가 없고, 그 대신에 모든 분석이 한 번에 수행될 수 있다. 혐기성 미생물의 산소 적응을 위한 방법은 모의된 인간 장관 산화환원 모형 (SHIRM)으로 불리는 생물반응기를 이용하여 실행되고, 그리고 다음의 단계를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다:
a) 세균 세포를 치명적인 농도의 산소로부터 보호하고 소화관 산화환원 환경을 모의하기 위해, 적합한 산화환원 매개체 및 환원제를 포함하는 일과적인 배양 배지 (당해 분야에서 공지된 바와 같음)에서 세균의 단일 집락의 접종.
b) 배양액이 후기 지수 증식기에 도달할 때, 배양액의 한 부분이 SHIRM 반응기 내로 접종에 이용되고 다른 부분이 분석을 위해 저장된다.
c) 최초 단리에서 이용된 것과 동일한 배양 배지를 내포하는 SHIRM 반응기에서 배양액의 접종 및 세균 균주의 일과적인 배양. 상기 성장 배지는 여기에서 Shirm Bed 배양 배지 (SBCM)로 불린다.
I. 예로서 하지만 제한 없이 시스테인, 글루타티온, 아스코르브산, 디티오트레이톨 및 갈산에 대한 환원제/항산화제 농도는 감소되고, 그리고 등가량의 상응하는 "산화된 대응물", 예로서 하지만 제한 없이 시스틴, 글루타티온-산화된 상태, 디히드로아스코르브산염, 산화된 디티오트레이톨 및 산화된 갈산으로 균형화된다.
II. 적용 전기 산화 전위는 퍼텐시오스타트를 통해 흑연, 흑연 펠트 또는 탄소 펠트 또는 탄소 섬유 애노드에서 외부 전압을 통해 유지된다. 셀 회로는 양성자 교환 막에 의해 분리된 애노드 챔버의 한쪽 팔에 캐소드 챔버를 연결함으로써 완결된다.
III. 산소 플럭스는 상이한 산소 확산 상수를 갖는 가변적 중격을 통해 분리된 애노드 챔버의 다른 측면 팔에 산소 주입기를 연결함으로써 제어된다. 즉각적인 산소 플럭스는 예로서, Clark의 유형 DO 프로브에 의해 계측된다 (도면 4a를 참조한다).
IV. 산소 플럭스는 산소 주입기를 순수한 산소 가스 또는 공기로 일소함으로써 유지되고, 그리고 원하는 용존 산소 농도는 가스 용해도의 Henry 법칙에 따라서 달성된다. 용존 산소는 이후, 산소 주입기를 통해 애노드 챔버로 확산한다.
V. 추가적으로, 산소 플럭스는 산소 주입기의 베드 용적을 변화시킴으로써 제어된다. 산소 주입기는 또한, 애노드 챔버 내로 산소의 직접적인 확산을 허용하기 위해 제거될 수 있다.
VI. 애노드 챔버 및 산소 주입기 사이에 중격 막은 산소 주입기로부터 애노드 챔버로 산소의 더욱 우수한 제어된 확산을 허용하기 위해 점액소 한천으로 더욱 코팅될 수 있다.
VII. SHIRM은 SBCM을 내포하는데, 이것은 용존 산소를 제거하기 위해 산소 없는 질소로 일소된다.
VIII. 이후, 첫 번째 접종에 이용된 SBCM은 SBCM X,Y/ VZ로서 지정될 수 있는데, 여기서 X는 항산화제 농도 (mM)를 지칭하고, Y는 산화된 대응물 농도 (mM)를 지칭하고, 그리고 'VZ'는 Ag/AgCl과 대비하여 적용 전압 (V)을 지시한다. SHIRM 생물반응기는 배양액이 정지기에 도달할 때까지 이행된다.
IX. 첫 번째 배양 후 회수된 배양액은 "개체군 P1"로서 지정될 수 있다.
d) 감소된 항산화제 농도, 증가된 산화된 대응물 농도 및 증가된 적용 전압을 갖는 SHIRM 반응기에서 차기 접종이 시작된다. 더욱 적은 항산화제는 더욱 적은 산소를 스캐빈징할 것이고, 이런 이유로 더욱 많은 산소가 가용할 것이고, 그리고 세포는 더욱 많은 산화 스트레스를 경험한다. 산소 주입기는 산소 확산 플럭스를 더욱 조절한다.
e) 재접종은 약 6차 계대배양 때까지 지속된다 (가령, 도면 5 및 8을 참조한다) (항산화제/산화환원 매개체, 산소 플럭스 및 전압의 병용 효과가 성장에 유의미하게 영향을 줄 때 (감소)).
f) 적용 전압은 일반적으로, 과전위 때문에, AgAgCl와 대비하여 0.6V를 뛰어넘어 증가되지 않을 것이다. 더욱 높은 전위는 전극의 급속한 파울링을 유발할 수 있고, 그리고 부가적으로, 미생물 시토크롬, 예를 들면, 시토크롬 a3의 치명적인 산화는 SHE와 대비하여 대략 +0.385V의 환원 전위를 소유한다.
g) 모든 조건을 일정하게 유지하면서, 약 27차 계대배양 때까지 (가령, 도면 5를 참조한다) 또는 약 10차 계대배양 때까지 (가령, 도면 8을 참조한다) 반복된 접종이 수행되었고, 더욱 정확하게는, 균주가 조건에 적응할 때까지 적합한 숫자의 계대배양이 수행되었고 (적응의 확률을 증가시키기 위해), 이때 모든 계대배양에서 신선한 배지가 이용되었다.
h) 27차 계대배양 후, 접종은 도면 5에서 보여 지는 바와 같이 약 30차 계대배양까지 지속되었다. 대안으로, 10차 계대배양 후, 접종은 도면 8에서 보여 지는 바와 같이 중지되었다.
i) 모든 계대배양액이 회수될 때, 이들은 최고 적응된 균주를 선택하기 위해, 비교 메타유전체학, 물질대사 특징화, 성장 동역학, 안정성 및 산화 스트레스 내성에 대해 분석된다.
상기 단계 중에서 하나 또는 그 이상이 타당하면, 본원에서 설명된 바와 같은 발명의 방법 중에서 한 가지에서 이용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 혐기성 미생물의 산소 적응을 위한 방법은 모의된 인간 장관 산화환원 모형 (SHIRM)으로 불리는 생물반응기를 이용하여 실행되고, 그리고 다음의 단계를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다:
a) 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 일과적인 배양 배지에서 세균의 단일 집락의 접종. 시스테인이 성장 배지의 결장 산화환원 전위를 모의하는데 이용되고, 그리고 레자주린이 산화환원 지시약으로서 이용된다.
b) 배양액이 후기 지수 증식기에 도달할 때, 배양액의 한 부분이 SHIRM 반응기 내로 접종에 이용되고 다른 부분이 분석을 위해 저장된다.
c) 최초 단리에서 이용된 것과 동일한 배양 배지를 내포하는 SHIRM 반응기에서 배양액의 접종 및 세균 균주의 일과적인 배양. 상기 성장 배지는 여기에서 Shirm Bed 배양 배지 (SBCM)로 불린다.
I. 환원제/항산화제 농도, 시스테인은 감소되고, 그리고 등가량의 상응하는 "산화된 대응물", 시스틴으로 균형화된다.
II. 적용 전기 산화 전위는 퍼텐시오스타트를 통해 흑연, 흑연 펠트 또는 탄소 펠트 또는 탄소 섬유 애노드에서 외부 전압을 통해 유지된다. 셀 회로는 양성자 교환 막에 의해 분리된 애노드 챔버의 한쪽 팔에 캐소드 챔버를 연결함으로써 완결된다.
III. 산소 플럭스는 상이한 산소 확산 상수를 갖는 가변적 중격을 통해 분리된 애노드 챔버의 다른 측면 팔에 산소 주입기를 연결함으로써 제어된다. 즉각적인 산소 플럭스는 예로서, Clark의 유형 DO 프로브에 의해 계측된다 (도면 4a를 참조한다).
IV. 산소 플럭스는 산소 주입기를 순수한 산소 가스 또는 공기로 일소함으로써 유지되고, 그리고 원하는 용존 산소 농도는 가스 용해도의 Henry 법칙에 따라서 달성된다. 용존 산소는 이후, 산소 주입기를 통해 애노드 챔버로 확산한다.
V. 추가적으로, 산소 플럭스는 산소 주입기의 베드 용적을 변화시킴으로써 제어된다. 산소 주입기는 또한, 애노드 챔버 내로 산소의 직접적인 확산을 허용하기 위해 제거될 수 있다.
VI. 애노드 챔버 및 산소 주입기 사이에 중격 막은 산소 주입기로부터 애노드 챔버로 산소의 더욱 우수한 제어된 확산을 허용하기 위해 점액소 한천으로 더욱 코팅될 수 있다.
VII. SHIRM은 SBCM을 내포하는데, 이것은 용존 산소를 제거하기 위해 산소 없는 질소로 일소된다.
VIII. 이후, 첫 번째 접종에 이용된 SBCM은 SBCM 8,0/ V0,1로서 지정될 수 있는데, 전자는 시스테인 농도(mM 단위)를 지시하는 반면, 후자는 시스틴 농도 (mM 단위)를 지시하고, 그리고 'V'는 Ag/AgCl과 대비하여 적용 전압을 지시한다. SHIRM 생물반응기는 배양액이 +100mV의 산화 전위 하에 정지기에 도달할 때까지 작동한다.
IX. 첫 번째 배양 후 회수된 배양액은 "개체군 P1"로서 지정될 수 있다.
d). 감소된 시스테인 농도, 증가된 시스틴 농도 및 증가된 적용 전압을 갖는 SHIRM 반응기에서 차기 접종이 시작된다 (도면 5 및 도면 8을 참조한다). 더욱 적은 항산화제는 더욱 적은 산소를 스캐빈징할 것이고, 이런 이유로 더욱 많은 산소가 가용할 것이고, 그리고 세포는 더욱 많은 산화 스트레스를 경험한다. 산소 주입기는 산소 확산 플럭스를 더욱 조절한다.
e) 재접종은 6차 계대배양 때까지 지속된다. 이러한 시기에, 항산화제는 3mM로 감소되고 "산화된 대응물"은 5mM로 증가되고, 반면 산화 전위는 0.6V (AgAgCl과 대비하여)로 상승된다. 전위 전압은 과전위 때문에 AgAgCl와 대비하여 0.6V를 뛰어넘어 증가되지 않을 것이다. 더욱 높은 전위는 전극의 급속한 파울링을 유발할 수 있고, 그리고 부가적으로, 미생물 시토크롬, 예를 들면, 시토크롬 a3은 SHE와 대비하여 대략 +0.385V의 환원 전위를 소유한다.
f) 모든 조건을 일정하게 유지하면서, 27차 계대배양 (도면 5) 또는 10차 계대배양 (도면 8) 때까지 반복된 접종이 수행되었는데, 이때 모든 계대배양에서 신선한 배지가 이용되었다.
g) 도면 5에서 보여 지는 바와 같은 시나리오에서, 27차 계대배양 후, 접종은 도면 5에서 보여 지는 바와 같이 30차 계대배양까지 지속되었다. 대안으로, 예로서 도면 8에서 보여 지는 바와 같이, 10차 계대배양 후, 접종이 중지되었다.
상기 단계 중에서 하나 또는 그 이상이 타당하면, 본원에서 설명된 바와 같은 발명의 방법 중에서 한 가지에서 이용될 수 있다.
산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화는 Nernst 방정식에 따른다. 시스테인/시스틴 산화환원 커플에 대한 실례가 아래에 제시된다:
Eh = Eo + RT/2Fln([시스틴] / [Cys]2) (a)
여기서:
Eh= 산화환원 전위 = V
Eo = 시스틴/시스테인 커플의 표준 산화환원 전위 = pH 7.4에서 0.25V
R= 일반적인 가스 상수 = 8.31451 J K-1 몰-1
F= 패러데이 상수 = 96,485 C/mol
T= 절대 온도 (K)
다양한 농도의 시스테인 /시스틴 산화환원 커플에 대해 계산된 산화환원 전위 (Eh) 값은 표 1에서 제시된다.
표 1
| 시스테인 | 시스틴 | Eh | |
| mM | (mV) | ||
| 7,2 | 0,4 | -223 | 산소 포화된 배지 |
| 7,995 | 0,005 | -283 | |
| 7 | 1 | -211 | |
| 6 | 2 | -198 | |
| 5 | 3 | -188 | |
| 4 | 4 | -178 | 질소 일소에 의해 제조된 산소 고갈된 성장 배지 |
| 3 | 5 | -168 | |
| 2 | 6 | -155 | |
| 1 | 7 | -135 | |
| 0,01 | 8 | -13 | |
4R-SH + O2 → 2R-SS-R + H2O (b)
방정식 (b)에 따르면, 4 몰의 시스테인 (R-SH)이 1 몰의 산소와 반응하여 2 몰의 시스틴 (R-SS-R)을 생산한다.
25℃에서 물에서 용존 산소 농도는 대략 200 μM이고, 그리고 성장 배지가 실험에 앞서 질소로 일소되지 않으면, 대략 800 μM의 시스테인이 200 μM의 산소와 반응하여 400 μM의 시스틴이 산출될 것이다. 따라서 8mM의 시스테인을 갖는 성장 배지의 경우에, 대략 -223 mV의 초기 산화환원 전위가 관찰될 것이다. 하지만, 산소 없는 질소로 성장 배지 내에 산소의 완전한 탈기는 소화관 내강 산화환원 전위 (대략 -300mV)에 가까운 대략 -283mV의 산화환원 전위를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 적응된 미생물의 실례를 더욱 제공한다.
따라서, 본 발명의 다른 추가 양상은 본 발명의 방법에 의해 획득된, 획득가능한, 제조된, 생산된, 확인된 또는 선별된 미생물 (적응된 미생물), 예를 들면, 미생물 균주를 제공한다. 이런 균주는 프로바이오틱 미생물 또는 세균 균주일 수 있다. "프로바이오틱"은 본원에서 이용된 바와 같이, 소비될 때 건강상 이익을 제공하는 미생물을 지칭한다. 가령, United Nations의 Food and Agricultural Organization은 프로바이오틱스를 "적합한 양으로 투여될 때, 숙주에게 건강상 이익을 부여하는 살아있는 미생물"로서 규정한다. 이런 미생물 또는 균주는 단리된 균주 또는 순수 배양액일 수 있고 자연발생 미생물 또는 균주와 일치하지 않을 것인데, 그 이유는 이들이 본 발명의 적응 방법에 종속되었기 때문이다. 바람직한 미생물 또는 균주는 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii)이다.
가령, 본 발명의 적응 방법에 의해 획득된 적응된 균주의 실례는 본원에서 TCS1, OCS-1 및 OCS-2로서 표시된 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii) 균주이다. 이들 균주는 부다페스트 조약 하에, 2016년 10월 12일자로 DSMZ (Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에 기탁되었고, 그리고 각각, 수탁 번호 DSM 32380, DSM 32378 및 DSM 32379가 제공되었다.
가령, 본 발명의 방법에 의해 획득된 미생물 또는 균주 (가령, 기탁된 균주 중에서 하나 또는 그 이상)는 화합물 (작용제) 또는 조성물, 예를 들면, 제약학적 화합물 또는 조성물 또는 영양 화합물 또는 조성물의 형태를 취할 수 있다.
본 발명은 따라서, 다음을 포함하는 조성물 또는 제제 역시 제공한다:
(i) 본 발명의 방법에 의해 획득된, 획득가능한, 제조된, 생산된, 확인된 또는 선별된 미생물 또는 균주, 또는 본원에서 달리 규정된 바와 같은 본 발명의 미생물 또는 균주 (가령, 기탁된 균주 중에서 하나 또는 그 이상); 그리고
(ii) 담체, 희석제 또는 부형제 (가령, 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제), 식료품 또는 식품 보충제, 또는 다른 치료적 또는 영양적 작용제로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 추가 성분. 따라서, 상기 조성물은 제약학적 조성물로서 또는 영양적 조성물, 예를 들면, 식품 산물로서 조제될 수 있다.
본원에서 규정된 바와 같은 발명의 미생물, 균주, 조성물 및 제제 (가령, 기탁된 균주 중에서 하나 또는 그 이상)의 치료적 용도 역시 제공된다.
이들 미생물, 균주, 조성물, 제제 등의 적절한 투여 및 조제 방식은 질병 부위에 따라 선택된다. 바람직한 투여 방식은 경구 또는 직장이지만, 이와 동등하게 정맥내 또는 근육내 주사가 적절할 수 있다.
본원에서 규정된 바와 같은 발명의 미생물, 균주, 조성물 및 제제의 적절한 용량은 치료되는 장애, 투여 방식 및 관계된 제제에 따라 당업자에 의해 쉽게 선택되거나 또는 결정될 수 있다. 가령, 용량 및 투여 체제는 개체에 투여된 본 발명의 미생물, 균주, 조성물 또는 제제가 치료적 또는 건강상 이익을 유발할 수 있도록 선택된다. 가령, 104 내지 1012의 미생물, 예를 들면, 105 내지 1010, 또는 106 내지 108, 또는 108 내지 1010 전체 CFUs의 세균의 일일량이 이용될 수 있다.
따라서, 예로서 본 발명의 방법에 의해 획득되거나 또는 본원에서 달리 규정된, 산소에 더욱 내성인 혐기성 미생물을 내포하는 산물 또는 조성물 또는 제제 또는 키트가 제공된다. 유리하게는, 이런 산물은 증가된 저장 수명 또는 증가된 더욱 긴 보관 기간을 갖는다.
바람직한 산물 또는 조성물은 동결된, 동결-건조된, 동결건조된, 또는 건조된 세균을 포함하고 (실시예를 또한 참조한다), 그리고 바람직하게는 단위 용량 형식, 예를 들면, 캡슐 또는 정제 또는 겔이다. 이런 산물 등에서 이용을 위한 적절한 용량 (가령, 세균의 숫자 또는 CFUs의 형태에서)은 본원의 다른 곳에서 및 실시예에서 설명된다. 다른 성분, 예를 들면, 보존제 (가령, 글리세롤), 안정제, 겔화제 및/또는 냉동보호제 역시 이런 산물 등에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 이런 추가 성분은 비자연 작용제이다.
감소된 (또는 축소된) 농도, 수준, 또는 성장이 본원에서 지칭되는 경우에, 바람직하게는 이런 감소 또는 축소 (및 실제로, 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같은 다른 감소 또는 축소 또는 부정적인 효과)는 계측가능한 감소이다, 더욱 바람직하게는 이들은 적절한 대조 수준 또는 값과 비교할 때, 유의미한 감소, 바람직하게는 예로서 ≤0.05의 확률 값으로 통계학적으로 유의한 감소이다.
증가된 (또는 상승된) 농도, 수준, 전압, 내성 또는 성장 등, 예를 들면, 산화 스트레스, 산소 플럭스 (또는 확산 또는 농도), 또는 산소 내성에서 단계별 증가, 또는 증가가 본원에서 지칭되는 경우에, 바람직하게는 이런 증가 (및 실제로, 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같은 다른 증가 또는 긍정적인 효과)는 계측가능한 증가이다, 더욱 바람직하게는 이들은 적절한 대조 수준 또는 값과 비교할 때, 유의미한 증가, 바람직하게는 예로서 ≤0.05의 확률 값으로 통계학적으로 유의한 증가이다.
실제로, 유의미한 변화가 본원에서 설명되는 경우에, 이런 변화는 적절한 대조 수준 또는 값과 비교할 때, 예로서 ≤0.05의 확률 값으로 통계학적으로 유의한 변화인 것이 바람직하다.
다음은 본 발명의 일부 실시예인데, 이들은 본 발명이 어떻게 이용될 수 있는 지에 관한 실질적인 실례를 상세하게 보여주기 위한 것으로, 본원에서 발명의 이용을 한정하는 것으로 의미되지 않는다.
실시예
실시예 1
산화된 환경에 혐기성 미생물의 적응
페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii) 균주는 Coy 챔버에서 이용된 엄격한 혐기성 조건 (5% H2, 15%CO2 및 80% N2) 하에 미생물학적 순수 배양 기술에 의해 건강한 지원자의 대변으로부터 단리되고 FBT-22 (DSM 32186)로 명명되었다. (FBT-22는 부다페스트 조약 하에, 2015년 10월 20일자로 DSMZ (Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에 기탁되었고 수탁 번호 DSM 32186이 제공되었다). 단리에 이용된 일과적인 배양 배지는 다음 (g/L)을 내포한다; 효모 추출물: 2,5; 카시톤: 10; 글루코오스: 4,5; 염화나트륨: 0,9; 인산이칼슘: 0,45; 인산이수소칼륨: 0,45; 황산암모늄: 1,32; 중탄산나트륨: 4g; 시스테인: 1. 레자주린: 0,001; 헤민: 0,01. 비타민 혼합물은 다음을 내포한다: 10 μg 비오틴, 10 μg 코발라민, 30 μg p-아미노벤조산, 50 μg 엽산 및 150 μg 피리독사민. 배지에서 짧은 사슬 지방산 (SCFA)의 최종 농도는 33 mM 아세트산염, 9 mM 프로피온산염 및 각각 1 mM의 이소부티레이트, 이소발레르산염 및 발레르산염이었다. 모든 성분은 무균으로 첨가되었고, 반면 튜브는 CO2가 분출되었다. 열 불안정 비타민은 0,22μm 필터로 필터 살균되고, 그리고 0,05 μg 티아민 ml-1 및 0,05 μg 리보플라빈 ml-1의 최종 농도를 제공하기 위해 배지가 고압멸균된 후 첨가되었다. 배지의 최종 pH는 1N NaOH 또는 1N HCl을 이용하여 7,2±0,2로 조정되었다. 배지는 121℃에서 15 분 동안 100 kPa에서 고압멸균되었다. 시스테인이 성장 배지의 결장 산화환원 전위를 모의하는데 이용되고, 그리고 레자주린이 산화환원 지시약으로서 이용되었다. SHIRM 생물반응기를 위한 접종물은 단일 집락을 7ml의 배양 배지에 접종함으로써 제조되었다. 37℃에서 12h-16h의 배양 후, 배양액은 후기 지수 증식기 (OD600 ~0.7)에 도달하였다. 대략 0.5ml의 마스터 배양액의 2개 튜브가 -80℃에서 20% 글리세롤에서 보존되고 FFR로서 지정되었다. 이들 FFR 스톡은 FFR-M1.1 및 FFR-M1.2로서 지정된다. FFRM1.1은 해동 없이, 7ml의 배양 배지 내로 직접적으로 접종되었다. 접종물은 배양액이 후기 지수 증식기 (OD600 ~0.7)에 도달할 때 37℃의 배양에서 12h-16h 동안 혐기성으로 배양되었고, 2.5ml의 배양액이 250ml SHIRM 생물반응기에서 접종되었다. 이러한 마스터 배양액의 비율은 이중으로 보존되고 (앞서 언급된 바와 같이) FFR-M2.1 및 FFR-M2.2로서 지정되었다. 임의의 오염 또는 사고의 경우에, 실험은 상응하는 FFRM 배양액을 통해 소생될 수 있다. SHIRM 베드 배양 배지 (SBCM)의 조성물은 균주 FBT-22 (DSM 32186)의 최초 단리에 이용된 것과 동일하지만; 추후에 시스테인 농도가 감소되고 등가량의 시스틴으로 균형화되었다. 적용 전기 산화 전위는 퍼텐시오스타트를 통해 흑연 애노드 (8.5cm X 0.25cm X 2.5cm)에서 외부 전압을 통해 유지되었다. 셀 회로는 양성자 교환 막에 의해 분리된 한쪽 팔에 캐소드 챔버를 연결함으로써 완결되었다. 산소 플럭스는 상이한 산소 확산 상수를 갖는 가변적 중격을 통해 분리된 애노드 챔버에 산소 주입기를 연결함으로써 제어되었다. 즉각적인 산소 플럭스는 Clark의 유형 DO 프로브에 의해 계측되었다. 산소 플럭스는 산소 주입기를 순수한 산소에 의해 일소함으로써 제어되는데, 이것은 반투막을 통해 애노드 챔버 내로 확산한다. 상기 막에서 산소의 확산성 (DOm) 및 질량 전달 상수 (KOm)는 각각, 2,4x10-6 cm2/s 및 1,3x10-4cm/s이다. 추가적으로, 산소 플럭스는 도면 6에서 보여 지는 바와 같이, 산소 주입기의 베드 용적, 예를 들면, 250ml 또는 100ml를 변화시킴으로써 제어되었다. 산소 주입기는 또한, 도면 7에서 보여 지는 바와 같이, 애노드 챔버 내로 산소의 직접적인 확산을 허용하기 위해 제거될 수 있다. 중격 막의 한천 점액소 코팅은 애노드 챔버로 산소 확산을 더욱 제어한다. 한천 점액소는 다음의 성분 (g/L)을 용해시키고 고압멸균함으로써 제조되었다: 한천: 2; NaCl: 8; KCl: 0.2; Na2HPO4: 1,42; KH2PO4: 0.24; 점액소 유형 II: 5. 배지는 121℃에서 15 분 동안 100 kPa에서 고압멸균되었다. SHIRM은 SBCM을 내포하는데, 이것은 용존 산소를 제거하기 위해 15 분 동안 산소 없는 질소로 일소되었다. SHIRM 반응기에서 최종 세포 농도는 대략 OD600 ~0.005로 조정되었다.
이후, FFR-M2.1로 첫 번째 접종에 이용된 SBCM은 SBCM 8,0/ V0.1으로서 지정되었는데, 여기서 전자 숫자 ("8")은 시스테인 농도 (mM)를 지시하고, 후자 숫자 ("0")는 시스틴 농도 (mM)를 지시하고, 그리고 'V'는 Ag/AgCl와 대비하여 적용 전압을 지시한다. 모든 실험은 제로 산소 플럭스에서 시작할 것이고, 그리고 산소는 산소 주입기로부터 미리 규정된 일정한 비율에서 확산한다. SHIRM 생물반응기는 배양액이 +100mV의 산화 전위 하에 정지기에 도달할 때까지, 37℃에서 24 시간 동안 작동되었다.
첫 번째 배양 후 회수된 배양액은 "개체군 P1"로서 지정되었는데, 이것은 대략 5 세대이다. 이러한 배치로부터 동결된 스톡은 FFR-P1.1 및 FFR-P1.2로서 지칭되었다. 2.5ml의 FFR-P1.1이 SBCM 7,1/V0.2을 갖는 새로운 SHIRM 반응기에서 접종되었다. 재접종은 6차 계대배양 때까지 지속되어 FFR-P6이 산출되었고, 그리고 상응하는 FFR-P는 각 중간 계대배양에서 보관되었다. 이러한 시기에서, 시스테인 농도는 3mM로 감소되고 시스틴은 5mM로 증가되었고, 반면 산화 전위는 AgAgCl과 대비하여 600mV로 상승되었다. 이러한 시기에서, 모든 조건을 일정하게 유지하면서 27차 계대배양 때까지 반복된 접종이 수행되었고, 이때 모든 계대배양에서 신선한 배지가 이용되었다. 27차 계대배양 후, 접종은 도면 5에서 보여 지는 바와 같이 30차 계대배양까지 지속되었다.
실시예 2
산화 환경에 적응된 진화된 균주의 선별
실시예 1로부터 다양한 FFR-P가 산화 환경 및 산소에 적응된 균주를 선별하기 위해 분석되는데, 상기 균주는 추가 생산에 이용될 수 있다.
상기 분석은 비교 메타유전체학, 물질대사 특징화, 성장 동역학, 안정성 및 내성에 근거된다.
비교 물질대사 특징화는 지방산 프로파일링, 더욱 정확하게는 다양한 프리바이오틱스, 예를 들면, 이눌린 및 난소화성 전분에서 부티르산염 생산을 통해 수행된다.
바이오매스 수율 및 성장률을 비롯한 비교 성장 동역학은 담즙산염 및 프리바이오틱스가 있거나 또는 없는 정상적인 배양 배지에서 수행된다.
비교 안정성 및 내성은 효소 및 30 분 동안 주위 공기에 노출이 있거나 또는 없이, 모의된 위액/모의된 장액의 존재에서 수행된다.
모의된 위액 시험 용액 (TS)은 2.0 g의 염화나트륨 및 3.2 g의 정제된 펩신 (돼지 위 점막층으로부터 유래됨, 단백질의 mg당 800 내지 2500 단위의 활성)을 7.0 mL의 염화수소산 및 1000 mL까지 물에 용해시킴으로써 미국 약전 (USP) 지침에 따라 제조된다. 본 시험 용액은 약 1.2의 pH를 갖는다.
모의된 장액 시험 용액 (TS) USP는 6.8 g의 일염기성 인산칼륨을 250 mL의 물에 용해시키고, 그리고 이후, 77 mL의 0.2 N 수산화나트륨 및 500 mL의 물을 첨가함으로써 제조된다. 10.0 g의 판크레아틴이 첨가되고, 그리고 결과의 용액은 0.2 N 수산화나트륨 또는 0.2 N 염화수소산을 이용하여 6.8 ± 0.1의 pH로 조정되고 1000 mL로 최종적으로 희석된다.
5,5'-디티오-2-니트로벤조에이트의 미생물 연료 세포 및 플라빈-의존성 환원이 FFR-M 및 FFR-P 세포 개체군에서 시토크롬 발현을 사정하는데 이용되었고, 반면 디아포라아제 활성은 니트로 블루 테트라졸륨 염을 통해 시험되었다.
최고 적응된 균주는 선별된다.
실시예 3
산화된 환경에 혐기성 미생물의 적응의 추가 실례
배양의 단계 때까지 실시예 1의 모든 단계 이후에, 첫 번째 배양 후 회수된 배양액은 "개체군 P1"로서 지정되었는데, 이것은 대략 5 세대이다. 이러한 배치로부터 동결된 스톡은 FFR-P1.1 및 FFR-P1.2로서 지칭되었다. 2.5ml의 FFR-P1.1이 SBCM 7,1/V0.2를 갖는 새로운 SHIRM 반응기에서 접종되었다. 재접종은 6차 계대배양 때까지 지속되어 FFR-P6이 산출되었고, 그리고 상응하는 FFR-P는 각 중간 계대배양에서 보관되었다. 이러한 시기에서, 시스테인 농도는 3mM로 감소되었고 시스틴은 5mM로 증가되었고, 반면 산화 전위는 AgAgCl과 대비하여 600mV로 상승되었다.
하지만, 실시예 1과 비교하여 실시예 3에서, 이러한 시기에서, 모든 조건을 일정하게 유지하면서 총 10차 계대배양 때까지 반복된 접종이 수행되었는데, 이때 모든 계대배양에서 신선한 배지가 도면 8에서 도시된 바와 같이 이용되었다.
실시예 4
실시예 3으로부터 진화된 균주의 선별
실시예 3으로부터 다양한 FFR-P가 산화 환경 및 산소에 적응된 균주를 선별하기 위해 분석되는데, 상기 균주는 추가 생산에 이용될 수 있다.
적응된 균주 선별은 다음의 단계에 근거된다:
a. 도면 8에서 도시된 모든 단계에서 100μl의 분취량이 수집되었다.
b. '단계 a'로부터 표본은 도면 9에서 보여 지는 바와 같이 공기 포화된 인산염 완충액 식염수 (PBS)에서 계열 희석되고 (103까지) 주위 온도에서 밀폐 바이알에서 배양되었다.
c. 바이알은 혐기성 챔버로 이송되고 50μl 분취량이 YCFAG 배지 (표 4)에서 접종되었다.
d. 평판은 24-72h 동안 혐기성으로 배양되었다.
e. 배양 후, 생균수가 시각적으로 사정되었다.
f. 집락 형태형에 근거하여, 훈련 후 발생된 임의의 변이체는 선택되고 고전적인 순수 배양 기술을 통해 정제되었다.
g. 적응된 균주는 그람 염색을 통해 순도에 대해 점검되었다.
h. 단계-f에서 선택된 5개 적응된 균주는 TCS1, LTCS, STCS, OCS-1 및 OCS-2로서 지정되었다.
i. 개별 단리 조건 및 단계를 비롯하여, 단리된 적응된 균주에 관한 완전한 상세는 표 2에서 제시된다.
j. 적응된 균주의 예비적 확인은 그람 염색, 물질대사 표현형분석 (짧은 사슬 지방산 프로필) 및 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii) 특이적 프라이머를 이용한 정량적 PCR (qPCR)에 근거되었다.
k. 균주 확인은 16SrDNA 염기서열결정을 통해 확증되었다.
l. 적응된 균주의 산소 내성 안정성은 도면 10에서 제시된 바와 같이 사정되었다. 개별 적응된 균주는 12h-14h 동안 YCFAG 배지에서 혐기성으로 배양되고 101, 102, 103, 104 및/또는 105 계열 희석되었다. 100μl 또는 50μl의 계열 희석된 배양액은 YCFAG 배지 평판에서 이중으로 접종되었다. 평판의 한 세트는 혐기성 조건 하에 배양되고 대조로서 역할을 하고, 반면 다른 세트는 20 분 동안 호기성으로 배양되었다. 주위 공기에 20 분 노출 동안, 산소는 한천 평판 내로 완전하게 확산하여 이의 컬러를 핑크색으로 변화시킨다. 환원된 상태에서 무색인 산화환원 지시약 염료 레자주린은 산화 후 핑크색이 된다. 이것은 배양 평판 배지 내로 완전한 산소 확산을 담보한다. 도면 10에서 묘사된 바와 같이 개별 처리에 노출 후, 시험 평판 및 대조 평판은 48h-72h 동안 혐기성 조건 하에 배양되었고, 그리고 생균수가 시각적으로 사정되었다.
m. 16SrDNA 염기서열결정을 통한 균주 확증 후, 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii)의 적응된 균주 TCS1, OCS-1 및 OCS-2가 그들의 산소 내성에 근거하여 선별되었고, 그리고 부다페스트 조약 하에, DSMZ (Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에서 기탁되었고, 그리고 각각, 수탁 번호 DSM 32380, DSM 32378 및 DSM 32379가 제공되었다.
n. 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii) 표준 균주, 부모 균주 및 적응된 균주의 산소 내성은 표 3에서 묘사된다.
표 2: 상이한 주기에서 단리된 적응된 균주
| 균주 코드 | 전체 명칭 | 단리 조건 | |
| 1 | TCS1 | Translucent colonies smooth | 3,5/v0,6 (1:100)의 6차 주기 |
| 2 | LTCS | Large translucent colonies smooth | 3,5/v0,6 (1:1000)의 10차 주기 |
| 3 | STCS | Small translucent colonies smooth | 3,5/v0,6 (1:1000)의 10차 주기 |
| 4 | OCS-1 | Opaque colonies smooth | 3,5/v0,6 (1:10)의 10차 주기 |
| 5 | OCS-2 | Opaque colonies smooth | 3,5/v0,6 (1:10)의 10차 주기 |
표 3: 공기에 노출 후 적응된 균주의 안정성 프로필
표 4: 페칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii)를 위한 YCFAG 배지
| g/L | ||
| 카시톤 | 10 | |
| 효모 추출물 | 2,5 | |
| NaCl | 0,9 | |
| K2HPO4 | 0,45 | |
| KH2PO4 | 0,45 | |
| NaHCO3 | 4 | |
| CaCl2.2H2O | 0,12 | 함께 고압멸균 |
| MgSO4.7H2O | 0,09 | |
| 글루코오스 | 4,5 | |
| 아세트산나트륨 | 2,7 | |
| 시스테인 | 1 | |
| 황산암모늄 | 1,32 | |
| 레자주린 | 0,001 | |
| 헤민 | 0,01 | |
| 비타민 | ||
| μg/L | 고압멸균 후 추가 | |
| 비오틴 (B7) | 10 | 필터 살균 |
| 코발라민 (B12) | 10 | |
| PABA | 30 | |
| 엽산 | 50 | |
| 피리독사민 | 150 | |
| 리보플라빈 (B2) | 50 | |
| 티아민 (B1) | 50 | |
| SCFA | ||
| mM | 고압멸균 후 추가 | |
| 프로피온산염 | 9 | 필터 살균 |
| 이소부티레이트 | 1 | |
| 이소발레르산염 | 2 | |
| 발레르산염 | 3 | |
| 최종 pH를 대략 7,2로 조정한다 | ||
실시예 5
진화된 균주의 유전자 특징화
실시예 1에서 모든 계대배양 동안 산출된 진화된 균주는 차세대 염기서열결정 (NGS)에 의해 특징된다. FFR-M 및 모든 FFR-P 배양액은 진화된/적응된 FFR-P 자손에서 촉발된 임의의 가능한 돌연변이에 대한 면밀한 유전체 분석을 위해 NGS에 종속된다. FFR-M 및 FFR-P 균주 사이의 차이는 또한, RNA-seq를 통해 전사체학 수준에서 연구된다.
실시예 6
혐기성 미생물의 증강된 생산
생산 셋업은 실시예 1로부터 획득된 최적화된 조건을 수반할 것이다. 실시예 2로부터 미생물의 배양 셋업은 실시예 1에서와 동일할 것이지만, 전압, 시스테인/시스틴 커플 및 산소 플럭스를 포함하는 고정된 산화 조건에서 단지 하나의 단계만을 수반할 것이다.
최적화된 발효 조건은 다음과 같다; 산소 1,3x10-4cm/s의 질량 전달 계수 (KOm) 및 대략 0,2nmoles ml-1min-1의 애노드 챔버 내로 산소 확산율, AgAgCL과 대비하여 적용 전압 0,6V, 시스테인 3mM, 시스틴 5mM 및 대략 -188mV의 성장 배지 SBCM의 초기 산화환원 전위를 갖는 막 중격.
발효 단계는 삼중 챔버 형상에서, 불소중합체 기초된 플라스틱 물질로 만들어진 150-리터 전기적으로 절연된 용기에서 실행된다 (도면 4c). 이것은 상기 실시예 2에서와 같은 제조물을 이용하여 접종된다.
발효로부터 세포 슬러리는 Alfa Laval로부터 연속적 원심분리기에서 분리되고, 그리고 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 표준 냉동보호제와 혼합된다. 동결건조 과정에서 임의의 어는점 감소를 방지하기 위해 세척 단계가 수행된다.
동결건조 장소에서, 세포 슬러리는 동결건조기 내에 각 평판에 부어 넣어진다. 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii)의 세포 슬러리는 18 %의 건물 함량을 갖고 4 내지 5 일 동안 동결건조된다.
만약 그렇지 않으면, 미생물의 발효 및 동결건조는 당해 분야에서 공지된 바와 같이 행위된다.
Claims (19)
- 혐기성 미생물의 적응 및 산소에 더욱 내성인 혐기성 미생물의 선별을 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 적용 전압 및 산소 확산을 통한 산화 스트레스의 단계별 이중 유도, 그리고 산화환원 상태를 조정하기 위한 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 단계별 변화와 함께 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 항산화제/산화된 대응물은 시스테인/시스틴, 글루타티온/글루타티온-산화된 상태, 아스코르빈산/디히드로아스코르브산염, 디티오트레이톨/산화된 디티오트레이톨, 그리고 갈산/산화된 갈산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 방법은 산화된 대응물의 농도에서 단계별 증가, 적용 전압에서 단계별 증가 및 산소 플럭스에서 단계별 증가와 합동된 항산화제의 농도에서 단계별 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 대한 시작 조건은 낮은 또는 제로 산소 플럭스, 낮은 적용 전압, 높은 농도의 항산화제 및 낮은 농도 또는 제로 농도의 산화된 대응물, 그리고 산소가 제거된 배양 배지 중에서 하나 또는 그 이상, 또는 모두에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 시작 조건은 8mM 시스테인, 0mM 시스틴, 0.1V의 적용 전압, 그리고 제로 또는 낮은 산소 플럭스 중에서 하나 또는 그 이상, 또는 모두에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 단계별 변화는 3mM의 최소 시스테인 농도, 5mM의 최대 시스틴 농도, 0.6 V의 최대 적용 전압, 그리고 높은 산소 플럭스 중에서 하나 또는 그 이상, 또는 모두일 때까지 지속되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 적용 전압은 0.6 V를 초과하지 않고, 및/또는 시스테인 농도는 3mM보다 낮지 않고, 및/또는 시스틴 농도는 5mM보다 높지 않고, 및/또는 배양 배지에서 용존 산소 농도는 준치사 농도에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 7 중에서 어느 한 항에 있어서, 일단 단계별 변화가 완결되면, 상기 방법은 단계별 변화 후 도달된 적용 전압, 산소 확산 및 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 최종 조건 하에 상기 미생물을 배양하는 하나 또는 그 이상의 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 8에 있어서, 추가 단계별 변화가 실행되는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 9 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법 또는 추가 단계는 새로운 배양 배지 내로 혐기성 미생물의 재접종을 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 재접종은 배양 조건에서 상기 단계별 변화를 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 미생물은 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 12 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추가 단계를 수반하고, 여기서 유지된 물질대사 특징을 갖는 최고 적응된 균주를 선별하기 위해, 적응된 균주가 산소 내성, 부티르산염 생산 및 성장 동역학의 사정에 대해 선별검사되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 혐기성 미생물의 증강된 생산을 위한 방법에 있어서, 이들 미생물은 일정한 산화 전위/적용 전압, 산소 확산 및 항산화제/산화된 대응물 농도 비율의 조합과 함께 배양되고, 따라서 도태 압력을 실시가능하게 하고 일정한 미생물 균주의 높은 수율을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 배양 조건은 3mM 시스테인, 5mM 시스틴, 0.6 V의 적용 전압 및 0.2nmolesml-1min-1의 산소 플럭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 14 또는 청구항 15에 있어서, 상기 미생물은 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 13 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 획득된 미생물 균주.
- 청구항 17에 있어서, 상기 미생물은 DSM 32380, DSM 32378 및 DSM 32379로 구성된 군에서 선택되는 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii) 균주인 것을 특징으로 하는 미생물 균주.
- DSM 32380, DSM 32378 및 DSM 32379으로 구성된 군에서 선택되는 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii) 균주.
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