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KR20180071665A - 심장줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법 - Google Patents

심장줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20180071665A
KR20180071665A KR1020160174541A KR20160174541A KR20180071665A KR 20180071665 A KR20180071665 A KR 20180071665A KR 1020160174541 A KR1020160174541 A KR 1020160174541A KR 20160174541 A KR20160174541 A KR 20160174541A KR 20180071665 A KR20180071665 A KR 20180071665A
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South Korea
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hydrogel
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cell sheet
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박기동
이원진
최민영
박경민
이윤기
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인제대학교 산학협력단
아주대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 심장줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 심장줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 본 발명의 다층 세포 시트는 제조하는데 특수한 기구가 필요하지 않으며, 물리적 특성이 좋아 다루기도 쉬우며, 세포 사이에 각종 성장 및 보호 인자 와 세포외 기질이 충분히 축적되어 이식 후 세포의 생존율을 높이며, 세포에 의해 유발된 수축에 의해 두께 또한 얇아 영양분 이동 또한 용이하다. 따라서, 상기 심장줄기세포의 다층세포시트는 심근 재생용 치료제로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

심장줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법{Multilayer cell sheet of cardiac stem cells and method for preparing the same}
본 발명은 성인 심근 조직 유래 내재성 심장줄기세포(cardiac stem cells; CSCs)의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 성인 심근 유래 내재성 심장줄기세포를 하이드로젤 내 함입시켜 다층으로 3차원 배양하여 제조된 다층세포시트는 손상된 심근조직을 재생시킬 수 있는 심근재생용 치료제로 적용 가능하다.
허혈성 심장질환 혹은 일차성(특발성) 및 이차성 심근질환은 심근세포의 손상, 사멸과 소실에 따라 심근기능 저하에 따른 울혈성 심부전이 동반된다. 성인의 경우 소실된 심근세포는 다시 재생되지 않아 심근조직은 섬유아세포와 반흔으로 대체되어 심근기능이 소실되므로, 심근세포의 재생만이 유일한 치료법으로 제시되었다. 이러한 손상된 심근조직을 재생하기 위하여 보다 범위를 넓게, 세포치료제 혹은 줄기세포치료제 및 줄기세포치료기술-조직 공학적 제품을 포함한 치료방법이 대두되고 있다.
손상된 심장 내로 이식된 줄기세포치료제는 2가지 작용기전을 통하여 심근재생을 유도하는 것으로 제시되었다. 첫 번째 작용기전은 이식된 줄기세포가 심근을 구성하는 세포(심근세포, 혈관내피세포, 혈관평활근세포)로 직접 분화하여 심근재생을 유도하는 기전이 제시되었다. 두 번째 작용기전은 줄기세포가 심근재생을 유도할 수 있는 생리활성인자, 즉 염증반응을 완화하는 항염증성 cytokines/인자의 분비, 심근세포를 보호하는 cytokines/인자의 분비, 신생혈관생성을 유도할 수 있는 cytokines/인자를 분비를 통하여 심근재생을 유도하는 즉, 간접적 paracrine 기전이 제시되었다. 조혈모세포(hematopoietic stem cells, HSCs), 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cells, EPCs) 혹은 지방 유래 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 두 번째 작용기전을 통하여 심근재생을 유도하나, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포와 더불어 성체줄기세포 중 유일하게 CSCs는 타 줄기세포와는 달리 이 두 가지 심근재생 작용기전을 가진 유일한 성체줄기세포로 인정되고 있어, 심근재생용 세포치료제로 요구되는 요건을 모두 갖춘 이상적 세포치료제로 인정되고 있다.
줄기세포치료제의 임상적 결과를 극대화하기 위하여 이식 효율을 높이고자 다양한 경로의 이식방법이 시도되고 있다. 현재 심장 내로 줄기세포치료제를 전달 및 이식하는 방법으로는 (1) 정맥 내 주사(intravenous infusion) 경로를 통한 전신투여, (2) 관상동맥 내 주사(transcoronary infusion) 경로를 통한 심근 내로 전달, (3) 심근 내 주사(intramyocardial injection), (4) 심장외막으로 이식 (epicardial implantation)이 제시되고 있다. 종래의 줄기세포치료제를 말초정맥 혹은 관상동맥으로 주사하는 방법과 심근 내 주입하는 방법의 경우, 투여한 세포의 1% 미만이 심장으로 전달되고 생존하여, 심장으로의 전달율(delivery rate), 정체율(retention rate), 생착률(engraftment rate)이 저조한 문제점이 있다. 이를 극복하기 위해서, 줄기세포치료제를 지지체(scaffold) 내로 파종한 후 심장외막에 이식하는 경로가 제시되었다. 이 경우 손상 심근 내의 과도한 염증반응과 유리 라디칼로부터 세포를 보호할 수 있으며, anoikis 현상으로 인한 세포죽음을 최소화 할 수 있다. 심장외막으로 지지체를 통하여 국소적으로 이식된 줄기세포치료제는 생리활성인자를 분비하여 심근재생을 유도하는 것으로 알려져 있다.
줄기세포치료제는 심장 내로 전달효율이 높아야 되며, 전달된 줄기세포치료제는 손상된 심근 내 오랜 기간 머물고 정체 및 잔존(retention)되어야 된다. 또한 심장 내로 전달된 세포는 열악한 손상부위에서 생존(engraftment)하여야만 세포치료제로서의 치료효과를 이룰 수 있다. 세포치료제의 심근재생 효능을 증대하기 위하여 첫째 심근 내로의 전달율을 향진하는 기술, 둘째 전달된 세포가 손상부위로 이주율 및 정체율(retention rate)을 증대시키는 기술, 셋째 손상된 심근 내로 이주 및 정체된 세포의 생존율(engraftment rate)을 증대시키는 기술이 요구된다. 이러한 조건을 충족하기 위하여 지지체 혹은 조직공학적 기법으로 제조한 이식체를 통하여 심장외막으로 국소 전달하는 연구가 시도되고 있다. 심장외막으로 줄기세포치료제의 이식은 지지체 내 함입시킨 후 이식하는 기술과 세포시트로 제조하는 방법이 현재 가장 널리 적용되고 있는 방법이다.
종래에는 줄기세포치료제의 심장으로 국소전달을 위한 운반체로서 지지체가 가장 널리 사용하고 있다. 지지체는 세포의 생존과 기능유지에 필수적인 세포외기질을 제공할 수 있어 세포치료제 전달 시 생존율을 높일 수 있다. 또한 지지체는 심근 내 혹은 심근외막으로 물리적으로 고정시킬 수 있어 심장으로의 전달율과 정체율을 높일 수 있다는 장점이 있다. 지지체는 생체 내에서 분해되는 생분해 특성을 지닌 천연고분자 혹은 합성고분자를 하이드로젤 유형과 다공성 스펀지 유형으로 제조되어 사용되고 있다. 하이드로젤은 다공성 스펀지 유형의 지지체와 비교하여 원하는 모양과 크기로의 제조가 용이하며, 고밀도로 세포를 탑재하여 전달할 수 있는 장점이 있다. 반면 물리적 강도가 취약하여 심장외막으로는 고정하기 어려워, 줄기세포치료제와 혼합한 후 심근 내로 주입 시 가장 널리 사용되는 지지체이다. 반면 다공성 스폰지 유형의 지지체는 다양한 크기와 모양으로 가공이 어려우나 물리적 강도 조절이 용이하여 줄기세포치료제를 심장외막으로 이식 시 운반체로 적용되고 있다. 그러나 다공성 스펀지 유형의 지지체는 고밀도의 세포를 전달하기 어렵고, 물리적 특성 강화를 위하여 가교반응에 따른 이물반응과 염증반응을 유발하는 단점이 제시되었다.
지지체를 통한 줄기세포치료제의 전달이 갖는 문제점을 극복하기 위하여 줄기세포치료제를 세포시트 형태로 제조하여 심장외막으로 전달하는 기술이 제시되었다. 종래, 다층세포시트를 제작하기 위해서는, 먼저 단층세포시트를 제작한 후 피펫, 지지막, 특수조작기 등을 이용하여 회수한 단층세포시트를 여러 겹으로 쌓아 다층세포시트를 제조하는 방법이 제시되었다. 단층세포시트를 층을 쌓는 방법은 5층 이상 제작 시 세포시트 내부로 산소 및 영양분 공급이 제한되어 세포손상이 발생하는 문제점이 대두되었으며, 그 결과 5층 미만의 다층세포시트만 생물학적 유효성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 단층세포시트의 중첩과정은 3층의 세포시트를 4번 5일 간격으로 층을 쌓는 방법으로 부착하여 만들 수 있지만, 총 제작시간은 20일 이상 소요되며, 세포시트 내 구성 세포의 생물학적 특성이 변화될 가능성도 있을 수 있고, 생체 내로 이식한 3층의 세포시트 내 혈관생성을 유도 후 반복적인 이식을 통해야만 다층세포시트의 치료효과를 얻을 수 있다. 즉, 현재까지 알려진 기술로 두꺼운 세포시트를 제작할 경우 많은 시간과 특수 배양용기 및 조작기가 필요하며, 각 과정 동안 섬세하게 조작하지 않을 경우 세포시트에 손상이 있을 수 있으며, 세포시트의 탈부착 및 이동 과정에서 오염기회 가능성이 단일 배양 과정 보다 많아서 안전성 문제가 제기될 수 있다.
Cell Transplant. 2014; 23(10):1305-19
본 발명은 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 심장줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 심장줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 항염증인자, 심근세포보호인자, 심근재생인자 및 신생혈관유도인자를 포함하는 심장줄기세포의 다층세포시트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 상기 심장줄기세포의 다층세포시트 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 심장질환 치료용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (1) 심장줄기세포(cardiac stem cells; CSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 심장줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 심장줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 항염증인자, 심근세포보호인자, 심근재생인자 및 신생혈관유도인자를 포함하는 심장줄기세포의 다층세포시트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 심장줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 심장질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 심장줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 심장줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 종래의 다층세포시트 제조 시 물리적 취약성으로 인하여 시트가 손상되는 문제 및 오염 위험성을 방지하며, 다단계 배양공정을 단일 배양공정으로 제조하는 방법을 통하여 제작시간을 단축할 수 있는 심장줄기세포 다층세포시트를 제조할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 한다. 더불어 심장줄기세포 다층세포시트는 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간의 결합을 통한 물리적 특성을 강화할 수 있으며, 세포배양 과정 중 심장줄기세포에서 생성, 분비 된 생리활성인자 및 세포외기질을 다층세포시트 내 축적시켜 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화할 수 있다.
도 1은 하이드로젤 지지 3차원 심근배양을 통하여 CSCs의 분리 배양을 나타낸다.
도 2는 심근으로부터 하이드로젤 내로 이동 성장한 CSCs을 분리한 후 2차원 배양을 나타낸다.
도 3은 CSCs의 자기재생능력을 나타낸다.
도 4는 CSCs의 체외성장능력을 나타낸다.
도 5는 CSCs의 면역표현 특성을 나타낸다.
도 6은 CSCs의 섬유소용해 활성도와 섬유소용해 억제제(Plasminogen activator inhibitor, PAI)의 CSCs 섬유소용해 활성도를 제어하는 효과를 나타낸다.
도 7은 피브린 하이드로젤의 조성과 PAI 도입여부에 따른 CSCs의 섬유소용해 활성도와 세포질 확산에 관한 결과이다.
도 8은 섬유소용해 억제제(PAI)의 투여 방법에 따른 3차원 피브린 하이드로젤 내 CSCs 세포질 확산 및 세포 간 접합에 미치는 영향을 나타낸다.
도 9는 하이드로젤 내 함입된 CSCs 밀도 및 섬유소용해 억제제(PAI) 도입여부에 따른 CSCs-매개 하이드로젤 수축에 대한 결과이다.
도 10은 부착배양환경에서 CSCs-매개 수축에 대한 collagen, fibrin, GTP 하이드로젤의 저항성에 대한 결과이다.
도 11은 부유배양환경에서 CSCs-매개 GPT 및 피브린 하이드로젤 수축을 나타낸다.
도 12는 부유배양 기간에 따른 CSCs-매개 피브린 하이드로젤 수축을 나타낸다.
도 13은 부유배양 기간에 따른 피브린 하이드로젤 내 CSCs 세포죽음과 caspase 3/7 활성도에 대한 결과이다.
도 14는 단층배양법으로 성장시킨 CSCs와 3차원적으로 배양한 하이드로젤 내의 CSCs의 항염증인자, 심근세포보호인자, 심근재생유도인자 및 신생혈관유도인자의 발현을 비교한 결과이다.
도 15는 배양환경(부착배양환경 및 부유배양환경)에 따른 CSCs 생리활성인자 mRNAs 발현에 대한 결과이다.
도 16은 부유배양 시간에 따른 CSCs 다층세포시트 내 섬유소의 응축과 수분 방출을 나타낸다.
도 17은 하이드로젤 내 함입되는 CSCs의 세포 수에 따라 다층세포시트 내 중첩되는 세포층을 나타낸다.
도 18은 CSCs 다층세포시트 내 세포 간 결합(beta-catenin) 및 세포와 ECM과의 결합(integrin-beta1)을 나타낸다.
도 19는 CSCs 다층세포시트 내 부착배양 기간에 따른 세포 간 접합(connexin 43)과 세포외기질(collagen type 4, laminin, fibronectin) 축적이 증가되는 것을 나타낸다.
도 20은 다층세포시트를 구성하는 CSCs의 면역표현형을 나타낸다.
도 21은 CSCs 다층세포시트의 신생혈관유도인자의 분비능력을 나타낸다.
도 22는 심근외막으로 이식한 CSCs 다층세포시트의 생착율과 손상 심근부위로 CSCs가 이주하는 능력을 나타낸다.
도 23은 심장 외막에 이식된 CSCs 다층세포시트 내로 미세혈관들의 성장되어 생착되는 것을 나타낸다.
도 24는 CSCs 다층세포시트의 심근경색모델에서 심근재생, 심근보호, 항섬유 효과에 대한 결과이다.
도 25는 CSCs 다층세포시트의 심근경색모델에서 신생혈관생성을 증진시키는 효과에 대한 결과이다.
도 26은 심장 외막에 위치한 다층세포시트 내 CSCs의 분화특성에 대한 결과이다.
도 27은 다층세포시트에서 심근 내로 이주한 CSCs의 심근세포 및 혈관평활근세포로 분화하는 능력을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 현재까지 알려진 방법으로 두꺼운 다층세포시트 제작 시 요구되는 시간과 복잡한 과정을 개선하고, 오염 등 여러 위험성을 방지하고자 하였다. 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 심장줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 종래의 다층세포시트 제조 시 물리적 취약성으로 인하여 시트가 손상되는 문제 및 오염 위험성을 방지하며, 다단계 배양공정을 단일 배양공정으로 제조하는 방법을 통하여 제작시간을 단축할 수 있는 심장줄기세포 다층세포시트를 제조할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 한다. 더불어 심장줄기세포 다층세포시트는 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간의 결합을 통한 구조적 안정성을 강화할 수 있으며, 세포배양 과정 중 심장줄기세포에서 생성, 분비된 생리활성인자 및 세포외기질을 다층세포시트 내 축적시켜 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화할 수 있다. 심장외막으로의 전달을 통하여 줄기세포치료제의 전달율, 잔존율, 그리고 생착율 증대를 통하여 심근재생을 증진시킬 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (1) 심장줄기세포(cardiac stem cells; CSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 심장줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 심장줄기세포는 심근 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계는 배양된 심장줄기세포를 용액 상태의 하이드로젤에 혼합한 후, 젤 상태로 전환시켜 심장줄기세포를 하이드로젤 내에 3차원적으로 균일하게 분포시킬 수 있다. 바람직하게는 30초에서 4분 내로 용액 상태에서 젤 상태로 하이드로젤의 상전환을 조절할 수 있다.
바람직하게는, 상기 하이드로젤은 천연 혹은 합성 고분자로 제조할 수 있으며, fibrin, collagen, gelatin, chitosan, PLLA, PEG, peptide 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 3차원 하이드로젤 내 고분자 함량은 0.1% ~ 5%로 구성되나, 바람직하게는 0.5% 미만의 고분자로 구성될 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤일 수 있으며, 상기 피브린 하이드로젤은 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐, 최종 농도 0.2 U/ml 내지 2 U/ml의 트롬빈 및 최종 농도 10 ㎍/ml 내지 500 ㎍/ml 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)을 함유할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 항섬유소용해제는 트란제믹산(tranexamic acid), 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid), 아미노카프로익산(aminocaproic acid) 또는 아프로티닌(aprotinin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계의 배양된 심장줄기세포는 트롬빈 용액에 첨가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계의 배양된 심장줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 심장줄기세포의 다층세포시트 내 세포 세포층을 조절하기 위하여 용액 상의 하이드로젤 내 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml 밀도의 세포를 혼합하여 특정한 모양의 틀(mold/몰드)에 10 μl/mm2 내지 500 μl/mm2 용량을 전달한 후 37℃에서 2시간 동안 중합/가교과정을 거쳐 젤(gel)로 상전이 시켜 3차원적으로 균일하게 세포가 분포하도록 하며, 바람직하게는 2.5 × 106/ml 내지 1 × 107/ml 세포 밀도로 100 μl/mm2 내지 300 μl/mm2 용량을 전달하여 심장줄기세포의 다층세포시트를 제조할 수 있다. 세포밀도 및 용량의 조절을 통하여 10층 내지 50층으로 구성된 다층세포시트를 제조할 수 있다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건은 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤을 원형, 직사각형, 혹은 정사각형 형태의 몰드 내로 캐스팅(casting)하여 물리적으로 지지되는 조건에서 배양할 수 있다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 부착배양조건은 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간 접합을 유도할 수 있다. 상기 부착배양조건에서 1일 내지 5일간 배양을 통하여 하이드로젤 내 함입된 세포가 하이드로젤 섬유상 체인(fibrillary chain)에 부착하고, 세포질의 확장, 이동 및 세포간 접합을 유도하여 구조적 안정성을 강화하는 방법이다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 심장줄기세포에서 생성되어 분비되는 세포외기질 (extracellular matrix, ECM), 항염증인자, 심근세포보호인자, 심근재생인자 및 신생혈관유도인자를 하이드로젤 내로 축적할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 세포외기질은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 콜라겐 타입 IV(collagen type IV)로 이루어질 수 있으며, 상기 항염증인자는 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10 또는 형질전환 성장인자(transforming growth factor-β; TGF-β) 일 수 있고, 상기 심근세포보호인자는 IL-6, IL-11, 카디오트로핀-1(cardiotrophin-1), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1 또는 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF)일 수 있으며, 상기 심근재생인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP) 또는 Sox-17 일 수 있고, 상기 신생혈관유도인자는 안지오포이에틴(angiopoietin) 계열, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF) 계열, 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF) 계열 또는 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (4) 단계의 부유배양조건은 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여, 하이드로젤 내 수분을 방출시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 심장줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 심장줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 항염증인자, 심근세포보호인자, 심근재생인자 및 신생혈관유도인자를 포함하는 심장줄기세포의 다층세포시트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤일 수 있으며, 상기 피브린 하이드로젤은 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐, 최종 농도 0.2 U/ml 내지 2 U/ml의 트롬빈 및 최종 농도 10 ㎍/ml 내지 500 ㎍/ml 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)을 함유할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 항섬유소용해제는 트란제믹산(tranexamic acid), 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid), 아미노카프로익산(aminocaproic acid) 또는 아프로티닌(aprotinin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 심장줄기세포의 다층세포시트 내 하이드로젤은 생체 내 염증반응 및 이물반응을 유발하지 않으며, 생체 내 3일 내지 3주 이내에 완전히 분해되는 생분해 특성을 지닌다.
바람직하게는, 상기 심장줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 심장줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 심장줄기세포의 다층세포시트는 세포막이 온전히 유지된 상태이며, 하이드로젤 고분자 및 세포외기질 지지를 통하여 안정적 구조적 특성을 지녀, 손상 심근 부위의 과도한 산화 자유 라디칼 매개 손상과 염증반응 매개체로부터 이식한 심장줄기세포의 생존율을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 심장줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 심장질환 치료용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 심장 손상 후 유발되는 심근의 섬유화(fibrosis) 정도를 감소시키고, 혈관생성 및 심근재생을 향상시키며, 심근 두께를 증가시켜, 심장수축기능을 향진시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 심장질환은 허혈성 심장질환, 일차성(특발성) 심근질환 또는 이차성 심근질환일 수 있으며, 상기 일차성(특발성) 심근질환은 확장형 심근병증(dilated cardiomyopathy; DCM), 비후형 심근병증(hypertrophic cardiomyopathy; HCM) 또는 제한성 심근병증(restrictive cardiomyopathy)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 심장줄기세포의 다층세포시트는 손상된 심장의 심근외막으로 전달되어, 안정적으로 심장 내 전달율, 잔존율, 생존율을 높이는 방법을 제공하며, 심장줄기세포 다층세포시트로부터 분비되는 심근재생/보호인자, 신생혈관유도인자, 항염증인자를 손상 심근 부위로 전달하여 심근재생/보호를 증진시키고 심장의 기능을 회복시키는 세포치료법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 성인 심근으로부터 CSCs 분리 및 배양
인제대학교 의과대학 윤리위원회 승인 후 성인 심근로부터 심장줄기세포(cardiac stem cells, CSCs)를 분리하고자 하였다. CSCs 분리는 KR 10-1389850에 제시된 방법을 이용하였다. 뇌사자로부터 공여받은 심근은 주변 심장외막과 심장내막을 제거한 후 1 mm3 크기의 절편으로 절단한 후 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 용액으로 5번 세척하였다. 트롬빈(Sigma-Aldrich, 서울, 대한민국)을 Dulbeco’s Modified Eagles Media(DMEM, Invitrogen, 서울, 대한민국)에 녹여 1 unit/ml 트롬빈 용액을 제조하였다. 인간 혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 DMEM에 녹여 0.25% 피브리노겐 용액을 제조하였다. 절단된 심근은 0.25% 트롬빈 용액에 분산시킨 후 동량의 0.25% 피브리노겐 용액과 혼합하고, 혼합액 10 mL을 100-mm 배양용기로 옮긴 후 겔이 형성되도록 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응하였다. 피브린 하이드로젤이 형성된 후 10 ml 세포배양액을 첨가하였다. 세포배양액은 90% DMEM (웰진, 경산시, 대한민국), 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, 서울, 대한민국), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 2 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 10 ng/ml insulin-like growth factor (IGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 10 μg/ml 젠타마이신(gentamicin, Invitrogen) 조성으로 제조하였다. 이후 배양접시는 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에서 30 rpm 속도로 교반 하면서 2주간 배양하였다. 신선한 세포배양액은 2일마다 교체하였다. 심근 절편에서 피브린 하이드로젤 내로 이동 성장한 CSCs는 10,000 unit 유로카나제(Urokinase, 녹십자)을 사용하여 피브린 하이드로젤을 분해한 후 유리되는 세포를 회수하였다. 회수된 CSCs는 통상적인 단층배양법으로 증폭 배양하였다. 세포가 80% 이상의 밀집도 상태에서 0.05% 트립신/EDTA (시그마알드리치, 서울, 대한민국)를 사용하여 세포를 배양용기로부터 떼어낸 후 계대 배양하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 피브린 하이드로젤 지지 3차원 장기 배양법을 통하여 심근으로부터 세포의 이동, 성장을 유도할 수 있었다. 심근으로부터 CSCs의 이동, 성장을 유도할 수 있으며 3차원적으로 함입한 이후 24시간 이내에 CSCs의 이동을 관찰하였다. 배양 1주 후, 하이드로젤 내로 심근으로부터 이동, 성장한 세포가 증가하였고, 배양기간이 증가됨에 따라 심근으로부터 이동, 성장하는 CSCs 수가 비례하여 증가하였다.
2주간 장기 배양 후 하이드로젤 내로 이동, 성장한 세포는 피브린 분해 효소인 10,000 unit 유로카나제를 사용하여 하이드로젤로부터 회수하였고, 하이드로젤로부터 해리된 세포 95% 이상 생존을 나타내었다. 이후 회수된 CSCs는 통상적인 단층배양환경에서 증폭 배양하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 단층배양환경에서 CSCs은 전형적인 방추상 모양으로 성장하였다. 세포가 80% 이상의 밀집도 상태에서 0.05% 트립신/EDTA (시그마알드리치, 서울, 대한민국)를 사용하여 세포를 배양용기로부터 때어낸 후 증폭 배양하였다.
< 실시예 2> 성인 심근 유래 CSCs의 성장특성 및 면역표현 특성
성인 심근 유래 CSCs의 체외 성장능력은 세포배가시간(population doubling time, PDTs)로 평가하였다. 분리한 CSCs의 면역표현적 특성은 면역형광염색을 시행한 후 공초점 레이저스캔현미경 및 유세포분석기(flow cytometry)로 분석하였다.
1) CSCs의 자기복제(self-renewal) 능력
CSCs의 자기복제 능력은 콜로니 형성 유닛-섬유아세포(colony forming unit-fibroblasts, CFU-Fs)와 군집배가시간(population doubling time, PDTs)으로 평가하였다. CSCs의 CFU-F의 형성능력을 평가하고자 단층배양법에 의해 증폭된 세포를 5 cells/cm2 밀도의 100-mm 배양 접시에 파종한 후 성장배양액을 첨가하였다. 배양 7일째, 2% 포르말린으로 10분간 세포를 고정한 후 0.1% crystal violet (LabChem Inc., Pittsburgh, PA)으로 염색하여 관찰하였다. 형성된 CFU-F 형성능력은 영상분석 프로그램(Image J, NIH, Bethesda, MD)을 이용하여 2 mm 크기 이상의 콜로니 수를 측정하였으며, 파종세포 수 당 콜로니 수를 산정하여 백분율(%)로 표기하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, CSCs는 단층배양환경에서 15%에서 콜로니를 형성하였고, 콜로니는 방추상 모양의 세포가 고밀도로 군집되어 구성하였다. 이는 CSCs이 자기복제능력을 보유하는 것을 확인할 수 있었다.
2) CSCs의 체외성장 능력
단층배양환경에서 세포배가시간(population doubling time, PDT)를 산정하여 CSCs의 체외성장 능력을 평가하였다. 1000개의 세포들을 48-멀티웰(multi-well) 배양용기에 파종하여 3일간 배양하였다. CelLyticTM MT lysis reagent (Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)을 이용하여 세포를 용해하였고, 용해된 DNA 함량을 Quant-iT™ PicoGreen reagent (Molecular probes, Eugene, OR)을 이용하여 측정하였다. 형광 마이크로 플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SynergyTM HT; Bio-Tek Instruments, Neufahrn, Germany)를 사용하여 발광(emission) 485 nm, 여기(excitation) 540 nm 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 형광강도를 세포수로 전환하기 위해 심근으로부터 분리한 세포를 이용하여 표준곡선을 구하였고, 이 표준곡선을 이용하여 샘플 내 형광강도를 세포수로 변환하였다. PDT는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(days in exponential phase)/((logN2-logN1)/log2)] 이때, N1은 지수성장기의 초기의 세포 수이며, N2는 지수성장기의 말기에서의 세포 수이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 단층배양환경에서 CSCs는 18회 이상 계대배양이 가능하였다. 계대배양 18회까지 PN-NCSCs의 PDT는 평균 35.7~45.3 시간 이내로 뛰어난 체외 세포성장 능력을 보였다. 또한 계대배양이 길어짐에 따라서 PDT는 다소 증가하였지만, 계대배양 18번째까지 세포의 노화는 나타내지 않았다. 이는 심근으로부터 분리한 세포는 자기복제능력과 성장능력이 뛰어남을 확인하였다.
3) CSCs의 면역표현 특성
CSCs의 면역표현형 특성을 분석하기 위하여 면역형광염색을 시행하였다. 단층배양환경에서 증폭 배양한 3×104 세포를 4-멀티웰 챔버 슬라이드(Lab-Tek™ II Chamber Slide™ System, Thermo Fisher Scientific, Seoul, Korea)에 파종하여 1일간 배양하였다. 이후, acetone/methanol 1:1 혼합액으로 세로를 고정하였다. 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 5% 우혈청알부민(bovine serum albumin, BSA; Fraction V, IgG-free, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 상온에서 30분간 반응하였다. 면역표현 특성을 평가하기 위하여 사용한 일차항체는 CSCs 표지자인 nestin, nkx-2.5, GATA-4, CD105, Sca-1, CD140b, c-kit, 심근세포 표지자인 α-sarcomeric actinin 및 myosin heavy chain, 혈관내피세포 표지자인 CD31 및 CD34, CD146, flk-1, 평활근세포 표지자인 α-smooth muscle actin(SMA), 조혈계 세포 표지자인 CD14, CD45, CD133, 중간엽줄기세포 표지자인 CD29, CD44, CD73, CD90을 이용하여 면역표현 특성을 평가하였다. 이후 해당 일차항체 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated IgG를 상온에서 45분간 반응하여 시그널을 검출하였다. 10 μg/ml DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 단층배양법에 의해 체외에서 증폭시킨 CSCs는 심장줄기세포 표지자인 nestin (98.8% ± 3.7%), nxk-2.5 (93.4% ± 2.1%), GATA-4 (96.4% ± 3.2%), CD105 (98.2% ± 4.2%), CD140b (90.1% ± 2.1%), Sca-1 (95.7% ± 4.1%)의 발현율을 나타내었다. CSCs는 중간엽줄기세포 표지자인 CD29, CD44, CD73, CD90은 90% 이상 발현되었다. 반면 c-Kit은 1% 미만의 세포에서 발현되었다. CSCs는 혈관내피세포, 평활근세포, 심근세포, 조혈계 세포 포지자 또한 1% 미만으로 발현되었다. 이상의 결과는 심근 유래 CSCs은 미분화 상태의 심근 유래 줄기세포와 동일한 면역표현 특성을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3> CSCs의 섬유소용해 활성도 및 PAI의 섬유소용해 억제를 통하여 피브린 하이드로젤의 3차원 지지체로서 구조적 안정성 강화
CSCs의 섬유소용해 활성도와 이를 억제하는 PAI 역할을 평가하기 위하여 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)인 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)을 사용하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 10 mM CaCl2가 포함된 DMEM 배지에 녹여 최종 0.25%의 농도에 피브리노겐 용액을 제조하였다. 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 DMEM에 녹여 최종 0.25 U/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 백만 개의 CSCs는 1ml에 트롬빈 용액에 혼합하여 세포가 분산된 트롬빈 용액을 제조하였다. 이후 피브리노겐 용액과 CSCs가 포함된 트롬빈 용액을 1:1 비율로 혼합하여 100 μl를 24-멀티웰 플레이트에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에 넣어서 2시간 동안의 가교반응을 거쳤다. 이후 DMEM에 10% 송아지 혈청(calf serum, CS)과 10 ㎍/ml 젠타마이신이 첨가된 배양액을 첨가하였다. 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 1일간 배양하였다. 섬유소용해제 억제제인 PAI를 넣지 않은 하이드로젤은 대조군으로 사용하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, PAI가 포함되지 않은 하이드로젤은 CSCs로부터 분비되는 섬유소용해 물질에 의하여 배양 1일째부터 하이드로젤이 완전히 용해되어 CSCs가 성장할 수 있는 3차원적 세포 부착 기질을 제공하지 못하였으며, 대부분의 세포들이 배양용기에 부착하여 2차원으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 PAI 첨가된 경우, 하이드로젤의 구조가 잘 유지되어 3차원적 세포부착 기질을 제공함으로써 하이드로젤 내의 CSCs는 3차원적으로 균일하게 분포하였으며, 배양 1일부터 세포질의 확장이 관찰되었고, 배양 2일째 세포간 결합을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 피브린 하이드로젤 내로 세포를 함입시켜 배양 시 CSCs에 의한 섬유소용해 활성에 따라 피브린 하이드로젤이 용해되어 CSCs의 3차원 지지체로서 기능이 소실되었다. 반면 PAI 도입을 통하여 CSCs의 섬유소용해를 억제하여 CSCs의 3차원 지지체로서 피브린 하이드로젤 기능을 유지할 수 있었으며, 세포질의 확장과 세포 간 접합을 지지할 수 있었다.
< 실시예 4> PAI 및 피브린 하이드로젤 조성에 따른 CSCs 세포질 확산
피브린 하이드로젤을 구성하는 피브리노겐 농도 및 PAI 도입에 따른 CSCs의 세포질 확산에 대한 용량을 평가하기 위하여 2.5 mg/ml, 5.0 mg/ml, 10.0 mg/ml, 20.0 mg/ml 농도의 피브리노겐 용액을 10 mM CaCl2가 포함된 DMEM 배지에 녹여 제조하였다. 트롬빈은 실시예 1과 같이 0.5 U/ml의 농도로 DMEM을 이용하여 제조하였다. 백만 개 CSCs를 1ml 트롬빈 용액에 분산하였다. 4가지 농도 피브리노겐 용액과 CSCs과 포함된 트롬빈 용액을 1:1 비율로 혼합한 후 100 μl 혼합액을 24-멀티웰 플레이트에 옮기고 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 가교반응을 거친 후 최종 0.125%, 0.25%, 0.5%, 1% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 4가지 유형 피브린 하이드로젤을 제조하였다. 10% calf serum과 100 ㎍/ml 젠타마이신이 포함된 DMEM을 세포배양액으로 사용하였다. 이후 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에 위치한 후 15 rpm 속도로 역동적 배양환경에서 1일간 배양하였다. 세포질의 확산(cell spreading)은 현미경 사진으로 촬영한 후 Image J를 이용하여 세포질 확산의 길이를 측정하였다. 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)인 200 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)은 트롬빈 용액에 도입하여 PAI 도입 여부가 세포질 확산에 미치는 영향을 평가하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1과 동일하게 PAI가 도입되지 않은 피브린 하이드로젤은 1일간 배양 후 피브린은 완전히 용해되어 세포는 3차원적 분포를 갖지 못하고 세포배양용기 바닥에 붙어있었다. PAI가 도입되지 않은 피브린 하이드로젤은 CSCs에서 분비되는 섬유소용해에 의해 3차원 지지체로서 기능이 소실되었다. 반면 PAI가 도입된 피브린 하이드로젤은 3차원 지지체로서 그 구조가 유지가 되었다. 그러나 피브리노겐 농도가 높은 피브린 하이드로젤 내 CSCs의 세포질 확산은 비례하여 감소되었다. 이상의 결과는 PAI에 의한 도입은 세포질 확산에 영향은 미미하였으나, 피브리노겐의 농도는 세포질 확산에 심각한 저해인자로서 작용하는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> PAI가 3차원 피브린 하이드로젤 내 CSCs 세포질 확산 및 세포 간 접합에 미치는 영향
PAI의 도입여부에 따라서 하이드로젤 내의 CSCs 세포질 확산 및 세포 간 접합에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 실시예 1과 같이, 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 하이드로젤 내에 CSCs 및 PAI를 도입하여 제조하였다. DMEM에 10% 송아지 혈청과 100 ㎍/ml 젠타마이신으로 첨가하여 배양 용액을 사용하였다. 배양 기간 동안 PAI를 도입하지 않은 피브린 하이드로젤(-/-)은 대조군으로 사용하였다. 6시간, 12시간 배양 후에, 1% 포르말린을 이용하여 1시간 동안 고정하고, 1% albumin/PBS 내에 0.2 unit/μl의 Oregon GreenTM 488-conjugated phalloidin을 30분간 반응 시킨 후, PBS 세척 후에 10 ㎍/ml DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen)를 5분간 염색하였다. 이후 confocal microscope을 통하여 분석하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, PAI를 전혀 도입하지 않은 하이드로젤(-/-) 및 배양용액 내 PAI를 도입하지 않은 하이드로젤(-/+)은 세포질의 확산이 제한적으로 관찰되었다. 반면 하이드로젤의 제조과정부터 배양용액 내 PAI를 도입한 하이드로젤(+/+)은 3차원적 세포부착 기질을 제공하였고, 하이드로젤 내 CSCs의 세포질 확산 및 세포 간 접합이 활발하게 이루어지는 것을 확인하였다. 이는 하이드로젤 내 및 지속적으로 PAI 도입은 피브린 하이드로젤 내 배양과정 동안 세포가 3차원적으로 성장, 접합할 수 있는 중요한 요소로서 작용함을 알 수 있다.
< 실시예 6> 피브린 하이드로젤 내 CSCs의 부착, 세포질 확장, 세포간 접합, 하이드로젤 수축에 미치는 PAI의 영향
PAI는 200 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)을 트롬빈 용액 내 첨가하여 PAI가 세포-매개 하이드로젤 수축에 미치는 영향을 평가하였다. 0.25% 피브리노겐 용액과 ml당 1x106, 2x106, 1x107의 CSCs 함유한 0.5 U/ml 트롬빈과 1:1로 혼합 후, 100 μl 혼합액을 5 mm 크기의 O-ring에 캐스팅 한 후, 37℃ 인큐베이터에서 1시간동안 가교반응을 거친 후에 1% 송아지혈청 함유한 DMEM 1ml을 배양용기에 첨가하였다. 이후 오비탈 쉐이커에 위치한 후 12시간 동안 오비탈 쉐이커에서 15rpm 속도로 역동적 배양하였다. 24시간 동안 O-ring에 부착된 상태로 배양한 후 O-ring으로부터 떼어낸 후 부유배양환경에서 2시간 배양하였다. 이후 하이드로젤의 수축율을 분석하였고, 현미경적 세포질 확장 및 세포간 접합을 평가하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, PAI가 첨가된 경우 세포질의 확산, 세포간 접합이 활발하게 이루어진 반면, PAI가 도입되지 않은 피브린 하이드로젤은 세포질의 확산 및 세포간 접합을 관찰할 수 없었다. 현미경 관찰에서 CSCs 주변의 하이드로젤은 섬유소가 용해되면서 hollow가 관찰되었고, 그 결과 부착할 수 있는 고분자 체인의 소실에 따라 세포질 확산과 세포간 접합은 관찰할 수 없었다. 반면에 PAI 첨가에 따라서 세포 부착 및 확산이 활발하게 이루어졌으며, 배양기간이 길어질수록 세포 간 결합이 증가되었다. PAI가 도입되지 않은 하이드로젤은 부유배양환경에서도 하이드로젤의 수축이 일어나지 않은 반면 PAI가 도입된 하이드로젤은 세포농도 의존하게 세포-매개 하이드로젤 수축이 일어나는 것을 확인할 수 있다. 이상의 결과는 CSCs-매개 하이드로젤 수축은 세포질의 확산과 세포간의 접합에 이루어져야만 발생하는 것을 확인할 수 있으며, 세포의 부착과 세포간 접합을 위해서 PAI가 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7> 하이드로젤 유형에 따른 CSCs -매개 수축에 대한 저항성
부착배양환경에서 CSCs 매개 수축에 대한 하이드로젤 저항을 평가하기 위해서 0.2% 콜라겐 하이드로젤, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)가 도입된 0.125% 피브린 하이드로젤, 3% GTP 하이드로젤 내 5x105/ml, 1x106/ml, 2x106/ml, 5x106/ml 밀도의 CSCs 함입시킨 후 24-멀티웰 배양용기 내에 옮긴 후 1일간 배양하였다. 실시예 1과 동일한 배양용액을 사용하였다. 1일간 배양 후에 포르말린 용액을 이용하여 고정한 후, toluidine blue 염색을 시행하였고, 하이드로젤 구조의 변화를 세포상태를 평가하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 콜라겐 하이드로젤은 CSCs의 수축에 따라서 저밀도 CSCs 세포가 함입된 콜라겐 하이드로젤은 수축되어 배양용기로부터 떨어지고, 고농도 세포가 함입된 콜라겐 하이드로젤이 역시 세포-매개 수축에 의해서 수축되고 배양용기로부터 떨어지는 현상이 발생하였다. 반면 피브린 하이드로젤 및 GPT 하이드로젤은 세포-매개 수축에 대해서 저항성을 띄며 3차원 구조를 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 하이드로젤 성분 및 유형에 따라서 물리적 강도는 다르며, 그 결과 세포-매개 수축에 대한 저항성이 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 콜라겐 하이드로젤의 물리적 강도는 취약하여 저농도 세포에서도 하이드로젤이 틀에서 떨어져 수축된 현상을 확인할 수 있었다.
< 실시예 8> 하이드로젤 유형에 따른 CSCs 부착, 세포질 확장, 세포간 접합, 세포-매개 하이드로젤 수축
본 실시예에서는 0.2% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 하이드로젤과 2.8 kPa, 5.1 kPa elastic modulus를 가진 3% GPT 하이드로젤 내에 ml 당 5x106의 CSCs를 함입하여 1일간 O-ring에 부착하여(stress condition)으로 배양하였다. 이후, O-ring으로부터 떼어낸 후 2시간 동안 부유배양환경(non-stressed culture condition)에서 배양하였다. 이후 하이드로젤은 포르말린에 고정한 후 파라핀블록과 절편을 제조한 후 hematoxylin-eosin 염색을 시행하여 하이드로젤 내 CSCs 부착, 세포질 확장, 세포간 접합을 평가하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 2.8 kPa과 5.1 kPa의 3% GPT 하이드로젤은 세포간의 접합이 저하되어 있었으며, CSC-매개 하이드로젤 수축율은 10% 미만이었다. 반면 피브린 하이드로젤 내 CSCs는 세포질의 확산 및 세포간의 접합이 활발하게 이루어져 하이드로젤은 50% 이상 수축이 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 하이드로젤의 물리적 특성과 더불어 세포-하이드로젤 생체접합성에 따라 세포질의 확산, 세포간의 접합이 유의하게 영향을 받으며, 그 결과 CSC-매개 수축에 심대한 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 9> 배양환경에 따른 피브린 하이드로젤의 CSC -매개 수축 및 세포죽음
부착배양환경과 부유배양환경에 따른 피브린 하이드로젤의 CSC-매개 수축 및 세포보존을 평가하고자 0.125% 피브리노겐 용액과 200 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid) 및 1x107/ml의 CSCs를 첨가한 0.5 U/ml 트롬빈 용액을 1:1로 혼합한 후 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. O-ring으로부터 떼어낸 후 부유시킨 부유배양환경에서 30분, 2시간, 3일간 배양하였다. 배양 환경에 따른 하이드로젤의 CSCs-매개 수축을 Image J 프로그램을 이용하여 분석하였다. 포르말린 용액을 이용하여 고정한 후 파라핀 블록과 절편을 제조하였고, hematoxylin-eosin 염색을 통하여 하이드로젤 내 CSCs의 세포손상과 죽음을 평가하였다. 세포손상과 죽음을 정량적으로 평가하기 위하여 세포가 함입된 CSCs의 카스파제3/7(caspase 3/7) 활성도를 Apo 3/7 HTSTM assay kit (Cell Technology, Minneapolis, MN)를 사용하여 분석하였다. 1% Tween20이 포함된 phosphate-buffered saline으로 10분간 처리 후 세포를 용해한 샘플 100 μl를 동량의 caspase 3/7 detection reagent 와 37℃에서 30분간 반응시켰고, 형광 마이크로플레이트 리더기 (fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)로 발광(emission) 488nm, 여기(excitation) 530nm의 파장에서 형광강도를 측정하여 활성도를 평가하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 부유배양환경에서의 시간이 증가할수록 CSCs-매개 하이드로젤의 수축은 유의하게 증가하였다. 도 13에 나타난 바와 같이, 부유한 상태의 배양 기간이 길어질수록 세포질의 손상 및 핵의 분쇄빈도가 증가하였으며, 이는 부유배양이 길어질수록 CSCs-매개 하이드로젤 수축이 증가되고, 그 결과 하이드로젤 내부로의 영양분 및 산소공급이 차단되어 세포손상 및 세포죽음이 발생한다는 것을 확인할 수 있었다. 더불어 부유배양환경에서 배양 시간이 길어질수록 caspase 3/7 활성도도 비례하여 증가되어, 부유배양환경은 과도한 세포-매개 하이드로젤 수축을 유발하고 그 결과 세포손상과 죽음이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 10> 배양환경에 따른 피브린 하이드로젤 내 생리활성 유전자 발현
실시예 9와 같이, 5x106/ml의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경 혹은 부유배양환경에서 배양하였다. 단층배양법으로 증폭 배양한 CSCs는 대조군으로 사용하였다. 배양 3일 후에 하이드로젤 내 혹은 단층배양 CSCs로부터 RNA를 분리한 후 reverse transcription 반응 후 cDNA를 제조하였고, 항염증 mRNA (IL-6, IL-10, TGF-b), 심근세포 보호 mRNA (IL-6, IL-11, CT-1, HGF, IGF-1, LIF), 심근재생 유도 mRNA (FGF-2, FGF-7, FGF-9, BMP-2, BMP-4, Sox-17), 신생혈관유도 mRNA(Ang-1, Ang-2, bFGF, HIF-1α, HGF, VEGF) 및 심근세포유도 mRNA(BMP-4, sox-17) mRNA 발현을 real time-quantitative PCR을 통하여 평가하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 3차원적으로 배양한 하이드로젤 내의 CSCs는 단층배양법으로 성장시킨 CSCs와 비교하였을 때, 항염증, 심근세포보호, 심근재생유도 및 신생혈관유도 mRNAs 발현이 유의하게 증가하는 것으로 확인하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 그 중에서도 부착배양환경에서 배양한 하이드로젤 내 CSCs는 부유배양환경에서 배양한 하이드로젤 내의 CSCs 보다 혈관생성을 촉진할 수 있는 mRNAs인 angiopoietin-1, -2 (Ang-1, -2), basic fibroblast growth factor (bFGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hypoxia inducible factor-1α와 심근세포로 분화를 유도할 있는 mRNAs인 bone morphogenetic rrotein4 (BMP4), Sox17 mRNA 발현이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 부착배양환경에서 하이드로젤 내 CSC는 신생혈관유도 및 심근세포 분화/재생을 유도할 수 있는 생리활성인자의 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
< 실시예 11> 세포-매개 수축을 통한 CSCs 다층세포시트 내 섬유소의 응축
실시예 9와 같이 5x106/ml 밀도의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. 이후 하이드로젤을 O-ring에서부터 떼어낸 후 30분, 2시간 동안 부유배양환경에서 배양하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하였다. 포르말린 용액을 이용하여 고정 후 파라핀 블록을 제작하여 헤마톡실린-에오진 염색과 anti-fibrinogen 항체플 이용하여 면역형광염색을 시행하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 부유한 상태의 배양 시간이 30분, 2시간으로 증가함에 따라서 CSCs-매개 수축에 의하여 하이드로젤 내 구조가 조밀하게 밀집되었고, 하이드로젤 고분자의 수분이 방출되고 피브린 섬유소가 두껍게 응축되어 CSCs 다층세포시트의 물리적 특성이 조밀하게 응축되는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 12> 하이드로젤 내 세포밀도 조절을 통한 다층세포시트 내 CSCs 세포층 조절
실시예 9와 같이 1x106/ml, 2x106/ml, 5x106/ml의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 sol 상의 1 ml 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. 이후 하이드로젤을 O-ring에서부터 떼어낸 후 2시간 동안 부유배양환경에서 배양하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하였다. 포르말린 용액을 이용하여 고정 후 파라핀 블록과 절편을 제작하여 헤마톡실린-에오진 염색하여 세포층을 산정하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, 부착배양환경에서 3일간 배양 후 2시간 동안 부유배양환경 후 제조된 CSCs 다층세포시트는 하이드로젤 내 파종한 CSCs 세포밀도와 비례하여 다층세포시트의 불투명도와 두께가 증가되었다. 또한 현미경 검사에서 1x106/ml 밀도로 제조된 다층세포시트는 시트 내 세포층은 10층 미만인 반면 5x106/ml 밀도로 파종하여 제조한 다층세포시트는 30층 이상으로 세포층이 구성되어 있고 하이드로젤 내 파종되는 세포밀도의 조정을 통하여 다양한 세포층으로 다층세포시트를 제조할 수 있었다.
< 실시예 13> CSCs 다층세포시트 내 세포- 세포간 접합 및 세포- 세포외기질간 접합을 통한 구조적 안정성 강화
실시예 9와 같이 5x106/ml의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 sol 상의 1 ml 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. 이후 하이드로젤을 O-ring에서부터 떼어낸 후 2시간 동안 부유배양환경에서 배양하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하였다. 포르말린 용액을 이용하여 고정 후 파라핀 블록과 절편을 제작하여 세포간 접합을 평가하기 위하여 anti-β-catenin 및 세포와 세포외기질간 접합을 평가하기 위하여 anti-integrin-β1 면역형광염색을 시행하였다. 10 μg/ml DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen)용액으로 핵을 염색하였다. 형광현미경 관찰을 통하여 세포간 접합과 세포와 세포외기질간의 접합을 평가하였다.
도 18에 나타난 바와 같이, 세포와 세포간 접합에 관계되는 anti-β-catenin이 세포질을 따라서 강하게 발현하였고, 세포간 접합이 잘 이루어져 있는 것을 확인할 수 있었고, 또한 ECM과 결합을 유도하는 integrin-β1 또한 세포질 주위로 발현되는 것을 확인할 결과 세포와 세포외기질간 접합을 통하여 구조적 특성을 강화할 수 있는 것을 확인하였다.
< 실시예 14> CSCs 다층세포시트 내 세포외기질 생성 및 축적을 통한 구조적 특성 강화
실시예 9와 같이 5x106/ml의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 sol 상의 1 ml 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 1일, 2일, 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. 이후 하이드로젤을 O-ring으로부터 떼어낸 후 2시간 동안 부유배양환경에서 배양하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하였다. 포르말린 용액을 이용하여 고정 후 파라핀 블록과 절편을 제작하여 세포외기질 생성과 축적을 평가하였다. 비특이적 반응을 억제하기 위해서 5% 염소 혈청(goat serum)으로 30분간 blocking한 후 일차항체는 anti-connexin 43, anti-collagen type IV, anti-laminin, anti-fibronectin을 이용하여 37℃에서 1시간 반응하였다. PBS로 3회 세척 후 이차항체는 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated를 상온에서 30분간 반응하였고, 10 μg/ml DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색하였다. 이후 ProLongGold antifade reagent(Molecular Probe)로 봉입하여 형광현미경을 통하여 발현여부를 평가하였다.
도 19에 나타난 바와 같이, 제조된 CSCs 다층세포시트 내 체외배양을 통하여 세포에서 생성되어 하이드로젤 내 basal lamina 유형의 세포외기질이 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 체외 배양을 통하여 축적되는 세포외기질은 부착배양환경 기간과 비례하여 증가되었다. 이상의 결과는 CSCs 다층세포시트는 세포에서 생성되어 분비, 축적되는 세포외기질에 의하여 다층세포시트의 구조적 안정성을 강화할 수 있음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 15> 다층세포시트 내 CSCs의 면역 표현형
실시예 9와 같이 5x106/ml의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 sol 상의 1 ml 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. 이후 하이드로젤을 O-ring에서부터 떼어낸 후 2시간 동안 부유배양환경에서 배양하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여 다층세포시트를 제조하였다. 다층세포시트를 구성하는 세포의 면역표현형은 파라핀 절편을 이용하여 이중면역형광염색을 시행하였다. 파라핀 절편은 anti-nestin과 반응한 후 isotype-matched Alexa Fluor 594-conjugated 이차항체와 반응시켰다. 이후 anti-cardiac troponin I, anti-myosin heavy chain을 각각 반응 시킨 후, 이후 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated 이차항체와 반응시켜 이중 면역형광염색을 실시하였다. DAPI (Invitrogen)를 이용하여 핵을 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, 다층세포시트를 구성하고 있는 CSCs는 CSCs의 표지자인 nestin은 강하게 발현된 반면, 심근세포 표지자인 cardiac troponin I(cTnI)나 myosin heavy chain(MHC)은 발현하지 않았고, 이는 세포시트를 구성하고 있는 세포는 미분화 상태의 CSCs로 구성되는 다층세포시트임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 16> CSCs 다층세포시트의 신생혈관유도 생체활성인자의 분비능력
실시예 9와 같이 5x106/ml의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 sol 상의 1 ml 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 100 μl를 5 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. 이후 하이드로젤을 O-ring으로부터 떼어낸 후 2시간 동안 부유배양환경에서 배양하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여 다층세포시트를 제조하였다. CSCs 다층세포시트의 혈관유도 생체활성인자의 분비능력을 평가하기 위하여 CSCs 다층세포시트를 1% 송아지혈청을 함유한 DMEM에 1일 혹은 3일 동안 배양한 후 배양액을 수거하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 배양액 내 신생혈관유도 인자의 농도를 평가하였다. 단층배양환경에서의 CSCs에서 분비되는 신생혈관유도인자를 대조군으로 이용하였다. 신생혈관유도인자는 angiopoietin-1, angiopoietin-2, basic fibroblast growth factor(bFGF), hepatocyte growth factor(HGF), vascular endothelial growth factor(VEGF) 발현은 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 분석하였다.
도 21에 나타난 바와 같이, CSCs 다층세포시트는 단층배양환경에서의 CSCs와 비교하여 신생혈관유도인자의 분비능력이 유의하게 증가되어 있었다. 또한 CSCs 다층세포시트는 3일동안 지속적으로 신생혈관유도인자를 분비할 수 있는 능력을 확인할 수 있었다.
< 실시예 17> CSCs 다층세포시트의 심장외막으로의 이식, 생착 및 손상부위로의 이주
실시예 9와 같이 5x106/ml의 CSCs를 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 0.125% 피브리노겐과 0.25 U/ml 트롬빈으로 구성된 sol 상의 1 ml 하이드로젤 내로 함입시켰다. 혼합액 300 μl를 10 mm 직경의 O-ring에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 2시간 polymerization을 거쳤다. DMEM에 1% 송아지 혈청, 10 ㎍/ml 젠타마이신, 100 ㎍/ml 트란제믹산(tranexamic acid)로 구성된 배양액을 첨가한 후 3일간 O-ring에 부착한 부착배양환경에서 배양하였다. 이후 하이드로젤을 O-ring에서부터 떼어낸 후 2시간 동안 부유배양환경에서 배양하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여 다층세포시트를 제조하였다. 세포의 생존 여부와 이주능력을 평가를 위하여 10 mM CM-DiI으로 라벨링한 CSCs을 이용하여 다층세포시트를 제조하였다. 제조된 CSCs 다층세포시트는 PBS로 보존하였으며, 1일 이내에 급성심근경색 쥐 모델로 이식하였다. 급성심근경색 모델은 동물실험은 일반사육 조건에서 유지되는 240-260 g의 Sprague Dawley rat을 사용하였다. 동물실험은 인제대학교의 동물실험운영위원회의 승인을 받은 후 시행하였다. 심근경색은 좌측하방 관상동맥(left anterior decending coronary artery)을 결찰하여 혈관순환을 차단하여 심근경색을 유도하였다. 동맥 결찰 30분 후 심근경색 부위의 심장외막에 CSCs 다층세포시트를 부착시켰으며, 다층세포시트는 이용하여 상, 하, 좌, 우 4군데를 suture하였다. CSCs 다층세포시트를 이식한 후 3일, 1주 및 2주 후 심장을 적출하고, 포르말린으로 고정한 후 파라핀 블록과 절편을 제조한 후 이식한 세포의 생존율과 이주를 평가하였다.
도 22에서 나타난 바와 같이, 세포시트는 심장 외막을 따라 단단하게 융합되어져 있었다. 다층세포시트를 구성하는 세포는 세포질과 세포핵이 온전히 유지된 것을 확인함에 따라서 CSCs가 생존하고 있는 것을 것을 확인하였다. CM-DiI에 라벨링(red)된 CSCs는 이식 1주 후 광범위하게 심장외벽을 따라 분포하고 있었으며, 이식 2주 후 CM-DiI 양성 CSCs 수가 감소되어 있었다. 그러나 CM-DiI 양성 CSCs는 심장외벽에서 손상된 심근 내로 이주하는 것을 확인할 수 있어, 심장외막으로의 이식을 통하여 안정적으로 CSCs를 심장외막 및 손상부위로 전달할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
도 23에 나타난 바와 같이, CSCs 다층세포시트를 이식 3일째 혈액세포를 함유한 혈관이 다층세포시트 내로 생성되는 것을 확인할 수 있어, 이식한 CSCs 다층세포시트가 이식 받은 동물의 혈액순환을 통하여 생존할 수 있음을 시사하는 결과이다.
< 실시예 18> CSCs 다층세포시트의 심근보호능력
실시예 17과 같이 CSCs 다층세포시트를 제조한 후 심근경색을 유도한 심장외벽에다 이식하였다. 이식한 CSCs 다층세포시트의 심장보호 및 심근재생 효과를 평가하기 위하여 다층세포시트를 이식한 후 4주째 심장을 적출한 후 포르말린으로 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. 파라핀 절편은 hematoxylin-eosin 염색과 masson trichrome 염색을 통하여 심근손상 및 심근 섬유화 정도를 분석하였다. Image J를 이용하여 좌심방 벽의 두께를 산정하였으며 섬유화된 심근 면적을 형태계측 방법으로 측정하였다.
도 24에 나타난 바와 같이, 심근경색모델을 만든 후에 CSC 다층세포시트를 이식한 쥐는 다층세포시트를 이식 받지 않은 대조군 쥐와 비교하였을 때 좌심실 두께가 유의하게 증가되어 있었으며, 좌심실 내 섬유화 병변은 유의하게 감소되어 있었다. 이상의 결과는 CSCs 다층세포시트 이식을 통하여 심근경색에 따른 심근소실 및 섬유화를 유의하게 감소시키는 CSCs 다층세포시트의 유효성을 제시한다.
< 실시예 19> CSCs 다층세포시트의 신생혈관유도 능력
생체 내 이식된 CSCs 다층세포시트의 심근 내 신생혈관유도 능력을 평가하고자 실시예 17과 같은 동일한 방법으로 CSCs 다층세포시트를 제작한 후 급성심근경색 모델의 심장외벽으로 이식하였다. CSCs 다층세포시트 이식 4주 후에 심장을 적출하여 파라핀 블록과 절편을 제조하였고, 심근경색 내 혈관밀도를 평가하기 위하여 anti-smooth muscle actinin(SMA) 항체를 이용하여 면역화학염색법을 수행하였다. Image J 프로그램을 이용하여 단위 면적당 미세혈관밀도를 산정하였다.
도 25에 나타난 바와 같이, 심근경색 후 손상된 심근 내 미세혈관밀도는 CSC 다층세포시트를 이식한 그룹(CSC sheet)에 있어서 다층세포시트를 이식하지 않은 대조군(control)과 비교하여 유의하게 증가되어 있었다. 이상의 결과는 CSCs 다층세포시트는 급성심근경색 모델에서 심근재생 및 신생혈관유도를 증진시켜 심근보호 및 심근재생을 촉진하는 것을 유효성을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 20> 다층세포시트 내 CSCs의 생체 내 분화특성 및 역할
CSCs 다층세포시트의 생체 내 분화특성 및 조직재생의 능력을 규명하고자 실시예 17과 같이 다층세포시트를 제조한 후 Sprague Dawley 쥐의 좌측 하방 관상동맥을 결찰하여 유도하고 30분 뒤에 심외막 부위에 CSCs 다층세포시트를 이식하였다. CSCs의 생체 내 분화특성과 그 역할을 규명하기 위하여 다층세포시트 제조 전 eGFP 유전자를 함유한 lentivirus를 통하여 CSCs 내로 전달하였다. CSCs 다층세포시트를 급성심근경색의 심장외막으로 이식한 후 2주 후 심장을 적출한 후 파라핀 블록 및 절편을 제조하였다. 파라핀 절편을 이용하여 eGFP 혹은 인간 미토콘드리아-특이 표지자(hMito), 그리고 심장세포-특이 표지자를 이용하여 이중형광염색을 시행하였고, confocal microscope을 이용하여 생체 내 세포분화를 분석하였다. 심근세포 표지자는 anti-myosin heavy chanin(MHC), 혈관평활근세포 표지자는 anti-smooth muscle actin(SMA)를 이용하였다. 이차항체는 Alexa Fluor-488-conjugated 이차항체를 이용하였다.
도 26에서 나타난 바와 같이, 심장 외막에 위치한 CSCs는 다층세포시트 제조 시 세포에 주입한 eGFP 단백질이 강하게 발현되었으며, 동시에 hMito 단백질이 발현되는 것은 세포가 심장외벽에 따라 생존하고 있음을 나타낸다. 동시에 심장외벽에 위치하는 eGFP 양성 CSCs는 MHC는 발현되지 않으나, SMA가 동시에 발현되는 점은 섬유아세포로 그 분화한 것을 확인할 수 있다. 혈관구조 주변으로 SMA와 eGFP가 발현되는 특성은 주입한 CSCs가 심장외벽의 혈관평활근세포로 분화하여 혈관형성에 관여하는 것을 확인할 수 있었다.
도 27에서 나타난 바와 같이, 심근 내 위치한 eGFP 및 hMito 양성 CSCs는 혈관벽 및 심근세포 모양을 보였으며, 해당 세포는 eGFP 및 MHC가 동시에 발현되는 심근세포 및 eGFP 및 SMA가 동시에 발현되는 혈관평활근세포로 형성되어 심근재생 및 혈관재생에 관계하는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (27)

  1. (1) 심장줄기세포(cardiac stem cells; CSCs)를 분리하여 배양하는 단계;
    (2) 상기 배양된 심장줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계;
    (3) 상기 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 심장줄기세포는 심근 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계는 배양된 심장줄기세포를 용액 상태의 하이드로젤에 혼합한 후, 젤 상태로 전환시켜 심장줄기세포를 하이드로젤 내에 3차원적으로 균일하게 분포시키는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피브린 하이드로젤은 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐, 최종 농도 0.2 U/ml 내지 2 U/ml의 트롬빈 및 최종 농도 10 ㎍/ml 내지 500 ㎍/ml 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)을 함유하는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항섬유소용해제는 트란제믹산(tranexamic acid), 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid), 아미노카프로익산(aminocaproic acid) 또는 아프로티닌(aprotinin)인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양된 심장줄기세포는 트롬빈 용액에 첨가된 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양된 심장줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건은 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤을 원형, 직사각형, 혹은 정사각형 형태의 몰드 내로 캐스팅(casting)하여 물리적으로 지지되는 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건은 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간 접합을 유도하는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 심장줄기세포에서 생성되어 분비되는 세포외기질 (extracellular matrix, ECM), 항염증인자, 심근세포보호인자, 심근재생인자 및 신생혈관유도인자를 하이드로젤 내로 축적하는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포외기질은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 콜라겐 타입 IV(collagen type IV)로 이루어진 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 항염증인자는 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10 또는 형질전환 성장인자(transforming growth factor-β; TGF-β)인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 심근세포보호인자는 IL-6, IL-11, 카디오트로핀-1(cardiotrophin-1), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1 또는 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF)인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 심근재생인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP) 또는 Sox-17인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 신생혈관유도인자는 안지오포이에틴(angiopoietin) 계열, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF) 계열, 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF) 계열 또는 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 (4) 단계의 부유배양조건은 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여, 하이드로젤 내 수분을 방출시키는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 심장줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  19. 심장줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 심장줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 항염증인자, 심근세포보호인자, 심근재생인자 및 신생혈관유도인자를 포함하는 심장줄기세포의 다층세포시트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 피브린 하이드로젤은 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐, 최종 농도 0.2 U/ml 내지 2 U/ml의 트롬빈 및 최종 농도 10 ㎍/ml 내지 500 ㎍/ml 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)을 함유하는 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트.
  22. 제19항에 있어서, 상기 심장줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도인 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트.
  23. 제19항에 있어서, 상기 심장줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 심장줄기세포의 다층세포시트.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 심장줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 심장질환 치료용 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조성물은 심장 손상 후 유발되는 심근의 섬유화(fibrosis) 정도를 감소시키고, 혈관생성 및 심근재생을 향상시키며, 심근 두께를 증가시켜, 심장수축기능을 향진시키는 것을 특징으로 하는 심장질환 치료용 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 심장질환은 허혈성 심장질환, 일차성(특발성) 심근질환 또는 이차성 심근질환인 것을 특징으로 하는 심장질환 치료용 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 일차성(특발성) 심근질환은 확장형 심근병증(dilated cardiomyopathy; DCM), 비후형 심근병증(hypertrophic cardiomyopathy; HCM) 또는 제한성 심근병증(restrictive cardiomyopathy)인 것을 특징으로 하는 심장질환 치료용 조성물.
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