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KR20180066262A - 만능 세포의 유전자 조작 - Google Patents

만능 세포의 유전자 조작 Download PDF

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KR20180066262A
KR20180066262A KR1020187015758A KR20187015758A KR20180066262A KR 20180066262 A KR20180066262 A KR 20180066262A KR 1020187015758 A KR1020187015758 A KR 1020187015758A KR 20187015758 A KR20187015758 A KR 20187015758A KR 20180066262 A KR20180066262 A KR 20180066262A
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ipsc
engineered
genome
cell
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KR1020187015758A
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바흐람 발라메르
람지 아부자라우
탐 통 리
웨이지에 란
라둔 클라크
라이언 비요달
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페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Abstract

선택된 부위에서 안정하고, 기능성인 게놈 편집을 갖는 게놈-조작된 iPSC 및 유도 세포를 수득하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 또한 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 세포 집단 또는 클론성 세포주가 제공되며, 이는 하나 이상의 선택된 내인성 유전자 내에 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 in/del의 표적화된 통합을 포함한다.

Description

만능 세포의 유전자 조작
관련출원
본 출원은 2015년 11월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/251,032호, 2016년 5월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/337,258호, 및 2016년 7월 25일자로 출원된 미국 가출원 제62/366,503호에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 개시내용은 이들의 전문이 참고로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 넓게는 줄기세포의 유전자 편집(genetic editing) 및 게놈 조작(genomic engineering) 분야에 관한 것이다. 보다 특별하게는, 본 개시내용은 특정 유전자좌를 표적으로 하고, 편집된 유전 물질의 연속적인 보유 및/또는 기능조절을 보장하는 분자 전략을 사용한 클론성 만능 줄기세포(clonal pluripotent stem cell)의 유전자 조정의 용도에 관한 것이다.
인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC) 연구 분야는 계속적으로 발전하고 있고, 유전자-조작된 hiPSC-유래 세포 치료제의 임상 연구가 출현하기 시작하고 있기 때문에, 유전자-변경된 세포의 투여에 관련된 안전성 문제가 다루어져야 하고, 경감되어야 한다. 이러한 안전성 문제를 다루기 위해서, 재조합 펩타이드, 단클론성 항체, 소분자-조정된 효소 활성 및 유전자-특이적 변형을 비롯한, 다수의 전략이 이상 세포의 선택적인 제거를 가능하게 하기 위해서 연구되어 왔다. 일반적으로, 이전 연구는 허피스 복합 바이러스 티미딘 카이나제 또는 유도성 카스파제-9(iCasp9)를 비롯한, 자살 유전자를 인간 세포에 안정하게 도입하기 위해서 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스, 및 짧은 프로모터를 사용하여 왔다. 그러나, 바이러스 벡터의 사용은 질환-관련된 유전자를 파괴 또는 활성화시킬 수 있는 무작위 통합 사건으로 이어져서, 잠재적으로 유해한 효과를 유발할 수 있다. 현재 사용되는 방법에서 다른 문제점은 낮은 삽입률; 무작위 삽입; 돌연변이; 높은 삽입 카피수, 및 무작위 삽입으로 인한 변화된 카피수 삽입을 갖는 세포의 불균질 집단을 선택하기 위한 힘든 세포 분류를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, iPSC 게놈 조작을 위해서, 다수의 인공 프로모터 및 게놈 영역은 만능 상태 및 분화된 상태 둘 모두에서 후성적 유전자 발현 침묵 경향이 있어서, 프로모터 또는 삽입된 유전자를 생성하고, 사건, 예컨대 세포 확장, 계대배양(passaging), 재프로그래밍, 분화 및/또는 탈분화에 무반응성이 되게 한다. 따라서, 특히, 치료적 용도를 위해서 유전자-조작된 면역 세포를 개발하는 경우, 안정성을 훼손시키지 않으면서, 삽입된 기능적인 양상의 반응을 유지시키기 위해서 최적의 게놈 편집 전략, 통합 부위, 프로모터, 및 다른 인자를 식별하는 것이 상당히 중요하다.
본 발명의 목적은 폴리뉴클레오타이드 삽입, 결실 및 삽입을 포함하고, 변형이 분화, 탈분화, 재프로그래밍, 확장, 계대배양 및/또는 이식 후에 후속으로 유래된 세포에서 기능성을 유지하는, 선택된 부위에서 하나 또는 몇몇 유전자 변형을 포함하는, iPSC 클론주(clonal line)로부터 유래된 단일 세포, 또는 그로부터의 유도 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 표적화된 통합 및/또는 표적화된 in/del을 비롯한, 동일한 유전자 변형을 포함하는, 재프로그래밍 비-만능 세포를 통해서 선택된 부위에서 하나 또는 몇몇 유전자 변형을 포함하는 단일 세포 유래된 iPSC 클론주를 생성시키는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 재프로그래밍된 세포의 게놈-조작 전에 비-만능 세포를 재프로그래밍하고, 이에 의해서 iPSC 또는 덜 분화된 세포를 후속 게놈 편집을 위해서 먼저 수득하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한 비-만능 세포의 게놈-조작 후에 비-만능 세포를 프로그래밍하고, 이의 의해서 게놈 조작된 비-만능 세포를 후속 세포 재프로그래밍을 위해서 먼저 수득하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 비-만능 세포의 게놈-조작과 병행하여에 비-만능 세포를 재프로그래밍하고, 이에 의해서 중간 세포를 재프로그래밍 또는 게놈-조작 둘 중 하나로부터 또는 그것을 위해서 단리하는 것이며, 두 공정은 세포의 단일 풀에서 동시에 일어난다.
본 발명의 목적은 동일한 선택된 부위에서 동일한 유전자 변형을 포함하는 iPSC 또는 덜 분화된 세포를 통해서 선택된 위치에서 하나 또는 몇몇 유전자 변형을 포함하는 CD34 세포, 조혈 내피 세포, HSC(조혈 줄기 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, 및 B 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 iPSC(또는 덜 분화된 세포) 유래된 비-만능 세포를 생성시키는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 덜 분화된 세포의 게놈-조작 이후에 전구체 및 만능 세포를 포함하는 덜 분화된 세포를 분화시키고, 이에 의해서 게놈 조작된 덜 분화된 세포를 후속 세포 분화를 위해서 먼저 수득하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 덜 분화된 세포의 게놈-조작과 병행하여 덜 분화된 세포를 분화시키고, 이에 의해서 중간 세포를 분화 또는 게놈-조작 중 어느 하나로부터 또는 이를 위해서 단리하지 않는 것이며, 두 공정은 세포의 단일 풀에서 동시에 일어난다.
본 발명의 일 양상은 통합 시 (1) 작제물 내에 포함된 1종 이상의 외인성 프로모터에, 또는 선택된 부위 내에 포함된 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 1종 이상의 관심 외인성 폴리뉴클레오타이드; 및 (2) iPSC; 및 후속으로 확장된 iPSC, iPSC로부터 유래된 분화된 세포 및/또는 그로부터의 탈분화된 세포 내의 선택된 부위에서의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합을 위해서, 선택된 부위에 특이적이고, 관심 외인성 폴리뉴클레오타이드에 플랭킹(flanking)된 상동성 아암의 쌍을 포함하는 작제물을 제공하고, 이들 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합되고, 기능성을 유지한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 링커 서열에 의해서 서로에 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 자가-절단 펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 유입 서열(IRES)을 제공한다. 일부 다른 실시형태에서, 상기 작제물은 마커를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 작제물은 선택된 부위에서 내인성 프로모터에 의해서 유도된 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 부위는 안전 하버(harbor) 유전자좌, 고발현 유전자좌, 일시적으로 발현되는 유전자좌, 또는 중단을 위한 유전자 유전자좌이다. 일부 실시형태에서, 안전 하버 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, -2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 유전자좌일 수 있다. 일부 실시형태에서, TAP1, TAP2 또는 타파신을 포함하는 중단을 위한 유전자 유전자좌, 또는 중단이 목적하는 세포 기능 또는 특성과 관련된 다른 관심 유전자, 예를 들어, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자가 있다.
상기 작제물의 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직-, 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다. 일 실시형태에서, 작제물 내에 포함된 외인성 프로모터는 CAG이다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 안전 스위치 단백질; 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드; 약물 표적 후보; 및 작제물과 통합된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존 중 하나 이상을 촉진시키는 단백질을 암호화한다. 일부 특정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 카스파제는 카스파제 9, 카스파제 3 또는 카스파제 7일 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 안전 스위치 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 작제물에서 CAG에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 일 양상은 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법을 제공하며, iPSC는 게놈 내의 하나 이상의 선택된 부위에서 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하고, 이 방법은 하기 (I), (II) 또는 (III)을 포함한다:
(I): 하기 (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 모두에 의해서, 임의의 순서로 iPSC를 유전자 조작하는 방법: (i) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하도록 제1항의 1종 이상의 작제물을 iPSC에 도입하는 단계; (ii) (a) 선택된 부위 인식이 가능한 1종 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위에서 하나 이상의 이중 가닥 브레이크를 iPSC 내에 도입하는 단계; 및 (b) 내인성 DNA 수선을 허용하여 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 단계 (I)(ii)(a)의 iPSC를 배양하고; 이에 의해서 적어도 하나의 기능적인 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계이되, 여기서 게놈-조작된 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화될 수 있는, 단계,
(II): (i) 비-만능 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜 비-만능 세포의 재프로그래밍을 개시하는 단계; 및 (ii) 단계 (II)(i)의 재프로그래밍 비-만능 세포에 (a) 및 (b): (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하기 위한 제1항의 1종 이상의 작제물; (b) 선택된 부위 인식이 가능한 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하는 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 브레이크 중 하나 또는 둘 모두를 임의의 순서로 도입하는 단계이되, 여기서 단계 (II)(ii)(b)의 세포를 내인성 DNA 수선을 허용하여 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 배양하고; 이에 의해서 적어도 하나의 기능성 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하고; 여기서 게놈-조작된 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화될 수 있는, 단계를 포함하는, 재프로그래밍 비-만능 세포를 유전자 조작하여 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 방법
(III): 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 재프로그래밍을 위해서 비-만능 세포를 유전자 조작하여 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 방법: (i) (a) 및 (b): (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하기 위한 제1항의 1종 이상의 작제물; (b) 선택된 부위 인식이 가능한 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하는 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 브레이크 중 하나 또는 둘 모두를 임의의 순서로 비-만능 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 단계 (III)(i)(b)의 세포를 내인성 DNA 수선을 허용하여 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 배양하는 단계; 및 (ii) 단계 (III)(i)의 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜, 선택된 부위에서 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하고; 이에 의해서 적어도 하나의 기능성 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계이되, 여기서 게놈-조작된 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화될 수 있는, 단계.
상기 방법의 일 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서의 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 게놈-조작된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입을 위한 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법을 사용하여 생성된 게놈-조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 또는 B-세포 CD20을 포함하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 게놈-조작된 iPSC가 2종 이상의 자살 유전자를 포함하는 경우, 자살 유전자는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된다.
일부 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 생성된 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 1종 이상의 내인성 유전자에서 in/del을 포함한다. 일부 실시형태에서, 파괴를 위한 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나를 포함한다.
추가의 일부 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 생성된 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드, 및 H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
추가로 일부 다른 실시형태에서, 접근법 (I), (II) 및/또는 (III)은 게놈-조작된 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜, 게놈-조작된 iPSC의 만능성을 유지시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 수득된 게놈 조작된 iPSC는 기능성이고, 분화 효력이 있고, 동일한 기능성의 게놈 편집을 포함하는 비-만능 세포로 분화할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기에 설명된 방법 중 임의의 하나로부터 생성된 게놈-조작된 iPSC를 제공한다. 일 실시형태에서, 생성된 게놈-조작된 iPSC는 상기에 제공된 작제물을 사용하여 도입된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 iPSC 내의 하나 이상의 선택된 부위에서 통합된다. 일 실시형태에서, 생성된 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자에서 포함된 하나 이상의 in/del을 포함한다. 일 실시형태에서, 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 하나 이상을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나의 결실 또는 감소된 발현을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중-, 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나 내에 도입 또는 증가된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입 또는 증가된 발현은 외인성 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 통합 또는 비-통합된 방법을 통해서이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 HLA 부류 I 및/또는 부류 II가 결핍된다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 B2M 널(null) 또는 저(low), TAP1 널 또는 저 및/또는 TAP2 널 또는 저를 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 통합 또는 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나; 또는 여기서 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 상기 세포 내에 포함된 비-발현 또는 저 발현 유전자로부터의 증가된 발현이다. 일부 실시형태에서, 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스, 에피솜 또는 플라스미드를 사용하여 도입된다.
일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 고 친화도 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 고 친화도 및 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16)를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 HLA-E를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 비-절단성 HLA-G를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 안전 스위치 단백질; 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드; 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 포함하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
추가의 일부 다른 실시형태에서, 1종 이상의 작제물 내에 포함된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합 시 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 다른 실시형태에서, iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 또는 B-세포 CD20을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 동일한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 적어도 2개의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 2개의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 일 실시형태에서, iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 2개의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제공된 방법을 사용하여 생성된 게놈-조작된 iPSC는 동일한 게놈 조작이 없는 iPSC와 비교할 때 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, 증가된 면역-내성, 또는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖고; 여기서 게놈-조작된 iPSC는 만능성을 유지하고; 여기서 게놈-조작된 iPSC는 동일한 기능적인 게놈 조작을 갖는 비-만능 세포로의 분화 가능성을 유지한다. 일 실시형태에서, 생성된 게놈-조작된 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화할 수 있고, 여기서 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포는 iPSC 내에 포함된 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함한다. 일 실시형태에서, 생성된 게놈-조작된 iPSC는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체; T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 비롯한, 조혈 계통 세포로 분화할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 (i) B2M 널 또는 저; (ii) TAP1 널 또는 저; (iii) TAP2 널 또는 저; (iv) 타파신 널 또는 저; (v) HLA-E 또는 비-절단성 HLA-E의 도입된 발현; (vi) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현; (vii) PDL1의 도입된 발현; (viii) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16); (ix) Fc 수용체;(x) T 세포 수용체(TCR); (xi) 키메라 항원 수용체(CAR); (xii) 안전 스위치 단백질을 발현하는 하나 이상의 자살 유전자; (xiii) 이중-, 다중-특이적 또는 보편적 관여자 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 제공한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 B2M 널, TAP1 널, TAP2 널, 또는 타파신 널이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, PDL1 및 hnCD16 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는, B2M 널이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, PDL1, hnCD16 및 CAR 중 하나 이상을 갖는 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, PDL1, hnCD16, CAR 및 적어도 하나의 안전 스위치 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 상기 세포 내에 포함된 비-발현 또는 저 발현 유전자 중 어느 하나로부터의 증가된 발현이다. 일부 다른 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 외인성 발현이다. 일부 실시형태에서, TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체, 또는 자살 유전자는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 동일한 유전자 조작이 없는 iPSC와 비교할 때 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖고; 여기서 게놈-조작된 iPSC는 만능성을 유지하고; 여기서 게놈-조작된 iPSC는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 비-만능 세포로의 분화 가능성을 유지한다.
HLA 부류 I 및/또는 II 결핍성이고, (1) 외인성 HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL,CD47, CD113 및 PDL1 중 하나 이상; 또는 (2) HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL, CD47, CD113 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현; 및 선택적으로 (3) TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 및 단일 또는 이중 안전 스위치 단백질 중 하나 이상을 추가로 포함하는 변형된 HLA 결핍 iPSC가 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 상기 세포 내에 포함된 비-발현 또는 저 발현 유전자 중 어느 하나로부터의 증가된 발현이다. 일 실시형태에서, 변형된 HLA 결핍 iPSC 내에 포함된 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 HLA 결핍 iPSC는 동일한 유전자 조작이 없는 iPSC와 비교할 때 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖고; 여기서 변형된 HLA 결핍 iPSC는 만능성을 유지하고; 여기서 변형된 HLA 결핍 iPSC는 HLA 결핍성이고, 동일한 기능적인 게놈 조작을 갖는 비-만능 세포로의 분화 가능성을 유지한다.
본 발명의 또 다른 양상은 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 상기에 제공된 바와 같은 게놈-조작된 iPSC 또는 변형된 HLA 결핍 iPSC를 수득하는 단계로서, iPSC는 적어도 하나의 기능성 게놈 편집을 포함하는, 단계; 및 (ii) 게놈-조작된 iPSC 또는 변형된 HLA 결핍 iPSC를 분화시켜 게놈-조작된 iPSC 내에 포함된 동일한 기능성의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 유래된 비-만능 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분화 단계는 배상체 형성을 필요로 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 분화 피더(feeder) 무함유, 기질(stromal) 무함유, 또는 무-혈청이다. 일부 실시형태에서, 유래된 비-만능 세포는 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유래된 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 iPSC로부터 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 계통 특이적 분화를 개시하기에 충분한 조건 하에 iPSC를 적용하는 단계; 및 (ii) 단계 (i)의 분화 세포를 유전자 조작하여 (a) 및 (b): (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하도록 단계 (i)의 분화 세포에 제1항의 1종 이상의 작제물을 도입하는 것; (b)(1) 단계 (i)의 분화 세포에 선택된 부위 인식이 가능한 1종 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하는 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 브레이크를 도입하고; (2) 내인성 DNA 수선을 허용하여 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 단계 (ii)(b)(1)로부터의 세포를 배양하고; 이에 의해서 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 기능성 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 비-만능 세포를 수득하는 것 중 하나 또는 둘 모두의 임의의 순서에 의해서 게놈-조작된 비-만능 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함한다.
본 발명은 상기 일반 방법을 사용하여 생성된 iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포를 추가로 제공하며, 생성된 비-만능 세포는 하나 이상의 기능성 표적화된 게놈 편집을 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 중배엽 세포, 조혈 내피 세포, CD34 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 안전 스위치 단백질; 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드; 약물 표적 후보; 또는 비-만능 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 포함하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 비-만능 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 포함한다. 일부 구체적인 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 하나 이상의 in/del을 갖는 내인성 유전자를 포함하며, 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 또는 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나 내에 결실 또는 감소된 발현을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나에서 도입된 또는 증가된 발현을 포함한다.
추가의 일부 다른 실시형태에서, 제54항 내지 제60항 중 어느 것의 iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포이고, 여기서 비-만능 세포는 (i) 각각 동일한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 적어도 2개의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 외인성 폴리뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질을 암호화하거나; 또는 (ii) 각각 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 적어도 2개의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 여기서 외인성 폴리뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질을 암호화한다. iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포의 일부 실시형태에서에서, 안전 스위치 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 및 이들의 조합물로부터 선택된다. iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포의 일부 실시형태에서에서, 안전 하버 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 iPSC로 재프로그래밍될 수 있고, 여기서 iPSC는 비-만능 세포 내에 포함된 동일한 기능성의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포의 일부 실시형태에서, 이로부터 재프로그래밍된 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화될 수 있다. 추가의 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 상이한 운명의 비-만능 세포로 교차분화될 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포를 제공하며, 이것은 (i) B2M 널 또는 저; (ii) TAP1 널 또는 저; (iii) TAP2 널 또는 저; (iv) 타파신 널 또는 저; (v) HLA-E 또는 비-절단성 HLA-E의 도입된 발현; (vi) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현; (vii) PDL1의 도입된 발현; (viii) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16); (ix) Fc 수용체; (x) T 세포 수용체(TCR); (xi) 키메라 항원 수용체(CAR); (xii) 안전 스위치 단백질을 발현하는 하나 이상의 자살 유전자; (xiii) 이중-, 다중-특이적 또는 보편적 관여자 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 B2M 널, TAP1 널, TAP2 널 또는 타파신 널이다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 HLA-E, HLA-G, PDL1 및 hnCD16 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 HLA-E, HLA-G, PDL1, hnCD16 및 CAR 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 HLA-E, HLA-G, PDL1, hnCD16, CAR 및 적어도 하나의 안전 스위치 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 상기 세포 내에 포함된 비-발현 또는 저 발현 유전자 중 어느 하나로부터의 증가된 발현이다. 일부 다른 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 외인성 발현이다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포 내에 포함된 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자 유도성이다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖고; 덜 분화된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 동일한 기능성의 게놈 조직을 갖는 더 분화된 조혈 계통 세포로의 분화 가능성을 갖는다.
본 발명은 추가로 (a) iPSC 유래된 게놈-조작된 CD34 세포; (b) iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 줄기 및 전구 세포; (C) iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 다능성 전구 세포; (d) iPSC 유래된 게놈-조작된 T 세포 전구체; (e) iPSC 유래된 게놈-조작된 NK 세포 전구체; (f) iPSC 유래된 게놈-조작된 T 세포; (g) 상기에 기술된 바와 같은 iPSC 유래된 게놈-조작된 NK 세포 및 이들의 조합물을 포함하는 iPSC 유래 조혈 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
(i) B2M 널 또는 저; (ii) TAP1 널 또는 저; (iii) TAP2 널 또는 저; (iv) 타파신 널 또는 저; (v) HLA-E 또는 비-절단성 HLA-E의 도입된 발현; (vi) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현; (vii) PDL1의 도입된 발현; (viii) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16); (ix) Fc 수용체;(x) T 세포 수용체(TCR); (xi) 키메라 항원 수용체(CAR); (xii) 안전 스위치 단백질을 발현하는 하나 이상의 자살 유전자; (xiii) 이중-, 다중-특이적 또는 보편적 관여자 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 게놈-조작된 조혈 계통 세포가 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 B2M 널, TAP1 널, TAP2 널 또는 타파신 널이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 HLA-E, HLA-G, PDL1 및 hnCD16 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 HLA-E, HLA-G, PDL1, hnCD16 및 CAR 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 HLA-E, HLA-G, PDL1, hnCD16, CAR 및 적어도 하나의 안전 스위치 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 갖는 B2M 널이다. 일부 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 상기 세포 내에 포함된 비-발현 또는 저 발현 유전자 중 어느 하나로부터의 증가된 발현이다. 일부 다른 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 외인성 발현이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 조혈 계통 세포 내에 포함된 TCR, CAR 또는 자살 유전자는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖고; 덜 분화된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 보다 분화된 조혈 계통 세포로의 분화 가능성을 유지한다.
HLA 부류 I 및/또는 II 결핍성이고, (1) 외인성 HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL,CD47, CD113 및 PDL1 중 하나 이상; 또는 (2) HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL,CD47, CD113 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현; 및 선택적으로 (3) TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 및 단일 또는 이중 안전 스위치 단백질 중 하나 이상을 포함하는 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포가 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 도입된 발현은 상기 세포 내에 포함된 비-발현 또는 저 발현 유전자 중 어느 하나로부터의 증가된 발현이다. 일부 실시형태에서, 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포 내에 포함된 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖고; 여기서 덜 분화된 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 보다 분화된 조혈 계통 세포로의 분화 가능성을 유지한다.
본 발명의 다른 양상은 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 (i) 세포가 게놈 내의 하나 이상의 선택된 부위에서 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 게놈-조작된 비-만능 세포; (ii) 1종 이상의 재프로그래밍 인자; 및 선택적으로, (iii) TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물을 포함하며, 여기서 조성물은 게놈-조작된 비-만능 세포 내에 포함된 동일한 표적화된 게놈 편집을 포함하는 iPSC를 수득하기에 유용하다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서의 상기 세포의 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 비-만능 세포 및 이들의 재프로그래밍된 iPSC의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다.
조성물의 일부 실시형태에서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 조성물의 일부 실시형태에서, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 삽입 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 조성물의 추가의 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 조성물의 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌, 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌 내에 통합된 2종 이상의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 조성물의 특정 일 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 조성물의 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 비-만능 세포 및 이로부터의 iPSC의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 포함한다.
조성물의 일부 실시형태에서, in/del을 갖는 파괴를 위한 1종 이상의 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자로부터 선택된다. 조성물의 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나 내에 결실 또는 감소된 발현을 포함한다. 조성물의 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나 내에 도입 또는 증가된 발현을 포함한다. 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 도입 또는 증가된 발현은 외인성 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 통합 또는 비-통합된 방법을 통해서이다. 일부 실시형태에서, 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스 또는 에피솜 또는 플라스미드를 사용하여 도입된다. 조성물의 일 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA 부류 I 및/또는 부류 II 결핍성이다. 일 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 B2M 널 또는 저, TAP1 널 또는 저, TAP2 널 또는 저 및/또는 타파신 널 또는 저를 포함한다. 조성물의 일부 다른 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 통합 또는 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스또는 에피솜 또는 플라스미드를 사용하여 도입된다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 포함하며, 여기서 상기 도입된 발현은 상기 세포 내에 포함된 비-발현 또는 저 발현 유전자 중 어느 하나로부터의 증가된 발현이다. 조성물의 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 고 친화도 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 고 친화도 및 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16)를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 HLA-E를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 비-절단성 HLA-G를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 조성물의 추가의 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함한다. 조성물의 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 비-만능 세포는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖거나; 또는 여기서 게놈-조작된 비-만능 세포는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물을 제공하며, 이 조성물은 (i) 비-만능 세포; (ii) 하나 이상의 선택된 유전좌에서의 표적화된 편집을 위한 1종 이상의 작제물; (iii) 1종 이상의 재프로그래밍 인자; 및 선택적으로, (iv) TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물을 포함하며, 여기서 조성물은 표적화된 게놈 편집을 포함하는 iPSC를 수득하기에 유용하고, 이에 의해서 게놈-조작된 iPSC는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖거나; 또는 여기서 게놈-조작된 iPSC는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 선택된 부위에서 이중 가닥 브레이크를 도입하기 위한 선택된 부위 인식이 가능한 1종 이상의 엔도뉴클레아제; 및/또는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 비-만능 세포 재프로그래밍된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모에 작동 가능하게 연결된다. 조성물의 일부 실시형태에서, 수득된 게놈-조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 수득된 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌 내에 통합된 2종 이상의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질을 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, 수득된 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, 수득된 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질에 연관된 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 in/del을 포함하는 수득된 게놈-조작된 iPSC는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 하나 이상을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물의 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 수득된 게놈-조작된 iPSC의 만능성을 유지하기 위해서 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 게놈-조작된 iPSC를 유지하기 위한 조성물을 포함하고, 조성물은 (i) 게놈-조작된 iPSC, 및 (ii) MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 재프로그래밍 게놈-조작된 비-만능 세포로부터 수득되고, 여기서 수득된 iPSC는 게놈-조작된 비-만능 세포 내의 선택된 부위에서 동일한 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 도입함으로써 클론성 iPSC 또는 iPSC의 풀을 유전자 조작함으로써 수득되다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자와 접촉된 재프로그래밍 비-만능 세포의 풀에 하나 이상의 선택된 부위에서의 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 도입함으로써 게놈 조작으로부터 수득된다.
조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 비-만능 세포 재프로그래밍된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 비-만능 세포 재프로그래밍된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 1종 이상의 내인성 유전자에서의 in/del을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 선택된 부위에서 이중 가닥 브레이크를 도입하기 위해서 선택된 부위 인식이 가능한 1종 이상의 엔도뉴클레아제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 및 이들의 조합물로부터 선택된 안전 스위치 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1를 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌 내에 통합된 2종 이상의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 유전자를 포함하고, H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 하나 이상의 in/del을 포함하고, 이것은 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나 내에 결실 또는 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나 내에 도입 또는 증가된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 외인성 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해서 통합 또는 비-통합된 방법을 통한 도입 또는 증가된 발현을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA 부류 I 및/또는 부류 II 결핍성이다. 일부 실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 B2M 널 또는 저, TAP1 널 또는 저 및/또는 TAP2 널 또는 저를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 통합 또는 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나; 또는 여기서 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 상기게놈-조작된 iPSC는 고 친화도 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 고 친화도 및 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16)를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 HLA-E를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 비-절단성 HLA-G를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖거나; 또는 여기서 게놈-조작된 iPSC는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 동일한 기능성의 표적화된 게놈 편집을 갖는 조혈 계통 세포를 포함하는 비-만능 세포로 분화할 가능성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물의 상기 게놈-조작된 iPSC는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포로 분화할 가능성을 갖는다.
추가로 본 발명에는 (i) 본 발명에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 의해서 제공된 바와 같은 게놈-조작된 iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, 게놈-조작된 비-만능 세포, 게놈-조작된 조혈 계통 세포, 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포의 하나 이상의 집단 또는 이들의 임의의 조합물; 및 (ii) 약제학적으로 허용 가능한 배지를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈 계통 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함한다.
추가로 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입함으로써 상기 약제학적 조성물의 치료적 용도가 제공되며, 여기서 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 연관된 암 또는 감염을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여 그로부터 게놈-조작된 iPSC 유래된 비-만능 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
이의 다양한 목적 및 이점은 첨부된 도면과 함께 제공된 하기 설명으로부터 명백할 것이며, 여기서 예시 및 예의 방식에 의해서 본 발명의 특정 실시형태가 언급되어 있다.
도 1은 자살 유전자가 AP1903에 활성화된 경우 CMV 프로모터 유도된 iCasp9 자살 유전자 및 세포 반응의 AAVS1 안전 하버 표적화된 삽입의 그래프 표현. A. AAVS1 유전자좌를 표적으로 하도록 설계된 공여자 작제물, AAVS1-G1.0의 도면. B. AAVS1 유전자좌 및 공여자 작제물에 특이적인 ZFN으로 형질주입된 퓨로마이신 선택된 293T 세포에서 GFP 발현을 위한 유세포 분석법. C. 퓨로-선택된 293T 세포를 24시간 동안 AP1903(또는 DMSO 대조군) 처리에 적용하였다. 처리된 세포를 수거하고, 7AAD(막-손상된 죽은 세포를 염색함)로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 7AAD 음성 세포(아마도 살아있는 세포) 백분율을 각각의 처리(n=2)에 대해서 플롯팅하였다. 유의한 세포 죽음을 AP1903 처리 후 검출하였다. D. 퓨로-선택된 293T 세포로부터의 게놈 DNA의 정션 PCR은 AAVS1 유전자좌로의 공여자 벡터의 표적화된 삽입을 나타내었다. E. hiPSC에 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 CMV-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물(AAVS1-G1.0)을 형질주입하였다. 퓨로-내성 세포를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. GFP 강도를 기반으로 3개의 집단을 분류하고, 추가 분석을 위해서 확장시켰다. F. 분류 및 확장된 GFP(음성), GFP(저) 및 GFP(고) 집단에 24시간 동안 AP1903(또는 DMSO 대조군) 처리를 적용하였다. 처리된 세포를 수거하고, 7AAD로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 7AAD 음성 세포(살아있는 세포) 백분율을 각각의 처리에 대해서 플롯팅하였다. G. 퓨로-선택 및 분류된 hiPSC로부터의 게놈 DNA의 정션 PCR은 GFP(음성) 또는 GFP(고) 집단에서가 아니라 GFP(저)에서 AAVS1 유전자좌로의 공여자 벡터의 표적화된 삽입을 나타내었다.
도 2는 hiPSC에서 다양한 내인성 프로모터 및 외인성 프로모터 하에서 iCasp9의 안전 하버 유전자좌 표적화된 삽입의 그래프 표현. A. 유전자 발현을 유도하는 AAVS1 프로모터를 사용하여 AAVs1 유전자좌를 표적화하도록 설계된 작제물의 도면. B. hiPSC에 AAVS1 내인성 프로모터의 제어 하에서 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 형질주입하였고; 퓨로-내성 세포를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. C. 확장된 퓨로-내성 iPSC를 24시간 동안 AP1903(또는 DMSO 대조군) 처리에 적용하였다. 처리된 세포를 수거하고,7AAD로 염색하였다. 7AAD 음성 세포 백분율을 각각의 처리에 대해서 플롯팅하였다. D. 퓨로-내성 풀로부터의 게놈 DNA의 정션 PCR은 이러한 집단에서 AAVS1 유전자좌로의 공여자 벡터의 표적화된 삽입을 나타내었다. E. 다양한 프로모터를 사용하여 AAVs1 유전자좌를 표적화하도록 설계된 작제몰의 도면. F. hiPSC에 다양한 내인성 프로모터 및 외인성 프로모터의 제어 하에서 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 형질주입하고, 퓨로-내성 세포를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다.
도 3은 iPSC에서 AAVS1 안전 하버로의 EF1α 프로모터-유도된 iCasp9의 표적화된 삽입의 그래프 표현. A. AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 EF1a-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물로 형질주입된 hiPSC(도 2)를 퓨로마이신 선택시킨 후 AP1903으로 처리하였다. 게이팅된 면적은 AP1903 세포사 유도에 반응성인 GFP 양성 세포를 강조한다. B. TRA181 및 GFP 양성 hiPSC를 96-웰 플레이트 내에서 벌크 또는 개별적으로 분류하였다. C. GFP 양성 벌크-분류된 hiPSC를 퓨로마이신-무함유 배지 중에서 시간에 따라서 유지시켜 시간에 따른 집단 프로파일을 결정하였다. D. 단일 세포로부터 유래된 클론성 hiPSC의 명시야 영상은 TRA181 세포 및 GFP 세포를 분류하였다. E. 클론성 hiPSC가 확장되었고, GFP 발현은 확장 후에 다양한 정도로 손실된다.
도 4는 hiPSC에서 AAVS1 안전 하버로의 CAG 프로모터-유도된 iCasp9의 표적화된 삽입의 그래프 표현. A. hiPSC에 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 CAG-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 형질주입하였다(도 2 참고). 퓨로-내성 세포를 96-웰 플레이트 내에서 벌크로 또는 개별적으로 분류하였다. B. GFP+ 벌크-분류된 iPSC를 퓨로마이신-무함유 배지 중에 21일 동안 유지시킨 후, 유세포 분석법에 의해서 GFP 발현에 대해서 분석하였다. C. AP1903로 처리되는 경우, GFP 양성 세포는 7AAD-염색 양성이 된다. D. 개별 분류 후 전형적인 집락의 명시야 영상. E. 단일 세포로부터 기원한 집락을 확장시켰고, 유세포 분석법 평가는 높은 GFP 및 TRA181 발현을 나타내었다. F. 선택된 클론의 평균 형광 강도. G. 모 hiPSC 집단 풀 및 CAG hiPSC 집단 풀 둘 모두에서 공여자 작제물과 AAVS1 유전자좌의 상동 재조합을 검출하기 위한 게놈 DNA의 정션 PCR.
도 5는 CAG-hiPSC 클론의 만능성 특징규명의 그래프 표현. A. 피더 무함유 배양물 상에 유지된 CAG 클론 C38의 대표적인 영상. B. 만능성 마커 NANOG 및 OCT4의 면역형광 염색. C. 다양한 내인성 만능성 마커의 발현에 대한 정량분석 RT-PCR. D. 선택된 CAG 클론은 계통 특이적 분화에 관한 것이었고, 계통 마커, Nestin, 외배엽; αSMA, 중배엽, SOX17, 내배엽에 대해서 평가하였다. E. CAG-C38을 다양한 계통으로 이루어진 테라토마를 상승시키는 이의 능력에 대해서 평가하였다. 테라토마를 주사 6주 후에 수거하였다.
도 6은 AAVS1 유전자좌로 표적화된 CAG-유도된 iCasp9를 사용한 만능 상태 및 분화된 상태 둘 모두에서 hiPSC 클론의 유도된 자살 유전자 매개된 사멸의 그래프 표현. A. 20개의 CAG-iCasp9 표적화된 hiPSC 클론을 24시간 동안 AP1903(또는 DMSO 대조군)으로 처리하고, 이어서 유세포 분석법에 의해서 GFP 및 7AAD 염색에 대해서 평가하였다. 클론 CAG-C5 및 -C38로부터의 유세포 분석법 플롯을 또한 이 도면에 나타내었다. B. 15개의 CAG-iCasp9 표적화된 iPSC 클론 중 하나가 AP1903(10nM) 처리 후에 살아남았다. C. AP1903(10nM) 처리 후 10cm 접시 상에서의 CAG-C5 살아있는 세포 피복 속도론(coverage kinetics). D. CAG-iCasp9 표적화된 hiPSC 클론을 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 세포로 분화하도록 유도하고, 각각을 AP1903으로 처리하고, 그 후 회수 및 분화시켰다. 처리 전 및 회수 후 복제 웰을 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 영상화하였다. CAG-C5 클론으로부터의 영상을 대표로서 나타내었다. E. CAG-iCasp9 표적화된 hiPSC 클론을, 48시간 동안 AP1903으로 처리된 CD34+ 세포로 분화하도록 유도하고, 유세포 분석법으로 세포사에 대해서 분석하였다.
도 7은 iCasp9-iPSC 클론으로부터 유래된 테라토마의 생체내 AP1903-유도된 퇴보의 그래프 표현. A. NSG 마우스 연구에서 피하 주사 위치의 도면. B. 모 hiPSC 주 및 CAG-C38 클론을 7 내지 11일에 AP1903(i.p. 총 200㎍)으로 처리한 후 34일에 수확된 테라토마의 영상. C. 수거된 테라토마를 체적에 대해서 측정하였다. D. 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 모 hiPSC 또는 CAG-C38 주로부터 유래된 수거된 테라토마. 모 hiPSC 주는 대부분 삼계통 분화된 세포 유형을 나타내지만, CAG-C38은 대부분 매우 조직화된 지방-유사 세포로 이루어진 것으로 보인다. E. 모 hiPSC 주 및 CAG 클론을 4E6 세포에서 주사하고, AP1903(i.p. 총 200㎍)로 40 내지 46일에 처리하였다. 모든 종양을 체적에 대해서 일상적으로 측정하였다.
도 8은 탈출된 클론의 특징규명의 그래프 표현. A. AP1903 처리에 살아남은 클론을 선택하는 방법의 도면. B. iCasp9 이식유전자의 PCR 증폭, 그 다음 임의의 서열 변경이 있는지를 결정하기 위한 정제 및 게놈 서열결정. C. 탈출된 클론의 유세포 분석법 평가는 높은 GFP 및 TRA181 발현을 나타내었다. D. 서열결정된 모든 클론에서 한점 돌연변이 K189E의 식별. E. K189E가 불응성(refractory) 클론에 대한 직접적인 이유인지를 식별하기 위해서, iCasp9 돌연변이 형태를 생성하고, 시험하였다. F. iCasp9 돌연변이 이식유전자가 AP1903 처리에 살아남은 것에 대한 이유인 것으로 확인되었다.
도 9는 iCasp9의 표적화되거나 또는 뉴클레아제-독립적인 삽입을 위해서 CRISPR/Cas9를 사용한 인간 ROSA26 유전자좌의 게놈 편집의 그래프 표현. A. CRISPR/Cas9를 사용하여 ROSA26 유전자좌를 표적화하는 작제물 설계의 도면. B. hiPSC에 ROSA26 유전자에 특이적인 gRNA/Cas9-RFP 플라스미드 및 A에 도시된 바와 같은CAG-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 형질주입하였다. 형질주입 2일 후, 세포 집단을 유세포 분석법에 의해서 GFP 발현에 대해서 분석하여 형질주입 효율을 결정하였다(약 89%). 형질주입 20일 후 퓨로-내성 세포를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. C. 작제물로 형질주입된 293개의 T 세포에서의 AP1903 유도된 세포사. D. 293개의 T 세포에서의 작제물의 표적화된 삽입. E. 표적화된 세포가 풍부해지도록 선택된 작제물 및 퓨로마이신으로 형질주입된 hiPSC.
도 10은 단일-대립유전자성 및 이중대립유전자성 iCasp9 표적화된 통합을 갖는 iPSC 클론의 생성의 그래프 표현. A. 제시된 CAG 프로모터-유도된 iCasp9 클론에서 이식유전자(iCasp9-GFP) 카피수의 정량분석 PCR-기반 평가. B. 유세포 분석법에 의해서 측정된 바와 같은 분류된 풀링된 배양물(흑색) 또는 단일대립유전자성(밝은 회색) 또는 이중대립유전자성 (어두운 회색) iCasp9 표적화된 삽입을 갖는 클론에서의 iCasp9-GFP의 평균 형광 강도(MFI). C. 표적화된 풀링된 세포 및 클론에서 AAVS1-이식유전자 정션을 중첩시킨 프라이머를 사용한 이식유전자 통합의 PCR 분석. D. PCR-기반 방법 및 AAVS1 통합 부위에 대해서 특이적인 프라이머를 사용한 AAVS1 대립유전자로의 표적화된 통합의 수의 평가. E. 라이브 세포 영상화를 사용한 10nM AP1903를 첨가한 직후 비분류된 표적화된 풀 세포, iCasp9-GFP 및 클론성 CAG-C38 및 CAG-C5 세포주에 대해서 분류된 표적화된 풀 세포에 의한 플레이트 표면 피복률의 평가.
도 11은 외인성 CAG 프로모터가 확립된 iPSC-유래 테라토마의 iCasp9-매개된 제거를 가능하게 함을 나타낸 그래프 표현. A. 연구 설계의 개략적인 설명. B. AP1903 투여 전 및 마지막 투여 3일 후(125㎍ i.p. 19일 내지 25일로부터, 하단 패널) NSG 마우스(n=2)의 제시된 3개의 군의 생물발광 영상화. C. 평균 및 SD로서 나타낸 제시된 세포 유형으로부터의 테라토마에 대한 총 플럭스(광자/s). D. 제시된 세포 유형에 대한 치료 후 대 치료 전의 총 플럭스의 비(평균 -/+SD). E. 클론성 CAG-C38 및 CAG 풀링된 세포 둘 모두가 주사된 마우스에 대한 결과. F. 제시된 세포 유형으로부터 유래된 테라토마의 최종 체적(28일). G. 28일에 테라토마의 영상. CAG-C38 클론 또는 CAG-iCasp9 풀링된 세포가 주입된 측부로부터는 테라토마가 검출되지 않았다. * p값 < 0.05, 언페어드 T-검증에 의해서 측정. ns; 유의하지 않음.
도 12는 단일-대립유전자성 iCasp9 클론의 것보다 더 효율적인 이식된 이중대립유전자성 iCasp9 클론의 유도성 사멸을 나타낸 그래프 표현. A. 연구 설계의 개략적인 설명. B. iPSC 이식 후 7, 14 및 42일에 제시된 세포 유형(이중대립유전자성 CAG-C5 클론, 단일-대립유전자성 CAG-C38 클론 및 모 iPSC)이 이식된 NSG 마우스의 생물발광 영상화. 7일의 영상화는 AP1903 투여(125㎍ i.p.; 7 내지 13일) 직전에 수행하였다. C. 하부 패널은 발견된 경우, 42일에 수집된 테라토마의 영상을 나타낸다. D. 평균 및 SD로서 나타낸 제시된 군으로부터의 테라토마에 대한 총 플럭스(광자/s). * p 값 < 0.05; ** p 값 <0.01; *** ** p 값 <0.001, 언페어드 T-검증에 의해서 측정, ns; 유의하지 않음.
도 13은 별개의 안전 하버 유전자좌 내의 표적화된 이중 자살 유전자를 갖는 안전 보호 시스템(safe guard system)의 생성을 나타낸 그래프 표현. A. sr39TK, sr39TK-불라스티시딘(Bsd) 정션 또는 내인성 H11 서열-이식유전자 정션에 특이적인 프라이머를 사용한 H11 안전 하버 유전자좌로의 sr39TK의 특이적 게놈 통합의 PCR 분석. GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용한다. B. (i) GCV 또는 AP1903 처리 중 어느 하나도 없이 성장시킨; (ii) 2일 동안 AP1903 단독으로 처리된; (iii) 9일 동안 GCV 단독으로 처리된; 및 (iv) 2일 동안 AP1903 및 GCV 둘 모두로 동시 처리하고, 이어서 AP1903을 세척 제거하고, 7일 더 동안 GCF로의 처리를 계속한 H11 유전자좌로의 sr39TK의 표적화된 삽입을 갖는 CAG-C38 iCasp9 iPSC 클론.
도 14는 B2M-/-, HLA I-결핍 iPSC의 생성의 그래프 표현. A. 형질주입 전(좌측 패널) 및 후(중간 패널)에 GFP 및 B2M 및 HLA-I 발현의 유세포 분석법 분석. B2M 및 HLA-I에 대해서 음성인 세포를 벌크로 분류하였다(우측 패녈). B. 96-웰 플레이트 내에서 클론성으로 분류된 B2M 및 HLA-I 음성 세포의 유세포 분석법 분석.
도 15는 B2M-/-, HLA I-결핍 iPSC의 개선된 지속성의 그래프 표현. A. 프라이밍된 T 세포에 의해서 사멸되지 않는 B2M-/- hiPSC. B. 단일 웰에서 NK 세포에 의한 공배양물에서 인식되지 않는 B2M-/- hiPSC. C. 별개의 웰에서 NK 세포에 의한 공배양물에서 인식되지 않는 B2M-/- hiPSC. D. B2M-/- hiPSC는 면역적격 마우스에서 획득된 지속성을 갖는다.
도 16는 iPSC 상에서의 HLA 부류 I의 조정이 면역적격 수용자에서 iPSC 지속성을 증가시킨 것을 나타낸 도면. A. 유전자 조작된 HLA-변형된 iPSC는 세포 표면 상에서 HLA-E를 발현하고, 만능 표현형을 유지한다. B. 야생형 iPSC와 비교할 때 증가된 지속성을 나타낸 B2M-/-HLAE iPSC로의 주사 후 72시간에 테라토마의 생체내 루시페린 영상화.
도 17은 고-친화도 비-절단성 CD16 수용체 및 41BBL 공-자극 분자를 발현하도록 유전자 조작된 iPSC가 iCD34 세포로의 분화 전체에서 발현을 보유하는 것을 나타낸 도면. A. 0일 미분화된 세포 B. 10일 분화된 세포.
도 18은 FTV106으로 유전자 조작된 T 세포로부터 유래된 iPSC에서 CAR(FTV106) 통합의 PCR 분석에 의해서 기원 T 세포의 동일한 유전자 각인을 보유한 iPSC(TiPSC)로의 CAR-T 세포의 재프로그래밍을 나타낸 도면.
도 19는 CAR에 대한 공동-식별자로서 CD19 키메라 항원 수용체(CAR) 및 절두된 LNGFR 세포 표면 마커를 발현하도록 유전자 조작된 iPSC가 iCD34 세포로의 분화를 통한 발현을 보유하는 것을 나타낸 도면. A. 0일 미분화된 세포 B. 10일 분화된 세포.
도 20은 내인성 TCR 프로모터에 의해서 유도된 CAR의 세포 유형 특이적 발현, 및 CAR의 유전자좌 특이적 삽입으로 인한 TCR의 발현 및 기능 녹-아웃(knock-아웃)을 나타낸 도면.
도 21은 면역억제 단백질을 발현하도록 조작된 hiPSC가 CD34 세포를 생성할 수 있음을 나타낸 도면: A. 변형된 HLA I-결핍 iPSC의 세포 표면 상에서의 HLAE, HLAG 및 PDL1의 발현; B. 모든 변형된 HLA I-결핍 iPSC는 분화 배양 10일 후에 CD34+ HE로 분화한다.
도 22는 면역억제 단백질을 발현하도록 조작된 hiPSC가 조혈 계통 세포를 생성할 수 있음을 나타낸 도면.
도 23은 조작된 비-고전적 HLA 면역억제 단백질의 발현이 hiPSC의 조혈 분화 동안 하향조절됨을 나타낸 도면: A. PDL1 발현이 유지되는 동안 HLA-E 및 HLA-G 단백질이 존재하지 않음; B. 단백질 셰딩(shedding)을 나타낸 상청액 분획 중에서의 HLA-E 및 HLA-G 단백질.
도 24는 hiPSC에서 비-절단성 HLAG 융합 단백질의 설계 및 발현을 나타낸 도면. A. HLA-E/B2M 및 HLA-G/B2M 융합 단백질의 절단-내성 형태의 설계; B. HLA-G/HLA-A3 비-절단성 단백질은 iPSC의 품질에 영향을 미치지 않으면서 세포 표면 상에서 발현된다.
도 25는 HLA 부류 I의 감소된 발현을 나타낸 TAP2-/- iPSC의 생성을 나타낸 도면: A. 모 FTi121과 비교할 때 HLA 부류 I 발현에서 유의한 감소를 나타낸 2개의 선택된 클론의 유세포 분석법 분석; B. IFNγ로의 치료 이후에 TAP2-/- 클론은 야생형 FTi121과 비교할 때 HLA 부류 I의 감소된 발현을 나타낸다.
도 26은 숙주 NK 세포가 면역적격 수용자에서 hiPSC 테라토마 거부반응에 기여하는 것을 나타낸 도면: A. 항체 주사 3일 후 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포의 부재; B. iPSC 주사 후 120시간에 NK 고갈된 마우스는 IgG 대조군 치료된 동물과 비교할 때 종양 거부반응에 대한 최고 내성을 나타내었다.
도 27은 변형된 HLA I-결핍 iPSC가 시험관내에서 증가된 지속성 및 내성을 가짐을 나타낸 도면. hiPSC-유래 세포 상의 면역억제 단백질의 발현은 A. purified 동종이계 인간 T 세포; B. PBMC 동종이계 인간 T 세포; C. PBMC 동종이계 인간 NK 세포의 인식 및 증식을 예방한다.
도 28은 hnCD16 단백질의 발현이 조작된 iPSC의 조혈 분화 가능성에 영향을 주지 않음을 나타낸 도면. A. hnCD16 표면 발현을 갖는 조작된 iNK 세포; B. hnCD16은 유전자 조작된 iPSC로부터 유래된 iNK 상에서 구성적으로 발현되고 계속적으로 유지된다.
도 29는 hnCD16-발현 iNK 세포의 향상된 기능성을 나타낸 도면: A. hnCD16-발현 iNK 세포에서 CD16 자극에 의해서 유도된 향상된 사이토카인 생산; B. hnCD16은 hnCD16-발현 iNK 세포의 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 향상시킨다.
도 30은 iNK 세포 확장의 방식에 의한 iPSC-유래 iNK 세포의 품질을 나타낸 도면.
도 31은 iNK 세포가 성인 NK 세포에 비해서 더 긴 말단소체를 갖는 것을 나타낸 도면.
도 32는 독시사이클린-유도성 CAR로 유전자 조작된 iPSC 주에서 Tet-유도성 CAR-2A-LNGFR 발현을 나타낸 도면: A. TetCAR iPSC에서의 유도성 CD19CAR 발현; B. iNK-매개된 세포독성을 유세포 분석법에 의해서 표적 세포 상에서의 카스파제-3의 발현에 대해서 평가하였고, iNK 세포독성은 유도성 CD19CAR 발현에 의해서 향상되었다.
도 33은 iPSC에서 Cre 또는 독시사이클린 유도성 발현을 도시한 도면: A. 중단 코돈이 제거되고, CAR 발현이 A. 1회 Cre 재조합효소 유도 시에 활성화된다; B. 독시사이클린 유도.
도 34는 파괴를 위해서 선택된 유전자 유전자좌에서 관심 유전자의 삽입 및 유전자 편집 후 hiPSC 클론성 선택을 도시한 도면: A. B2M 유전자좌에서 관심 유전자를 삽입하기 위한 표적 벡터 및 공여자 벡터에 대한 작제물 설계; B. 삽입을 위해서 선택된 유전자좌에서 선택 유전자를 함유한 클론성 집단에 대한 유전자 편집 이후의 hiPSC.
도 35는 proT 세포에서 유세포 분석법에 의한 CD34 및 CD7의 iProT 전환, 냉동보존, 및 발현을 나타낸 도면: A. proT 세포 단리 이전; B. 해동 3일 후; C. 냉동보존 10+13일; D. 냉동보존되지 않은 것; E. proT 세포는 해동 후 살아있고, T 세포 분화 배지에서 배영되는 경우 증가된 세포 증식을 나타낸다.
도 36은 iPSC- 및 CB-유래 ProT 세포의 기능적 특징규명: 사이토카인 방출 및 주화성(chemotaxis)을 나타낸 도면: A. iPSC-유래 ProT 세포는 CCL21 및 SDF를 향해서 성공적으로 이동할 수 있다; B. iPSC-유래 proT 세포는 IFNγ 및 TNFα 사이토카인을 생산 및 분비하도록 반응할 수 있다.
도 37은 iPSC-유래 ProT 세포가 TCR 감마 유전자좌로부터 남아있는 생식계열의 감소된 백분율을 가져서, TCR 유전자좌의 VDJ 재조합을 개시하는 것을 나타낸 도면.
줄기세포, 예컨대 hESC(배아 줄기세포) 또는 iPSC(유도 만능 줄기세포)의 게놈 변형은 폴리뉴클레오타이드 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 게놈-조작된 iPSC에서 외인성 유전자 발현은 종종 본래 게놈-조작된 iPSC의 연장된 클론성 확장 후, 세포 분화 후, 및 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 세포로부터의 비분화된 세포 유형에서의 유전자 침묵 또는 감소된 유전자 발현과 같은 문제를 마주한다. 본 발명은 자살 유전자를 비롯한 1종 이상의 외인성 유전자 및 다른 기능성 양상을 iPSC에 안정하게 통합시키고, 확장된 iPSC 및 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 분화된 세포에서 유전자의 기능성 반응을 유지시키기 위한 효율적이고, 신뢰할 만하고, 표적화된 접근법을 제공한다. 일 실시형태에서 iPSC는 단일 세포 유래된 클론성 iPSC이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 iPSC, 확장된 iPSC, 및 이로부터 유래된 분화된 세포에서 특정 비-독성 화학적 유도자에 반응성인 하나 이상의 선택된 부위에서 표적화된 통합에 적합한 유전자-암호화된 유도성 "자살" 시스템을 제공한다. 따라서 본 발명은 다양한 세포 치료제에 적합한, 주변 세포 및 조직을 손상시키지 않으면서 투여된 세포를 제거하기 위한 효율적이고, 신뢰할 만하고, 표적화된 접근법을 나타낸다. 추가로, 본 발명은 또한 재프로그래밍 및 탈분화에 관련된 다수의 유전적 양상과 통합된 클론성 iPSC, iPSC 분화, HSC(조혈 줄기 및 전구 세포), T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 이동, 세포독성, 생존도, 유지, 확장, 장기간 지속(longevity), 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 수득하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 i카스파제9 유전자를 화학적 유도에 대해서 불응성이 되게 하고, 유도된 세포사로부터의 탈출을 허용하는 i카스파제9 유전자에서의 돌연변이의 식별, 및 이러한 탈출을 극복 또는 예방하기 위한 접근법, 예컨대 이중 자살 유전자 안전 보호 시스템, 또는 이중 대립유전자 자살 유전자 삽입을 기술한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다. 단수의 용어는 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안의(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약"또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 많이 변하는 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 관해 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 더 높은 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"은 상호 호환적으로 사용되고, 조성물, 예컨대 세포 집단 또는 배양 배지를 기재하기 위해 사용될 때, 특정된 물질 또는 그의 공급원이 없는, 예컨대 구체화된 물질 또는 그의 공급원이 95% 없는, 96% 없는, 97% 없는, 98% 없는, 99% 없거나, 또는 통상적인 수단에 의해 측정하여 검출 불가능한 조성물을 지칭한다. 조성물 중의 특정 성분 또는 물질이 "없는" 또는 "본질적으로 없는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성물 중에 포함되지 않거나, 또는 (2) 기능적으로 비활성이지만, 저농도인 조성물 중에 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 조성물의 특정 물질 또는 그의 공급원의 부재를 지칭할 때, 용어 "의 부재"에 유사한 의미가 적용될 수 있다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다(포함한다)", "포함한다" 및 "포함하는"은 단계들 또는 요소들의 언급된 단계 또는 요소의 포함을 나타내지만, 단계들 또는 요소들의 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 그룹의 제외를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "포함하다(include)", "가지다(has)", "함유한다(contain)" 및 "포함하다(포함한다)"는 동의어로 사용된다.
"이루어진"은 어구 "이루어진"에 따르는 것은 무엇이든 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수적인 것, 다른 요소가 존재하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수적인 것이지만, 다른 요소가 선택적이지는 않고, 그들이 열거된 요소의 활성 도는 작용에 영향을 미치는지의 여부에 따라 제공될 수도 있고 제공되지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 반드시 동일한 실시형태를 모두 언급할 필요는 없다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
용어 "생체밖"은 일반적으로 유기체 밖, 예컨대 바람직하게는 자연 조건의 최소 변형을 갖는 유기체 밖의 인공 환경에서의 살아있는 조직 내 또는 살아있는 조직 상에서 행해지는 실험 또는 측정에서 일어나는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체밖" 절차는 유기체로부터 취해지고, 보통 멸균 조건 하에 실험 장치에서, 그리고 전형적으로 환경에 따라서 몇 시간 동안 또는 약 24시간까지(48시간 또는 72시간 또는 그 이상을 포함))배양되는 살아있는 세포 또는 조직을 수반한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집되고, 냉동될 수 있고, 이후에 생체밖 처리를 위해 해동될 수 있다. 살아있는 세포 또는 조직을 이용하여 며칠보다 더 길게 지속되는 조직 배양 실험 또는 절차는 전형적으로 "시험관내"가 (특정 실시형태에서, 이 용어가 생체밖과 상호호환적으로 사용될 수는 있지만) 되는 것으로 고려된다.
용어 "생체내"는 일반적으로 유기체 내에서 일어나는 활동을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 세포 효력의 증가" 또는 "발생 효력의 증가"는 세포의 효력을 증가시키거나 또는 세포를 덜 분화된 상태로 분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 증가된 세포 효력을 갖는 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포에 비해 더 발생된 가소성을 가진다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 다시 말해서, 재프로그래밍된 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포보다 덜 분화된 상태의 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "분화"는 비전문화된("uncommitted") 또는 덜 전문화된 세포가 전문화된 세포, 예를 들어, 혈액 세포 또는 근육 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도 세포는 세포 계통 내에서 더 전문화된("전념된(committed)") 위치 상에서 취해진 것이다. 용어 "전념된"은 분화 과정에 적용될 때, 정상 환경 하에서 그것이 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 서브세트로 분화를 계속할 수 있는 지점으로 분화 경로에서 진행하고, 정상 환경 하에서 상이하나 세포 유형으로 분화하거나 또는 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아가는 지점까지 분화 경로에서 진행되는 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "만능"은 신체 또는 체세포의 모든 계통(즉, 배아 적합)을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기세포는 각각 3가지의 배층(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로부터의 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기세포 유형이다. 만능성은 완전한 유기체를 더 원시적으로 발생되게 할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능 세포(예를 들어, 원외배엽 줄기세포 또는 EpiSC), 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기세포)가 생기게 할 수 있는 더 만능의 세포의 범위에 있는 발생 효력의 연속체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유도 만능 줄기세포" 또는 iPSC는 줄기세포가 유도 또는 변화된, 즉, 모두 3가지의 배아 또는 진피층(중배엽, 내배엽 및 외배엽)으로 분화할 수 있는 세포로 재프로그래밍된 분화된 성인, 신생아 또는 태아 세포로부터 생성된다는 것을 의미한다. 생성된 iPSC는 그들이 자연에서 발견되기 때문에 세포를 지칭하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "배아 줄기세포"는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 자연 유래 만능 줄기세포를 지칭한다. 배아 줄기세포는 만능성이며, 3가지의 1차 배엽(외배엽, 내배엽 및 중배엽)의 모든 유도체로의 발생 동안 생기게 한다. 그들은 배아외막 또는 태반에 기여하지 않으며, 즉, 전능성이 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "다능성 줄기세포"는 하나 이상의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)(그러나 3가지 모두는 아님)의 세포로 분화하는 발생 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 따라서, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"로 지칭될 수 있다. 다능성 세포는 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 다능성 세포의 예는 성체 줄기세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포 및 신경 줄기세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 주어진 계통에서 다수 유형의 세포(그러나 다른 계통의 세포는 아님)를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 다수의 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 뉴런을 형성할 수 없다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능성보다 더 적은 발생 가능성 정도를 갖는 세포 상태를 지칭한다.
만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특징을 평가함으로써 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능 줄기세포 형태; (ii) 비제한적 자기-재생을 위한 가능성; (iii) SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 만능 줄기세포 마커의 발현; (iv) 모두 3가지의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화하는 능력; (v) 3가지 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 3가지 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배상체의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
2가지 유형의 만능성이 이전에 기재되었다: 후기 배반포의 원외배엽 줄기세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 또는 "전이성" 상태, 및 초기/이식전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "미경험" 또는 "바닥" 상태. 만능성 상태는 둘 다 상기 기재한 바와 같은 특징을 나타내지만, 미경험 또는 바닥 상태는 추가로 다음을 나타낸다: (i) 여성 세포에서 X-염색체의 사전-비활성화 또는 재활성화; (ii) 단일-세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존; (iii) DNA 메틸화에서의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에 대한 H3K27me3 억제 염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 만능 세포의 프라이밍된 상태에 비해 분화 마커의 감소된 발현. 외인성 만능성 유전자가 체세포에 도입되고, 발현되며, 이어서 얻어진 만능 세포로부터 침묵화되거나 제거된 세포 프로그래밍의 표준 방법은 일반적으로 만능성의 프라이밍-상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능 세포 배양 조건 하에서, 외인성 이식유전자 발현이 유지되지 않는 한 이러한 세포는 프라이밍된 상태로 남아있되, 바닥 상태의 특징이 관찰된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "만능 줄기세포 형태"는 배아 줄기세포의 고전적 형태 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비, 핵소체의 주목할 만한 존재 및 전형적인 세포내 간격과 함께 형상이 둥글고 작은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는, 인간 환자, 가축 또는 다른 집에서 기르는 동물을 지칭한다.
"만능 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, 세포의 발생 효력을 증가시킬 수 있는 제제를 지칭한다. 만능 인자는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 만능 인자는, 예를 들어, 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍 제제를 포함한다.
"배양물" 또는 "세포 배양물"은 시험관내 환경에서 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양 배지", "배양 배지"(각각의 경우에 단수 "배지"), "보충물" 및 "배지 보충물"은 세포 배양물을 배양하는 영양 조성물을 지칭한다.
"배양하다" 또는 "유지하다"는, 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱)세포 배양물 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체 밖에서 세포를 지속하고/하거나, 증식(성장)시키고/시키거나 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지하는"은 세포를 증식시키고/시키거나 지속시키는 데 도움이 되는 영양소, 호르몬 및/또는 다른 인자의 공급원으로서 배양 배지를 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "중배엽"은 초기 배형성 동안 나타나고, 순환계, 근육, 심장, 진피, 골격 및 기타 지지 및 결합 조직의 혈액 세포를 포함하는 다양한 전문화된 세포 유형이 생기게 하는 3가지 배엽 중 하나를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "확정적 조혈 내피세포"(HE) 또는 "만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포"(iHE)는 내피세포에서 조혈세포로의 이행(endothelial-to-hematopoietic transition)으로 불리는 과정에서 조혈 줄기 및 전구 세포를 생기게 하는 내피 세포의 서브세트를 지칭한다.　배아 내 조혈 세포의 발생은 혈액모세포에서 확정적 조혈 내피세포 및 조혈 전구세포까지 측판 중배엽으로부터 순차적으로 진행된다.
용어 "조혈 줄기 및 전구 세포", "조혈 줄기세포", "조혈 전구 세포", 또는 "조혈 전구체 세포"는 조혈 계통에 전념되지만, 추가로 조혈 분화가 가능하고, 다능성 조혈 줄기세포(혈구모세포), 골수 전구세포, 거핵세포 전구세포, 적혈구 전구세포 및 림프구 전구세포를 포함하는 세포를 지칭한다. 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC)는 골수(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 비롯한, 혈액 세포 유형 모두를 생성시키는 다능성 줄기세포이다. 용어 "확정적 조혈 줄기세포"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 성숙 골수, 및 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 비롯한 림프구 세포 유형 둘 모두를 생성할 수 있는 CD34+ 조혈 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 또한 원시적 적혈구, 거핵세포 및 대식세포를 생성시키는 원시적 조혈 세포의 다양한 하위세트를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "T 림프구" 및 "T 세포"는 상호 호환적으로 사용되고, 흉선에서 성숙을 완결하고, 신체에서 특이적 외부 항원의 식별 및 다른 면역 세포의 활성화 및 비활성화를 비롯한, 면역계에서 다양한 역할을 갖는 백혈구의 주요 유형을 지칭한다. T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어, 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어, Jurkat, SupT1 등, 또는 포유동물로부터 얻은 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD3+ 세포일 수 있다. T 세포는 T 세포의 임의의 유형일 수 있고, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 말초 혈액 백혈구(PBL), 종양 침윤성 림프구(TIL), 기억 T 세포, 미경험 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδT 세포) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 추가적인 유형의 헬퍼 T 세포는 Th3(Treg), Th17, Th9 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 추가적인 유형의 기억 T 세포는 중앙 기억 T 세포(Tcm 세포), 효과기 기억 T 세포(Tem 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다. T 세포는 또한 유전자 조작된 T 세포, 예컨대 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키도록 변형된 T 세포를 지칭할 수 있다. T 세포는 또한 줄기세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다.
"CD4+ T 세포"는 이의 표면 상에서 CD4를 발현하고, 세포-매개된 면역 반응과 연관된 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 이것은 사이토카인, 예컨대 IFN-감마, TNF-알파, IL-2, IL-4 및 IL-10의 분비를 포함할 수 있는, 자극 이후의 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4"는 T-림프구 상의 분화 항원으로서 본래 정의되지만, 단핵구/대식세포를 비롯한 다른 세포 상에서도 발견되는 55-kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 초유전자 패밀리의 구성원이고, MHC(주요 조직적합 복합체(major histocompatibility 복합체)) 부류 II-제한된 면역 반응에서 회합성 인식 요소로서 관련된다. T-림프구 상에서 이것은 헬퍼/유도자 하위세트를 정의한다.
"CD8+ T 세포"는 이의 표면 상에서 CD8을 발현하고, MHC 부류 I-제한되고, 세포독성 T 세포로서 기능하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. "CD8" 분자는 흉선세포 상에서 그리고 세포독성 및 억제유전자(suppressor) T-림프구 상에서 발견되는 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 초유전자 패밀리의 구성원이고, 주요 조직적합 복합체 부류 I-제한된 상호작용에서 회합성 인식 요소이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체(CD3)의 부재에 의해 나타나는 말초 혈액 림프구의 서브세트를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "적응 NK 세포" 및 "기억 NK 세포"는 상호 호환 가능하며, NKG2C 및 CD57, 및 선택적으로, CD16을 발현시키지만, 다음의 PLZF, SYK, FceR 및 EAT-2 중 하나의 발현은 결여하는 표현형으로 CD3- 및 CD56+인 NK 세포의 서브세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD56+ NK 세포의 단리된 하위집단은 CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR 리간드, NKp30, NKp40, NKp46, 활성화 및 저해 KIR, NKG2A 및 DNAM-1의 발현을 포함한다. CD56+는 어두운 또는 밝은 발현일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "NKT 세포" 또는 "자연 살해 T 세포"는 T 세포 수용체(TCR)를 발현시키는 CD1d-제한 T 세포를 지칭한다. 통상적인 주조직적합성(MHC) 분자에 의해 제시된 펩타이드 항원을 검출하는 통상적인 T 세포와 달리, NKT 세포는 CD1d, 비-고전적 MHC 분자에 의해 제시된 지질 항원을 인식한다. 2가지 유형의 NKT 세포가 현재 인식된다. 비변이체 또는 I형 NKT 세포는 제한된 범위의 β 쇄(인간에서의 Vβ11)와 관련된 매우 제한된 TCR 레퍼토리 - 정규 α-쇄(인간에서의 Vα24-Jα18)를 발현시킨다. 비정규 또는 비변이체가 아닌 II형 NKT 세포로 불리는 NKT 세포의 제2 집단은 더 이종성의 TCR αβ 용법을 나타낸다. I형 NKT 세포는 현재 면역요법에 적합한 것으로 고려된다. 적응 또는 비변이체(I형) NKT 세포는 다음의 마커, TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 및 CD56 중 적어도 하나 이상의 발현에 의해 확인될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단리된" 등은 이의 본래 환경으로부터 분리된 세포 또는 세포의 집단을 지칭하고, 즉, 단리된 세포의 환경은 "비-단리된" 참조 세포가 존재하는 환경에서 발견되는 바와 같은 적어도 하나의 성분이 실질적으로 없다. 이 용어는 이것이 이의 자연 환경, 예를 들어, 조직, 생검물에서 발견되는 바와 같은 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 포함한다. 이 용어는 또한 세포가 비-자연 발생 환경, 예를 들어, 배양물, 세포 현탁물에서 발견되는 바와 같은 적어도 하나의, 일부의 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 포함한다. 따라서, 단리된 세포는 이것이 자연에서 발견되는 바와 같은 또는 이것이 비-자연 발생 환경에서 성장, 저장 또는 존재하는 바와 같은, 다른 물질, 세포 또는 세포 집단을 비롯한 적어도 하나의 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 세포의 구체적인 예는 부분적으로 순수한 세포, 실질적으로 순수한 세포 및 비-자연 발생인 배지에서 배양된 세포를 포함한다. 단리된 세포는 목적하는 세포 또는 이의 집단을 환경에서의 다른 물질 또는 세포로부터 분리하거나, 또는 하나 이상의 다른 세포 집단 또는 하위집단을 환경으로부터 제거함으로써 수득될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "순도" 등은 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 예를 들어 순도는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%로 증가될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "암호화"는 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 중 어느 하나 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 템플레이트로서 기능하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서의 뉴클레오타이드의 특이적 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생산하는 경우 단백질을 암호화한다. 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 템플레이트로서 사용되는, 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 통상적으로 서열 목록으로 제공되는 암호 가닥, 및 비-암호 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화한다고 지칭될 수 있다.
"작제물"은 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다. "벡터"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이 외부 유전 물질의 표적 세포로의 전달 또는 이송을 안내할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭하고, 여기서 그것은 복제 및/또는 발현될 수 있다. 용어 "벡터"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이 전달될 작제물을 포함한다. 벡터는 선형 또는 원형 분자일 수 있다. 벡터는 통합 또는 비통합될 수 있다. 벡터의 주요 유형은 플라스미드, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
"통합"이라는 것은, 작제물의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 세포 게놈 내로 안정하게 삽입되는 것, 즉 세포의 염색체 DNA 내의 핵산 서열에 공유 연결되는 것을 의미한다. "표적화된 통합"이라는 것은, 작제물의 뉴클레오타이드(들)이 미리-선택된 부위 또는 "통합 부위"에서 세포의 염색체 또는 미토콘드리아 DNA에 삽입되는 것을 의미한다. 용어 "통합"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 통합 부위에서 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 결실이 있거나 또는 결실이 없는, 작제물의 1종 이상의 외인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 삽입에 관련된 과정을 추가로 지칭한다. 이 경우, 삽입 부위 내에 결실이 존재하는 경우, "통합"은 하나 이상의 삽입된 뉴클레오타이드가 결실된 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 대체를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "외인성"은 언급된 분자 또는 언급된 활성이 숙주 세포에 도입된 것을 의미하도록 의도된다. 분자는 예를 들어, 암호화 핵산을 숙주 유전 물질에 도입함으로써, 예컨대 숙주 염색체에 또는 비-염색체 유전 물질, 예컨대 플라스미드로서 통합시킴으로써 도입될 수 있다. 따라서, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 바와 같이 이 용어는 발현성 형태의 암호화 핵산의 세포로의 도입을 지칭한다. 용어 "내인성"은 숙수 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 경우 이 용어는 외인성으로 도입된 것이 아닌 세포 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "관심 유전자" 또는 "관심 폴리뉴클레오타이드 서열"은 RNA로 전사되고, 일부예에서는 적절한 조절 서열의 제어 하에서 일어나는 경우 생체내에서 폴리펩타이드로 번역되는 DNA 서열이다. 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물(예를 들어 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 관심 유전자는 miRNA, shRNA, 네이티브 폴리펩타이드(즉, 자연에서 발견되는 폴리펩타이드) 또는 이의 단편; 변이체 폴리펩타이드(즉, 네이티브 폴리펩타이드과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 네이티브 폴리펩타이드의 돌염변이) 또는 이의 단편; 조작된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편, 치료 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 영상화 마커, 선택성 마커 등을 암호화할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체인, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 서열은 4개의 뉴클레오타이드 염기: 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 경우 티민에 대해서 우라실(U)으로 구성된다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 이중-가닥 분자 및 단일-가닥 분자 둘 모두를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호 호환적으로 사용되고, 펩타이드 결합에 의해서 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 분자를 지칭한다. 폴리펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 폴리펩타이드의 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어는 또한 일반적으로 관련 기술 분야에서 예를 들어, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머라 지칭되는 단쇄, 및 일반적으로 관련 기술 분야에서 폴리펩타이드 또는 단백질이라 지칭되는 장쇄 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩타이드"는 예를 들어, 특히 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 자연 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함한다.
"작동 가능하게-연결된"은 하나의 기능이 서로에 의해서 영향을 받도록 하는 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 그 암호 서열 또는 기능성 RNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우(즉, 암호 서열 또는 기능성 RNA가 프로모터의 전사 제어 하에 있는 경우) 암호 서열 또는 기능성 RNA와 작동 가능하게-연결된다. 암호 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작동 가능하게-연결될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 각인"은 공급원 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전적 또는 후성적 정보를 지칭하고, 공급원 세포 유래 iPSC 및/또는 iPSC-유래 조혈 계통 세포에서 유지 가능하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "공급원 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비만능 세포이고, 공급원 세포 유래 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정 세포 유형으로 추가로 분화될 수 있다. 공급원 세포 유래 iPSC, 및 그것으로부터의 분화 세포는 때때로 내용에 따라서 "유래 세포"로 총괄적으로 불린다. 우선적 치료 속성을 부여하는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 유전자 각인(들)은 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 선택된 공급원 세포의 재프로그래밍을 통해 또는 게놈 편집을 이용하여 유전자 변형된 양상을 iPSC에 도입하는 것을 통해 iPSC 내에 혼입된다. 구체적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 내용으로부터 얻은 공급원 세포의 양상에서, 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전자 각인은 동정되든 아니든 근본적인 분자 사건과 상관없이 선택된 공급원 세포의 유도 세포 상에서 통과된 유지 가능한 표현형, 즉, 우선적 치료 속성을 나타내는 임의의 내용 특이적인 유전적 또는 후성적 변형을 포함할 수 있다. 공여자-, 질환- 또는 치료 반응- 특이적 공급원 세포는 iPSC에서 유지 가능한 유전자 각인 및 유래된 조혈 계통 세포를 포함할 수 있으며, 이 유전자 각인은, 예를 들어, 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포로부터의 사전 배열된 단일 특이적 TCR; 추적할 수 있는 그리고 바람직한 유전적 다형성, 예를 들어, 선택된 공여자에서 고친화도 CD16 수용체를 암호화하는 점 돌연변이에 대한 동형접합성; 및 사전 결정된 HLA 필요, 즉, 증가된 집단을 갖는 단상형을 나타내는 선택된 HLA-매칭된 공여자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 우선적 치료적 속성은 유래된 세포의 개선된 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적 치료 속성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 관한 것일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "향상된 치료적 특성"은 동일한 일반적 세포 유형의 전형적 면역 세포에 비해 향상된 세포의 치료적 특성을 지칭한다. 예를 들어, "치료적 특성"을 갖는 NK 세포는 전형적, 비변형 및/또는 자연 유래 NK 세포에 비해 향상된, 개선된 그리고/또는 증가된 치료적 특성을 가질 것이다. 면역 세포의 치료적 특성은 세포 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 면역 세포의 치료적 특성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 의해 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "관여자"는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 및 종양 세포 사이에 연결을 형성할 수 있고; 면역 세포를 활성화시킬 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 관여자의 예는 이중 특이적 T 세포 관여자(BiTE), 이중 특이적 살해 세포 관여자(BiKE), 삼중 특이적 살해 세포 관여자 또는 다중 특이적 살해 세포 관여자 또는 다중 면역 세포 유형과 상용성인 보편적 관여자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "표면 촉발 수용체"는 면역 반응, 예를 들어, 세포독성 반응을 촉발시키거나 또는 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 촉발 수용체는 조작될 수 있고, 효과기 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 효과기 세포의 자연적 수용체 및 세포 유형과 독립적인 효과기 세포와 특정 표적 세포 예를 들어, 종양 세포 사이의 이중- 또는 다중-특이적 항체 맞물림을 용이하게 한다. 이 접근을 사용하여, 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하는 iPSC를 생성할 수 있고, 이어서, 이러한 iPSC를 보편적 표면 촉발 수용체를 발현시키는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 분화시킬 수 있다. "보편적"은 표면 촉발 수용체가 세포 유형과 상관 없이 임의의 효과기 세포에서 발현되고, 활성화시킬 수 있으며, 보편적 수용체를 발현시키는 모든 효과기 세포는 관여자의 종양 결합 특이성과 상관없이 표면 촉발 수용체에 의해 인식될 수 있는 동일한 에피토프를 갖는 관여자에 결합되거나 또는 연결될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 이렇게 해서, 하나 또는 다중 효과기 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정 유형을 사멸시키기 위해 그리고 일부 다른 경우에 2 이상의 유형의 종양을 사멸시키기 위해 관려될 수 있다. 표면 촉발 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공자극 도메인 및 관여자의 에피토프에 특이적인 항-에피토프를 포함한다. 이중 특이성 관여자는 한 말단 상에서 표면 촉발 수용체의 항-에피토프에 특이적이고, 다른 말단 상에서 종양 항원에 특이적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "안전 스위치 단백질"은 세포 요법의 잠재적인 독성 또는 다른 유해 효과를 방지하도록 설계된 조작 단백질을 지칭한다. 일부 상황에서, 안전 스위치 단백질 발현은 안전 스위치 단백질을 그의 게놈으로 암호화하는 유전자 내에 영구적으로 혼입된 이식 조작 세포에 대한 안전 문제를 처리하기 위해 조건적으로 제어된다. 이 조건적 조절은 가변적일 수 있고, 소분자-매개 번역 후 활성화 및 조직-특이적 및/또는 일시적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 수 있다. 안전 스위치는 세포자멸사의 저해, 단백질 합성의 저해, DNA 복제, 성장 저지, 전사 및 전사 후 유전적 조절 및/또는 항체-매개 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 예에서, 안전 스위치 단백질은 활성화될 때 치료 세포의 세포자멸사 및/또는 세포사를 촉발시키는 외인성 분자, 예를 들어, 프로드러그에 의해 활성화된다. 이 전략에서, 유해 사건이 있는 경우에 투여되는 프로드러그는 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고, 형질도입 세포를 사멸시킨다,
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드"는 유기체에 대한 생물학적 및/또는 약제학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질은 질환에 대한 치유하는 근치적 또는 고식적 특성을 가지며, 질환의 중증도를 개선시키거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 반전시키거나 또는 줄이기 위해 투여될 수 있다. 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 예방적 특성을 가지며, 질환의 개시를 방지하기 위해 또는 그것이 생길 때 이러한 질환 또는 병리적 병태의 중증도를 줄이기 위해 사용된다. 약제학적으로 활성인 단백질은 전체 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 활성인 단편을 포함한다. 또한 단백질 또는 펩타이드의 약제학적으로 활성인 유사체 또는 단백질 또는 펩타이드의 단편의 유사체를 포함한다. 용어 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 치료적 이점을 제공하기 위해 협력적으로 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "신호전달 분자"는 세포 신호 형질도입을 조절하거나, 이에 참여하거나, 저해하거나, 활성화시키거나, 감소시키거나 또는 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. 신호 형질도입은 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발시키는 경로를 따라서 단백질 복합체의 동원에 의한 화학적 변형의 형태로 분자 신호의 전달을 지칭한다. 신호 형질도입 경로는 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있고, G 단백질 결합 수용체 신호전달, 타이로신 카이나제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드-개폐 이온 통로 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP-의존적인 경로, 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "표적화 양상"은 i) 독특한 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 관련된 항원 특이성, ii) 단클론성 항체 또는 이중특이성 관여자와 관련된 관여자 특이성, iii) 형질전환 세포의 표적화, iv) 암 줄기세포의 표적화, 및 v) 특정 항원 또는 표면 분자의 부재 하에서의 다른 표적화 전략을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진시키기 위해 세포 내에 유전적으로 혼입된 분자, 예를 들어, 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "특이적" 또는 "특이성"은 비특이적 또는 비선택적 결합과 대조적으로 표적 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 관여자의 능력을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "입양 세포 요법"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 형질도입 전에 생체밖에서 확장된 유전자 변형된 또는 변형되지 않은 T 또는 B 세포로서 동정된 자가 또는 동종이계 림프구의 형질도입에 관한 세포 기반 면역요법을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료적으로 충분한 양"은 그의 의미 내에서 비독성이지만 충분하고 그리고/또는 유효한 양의 특정 치료적 및/또는 약제학적 조성물을 포함하며, 목적으로 하는 치료 효과를 제공하는 것을 언급한다. 필요한 정확한 양은 환자의 일반적 건강상태, 환자의 연령 및 병기 및 병태의 중증도와 같은 인자에 따라서 대상체에 따라 다를 것이다. 특정 실시형태에서, 치료적으로 충분한 양은 치료 중인 대상체의 질환 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선시키고/시키거나, 감소시키고/시키거나 좋아지게 하는데 충분하고/하거나 효과적이다.
만능 줄기세포의 분화는 배양 시스템의 변화, 예컨대 배양 배지 또는 tHE 세포의 물리적 상태에서 자극제의 변화를 필요로 한다. 가장 통상적인 전략은 계통-특이적 분화를 개시하기 위해 통상적이고 중요한 중간체로서 배상체(EB)의 형성을 이용한다. EB는 그들의 3차원 면적 내에서 수많은 계통을 생기게 하기 때문에 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정, 전형적으로 몇 시간 내지 며칠을 통해, 단순한 EB(예를 들어, 응집된 만능 줄기세포는 분화하도록 유발됨)는 성숙을 계속하고, 그들이 추가로 분화를 계속하도록 진행되는 시간, 전형적으로 며칠 내지 몇주에 낭포성 EB로 발생된다. 세포의 3차원 다층 클러스터에서 만능 줄기세포가 서로 근접하게 함으로써 EB 형성이 개시되며, 전형적으로 이는 만능 세포가 액적 중의 침전을 허용하는 단계, 세포를 "U"형 바닥 웰-플레이트 내로 또는 기계적 교반에 의해 침전시키는 단계를 포함하는 몇몇 방법 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진시키기 위해, 만능 줄기세포 응집물은 추가적인 분화 신호가 필요한데, 만능성 배양물 유지 배지 내에 유지된 응집물이 적절한 EB를 형성하지 않기 때문이다. 이렇게 해서, 만능 줄기세포 응집물은 선택 계통에 대한 유발 신호를 제공하는 분화 배지로 전달될 필요가 있다. 만능 줄기세포의 EB-기반 배양물은 전형적으로 EB 세포 클러스터 내에서 보통의 증식을 갖는 분화된 세포 집단(외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)의 생성을 초래한다. 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 증명되었지만, 그러나 EB는 3차원 구조에서 tHE 세포의 환경으로부터의 분화 신호에 대한관 일치되지 않는 노출 때문에 가변성 분화 상태로 이종성 세포가 생기게 한다. 추가로, EB는 생성 및 유지하는 데 힘이 든다. 게다가, EB를 통한 세포 분화는 보통 세포 확장을 수반하는데, 이는 또한 낮은 분화 효율에 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 별개인 "응집물 형성"은 만능 줄기세포 유래 세포의 집단을 확장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집물-기반 만능 줄기세포 확장 동안, 배양 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집물의 크기를 증가시켜 더 큰 응집물을 형성하고, 이들 응집물은 배양물 내의 세포 증식을 유지시키기 위해 그리고 세포 수를 증가시키기 위해 더 작은 응집물로 일상적으로 기계적으로 또는 효소적으로 해리될 수 있다. EB 배양물과 별개로, 유지 배양물 중의 응집물 내에서 배양된 세포는 만능성 마커를 유지한다. 만능 줄기세포 응집물은 분화를 유도하기 위한 추가적인 분화 신호를 필요로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터, 즉, "형성"을 통한 분화와 별개인 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 단일층 분화, 본 명세서에 개시된 이점 중에서, 분화 개시를 위한 EB 형성에 대한 필요를 회피한다. 단일층 배양은 배아 발생, 예컨대 EB 형성을 모방하지 않기 때문에, 특정 계통에 대한 분화는 EB에서의 모두 3가지 배엽 분화에 비해 최소인 것으로 여겨진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "해리된" 세포는 다른 세포로부터 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내에서 응집하는 세포는 서로로부터, 예컨대 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 해리에 의해 효소적으로 또는 기계적으로 해리될 수 있다. 또 다른 대안의 실시형태에서, 부착 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리된다. 따라서 해리는 세포외 기질(ECM) 및 기질(예를 들어, 배양 표면)과의 세포 상호작용을 파괴하는 것 또는 세포 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "피더 세포" 또는 "피더"는 피더 세포가 제2 세포 유형의 지지체에 대한 성장 인자 및 영양소를 제공하기 때문에 제2 유형의 tHE 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하는 제2 유형의 세포와 함께 공동배양되는 한 가지 유형의 세포를 기재하는 용어이다. 피더 세포는 그들의 지지하는 tHE 세포와 상이한 종으로부터 선택적으로 유래된다. 예를 들어, 줄기세포를 포함하는 특정 유형의 인간 세포는 마우스 배아 섬유아세포, 또는 불멸 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양물에 의해 지지될 수 있다. 피더 세포는 그들이 지지하는 tHE 세포보다 더 커지는 것을 방지하기 위해 방사선 조사 또는 항-유사분열제, 예컨대 미토마이신에 의한 처리에 의해 다른 세포와 함께 공동배양시킬 때 전형적으로 비활성화될 수 있다. 피더 세포는 내피 세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 앞서 언급한 것으로 제한하는 일 없이, 한 가지의 특정 피더 세포 유형은 인간 피더, 예컨대 인간 피부 섬유아세포일 수 있다. 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 피더 세포는 특정 계통에 대한 만능성, 직접적 분화를 유지하기 위해 그리고 전문화된 세포 유형, 예컨대 효과기 세포로의 성숙을 촉진시키기 위해 부분적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "피더-무함유"(feeder-free: FF) 환경은 피더 또는 기질 세포가 본질적으로 없고, 그리고/또는 피더 세포의 배양에 의해 사전 조건화되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "사전 조건화된" 배지는 피더 세포가 시간 기간 동안, 예컨대 적어도 1일 동안 배지 내에서 배양된 후에 채취된 배지를 지칭한다. 사전 조건화된 배지는 배지에서 배양된 피더 세포에 의해 분화된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 다수의 매개체 물질을 함유한다.
"기능성"은, iPSC 및 그로부터 분화된 유래된 비-만능 세포의 게놈 편집 또는 변형, 또는 비-만능 세포 및 그로부터 재프로그래밍된 유래된 iPSC의 게놈 편집 또는 변형의 맥락에서 사용되는 바와 같이, (1) 유전자 수준에서는--성공적인 녹-인, 녹-아웃, 녹-다운 유전자 발현, 유전자 이식된 또는 제어된 유전자 발현, 예컨대 목적하는 세포 발생 단계에서 유도성 또는 일시적 발현(이것은 직접적인 게놈 편집 또는 변형을 통해서 또는 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 출발 세포의 재프로그래밍을 통한 "패싱-온(passing-on)"을 통해서 달성됨)을 지칭하거나; 또는 (2) 세포 수준에서는―(i) 직접적인 게놈 편집을 통해서 상기 세포에서 수득된 유전자 발현 변형, (ii) 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 출발 세포의 재프로그래밍을 통한 "패싱-온"을 통해서 상기 세포에서 유지된 유전자 발현 별형; (iii) 상기 세포의 초기 발달 단계에서만 보이거나, 또는 분화 또는 재프로그래밍을 통해서 상기 세포를 생성시키는 출발 세포에서만 보이는 유전자 발현 변형의 결과로서의 상기 세포에서의 하류 유전자 조절; 또는 (iv) iPSC, 전구체 또는 탈분화된 세포 기원에서 수행된 게놈 편집 또는 변형으로부터 초기에 유래된, 성숙 세포 산물 내에 나타난 향상되거나 또는 새로 성취된 세포 기능 또는 속성을 통해서 세포 기능/특징을 성공적으로 제거, 부가 또는 변경한 것을 지칭한다.
HLA-부류 I 결핍, 또는 HLA-부류 II 결핍, 또는 둘 모두를 비롯한, "HLA 결핍"은 HLA 부류 I 단백질 이종이량체 및/또는 HLA 부류 II 이종이량체를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현이 결여되거나 또는 더이상 유지되지 않거나 또는 감소되어, 줄어들거나 또는 감소된 수준이 다른 세포에 의해서 또는 합성 방법에 의해서 자연적으로 검출 가능한 수준보다 낮은, 세포를 지칭한다. HLA 부류 I 결핍은 HLA 부류 I 유전자좌(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능성 결실, 또는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP 1 유전자, TAP 2 유전자 및 타파신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLA 부류-I 연관된 유전자의 결실 또는 이의 발현 수준의 감소에 의해서 달성될 수 있다. HLA 부류 II 결핍은 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLA-II 연관된 유전자의 기능성 결실 또는 감소에 의해서 달성될 수 있다. 본 발명 이전에는 HLA 복합체 결핍 또는 변경된 iPSC가 조절된 활성을 보유하면서, 발달하고, 성숙하고, 기능성 분화된 세포를 생성시키는 능력을 가지는 지의 여부가 명확하지 않았다. 또한, 본 발명 이전에는, HLA 복합체 결핍 분화된 세포가 HLA 복합체 결핍을 가지면서, iPSC로 재프로그래밍될 수 있고, 만능 줄기세포로서 유지될 수 있는지의 여부가 명확하지 않았다. 세포 재프로그래밍, 만능성의 유지 및 분화 동안의 예상치 못한 실패는 발달 단계 특이적 유전자 발현 또는 이의 부족, HLA 복합체 제시에 대한 요구, 도입된 표면 발현 양상의 단백질 셰딩, 적절하고 효율적인 클론성 재프로그래밍에 대한 필요성, 및 분화 프로토콜의 재구성에 대한 필요성을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 양상에 관련될 수 있다.
"변형된 HLA 결핍 iPSC"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 개선된 분화 가능성, 항원 표적화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제에 대한 내성, 증식, 공자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생산(오토크린 또는 파라크린), 주화성, 및 세포 세포독성, 예컨대 비-고전적 HLA 부류 I 단백질(예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), CD16 Fc 수용체, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 41BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3z, 41BBL, CD47, CD113 및 PDL1로 제한되지 않는 관련된 단백질을 발현하는 유전자를 도입함으로써 추가로 변형된 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍"된 세포는 iPSC가 아닌 세포를 또한 포함한다.
FcR로 약칭되는 "Fc 수용체"는 그것이 인식한 항체의 유형을 기반으로 분류된다. 예를 들어, 항체의 가장 일반적인 부류, IgG에 결합하는 것은 Fc-감마 수용체(FcγR)라 지칭되며, IgA에 결합하는 것은 Fc-알파 수용체(FcαR)라 지칭되고, IgE에 결합하는 것은 Fc-엡실론 수용체(FcεR)라 지칭된다. FcR의 부류는 또한 이를 발현하는 세포(대식세포, 과립구, 자연 살해 세포, T 및 B 세포) 및 각각의 수용체의 신호전달 특성에 의해서 구별된다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 몇몇 구성원, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b)을 포함하는데, 이것은 이의 상이한 분자 구조로 인해서 이이의 항체 친화도가 상이하다.
CD16은 두 아이소폼, Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b)로서 식별되어 있다. CD16a는 표적 세포에 부착된 단량체 IgG에 결합하여 NK 세포를 활성화시켜 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 가능하게 하는, NK 세포에 의해서 발현된 막관통 단백질이다. "고 친화도 CD16", "비-절단성 CD16", 또는 "고 친화도 비-절단성 CD16"은, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, CD16의 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화도를 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구 상의 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백질분해 절단 과정인, 엑토도메인(extodomain) 셰딩되는 경향이 있다. F176V 및 F158V는 높은 친화도를 갖는 예시적인 CD16 변이체인 반면; S197P 변이체는 CD16의 비-절단성 버전의 예이다.
I. iPSC 세포 내의 선택된 유전자좌에서 표적화된 게놈 편집을 위한 방법
게놈 편집 또는 유전자 편집은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 DNA가 표적화된 세포의 게놈에서 삽입, 결실 및/또는 대체되는 유전자 조작의 유형이다. 표적화된 게놈 편집("표적화된 게놈 편집" 또는 "표적화된 유전자 편집"과 상호 호환적임)은 게놈 내의 미리-선택된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환을 가능하게 한다. 내인성 서열이 표적화된 편집 동안 삽입 부위 내에서 결실되는 경우, 영향을 받은 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 결실로 인해서 녹-아웃 또는 녹-다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 또한 내인성 유전자 발현을 파괴하기 위해서 사용될 수 있다. 삽입 부위에서 내인성 서열의 결실이 있거나 없는 1종 이상의 외인성 서열의 삽입을 포함하는 과정을 지칭하는 "표적화된 통합"이 유사하게 본 명세서에서 사용된다. 비교하면, 무작위로 통합된 유전자는 위치 효과 및 침묵화되어, 이의 발현이 신뢰할 수 없거나 예측할 수 없게 만드는 경향이 있다. 예를 들어, 동원체 및 하위-말단소체 영역은 특히 이식유전자 침묵화되는 경향이 있다. 상반되게, 새로 통합된 유전자는 주변 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 주어, 가능하게는 세포 거동을 변경하거나 또는 세포 형질전환을 선호하는 경향이 있다. 따라서, 외인성 DNA를 미리-선택된 유전자좌, 예컨대 안전 하버 유전자좌 또는 게놈 안전 하버(GSH)에 삽입하는 것은 안전성, 효율성, 카피수 대조군 및 신뢰할 수 있는 유전자 반응 대조군을 위해서 중요하다.
표적화된 편집은 뉴클레아제-독립적인 접근법을 통해서 또는 뉴클레아제-의존적인 접근법을 통해서 달성될 수 있다. 뉴클레아제-독립적인 표적화된 편집 접근법에서, 상동 재조합은 숙주 세포의 효소적 기구를 통해서, 삽입될 외인성 폴리뉴클레오타이드를 플랭킹하는 상동성 서열에 의해서 안내된다.
대안적으로, 표적화된 편집은 특이적인 희귀한-절단 엔도뉴클레아제에 의해서 이중 가닥 브레이크(DSB)의 특이적 도입을 통해서 더 높은 빈도로 달성될 수 있다. 이러한 뉴클레아제-의존적인 표적화된 편집은 비-상동 단부 결합(NHEJ)을 비롯한 DNA 수선 기전을 사용하는데, 이것은 DSB에 반응하여 일어난다. 외인성 유전 물질을 함유하는 공여자 벡터가 없는 경우, NHEJ는 종종 적은 수의 내인성 뉴클레오타이드의 무작위 삽입 또는 결실(in/del)로 이어진다. 비교하면, 상동성 아암의 쌍에 의해서 플랭킹된 외인성 유전 물질을 함유하는 공여자 벡터가 존재하는 경우, 외인성 유전 물질은 상동 재조합에 의해서 상동성 지향된 수선(HDR)으로 안내되어, "표적화된 통합"을 유발할 수 있다.
특이적이고, 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 사용 가능한 엔도뉴클레아제는 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), RNA-가이디드 CRISPR-Cas9 뉴클레아제(CRISPR/Cas9; Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats Associated 9)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가로, phiC31 및 Bxb1 인테그라제를 사용하는 DICE(이중 인테그라제 카세트 교환(dual integrase cassette exchange)) 시스템이 또한 표적화된 통합을 위한 유망한 툴이다.
ZFN은 아연 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "아연 핑거 DNA 결합 도메인" 또는 "ZFBD"라는 것은, 하나 이상의 아연 핑거를 통해서 서열-특이적인 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩타이드 도메인을 의미한다. 아연 핑거는 구조가 아연 이온의 배위를 통해서 안정화된 아연 핑거 결합 도메인 내의 약 30개 아미노산의 도메인이다. 아연 핑거의 예는 C2H2 아연 핑거, C3H 아연 핑거 및 C4 아연 핑거를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. "설계된" 아연 핑거 도메인은 그의 설계/조성이 합리적 기준, 예를 들어, 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 분류하는 데이터베이스에서의 치환 규칙 및 처리 정보를 위한 컴퓨터계산된 알고리즘의 응용으로부터 원칙적으로 유래되는 자연에서 발생하지 않는 도메인이다(예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호 참고; 또한 국제 특허 제WO 98/53058호; 제WO 98/53059호; 제WO 98/53060호; 제WO 02/016536호 및 제WO 03/016496호 참고). "선택된" 아연 핑거 도메인은 그의 생산이 경험적 공정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 혼성 선택으로부터 주로 유발되는 자연에서 발견되지 않는 도메인이다. ZFN은 전체 개시내용이 참고로 본 명세서에 포함된 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 보다 상세하게 기술된다. 관련 기술 분야에서 ZFN의 가장 인식되는 예는 FokI 뉴클레아제와 아연 핑거 DNA 결합 도메인의 융합이다.
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성자-유사 효과기 DNA 결합 도메인", "TAL 효과기 DNA 결합 도메인", 또는 "TALE DNA 결합 도메인"이라는 것은 DNA에 대한 TAL 효과기 단백질의 결합에 대한 책임이 있는 TAL 효과기 단백질의 폴리펩타이드 도메인을 의미한다. TAL 효과기 단백질은 감염 동안 산토모나스(Xanthomonas) 속의 물 병원체에 의해서 분해된다. 이들 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가서, 이의 DNA 결합 도메인을 통해서 효과기-특이적 DNA 서열에 결합하여, 이의 전사활성화 도메인을 통해서 이러한 서열에서 유전자 전사를 활성화시킨다. TAL 효과기 DNA 결합 도메인 특이성은 반복 가변-이중잔기(repeat variable-diresidues: RVD)라 지칭되는 선택된 반복 위치에서 다형성을 포함하는 불완전한 34개의 아미노산 반복부의 효과기-가변 수에 좌우된다. TALEN은 참고로 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원 제2011/0145940호에 보다 상세하게 기술되어 있다. 관련 기술 분야에서 TALEN의 가장 인식되는 예는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 대한 FokI 뉴클레아제의 융합 폴리펩타이드이다.
본 방법에서의 용도를 발견한 표적화된 뉴클레아제의 또 다른 예는 DNA 결합 도메인, 예를 들어 관심 DNA 서열에 대해서 특이성을 갖는 아연 핑거 DNA 결합 도메인, TAL 효과기 DNA 결합 도메인 등에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 Spo11 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드인, 표적화된 Spo11 뉴클레아제이다(예를 들어, 개시내용이 참고로 본 명세서에 포함된 미국 출원 제61/555,857호 참고).
본 발명에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가 예는 개별적으로 사용되든지 조합으로 사용되든지에 관계 없이 Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1, 및 Wβ/SPBc/TP901-1을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
표적화된 뉴클레아제의 다른 비제한적인 예는 자연 발생 뉴클레아제 및 재조합 뉴클레아제, 예를 들어, CRISPR/카스파제9, 제한 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제 귀소 엔도뉴클레아제 등을 포함한다.
CRISPR/카스파제-9는 2개의 주요 성분이 필요하다:(1) 카스파제-9 엔도뉴클레아제(Casp9) 및 (2) crRNA-tracrRNA 복합체. 공동-발현되는 경우, 두 성분은 PAM 및 PAM 근처의 시딩 영역을 포함하는 표적 DNA 서열에 모집된 복합체를 형성한다. crRNA 및 tracrRNA는 Casp9가 선택된 서열을 표적화하는 것을 안내하기 위해서 키메라 가이드 RNA(gRNA)를 형성하도록 조합될 수 있다. 이어서 이러한 두 성분은 형질주입 또는 형질도입을 통해서 포유동물 세포에 전달될 수 있다.
DICE 매개된 삽입은 재조합효소, phiC31 및 Bxb1의 쌍을 사용하여, 각각의 효소 사진의 작은 attB 및 attP 인식 부위에 엄격하게 제한된 외인성 DNA의 단방향성 통합을 제공한다. 이러한 표적 att 부위는 포유동물 게놈에는 자연적으로 존재하지 않기 때문에, 이것은 목적하는 통합 부위에서 게놈에 먼저 도입되어야 한다(예를 들어, 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 츨원 공개 제2015/0140665호 참고).
본 발명의 일 양상은 표적화된 게놈 통합을 위해서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 제공한다. 일 실시형태에서, 작제물은 목적하는 통합 부위에 특이적인 상동 아암의 쌍을 추가로 포함하고, 표적화된 통합의 방법은 세포 숙주 효소 기구에 의한 부위 특이적 상동 재조합이 가능하도록 작제물을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 ZFN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 추가로 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 TALEN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물 세포에 도입하는 단계, Cas9-매개된 삽입이 가능하도록 Cas9 발현 카세트, 및 목적하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 DICE 재조합효소의 쌍의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 세포 내의 목적하는 통합 부위에 도입하는 단계, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 DICE-매개된 표적화된 통합이 가능하도록, DICE 재조합효소를 위한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다.
표적화된 통합을 위한 유망한 부위는 안전 하버 유전자좌, 또는 게놈 안전 하버(GSH)를 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 이것은 숙주 세포 또는 유기체에 악영향을 미치지 않으면서 새로 통합된 DNA의 예측 가능한 발현을 이론적으로 수용할 수 있는 인간 게놈의 유전자내 또는 유전자외 영역이다. 유용한 안전 하버는 벡터-암호화된 단백질 또는 비-암호 RNA의 목적하는 수준을 산출하기에 충분한 이식유전자 발현을 허용해야 한다. 안전 하버는 또한 세포를 악성 형질전환하게 만들지도 않고 세포 기능을 변경시키지도 않아야 한다. 잠재적인 안전 하버 유전자좌일 통합 부위의 경우, 서열 주석에 의해서 판단되는 바와 같은, 조절 요소 또는 유전자의 파괴의 부재를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기준을 충족하는 것이 이상적으로 필요하며; 이것은 반대 방향으로 전사되는 2개의 유전자 사이의 수렴부(convergence)에서의 유전자 밀집 면적 또는 위치 내의 유전자간 영역이고; 벡터-암호화된 전사 활성자와 인접한 유전자, 특히 암-관련된 유전자 및 마이크로RNA 유전자의 프로모터 간의 긴-범위 상호작용의 가능성을 최소화하는 거리를 유지하고; 넓은 공간 및 일시적 발현 서열 태그(EST) 발현 패턴에 의해서 반영되는 바와 같은, 흔한 전사 활성을 나타내는, 명백하게 흔한 전사 활성을 갖는다. 후자 특징은, 분화 동안 염색질 리모델링이 전형적으로 일부 유전자좌의 침묵 및 다른 것의 잠재적인 활성화로 이어지는 경우, 줄기세포에서 특히 중요하다. 외인성 삽입에 적합한 영역 내에서, 삽입을 위해서 선택된 정확한 유전자좌는 반복적인 요소 및 보존 서열이 없고, 상동성 아암의 증폭을 위한 프라이머가 쉽게 설계될 수 있다.
인간 게놈 편집 또는 구체적으로 표적화된 통합에 적합한 부위는 아데노-연관된 바이러스 부위 1(AAVS1), 케모카인(CC 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자 유전자좌 및 마우스 ROSA26 유전자좌의 인간 오쏘로그(orthologue)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 마우스 H11 유전자좌의 인간 오쏘로그는 또한 본 명세서에 개시된 표적화된 통합의 조성물 및 방법을 사용한 삽입에 적합한 부위일 수 있다. 추가로, 콜라겐 및 HTRP 유전자 유전자좌는 또한 표적화된 통합을 위한 안전 하버로서 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 선택된 부위의 검증은 특이적 통합 사건 및 프로모터 선출, 외인성 유전자 서열 및 배열을 비롯한 삽입 전략의 최적화를 위해서 특히 줄기세포에서 필수적인 것으로 밝혀져 있고, 작제물 설계가 종종 필요하다.
표적화된 in/del을 위해서, 편집 부위는 종종 발현 및/또는 기능이 방해되도록 의도되는 내인성 유전자 내에 포함된다. 일 실시형태에서, 표적화된 in/del을 포함하는 내인성 유전자는 면역 반응 조절 및 조정과 연관된다. 일부 다른 실시형태에서, 표적화된 in/del을 포함하는 내인성 유전자는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 줄기세포 및/또는 전구 세포 및 그로부터 유래된 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된다.
이와 같이, 본 발명의 일 양상은 계속적 또는 일시적 유전자 발현에 대해서 안전하고, 널리 조절되는 것으로 공지되거나 증명된 게놈 안전 하버 또는 미리 선택된 유전자좌를 비롯한 선택된 유전자좌, 예컨대 본 명세서에 제공된 바와 같은 B2M, TAP1, TAP2 또는 타파신 유전자좌에서의 표적화된 통합 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 표적화된 통합 방법을 위한 게놈 안전 하버는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 목적하는 통합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 세포 숙주 효소 기구에 의한 부위 특이적 상동 재조합이 가능하도록, 목적하는 통합 부위 및1종 이상의 외인성 서열에 특이적인 상동 아암의 쌍을 포함하는 작제물을 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 ZFN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위 포함한다 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다. 추가로 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 TALEN-매개된 삽입이 가능하도록 목적하는 통합 부위에 특이적인 DNA-결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다. 른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, Cas9-매개된 삽입이 가능하도록 Cas9 발현 카세트, 및 목적하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 DICE 재조합효소의 쌍의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 세포 내의 목적하는 통합부위에 도입하는 단계, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 단계, 및 DICE-매개된 표적화된 통합이 가능하도록 DICE 재조합효소를 위한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 목적하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다.
추가로, 본 명세서에 제공된 바와 같이, 상기 안전 하버에서의 표적화된 통합 방법을 사용하여 임의의 관심 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 및 줄기세포 및/또는 전구 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드를 삽입한다. 일부 다른 실시형태에서, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물은 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물에서 외인성 폴리뉴클레오타이드는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 자살 유전자이다. 유도된 세포사에 적합한 자살 유전자 시스템은 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7) 및 AP1903; 티미딘 카이나제(TK) 및 간시클로버(GCV); 사이토신 데아미나제(CD) 및 5-플루오로사이토신(5-FC)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 일부 자살 유전자 시스템은 세포 유형 특이적이고, 예를 들어, T 림프구의 B-세포 분자 CD20로의 유전자 변형은 mAb 리툭시맙의 투여 시에 이의 제거를 허용한다. 추가로, 세툭시맙에 의해서 인식되는 에피토프를 함유하는 변형된 EGFR을 사용하여 세포가 세툭시맙에 노출되는 경우 유전자 조작된 세포를 고갈시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 양상은 카스파제 9(카스파제 3 또는 7), 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 및 B-세포 CD20으로부터 선택된 안전 스위치 단백질을 암호화하는 하나 이상의 자살 유전자의 표적화된 통합 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 방법에 의해서 통합된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 통합을 위해서 작제물 내에 포함된 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해서 유도된다. 프로모터는 유도성 또는 작제성일 수 있고, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 적합한 작제성 프로모터는, 거대세포바이러스(CMV), 연장 인자 1α(EF1α), 포스포글리세레이트 카이나제(PGK), 혼성 CMV 증강자/닭 β-액틴(CAG) 및 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CAG이다.
본 발명에서 방법에 의해서 통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합 부위에서, 숙주 게놈 내의 내인성 프로모터에 의해서 유도될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈 내의 AAVS1 유전자좌에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 AAVS1 프로모터에 의해서 유도된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈 내의 ROSA26 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 ROSA26 프로모터에 의해서 유도된다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈 내의 H11 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 H11 프로모터에 의해서 유도된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈 내의 콜라겐 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 콜라겐 프로모터에 의해서 유도된다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈 내의 HTRP 유전자좌에서 표적화된 통합을 위해서 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 HTRP 프로모터에 의해서 유도된다. 이론적으로, 목적하는 장소에서의 올바른 삽입 만이 내인성 프로모터에 의해서 유도된 외인성 유전자의 유전자 발현을 가능하게 할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적화된 통합 방법을 위한 작제물 내에 포함된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 하나의 프로모터에 의해서 유도된다. 일부 실시형태에서, 작제물은 동일한 프로모터에 의해서 유도된 2개의 인접한 폴리뉴클레오타이드 사이에 하나 이상의 링커 서열를 포함하여 모이어티들 사이에서 더 큰 물리적 분리를 제공하고, 효소 기구에 대한 접근성을 최대화한다. 링커 서열의 링커 펩타이드는 모이어티들(외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 그로부터 암호화된 단백질 또는 펩타이드) 간의 물리적 분리를 관련 기능에 따라서 더 가요성이거나 더 강하게 만들도록 선택된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커 서열은 프로테아제에 의해서 절단 가능하거나 또는 화학적으로 절단 가능하여 별개의 모이어티를 산출할 수 있다. 링커 내의 효소 절단 부위의 예는 단백질분해 효소, 예컨대 엔테로카이나제, 인자 Xa, 트립신, 콜라게나제 및 트롬빈에 의한 전달을 위한 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 숙주에 의해서 자연적으로 생성된 것이거나 또는 그것은 외인성으로 도입된다. 대안적으로, 링커 내의 절단 부위는 선택된 화학물질, 예를 들어, 시아노겐 브로마이드, 하이드록실아민, 또는 저 pH에 노출될 때 절단될 수 있는 부위일 수 있다. 선택적인 링커 서열은 절단 부위의 제공이 아닌 목적을 제공할 수 있다. 링커 서열은 모이어티를 위해서 또 다른 인접한 모이어티에 대한 모이어티의 효과적인 위치결정이 적절하게 기능하는 것을 허용해햐 한다. 링커는 또한 모이어티들 간의 임의의 입체 장애를 예방하기에 충분한 길이의 단순한 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 링커 서열은 예를 들어, 인산화 부위, 바이오티닐화 부위, 설페이션 부위, γ-카복실화 부위 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 번역-후 변형을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 생물학적 활성 펩타이드를 단일의 바람직하지 않은 컨포메이션으로 유지하지 않도록 가요성이다. 링커는 가요성을 제공하기 위해서, 작은 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 및 세린으로 주로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서 링커 서열 중 약 80 또는 90% 이상은 글리신, 알라닌, 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, G4S 링커 펩타이드는 융합 단백질의 단부-가공 도메인과 엔도뉴클레아제 도메인을 분리한다. 2A 링커 서열은 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 생성되는 것을 허용한다. 적합한 링커 서열은 경험적으로 쉽게 식별될 수 있다. 추가로, 링커 서열의 적합한 크기 및 서열은 또한 종래의 컴퓨터 모델링 기술에 의해서 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 서열은 자가-절단 펩타이드를 암호화한다. 일 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 2A이다. 일부 다른 실시형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 도입 서열(Internal Ribosome Entry Sequence: IRES)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 임의의 2개의 연속적인 링커 서열은 상이하다.
표적화된 통합을 위해서 외인성 폴리뉴클레오타이를 포함하는 작제물을 세포에 도입하는 방법은 그 자체로 공지된 세포에 대한 유전자 도입 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 작제물은 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터의 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적 세포(예를 들어, pAl- 11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo)으로의 전달 및/또는 발현 등을 위해서 플라스미드 벡터가 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포로 전달하기 위해서 에피솜 벡터가 사용된다. 상동 재조합을 통해서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 유전자 조작하기 위해서 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV)가 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 달리, rAAV는 숙주 게놈에 통합되지 않는다. 또한, 에피솜 rAAV 벡터는 종래의 표적화 플라스미드의 형질주입과 비교할 때 훨씬 떠 높은 비율로 상동성-지향된 유전자 표적화를 매개한다. 일부 실시형태에서, iPSC의 게놈 내의 표적 부위에서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하기 위해서 AAV6 또는 AAV2 벡터가 사용된다.
II. 게놈-조작된 iPSC의 수득 및 유지 방법
본 발명은 하나 이상의 목적하는 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득 및 유지하는 방법을 제공하고, 여기서 표적화된 편집은 각각의 선택된 편집 부위에서 확장된 게놈-조작된 iPSC 또는 iPSC 유래된 비-만능 세포에서 무손상이고 기능성을 유지한다. 표적화된 편집은 선택된 부위에서 게놈 iPSC 삽입, 결실 및/또는 치환, 즉 표적화된 통합 및/또는 in/del에 도입된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC은 운명 유지 배지(Fate Maintenance Medium: FMM)로서 표 1에 나타낸 세포 배양 배지 중에서 연장된 기간 동안 단일 세포로서 유지, 계대배양 및 확장되고, 여기서 iPSC는 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집 및 기능성 변형을 보유한다. 배지의 성분은 표 1에 나타낸 최적의 범위 내의 양으로 배지 중에 존재할 수 있다. FMM 중에서 배양된 iPSC는 이의 미분화되고, 기저이거나 또는 미경험, 프로파일; 배양물 세정 또는 선택이 필요 없는 게놈 안정성을 계속 유지시키는 것으로 나타났고; 배상체 또는 단일층(배상체의 형성 없음)을 통한 3개의 모든 체세포 계통, 시험관내 분화; 및 테라토마에 형성에 의한 생체내 분화를 쉽게 생성한다(예를 들어, 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 출원 제61/947,979호 참고).
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일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK5 저해제가 없거나 본질적으로 없는 배지 중에서 유지, 계대배양 및 확장되고, 여기서 iPSC는 선택된 부위에서 무손상이고 기능성 표적화된 편집을 보유한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 통합을 위한 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 in/del을 위한 부위는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 유지, 계대배양 및 확장된 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 목적하는 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 유지, 계대배양 및 확장된 게놈-조작된 iPSC는 동일하거나 또는 상이한 목적하는 통합 부위에서 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 줄기세포 및/또는 전구 세포의 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 in/del을 추가로 포함하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 유전자 발현의 파괴를 유발한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-아웃을 유발한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-다운을 유발한다. 일부 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드 를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 선택된 부위(들)에서 in/del을 비롯한 하나 이상의 표적화된 편집을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, in/del은 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 체크 포인트 유전자(check point gene) 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 MHC 부류 I 억제유전자 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 주요 조직적합 복합체와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 B2M, PD1, TAP1, TAP2, 타파신, TCR 유전자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 암호화 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 iPSC의 표적화된 편집을 통해서; 또는 먼저 표적화된 편집에 의해서 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성하고, 이어서 선택된/단리된 게놈-조작된 비-만능 세포를 재프로그래밍하여 비-만능 세포와 동일한 표적화된 편집을 포함하는 iPSC를 수득함으로써 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가 양상은 표적화된 통합 및/또는 표적화된 in/del을 세포에 도입함으로써 재프로그래밍을 병행하여 겪는 게놈-조작된 비-만능 세포를 제공하며, 여기서 접촉된 비-만능 세포는 재프로그래밍을 위해서 충분한 조건 하에 있고, 여기서 재프로그래밍을 위한 조건은 비-만능 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 동시 게놈-조작 및 재프로그래밍을 위한 방법의 다양한 실시형태에서, 표적화된 통합 및/또는 표적화된 in/del은 비-만능 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시킴으로써 재프로그래밍 개시 이전에, 또는 이것에 본질적으로 부수적으로 비-만능 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 병행하여 게놈-조작하고, 비-만능 세포를 재프로그래밍하기 위해서, 표적화된 통합 및/또는 in/del은 또한 비-만능 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시킴으로써 재프로그래밍의 수일 공정이 개시된 후에 비-만능 세포에 도입될 수 있고, 여기서 작제물 보유 벡터는 재프로그래밍 세포가 SSEA4, Tra181 및 CD30을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 내인성 만능 유전자의 안정한 발현을 제시하기 전에 도입된다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 비-만능 세포를 적어도 하나의 재프로그래밍 인자. 및 선택적으로TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제의 조합물(FRM; 표 1)과 접촉시킴으로써 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 임의의 방법을 통과한 게놈-조작된 iPSC는 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제의 조합물(FMM; 표 1)을 포함하는 혼합물을 사용하여 추가로 유지 및 확장된다.
게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 상기 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 PSC에 도입하여 선택된 부위에서 게놈-조작된 iPSC를 수득함으로써 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법은 (a) 하나 이상의 표적화된 편집을 비-만능 세포에 도입하여 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 비-만능 세포를 수득하는 단계, 및 (b) 게놈-조작된 비-만능 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법은 (a) 비-만능 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜 비-만능 세포의 재프로그래밍을 개시하는 단계; (b) 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 게놈-조작을 위해서 재프로그래밍 비-만능 세포에 도입하는 단계; 및 (C) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 클론성 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다.
재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3, L1TD1 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 1종 이상의 재프로그래밍 인자는 폴리펩타이드의 형태일 수 있다. 재프로그래밍 인자는 또한 폴리뉴클레오타이드의 형태일 수 있고, 따라서 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜 및 미니-서클에 의해서 비-만능 세포에 도입된다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 렌티바이러스 벡터에 의해서 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 에피솜 벡터에 의해서 도입된다. 다양한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스 벡터에 의해서 도입된다.
일부 실시형태에서, 비-만능 세포는 동일하거나 또는 상이한 선택된 부위에서 표적화된 통합을 위해서 다수의 벡터에 의해서 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다수의 작제물 및/또는 상이한 프로모터와 함께 이송된다. 이러한 외인성 폴리뉴클레오타이드는 자살 유전자, 또는 표적화 양상을 암호화하는 유전자, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 RNA를 암호화한다. 이들 외인성 폴리뉴클레오타이드는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적-특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해서 유도될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 프로모터를 활성화시키는 조건 하에 있는 경우, 예를 들어 유도제의 존재 하에서 또는 특정 분화된 세포 유형 내에서 발현성이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 iPSC에서 그리고/또는 iPSC로부터 분화된 세포에서 발현된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 구성적 프로모터, 예를 들어 CAG에 의해서 유도된 카스파제-9에 의해서 유도된다. 이들 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물 및/또는 상이한 프로모터는 비-만능 세포로 동시에 또는 연속적으로 이송될 수 있다. 다수의 작제물의 표적화된 통합에 적용된 비-만능 세포는 1종 이상의 재프로그래밍 인자를 동시에 접촉하여 게놈 조작과 병행하여 재프로그래밍을 개시하여, 세포의 동일한 풀 중에서 다수의 표적화된 통합을 포함할 수 있는 게놈-조작된 iPSC를 수득할 수 있다. 이와 같이, 이러한 견고한 방법은 동시 재프로그래밍 및 조작 전략을 가능하게 하여 하나 이상의 선택된 표적 부위 내에 통합된 다수의 양상을 갖는 클론성 게놈 조작된 hiPSC를 유도한다.
일부 실시형태에서, 비-만능 세포는 1종 이상의 내인성 유전자를 비롯한 선택된 부위에서 하나 이상의 in/del이 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 in/del을 포함하는 비-만능 세포는 상기에 기술된 하나 이상의 표적화된 통합을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 유전자 발현의 파괴를 유발한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-아웃을 유발한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-다운을 유발한다. 일부 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 선택된 부위(들)에서 in/del을 비롯한 하나 이상의 표적화된 편집을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, in/del은 면역 반응 조절 및 매개에 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 체크 포인트 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 MHC 부류 I 억제유전자 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 주요 조직적합 복합체와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 B2M, PD1, TAP1, TAP2, 타파신, TCR 유전자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 암호화 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
III. 분화 게놈-조작된 iPSC에 의해서 유전자 조작된 비-만능 세포를 수득하는 방법
본 발명의 추가 양상은 테라토마 형성에 의한 게놈-조작된 iPSC의 생체내 분화 방법을 제공하며, 여기서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 목적하는 부위(들)에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 비롯한 무손상 및 기능성 표적화된 편집을 보유한다. 일부 실시형태에서, 테라토마를 통해서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 목적하는 부위에서 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 테라토마를 통해서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 표적화 양상을 암호화하거나, 또는 줄기세포 및/또는 전구 세포의 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함하는 테라토마를 통해서 게놈-조작된 iPSC로부터 생체내에서 유래된 분화된 세포는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 내인성 유전자 내에 하나 이상의 in/del을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 체크 포인트 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 MHC 부류 I 억제유전자 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 주요 조직적합 복합체와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 B2M, PD1, TAP1, TAP2, 타파신, TCR 유전자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 암호화 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 선택된 부위(들)에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 시험관내에서 조혈 세포 계통 또는 임의의 다른 특이적 세포 유형을 유래시키는 데 사용되며, 여기서, 유래된 비-만능 세포는 선택된 부위(들)에서 기능성 표적화된 편집을 보유한다. 일 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래 세포는 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포, 확정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구체 (MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 여기서 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 이들 세포는 목적하는 부위(들)에서 기능성 표적화된 편집을 보유한다.
iPSC-유래 조혈 세포 계통을 수득하는 적용 가능한 분화 방법 및 조성물을 예를 들어, 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된 국제 출원 제PCT/US2016/044122호에 설명된 것을 포함한다. 제공된 바와 같이, 조혈 세포 계통을 생성시키는 방법 및 조성물은 EB 형성이 필요 없는 무-혈청, 피더-무함유 및/또는 기질-무함유 조건 하에서 그리고 플랫폼을 배양하는 확장 가능한 단일층에서의 hiPSC를 비롯한, 만능 줄기세포로부터 유래된 확정적 조혈 내피세포(HE)를 통한 것이다. 제공된 방법에 따라서 분화될 수 있는 세포는 만능 줄기세포로부터 특히 말단 분화된 세포 및 및 교차분화된 세포, 만능 중간체를 통하지 않는 조혈 운명으로 직접 전이되는 다양한 계통의 세포에 전념된 전구 세포까지의 범위이다. 유사하게, 줄기세포의 분화에 의해서 생산된 세포는 다능성 줄기 또는 전구 세포로부터 말단 분화된 줄기세포, 및 모든 그 사이의 조혈 세포 계통까지의 범위이다.
단일층 배양물 중의 만능 줄기세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화 및 확장시키는 방법은 만능 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 단계를 포함한다. 제공된 바와 같이, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포로부터 배상체를 형성하지 않고 수득 및 확장된다. 이어서 중배엽 세포를 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와의 접촉에 적용하여 만능 줄기세포로부터 배상체를 형성하지 않고 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 확장된 중배엽 세포를 수득한다. bFGF, 및 선택적으로, ROCK 저해제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속 접촉에 의해서, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 확정적 HE 세포로 분화되고, 이것은 분화 동안 확장된다.
조혈 계통의 세포를 수득하기 위한 본 명세서에 제공된 방법은 EB-매개된 만능 줄기세포 분화보다 우수한데, 그 이유는 EB 형성은 보통 최소 세포 확장으로 이어지고, 집단에서 세포의 균질한 확장 및 균질한 분화가 요구되는 다수의 응용에 중요한 단일층 배양물을 허용하지 않고, 힘들고, 낮은 효율이기 때문이다.
제공된 단일층 분화 플랫폼은 조혈 줄기세포 및 분화된 자손, 예컨대 T, B, NKT 및 NK 세포를 유도하는 확정적 조혈 내피세포로의 분화를 가능하게 한다. 단일층 분화 전략은 향상된 분화 효율과 다양한 치료적 응용을 위한 만능 줄기세포-유래 조혈 세포의 치료적으로 관련된 수의 전달을 가능하게 하는 대규모 확장을 조합한다. 추가로, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하는 단일층 배양은 전체 범위의 시험관내 분화, 생체밖 조정, 및 생체내 장기간 조혈 자기-재생, 재구성 및 생착을 가능하게 하는 기능성 조혈 계통 세포로 이어진다. 제공된 바와 같이, iPSC 유래 조혈 계통 세포은 확정적 조혈 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
만능 줄기세포의 확정적 조혈 계통의 세포로의 분화를 유도하는 방법은, 하기를 포함한다: (i) 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF와 접촉시켜, 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하는 단계; (ii) 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없음), 중배엽 세포로부터 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포의 분화 확장을 개시하는 단계; (iii) 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없음), 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포의 분화 및 확장을 개시하는 단계.
일부 실시형태에서, 방법은 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없음), 만능 줄기세포를 시딩 및 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC, 또는 미경험 iPSC, 또는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는 iPSC; 및 iPSC 내에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 그로부터 분화된 조혈 세포에서 보유된다. 만능 줄기세포의 조혈 계통의 세포로의 유도를 위한 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 조혈 계통의 세포로의 분화는 배상체의 생성이 없고, 단일층 배양 형태이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 얻어진 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 얻어진 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+ CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피 세포는 CD34+ CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (i) 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시켜; 확정적 조혈 내피세포의 프레-T 세포 전구체로의 분화를 개시하는 단계; 및 선택적으로, (ii) 프레-T 세포 전구체를 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시켜, 프레-T 세포 전구체의 T 세포 전구체 또는 T 세포로의 분화를 개시하는 단계. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체는 CD45+CD7+이다.
만능 줄기세포의 조혈 계통의 세포로의 유도를 위한 상기 방법의 추가의 일부 실시형태에서, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (i) 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 확정적 조혈 내피세포의 프레-NK 세포 전구체로의 분화를 개시하는 단계, (ii) 만능 줄기세포-유래 프레-NK 세포 전구체를 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시켜(여기서 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없음), 프레-NK 세포 전구체의 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 분화를 개시하는 단계. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 전구세포는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, 및 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해서 추가로 정의된다.
따라서, 상기 분화 방법을 사용하면, iPSC 유래 조혈 세포의 하나 이상의 집단 (i) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하면, CD34+ HE 세포(iCD34); (ii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하면, 확정적 조혈 내피세포(iHE); (iii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하면, 확정적 HSC; (iv) iMPP-A를 사용하면, 다능성 전구 세포(iMPP); (v) iTC-A2, 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하면, T 세포 전구체(ipro-T); (vi) iTC-B2를 사용하면 T 세포(iTC); (vii) iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하면, NK 세포 전구체(ipro-NK); 및/또는 (viii) NK 세포(iNK), 및 iNK-B2을 수득할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 다음과 같다:
a. iCD34-C는 ROCK 저해제, bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11, IGF, 및 EPO로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하고; TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고;
b. iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
c. iTC-A2는ROCK 저해제; SCF, Flt3L, TPO, 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하고;
d. iTC-B2는 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고; 여기서 조성물은 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없고;
e. iNK-A2는 ROCK 저해제, 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하고;
f. iNK-B2는 SCF, Flt3L, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 수득된 게놈-조작된 iPSC-유래 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 하나 이상의 목적하는 통합 부위 내에 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래 세포는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 줄기세포 및/또는 전구 세포의 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈-조작된 iPSC-유래 세포는 체크 포인트 유전자, 내인성 T 세포 수용체 유전자, 및 MHC 부류 I 억제유전자 유전자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈-조작된 iPSC-유래 세포는 B2M 유전자 내에 in/del을 추가로 포함하고, 여기서 B2M이 넉 아웃된다.
추가로, 제1 운명의 게놈-조작된 조혈 세포를 제2 운명의 게놈-조작된 조혈 세포로 얻기 위한 적용 가능한 탈분화 방법 및 조성물은 예를 들어, 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된 국제 공개 제WO2011/159726호에 설명된 것을 포함한다. 그것에 제공된 방법 및 조성물은 재프로그래밍 동안 내인성 Nanog 유전자의 발현을 제한하고; 비-만능 중간체 세포를 중간체 세포의 목적하는 세포 유형으로의 분화를 위한 조건에 적용함으로써 출발 비-만능 세포를 비-만능 중간체 세포로 부분적으로 재프로그래밍하는 것을 허용한다.
IV. iPSC 세포 내에 관심 유전자를 도입하기 위한 선택된 유전좌에서의 표적화된 통합을 위한 조성믈
상기의 관점에서, 본 발명은 통합 부위에서 임의의 내인성 서열의 결실이 있거나 또는 없이, 선택된 부위에서 유도 만능 줄기세포(iPSC)의 게놈 내의 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합을 위한 작제물을 제공한다. 일 실시형태에서, 작제물은 하나 이상의 관심 단백질을 발현하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 적어도 1종의 외인성 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 작제물은 표적화된 통합을 위해서 벡터에 의해서 iPSC로 이송된다. 다른 실시형태에서, 작제물은 표적화된 통합을 위해서 벡터에 의해서 비-만능 세포로 이송되고, 이어서 비-만능 세포는 재프로그래밍에 적용되어 게놈-조작된 iPSC가 수득된다. 두 접근법 중 하나에 의해서, 작제물은 통합이 유지되고, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 재프로그래밍 또는 벡터 이송으로부터 수득된 iPSC, 후속으로 확장된 iPSC, iPSC로부터 유래된 분화된 세포 및 그로부터 유래된 탈분화된 세포에서 기능성이다.
일부 실시형태에서, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 적어도 1종의 외인성 프로모터를 포함하는 작제물은 선택된 부위에 특이적인 상동성 아암을 추가로 포함하고, 상동성 아암은 작제물에서 프로모터 및 관심 외인성 폴리뉴클레오타이드에 플랭킹되어 있다. 작제물의 이러한 실시형태는 뉴클레아제-독립적인 표적화된 통합 전략을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서 외인성 프로모터는 CAG이다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 외인성 프로모터를 갖는 작제물 내에 포함된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 링커 서열에 의해서 서로에 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 자가-절단 펩타이드를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 도입 서열(IRES)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 작제물 내의 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 다시스트론성이다.
1종 이상의 외인성 프로모터를 포함하고, 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 작제물의 일부 실시형태는 마커를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 선택된 부위에서 내인성 프로모터에 의해서 유도된다. 일 실시형태에서, 하나의 폴리뉴클레오타이드는 형광 단백질을 암호화한다. 다른 실시형태에서, 하나의 폴리뉴클레오타이드는 퓨로마이신-내성 유전자이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 작제물은 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함하는 안전 하버 유전자좌에서 표적화된 통합을 가능하게 하는 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 안전 하버 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 및 RUNX1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 작제물은 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 게놈-조작된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 프로모터에 의해서 유도된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적-특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상이한 프로모터에 의해서 유도된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 선택된 안전 하버 유전자좌 내에 통합된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상이한 선택된 안전 하버 유전자좌 내에 통합된다. 특정 일 실시형태에서, 외인성 또는 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 외인성 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상은 1종 이상의 안전 스위치 단백질을 암호화한다. 안전 스위치 단백질은 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7), 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 및 B-세포 CD20으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 작제물 내에 포함된 자살 유전자는 카스파제-9를 암호화한다. 일 실시형태에서, 작제물 내에 포함된 자살 유전자는 티미딘 카이나제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 작제물은 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 및 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌 중 하나에서 표적화된 통합을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 작제물은 AAVS1에서 표적화된 통합을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 작제물은 ROSA26에서 표적화된 통합을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 작제물은 H11에서 표적화된 통합을 위한 것이다.
본 발명은 또한 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 제공한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 NHEJ를 사용하여 iPSC 및/또는 편집으로의 벡터에 의한 작제물 이송을 통해서 수득된다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 표적화된 편집을 갖는 재프로그래밍 비-만능 세포로부터 수득된다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 재프로그래밍 인자, 재프로그래밍 소분자 및/또는 관심 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합을 위한 작제물을 보유하는 벡터를 사용하여 비-만능 세포를 병행하여 재프로그래밍 및 게놈-조작하여 수득된다.
일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질로부터 선택된 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정과 연관된 단백질; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 in/del을 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 in/del을 추가로 포함하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 유전자 발현의 파괴를 유발한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-아웃을 유발한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-다운을 유발한다. 일부 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 선택된 부위(들)에서 in/del을 포함하는 하나 이상의 표적화된 편집을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, in/del은 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 체크 포인트 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 1종 이상의 내인성 MHC 부류 I 억제유전자 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 주요 조직적합 복합체와 연관된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 B2M, PD1, TAP1, TAP2, 타파신, TCR 유전자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 암호화 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, B2M 유전자 내에서 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M 널 또는 저, 및 HLA-I 결핍성이다.
일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 선택된 부위 내에 통합된 하나의 자살 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 각각 동일하거나 또는 상이한 통합 부위 내에 통합된 적어도 2개의 자살 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적-특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해서 유도된다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 하나 이상의 선택된 내인성 유전자 내에 in/del(들)을 추가로 포함하는 선택된 통합 부위(들)에서 하나 이상의 자살 유전자를 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 목적하는 양상의 다수의 표적화된 편집을 갖는 비-만능 세포가 유도된 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위해서 표 1의 배양 플랫폼을 사용하여 재프로그래밍하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 표적화된 통합 또는 in/del을 위한 비-만능 세포의 게놈 조작은 비-만능 세포의 재프로그래밍과 동시에 실시되고, 견고하고, 효율적이고, 정확하고, 신뢰할 수 있는 방식으로 게놈-조작된 iPSC를 생성한다.
본 발명은 게놈-조작된 iPSC로부터 유도된 비-만능 세포를 추가로 제공하며, 여기서 게놈-조작된 iPSC는 iPSC의 표적화된 편집을 통해서, 또는 부위 특이적 통합 또는 in/del을 갖는 게놈-조작된 비-만능 세포의 재프로그래밍을 통해서 연속적으로(먼저 재프로그래밍된 iPSC를 수득하고, 이어서 게놈-조작을 수행하거나; 또는 먼저 게놈-조작된 비-만능 세포를 수득하고, 이어서 재프로그래밍을 수행하거나), 또는 병행하여(세포의 동일한 풀을 동시에 재프로그래밍 및 게놈-조작함) 수득된다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래 비-만능 세포는 전구 세포 또는 완전히-분화된 세포이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC-유래 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 또는 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포이다.
또한 본 발명에 의해서 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 조성물은 게놈-조작된 비-만능 세포를 동일한 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC로 재프로그래밍하기 위해서 게놈-조작된 비-만능 세포; 1종 이상의 재프로그래밍 인자; 및 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물을 포함한다. 상기 조성물의 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 게놈-조작된 비-만능 세포는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적-특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해서 유도된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이한 선택된 부위에서 표적화된 통합이 가능한 상이한 작제물 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1 또는 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 다른 유전자좌를 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물은 비-만능 세포, 1종 이상의 부위-특이적 엔도뉴클레아제, 1종 이상의 재프로그래밍 인자; 및 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제의 조합물, 및 선택적으로 표적화된 통합을 위해서 상동상 아암에 플랭킹된 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 1종 이상의 작제물을 1종 이상의 작제물을 포함하며, 여기서 조성물은 비-만능 세포를 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC로 병행하여 게놈-조작 및 재프로그래밍하기에 유용하다. 일부 실시형태에서, 상이한 작제물 및/또는 in/del은 재프로그래밍 인자와 동시에 또는 연속적으로 비-만능 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 상이한 작제물 및/또는 in/del은 재프로그래밍 동안 비-만능 세포에 도입되어, 게놈 조작 및 재프로그래밍은 동시성 또는 병행성이다.
일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물은 비-만능 세포, 1종 이상의 재프로그래밍 인자; 및 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제의 조합물, 및 표적화된 통합을 위해서 상동성 아암에 플랭킹된 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 1종 이상의 작제물을 포함하고, 여기서 조성물은 비-만능 세포를 조성물 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC로 병행하여 게놈-조작 및 재프로그래밍하기에 유용하다. 일부 실시형태에서, 상이한 작제물 및/또는 in/del은 재프로그래밍 인자와 동시에 또는 연속적으로 비-만능 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 상이한 작제물 및/또는 in/del은 재프로그래밍 동안 비-만능 세포에 도입되어, 게놈 조작 및 재프로그래밍은 동시성 또는 병행성이다.
추가로, 게놈-조작된 비-만능 세포의 재프로그래밍으로부터 수득된 게놈-조작된 iPSC를 유지하기 위한 조성물이 또한 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 조성물은 게놈-조작된 비-만능 세포로부터 재프로그래밍된 게놈-조작된 iPSC; 및 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제의 조합물을 포함한다. 일 실시형태에서, 재프로그래밍으로부터 수득된 iPSC는 장기간 계대배양 및 확장 동안 만능성 및 표적화된 편집을 보유한다.
또한 게놈-조작된 iPSC 및 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서 게놈-조작된 iPSC는 (a) 게놈-조작된 비-만능 세포를 재프로그래밍하거나(여기서 수득된 iPSC는 게놈-조작된 비-만능 세포 내에 포함된 동일한 표적화된 편집을 포함함); 또는 (b) 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 도입함으로써 클론성 iPSC 또는 iPSC의 풀을 게놈 조작하거나; 또는 (c) 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉된 재프로그래밍 비-만능 세포의 풀에 도입함으로써 게놈 조작함으로써 수득된다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 비-만능 세포 재프로그래밍된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정과 연관된 단백질; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 in/del을 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 1종 이상의 내인성 유전자 내에 in/del을 추가로 포함하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
V. 유전자 조작된 iPSC 및 이로부터의 기능성 양상을 갖는 유래된 면역 세포의 치료적 용도
본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물을 이용하여 유전자 조작된 iPSC 및/또는 상기 iPSC로부터 유래된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단을 포함하는 조성물을 제공하되, 면역 세포는 유전자 조작되고, 세포 기반 입양 요법에 적합하다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래된 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proT 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proNK 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 유전자 조작된 면역 세포는 개선된 치료적 가능성을 위해 생체밖에서 추가로 조정된다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비의 미경험 T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비의 I형 NKT 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비의 적응 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포 또는 NK 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 동종이계이다. 일부 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전자 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, 또는 NK 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 자연 발생적이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 효과기 세포에서 바람직한 치료적 속성을 전달하는 유전자 각인을 포함하는데, 이 유전자 각인은 상기 iPSC로부터 유래된 분화된 조혈 세포에서 보유되고, 기능성이다.
일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 유전자 각인은 (i) 비-만능 세포를 iPSC로 재프로그래밍한 동안에 또는 후에 만능 세포 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전자 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 유지 가능한 치료적 속성을 포함하되, 상기 만능 세포는 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 공급원 치료적 속성을 보유하는데, 이는 또한 iPSC 유래 조혈 계통 세포 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5 또는 RFXAP, 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자의 결실 또는 감소된 발현; (ii) 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 결합을 위한 HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체 또는 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다.
또한 일부 다른 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상에 관한 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 B2M 널 또는 저, HLA-E/G, PDL1, A2AR, CD47, LAG3 널 또는 저, TIM3 눌, TAP1 널 또는 저, TAP2 널 또는 저, 타파신 널 또는 저, NLRC5 널 또는 저, PD1 널 또는 저, RFKANK 널 또는 저, CIITA 널 또는 저, RFX5 널 또는 저 및 RFXAP 널 또는 저 중 하나 이상을 포함한다. 변형된 HLA 클래스 I 및/또는 II을 갖는 이들 세포는 면역 검출에 대한 증가된 내성을 가지며, 따라서 개선된 생체내 지속성을 제공한다. 게다가, 이러한 세포는 입양 세포 요법에서 HLA 매칭에 대한 필요를 회피할 수 있고, 따라서, 보편적, 기존의 치료 요법의 공급원을 제공한다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유도체 조혈 세포는 hnCD16(고-친화도 비-절단성 CD16), HLA-E, HLA-G, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, 또는 TCR 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 세포는 개선된 효과기 능력을 갖는다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 항원 특이적이다.
다양한 질환은 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 본 발명의 면역 세포를 도입함으로써 개선될 수 있다. 질환의 예는 원형 탈모증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 피부근육염, 당뇨병(1형), 일부 형태의 소아 특발성 관절염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 일부 형태의 심근염, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근육염, 원발성 담즙성 간병변, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 낭창, 일부 형태의 갑상선염, 일부 형태의 포도막염, 백반증, 다발혈관염 육아종증(베게너 육아종증)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 자가면역 장애; 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 및 골수 이형성 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액학적 악성 종양; 뇌, 전립선, 유방, 폐, 결장, 자궁, 피부, 간, 뼈, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 머리, 목, 위, 자궁경부, 직장, 후두 또는 식도의 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 고형 종양; 및 HIV-(인간 면역결핍 바이러스), RSV-(호흡기 세포융합 바이러스), EBV-(엡스타인-바르 바이러스), CMV-(거대세포바이러스), 아데노바이러스- 및 BK 폴리오마 바이러스-관련 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 감염을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 대상체에게 본 명세서에 기재된 임의의 tHE 세포를 포함하는 조성물을 투여함으로써 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "치료하는", "치료" 등은 일반적으로 목적으로 하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기여하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료"는 포유류에서 질환의 임의의 치료를 아우르며, 질환의 성향이 있을 수 있지만, 아직 그것이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 생기는 것을 방지하는 것; 질환을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 또는 질환을 없애는 것, 즉, 질환의 질환의 퇴보를 야기하는 것을 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질환 또는 손상의 개시 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 또는 감소시키는 경우 진행 중인 질환의 치료는 특정 관심 대상을 가진다.
특정 실시형태에서, 대상체는 세포 요법에 의해 치료되고/되거나, 개선되고/되거나 좋아질 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 가진다. 일부 실시형태는 세포 요법이 필요하며, 이에 의해 세포 요법, 예를 들어, 세포 물질이 대상체에 투여되는 요법은 손상, 질환 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상의 중증도를 치료하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 좋아지게 하고/하거나 감소시킬 수 있는, 대상체가 손상, 질환 또는 병태를 갖는 대상체이다. 특정 실시형태는 세포 요법이 필요한 대상체가 골수 또는 줄기세포 이식을 위한 후보, 화학요법 또는 방사선 조사 요법을 받은 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어, 조혈계의 과증식성 장애 또는 암을 갖거나 또는 가질 위험에 있는 대상체, 종양, 예를 들어, 고형 종양이 있거나 또는 발생할 위험에 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환을 갖거나 또는 가질 위험에 있는 대상체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다는 것을 상정한다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 조혈 계통 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공하되, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 배지를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 CD34+ HE 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 HSC를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입하는 것에 의한 상기 약제학적 조성물의 치료적 용도를 제공하되, 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 가진다.
단리된 만능 줄기세포 유래 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 줄기세포 유래 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 정제된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포, proT 세포, proNK 세포 또는 HSC를 갖는 약제학적 조성물, 예컨대 세포 요법이 필요한 대상체를 치료하기 위해서 약 95%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 만능 줄기세포 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 포함하며, 집단은 약 0.1 %, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 미만의 iPSC 유래된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 포함한다. 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 일부 실시형태에서 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 초과의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 약 0.1% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 60% 내지 70%, 약 70% 내지 80%, 약 80% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 또는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 약 0.1%, 약 1%, 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 자가와 동종이계 면역 세포가 둘 다 세포 요법에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 자가 세포 요법은 감소된 감염, GvHD에 대한 낮은 확률 및 빠른 면역 재구성을 가질 수 있다. 동종이계 세포 요법은 면역 매개 이식편대 숙주반응(GVM) 효과 및 낮은 재발률을 가질 수 있다. 세포 요법이 필요한 환자 또는 대상체의 특정 병태에 기반하여, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 투여할 특정 유형의 요법을 결정할 수 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 동종이계이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제형의 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 자가이다. 자가 이식에 대해, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 완전하게 또는 부분적으로 HLA-매칭된다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 HLA-매칭되지 않는다.
일부 실시형태에서, 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 0.5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 10 x 105개의 세포, 적어도 0.5 x 106개의 세포, 적어도 0.75 x 106개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 1.25 x 106개의 세포, 적어도 1.5 x 106개의 세포, 적어도 1.75 x 106개의 세포, 적어도 2 x 106개의 세포, 적어도 2.5 x 106개의 세포, 적어도 3 x 106개의 세포, 적어도 4 x 106개의 세포, 적어도 5 x 106개의 세포, 적어도 10 x 106개의 세포, 적어도 15 x 106개의 세포, 적어도 20 x 106개의 세포, 적어도 25 x 106개의 세포, 또는 적어도 30 x 106개의 세포이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 0.1 x 105개의 세포 내지 약 10 x 105개의 세포; 약 0.5 x 106개의 세포 내지 약 5 x 106개의 세포; 약 1 x 106개의 세포 내지 약 3 x 106개의 세포; 약 1.5 x 106개의 세포 내지 약 2.5 x 106 세포; 또는 약 2 x 106개의 세포 내지 약 2.5 x 106 세포이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 1 x 106개의 세포 내지 약 3 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 5 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 10 x 106개의 세포, 약 10 x 106개의 세포 내지 약 20 x 106개의 세포, 약 10 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106 세포, 또는 약 20 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106개의 세포이다.
일부 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 1 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 20 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 10 x 106개의 세포, 약 2.0 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106개의 세포, 약 2.0 x 106개의 세포 내지 약 20 x 106개의 세포, 또는 약 2.0 x 106개의 세포 내지 약 10 x 106개의 세포이다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 1 x 106개의 세포, 약 2 x 106개의 세포, 약 5 x 106개의 세포, 약 7 x 106개의 세포, 약 10 x 106개의 세포, 약 15 x 106개의 세포, 약 17 x 106개의 세포, 약 20 x 106개의 세포 약 25 x 106 세포, 또는 약 30 x 106개의 세포이다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 부분적 또는 단일 제대혈 중의 면역 세포의 수이거나, 또는 적어도 0.1 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 0.5 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 1 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 5 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 10 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 0.5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 0.75 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1.25 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1.5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1.75 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 2 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 2.5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 3 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 4 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 10 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 15 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 20 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 25 x 106개의 세포/체중(㎏), 또는 적어도 30 x 106개의 세포/체중(㎏)이다.
본 발명에 의해 제공된 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포는 투여 전에 생체밖 또는 시험관내에서 확장되는 일 없이 대상체에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 개선된 치료적 가능성을 갖는 면역 세포를 얻기 위해 1종 이상의 제제를 이용하여 생체밖에서 조정되고, 처리된다. 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포의 조정된 집단은 치료제(들)를 제거하기 위해 세척될 수 있고, 개선된 집단은 시험관내 집단의 추가적인 확장 없이 환자에게 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 1종 이상의 작용제를 이용한 조정 전에 확장된 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여 TCR, CAR 또는 단백질을 발현시키기 위해서 재조합적으로 생산될 수 있다.
재조합 TCR 또는 CAR을 발현시키는 유전자 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대해, tHE 세포의 유전자 변형 전이든 또는 후이든, 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 6,534,055호; 6,905,680호; 6,692,964호; 5,858,358호; 6,887,466호; 6,905,681호; 7,144,575호; 7,067,318호; 7,172,869호; 7,232,566호; 7,175,843호; 5,883,223호; 6,905,874호; 6,797,514호; 6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 방법을 이용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
특정 실시형태에서, 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있을 수 있거나 또는 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 제제는 동일한 표면(즉, "시스" 형성)에 또는 별개의 표면(즉, "트랜스" 형성)에 결합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 결합될 수 있고, 다른 제제는 용액 중에 있다. 일 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 신호는 세포 표면에 결합될 수 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 결합된다. 특정 실시형태에서, 제제는 둘 다 용액 중에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서, 세포 발현 Fc 수용체 또는 본 발명에서 T 림프구를 활성화 및 확장시킴에 있어서 사용하기 위해 상정되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 미국 특허 출원 간행물 제20040101519호 및 제20060034810호에 개시된 것과 같은 제제에 결합하는 다른 결합제와 같이 표면에 가교된다.
본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 조성물은 멸균일 수 있고, 인간 환자에 대한 투여에 적합하거나 바로 투여될 수 있다(즉, 임의의 추가적인 가공 없이 투여될 수 있다). 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 환자에게 바로 주입된다. 바로 투여할 수 있는 세포 기반 조성물은 조성물이 대상체에 대한 이식 또는 투여 전에 임의의 추가적인 치료 또는 조작을 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다.
환자에 대한 투여에 적합한 멸균의, 치료적으로 허용 가능한 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 배지, 예를 들어, 세포 배양 배지), 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 투여 중인 특정 조성물에 의해서 뿐만 아니라 치료 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 투여된다. 따라서, 본 발명의 치료 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985]을 참조하며, 이의 개시내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨).
특정 실시형태에서, 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 갖는 치료적 세포 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지를 가진다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 치료 조성물은 장용 또는 비경구 투여 방법에 의해 별개로 또는 목적으로 하는 치료 목적을 달성하기 위해 다른 적합한 화합물과 조합하여 투여될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 이를 치료 중인 인간 대상체에 대한 투여에 적합하게 제공하기 위해 충분히 고순도를 가지고, 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 추가로 치료 조성물의 안정성을 유지하거나 또는 증가시켜야 한다
이러한 담체 용액은 또한 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 완충제는 화학물질 구성이 PH의 상당한 변화 없이 산 또는 염기를 중화시키는 용액 또는 액체를 지칭한다. 본 발명에 의해 생각되는 완충제의 예는 둘베코 인산염 완충 식염수(PBS), 링거 용액, 수 중 5% 덱스트로스(D5W), 정상/생리 식염수(0.9% NaCl)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이들 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 치료 조성물의 PH를 약 3 내지 약 10으로 유지하는 데 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이렇게 해서, 완충제는 총 조성물을 기준으로 중량에 따라 약 5%만큼일 수 있다. 전해질, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 염화나트륨 및 염화칼륨은 또한 치료 조성물 중에 포함될 수 있다. 일 양상에서, 치료 조성물의 PH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료 조성물의 PH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 상기 PH 범위 중 하나의 PH를 갖는 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 PH가 약 7이다. 대안적으로, 치료 조성물은 PH 범위가 약 6.8 내지 약 7.4이다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 PH가 약 7.4이다.
본 발명의 멸균 조성물은 비독성 약제학적으로 허용 가능한 배지 중의 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 현탁액은 세포가 고체 지지체에 부착되지 않는 비부착 조건을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에 유지된 세포는 교반될 수 있고, 지지체, 예컨대 배양 접시에 부착되지 않는다.
현탁액은 미세하게 나누어진 종이 다른 종과 조합되는 분산물(혼합물)이며, 전자는 매우 미세하게 나누어지고, 혼합되어서, 그것은 빠르게 침강하지 않는다. 현탁액은 용액을 포함하는 액체 배지와 같은 비히클을 이용하여 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 치료 조성물은 줄기 및/또는 전구 세포가 허용 가능한 액체 배지 또는 용액, 예를 들어, 식염수 또는 무 혈청 배지 내에서 분산되며, 고체 지지체에 부착되지 않는 현탁액이다. 매일의 생활에서, 가장 통상적인 현탁액은 액체 물 중의 고체 현탁액이다. 허용 가능한 희석제 중에서, 예를 들어, 사용될 수 있는 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, 등장성 염화나트륨(식염수) 용액 및 무혈청 세포 배양 배지이다. 일부 실시형태에서, 고장성 용액은 현탁액을 제조하는 데 사용된다. 추가로, 멸균의 고정유는 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 비경구 적용을 위해, 특히 적합한 비히클은 용액, 바람직하게는 유성 또는 수성 용액뿐만 아니라 현탁액, 에멀전 또는 이식물로 이루어진다. 수성 현탁액은 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시형태에서, 주입 용액은 대상체 조직에 대해 등장성이다. 일부 실시형태에서, 주입 용액은 대상체 조직에 대해 고장성이다.
약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및 본 발명의 바로 투여할 수 있는 약제학적 조성물을 포함하는 다른 성분은 치료 조성물이 임상 요법에서 사용되도록 허용할 미국 약제 등급 시약으로부터 유래된다. 전형적으로, 임의의 배지, 용액 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 이들 마무리 시약은 관련 기술 분야의 통상적인 방식, 예컨대 멸균 필터에서 멸균되고, 사용 전에 다양한 목적으로 하지 않는 오염물질, 예컨대 마이코플라스마, 내독소, 또는 바이러스 오염물질에 대해 시험된다. 일 실시형태에서 약제학적으로 허용 가능한 담체는 인간 또는 동물 유래의 천연 단백질이 실질적으로 없고, 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 세포 집단을 저장하는 데 적합하다. 약제학적 조성물은 인간 환자에게 투여되도록 의도되고, 따라서, 세포 배양물 성분, 예컨대 소 혈청 알부민, 말 혈청, 및 소태아 혈청이 실질적으로 없다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지, 특히 본 발명의 조성물 및/또는 배양물의 용도를 부분적으로 제공한다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 유지, 성장 및/또는 건강상태를 지지하는 임의의 배지는 약제학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 무 혈청 및/또는 무 피더 배지이다.
약제학적 조성물은 유래된 조혈 계통 세포의 조정된 단리 집단을 저장하는 데 적합한 무 혈청 배지를 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 무 혈청 배지는 무 동물이고, 선택적으로 무 단백질일 수 있다. 선택적으로 배지는 생약제학적으로 허용 가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 무 동물 배지는 성분이 비동물 공급원으로부터 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무 동물 배지 중의 천연 동물 단백질을 대체하며, 영양소는 합성, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 얻어진다. 대조적으로 무 단백질 배지는 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 배지의 상기 예가 예시적이며 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지 제형을 어떤 방법으로 제한하지 않는다는 것과 관련 기술 분야에 공지되어 있고 입수 가능한 다수의 적합한 배지가 있다는 것을 인식할 것이다.
약제학적 조성물은 마이코플라즘, 내독소, 및 미생물 오염물질이 실질적으로 없다. 특정 실시형태에서, 치료 조성물은 약 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.1 또는 0.05 ㎍/㎖ 미만의 소 혈청 알부민을 함유한다.
마이코플라스마 및 미생물 오여물질에 대해, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 없는"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 일반적으로 허용되는 시험에 대한 부정적 판독을 의미한다. 예를 들어, 마이코플라스마 오염물질은 브로스 배지에서 치료 조성물의 샘플을 다시 배양시킴으로써 결정되고, 적절한 양성 및 음성 대조군에 의해 37℃에서 제1일, 제3일, 제7일 및 제14일에 한천 플레이트를 거쳐서 분산된다. 샘플 외관은 양성 및 음성 대조군에 대해 현미경에 의해 100x로 비교된다. 추가적으로, 지표 세포 배양물의 접종은 3 및 5일 동안 인큐베이션되고, DNA-결합 형광 색소를 이용하여 형광현미경에 의해 마이코플라스마의 존재에 대해 600 x에서 시험된다. 한천 및/또는 브로스 배지 절차 및 지표 세포 배양 절차가 마이코플라스마 오염의 증거를 나타내지 않는다면 샘플은 충분한 것으로 고려된다.
유기 용매 또는 적합한 유기 용매는 일반적으로 용액을 생성시키는, 고체, 액체 또는 기체 용질을 용해시키는 탄소 함유 액체 또는 기체에 관한 것이다. 적합한 유기 용매는 포유류 세포에 대한 생체밖 투여 또는 포유류 세포와 함께 인큐베이션하는 데 적절한 것이고, 또한 예컨대 인큐베이션 또는 투여 시간 동안 선택된 농도에서 생체밖 조건(예를 들어, 세포 배양물) 하에서 또는 생체내에서 최소 독성 또는 다른 저해 효과를 가짐으로써 대상체에 대한 생체에 투여에 적절하게 될 수 있다. 적합한 유기 용매는 또한 본 명세서에 기재된 제제의 저장 안정성 및 조작에 적절하여야 한다.
적합한 유기 용매의 예는 다이메틸 설폭사이드(DMSO), N,N-다이메틸폼아마이드(DMF), 다이메톡시에탄(DME) 및 다이메틸아세트아마이드(이들의 혼합물 또는 조합물을 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물 또는 유기 용매는 메틸 아세테이트가 실질적으로 없는데, 이는 조성물 또는 용매 중에 미량, 바람직하게는 검출 불가능한 양(예를 들어, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 기체 크로마토그래피(GC) 등으로 측정) 메틸 아세테이트만이 있어야 한다는 것을 의미한다.
내독소가 없는 용기 또는 조성물은 용기 또는 조성물이 기껏해야 미량의(즉, 대상체에 대해 유해한 생리적 효과를 갖지 않는 양) 내독소, 또는 검출 불가능한 양의 내독소를 함유한다는 것을 의미한다. "내독소가 실질적으로 없는" 세포는 세포의 용량 당 내독소가 FDA에 의해 생물학에 대해 허용되는 것(1일당 5 EU/kg 체중의 총 내독소이며, 평균 70 kg인 사람에 대해 세포의 총 용량 당 350 EU임)보다 더 적다는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 무 내독소 용기 및/또는 조성물은 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 무 내독소이다. 내독소는 그램 양성 박테리아, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에서 발견될 수 있지만, 내독소는 특정 박테리아, 전형적으로 그램 음성 박테리아와 관련된 독소이다. 대부분의 우세한 내독소는 다양한 그램 음성 박테리아의 외막에서 발견되는 지질다당류(LPS) 또는 지질올리고당(LOS)인데, 이는 이들 박테리아가 질환을 야기하는 능력에서 중심 병원성 특징을 나타낸다. 인간에서 소량의 내독소는 다른 유해한 생리적 효과 중에서도 발열, 혈압 저하, 및 염증 및 응고의 활성화를 생성할 수 있다. 따라서, 종종 약물 제품 용기로부터 대부분의 또는 모든 미량의 내독소를 제거하는 것이 바람직할 수 있는데, 소량조차도 인간에서 유해한 효과를 야기할 수 있기 때문이다. 내독소는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 용기로부터 제거될 수 있으며, 예를 들어, 용기는 무 내독소 물을 이용하여 HEPA 여과된 세척 장비에서 세정될 수 있고, 250℃에서 발열원이 제거되며, 그리고 클래스 100/10 클린룸 내에 위치된 HEPA 여과 워크스테이션에서 깨끗하게 포장된다(예를 들어, 클래스 100 클린룸은 1입방피트의 공기 중에서 1/2 마이크론보다 더 큰 100개 이하의 입자를 함유한다).
실시예
다음의 실시예는 예시의 방법에 의해, 그리고 제한의 방법에 의하지 않고 제공한다.
실시예 1 - 물질 및 방법
상이한 안전 하버 유전자좌 통합 전략과 조합하여 다양한 프로모터의 제어 하에서 자살 시스템을 효과적으로 선택 및 시험하기 위해서, 본 출원인의 소유의 hiPSC 플랫폼을 사용하였는데, 이는 단일 세포 계대배양 및 고-처리량, 96-웰 플레이트-기반 유세포 분석법 분류를 가능하게 하여, 단일 또는 다수의 유전자 조정을 갖는 클론성 hiPSC의 유도를 허용한다.
소분자 배양물 중에서의 hiPSC 유지 : 배양물의 컨플루언시가 75% 내지 90%에 도달된 후 hiPSC를 단일 세포로서 일상적으로 계대배양하였다. 단일-세포 해리를 위해서, hiPSC를 PBS(메디에이테크(Mediatech))로 1회 세척하고, 애큐타제(Accutase)(밀리포어(Millipore))로 3 내지 5분 동안 37℃에서 처리한 후, 피펫팅하여 단일-세포 해리를 보장하였다. 이어서, 단일-세포 현탁물을 종래의 배지와 동일 부피로 혼합하고, 225 Х g에서 4분 동안 원심분리하고, FMM 중에 재현탁하고, 마트리겔-코팅된 표면 상에 플레이팅 하였다. 계대배양은 전형적으로 1:6 내지 1:8이었고, 마트리겔로 2 내지 4시간 동안 37℃에서 미리 코팅된 조직 배양 플레이트로 옮기고, FMM을 2 내지 3일 마다 공급하였다. 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO2로 설정된 가습 인큐베이터에서 유지시켰다.
게놈 안전 하버 내로의 iCasp9의 표적화된 삽입을 위한 ZFN, CRISPR을 갖는 인간 iPSC 게놈 편집 : ZFN 매개된 게놈 편집을 위해서, 2백만개의 iPSC에 2.5ug ZFN-L(FTV893; 서열번호 2 및 4), 2.5ug ZFN-R(FTV894; 서열번호 3 및 5) 및 5ug AAVS1 iCasp9 공여자 작제물(FTV895, FTV930, FTV921, FTV931, FTV932, FTV952 또는 FTV953; i카스파제9 서열번호 7 및 8) 플라스미드 DNA의 혼합물을 형질주입하였다. CRISPR 매개된 게놈 편집을 위해서, 2백만개의 iPSC에 5ug ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922; 서열번호 6) 및 5ug ROSA26 iCasp9 공여자 작제물(FTV955 또는 FTV956)의 혼합물을 형질주입하였다. 형질주입은 파라미터 1500V, 10ms, 3펄스를 사용하여 네온 형질주입 시스템(Neon transfection system)(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 수행하였다. 형질주입 후 2 또는 3일에, 플라스미드가 인공 프로모터-드라이버 GFP 및/또는 RFP 발현 카세트를 함유하는 경우 유세포 분석법을 사용하여 형질주입 효율을 측정하였다. 형질주입 후 4일에, 퓨로마이신을 0.1ug/㎖의 농도로 처음 7일 동안 그리고 7일 후에는 0.2ug/㎖의 농도로 배지에 첨가하여 표적화된 세포를 선택하였다. 퓨로마이신 선택 동안, 세포를 10일에 새로운 마트리겔-코팅된 웰 상에서 계대배양하였다. 16일 또는 퓨로마이신 선택 이후에, 살아남은 세포를 GFP+ iPS 세포 백분율에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다.
게놈-편집된 iPSC의 벌크 분류 및 클론 분류 : AAVS1 EF1α 또는 ZFN에 의해서 매개된 CAG 프로모터-유도된 iCasp9-2A-GFP로 표적화된 iPSC를 퓨로마이신 선택 20일 후에 GFP+SSEA4+TRA181+ iPSC로 벌크 분류 및 클론 분류하였다. 단일 세포 해리된 표적화된 iPSC 풀을 한스 밸런스트 염 용액(Hanks' Balanced Salt Solutio)(메디에이테크), 4% 우태아 혈청(인비트로젠), 1x 페니실린/스트렙토마이신(메디에이테크) 및 10 mM 헤페스(Hepes)(메디에이테크)를 함유하고; 최적 성능을 위해서 새로 제조된 급냉 염색 완충제 중에 재현탁하였다. SSEA4-PE, TRA181-알렉사 플루오르-647(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 포함하는 접합된 1차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 모든 항체를 백만개의 세포당 100㎕의 염색 완충제 중에서 7㎕로 사용하였다. 용액을 염색 완충제 중에서 1회 세척하고, 225g에서 4분 동안 스핀 다운하고, 10μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충제 중에 재현탁하고, 유세포 분석법 분류를 위해서 얼음 상에서 유지시켰다. 유세포 분석법 분류를 FACS 아리아 II(BD 바이오사이언시스) 상에서 수행하였다. 벌크 분류를 위해서, GFP+SSEA4+TRA181+ 세포를 7㎖ FMM으로 충전된 15㎖ 캐노니컬 튜브(canonical tube) 내에서 게이팅 및 분류하였다. 클론 부류를 위해서, 분류된 세포를 100μM 노즐을 사용하여, 웰당 3개 사건의 농도로 직접 96-웰 플레이트에 배출하였다. 각각의 웰은 5㎍/㎖ 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(메디에이테크)이 보충된 200㎕ FMM을 미리 충전되어 있었고, 이미 5x 마트리겔로 밤새 코팅되어 있었다. 5x 마트리겔 예비코팅은 EM/F12 5㎖에 마트리겔의 하나의 분취물을 첨가하고, 이어서 적절한 재현탁을 허용하도록 4℃에서 밤새 인큐베이션시키고, 마지막으로 96-웰 플레이트에 웰당 50㎕로 첨가한 후 밤새 37℃에서 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 각각의 웰에 배지를 첨가하기 직전에 5x 마트리겔을 흡인시켰다. 분류가 완결된 후, 96-웰 플레이트를 인큐베이션 전에 225g에서 1 내지 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 7일 동안 방해하지 않고 정치시켰다. 제7일에, 150㎕의 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 100㎕의 FMM으로 대체하였다. 분류 후 웰에 10일에 추가 100㎕의 FMM을 재공급하였다. 집락 형성을 초기 2일에 검출하고, 대부분의 집락을 분류 후 7일 내지 10일에 확장시켰다. 제1 계대배양에서, 웰을 PBS로 세척하고, 37℃에서 대략 10분 동안 30㎕의 애큐타제로 해리시켰다. 확장된 애큐타제 처리에 대한 요구는 연장된 기간 동안 배양물에서 한가롭게 있는 집락의 압축성을 반영한다. 세포가 해리된 것으로 보인 후, 200㎕의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고, 수회 피펫팅하여 집락을 파괴하였다. 해리된 집락을 5x 마트리겔에 의해 미리 코팅된 96-웰 플레이트의 또 다른 웰로 옮기고, 이어서 인큐베이션 전에 225g에서 2분 동안 원심분리하였다. 확장 전에 초기 집락을 분산시키도록 이러한 1:1 계대배양을 수행하였다. 후속 계대배양을 3분 내지 5분 동안 애큐타제 처리 및 75 내지 90%의 컨플루언시 시 FMM에서 1x 마트리겔로 미리 코팅된 더 큰 웰로 1:4 내지 1:8의 확장에 의해 일상적으로 수행하였다. 각각의 클론성 세포주를 GFP 형광 수준 및 TRA1-81 발현 수준에 대해서 분석하였다. 대략 100%의 GFP+ 및 TRA1-81+를 갖는 클론주를 추가 PCR 스크리닝 및 분석을 위해서 선택하였다. 유세포 분석법 분석을 구아바 이지사이트 8 HT(밀리포어) 상에서 수행하고, 플로우조(Flowjo)(플로우조, 엘엘씨(Flowjo, LLC))를 사용하여 분석하였다.
iCasp9-통합된 iPSC의 시험관내 유도성 사멸 : 이량체화의 화학적 유도자(CID; AP1903)를 메드켐익스프레스(Medchemexpress)(몬마우쓰 정션(Monmouth Junction), 미국 뉴저지주 소재)로부터 구입하였다. CID 노출 24시간 후, 세포를 수거하고, 제조사의 지시서(BD 바이오사이언시스)에 따라서 7-아미노 액티노마이신 D(7-AAD)로 염색하였다. 7-AAD 양성 세포의 백분율을 유세포 분석법(구아바(Guava), 이엠디 밀리포어, 미국 메사추세츠주 빌러리카 소재)에 의해서 죽은 세포로서 정량화하고, 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
AP1903가 iCasp9-표적화된 iPSC 클론의 완전한 세포사를 유도하였는지를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 각각의 표적화된 iPSC 클론의 3개의 웰을 AP1903로 48시간 동안 처리하고, 이어서 웰을 PBS로 2회 세척한 후, 새로운 iPSC 배지를 첨가하였다. 웰을 2일마다 총 5일 동안 새로운 배지를 사용하여 회수하였다. 이어서, 웰을 알칼린 포스파타제 염색 시약(시그마(Sigma))로 염색하였다.
iCasp9 표적화된 클론의 시험관내 삼계통 지향된 분화 및 유도성 사멸 : 지향된 단일층 삼계통 분화를 위해서, 분화 시작 전날에 hiPSC를 FMM 중에서 마트리겔 코팅된 웰 상에 시딩하였다(예를 들어, 내배엽의 경우 200K 세포/웰, 외배엽의 경우 50K 세포/웰, 중배엽의 경우 10K 및 50K 세포/웰). 4개의 반복검증 웰을 각각의 계통 분화를 위해서 설정하였다. 내배엽 분화의 경우, FMM 배지를 하기의 내배엽 유도 배지로 대체하였다: RPMI-1640, 아스코르브산(50㎍/㎖), 모노싸이오글리세롤(450μM), 1X 글루타민, 넉아웃 혈청 대체물(Knockout Serum Replacement) (0.20%), 액티빈 A(100ng/㎖), CHIR99021 (바이오비젼(Biovision))(3μM), 1X 페니실린/스트렙토마이신. 2일 후에, 하기 배지로 대체한다: RPMI-1640, 아스코르브산(50㎍/㎖), 모노싸이오글리세롤(450μM), 1X 글루타민, 넉아웃 혈청 대체물 (0.50%), bFGF(5ng/㎖), 액티빈 A(100ng/㎖), 1X 페니실린/스트렙토마이신. 하나의 웰을 3일에 고정시키고, Sox17(알앤디 시스템즈(R&D Systems))에 대해서 염색하였다. 하나의 웰을 크리스탈 바이올렛으로 3일에 염색하였다. 나머지 2개의 웰을 48시간 동안 AP1903로 처리하고, 이어서 세척하고, 새로운 분화 배지를 보충하고, 5일 동안 배양을 계속한 후, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 중배엽 분화의 경우, 배지를 ITS, 10ng/㎖ bFGF, 20μM 포스콜린(Forskolin) 및 3μM CHIR99021이 보충된 DMEM/F12(메디에이테크)로 대체하였다. 배지를 2일마다 교환하고, 하나의 웰을 4일째에 고정시키고, αSMA(시그마)로 염색하였다. 하나의 웰을 크리스탈 바이올렛으로 4일에 염색하였다. 나머지 2개의 웰을 AP1903으로 48시간 동안 처리하고, 이어서 세척하고, 새로운 분화 배지를 보충하고, 5일 동안 배양을 계속하고, 그 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 외배엽 분화의 경우, FMM 배지를 하기 중성 유도 배지로 대체하였다: 1x B27 배지 첨가제(라이프 테크놀로지스(라이프테크놀로지스)), 1x N2 배지 첨가제(라이프 테크놀로지스), 10μM SB431542 및 100nM LDN-193189가 보충된 DMEM/F12(메디에이테크). 배지를 2일마다 교환하였고, 하나의 웰을 7일째로 고정시키고, Nestin(아브캄(Abcam))에 대해서 염색하였다. 하나의 웰을 7일에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 나머지 2개의 웰을 AP1903으로 48시간 동안 처리하고, 이어서 세척하고, 새로운 분화 배지를 보충하고, 5일 동안 배양을 계속하고, 그 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
크리스탈 바이올렛 염색 : 0.5g의 크리스탈 바이올렛 염색제(시그마)를 100㎖ 탈이온수 중에 용해시킴으로써 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액을 제조하였다. 실온에서 여과 및 저장한다. 염색을 위해서, 세포를 PBS로 2회 세척한다. 실온에서 PBS를 4% 파라폼알데하이드를 함유하는 PBS로 15분 동안 대체한다. PBS로 2회 헹군다. 0.1% 크리스탈 바이올렛(10% 에탄올 중에서 제조됨)으로 15분 동안 실온에서 염색한다. CV를 쏟아낸다. 물이 더 이상 어두워지지 않을 때까지 세포를 세척병으로부터의 탈이온수로 온화하게 세척한다. 탈이온수를 배출하고, 염색된 세포를 건조하고, 그 후 사진찍는다.
iCasp9-통합된 iPSC로부터 유래된 테라토마의 생체내 유도성 사멸 : 모든 마우스를 출원인의 시설에 두었다. 마우스에 관련된 모든 실험 프로토콜은 출원인의 실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해서 승인되었다. 본 연구에서 사용된 모든 마우스는 7 내지 10주령의 암컷 NSG 마우스(NOD/SCID/γ널, 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory))였다. 테라토마 검정을 위해서, 50% FMM 배지 및 50% 마트리겔 중의 1 내지 2x106 iPSC로 이루어진 200㎕를 배측면(dorso-lateral) 면적에 피하로 도입하였다. 각각의 마우스에게 양 측 상에 2개의 세포 주사를 제공하였는데, 좌측에는 iCasp9-통합된 iPSC를 주사하였고, 우측에는 비변형 모 iPSC 주를 주입하였다. 제시된 시간 지점에서 생체내 사멸을 개시하기 위해서, 마우스에게 매일 복강내(i.p.) 주사를 통해서 5 또는 7일 동안 AP1903(125㎍/마우스)을 투여하였다. 마우스를 테라토마 형성에 대해서 모니터링하였고, 3주에 또는 제시된 바와 같이 체적 측정을 개시하였다. 테라토마를 제시된 시간 지점에서 수집하고, 조직학 또는 분자 검정을 위해서 가공하였다. AP1903 스톡을 DMSO(25㎍/㎖) 중에서 제조하였다. 단일 i.p. 주사를 위해서, 5㎕ 스톡 용액을 200㎕ PBS에 첨가한 후, 수욕 중에서 10분 동안 초음파처리하였다. 조직학을 위해서, 테라토마를 PBS 중에 수거하고, 밤새 실온에서 4% 파라폼알데하이드 중에서 고정시키고, 그 후에 가공을 위해서 실온에서 70% 에탄올 중에서 유지시켰다. 샘플을 선택 및 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해서 UCSD 조직학 코어 설비에 제출하였다. 박편을 관찰하고, 해석하고, 니콘(Nikon) DS-Fi1 카메라가 장치된 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TS100 현미경을 사용하여 사진찍었다.
이식된 루시페라제-발현 iPSC의 유도성 사멸의 생채네 가시화 : AP1903-유도된 사멸을 생체내에서 가시화하기 위해서, iCasp9-통합된 iPSC 및 비변형 모 iPSC를 파이어플라이 루시페라제 유전자 및 IRES에 연결된 RFP로 구성된 다시스트론성 카세트를 함유하는 렌티바이러스로 감염시키고, EF1α(바이오세티아)의 제어 하에서 발현시켰다. 감염된 세포를 RFP+ 세포에 대해서 분류하였고, 상기에 같이 주사하였다. 2x106개의 iCasp9-통합된 iPSC를 NSG 마우스의 좌측 상에 피하 주사하고, 동일한 수의 모 iPSC를 우측 상에 주사하였다. AP1903 i.p. 주사를 제시된 일에 투여하였다. iPSC 이식 직후(0일)에 시작하여, 생착 및 테라토마 체적을 제노겐(Xenogen) IVIS 영상화 시스템을 사용하여 매주 모니터링하였다. 영상화를 위해서, 마우스에게 D-루시페린(4㎎/마우스, 써모 피셔(Thermo Fisher))을 복강내 주사하고, 10분 후에 생물발광을 기록하였다. 제노겐 리빙 이미지 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다.
실시예 2 - CMV 프로모터에 의해서 조절된 AVS1 안전 하버 표적화된 iCasp9 자살 유전자는 AP1903에 의해서 활성화되는 경우 가변적인 반응을 도출한다
iPSC에서 적절한 통합 및 발현 전략의 고처리량 분석을 수행하기 위해서, iCasp9 자살 유전자 플랫폼을 선택하였는데, 여기서 신속한 카스파제-9 매개된 세포사는 이량체화의 소분자 화학적 유도자, 예컨대 AP1903에 의해서 유도될 수 있다. 소분자 유도의 경우 최종 산물로의 각각의 발단 단계에서의 효능을 입증하기 위해서는, iCasp9 유전자는 만능 줄기세포 유지 및 분화의 모든 단계에서 계속적으로 발현될 필요가 있을 것이라는 것을 주목해야 한다. 웰당 단일 hiPSC 방식에서, AAVS1, ROSA26, 및 H11 유전자좌를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 안전 하버 유전자좌에서 다양한 자살 유전자 발현 카세트를 효율적으로 그리고 정확하게 통합 및 유지시키기 위해서. 각각 내인성 AAVS1 또는 ROSA26, 거대세포바이러스(CMV), 연장 인자 1α(EF1α), 포스포글리세레이트 카이나제(PGK), 혼성 CMV 증강자/닭 β-액틴(CAG) 및 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터를 비롯한 다양한 내인성 프로모터 및 외인성 프로모터의 하류에서 자살 유전자 발현 카세트를 함유하는, 몇몇 통합 벡터를 시험하여 hiPSC 및 hiPSC-유래 분화된 세포 둘 모두에서 상이한 자살 시스템의 활성을 체계적으로 분석 및 비교하였다.
AAVS1 유전자좌를 표적으로 하고(도 1A), Casp9 자살 유전자를 293T 세포에 통합하도록 CMV-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물(AAVS1-G1.0)을 설계하였다. 공여자 작제물은 또한 GFP 및 퓨로마이신 유전자를 포함하는데, 이의 발현은 표적화된 삽입이 일어날 때 AAVS1 내인성 프로모터에 의해서 유도된다(도 1A). 293T 세포에 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 공여자 작제물 AAVS1-G1.0을 형질주입하였다. 형질주입 3일 후에, 퓨로마이신 선택을 시작하였고, 12일 동안 계속하였다. 퓨로-선택된 집단을 유세포 분석법에 의해서 GFP 발현에 대해서 분석하고, GFP 발현 수준의 범위를 관찰하였다. 퓨로-선택된 세포 집단의 약 82%는 GFP를 발현하였음이 관찰되었다(도 1B). 다음으로, 퓨로-선택된 293T 세포를 10nM 또는 120nM AP1903(DMSO를 대조군으로 사용하였음) 처리에 24시간 동안 적용하였다. 처리된 세포를 이어서 수거하고, 7AAD로 염색하였는데, 이것은 막-손상된 죽은 세포를 선택적으로 염색하였고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 7AAD 음성 세포(아마도 살이있는 세포) 백분율을 각각의 처리에 대해서 플롯팅하였다(대조군에서 DMSO; AP1903 10nM; 및 AP1903 120nM)(n=2). 두 농도 모두 하에서 AP1903 처리 후에 상당한 세포사가 검출되었다(도 1C). AP1903의 투여량은 죽은 세포 비율에 영향을 갖는 것 같지 않았다. 퓨로-선택된 293T 세포에서 AAVS1 유전자좌 내의 공여자 벡터의 표적화된 삽입을 공여자 벡터 삽입에 의해서 형성된 정션에 특이적인 PCR 증폭 산물의 존재 하에서 이들 퓨로-선택된 293T 세포로부터의 게놈 DNA의 정션 PCR(도 1D)을 사용하여 추가로 확인하였다.
293T 세포에 유사하게, hiPSC에 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 CMV-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물(AAVS1-G1.0)을 형질주입하였다. 퓨로마이신 선택을 형질주입 3일 후에 시작하고, 16일 동안 계속하였다. 퓨로-내성 세포를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. GFP 강도, 즉 GFP(음성), GFP(저) 및 GFP(고)를 기반으로 3개의 집단을 유세포 분석법에 의해서 분류하였다(도 1E). 분류된 GFP(음성), GFP(저) 및 GFP(고) 집단을 확장시키고, 이어서 AP1903 처리(10nM or 100nM), 또는 대조군으로서의 DMSO 처리에 24시간 적용하였다. 처리된 세포를 수거하고, 7AAD로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 7AAD 음성 세포(아마도 살아있는 세포) 백분율을 각각의 처리에 대해서 플롯팅하였다. 그러나, AAVS1 유전자좌에서 표적화된 Casp9 삽입을 갖는 293T 세포와 대조적으로, AP1903 매개된 세포사는 AAVS1 유전자좌에서 표적화된 Casp9 삽입을 갖는 iPSC에서는 모든 처리에서 검출되지 않았다(도 1F). 퓨로-선택 및 분류된 hiPSC로부터의 게놈 DNA로부터의 정션 PCR은 GFP(음성) 또는 GFP(고) 집단에서가 아니라, GFP(저) 집단에서만 AAVS1 유전자좌 내로의 공여자 벡터의 표적화된 삽입을 나타내었다(도 1G). 따라서, GFP(고) 집단에서의 세포사의 감소는 게놈에서 부정확한(표적화되지 않은) 삽입 및 CMV 프로모터 하에서의 iCasp9 발현의 당연한 부재와 연관된다고 여겨졌다(도 1G, 레인 4; 레인 1-마커). 반면에, GFP(저)에서의 세포사의 감소는 iPSC에서 정확한 표적화된 삽입에도 불구하고 CMV 프로모터 하에서의 iCasp9 유전자의 감소된 발현과 연관된다고 여겨졌다(도 1G, 레인 5). 따라서, CMV 프로모터에 의해서 조절된 AAVS1 안전 하버 표적화된 iCasp9 자살 유전자는 AP1903에 의해서 활성화되는 경우, 아마도, 통합을 위한 세포 유형 및 게놈 내의 통합 부위에 따라서 가변적인 반응을 도출한다.
실시예 3 - hiPSC에서 다양한 내인성 프로모터 및 외인성 프로모터 하에서의 iCasp9의 안전 하버 유전자좌 표적화된 삽입
이전 연구에서 AAVS1 프로모터 하에서의 퓨로마이신 선택이 선택 동안 생존도 및 성장을 유지하도록 견고하게 발현되었기 때문에, 다음으로 삽입 시에 iCasp9 유전자 발현을 유도하는 내인성 AAVS1 프로모터(및 GFP, 및 퓨로마이신 마커 유전자)를 사용하여 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하도록 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 설계하였다(도 2A). hiPSC에 AAVS1 내인성 프로모터의 제어 하에서 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 iCasp9 AAVS를 포함하는 공여자 작제물을 형질주입하였다. 퓨로마이신 선택을 형질주입 3일 후에 시작하였고, 20일 동안 계속하고, 그 후 퓨로-내성 세포를 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, GFP 발현을 나타내었다(도 2B). 이어서 확장된 퓨로-내성 iPSC를 AP1903(또는 DMSO 대조군) 처리에 24시간 동안 적용하였다. 처리된 세포를 수거하고, 7AAD로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 7AAD 음성 세포, 즉, 살아있는 세포, 백분율을 각각의 처리에 대해서 플롯팅하였다. 그러나, AP1903에 의해서 매개된 세포사는 AAVS1 유전자좌에서 Casp9의 표적화된 삽입을 갖고, 내인성 AAVS1 프로모터에 의한 제어된 Casp9 발현을 갖는 iPSC에서 모든 처리에서 검출되지 않았다(도 2C). 퓨로-내성 풀로부터의 게놈 DNA의 정션 PCR은 이러한 집단에서 AAVS1 유전자좌 내로의 공여자 벡터의 표적화된 삽입을 나타내었다(도 2D). 이와 같이, 내인성 AAVS1 프로모터에 의해서 조절되는 AAVS1 안전 하버 표적화된 iCasp9 자살 유전자는 AAVS1 유전자좌에서의 정확한 삽입에도 불구하고 iCasp9 발현을 도출하는데 실패한 것으로 보인다. GFP 발현 강도를 기준으로, 다시 낮은 수준 발현은 iCasp9 매개된 세포사에 충분하지 않은 것 같다.
다른 유전자 전달 전략, 예컨대 렌티바이러스 매개된 이식유전자 통합(여기서 유전자의 다수의 카피가 개별 세포마다 도입됨)과 달리, 유전자좌 특이적 표적화 방법에서는, 상이한 프로모터의 특성이 기능성 결과에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 프로모터가 목적하는 수준에서 강한 발현을 유지하는 것을 조사하기 위해서, 이어서 iCasp9 발현을 유도하는 다양한 외인성 프로모터를 사용하고, 그리높은 GFP를 유도하는 AAVS1 내인성 프로모터 및 퓨로마이신 마커 유전자를 사용하여 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하도록 작제물을 설계하였다(도 2E). 시험된 외인성 프로모터는 CMV, UBC, PGK, EF1α 및 CAG를 포함하였다. 선택된 외인성 프로모터 중 하나의 제어 하에서 hiPSC에 AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 형질주입하였다. 퓨로마이신 선택을 형질주입 3일 후에 시작하였고, 20일 동안 계속하고, 그 후 퓨로-내성 세포를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. EF1α 및 CAG(서열번호 1 참고)의 제어 하에서 iCasp9를 포함하는 작제물이 형질주입된 hiPSC는 형질주입 시 높은 GFP 발현을 나타내었고, CAG 단독은 강한 발현을 나타내었다는 것이 관찰되었다(도 2F 및 표 1). 이들 두 전략을 추가 분석을 위해서 선택하였다.
실시예 4 - iPSC에서 AAVS1 안전 하버 내로의 EF1α 프로모터-유도된 iCasp9의 표적화된 삽입.
도 2E에 따라서 AAVS1 유전자좌를 표적화하도록 EF1α-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 설계하였다. AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 EF1a-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물이 형질주입된 hiPSC를 20일 동안 퓨로마이신 선택하고, 그 다음 AP1903 처리하였다. 유세포 분석법 분석을 나타내는 도 3A에서의 게이팅된 영역은 표적화된 삽입을 갖는 GFP 양성 iPSC 세포를 강조하지만, 소수가 1903 세포사 유도에 반응하였다. 이들 GFP 양성 집단이 풍부해지고, 유지될 수 있는지를 결정하기 위해서, TRA181(만능 및 미분화 상태를 나타내는 마커) 및 GFP 양성(iCasp9 발현의 지표) hiPSC를 선택 대략 16일 후에 96-웰 플레이트 내에서 벌크로 또는 개별적으로 분류하였다(도 3B). GFP 양성 벌크-분류된 hiPSC를 퓨로마이신-무함유 배지 중에서 시간에 따라서 유지시켜 시간에 따른 집단 프로파일을 결정하였다(도 3C). 고 TRA181 및 높은 GFP를 발현하는 세포의 백분율이 시간에 따라서 감소됨이 관찰되었다(예를 들어, 분류 후 2일로부터 분류 후 16일까지). 이러한 데이터는 EF1a가 고-수준 발현을 나타내었지만, 그것은 가장 가능하게는, 만능 상태에서 침묵으로 인해서 그 발현을 유지할 수 없다는 것을 시사한다. 강한 EF1a 매개된 발현을 함유하는 개별 hiPSC가 발견될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해서, 개별 hiPSC 분류된 세포를 스크리닝하였다. 단일 세포 분류된 TRA181 세포 및 GFP 세포로부터 유래된 클론성 hiPSC의 명시야 영상은 단일 분류된 세포로부터 유래된 hiPSC 집락의 모폴로지를 나타내었다(도 3D). 이어서, AAVS1 유전자좌에서 EF1α-유도된 iCasp9의 표적화된 삽입을 갖는 클론성 hiPSC를 확장시키고, GFP 발현에 대해서 평가하였다. 그러나, 모든 집락은 확장 후에 다양한 정도로 GFP 발현이 손실되었는데, 이는 삽입 후 확장 동안 hiPSC에서 발현을 유지시키는 EF1α 프로모터의 무능력을 시사한다(도 3E, 예를 들어 EF1α 클론 C1 및 C23). 총괄하여 벌크 및 개별 분류된 수준에서, EF1a는 GFP 및 결국 iCasp9 발현을 강하게 유지할 수 없었다.
실시예 5 - hiPSC에서 AAVS1 안전 하버 내로의 CAG 프로모터-유도된 iCasp9의 표적화된 삽입
몇몇 내인성 프로모터는 hiPSC의 클론성 확장 동안 iCasp9의 지속적인 발현을 유도하는 것을 발견하였지만, 그 발현 수준은 너무 낮아서 AP1903 처리에 효과적으로 반응할 수 없다고 결정되었다. 다양한 외인성 프로모터의 제어 하에서 iCasp9의 발현은 또한 hiPSC의 연장된 클론성 확장 동안 손실되는 것으로 나타났고, AP1903-유도된 세포사를 유도하는 데 실패하였다. AAVS1 유전자좌에 특이적인 ZFN 및 CAG-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물이 형질주입된 hiPSC를 다음에 평가하였다(도 2E 및 표 1).
퓨로마이신 선택을 형질주입 3일 후에 시작하였고, 16일 동안 계속하고, 그 후에 퓨로-내성 세포를 높은 GFP 발현에 대해서 96-웰 플레이트 내에서 벌크로 또는 개별적으로 분류하였다. 표적화 및 퓨로-선택 후 GFP 양성 벌크-분류된 iPSC를 퓨로마이신-무함유 배지 중에서 21일 동안 유지시키고, 그 후 유세포 분석법에 의해서 평가하여 높은 GFP 발현이 iPSC 확장 동안 유지될 수 있는지를 입증하였다. 도 4B는 GFP 양성 세포 백분율이 연장된 확장 동안 유지될 뿐만 아니라 GFP 양성 세포의 백분율은 99%를 초과하였음을 나타내었다. 이는 특이적 유전자좌에 표적화된 프로모터가, 다수의 카피가 게놈에 삽입되는 렌티바이러스 방법의 것과 유사한 강한 발현을 유지할 수 있다는 첫번째 관찰이다. 다음으로, 99% GFP 발현을 유지하는 벌크 분류의 iCasp9 유전자 반응을 시험하였다. 도 4C는 AP1903로 처리하는 경우, GFP 양성 세포가 유도된 세포사를 겪어서, 처리 후 7AAD-염색 양성이 되었음을 나타내었다. 효과적인 iCasp9 매개된 세포사로 번역되는 강한 발현을 나타내는 CAG 벌크 집단을 사용하여, 본 발명자들은 다음으로 개별 클론을 평가하였다. 다음으로, 마트리겔-코팅된 96-웰 플레이트 내에서 클론성으로 분류된 퓨로-내성 iPSC를 평가하였다. 개별 분류 후 전형적인 집락의 명시야 영상은 고품질의 만능 만능 모폴로지를 나타낸다(도 4D). 단일 세포로부터 기원한 집락을 개별적으로 확장시키고, 유세포 분석법에 의해서 GFP 및 TRA181 발현에 대해서 평가하였다. 모든 선택된 집락(예를 들어, CAG-C5, -C8, -C12, -C38)은 확장 동안 GFP 및 TRA181 발현의 높은-백분율을 유지하는 것을 나타내었다(도 4E). 선택된 클론의 평균 형광 강도(MFI)를 도 4F에 도시하고, CAG-C5가 최고 MFI, 1500을 가지며, CAG-C38은 4개의 클론 중에서 비교적 가장 낮은, MFI, 즉 858을 갖는다. 게놈 DNA의 정션 PCR을 모든 선택된 GFP+ 클론을 사용하여 수행하여 공여자 작제물 및 AAVS1 유전자좌의 상동 재조합을 검출하였다. 모 hiPSC는 형질주입 전의 본래 hiPSC 주를 나타낸다.
CAG hiPSC 집단 풀은 표적화 형질주입 및 16일의 퓨로마이신 선택 후의 집단을 나타낸다. GAPDH 게놈 서열을 증폭시켜 게놈 DNA의 품질을 보장하였다. 모든 선택된 GFP 양성 클론은 AAVS1 유전자좌에서 정확한 삽입을 입증하였다(도 4G). 따라서, 상기 데이터는 CAG가 hiPSC 세포에서 AAVS1 유전자좌 내로 표적화된 후 iPSC 확장 동안 이의 제어 하에서 유전자의 높은-수준 발현을 강하게 유지시키는 능력을 갖는 유일한 프로모터임을 시사한다.
형질주입 시기(형질주입 2 내지 3일 후)에 추가적인 프로모터의 성능, 퓨로마이신 선택 후(퓨로-선택 20일 후) 유지, 및 AP1903 처리 후 기능성 반응을 유사하게 평가하였다. 하기 표 1은 외인성 프로모터 CMV, UBC, EF1α, CAG, 및 PGK, 및 내인성 프로모터 AAVS1의 성능을 개괄한다. 표 1에서, 자살 유전자 반응을 AP1903 처리에 반응하는 GFP 양성 세포의 수를 기준으로 정량화한다.
Figure pct00002
이와 같이, 모든 시험된 프로모터 중에서, CAG는 모든 계수치에 대해서 가장 우수한 성능을 나타내고, CAG-iPSC 클론을 하기에 추가로 특징규명하였다.
실시예 6- CAG-hiPSC 클론의 만능성 특징규명
모든 선택된 CAG-hiPSC 클론을 만능성 특징규명을 위해서 분석하였다. 도 5A는 피더 무함유 배양물 상에서 유지된 CAG 클론 C38의 대표적인 영상인데, 이것은 높은 핵 대 세포질 비로 이루어진 개별 세포를 갖는 hiPSC의 균질한 배양물을 나타낸다. 도 5B에서 만능성 마커 NANOG 및 OCT4의 면역형광 염색은 CAG-hiPSC 클론이 만능성이고, 분화되지 않는 것을 나타낸다. NANOG, OCT4, SOX2, REX1, DPPA2 및 MYC를 비롯한 다양한 내인성 만능성 마커의 발현에 대한 정량분석 RT-PCR을 또한 수행하여 선택된 CAG-hiPSC 클론(CAG-C5, -C8, -C12, -C38 및 -C40)의 만능성 상태를 도시하였다. NANOG 발현은 모든 CAG-hiPSC 클론에서 모 iPSC보다 더 낮은 것을 나타낸다. 유세포 분석법 분석을 또한 TRA181, SSEA3 및 CD30 마커 발현에 대해서 수행하였다. 다음으로, 선택된 CAG 클론을 계통 특이적 분화로 유도하고, 계통 마커에 대해서 평가하였다. 도 5D는 선택된 CAG 클론을 분화로 유도한 후, 외배엽에 대한 마커인 NESTIN; 중배엽에 대한 마커인 αSMA; 및 내배엽에 대한 마커인 SOX17의 발현을 나타낸다. CAG-iPSC 클론 중 하나인, CAG-C38을 다양한 계통으로 이루어진 테라토마를 생성시키는 이의 가능성에 대해서 추가로 평가하였다. 도 5E에서, 테라토마를 주사 6주 후에 수거하고, 3개의 배엽(내배엽, 중배엽 또는 외배엽)을 나타낸다. 이러한 데이터는 CAG-iPSC 클론이 만능성을 보유하고, 모든 계통의 비-만능 세포로 분화하는 능력 및 만능성을 보유하였음을 입증한다.
실시예 7 - AAVS1 유전자좌 내에 표적화된 CAG-유도된 iCasp9를 갖는 만능 및 분화 상태 둘 모두에서의 hiPSC 클론의 유도된 자살 유전자 매개된 사멸
20개의 CAG-iCasp9 표적화된 hiPSC 클론을 AP1903(또는 DMSO 대조군)으로 24시간 동안 처리하고, 그 후 7AAD로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 GFP 및 7AAD 염색에 대해서 분석하였다. 모든 클론은 AP1903 처리 후에 95%를 초과하는 7AAD-염색 양성을 나타내었다(도 6A). 2개의 대표적인 클론(CAG-C5 및 -C38)으로부터의 유세포 분석법 플롯은 또한 CAG-iPSC 클론의 만능 상태에서 Casp9 유전자 반응을 도시한 것을 또한 나타낸다(도 6A). 15개의 CAG-iCasp9 표적화된 iPSC 클론을 12-웰 플레이트에서 3회 반복 웰로 배양하였다. 컨플루언스 후, 하나의 웰을 알칼리 포스파타제에 대해서 염색하고, 사진을 찍고, 또 다른 2개의 웰을 AP1903(10nM)로 48시간 동안 처리하였다. 처리된 웰을 PBS로 세척하고, 임의의 잔류하는 살아있는 세포를 위해서 새로운 배지를 첨가하여 수거하였다. 8일에 회수된 웰을 알칼린 포스파타제에 대해서 염색하고, 사진을 찍어 iPSC 클론의 임의의 생존을 기록하였다. 15개의 클론 중에서, 클론 CAG-C14 만이 살아남은 클론을 함유하였고, 즉 유도된 죽음을 벗어났다(도 6B). 나머지 14개의 클론은 어떤 염색도 나타내지 않았는데, 이는 Casp9의 유도된 발현 시에 살아남은 세포가 없음을 나타내었다. 도 6C는 AP1903(10nM) 처리 후 10cm 접시 상에서 클론 CAG-C5의 살아있는 세포 피복 속도론을 나타내었다. 살아있는 세포는 처리 대략 8분 후에 죽기 시작하였고, 거의 모든 살아있는 세포는 AP1903 처리 12분 후에 사멸하였다. 다음으로, CAG-iCasp9 표적화된 hiPSC 클론을 3개의 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 또는 외배엽으로부터의 세포로 분화하도록 유도하였고, 각각 48시간 동안 AP1903으로 처리하고, 5일 동안 분화 배지 중에서 회수하였다. 처리 전 및 회수 후 반복검증 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 도 6D에 도시된 바와 같이 영상화하였다. CAG-C5 클론으로부터의 영상을 대표로서 도시하였고, 이는 모든 계통의 세포가 AP1903 처리 후에 사멸된 것을 입증한다. 마지막으로, CAG-iCasp9 표적화된 hiPSC 클론을 CD34+ 세포로 분화하도록 유도하였고, 48시간 동안 AP1903으로 처리하고, 유세포 분석법으로 세포사에 대해서 분석하였다. 도 6E에 도시된 증가된 7AAD 염색은 AP1903 처리 후 CD34+ 세포사를 나타내었다. 이 데이터는 세포의 후성적 상태, 즉 만능 상태, 대 외배엽, 내배엽 또는 중배엽 또는 세포 유형 특이적 상태, 예컨대 CD34 양성 세포에 관계 없이, AAVS1 유전자좌에 표적화된 CAG는 iCasp9의 발현을 강하게 유지한다는 것을 나타낸다.
실시예 8 - iCasp9-iPSC 클론으로부터 유래된 테라토마의 AP1903-유도된 퇴보의 생체내 입증
NSG 마우스 연구에서 피하 주사 위치결정을 도 7A에 나타내어 iCasp9 발현 및 유도를 통해서 매개된 생체내 세포사를 입증하였다. 모 hiPSC 주 및 CAG-C38 클론을 4E6 세포에서 주입하고(0일), 7 내지 11일에 AP1903(i.p. 총 200㎍)로 처리하였다. 34일에 테라토마를 수거하고, 크기를 나타내도록 영상화하였다(도 7B). CAG-C38 수거 중에서, 하나의 주사 부위는 어떤 종양도 함유하지 않았지만, 나머지는 대부분 지방 유사 세포로 이루어졌다. 수거된 테라토마를 또한 체적에 대해서 측정하였다(도 7C). 수거된 종양 중에서, CAG-38 hiPSC 기원 테라토마는 검출되지 않거나 이의 모 대조군보다 상당히 더 적은 것으로 인지되었다. 수거된 테라토마는 헤마톡실린 및 에오신 염색되었고, 염색 결과는 모 iPSC와 CAG-hiPSC 클론 사이에서 조직학적 차이를 나타낸다(도 7D). 모 hiPSC 주는 주로 삼계통 분화된 세포 유형을 나타낸 반면, CAG-C38은 아마도 마우스로부터 기여된 대부분 높게 조직화된 지방-유사 세포로 이루어진 것으로 보인다. 다음으로, 모 hiPSC 주 및 CAG 클론을 4E6 세포에서 주사하고, 40 내지 46일에 AP1903(i.p. 총 200㎍)으로 처리하였다. 모든 종양을 일상적으로 체적에 대해서 측정하였고, CAG-iPSC는 Casp9 유전자 발현에 여전히 반응성이고, 분비된 CAG-iPSC 클론 중 임의의 것이 주사된 마우스에서 종양의 체적 감소를 유발하였다. 총괄하여, 데이터는 시험관내 및 생체내에서 AAVS1 유전자좌에 표적화된 CAG 프로모터의 강한 발현을 입증한다.
실시예 9 - iCasp9의 표적화된 또는 뉴클레아제-독립적인 삽입을 위해서 CRISPR/Cas9를 사용한 인간 ROSA26 유전자좌의 게놈 편집
다른 표적화 전략 및 안전 하버 유전자좌의 상승작용을 시험하기 위해서, 본 실험에서, iPSC 게놈의 상이한 내인성 유전자좌를 CAG 프로모터에 의해서 유도된 외인성 유전자의 뉴클레아제-독립적인 표적화된 삽입에 대한 이의 퍼텬셀에 대해서 시험하였다. 도 9A에 도시된 바와 같이, CRISPR/Cas9를 사용하여 ROSA26 유전자좌를 표적화하도록 작제물을 설계하였다. hiPSC에 ROSA26 유전자좌에 특이적인 gRNA/Cas9-RFP 플라스미드 및 CAG-유도된 iCasp9를 포함하는 공여자 작제물을 형질주입하였다. 형질주입 2일 후, 세포 집단을 유세포 분석법에 의해서 세포 중에서의 GFP 발현에 대해서 분석하여 형질주입 효율을 결정하였고, 이는 약 80% 내지 약 85%인 것으로 나타났다(도 9B). 퓨로마이신 선택을 형질주입 3일 후에 시작하였고, 20일 동안 계속하고, 그 후 퓨로-내성 세포를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. GFP 발현은 iPSC 확장 동안 지속되었다(도 9B). 하기 표 2는 도 9A에 도시된 작제물을 갖는 iPSC의 발현 수준 및 기능성 반응을 요약한다.
Figure pct00003
표 2는 CAG 유도된 표적화된 외인성 유전자 삽입이 AAVS1 유전자좌뿐만 아니라 또한 ROSA26 유전자좌에 적합하고, ZFN 및 CRISPR 전략 둘 모두에 의해서 매개될 수 있다는 것을 입증한다. 상동 아암을 사용함으로써, 뉴클레아제 독립적인 전략을 사용한 ROSA26 유전자좌를 표적화는 추가적인 작제물 설계를 또한 사용하여 전략 실현 가능성을 시험하였다. 뉴클레아제 독립적인 ROSA26 유전자좌를 위한 작제물은 CAG 프로모터 유도 GFP 및 iCasp9로 이루어지는 반면, RFP는 오프-타깃 통합을 나타낼 것이다(도 9C). 도 9C의 작제물이 형질주입되고 퓨로마이신 선택된 hiPSC 및 293 T 세포 각각을 표적화된 세포(도 9D 및 도 9E)에 대해서 풍부하게 하였다. 데이터는 뉴클레아제 독립적인 전략이 또한 표적화된 hiPSC를 효율적으로 생성하도록 현재 플랫폼에 적용될 수 있다는 것을 입증한다.
요약하면, CAG 프로모터는, 표적화 전략, 유전자좌 또는 분화의 상이한 상태에 관계없이, hiPSC의 장기간 클론성 확장 동안 iCasp9 발현의 높은 수준을 유지시켰다. 더 나아가, 이들 iCasp9-통합된 클론주는 AP1903의 존재 하에서 신속한 세포사를 겪었고, 배양물이 이량체화 분자의 부재 하에서 회수될 때 잔류하는 세포 생존이 관찰되지 않았다. 추가로, hiPSC 클론을 시험관내에서 3개의 체세포 계통으로 분화시켰고, AP1903-유도된 세포사에 완전히 적용되는 것으로 발견되었다. 클론을 또한 구체적으로 조혈 세포로 분화시켜 AP1903 치료에 의한 세포사의 완전한 유도를 입증하였다. NSG 마우스에 주입하여 테라토마를 형성할 때, 유사한 세포사-매개된 반응이 생체내에서 관찰되었다. iPSC에서 뉴클레아제 무함유 CAG-유도된 표적화된 통합을 사용하여 유사한 결과가 인지되었다. 따라서, 효율적이고, 정확하고, 지속 가능한 것 외에도, 본 명세서에 제공된 바와 같은 CAG 유도된 표적화된 통합 시스템은 또한 신뢰할 수 있는데, 그 이유는 다른 프로모터 및/또는 작제물에서 종종 인지되는 후성적 경관 변경을 유발하는 것으로 보이지 않기 때문이며, 이러한 변경은 시험관내 및 생체내에서 둘 모두에서 iPSC, 확장된 iPSC 또는 iPSC-유래 분화된 세포에서 자살 유전자-매개된 반응을 중단할 것이다. 다른 외인성 유전자 및/또는 상이한 선택된 유전자좌가 또한 이러한 플랫폼에 적용될 수 있다. 예를 들어, GFP 및 iCasp9를 함유하는 작제물을 생성시키는 것에 더하여, 상이한 기능성의 유전자가 작제물에 혼입될 수 있다. 표적화 양상, 예컨대 키메라 항원 수용체 또는 조작된 T 세포 수용체가 또한 특이적 유전자좌에 도입될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 특이적 유전자좌에 대한 다양한 유전자의 표적화를 그 시기 또는 재프로그래밍에서 수행할 수 있다. 이미 논의된 바와 같이, hiPSC 플랫폼은 다양한 속성을 갖는 개별 세포를 선택할 수 있고, 이러한 속성은 특이적 유전자좌에 도입된 목적하는 유전자와 접촉한 성공적으로 재프로그래밍된 hiPSC를 포함할 수 있다. 현저하게는, 하나의 hiPSC 클론은 특정 희귀 세포를 함유하였고, 유도된 세포사를 탈출하였고, 이러한 클론 및 이들 희귀 세포는 탈출의 분자 기전에 접근하는 것으로 특징규명되었다.
실시예 10 - 탈출된 클론의 특징규명은 모든 확장된 클론에서 한점 돌연변이를 나타낸다
AP1903 처리 시 살아남은 클론을 회수하는 데 사용되는 절차는 AP1903 처리에 살아남은 클론을 선별 및 확장함으로써 이루어졌다(도 8A). 입증된 바와 같이, 모든 탈출된 클론은 정션 PCR에 의해서 제시된 정확한 표적화된 삽입을 갖는다. 서열 변경이 탈출된 클론에서 인지되는지를 결정하기 위해서, 정제 및 게놈 서열결정 이후에 iCasp9 이식유전자의 PCR 증폭을 수행하였다(도 8B). 이들 탈출된 클론의 iCasp9 이식유전자의 서열은 모든 서열결정된 클론에서 한점 돌연변이 K189E를 제시하였다(도 8C). K189E가 불응성 클론에 대한 직접적인 이유인지를 확인하기 위해서, iCasp9 돌연변이 형태를 도 2E에 따라서 생성하고, 형질주입을 위해서 사용하였고, 생성된 표적화된 iPSC 세포를 시험하였다. 도 8E는 GFP 발현 CAS-iCasp9m iPSC 세포가 AP1903 처리에 반응성이 아니고, 모든 세포는 CAS-iCasp9wt iPSC 세포와 비교하면, GFP 발현의 동일한 높은 수준으로의 처리 시에 살아남았다는 것을 도시한다.
실시예 11 - 컨센서스 한점 돌연변이를 포함하는 탈출된 클론을 구제하기 위한 접근법
상기 실시예는 단일 불응성 주로부터 유래된 시험관내 처리-내성 클론이 모든 시험된 클론에 대해서 iCasp9에서 점 돌연변이를 불활성화시키는 켄센서스를 포함한다는 것을 나타내었다. 그러나, 사멸 속도론이 개선되었고, 이중대립유전자성 iCasp9 삽입을 갖는 hiPSC 클론을 선택함으로써 시험관내 및 생체내에서 내성 비율이 줄어들었다. 따라서, 단일 유도성 안전 시스템에 대한 내성을 발달시킬 가능성을 보호하기 위해서, 각각 고유의 안전 하버 유전자좌 내에 혼입된, iCasp9 및 단순 포진 바이러스 티미딘 카이나제를 비롯한 다수의 조건부 자살 유전자를 함유하는 hiPSC 클론의 생성 및 선택을 조사하였다.이중 안전 보호 시스템을 시험관내 및 생체내에서 단일 iCasp9 안전 스위치와 비교하여 이식된 세포의 안전성 및 효율적인 제거를 평가하였다.
실시예 12 - hiPSC 내의 AAVS1 안전 하버에서 CAG 프로모터-유도된 iCasp9의 표적화된 삽입의 카피수
CAG 프로모터-유도된 iCasp9 클론에서 이식유전자(iCasp9-GFP) 카피수의 정량분석 PCR-기반 평가는, 적은 수의 클론이 이식유전자의 하나를 초과하는 카피를 갖는 것을 나타내었다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 1의 카피수는 단일-대립유전자성 iCasp9 통합을 시사하고, 2의 카피수는 이중대립유전자성 iCasp9 통합을 시사하는 반면, 2 초과는 잠재적인 무작위 통합을 시사한다. 단일대립유전자성 또는 이중대립유전자성 iCasp9 표적화된 삽입을 갖는 클론에서 또는 분류된 풀링된 배양물에서, 도 10B에 도시된 바와 같은, iCasp9-GFP의 평균 형광 강도(MFI)는 이식유전자 발현 수준아 카피수에 상응하며, 카피수가 높을수록 MFI 판독값이 더 높다는 것을 입증하였다. 표적화된 풀링된 세포 및 클론에서 AAVS1-이식유전자 정션과 겹친 프라이머를 사용한 이식유전자 통합의 PCR 분석은 iCasp9-GFP 이식유전의 AAVS1 유전자좌 내에서의 특이적 통합을 확인해 주었다(도 10C). AAVS1 통합 부위에 대해서 특이적인 프로이머를 사용하여 표적화된 통합을 갖는 대립유전자의 수를 평가하였다. 밴드의 결손은 AAVS1 대립유전자 둘 모두에서 통합부위가 방해받았음, 즉 이중대립유전자성 삽입을 시사하는 반면, 밴드의 존재는 하나 또는 두 대립유전자가 방해받지 않았음을 시사한다(도 10D). 도 10C 및 10D에 나타낸 바와 같이, CAG-C5 및 CAG-C35 클론은 이식유전자의 2개의 카피의 이중대립유전자성 삽입을 갖는 반면, CAG-C38 클론은 하나의 대립유전자에서 표적화된 장소 내에 삽입된 하나의 카피를 갖는다. 플레이트 표면 피복률을 라이브 세포 영상화를 사용하여 10nM AP1903의 첨가직후에 평가하였다. 도 10E에 나타낸 바와 같이, 비분류된 표적화된 풀 세포(통합 및 비--통합)는 적어도 유도된 사멸 능력을 갖는 반면, iCasp9-GFP에 대해서 분류된 표적화된 풀 세포(표적화 및 무작위 통합, 가변 카피수를 가짐)는 약간 더 양호한 유도된 사멸 능력을 나타내었다. 클론성 CAG-C38(단일-대립유전자성 표적화된 삽입) 및 CAG-C5(이중대립유전자성 표적화된 삽입) 세포주는 풀링된 세포와 비교하는 경우 훨씬 더 높은 사멸률 및 효율을 갖는다.
실시예 13 - 생체내에서 테라토마의 유도성 사멸 및 퇴보에서 이식된 이중대립유전자성 iCasp9 클론 및 단일-대립유전자성 iCasp9 클론의 비교
피하 위치결정 주사를 사용한 NSG 마우스 연구는 도 11A에서 CAG-C38 클론, CAG-풀, PGK-풀(PGK-iCasp9 이식유전자), UBC-풀(UBC-iCasp9 이식유전자) 및 CMV-풀(CMV-iCasp9 이식유전자)에서 iCasp9 발현 및 유도를 통해서 매개된 생체내 세포사를 입증하였다. CAG-C38 클론 및 풀을 0일에 4E6 세포에서 NSG 마우스(n=2)의 3개의 군에 주사하고, 마우스를 19 내지 25일에 AP1903(i.p. 125㎍)로 치료하였다. 28일에, 테라토마를 수거하고, 영상화하여 크기를 나타내었다. 투여 전(도 11B, 상단 패널) 및 AP1903 마지막 투여 3일 후(도 11B, 하단 패널)에 NSG 마우스의 3개의 군의 생물발광 영상화는 단지 외인성 CAG 프로모터가 확립된 iPSC-유래 테라토마의 iCasp9-매개된 제거를 가능하게 하였음을 나타내었다. 이러한 관찰을 도 11C 내지 11G로 추가로 도시하였다. 도 11C에서 평균 및 SD로 나타낸 바와 같은 제시된 세포 유형으로부터의 테라토마에서의 종양 세포의 양을 나타내는 총 플럭스(광자/s)는 도 11B에서 테라토마 크기의 발견을 확증하였다. 제시된 세포 유형에 대한 처리 후의 총 플럭스 대 처리 전의 총 플러스의 비(평균 ±SD)를 도 11D에 나타내었다. 클론성 CAG-C38 및 CAG 풀링된 세포 둘 모두가 주사된 마우스에 대한 결과를 별개로 고차원 정의를 갖는 도 11E에서 플롯팅하였다. 28일에 제시된 세포 유형으로부터 유래된 테라토마의 최종 체적 측정치를 도 11F에 도시하였다. 도 11G는 28일에 제시된 세포 유형으로부터 유래된 테라토마의 영상을 나타낸다. CAG-C38 클론 또는 CAG-iCasp9 풀링된 세포가 주입된 측면으로부터는 어떤 테라토마도 검출되지 않았다. 총괄하여, 이들 데이터는 iCasp9-GFP 이식유전자의 발현을 유도하는 상이한 프로모터의 시험관내 연구를 확인해 주었으며, CAG 프로모터가 시험된 시험관내 및 생체내 중에서 가장 효과적임을 나타내었다. 데이터는 iCasp9-GFP에 대해서 단일-대립유전자성임에도 불구하고, CAG-C38 클론이 자살 유전자 유도 시에 테라토마 제거에서 CAG 풀링된 세포보다 더 효과적임을 나타낸다.
게다가, 이식된 이중대립유전자성 iCasp9 클론의 유도성 사멸을 시험하였고, 단일-대립유전자성 iCasp9 클론의 것과 비교하였다. 피하 위치결정 주사를 사용한 NSG 마우스 연구를 도 12A에 도시하여 모 세포, CAG-C5 클론 및 CAG-C38 클론에서 iCasp9 발현 및 유도를 통해서 매개된 생체내 세포사를 입증하였다. 대표적인 세포 유형을 0일에 NSG 마우스의 4개의 군(n=2)에 주입하고, 마우스를 일 7 내지 13일에 AP1903(i.p. 125㎍)로 치료하였다. 7, 14, 및 42일에, 테라토마를 영상화하였다. 42일에, 테라토마를 수거하고, 영상화하여 크기를 나타내었다.
iPSC 이식 후 일 7, 14 및 42일에 제시된 세포 유형(이중대립유전자성 CAG-C5 클론, 단일-대립유전자성 CAG-C38 클론 및 모 iPSC)이 이식된 NSG 마우스의 생물발광 영상화(도 12B). 7일의 영상화는 AP1903 투여(125㎍ i.p.;7 내지 13일) 직전에 수행하였다. 중간 패널은 존재하는 경우, 14일에 수집된 테라테마의 영상을 나타내고, 하부 패널은 발견되는 겨우 42일에 수집된 테라토마의 영상을 나타낸다. 도시된 바와 같이, CAG-C5 및 CAG-C38 둘 모두는 모든 치료된 마우스에서 14일에 테라토마를 제거할 수 있다. 그러나, 테라토마는 늦어도 42일까지 CAG-C38이 이식된 마우스에서 퇴보된 반면, CAG-C5가 이식된 마우스에서 제거된 테라토마는 다시 성장하지 않았다. 도 12C는 42일에 제시된 세포 유형으로부터 유래된 테라토마의 영상을 나타낸다. 도 12D에서 평균 및 SD로 나타낸 제시된 군으로부터의 테라토마에 대한 총 플럭스(광자/s)는 도 12B 및 12C에서 영상화 데이터로 확증되었다. 총괄하여, 이들 데이터는 단일-대립유전자성 iCasp9 클론의 것보다 더 효과적인 이식된 이중대립유전자성 iCasp9 클론의 유도성 사멸을 입증하였다.
실시예 14 - 별개의 안전 하버 유전자좌 내에 표적화된 이중 자살 유전자를 갖는 안전 보호 시스템의 생성
단일 세포 수준에서 고-해상도의 정밀 조작의 능력 및 효능을 입증하기 위해서, 별개의 안전 하버 유전자좌 내에 표적화된 이중 자살 유전자를 갖는 안전 보호 시스템을 갖는 클론성 iPSC를 생성하였다. AAVS1 유전자좌 내에 통합된 CAG-iCasp9에 더하여, CAG-sr39TK를 본 명세서에 기술된 표적화된 삽입 방법을 사용하여 CAG-C38 클론성 iPSC에서 H11 안전 하버 내에 삽입하였다. 도 13A에 도시된 바와 같이, PCR 분석은 sr39TK, sr39TK-불라스티시딘(Bsd) 정션 또는 내인성 H11 서열-이식유전자 정션에 특이적인 프라이머를 사용한 H11 안전 하버 유전자좌 내로의 sr39TK의 특이적 게놈 통합을 확인해 주었으며, GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. H11 유전자좌(sr39TK에 대해서 비-클론성임) 내로의 sr39TK의 표적화된 삽입을 갖는 iCasp9 iPSC 클론을 처음 2일 동안 10nM AP1903으로 처리하거나 처리하지 않고 9일 동안 25㎍/㎖ 간시클로버(GCV)로 처리하였다. CAG-C38 iCasp9 클론(iCasp9에 대해서 단일-대립유전자성임)의 AP1903 단독으로의 2일 동안의 처리는 대부분의 세포의 유도성 사멸로 이어졌지만, 희귀 세포는 유지되었다(도 13B(ii)). GCV 처리 단독으로의 9일 동안의 CAG-C38 iCasp9 클론의 처리는 확장된 GCV-불응성 세포로 이어졌다(도 13B(iii)). 그러나, AP1903 및 GCV 둘 모두로의 동시 처리는 모든 불응성 세포가 효과적으로 제거되었는데, 이는 이중 자살 안전 보호 시스템의 사용이 유도성 자살 유전자 중 어느 하나 하에서 탈출된 잔류하는 세포를 사멸시킴으로써 iCasp9 자살 유전자 단독의 사용보다 더 효과적임을 나타낸다.
본 명세서에는 또한 관심 유전자의 제어 가능한 발현을 위해서, 안전-하버 유전자좌에서 유도성 카세트를 포함하는 iPSC 의 설계가 제공되어 있다. 유도성 카세트의 유전자좌 특이적 삽입은 iPSC 수준에서 일어난다. 실시예에 설명된, 관심 유전자, 여기서는 CAR의 발현은 두 loxP 부위에 의해서 플랭킹된 번역 중단 코돈에 의해서 불활성화된다. 중단 코돈이 그 결과 제거되고, CAR 발현이 활성화된다. 유도자는 생체밖 iPSC 분화 동안 임의의 선택된 단계에서 투여되어, 분화 절차의 최적화를 용이하게 할 수 있다. CAR은 최종 산물, 예컨대 iT 또는 iNK에서의 높은 수준 및 지속되는 발현을 위해서 강한 구성적 프로모터에 의해서 유도된다.
동시에 hiPSC 집단에서 새로운 관심 유전자를 삽입하면서, 유전자 특이적 파괴를 위해서 선택된 유전자좌를 고유하게 표적화하고, 그 다음 고-처리량 방식으로 단일 세포를 분류하여 관심 유전자의 고유한 카피수, 표적화된 유전자의 기능성 파괴 및 오프-타깃 효과의 부재를 비롯한 모든 요구되는 기준을 함유하는 hiPSC 클론을 선택하는 신규 전략을 또한 개발하였다.
도 34A는 음성 및 양성 가닥 지향된 뉴클레아제 결합을 함유하는 표적 벡터, 및 B2M를 위한 상동성 암, 피괴를 위한 예시된 유전자 및 파괴된 유전자좌에서 삽입을 위한 관심 유전자(예를 들어, CD16, HLA-G 및 PDL1)를 함유하는 공여자 벡터를 위한 작제물 설계를 나타낸다. 도 34B는 선택된 유전자좌에서 선택된 유전자를 함유하는 클론성 집단을 위한 유전자 편집 후 hiPSC 선택의 도면을 도시한다.
실시예 15 - B2M 널 (B2M-/-), HLA I-결핍 iPSC 및 이의 변형의 생성
단일 세포 유전자 편집을 수행하여 HLA 복합체 변형을 달성하는 능력을 입증하기 위해서, iPSC주에 야생형 Cas9에 비해서 더 약한 오프-타깃 효과를 제공하도록 조작된 Cas9 니카제 발현 플라스미드 내의 B2M-표적화 gRNA 쌍을 형질주입하였다. 도 14A는 형질주입 전(좌측 패널) 및 후(중간 패널)의 GFP 및 B2M/HLA-I 발현의 유세포 분석법 분석을 나타내었다. B2M 및 HLA-I을 동일한 염료에 접합된 B2M-특이적 항체 및 HLA-I-특이적 항체를 사용하여 동시에 검출하였다. B2M 및 HLA-I 둘 모두에 대해서 음성인 세포(둘러쌓은 집단)를 96-웰 플레이트 내에서 벌크로(도14A) 또는 클론성으로 분류하여 클론주를 생성하였다(도 14B). 표적화된 편집을 사용한 B2M-/- 및 HLA I-결핍 클론을 클론성 게놈 DNA 서열결정에 의해서 추가로 분석하였고, B2M 넉아웃 표현형으로 이어지는 작은 결실 또는 삽입을 갖는 것을 확인하였다.
이어서, HLA 부류 I 결핍 iPSC(B2M-/- iPSC, HLA I 널 iPSC라고도 지칭됨)를 예를 들어, 렌티바이러스를 사용하여 유전자 조작하여 HLA I 결핍 세포를 추가로 변형시키려는 목적을 위해서 HLA-E/B2M 융합 단백질을 도입하였다. 변형된 HLA I-결핍 iPSC(B2M-/- HLA-E iPSC)의 품질(즉, 만능성 상태)을 만능성 마커 TRA-181 및 SSEA4뿐만 아니라 HLA-E의 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 평가하였다. 도 16A는 변형된 HLA I-결핍 iPSC가 세포 표면 상에서 HLA-E를 발현하고, 만능 표현형을 유지하는 것을 나타낸다. 렌티바이러스 형질도입으로부터의 결과와 비교하면 HLA-E/B2M 융합 단백질 발현 뉴클레오타이드가 HLA I 결핍 iPSC 내에 통합된 경우 유사한 결과가 인지되었다.
그 다음 B2M-/- HLA-E iPSC를 PDL1 단백질을 함유하도록 유전자 조작하여, 변형된 HLA I 결핍 iPSC: B2M-/- HLA-E PDL1 iPSC를 생성하였다. 추가로, B2M-/- iPSC를 HLA-G/B2M 융합 단백질을 함유하도록 유전자 조작하고, 이어서 그 다음 PDL1 단백질을 함유하도록 유전자 조작하여, 또 다른 HLA I 변형된 B2M 널 iPSC: B2M-/- HLA-G PDL1 iPSC를 생성하였다. 도 21A는 변형된 HLA I- 결핍 iPSC의 세포 표면 상에서의 HLA-E, HLA-G 및 PDL1의 발현을 나타낸다. HLA-G/B2M 융합 단백질 발현 뉴클레오타이드가 HLA I 결핍 iPSC 내에 통합된 경우 유사한 결과가 인지되었다.
변형된 HLA-I 결핍 iPSC가 이의 조혈 분화 능력을 유지하였는지를 결정하기 위해서, 다양한 변형된 HLA-I 결핍 iPSC(B2M-/-, B2M-/-HLA-E, B2M-/-HLA-E/PDL1, B2M-/-HLA-G 및 B2M-/-HLA-G/PDL1)를 각각 본 명세서에서 사용된 iCD34 분화 프로토콜을 사용하여 CD34+ HE로 분화시켰다. 도 21B는 모든 변형된 HLA I 결핍 iPSC가 분화 10일 후 유세포 분석법에 의해서 인지된 바와 같이 CD34+ HE으로 분화할 수 있음을 입증한다. CD34+ 세포를 단리하고, iNK 또는 iT 림프구 분화 배양물 중에 넣었다. 도 22는 유전자 조작된 면역-내성 양상, 예를 들어, HLA-E, HLA-G 또는 PDL1을 통한 HLA I 결핍 iPSC의 조정은 유세포 분석법에 의해서 인지되는 바와 같이 추가적인 분화 10일 이후에 ProNK(NK 전구체; CD45+CD56) 및 ProT(T 세포 전구체; CD45+CD34+CD7+) 세포를 생성시키는 iCD34 세포의 능력을 동요시키지 않음을 입증한다. PDL1 단백질 발현 뉴클레오타이드가 HLA I 결핍 iPSC에 통합되는 경우 유사한 결과가 인지되었다.
유전자 조작된 면역-내성 단백질의 발현이 조혈 분화 동안 유지되는지를 결정하기 위해서, 변형된 HLA-I 결핍 CD34+ 세포로부터 20일 동안 분화된 iNK 세포를 유세포 분석법에 의해서 세포 표면 상에서 HLA-E, HLA-G 및 PDL1의 발현에 대해서 평가하였다. 도 23A는 HLA-E 및 HLA-G 단백질은 존재하지 않지만, PDL1 발현이 유지되는 것을 입증한다. HLA-E 및 HLA-G 단백질이 조혈 분화 동안 세포 표면으로부터 절단되는지를 결정하기 위해서 20일 iNK 세포 및 20일 배양 배지 상청액으로부터의 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 의해서 HLA-E 및 HLA-G 단백질의 발현에 대해서 조사하였다. 도 23B는 HLA-E 단백질 및 HLA-G 단백질이 상청액 분획에서 발견되는 것을 입증하고, 따라서 HLA-E 단백질 및 HLA-G 단백질이 iPSC-유래 NK 세포의 세포 표면으로부터 셰딩될 것이라고 결론지어 진다.
변형된 HLA I-결핍 iPSC-유래 림프구 효과기 세포의 향상된 지속성을 유지시키기 위해서 HLA-E/B2M 융합 단백질 및 HLA-G/B2M 융합 단백질의 절단-내성 형태를 설계하였고(도 24A), 비-절단성 HLA-G/HLA-A3 융합 단백질을 함유하도록 B2M-/- iPSC를 유전자 조작하였다. 도 24B는 HLA-G/HLA-A3 비-절단성 단백질이 HLA-G의 발현에 대한 유세포 분석법에 의해서 세포 표면 상에서 발현되고, 만능 단백질(TRA-181, SSEA4, NANOG 및 OCT3/4)의 발현에 의해서 인지되는 바와 같이 iPSC의 품질에 영향을 주지 않음을 입증한다.
HLA 부류 I 결핍 iPSC를 생성하기 위한 대안적인 방법은, HLA 부류 I 분자 상에 펩타이드를 로딩하는 책임이 있는 펩타이드 로딩 복합체(PLC)를 방해하는 것이다. 항원 가공과 연관된 이송자(TAP)가 PLC의 통합 구성원이고, 이 유전자의 파괴는 세포 표면 상에서 안정한 HLA 부류 I 분자의 상당한 감소를 유발한다. 그러나, TAP2널(TAP2-/-), HLA I 결핍 iPSC가 iPSC의 분화 가능성 또는 지속성에 임의의 효과를 갖는지는 공지되어 있지 않다. TAP2널 iPSC 주를 생성하기 위해서 FTi121 iPSC에 Cas9 니카제 발현 플라스미드 내의 TAP2 gRNA 쌍을 형질주입하였다. HLA-I에 대한 음성/저 세포를 96 웰 플레이트 내에서 클론성으로 분류하여 클론주를 생성하였다. 도 25A는 모 FTi121에 비해서 HLA 부류 I 발현에서 상당한 감소를 나타내는 2개의 선택된 클론의 유세포 분석법 분석을 나타낸다. IFNγ로의 iPSC의 처리는 표면 상의 HLA 부류 I 분자의 상향조절을 유도한다. 도 25B는 IFNγ로의 처리 이후에 TAP2-/- 클론이 야생형 FTi121에 비해서 HLA 부류 I의 감소된 발현을 나타내는 것을 입증하는데, 이는 HLA 복합체 발현의 최적 수준을 식별하여 T 세포 및 NK 세포 검출 둘 모두를 회피하는 독특한 전략을 시사한다.
실시예 16 - B2M-/- 및 HLA I-결핍 iPSC는 개선된 지속성을 갖는다
HLA-I의 부재가 B2M-/- hiPSC가 T 림프구 반응을 회피하는 것을 가능하게 하는지를 결정하기 위해서, 말초 혈액 T 세포를 10일 동안 hiPSC와 공동배양함으로써 프라이밍하였다. 10일 후 확장 및 프라이밍된 T 세포를 수거하고, 세포독성 효과기 세포로서 사용하였다. 야생형 hiPSC(WT) 또는 B2M-/- (조작된) hiPSC 표적 세포를 단독으로 또는 1:3의 비의 프라이밍된 T 세포를 갖는 공배양물로 플레이팅하였다. 웰당 표적 세포의 수를 인큐사이트 줌(Incucyte Zoom)을 사용하여 5일에 걸쳐서 측정하였다. 도 15A에 나타난 바와 같이, WT hiPSC 표적 세포는 프라이밍된 T 세포에 의해서 인식 및 사멸된 반면, 조작된 hiPSC는 영향이 없었다.
B2M-/- hiPSC가 T 세포에 의한 인식 및 사멸을 회피할 수 있는 것으로 나타났지만, 이들 세포는 NK 세포에 의해서 보다 효율적으로 사멸될 수 있는 문제가 있었는데, 그 이유는 NK 세포가 B2M 부족 세포의 경우인 MHC 부류 I이 부족한 세포에 의해서 활성화되고; 그렇게 되면, 생체내에서 거부반응에 기여할 수 있다고 알려져 있기 때문이다. B2m-/- hiPSC가 증가된 NK 세포 인식을 갖는지의 여부를 시험하기 위해서, K562 세포, 아생형 iPSC(WT)로부터 분화된 CD45+ 세포, 또는 B2M-/- iPSC(B2M-/- )로부터 분화된 CD45+ 세포를 별개로 각각 CFSE, e670 증식 염료(이바이오사이언스(eBioscience)), 또는 e450 증식 염료(이바이오사이언스)로 표지하였다. 모든 3개의 표지된 표적 세포를 동일한 비율로 혼합하고, 단일 웰 내에서 제시된 비율로 NK 세포 효과기에 첨가하거나(도 15B), 또는 3개의 표지된 표적 세포를 각각의 별개의 웰 내에서 NK 세포 효과기에 첨가하였다(도 15C). 세포를 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포 세포독성의 유세포 분석법 기반 정량분석을 수행하였다. 도 15B 및 15C에 나타낸 바와 같이, 시험관내에서 어떤 증가된 NK 세포 인식도 없는 것으로 보였는데, 여기서 B2M-/- 및 WT hiPSC CD45+ 세포 둘 모두는 동일한 비율로 그리고 양성 대조군으로 포함된 공지된 NK 세포 표적인, K562 세포의 사멸과 비교하여, 둘 모두 비교적 낮은 수준으로 사멸되었다. 따라서, 데이터는 이러한 B2M-/- iPSC 주가 NK 세포 인식을 유도하지 않으면서 T 세포 매개된 사멸을 피할 수 있다는 것을 시사하였으며, 이는 개선된 지속성을 갖는 보편적인 공여자/수용자 상용성 hiPSC 클론주를 나타낸다.
보편적 B2M-/- hiPSC 클론주의 개선된 지속성을 생체내에서 추가로 평가하였다. HLA-A의 부재가 수용성(competent) 면역계의 존재 하에서 생체내에서 지속성의 증가를 허용하는지를 결정하기 위해서, 루시페라제 처리된 WT hiPSC(WT) 및 B2M-/- hiPSC(조작됨)를 면역손상된(immunocompromised) NSG)(도 15D 좌측) 또는 면역적격 WT C57BL/6(도 15D 우측) 수용자 마우스에 피하로 양측에 주사하여 테라토마를 형성하였다. 96시간 후 마우스를 생물발광 IVIS 영상화에 적용하여 테라토마를 검출하였다. NSG 수용자에서 WT 및 조작된 테라토마 둘 모두는 동일한 강도로 검출된 반면, WT C57BL/6 마우스에서 조작된 B2M-/- hiPSC는 WT hiPSC에 비해서 증가된 지속성을 나타내었다.
실시예 17 - iPSC 상에서의 HLA 부류 I의 조정은 생체내에서 iPSC의 지속성을 증가시킨다
HLA I-결핍 iPSC가 생체내에서 지속성을 증가시켰는지를 결정하기 위해서, 루시페라제 처리된 야생형 iPSC 및 B2M-/-HLA-E iPSC를 테라토마 검정에서 완전 면역적격 C57BL/6 수용자의 반대 옆구리 상에 피하로 주사하였다. 마우스를 루시페린 주사와 함께 IVIS 영상화에 의해서 매일 분석하여 테라토마를 발달된 테라토마를 가시화하였다. 도 16B는 주사 후 72 내지 144시간에, B2M-/-HLA-E iPSC가 야생형 iPSC와 비교할 때 약 6배의 증가된 정량적 지속성을 나타낸 것을 입증한다. B2M-/-HLA-E iPSC 테라토마를 갖는 증가된 루시페린 영상화를 도시한 3마리의 대표적인 마우스를 또한 도 16B에 제공하였다. HLA-G를 HLA-E 대신에 사용한 경우 지속성에서 유사한 개선이 관찰되었다. 추가로, 상기에 기술된 바와 같이, 절단을 회피하기 위한 HLA-E 또는 HLA-G의 변형된 버전을 적용하여 HLA 부류 I 변형된 iPSC의 생체내 지속성을 추가로 향상시켰다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 일부 시나리오에서 CMV+ 공여자로부터 수득된 NK 세포가 NKG2C 발현을 나타내어, 활성화되는 경우, HLA-E 표면 발현이 대신에 NKG2C를 활성화시켜, NK 세포 인식 및 HLA-E 발현 세포의 결과적인 사멸을 비롯한, 악영향으로 이어진다는 것을 인식하였다. NK 세포가 NKG2A를 발현하는 경우에 반해서, NK 세포는 HLA-E 표면 발현 iPSC 및 분화된 자손에 의해서 불활성화되어, 이들 HLA-E 표면 발현 세포의 지속성을 증가시킬 수 있다.
숙주 면역 반응의 어느 성분이 야생형 수용자 마우스에서 향상된 변형된 HLA I-결핍 iPSC의 거부반응에 관련되는지를 결정하기 위해서, 각각 항-CD4, 항-CD8a 및 항-NK1.1 항체의 주입을 통해서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포를 개별적으로 고갈시켰다. 도 26A는 항체 주입 3일 후 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포의 부재를 입증한다. 항체-매개된 고갈 3일 후 루시페라제 처리된 B2M-/- HLA I-변형된 iPSC를 면역적격 C57BL/6 마우스의 옆구리 상에 피하 주사하여 테라토마를 형성하였다. 마우스를 루시페린 주사와 함께 IVIS 영상화에 의해서 매일 분석하여 발달된 테라토마를 가시화하였다. 도 26B는 iPSC 주사 후 120시간에 NK 세포 고갈된 마우스가 IgG 대조군 치료된 동물에 비해서 종양 거부반응에 대해서 최고 내성을 나타내었음을 입증한다.
유전자 조작된 HLA I-변형된 iPSC가 시험관내에서 증가된 지속성 및 내성을 갖는지를 결정하기 위해서 B2M-/- PDL1 HLA-I 변형된 iPSC를 3일 동안 현탁물 중에서 배양하고, 이어서 IFNγ로 24시간 동안 처리하여 HLA 부류 I의 발현을 유도하였다. 세포 증식을 모니터링하기 위해서 셀 트레이스 바이올렛(CTV)으로 미리 표지된 동종이계 정제된 T 세포(도 27A), 전체 말초 혈액 단핵 세포 중에 함유된 동종이계 T 세포 및 NK 세포(PBMC, 도 27B 및 27C)를 갖는 공배양물에 처리된 iPSC를 넣었다. T 세포/PBMC 단독(비자극됨) 및 활성 및 증식을 유도하기 위해서 항-CD3/CD28 비드로 자극된 T 세포/PBMC(자극됨)를 대조군으로서 사용하였다. 공배양물 개시 12일 후 세포를 유세포 분석법에 의해서 평가하여 HLA I-변형된 iPSC-유래 세포를 인식하고, 이에 반응하는 이의 능력의 척도로서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 CD56+ NK 세포의 증식의 양을 결정하였다. 도 27A 및 27B는 야생형 iPSC-유래 세포와 공배양된 T 세포에 비해서, B2M-/- 및 더 나아가 B2M-/-HLA I-변형된 iPSC-유래 세포와 공배양된 T 세포가 CTV 증식 염료의 희석에 의해서 인지되는 바와 같이 더 적은 증식을 나타내었음을 입증한다. 도 27C는 NK 세포 증식에 대한 유사한 효과를 입증하는데, 이는 총괄하여 T 세포 및 NK 세포에 대한 면역 내성을 향상시키는 HLA 부류 I 변형의 능력을 의미한다.
실시예 18 - 추가 편집을 통해서 향상된 특성을 갖는 iPSC의 생성
iPSC 수준이 변형 또는 조정된 분자를 사용하여 본 발명의 분화 플랫폼을 통해서 수득된 유도체 림프구를 사용하여 면역 요법에서 바람직한 특성을 향상시킬 수 있다. 이러한 분자는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 포함할 수 있다. B2M/HLA-I 및 HLA-E/G에 더하여, 바람직한 특성에 기여하는 표적화된 분자는 CD16 수용체 및 41BBL 공자극 분자, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR(키메라 항원 수용체), TCR(T 세포 수용체), TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, 염색체 6p21 영역내의 임의의 유전자, 관여자, 및 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자를 커플링하기 위한 표면 촉발 수용체를 추가로 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, iPSC에서 표적화된 분자의 유전자 변형은 하기 중 하나 이상을 포함한다: B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자의 결실 또는 감소된 발현; HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 또는 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체의 도입 또는 증가된 발현. 표적화된 분자의 증가된 발현 또는 감소된 발현은 영구적, 단기적, 일시적 또는 유도성일 수 있고, 내인성 또는 외인성 프로모터에 의해서 제어될 수 있다.
이들 목적하는 양상은 관련 기술 분야에 공지된 다양한 전달 방법을 사용하여 iPSC에 도입될 수 있다. 본 예시적인 설명에서, 고-친화도 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16) 및 41BBL 공자극 분자를 함유하여 향상된 세포독성을 갖는 iPSC를 생성하도록 iPSC를 유전자 조작하였다. 도 17A는 유세포 분석에 의해서 렌티-바이러스 형질도입 이후 iPSC의 표면 상에서의 hnCD16 및 41BBL의 효율적인 발현을 입증한다. 도 17B는 hnCD16의 발현 및 41BBL 발현이 유지되고, 분화 10일 후 CD34+ HE 세포를 생성시키는 iPSC의 능력을 동요시키지 않는다는 것을 입증한다.
hnCD16(고-친화도 비-절단성 CD16 수용체) 단백질의 발현이 조작된 iPSC의 조혈 분화에 영향을 주는지를 평가하기 위해서 hnCD16/41BBL 유전자 조작된 iPSC의 풀을 96 웰 플레이트 내에서 클론성으로 분류하였다. 3개의 양성 클론을 선택하고, 10일 동안 분화시켜 iCD34+ 세포를 생성하였다. 도 28A는 유세포 분석법에 인지되는 바와 같은 CD34+ HE 상에서 hnCD16 및 41BBL의 균질한 발현을 입증한다. CD34+ 세포를 단리하고, 10일 동안 NK 촉진 조건 하에서 추가로 분화시켜 proNK 세포를 생성하였다. 도 28A는 CD56+ NK 전구세포가 hnCD16 단백질의 발현의 높은 수준을 유지하고는 것을 나타내고, hnCD16 및 41BBL의 발현이 조작된 iPSC의 조혈 분화 능력을 동요시키지 않는다는 것을 입증한다.
NK 세포에 의해서 발현된 내인성 CD16 수용체는 NK 세포 활성화 이후 세포 표면으로부터 절단된다. hnCD16 조작된 단백질이 절단되지 않는 것을 확인하기 위해서, hnCD16 발현 iNK 세포 및 말초 혈액(PB)-유래 NK 세포를 1) 항상성 배양물, 2) CD16 절단을 억제하는 TACE/ADAM 저해제의 존재 또는 부재 하에서의 항상성 배양물 또는 3) NK 세포 활성화 및 후속 CD16 셰딩을 촉진시키도록 K562 표적 세포로 자극된 배양물에서 배양하였다. 자극이 없는 PB-유래 NK 세포 및 iNK 세포를 항상성 대조군을 나타낸다. 도 28B는 항상성 배양 동안 CD16 발현의 PB-유래 NK 세포의 손실이 TACE/ADAM 저해제에 의해서 감소 또는 저해되고, K562와의 공배양이 세포를 표적으로 한 후 CD16 발현의 손실이 증가된다는 것을 입증한다. 이에 반해서, hnCD16 조작된 iNK 상의 CD16의 발현은 K562 표적 세포에 의한 iNK 세포 활성화 시 변함없이 유지되고, 따라서 비-절단성 고 친화도 CD16 수용체의 온전성을 확인해 준다.
hnCD16 수용체의 향상된 기능성을 평가하기 위해서 hnCD16-발현 iNK 세포를 비자극하거나 또는 5ug/㎖ 항-CD16 또는 단독 또는 5ug/㎖ 항-CD16과 조합하여 P815 세포의 1:1 비율로 자극하였다. iNK 세포를 NK 세포 활성화의 특질인 염증전 사이토카인 방출 및 탈과립화에 대해서 유세포 분석법에 의해서 평가하였다. 도 29A는 CD45+CD56+CD3- 분획 상에 게이팅된 iNK 세포를 도시하고, IFN□, TNF□, 및 CD107a 표면 발현을 나타낸다. hnCD16 발현 iNK 세포는 항-CD16 항체에 대한 반응에서 TNFα 및 CD107a의 증가된 발현을 가지는데, 이는 P815 세포 및 항-CD16과의 공배양에 의해서 추가로 향상될 수 있다. 이들 데이터는 hnCD16 수용체가 iPSC-유래 iNK 세포에 대해서 기능성임을 입증하였다.
항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)는 항체-코팅된 표적 세포에 대한 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개된 용해의 기전이다. ADCC 기능을 평가하기 위해서, hnCD16-발현 iNK 세포를 허셉틴 항체와 함께 또는 그것 없이 120시간 동안 핵 레드(nuclear red)-표지된 SKOV 표적 세포와 함께 공배양하였다. 표적 세포의 정량분석을 2시간 마다 인큐사이트 줌(Incucyte ZOOM) 세포 분석 시스템(에센 바이오사이언스(Essen BioScience), 미국 미시간주 안 아버 소재)을 사용하여 분석하였다. 도 29B는 hnCD16 발현 iNK 세포가 허셉틴 항체의 존재 하에서 강력한 ADCC를 가짐을 입증하는데, 이는 조작된 iNK 세포의 향상된 기능성에 대한 추가 증거를 제공한다.
iPSC-유래 iNK 세포의 품질을 추가로 평가하기 위해서, 배양물을 하기와 같이 확장-촉진 조건에 놓았다. CD45+CD3-CD56+(약 66%)를 CD34+ 세포로부터 iNK 분화 18일에 수득하였다. 세포(2.5 x 10^5/㎖)를 동일한 수의 조사된 K562/mbIL-21/41BBL 피더 및 250 U/㎖ rhIL-2와 함께 매주 배양하였다. 각각의 라운드의 피더 첨가 후에, 새로운 배지(B0) 및 IL-2를 3일에 첨가하였다. 세포를 5일에 2.5 x 10^5/㎖로 희석하고, 새로운 배지 및 IL-2(250U/㎖)를 공급하였다. 세포 계수치 및 유세포 분석법을 사용하여 NK 세포의 배수 확장을 결정하였다. 도 30은 iNK 세포가 배양 15일 동안 495 배수의 확장을 겪는 것을 입증한다.
따라서, iPSC는 B2M 널 또는 저, HLA-E/G, PDL1, A2AR, CD47, LAG3 널 또는 저, TIM3 널 또는 저, TAP1 널 또는 저, TAP2 널 또는 저, 타파신 널 또는 저, NLRC5 널 또는 저, PD1 널 또는 저, RFKANK 널 또는 저, CIITA 널 또는 저, RFX5 널 또는 저 및 RFXAP 널 또는 저 중 하나 이상을 포함하도록 생성된다. 변형된 HLA 부류 I 및/또는 II를 갖는 이들 세포는 면역 검출에 대한 증가된 내성을 갖고, 따라서 개선된 생체내 지속성을 제공한다. 게다가, 이러한 세포는 입양 세포 요법에서 HLA 매칭에 대한 요구를 회피할 수 있고, 따라서 보편적인 기성품 치료 요법의 기원을 제공한다.
또한 개선된 면역 효과기 능력을 제공하는, HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR 및 TCR 중 하나 이상을 포함하는 iPSC가 생성된다.
실시예 19 - CAR-T 유래 iPSC는 CAR을 보유한다
키메라 항원 수용체(CAR)는 면역 효과기 세포, 예컨대 T 또는 NK 세포 상에 특이성을 적용하는 기능을 하는 조작된 막관통 수용체이다. CAR은 항원 인식을 제공하기 위한 단클론성 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편(scFV) 및 면역 효과기 세포에 활성화 신호를 제공하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 조합물로 전형적으로 이루어진 융합 단백질이다. CAR은 강력한 보편적 암 면역요법으로서 상당한 가능성을 보유하는데, 그 이유는 CAR-면역 효과기 세포가 임의의 종양 연관 항원을 인식하여, HLA 매칭 필요성 없이 조작된 면약 효과기 세포를 종양 세포에만 표적화화도록 조작될 수 있기 때문이다.
본 발명자들은 기원 세포, 즉 동일한 키메라 항원 수용체의 동일한 유전자 각인을 보유하는 iPSC에 대한 CAR-T 세포의 재프로그래밍을 보여주었다(도 18). CAR에 대한 공식별자로서 CD19 키메라 항원 수용체(CAR) 및 절두된 LNGFR 세포 표면 마커를 발현하도록 유전자 조작된 iPSC는 iCD34 세포로의 분화를 통한 발현을 보유한다(도 18).
본 명세서에는 또한 내인성 TCR 유전자좌에서 CAR을 포함하는 iPSC가 제공된다. CAR의 유전자좌 특이적 삽입은 T 세포의 수준에서 달성되었고, 그 다음 CAR의 표적화된 삽입을 포함하는 iPSC로 재프로그래밍하였다. 대안적으로, CAR의 유전자좌 특이적 삽입은 iPSC 수준에서 일어날 수 있다. 단지 하나의 발현성 TCR 유전자좌가 존재하기 때문에, 발현성인 CAR 삽입의 카피수는 유전자좌 특이적 삽입을 통한 제어 하에 있다. 추가로, CAR은 TCR의 불변 영역 내에 삽입된다. TCR 불변 영역의 절두는 TCR 녹-아웃으로 이어지는데, 이는 세포 요법에서 HLA 매칭 요건을 제거한다. 게다가, CAR 발현은 TCR 내인성 프로모터에 의해서 제어되고, 따라서 TCR과 동일한 수준이고, 동일한 발달 단계에 있다. 내인성 TCR을 모방하는 제어된 CAR 발현은 iPSC 분화의 과정 동안 분화 효력에 대한 퍼턴셀 영향을 회피한다. 도 20은 모주에서 TCR 발현과 비교할 때 대등한 수준에서 CAR의 발현 및 조작된 세포주에서 TCR의 발현 및 기능 둘 모두의 제거를 나타낸다. 이어서, 조작된 T 세포를 내인성 TCR 유전자좌에서 CAR을 포함하는 iPSC로 재프로그래핑한다.
추가로, 본 발명자들은 독시사이클린-유도성 CAR 발현을 갖는 iPSC 주를 생성하였다. 공식별자로서 테트라사이클린 반응 요소(TRE), CD19 CAR 및 절두된 LNGFR 표면 마커를 함유하는 렌티바이러스를 형질도입함으로써 iPSC를 유전자 조작하였다. TetCAR iPSC를 생성하도록 Tet-On 발전된 트랜스작용인자(rtTA)를 함유하는 별개의 렌티바이러스를 또한 iPSC 내에서 유전자 조작하였다. 독시사이클린 유도성 시스템 TetCAR의 효율을 결정하기 위해서, iPSC를 독시사이클린과 함께 또는 그것 없이 배양하였고, CAR 및 LNGFR 마커의 발현을 유세포 분석법에 의해서 평가하였다. 추가로, iPSC를 Tra-181에 대해서 염색하여 iPSC의 만능 품질을 평가하였다. 도 32A는 독시사이클린 치료 이후에 약 65%의 iPSC가 Tra-181 발현을 유지하면서 CAR 및 LNGFR의 발현에 대해서 양성임을 입증한다.
TetCAR iPSC가 향상된 기능성을 갖는지를 결정하기 위해서, TetCAR iPSC를 10일 동안 분화시켜 CD34+ HE를 생성하였다. CD34+ HE를 단리하고, 세포를 추가로 30일 동안 분화시켜 iNK 세포를 생성하였다. iNK 세포를 24시간 동안 독시사이클린으로 처리하여 CAR 발현을 유도하였다. 이어서, CD19-발현 Raji B 세포 림프종 주, CD19의 발현이 없는 K562 세포, 또는 인간 CD19를 발현하도록 조작된 K562 세포와 함께 24시간 동안의 공배양에 의해서 iNK 세포독성을 평가하였다. iNK-매개된 세포독성을 표적 세포 상에서 카스파제-3의 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 평가하였다. 도 32B는 독시사이클린으로 처리된 TetCAR iNK 세포가 비-처리된 대조군에 비해서 증가된 세포독성을 나타내었음을 입증하고, 이는 CAR이 iPSC-유래 림프구 효과기 세포에 향상된 기능을 수여하는 것을 확인해 준다.
실시예 20 - 개선된 표적화 특이성을 위한 보편적 관여자를 포함하는 iPSC의 생성
표적화된 종양 세포에 효과기 세포를 재지향시킬 수 있는 이중- 또는 다중-특이적 관여자를 커플링함으로써 iPSC, 및 T, NK, NKT 세포, 대식세포 및 호중구를 비롯한 유래된 림프구 효과기 세포의 세포 세포독성을 추가로 향상시킬 수 있다. 일반적으로, 이중- 또는 다중-특이적 관여의 개념은 효과기 세포의 표면에서 종양-연관된 항원 및 활성화 수용체를 동시에 표적화하는 이중- 또는 다중-특이적 항체를 사용하여 특이적 종양 세포에 효과기 세포를 재표적화하는 것에 초점을 맞추고 있다. 이러한 이중특이적 결합은 또한 효과기 세포 기능을 자극시켜, 효과적인 효과기 세포 활성 및 궁극적으로 종양 세포 파괴로 이어진다. 효과기 세포 활성화 및 종양 세포 사멸은 효과기 및 표적 세포가 이중특이적 관여자에 의해서 가교결합될 때만 일어나기 때문에, 그것은 안전한 제어 기전을 제공한다. 더 나아가, 이러한 재표적화 관여자를 통해서, 주요 조직적합 복합체 (MHC)-제한된 활성화가 우회된다.
종양 세포의 편에서, 이중특이적 관여자 커플링에 사용될 수 있는 확립된 종양-연관된 항원은 혈액 악성 종양의 CD19, CD20 또는 CD30; EGFR(표피 성장 인자 수용체), HER2/ERBB2/neu(인간 표피 성장 인자 수용체 2), EPCAM(상피 세포 접착 분자), EphA2(에리쓰로포이에틴-생산 간세포 암종 A2) 및 고형 종양의 경우 CEA(암배항원(carcinoembrantigen)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 표면 이중특이적 항체/관여자는 추가적인 특징, 예컨대 이중특이적 관여 및 결합을 향상시키기 위한 바이오티닐화된 단백질(들), 장기간 표면 제시를 위한 표면 막 고정 도메인(들), 이중특이적 상호작용 시 신호전달을 향상시키기 위한 공자극 도메인(들), 및 관여자의 유도성 또는 일시적 발현 제어를 위한 온 및 오프-스위치 기전을 추가로 포함할 수 있다.
이중특이적 관여자 매개된 효과기 세포 재표적화는 효과기 세포의 편에서는 표면 수용체의 커플링에 관여한다. 자연적으로 존재하는 표면 수용체는 T 세포 상에서 발현되는 각각 CD3, FcgRIII(CD16), FcgRI(CD64) 및 FcaR(CD89), NKT 세포, NK 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 조작된 표면 촉발 수용체를 도입하여 재표적화 관여자 커플링의 목적을 위해서 효과기 세포 표면 상에서 발현시킬 수 있다. 유전자 조작된 표면 촉발 수용체는 그의 자연 수용체 및 세포 유형에 독립적인 특이적 표적 세포와 효과기 세포 간의 이중- 또는 다중-특이적 항체 관여를 가능하게 한다. 이러한 접근법을 사용하여, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하는 iPSC를 생성하고, 이어서 iPSC를 보편적 표면 촉발 수용체를 발현하는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 분화시키는 것이 가능하다. 일반적으로, 조작된 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 함유한다. 표면 촉발 수용체의 항-에피토프는 한 단부 상에서 에피토프에 매칭되는 이중- 또는 다중-특이적 관여자를 갖는 수용체를 발현하는 임의의 효과기 세포의 커플링을 지향한다. 다른 단부 상의 관여자의 표적화 특이성은 커플링된 효과기 세포를 사멸에 대한 특이적 항원을 갖는 종양 세포로 지향시킨다. 보편적 표면 촉발 수용체의 경우, 일례에서, 공자극 도메인은 IL2 단백질 및 이의 부분을 포함하여 캐노니컬 또는 비캐노니컬 세포 활성화를 달성하고/하거나 효과기 세포 유형에 관계없이 효과기 세포 기능을 향상시킬 수 있다.
실시예 21 - iPSC-유래 세포 산물은 더 큰 증식, 생존 및 지속 가능성을 대표하는 더 긴 말단소체 길이를 갖는다
말단소체 단축은 세포 노화로 일어나고, 줄기세포 기능장애 및 세포 노쇠와 연관된다. iPSC-유래 세포 요법의 중요한 인센티브는 iPSC-유래 세포 산물이 더 큰 증식 가능성을 나타내는 더 긴 말단소체 길이를 가질 것이라는 것이다. iPSC-유래 iNK 세포의 말단소체 온전성을 평가하기 위해서, CD56+ 세포를 27일 iNK 세포 배양물 및 성인 PB-유래 NK 세포로부터 단리하였다. 정제 후, 각각의 샘플을 30kb 초과의 말단소체를 갖는 인간 T 세포 백혈병 세포주(1301 세포주)인, 동일한 수의 참조 세포와 합하였다. 각각의 샘플/참조 세포 혼합물을 위해서, DNA를 프로브 없이 혼성화 용액의 존재 하에서 또는 플루오레세인-접합된 펩타이드 핵산(PNA) 말단소체 프로브(말단소체 PNA 키트, 다코 인크(Dako Inc))를 함유하는 혼성화 용액 중에서 변성시켰다. 샘플/참조 세포 혼합물을 암실에서 실온(RT)에서 밤새 인큐베이션시키고, 이어서 세척하여 비결합된 프로브를 제거하였다. DNA 염색 용액을 모든 샘플에 첨가하고, 이어서 BD 포테사(BD Fortessa) X-20(BD 바이오사이언시스) 상에서 획득하였다. 1301 세포주와 비교한 상대적인 말단소체 길이를 각각의 샘플의 말단소체 신호와 참조 세포(1301 세포주) 간의 비로서 계산하고, G0/1 세포의 DNA 인덱스에 대해서 보정하였다. 도 31은 iNK 세포가 2개의 별개의 성인 NK 세포 공여자에 비해서 증가된 말단소체 길이를 갖지만, iPSC 대조군에 비해서 더 짧은 말단소체를 갖는 것을 입증하는데, 이는 공여자 NK 세포와 비교하면 iPSC 유래된 NK 세포에서 더 큰 증식, 생존 및 지속 가능성을 나타낸다.
실시예 22 - 냉동보존된 iPSC-유래 세포 산물은 기능성 세포로서 이의 분화 가능성 및 유전자 각인을 유지한다
예로서 iPSC-유래 ProT(T 전구)를 사용하여, iPSC-유래 세포 산물을 이의 냉동보존 능력에 대해서; 그리고 iPSC-유래 전구 세포 산물의 경우, 완전 분화된 세포로의 추가 분화를 위한 가능성을 유지하는 능력에 대해서 평가하였다. iPSC로부터 유래된 분류된 CD34+ 세포를 추가로 10일 동안 T 세포 분화 배양물 중에서 분화시켰다. 10+10일에 CD45+CD34+CD7+ ProT 세포를 FACS에 의해서 단리하고, 2개의 별개의 냉동보존 배지 중에 냉동보존하였다. ProT 세포를 냉동보존하고, 이어서 해동하고, T 세포 분화 배양물 중에 다시 넣었다. 도 35는 proT 세포 단리 전(A), 및 해동 3일 후(B 및 C) 유세포 분석법에 의한 CD34 및 CD7의 발현을 도시한다. 10+13일 냉동보존된 ProT 세포는 냉동보존되지 않은 ProT 세포(B)와 비교하여 동일한 방식으로 CD34-CD45+CD7+ 세포로 추가로 분화된다. 도 35는 ProT 세포가 해동 후 생존 가능하고(D), T 세포 분화 배지에서 배양되는 경우 증가된 세포 증식을 나타내는 것(E)을 입증한다.
T 세포 발달 동안, 조혈 전구 세포는 골수로부터 흉선으로 이동하여 ProT 세포로 분화한다. iPSC-유래 proT 세포를 추가로 특징규명하기 위해서, 본 발명자들은 흉선에서 발현되어 발달하는 T 세포를 모집하는 것으로 공지된 케모카인으로 이동하는 이의 능력을 평가하였다. 10+10일에 iPSC-유래 ProT 세포를 마커 CD45+CD7+에 대해서 FACS에 의해서 단리하고, 세포를 케모카인 CCL21, CCL25 및 SDF를 갖는 트랜스웰 이동 검정에 플레이팅하였다. 4시간 후 케모카인으로 이동된 생존한 ProT 세포의 수를 애큐카운트(Accucount) 정량분석 입자(스페로테크(Spherotech), 미국 일리노이주 레이크 포레스트 소재)를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 정량분석하였다. 도 36A는 iPSC-유래 ProT 세포가 CCL21 및 SDF로 성공적으로 이동할 수 있다는 것을 입증하고, 이는 T 세포 계통 전념을 위한 추가 증가를 제공한다. 흉선으로의 진입 시, ProT 세포는 흉선 환경에 반응하여 사이토카인 IFNγ, TNFα 및 IL2를 분비한다. 흉선 환경에 반응하는 iPSC-유래 proT 세포의 능력을 평가하기 위해서, iPSC-유래 proT 세포, CB-유래 proT 세포 및 말초 혈액 T 세포를 비자극시키거나 또는 4시간 동안 PMA+이노마이신으로 자극시켰다. 4시간 후, 세포를 수집하고, IFNγ, TNFα 및 IL2에 대해서 염색하였다. 도 36B는 iPSC-유래 proT 세포가 반응하여 IFNγ 및 TNFα 사이토카인를 생산 및 분비하는 것을 입증한다.
기능성 proT 세포의 추가 특징은 기능 T 세포 수용체를 생성하기 위한 TCR 감마 유전자좌의 VDJ 재조합의 개시이다. iPSC-유래 ProT 세포가 VDJ 재조합을 개시하였는지를 결정하기 위해서, 게놈 DNA를 단리하였다. TCR 유전자 재조합 후 잃어버린 게놈 영역(V-Jγ 및 V-DJβ)을 생식계열 DNA에 대한 대조군으로서 qPCR에 의해서 증폭시켰다. 변화되지 않고 유지된 또 다른 영역(Cβ2)을 또한 생식계열 DNA를 위한 대조군으로서 증폭시켰다. 섬유모세포주로부터 수득된 게놈 DNA를 사용하여 표준 곡선을 작제하였다. 각각 V-Jγ 또는 V-DJβ의 카피수를 Cβ2의 카피수와 비교함으로써 생식계열 구성으로 유지된 TCRγ 유전자좌 또는 TCRβ 유전자좌의 백분율을 계산하였다. FTi121 iPSC 및 T 세포로부터 재프로그래밍된 iPSC(TiPS C9.1)를 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 제공한다. 도 37은 FTi121 및 TiPS C9.1과 비교하는 경우 FTi121 iPSC-유래 ProT 세포가 TCR 감마 유전자좌로부터 남아있는 생식계열의 감소된 백분율을 갖는다는 것을 입증하고, 이는 이들이 TCR 유전자좌의 재배열을 시작하고, T 세포 계통에 전념된다는 것을 나타낸다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시형태를 대표하고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 다양한 치환 및 변형은 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 본 개시내용에 행해질 수 있음은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 자명할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 본 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 각각의 예에서 본 명세서에서 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 임의의 것은 다른 2개의 용어 중 어느 하나에 의해 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용되고, 도시되고 기술된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 개시내용의 범주 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시형태 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변형 및 변경은 관련 기술 분야의 통사의 기술자에 의해서 분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위에 의해서 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (126)

  1. 작제물로서, 통합 시에 상기 작제물 내에 포함된 1종 이상의 외인성 프로모터에 또는 선택된 부위 내에 포함된 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 1종 이상의 관심 외인성 폴리뉴클레오타이드; 및 상기 선택된 부위에 특이적이고, 상기 관심 외인성 폴리뉴클레오타이드에 플랭킹(flanking)된 상동성 아암의 쌍을 포함하되,
    상기 작제물은 iPSC(induced pluripotent stem cell) 내의 상기 선택된 부위에서 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합을 위한 것이고;
    상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 후속하는 확장된 iPSC, 상기 iPSC로부터 유래된 분화된 세포 및/또는 그로부터 유래된 탈분화된 세포에서 통합되고, 기능성으로 유지되는, 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 링커 서열에 의해서 서로에 연결되거나; 또는 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이한 프로모터 하에서 발현하는, 작제물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 링커 서열은 자가-절단 펩타이드를 암호화하는, 작제물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 링커 서열은 내부 리보솜 도입 서열(Internal Ribosome Entry Sequence: IRES)을 제공하는, 작제물.
  5. 제1항에 있어서, 마커를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 선택된 부위에서 상기 내인성 프로모터에 의해서 유도된 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 작제물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 선택된 부위는 안전 하버 유전자좌(safe harbor locus), 고 발현성 유전자좌, 일시적으로 발현된 유전자좌, 또는 중단을 위한 유전자 유전자좌인, 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 안전 하버 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 게놈 안전 하버의 기준을 충족시키는 유전자좌를 포함하거나; 또는 상기 중단을 위한 유전자 유전자좌는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자를 포함하는, 작제물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 작제물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 1종 이상의 안전 스위치 단백질; 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드; 약물 표적 후보; 및 상기 작제물과 통합된 상기 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는, 작제물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화하는, 작제물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 안전 스위치 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 CAG에 작동 가능하게 연결된, 작제물.
  13. 게놈 내의 하나 이상의 선택된 부위에서 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집(genomic editing)을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법으로서, 하기 (I), (II) 또는 (III) 단계를 포함하고, 이에 의해서 적어도 하나의 기능성 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하되, 상기 게놈-조작된 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화될 수 있는, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법:
    (I): 하기 단계 (i) 및 (ii) 단계 중 하나 또는 둘 모두를 임의의 순서로 포함하는, iPSC를 유전자 조작하는 단계:
    (i) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하도록 제1항의 1종 이상의 작제물을 iPSC에 도입하는 단계;
    (ii) (a) 선택된 부위 인식이 가능한 1종 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 선택된 부위에서 하나 이상의 이중 가닥 브레이크를 iPSC 내에 도입하는 단계; 및
    (b) 내인성 DNA 수선을 허용하여 상기 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 단계 (I)(ii)(a)의 iPSC를 배양하는 단계;
    (II): 하기 단계들을 포함하는, 재프로그래밍 비-만능 세포를 유전자 조작하여 상기-게놈 조작된 iPSC를 수득하는 단계:
    (i) 비-만능 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜 상기 비-만능 세포의 재프로그래밍을 개시하는 단계; 및
    (ii) 상기 단계 (II)(i)의 재프로그래밍 비-만능 세포에 하기 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 모두를 임의의 순서로 도입하는 단계로서,
    (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하기 위한 제1항의 1종 이상의 작제물;
    (b) 선택된 부위 인식이 가능한 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하는 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 브레이크;
    상기 단계 (II)(ii)(b)의 세포를 내인성 DNA 수선을 허용하여 상기 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 배양하는, 상기 도입하는 단계; 및
    (III): 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는, 재프로그래밍을 위해서 비-만능 세포를 유전자 조작하여 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계:
    (i) 비-만능 세포에 하기 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 모두를 임의의 순서로 도입하는 단계로서,
    (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하기 위한 제1항의 1종 이상의 작제물;
    (b) 선택된 부위 인식이 가능한 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하는 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 브레이크;
    상기 단계 (III)(i)(b)의 세포를 내인성 DNA 수선을 허용하여 상기 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 배양하는, 상기 도입하는 단계; 및
    (ii) 상기 단계 (III)(i)의 세포를 1종 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시켜, 선택된 부위에서 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC를 수득하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 선택된 부위에서 상기 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 상기 게놈-조작된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상기 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 또는 B-세포 CD20을 포함하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 게놈-조작된 iPSC가 2종 이상의 자살 유전자를 포함하는 경우, 상기 자살 유전자는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  17. 제14항 또는 제16항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 1종 이상의 내인성 유전자에서 in/del을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이 및 H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 군 (I), (II) 및/또는 (III)은 상기 게놈-조작된 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 상기 수득된 게놈 조작된 iPSC는 기능성이고, 분화 효력이 있고, 동일한 기능성의 게놈 편집을 포함하는 비-만능 세포로 분화할 수 있는, 게놈-조작된 iPSC를 생성시키는 방법.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항으로부터 생성된 게놈-조작된 iPSC.
  23. 제22항에 있어서, 상기 iPSC는 제1항의 작제물 내에 포함된 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 선택된 부위에서 통합된, 게놈-조작된 iPSC.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 iPSC는 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  25. 제24항에 있어서, 상기 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  26. 제22항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나 내에 결실 또는 감소된 발현을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  27. 제22항 또는 제26항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중-, 다중- 특이적 또는 보편적 관여자(universal engager)와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나 내에 도입 또는 증가된 발현을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  28. 제27항에 있어서, 상기 도입 또는 증가된 발현은 외인성 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위한 통합 또는 비-통합된 방법을 통해서인, 게놈-조작된 iPSC.
  29. 제22항 또는 제26항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA 부류 I 및/또는 부류 II 결핍성인, 게놈-조작된 iPSC.
  30. 제22항 또는 제29항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 B2M 널(null) 또는 저(low), TAP1 널 또는 저 및/또는 TAP2 널 또는 저를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  31. 제22항 또는 제30항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 통합 또는 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  32. 제22항 또는 제31항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 고 친화도 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 고 친화도 및 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16)를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 HLA-E를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 비-절단성 HLA-G를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC는 안전 스위치 단백질; 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드; 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 포함하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  34. 제33항에 있어서, 상기 1종 이상의 작제물 내에 포함된 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합 시 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 게놈-조작된 iPSC.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR 또는 B-세포 CD20을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  36. 제22항 또는 제35항에 있어서, 상기 iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 동일한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 적어도 2종의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 2개의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 동일한 유전자 조작이 없는 iPSC와 비교할 때 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, 증가된 면역-내성, 또는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖되; 상기 게놈-조작된 iPSC는 만능성을 유지하고; 그리고 게놈-조작된 iPSC는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 비-만능 세포로의 분화 가능성을 유지하는, 게놈-조작된 iPSC.
  39. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화할 수 있되, 상기 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포는 상기 iPSC 내에 포함된 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  40. 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC는 조혈 계통 세포로 분화할 수 있는, 게놈-조작된 iPSC.
  41. 제22항 내지 제39항 중어느 한 항에 있어서, 상기 부분적으로 분화된 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체 또는 NK 세포 전구체를 포함하고; 완전히-분화된 세포는 T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC.
  42. 하기를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC:
    (i) B2M 널 또는 저;
    (ii) TAP1 널 또는 저;
    (iii) TAP2 널 또는 저;
    (iv) 타파신 널 또는 저;
    (v) HLA-E 또는 비-절단성 HLA-E의 도입된 발현;
    (vi) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현;
    (vii) PDL1의 도입된 발현;
    (viii) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16);
    (ix) Fc 수용체;
    (x) T 세포 수용체(TCR);
    (xi) 키메라 항원 수용체(CAR)
    (xii) 안전 스위치 단백질을 발현하는 하나 이상의 자살 유전자;
    (xiii) 이중-, 다중-특이적 또는 보편적 관여자, 또는
    이들의 조합물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자는 유도성인, 게놈-조작된 iPSC.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 동일한 유전자 조작이 없는 iPSC와 비교할 때 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖되; 상기 게놈-조작된 iPSC는 만능성을 유지하고; 상기 게놈-조작된 iPSC는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 비-만능 세포로의 분화 가능성을 유지하는, 게놈-조작된 iPSC.
  45. 변형된 HLA 결핍 iPSC로서, 상기 iPSC는 HLA 부류 I 및/또는 II 결핍성이고, (1) 외인성 HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL, CD47, CD113 및 PDL1 중 하나 이상; 또는 (2) HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL, CD47, CD113 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현; 및 선택적으로 (3) TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 및 단일 또는 이중 안전 스위치 단백질 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 변형된 HLA 결핍 iPSC.
  46. 제45항에 있어서, 상기 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자는 유도성인, 변형된 HLA 결핍 iPSC.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 동일한 유전자 조작이 없는 iPSC와 비교할 때 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖되; 상기 변형된 HLA 결핍 iPSC는 만능성을 유지하고; 상기 변형된 HLA 결핍 iPSC는 HLA 결핍성이고, 동일한 기능적인 게놈 조작을 갖는 비-만능 세포로의 분화 가능성을 유지하는, 변형된 HLA 결핍 iPSC.
  48. 하기 단계들을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC로부터 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법:
    (i) 제22항 내지 제44항 중 어느 한 항의 게놈-조작된 iPSC 또는 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항의 변형된 HLA 결핍 iPSC를 수득하는 단계로서, 상기 iPSC는 적어도 하나의 기능성 게놈 편집을 포함하는, 상기 수득하는 단계; 및
    (ii) 상기 게놈-조작된 iPSC 또는 변형된 HLA 결핍 iPSC를 분화시켜 상기 게놈-조작된 iPSC 내에 포함된 동일한 기능성의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 유래된 비-만능 세포를 수득하는 분화 단계.
  49. 제48항에 있어서, 상기 유래된 비-만능 세포는 조혈 계통 세포를 포함하고; 상기 분화 단계 (ii)는 배상체의 형성이 없는, 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 유래된 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법.
  51. iPSC로부터 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법으로서, 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함하고, 이에 의해서 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 기능성 표적화된 편집을 포함하는 게놈-조작된 비-만능 세포를 수득하는, iPSC로부터 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법.
    (i) iPSC를 계통 특이적 분화를 개시하기에 충분한 조건 하에 적용하는 단계; 및
    (ii) 상기 단계 (i)의 분화하는 세포를 유전자 조작하여 임의의 순서의 하기 단계 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 모두에 의해서 상기 게놈-조작된 비-만능 세포를 수득하는 단계:
    (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합을 허용하도록 상기 단계 (i)의 분화 세포에 제1항의 1종 이상의 작제물을 도입하는 단계;
    (b) (1) 선택된 부위 인식이 가능한 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 선택된 부위에서 상기 단계 (i)의 분화 세포에 하나 이상의 이중 가닥 브레이크를 도입하는 단계; 및
    (2) 내인성 DNA 수선을 허용하여 상기 선택된 부위에서 표적화된 in/del을 생성하도록 단계 (ii)(b)(1)로부터의 세포를 배양하는 단계.
  52. 제51항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 조혈 계통 세포를 포함하는, iPSC로부터 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, iPSC로부터 게놈-조작된 비-만능 세포를 생성시키는 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생성된 iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포로서, 상기 비-만능 세포는 하나 이상의 기능성 표적화된 게놈 편집을 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 비-만능 세포는 중배엽 세포, 조혈 내피 세포, CD34 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 비-만능 세포는 안전 스위치 단백질; 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드; 약물 표적 후보; 또는 비-만능 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 포함하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  57. 제54항 또는 제56항에 있어서, 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 비-만능 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  58. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 in/del을 포함하는 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자를 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  59. 제57항에 있어서, 상기 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나 내에 결실 또는 감소된 발현을 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  60. 제57항에 있어서, 상기 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나 내에 도입 또는 증가된 발현을 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-만능 세포는,
    (i) 각각 동일한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 적어도 2개의 외인성 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질을 암호화하는, 상기 적어도 2개의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (ii) 각각 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 적어도 2개의 외인성 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질을 암호화하는, 상기 적어도 2개의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  62. 제61항에 있어서, 안전 스위치 단백질을 암호화하는 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 및 이들의 조합물로부터 선택되는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  63. 제61항에 있어서, 상기 안전 하버 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-만능 세포는 iPSC로 재프로그래밍될 수 있되, 상기 iPSC는 상기 비-만능 세포 내에 포함된 동일한 기능성의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  65. 제64항에 있어서, 이로부터 재프로그래밍된 상기 iPSC는 부분적으로 분화된 세포 또는 완전히-분화된 세포로 분화될 수 있는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  66. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 상이한 운명의 비-만능 세포로 교차분화될 수 있는, iPSC 유래된 게놈-조작된 비-만능 세포.
  67. 하기를 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포이되, 상기 iPSC는 상기 게놈-조작된 조혈 계통 세포와 동일한 게놈 편집을 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포:
    (i) B2M 널 또는 저;
    (ii) TAP1 널 또는 저;
    (iii) TAP2 널 또는 저;
    (iv) 타파신 널 또는 저;
    (v) HLA-E 또는 비-절단성 HLA-E의 도입된 발현;
    (vi) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현;
    (vii) PDL1의 도입된 발현;
    (viii) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16);
    (ix) Fc 수용체;
    (x) T 세포 수용체(TCR);
    (xi) 키메라 항원 수용체(CAR)
    (xii) 안전 스위치 단백질을 발현하는 하나 이상의 자살 유전자;
    (xiii) 이중-, 다중-특이적 또는 보편적 관여자, 또는
    이들의 임의의 조합물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자는 유도성인, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 조혈 계통 세포는 중배엽 세포, 조혈 내피 세포, CD34 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체 또는 NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖되; 상기 덜 분화된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 더 분화된 조혈 계통 세포로의 분화 가능성을 유지하는, iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 계통 세포.
  71. 제67항 내지 제70항의 하기 세포를 포함하는, iPSC 유래 조혈 세포를 포함하는 조성물:
    (a) iPSC 유래된 게놈-조작된 CD34 세포;
    (b) iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 줄기 및 전구 세포;
    (c) iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 줄기 및 전구 세포;
    (d) iPSC 유래된 게놈-조작된 조혈 다능성 전구 세포;
    (e) iPSC 유래된 게놈-조작된 T 세포 전구체;
    (f) iPSC 유래된 게놈-조작된 NK 세포 전구체;
    (g) iPSC 유래된 게놈-조작된 T 세포; 또는
    (h) iPSC 유래된 게놈-조작된 NK 세포;
    또는 이들의 임의의 조합물.
  72. 하기를 포함하는, 게놈-조작된 조혈 계통 세포:
    (i) B2M 널 또는 저;
    (ii) TAP1 널 또는 저;
    (iii) TAP2 널 또는 저;
    (iv) 타파신 널 또는 저;
    (v) HLA-E 또는 비-절단성 HLA-E의 도입된 발현;
    (vi) HLA-G 또는 비-절단성 HLA-G의 도입된 발현;
    (vii) PDL1의 도입된 발현;
    (viii) 고 친화도 비-절단성 CD16(hnCD16);
    (ix) Fc 수용체;
    (x) T 세포 수용체(TCR);
    (xi) 키메라 항원 수용체(CAR)
    (xii) 안전 스위치 단백질을 발현하는 하나 이상의 자살 유전자;
    (xiii) 이중-, 다중-특이적 또는 보편적 관여자, 또는
    이들의 임의의 조합물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자는 유도성인, 게놈-조작된 조혈 계통 세포.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 조혈 계통 세포는 중배엽 세포, 조혈 내피 세포, CD34 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, 게놈-조작된 조혈 계통 세포.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖되; 상기 덜 분화된 게놈-조작된 조혈 계통 세포는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 더 분화된 조혈 계통 세포로의 분화 가능성을 유지하는, 게놈-조작된 조혈 계통 세포.
  76. 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포로서, 상기 조혈 계통 세포는 HLA 부류 I 및/또는 II 결핍성이고, (1) 외인성 HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL,CD47, CD113 및 PDL1 중 하나 이상; 또는 (2) HLA-E, HLA-G, CD16, 4lBBL,CD47, CD113 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현; 및 선택적으로 (3) TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 및 단일 또는 이중 안전 스위치 단백질 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포.
  77. 제76항에 있어서, 상기 TCR, CAR, 관여자, Fc 수용체 또는 자살 유전자는 유도성인, 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성, T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖되; 상기 덜 분화된 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포는 동일한 기능성의 게놈 조작을 갖는 더 분화된 조혈 계통 세포로의 분화 가능성을 유지하는, 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포.
  79. 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물로서,
    (i) 게놈-조작된 비-만능 세포, 또는 제54항 내지 제70항 또는 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항의 세포로서, 상기 비-만능 세포는 상기 게놈 내의 하나 이상의 선택된 부위에서 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는, 상기 세포;
    (ii) 1종 이상의 재프로그래밍 인자; 및 선택적으로,
    (iii) TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물
    을 포함하되, 상기 조성물은 게놈-조작된 비-만능 세포 내에 포함된 동일한 표적화된 게놈 편집을 포함하는 iPSC를 수득하기에 유용한, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 하나 이상의 선택된 부위에서 상기 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 비-만능 세포의 및 이들의 재프로그래밍된 iPSC의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상기 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물
  82. 제80항에 있어서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 삽입 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  83. 제80항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  84. 제80항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 2종 이상의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  85. 제80항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  86. 제79항 또는 제80항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 비-만능 세포 및 이로부터의 iPSC의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  88. 제79항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나 내에 결실 또는 감소된 발현을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  89. 제79항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나 내에 도입 또는 증가된 발현을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  90. 제79항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입 또는 증가된 발현은 외인성 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 통합 또는 비-통합된 방법을 통해서인, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  91. 제79항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA 부류 I 및/또는 부류 II 결핍성인, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  92. 제79항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 B2M 널 또는 저, TAP1 널 또는 저 및/또는 TAP2 널 또는 저를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  93. 제79항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 통합 또는 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나; 또는 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  94. 제79항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 고 친화도 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 고 친화도 및 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16)를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 HLA-E를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 비-절단성 HLA-G를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  95. 제79항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  96. 제79항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖거나; 또는 상기 게놈-조작된 비-만능 세포는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  97. 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물로서,
    (i) 비-만능 세포;
    (ii) 하나 이상의 선택된 유전좌에서의 표적화된 편집을 위한 1종 이상의 작제물;
    (iii) 1종 이상의 재프로그래밍 인자; 및 선택적으로,
    (iv) TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물
    을 포함하되, 상기 조성물은 표적화된 게놈 편집을 포함하는 iPSC를 수득하기에 유용하고, 이에 의해서 상기 게놈-조작된 iPSC는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖거나; 또는 상기 게놈-조작된 iPSC는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 선택된 부위에서 이중 가닥 브레이크를 도입하기 위해서 선택된 부위 인식이 가능한 1종 이상의 엔도뉴클레아제; 및/또는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 비-만능 세포 재프로그래밍된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 더 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  100. 제97항에 있어서, 상기 수득된 게놈-조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  101. 제97항에 있어서, 상기 수득된 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 2종 이상의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  102. 제97항에 있어서, 상기 수득된 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  103. 제97항에 있어서, 상기 수득된 게놈-조작된 iPSC는 표적화 양상; 수용체; 신호전달 분자; 전사 인자; 약물 표적 후보; 면역 반응 조절 및 조정; 및 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 내인성 유전자 내에 포함된 하나 이상의 in/del을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  104. 제103항에 있어서, 상기 하나 이상의 in/del을 포함하는 수득된 게놈-조작된 iPSC는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  105. 제97항에 있어서, 상기 비-만능 세포는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포를 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  106. 제97항에 있어서, 상기 수득된 게놈-조작된 iPSC의 만능성을 유지하기 위해서 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물을 더 포함하는, 게놈-조작된 iPSC를 수득하기 위한 조성물.
  107. 조성물로서,
    (i) 게놈-조작된 iPSC로서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 하기 (a) 또는 (b) 또는 (c) 단계로부터 수득된, 상기 게놈-조작된 iPSC:
    (a) 게놈-조작된 비-만능 세포를 재프로그램하는 단계로서, 상기 수득된 iPSC는 상기 게놈-조작된 비-만능 세포 내의 선택된 부위에서 동일한 표적화된 통합 및/또는 in/del을 포함하는, 상기 게놈-조작된 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 단계; 또는
    (b) 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 도입함으로써 클론성 iPSC 또는 iPSC의 풀을 유전자 조작하는 단계; 또는
    (c) 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 in/del을 1종 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제, MEK 저해제, GSK3 저해제 및/또는 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉된 재프로그래밍 비-만능 세포의 풀에 도입함으로써 게놈 조작하는 단계; 및
    (ii) MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 소분자 조성물
    을 포함하되,
    상기 게놈-조작된 iPSC는 안전 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보, 또는 비-만능 세포 재프로그래밍된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 촉진하는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 비-만능 세포 재프로그래밍된 iPSC 또는 이의 유도 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성 및/또는 생존을 억제하는 단백질과 연관된 1종 이상의 내인성 유전자에서 in/del을 포함하는, 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 선택된 부위에서 이중 가닥 브레이크를 도입하기 위해서 선택된 부위 인식이 가능한 1종 이상의 엔도뉴클레아제를 더 포함하는, 조성물.
  109. 제107항에 있어서, 상기 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 구성적, 유도성, 일시적-, 조직- 또는 세포 유형-특이적 프로모터를 포함하는 1종 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 선택된 부위 내에 포함된 1종 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 조성물.
  110. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 카이나제, 사이토신 데아미나제, 변형된 EGFR, B-세포 CD20 및 이들의 조합물로부터 선택된 안전 스위치 단백질을 암호화하는 1종 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  111. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 하버 유전자좌 내에 통합된 2종 이상의 동일하거나 또는 상이한 안전 스위치 단백질 암호화 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  112. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 AAVS1 유전자좌에서 카스파제 암호화 유전자를 포함하고, H11 유전자좌에서 티미딘 카이나제 암호화 유전자를 포함하는, 조성물.
  113. 제107항에 있어서, 상기 하나 이상의 in/del을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자를 포함하는, 조성물.
  114. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP 및 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자 중 적어도 하나 내에 결실 또는 감소된 발현을 포함하는, 조성물.
  115. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, Fc 수용체, 관여자, 및 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 커플링을 위한 표면 촉발 수용체 중 적어도 하나 내에 도입 또는 증가된 발현을 포함하는, 조성물.
  116. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 외인성 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해서 통합 또는 비-통합된 방법을 통해서 도입 또는 증가된 발현을 포함하는, 조성물.
  117. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA 부류 I 및/또는 부류 II 결핍성인, 조성물.
  118. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 B2M 널 또는 저, TAP1 널 또는 저 및/또는 TAP2 널 또는 저를 포함하는, 조성물.
  119. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 통합 또는 비-통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나; 또는 상기 게놈-조작된 iPSC는 HLA-E, HLA-G, CD16, 41BBL 및 PDL1 단백질 중 하나 이상의 도입된 발현을 포함하는, 조성물.
  120. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 고 친화도 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 CD16 수용체를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 고 친화도 및 비-절단성 CD16 수용체(hnCD16)를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 비-절단성 HLA-E를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 비-절단성 HLA-G를 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  121. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 개선된 지속성, 면역 세포에 대한 증가된 내성 또는 증가된 면역-내성을 갖거나; 또는 상기 게놈-조작된 iPSC는 T 및/또는 NK 세포에 대한 증가된 내성을 갖는, 조성물.
  122. 제107항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 동일한 기능성의 표적화된 게놈 편집을 갖는 조혈 계통 세포를 포함하는 비-만능 세포로 분화할 가능성을 갖는, 조성물.
  123. 제122항에 있어서, 상기 게놈-조작된 iPSC는 중배엽 세포, CD34 세포, 조혈 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포 또는 B 세포로 분화할 가능성을 갖는, 조성물.
  124. 하기를 포함하는, 약제학적 조성물:
    (a) 제22항 내지 제44항 중 어느 한 항의 게놈-조작된 iPSC;
    (b) 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항의 변형된 HLA 결핍 iPSC;
    (c) 제54항 내지 제66항 중 어느 한 항의 게놈-조작된 비-만능 세포;
    (d) 제67항 내지 제70항, 및 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항의 게놈-조작된 조혈 계통 세포; 또는
    (e) 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항의 변형된 HLA 결핍 조혈 계통 세포; 또는 이들의 임의의 조합물; 및 약제학적으로 허용 가능한 배지.
  125. 제124항의 약제학적 조성물의 치료적 용도로서, 상기 조성물을 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 도입하는 것을 포함하되, 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암, 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 연관된 감염을 갖는, 약제학적 조성물의 치료적 용도.
  126. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라서 게놈-조작된 iPSC를 제조하는 방법 및 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따라서 그로부터 유래된 비-만능 세포를 제조하는 방법.
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