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KR20180057609A - Glp-1 및 대사성 질환 치료용 조성물에서 이의 용도 - Google Patents

Glp-1 및 대사성 질환 치료용 조성물에서 이의 용도 Download PDF

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KR20180057609A
KR20180057609A KR1020187005975A KR20187005975A KR20180057609A KR 20180057609 A KR20180057609 A KR 20180057609A KR 1020187005975 A KR1020187005975 A KR 1020187005975A KR 20187005975 A KR20187005975 A KR 20187005975A KR 20180057609 A KR20180057609 A KR 20180057609A
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glp
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vector
seq
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크리스티안 힌더러
제임스 엠. 윌슨
매튜 윌슨
Original Assignee
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

대상에게서 유형 II 당뇨병 치료를 위한 조성물 및 방법. GLP-1의 프로펩티드(propeptide) 및 활성 부분을 인코드하는 서열이 포함된 핵산 분자를 함유하는 바이러스 벡터가 제시되며, 여기에서, 발현되었을 때, GLP-1의 N-말단 아미노산은 상기 프로펩티드의 C-말단 아미노산의 바로 뒤에 있다. 바람직한 구체예들에서, 상기 대상은 고양이 또는 개이다.

Description

GLP-1 및 대사성 질환 치료용 조성물에서 이의 용도
전자 형식으로 제출된 자료들의 참고자료에 통합
출원인은 전자 형태로 서열 목록을 참고자료로 본 명세서에 통합시킨다. 이 파일은 "15-7471_Seq_Listing_ST25"로 표시한다.
발명의 배경
미국에서 고양이 400 마리 중 1 마리와 개 500 마리 중 1 마리는 인간의 2 형 당뇨병 (T2DM)과 유사한 질환을 가지고 있다. 현재의 표준 치료는 수의사의 빈번한 방문과 일회용 진단을 통하여 동물 소유자가 하루에 2회 인슐린을 주사하는 것으로써, 이것들은 모두 비용이 많이 들고, 시간이 많이 소요된다.
글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)은 내생성 펩티드 호르몬으로써, 포도당 항상성(glucose homeostasis)에 중심적 역할을 한다. GLP-1 유사체들은 당뇨병 치료를 위한 공통적인 인간의 치료 호르몬으로 현재 이용된다. GLP-1은 인슐린 방출을 강화하고, 인슐린 감수성을 높이고, 베타 세포 손실을 방지하고, 위 배출(emptying)을 지연시킴으로써 고혈당을 조절할 수 있는 능력을 가진다. 그러나, GLP-1은 혈액 순환에서 반감기가 짧기 때문에, 안정적인 벡터-매개된 전달이 아닌, 독립형 치료제로 개발하기가 어렵다. 상기 고유 호르몬의 짧은 반감기를 극복하도록 조작된 GLP-1 유사체들은 T2DM의 치료에 중요한 치료제로 부상했다. 그러나, 이들 약은 여전히 빈번하게 피하 주사해야 한다. GLP-1의 지속적인 치료 수준을 달성하기 위한 또다른 접근법은 아데노-연합 바이러스 또는 다른 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 매개되는 유전자 전달(transfer)을 사용하여 상기 고유한 펩티드를 생체 내에서 연속적으로 생산하는 것이다. GLP-1은 짧은 반감기, 광범위한 치료 지수(index) 및 장기간 노출의 안전성 때문에, 이러한 전달 방법에 대한 이상적인 후보 물질이 된다. 이 방법은 상기 질환을 앓고 있는 사람 및 다른 종 모두에서 T2DM을 위한 편리하고 효과적인 치료법을 제공할 수 있다.
GLP-1은 전구체 폴리펩티드로부터 활성 펩티드를 방출하기 위하여 세포-특이적 프로테아제가 필요하기 때문에, 유전자 치료 벡터로부터 고유한 형태로 발현될 수 없다. 작은 단백질의 비효율적 해독 및 분비, 또는 활성 GLP-1을 생성하기 위한 신호 펩티드의 비효율적인 절단으로 인하여, 분비를 지시하는 신호 펩티드를 가진 상기 펩티드를 단순히 발현시키려는 시도는 실패했다. 벡터-매개된 GLP-1 발현에 대한 기존의 설치류 연구에서, 이 펩티드는 더 크고, 종-특이적이 아닌 프로펩티드에 이어서 인플루엔자 헤마글루티닌, 그리고 GLP-1 N-말단이 앞에 절단 부위가 있을 때 이 펩티드가 발현되어 GLP-1의 효과적인 순환 수준이 달성되었다. 가령, Gaddy et al, dsAAV8-mediated gene transfer and b-cell expression of IL-4 and b-cell growth factors are capable of reversing early-onset diabetes in NOD mice, Gene Therapy, 19:791-9 (2012) and Choi and Lee, Long-term, antidiabetogenic effects of GLP-1 gene therapy using a double-stranded, adeno- associated viral vector, Gene Therapy, 18:155- 63 (2011), 이들은 참고자료에 편입됨. 그러나, 이들 외래 프로펩티드는 형질도입된(transduced) 세포에 대한 파괴적인 면역 반응을 불법화시킬 가능성이 있다. 따라서, 대상, 특히 반려 동물의 유형 II 당뇨병을 효과적으로 치료하는데 유용한 조성물이 필요하다.
발명의 요약
신규한 조작된 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1) 구조체들이 제시된다. 이들 구조체에서 발현되는 GLP-1 단백질은 단독 치료제로써 제공되는 GLP-1 단백질과 비교하였을 때, 순환 반감기가 증가되는 적절한 특징을 갖고, 그리고 생체내에서 GLP-1의 활성 부분을 방출시키도록 효과적으로 프로세싱된다. 이들 구조체는 다수의 경로를 통하여 이를 필요로 하는 대상에게 전달될 수 있고, 구체적으로 재조합 벡터 이를 테면, 재조합 아데노-연합된 바이러스 (rAAV) 벡터에 의해 생체내에서 매개된 발현에 의해 전달될 수 있다.
일부 구체예들에서, GLP-1 구조체를 포함하는 바이러스 벡터가 제시된다. 일부 구체예들에서, 상기 GLP-1 구조체는 GLP-1의 프로펩티드 및 활성 부분을 인코드하고, 이것이 발현되었을 때, GLP-1의 N-말단 아미노산은 상기 프로펩티드의 C-말단 아미노산의 바로 뒤에 있다.
일부 구체예들에서, 상기 프로펩티드는 내생성 서열이다. 즉, 상기 프로펩티드 서열은 궁극적으로 투여하기로 의도된 대상과 동일한 종으로부터 유래된다.
일부 구체예들에서, 상기 프로펩티드는 응고 인자로부터 유래된 리더(leader) 서열이다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 단백질 S, 인자 IX, 알부민, 알부민, IL2, 트롬빈, 및 만노시다제(mannosidase)로부터 선택된 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 퓨린 부위를 함유한다.
일부 구체예들에서, 상기 GLP-1 구조체는 GLP-1의 활성 부분에 상응하는 GLP-1 서열을 인코드한다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 GLP-1의 아미노산 7-37을 인코드한다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 서열 번호: 1이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 5에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체를 인코드하는 핵산 서열은 서열 번호: 6에서 제시된다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 5를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 제시된 재조합 벡터는 상기 프로펩티드 및 GLP-1을 포함하는 발현 카세트(expression cassette)를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 간 세포에서 상기 GLP-1의 발현을 특이적으로 지시하는 프로모터를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 재조합 벡터는 재조합 아데노-연합된 바이러스 (rAAV) 벡터다. 일부 구체예들에서, 상기 rAAV는 AAV8, AAVrh64R1, AAV9, AAVhu.37 또는 AAVrh10으로부터 선택된 캡시드(capsid)를 갖는다. 특정 구체예에서, GLP-1의 프로펩티드 및 활성 부분이 포함된 발현 카세트를 갖는 rAAV 벡터가 제시된다. 특정 구체예에서, 상기 프로펩티드는 응고 인자 IX 리더 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 GLP-1의 aa 7-37을 인코드한다. 또다른 구체예에서, 상기 rAAV 벡터는 간 세포에서 상기 GLP-1의 발현을 특이적으로 지시하는 프로모터가 포함된 발현 카세트를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 약학적으로 수용가능한 운반체 및 재조합 벡터가 포함된 약학 조성물이 제시된다. 발현 카세트를 갖는 본원에서 기술된 재조합 벡터를 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 T2DM을 치료하는 방법이 또한 제시되는데, 여기에서 전술한 발현 카세트는 상기 대상에서 GLP-1 구조체의 발현을 지시하는 조정 제어(regulatory control) 서열을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 치료되는 대상은 반려 동물이다. 한 구체예에서, 상기 대상은 고양이다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 개이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "환자"와 "대상(subject)"은 호환될 수 있고, 인간 또는 동물 대상을 지칭할 수 있다.
여전히 또다른 구체예에서, 대상에게서 GLP-1의 순환 반감기를 증가시키는 방법은 내생성 GLP-1의 프로펩티드 및 활성 부분을 인코드하는 발현 카세트를 갖는 본원에서 기술된 재조합 벡터를 제공하는 것을 포함하며, 이것이 발현되었을 때, GLP-1의 N-말단 아미노산은 상기 프로펩티드의 C-말단 아미노산의 바로 뒤에 있다.
상기에서 기술된 재조합 벡터는 유형 II 당뇨병 치료를 위한 요법(regimen)에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면 및 이점은 본 발명의 다음의 상세한 설명으로부터 용이하게 명백해질 것이다.
도 1은 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 형질감염된(transfected) HEK293 세포에서 활성 GLP-1 발현의 시험관내 평가 결과를 제시한다. 왼쪽의 막대는 배지-만으로 된 대조에 해당한다. 중간 막대는 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 인터루킨-2 신호 펩티드 다음에 GLP-1 (7-37)를 갖는 GLP-1 구조체에 해당된다. 우측 막대는 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 인자 IX 프로펩티드 다음에 GLP-1 (7-37)을 갖는 GLP-1 구조체에 해당된다. 값은 중복 웰에서 평균 +/- SEM로 나타낸다.
도 2는 RAG -/- 마우스를 AAV8.CB.fFIX_GLP1으로 형질도입하여 생체내 GLP-1의 발현을 보여주는 연구 결과를 제시한다. 위의 3개 선 (사각형, 삼각형 및 다이아몬드형)은 AAV8.CB.fFIX_GLP1로 처리된 3마리 마우스에 해당된다. 바닥 선은 내부 대조 마우스에 해당된다.
도 3은 AAV8.CB.fFIX_GLP1 (Db+AAV)로 처리된 당뇨병 마우스(db/db) 의 연구 결과를 제시한다. 야생형 (WT), 연령 정합 대조는 벡터로 형질감염안된 당뇨병(Db) 마우스를 이용하였다. 혈청 포도당 수준은 매주 측정되었다. 값은 평균 +/- SEM이다.
도 4는 실시예 2와 3에 이용된 GLP-1 구조체에 대한 구조체 전략을 나타내는 지도다. 이 지도는 CB7 프로모터, 고양이 인자 IX 프로펩티드, GLP-1 (7-37) 및 poly A 서열을 보여준다.
도 5는 형질감염된 HuH7 세포에서 활성 GLP-1 발현의 시험관 평가 결과를 제공한다. 다음의 각 서열은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 GLP-1 서열의 상류에 배치된다: 단백질 S 프로펩티드 (Prot S), 알부민 프로펩티드 (Alb), 퓨린 부위와 함께 IL2 리더(IL2 Fur), 퓨린 부위와 함께 알부민 프로펩티드 (Alb Fur), 인자 IX 프로펩티드 (FIX), 퓨린 부위 없는 IL2 리더(IL2), 그리고 형질감염안된 HuH7 세포. 이용된 모든 서열은 고양이 서열들이다.
도 6은 형질감염된 세포에서 활성 GLP-1 발현의 시험관 평가 결과를 제공한다. 다음의 각 서열은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 GLP-1 서열의 상류에 배치된다: 퓨린 부위와 함께 IL2 리더 (IL2 Fur), 퓨린 부위와 함께 알부민 프로펩티드 (Alb Fur), 인자 IX 프로펩티드 (FIX), 트롬빈 리더 서열, 퓨린 부위와 함께 만노시다제 리더 (ManFur), 그리고 형질감염안된 세포 (tc+). 이용된 모든 서열은 고양이 서열들이다.
도 7은 실시예 5에서 기술된 바와 같이, 야생형 마우스에게 3가지 상이한 GLP-1 구조체를 투여한 결과를 제시한다. 각 4마리 마우스 코호트에게 5 x 1010 의 상응하는 벡터를 주사하였고, 활성 GLP-1 발현에 대하여 평가하였다.
도 8은 실시예 7에서 기술된 바와 같이, 건강한 고양이에게 3가지 상이한 GLP-1 구조체를 투여한 결과를 제시한다. 표시된 시점에서 활성 GLP-1 발현에 대하여 혈액을 평가하였다.
발명의 상세한 설명
반려 동물 및 인간을 포함하는 대상에서 사용하기 위해 GLP-1 발현 구조체가 개발되었으며, 이때 리더 프로펩티드는 동물 또는 인간 환자의 종에 내인성인 단백질로부터 유래되었다. 바람직하게는, 절단 및 분비 후에, 이들 구조체로부터 생성된 모든 생성물, 즉 유리 프로펩티드 및 활성 GLP-1은 비-면역원성 자가-펩티드이다.
본원에 기재된 GLP-1 구조체는 단독 치료제로서의 GLP-1 펩티드의 투여와 비교하였을 때, GLP-1의 순환 반감기를 증가시키는 것을 특징으로 한다. 이것은 GLP-1 활성 펩티드의 N-말단의 정확한 프로세싱과 함께, 벡터 내에 함유된 발현 카세트의 계속적인 발현 때문이다.
이들 구조체는 다수의 경로를 통하여 이를 필요로 하는 대상에게 전달될 수 있고, 구체적으로 재조합 벡터 이를 테면, rAAV 벡터에 의해 생체내에서 매개된 발현에 의해 전달될 수 있다. 또한, T2DM 또는 대사 증후군 치료를 필요로 하는 대상에서 이를 치료하고, 대상에게서 GLP-1의 반감기를 증가시키기 위한 요법에서 이들 구조체를 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 대상에게서 GLP-1의 활성을 강화시키는 방법이 제공된다. 또한, 이를 필요로 하는 대상의 체중 감소를 유도하는 방법이 제공된다.
글루카곤-유사 펩티드 1, 또는 GLP-1은 프로글루카곤 유전자의 전사 산물로부터 유래된 인크레틴(incretin)이다. 생체 내에서, 글루카곤 유전자는 180개 아미노산으로 된 프레프로(prepro) 폴리펩티드를 발현시키고, 이것은 단백질 분해 과정을 통해 2가지 형태의 글루카곤, GLP-1 및 GLP-2를 형성한다. 원래 시퀀싱 연구에서 GLP-1은 37개 아미노산 잔기를 보유한다는 것을 알았다. 그러나, 후속적인 정보에 따르면, 이 펩티드는 프로펩티드이며, 추가적으로 아미노 말단으로부터 6 개의 아미노산을 제거되어, 활성 형태의 GLP-1인, GLP-1 (7-37)이 형성된다. 위치 37의 글리신은 생체내에서 아미드로 변형되어, GLP-1 (7-36) 아미드가 형성된다. GLP-1 (7-37) 및 GLP-1 (7-36) 아미드는 대등한 효능의 인슐린분비성 호르몬이다. 따라서, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 본원에서 유용한 GLP-1의 생물학적 "활성" 형태는 다음과 같다: GLP-1-(7-37) 및 GLP-1-(7-36)NH2.
편의성을 위하여, "야생형" GLP-1 (7-37)의 서열, 가령, 인간 GLP-1의 고유 서열은 서열 번호: 1에 나타낸다: HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G. 이 야생형 아미노산 서열은 하기 실시예들에서 이용되며, 인간, 고양이 및 개를 비롯한 다양한 종에 걸쳐 보존된다. 그러나, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 GLP-1은 GLP-1의 임의의 활성 형태, 가령, GLP-1 (7-37) 또는 GLP-1 (7-36) 아미드를 지칭한다. 또한, 한 구체예에서, 용어 GLP-1은 상기 GLP-1 펩티드의 기능적 변이체를 지칭한다. 기능적 변이체는 상이한 종으로부터 유래된 동족체를 포함한다. GLP-1 및 이의 패밀리 펩티드의 N-말단(활성 부분)은 높은 수준의 서열 동일성(identity)을 공유한다. 그러나, 종간에 GLP-1 단백질 중에서 일부 변이를 볼 수 있는데, 구체적으로 하기에서 굵게 표시된 부분이다:
Figure pct00001
한 구체예에서, GLP-1의 기능적 변이체는 본원에서 기술된 또는 당분야에 공지된 GLP-1 핵산 또는 아미노산 서열로부터 최대 약 10% 변이를 함유하지만, 여전히 상기 야생형 서열의 기능을 유지하는 변이체들을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "기능의 유지(retain function)"에서 이것은 발현 또는 활성이 반드시 동일한 수준일 필요는 없지만, 상기 핵산 또는 아미노산이 이의 야생형 서열과 동일한 방식으로 기능을 한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 기능적 변이체는 야생형 서열과 비교하였을 때, 발현 또는 활성은 증가된다. 또다른 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 야생형 서열과 비교하였을 때, 발현 또는 활성은 감소된다. 한 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 야생형 서열과 비교하였을 때, 발현 또는 활성은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상으로 증가 또는 감소된다.
또다른 구체예에서, GLP-1의 기능적 변이체는 본원에서 기술된 또는 당분야에 공지된 GLP-1 핵산 또는 아미노산 서열로부터 최대 약 20% 변이를 함유하지만, 여전히 상기 야생형 서열의 기능을 유지하는 변이체들을 포함한다.
한 구체예에서, GLP-1의 기능적 변이체는 본원에서 기술된 또는 당분야에 공지된 GLP-1 핵산 또는 아미노산 서열로부터 최대 약 30% 변이를 함유하지만, 여전히 상기 야생형 서열의 기능을 유지하는 변이체들을 포함한다
한 구체예에서, 용어 GLP-1은 상기에서 생성된 서열(서열 번호: 1)과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 있는 활성 GLP-1을 말한다. 한 구체예에서, 잔기에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 있으며, 이는 종간의 변이로 나타난다(가령, 상기에서 굵게 표시된 잔기). 또다른 구체예에서, 잔기에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 만들어지고, 이는 종간에 보존된다. 비록 GLP-1은 종간에 높은 정도의 동일성을 공유하지만, 벡터를 궁극적으로 투여하게 되는 대상의 종에 근거하여 상기 GLP-1 서열을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 한 실시예에서, 상기 대상은 포유류다. 예를 들면, 한 구체예에서, 상기 대상이 고양이라면, 상기 GLP-1 서열은 고양이 단백질로부터 유래된다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 개의 단백질로부터 유래된다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 인간 단백질로부터 유래된다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 비-인간 영장류 단백질로부터 유래된다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1은 소, 양 또는 돼지 단백질로부터 유래된다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1은 설치류로부터 유래된다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 GLP-1 (7-37)을 인코드한다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 서열 번호: 1이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 서열 번호:1의 aa 1-29(야생형 GLP-1의 aa 7-36에 상응)이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "유래된(derived)" 또는 "~로부터 유래된"이란 서열 또는 단백질은 특정 대상 종으로부터 유래되거나, 또는 특정 대상 종으로부터 유래된 단백질 또는 서열과 동일한 서열을 공유한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 개로부터 "유래된" 프로펩티드 서열은 개에서 발현되는 동일한 프로펩티드 서열과 동일한 서열 (또는 본원에서 정의된 바와 같은, 이의 변이체)을 공유한다. 그러나, 특정 핵산 또는 아미노산은 실제로 개로부터 기원될 필요는 없다. 유사한 단백질 (가령, 동족체)의 돌연변이 유발 또는 핵산 또는 아미노산 서열의 인위적 생산을 비롯한, 원하는 서열을 생성할 수 있는 다양한 기술이 당업계에 공지되어있다. "유래된" 핵산 또는 아미노산은 유래된 서열의 실제 공급원과는 무관하게, 그것이 "유래된" 종에서의 동일한 핵산 또는 아미노산 기능을 보유한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "GLP-1 구조체", "GLP-1 발현 구조체" 및 동의어는 프로펩티드 서열과 조합된 본원에서 기술된 GLP-1 서열을 포함한다. 용어 "GLP-1 구조체", "GLP-1 발현 구조체" 및 동의어는 상기 프로펩티드와 GLP-1를 인코드하는 핵산 서열 또는 이의 발현 산물을 지칭할 때 이용될 수 있다.
본원에서 기술된 GLP-1 구조체는 또한 프로펩티드 서열을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 리더 서열, 프로펩티드, 신호 서열, 프레펩티드 및 유사한 용어는 생체내에서 최종 활성 GLP-1 펩티드로부터 절단되는 서열을 지칭한다. 이러한 "프로펩티드(propeptide)" 서열은 이러한 서열, 가령, 신호 서열 및 프로펩티드 서열을 하나 이상 포함할 수 있다. 비록 내생성 GLP-1이 프로호르몬 (프로글루카곤, 이것이 절단되어 활성형의 GLP-1이 됨)로 발현되지만, 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 구조체에 이용된 프로펩티드는 GLP-1에 이종성(heterologous) 단백질로부터 유래된 리더 서열이다.
한 구체예에서, 상기 프로펩티드는 궁극적으로 투여하기로 의도된 대상과 동일한 종으로부터 유래된다. 예를 들면, 한 구체예에서, 바람직한 대상은 고양이이며, 상기 프로펩티드 서열은 고양이 단백질로부터 유래된다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 개의 단백질로부터 유래된다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 인간 단백질로부터 유래된다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 비-인간 영장류 단백질로부터 유래된다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 소, 양 또는 돼지 단백질로부터 유래된다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 설치류로부터 유래된다.
생체내에서 GLP-1 구조체의 발현을 강화시키기 위하여, 상기 프로펩티드의 길이를 변화시키거나 및/또는 선택할 수 있다. 따라서, 내생성 프로펩티드는 바람직한 길이로 선택될 수 있거나, 또는 야생형 프로펩티드의 기능을 보유하지만, 더 바람직한 서열 길이로 유지되는 프로펩티드를 생성하도록 원하는 프로펩티드가 조작될 수 있다.
바람직하게는, 상기 프로펩티드는 최소한 약 19개의 아미노산을 GLP1 길이에 추가하여, 길이가 최소한 약 45-50개의 아미노산인, 프로펩티드-GLP-1 발현 최종 산물이 만들어진다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드는 최소한 약 35개의 아미노산을 추가하여, 길이가 최소한 약 65개의 아미노산인, 프로펩티드-GLP-1 발현 최종 산물이 만들어진다. 이러한 크기 요건 때문에, 알부민 및 응고 인자가 프로펩티드의 바람직한 원천이다. 본원에서 기술된 바와 같이, 이들 프로펩티드의 돌연변이체 및 변이체들은 본원에서 기술된 조성물 및 방법에 또한 유용하다. 특히, 본원에 기술된 프로 펩티드의 N-말단 절두된 단편 (즉, C- 말단 부분을 보유함)은 발현 산물을 활성 GLP-1로 적절히 가공하는데 필요한 절단 신호를 보유하는 조건에서 유용하다.
한 구체예에서, 바람직한 프로펩티드의 기능적 변이체는 본원에서 기술된 또는 당분야에 공지된 프로펩티드 핵산 또는 아미노산 서열로부터 최대 약 10% 변이를 함유하지만, 여전히 상기 야생형 서열의 기능을 유지하는 변이체들을 포함한다 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "기능의 유지(retain function)"에서 이것은 발현 또는 활성이 반드시 동일한 수준일 필요는 없지만, 상기 핵산 또는 아미노산이 이의 야생형 서열과 동일한 방식으로 기능을 한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 기능적 변이체는 야생형 서열과 비교하였을 때, 발현 또는 활성은 증가된다. 또다른 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 야생형 서열과 비교하였을 때, 발현 또는 활성이 감소된다. 한 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 야생형 서열과 비교하였을 때, 발현 또는 활성이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상으로 증가 또는 감소된다.
또다른 구체예에서, 바람직한 프로펩티드의 기능적 변이체는 본원에서 기술된 또는 당분야에 공지된 프로펩티드 핵산 또는 아미노산 서열로부터 최대 약 20% 변이를 함유하지만, 여전히 상기 야생형 서열의 기능을 유지하는 변이체들을 포함한다
또다른 구체예에서, 바람직한 프로펩티드의 기능적 변이체는 본원에서 기술된 또는 당분야에 공지된 프로펩티드 핵산 또는 아미노산 서열로부터 최대 약 30% 변이를 함유하지만, 여전히 상기 야생형 서열의 기능을 유지하는 변이체들을 포함한다
한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 추가 서열과 조합되어 N-말단 프로세싱의 효율을 증가시킨다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 절단 부위와 복합된다. 한 구체예에서, 상기 퓨린 서열은 RX[R/K]R 콘센수스(consensus) 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 퓨린 서열은 서열 RKRR을 포함한다. 상기 퓨린 부위는 당업자에 의해 변형될 수 있고, FurinDB, 예시적으로 실증된 퓨린 절단 부위를 함유하는 데이터베이스, 기질, 종, 실험 방법, 실험 및 관련 약물 표적화 퓨린 기질의 원래 공개자료에 대한 논의는 Tian et al, Int. J. Mol. Sci, 2011, 12:1010-5을 참고하며, 이 자료는 본원에 참고자료에 편입된다.
한 구체예에서, 상기 프로펩티드는 인자(Factor) IX 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 인자 II 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 인자 VII 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 인자 X 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 단백질 C 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 단백질 S 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 알부민 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 만노시다제 프로펩티드다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드는 뼈 "gla" 단백질로부터 유래된다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드는 최소한 약 19-100개의 아미노산 길이를 갖는데, 이때 상기 범위 사이의 임의의 정수들이 포함된다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 25개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 35개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 40개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 40개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 45개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 50개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 55개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 60개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 65개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 70개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 75개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 80, 85, 90, 95 또는 100개 아미노산이다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49개의 아미노산이다.
용어 "아미노산 치환(substitution)" 및 이의 동의어는 아미노산을 다른 아미노산으로 대체함으로써, 아미노산 서열을 변형시키는 것을 포함한다. 상기 치환은 보존적 치환일 수 있다. 또는 비-보존적 치환일 수도 있다. 2 개의 아미노산을 언급 할 때, 보존적(conservative)이라는 용어는 아미노산이 당업자에 의해 인식되는 공통적인 특성을 공유함을 의미한다. 예를 들면, 소수성 비-산성 측쇄를 갖는 아미노산, 소수성 산성 측쇄를 갖는 아미노산, 친수성 비-산성 측쇄를 갖는 아미노산, 친수성 산성 측쇄를 갖는 아미노산 그리고 친수성 염기성 측쇄를 갖는 아미노산이 포함된다. 공통적인 특성은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산, 지방족 소수성 측쇄를 갖는 아미노산, 방향족 소수성 측쇄를 갖는 아미노산, 극성 중성 측쇄를 갖는 아미노산, 전기적으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산, 전기적으로 하전된 산성 측쇄 그리고 전기적으로 하전된 염기성 측쇄를 가진 아미노산일 수도 있다. 자연 발생적, 그리고 비-자연 발생적 아미노산은 당업계에 공지되어 있고, 구체예에서 아미노산을 대체하는데 사용될 수 있다. 아미노산을 치환하는 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서의 "하나 또는 그 이상의"에 대한 언급은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 개별적인 구체예를 포함하는 것으로 의도된다.
또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 펩티드 또는 프로펩티드는 상기 GLP-1 서열 또는 프로펩티드 서열로부터 최대 10% 변이를 함유하는 변이체들을 포함하며, 이들 용어는 본원에서 기술된다. 즉, 상기 GLP-1 펩티드 또는 프로펩티드는 본원에서 제시된 및/또는 당분야에 공지된 GLP-1 또는 프로펩티드 서열에 대하여 약 90% 동일성 내지 약 99.9 % 동일성, 약 95% 내지 약 99% 동일성 또는 약 97% 내지 약 98% 동일성을 공유한다.
본원에서 제공되는 GLP-1 펩티드 및 프로펩티드에 추가하여, 이들 펩티드를 인코드하는 핵산 서열들이 제시된다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 GLP-1 펩티드를 인코드하는 핵산 서열이 제시된다. 또다른 구체예에서, 이 서열은 서열 번호:1의 GLP-1 서열을 인코드하는 임의의 핵산 서열을 포함한다. GLP-1 (7-37)의 야생형 핵산 서열은 서열 번호: 56에 제시된다. 고양이 글루카곤의 서열은 공지되어 있고, 가령, NCBI 참조 서열: XM_006935320.1로 찾아볼 수 있다. 개의 글루카곤의 서열은 공지되어 있고, 가령, NCBI 참조 서열: NM_001003044.1로 찾아볼 수 있다. 한 구체예에서, GLP-1을 코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재된 GLP-1 펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 코돈 최적화 서열이다. 한 구체예에서, 상기 코돈 최적화된 서열은 당분야에 공지된 또는 본원에서 기술된 GLP-1 핵산 서열과 최소한 약 60% 동일성을 공유한다. 한 구체예에서, 상기 코돈 최적화된 서열은 당분야에 공지된 또는 본원에서 기술된 GLP-1 핵산 서열과 최소한 약 70% 동일성을 공유한다. 한 구체예에서, 상기 코돈 최적화된 서열은 당분야에 공지된 또는 본원에서 기술된 GLP-1 핵산 서열과 최소한 약 80% 동일성을 공유한다. 한 구체예에서, 상기 코돈 최적화된 서열은 당분야에 공지된 또는 본원에서 기술된 GLP-1 핵산 서열과 최소한 약 90% 동일성을 공유한다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 서열은 고양이에게서 발현되도록 최적화된다. 한 구체예에서, GLP-1 (7-37)의 핵산 서열은 서열 번호: 2에 제시된다. 또다른 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 프로 펩티드 서열을 인코드하는 핵산 서열이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 핵산 서열은 인자 IX 프로펩티드 서열을 인코드한다. 또다른 구체예에서, 고양이 인자 IX 프로펩티드 서열을 인코드하는 핵산 서열은 서열 번호: 4이다.
한 구체예에서 상기 프로펩티드 및 GLP-1 펩티드는 생성물이 발현될 때, GLP-1 펩티드의 N-말단 아미노산 잔기가 프로펩티드의 C-단부 아미노산 잔기에 추가 잔기없이, 즉시 이어지도록 배열된다. 따라서, 바람직하게는, 프로펩티드 및 GLP-1 펩티드의 코딩 영역 모두는 프로펩티드와 GLP-1의 코딩 서열 사이의 링커 없이 단일 핵산 서열에 혼입된다.
GLP-1 펩티드 및/또는 프로펩티드의 변이체 또는 단편이 바람직한 경우, 이들 펩티드의 코딩 서열은 야생형 핵산 서열의 부위-지향된(site-directed) 돌연변이유발을 이용하여 생성될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 웹 기반 또는 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램 뿐만 아니라, 서비스 기반 회사는 아미노산 서열을 RNA 및/또는 cDNA 둘 모두를 포함하는 핵산 코딩 서열로 역-해독하는 데 사용될 수 있다. 가령, backtranseq by EMBOSS, http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/; Gene Infinity (http://www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html); ExPasy (http://www.expasy.org/tools/) 참고. 한 구체예에서, RNA 및/또는 cDNA 코딩 서열은 본원에서 논의된 바와 같이, 궁극적으로 투여하기로 의도된 대상 종에서 최적 발현되도록 기획된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 코딩 서열은 고양이에서 최적 발현되도록 기획된다. 따라서, 또다른 구체예에서, 상기 코딩 서열은 개에서 최적 발현되도록 기획된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 코딩 서열은 인간에서 최적 발현되도록 기획된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 상기 코딩 서열은 양장류에서 최적 발현되도록 기획된다. 또다른 구체예에서, 상기 코딩 서열은 양, 소 또는 돼지에서 최적 발현되도록 기획된다. 또다른 구체예에서, 상기 코딩 서열은 설치류에서 최적 발현되도록 기획된다.
상기 코딩 서열은 코돈 최적화(optimization)를 이용한 최적 발현을 위하여 기획된다. 코돈-최적화된 코딩 영역은 상이한 다양한 방법에 의해 기획될 수 있다. 이러한 최적화는 온라인, 공개된 방법 또는 코돈 최적화 서비스를 제공하는 회사에서 이용가능한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 코돈 최적화를 위한 한 가지 방법은 가령, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/012924에서 기술되며, 이는 본원의 참고자료에 편입된다. 간략하게 설명하자면, 생성물을 코딩하는 핵산 서열은 유사한 코돈 서열로 변형된다. 적합하게는, 생성의 개방 판독 틀 (ORF)의 전체 길이가 변경된다. 그러나, 일부 구체예들에서, ORF의 단편만 변경될 수 있다. 이들 방법 중 하나를 사용함으로써, 주어진 폴리티이드 서열에 빈도를 적용하고, 폴리펩티이드를 코딩하는 코돈-최적화된 코딩 영역의 핵산 단편을 생성할 수 있다.
핵산 서열의 문맥에서 "동일성 백분율(%)", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 또는 "동일 백분율"이란 용어는 대응하도록 정렬 될 때, 두 서열에서 동일한 두 서열의 염기를 의미한다. 서열 동일성 비교 길이는 게놈의 전장, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 적어도 약 100 내지 150개의 뉴클레오티드의 단편, 또는 원하는 데로 될 수 있다. 그러나, 더 작은 단편들 사이의 동일성, 가령, 적어도 약 9 개 뉴클레오티드, 보통 약 20 내지 24개 뉴클레오티드, 약 28 내지 32 뉴클레오티드, 약 36 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 또한 바람직할 수 있다. 다중 서열 정렬 프로그램은 핵산 서열에도 이용 가능하다. 이러한 프로그램의 예로는 인터넷상의 웹 서버를 통해 액세스할 수 있는 "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP" 및 "MEME"가 있다. 그러한 프로그램의 다른 소스는 당업자에게 공지되어 있다. 또는 Vector NTI 유틸리티도 사용된다. 상기 기술된 프로그램에 포함된 것을 포함하여, 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 알고리즘이 또한 존재한다. 다른 예로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 GCG 버젼 6.1의 프로그램인 Fasta ™를 사용하여 비교될 수 있다. Fasta ™는 의문(query) 서열과 검색 서열 사이의 가장 잘 겹쳐지는 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 간의 서열 동일성 백분율은 참조로 포함된 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같이, 그의 디폴트 매개변수 (워드 크기 6 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOP AM 인자)를 갖는 Fasta™를 사용하여 결정될 수 있다.
아미노산 서열의 문맥에서 "동일성 백분율(%)", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 또는 "동일 백분율"이란 용어는 대응하도록 정렬 될 때, 두 서열에서 동일한 잔기를 의미한다. 동일성 백분율은 전장의 단백질, 폴리펩티드, 약 70개 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 또는 이의 펩티드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 코딩 서열에 걸친 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8개 아미노산 길이 일 수 있고, 최대 약 150개 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 두 개의 다른 서열 사이의 "동일성", "상동성(homology)" 또는 "유사성(similarity)"을 언급 할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된(aligned)"서열과 관련하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬(alignments)"은 다수의 핵산 서열 또는 단백질 (아미노산) 서열을 말하며, 종종 참조 서열과 비교하여 누락 또는 추가 염기 또는 아미노산에 대한 보정을 포함한다. 정렬은 공개적으로 또는 상업적으로 이용가능한 다양한 다중 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램은 가령, "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME" 및 "Match-Box" 프로그램과 같은 아미노산 서열에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이들 프로그램 중 임의의 것은 디폴트 설정에서 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이들 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 적어도 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 동일성 수준 또는 정렬 수준을 제공하는 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 가령, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999) 참고.
프로펩티드 및 GLP-1 서열의 다양한 조합을 바람직한 GLP-1 발현 구조체를 생성하기 위한 본원의 교시에 따라 제조할 수 있다. 이것은 본원에 기재된 GLP-1 활성 펩티드 서열로 당업계에 공지 된 프로 펩티드 서열의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 응고 인자 프로펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 비타민 k-의존성 혈장 단백질의 프로펩티드 부분은 상당히 보존되어있다. Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, Colman, Ed., 1827 pp., illustrated. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2006 참고.
한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 인자 IX 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위와 조합된 인자 IX 서열을 포함한다. 하기 실시예에서 그리고 한 구체예에서 실증된 바와 같이, 프로펩티드 서열은 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이(펠리스 카투스(felis catus)) 인자 IX 리더 서열이다. 한 구체예에서, 상기 인자 IX 리더 서열은 신호 및 활성화 서열 (프로-서열)을 포함하며, 길이는 약 46개 아미노산이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 5에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체를 인코드하는 핵산 서열은 서열 번호: 6에서 제시된다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 5를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 고양이 인자 IX의 아미노산 서열은 공지되어 있고, GenBank 기탁번호 AAR26346.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 11로 다시 만들었다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 상기 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 개의(캐니스 루피스 팔말라리스(canis lupis familiaris)) 인자 IX 리더 서열이다. 개의 인자 IX의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: NP_001003323.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 12로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 12의 아미노산 1-39이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 13에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 13을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 인간의 인자 IX 리더 서열이다. 인간 인자 IX의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: AAA98726.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 14로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 14의 아미노산 1-46이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 15에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 15을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 인자 IX의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 인자 VII 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위와 조합된 인자 VII 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 인자 VII 리더 서열은 신호 및 활성화 서열 (프로-서열)을 포함하며, 길이는 약 37-40개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이 (펠리스 카투스) 인자 VII 리더 서열이다. 고양이 인자 VII의 아미노산 서열은 공지되어 있고, GenBank 기탁번호 XP 003980582.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 16으로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 16의 아미노산 1-40이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 17에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 17을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 GLP- 1(7-37) 야생형 서열과 복합된 개의 인자 VII 리더 서열이다. 개의 인자 VII의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: ABB02531.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 18로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 18의 아미노산 1-40이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 19에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 19을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 인간 인자 VII 리더 서열이다. 인간 인자 VII의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: ACB87203.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 20로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 20의 아미노산 1-60이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 21에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 21을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 38aa의 리더 서열을 갖는 인간 인자 VII의 다른 형태는 때로는 변이체 2로 불린다. 이러한 변이체 2는 5 '코딩 영역에서 엑손이 결핍되지만, 변이체 1과 비교하면, 리딩 프레임은 유지하고 있다. 인코드된 아이소폼(b)은 아이소폼(a) 보다 더 짧다. 인간 인자 VII, 변이체 2의 서열은 공지되어 있고, 가령 NCBI 참조 서열: NP_062562.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 22로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 22의 아미노산 1-38이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 23에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 23을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 인자 VII의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
항응고(anticoagulant) 인자 II는 또한 프로트롬빈이라고도 한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 인자 II는 프로트롬빈 및 트롬빈과 호환사용된다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 인자 II 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위와 조합된 인자 II (트롬빈) 서열이다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 41-43개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 상기 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이 인자 II 리더 서열이다. 고양이 인자 II의 아미노산 서열은 공지되어 있고, GenBank 기탁번호 XP 003993267.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 24로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 24의 아미노산 1-43이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 25에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 25를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 개의 인자 II 리더 서열이다. 개의 인자 II의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: XP_003639742.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 26로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 26의 아미노산 1-41이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 27에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 27을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 인간 인자 II 리더 서열이다. 인간 인자 II의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: NP_000497.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 28로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 28의 아미노산 1-43이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 29에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 29를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 인자 II의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 인자 IX 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위와 조합된 인자 IX 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 39-46개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이의 인자 IX 리더 서열이다. 고양이 인자 IX의 아미노산 서열은 공지되어 있고, GenBank 기탁번호 NP_001009377.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 30으로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 30의 아미노산 1-46이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 31에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 31을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 GLP- 1(7-37) 야생형 서열과 복합된 개의 인자 IX 리더 서열이다. 개의 인자 IX의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: NP_001003323.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 32로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 32의 아미노산 1-39이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 33에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 33을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 인간 인자 IX 리더 서열이다. 인간의 인자 IX의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: NP_000124.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 34로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 34의 아미노산 1-46이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 35에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 35를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 인자 IX의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 단백질 S (또한 소위 비타민 K-의존적 단백질 S) 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위와 조합된 단백질 S 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 36-57개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 상기 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이의 단백질 S 리더 서열이다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 7의 아미노산 1-57이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 7에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 7을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 8, 또는 이의 코돈 최적화된 서열에 의해 인코드된다. 고양이 단백질 S의 아미노산 서열은 공지되어 있고, GenBank 기탁번호 XP 011284289로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 36으로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 36의 아미노산 1-36이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 37에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 37을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이의 단백질 S 리더 서열이다. 고양이의 단백질 S의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: XP_005639500.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 38로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 38의 아미노산 1-41이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 39에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 39을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 인간 단백질 S 리더 서열이다. 인간 단백질 S의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 가령: UniProtKB/Swiss-Prot: P07225.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 40으로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 40의 아미노산 1-41이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 41에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 41을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 단백질 S의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 단백질 Z (또한 비타민 K- 의존적 단백질 Z라고도 함) 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위와 조합된 단백질 Z 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 62개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 상기 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이 단백질 Z 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호:1에 나타낸 상기 GLP-1 (7-37) 서열과 복합된 고양이 단백질 Z 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 인간의 단백질 Z 리더 서열이다. 인간 단백질 Z의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 가령: GenBank: AAA36501.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 42로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 42의 아미노산 1-62이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 43에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 43을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 단백질 Z의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 단백질 C (또한 비타민 K- 의존적 단백질 C라고도 함) 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위와 조합된 단백질 C 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 42개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호:1에 나타낸 상기 GLP-1 (7-37) 서열과 복합된 고양이 단백질 Z 리더 서열이다. 고양이 단백질 C의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: XP_011283508.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 44로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 44의 아미노산 1-42이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 45에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 45를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP- 1(7-37) 야생형 서열과 복합된 개의 단백질 C 리더 서열이다. 개의 단백질 C의 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: GenBank: CAA05126.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 46으로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 46의 아미노산 1-42이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 47에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 47을 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호:1에 나타낸 상기 GLP-1 (7-37) 서열과 복합된 인간 단백질 C 리더 서열이다. 인간 단백질 C의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 가령: GenBank: AAA60166.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 48로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 48의 아미노산 1-42이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 49에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 49를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 단백질 C의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 알부민 리더 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 퓨린 부위과 조합된 알부민 리더 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드의 길이는 약 24개 아미노산이다. 또다른 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 상기 GLP-1 (7-37) 야생형 서열과 복합된 고양이 알부민 리더 서열이다. 고양이 알부민의 아미노산 서열은 공지되어 있고, GenBank 기탁번호 CAA59279.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 50으로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 50의 아미노산 1-24이다. 한 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 9에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 9를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 한 구체예에서, 고양이 알부민 프로펩티드-GLP-1 구조체를 인코드하는 핵산 서열은 서열 번호: 10이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 개의 알부민 리더 서열이다. 개의 알부민 아미노산 서열은 공지되어 있고, NCBI 참조 서열: CAB64867.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 51로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 51의 아미노산 1-24이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 52에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 52를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 상기 GLP-1(7-37) 야생형 서열과 복합된 인간 알부민 리더 서열이다. 인간 알부민의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 가령: NCBI 참조 서열: AAA98797.1로 찾아볼 수 있으며, 이는 편의를 위하여 서열 번호: 53으로 다시 만들었다. 한 구체예에서, 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 53의 아미노산 1-24이다. 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체 서열은 서열 번호: 54에서 제시된 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 GLP-1 구조체는 서열 번호: 54를 인코드하는 코돈 최적화된 서열이다. 유사한 구조가 당업계에 공지된 알부민의 다른 아이소폼(isoforms)을 사용하여 만들어질 수 있다.
한 구체예에서, 본원에서 기술된 GLP-1 구조체를 인코드하는 핵산 서열은 임의의 적합한 유전적 요소, 가령, 네이키드 DNA, 파아지, 트랜스포존, 코스미드, RNA 분자 (가령, mRNA), 에피좀 등등의 안으로 조작될 수 있고, 이것은 포장 숙주 세포에서 DNA 또는 RNA, 바이러스 벡터를 운반하는 나노입자를 만들거나 및/또는 대상의 숙주 세포로 전달하기 위하여, 숙주 세포로 이 안에 포함된 hLDLR 서열을 전달한다. 한 구체예에서, 상기 유전 요소는 플라스미드다. 선택된 유전 요소는 형질 감염, 전기천공, 리포좀 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA-코팅된 펠렛, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 이러한 구조체를 제조하는 데 사용되는 방법은 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함하는 핵산 조작 기술이 있는 사람들에게 공지되어 있다. 가령, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012) 참고.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "발현 카세트(expression cassette)"는 GLP-1 구조체 코딩 서열 (예를 들어, 프로펩티드 및 GLP-1 활성 펩티드의 코딩 서열), 프로모터, 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 지칭하며, 그리고 이를 위한 임의의 다른 조정 서열을 포함할 수 있고, 이 카세트는 유전자 요소로 조작되거나, 또는 바이러스 벡터의 캡시드 (capsid)(예: 바이러스 입자)에 패키징된다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성하기 위한 이러한 발현 카세트는 바이러스 게놈의 패키징 서열 및 다른 발현 제어 서열 측면에 위치하는 본원에 기술된 GLP-1 구조체 서열을 함유한다. 당분야에 공지된 기술, 본원에서 기술된 바와 같이 가령, 코돈 최적화를 포함하는 기술을 이용하여 특정 종에 대하여 최적화될 수 있다.
상기 발현 카세트는 발현 제어 서열의 일부분으로써 프로모터 서열을 전형적으로 포함한다. 한 구체예에서, 간-특이적 프로모터 티록신 결합 글로불린 (TBG)이 이용된다. 본원에서 기술된 플라스미드 및 벡터에서 CB7 프로모터가 이용된다. CB7은 사이토메갈로바이러스 인헨서 요소와 함께, 병아리 β-액틴 프로모터다. 대안으로, 다른 간-특이적 프로모터들이 이용된다[가령, The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPD, 알파 1 항-트립신 (A1AT); 인간 알부민 Miyatake et al., J. Virol., 71:5124 32 (1997), humAlb; 그리고 B형 간염 바이러스 코어 프로모터, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002 9 (1996)]. TTR 최소 인헨서/프로모터, 알파-안티트립신 프로모터, LSP (845 nt)25(인트론이-적은 scAAV를 요구함). 비록 바람직한 정도가 덜하지만, 다른 프로모터, 이를 테면, 바이러스 프로모터, 구성 프로모터, 규제가능한 프로모터 [가령, WO 2011/126808 및 WO 2013/04943 참고], 또는 생리학적 신호에 반응성이 있는 프로모터가 본원에서 기술된 백터에 사용되고 이용될 수 있다.
프로모터에 추가하여, 발현 카세트 및/또는 벡터는 다른 적합한 전사 개시, 종료, 인헨서 서열, 효과적인 RNA 프로세싱 신호, 이를 테면, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효과를 강화시키는 서열(가령, Kozak 콘센수스 서열); 단백질 안정성을 강화시키는 서열; 그리고 바람직한 경우, 인코드된 산물의 분비를 강화시키는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 polyA 서열의 예로는 가령, 그중에서도 SV40, 소 성장 호르몬 (bGH), 및 TK poly A를 포함한다. 적합한 인헨서의 예로는 가령, 알파 훼토단백질 인헨서, TTR 최소 프로모터/인헨서, LSP (TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠민 인헨서)를 포함한다.
이들 제어 서열은 상기 GLP-1 구조체 서열에 "작동가능하도록 연계된다(operably linked)". 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "작동가능하도록 연계된"이란 관심대상 유전자와 연접하는 발현 조절 서열과 관심대상 유전자를 조절하기 위해 트랜스(trans) 또는 먼 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 모두를 지칭한다.
상기 발현 카세트는 바이러스 벡터의 생산에 사용되는 플라스미드 상에서 조작될 수 있다. 상기 발현 카세트를 AAV 바이러스 입자 안으로 패키지하는데 요구되는 최소 서열은 AAV 5' 및 3' ITRs이며, 이들은 캡시드와 동일한 AAV 기원이거나, 또는 상이한 AAV 기원 (AAV 위형(pseudotype)을 만들기 위하여)일 수 있다. 한 구체예에서, AAV2의 ITR 서열, 또는 이의 결손된 형태(△ITR)는 조정 승인을 가속화시키기 위하여 편리하게 이용된다. 그러나, 다른 AAV 원천의 ITRs이 선택될 수 있다. ITRs의 원천이 AAV2이고, 그리고 AAV 캡시드는 또다른 AAV 원천인 경우, 생성된 벡터는 위형(pseudotype)이라고 부를 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터의 발현 카세트는 AAV 5' ITR, 상기 프로펩티드-GLP-1 활성 펩티드 코딩 서열 및 임의의 조정 서열, 그리고 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이들 요소들의 다른 배위(configurations)가 적합할 수 있다. D-서열 및 말단 해리 부위 (trs)이 결손된 5' ITR의 단축형, △ITR이 기술되었다. 다른 구체예들에서, 전장의 AAV 5' 및 3' ITRs이 이용된다.
예시적인 플라스미드가 서열 목록에서 제시된다. 서열 번호: 57은 pn1044.CB7.GLP1feprotS로 명명된, 고양이 단백질 S 프로펩티드-GLP1 구조체를 인코드하는 플라스미드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호: 57의 플라스미드로 조작된다. 서열 번호: 58은 pn1044.CB7.GLP1feIL2fur로 명명된, 고양이 IL2 프로펩티드 (퓨린 부위 포함)-GLP1 구조체를 인코드하는 플라스미드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호: 58의 플라스미드로 조작된다. 서열 번호: 59는 p1044.CB7.GLP1feThrombin으로 명명된, 고양이 트롬빈 프로펩티드-GLP1 구조체를 인코드하는 플라스미드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호: 59의 플라스미드로 조작된다. 서열 번호: 60은 p1044.CB7.GLP1feManFur로 명명된, 고양이 만노시다제 (퓨린 부위와 함께) 프로펩티드-GLP1 구조체를 인코드하는 플라스미드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호: 60의 플라스미드로 조작된다. 서열 번호: 61은 p1044 GLP1fealb로 명명된, 고양이 알부민 프로펩티드-GLP1 구조체를 인코드하는 플라스미드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호: 61의 플라스미드로 조작된다. 서열 번호: 62은 p1044 GLP1fealbfur로 명명된, 고양이 알부민 (퓨린 부위와 함께) 프로펩티드-GLP1 구조체를 인코딩하는 플라스미드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호: 62의 플라스미드로 조작된다. 서열 번호: 63은 p1044 GLP1fealbfur로 명명된, 고양이 트롬빈 (퓨린 부위와 함께) 프로펩티드-GLP1 구조체를 인코딩하는 플라스미드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호: 62의 플라스미드로 조작된다.
약어 "sc"는 자가-상보성을 나타낸다. "자가-상보성(self-complementary) AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반되는 코딩 영역이 분자내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 기획된, 발현 카세트를 갖는 플라스미드 또는 벡터를 말한다. 감염시, 제2 가닥의 세포 매개된 합성을 기다리기보다는, scAAV의 두 개의 상보적인 절반은 연관되어 즉시 복제 및 전사가 가능한 한 개의 이중 가닥 DNA (dsDNA) 유닛을 형성할 것이다. 가령, D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254 참고. 자가-상보성 AAVs는 가령, 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683에 기술되어 있으며, 이들 각각은 모두 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
아데노-연합된 바이러스 (AAV) 바이러스 벡터는 표적 세포로 운반을 위하여 패키지된 핵산 서열인, AAV 단백질 캡시드를 갖는 AAV DNase-저항성 입자다. AAV 캡시드는 60개의 캡시드 (cap) 단백질 소단위, VP1, VP2, 및 VP3로 구성되며, 이들은 선택된 AAV에 따라, 대략적으로 1:1:10 내지 1:1:20의 비율의 정이십면체 대칭으로 정렬된다. AAV 혈청형(serotypes)은 AAV 바이러스 벡터 (DNase 저항성 바이러스 입자)의 캡시드의 원천으로 선택될 수 있는데, 가령, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, rh10, AAVrh64R1, AAVrh64R2, rh8, rh.10, 임의의 공지의 또는 언급된 AAVs 또는 AAVs의 앞으로 발견될 변이체들이다. 가령, 미국 공개된 특허 출원 번호 2007-0036760-A1; 미국 공개된 특허 출원 번호. 2009-0197338-A1; EP 1310571 참고. WO 2003/042397 (AAV7 및 다른 유사한 AAV), 미국 특허 7790449 및 미국 특허 7282199 (AAV8), WO 2005/033321 및 미국 7,906,111 (AAV9), 그리고 WO 2006/110689, 그리고 WO 2003/042397 (rh. 10) 참고. 대안으로, 임의의 언급된 AAVs를 바탕으로 재조합 AAV는 AAV 캡시드의 원천으로 이용될 수 있다. 이 문서는 또한 AAV를 생성하기 위해 선택될 수 있는 다른 AAV를 기술하며, 이들은 참고자료에 편입된다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터에서 이용되는 AAV cap는 전술한 AAV Caps 또는 이를 인코드하는 핵산의 돌연변이생성(가령, 삽입, 결손 또는 치환에 의해)에 의해 생성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 AAV 캡시드는 전술한 AAV 캡시드 단백질중 2개 또는 3개 또는 4개 또는 그 이상으로부터 유래된 도메인을 포함하는 키메라다. 일부 구체예들에서, 상기 AAV 캡시드는 상이한 2개 또는 3개의 AAVs 또는 재조합 AAVs로부터 Vp1, Vp2, 및 Vp3 단량체의 모자이크다. 일부 구체예들에서, rAAV 조성물은 전술한 Caps중 하나 이상을 포함한다.
발현 카세트를 비리온(virions)으로 패키징하기 위하여, 상기 ITRs는 동일한 구조체 안에서 이 유전자와 동일한 cis 형태로 요구되는 유일한 AAV 성분들이다. 한 구체예에서, AAV 벡터를 만들기 위하여, 복제 (rep) 및/또는 캡시드 (cap)를 위한 코딩 서열은 AAV 게놈으로부터 제거되고, trans로 공급되거나, 또는 패키징 세포 계통에 의해 공급된다. 예를 들면, 상기와 같이, 위형의(pseudotyped) AAV는 상기 AAV 캡시드의 원천과는 상이한 원천으로부터 유래된 ITRs을 함유할 수 있다. 추가적으로, 또는 대안으로, 키메라 AAV 캡시드를 이용할 수 있다. 여전히 다른 AAV 성분들이 선택될 수 있다. 그러한 AAV 서열의 출처는 여기에 기술되어 있으며, 학술, 상업 또는 공공 출처(가령, American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 단리되거나 획득될 수도 있다. 대안으로, 상기 AAV 서열은 문헌, 또는 예를 들어 GenBank®, PubMed®, 등과 같은 데이터베이스에서 이용가능한 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적절한 수단을 통해 수득할 수 있다.
대상에게 전달하기에 적합한 AAV 바이러스 벡터를 생성하고 단리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가령, 미국 특허 7790449; 미국 특허 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 및 미국 7588772 B2] 참고. 한 시스템에서, 생산자 세포주는 ITR의 측면에 위치하는 이식유전자(transgene) 및 rep와 cap을 인코딩하는 구조체 (들)에 의해 일시적으로 형질감염된다. 제 2 시스템에서, rep 및 cap을 안정적으로 공급하는 패키징 세포계통은 ITRs의 측면에 있는 이식유전자를 인코딩하는 구조체로 일시적으로 형질감염된다. 이들 각 시스템에서, AAV 비리온은 헬퍼(helper) 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스의 감염에 반응하여 생성되는데, 오염 바이러스로부터 상기 rAAVs의 분리가 필요하다. 더욱 최근에, AAV를 회수시키기 위하여, 헬퍼 바이러스를 이용한 감염이 요구되지 않는 시스템이 개발되었는데, 요구되는 헬퍼 기능 (가령, 아데노바이러스 E1, E2a, VA, 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52, 및 UL29, 그리고 헤르페스바이러스 중합효소)이 이 시스템에 의해 trans로 또한 공급된다. 이들 신규 시스템에서, 헬퍼 기능은 요구되는 헬퍼 기능을 인코드하는 구조체로 이 세포의 일시적 형질감염에 의해 공급될 수 있거나, 또는 이 세포들은 헬퍼 기능을 인코드하는 유전자를 안정적으로 함유하도록 조작될 수 있고, 이의 발현은 전사 또는 전사후 수준에서 제어될 수 있다. 또다른 시스템에서, ITRs의 측면에 있는 이식유전자와 rep/cap 유전자는 베큘로바이러스-기반 벡터을 이용한 감염에 의해 곤충 세포로 도입된다. 이들 생산 시스템에 대한 검토는 일반적으로 가령, Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929를 참고하며, 이의 각 내용은 본 명세서의 참고자료에 전문이 편입된다. 이들 및 기타 AAV 생산 시스템을 만들고 이용하는 방법은 다음의 미국 특허에서 또한 설명되어 있으며, 이의 각 내용은 본 명세서의 참고자료에 전문이 편입된다: 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; 및 7,439,065. 가령, Grieger & Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology," J. Gene Med. 10:717-733; 그리고 하기에서 언급된 문헌들을 참고하며, 이의 각 내용은 본 명세서의 참고자료에 전문이 편입된다: 본 발명의 임의의 구체예를 구축하는데 이용되는 방법은 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함하는 핵산 조작 기술이 있는 사람들에게 공지되어 있다. 가령, Green and Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012) 참고. 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 잘 알려져 있으며, 본 발명에서 적합한 방법의 선택은 제한되는 것은 아니다. 가령, K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532 및 미국 특허 번호 5,478,745 참고.
임의선택적으로, 본원에서 기술된 GLP-1 구조체는 rAAV이외에 바이러스 벡터로 전달될 수 있다. 이러한 다른 바이러스 벡터는 유전자 요법에 적합한 임의의 바이러스를 포함하며, 아데노바이러스; 헤르페스 바이러스; 렌티바이러스; 레트로바이러스; 등을 포함하나, 이에 국한되지 않는 것들이 이용될 수 있다. 적합하게는 이들 다른 벡터중 하나가 만들어질 때, 복제-결함성 바이러스 벡터로 만들어진다.
"복제-결함성(defective) 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심대상 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 외피 내에 포장된, 합성 또는 인위적 바이러스 입자를 지칭하며, 여기에서 바이러스 캡시드 또는 외피 내에 포장된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제-결함성이다; 즉, 이들은 후손 비리온을 만들 수 없지만, 표적 세포를 감염시키는 능력은 유지한다. 한 구체예에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하지 않고(이 게놈은 인위적인 게놈의 증폭 및 패키징에 요구되는 신호 측면에 오직 관심대상의 이식유전자를 함유하는 "거트레스(gutless)"로 조작될 수 있지만, 그러나, 이들 유전자는 생산하는 동안 공급될 수 있다. 따라서, 복제에 필요한 바이러스 효소가 존재하는 경우를 제외하고, 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 발생할 수 없기 때문에, 유전자 요법에서의 이의 사용은 안전하다고 간주된다.
본원에서 기술된 바이러스 벡터 구조체를 포함하는 조성물이 또한 제시된다. 본원에서 기술된 약학 조성물은 임의의 적합한 경로 또는 상이한 경로의 조합에 의해 이를 필요로 하는 대상에게 전달되도록 기획된다. 간으로 직접 전달 (임의선택적으로 정맥을 경유하여, 간 동맥을 경유하여, 또는 이식에 의해), 경구, 흡입, 비강내, 기관내(intratracheal), 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 그리고 다른 비경구 투여. 본원에서 기술된 바이러스 벡터는 단일 조성물 또는 다중 조성물로 전달될 수 있다. 임의선택적으로, 2개 또는 그 이상의 상이한 AAV가 전달될 수 있거나, 또는 다중 바이러스[가령, WO 2011/126808 및 WO 2013/049493 참고], 또다른 구체예에서, 다중 바이러스는 상이한 복제-결함성 바이러스(가령, AAV 및 아데노바이러스)를 함유할 수 있다.
상기 복제-결함성 바이러스는 유전자 전달 및 유전자 치료 응용에 사용하기 위해 생리학적으로 수용가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다. AAV 바이러스 벡터의 경우, 게놈 복사체 ("GC")의 정량화는 제형에 포함된 용량(dose)의 척도로 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 복제-결함성 바이러스 조성물의 게놈 복사체 (GC) 수를 결정할 수 있다. AAV GC 수 적정을 실행하는 한 가지 방법은 다음과 같다: 정제된 AAV 벡터 시료를 우선 DNase로 처리하여, 캡슐화되지 않은 AAV 게놈 DNA 또는 생산 과정에서 오염된 플라스미드 DNA를 제거한다. 그런 다음 DNase 저항성 입자는 열처리하여, 캡시드에서 게놈을 방출시킨다. 그런 다음 방출된 게놈은 바이러스 게놈의 특정 영역(통상적으로 poly A 신호)을 표적으로하는 프라이머/프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR로 정량된다.
또한, 복제-결함성 바이러스 조성물은 약 1.0 × 109 GC 내지 약 1.0 × 1015 GC의 범위에 있는 복제-결함성 바이러스의 양을 함유하는 투약 단위로 제형화될 수 있다. 또다른 구체예에서, 이 양의 바이러스 게놈은 분할된 용량으로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 투여량(dosage)은 평균 5kg의 고양이 또는 작은 개를 대상으로 하는 경우, 약 1.0 x 1011 GC 내지 약 1.0 x 1012 GC이다. 한 구체예에서, 평균 약 20 kg의 중간 개의 대상를 대상으로 하는 경우, 상기 투여량은 약 1.0 x 1012 GC 내지 약 1.0 x 1013 GC이다. 평균적으로 개는 체중이 약 5 내지 약 50 kg이다. 한 구체예에서, 평균 약 70 kg의 인간을 대상으로 하는 경우, 상기 투여량은 약 1.0 x 1012 GC 내지 약 1.0 x 1013 GC이다. 평균적으로 인간의 체중은 약 55 내지 약 80 kg이다. 한 구체예에서, 대상의 투여량은 약 1.0 x 1011 GC 내지 1.0 x 1013 GC이다. 또다른 구체예에서, 용량 약 3 x 1012 GC이다. 예를 들면, AAV 바이러스의 용량은 약 1 x 1011 GC, 약 5 X 1011 GC, 약 1 X 1012 GC, 약 5 X 1012 GC, 또는 약 1 X 1013 GC일 수 있다. 또다른 실시예에서, 상기 구조체는 mL당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 양으로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 구조체는 수의과 동물 대상의 경우 1 μL 내지 약 100 mL 용적으로 전달될 수 있다. 가령, 다양한 수의과 동물에 물질을 투여하기 위한 양호한 실행에 대한 논의는 Diehl et al, J. Applied Toxicology, 21:15-23 (2001) 참고. 이 문헌은 본 명에서의 참고자료에 편입된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "투여량(dosage)"이란 용어는 치료 과정에서 대상에게 전달되는 총 투여량 또는 단일 투여 (다중 투여)로 전달되는 양을 지칭할 수 있다.
상기 기술된 재조합 벡터는 공지된 방법에 따라 숙주 세포에 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리학적으로 양립가능한 운반체에 현탁된 rAAV는 고양이, 개, 인간 또는 비-인간 포유동물 대상을 포함하나, 이에 국한되지 않는 원하는 대상에게 투여될 수 있다. 적합한 운반체는 전달 바이러스에 의해 지시되는 관점을 고려하여, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 한 가지 적합한 운반체는 염수를 포함하는데, 이는 다양한 완충 용액 (가령, 인산염 완충된 염수)으로 제형화될 수 있다. 다른 예시적인 운반체는 염수, 락토스, 슈크로스, 인산 칼슘, 젤라틴, 덱스트린, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참깨유, 및 물을 포함한다. 운반체의 선택은 본 발명에서 제한되지 않는다.
임의선택적으로, 본 발명의 조성물은 상기 rAAV 및/또는 변이체 및 운반체(들)에 추가하여, 다른 통상적인 약학 성분들, 이를 테면, 보존제 또는 화학적 안정제를 포함한다. 적절한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 소르빈산 칼륨, 소르 브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 제시되는데, 이때 각 벡터는 본원에서 기술된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 GLP-1 구조체를 포함한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 조성물은 프로펩티드-GLP-1-(7-37) 구조체를 인코드하는 AAV 벡터를 포함한다. 동일한 조성물은 또한 프로펩티드 및 GLP-1-(7-36)NH2 구조체를 인코드하는 AAV 벡터를 포함한다. 상기 AAV 벡터 캡시드의 원천은 조성물 안에 포함된 각 구조체와 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
본원에서 기술된 바이러스 벡터 및 다른 구조체는 대상에게 증가된 반감기를 갖는 GLP-1을 제공하고, 및/또는 대상의 유형 II 당뇨병 또는 대사성 증후군을 치료하기 위하여, 이를 필요로 하는 대상에게 GLP-1 구조체를 전달하기 위한 약물 제조에 이용될 수 있다. 따라서, 또다른 측면에서, 당뇨병을 치료하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 본원에서 기술된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 본원에서 기술된 바와 같이, 프로펩티드-GLP-1 발현 카세트가 함유된 바이러스 벡터를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 대상은 포유류다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 고양이 또는 개이다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 인간이다.
또다른 구체예에서, 고양이의 T2DM을 치료하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 고양이 인자 IX의 프로펩티드 및 GLP-1 활성 부분을 인코드하는 서열이 포함된 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함하며, 여기에서, 발현되었을 때, GLP-1의 N-말단 아미노산은 상기 프로펩티드의 C-말단 아미노산의 바로 뒤에 있다.
또다른 측면에서 대사성 증후군을 치료하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 본원에서 기술된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 본원에서 기술된 바와 같이, 프로펩티드- GLP-1 발현 카세트가 함유된 바이러스 벡터를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 대상은 포유류다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 고양이 또는 개이다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 인간이다.
또다른 측면에서, 대상의 체중을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 본원에서 기술된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 본원에서 기술된 바와 같이, 프로펩티드-GLP-1 발현 카세트가 함유된 바이러스 벡터를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 대상은 포유류다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 고양이 또는 개이다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 인간이다.
치료 과정은 임의선택적으로 동일한 바이러스 벡터 (가령, AAV8 벡터) 또는 상이한 바이러스 벡터 (가령, AAV8 및 AAVrh10)의 반복 투여를 포함할 수 있다. 또 다른 조합은 본원에 기재된 바이러스 벡터를 사용하여 선택될 수 있다. 임의선택적으로, 본원에서 기술된 조성물은 다른 당뇨 약물 또는 단백질-기반의 요법이 관련된 요법 (가령, GLP-1 유사체, 인슐린, 경구 항고혈당 약물 (술포닐우레아, 비구아니드, 티아졸리딘디온, 그리고 알파-글루코이다제 억제제) 포함과 복합될 수 있다. 임의선택적으로, 본원에 기재된 조성물은 식이 요법 및 운동 요법을 포함하는 생활 습관 변화를 포함하는 요법과 조합될 수 있다.
용어 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 지칭한다는 것을 유의해야 한다. 이와 같이, 용어 "하나"("a" (또는 "an")), "하나 이상"및 "적어도 하나"는 여기서 상호 교환 적으로 사용된다.
단어 "포함한다", "포함한다" 및 "포함하는"이란 배타적이지 않고 포괄적으로 해석되어야 한다. 단어 "구성하다", "구성하는" 및 그 변형은 포괄적인 것이 아니라 배타으로 해석되어야 한다. 본 명세서의 다양한 구체예가 "포함하는(comprising)" 언어를 사용하여 제공되는 동안, 다른 상황 하에서, 관련된 구체예는 또한 "구성된(consisting of)" 또는 "본질적으로 구성된(consisting essentially of)"의 언어를 사용하는 것으로 해석되고, 설명되도록 의도된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "약(about)"은 달리 언급하지 않는 한, 주어진 기준으로부터 10 %의 변동성을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "조절(regulation)" 또는 이의 변형은 생물학적 경로의 하나 또는 그 이상의 성분을 저해하는 조성물의 능력을 지칭한다.
"대상(subject)"은 인간, 마우스, 렛, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 또는 비-인간 영장류, 가령, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 고릴라와 같은 포유 동물이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "대상"은 "환자"와 호환사용된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "질병", "장애" 및 "상태"는 상호 호환적으로 사용되어, 대상의 비정상 상태를 나타낸다.
본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가지며, 그리고 본 출원에서 이용된 많은 용어들에 대한 일반적인 지침을 당업자에게 제공하는 출판된 텍스트를 참조한다.
다음의 실시예들은 오직 설명을 위한 것이며, 본 명세서의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1 - GLP-1 벡터의 구축
공지된 절단 부위를 갖는 프로펩티드를 함유하는 몇 가지 분비된 단백질이 선택되었다. 여기에는 응고 인자 (인자 II, VII, IX, X, 단백질 C, 단백질 S) 및 간에서 생성되는 다른 단백질 (알부민)을 포함한다. 상기 프로펩티드 서열은 상기 GLP-1 (7-37) 아미노산 서열의 상류에 배치된다. 오직 인터루킨-2 신호 펩티드 다음에 GLP-1 (7-37)를 포함하는 대조 서열 또한 기획되었다. 생성된 단백질 서열은 역-해독되고, 코돈 최적화되고, kozak 콘센수스 서열, 정지 코돈, 및 클로닝 부위가 추가된다. 이 서열은 GeneArt에서 만들었으며, CMV 인헨서 (p1044)와 함께, 병아리-베타 액틴 프로모터를 함유하는 발현 벡터 안에 클론되었다. 상기 발현 구조체는 AAV2 ITRs 측면에 있다. 고양이 FIX_GLP1 아미노산 서열은 서열 번호: 5에 나타낸다. 고양이 ProtS_GLP1 아미노산 서열은 서열 번호: 7에 나타낸다. 고양이 Alb_GLP1 아미노산 서열은 서열 번호: 9에 나타낸다. 고양이 FVII_GLP1 아미노산 서열은 서열 번호: 17에 나타낸다. 고양이 FII_GLP1 아미노산 서열은 서열 번호: 25에 나타낸다. 고양이 ProtC_GLP1 아미노산 서열은 서열 번호: 45에 나타낸다.
실시예 2 -시험관 분석
GLP-1 서열의 상류에 IL-2 신호 펩티드 또는 고양이 인자 IX 프로펩티드 만을 함유하는 구조체를 위한 정제된 플라스미드는 제조업자의 지시에 따라 리포펙타민 2000을 이용하여 90% 합류 HEK 293 세포의 6개 웰 플레이트의 삼중 웰로 형질감염되었다. 형질감염 48 시간 후에 상층액을 수거하고, 고감도 N-말단 GLP-1 ELISA (Millipore)를 사용하여 활성 GLP-1을 측정하였다. 도 1에 2개 구조체의 발현을 나타낸다. 도 1은 IL-2 대조에서 GLP-1의 발현은 기본적으로 0이며, 한편 상기 인자 IX 구조체의 발현은 약 60pM임을 보여준다.
실시예 3 - 생체내 GLP-1 발현
이미 설명된 바와 같이, 고양이 인자 IX 프로펩티드를 함유하는 구조체는 삼중 형질감염 및 이딕사놀(iodixanol) 구배 정제에 의해 AAV 혈청형 8 벡터에 패키지되었다. RAG-/- 마우스 (n=4) 마우스는 50 마이크로리터의 PBS에서 벡터 (1012 GC/kg)의 정맥 주사를 맞았다. 정맥 주사는 내부 대조군으로 사용된 한 동물 (마우스 D)에서 달성 될 수 없을 것이다. 5 마이크로리터 DPP-IV 억제제 (Millipore)를 함유하는 혈청 분리기 튜브에서 전혈을 분리하여, 혈청을 연속적으로 수집하고 상기와 같이 활성 GLP-1을 분석하였다. 혈청 활성 GLP-1 농도는 도 2에 나타낸다. 도 2는 대조군 마우스의 활성 GLP-1 수준이 2 pM 미만임을 보여준다. 대조적으로, AAV8.CB.fFIX_GLP1을 주사맞은 3마리 마우스에서, 상기 GLP-1 농도는 1 pM 아래에서 출발하여, 14일차 정점을 찍고 (마우스 C에서 약 10pM), 21일차에 감소하고, 42일차에 재반등하였다. 프로펩티드의 절단 후, GLP-1은 상기 프로펩티드의 절단 후 인위적인 구조체에서 전달되며, 이 펩티드는 도 2에 나타낸 바와 같이 활성이 있다. 간에 추가하여 (도 2), 근육에서도 프로펩티드의 프로세싱이 특징화되었다(데이타 나타내지 않음). 과다발현하였을 때에도 프로세싱은 효과적이다.
실시예 4 - GLP-1 구조체로 당뇨병의 생체내 치료
6-7주령의 당뇨병 (db/db) 마우스에게 50 마이크로리터의 PBS내 인자 IX 프로펩티드 벡터 (3 x 1012 GC/kg, n = 5)의 정맥 주사하였다. 치료를 받지 않은 연령-정합된 db/db 마우스 (n = 5)와 치료되지 않은 db +/- 마우스 (n = 5) (WT)는 대조군으로 사용된다. 혈청 포도당은 플레이트 기반의 포도당 분석 (Caymen Chemical)을 이용하여 매주 측정되었다. 혈청 포도당 데이터는 도 3에 나타낸다. 도 3에서 AAV8.CB.fFIX_GLP1로 치료를 받은 당뇨병 마우스의 혈청 포도당 수준은 치료 후, 처리되지 않은 연령-정합된 당뇨병 (Db) 마우스보다 일관성이 적은 것을 보여준다.
실시예 5 - 다양한 구조체의 생체내 GLP-1 발현
AAV 매개된 GLP-1 발현에 대한 가능한 임상 후보를 분석하기 위하여 이 연구가 기획되었다. 인자 IX 퓨린 프로펩티드는 마우스에서 n-말단 절단된 glp1 (활성 glp-1)을 발현시킬 수 있다는 것을 이미 보여주었다. 그 다음 있을 수 있는 더 나은 구조체를 평가하기 위하여 6마리 야생형 검정 마우스에서 다양한 다른 구조체를 시험하였다. 코호느는 IV로 투여된 총 5 x1010 대응 벡터로 처리된 각 4마리 마우스이다. 트롬빈 퓨린 프로펩티드, 또다른 응고 인자는 인자 IX 및 만노시다제 퓨린 구조체보다 6마리 검정 마우스에서 활성이 더 큰 GLP-1를 생산하였다. 도 7.
실시예 6 - 고양이의 생체내 GLP-1 처리.
고객이 소유하는 6마리 동물에서 단일 용량의, 개방 라벨 파일롯 연구가 수행될 것이다. 포함 기준은 다음과 같다:
1. 최소한 2회 연속 측정에서 혈액 포도당 ≥ 200 mg/dL
2. 실험실 기준 범위 이상의 푸럭토사민(Fructosamine)
3. 대상은 인슐린 요법의 후보가 아님 (소유주가 치료 또는 기타 금기 사항을 제공할 수 없기 때문에)
4. 연구 프로토콜을 고수하고자 하는 소유자
배제 기준은 다음과 같다:
1. 고혈당증은 약물, 말단 비대증 등의 속발성으로 여겨진다.
2. 현재 인슐린 또는 경구용 저혈당 약물 사용
3. 제약 및 정맥천자를 수용하지 않음
4. 조사자의 의견으로는 대상에게 추가적인 위험을 초래하거나 연구 약물의 평가를 방해하는 임의의 상태.
상기 대상 동물은 0일째 1013 GC AAV8.CB7.thrGLP1을 제공받을 것이다. CBC/chem, 푸럭토사민, 포도당 곡선 및 혈청 GLP-1은 0, 14, 28, 42, 60, 90, 120, 150, 180 일차에 스크리닝에서 실행될 것이다.
실시예 7 - 건강한 고양이들에서 캡시드 및 투여량 비교
건강한 고양이에게 하기에서 설명된 GLP1을 발현시키는 벡터가 제공되었고, 90일차(d90) 까지 주단위로 Millipore 활성 GLP1 분석을 통하여 평가되었다. 분석용 혈액을 GLP1 보존 DPPIV 억제제 혈장 튜브(BD Biosciences, P700 혈장 튜브)에 수집하였다. CBC 및 화학 패널은 0일차, 14일차, 28일차, 42일차, 60일차 및 90일차에 취하였다. 90일 후 동물은 희생되었다.
디지털 비말 PCR (ddpcr)에 의해 측정하였을 때, AV8.CB7.CI.GLP1thrombin.rBG, 7x1012 gc/kg이 첫번째 고양이 코호트에 제공되었다. AAV3b.CB7.CI.GLP1thrombin.rBG, 7 x1012gc/kg (ddpcr)는 한 마리 고양이에게 제공되었다. AAV8.CB7.CI.GLP1thrombin.rBG 2 x1012 gc/kg (ddpcr)는 2 마리 고양이에게 제공되었다. glp1 활성 차이는 도 8에 나타낸다.
본 명세서에 인용된 모든 출판물 뿐만 아니라, 미국 가출원 62/201,803 및 62/356,289는 본원에 참고자료에 편입되어 있다. 유사하게, 본원에서 언급되고, 첨부된 서열 목록에 나타나는 서열 번호는 참고 문헌에 편입되어 있다. 본 발명은 특정 구체예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 수정이 이루어질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 안에 속하는 것으로 의도된다.

Claims (41)

  1. 선택된 종에서 당뇨병 치료에 유용한 바이러스 벡터에 있어서, 이 벡터는 프로펩티드 및 GLP-1을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하며, 여기에서, 발현되었을 때, GLP-1의 N-말단 아미노산은 상기 프로펩티드의 C-말단 아미노산의 바로 뒤에 있는, 바이러스 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 최소한 약 40개의 아미노산인, 바이러스 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 궁극적으로 벡터가 투여하기로 의도된 대상과 동일한 종으로부터 유래된, 바이러스 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 고양이 서열인, 바이러스 벡터.
  5. 청구항 3에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 개, 인간, 비-인간 영장류, 등의 서열인, 바이러스 벡터.
  6. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 바이러스 벡터는 고양이, 개 또는 인간에서 선택된 포유류를 치료하기 위하여 기획된, 바이러스 벡터.
  7. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 GLP-1 서열은 GLP-1의 활성 부분을 인코드하는, 바이러스 벡터.
  8. 청구항 7에 있어서, 여기에서 상기 GLP-1 서열은 아미노산 7-37을 인코드하는, 바이러스 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서, 여기에서 상기 GLP-1 서열은 서열 번호: 1 또는 이에 최소한 75% 동일한 서열인, 바이러스 벡터.
  10. 청구항 1에 있어서, 여기에서 GLP-1을 인코드하는 핵산 서열은 서열 번호: 2 또는 이에 최소한 60% 동일한 서열인, 바이러스 벡터.
  11. 청구항 10에 있어서, 여기에서 상기 서열 코돈은 고양이 또는 개 또는 인간 발현을 위해 최적화된, 바이러스 벡터.
  12. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 핵산 서열은 신호 펩티드 (프레펩티드) 및 프로펩티드를 모두 인코드하는, 바이러스 벡터.
  13. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 인자 IX 프로펩티드 또는 이의 변이체인, 바이러스 벡터.
  14. 청구항 13에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 고양이 인자 IX 프로펩티드 또는 이에 최소한 80% 동일한 서열인, 바이러스 벡터.
  15. 청구항 13에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드 서열은 인자 IX 서열의 아미노산 1-46을 인코드하는, 바이러스 벡터.
  16. 청구항 15에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드 서열은 서열 번호: 3인, 바이러스 벡터.
  17. 청구항 15에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드를 인코드하는 핵산 서열은 서열 번호: 4를 포함하는, 바이러스 벡터.
  18. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 알부민 프로펩티드인, 바이러스 벡터.
  19. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드는 응고 인자 II, VII, IX, X, 단백질 C, 및 단백질 S 단백질로부터 선택된 응고인자의 프로펩티드 부분인, 바이러스 벡터.
  20. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 프로펩티드 서열은 선택된 환자 종에 최적화된 코돈인, 바이러스 벡터.
  21. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 상기 프로펩티드 및 GLP-1의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 더 포함하는, 바이러스 벡터.
  22. 청구항 21에 있어서, 여기에서 상기 발현 제어 서열은 프로모터를 포함하는, 바이러스 벡터.
  23. 청구항 22에 있어서, 여기에서 상기 프로모터는 CB7 프로모터인, 바이러스 벡터.
  24. 청구항 21에 있어서, 여기에서 상기 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터를 포함하는, 바이러스 벡터.
  25. 청구항 24에 있어서, 여기에서 조직-특이적 프로모터는 간-특이적 프로모터인, 바이러스 벡터.
  26. 청구항 24에 있어서, 여기에서 상기 조직-특이적 프로모터는 티록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터 또는 림프구-특이적 단백질 1 (LSP1) 프로모터로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  27. 청구항 1에 있어서, 인트론, Kozak 서열, poly A, 및 전사-후 조정 요소들중 하나 또는 그 이상을 더 포함하는, 바이러스 벡터.
  28. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 벡터는 재조합 아데노-연합된 바이러스 (AAV) 벡터인, 바이러스 벡터.
  29. 청구항 26에 있어서, 여기에서 상기 벡터는 AAV8, rh64R1, AAV9, AAVhu.37, 또는 rh10 및 이의 변이체로부터 선택된 캡시드를 갖는 rAAV인, 재조합 벡터.
  30. 청구항 1에 있어서, 여기에서 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터, 통합(integrating) 벡터, DNA 및 RNA 나노입자로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  31. 약학적으로 수용가능한 운반체와 청구항 1 내지 30중 임의의 한 항에 따른 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물.
  32. 청구항 31에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 치료 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 여기에서 전술한 조성물은 정맥으로 투여되는, 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 여기에서 전술한 대상은 포유류인, 방법.
  35. 청구항 32에 있어서, 여기에서 전술한 대상은 고양이 또는 개인, 방법.
  36. 청구항 32에 있어서, 여기에서 전술한 대상은 고양이이고, 상기 프로펩티드는 고양이 서열인, 방법.
  37. 청구항 32에 있어서, 여기에서 전술한 조성물은 또다른 요법과 병용 투여되는, 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 여기에서 전술한 조성물은 인슐린 요법과 함께 투여되는, 방법.
  39. 청구항 32에 있어서, 여기에서 전술한 조성물은 약 1x1012 GC/kg의 투여량으로 투여되는, 방법.
  40. 청구항 32에 있어서, 여기에서 전술한 조성물은 1회 이상 투여되는, 방법.
  41. 내생성 GLP-1의 프로펩티드 및 활성 부분을 제공하는 단계를 포함하는, 대상에서 GLP-1의 순환 반감기를 증가시키는 방법에 있어서, 여기에서, 발현되었을 때, 상기 GLP-1의 N-말단 아미노산은 상기 프로펩티드의 C-말단 아미노산 바로 다음에 있는, 방법.
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