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KR20180055900A - 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스의 생산 방법 - Google Patents

고감염가 또한 고순도의 파보바이러스의 생산 방법 Download PDF

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KR20180055900A
KR20180055900A KR1020187012566A KR20187012566A KR20180055900A KR 20180055900 A KR20180055900 A KR 20180055900A KR 1020187012566 A KR1020187012566 A KR 1020187012566A KR 20187012566 A KR20187012566 A KR 20187012566A KR 20180055900 A KR20180055900 A KR 20180055900A
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Abstract

본 발명에서는, 파보바이러스의 감염가가 109 TCID50/mL 이상이며, 또한, 상기 파보바이러스의 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 5000 : 1 초과인, 비농축의 세포 배양 상청 유래의 파보바이러스 및 그러한 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스의 생산 방법을 제공한다.

Description

고감염가 또한 고순도의 파보바이러스의 생산 방법
본 발명은, 배양 상청 중에 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 얻어지는 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스에 관한 것이다.
바이러스는 인간을 포함하여 많은 동식물이나 미생물에 감염하고 증폭한다. 어느 것은 DNA를 게놈으로서 갖는 DNA 바이러스이고, 또 어느 것은 RNA를 게놈으로서 갖는 RNA 바이러스이고, 각 바이러스는, 각각에 상이한 증식 기구를 갖는다. 인간 등의 동물에 감염한 경우에, 바이러스 감염증을 야기하는 바이러스도 많다. 바이러스는 단독으로는 증식할 수 없고, 다른 동물·식물·미생물의 세포에 감염하여, 그 세포의 능력을 이용하여 증식할 수 있다. 바이러스가 감염하여 증식할 수 있는 세포를, 그 바이러스의 「숙주 세포」라고 부른다. 바이러스가 감염·증식할 수 있는 숙주 세포의 종류는 바이러스의 종류마다 정해져 있다.
파보바이러스는 소형의 단일가닥 DNA 바이러스이고, 직경 약 20 nm로 작은 정20면체 바이러스이고 엔벨로프를 갖지 않는다(비특허문헌 1). 파보바이러스는, 동물에 감염함으로써 질환을 야기한다. 상기 질환으로는, B19 파보바이러스가 인간에 야기하는 전염성 홍반이나 빈혈, 관절염 외에, 원숭이 파보바이러스(SPV)에 의한 빈혈, 고양이 파보바이러스(FPV)에 의한 고양이의 장염·백혈구 감소·실조증, 개 파보바이러스(CPV)에 의한 개의 장염·심근염, 돼지 파보바이러스(PPV)에 의한 돼지의 사산, 소 파보바이러스(BPV)에 의한 소의 장염, 거위 파보바이러스(GPV)에 의한 거위의 장염·심근염, 마우스 미소 바이러스(MVM)에 의한 마우스의 장염·간염 등이 알려져 있다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 파보바이러스는, 개나 고양이와 같은 인간이 기르는 동물의 병의 원인을 야기하는 병원체로서 중요하다. 개에 개 파보바이러스가 감염하면, 전술한 바와 같이 장염을 일으켜, 심한 설사나 구토를 발생하고, 사망하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3). 고양이가 파보바이러스에 감염하면, 급성 장염이나 백혈구 감소를 일으키는 경우가 있고, 이차 감염으로 사망할 가능성도 있고, 또한 태자나 신생자에 감염하면, 중추신경이나 흉선이 장해를 받아, 운동 실조를 일으키는 경우가 있는가 하면, 사망해 버리는 경우도 있다.
파보바이러스 감염증을 막기 위해 파보바이러스의 백신에 관한 연구가 이루어지고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2). 이들 연구에는, 바이러스를 생산하여 사용할 필요가 있다. 많은 바이러스는, 숙주 세포를 배양하고, 이것에 바이러스를 감염시킴으로써, 증식시켜, 생산할 수 있다. 바이러스를 약독화 혹은 불활화한 백신 생산도, 바이러스 생산과 동일한 순서에 의해 달성된다.
제약 업계에 있어서는, 유전자 재조합 의약품(바이오 의약품)이나 항체 의약품 등 생물 유래의 의약품이 바이러스에 오염되어 있지 않은 것(바이러스 안전성)을 보증하기 위해, 제조 공정의 바이러스 클리어런스(제거 성능)를 평가할 필요가 있다. 그 때문에 각 공정 전의 의약품 중간 제품에 바이러스를 첨가하여 공정 전후의 바이러스량을 정량함으로써, 개개의 공정이 갖는 바이러스 클리어런스의 측정이 행해지고 있다. 특히, 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스 평가에 사용되는 바이러스 종류의 선택 방법에 관하여 정한 ICH(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use: 일미 EU 의약품 규제 조화 국제 회의) 가이드라인에 기재된 방법으로 실시되는 혈장 분획 제제의 바이러스 클리어런스 평가에서는, 파보바이러스의 일종 돼지 파보바이러스(PPV: Porcine Parvovirus)가 고빈도로 사용되고, 바이오 의약품의 바이러스 클리어런스 평가에서는, 파보바이러스의 일종 마우스 미소 바이러스(MVM: Minute virus of mice)가 고빈도로 사용되고 있다. 이와 같이, 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스 평가에는 고빈도로 파보바이러스가 사용되고 있다.
바이러스를 생산하려면, 실험 동물을 이용하는 방법, 계란을 이용하는 방법, 조직 배양·배양 세포를 이용하는 방법이 있다(비특허문헌 4). 실험 동물이나 계란을 이용하는 방법은 고비용이라는 결점이 있다. 그것을 대신할 방법이 배양 세포를 이용하는 방법이다. 파보바이러스의 생산도, 배양 세포를 이용하는 방법으로 행해진다(특허문헌 1).
파보바이러스 등의 바이러스를 생산하기 위해서는, 숙주 세포의 배양계에 시드 바이러스를 감염시키고, 바이러스를 증식시켜 회수하는 방법이 일반적으로 행해진다. 여기서 말하는 시드 바이러스란, 바이러스 증식의 초기에 이용하는 소량의 바이러스를 「씨」로 가정한 호칭이다. 종래의 바이러스 생산에 있어서, 숙주 세포에 시드 바이러스를 감염시키는 타이밍은, 통상, 숙주 세포가 컨플루언트에 도달하고, 단층 상태를 형성한 단계이다(비특허문헌 4, 특허문헌 3∼6). 즉, 숙주 세포를 배양 용기에 접종하고, 증식시켜, 배양 용기 저면의 전면에 숙주 세포가 증식하여 퍼진 상태에서, 시드 바이러스를 접종하는 것이 통상적이지만, 그것은, 감염될 수 있는 세포가 고밀도로 존재하는 상황이, 보다 많은 바이러스를 생산하는 장을 제공하는 계이기 때문이다. 숙주 세포를 배양 용기에 접종하고 나서 이 컨플루언트의 상태가 될 때까지는, 통상 2∼3일 요한다(비특허문헌 4). 이 컨플루언트 상태에서는, 숙주 세포는 정상기이고, 그 이상 증식하지 않는다. 따라서, 종래 기술은, 숙주 세포의 증식 배양 공정을 완료한 후에, 그 이상 세포 증식이 일어나지 않는 배양 환경하에서 바이러스 감염을 개시하고, 바이러스 감염에 의해 숙주 세포가 사멸하는 것과 동시 진행으로 바이러스를 배양 상청 중에 생산한다고 하는 것이었다. 이러한 방법은, 파보바이러스에 있어서도 예외는 아니고, 컨플루언트 상태의 세포에 감염시키는 방법으로 바이러스 생산이 행해지고(비특허문헌 5, 비특허문헌 6), 얻어지는 파보바이러스의 감염가는 105∼107 TCID50/mL였다. 종래의 배양계에 있어서는, 가장 세포수가 많은 상태인 컨플루언트의 상태에서 숙주 세포에 파보바이러스가 첨가되고, 첨가된 파보바이러스는 숙주 세포 내에서 증식하고, 숙주 세포의 사멸을 수반하여 증가한다. 가장 파보바이러스 감염가가 높아지는 시기에 배양 상청을 회수함으로써, 가장 고감염가의 파보바이러스 용액을 회수할 수 있다. 이 방법으로 배양 상청 중에 얻어진 파보바이러스는, 당연히 세포 배양에 제공된 배지 중에 현탁한 상태로 회수된다.
또한, 상기한 바와 같이 하여 얻어진 파보바이러스 용액에 관하여, 불순물을 제거하는 것도 행해진다. 제거 방법으로서, 저속 원심 분리에 의해 세포의 파편 등의 불순물을 제거하는 것이 행해진다(비특허문헌 7).
WO2007/125605호 공보 일본 특허공표 평10-508485호 공보 일본 특허공개 2009-297036호 공보 일본 특허 제2655876호 공보 일본 특허공개 소58-22008호 공보 일본 특허공개 소61-24370호 공보
바이러스·세균 감염 new 파일 1997 나가이 요시유키·와타나베 하루오편, 요도샤: p.68 바이러스학 1997 하타나카 마사카즈편, 아사쿠라 서점: 222-223 M.Azetaka et.al 1980 Jpn.J.Vet.Sci.43:243-255 바이러스 실험학 총론 국립 예방 위생 연구소 학우회편 1973:61, 113, 131 및 166-176 P.A.Bachmann 1972 Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(140)4:1369-1374 P.A.Bachmann et al. 1976 Zbl.Vet.Med.B. No.23:355-363 바이러스 실험학 각론 1973 국립 예방 위생 연구소 학우회·편 22-23
상기한 바와 같이, 생물 유래의 의약품의 바이러스 안전성 평가나 백신 생산에 사용하기 위해, 높은 감염가의 파보바이러스를 생산할 것이 요구되고 있다.
또한, 상기에서 서술한 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스 평가에서도, 높은 감염가의 바이러스를 생산할 것이 요구되고 있다. 상기 평가를 위한 바이러스 제거 필터의 바이러스 클리어런스 시험은, 실생산 공정을 스케일 다운한 모델 공정에서 실시되는데, 이 바이러스 클리어런스 시험에 요구되는 점은, 첫째로, 필터의 눈막힘이 생기지 않는 정도의 바이러스 현탁액 첨가량일 것과, 둘째로, 평가하는 공정의 바이러스 클리어런스 수치인 대수 제거율(LRV)이 4 이상인 것을 나타낼 수 있는 첨가량일 것이다. 전자에 관해서는, 공정의 유속을 포함한 여러가지 파라미터가 실생산 공정과 동일해야 하기(WHO Technical Report, Series No.924, 2004 162-165) 때문에, 바이러스 첨가에 의한 눈막힘이 생기지 않는 첨가량으로 할 필요가 있다. 그러기 위해서는, 체적비로 1％ 이하, 바람직하게는 0.1％ 이하의 첨가가 바람직하다. 후자의 LRV에 관해서는, 4 이상 있는 공정이, 바이러스 제거에 관하여 견뢰성을 가져 효과적이고 신뢰성이 있는 공정(A Robust, effective and reliable process step)이라고 간주되는 점에서(WHO Technical Report, Series No.924, 2004 163-164), 4 이상을 결과로서 낼 수 있는 바이러스 첨가량으로 할 필요가 있다. 이와 같이, 바이러스 제거 성능으로서 LRV가 4 이상인 것을 나타낼 필요가 있고, 또한 중간 제품에 첨가하는 바이러스 현탁액의 양은 체적비로 1％ 이하, 바람직하게는 0.1％가 바람직하다. 그러나, 종래의 배양법으로 얻어지는 낮은 감염가의 파보바이러스(감염가는 105∼107 TCID50/mL, 파보바이러스의 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 10 미만 : 1)를 1％ 또는 0.1％ 첨가한 경우에는, 프리필터에서의 손실이나, 정량 오차의 문제로부터 LRV가 4 이상인 것을 나타내는 것이 곤란해진다. 이 때 LRV가 4 이상인 것을 확실하게 나타내기 위해서는, 바이러스 첨가 체적을 증가시켜야 하고, 그렇게 하면 필터의 눈막힘 등의 폐해가 일어나기 쉬워지는 문제가 있다.
또한, 바이러스 제거막의 새로운 평가 기준으로서, 단위 막면적당의 바이러스 부하량을 종래보다 증가시켰을 때의 바이러스 제거성이 최근 주목되고 있다. 이 평가에서는, 종래의 측정보다 많은 바이러스 용액을 여과하기 때문에, 첨가하는 바이러스 현탁액이 증가함에 따라, 바이러스 현탁액에 포함되는 불순물 단백질도 함께 보다 많이 여과되어 버리고, 필터의 눈막힘 등의 폐해가 일어날 가능성이 종래의 측정보다 높아진다. 그 때문에, 바이러스 용액에 포함되는 불순물 단백질 농도가 더욱 낮은 것일 것이 요구된다.
종래, 이러한 문제를 해결하기 위해, 초원심 분리에 의해 바이러스를 침전시키는 등의 조작으로 농축하는 수법이 가능했다. 그러나, 이들 수법에서는, 불순물도 동시에 농축되기 때문에, 실험의 결과나, 바이러스 제거 필터 여과시에 불순물의 악영향이 생겨 버리는 문제가 있다.
또한, 바이러스를 세슘 밀도 구배 초원심 방법이나 수크로오스 밀도 구배 초원심 등의 밀도 구배 초원심 분리에 의해 농축하는 기술은, 조작이 매우 번잡하고 어려운 숙련 기술이 요구된다. 덧붙여, 범용적인 초원심 분리기의 원심관의 체적이 율속이 되고, 스케일 업이 곤란하기 때문에, 일반적으로는 소규모의 실험에서밖에 행할 수 없고, 산업상 이들 농축 공정을 도입하는 것은 현실적이지 않다.
또한, 고감염가의 바이러스 현탁액을 얻기 위해, 감염 세포를 회수하고 동결 융해를 반복하여 세포를 강제적·물리적으로 파괴하여, 세포 내부에 축적한 바이러스를 회수하는 방법도 알려져 있다. 마우스 미소 바이러스 등에서 통상 행해지고 있는 바이러스 생산 방법이지만, 이 방법에서는 대량의 숙주 세포 내부의 불순물이 혼입되어 버린다.
이와 같이, 종래의 바이러스 생산 기술을 채용하는 것은 매우 곤란하여, 복잡한 조작인 초원심 분리 등의 농축 조작을 이용하지 않고, 보다 간편하고 효율적으로, 고순도의 고감염가의 파보바이러스를 얻는 방법이 요구되고 있다.
본 발명자는, 우선, 종래 채용되고 있지 않았던 매우 낮은 특정 범위의 세포 밀도의 숙주 세포에, 특정 범위가 낮은 감염 다중성(MOI)으로 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염시키고, 추가로, 특정 기간 숙주 세포를 배양하고 배양 상청을 회수함으로써, 파보바이러스 특유의 증식 기구를 이용하여, 종래법보다 높은 감염가의 파보바이러스가 얻어지는 것을 알아냈다(WO2014/080676).
본 발명자들은, 추가로 상기 과제를 해결하기 위해, 숙주 세포에 파보바이러스의 시드 바이러스를 접종하고, 파보바이러스를 증식시키는 배양계에 있어서의 여러가지 조건(초기 숙주 세포 밀도나 배지 교환 시기를 포함한 배양 시간)과 얻어지는 바이러스 감염가 및 순도와의 관계에 관하여 예의 검토한 결과, 놀랍게도, 종래 채용되고 있지 않았던 산출법을 이용하여 숙주 세포의 감염시 세포수를 결정하고, 추가로, 특정 기간 숙주 세포를 배양 후, 배양 상청을 한 번 무혈청 배지로 교환하고, 특정 기간 추가 배양 후에 배양 상청을 회수한다고 하는 종래 행해지고 있지 않았던 방법을 채용함으로써, 종래법에서는 얻어지지 않은 매우 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 것을 알아내기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1]
고감염가 또한 고순도의 파보바이러스의 생산 방법으로서,
(a) 숙주 세포가 파보바이러스에 감염된 때의 배양 기재의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화를, 감염시 세포 밀도(A)마다 사전에 별도 산출해 두는 공정과,
(b) 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 세포 밀도의 경시 변화로부터,
(b1) 감염으로부터, 세포 밀도의 경시 변화의 피크시까지의 시간(Tmax)과,
(b2) Tmax에 있어서의 세포 밀도(Bmax)와 A가 이하의 식(1)을 만족하는 A1과,
(b3) 그러한 A1 중 최대의 감염시 세포 밀도(Amax)와,
(b4) 이하의 식(2)를 만족하는 A2
를 결정하는 공정과,
Bmax/A1 ＞ 1.2 식(1)
Amax ≥ A2 ≥ Amax/10 식(2)
(c) 공정(b)의 (b4)에서 결정한 A2의 감염시 세포 밀도의 숙주 세포와 혈청 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.001∼0.1이 되도록 접종하는 공정과,
(d) 공정(c)에서 얻어진 숙주 세포와 파보바이러스를 포함하는 배양물을, 공정(b)의 (b1)에서 결정한 Tmax 이상 Tmax＋48시간 미만의 시간 배양하는 공정과,
(e) 공정(d)의 배양 상청을 무혈청 배지로 교환하고, 12시간 이상 배양하는 공정과,
(f) 공정(e)의 배양에 의해 얻어지는 파보바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하는 공정
을 포함하고, 상기 공정(b)에 있어서, 식(1)을 만족하는 A가 존재하지 않는 경우, 별도의 감염시 세포 밀도 A를 채용하여 공정(a) 및 공정(b)를 재차 실시하는, 방법.
[2]
상기 숙주 세포가 접착 의존성 세포인, [1]에 기재된 방법.
[3]
상기 파보바이러스가, 돼지 파보바이러스(PPV), 개 파보바이러스(CPV), 마우스 미소 바이러스(MVM), 래트 바이러스(RV), H-1 바이러스(H-1), 고양이 파보바이러스(FPV), 거위 파보바이러스(GPV), 또는 소 파보바이러스(BPV)인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4]
상기 공정(e)가, 배양 상청을 무혈청 배지로 교환하고, 24시간 이상 배양하는 공정인, [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5]
상기 공정(b)가, Bmax와 A가 이하의 식(1’):
Bmax/A1' ≥ 2.0 식(1’)
를 만족하는 A1'를 산출하는 공정을 포함하는, [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6]
상기 공정(d) 및 (e)에 있어서의 배양이, 33℃ 이상 39℃ 이하의 온도에서 실시되는, [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 파보바이러스의 생산 방법.
[7]
상기 공정(d) 및 (e)에 있어서, 상기 숙주 세포와 상기 파보바이러스가 동시 진행으로 증식하는, [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 파보바이러스의 생산 방법.
[8]
상기 공정(f)가, 상기 배양 상청에 포함되는 유리의 숙주 세포와 숙주 세포의 파편을 제거하는 공정을 포함하는, [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9]
상기 제거 공정이, 공경 0.2 ㎛∼0.45 ㎛의 막여과를 이용하여 행해지는, [8]에 기재된 방법.
[10]
[1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 109 TCID50/mL 이상의 감염가의 파보바이러스.
[11]
파보바이러스의 감염가가 109 TCID50/mL 이상이며, 또한, 상기 파보바이러스의 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 5000 : 1 초과인, 비농축의 세포 배양 상청 유래의 파보바이러스.
본 발명에 의해, 세포 배양으로 간편하고 효율적으로, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어진다. 이에 따라, 파보바이러스 사용시의 감염가 부족 및 불순물 단백질에서 기인하는 폐해를 해소하는 것이 가능해진다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태(이하, 「본 실시형태」라고 함)에 관하여 상세히 설명한다. 또, 본 발명은, 이하의 실시형태에 한정되는 것이 아니라, 그 요지의 범위 내에서 여러가지로 변형하여 실시할 수 있다.
본 실시형태는, 109 TCID50/mL 이상의 고감염가 또한, 불순물 단백질 농도에 대한 바이러스 감염가가 5000(TCID50/mL)/(ng/mL) 이상인 고순도의 파보바이러스를 생산하는 방법으로서,
(a) 숙주 세포가 파보바이러스에 감염된 때의 배양 기재의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화를, 감염시 세포 밀도(A)마다 사전에 별도 산출해 두는 공정과,
(b) 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 세포 밀도의 경시 변화로부터,
(b1) 감염으로부터, 세포 밀도의 경시 변화의 피크시까지의 시간(Tmax)과,
(b2) Tmax에 있어서의 세포 밀도(Bmax)와 A가 이하의 식(1)을 만족하는 A1과,
(b3) 그러한 A1 중 최대의 감염시 세포 밀도(Amax)와,
(b4) 이하의 식(2)를 만족하는 A2
를 결정하는 공정과,
Bmax/A1 ＞ 1.2 식(1)
Amax ≥ A2 ≥ Amax/10 식(2)
(c) 공정(b)의 (b4)에서 결정한 A2의 감염시 세포 밀도의 숙주 세포와 혈청 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.001∼0.1이 되도록 접종하는 공정과,
(d) 공정(c)에서 얻어진 숙주 세포와 파보바이러스를 포함하는 배양물을, 공정(b)의 (b1)에서 결정한 Tmax 이상 Tmax＋48시간 미만의 시간 배양하는 공정과,
(e) 공정(d)의 배양 상청을 무혈청 배지로 교환하고, 12시간 이상 배양하는 공정과,
(f) 공정(e)의 배양에 의해 얻어지는 파보바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하는 공정
을 포함하고, 상기 공정(b)에 있어서, 식(1)을 만족하는 A가 존재하지 않는 경우, 별도의 감염시 세포 밀도 A를 채용하여 공정(a) 및 공정(b)를 재차 실시하는 방법에 관한 것이다.
공정(a): 우선, 파보바이러스 숙주 세포가 파보바이러스에 감염된 때의 배양 기재의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화를, 감염시 세포 밀도(A)마다 사전에 별도 산출한다.
또, 숙주 세포는, 계대 배양에 의해 증식시킬 수 있다.
파보바이러스는 소형의 선상 단일가닥 DNA 바이러스이다. DNA 바이러스는, 게놈으로서 DNA를 갖는 바이러스이고, 숙주 세포의 RNA 폴리메라아제를 이용하여 게놈 DNA로부터 mRNA를 합성하고, 상기 mRNA를 바탕으로 단백질을 합성하여 증식한다. DNA 바이러스의 대부분은, 이중가닥 DNA 바이러스이지만, 파보바이러스는 선상 단일가닥 DNA를 게놈으로서 갖는다. 단일가닥 DNA의 상태에서는 바이러스 증식은 할 수 없기 때문에, 파보바이러스는, 숙주 세포의 RNA 폴리메라아제에 더하여, DNA 폴리메라아제를 이용하여 이중가닥 DNA의 상태를 거쳐 증식한다고 하는 특유의 증식 기구를 갖는다.
파보바이러스과(Parvoviridae) 바이러스는, 파보바이러스 아과에 속하는 3개의 속, 즉, 바이러스 복제에 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않고 숙주 세포 내에서 자율적으로 증식하는 파보바이러스속(Parvorivirus), 헬퍼 바이러스를 필요로 하는 디펜도바이러스속(Dependovirus), 및 적혈구 특이적으로 감염하는 에리트로바이러스속(Erythrovirus)과, 덴소바이러스 아과에 속하는 3개의 속, 곤충에 감염하는 덴소바이러스속(Densovirus), 이테라바이러스속(Iteravirus), 및 브레비 덴소바이러스속(Aedes aegypti densovirus)이 알려져 있다. 본 실시형태에 있어서의 「파보바이러스」란, 파보바이러스속의 바이러스를 말한다. 파보바이러스속의 바이러스는 전부 유사한 증식 기구를 갖기 때문에, 본 실시형태의 방법을 공통되게 이용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 파보바이러스속의 바이러스는, 증식을 정지하고 있는 세포(휴지 세포)의 DNA 대사를 유도하기 위한 보조 단백질을 갖지 않고, 또한, 이중가닥의 전사 주형도 갖지 않기 때문에, 숙주 세포의 DNA 합성 기구가 S 기의 개시와 함께 활성화되고, 숙주 세포로부터의 DNA 상보쇄의 제공이 있을 때까지, 자기의 유전자를 발현할 수 없다. 이러한 구조의 파보바이러스속의 바이러스는, 증식을 정지하고 있는 세포의 DNA 대사를 유도하여 그 합성계를 이용할 수 없기 때문에, 분열 증식하고 있는 S 기의 세포에 감염하고, 세포의 증식에 따라 증식하는 증식 기구를 갖는다.
본 실시형태에 있어서의 파보바이러스(파보바이러스속 바이러스)에는, 한정하는 것은 아니지만, 돼지 파보바이러스(Porcine Parvovirus PPV), 개 파보바이러스(Canine Parvovirus CPV), 마우스 미소 바이러스(Minute Virus of Mice MVM), 래트 바이러스(Rat Virus RV), H-1 바이러스(H-1 Virus H-1), 고양이 파보바이러스(Feline Parvovirus FPV), 거위 파보바이러스(Goose Parvovirus GPV), 소 파보바이러스(Bovine Parvovirus BPV)가 포함된다. 이들 바이러스는, 유사한 크기, 게놈 구조, 바이러스 입자 구조, 증식 기구를 갖고 있고, 전부 본 실시형태의 방법에 있어서 적합하게 사용 가능하다.
본 실시형태에 있어서 「파보바이러스」란, 특별한 언급이 없는 한, 파보바이러스 및 이것을 포함하는 파보바이러스 용액 모두를 가리킨다. 파보바이러스 용액은, 파보바이러스를 포함하는 한 특별히 한정되지 않고, 예컨대 파보바이러스를 감염시킨 숙주 세포를 배양 후의 배양 상청 및 이 배양 상청으로부터 불순물 제거 후의 바이러스 현탁액을 포함한다.
본 실시형태에 있어서의 「숙주 세포」는, 상기한 파보바이러스에 감수성이 있는(파보바이러스에 감염될 수 있는) 세포이면 그 종류는 한정되지 않는다. 파보바이러스에 감수성이 있는 세포로는, 예컨대, 돼지 파보바이러스에 감수성이 있는 PK-13 세포, PK-15 세포, LCC-PK1 세포, ESK(embryonic swine kidney) 세포, SK 세포, ST(swine testes) 세포 및 MPK(Minipig kidney) 세포, 개 파보바이러스에 감수성이 있는 MDCK(Mardin-Darby canine kidney) 세포, FEA(feline embryonic fibroblasts) 세포, CRFK(Crandell feline kidney) 세포 및 FK-81 세포(embryonic feline kidney), 마우스 미소 바이러스에 감수성이 있는 A9(mouse fibroblast) 세포 및 C6(rat glial) 세포, 래트 바이러스에 감수성이 있는 NRK(normal rat kidney) 세포, H-1 바이러스에 감수성이 있는 Molt-4(human T-cell) 세포, AV-1(human B-cell) 세포 및 NC-37(human B-cell) 세포, 고양이 파보바이러스에 감수성이 있는 CRFK 세포, Mya 1 세포, NLFK(Norden Laboratories Feline Kidney) 세포 및 A72 세포, 거위 파보바이러스에 감수성이 있는 GEF(goose embryo fibroblast) 세포, 소 파보바이러스에 감수성이 있는 BEK(bovine embryonic kidney) 세포, 버팔로 폐 선유아세포 및 EBTr(bovine embryonic trachea) 세포 등을 들 수 있다. 숙주 세포는, 바람직하게는, 감염에 의해 세포 변성을 일으키는 세포를 이용할 수 있다. 예컨대, 돼지 파보바이러스의 경우는 돼지의 신장 세포, 개 파보바이러스의 경우는 개 신장 세포를 이용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 상기한 바와 같이, 파보바이러스에 대하여 감수성이 있고, 적합하게는 세포 변성을 일으키는 세포이면 널리 적용 가능하다. 또한, 본 실시형태에 있어서 「숙주 세포」로는, 무한 증식능을 가진 동물 세포를 이용할 수 있고, 일반적으로 「세포주(Cell line)」라고 불리는 것을 이용할 수 있다.
본 실시형태에 있어서, 숙주 세포는, 배지 교환이 용이하다는 관점에서, 접착 의존성 세포인 것이 바람직하다. 「접착 의존성 세포」란, 근 세포나 장기 세포와 같이 배양 기질에 접착한 상태가 아니면 생존·증식할 수 없는 세포이다. 접착 의존성 세포는, 배양 플라스크 등의 배양 기재의 저면·벽면이나, 마이크로캐리어라고 불리는 담체에 부착시켜 배양된다. 플라스크나 샬레는 일반적으로 소스케일 배양에 이용된다. 마이크로캐리어를 이용한 배양은, 축차 스케일 업이 용이한 이점이 있다(일본 특허 제3982843호 다공질 담체를 이용한 동물 세포의 축차 배양 방법). 또한, 본 실시형태에 있어서, 부유성 세포를 이용할 수도 있다. 「부유성 세포」는, 부유 상태에서 증식하고, 배지 중에 현탁시킨 상태에서 정치 또는 교반하여 배양된다. 부유성 세포에서는, 배양 상청을 회수하기 전에 배지 교환을 행하는 것이 곤란해지기 때문에, 예컨대 마이크로캐리어에 부착시켜 배양하는 것이 바람직하다.
본 실시형태에 있어서 「배양 기재」는, 그 종류가 한정되는 것은 아니고, 배양 용기, 배양 플라스크, 샬레, 롤러 보틀, 배양 플레이트 등, 세포 배양에서 통상 이용되는 임의의 배양 기재가 포함된다.
배양은, 둘베코 개변 이글 배지(DMEM 배지), 이글 배지(MEM 배지), F-12 배지 등 기술 분야에서 통상 이용되는 배지, 적합하게는 둘베코 개변 이글 배지(DMEM 배지)를 이용하고, 5％ 정도의 이산화탄소 가스 환경하에서 행할 수 있지만, 숙주 세포의 증식에 알맞은 환경 배양 조건이면, 이것에 한정되는 것은 아니다. 배양 온도는, 숙주 세포의 증식에 알맞은 온도로 할 수 있다. 파보바이러스의 숙주 세포는 33℃∼39℃의 범위에서 증식하는 것이 알려져 있기 때문에(「동물 세포 배양법 입문(생물 화학 실험법 29) 마츠야 유타카저/학회 출판 센터」 p.14-15), 바람직하게는, 배양 온도는 33℃ 이상 39℃ 이하, 예컨대 약 37℃로 할 수 있다. 또, 세포 증식 인자를 포함하는 동물 혈청(소 태아 혈청이나 송아지 혈청, 말 혈청 등)을 10％ 이하의 비율로 포함하는 배지를 사용하는 것이 바람직하고, 후술하는 공정(c) 및 (d)에 있어서의 배지와 동일한 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
본 실시형태에 있어서 「감염가」란, 바이러스 감염 역가를 나타내는 단위이고, 바이러스 업계에서 종종 사용되는 「타이터(Titer)」와 동의이다. 바이러스는 광학 현미경을 이용해도 볼 수 없기 때문에, 생물 세포와 같이 현미경으로 밀도(개수/체적)를 계측할 수 없다. 따라서, 바이러스의 경우는 숙주 세포에 대한 감염능을 이용한 감염 역가를 단위로 하여, 그 양이나 농도의 대체로 한다. 예컨대, 숙주 세포의 단층에 대하여 적당한 배율로 희석한 바이러스 현탁액을 첨가하면, 바이러스의 개수가 플라크로서 검출되고, 플라크 형성 단위(plaque forming unit = pfu)/mL로서 감염 역가를 측정할 수 있다. 혹은, 바이러스가 포함되어 있는 액체의 희석을 진행시켜 나가, 숙주 세포에 대한 감염 양성을 발생하는 비율이 50％가 되는 농도를 50％ 감염량(tissue culture infectious dose = TCID50)/mL로서 감염 역가를 측정할 수 있다. 본 실시형태에 있어서, 사용하는 파보바이러스는 모두 TCID50/mL로서 감염 역가를 측정할 수 있고, TCID50/mL로서 감염 역가를 표기할 수 있다. 또, pfu/mL 등의 다른 단위에 의해 파보바이러스의 감염 역가를 나타내도 좋다. 다른 단위로 감염 역가를 측정할 수 있는 파보바이러스에 있어서는, 동일한 파보바이러스 현탁액을 동시에 쌍방의 단위로 감염 역가 측정함으로써, 상이한 단위 사이의 환산을 용이하게 실시할 수 있다.
본 실시형태에 있어서 「숙주 세포가 파보바이러스에 감염된 때의 배양 기재의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화」의 산출은, 배양 용기 중에 있어서 특정한 다중 감염성(MOI)으로 파보바이러스에 감염시킨 숙주 세포를 접종한 후, 24시간마다 세포를 회수하여 배양 기재 중의 세포수를 계측함으로써 행할 수 있다. 여기서 「감염 다중성」이란, 숙주 세포수에 대한 바이러스의 첨가량의 비율이고, 바이러스 감염가/숙주 세포수로 표시된다. 숙주 세포에 파보바이러스가 감염 후, 세포는 우선 증식하여 배양 기재 중의 세포 밀도는 증가한다. 일정 기간 후, 세포는 바이러스에 의한 감작에 의해 사멸을 시작하기 때문에, 세포 밀도는 피크를 맞이하고 그 후 감소한다. 이러한 경시 변화를, 숙주 세포가 파보바이러스에 감염된 때의 감염시 세포수마다 산출한다.
세포수의 산출은 당업자에 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있고, 예컨대, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 우선 세포 기재에 접착한 세포에, 소량의 트립신 등의 단백질 분해 효소나 EDTA 등의 킬레이트제 또는 이들의 혼합액을 첨가하고 숙주 세포를 배양 용기로부터 박리한다. 박리된 세포 용액을 혈청을 포함하는 배지로 희석하고, 세포 박리 작용을 억제한 후, 혈구 계산반 등에 희석 후의 용액을 주입하고, 현미경 하에서 세포수를 계측한다. 셀 소터 또는 셀 카운터로 세포수를 계측할 수도 있다.
본 실시형태의 공정(a)에 있어서, 복수의 상이한 감염시 세포 밀도(A)의 각각에 관하여, 감염 후의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화를 산출한다. 공정(a)에 있어서의 감염시 세포수의 선정 방법은, 후술하는 공정(b)에 있어서, 식(1)을 만족하는 A를 선정할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 공정(b)에 있어서 식(1)을 만족하는 A가 존재하지 않는 경우, 상이한 A를 채용하여 공정(a) 및 (b)를 재차 실시할 수 있다.
일양태에 있어서, 예컨대, 숙주 세포의 컨플루언트 상태의 세포 밀도(이하 C로 함)를 기준으로 하여, C∼C/100 정도, 예컨대, C, C/3, C/10, C/30 및 C/100 정도를 A로서 선정할 수 있다.
공정(b): 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 세포 밀도의 경시 변화로부터, 적절한 감염시 세포 밀도를 결정한다.
(b1) 파보바이러스에 감염된 숙주 세포는, 감염 후 일정 기간 동안은 증식하지만, 피크에 도달한 후에는 바이러스에 의한 감작에 의해 사멸해 가기 때문에, 우선, 감염으로부터 세포 밀도의 경시 변화의 피크시까지의 시간(Tmax)을 결정한다.
(b2) 다음으로, Tmax에 있어서의 세포 밀도(Bmax)와 A가 이하의 식(1)을 만족하는 A1을 결정한다.
Bmax/A1 ＞ 1.2 식(1)
파보바이러스 특유의 증식 기구에서는, 바이러스와 숙주 세포가 동시 증식하기 때문에, 감염시 세포수(A)로부터 피크시의 Tmax까지 세포가 1.2 초과, 예컨대 1.5배 이상, 바람직하게는 1.75 이상, 보다 바람직하게는 2.0배 이상으로 증식하는 것과 같은 감염시 세포수 A1이 적절한 것으로 생각된다. 이것은 이론에 속박되는 것은 아니지만, A가 지나치게 큰 경우, 컨플루언트 상태의 세포수에 가까워지기 때문에 숙주 세포 자체가 증식할 수 없고 Bmax/A가 작아지는 경향이 있고, 1세포당의 바이러스 생산량이 낮아지기 때문인 것으로 생각된다.
(b3) 다음으로, 그러한 A1 중 최대의 감염시 세포 밀도(Amax)를 결정하고,
(b4) 이 Amax로부터, 이하의 식(2)를 만족하는 A2를 결정한다.
Amax ≥ A2 ≥ Amax/10 식(2)
A가 지나치게 작은 경우, 피크시의 세포 밀도(Bmax)는 배양 기재의 제한을 받는 경우가 없기 때문에 Bmax/A는 높은 값으로 일정해지고 1세포당의 바이러스 생산량은 한계점이 된다. 한편으로 바이러스 농도는 숙주 세포의 수에 의존하기 때문에, A가 작아질수록 바이러스 농도는 낮아지는 경향이 있는 것으로 생각된다.
그 때문에 적절한 감염시의 세포수 A는, 공정(a)에 있어서 선정한 몇갠가의 A 중, Bmax/A가 식(1)을 만족하는 A1 중에서 최대의 A(Amax)인 것으로 생각된다. 또한, 이 Amax로부터 감염시 세포 밀도를 1/10 정도 낮춰도 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 회수할 수 있는 것으로 생각된다. 이것은, 이론에 속박되는 것은 아니지만, A가 Amax로부터 다소 감소하더라도 A의 감소에 대응하여 1세포당의 바이러스 생산량이 높아지기 때문에, 최종적으로 얻어지는 파보바이러스 농도가 변하지 않기 때문인 것으로 생각된다.
공정(c): 계속해서, 공정(b)에 있어서 결정한 A2의 적절한 세포 밀도의 숙주 세포와 혈청 배지를 포함하는 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 MOI가 0.001∼0.1이 되도록 접종한다.
공정(c)에 있어서는, 우선, A2보다 적은 세포 밀도로 숙주 세포를 미리 세포 기재에 접종시켜 두고 일정 시간 배양 후에 A2의 세포 밀도로 하거나, 혹은 A2의 세포 밀도가 되는 양의 숙주 세포 함유 혈청 배지를 배양 기재에 접종함으로써 배양 기재를 조제할 수 있다. 혈청 배지로는, 둘베코 개변 이글 배지(DMEM 배지), 이글 배지(MEM 배지), F-12 배지 등에, 소 태아 혈청, 송아지 혈청, 말 혈청 등의 동물 혈청을 예컨대 0.5％∼15％, 바람직하게는 1％∼10％ 포함하는 배지를 이용할 수 있다.
본 실시형태에서는, 비바이러스 감염의 숙주 세포의 배가 시간이나 컨플루언트 상태의 파라미터가 아니라, 상기한 바와 같이, 파보바이러스에 감염된 숙주 세포의 세포 밀도의 경시 변화로부터 감염시 세포수를 결정하는 것이 중요한 특징이다. 파보바이러스의 경우, 종래의 바이러스 생산 방법의 상식인 컨플루언트 상태의 숙주 세포에 바이러스를 감염시키는 방법에서는, 숙주 세포의 증식은 보이지 않고, 숙주 세포는 감염에 의한 세포 변성을 거쳐 사멸로의 일로를 걸을 뿐이었던 데 반하여, 본 실시형태에서는, 파보바이러스 감염 후에도 숙주 세포가 일정 배율 이상 증식하는 여유를 남긴 숙주 세포 밀도로 바이러스 감염시킴으로써, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 얻는 것에 성공했다. 과거의 지견으로서 매우 낮은 세포 밀도로 감염을 개시하여 숙주 세포 증식과 파보바이러스 증식을 동시 진행시키는 기술이 존재하지만(WO2014/080676), 본 실시형태에 의하면, 이러한 기술보다 더욱 고감염가 또한 고농도의 파보바이러스를 얻을 수 있다.
다음으로, 공정(c)에 있어서, 상기한 바와 같이 조제한 A2의 세포 밀도의 숙주 세포를 포함하는 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.001∼0.1이 되도록 접종한다. 파보바이러스의 시드 바이러스의 접종은, 상기한 숙주 세포를 배양 기재에 접종하는 것과 동시에 MOI가 0.001∼0.1이 되도록 시드 바이러스를 접종해도 좋고, 보다 낮은 세포 밀도로 숙주 세포 배양을 개시하고, 상기한 A2의 세포 밀도가 된 시점에서 MOI가 0.001∼0.1이 되도록 시드 바이러스를 접종해도 좋다. 상기 소정의 MOI의 범위는 일반적으로 파보바이러스를 증식시킬 때에 사용되는 값의 범위이고, 범위 내이면 고농도 고순도의 바이러스를 회수한다고 하는 목적에 영향을 주지 않는다.
공정(d): 파보바이러스의 시드 바이러스의 접종 후, 상기 파보바이러스와 숙주 세포를 포함하는 배양물을 소정 시간 배양한다. 공정(d)에 있어서, 숙주 세포와 파보바이러스가, 동시 진행으로 증식한다. 배양 시간은, 상기 공정(b)의 (b1)에서 결정한, 바이러스 감염으로부터 세포 밀도의 경시 변화의 피크시까지의 시간(Tmax) 이상 Tmax＋48시간 미만의 시간이고, 예컨대 Tmax 이상 Tmax＋36시간 이하의 시간이고, 바람직하게는 Tmax 이상 Tmax＋30시간 이하의 시간이고, 보다 바람직하게는 Tmax 이상 Tmax＋24시간 이하의 시간이다. 상기 소정 시간의 배양 중, 숙주 세포에 감염한 시드 바이러스의 대부분은, 숙주 세포 중에서 숙주 세포의 기능을 빌려 스스로를 복제하고, 세포 내에 머물러 있다.
공정(e): 공정(d)에 있어서 소정 시간 배양한 배양 상청에는, 혈청 유래의 불순물 단백질이 많이 포함되지만, 바이러스에 감염된 숙주 세포의 대부분은 배양 기재에 접착한 채이다. 본 실시형태에서는, 배양에 이용한 혈청 배지를 무혈청 배지로 교환함으로써, 불순물 단백질을 제거하고, 고순도의 파보바이러스를 회수할 수 있다. 무혈청 배지로는, 상기 공정(d)에 관하여 기재한 배지에 혈청을 첨가하지 않는 것을 이용할 수 있다.
배지 교환 후, 12시간 이상, 바람직하게는 18시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상 배양함으로써, 바이러스에 감염되어 있었던 숙주 세포로부터 바이러스가 방출되고, 바이러스를 포함한 배양 상청이 얻어진다. 또한, 배지 교환 후 36시간 이상 배양해도 얻어지는 파보바이러스의 감염가에 영향은 없는 것으로 생각된다. 따라서, 배양 비용의 면에서 배지 교환 후의 배양 시간은 36시간 이하로 하는 것이 바람직하다.
공정(d) 및 (e)에 있어서의 배양시의 배양 온도는, 숙주 세포의 증식에 알맞은 온도로 할 수 있고, 바람직하게는 33℃ 이상 39℃ 이하, 예컨대 약 37℃로 할 수 있다. 또한, 공정(a)에 있어서의 배양 조건과 동일한 조건에서 배양하는 것이 바람직한 점에서, 공정(a)에 있어서 파보바이러스에 감염된 숙주 세포의 세포 밀도를 사전에 산출했을 때의 배양 온도와 동일한 정도의 배양 온도로 하는 것이 바람직하다.
공정(f): 상기 소정 시간 배양한 후, 파보바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수한다. 또, 종래법으로서, 감염 숙주 세포를 동결 융해의 반복 등으로 감염 숙주 세포를 파괴하고, 바이러스를 회수하는 방법이 있지만, 이 방법에서는 파괴시에 숙주 세포 내부의 불순물이 대량으로 방출되어 버린다. 한편, 본 실시형태와 같이, 배양 상청을 회수하는 방법에서도 바이러스 감염에 의해 붕괴된 숙주 세포 유래의 불순물이 혼입되기는 하지만, 불순물량은 숙주 세포의 동결 융해 파괴를 행한 경우보다 현저히 적다. 또한, 파보바이러스 및 숙주 세포의 배양 상청을 무혈청 배지로 교환함으로써, 혈청 배지만으로 배양한 경우보다 혈청 유래의 불순물량도 현저히 적어진다. 따라서, 본 실시형태에서는, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 배양 상청으로부터 간편히 회수할 수 있다.
상기한 본 실시형태의 방법에 의해, 109 TCID50/mL 이상의 고감염가 파보바이러스를 얻을 수 있다.
공정(f)의 회수는, 유리의 숙주 세포나 숙주 세포의 파편 등의 불순물 등을 제거하는 공정을 포함할 수 있고, 이 제거 공정은, 이미 알려진 조건에서의 저속 원심 분리에 가함으로써 실시할 수 있다. 혹은/추가로, 공경 0.1∼0.5 ㎛, 바람직하게는, 0.2∼0.45 ㎛의 막여과에 의해 불순물을 제거할 수 있다.
공정(f)의 회수는, 바람직하게는, 배양 상청을 농축하지 않고 행할 수 있다. 이에 따라, 후술하는 농축에 따르는 불순물의 농축이 일어나지 않고, 고순도의 파보바이러스를 용이하게 얻을 수 있다.
상기한 바와 같이, 파보바이러스의 배양·회수를 행함으로써, 파보바이러스의 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 5000 : 1 초과, 바람직하게는 9000 : 1 초과인 고순도의 파보바이러스를 얻을 수 있다. 「불순물」로는, 유리의 숙주 세포나 숙주 세포의 파편, 숙주 세포나 혈청 성분에서 유래되는 단백질 등을 들 수 있지만, 유리의 숙주 세포나 숙주 세포의 파편은 사이즈가 크고, 상기한 원심 분리나 여과 등의 이미 알려진 방법으로 용이하게 제거할 수 있기 때문에, 본 실시형태의 일양태에 있어서는, 단백질 농도를 불순물의 존재 비율을 나타내는 지표로서 이용한다.
불순물 단백질 농도의 측정은, 당업자에 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있고, 예컨대, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 시판되는 프로테인 앗세이 시약 등을 이용하여 BCA 법에 의해 행할 수 있다.
본 실시형태는 또한, 고순도 또한 고감염가의, 비농축의 세포 배양 상청 유래의 파보바이러스에 관한 것이다.
본 실시형태에 있어서 농축이란, 농축 전과 비교하여 농축 후의 바이러스 농도가 증가하는 것, 즉 감염가가 증가하는 것을 가리킨다. 일양태에 있어서, 본 실시형태의 파보바이러스는, 이러한 농축을 거치지 않고 배양 상청으로부터 얻어진, 농축에 따르는 불순물의 농축이 없는 고순도의 파보바이러스이다.
구체적으로는, 농축 조작으로는, 세슘 밀도 구배 초원심, 수크로오스 밀도 구배 원심 등의 밀도 구배 원심; 초원심 분리; 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피; 초여과; 탄젠셜 플로우 여과; 화학 유도성 침전; 바이러스 흡착형 크로마토그래피; 폴리머 유도성 응집; 막 흡착 등을 들 수 있다.
농축 이외의 조작으로는, 초원심 분리가 아닌 원심 분리(10,000 xg 이하 또한 100,000 xg·h 이하의 원심 분리), 제균 막여과 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 후술하는 실시예에 있어서의 정제 조작을 들 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 실시형태에 의해 불순물 단백질 농도가 낮은 고순도 또한 109 TCID50/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스가 얻어지고, 파보바이러스 사용시의 여러가지 감염가 부족에서 기인하는 폐해를 해소하는 것이 가능해진다. 이하, 대표적인 3가지 용도에 관련하여 서술한다.
첫번째 용도, 즉 바이러스를 항바이러스약 탐색 등의 연구 용도로 사용하는 경우, 불순물의 존재는, 원하는 반응을 저해하는 등의 악영향을 미칠 우려가 있다. 따라서, 실제로 시험에 제공하는 바이러스 감염가보다 높은 감염가의 바이러스를 생산해 두고, 불순물이 영향을 주지 않는 정도로까지 희석하여 연구에 사용하게 된다. 높은 바이러스 저해 활성을 측정할 수 있도록 하기 위해서는, 높은 바이러스 감염가로 시험에 제공해야 하기 때문에, 그것보다 높은 감염가의 바이러스를 생산해 둘 필요가 있다. 즉, 세포 배양으로 얻어지는 바이러스의 감염가는 높은 쪽이 바람직하다. 본 실시형태에 의해, 109 TCID50/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스가 얻어짐으로써, 파보바이러스를 이용한 항바이러스약 연구에 있어서, 희석하고 나서 연구 재료로서 제공하는 것이 가능해지고, 불순물에 의한 예기치 못한 반응이나 간섭을 경감하는 것이 가능해진다.
두번째 용도, 즉 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스를 평가하기 위해 바이러스를 생산하는 경우에도 바이러스가 고순도 또한 고감염가인 것이 바람직하다. 상기한 바와 같이, 이 바이러스 클리어런스 시험에 요구되는 점은, 첫째로, 필터의 눈막힘이 생기지 않는 정도의 바이러스 현탁액 첨가량일 것과, 둘째로, 평가하는 공정의 바이러스 클리어런스 수치인 대수 제거율(LRV)이 4 이상인 것을 나타낼 수 있는 첨가량일 것이다. LRV 4 이상이기 위해서는, 바이러스 제거 필터 공정에 제공하는 중간 제품에 바이러스 감염화가 104 TCID50/mL가 되도록 바이러스를 첨가해야 하지만, 실제로는, 바이러스 감염가의 정량 오차나, 바이러스 입자의 회합체를 제거하는 프리필터에서의 손실 및, 바이러스 검출 하한이 상승할 가능성(여과 용액이 세포 독성을 갖는 경우, 여과 용액을 희석하여 바이러스 감염가를 측정해야 하고 바이러스 검출 하한이 상승함)을 고려하여, 106 TCID50/mL 이상이 되도록 바이러스를 첨가할 필요가 있다. 체적비로 0.1％ 첨가하여, 106 TCID50/mL 이상으로 하려면, 원래의 바이러스 현탁액은 109 TCID50/mL 이상인 것이 필요하다. 본 실시형태에 의해, 고순도의 109 TCID50/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스가 얻어짐으로써, 각 공정의 파보바이러스 클리어런스를 평가할 때에, 파보바이러스의 첨가를 현저히 감소시킬 수 있게 되고, 파보바이러스 유래의 불순물에 의한 필터의 눈막힘의 문제를 해소할 수 있다. 또, 상기한 바와 같이, 최근 바이러스 제거 필터의 새로운 평가 기준으로서, 단위 막면적당의 바이러스 부하량을 종래보다 증가시켰을 때의 바이러스 제거성, 예컨대 1013 TCID50/m2 이상의 바이러스를 부하했을 때의 바이러스 제거성이 주목되고 있다. 종래의 방법으로 회수 가능한 108 TCID50/mL의 바이러스에서는, 체적비 1％로 첨가한 용액 1 L를 0.001 m2의 필터로 여과하는 것에 의해서밖에 바이러스를 부하할 수 없었다(WO2014/080676). 본 실시형태에 의해, 고순도의 109 TCID50/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스가 얻어짐으로써, 상기와 동일한 여과 조건에서 1013 TCID50/m2 이상의 바이러스 부하량이 가능해진다.
또한, 세번째 용도, 백신 생산에서도, 세포 배양으로 생산되는 바이러스가 고순도 또한 고감염가인 것에 의해, 그 후의 바이러스 백신 정제 공정에 대한 부하가 경감되어, 제조에 있어 유리하다. 순도가 낮으면 정제 공정에 대한 부하가 걸리고, 또한, 바이러스 감염가가 낮으면, 상대적으로 불순물 농도가 높아지기 때문에 정제 공정에 대한 부하가 걸려, 제조에 있어 불리해진다. 본 실시형태에 의해, 고순도의 109 TCID50/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스가 얻어짐으로써, 파보바이러스의 백신 생산에 있어서도, 정제 원료 중의 백신량이 비약적으로 많아지기 때문에, 백신 정제 공정을 보다 효율적이고 저비용으로 실시하는 것이 가능해진다.
실시예
이하 실시예 및 비교예에 기초하여, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 또, 여기에 나타내는 실시예는 대표예이고, 본 발명이 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1 파보바이러스 감염 후의 세포 밀도의 경시 변화 1]
돼지 파보바이러스(PPV)의 숙주 세포로서 PK-15 세포(ATCC로부터 구입, 카탈로그 번호 CCL-33, 파보바이러스 감수성의 접착 의존성 세포)를 이용하고, 이것을 둘베코 개변 이글 배지(DMEM 배지, 라이프 테크놀로지사 제조, 제조번호 11965-092)에 10％ 소 태아 혈청을 첨가한 배지(이하, 「혈청 배지」라고 부름. 후술하는 실시예에서도 동일)로, 37℃, 5％ CO2 환경하에서, 75 cm2 바닥 면적, 용량 15 mL의 조직 배양용 플라스크(이하, 「플라스크」라고 부름. 후술하는 실시예에서도 동일)를 이용하여 계대 배양했다.
계속해서, 상기 플라스크로부터 PK-15 세포를 박리하고, 새로운 플라스크에, 1.8×107 세포/플라스크(시료 1a), 6.0×106 세포/플라스크(시료 1b), 3.0×106 세포/플라스크(시료 1c), 1.2×106 세포/플라스크(시료 1d), 6.0×105 세포/플라스크(시료 1e), 및 1.0×105 세포/플라스크(시료 1f)의 세포 밀도(A)의 숙주 세포를, 10 mL의 혈청 배지와 함께 분주(分注)했다. 또, 이들의 감염시 세포 밀도 A는, PK-15 세포의 컨플루언트 증식시의 세포 밀도(C)를 3.0×107 세포/플라스크로 한 경우, 각각, C/1.67, C/5, C/10, C/25, C/50 및 C/300인 것으로 생각되었다.
각 세포 밀도의 조건에 관하여 3 플라스크씩 분주했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI = 0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5％ CO2 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후 24시간, 48시간 및 72시간 배양한 시점에서 플라스크 저면에 있는 세포를 회수하여, 세포 밀도(B)를 산출했다.
세포수의 산출은 이하와 같이 하여 행했다. 우선 세포 기재에 접착한 세포에, 소량의 트립신 등의 단백질 분해 효소나 EDTA 등의 킬레이트제 또는 그 혼합액을 첨가하고 숙주 세포를 배양 용기로부터 박리했다. 박리된 세포 용액을 혈청을 포함하는 배지로 희석하고 세포 박리 작용을 억제한 후, 혈구 계산반 등에 희석 후의 용액을 주입하고, 현미경 하에서 세포수를 계측했다.
바이러스 감염시의 세포 밀도(A = 세포수/플라스크) 및 이 A와 배양 24시간마다의 세포 밀도(B = 세포수/플라스크)로부터 산출한 비(B/A)를, 표 1에 나타낸다. 그렇게 하면, 통상, 세포는 바이러스에 감염되면 시간의 경과와 함께 사멸해 가는 것이지만, 파보바이러스에 감염된 세포는 세포 증식이 계속되고, 어느 감염시 세포 밀도 A의 경우에도, 48시간 경과 시점까지 전체의 세포수는 증가해 갔다. 그러나, 그 후, 72시간 경과 시점에서는 세포가 바이러스 감작에 의해 사멸하고, 전체의 세포수는 현저히 감소했다.
또한, 시험한 A의 범위에서는, 감염시 세포 밀도가 높을수록 감염 후의 세포 증식 속도가 낮아지는 경향이 보였지만, 한편으로, 감염시 세포 밀도가 낮으면 낮을수록 감염 후의 세포 증식 속도가 높아지는 것은 아니었다.
Figure pct00001
[실시예 2 파보바이러스 감염 세포 배양 후의 배지 교환 1]
실시예 1과 동일하게 하여 PK-15 세포를 계대 배양하고, 새로운 플라스크에, 시료 1a∼1f와 동일한 세포 밀도의 숙주 세포를, 10 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도의 조건에 관하여 6 플라스크씩 분주했다(시료 2a∼2f). 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI = 0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5％ CO2 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 48시간, 및 72시간 배양한 시점에서 1 플라스크씩 배양 상청을 제거하고, 플라스크 저면의 세포를, 혈청을 첨가하지 않은 DMEM 배지(이하, 「무혈청 배지」라고 함)로 세정한 후, 10 mL의 무혈청 배지를 첨가하고, 추가로 배양을 행하여, 24시간 후, 48시간 후, 및 72시간 후에 1 플라스크씩 상기 무혈청 배지의 배양 상청을 회수했다. 회수한 무혈청 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(밀리포아사 제조 Millex-HV)로 여과했다.
PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 바이러스에 의한 세포 변성을 이용한 CPE 법으로 TCID50 법으로 측정했다. 50％ 감염가의 계산은, Reed-Muench 법(의과 바이러스학, 2000. 난코도. 171-172)으로 행했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2의 수치는, 감염가를 대수치로 표시하고 있다. 예컨대, 9.1이란, 109.1 TCID50/mL인 것을 나타낸다. 표 2에 나타내는 바와 같이, 얻어진 바이러스의 감염가는, 시료 2b∼2e에서는 109 TCID50/mL 이상의 높은 감염가였지만, 시료 2a 및 2f에서는, 어느 조건하에서도 109 TCID50/mL 미만이었다.
Figure pct00002
또한, 불순물 단백질 농도를 Thermo Scientific사의 프로테인 앗세이 시약(BCA 법)으로 측정하고, PPV 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타내는 바와 같이, 시료 2b∼2e에서는 불순물 단백질의 비율이 매우 낮은, 고순도의 파보바이러스가 얻어졌다. 한편, 시료 2a 및 2f에서는, 시료 2b∼2e와 비교하여, 얻어진 파보바이러스 중의 불순물 단백질의 비율이 높았다.
Figure pct00003
상기한 실시예 1 및 2의 결과로부터, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 배양 조건을 결정했다.
우선, 실시예 1로부터, 감염시 세포 밀도(A)마다 감염 후의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화를 기록하고, 각각의 밀도에 대응하는 피크시(Tmax = 본 실시예에서는 48시간)의 세포 밀도(Bmax)를 기록하고, 감염 후의 세포 증식 속도의 기준이 되는 Bmax/A의 비를 산출한 바, Bmax/A가 적어도 1.2보다 커지는 감염시 세포 밀도(예컨대, 1.5 이상, 바람직하게는 1.75 이상, 보다 바람직하게는 2.0 이상)를 채용하면, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다. 즉, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 얻기 위해서는, A1과 Bmax가 이하의 식(1)을 만족하는 것이 중요한 것으로 생각되었다.
Bmax/A1 ＞ 1.2 식(1)
또한, Bmax/A가 적어도 1.2보다 커지는 감염시 세포 밀도 중 최대의 밀도(Amax)의 감염시 세포 밀도이면, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다. 또한, 이 밀도를 1/10 정도 낮춰도, A의 감소에 대응하여 1세포당의 바이러스 생산량이 높아지기 때문에, 최종적으로 얻어지는 파보바이러스 농도가 변하지 않고 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 회수할 수 있는 것으로 생각되었다. 즉, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 얻기 위해서는, 숙주 세포의 감염시 세포 밀도가, 이하의 식(2)를 만족하는 것이 중요한 것으로 생각되었다.
Amax ≥ A2 ≥ Amax/10 식(2)
실시예 2로부터, 상기 범위의 감염시 세포 밀도를 채용하고, 세포 밀도의 경시 변화가 피크가 되는 시점 또는 피크시로부터 일정 시간 경과 후에, 배양 상청을 무혈청 배지로 교환하고, 일정 시간, 예컨대, 12시간 이상, 바람직하게는 18시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 배양하면, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다.
[비교예 1]
실시예 1과 동일하게 하여 PK-15 세포를 계대 배양하고, 새로운 플라스크에, 시료 1b∼1e와 동일한 세포 밀도의 숙주 세포를, 10 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도의 조건에 관하여 6 플라스크씩 분주했다(시료 3b∼3e). 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI = 0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5％ CO2 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 96시간 배양한 시점에서 1 플라스크씩 배양 상청을 제거하고, 플라스크 저면의 세포를, 혈청을 첨가하지 않은 DMEM 배지(이하, 「무혈청 배지」라고 함)로 세정한 후, 10 mL의 무혈청 배지를 첨가하고, 추가로 배양을 행하여, 24시간 후, 48시간 후, 및 72시간 후에 1 플라스크씩 상기 무혈청 배지의 배양 상청을 회수했다. 회수한 무혈청 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심(1710×g, 20분 = 570×g·h)하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(밀리포아 제조)로 여과했다.
PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에 나타내는 바와 같이, 감염시 세포 밀도가 동일한 시료 2b∼2e와 비교하면, 시료 3b∼3e에서 얻어진 바이러스의 감염가는, 어느 조건하에서도 낮고, 109 TCID50/mL 이상으로는 되지 않았다. 배지 교환 전의 배양 시간이, 얻어지는 바이러스의 감염가에 영향을 주는 것이 분명해졌다.
Figure pct00004
또한, 실시예 2와 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 5에 나타냈다. 감염시 세포 밀도가 동일한 시료 2b∼2e와 비교하면, 시료 3b∼3e에서는 얻어진 파보바이러스 중의 불순물 단백질의 비율이 높았다. 배지 교환 전의 배양 시간이, 얻어지는 바이러스의 순도에도 영향을 주는 것이 분명해졌다.
실시예 2와 비교예 1의 결과로부터, 세포 밀도의 경시 변화가 피크가 되는 시점으로부터 48시간 미만, 예컨대 36시간 이내, 바람직하게는 30시간 이내, 보다 바람직하게는 24시간 이내의 시간 배양 후, 무혈청 배지 교환하면, 고순도 및 고감염가의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다.
Figure pct00005
[실시예 3 파보바이러스 감염 후의 세포 밀도의 경시 변화 2]
마우스 미소 바이러스(MVM)의 숙주 세포로서 A9 세포(ATCC로부터 구입, 카탈로그 번호 CCL-1.4, 파보바이러스 감수성의 접착 의존성 세포)를 이용하고, 이것을 혈청 배지로, 37℃, 5％ CO2 환경하에서, 플라스크를 이용하여 계대 배양했다.
계속해서, 상기 플라스크로부터 A9 세포를 박리하고, 새로운 플라스크에, 6.0×106 세포/플라스크(시료 4a), 3.0×106 세포/플라스크(시료 4b), 1.5×106 세포/플라스크(시료 4c), 6.0×105 세포/플라스크(시료 4d), 3.0×105 세포/플라스크(시료 4e), 및 1.0×105 세포/플라스크(시료 4f)의 세포 밀도(A)의 숙주 세포를, 10 mL의 혈청 배지와 함께 분주했다. 또, 이들의 감염시 세포 밀도 A는, A9 세포의 컨플루언트 증식시의 세포 밀도(C)를 3.0×107 세포/플라스크로 한 경우, 각각, C/5, C/10, C/20, C/50, C/100 및 C/300인 것으로 생각되었다.
각 세포 밀도의 조건에 관하여 3 플라스크씩 분주했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 MVM을 MOI = 0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5％ CO2 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후 72시간, 96시간 및 120시간 배양한 시점에서 플라스크 저면에 있는 세포를 회수하여, 세포 밀도(B)를 산출했다.
세포수의 산출은 이하와 같이 하여 행했다. 우선 세포 기재에 접착한 세포에, 소량의 트립신 등의 단백질 분해 효소나 EDTA 등의 킬레이트제 또는 그 혼합액을 첨가하고 숙주 세포를 배양 용기로부터 박리했다. 박리된 세포 용액을 혈청을 포함하는 배지로 희석하고 세포 박리 작용을 억제한 후, 혈구 계산반 등에 희석 후의 용액을 주입하고, 현미경 하에서 세포수를 계측했다.
바이러스 감염시의 세포 밀도(A = 세포수/플라스크) 및 이 A와 배양 24시간마다의 세포 밀도(B = 세포수/플라스크)로부터 산출한 비(B/A)를, 표 6에 나타낸다. 그렇게 하면, 통상, 세포는 바이러스에 감염되면 시간의 경과와 함께 사멸해 가는 것이지만, 파보바이러스에 감염된 세포는 세포 증식이 계속되고, 어느 감염시 세포 밀도 A의 경우에도, 72시간 경과 시점까지 전체의 세포수는 증가되어 갔다. 그러나, 그 후, 96시간 경과 시점에서는 세포가 바이러스 감작에 의해 사멸하고, 전체의 세포수는 감소했다.
또한, 시험한 A의 범위에서는, 감염시 세포 밀도가 높을수록 감염 후의 세포 증식 속도가 낮아지는 경향이 보였지만, 한편으로, 감염시 세포 밀도가 낮으면 낮을수록 감염 후의 세포 증식 속도가 높아지는 것은 아니었다.
Figure pct00006
[실시예 4 파보바이러스 감염 세포 배양 후의 배지 교환 2]
실시예 3과 동일하게 하여 A9 세포를 계대 배양하고, 새로운 플라스크에, 시료 4a∼4f와 동일한 세포 밀도의 숙주 세포를, 10 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도의 조건에 관하여 6 플라스크씩 분주했다(시료 5a∼5f). 계속해서, 상기 각 플라스크에 MVM을 MOI = 0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5％ CO2 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 96시간, 및 120시간 배양한 시점에서 1 플라스크씩 배양 상청을 제거하고, 플라스크 저면의 세포를, 무혈청 배지로 세정한 후, 10 mL의 무혈청 배지를 첨가하고, 추가로 배양을 행하여, 24시간 후, 48시간 후, 및 72시간 후에 1 플라스크씩 상기 무혈청 배지의 배양 상청을 회수했다. 회수한 무혈청 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(밀리포아사 제조 Millex-HV)로 여과했다.
MVM 감염가를, 실시예 2와 동일한 수법에 의해 측정한 그 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7의 수치는, 감염가를 대수치로 표시하고 있다. 예컨대, 9.1이란, 109.1 TCID50/mL인 것을 나타낸다. 표 7에 나타내는 바와 같이, 얻어진 바이러스의 감염가는, 시료 5b∼5e에서는 109 TCID50/mL 이상의 높은 감염가였지만, 시료 5a 및 5f에서는, 어느 조건하에서도 109 TCID50/mL 미만이었다.
Figure pct00007
또한, 불순물 단백질 농도를 Thermo Scientific사의 프로테인 앗세이 시약(BCA 법)으로 측정하고, MVM 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 결과를 표 8에 나타낸다. 표 8에 나타내는 바와 같이, 시료 5b∼5e에서는 불순물 단백질의 비율이 매우 낮은, 고순도의 파보바이러스가 얻어졌다. 한편, 시료 5a 및 5f에서는, 시료 5b∼5e와 비교하여, 얻어진 파보바이러스 중의 불순물 단백질의 비율이 높았다.
Figure pct00008
상기한 실시예 3 및 4의 결과로부터, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 배양 조건을 결정했다.
우선, 실시예 3으로부터, 감염시 세포 밀도(A)마다 감염 후의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화를 기록하고, 각각의 밀도에 대응하는 피크시(Tmax = 본 실시예에서는 96시간)의 세포 밀도(Bmax)를 기록하고, 감염 후의 세포 증식 속도의 기준이 되는 Bmax/A의 비를 산출한 바, Bmax/A가 적어도 1.2보다 커지는 감염시 세포 밀도(예컨대, 1.5 이상, 바람직하게는 1.75 이상, 보다 바람직하게는 2.0 이상)를 채용하면, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다. 즉, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 얻기 위해서는, A1과 Bmax가 이하의 식(1)을 만족하는 것이 중요한 것으로 생각되었다.
Bmax/A1 ＞ 1.2 식(1)
또한, Bmax/A가 적어도 1.2보다 커지는 감염시 세포 밀도 중 최대의 밀도(Amax)의 감염시 세포 밀도이면, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다. 또한, 이 밀도를 1/10 정도 낮춰도, A의 감소에 대응하여 1세포당의 바이러스 생산량이 높아지기 때문에, 최종적으로 얻어지는 파보바이러스 농도가 변하지 않고 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 회수할 수 있는 것으로 생각되었다. 즉, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스를 얻기 위해서는, 숙주 세포의 감염시 세포 밀도가, 이하의 식(2)를 만족하는 것이 중요한 것으로 생각되었다.
Amax ≥ A2 ≥ Amax/10 식(2)
실시예 4로부터, 상기 범위의 감염시 세포 밀도를 채용하고, 세포 밀도의 경시 변화가 피크가 되는 시점 또는 피크시로부터 일정 시간 경과 후에, 배양 상청을 무혈청 배지로 교환하고, 일정 시간, 예컨대, 12시간 이상, 바람직하게는 18시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 배양하면, 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다.
[비교예 2]
실시예 3과 동일하게 하여 A9 세포를 계대 배양하고, 새로운 플라스크에, 시료 4b∼4e와 동일한 세포 밀도의 숙주 세포를, 10 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도의 조건에 관하여 6 플라스크씩 분주했다(시료 6b∼6e). 계속해서, 상기 각 플라스크에 MVM을 MOI = 0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5％ CO2 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 144시간 배양한 시점에서 1 플라스크씩 배양 상청을 제거하고, 플라스크 저면의 세포를, 무혈청 배지로 세정한 후, 10 mL의 무혈청 배지를 첨가하고, 추가로 배양을 행하여, 24시간 후, 48시간 후, 및 72시간 후에 1 플라스크씩 상기 무혈청 배지의 배양 상청을 회수했다. 회수한 무혈청 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심(1710×g, 20분 = 570×g·h)하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(밀리포아 제조)로 여과했다.
MVM 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 9에 나타낸다. 표 9에 나타내는 바와 같이, 감염시 세포 밀도가 동일한 시료 5b∼5e와 비교하면, 시료 6b∼6e에서 얻어진 바이러스의 감염가는, 어느 조건하에서도 낮고, 109 TCID50/mL 이상으로는 되지 않았다. 배지 교환 전의 배양 시간이, 얻어지는 바이러스의 감염가에 영향을 주는 것이 분명해졌다.
Figure pct00009
또한, 실시예 2와 동일하게 하여 MVM 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 10에 나타냈다. 감염시 세포 밀도가 동일한 시료 5b∼5e와 비교하면, 시료 6b∼6e에서는 얻어진 파보바이러스 중의 불순물 단백질의 비율이 높았다. 배지 교환 전의 배양 시간이, 얻어지는 바이러스의 순도에도 영향을 주는 것이 분명해졌다.
실시예 4와 비교예 2의 결과로부터, 세포 밀도의 경시 변화가 피크가 되는 시점으로부터 48시간 미만, 예컨대 36시간 이내, 바람직하게는 30시간 이내, 보다 바람직하게는 24시간 이내의 시간 배양 후, 무혈청 배지 교환하면, 고순도 및 고감염가의 파보바이러스가 얻어지는 것으로 생각되었다.
Figure pct00010
산업상 이용가능성
본 발명의 방법에 의해, 고순도 또한 고감염가의 파보바이러스가 얻어진다. 이 파보바이러스는, 항바이러스약 탐색 등의 바이러스 연구 재료의 조제나, 생물 제제(의약품) 제조 공정에 있어서의 바이러스 클리어런스 안전성 평가에 사용하는 바이러스의 조제, 또한 백신 생산 등에 이용할 수 있고, 본 발명은 이들 분야에서의 산업상 이용 가능성을 갖는다.
본 출원은, 2015년 11월 6일에 출원된 일본 특허출원 제2015-218775호에 기초하는 우선권을 주장하는 것으로, 이 내용은 여기에 참조로서 도입된다.

Claims (11)

  1. 고감염가 또한 고순도의 파보바이러스의 생산 방법으로서,
    (a) 숙주 세포가 파보바이러스에 감염된 때의 배양 기재의 세포 밀도의 24시간마다의 경시 변화를, 감염시 세포 밀도(A)마다 사전에 별도 산출해 두는 공정과,
    (b) 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 세포 밀도의 경시 변화로부터,
    (b1) 감염으로부터, 세포 밀도의 경시 변화의 피크시까지의 시간(Tmax)과,
    (b2) Tmax에 있어서의 세포 밀도(Bmax)와 A가 이하의 식(1)을 만족하는 A1과,
    (b3) 그러한 A1 중 최대의 감염시 세포 밀도(Amax)와,
    (b4) 이하의 식(2)를 만족하는 A2
    를 결정하는 공정과,
    Bmax/A1 ＞ 1.2 식(1)
    Amax ≥ A2 ≥ Amax/10 식(2)
    (c) 공정(b)의 (b4)에서 결정한 A2의 감염시 세포 밀도의 숙주 세포와 혈청 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.001∼0.1이 되도록 접종하는 공정과,
    (d) 공정(c)에서 얻어진 숙주 세포와 파보바이러스를 포함하는 배양물을, 공정(b)의 (b1)에서 결정한 Tmax 이상 Tmax＋48시간 미만의 시간 배양하는 공정과,
    (e) 공정(d)의 배양 상청을 무혈청 배지로 교환하고, 12시간 이상 배양하는 공정과,
    (f) 공정(e)의 배양에 의해 얻어지는 파보바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하는 공정
    을 포함하고, 상기 공정(b)에 있어서, 식(1)을 만족하는 A가 존재하지 않는 경우, 별도의 감염시 세포 밀도 A를 채용하여 공정(a) 및 공정(b)를 재차 실시하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 접착 의존성 세포인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 파보바이러스가, 돼지 파보바이러스(PPV), 개 파보바이러스(CPV), 마우스 미소 바이러스(MVM), 래트 바이러스(RV), H-1 바이러스(H-1), 고양이 파보바이러스(FPV), 거위 파보바이러스(GPV), 또는 소 파보바이러스(BPV)인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(e)가 배양 상청을 무혈청 배지로 교환하고 24시간 이상 배양하는 공정인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(b)가, Bmax와 A가 이하의 식(1’):
    Bmax/A1' ≥ 2.0 식(1’)
    를 만족하는 A1'를 산출하는 공정을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(d) 및 (e)에 있어서의 배양이 33℃ 이상 39℃ 이하의 온도에서 실시되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(d) 및 (e)에 있어서, 상기 숙주 세포와 상기 파보바이러스가 동시 진행으로 증식하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(f)가 상기 배양 상청에 포함되는 유리의 숙주 세포와 숙주 세포의 파편을 제거하는 공정을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제거 공정이 공경 0.2 ㎛∼0.45 ㎛의 막여과를 이용하여 행해지는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 109 TCID50/mL 이상의 감염가의 파보바이러스.
  11. 파보바이러스의 감염가가 109 TCID50/mL 이상이며, 또한, 상기 파보바이러스의 감염가(TCID50/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 5000 : 1 초과인, 비농축의 세포 배양 상청 유래의 파보바이러스.
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