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KR20180037944A - 슈도모나스 pf-11 배양물로부터 제조된 방오 조성물 - Google Patents

슈도모나스 pf-11 배양물로부터 제조된 방오 조성물 Download PDF

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KR20180037944A
KR20180037944A KR1020187000927A KR20187000927A KR20180037944A KR 20180037944 A KR20180037944 A KR 20180037944A KR 1020187000927 A KR1020187000927 A KR 1020187000927A KR 20187000927 A KR20187000927 A KR 20187000927A KR 20180037944 A KR20180037944 A KR 20180037944A
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KR
South Korea
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supernatant
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pseudomonas
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KR1020187000927A
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Inventor
곤칼로 코스타
패트릭 프레이레
로마나 산토스
아나 크리스티나 실바
이네스 귀노트
Original Assignee
바이오미메틱스, 에스.에이.
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Publication date
Application filed by 바이오미메틱스, 에스.에이. filed Critical 바이오미메틱스, 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 슈도모나스 환경 균주 PF-11의 세포를 배양하는 단계; 및 상청액을 회수하는 단계를 포함하는 세균 상청액을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표면을 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면 위에 생물막의 양을 감소시키고, 표면에 대한 적어도 하나의 유기체의 부착을 감소시키고, 또는 표면 위에 미세부착물 또는 거대부착물을 감소시키는 방법을 고려한다. 본 발명은 또한 진균, 세균, 곤충 또는 해양 요각류를 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 진균 또는 세균 세포를 사멸하거나 이의 성장을 저해하고, 곤충 또는 해양 요각류를 사멸하거나 이의 발생을 저해하는 방법을 고려한다. 본 발명은 또한 슈도모나스 균주 PF-11의 실질적으로 순수한 배양물을 고려한다. 본 발명은 또한 슈도모나스 균주 PF-11로 농축된 배양물을 고려한다. 본 발명은 또한 세균이 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는지 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

Description

슈도모나스 PF-11 배양물로부터 제조된 방오 조성물
본 출원 전체에서 괄호 안에 언급된 것을 비롯해 다양한 간행물이 참조된다. 괄호 안에 언급된 간행물에 대한 전체 인용은 청구범위 직전의 명세서 말미에서 확인할 수 있다. 모든 참조된 간행물의 개시 내용은 그 전체가 본 발명이 속하는 기술 수준을 더욱 온전히 설명하기 위하여 본 출원 내에 참조로서 여기에 포함된다.
항미생물 내성
세균 감염의 치료 및 예방은 항미생물제에 대해 증가하는 세균 내성으로 인해 향후 수십 년 동안 전 세계적으로 주요한 건강 문제이다 (Kaplan 2004). 해마다 25,000명이 넘는 환자가 EU에서만 다-약제 내성 세균으로 인한 감염으로 사망하며, 이는 15억 유로에 이르는 사회 전반에 직접적인 비용을 초래한다 (ECDC/EMA joint technical report 2009). 그러나 인간의 병원균을 치료하는데 사용되는 항생제는 질병을 치료하고 성장을 촉진하며 사료 효율을 높이기 위해 동물에도 사용된다 (FAO/OIE/WHO 2003). 그 결과, 도시와 농업 공급원 둘 다로부터의 항생제는 토양과 수생 환경에서 지속되어 내성 세균의 선택으로 이어지는 강한 압력을 발휘한다. 따라서, 항미생물 내성 (AMR)을 가진 세균의 존재는 동물 사육 시설 및 도축장, 토양 및 폐수, 도시 및 농지 하수에서 검출되었다. 이들 내성 세균의 대부분은 내성 유전자를 인간 병원체에 전이시키는 것으로 나타났다 (Martinez 2013). 따라서, 항생제의 지속적인 사용과 남용은 환경적으로 내성인 균주를 선별하는데 크게 기여하며 AMR 메커니즘을 병원성 균주에 전달할 수 있고, 이는 치료용으로 도입된 임의의 항생제가, 단기간에, 세균이 그 사용에 대해 내성을 갖게 하는 메커니즘의 선택을 유발할 수 있는 한계점을 초래한다.
새로운 이용가능한 항생제의 흐름은 줄어들었고, 1990년대와 금세기의 첫 10년 동안 허가된 수는 더 적었다 (Boucher et al. 2009). 따라서, AMR 세균으로 인한 감염의 부담과 문제를 해결하기 위한 새로운 항생제의 개발 사이에는 간극이 있다. 이는 세균에 의해 쉽게 극복되는 새로운 효율적인 항생제 개발의 어려움, 새로운 항생제 사용을 시행하기 위한 규제의 어려움 및 항생제가 제약 업계에서 수익성이 높지 않다는 사실에 기인한다 (Livermore 2011; Payne 외 2007). 따라서, 연구 노력은 효과적이고 AMR 메커니즘을 촉진하지 않을, 독창적인 행동 방식을 갖는 새로운 항균 전략을 개발하는 데 초점을 맞추어야 한다.
생물부착물 ( Biofouling )
살아 있는 유기체는 가장 다양한 환경, 자연 및 합성적 표면 위에 부착하여 성장할 수 있다. 생물 부착은, 물에 노출되었을 때, 흡수된 유기 물질의 축적에 의해 유발되는 다중-층 표면 집락화의 자연적 과정으로 이루어지며, 이는 세균 또는 미세-조류 부착을 위한 조건화 필름을 형성하여 생물막 (biofilm) 형성을 초래한다 (Abarzua et al., Olsen et al.).
항미생물 내성 및 생물부착을 감소시키기 위한 신규한 방법 및 조성물이 요구된다.
살진균제
항생제와 같이, 미생물 유기체에 의해 생성된 항진균 화합물의 이용은 의약 화합물에 강력한 중점을 두고 새로운 활성 화합물의 개발에 크게 이용되고 있다.
몇몇 세균은 효소, 시데로포어 (siderophore), 및 시안화수소 또는 에틸렌과 같은 다양한 분자를 포함하는, 자연계에서 항진균제 및 항생제인 다양한 부류의 화합물을 생산하는 것으로 밝혀졌다.
기생충인 진균은 동물 및 인간 개체군에서 심각한 작물 손실과 질병을 일으킬 뿐만 아니라 자연 생물학적 공동체의 구성과 구조를 형성하는 일반적이고 중요한 병원체이다. 살진균제는 건강 및 수의학 응용에서 제지 생산 및 가정 살림과 같은 산업에 이르기까지 다양한 응용 분야에 사용될 수 있다.
인간의 건강에서 진균 감염은 하나 이상의 진균의 종에 의한 조직의 침범을 나타낸다. 대부분의 진균 감염은 공기, 토양 또는 새의 배설물과 같이 인근 환경에서 진균의 원인에 대한 사람의 노출로 인해 발생한다. 진균 감염에 의해 야기되는 흔한 질병으로는 손톱과 발톱 곰팡이, 무좀 (Athlete's foot), 완선 (jock itch), 두피 및 모발 감염, 백선, 진균성 부비동 감염, 모창 (barber's itch) 등이 있다. 이러한 질병은 일반적으로 통증, 불편함 및 사회적 당혹을 환자에게 유발한다. 이들은 종종 영구적 손상을 일으킬 수도 있으며, 경우에 따라 장기 이식 수용자 및 HIV/에이즈 보유자와 같은 특정 환자에게는 치명적일 수도 있다.
식물은 또한 매우 다양한 병원성 진균에 의해 지속적으로 도전받고 있다. 진균의 통제는, 식물이나 식물의 일부분에서 진균의 번식이 경엽, 과일 또는 종자의 생산 및 재배 작물의 전반적인 품질을 저해하기 때문에 중요하다. 농경 및 원예에서 모든 진균성 질병의 약 25%는 분말성 곰팡이 식물병원체 (phytopathogen)에 의해 발생한다. 농경 및 원예 경작에서 진균 번식의 막대한 경제적 파급 효과로 인해 범용 및 특정 응용 분야에서 광범위한 스펙트럼의 살진균성 및 정진균성 (fungistatic) 제품이 개발되었다. 이러한 예는 무기 중탄산염, 탄산염 화합물, 레시틴 및 석회의 사용이다. 그러나 이러한 살진균성 및 정진균성 제품은 환경에 유해할 수 있으며 지하수와 같은 지역을 오염시킬 수 있다. 따라서 최소한의 식물 독성 부작용으로 식물을 보호하고 환경을 해치지 않으면서 진균을 방제할 수 있는 생물학적 해법이 요구된다.
살충제
모기-매개 (mosquito-borne) 질병은 전 세계적으로 매년 7억 명의 사람들에게 영향을 미치며 백만 명이 넘는 사망자의 발생에 책임이 있다. 모기-매개 질병을 통제하는 것은 세계보건기구 (WHO)의 새천년 개발 목표 (Millennium Development Goal)에서 확립된 목표이다. 또한, 유럽에서 이러한 질병은 유럽 질병 예방 및 통제 센터 (European Center for Disease Prevention and Control)에 의해 새로운 위협으로 간주되고 있다. 지금까지 모기 방제는 환경에 막대한 피해를 주었고 살충제 내성 증가를 초래하는, 주로 살충제 적용에 의존하였다.
더욱이, 많은 곤충이 자택소유자, 행락객, 정원사, 및 농가에, 그리고 농작물에 대한 곤충 피해의 결과로 농산물에 대한 투자가 종종 파괴되거나 감소되는 사람들에게는 일반적으로 해충으로 간주되고 있다. 특히 재배 기간이 짧은 지역에서는, 심각한 곤충 피해가 재배자에게 모든 이익의 손실과 작물 수확량의 극적인 감소를 의미할 수 있다. 특정 농산물의 부족한 공급은 결국 식품 가공업자에게 더 높은 비용을 초래하고, 이는 식품 공장 및 그 공장에서 파생된 제품의 궁극적인 소비자에게로 귀결된다.
살충제 또는 혁신적인 전략에서의 신규 활성 성분은 식물 또는 세균으로부터 분리된 천연 산물을 기반으로 하고 농업과 건강이라는 두 가지 주요 영역에서 작용하는데 있어 매우 중요하며 연구 대상입니다.
농업에서
살충제는 농업 생산성과 식량 공급의 성장에 중요한 기여를 해왔다. 다른 한편으로, 이는 또한 인간, 동물 및 환경 부작용으로 인한 우려의 원천이었다. 이러한 우려는 살충제의 응용 및 사용에 대한 정부 규제의 증가, 유기농 식품 수요의 증가 및 사람들 사이의 건강 의식의 증진의 형태로 나타났다. 지난 수십 년 동안 합성 유기 화학물질의 광범위한 사용은 다수의 장기적인 환경 문제를 초래하였다. 주요 문제는 농약이 환경, 특히 물에 축적되는 것과 관련이 있다. 이러한 우려는 농약 사용자의 안전성에 대한 우려와 함께 계속되고 있다. 이러한 모든 사실은 세계적으로 바이오-살충제 시장의 성장을 위한 거대한 범주가 있음을 나타낸다.
곤충으로 인한 피해는 임의의 식물 작물 종의 생산성 감소에서 가장 중요한 요소 중 하나이다. 총 연간 경제적 손실은 약 177억 달러에 달한다. 살충제는 하천, 강 또는 수로 오염과 같이 이러한 화학물질이 갖는 환경적 영향으로 인해 생기는 손실뿐만 아니라 내성을 유발한 가능성이 더 많다는 사실로 인해 작물 보호에 지속적으로 덜 효과적이다. 이 모든 변수들은 연간 1조 달러의 식량 손실 또는 전 세계적으로 낭비되는 식량의 추정에 기여한다.
건강을 위해
모기는 말라리아, 림프 사상충증 (lymphatic filariasis), 및 뎅기열, 지카 (Zika), 황열병, 치쿤구아나 열병 (chikungunya) 및 웨스트 나일 열병과 같은 아르보바이러스 (arbovirose)와 같이 질병을 유발하는 몇몇 사람 및/또는 동물의 병원체의 매개체이다. 이들 질병은 특히 이들이 가장 만연하는, 아열대 및 열대 지방의 국가에서, 높은 수준의 사망률 및/또는 이환율을 초래하며, 이로 인해 사회 경제적으로 큰 영향을 미친다. 모기 매개 질병의 통제는 세계 보건기구의 새천년 개발 목표 (Millennium Development Goals, MDG)에서 고려된다. 또한, 세계화, 인간 이동 및 기후 변화와 같은 요인들로 인해, 결과적으로 지리적 모기 매개체 종 및/또는 병원체 분포의 확장으로 인해, 이러한 질병 중 일부가 확산되고 등장하였는데, 예를 들어 2007년 이탈리아의 치쿤구아나열 발열, 2012년 마데이라 섬-포르투갈의 뎅기열, 2010년 프랑스, 2010년 그리스 말라리아와 같은 온대 지역에서의 재발이 있다. 또한, 1999년 미국에서 웨스트 나일 열병이 도입되었고 2013/14년에 카리브해와 브라질에서 치쿤구야 열병이 도입됨에 따라, 현재 이들은 동부 및 서반구 전역에 걸쳐 가장 널리 퍼진 아르보바이러스성 모기 매개 질병인 뎅기열과 함께 존재한다. 이들 감염의 공중 보건 관련성은, 이들이 열성 증후군, 심한 관절통, 수막 뇌염 또는 출혈성 증후군을 유발하여 심각한 이환율 및/또는 사망률을 초래할 수 있기 때문에 상당히 높다.
매개체 제어는 매개체-매개 질병을 통제하는 기본적인 수단으로 남아 있다. 통합 매개체 제어 (Integrated Vector Control) 전략이 권장되긴 하지만, 매개체 제어는 주로 살충제 적용에 의존해 왔다. 환경 비용과 살충제 내성 발생 (집중적 및/또는 간헐적 적용의 결과로서, 이들은 종종 매우 높은, 만만치 않은 비용에 의해 발생함)로 인해, 새로운 살충제/제제/전략이, 즉 생물학적인 것이 식물 또는 세균 제품을 기반으로 연구되고 있다.
생물농약 (Bio-pesticides)
해충 관리에 있어 세균 기원의 대사 산물의 사용은, 이들이 내성 발생을 유발하기 쉽지 않고 일반적으로 통상적인 살충제보다 생분해성이고 환경친화적이기 때문에, 농업과 인간/동물 질병 매개체의 통제에서 증가하고 있다.
현재 바이오-살충제로 사용되는 주요 생물농약은 세균 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis, Bt)에서 유래하며, 이는 총 살충제 시장의 약 2%를 차지한다. 모기 매개체 방제에서, 사용 중인 주요 살충제는 B.t. 이스라엘렌시스 (B.t. israelensis) (Bti) 및 리신바실러스 스파에리쿠스 (Lysinbacillus sphaericus)(= Bacillus sphaericus) (Ls)였다. Bti와 Ls는 모기의 애벌레 단계에 대해 높은 특이성을 나타내며, 아마도 이들의 배타적인 작용에 의해서뿐만 아니라 다른 세균 종에 의해서도 야기되는 패혈증에 수반되는 중장 (midgut) 조직의 파괴에 의해 곤충을 죽인다. 포자형성 (sporulation) 시, Bti와 Ls는 Cry 또는 Cyt 독소라고 불리는 다양한 살충 단백질에 의해 형성된 결정 포접물을 생성한다. 이들 독소는 매우 선택적인 스펙트럼의 활성을 나타낸다. 좁은 범위의 곤충 종을 사멸하면서 이들의 사용은 화학적 살충제의 사용에 있어 유의미한 감소를 초래하였다.
그러나 Bti 및 Ls 기반 살충제에 대한 내성 발생 가능성에 대한 보고가 나타나고 있다. 다른 한편으로, 해충 방제 이력은 내성 발생을 피하기 위해 사용중인 살충제의 순환이 권장됨을 보여준다.
따라서, 농업 해충 관리에 채택된 유사한 전략과 조합하여, 새로운 살균제 또는 이를 사용하는 방법이 요구되고 연구되어야 하며, 모기와 같은 해충이나 매개체 곤충을 방제하는데 광범위한 해법을 제공한다.
해양 기생충
집약적인 어류 양식은 바닷물이 (sea lice)와 같은 기생충에 의한 어류의 상해를 통해 상당한 경제적 손실을 초래한다. 이러한 해양 요각류의 감염은 그물-우리 (net-pen) 기반 생산 내에서 피하기가 어려우며 전 세계적 양식 산업에서 심각한 문제이다. 문제의 중요성은 지역마다 다르다. 연어 양식 산업 분야에서 바닷물이의 방제는 그의 미래 지속가능성에 결정적이다. 바닷물이 감염은, 그들의 먹이가 삼투압 문제와 2차 감염으로 이어지고, 치료되지 않는 경우 어류에게 매우 해롭거나 치명적인 수준에 도달할 수 있는 병변을 일으키기 때문에, 그들의 숙주의 성장, 번식력 및 생존에 영향을 미친다. 야생 및 양식 연어 둘 다 바닷물이에 대한 숙주로서 작용할 수 있다. 바닷물이는 물을 통해 이동하여 양식 어류에서 야생 어류로 옮겨질 수 있고 그 반대일 수 있다. 양식 어류와 야생 어류 사이에서 기생충의 가능한 상호작용과 교차-감염은 많은 우려를 유발하고 있다. 양식 산업의 목적은 어류 양식 시설로부터의 바닷물이가 야생 어류 개체군에 부정적인 영향을 미치지 않도록 하는 것이다.
현재, 양식 어류에 대한 바닷물이의 처리에는 생물학적 처리 [놀래기 (wrasse), 클리너 피쉬 (cleaner fish)], 약제 처리 (경구 치료 및 욕조 처리) 및 첨가제 함유-사료 화합물 (additive in-feed compound)이 포함된다. 다양한 치료법이 조합될 수 있다. 항-기생충 제제는 1980년대 초반부터 감염을 퇴치하기 위해 사용되어 왔으며, 유기인산염 (organophosphate)은 1980년대 초반부터 1990년대 중반에 내성이 발생할 때까지 사용되었다. 그 당시부터, 합성 피레트로이드 (pyrethroid)인 사이퍼메트린 (cypermethrin), 델타메트린 (deltamethrin) 및 에버멕틴 에마멕틴 (avermectin emamectin)이 바닷물이의 처리를 위해 유기인산염을 거의 완전히 대체하였다. 그러나 최근에는, 이들 피레트로이드와 에마멕틴에 대한 몇몇 처리 실패가 보고되었으며 민감도 감소가 검출되었다. 오늘날 해충 관리 전략은 항-기생충 제제를 거의 사용하지 않고 있다.
과산화수소가 또한 어류로부터 바닷물이를 제거하는데 사용된다. 그러나 대량의 과산화수소를 필요로 하기 때문에 어류에 대한 제한된 치료적 활성과 독성은 이를 이상적인 방법으로 만들지 않는다. 과산화수소는 바닷물이를 죽이지 않기 때문에 기생충이 어류를 다시 공격할 수 있다.
수많은 처리법이 이용 가능하지만 아직 신뢰할 수 있는 방법이 확립되어 있지는 않다. 또한, 자주 사용되는 부위에는 처리에 대한 바닷물이의 감수성 감소가 보고된바 있다. 교차-내성은 또한 관련된 화합물 사이에서 발생할 수도 있다. 특별한 처리에 대한 내성의 증거가 있는 경우, 관련된 화합물의 사용을 피하도록 주의를 기울여야 한다. 정확한 처리 절차를 따르고, 전체 권장 용량을 투여하고, 가능한 경우 다른 처리 방법을 번갈아 사용함으로써 내성 가능성을 줄일 수 있다. 따라서, 내성 발생을 피하기 위해서는 몇몇 다른 그룹의 유효 화합물이 바닷물이 감염의 처리에 이용가능할 필요가 있다. 결과적으로, 바닷물이 감염을 퇴치하는데 효과적이며 어류, 소비자 및 환경에 안전한, 어류에서 바닷물이를 통제하는 개선된 수단에 대한 필요성이 오랫동안 요구되고 있다. 언뜻 보기에 바닷물이 감염의 관리에 유용한 화합물을 확인하는 명백한 접근법은, 이전에 해양 기생충에 대해 효과적인 것으로 나타났던 살충제 또는 화합물과 같은 알려진 살충제에 초점을 맞추는 것일 수 있다. 그러나 경험에 따르면, 다른 수생 기생충에 대한 특정 화합물의 효과조차도 바닷물이 감염에 대해 효과적인 화합물의 지표가 아닌 것으로 나타났다. 다수의 항-기생충 제제가 바닷물이 감염 퇴치를 위한 이들의 효과에 대해 시험되었다. 잘 알려진 예로는 항-연충제 (anti-helmintics)이지만 바닷물이에 아무런 영향을 미치지 않는 프라지콴텔 (praziquantel)과 다른 벤즈이미다졸 (펜벤다졸, 메벤다졸, 알벤다졸, 플루벤다졸 등)이다. 피란텔 (Pyrantel)은 바닷물이에 영향을 미치지 않는 또 다른 항-연충제 (항선충 티오펜)이다. 톨투라주릴 및 디클라주릴과 같은 항원충제 (coccidiostats) 또한 바닷물이에 영향을 미치지 않는다. 소장 원생동물에 영향을 미치지만, 바닷물이에는 영향을 미치지 않는 바지트라진 (bazitrazin)에 대해서도 동일한 것이 사실이다. 이용가능한 살충제의 극소수만이 바닷물이와 같은 어류 기생충에 대해 우수한 효능을 나타내었다. 이들에는 사이퍼메트린 (cypermethrin)과 델타메트린 (deltamethrin)과 같은 피레트로이드가 포함된다. 알려진 항-기생충 화합물이 새로운 종에 대해 시험되는 경우 경험하게 되는 어려움, 예컨대 다양한 종의 기생충 사이에서 유전형 및 표현형의 큰 다양성, 큰 대사적 차이 및 기생충이 매우 다른 서식지를 점유하고 숙주의 전염과 감염에 대한 다른 전략을 가지고 있다는 사실을 설명하는 몇 가지 요인이 있다.
기생충 침입을 치료하기 위한 치료적 화학물질 이면의 원리는 숙주에 극적으로 영향을 미치지 않으면서 기생충의 효율적인 불활성화를 허용하는 적정약물 농도 (therapeutic window)를 찾는 것이다.
본 발명은 슈도모나스 환경 균주 PF-11의 세포를 배양하는 단계; 및 상청액을 회수하는 단계를 포함하는, 세균 상청액을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 표면을 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면 위에서 생물막의 양을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 표면은 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면에 대한 적어도 하나의 유기체의 부착을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 표면을 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면 위에서 미세부착물 또는 거대부착물을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 진균, 세균, 곤충 또는 해양 요각류를 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 진균, 세균 세포를 사멸하거나 이들의 성장을 감소시키고, 또는 곤충 또는 해양 요각류를 사멸하거나 이들의 발생을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 슈도모나스 균주 PF-11의 실질적으로 순수한 배양물을 제공한다.
본 발명은 또한 i) 세균 세포를 고분자량 기질이 보충된 성장 제한 배지 중에 배치하는 단계; ii) 세포가 고분자량 기질이 보충된 성장 제한 배지에서 성장하는지 여부를 결정하는 단계; 및 iii) 만약 세포가 단계 ii)에서 성장하는 것으로 결정된다면 세균을 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는 것으로 확인하고, 만약 세포가 단계 ii)에서 성장하지 않는 것으로 결정된다면 세균을 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 없는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 세균이 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는지 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
도 1A. 세균 시크레톰 (secretome)의 항미생물 효과. 수집된 상청액의 성장 저해 가능성을 비-병원성 균주 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ATCC27853에 대해 시험하였다.
도 1B. 세균 시크레톰의 항미생물 효과. 수집된 상청액의 성장 저해 가능성을 비-병원성 균주 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) ATCC25922에 대해 시험하였다.
도 1C. 세균 시크레톰의 항미생물 효과. 수집된 상청액의 성장 저해 가능성을 비-병원성 균주 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) NCTC8325에 대해 시험하였다.
도 2. PF-11 시크레톰의 항미생물 효과. PF-11 시크레톰의 항미생물 활성을 도 1에서와 같은 참조 균주에 대해 시험하였고 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 참조 균주 KT2440 및 다른 P. 푸티다 환경 단리 균주로 확대시켰다.
도 3A. PF-11 시크레톰 분획의 항미생물 활성. 분비된 단백질 및 소분자의 효과. 이 분획의 효과를 균주 슈도모나스 아에루지노사 ATCC27853, 에스케리치아 콜라이 ATCC25922, 스타필로코커스 아우레우스 NCTC8325 및 슈도모나스 푸티다 참조 균주 KT2440의 성장에 대해 시험하였다.
도 3B. PF-11 시크레톰 분획의 항미생물 활성. 단백질을 포함하는 더 큰 분자의 효과. 이 분획의 효과를 균주 슈도모나스 아에루지노사 ATCC27853, 에스케리치아 콜라이 ATCC25922, 스타필로코커스 아우레우스 NCTC8325 및 슈도모나스 푸티다 참조 균주 KT2440의 성장에 대해 시험하였다.
도 3C. PF-11 시크레톰 분획의 항미생물 활성. 보일링된 미가공 (boiled raw) 시크레톰의 효과. 이 분획의 효과를 균주 슈도모나스 아에루지노사 ATCC27853, 에스케리치아 콜라이 ATCC25922, 스타필로코커스 아우레우스 NCTC8325 및 슈도모나스 푸티다 참조 균주 KT2440의 성장에 대해 시험하였다.
도 4A. 슈도모나스 균주 분비 단백질의 HPLC 양상. M9 배지 (대조군), 및 지수기의 P. 푸티다 참조 균주 및 PF-11 분비 단백질 사이의 비교. 참조 균주는 고농도에서 가장 높은 단백질성 분자량을 가진 반면, 균주 11은 첫 번째 내용물의 크기와 약간 겹치지만, 대부분 수 kDa을 따라 분포된 펩티드를 주로 나타낸다.
도 4B. 슈도모나스 PF-11 단리 균주 분비 단백질의 HPLC 양상. SDS-PAGE 후에, 예상되는 바와 같이, 지수기와 비교하여, 정지기 시크레톰은 펩티드의 상당히 더 높은 다양성 및 수준을 갖는다.
도 5. PF-11 시크레톰의 표면 장력의 결정.
도 6. E. 콜라이, S. 아우레우스 및 P. 아에루지노사 참조 균주의 조 추출물에 대한 PF-11 시크레톰의 분해 효소 활성의 분석.
도 7A. 이전에 사용된 독성 임상 병원성 단리 균주인 에스케리치아 콜라이 O157 및 메티실린-내성 S. 아우레우스 (MRSA) ATCC 33591 및 비-병원성 E. 콜라이 및 S. 아우레우스에 대한 상이한 농도의 PF-11 시크레톰의 성장 저해 검정.
도 7B. 이전에 사용된 독성 임상 병원성 단리 균주인 에스케리치아 콜라이 O157 및 메티실린-내성 S. 아우레우스 (MRSA) ATCC 33591 및 비-병원성 E. 콜라이 및 S. 아우레우스에 대한 상이한 농도의 PF-11 시크레톰의 성장 저해 검정. PF-11 시크레톰의 분리된 펩티드 분획의 효과.
도 7C. 이전에 사용된 독성 임상 병원성 단리 균주인 에스케리치아 콜라이 O157 및 메티실린-내성 S. 아우레우스 (MRSA) ATCC 33591 및 비-병원성 E. 콜라이 및 S. 아우레우스에 대한 상이한 농도의 PF-11 시크레톰의 성장 저해 검정. PF-11 시크레톰의 더 큰 분자 분획의 효과.
도 7D. 이전에 사용된 독성 임상 병원성 단리 균주인 에스케리치아 콜라이 O157 및 메티실린-내성 S. 아우레우스 (MRSA) ATCC 33591 및 비-병원성 E. 콜라이 및 S. 아우레우스에 대한 상이한 농도의 PF-11 시크레톰의 성장 저해 검정. PF-11의 보일링된 전체 시크레톰의 효과.
도 8A. 참조 균주 P.푸티다 KT2440 및 7종의 선택된 환경 단리 균주 (PF-08, PF-09, PF-11, PF-13, PF-29, PF-50 및 PF-57)로부터 추출된 단백질 프로파일을 갖는 SDS-PAGE 겔. M9 배지에서 성장한 정지상 세균의 세포내 범용 단백질 프로파일. 로우딩된 샘플은 동량의 총 단백질에 상응한다.
도 8B. 참조 균주 P. 푸티다 KT2440 및 7종의 선택된 환경 단리 균주 (PF-08, PF-09, PF-11, PF-13, PF-29, PF-50 및 PF-57)로부터 추출된 단백질 프로파일을 갖는 SDS-PAGE 겔. TCA/아세톤을 이용한 침전에 의해, 동일한 성장 조건에서 성장된 동일한 균주의 상청액으로부터 회수된 분비 단백질. 과다 로우딩을 피하기 위해 1:8로 희석된 PF-11을 제외하고, 로우딩된 샘플은 동량의 수집된 상청액에 상응한다. 대조군 레인은 비-접종된 성장 배지 M9에 상응한다.
도 8C. 참조 균주 P.푸티다 KT2440 및 7종의 선택된 환경 단리 균주 (PF-08, PF-09, PF-11, PF-13, PF-29, PF-50 및 PF-57)로부터 추출된 단백질 프로파일을 갖는 SDS-PAGE 겔. OD600 nm가 0.1 내지 1.2 (1.2는 후기 정지기에 상응함)인 성장 곡선을 따라서 PF-11에 의해 배지 내로 분비된 단백질의 프로파일. 겔 내로 적용된 샘플은 각각 40, 30, 20, 4, 및 2 ml 배양 부피의 상청액에 상응한다. M: 분자량 마커.
도 9A. 상청액 중의 총 단백질의 양 (mg)에 대한 프로테아제 당량 (μg)으로 측정된, 지수기 (11 EXP) 및 정지기 (11 STAT)에서 PF-11 시크레톰의 단백분해 활성.
도 9B. 인큐베이션 온도 (15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45℃)에 따른 카제인에 대한 성장 정지기에서 수집된 PF-11 시크레톰의 단백분해 활성. 데이터는 100% 활성이 단백질 1 mg 당 115 μg에 상응하는 상대적 백분율로 표시된다 (표 1 참조).
도 9C. 효소적 턴오버 (enzymatic turnover) 평가: 37℃에서의 밤새 인큐베이션 후 PF-11 정지상 시크레톰의 단백분해 활성 (좌측).
도 9D. 효소적 턴오버 평가: 37℃에서의 밤새 인큐베이션 전 (레인 1) 및 후 (레인 2)의 PF-11 시트레톰 프로파일. 모든 실험에서 짙은 수직 막대는 최소 3 회의 독립적인 측정의 표준 편차를 나타낸다.
도 10A. PF-11 분비 단백질에 의해 분해되는 최종 단백분해 기질의 스크리닝에 사용되는 2D 대각선 SDS-PAGE 겔. E. 콜라이 ATCC 25922로부터의 총 단백질 추출물을 1D SDS-PAGE 겔에 적용하고, 음성 대조군으로서 M9 배지 및 PF-11 상청액과 함께 35℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 2차원 인큐베이션 후 실행하였고, 좌측 겔에 나타난 바와 같이, 단백분해의 부재 시에는 연속 대각선 밴드를 나타낸다. 화살표는 1차 차원의 이동 방향을 나타낸다.
도 10B. PF-11 분비 단백질에 의해 분해되는 최종 단백분해 기질의 스크리닝에 사용되는 2D 대각선 SDS-PAGE 겔. 도 10A와 동일하지만, 상기에 기술된 바와 같이 준비된 성게 접착성 풋프린트 (adhesive footprint)의 단백질 추출물을 사용한다.
도 11. M9 배지 (대조군), PF-11 및 KT2440 배양물 및 상청액 (SN)과 함께 인큐베이션된 해양 생물막. 수족관에 침전된 회수된 페트리 디쉬를 18시간 및 40시간의 인큐베이션 후 부착된 세균 및 미세조류의 제거를 시험하는데 사용하였다.
도 12. 크리스탈 바이올렛으로 착색된, M9 배지 (대조군), PF-11 및 KT2440 배양물 및 상청액 (SN)과 함께 인큐베이션된 성게 접착성 풋프린트. 마지막 2개 슬라이드는 보일링된 PF-11 상청액이 생물학적 접착제 (보일링된 PF-11 SN)의 파괴에 아무런 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
도 13A. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 소 혈청 알부민이 첨가된 영양 배지에서의 성장 (NB+BSA).
도 13B. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 젤라틴이 첨가된 영양 배지에서의 성장 (NB+젤라틴). 값은 두 측정값의 평균을 나타내며 오차 막대는 각각의 표준 편차를 나타낸다.
도 14A. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 소 혈청 알부분이 첨가된 질소원 부재의 M9에서의 성장 (M9-N+BSA). 값은 두 측정값의 평균을 나타내며 오차 막대는 각각의 표준 편차를 나타낸다.
도 14B. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 젤라틴이 첨가된 질소원 부재의 M9에서의 성장 (M9-N+젤라틴). 값은 두 측정값의 평균을 나타내며 오차 막대는 각각의 표준 편차를 나타낸다.
도 14C. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 소 혈청 알부민이 첨가된 탄소원 부재인 M9에서인 성장 (M9-G+BSA). 값은 두 측정값의 평균을 나타내며 오차 막대는 각각의 표준 편차를 나타낸다.
도 14D. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 젤라틴이 첨가된 탄소원 부재인 M9에서인 성장 (M9-G+젤라틴). 값은 두 측정값의 평균을 나타내며 오차 막대는 각각의 표준 편차를 나타낸다.
도 14E. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 소 혈청 알부민이 첨가된 슈도모나스 최소 배지에서의 성장 (PMM+BSA). 값은 두 측정값의 평균을 나타내며 오차 막대는 각각의 표준 편차를 나타낸다.
도 14F. 물 (O), P. 푸티다 및 P. 아에루지노사 참조 균주 KT2440 및 NTC, 각각, 및 환경 단리 균주 PF-11 (양성 대조군) 및 PF-29 (음성 대조군)의 접종물에 의해 표준화된 바와 같은 백분율 성장. 젤라틴이 첨가된 슈도모나스 최소 배지에서의 성장 (PMM+젤라틴). 값은 두 측정값의 평균을 나타내며 오차 막대는 각각의 표준 편차를 나타낸다.
도 15. 선택된 단리 균주의 세포외 단백질 가수분해 활성의 시각적 정밀조사. 15분, 8시간, 72시간, 및 2개월 동안의 M9 완전 배지 성장 배양에 노출된 후에, 광막 (photofilm)의 표면 젤라틴 층의 분해에 대한 평가.
도 16A. 참조 균주 P. 푸티다 KT2440 (1) 및 선택된 환경 단리 균주 PF-09, PF-11, PF-29 및 참조 균주 NTC로부터의 분비 단백질의 SDS-PAGE 단백질 프로파일. 분비 단백질을 TCA/아세톤을 이용한 침전에 의해 상청액으로부터 회수하였다. 로우딩된 샘플은 동량의 수집된 상청액에 상응한다 - 겔의 좌측에 분자량 마커가 표시된다.
도 16B. 젤라틴 자이모그래프 (zymograph)에서 분비된 단백질의 세포외 프로테아제 프로파일.
도 17A. 샘플을 10 mM PMSF 및/또는 10 mM EDTA 저해제와 인큐베이션한 후 젤라틴 자이모그래프에서 슈도모나스 아에루지노사 NTC 27853 참조 균주 환경 단리 균주의 분비된 단백질의 세포외 프로테아제 프로파일.
도 17B. 샘플을 10 mM PMSF 및/또는 10 mM EDTA 저해제와 인큐베이션한 후 젤라틴 자이모그래프에서 슈도모나스 PF-11 환경 단리 균주의 분비된 단백질의 세포외 프로테아제 프로파일.
도 18A. 분류학적 상동성에 의해 분류된 PF-11 시크레톰 단백질.
도 18B. 분자적 기능에 의해 분류된 PF-11 시크레톰 단백질.
도 18C. 효소적 활성에 의해 분류된 PF-11 시크레톰 단백질.
도 19. 성장의 지수기 중반에서 PF-11의 첨가 후, 해양 브로쓰에서 코베티아 마리나 (Cobetia marina)의 세균 성장 곡선의 평가.
도 20. OD600nm 및 mg/L에 상응하는 ppm으로 PF-11 농도 (w/v)에 의해 결정된 성장의 %로 측정되는, 브로쓰 미량희석 시험에 의한, 2가지 해양 세균, 비브레오 콜레라 (Vibrio cholera) 및 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus)의 성장에 대한 PF-11의 항미생물 효과.
도 21. 크리스탈 바이올렛 착색으로 결정된 부착된 세포 밀도의 %로 측정된, 세균 생물막 형성의 PF-11 방지. PF-11 농도는 mg/L에 상응하는, ppm (w/v)이다.
도 22. 1종의 해수 [테트라셀미스 수에시카 (Tetraselmis suecica)] 및 2종의 담수 [클라마이도모나스 레인하르드티 (Chlamydomonas reinhardtii) 및 슈도키르치네리엘라 서브캐피타타 (Pseudokirchneriella subcapitata)] 미세조류 성장에 대한 PF-11의 살조제 (algaecide) 효과. PF-11 농도 (g/L).
도 23. 상이한 농도의 PF- 11 시크레톰에 대한 아노펠레스 아트로파르부스 (Anopheles atroparvus) 유충의 생존능 검정.
도 24. 바닷물이 유생 (Copepodids)에 대한 상이한 농도의 PF-11 시크레톰의 생존능 검정.
도 25. 바닷물이 유충에 대한 상이한 농도의 PF-11 시크레톰의 생존능 검정.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 언급되거나 또는 맥락에 의해 다르게 요구되지 않는 한, 다음의 용어 각각은 하기에 개시된 바와 같은 정의를 갖는다.
포괄적 정의
본원에 사용된 바와 같이, 수치 또는 범위의 맥락에서 "약"은 맥락이 더 제한된 범위를 요구하지 않는 한, 언급되거나 청구된 수치 또는 범위의 ±10%를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "시크레톰"은 세포에 의해 생산되고 분비된 유기 분자 및 무기 원소의 총체를 의미한다. 성장 조건이 명시되는 경우, 시크레톰은 그러한 성장 조건하에서 세포에 의해 생산되고 분비된 유기 분자 및 무기 원소의 총체이다. 시크레톰이 세포 상청액에서 회수될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동적으로 연결된"은 구성요소들이 그들의 정상적인 기능을 수행하도록 구성되는 병렬구조 (juxtaposition)를 지칭한다. 예를 들어, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 대조군 서열 또는 프로모터는 코딩 서열의 발현을 초래할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "슈도모나스 균주 PF-11의 세포"는 슈도모나스 균주 PF-11의 세포 또는 이들의 임의의 자손을 지칭한다. 슈도모나스 균주 PF-11은 Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) (주소: Inhoffenstr. 7B 38124 Braunschweig)에 2015년 6월 2일자로 기탁번호 DSM 32058로 기탁되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 미생물의 "실질적으로 순수한 배양물"은 배양물 중의 다양한 미생물 (예컨대, 세균, 진균 (효모 포함), 마이코플라즈마, 또는 원생동물) 세포의 총 개수의 약 40% 미만 (즉, 약: 35%; 30%; 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0.5%; 0.25%; 0.1%; 0.01%; 0.001%; 0.0001% 미만; 또는 그 이하)이 상기 미생물 이외의 생존 가능한 미생물 세포인, 미생물의 배양물이다.
본원에 사용된 바와 같이, 슈도모나스 균주 PF-11 세포로 "농축된"은 자연계에서 발견되는 슈도모나스 균주 PF-11 세포의 임의의 농도보다 높은 슈도모나스 균주 PF-11 세포의 농도를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 하나의 위치 (예컨대, 숙주, 시스템)에서 또 다른 위치로 연결되어 있는 다른 폴리뉴클레오티드 단편 또는 서열을 운반 및 전달할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 이 용어는 생체 내 또는 시험관 내 발현 시스템을 위한 벡터를 포함한다. 비-제한적인 예시로서, 벡터는 전형적으로 에피솜으로 유지되지만 숙주 게놈 내로 통합될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"의 형태일 수 있다.
본 발명의 양태는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산하는데 효과적인 조건하에서 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는 세포를 배양하고, 하나 이상의 세포외 프로테아제를 포함하는 시크레톰을 회수함으로써 하나 이상의 세포외 프로테아제를 포함하는 시크레톰의 생산에 관한 것이다. 배양하기에 바람직한 세포는 본 발명의 세포이다. 효과적인 배양 조건은 세포외 프로테아제 생산을 허용하는데 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 효과적인 배지는 세포가 본 발명의 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산하도록 배양되는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 동화가능한 탄소, 질소 및 인산염 공급원, 및 적합한 염, 미네랄, 금속 및 다른 영양소, 예컨대 비타민을 갖는 수성 배지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 동화가능한 탄소, 질소 또는 인산염 공급원이 결여되거나 감소된 성장 제한 배지이다.
본 발명은 또한 본 발명의 세포의 상청액, 변형된 상청액, 상청액 분획, 시크레톰, 부분적으로 정제된 시크레톰, 및 시크레톰 분획을 제공한다.
배지
본 발명의 실시양태에 유용한 세균 배지의 비-제한적인 예시는 M9 배지, M9-NH4Cl-Vit B1 배지, M9-글루코스 배지, 슈도모나스용 최소 배지, 및 NB를 포함하고, 하기에 기술된다.
M9 배지: 12.8 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 g NH4Cl, 1 ml CaCl2 100 mM, 1 ml MgSO4 1 M, 20 ml 글루코스 20% 보충된 500 μl Vit B1 1%/1 L (0).
M9-NH4Cl-Vit B1 또는 M9-N 배지: 12.8 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 ml CaCl2 100 mM, 1 ml MgSO4 1 M/1 L (0),
M9-글루코스 또는 M9-G: 12.8 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 ml CaCl2 100 mM, 1 ml MgSO4 1 M/1 L (0)
슈도모나스용 최소 배지: 1 g K2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0.2 g MgSO4·7H2O, 3 mg FeCl3/1 L (Prijambada et al. 1995)
NB: 1% 펩톤, 0.6% 비프 추출물, 1% NaCl (Gaby and Hadley 1957).
약어
하기 약어가 본원에 사용된다:
BSA: 소 혈청 알부민; OD: 광학 밀도; MMP: 슈도모나스용 최소 배지; M9-N: M9-NH4Cl-Vit B1; M9-G: M9-글루코스.
실시양태
본 발명은 슈도모나스 환경 균주 PF-11의 세포를 배양하고; 상청액을 화수하는 것을 포함하는, 세균 상청액을 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 슈도모나스 균주 PF-11의 세포는 세포 또는 세포의 자손이 적어도 하나의 세포외 프로테아제를 생산하는 조건하에서 배양되고, 상청액은 적어도 하나의 세포외 프로테아제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양된 세포의 수가 기하급수적인 속도로 증가할 때 상청액을 회수한다. 다른 실시양태에서, 배양된 세포의 수가 기하급수적인 속도로 증가한 후에 상청액을 회수한다. 다른 실시양태에서, 세포를 글루코스가 보충된 염 배지에서 배양한다. 다른 실시양태에서, 세포를 글루코스가 보충된 M9 배지에서 배양한다. 다른 실시양태에서, 세포를 암모늄 및 티아민이 결여된 배지에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 세포를 약 28, 29, 30, 31, 또는 32℃의 온도에서 배양한다.
일부 실시양태에서, 방법은 상청액 또는 변형된 상청액을 10 kDa 크기를 초과하는 성분들의 분획과, 10 kDa 크기 미만의 성분들의 분획으로 분류하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 상청액 또는 이의 분획의 염 농도를 감소시키고; 상청액 또는 이의 분획의 수분 함량을 감소시키고; 또는 상청액 또는 이의 분획을 살균하여, 변형된 상청액 또는 이의 분획을 생산하기 위해, 상청액 또는 이의 분획의 하나 이상의 구성성분으로부터 적어도 하나의 세포외 프로테아제를 분리하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 허용가능한 담체를 상청액, 변형된 상청액, 또는 이의 분획에 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 표면을 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 표면 위에 생물막의 양을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 생물막은 수생 생물막이다. 일부 실시양태에서, 수생 생물막은: 담수 생물막; 연못, 호수 또는 강 환경에서 성장할 수 있는 담수 생물막; 해양 생물막; 또는 담수 또는 해수 수족관에서 성장할 수 있는 해양 생물막이다.
본 발명은 또한 표면을 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 표면에 대한 적어도 하나의 유기체의 부착을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 유기체는 조류, 성게, 따개비 (barnacle), 또는 이끼벌레 (bryozoans zooid)이다.
본 발명은 또한 표면을 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 표면 위에 미세부착물 (microfouling) 또는 거대부착물 (macrofouling)을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 표면은 유리, 섬유유리, 울, 고무, 플라스틱, 또는 금속이다. 다른 실시양태에서, 표면은 수족관, 수영장, 부표, 선창, 또는 배 또는 바지선의 선체의 표면이다. 다른 실시양태에서, 표면은 어망 또는 물에 놓인 다른 그물의 표면이다. 다른 실시양태에서, 표면은 로프이다. 다른 실시양태에서, 표면은 벽 또는 천장 구조물의 표면이다.
일부 실시양태에서, 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 페이트 또는 투명 코팅이다.
본 발명은 또한 진균을 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 진균을 사멸하거나 이의 성장을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 곤충을 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 곤충을 사멸하거나 이의 발생을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 해양 요각류를 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 해양 요각류를 사멸하거나 이의 발생을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세균 세포를 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세균 세포를 사멸하거나 이의 성장을 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 상청액 분획 또는 변형된 상청액 분획은 슈도모나스 균주 PF-11 시크레톰의 10 kDa 크기 초과의 성분들을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상청액 분획 또는 변형된 상청액 분획은 슈도모나스 균주 PF-11 시크레톰 10 kDa 크기 미만의 성분을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세균 세포는 슈도모나스 spp., 슈도모나스 아에루지노사, 또는 슈도모나스 세포 이외의 것이다. 다른 실시양태에서, 세균 세포는 스타필로코커스 spp., 스타필로코커스 아우레우스, 또는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스 세포이다. 다른 실시양태에서, 세균 세포는 에스케리치아 spp., 에스케리치아 콜라이 세포, 또는 에스케리치아 콜라이 O157 세포이다.
본 발명은 또한 슈도모나스 균주 PF-11의 실질적으로 순수한 배양물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 순수한 배양물의 세포는 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 유전자 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 변형되어 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 순수한 배양물의 세포는 슈도모나스 균주 PF-11의 상응하는 세포에 비해 항생제 화합물에 증가된 감수성을 갖도록 유전적으로 변형되어 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 순수한 배양물은 배양물 중의 생육가능한 미생물의 총 개수의 약 40%; 35%; 30%; 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0.5%; 0.25%; 0.1%; 0.01%; 0.001%; 0.0001% 미만; 또는 그 이하가 슈도모나스 균주 PF-11 세포 이외의 생육 가능한 세포인 것이다.
본 발명은 또한 슈도모나스 균주 PF-11로 농축된 배양물을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 실시양태의 임의의 하나의 세포, 또는 이의 상청액, 변형된 상청액, 또는 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기술된 실시양태의 임의의 하나의 세포, 또는 이의 상청액, 변형된 상청액, 또는 분획을 포함하는 방오 또는 항미생물 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명은 또한 세균이 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는지 여부를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: i) 세균 세포를 고분자량 기질이 보충된 성장 제한 배지 중에 배치하는 단계; ii) 세포가 고분자량 기질이 보충된 성장 제한 배지에서 성장하는지 여부를 결정하는 단계; 및 iii) 만약 세포가 단계 ii)에서 성장하는 것으로 결정된다면 세균을 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는 것으로 확인하고, 만약 세포가 단계 ii)에서 성장하지 않는 것으로 결정된다면 세균을 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 없는 것으로 확인하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 고분자량 기질이 보충된 성장 제한 배지에서 세포의 수가 적어도 0.5, 1, 3, 4, 5, 또는 1-24시간에 걸쳐서 적어도 1, 5, 10, 100, 1000, 또는 10,000-배 증가하는 경우, 세포는 성장한 것으로 결정된다.
일 실시양태에서, 성장 제한 배지는 염 배지이다. 다른 실시양태에서, 성장 제한 배지는 글루코스가 보충된 염 배지이다. 다른 실시양태에서, 성장 제한 배지는 글루코스가 보충된 M9 배지이다. 다른 실시양태에서, 성장 배지는 암모늄 및 티아민이 결여된다. 다른 실시양태에서, 성장 제한 배지는 약 28, 29, 30, 31, 또는 32℃의 온도에서 유지된다. 다른 실시양태에서, 성장 제한 배지는 액체이다. 다른 실시양태에서, 성장 배지는 한천을 포함한다.
일 실시양태에서, 고분자량 기질은 세균 세포의 세포벽 또는 세포막을 통과할 수 없다. 다른 실시양태에서, 고분자량 기질은 내재화되고 세포의 성장에 사용되기 위하여 분해되어야 한다. 다른 실시양태에서, 고분자량 기질은 젤라틴, 카제인, 헤모글로빈, 또는 소 혈청 알부민 (BSA)이다.
일 실시양태에서, 단계 i)의 세균 세포는 고분자량 기질을 포함하는 성장 제한 배지로 희석되는 완전 배지로부터 수득된다.
본원에 기술된 임의의 실시양태는 본원에 기술된 목적, 목표, 및 필요 중 적어도 하나와 일치하는 임의의 방식으로 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있고, "실시양태", "일부 실시양태", "대안적인 실시양태", "다양한 실시양태", "일 실시양태" 등에 대한 언급은 반드시 상호 배타적인 것은 아니며, 실시양태와 관련하여 기술된 고유한 특징, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 실시양태에 포함될 수 있음을 나타내기 위한 것이다.
배양
세균 세포를 배양하는 방법은 통상의 기술자에게 공지될 것이며 본원에 기술된 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 세포는 통상적인 발효 생물반응기, 쉐이크 플라스크, 테스트 튜브, 미세역가 디쉬, 및 페트리 디쉬에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 이러한 배양 조건은 통상의 기술자의 전문적 기술 범위 내이다.
시크레톰 또는 시크레톰을 포함하는 상청액의 하나 이상의 성분들로부터 세포외 프로테아제를 분리하는 비-제한적인 방법에는 투석, 한외여과, 초원심분리 및 크로마토그래피 방법 (이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 팽창된 베드 흡착 (EBA) 크로마토그래피 분리, 역상 크로마토그래피, 신속 단백질 액체 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)이 포함된다.
시크레톰을 포함하는 상청액을 회수하기 위해 배양 배지로부터 세포를 제거하는 방법의 비-제한적인 예시에는 원심분리, 여과, 또는 침강이 포함된다. 상청액, 변형된 상청액, 또는 이의 분획의 수분 함량을 감소시키는 방법의 비-제한적인 예시에는 증발, 저분자량 막을 이용한 투석 또는 여과, 동결 건조, 분무 건조 및 드럼 건조가 포함된다.
본 발명의 조성물
본 발명의 조성물은, 본원에서 "허용가능한 담체"로도 지칭되는, 부형제를 포함한다. 부형제는 처리될 표면이 용인할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 부형제의 예시에는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 행크 용액 (Hank's solution), 및 기타 생리학적으로 균형 잡힌 염 용액이 포함된다. 비수성 비히클, 예컨대 고정 오일, 참기름, 에틸 올리에이트, 또는 트리글리세라이드가 또한 사용될 수 있다. 다른 유용한 제제에는 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 점도 증진제를 함유하는 현탁액을 포함한다. 부형제는 또한 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 함유할 수 있다. 완충제의 예시에는 인산염 완충제, 중탄산염 완충제 및 Tris 완충제가 포함되는 반면, 보존제의 예시에는 티메로살 또는 o-크레솔, 포르말린 및 벤질 알코올이 포함된다. 예를 들어; 이들로 제한되지는 않지만, 중합체성 제어 방출 비히클, 생분해성 임플란트, 리포좀, 세균, 바이러스, 다른 세포, 오일, 에스테르, 및 글리콜과 같은 부형제가 또한 조성물의 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 코팅이거나 코팅과 혼합된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 페인트이거나 페인트와 혼합된다. 일 실시양태에서, 페인트는 수성-기반 페이트이다. 다른 실시양태에서, 페인트는 유성-기반 페이트이다. 다른 실시양태에서, 페인트는 해양 페인트이다. 다른 실시양태에서, 페인트는 용매 또는 희석제를 함유하지 않는다. 코팅 또는 페인트는 수족관의 유리, 수영장의 벽체 (lining), 수산양식 그물, 또는 배의 선체와 같은, 본원에 기술된 하나 이상의 표면에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 환경 내로 또는 표면 위에 본 발명의 조성물을 서서히 방출할 수 있는 제어 방출 제제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 제어 방출 제제는 제어 방출 비히클 내에 본 발명의 조성물을 포함한다. 적합한 제어 방출 비히클에는 생분해성 중합체, 다른 중합체성 매트릭스, 캡슐, 마이크로캡슐, 미세입자, 볼루스 제제, 삼투압 펌프, 확산 장치, 리포솜, 리포스피어, 및 경피 전달 시스템이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 제어 방출 제제는 생분해성 (즉, 생부식성)이다. 서방출 조성물은 유동적인 물에 사용하기에 특히 적합하다. 제제는 바람직하게는 약 1 내지 약 12개월 범위의 기간에 걸쳐 방출된다. 본 발명의 바람직한 제어 방출 제제는 바람직하게는 적어도 약 1개월, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3개월, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 6개월, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 약 9개월, 및 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 약 12개월간 치료 효과를 발휘할 수 있다
대안적인 실시양태에서, 조성물은 건조 조성물이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 세포의 건조 추출물, 예컨대 본 발명의 상청액 또는 시크레톰이다. 액체 조성물은 당해 분야에 공지된 임의의 기법, 예컨대 동결 건조, 분무 건조 및 드럼 건조를 이용하여 건조될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 건조 조성물은 코팅 또는 페인트에 첨가제로서 사용될 수 있다.
세포의 변형
실시양태에서, 본 발명의 세포는 그의 자연 발생적인 대응물로부터 변형되었다. 일 실시양태에서, 세포는 그의 자연 발생적인 대응물에 비해 항생제에 내성이거나 또는 그에 대해 증가된 내성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 세포는 그의 자연 발생적인 대응물에 비해 항생제에 내성이 아니거나, 또는 덜 내성이다.
본 발명의 측면은 특정 유전자형 변형을 갖는 본 발명의 세포를 선택하는 능력과 관련이 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 세포의 선택을 허용하는 외인성 선택가능 마커를 포함한다.
재조합 DNA 기법의 한 가지 공통적인 선택 전략은 클로닝된 유전자 또는 DNA 서열을, 유전적 요소를 포함하는 숙주 세포 (형질전환된 세포)를 그렇지 않은 세포로부터의 분리를 허용하는 표현형적 특성을 갖는 유전적 요소 (플라스미드, 바이러스, 트렌스포존 등)에 포함시키는 것이다. 생존 선택을 제공하는 유전자가 특히 유용하다. 따라서, 유전적 요소를 함유하는 세포의 선택은 독성 물질을 함유하고 "내성 유전자"를 발현하는 형질전환체만이 생존할 수 있는 배지에서 세포를 성장시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 발현될 때 세포의 선택을 가능케 하는 외인성 유전자를 포함한다. 본 발명의 세포의 선택을 가능케 하는 외인성 유전자의 비-제한적인 예시에는 항생제 내성 유전자가 포함된다. 바이러스 내성, 중금속 내성, 또는 폴리펩티드 내성을 제공하는 유전자가 또한 이용가능하다. 당업자는 형질전환된 숙주 세포에서 항생제 내성과 같은 내성을 코딩하는 유전자를 발현하는 유전적 요소 (예컨대, 클로닝 벡터)에 기초하는 형질전환된 세포의 선택에 대한 프로토콜을 인지할 것이다 (예컨대, US 4,237,224; Ausubel, 2000 참조). 예시적인 항생제에는 페니실린, 테트라사이클린, 스트렙토마이신 및 설파제가 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 그들의 게놈 내로 통합되는 외인성 내성 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 리포터 폴리펩티드를 발현한다. 본원에 사용된 바와 같이, "리포터 폴리펩티드"는 세포 내에서 식별 가능한 신호를 제공하거나 당해 분야에 공지된, 임의의 기법에 의해 세포 내에서 특이적으로 검출될 수 있는 폴리펩티드이다. 리포터 폴리펩티드의 예시에는 스트렙타비딘, 베타-갈락토시다제, 에피토프 태그, 형광 단백질, 발광 단백질 및 발색 효소가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
형광 단백질은 통상의 기술자에게 잘 알려질 것이며, GFP, AcGFP, EGFP, TagGFP, EBFP, EBFP2, Asurite, mCFP, mKeima-Red, Azami Green, YagYFP, YFP, Topaz, mCitrine, Kusabira Orange, mOrange, mKO, TagRFP, RFP, DsRed, DsRed2, mStrawberry, mRFP1, mCherry, 및 mRaspberry를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 발광 단백질의 예시에는 루시퍼라제와 같이 빛을 발산하는 반응을 촉메할 수 있는 효소가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 발색 효소의 예시에는 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 알칼라인 포스파제가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
에피토프 태그의 예시에는 V5-태그, Myc-태그, HA-태그, FLAG-태그, GST-태그, 및 His-태그가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 에피토프 태그의 추가적인 예시가 하기 문헌에 기술되어 있다: Huang and Honda, CED: a conformational epitope database. BMC Immunology 7:7 www.biomedcentral.com/1471-2172/7/7#B1. Retrieved February 16, 2011 (2006); 및 Walker and Rapley, Molecular biomethods handbook. Pg. 467 (Humana Press, 2008). 이들 문헌은 그 전체가 본 출원에 참조로서 여기에 포함된다.
다른 간행물 또는 참고문헌 및 실험 세부사항에 대한 언급
본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 각각의 개별 간행물 또는 참고문헌이 구체적 및 개별적으로 참고로 포함되도록 지시된 바와 같이 그 전체가 참고로서 여기에 포함된다. 본원에 인용된 간행물 및 참고문헌은 선행기술로 인정되지 않는다.
본 발명은 하기 실험 세부사항을 참조하여 더 잘 이해 될 것이나, 통상의 기술자는 상세히 설명된 특정 실험이 그 이후에 후속하는 청구범위에 정의된 본 발명의 단지 예시일뿐이라는 것을 쉽게 인식할 것이다.
실험 세부사항
본 발명의 보다 완전한 이해를 돕기 위해 하기에 실시예가 제공된다. 하기 실시예는 본 발명을 제조하고 실시하는 예시적인 방식을 설명한다. 그러나, 발명의 범위는 단지 예시의 목적을 위한 이들 실시예에 개시된 특정 실시양태로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 - 균주 PF -11의 단리, 특성 규명 및 보존
환경 샘플링 및 세균 단리.
토양 및/또는 진흙 샘플을 포르투갈 리스본 주변의 타구스 (Tagus) 강에서 채집하였다. 채집된 재료 (10 g)를 멸균수 (50 mL)로 균질화하였다. 혼합물의 중력 침감 후, 액체 분획을 회수하였다. 그 후에 재료 현탁액 (미생물 함유)을 원심분리 (12000 g, 5 분)로 수집하였다. 수득된 펠렛을 멸균수에 재현탁하였다. 일차 성장을 LB (Luria Bertani) 배지에서 수행하였다. 이들 배양물을 희석하고 (10-2 내지 10-9) LA (LB + 한천) 또는 암피실린 (8 μg/mL), 아목실린 (8 μg/mL) 또는 세포탁심 (2 μg/mL) 함유 LA (8 μg/mL) 중 하나에 도말하여, 내성 또는 감소된 감수성을 나타내는 균주를 선택하였다. 크기 또는 형태에 있어서 식별가능한 차이를 나타내는 콜로니를 선택하였다. 각각의 선택된 콜로니를 연속 플레이트 계대 (최대 3회)에 적용하여 순수한 배양물을 수득하였다.
단리된 균주의 동정.
그람-음성 균주의 검출을 사이클로헥시미드 (cycloheximide) 함유 선택적 McConkey nr3 배지에서 수행하였다. 생화학적 특성 규명을 수행하여 광범위한 균주 특성을 확립하였다. TSI (Triple Sugar Iron), 옥시다제 및 카탈라제 테스트로부터 덱스트로스, 락토스, 사카로스, 및 황화 화합물을 발효시키고 옥시다제 및/또는 카탈라제를 생산하는 능력을 유추하였다 (Hajna 1945). 이전의 결정에 따라서, 상업적으로 이용가능한 표현형 동정 시스템을 사용하여 단리된 그람-음성 세균의 정확한 동정을 수행하였다. 자동화 시스템 및 소프트웨어 (BioMerieux)가 결합된 API® (API 20E 및 API ID32 GN) 테스트 스트립을 사용하여 ≥ 99.5%의 정확도로 동정하였다. 단리된 균주 PF-11을 99.9% 정확도를 가지고 슈도모나스 푸티다로 동정하였다.
MIC 결정.
MIC (최소 저해 농도)를 CLSI 표준 (CLSI, M02-A10; CLSI, M100-S21)에 따라서 한천 희석 및 디스크 확산에 의해 결정하였다. 간략히는, MIC를 결정하기 위해 시험될 항생제의 연속 희석액으로 보충된 LA 플레이트를 제조하였다. 균주의 성장을 방지하는 가장 낮은 항생제 농도가 MIC 값으로 간주된다. 균주 에스케리치아 콜라이 ATCC 25922를 권고된 바와 같이, 대조군 균주로 사용하였다. 균주 PF-11은 CLSI 표준 및 EUCAST에 의한 내성 중단점 (breakpoint)의 참고치를 사용하여 암피실린, 아목실린, 세포탁심, 세프타지딤, 세폭시틴, 아즈트레오남에 내성인 것으로 결정되었다.
PF -11 균주의 보존.
균주를 여러 분액으로, 보존 배지로서 20% 글리세롤이 보충된 LB 배지를 사용하여 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2 - PF -11 배양 성장, 화합물 생산, 회수 및 분비된 화합물의 특징 규명
PF -11 성장 조건.
냉동된 세균 분액을 30℃의 LB 한천 배지에서 밤새 (16-18시간) 도말하였다. 그 후에 하나의 콜로니를 사용하여 글루코스가 보충된 M9 배지를 함유하는 멸균 플라스크에 접종하고, 16시간 동안 오비탈 셰이커에서 30℃, 120 r.p.m.으로 성장시켰다.
배양물으로부터 화합물의 회수.
세포를 4℃에서 14.000 r.p.m.으로 15분간의 원심분리에 의해 제거하고 상청액을 수집하였다. 상청액을 0.22 μm DURAPORE 필터 (Millex GP, Millipore, Ireland)가 구비된 여과 장치를 사용하는 여과에 의해 살균한다. 무균 상태 (Sterility)를 LA 플레이트에서 적어도 16시간 동안 50 μl의 상청액을 30℃에서 인큐베이션함으로써 확인한다.
화합물의 미가공 혼합물의 정제.
상청액을 -80℃로 냉동시키고 동결건조에 의해 탈수시켰다. 그 후에 이를 물에 재현탁하고 2 kDa의 컷오프 (cutoff)를 사용하여 투석을 수행하여 과량의 염을 제거하였다. 투석된 혼합물을 재-동결건조하고 분말로서 -80℃에 유지하였다.
혼합물 내 존재하는 단백질의 동정.
시크레톰 단백질을 미니-겔 포맷 (7x7 cm 테트라 시스템, Bio-Rad)으로 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (12% SDS-PAGE)에 의해 분리하였다. 레인당 20 μg의 단백질을 사용하였다. 샘플을 MilliQ 워터로 10배 희석하고 반응 완충제 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) 글리세롤, 2% (w/v) SDS, 5% (v/v) b-머캅토에탄올)와 혼합하였다. 전기영동 전에, 샘플을 100℃에서 5분간 가열하였다. 단백질 밴드를 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하였다.
단백질 밴드를 겔로부터 수동으로 잘라내고 MilliQ 워터로 세척하고 50% (v/v) 아세토니트릴로, 이어서 100% 아세토니트릴로 변색시켰다. 시스테인 잔기를 10 mM DTT를 이용해 환원시키고 50 mM 이오도아세트아미드로 알킬화하였다. 겔 조각을 진공 하의 원심분리에 의해 건조시키고 50 mM NH4HCO3 및 6.7 ng/μL의 트립신 (변형된 돼지 트립신, 단백질공학 등급, Promega)을 함유하는 분해 완충제 중에서 4℃에서 재수화시켰다. 30분 후, 상청액을 제거하여 버리고 20 μl의 50 mM NH4HCO3을 첨가하였다. 분해는 37℃에서 밤새 진행되게 하였다. 분해 후, 잔존하는 상청액을 제거하고 -20℃에 보관하였다.
수득된 펩티드 혼합물을 ZipTip C18 (Millipore)을 이용해 탈염하고, 진공 건조시키고 분석 전에 0.1% FA 중에 재구성하였다. 나노-LC-MS/MS 셋 업은 다음과 같았다. 샘플을 Finnigan Micro AS 오토샘플러를 통해 주입하고 Micro AS-Surveyor MS 크로마토그래피 시스템을 사용하여 15 μl/분의 유속으로 NanoEase 트랩 칼럼 Symmetry 300™, C18, 5 μm (Waters)에 로우딩하였다. 펩티드를 0% B에서 10분의 이소크래틱 (isocratic) 용출, 10분간의 0% 내지 15% B, 70분간의 15% 내지 60% B, 및 20분간의 60% 내지 100% B의 선형 구배를 갖는 3개의 연속 단계, 이어서 10분간의 100% B에서의 이소크래틱 용출을 포함하는 (A = H2O 중의 0.1% FA, B = CH3CN 중의 0.1% FA), C18 PepMap 100, 3 μm 모세관 칼럼 (75 μm, 15 cm) (Dionex, LC Packings)을 사용하여 160분간 실행하여 분리하였다. 펩티드 분리에 사용되는 110 nl/분 유속은 인-하우스 스플리터 (splitter) 시스템에 의해 제공하였다. 칼럼 배출구를 7 T LTQ-FT Ultra에 연결된 TriVersa NanoMate의 LC 커플러에 연결시켰다. 질량 분석기를 데이터 의존적 방식으로 작동시켰다. 최대 10개의 스캔당 가장 강렬한 이온을 단편화하고 선형 이온 트랩에서 검출하였다. FTICR 셀 및 선형 트랩으로의 이온 전송은 측량 전체 스캔의 경우 1백만 카운트로, MS/MS 실험의 경우 50,000 카운트로 충전 용량을 설정함으로써 분석기의 최적 성능을 위해 자동으로 제어되었다. MS/MS에 대해 이미 선택된 표적 이온을 60초 동안 동적으로 제외하였다. Sequest 및 Mascot 엔진을 사용하는 Proteome Discoverer 소프트웨어 v1.2 (Thermo)로 데이터베이스 서치를 수행하였다. 사용된 데이터베이스는 Swissprot 및 NCBInr이었다.
Blast2GO 프로그램을 동정된 단백질의 기능적 분석을 위해 사용했는데, 이는 3개의 주요 단계로 구성된다: 상동 서열을 찾기 위한 블라스트, 블라스트 히트와 연관된 GO-용어를 수집하기 위한 맵핑, 및 상기 맵핑에서 수집된 GO 용어의 풀 (pool)로부터 쿼리 서열에 대한 기능적 용어의 할당. 기능적 할당은 GO 데이터베이스를 토대로 한다. 동정된 단백질의 서열 데이터는 Blast2GO 소프트웨어에 의한 배치 분석을 위해 다중 FASTA 파일로서 업로드되었다. Blastp를 사용하는 공공의 Swissprot 데이터베이스에 대해 블라스트 단계를 수행하였다. 다른 매개변수는 디폴트 값으로 유지되었는데: e-값 역치는 1e-3이고 서열당 20 히트의 복구가 유지되었다. 나아가, 최소 정렬 길이 (hsp 필터)를 100개 뉴클레오티드보다 작은 영역과 매칭하는 히트를 회피하기 위해 33으로 설정하였다. QBlast-NCBI를 Blast 모드로 설정하였다. 1.0E-6의 e-값-히트-필터를 갖는 주석 형상, 55의 주석 컷오프 및 5의 GO 중량이 선택되었다. 정보의 압축된 표시를 얻기 위해 20의 서열 필터를 사용하여, 동정된 단백질을 조합된 그래프의 분석 도구를 사용하는 GO 카테고리의 선택된 하위 그룹 (예컨대, 분자 기능)으로 분류하였다.
질량 분석 및 상동성 조사 분석은 PF-11 시크레톰이 적어도 171종의 단백질을 함유함을 나타내었다. 동정된 단백질의 기능적 분석은 시크레톰 단백질이 1) 속 슈도모나스, 더욱 특이적으로 슈도모나스 아에루지노사로부터의 단백질과 높은 상동성을 나타내고 (도 18A); 2) 시크레톰 단백질의 36%가 촉매 활성을 가지며 (도 18B), 3) 이들 중에서, 히드롤라제가 시크레톰 내 가장 풍부한 효소임 (도 18C)을 나타내었다.
실시예 3 - 환경 기원으로부터의 항미생물제
강력한 적응 능력을 지닌, 항생제에 대한 내성을 통한 이전의 연구 과정 (Meireles 2013)에서 수집된, 슈도모나스 푸티다 환경 균주의 이질적인 컬렉션을 사용하여 미생물 성장 조절을 위한 분비된 천연 화합물의 잠재력을 스크리닝하였다. Meireles 2013의 내용은 본 출원에 참고로서 여기에 포함된다. 다양한 범위의 균주 특성을 수집하는 것을 목표로, 컬렉션으로부터 한 세트의 P. 푸티다 단리 균주를 그들의 적응 수준, 항생제 내성 및 일반적인 적합성 (데이터 미제시)을 기준으로 선택하였다. 이들 균주의 시크레톰 (즉, 이들의 분비 분자들)을 수집하고 에스케리치아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스 및 슈도모나스 아에루지노사의 3가지 유형의 균주 장르에 대해 먼저 시험하였다. 한 균주 PF-11은 뛰어난 항미생물 잠재력을 나타내었다. 그 후에, 이 초기 세트를 그로부터 시크레톰이 수집된 모든 P. 푸티다 균주로 확대시켰다. 항미생물 특성을 보유하는 화합물의 초기 특성 규명을 수행하여 그의 영향에 기여할 수 있는 펩티드, 효소 및 계면활성제의 존재를 나타내었다. 마지막으로, 병원성 균주에 대한 PF-11 시크레톰의 영향을 시험하고 감염 치료에 있어서 향후 응용 가능성을 평가하기 위해, 임상 균주 MRSA (메티실린 내성 S. 아우레우스) 및 독성 E. 콜라이 O157의 성장을 분석하였다. 따라서, 환경으로부터 단리된, P. 푸티다 PF-11은 항생제로서 향후 응용에 높은 잠재력을 갖는 항미생물 화합물의 강력한 분비자인 것으로 확인되었다.
재료 및 방법
세균 환경 단리 균주 및 시험 균주
이전에, 65종의 슈도모나스 푸티다의 환경 컬렉션을 토양으로부터 분리하고, 육안으로 선택하고, 획득 항생제 내성 메커니즘에 대해 동정하고 특성을 규명하였다 (Meireles 2013). 토양 및 진흙 샘플을 포르투갈 리스본 지역의 테조 (Tejo) 강 근처의 여러 위치에서 수집하였다. 예비적인 표현형 분석 후, 주요 적응 능력 (빠른 성장, 최소 영양소 요건) 및 항미생물 다중-내성 프로파일을 나타낸 7종의 P. 푸티다 균주 (PF-8, PF-9, PF-11, PF-13, PF-29, PF-50, PF-57)를 이들의 항미생물 화합물의 분비에 대해 스크리닝하기 위해 선택하였다.
세균 배양 성장 조건
사용된 모든 균주를 -80℃에서 5% 글리세롤 중에 보관하였고 M9 배지에 접종하기 전에 35℃의 LA (Luria broth Agar)에서 밤새 도말하였다. 단일 콜로니를 0.4% 글루코스가 보충된 액체 M9 최소 배지 (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl, 18.7 mM NH4Cl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 0.0005% 티아민)에 35℃, 120 r.p.m.으로 1, 2, 4, 6, 또는 24시간 (후자는 정지기로 정의되었음) 동안 접종하였다.
세균 배양물으로부터 상청액의 제조
M9 배지 중의 세균 배양물으로부터 상청액을 회수하고 이전에 기술된 바와 같이 (Roy et al.), 여과 장치에서 0.22 μm 나일론 필터 (Millex GP, Millipore, Ireland)를 통해 살균-여과하였다. 살균 상태를 확인하기 위하여, 100 μl의 각 상청액을 적어도 16시간 동안 35℃에서 인큐베이션하였다.
항미생물 실험을 위해, 여과된 상청액을 직접 사용하였고; 시험관 내 단백분해 검정을 위해, 상청액을 -50℃에서 동결건조하고 물에 현탁한 후 수집된 상청액의 최초 부피에 대해 20배 농축하였다.
배양물 조 단백질 추출 및 분리
균주를 지시된 조건에서 LB에서 밤새 성장시켰다. 그 후에 배양물을 10000 g에서 10분간 원심분리하여 세균 펠렛을 수득하였다. 단백질 추출 완충제를 첨가하고 5분간 끓여서 세포를 용해시켰다. 단백질을 280 nm의 Nanodrop 장치 측정 (Bio-Rad)에서 정량하고 최종 10 μg/10 μl로 균질화하였다. SDS-PAGE용 12.5% PAA 겔에 샘플을 로우딩하기 직전에 쿠마시 블루 브릴리언트® (Sigma) 및 1% β-머캅토에탄올 함유 1:1 vol의 단백질 로우딩 완충제를 첨가하였다.
세균 배양물으로부터 상청액의 제조
선택된 세균 단리 균주를 35℃에서 16시간 동안 도말하고 추가 48시간까지 보관하였다. 콜로니를 글루코스가 보충된 Luria Bertani (LB) 브로쓰 또는 M9 최소 배지 중에서 35℃, 120 r.p.m.으로 1, 2, 4, 6, 또는 24시간 (정지기) 동안 성장시켰다. 배양물이 목표한 성장기에 도달한 후에 이들을 순차적 사용을 위해 보관하거나, 또는 10000 g에서 15분간 원심분리하였다. 상청액을 여과 장치 내 0.2 μm 기공 나일론 필터 (Millex GP, Millipore, Ireland)로 여과하였다. 살균 상태를 확인하기 위하여, 1 mL의 각 상청액을 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 분획이 필요한 경우에는 여과된 상청액을 10 kDa 컷오프를 갖는 아미콘 튜브에서 원심분리하고 상부 분획을 M9 배지 중에 유사한 최종 부피로 재용해시켜, 분획 농도 또는 완충제 조성에서의 변화를 회피하였다. 단백질 변성을 촉진하기 위해 열 불활성화 여과된 상청액을 10분간 100℃의 끓는 물 중에서의 인큐베이션을 통해 달성하였다. 4℃에서 1 또는 2주간 휴지된 바로 앞서 기술된 임의의 분획을 이용해 일부 실험을 수행하여, 다당류 및 계면활성제 특성을 온전히 유지하면서 단백분해 활성을 "소실"시키고 분획 과정에서 분자의 비특이적 감소를 회피하기 위해 이들을 개별적으로 평가하였다. 각 실험마다 적어도 3회의 독립적인 반복이 수행되었다. HPLC 분석을 위해, 여과된 상청액 (200 ml)을 -20℃에 보관하고 -54℃에서 동결건조시키고, 마지막으로 5 ml의 이중 증류수에 재-현탁하고; 펩티드가 분석될 수 있도록 펩티드 분획을 10 kDa 컷-오프로 분리하였다.
세균 단백질 분해 연구
E. 콜라이 유형 균주로부터 추출된 200 μg의 총 단백질을 4 내지 7 μg/μL의 최종 농도로 상청액과 (개별적으로) 혼합하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 프로테아제 활성을 저해하기 위하여, 4-아미디노페닐메탄설포닐 플루오라이드 히드로클로라이드 (amidinophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride)를 25 μm의 최종 농도로 첨가하였다. 반응의 내용물을 로우딩 염료와 (6회) 혼합하고 SDS-PAGE로 분리하였다. 동일한 절차를 수행하여 상이한 온도, 구체적으로 15 내지 45℃에서 매 5℃마다 정지상 11종 단리 균주 시크레톰의 활성을 측정하였다. 이 절차를 다시 이용하여 4℃에서 저장 시간에 따른 시크레톰의 단백분해 활성의 소실을 평가하였다. 최소 3회 독립적 반복이 각 실험마다 수행되었다.
배양 상청액 중의 단백질 검출
단리 균주를 LB 배지에서 지시된 조건하에서 밤새 성장시킨 후, 배양물을 10000 g에서 15분간 원심분리하여 세균 펠렛을 수득하고, 상청액을 회수하고, 이전에 기술된 바와 같이 (Roy et al.) 0.2 μm 필터 (Millipore)를 통해 살균-여과하였다. 그 후에 동량의 단백질을 인접한 웰 상에 로우딩하고, 12.5% SDS-PAGE에 의해 분리하였다.
HPLC에 의한 PF -11 분비 펩티드의 분리
HPLC 시스템은 LDC, Milton Roy, Consta Metric 1 펌프, 및 Lichrosorb RP-18 (Merck Hibar) 칼럼 (5 μm의 입자 크기, 길이-125 mm, 내경-4 mm)으로 구성된다. 펌프 압력은 60 MPa였다. 주입기는 자동식이었다 (Rheotype Gilson Abimed Model 231). 검출기는 형광 분광광도계를 구비하였다 (Shimadzu RF 535, 감마 여기-365 mm 및 감마 방출-444 nm). 유속은 분당 1 mL였고, 주입 부피는 50 μl였다. 이동상은 물/아세토니트릴이었다 (75:25).
표준 용액
AFM1, AFB1, AFB2, AFG1, 및 AFG2를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 입수하였다. AFM1의 상업적 스톡 용액은 1,000 ng/mL였다. HPLC 등급의 아세토니트릴/물을 사용하여 대략 25 ng/mL을 제공하도록 스톡 용액을 1:40으로 희석하여 스파이크 용액을 제조하였다. 희석된 스톡 용액 중에서, 140 μl를 70 mL의 탈지된 Hipp 유아용 우유에 첨가하였다. 2 μg/L의 AFM1을 1:500으로 희석하여 검량선을 작성하였다. 스톡 용액을 사용하지 않을 때는 4℃에 보관하였다.
결과
항생제 선택을 통해 이전에 수집된 슈도모나스 푸티다 환경 단리 균주의 컬렉션 (Meireles 2013)을 사용하여 미생물 성장 조절을 위한 천연 세균 수단의 잠재력을 스크리닝하였다. 이들 균주 중에서, 소수의 단리 균주가 적응 가능성 및 평균 이상의 세포외 분비능을 나타내었고 (데이터 미제시), 이에 7종의 슈도모나스 환경 단리 균주 (PF-8, PF-9, PF-11, PF-13, PF-29, PF-50, PF-57)를 선택하고 추가로 조사하였다. 먼저, 이들 선택된 단리 균주 및 대조 균주 P. 푸티다 KT2440의 세균 배양물의 상청액을 최소 배지 및 성장의 정지기에서 수집하고, 이들의 시크레톰의 항미생물 효과를 평가하였다. 수집된 상청액의 성장 저해 가능성을 인간 감염에 관여하는 3종의 광범위하게 연구된 세균 장르에 대해 시험하였다: 에스케리치아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스 및 슈도모나스 아에루지노사. 3종의 비-병원성 균주 (E. 콜라이 ATCC25922, S. 아우레우스 NCTC8325 및 P. 아에루지노사 ATCC27853)를 이 단계에서 사용하여 시크레톰의 항미생물 효과를 평가하였다. 3종의 시험 균주를 풍부 배지에서 성장시키고 상청액이 회수된 최소 성장 배지 M9으로 구성된 대조군 및 8종의 시크레톰과 16시간 동안 1:1 부피로 인큐베이션하였다 (도 1A-C). P. 아에루지노사는 7종의 단리 균주 또는 참조 균주 P. 푸티다 KT2440 중 하나에 의해 분비된 화합물에 의해 명백히 영향을 받지 않았다 (도 1A). 반대로, E. 콜라이 및 S. 아우레우스 시험 균주 둘 다는 일부 P. 푸티다 시크레톰에 의해 강력히 영향을 받았다. 서로 다른 복제물에 대해 일관된 저해 효과만을 고려하면, E. 콜라이 성장은 PF-9 및 PF-11의 시크레톰에 의해 적어도 40% 저해되었다 (도 1B). S. 아우레우스 성장 저해를 이용한 시험은 시크레톰에 더 큰 민감성을 나타내었는데, 균주 PF-13, PF-29 및 PF-50의 시크레톰은 50% 초과로 성장을 감소시키고, 특히 PF-11의 시크레톰은 S. 아우레우스의 성장을 90% 저해하였다 (도 1C). 균주 PF-11의 시크레톰이 E. 콜라이 및 S. 아우레우스 둘 다에서 가장 폭넓은 성장 저해를 나타냄을 고려하여, 이를 이후의 연구를 위해 선택하였다.
슈도모나스 PF-11의 시크레톰의 세균 성장에 대한 효과를 상기와 같이, 그러나 표적으로 이전에 사용된 모든 슈도모나스 단리 균주 및 참조 균주를 첨가하여 시험하였다. 도 2로부터의 데이터는 PF-11 균주의 배양 배지로부터 회수된 분비된 화합물이 모든 P. 푸티다 균주에 대해 대략 50%의 성장 저해의 강력한 억제 효과를 가짐을 명확히 보여주고, 이는 동일한 장르의 세균에 대한 분비 화합물의 탁월한 효과를 나타낸다. 반대로, 성장 정지기에서 PF-11의 배양물으로부터 회수된 배양 상청액을 PF-11 균주 자체에 대해 시험한 경우에는, 성장이 20% 감소하였고 (도 2), 이는 이전에 검출된 다른 세균의 성장 저해제 이외에, 이 균주에 특이적인 성장 증진제의 존재를 나타낸다. PF-11에 특이적인, 이러한 성장 증진제의 존재는 실질적으로 순수한 배양물 또는 PF-11이 농축된 배양물이 이들의 자연 상태에서의 세포와는 다르게 행동할 것임을 의미한다. 실질적으로 순수한 배양물 또는 PF-11이 농축된 배양물은 자연계에서 PF-11에 비해 증가된 성장을 입증할 것이다. 따라서, 실질적으로 순수한 배양물 또는 PF-11이 농축된 배양물은 이들이 자연계에 존재하는 바와 같은 PF-11 세포보다 더 유용하다. 예를 들어, 실질적으로 순수하거나 또는 농축된 배양물은 방오, 항미생물 또는 다른 응용을 위한 분비 화합물을 생산하는데 보다 유용할 것이다.
최소 배지 M9에서 성장 정지기에 분비된 PF-11의 시크레톰을 회수하고 10 kDa 배제 막 필터를 사용하여 분리하였다. 2개의 분획을 수득하였다: 하나는 분비 펩티드 및 작은 분자를 함유하고, 두 번째는 단백질을 포함하는 더 큰 분자를 함유한다. 이전에 사용된 균주들의 성장에 대한 이들 분획의 효과를 시험하였다. P. 아에루지노사 ATCC27853의 성장은, 예상한 대로, PF-11 시크레톰의 어떠한 분획에도 영향을 받지 않았다 (도 3A & 도 3B). 다른 2종의 그람-음성 균주, P. 푸티다 KT2420 및 E. 콜라이 ATCC25922의 성장은 완전한 시크레톰에 의해 강력히 저해되었다 (50%). 그러나, E. 콜라이 성장은 분비 펩티드성 분획에 의해 단지 약간 감소한 반면 (25%), P. 푸티다에는 유의미한 영향을 미치지 않았다 (도 3A). 반대로, 단백질 및 더 큰 분자를 함유하는 분획은, 다소 감소했음에도 불구하고, 일반적으로 이들 2종의 균주에 대해 관찰된 범용 항미생물 활성을 보유한다 (도 3B). 분명하게도, S. 아우레우스 NCTC 8325는 PF-11의 완전한 시크레톰에 의해 거의 완벽하게 저해되었다 (90%). 도 3A로부터의 데이터는 시크레톰의 펩티드성 분획이 동일한 저해를 재생함을 나타내고, 이는 이러한 분획이 항-스타필로코커스 화합물의 주요 공급원임을 나타낸다. 그러나, 단백질 분획 (10 kDa 초과)은 또한 이 균주의 성장을 50% 이상 저해하는 효과를 나타내는데 (도 3B), 이는 여러 유형의 항-스타필로코커스 분자가 시크레톰에 존재함을 시사한다. PF-11의 상청액의 활성 특성을 더욱 규명하기 위하여, 이의 항미생물 효과를 보일링 후 분자를 변성시키고, 다른 효과들 중에서, 존재하는 임의의 효소 활성을 파괴하는지 시험하였다. 도 3C의 데이터는 보일링 후에도 시크레톰이 도 2에서 이전에 관찰된 항미생물 효과를 보유함을 나타낸다.
분비 펩티드 함량 (도 3B에서 상기와 같이 제조됨)의 특성을 규명하기 위하여, 성장 지수기에서 P. 푸티다 PF-11 시크레톰에 함유된 물질의 평가를 참조 균주로서 P. 푸티다 KT2440을 사용하여 HPLC에 의해 수행하였다. 참조 균주의 분비 펩티드의 프로파일은 초기 용출 단계에서만 볼 수 있는 매우 작은 펩티드를 나타내는 일부 피크를 갖는 불량한 용출 프로파일을 나타내었다. 반대로, PF-11의 시크레톰은 크로마토그래피를 따라 균질하게 용출되고, 특히 균주 KT2440보다 훨씬 더 많은 양의 펩티드의 명백한 풍부함을 나타내었다 (도 4A). PF-11 시크레톰의 이러한 펩티드성 분획에 대한 보다 상세한 HPLC 분석은, 성장의 지수기 및 정지기에서 수득된 추출물을 이제 비교하여, 이 균주에 의해 분비된 펩티드의 미묘한 복잡성을 나타내었다 (도 4B). 나아가, 이러한 작은 분자들의 매우 강력한 축적은 성장의 정지기에서 명확하게 검출 가능하며, 이는 펩티드의 우수한 안정성을 나타내고 P. 푸티다 PF-11 균주가 탁월한 펩티드 분비 균주임을 확인한다.
세균 펩티드는 종종 계면활성제 특성을 갖는 리포펩티드이다. 따라서, 성장의 정지기에서 PF-11의 세균 배양물의 표면 장력을 분석하여 성장 배지 및 균주 KT2440와 비교하였다 (도 5A). 동일한 부피의 용액을 플라스틱 표면 위에 떨어뜨려 방울의 직경 및 그의 높이 둘 다를 시각화하였다 (재료 및 방법 참조). 성장 배지 단독 및 균주 KT2440 둘 다는 증착의 직경 및 높이 둘 다에서 유사한 특징을 나타내었다. 반대로, PF-11 배양물의 액적은 직경의 동시 증가 (대조군에 비해 2배가 됨)와 높이의 상당한 감소로부터 명백히 볼 수 있는, 표면 접촉의 매우 현저한 확장을 나타내었다. 배양된 PF-11 함유 배지는 접촉 표면 장력을 강력히 감소시키는데, 이는 배지 중에 계면활성제 분자의 존재를 나타낸다. 세균 세포의 존재로부터 임의의 인공적 효과를 제거하기 위하여, 균주 KT2440 및 PF-11의 정제된 시크레톰을 사용하여 실험을 반복하였다 (도 5B). 세균 배양물을 이용해 이전에 수득된 데이터는 균주 PF-11이 배지 내로 계면활성제 분자를 활발히 분비함을 나타내는, 이들의 시크레톰으로 확인되었다.
10 kDa 크기를 초과하는 화합물의 분획은 시험된 몇몇 표적 균주에 대해 상당한 항미생물 효과를 나타내었다. 추출된 시크레톰의 보일링이 이들의 특성을 유의미하게 변경시키지 못했다고 하더라도, 효소, 즉 촉매 활성을 갖는 단백질의 존재는 그들이 나타내는 저해 효과에 상당히 기여할 수 있다. 따라서, 분해 효소의 존재를 E. 콜라이, S. 아우레우스 및 P. 아에루지노사 균주로부터의 조 단백질 추출물을 사용하여 분석하고, 성장의 지수기 및 정지기에서 추출된 PF-11의 시크레톰, KT2440의 시크레톰 및 대조군으로서 물과 밤새 인큐베이션하였다 (도 6). 물과의 인큐베이션은 외부 효과의 영향 없이 37℃에서의 하룻밤 후에 표적 단백질 패턴을 보여준다. KT2440의 시크레톰과의 밤새 인큐베이션 후 단백질 프로파일은 더 큰 단백질에 상응하는 상부 밴드의 희미해짐을 초래하는데, 그러나 이는 낮은 수준으로 일부 분해를 나타낸다. 반대로, PF-11의 시크레톰은 상기에 나타난 바와 같이, 정지기에 비해 더 낮은 농도의 화합물로, 지수기에서 수집된 경우에서조차, 모든 단백질 추출물을 강력히 분해한다. 이러한 분석은 현저한 농도 및 매우 효율적인 활성으로, 별개의 세균으로부터의 총 조 단백질 추출물과 같은 복잡한 기질을 분해할 수 있는, PF-11 시크레톰 내 분비된 분해 효소의 존재를 나타낸다.
따라서 그람-음성 및 그럼-양성 균주 둘 다에 강력한 항미생물 효과를 갖는, 슈도모나스 PF-11의 시크레톰은 조성 및 활성 측면에서 매우 풍부하고 복합적이다. 이러한 화합물의 잠재적 응용에 관한 추가 연구를 위해, 분비된 분자를 추출하고 농축하고 이들의 특성을 규명하는 것이 필수적이다. 따라서, 시크레톰을 동결건조에 의해 농축하고, 완충제 교환에 의해 탈염시키고, 물에 재현탁하였다. 이렇게 재구성된 용액을 앞서 시험된 E. 콜라이 및 S. 아우레우스에 대해 상이한 농도 (PF-11 배양물의 상청액 중의 농도와 등가인 1X의 농도로, 10X, 4X 및 2X)에서 분석하여, 화합물이 이러한 정제 과정 후에 그들의 항미생물 특성을 보유하는지를 평가하였다. 나아가, 이러한 연구의 한 가지 목표가 새로운 항-감염 접근법을 구현하는 것일 수 있고 병원성 균주가 "유형" 균주와 다른 특성을 가지기 때문에, 두 가지 병원성 균주를 사용하여 PF-11에 의해 분비되고 정제된 화합물을 시험하였다. 에스케리치아 콜라이 O157 및 메티실린-내성 S. 아우레우스 (MRSA) ATCC 33591은 일반적으로 공식 EU 통제 및 모니터링에서 참조 군주로 사용되는 독성 임상 병원성 단리 균주이다. 먼저, 정제, 탈염 및 농축된 총 시크레톰을 이들 4종의 균주를 이용한 성장 저해 분석에 사용하였다 (도 7A). 이전과 같이, PF-11 시크레톰의 강력한 항미생물 활성은 모든 시험된 균주에 대해 명확하다. S. 아우레우스 균주는 2X 농축된 추출물로 완전히 저해되었다. 그러나, 더 높은 농도 (4X 및 10X)에서는, 저해 효과가 감소되지만, 80% 이상의 성장 저해가 여전히 달성된다. E. 콜라이 O157이 E. 콜라이 ATCC 25922보다 더 낮은 농도에서 이러한 항미생물 효과에 대해 더 내성이지만, E. 콜라이 균주 둘 다는 PF-11 시크레톰의 존재하에서 유사하게 행동한다. 이러한 차이와 무관하게, 10X의 농도에서, 두 균주의 성장은 90% 저해된다. 이전과 같이, 재현탁된 시크레톰의 펩티드성 분획을 분리하고 그들의 항미생물 효과를 분석하였다. 펩티드는 2X의 농도에서 E. 콜라이 균주에 감소된 효과를 나타낸다 (도 7B). 그러나, 4X의 농도에서, 두 균주의 성장은 50% 저해되고 총 성장 저해는 10X의 농도에서 달성된다. 펩티드성 항-스타필로코커스 효과와 관련하여, 2X 농도에서 약 90%의 저해가 달성되고, 더 높은 농도에서 100% 저해에 근접한 범위이다. 10 kDa 크기 초과의 분자를 함유하는 분획의 항미생물 효과를 분석한 결과, E. 콜라이 25922에 대한 PF-11 배양물의 상청액을 이용해 관찰된 성장 저해가 검증되었으나 (도 7C), 이 분획은 병원성 E. 콜라이 O157의 성장에 유의미한 효과를 나타내지 않았다. 놀랍게도, S. 아우레우스 성장은 80% 이상의 저해로 두 균주 모두에 대해 상당히 손상된 반면, 상청액을 이용한 경우에는 단지 50% 저해만이 달성되었다. 동일하지만 분자 구조를 변성시키기 위해 보일링한 이 분획을 사용한 추가 시험을 수행하여, 보일링하지 않은 현탁액과 매우 유사한 결과를 수득하였다 (도 7D).
실시예 4 - PF -11 시크레톰의 방오 효과
P. 푸티다 환경 균주의 이종 컬렉션을 항생제 내성을 통한 능동적 선택에 의한 이전 연구의 과정에서 수집하였다 (Meireles 2013). 이러한 세트의 균주를 사용하여 P. 푸티다에 의해 생산된 프로테아제를 동정하고 특성을 규명하기 위해 세포외 분비 가능성을 발굴하였다. P. 푸티다 KT2440과 비교하여, 생물복원 (bioremediation) 응용의 맥락에서 단리되고 연구된 균주인, 슈도모나스 PF-11은 컬렉션으로부터의 모든 다른 세균들 중에서 잠재적으로 생물공학적 관련성을 갖는 유용한 균주로 나타났다. 이 환경 균주를 스크리닝하는데 사용된 선별 과정 및 방오제 분비 세균으로서 이의 잠재력 평가가 본원에 기술된다. 조 세균 단백질 추출물 및 해양 생물학적 접착제의 분해 둘 다에서 강력한 단백분해 효과가 시험관 내에서 나타났다. 나아가, 상청액 또는 전체 PF-11 세균 배양물 중 하나를 사용한 생체 내 분석은 해양 미세부착물의 붕괴 및 성게에 의해 생산된 생물학적 접착제의 분해에 대한 이 균주의 방오 특성을 명백히 입증한다.
따라서, 환경으로부터 분리된, 균주 슈도모나스 PF-11은 다른 생체-분자들 중에서, 미세부착 또는 거대부착 현상에서 강력한 방오 효과를 촉진할 수 있는 프로테아제의 농축된 혼합물을 분비할 수 있다. 따라서, 자연 기원으로부터의 이러한 화합물은 신규 코팅 또는 보호적 페인트에 대한 첨가제와 같은 해양 방오 기술분야에서 잠재적으로 유용하다.
재료 및 방법
세균 단리 균주
먼저, 65종의 슈도모나스 푸티다의 환경 컬렉션을 토양으로부터 분리하고, 육안으로 선별하고, 동정하고 획득 항생제 내성 메커니즘에 대한 특성을 규명하였다 (Meireles 2013). 토양 및 진흙 샘플을 포르투갈 리스본 지역의 테조강 주변 여러 지역에서 수집하였다. 예비적인 표현형 분석 후, 주요 적응 능력 (빠른 성장, 최소 영양소 요건) 및 항미생물 다중-내성 프로파일을 나타낸 7종의 P. 푸티다 균주를 이들의 분비 행동을 스크리닝하기 위해 선택하였다. 이러한 환경 세트를 분석하고 잘 연구된 참조 균주인 P. 푸티다 KT2440과 비교하였다 (Palleroni).
세균 배양 성장 조건
사용된 모든 균주를 5% 글리세롤 중에서 -80℃로 보관하고 M9 접종 전에 35℃에서 밤새 (16시간) 동안 LA에 도말하였다. 단일 콜로니를 0.4% 글루코스가 보충된 액체 M9 최소 배지 (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl, 18.7 mM NH4Cl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 0.0005% 티아민) (Miller et al.)에서, 35℃, 120 r.p.m.으로 1, 2, 4, 6, 또는 24시간 (후자는 정지기로서 정의됨) 동안 성장시켰다. 배양물이 목적하는 성장기에 도달한 후, 이들을 직접 사용을 위해 수집하거나 배양 배지 중의 대량의 세포를 상청액으로부터 수집된 분비 분자로부터 분리하기 위해 최소 15분간 10.000 g에서 원심분리하였다.
세균 세포내 단백질 추출 및 분리
성장의 지수기 또는 정지기로부터의 세균 세포 펠렛을 10.000 g에서 15분간의 원심분리에 의해 수집하였다. 세균을 단백질 추출 완충제 (2% SDS, 20 mM Tris, 2 mM PMSF) (Sambrook et al.)에 재현탁하고 현탁액을 5분간 끓여서 세포 용해를 유도하였다. 단백질을 280 nm에서의 측정에 의해 Nanodrop 장치 (Thermo Fisher Scientific)에서 정량하고 최종 10 μg/10 μl로 균질화하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루® (Sigma) (0.03%), 글리세롤 (30%), 및 β-머캅토에탄올 (10%)을 함유하는 1:1 vol의 단백질 로우딩 완충제를 첨가하고 SDS-PAGE용 12.5% 겔에 샘플을 로우딩하기 직전에 끓였다.
세균 배양물으로부터 상청액의 제조
M9 배지 중의 세균 배양물으로부터 상청액을 회수하고 이전에 기술된 바와 같이, 여과 장치 내 0.22 μm 나일론 필터 (Millex GP, Millipore, Ireland)를 통해 살균-여과하였다. 살균 상태를 확인하기 위해, 100 μl의 각 상청액을 35℃에서 적어도 16시간 동안 인큐베이션하였다. 방오 실험을 위해, 여과된 상청액을 직접 사용하였고, 시험관 내 단백분해 분석을 위해 상청액을 -50℃에서 동결건조하고 물에 재현탁한 후 수집된 상청액의 최초 부피에 대해 20배 농축시켰다.
분비된 단백질 TCA 침전
살균-여과된 단백질 상청액을 트리클로로아세트산 (TCA) 및 아세톤을 사용하여 침전시켰다. 아세톤 중의 25% TCA 용액을 4℃에서 각 샘플에 1:3의 부피비로 (보통 25 ml의 상청액을 침전시키는데 8 ml TCA) 첨가하였다. 균질화 후 혼합물을 15분간 얼음 중에 인큐베이션한 후 10분간 4℃에서 10.000 g로 원심분리하였다. 수득된 펠렛을 아세톤으로 2회 세척하고, 각각 10 ml 및 4 ml로 현탁한 후, 이어서 동일한 조건으로 원심분리하였다. 건조된 최종 침전물을 40 μl의 SDS 단백질 변성 로우딩 완충제 (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 20% 글리세롤, 0,01% 브로모페놀 블루)에 현탁하고, 이 중 10 μl를 12.5% SDS-PAGE 겔에 걸었다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 (Sigma)로 염색하였다. 겔에 적용된 침전된 분획은 초기 세포 배양 현택액의 6.5 ml에 상응한다.
단백분해 분석
P. 푸티다 시크레톰의 단백분해 함량을 평가하기 위하여, 제조사의 지침에 따라서 형광 프로테아제 분석 키트 (Fluorescent Protease Assay Kit, Pierce)를 사용하였다. 간략히는, 분석은 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 샘플 중의 프로테아제 활성을 평가하기 위한 플루오레세인-표지된 기질 (카제인)의 사용을 포함한다. 이렇게 과하게 표지된 온전한 단백질 기질의 형광 특성은 프로테아제에 의한 분해 시 극적으로 변하고, 이는 단백분해의 측정 가능한 표시를 초래한다: (형광 소거의 감소의 결과로서) 기질이 더 작은 플루오레세인-표지된 단편으로 분해됨에 따라서 (동종전이 형광 과정) 총 형광 신호는 증가한다. 형광 측정은 표준 플루오레세인 여기/방출 필터 (485/538 nm)를 갖는, 0.5 cm 광학 경로 석영 큐벳에서 Fluorolog-3 (Horiba Jobin Yvon)을 이용해 수행하였다. 검정을 위해 선택된 통상의 프로테아제는 트립신이었다. 시크레톰 샘플을 TBS (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2) 중에서 100배 희석하였다. 트립신 표준품 및 카제인 용액을 동일한 완충제로 제조하였다. 모든 샘플 및 표준품을 실온에서 20분간 기질과 인큐베이션하였다. 단백질 농도를 표준품으로 소 혈청 알부민 (BSA) (Bio-Rad)을 사용하는 브래드포드 단백질 분석에 의해 결정하였다. 모든 단리된 P. 푸티다 균주의 시크레톰을 이 방법에 따라서 평가하였지만, 블랭크보다 우수한 총 형광 값을 나타낸 것들만이 추가로 처리되었다. 샘플 중의 프로테아제 농도의 추정치는 트립신 표준품을 이용한 선형 회귀 (linear regression)에 의해 계산한 후 이 분석에 사용된 총 단백질 양으로 나누었다 (μg 프로테아제/μg 단백질). 프로테아제 활성에 대한 온도의 효과를 평가하기 위하여, 시크레톰 샘플을 상이한 온도 (15 내지 45℃, Δ5℃)에서 플루오레세인-표지된 카제인과 함께 20분간 인큐베이션하였다. 수득된 단백질 mg당 μg 프로테아제 활성의 가장 높은 값을 최대 활성 (100%)으로 간주하였고 비율은 모든 온도 결과와 이 값 사이에서 수행되었다. 정상적인 블랭크 외에, 온도가 형광 신호 단독으로 영향을 미치지 않는지를 확인하기 위해, 연구된 각 온도에서 완충제 중에서만 인큐베이션된 플루오레세인-표지된 카제인을 추가 대조군으로 만들었다.
프로테아제 기질의 스크리닝을 위한 2D-PAGE
세균 표준 균주 (대장균 ATCC 25922)의 세포내 단백질 추출물 및 성게 파라센트로투스 리비두스 (Paracentrotus lividus) 스크래핑된 접착성 풋프린트를 이전에 기술된 바와 같은 단백분해 분석을 위한 기질로 사용하였다 (Nestler et al.). E. 콜라이 총 단백질을 상기와 같이 추출하였다 (세균 세포내 단백질 추출 및 분리). 성게 접착성 풋프린트 (건조 중량으로 1 mg)를 4℃에서 1시간 동안 1 mL 10% 트리클로로아세트산, 0.07% β-머캅토에탄올 (w/v) 중에 현탁하여 단백질을 침전시킨 후, 아세톤 (v/v) 중의 1 mL의 냉각 (-20℃) 0.07% β-머캅토에탄올로 3회 세척하고, 마지막으로 진공 건조시켰다. 수득된 단백질 펠렛을 비-환원 조건 (2% SDS, 20% 글리세롤, 62.5 mM Tris-HCl 중, pH 6.8) 하에서 재현탁하고 수득된 용액을 95℃에서 5분간 가열하였다. 그 후에, 성게 접착성 단백질을 SDS-PAGE를 사용한 12.5% 폴리아크릴아미드 겔에서 1차원으로 분리하였다. 분리 후, 레인을 잘라내고 음성 대조군으로서 M9 배지 및 PF-11 균주 상청액과 5시간 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 1D 레인을 12.5% 폴리아크릴아미드 겔의 상부에 아가로스로 밀봉하여, 1차원과 직교하는 2차원을 실행하였다. 전기영동이 동일한 조건하에서 수행되기 때문에, 분해되지 않은 단백질은 겔을 통해 대각선으로 나타나고, 특이적 단백분해 절단의 산물은 이 대각선 아래에서 나타나야 한다.
해양 생물막 파괴
PF-11 P. 푸티다 최종 단리 균주 상청액의 항-미생물 부착물 가능성을 생체 외에서 평가하기 위하여, 해양 생물막을 "바스코 다 가마 수족관 (Vasco da Gama Aquarium)" (Alges, Oeiras)에서 33‰의 해수를 이용해 15℃의 개방-회로 탱크 내부에 배치된 페트리 디쉬에서 발생시켰다. 이러한 페트디 디쉬를 이중 증류수로 3회 가볍게 세척하여 과량의 염을 제거하고 유기 물질을 느슨하게 하였다. 잔존하는 강하게 부착된 물질 (세균 및 미세조류)를 상이한 세포 기질 및 살균 상청액과 함께 인큐베이션하여 유리 매트릭스로부터 해양 미세부착물을 파괴하는 이들의 능력을 실온에서 18 및 40시간 동안 평가하였다. 인큐베이션 기간 후 액체 분획을 제거하고 디쉬를 이중 증류수로 가볍게 세척하여 생물막 파괴를 시각화하였다. 모든 시험을 적어도 3회 실시하였다. 대표적인 사진이 제공된다.
성게 접착성 풋프린트의 생체 외 분해
종 파라센트로투스 리비두스 유래 성게 (Lamark 1816)를 포르투갈의 서해안에서 간조 때에 수지하였다 (Estoril, Cascais). 수집 후, 동물을 "바스코 다 가마 수족관" (Alges, Oeiras)으로 옮기고 15℃ 및 33‰의 개방-회로 탱크에서 유지하였다. 인공 해수 (Crystal Sea, Marine Enterprises International, Baltimore, MD, USA) 중에 성게를 함유하는 작은 플라스틱 수족관 (3 L)을 사용하여 접착성 물질을 수집하였다. 이 수족관은 동물의 부착을 허용하는 제거 가능한 유리 기판으로 내부가 덮여 있다.
몇 시간 후, 수 백개의 풋프린트로 둘러싸인 이들 유리 기판을 제거하고, 증류수로 세척하고, 단백질 추출을 위해 일회용 메스 (scalpel)로 긁어 내거나 제거 분석에 직접적으로 사용하였다 (O). 슈도모나스 PF-11 최종 단리 균주 상청액의 해양 방오 가능성을 생체 외에서 평가하기 위하여, 수집된 성게 풋프린트를 앞서 기술된 세포 배양물 및 살균 상청액과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 전에, 유리 슬라이드를 이중 증류수로 세척하고, 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 다시 세척하여 접착성 풋프린트 물질을 시각화하였다. 이어서 이들을 평가 중인 용액과 함께 18시간 동안 35℃, ~80 r.p.m.으로 인큐베이션하였다. 유리 슬라이드를 마지막으로 세척하고 동일한 프로토콜에 따라서 염색하고 유리 기판으로부터 생물학적 접착제를 제거하는 이들의 능력을 평가하였다.
해양 환경에서 무척추동물에 대한 방오제로서 PF-11 시크레톰의 능력을 평가하기 위하여, 성게 관족에 의해 분비된 접착성 풋프린트를 단백분해 기질로 사용하였다. 이들의 접착 강도 (단위 면적당 힘)는 0.09 내지 0.54 MPa로 측정되었고 ( et al. 2005, Santos et al. 2006), 이는 다른 해양 무척추동물과 비교할 때 (각각 비-영구적 및 영구적 접착제의 경우 0.1-0.5 및 0.5-1 MPa (Smith 2006)), 성게의 분비된 접착제가 강력한 비-영구적 아교임을 나타낸다.
성게에 의해 분비된 접착성 아교는 수성 환경에서 중합되어 단백질에 의해 부분적으로 형성된, 화합물의 복잡한 혼합물을 함유하는 비월식 (interlaced) 구조를 형성할 수 있다. 따라서 이는 앞서 나타난 바와 같이 매우 안정하고 분해에 내성이다 (Santos et al. 2005, Santos et al. 2009).
성게를 15℃의 해수 수족관에서 유지한 후 유리판 위에 놓아두어 접착되게 하였다. 이들의 자연적인 행동으로 인해, 성게는 연속적으로 부착하고 탈착하여, 유리 위에 접착성 풋프린트를 남기고, 이는 용해되기 위해 강력한 변성제 및 환원제를 요구한다 (Santos et al. 2009). 접착성 풋프린트로부터 추출된 단백질의 분리를 구성하는 1차원으로 대각선 SDS-PAGE를 수행하고, 이어서 겔 레인을 PF-11 상청액과 함께 인큐베이션한 후, 최종적으로 E. 콜라이 단백질 추출물에 대해 2차원을 걸었다.
이전과 같이, PF-11 세포 배양물으로부터 회수된 상청액과의 인큐베이션은 단백질의 완전한 분해를 보장하였다. 이 단백질 추출물이 E. 콜라이에서 추출한 총 세포 단백질 추출물만큼 복잡하지는 않더라도, 분해하기 더 어려울 것으로 예상되는 접착성 단백질을 포함하고 있지만, 결과는 PF-11 균주에 의해 분비된 단백질의 강력한 단백분해 활성을 확인하고, 또한 방오 화합물 분비인자로서 이의 잠재력을 강화시키는데 기여한다 (도 10B).
시크레톰 분석
환경 세균 단리 균주의 컬렉션을 강한 적응과 생존 잠재력을 가진 균주를 선발하기 위한 스크리닝 방법으로 몇몇 항생제를 사용하여 도심의 하천 기슭과 농장 토양으로부터 회수하였다. 수거되고 확인된 세균 중에서, 슈도모나세아스가 아마도 신속한 복제 속도, 다양한 조건에 대한 다용도 적응 및 스트레스에 대한 확립된 내성과 관련이 있는, 복원성 기술의 뛰어난 저장소로서 부상하였다 (Palleroni). 이 패밀리 중에서, 슈도모나스 푸티다는 가장 널리 퍼진 종으로, 일반적으로 β-락탐에 내성이 있는 상당한 수의 균주와 함께 70종 균주의 한 세트가 분리되었다 (미공개 데이터).
생물공학적 응용을 위해 잠재적으로 활성인 생체분자를 스크리닝하기 위해, 일반적으로 β-락탐, 및 특이적으로 3세대 세팔로스포린 및 카르바페넴에 높은 내성 프로파일을 나타내는, 7종의 환경 단리된 P. 푸티다 균주를 선별하고, 최소 미네랄 배지에서 배양하고, 이들의 분비 프로파일에 대해 평가하였다 (Meireles 2013). 먼저, 총 세포 단백질을 환경 단리 균주로부터 추출하고 생물복원 조사의 맥락에서 광범위하게 연구된, P. 푸티다 KT2440과 비교하였다 (Nelson et al.).
P. 푸티다 mt-2유래 균주 KT2440은 유해한 환경에 대한 적응 또는 독성 화합물에 대한 내성 잠재력 중 하나인, 생물복원 도구로서 그의 잠재력과 탁월한 행동을 기반으로 분리된 균주이다 (O et al.). 따라서 이들의 특성이 동일한 종의 대부분의 균주보다 생존 기술면에서 보다 다재다능하다는 측면에서, 이는 이미 비-전형적 P. 푸티다 균주이다. SDS-PAGE 겔에 의한 분석은 균주 KT2440와 유사한 프로파일 분포를 갖는 균주 PF-11을 제외하고 (도 8A에서 각각 레인 4 및 1), 단리 균주들 사이에서 대부분 유사한 세포내 단백질 분포를 나타내었다 (도 8A). 이와 동시에, 이들 균주의 분비 가능성을 평가하기 위해, 배지로 분비된 단백질을 (여과에 의한 세포의 제거 후) TCA/아세톤으로 침전시켜 농축하고 초기 배지 부피에 비례하게 현탁하였다.
시크레톰 프로파일은 SDS-PAGE에 의해 유사하게 분석되었다 (도 8B). 세포내 단백질 분획과는 달리, 분비 단백질 프로파일은 조성에서뿐만 아니라 정량적으로 단리 균주들 사이에서 달랐다. 가장 현저한 차이가 균주 PF-11 분비 행동에서 관찰되었다. 실제로, 동일한 겔에서 모든 군주에 대한 데이터를 제시하기 위해, PF-11 균주의 회수된 시크레톰을 과다-로우딩을 피하기 위해 8배로 희석해야만 했다. 그럼에도 불구하고, 도 8B에 나타난 바와 같이, 이는 연구된 다른 균주의 시크레톰보다 유의미하게 더욱 농축되고 복잡하다.
PF-11을 8배 희석한 샘플을 제외하고, 이 겔에 로우딩된 단백질은 성장의 정지기에서 배양 상청액의 동일한 부피에 상응한다. 슈도모나스 PF-11이 이렇게 높은 수준의 분비 단백질을 생산하여 강력한 분비 가능성을 나타냈음을 고려하여, 그의 시크레톰을 추가 특성 분석을 위해 선택하였다. 균주 PF-11에 의해 분비된 단백질을 수집하고 성장 조건에 기인한 변화를 결정하기 위해 성장 곡선을 따라 시각화하였다. 글루코스 보충된 M9 최소 배지에서의 성장 곡선 후에, 예상한 바와 같이, 배지로 방출된 단백질이 배양 중인 세포의 증가로 인해 시간에 따라 유의적으로 축적되었음을 검증할 수 있었다 (도 8C). 벌크 상청액의 단백분해 활성을 모든 스크리닝된 균주에 대해 분석하였다.
여과된 상청액을 동결건조하여 효소 활성을 유지하고 미가공 상청액의 농도에 상응하는 물에 20배로 현탁하였다. 시험된 모든 샘플 중에서, 성장의 지수기 또는 정지기 중 하나에서 수집된, PF-11 시크레톰만이 단백분해 활성 측정을 위한 카제인 기질을 분해할 수 있었다 (표 1).
시크레톰 기원 μg 프로테아제/mg 단백질
KT2440 STAT ND
PF-8 STAT ND
PF-9 STAT ND
PF-11 EXP 63.15
PF-11 STAT 115.12
PF-13 STAT ND
PF-29 STAT ND
PF-50 STAT ND
PF-57 STAT ND
표 1. M9 최소 배지에서 P. 푸티다 참조 및 단리 균주에 의해 정지기 (STAT)에서 분비된 총 단백질의 프로테아제 활성. 데이터는 또한 지수기 (EXP)에서 PF-11 세포외 프로테아제를 나타낸다. ND: 검출 가능하지 않음.
이 스크리닝에서, PF-11은 명백히 탁월한 분비 잠재력을 갖는 균주로서 행동한다. 상청액 내 전체 분비 단백질의 축적이 성장 곡선을 따라 관찰되었기 때문에, 단백분해 활성의 증가가 정지기에서 수집된 시크레톰에서 예측될 수 있다. 그러나, 정지상에서 측정된 총 분비된 단백질로 표준화된 단백분해 활성은 분비 단백질의 mg당 115 μg이었고, 이는 지수기와 비교할 때 거의 2배 증가에 상응하고, 또한 성장 곡선을 따라서 분비 단백질들 사이에서 프로테아제의 농축을 나타낸다 (표 1; 도 9A).
정지기에서 수집된, 분비 프로테아제의 단백분해 활성을 위한 최적 온도는 15 내지 45℃로 측정되었고 35℃에서 확립되었다 (도 9B). 활성을 카세인의 단백분해가 시험된 온도에 따라 백분율로 비교하고 플로팅하였다. P. 푸티다는 보통 평균적으로 15 내지 30℃ 사이의 온도 범위에서 생존하는 환경 균주이기 때문에, 그의 분비 단백질이 넓은 열적 범위에서 활성을 유지할 수 있을 것으로 기대 될 수 있다. 도 9B에 나타난 바와 같이, 15℃와 같이 낮은 온도에서, 분비 프로테아제는 35℃의 최적 온도에서의 그의 활성과 비교하여 여전히 그의 단백분해 활성의 30%를 유지한다.
대부분의 세균 프로테아제는 열 충격 조건에서 약화되는 이들의 세포 기능으로 인해 약 50-60℃의 최적 온도를 갖는다 (Angilletta et al.). 세포외 세균 프로테아제는 또한 산업적 응용을 위한 프로테아제의 생산 및 정제에 광범위하게 사용되는 바실러스 spp와 유사한 특징을 갖는 것으로 나타났다 (Watanabe et al., Angilletta et al.). 반면, 해양 미생물은 일반적으로 30℃에서 최대 활성을 나타내는 중국에서 분리된 해양 세균 균주에 의해 생산된 금속단백분해효소 (metalloproteinase)와 같은, 저온-적응 효소를 생산한다 (O et al.).
프로테아제에 대한 모든 산업적 응용은 이들 효소가 낮은 턴오버 (turnover)를 가질 것을 요구할 것이다. 이를 평가하기 위하여, PF-11 분비 단백질을 37℃에서 밤새 인큐베이션하고 단백분해 활성을 평가하여 약 25%의 활성이 감소하였음을 입증하였다 (도 9C). 또한, 아마도 일부 고분자량 성분이 자가단백분해 (autoproteolysis)로 인해 감소되었다 할지라도 밤새 인큐베이션 후 시크레톰 단백질 프로파일은 거의 변화하지 않았다 (도 9D).
지수기 또는 정지기 중 하나의, PF-11 배양물으로부터 회수된 상청액은 카제인에 강력한 단백분해 효과를 나타내었다. 이것이 이러한 시크레톰의 높은 특이적 단백분해 활성을 명백히 보여주는 것이라 하더라도, 이는 단일 기질의 단백분해로 남아 있다. 넓은 범위의 표적된 프로테아제(들) 혼합물로서 PF-11 균주의 효과를 평가하기 위하여, 총 단백질을 에스케리치아 콜라이 균주로부터 추출하고 기질로 사용하였다. 대각선 SDS-PAGE 겔을 수행하여 PF-11 시크레톰에 의한 E. 콜라이 단백질 추출물의 최종 단백분해를 시각화하였다 (Nestler et al.).
E. 콜라이 ATCC 25922로부터 수집된 총 단백질을 1차원 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분리한 후 겔 레인을 PF-11 활성 상청액과 함께 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 크기별로 또한 분자를 분리하는, 2차원의 이동은 E. 콜라이 단백질 추출물의 거의 완전한 분해를 명백히 나타내었다 (도 10A). 드물게 분해 단편이 여전히 검출 가능했지만, 대조군 겔과는 달리, 대각선 이동 패턴의 명백한 부재는 PF-11 시크레톰의 강력하고 광범위한 단백분해 활성을 확인한다. 이러한 결과는 이들이 단백질의 복잡한 용액을 거의 완전히 분해할 수 있었기 때문에, 이들 분비된 프로테아제가 방오제로 작용할 수 있음을 시사한다.
PF -11 시크레톰의 시험관 내 효과
PF-11 시크레톰의 방오 효과를 시험관 내에서 평가하기 위하여, 2개의 분석을 수행하였다. 방오 작용을 유리 페트리 디쉬 또는 슬라이드에 침적된, 해양 세균, 미세조류, 해양 생물막 및 성게 접착성 풋프린트로 표시되는, 미세부착물 및 거대부착물에 대해 시험하였다.
바다에 잠긴 재료는 미생물, 주로 세균의 부착 장소가 된다. 이들 세균의 대다수는 약간의 유기 잔재물이 부착하는 점액성 재료를 생산한다. 그 후에 미세조류는 표면에 집락을 형성할 수 있다. 잔재물 및 조류 집단과 조합된 세균 및 이들의 부산물은 통상 "슬라임 막 (slime film)"으로 불리는 것을 구성한다. 이 막은 일반적으로 잠긴 표면 위에서 나타나는 부착물의 첫 번째 형태이다.
마리노박터 히드로카르보노클라스티쿠스 (Marinobacter hydrocarbonoclasticus) 및 코베티아 마리나 (Cobetia marina)는 해양 생물부착물의 주된 일차적 이주자로서 일관되게 기술되는 엄격한 해양 세균이다. 이들 세균은 해양 방오 시험의 지표로서 주기적으로 사용되어, 미세부착물 또는 보다 일반적으로 슬라임으로 알려진 생물부착물의 초기 층으로 지시되는 화합물의 방오능을 평가하였다. PF-11 시크레톰은 코베티아 마리나 성장의 조절에 매우 효율적이다. 도 19에 제시된 데이터는 여러 농도의 PF-11 시크레톰의 존재하에서, 해양 환경 내 최적 조건에서 코베티아 마리나의 성장 진화를 나타낸다. 묘사된 곡선은 8 g/L 및 4 g/L만큼 낮은 PF-11 시크레톰 농도에서 C. 마리나의 강력한 성장 저해를 명확하게 보여준다. PF-11 시크레톰은 또한 470 또는 234 ppm (w/v)의 낮은 농도에서, 성장 저해 시험에서 일반적으로 해양 생물부착물과 관련된, 비브리오 spp와 같은, 여러 다른 해양 세균의 성장을 방지한다 (도 20). 이들 균주 이외에, PF-11 시크레톰은 그람-음성 및 그람-양성 세균 둘 다, 즉 이들 중에서 에스케리치아 콜라이, 비브리오 알지놀리티쿠스 (Vibrio alginolyticus), 비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 코베티아 마리나, 마리노박터 히드로카르보노클라스티쿠스, 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 파에칼리스에 대해 효과적인 항미생물 활성을 발휘한다.
따라서 PF-11 시크레톰은 일반적으로 세균 유기체의 성장 조절에 매우 효과적이다. 더욱 구체적으로, PF-11 시크레톰은 해양 생물부착물의 초기 층을 형성하는 세균에 대한 방오능을 갖는다. 세균의 성장 자체를 조절하는 것 이외에, PF-11 시크레톰은 또한 슬라임의 실제 기저 형성인, 해양 세균 생물막의 형성을 방지하는데 효과적이다. 도 21에 나타낸 데이터는 500-2000 ppm 범위의 PF-11 시크레톰의 농도에서 달성된, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 마리노박터 히드로카르보노클라스티쿠스 생물막의 방지에 대한 PF-11의 효과를 나타낸다.
해양 세균과 함께, PF-11 시크레톰은 또한 효과적인 항-미세조류 활성을 발휘하여, 도 22에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 클라마이도모나스 레인하르드티 (Chlamydomonas reinhardtii), 슈도키르키네리엘라 서브캐피타타 (Pseudokirchneriella subcapitata) 및 테트라셀미스 수에시카 (Tetraselmis suecica)와 같은 몇몇 미세조류의 성장에 영향을 줄 수 있다. 시험된 가장 민감한 종은 클라마이도모나스 레인하르드티이고 가장 내성인 종은 슈도키르키네리엘라 서브캐피타타였다.
상기에 나타난 바와 같이, 단일 세균 생물막의 형성을 방지하고 단일 미세조류의 성장을 방지하는 것을 넘어서, PF-11은, 재-순환 해수 및 안정화된 해양 메조코즘 (mesocosm)을 갖춘 대형 수족관에 8일간 잠긴 멸균된 유리 페트리 디쉬에 수집된 해양 세균 조류 및 미세조류로 본질적으로 구성된, 이미 형성된 혼합 해양 생물막을 효과적으로 파괴시키는 것으로 나타났다. 생물막이 생성된 접시를 세척하여 주로 해양 세균 및 미세조류로 구성된 미세부착물은 유지하면서 부착되지 않은 물질은 제거하였다. 그 후에 생물막을 PF-11 상청액 및 배양물 자체와 각각의 대조군과 함께 인큐베이션하고, 그들의 영향을 실온에서 18시간 및 40시간의 인큐베이션 후 평가하였다. 초기 세척에 저항하는 불량하게 결합된 물질은 분석된 분획들 중 하나와 함께 인큐베이션될 때 (<18시간) 신속하게 제거되었다. 그러나, 보다 밀착되게 부착된 해양 생물막 형성은 PF-11의 상청액 또는 세포 배양물의 첨가에 의해서만 제거될 수 있었다 (>18시간) (도 11). 무척추동물 부착물의 경우, P. 푸티다 PF-11 시크레톰을 유리 위의 성게 접착성 풋프린트의 제거에 대해서 시험하였다. PF-11 균주의 성장으로부터 회수된 배양물과 상청액 둘 다는 유리 슬라이드상의 성게가 남긴 접착성 풋프린트를 완전히 파괴시키고 제거할 수 있었다 (도 12). 반대로, 대조군으로 사용된 상청액 또는 배양물, 멸균 배지 또는 별개의 세균 (환경적으로 분리된 P. 푸티다 또는 KT2440 균주를 포함)으로부터 방출된 물질 중 어느 것도 방오 작용을 나타내지 않았다. 프로테아제와 같은 단백질의 효소 활성은 이들의 천연 3차원 구조의 유지에 의존하기 때문에, PF-11 시크레톰의 관찰된 방오 작용에서 효소 활성의 관련성을 평가하기 위해 끓인 상청액 (100℃에서 15분)을 사용하여 보충 분석을 병행하였다 (도 12). 이 실험은 이들의 효소 활성을 유지하는, 천연 단백질이 성게 분비 접착제를 제거하는데 요구됨을 나타내었다. 따라서, 이전에 검출된 프로테아제와 같은 가수분해 효소는 슈도모나스 PF-11에 의해 분비된 화합물에 방오능력 부여하는데 필수적이다. 따라서, 이 환경 단리 균주는 단백질을 강력하게 분해하고, 세균 생물막 형성을 방해하며, 해양 생물접착제를 제거할 수 있는, 효소 활성을 갖는 매우 가치 있는 화합물의 혼합물을 분비한다.
실시예 5 - PF -11 시크레톰의 효소 활성
여기에 기술된 연구의 목적은 PF-11 및 여러 다른 분리 균주로부터 분비된 효소의 단백분해 활성을 평가하는 것이었다. 본 발명자들은 단백질이나 에너지원이 고갈된 배지에 첨가된 고분자량 기질의 일정 정도의 단백분해 후에만 균주가 성장을 위해 이를 내재화하여 사용할 수 있다는 아이디어에 기반한 방법을 확립하였다.
재료 및 방법
세균 단리 균주
본 연구 전에, 71종의 환경 균주의 컬렉션을 분리하고, 육안으로 선택하고, 획득 항생제 내성 메커니즘에 의해 동정하고 특성을 규명하였다 (Meireles 2013). 최종 단리 균주 선택에서, 92%가 슈도모나스 푸티다였다. 이들 중 하나인 PF-11은 높은 수준으로 프로테아제를 분비하는 것으로 나타났다. 더 많은 세포외 세균 프로테아제의 강력한 생산자를 찾는 것을 목표로, 전체 컬렉션을 본원에 기술된 스크리닝 절차에 적용하였다.
시험된 배지 및 보충제
배지 제형에서 일반적으로 사용되거나 관련된 스크리닝과 관련된 다른 단백질성 기질과 관련하여, 이 장르에 대한 문헌에서 언급된 다양한 배지를 평가하였다. 사용된 배지는 다음과 같다: M9 - 12.8 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 g NH4Cl, 1 ml CaCl2 100 mM, 1 ml MgSO4 1 M, 20 ml 글루코스 20%가 보충된 500 μl Vit B1 1%/1 L (Miller 1972), M9-NH4Cl-Vit B1 또는 M9-N - 12.8 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 ml CaCl2 100 mM, 1 ml MgSO4 1 M/1 L (Miller 1972), M9-글루코스 또는 M9-G - 12.8 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 ml CaCl2 100 mM, 1 ml MgSO4 1 M/1 L (Miller 1972), 슈도모나스용 최소 배지 또는 MMP - 1 g K2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0.2 g MgSO4.7H2O, 3 mg FeCl3/1 L (Prijambada, Negoro et al. 1995), 및 NB - 1% 펩톤, 0.6% 비프 추출액, 대개 임의의 보충제에 대해 양성 대조군으로 간주되는, 1% NaCl (Gaby and Hadley 1957). 시험된 보충제는 다음과 같다: BSA 1%, 헤모글로빈 1%, 젤라틴 1%, 탈지유 2%, 카제인 1%, 또한 모든 시험된 배지에 대해 양성 대조군으로 간주되는, 카사미노산 (casaminoacids) 1%, 및 음성 대조군으로 사용된 H2O.
세포외 프로테아제 검출을 위한 최소 배지 및 보충제 시험
96 웰 미세역가 플레이트를 시험하고자 하는 100 μl의 배지-보충제 쌍으로 채웠다. 각 단리 균주의 단일 콜로니를 Bacto-Mueller Hinton 배지 (Difco) 중에 접종하고 600 nm에서의 흡광도가 약 1 또는 2에 도달하도록 성장시켰다. 그 후에 배양물을 M9 배지 염만으로 C1V1=C2V2 식에 따라서 0.04의 OD 600 nm로 희석하고, 10 μl를 각각의 미세역가 플레이트 웰에 분주하였다. 플레이트를 계속 35℃에서 인큐베이션하였다. 검출이 의도된 시점에서 - 18시간, 26시간, 72시간 - 플레이트를 끈으로 묶어서 교반하고 검출기에서 판독하였다. 블랭크 용액 대비 샘플의 OD에 의해 성장을 결정하였다. 이 초기 시험에 사용된 균주는 음성 대조군 균주 PF-29 단리 균주, 양성 대조군 PF-11 단리 균주, 참조 균주 P. 푸티다 KT2440, 및 참조 균주 P. 아에루지노사 NTC27853이었다.
최소 배지 액체 성장 절차
96 웰 미세역가 플레이트를 100 μl의 선택된 배지로 채웠다: M9-N+BSA, M9-G+BSA, M9-G+젤라틴, MMP+BSA, 및 MMP+젤라틴. 각 단리 균주의 단일 콜로니를 글루코스 보충된 M9 배지에 접종하고 약 21시간 동안 성장시켰다. 그 후에 배양물을 1x M9 염으로만 100배 희석하고; 이러한 희석액의 10 μl를 각 미세역가 플레이트의 웰에 분주하였다. 플레이트를 계속 35℃에서 인큐베이션하였다. 검출이 의도된 시점에서 - 21시간 및 46시간 - 플레이트를 끈으로 묶어 교반하고 검출기 내에서 판독하였다. 블랭크 용액 대비 샘플의 OD에 의해 성장을 결정하였다. 컬렉션으로부터의 모든 균주를 이 시험 조건으로 다시 평가하였고, PF-29 단리 균주를 음성 대조군으로, PF-11 단리 균주를 양성 대조군으로 사용하였다.
광막 젤라틴 제거 절차
각각의 선택된 단리 균주의 단일 콜로니를 Bacto-LB (Difco) 또는 M9 배지 (O)에 접종하고 밤새 성장시켰다. 사용된 광막의 조각을 각 튜브에 첨가하고 계속 RT에서 인큐베이션하였다. 필름을 인큐베이션 8분, 12분, 1시간, 8시간, 32시간, 및 2개월째 (모든 광막 젤라틴 층이 분해될 때까지 걸린 시간, 즉 접종되지 않은 배지 대조군)에 배양물으로부터 제거하였다. 이들 시점에서 막을 이중 증류수 분사 하에서 세척하고, 공기 건조시키고 사진을 촬영하였다.
세균 배양물으로부터 상청액의 제조
선택된 세균 단리 균주의 개별 콜로니를 글루코스가 보충된 400 ml의 M9 최소 배지에서 35℃, 120 r.p.m.으로 24시간 동안 접종하였다. 배양물을 10.000 g에서 15분간 원심분리하여 세균의 펠렛을 생성하고, 상청액을 이전에 기술된 바와 같이, 여과 장치를 통해 0.2 μm DURAPORE 저 단백질 결합 필터 (Millipore)로 여과하였다 (O). 회수된 여과물을 -20℃에 냉동시키고, -52℃에서 동결건조시키고, 20배 농축하였다. 단백질 농도를 표준품으로 소 혈청 알부민 (BSA) (Bio-Rad)을 사용하는 브래드포드 단백질 분석으로 측정하였다.
시험관 내 단백분해 분석
형광 프로테아제 분석 키트 (Pierce)를 사용하여 제조사의 지침에 따라서 P. 푸티다 시크레톰의 단백분해 함량을 평가하였다. 간략히, 분석은 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 샘플 중의 프로테아제 활성을 평가하기 위한 플루오레세인-표지된 기질 (대부분의 프로테아제의 천연 기질과 유사한, 카제인)의 사용을 포함한다. 기질의 형광 특성은 프로테아제에 의한 분해 시 변화하고, 이는 단백분해의 측정 가능한 표시를 초래한다. 형광 측정은 표준 플루오레세인 여기/방출 필터 (485/538 nm)를 갖는, 0.5 cm 광학 경로 석영 큐벳에서 Fluorolog-3 (Horiba Jobin Yvon)을 이용해 수행하였다. 검정을 위해, 트립신을 표준품으로 사용하였다. 시크레톰 샘플을 TBS (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2) 중에서 100배 희석하였다. 모든 샘플 및 표준품을 실온에서 20분간 기질과 인큐베이션하였다. 단백질 농도를 표준품으로 소 혈청 알부민 (BSA) (Bio-Rad)을 사용하는 브래드포드 단백질 분석에 의해 결정하였다. 샘플 중의 프로테아제의 정량은 트립신 표준품을 이용한 선형 회귀에 의해 계산한 후 이 분석에 사용된 총 단백질 양 (μg 프로테아제/μg 단백질)으로 측정된 활성을 나누어 표준화하였다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동
단백질을, 기술된 바와 같이, 간략히는 미니-겔 포맷 (7×7 cm Tetra system from Bio-Rad)에서, 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (12% SDS-PAGE)에 의해 분리하였다 (Lamy, et al. 2010; da Costa et al. 2011). 단백질 농도를 표준품으로 소 혈청 알부민을 사용하는 브래드포드 단백질 분석으로 결정하였다. 샘플을 환원 완충제 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) 글리세롤, 2% (w/v) SDS, 5% (v/v) b-머캅토에탄올)로 6배 희석하였다. 전기영동 전에, 샘플을 100℃에서 5분간 가열하였다. 단백질 밴드를 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하였다.
프로테아제 검출을 위한 자이모그램 ( Zymogram )
카제인 및 젤라틴 자이모그램을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Oldak and Trafny 2005). 간략히는, 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 (Laemmli 1970)을 4℃에서 1% 카제인 또는 젤라틴과 공-중합하였다. 비-환원 로우딩 완충제 (62.5 mM Tris, 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루)를 로우딩 전에 시크레톰 샘플에 첨가하였다. 브로모페놀 염료가 겔의 바닥에 도달할 때까지 4℃에서 100 V로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, SDS 제거를 위해 겔을 2.5% (v/v) Triton X-100으로 2회, 각 30분간 세척하고, 이어서 탈이온수로 3회, 각 5분간 세척하였다. 그 후에 겔을 효소 탈변성 (renaturation) 및 후속 단백분해 활성을 위해 활성 완충제 (0.1 M Tris-HCl, 0.01 M CaCl2, pH 8) 중에서 37℃로 인큐베이션하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250에서 1시간 동안 인큐베이션 전에 탈이온수에서 3회, 각 5분간 겔을 세척하였다. ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare Life Sciences)에 의해 이미지를 수득하였다. 프로테아제 활성은 파란색 배경에 명확한 밴드로 표시되었다. ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare Life Sciences)에 의해 이미지를 입수하였다. 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 EDTA에 의한 프로테아제 저해는 문헌 (Bertolini and Rohovec 1992)에 기술된 바와 같이 측정하였다.
결과
본 발명의 목적은 PF-11 및 몇몇 다른 단리 균주로부터 분비된 효소의 단백분해 활성을 평가하고 비교하는 것이었다. 이 목적을 위하여, 본 발명자들은 3종의 기본 배지를 선택하였다: 슈도모나세아에용 M9 최소 배지 (Miller 1972), 첫 번째와 단지 약간 다른 문헌 (Prijambada, Negoro et al. 1995)에 기술된 바와 같은 슈도모나스용으로 고안된 최소 배지, 및 슈도모나스 아에루지노사를 동정하도록 정의된 풍부 배지, 영양 브로쓰. 본 발명자들은 첫 번째 배지에서 질소원 (암모늄 및 티아민)을 제거하여 이를 M9-N으로 명명하거나, 당/에너지원 (글루코스)를 제거하여 이를 M9-G으로 명명하여 추가적으로 개조하였다 (재료 및 방법 참고). 풍부 배지로서, NB는 이들이 세포외 프로테아제를 생산하는지 여부와 상관 없이 모든 균주의 무차별적 성장을 허용하였는데 (도 13A-B), 그러한 기질들은 내재화되어 성장에 사용되는 분해를 요구하지 않기 때문에, 이는 카사미노산 또는 탈지유가 첨가된 임의의 다른 시험된 배지에서와 같다 (데이터 미제시). 다른 모든 배지는 성장 제한 조건을 목표로 설계되었고, 그로써 성장시키고 광학 밀도 판독값을 기록하기 위해서는 배양을 위해 보충된 기질이 분해되는 것이 필수적이다. 역사적인 이유로, 단백분해를 측정하는 방법으로서 본 발명자들은 보충제 탈지유, 카제인 및 카사미노산 (모든 균주의 성장을 위한 양성 대조군)을 사용하였지만, BSA, 헤모글로빈, 및 젤라틴과 같은 몇몇 생화학적 접근법 및 프로테아제 생산 평가를 위해 이미 기술된 다른 단백질이 또한 사용될 수 있고, 이들 모든 단백질은 절단되기 전에 세포 내로의 내재화가 달성되어서는 않된다 (재료 및 방법 참고). H2O를 기질 대신에 음성 대조군으로 사용하였다.
배지 및 보충제를 교환하고 무균주, 음성 대조군으로서 PF-29, 및 양성 대조군으로서 PF-11, 및 마지막으로 P. 푸티다 KT2440 및 P. 아에루지노사 참조 균주에 대해 평가하였고, P. 아에루지노사가 많은 활성 화합물의 강력한 분비자로서 기술되어 있기 때문에, 후자가 양성 반응을 가질 것으로 예상되지만, 이들은 미지 샘플의 상태로 평가되었다. 총 배지 제거는 헤모글로빈 및 카제인 용해에 의해 달성되지 않았다. 그의 분광 경로에서 빛을 유지하고 스스로 광학 흡광도를 나타내면서, 이들은 균주 성장을 차폐하여 단백질성 보충제로서 이들의 사용을 방지하였다 (데이터 미제시). 시험된 나머지 옵션에 대해서는, 초기 조건이 성취되었고 결과를 분석하였다. 배지-단백질성 보충제의 몇몇 조합: M9-G+BSA, M9-G+젤라틴, M9-N+젤라틴, PPM+BSA, 및 PPM+젤라틴-은 프로테아제 생산 균주의 선별을 위한 기준을 충족시켰다 (도 14A-F). 흥미롭게도, 일부 보충제는 소정의 배지와 함께 비특이적 성장을 발생시키는 반면, M9-N과 M9-G의 젤라틴에서 볼 수 있듯이, 이들은 다른 것들과 완벽하게 차별적인 힘을 가지고 있었다 (도 14C 및 D).
본 발명자들은 PF-11 시크레톰의 활성을 보다 잘 특성화하기 위하여 2종의 참조 균주, 슈도모나스 아에루지노사 NTC27853 및 슈도모나스 푸티다 KT2440과, 음성 대조군으로서 환경 단리 균주 PF-29를 선택하였다.
벌크 상청액의 단백분해 함량을 모든 균주에 대해서 플루오레세인 붕괴에 의해 분석하였다. 오로지 PF-11 분비 단백질만이 단백분해 함량 결정을 위해 형광 카제인 기질을 분해할 수 있었다. 총 분비 단백질에 의해 표준화된 프로테아제 농도는 PF-11의 경우 100 μg/mg이었다. PF-11 균주는 다른 균주들에 비해 명백히 더 높은 단백분해 함량을 나타내었다. 세포외 프로테아제 생산의 음성 대조군으로서, 본 발명자들은 이전에 시험되었고 세포외 단백분해 활성을 나타내지 않는 것으로 알려진, PF-29 균주를 사용하였다.
본 발명자들은 PF-11의 단백분해 활성을 참조 균주 슈도모나스 푸티다 KT2440, 음성 대조군으로 이전에 확인된 단리 균주 PF-29, 및 잠재적 프로테아제 생산자로서 이전에 확인된 단리 균주 PF-9 및 PF-22와 비교하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 인큐베이션 내지 세균 성장 배양 후, 광막의 표피 젤라틴 층의 분해를 육안 검사에 의해 초기 분석을 수행하였다. PF-11 세균 브로쓰는 표면의 신속한 세정을 통해 드러난, 탁월한 단백분해 활성을 나타내었다 (도 15).
분자적 접근법의 측면에서, 본 발명자들은 Aer . salmonicida를 비롯한 다른 유기체의 프로테아제 연구를 위해 민감하고 신뢰할 수 있는 방법인 자이모그라피로 균주의 단백분해 활성을 분석하였고 (Arnesen et al. 1995; Gudmundsdo'ttir et al. 2003), 스크리닝 절차로 사용하기 위한 방법을 한 가지 더 평가하였다. 모든 시험된 균주는 이들의 SDS-PAGE 단백질 프로파일에서 볼 수 있는 바와 같이 단백질을 분비하는 것으로 확인되었다 (도 16A). 젤라틴 공-중합된 SDS-PAGE에서 수득된 자이모그램은 시험된 균주들 사이에서 상이한 밴드 패턴의 동정을 가능케 하였다 (도 16B). 평가된 균주들 중에서, PF-11 이외에, 균주 슈도모나스 아에루지노사 NTC27853만이 하나의 단백분해 활성 밴드를 나타내었다. 단백분해 함량의 시험관 내 측정에서 관찰된 바와 같이, 균주 PF-11은 더 높은 단백분해 활성에 상응하는, 더 강렬한 밴드를 나타내었다.
SDS-PAGE 단백질 프로파일은 10 내지 100 kDa의 단백질 밴드를 나타내었고 더 강렬한 밴드는 고분자량 영역에 있지 않았다. 그러나, 자이모그램은 고 분자량 영역에서만 단백분해 활성을 나타내었다. 이러한 사실은 자이모그래피 연구에 필요한 낮은 변성 조건에서는 해리되지 않는 일부 단백질-단백질 복합체에 기인한 것일 수 있다 (Snoek-van Beurden and Von den Hoff 2005). 세포외 프로테아제 생산자에 존재하는 프로테아제 유형의 추가 평가는 PMSF에 의한 세린 프로테아제 및 EDTA에 의한 금속-프로테아제의 선택적 저해에 의해 수행되었다. PF-11 및 NTC를 10 mM EDTA로 처리한 경우, 이들의 단백분해 활성은 비-처리된 대조군 수준에 비해 강력히 저해된 반면, 10 mM PMSF는 유의미하게 더 낮은 저해 효과를 나타내었다 (도 17A 및 B). 따라서, 이들 시크레톰에서 프로테아제 활성의 단지 약 10%만이 세린 프로테아제에 기인한 반면, 약 50%는 금속-프로테아제에 기인한다.
실시예 6 - PF -11 시크레톰의 살진균 효과
재료 및 방법
MIC (최소 저해 농도)를 CLSI 표준 (Clinical and Laboratory Standards Institute) M27-A3 (Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; CLSI) 및 M38-A (Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous fungi; CLSI)에 따라서 측정하였다. 사용된 사상균 (filamentous fungi)은 아스페르질러스 니거 (Aspergillus niger), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 아큐타툼 (Colletotrichum acutatum), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides) 및 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)이었다. 아스페르질러스 니거는 진균으로서 아스페르질러스 속의 가장 일반적인 종의 하나이다. 이는 포도, 살구, 양파, 땅콩과 같은 특정 과일과 채소에 검은 곰팡이 (black mould)라는 질병을 일으키며 음식의 흔한 오염원이다. 보트리티스 시네레아는 그의 가장 주목할만한 숙주가 와인 포도일 수는 있지만, 많은 식물 종에 영향을 미치는 외생 (ecrotrophic) 곰팡이이다. 포도 재배에서는, 일반적으로 잿빛 곰팡이 (botrytis bunch rot)로 알려져 있고, 원예에서는, 보통 회색 곰팡이 (grey mould 또는 gray mold)로 불린다. 이 곰팡이는 포도에 2가지 다른 종류의 감염을 유발한다. 콜레토트리쿰 아큐타툼은 식물 병원균이다. 이는 전 세계적으로 루핀 (lupin) 종의 가장 파괴적인 곰팡이병인, 탄저병 (anthracnose)을 유발하는 유기체이다. 푸사리움 옥시스포룸의 병원성 균주는 매우 넓은 숙주 범위를 가지고 있으며, 절지동물에서 사람까지의 동물뿐만 아니라 겉씨식물과 속씨식물 둘 다의 범위를 포함하는 식물을 포함한다.
사용된 효모는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 및 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata)였다. 칸디다 알비칸스는 효모 및 사상균 세포 둘 다로서 성장하는 이배체 곰팡이이고 인간의 기회성 구강 및 생식기 감염, 및 조갑 (nail plate)의 감염인, 칸디다 손발톱진균증 (candidal onychomycosis)의 발생 원인이다. C. 알비칸스에 의한 것을 비롯한 전신 곰팡이 감염 (진균혈증, fungemias)은 면역손상된 환자 (예컨대, AIDS, 암 화학요법, 장기 또는 골수 이식)의 이환율과 사망률의 중요한 원인으로 나타났다
결과
PF-11 시크레톰은 표 2의 효모 및 사상균에 대해 항진균 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 PF-11 시크레톰이 살진균제로서 다른 모든 관련 분야 중에서, 인간 건강 및 식품 식물 둘 다를 위해 사용될 수 있는 곰팡이에 대해 효과적인 하나 이상의 활성제를 그의 조성에 함유함을 나타낸다.
종 MIC (g/L)
사상균
아스페르질러스 니거 7.5
보트리티스 시네레아 3.75
콜레토트리쿰 아큐타툼 3.75
콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 3.75
푸사리움 옥시스포룸 7.5
효모
칸디다 알비칸스 3.75
칸디다 글라브라타 3.75
표 2 - PF-11 시크레톰은 효모 및 사상균에 대해 항진균 활성을 나타내었다.
실시예 7 - PF -11 시크레톰의 유충제/살충제
재료 및 방법
유충
후기 3rd 및/또는 초기 4th 모기 쿨렉스 테일레리 (Culex theileri), 아노펠레스 아트로파루부스 (Anopheles atroparvus) 및 아노펠레스 감비아에 (Anopheles gambiae)의 유충을 사용하였다. 분석을 위한 충분한 수의 유충을 생산하는 모기의 활동적인 숫자를 보유하기 위해 모기 콜로니를 증가시켰다.
생체분석
0과 100% 사망률 둘 다를 통합하기 위해 연속적 희석에 의해 용량을 계획하였다. 분석은 식량 공급 없이, 25-27℃ 및 12시간 명/12시간 암의 광주기의 곤충 통제 조건에서 농도당 탈이온수 250 ml 중에 25 마리의 유충을 사용하여 수행하였다. 유충의 사망률을 24시간 후에 기록하였다. 탈이온수만을 음성 대조군으로 사용하였다. 분석은 모기 유충제를 평가하기 위한 WHO 국제 지침에 따라 수행되었다.
결과
PF-11 시크레톰은 화학적/생물학적 화합물로서 이의 사용을 통해, 곤충을 사멸하거나 이의 발생을 예방함으로써 곤충의 번식을 통제할 수 있는 능력을 나타내기 때문에, 이는 살충 용도로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 비행 성체로의 변태 전에, 이들의 수생 발단 단계 도중에 모기 유충을 죽임으로써 저농도의 PF-11 시크레톰에서 살충 활성을 관찰하였다. PF-11 시크레톰은 24시간 후에 3.9 g/L의 농도에서 100% 유충 사망률을 나타낸다.
실시예 8 - PF -11 시크레톰의 항-해양 요각류 효과
재료 및 방법
분석은, 블랭크 대조군에 비해 유충과 요각목 (copepodid)의 생존능을 평가하기 위해 바닷물이 (Lepeophtheirus salmonis salmonis) 유충과 요각목을 PF-11 시크레톰과 함께 인큐베이션하는 것으로 구성되었다. 70 ppm에서 40분 이내에 유충을 사멸하는 것으로 알려진, 치아염소산 나트륨 (sodium hypocholorite, NaOCl)을 양성 대조군으로 사용하였다.
유충
벤조카인 (benzocaine)으로 연어 바닷물이를 진정시키고, 핀셋으로 알 끈 (egg string)을 수확하고, 인큐베이터에 놓인 수조에 이 끈을 이동시켜서 유충을 수득하였다. 인큐베이터 내부에서, 인큐베이션 기간에 걸쳐서 물을 지속적으로 변화시켜 주었다. 유충이 발생하면 인큐베이터로부터 이들을 제거하여 생체분석에 사용하였다.
요각목
요각목을 유충에 대해 기술된 바와 같이 바닷물이로부터의 알 끈으로부터 발생시켰다.
생체분석
이 (louse) 유충과 요각목을 함유하는 해수를 페트리 디쉬에 넣고 PF-11 시크레톰을 최종 의도된 농도로 첨가하였다. 화합물이 첨가되지 않은 해수 중의 유충 및 요각목을 또한 비교를 위해 사용하였다. 양성 대조군은 70 ppm에서의 NaOCl였다. 유충 및 요각목 생존능을 시간의 경과에 따라 점검하였다. 유충 생존능의 평가를 수행하고 블랭크 대조군의 생존능과 비교하였다. 순수한 해수 대조군 및 배지 블랭크 대조군에서의 생존능을 모니터링하고 비교하여 실험 전반에 걸쳐 동일하게 유지하였다.
결과
사용된 농도 범위에서, PF-11 시크레톰은 NaOCl이 100% 효과적인 되는데 필요한 시간인 20분 전에, 바닷물이 유충 및 요각목을 100% 사멸하여, 70 ppm에서의 양성 대조군 NaOCl보다 바닷물이 유충 (도 24) 및 요각목 (도 25)에 대해 실질적으로 더 우수한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 PF-11 시크레톰이 바닷물이에 대해 효과적이고, 따라서 항-기생충 활성을 나타냄을 보여준다.
논의
항미생물 내성
실제로 요즘 사용되는 모든 항생제에 대한 항미생물 내성의 출현은 세균 감염에 대한 효율적인 치료가 곧 가능하지 않은 상황을 급속하게 초래하다. 의학적으로 사용되는, 새로 도입된 임의의 항생제는 그의 효과를 저해하는 세균 내성의 검출에 의해 1년 이내에 극복되어 왔다. 따라서 새로운 항미생물 화합물에 대한 연구는 세균에서 새로운 내성 메커니즘을 촉진하거나 이미 존재하는 내성 과정을 선택하지 않은 효율적인 항생제를 찾을 필요성을 통합해야 한다.
활성 생물학적 화합물의 환경적 생체전망 (bio-prospection)은 세균 증식의 제어를 위한 이러한 경우에 새로운 천연 도구의 개발을 위한 매력적인 전략이다. 환경 미생물은 주변 환경의 변화에 지속적으로 압박을 받고 있으며, 이는 외부 변화에 대처하고 영양소에 대해 이웃하는 미생물과 경쟁하기 위해 매우 다양한 분자 반응을 보유해야 하는 고도의 내성 세균 세포의 적극적 선택을 유도한다. 세균은 이웃하는 미생물의 성장을 저해하거나 심지어는 이들을 파괴함으로써 그들 자신의 생존과 영양소에 대한 접근을 보장하면서, 수백만 년 동안 그들의 경쟁자를 압도할 수 있는 도구를 개발해 왔다. 세균은 가장 다양한 응용 분야 (항생제 생산, 생화학 공정, 식품 산업 등)에서 성공적으로 사용되고 있는 세포외 분자의 천연 생산자이다 (Wilhelm et al., Wu and Chen et al., Liu and Li 2011, Pontes et al.).
항미생물 펩티드 (AMP)는 세균 세포막을 급속히 파괴하여 그람-양성 및 그람-음성 종에 대해 광범위한 스펙트럼 활성을 부여하기 때문에, 감염 관리에 탁월한 후보자이다. 주목할 만하게도, AMP는 자연계에 널리 분포되어 있고 수백만 년 동안 세균이 이 분자에 노출되어 있었지만 광범위한 내성은 보고되지 않았다 (Fjell et al., 2011). 전통적인 항생제에 대한 미생물 내성의 증가를 감안할 때, AMP의 사용은 세균 감염의 미래 치료를 위한 가치 있는 대안으로 두드러진다. AMP는 모든 생물 종에 의해 생성되며 선천적 면역 체계의 주요 구성요소를 나타내어, 세균, 진균 및 효모를 비롯한 침입하는 병원균에 대해 신속한 작동 무기를 제공한다 (Boman, 1995; Hancock et al., 2006; Selsted and Ouellette, 2005; Zasloff, 2002). AMP는 교차-내성을 갖지 않는 통상의 항생제와는 달리 막을 빠르게 침투하고, 퍼져서 파괴하여 비가역적 세포 손상을 유발할 수 있고 (Ludtke et al., 1996; Pouny et al., 1992; Shai, 2002); 이들 작용의 비가역성은 미생물 내성의 출현 가능성을 감소시킨다 (Zasloff, 2002). 진핵생물-AMP는 일반적으로 넓은 스펙트럼의 항미생물제이지만 대부분이 세균과 진핵 세포 둘 다에 독성을 갖기 때문에, 이들의 직접 사용을 무력화한다 (Asthana 2004). 진핵생물 AMP의 높은 세포독성과 낮은 생체이용률은 일반적으로 효율성을 위해 필요한 고농도에서 발생하는 펩티드의 단백분해 또는 응집으로 인해서, 지금까지 임상적 응용을 방해하고 있다 (Giuliani 2008). 대조적으로, 리포펩티드 또는 펩티도리피드와 같이 세균에 의해 생성된 AMP는 선택적이며 동물에게 더 낮은 독성을 나타낸다 (Parisien 2008). 리포펩티드는 세균과 곰팡이에서만 생산되며, 강력한 항미생물 활성과 계면활성제 특성을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고, 천연 리포펩티드는 비-세포-선택적이므로 포유류 세포에도 독성을 나타낼 수 있다. 이에도 불구하고 이 패밀리의 일원인 답토마이신 (daptomycin)은 그람-양성 세균에 대해서만 활성이며 복합적인 피부 감염 치료를 위해 식품의약청 (Food and Drug Administration, FDA)의 승인을 받았다 (보건사회복지부, 2003). 펩티도리피드 역시 식물병원체를 파괴하거나 제거할 수 있는 이들의 능력으로 인해서 현재 조사가 진행 중이다. 이들의 계면활성제 특성을 이용하여 표면으로부터 세균의 부착 및/또는 탈착, 세균의 생물막 발생 및 유지 (O'Toole et al., 2000) 및 세균 운동성, 세포간 통신 및 영양소 접근을 자극할 수 있다 (Al-Tahhan et al., 2000; Garcia-Junco et al., 2001). 세균 기원의 AMP가 적용에 대해서는 제한된 성공을 거두며 연구되어 왔지만, 이러한 접근법을 전달하려는 대부분의 시도는 진핵생물 AMP에 초점을 맞추어 왔다. 그러나, 환경 세균이 AMR의 과정과 이들의 대부분 발견하지 않은 다양성에 미치는 영향은 새로운 항미생물제 연구의 기회를 열어준다.
실시예 3에서, 강력한 적응 능력을 지닌 항생제에 대한 내성을 통한 이전의 연구 과정 (Meireles, 2013)에서 수집된, 환경 슈도모나스 푸티다 균주의 이종 콜렉션이 미생물 성장 조절을 위한 분비된 천연 화합물의 잠재력을 스크리닝하는데 사용되었다. 이들이 생산 세균의 생존에 의해 제공되는 효율성 증명과 함께, 다양한 온도와 조건에서 더 안정한 화합물, 및 특히 이웃한 경쟁자의 성장에 영향을 주기 위해 자연적으로 사용되는 분자를 초래해야 하기 때문에, 분비 분자에 중점을 두었다. 슈도모나스 종은 일반적으로 환경에 널리 퍼져있으며 오염이 심한 지역에서도 지속된다. 이들은 또한 쿼럼-센싱 통신 (quorum-sensing communication) (Roy 등)에서의 호모세린 락톤 자동-유도제와 같은 세균 통신에 관련된 분자, 피오베르딘 (pyoverdine) 또는 피오시아닌 (pyocyanin)과 같은 여러 유형의 시데로포어 (Nestler et al.), 엑소폴리사카라이드 (exopolysaccharide) 및 세포외 프로테아제를 포함하는 몇 가지 상이한 효소 (Wilhelm et al.)를 활발히 분비하는 것으로 나타났다.
환경 P. 푸티다 단리 균주의 컬렉션을 사용하여 항미생물 화합물 분비에 대해 선별하였다. 7종의 단리 균주 및 P. 푸티다 참조 균주의 한 세트의 시크레톰을 사용하여 이들의 항미생물 활성을 측정하였다. 일부 시크레톰은 세균 성장 저해에 대해 잠재력을 보였으나, 균주 PF-11에 의해 분비된 화합물은 다른 세균의 성장 방지에 놀랍고 뛰어난 효과를 나타내었다 (도 1A-C). 그러나, 이는 P. 푸티다와 매우 밀접한 유형으로, 광범위하게 편재하고 그의 적응 기술에 대해 공지된, P 아에루지노사의 성장을 저해하지는 않았다. 반대로, E. 콜라이 및 S. 아우레우스의 성장에 대한 강력한 성장 저해가 결정되었는데, 이는 그람-음성 및 그람-양성 균주 둘 다에 대한 영향을 나타내었다. 이 유형의 대표적인 예로서 사용된 이들 참조 균주는 PF-11의 시크레톰이 병원성 E. 콜라이 및 S. 아우레우스 균주를 제어할 수 있는 화합물을 함유하고 있다는 강력한 가능성을 나타내었다. 단리 균주 및 KR2440을 비롯해 다른 P. 푸티다 균주의 성장 역시 상당히 손상되었다 (도 2).
놀랍게도, 그 자신의 성장에 대해 시험한 경우, PF-11의 시크레톰은 성장 자극제로 작용하였는데, 이는 특정 균주-간 통신으로 그 균주의 복제를 촉진하는 특정 화합물의 존재를 나타낸다. 다른 P. 푸티다 균주도 또는 P. 아에루지노사조차도 이러한 행태를 나타내지 않았는데, 이는 PF-11 균주의 독창성을 강조한다. 이 세균은 경쟁자를 강력히 저해하는 수단 및 형제자매 복제를 과다-자극하는 이점을 가지고, 성공적인 환경 생존자의 특징을 명백히 나타낸다.
분자 크기 배제에 의한 PF-11의 시크레톰의 분리는 펩티드 및 소 화합물 (10 kDa 미만의 크기)을 함유하는 분획 및 더 큰 화합물 (효소를 비롯한 단백질 및 기타)을 갖는 또 다른 분획을 생성하였다. 도 3의 데이터는 어느 한 분획에 의해서는 P. 아에루지노사 성장의 손상이 부재한 반면, E. 콜라이 및 S. 아우레우스는 본질적으로 단백질 분획에 의해 저해됨을 확인한다. S. 아우레우스는 어떤 분획에 의해서도 강력히 저해되지만, 펩티드성 분획은 더 강력한 항-스타필로코컬 효과를 명백히 갖는다. 이러한 결과는 PF-11 시크레톰의 항미생물 특성에도 불구하고, 이들이 상이한 화합물 또는 분자에 의해 뒷받침되며, 명백히 다른 세균에 영향을 미침을 보여준다. 따라서, 이 시크레톰은 세균 증식을 저해하고 다른 세균 유형을 표적할 수 있는, 별개의 조합 또는 어쩌면 그 자체로 상이한 요소들의 혼합물을 함유한다. 따라서, 균주 PF-11에 의해 분비된 화합물은 항미생물 응용의 확대된 가능성을 나타내고, 이는 다양한 응용을 위해 여러 관심 분자가 존재함을 시사한다.
조성물의 관점에서 PF-11 시크레톰의 일반적인 특성은 현저한 농도의 펩티드 (도 4), 최종적으로는 리포펩티드인 계면활성제 분자 (도 5) 및 분해 효소 (도 6)의 존재를 나타내었다. 이러한 모든 종류의 화합물은 세균에 의해 다량으로 분비되고, P. 푸티다 KT2440에 대한 명백히 두드러진 행태로, 잠재적 항미생물 화합물의 관점에서 이 시크레톰의 풍부함을 확인한다.
향후 응용의 경로를 명확히 하기 위해, 화합물의 생물학적 활성을 유지하도록 PF-11 균주의 시크레톰을 수집하고 동결건조에 의해 농축하였다. 이전에 E. 콜라이 및 S. 아우레우스를 이용해 수득된 결과를 검증하였고 병원성 균주 E. 콜라이 O157 및 메티실린-내성 S. 아우레우스 (MRSA) ATCC 33591에 대한 영향을 확립하였다. 향균 화합물은 이 시크레톰의 다양한 시험 분획에서 발견되지만, 펩티드 분획은 아마도 항미생물 펩티드인, 별개의 세균에 대해 더 높은 항미생물 효과를 갖는 분자를 함유하고, 궁극적으로 계면활성제 활성을 갖는다.
방오 ( Antifouling )
해양 환경에서, 미세부착물의 이러한 초기 단계 이후에, 해초, 따개비 및 다른 해양 무척추동물의 고정으로 이루어지는 거대부착물의 단계가 결국 발생하고, 이는 선박 선체, 양식 그물 우리, 해수 유입 파이프 또는 근해 플랫폼과 같은 잠긴 인공 구조물에 대해 기능 및 유지 문제를 초래한다 (Railkin et al.). 선박 선체 상의 미세부착물은 마찰 항력을 증가시키고, 그 자체가 선적 시 연료 소비가 21% 증가하는 원인이 되는 반면, 거대부착물의 영향은 86%에 가까운 에너지 손실을 초래할 수 있다 (Schultz et al.).
오늘날 세계 무역의 약 90%는 해상 국제 선박을 기준으로 한다 (국제상공회의소). 해양 생물부착물이 국제 해상 운송 비용에 미치는 경제적 영향은 상당하며, 연간 40억 달러로 추정되는 글로벌 산업의 프레임 안에서, 방오 기술에 대한 연구의 필요성을 기하급수적으로 초래하였다 (Dafforn et al.). 이러한 산업의 경쟁력에 대한 방오의 과도한 영향은 해상 운송의 기원 이래로 방오 해법의 개발 및 구현을 이끌어 내었다. 선박 선체의 코팅은 부식을 줄이고 생물학적 부착을 방지하는 것을 목표로 한다.
구리 및 트리부틸틴과 같은 독성 화합물이 이 공정에 사용되는 페인트에 첨가되어 왔고, 주변 바다에 이들의 지속적인 방출로 인해 생물부착물의 형성을 성공적으로 방지하였다 (Yebra et al.). 그러나, 특히 트리부틸틴과 같은 이러한 물질의 광범위한 사용은 환경에 이의 축적을 초래하였고, 해양 공동체에 대한 이들의 비-특이성 및 그 결과의 독성 영향으로 인해 전 세계적 우려를 유발하고 있다 (Thomas et al.). 결과적으로, 국제 해사기구 (International Maritime Organization)는 2003년에 트리부틸틴-계 페인트의 사용을 금지하였으며, 이는 효율적인 방오 해법의 결여를 초래하였다 (International Maritime Organisation, London). 구리-계 페인트는 여전히 사용되고 있으며 새로운 비-독성 실리콘-계 코팅이 개발되어 시행되었지만, 이들의 사용이 강력하게 규제되고 더욱이 이들의 효율성이 감소되었다 (Townsin et al.). 따라서 신규하고 천연인 방오 화합물의 연구가 개발되어 왔으며 여전히 생물학적 증식을 통제하기 위한 비-독성의 효율적인 방법을 구현하기 위한 가장 유망한 접근법으로 남아있지만, 성공적으로 상용화된 해법은 아직까지 없다 (Dafforn et al.).
따라서, 환경에 독성 영향을 미치지 않으면서, 이들 부착 구조물의 형성을 방지 또는 파괴할 수 있는 효소의 동정에 대한 연구가 이루어졌다 (Leroy et al., Pettitt et al.). 생물부착물에 잠재적 영향을 갖는 분해성 또는 항-증식성 화합물 중에서, 세균에서 하등 진핵생물에까지 생물학적 종에 의해 사용되는 접착성 아교 또는 분자의 핵심이 본질적으로 단백질성이기 때문에, 프로테아제의 분해성 효소 활성이 유망한 경로로 제안되어 왔다 (Rawlings et al.). 프로테아제의 혼합물은 울바 유주자 (Ulva zoospores), 발라너스 암피트리테 (Balanus Amphitrite) 만각류 (cyprid) 유충 및 버굴라 네리티나 (Bugula neritina)의 정착을 저해하는 것으로 나타났고 (Pettitt et al., Dobretsov et al.), 이러한 활성은 아마도 펩디드-계 접착 화합물의 분해를 통한 접착제 효과의 감소에 기인한 것으로 확인되었다 (Aldred et al.). 나아가, 이러한 효소를 수계 페인트에 배합하는 경우 프로테아제와 관련된 방오 효과가 확립되었다 (Dobretsov et al.). 또한, 슈도알테로모나스 (Pseudoalteromonas) 생물막 형성에서 관찰되는 바와 같이, 단백질은 생물막 매트릭스의 중요한 부분을 구성하고 프로테아제는 이러한 구조를 파괴하는데 효과적일 수 있다 (Leroy et al.).
활성 생물학적 화합물의 환경적 생체전망은 신규한 생물공학적 도구의 개발을 위한 매력적인 전략이다. 세균은 가장 다양한 분야 (항생제 생산, 생화학적 공정, 식품 산업 등)에서 성공적으로 사용되고 있는 세포외 분자의 천연 생산자이다 (Wilhelm et al., Pontes et al.). 환경 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 특히 슈도모나세아에 (Pseudomonaceae)는 주변 배지 내로 세포외 프로테아제를 분비하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 분비된 프로테아제는 종종 슈도모나스 아에루지노사에 의해 생산된 알칼라인 프로테아제 및 엘라스타제와 같이, 감염 전략에 기여하는 독성 인자이지만 (Liu 1974), 또한 세라티아 종 (Serratia sp.) 균주 E-15에 의해 생산되는 금속프로테아제와 같이 항-염증제로 사용되고 있다 (Nakahama et al.). 인간 및 어류의 기회적 병원체인 아에로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila)는 온도-안정성 금속프로테아제 및 온도-민감성 세린 프로테아제라는 2가지 다른 유형의 세포외 프로테아제를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (Leung et al.).
특히 토양 표면 또는 강변 근처에 위치해 있는 경우, 환경 균주는 불안정한 주변의 영향을 지속적으로 받게 된다. 그들 중에서도 온도, 습도, 빛 또는 영양소의 유무에 있어서 규칙적인 일상의 변화는 인위적인 요인을 고려할 때 증가하는 이들 세균에 대한 선택적 압력을 강요하는 경향이 있다. 후자는 다양한 종류의 천천히 지속되는 오염 (화학물질, 살충제, 분변으로 오염된 상하수도 등)에서 급격한 산업적 독성 배출까지 다양할 수 있다. 이러한 모든 요인들은 고도로 전문화된 내성 세균 세포, 및 동시에, 매우 다양한 이러한 외부 압력에 대처하기 위해 다수의 반응을 보유해야만 하는 세균의 적극적인 선택을 유도한다. 이러한 가혹한 조건은 외부 조건 변화에 저항하지만 또한 생존을 위한 조용한 전쟁에서 진정한 무기를 사용하여, 이웃하는 미생물에 대해 고도로 경쟁적인, 다른 기원으로부터 다른 분해 메커니즘을 통해 영양소를 얻는데 매우 성공한 환경 균주에 반영된다. 이러한 과정에 관여하는 메커니즘 및 생산된 생체분자는 실제 상황에서 직접 시험된 수십억 년의 진화의 결과이며, 이들의 효율성은 이를 수반하는 종의 생존에 의해 입증된다. 따라서 이러한 공동체는 유기체의 생물학적 방제 (biocontrol)를 유도하는 응용에 사용되는 분자를 선별하는데 탁월한 저장소이다.
주로 토양에서 발견되는 슈도모나세아에인, 슈도모나스 푸티다는 부식된 물질의 화학종속영양 (chemoheterotrophic) 세포외 분해를 할 수 있는, 부생영양 (saprotrophic) 미생물이다. 가장 작 정응된 환경 세균의 하나로서, P. 푸티다는 주변 영양소의 능동적인 포획뿐만 아니라 독성 또는 항-증식성 화합물의 분비를 통해 이들의 성장에 영향을 미침으로써 다른 경쟁자인, 세균과 진균의 방제를 허용하는, 유전적으로 동봉된 적응 능력의 무기를 보유한다 (Gjermansen et al., Tsuru et al.).
실시예 4에서, 자연적으로 생산되고 환경 공동체에 비-독성인 방오제로서 생물공학적 응용과 관련된 세포외 화합물을 생산할 수 있는 환경 슈도모나스 균주를 검출하기 위한 선택이 수행되었다. 슈도모나스 종 균주는 환경에 널리 퍼져 있으며 오염이 심각한 지역에서도 지속된다 (Madigan et al.). 이들은 또한 쿼럼-센싱과 관련된 호모세린 락톤 자동-유도제 (Charlton et al., Huang et al.), 피오베르딘 또는 피로시아닌과 같은 다른 유형의 시데로포어 (Meyer et al.), 엑소폴리사카라이드 및 세포외 프로테아제를 비롯한 몇몇 상이한 효소 (Liu 1974)와 같은 세균 통신과 관련된 분자를 활발히 분비하는 것으로 나타났다. 분비된 생체분자의 수집 가능성은 생명공학적 응용을 고려할 때 몇 가지 흥미로운 이점을 제시한다. 분석적 특성 규명 및 사용에 필요한 이들의 대량 회수가 촉진될 뿐만 아니라, 일반적으로 환경으로 분비되는 분자인, 이들은 원칙적으로 세포내 분자보다 더 안정적이어서 자발적 분해에 더 내성이어야 한다.
시험된 균주들 중에서, 슈도모나스 PF-11은 카제인, 총 E. 콜라이 단백질 추출물, 및 성게에 의해 분비된 접착제를 분해할 수 있는, 프로테아제, 또는 아마도 프로테아제의 혼합물을 생산하는, 탁월한 프로테아제-분비 균주로서 확립되었다. 나아가, 검출된 활성은 넓은 간격의 온도에서 상당히 안정을 유지하였고 매우 낮은 턴오버율 (turnover rate)을 나타내었다. 이러한 단백분해 활성은 PF-11 세포 배양물의 상청액 중에 분비된 프로테아제의 존재에 의존한다. 상기에 기술된 바와 같이, 프로테아제는 방오 코팅 응용을 위한 우수한 효소적 후보자로서 일관되게 고려되고 있다.
또한, 이 균주에 의해 생산된 상청액 혼합물 및 벌크 배양물 둘 다는 단독으로 유리 기판에 부착된 해양 생물막 및 성게 접착성 풋프린트를 파괴할 수 있었다. 상당 부분은, 이러한 효과가 용액 중에서 프로테아제 존재에 기인할 수 있는데, 이는 선천적 구조 단백질의 분해가 임의의 파괴를 없애는데 충분하기 때문이다. 실제로, 해양 생물막에 존재하는 성게 또는 다양한 미생물의 부착 메커니즘의 단백질 기반 접착성 구조는 단백분해, 및 그 후의 부착물의 파괴를 위한 이상적인 표적을 구성한다. 그러나, 다른 조절 요소가 이 분비된 혼합물을 통합할 수 있고 조합하여 접착제 온전성에 대한 이러한 강력한 효과에 기여할 수 있다. 슈도모나스 PF-11의 시크레톰은 분명히 매우 연관된 잠재적 방오 화합물의 풍부하고 복잡한 혼합물을 구성한다.
환경으로부터 단리된 균주 슈도모나스 PF-11은 미세부착물 및 거대부착물 현상 둘 다에 강력한 방오 효과를 촉진하는 프로테아제 및 아마도 다른 화합물의 농축된 혼합물을 분비할 수 있다. 방오 제거에 관여하는 활성 인자를 규명하기 위하여, 이러한 분비된 혼합물의 방오 성분의 특성 규명이 요구되며 이 연구의 논리적 지속이 진행 중이다. 이의 지각된 잠재력은 검출된 단백분해 활성을 훨씬 뛰어 넘는다. 이 과정에 관여하는 분자의 동정은 생물학적 부착 메커니즘을 더 밝힐 수 있을 뿐만 아니라, 환경 친화적인 생체활성 분자의 신규한 세트에 확실히 기여할 것이고, 이는 특히 해양 방오 제거 전략에서 여러 가지 방오 위험에 대한 해결책의 일부가 될 수 있다.
프로테아제
프로테아제는 연속하는 아미노산들 사이의 펩티드 결합을 가수분해하여, 다른 단백질 또는 올리고펩티드의 단백분해를 수행하는 효소이다. 친핵성 공격은 엔도펩티다제에 의해 펩티드 쇄 내에서 특정 아미노산과 관련되어 일어날 수 있으며, 또는 엑소펩티다제에 의해, 단백질의 말단에서, 비특이적일 수 있다. 따라서, 기질은 더 짧은 쇄 또는 올리고펩티드 중 하나로 부분적으로 분해되거나, 또는 완전히 분해되어, 그들의 아미노산 빌딩 블록을 방출한다 (Barrett 2001). 이들 생촉매는 그들이 활성을 나타내는 pH 범위와 일치하는, 산성, 중성 또는 알칼리성으로 정의된다 (Gupta, Beg et al. 2002). 그들의 촉매 메커니즘, 기질 특이성, 및 심지어는 단백질 저분자 저해제에 따라서, 프로테아제는 또한 아스파라긴 펩티드 리아제, 또는 아스파르트산, 시스테인, 세린, 쓰레오닌, 및 금속 또는 미지의 촉매 유형 펩티다제로 분류될 수 있다 (Rawlings, Barrett et al. 2012). 지금까지, 세포외 세균 프로테아제, 및 이들 중에서도 세린 및 금속 프로테아제가 가장 잘 연구되어 있다 (Wu et al.).
생물학적 촉매에 대한 세계적 수요는 2013년에 70억 달러에 이를 것으로 예상된다. 프로테아제는 오늘날 효소 산업의 주요 그룹 중 하나이며 다수의 세제 안정성 프로테아제가 이들의 광범위한 사용으로 인해 분리되고 특성이 규명되었다 (GCI 2009). 세포외 세균 프로테아제 (EBP)는 생체공학 및 산업의 맥락에서 고유한 몇 가지 특성을 나타내는데: 이들은 프리-프로펩티드로 번역되고, 세포에 의해 분비되며 (따라서 성장 배지 중에서 자연적으로 접근할 수 있고, 이들을 수득하기 위한 특별한 방법을 피할 수 있으며, 나아가 관심 화합물을 회수하면서 배양이 유지되게 할 수 있음), 더욱이 이들은 세포 외부에서만 활성이다 (따라서 과발현 시 독성을 나타내지 않거나 과도한 축적으로 인해 배양 성장 및 유지 능력을 감소시키지 않음). 그 후에 효소의 활성 형태가 성숙 시 절단되거나 (Kessler and Ohman 2004; Gao, Wang et al. 2010) 또는 이들의 조절자로서 작용하는 다른 프로테아제에 의해 보조되는 (Kessler, Safrin et al. 1998), 분자내 샤페론을 통한 자가-프로세싱에 의해 달성된다. 이러한 측면 이외에, 세포외 프로테아제는 일반적으로 단리 균주가 성장하는 환경에 의존적인 최적 온도, pH (및 pI) 및 이온 강도를 나타내고, 따라서 특정 환경, 용매 또는 온도에 대해 인간이 유도한 진화론적 압력을 만드는 극한 조건에서 성장하고 기능하도록 배양 및 단백질 적응을 유도할 수 있기 때문에, 이들의 기원에 따라 특정 단리 균주에 대한 의도된 활성을 위해서 스크리닝을 좁힐 수 있다. 또한, 분비된 생촉매는 세포 외부에서 완충되지 않기 때문에 이들은 일반적으로 열, pH 및 심지어 염에 흥미로운 안정성을 자연적으로 나타낸다 (Wu and Chen et al. 2011).
그러나 프로테아제가 편재하는 경우, 이들 대부분은 기질 특이성 또는 용매 안정성/활성의 결여로 인해서와 같이, 발현 수준 또는 하류 프로세싱 요건 및 결과적인 생산 비용으로 인해 산업적 소재가 아니며, 이는 이들의 의도된 사용을 위한 조건에 대한 이들의 (부)적응성을 말하는 것이다 (Gupta, Beg et al. 2002). 그럼에도 불구하고, 미생물 프로테아제는 1999년 이전부터 대부분의 산업적 프로테아제 생산을 대표하며, 이들의 시장은 오로지 성장하는 경향이 있을 뿐이다 (Godfrey and West 1996; Kumar and Takagi 1999).
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Claims (33)

  1. 하기를 포함하는 세균 상청액을 제조하는 방법:
    i) 슈도모나스 환경 균주 (Pseudomonas environmental strain) PF-11의 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 상청액을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 슈도모나스 균주 PF-11의 세포가 적어도 하나의 세포외 프로테아제를 생산하는 조건하에서 상기 세포를 배양하고, 상청액이 적어도 하나의 세포외 프로테아제를 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 배양된 세포의 수가 기하급수적인 속도로 증가할 때 상청액을 회수하거나;
    (b) 배양된 세포의 수가 기하급수적인 속도로 증가하는 것을 멈춘 후에 상청액을 회수하거나;
    (c) 세포를 글루코스가 보충된 염 배지에서 배양하거나;
    (d) 세포를 글루코스가 보충된 M9 배지에서 배양하거나;
    (e) 세포를 암모늄 및 티아민이 결여된 배지에서 배양하거나; 또는
    (f) 세포를 약 28, 29, 30, 31, 또는 32℃의 온도에서 배양하는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상청액 또는 변형된 상청액을
    (a) 10 kDa 크기를 초과하는 성분들의 분획; 및
    (b) 10 kDa 크기 미만인 성분들의 분획으로 나누는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 상청액 또는 이의 분획을 생산하기 위해 하기를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 상청액 또는 이의 분획의 하나 이상의 성분들로부터 적어도 하나의 세포외 프로테아제의 분리;
    (b) 상청액 또는 이의 분획의 염 농도 감소;
    (c) 상청액 또는 이의 분획의 물 함량의 감소; 또는
    (d) 상청액 또는 이의 분획의 살균.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 허용가능한 담체를 상청액, 변형된 상청액, 또는 이의 분획에 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 표면을
    i) 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는
    ii) 슈도모나스 균주 PF-11의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    표면 위에 생물막의 양을 감소시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 생물막이
    (a) 담수 생물막이거나;
    (b) 연못, 호수, 또는 강 환경에서 성장할 수 있는 담수 생물막이거나;
    (c) 해양 생물막이거나; 또는
    (d) 담수 또는 염수 수족관에서 성장할 수 있는 것인, 방법.
  9. 표면을
    i) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는
    ii) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    표면에 대한 적어도 하나의 유기체의 부착을 감소시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 유기체가 조류, 성게, 따개비 (barnacle), 또는 이끼벌레 (bryozoan zooid)인 것인, 방법.
  11. 표면을
    i) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는
    ii) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    표면 위에 미세부착물 (microfouling) 또는 거대부착물 (macrofouling)을 감소시키는 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이
    (a) 유리, 섬유유리, 목재, 고무, 플라스틱, 또는 금속;
    (b) 수족관, 수영장, 부표, 선창, 또는 배 또는 바지선의 선체의 표면;
    (c) 어망 또는 물에 놓인 다른 그물;
    (d) 로프; 또는
    (e) 벽 또는 천장 구조물인 것인, 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 페인트 또는 투명 코팅인 것인, 방법.
  14. 진균을
    i) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는
    ii) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    진균을 사멸하거나 이의 성장을 감소시키는 방법.
  15. 곤충을
    i) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는
    ii) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    곤충을 사멸하거나 이의 발생을 저해하는 방법.
  16. 해양 요각류 (marine copepod)를
    i) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는
    ii) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    해양 요각류를 사멸하거나 이의 발생을 저해하는 방법.
  17. 세균 세포를
    i) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획; 또는
    ii) 슈도모나스 균주 PF-11 배양물의 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    세균 세포를 사멸하거나 이의 성장을 감소시키는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상청액 분획 또는 변형된 상청액 분획이 슈도모나스 균주 PF-11 시크레톰 (secretome)의 10 kDa 크기를 초과하는 성분들을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상청액 분획 또는 변형된 상청액 분획이 슈도모나스 균주 PF-11 시크레톰의 10 kDa 크기 미만의 성분들을 포함하는 것인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 세포가 슈도모나스 종 (Pseudomonas spp.)인 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 또는 슈도모나스 세포 이외인 것인, 방법.
  21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 세포가 스타필로코커스 종 (Staphylococcus spp.)인 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 또는 메티실린-내성 (methicillin-resistant) 스타필로코커스 아우레우스 세포인 것인, 방법.
  22. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 세포가 에스케리치아 종 (Escherichia spp.)인 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 또는 에스케리치아 콜라이 O157 세포인 것인, 방법.
  23. 슈도모나스 균주 PF-11의 실질적으로 순수한 배양물.
  24. 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 내성 유전자 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 변형된, 슈도모나스 균주 PF-11 세포의 실질적으로 순수한 배양물.
  25. 슈도모나스 균주 PF-11의 상응하는 세포에 비해 항생제 화합물에 대해 증가된 감수성을 갖도록 유전적으로 변형된, 슈도모나스 균주 PF-11 세포의 실질적으로 순수한 배양물.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물 중의 생존 가능한 미생물 세포의 총 개수의 약 40%; 35%; 30%; 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0.5%; 0.25%; 0.1%; 0.01%; 0.001%; 0.0001% 미만; 또는 그 이하가 슈도모나스 균주 PF-11 세포 이외의 생존 가능한 세포인 것인, 방법.
  27. 슈도모나스 균주 PF-11 세포가 농축된 세균 배양물.
  28. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 슈도모나스 균주 PF-11 세포가 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 세포인 것인, 방법.
  29. 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상청액, 상청액 분획, 변형된 상청액 또는 변형된 상청액 분획이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라서 생산되는 것인, 방법.
  30. 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 슈도모나스 균주 PF-11 배양물이 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포의 배양물인 것인, 방법.
  31. i) 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 세포, 또는 이의 상청액, 변형된 상청액, 또는 분획, 및
    ii) 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는,
    조성물.
  32. i) 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 세포, 또는 이의 상청액, 변형된 상청액, 또는 분획; 또는
    ii) 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 세포, 또는 이의 상청액, 변형된 상청액 또는 분획, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함하는, 방오 또는 항미생물 조성물.
  33. 하기를 포함하는, 세균이 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는지 여부를 확인하는 방법:
    i) 세균 세포를 고분자량 기질이 보충된 성장 제한 배지 중에 배치하는 단계;
    ii) 세포가 고분자량 기질이 보충된 성장 제한 배지에서 성장하는지 여부를 결정하는 단계; 및
    iii) 세포가 단계 ii)에서 성장하는 것으로 결정되는 경우 세균을 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 있는 것으로 확인하고, 세포가 단계 ii)에서 성장하지 않는 것으로 결정되는 경우 세균을 고분자량 기질을 분해할 수 있는 하나 이상의 세포외 프로테아제를 생산할 수 없는 것으로 확인하는 단계.
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