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KR20180035807A - 항원적으로 매치된 인플루엔자 백신 - Google Patents

항원적으로 매치된 인플루엔자 백신 Download PDF

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KR20180035807A
KR20180035807A KR1020187002506A KR20187002506A KR20180035807A KR 20180035807 A KR20180035807 A KR 20180035807A KR 1020187002506 A KR1020187002506 A KR 1020187002506A KR 20187002506 A KR20187002506 A KR 20187002506A KR 20180035807 A KR20180035807 A KR 20180035807A
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influenza
ile
asn
leu
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Withdrawn
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KR1020187002506A
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English (en)
Inventor
에탄 씨. 세템브레
필립 알. 도르미처
Original Assignee
세퀴러스 유케이 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 세퀴러스 유케이 리미티드 filed Critical 세퀴러스 유케이 리미티드
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Abstract

본원에는 인간 대상체에서 개선된 면역-보호를 이루기 위한 인플루엔자 백신 조성물, 관련된 제제 및 중간체, 제형, 제조 방법, 면역화 방법 및 그것들의 사용이 개시된다. 보다 구체적으로, 비-난-기반 인플루엔자 백신이 기술되며, 그것은 개선된 항원성 매치를 제공한다.

Description

항원적으로 매치된 인플루엔자 백신
본 출원은 미국 가출원 번호 62/185,532(2015년 6월 26일에 출원됨) 및 미국 가출원 번호 62/313,184(2016년 3월 25일에 출원됨)의 유익을 주장하며, 상기 출원들의 전체 내용은 모든 목적에 대해 참조로서 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 백신, 보다 구체적으로 개선된 인플루엔자 백신에 관한 것이다.
인플루엔자는 심각한 병 및 심지어 사망을 초래할 수 있다. 이 질환에 대해 보호하는 최상의 방법은 예방 수단으로서 예방접종을 하는 것이다. 그러나, 인플루엔자 백신 제조에 대한 주요 도전은 인플루엔자 바이러스가 끊임없이 변화하고, 그로써 백신이 매년 순환하는 바이러스에 적응될 필요가 있다는 것이다. 이 목적을 위해, 세계보건기구(WHO)는 인플루엔자를 전 세계적으로 모니터링하고 매년 다가오는 인플루엔자 계절에 인플루엔자 백신에 포함되어야 하는 인플루엔자를 제안한다.
WHO에 의해 선택된 인플루엔자 스트레인들이 일반적으로 순환하는 인플루엔자 스트레인에 대해 양호하게 매치되는 것으로 증명되었던 한편으로, 순환하는 스트레인들이 더 이상 백신에서 발견된 인플루엔자 스트레인에 잘 매치되지 않고 따라서 인플루엔자 백신이 더 낮은 효능을 가지는 경우가 있었다. 예를 들어, 2014/2015 계절에 백신에 대해 선택된 H3N2 스트레인과 순환하는 H3N2 스트레인 사이에 미스매치가 있었고, 그 결과 이 스트레인에 대해 빈약한 보호를 제공하는 백신이 초래되었다.
백신 제조에서 관찰된 항원성 미스매치는 소위 적응, 예컨대 난 적응(egg adaptation)에 기인하였다. 이것은 난 계대(passage)가 항원성에 영향을 미치는 글리코실화의 난(egg)-적응성 손실을 초래하는 것을 보여주는 연구들에서 예시된다. 예를 들어, Kishida 등(참고문헌 119)은 항원성의 변화를 초래한 B-Victoria 바이러스에서 글리코실화의 난-적응성 손실을 보고하였다.
1986/87 계절에, 두 개의 인플루엔자 백신이 계절 후기의 새로운 H1N1 인플루엔자 스트레인의 출현의 결과로서 제조되었다. 그 경우에 계절 초기에 활용될 수 있는 것으로 만들어졌던 3가 계절성 인플루엔자 백신에 더불어 고-위험군 사람들에 대해 제조되고 투여되기 위해 새로운 H1N1 스트레인에 대해 난에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 1가 인플루엔자 백신에 대해 조절제가 권고되었다.
인플루엔자 백신에서 항원성 미스매치에 의해 유발된 면역-보호의 제한된 효능/유효성은 도전으로 남아 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 특정 인플루엔자 계절에 계절성 인플루엔자 백신이 백신 스트레인과 순환하는 바이러스 사이의 항원성 미스매치로 인해 바람직한 백신 효능(임상적 맥락에서) 또는 백신 유효성(역학적 맥락에서)이 결핍되어 있다는 인식을 기반으로 한다. 최근에, 비효과적인 독감 백신이 우려할 정도의 수의 독감 계절에서 관찰되었다. 본 발명은 더 나은 항원성 매치를 가진, 예를 들면 본원에서 보다 상세하게 기술되는, 구제 백신(rescue vaccine) 및 하이브리드 백신의 형태의, 개선된 인플루엔자 백신에 대한 기존의 충족되지 못한 요구에 대한 해결책을 제공한다.
구제 백신 및 하이브리드 백신은 공통적으로 둘 다 난-없는 프로세스(egg-free process)로 생성된 항원을 포함하는 것으로 고려되고 둘 다 종래의 난-기반 백신이 이룰 수 없는 방법으로 순환하는 바이러스에 대한 항원성 매치를 제공하는 항원을 포함한다.
권고된 스트레인들은 현재 난에서 성장하고(난-적응된 버전) 전통적인 난-기반 백신 제조를 수용하기 위하여, 표준 분석에 의해 쉽게 검출되고 측정될 수 있는 스트레인들에 제한된다는 것이 주지된다. 그러나 일부 상황에서, 특정 클레이드(clade)의 인플루엔자 바이러스는 난에서 잘 성장하지 못하며, 그런 경우에는 난에서 성장할 수 있는 더 나은 능력을 가진 상이하지만 관련된 클레이드가 디폴트로서 선택될 수 있다. 매치되지 않은 클레이드로부터의 스트레인의 사용은 결과적인 백신에서 항원성 미스매치를 유도할 수 있고, 이것이 오늘날 문제로 남아 있다.
구제 백신은 항원성 미스매치로 인해 충분한 면역-보호를 제공하는 데 비효과적인 것으로 밝혀진 정기적인 계절성 독감 백신에 이어서, 전형적으로 오프-사이클로 제조된다. 그러므로, 구제 백신은 동일한 독감 계절에 이미 상업적으로 허용되는, 또는 이미 제조되고 있는 정기적인 계절성 백신을 보충하기 위한 "후속" 백신으로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 구제 백신은 1가의, 세포 배양-기반 백신일 수 있다. 그런 백신은 정기적인 계절성 백신이 활용할 수 있게 만들어진 후, 예컨대 4주, 또는 예컨대 8주, 10주, 12주, 16주, 20주, 24주 후에 활용할 수 있게 만들어질 수 있다. 그러므로, 구제 백신은 난 적응으로부터 유래되는 항원성 미스매치에 대한 해결책을 제공할 수 있다. 본원에 기술된 구제 백신은 또한, 또는 다르게는, 순환하는 바이러스의 항원성 변이 또는 불연속 변이로부터 유래하는 항원성 미스매치(예컨대 백신 제조를 위한 스트레인의 선택과 실제 질환의 피크 사이에서)에 대한 해결책을 제공할 수 있다.
본원에 기술된 제1 인플루엔자 백신은 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 백신일 수 있다. 제1 인플루엔자 백신은 제2 인플루엔자 백신 전에 활용되도록 만들어질 수 있다. 본원에 기술된 구제 백신은 본원에 기술된 제2 인플루엔자 백신 구제 백신일 수 있다. 제2(구제) 백신은 난에서 계대되지 않은 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함할 수 있고, 제2 인플루엔자 백신의 항원은 제1 인플루엔자 백신의 항원보다 더 밀접하게순환하는 스트레인에 항원적으로 매치된다. 제2 인플루엔자 백신은 제1 인플루엔자 백신 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 5개월 후에 투여될 수 있다. 바람직하게, 제2 인플루엔자 백신은 제1 인플루엔자 백신 후 3개월 내에 투여된다.
일부 구체예에서, 구제 인플루엔자 백신은 숙주 세포에서 제조된 항원을 포함하고, 항원은 동일한 인플루엔자 계절에 초기에 활용될 수 있는 계절성 인플루엔자 백신(예컨대 제1 인플루엔자 백신)보다 더 큰(즉 더 밀접한), 순환하는 인플루엔자 바이러스의 항원(예컨대 순환하는 스트레인의 항원)에 대한 항원성 매치를 가지며, 계절성 인플루엔자 백신은 순환하는 인플루엔자 바이러스에 대한 ≤50% 백신 유효성을 가진다. 기술분야의 숙련자들에게 명백한 것과 같이, 본원에서 언급되는 '숙주 세포'는 난이 아니다. 본원에서 사용되는 용어 '숙주 세포'는 '세포 배양물'로 치환될 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포(세포 배양물)에서 제조된 항원은 난에서 계대되지 않은 항원이다.
따라서, 본원에서 정의된 제1 인플루엔자 백신은 순환하는 인플루엔자 바이러스에 대해 ≤50%의 백신 유효성을 가진다.
발명은 추가로 하이브리드 백신 및 그것의 중간 조성물(예를 들면 최종 백신 생성물 전, 하이브리드 백신의 제조 중에 제조된 중간 조성물)을 제공한다. 본질적으로, 하이브리드 백신은 비-난-기반 제제로 제조된 적어도 하나의 항원 및 난-기반 제제로 제조된 적어도 하나의 항원을 포함할 수 있다. 종래의 난-기반 제조는 난 적응 또는 클레이드 미스매치에 민감하지 않은 스트레인들의 항원을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 동시에, 그러나 별도로, 난-특이적 도전들에 민감한 하나 이상의 스트레인들이 난-없는 시스템(들)에서 제조된다. 하이브리드 백신은 그런 성분들을 바람직하게는 단일 제형으로 조합하여 난-의존성 항원성 미스매치를 피해갈 수 있다.
일부 구체예에서, 하이브리드 백신은 (i) 난-기반 제제로부터의 바이러스 항원; (ii) 세포 배양-기반 제제로부터의 바이러스 항원; (iii) 재조합 단백질 제제로부터의 바이러스 항원; 및 (iv) 바이러스 항원을 암호화하는 RNA 레플리콘으로 구성되는 군으로부터 선택된 둘 이상의 성분을 포함한다.
추가의 측면으로, 발명은 항원적으로 매치된 백신을 제조하기 위하여, 개선된 시드(seed) 바이러스 및 관련 방법을 제공한다. 이것은 적어도 부분적으로는 원래의 분리물 중의 혼합 종(예컨대 유사-종)의 존재가 후속적인 항원성 변이에 기여하는 인자일 가능성이 있다는 인식을 기반으로 한다. 이것은 소위 "세포 적응"의 결과로 광범위하게 생각되었던 것과는 정반대이다. 따라서, 발명은 규정된 유전자 서열로 만들어진 합성 바이러스를 사용함으로써 문제의 근원을 해결하기 위한 해결책들을 제공한다. 그러므로, 발명은 야생형 분리물보다 항원성 변이에 대해 덜 민감한, 개선된 시드 바이러스, 후보 백신 바이러스(CVV) 또는 참조 스트레인들을 제공한다.
발명에 따라서, 본원에 기술된 시드 바이러스 제제는 유전자적으로 균일한 바이러스 집단을 포함하고, 바이러스 집단의 항원은 유전자적으로 규정된 서열로부터 합성적으로 유도된다. 발명은 또한 조성물의 제조에서 본원에 기술된 시드 바이러스 제제의 사용을 포함한다. 시드 바이러스 제제는 본원에서 규정된 조성물, 인플루엔자 백신, 구제 백신 또는 하이브리드 백신을 제조 또는 생산하기 위해 사용될 수 있다. 관련된 구체예에서, 발명은 바이러스의 유전자적으로 균일한 집단을 포함하는 시드 바이러스 제제를 제조하는 단계를 포함하고, 바이러스 집단의 항원이 유전자적으로 규정된 서열로부터 합성적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 만들어진 백신을 제공한다.
발명의 목적은 순환하는 인플루엔자 스트레인들에 대한 보호를 한층 더 개선하는 추가의 및 개선된 투여 처방을 제공하는 것이다.
발명은 또한 개선된 인플루엔자 백신 및 그것에 대한 관련된 사용 및 제조 방법을 제공한다.
도 1은 최근 몇년 동안 최악의 독감 계절이 바이러스가 진화한 계절(즉 바이러스가 가장 큰 변화를 진행한 계절)인 것을 예시하는 선 그래프를 도시한다. 6번의 독감 계절의 각각에 대한 독감-유사 질병과 관련된 병원 방문의 시간 경과가 시간 경과에 따라 도표로 표시된다.
도 2는 상이한 연령 그룹에 대한 백신 효능과 인플루엔자-관련 입원률 사이의 관계를 보여주는 그래프를 도시한다. (Nichol K, et al. Vaccine 2003; 21:1769-1775; Goodwin K, et al. Vaccine 2006; 24:1159-1169; Grubeck-Loebenstein B, et al. Nat Med 1998; 4:870; 및 Glezen WP, et al. Am Rev Respir Dis 1987; 136:550-555로부터 적응됨).
도 3은 4개의 상이한 시스템에서 H3N2 바이러스 분리 속도를 묘사하는 막대 그래프를 도시한다.
도 4는 MDCK 세포에서 연속적으로 계대된 3C.2A 바이러스의 HA 역가(오셀타미비어의 존재하에)를 보여주는 그래프를 도시한다.
도 5는 항원성 특성화에 대해 생성된 합성 바이러스들의 패널을 도시한다. 항원 공급원하에서 "난" 또는 "세포"는 합성에 대한 HA 및 NA 서열들을 제공한 바이러스들의 계대 이력을 나타낸다. 혼합된 계대 이력의 경우에, 난에서의 임의의 계대는 "난" 지정을 촉발시키기에 충분하다. 모든 합성 시험 바이러스는 사용된 HA 및 NA 서열들과 관계없이, 이들 연구에 대해 포유류 세포에서 배타적으로 계대되었다.
도 6은 난-적응된 후보 백신 바이러스로부터 유도된 HA 및 NA 서열을 가지는 난-증식된 비-합성 바이러스 및 MDCK 세포-증식된 합성 바이러스의 HI 비교를 도시한다.
도 7은 난- 또는 포유류-증식된 야생형 바이러스로부터 유도된 HA 및 NA 서열을 가지는 합성 바이러스들의 HI 특성화를 제공한다.
도 8은 난- 및 포유류 세포-유도된 H3N2 항원: (A) A/Victoria/210/2009(H3N2); 및 (B) A/Victoria/361/2011(H3N2)을 가지는 바이러스들 사이의 항원성 미스매치를 보여주는 HI 역가를 도시한다.
도 9는 난- 및 포유류 세포-유도된 B 항원을 가지는 바이러스들 사이의 항원성 미스매치를 보여주는 HI 역가를 도시한다.
도 10은 H3N2 스트레인 A/Switzerland/9715293/2013에 대한 2-방법 HI 시험을 도시한다.
도 11은 보조제가 있거나 없이, (A) 난-유도된 A/Hong Kong/5738/2014 시험 바이러스; 및 (B) 세포-유도된 A/Hong Kong/5738/2014 시험 바이러스에 대해 시험된, 3가지 주요 클레이드(3C.1, 3C.2a, 3C.3a)로부터 유도된 난- 및 세포-유도된 H3N2 모노벌크에 대해 발생된 마우스 항혈청에 대한 미세-중립화 분석 결과를 도시한다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 특정 인플루엔자 계절에 계절성 인플루엔자 백신이 백신 항원과 순환하는 스트레인들 사이의 항원성 미스매치로 인한 바람직한 효능이 결핍되었다는 인식을 기반으로 한다.
항원성 관련성
본원에서 사용되는 용어 "매치" 및 "미스매치"는, 다르게 명시되지 않는 한, 각각 백신 스트레인의 상응하는 항원(예컨대 "후보 백신 바이러스" 또는 "CVV")과 순환하는 스트레인 사이의 항원성 매치 및 미스매치를 나타낸다. 항원성 미스매치는 백신접종된 개체들에 대한 보호를 제공하는데 있어 백신의 낮은 유효성을 초래할 수 있다. 특정 계절에, 예를 들어, 효능은 항원성 미스매치로 인해 50% 이하, 예컨대 0 내지 50%일 수 있다(더 많은 것은 하기의 실시예에서 참조함). 낮은 유효성은 순환하는 인플루엔자 바이러스에 대한 ≤50% 백신 유효성(또는 심지어 ≤30% 백신 유효성)으로서 규정될 수 있다.
본 개시는 또한 "항원성 관련성" 또는 "항원성 유사성"을 나타내며, 그것들은 "항원성 매치"의 정도를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다.
항원성 미스매치의 잠재적인 근원이 다수 있다. 첫째, 백신의 제조를 위한 타이밍을 기반으로, 선택은 실제 질환의 피크 전 수개월 전에 이루어질 것을 필요로 하고, 그 동안 순환하는 바이러스의 항원성 변이 또는 불연속 변이가 있을 수 있다. 둘째, 감시가 불완전하여, 백신 스트레인들에 대한 권고는 순환하는 바이러스에 대한 정확한 정보를 반영하는 것이 아닐 수 있다. 셋째, 세계적인 인플루엔자 시스템은 많은 기관과 프로세스가 관여되면서 매우 크고, 그것은 정보 처리에 지연을 유발할 수 있다. 그리고 넷째로, 난에 대한 적응은, 실제로 최근 수년에 관찰되었던, HA의 돌연변이들을 통해 항원성 미스매치를 초래할 수 있다.
헤마글루티닌(HA)은 인플루엔자 바이러스의 일차 항원이다. 특히, HA 단백질의 헤드 영역은 우세한 항원성 영역이고 핵심 에피토프뿐 아니라, 숙주 세포 유입에 필요한 수용체 결합 부위를 함유한다.
항원성 매치/미스매치의 측정은 기술분야에 잘 수립되어 있다. 산업적 표준은 적혈구 응집 억제(HI) 분석으로, 그것은 HA 항원성을 측정하기 위한 선택 기준으로서 사용되며 WHO 표준 분석이다. 표준 프로토콜은 바이러스로 감염된 나이브(naive) 페럿에 의한 항혈청 생성을 포함한다. 본질적으로, HI는 적혈구 표면 항원에 대한 수용체와 다가 바이러스에 의한 세포들의 교차 결합에 의해 유발된 적혈구의 군집을 차단하는 면역 혈청의 능력을 측정한다. 더 높은 HI-차단 항체 역가는 더 큰 중화 반응과 상관이 있다. "원 웨이" HI에서, 바이러스 A 감염으로부터의 혈청은 HI 대비 바이러스 A 및 바이러스 B에서 사용되는 한편, "투 웨이" HI에서, 바이러스 A 감염으로부터의 혈청은 HI 대비 바이러스 A 및 바이러스 B에서 사용되고, 바이러스 B 감염으로부터의 혈청은 HI 대비 바이러스 A 및 바이러스 B에서 사용된다.
항원성 관련성의 개념을 한층 더 예시하기 위하여, 하기 표 1은 다음의 바이러스들의 관련성을 보여주는 완전한 "투 웨이" 표를 제공한다: WI/05(A/위스콘신/67/2005); NY/04(A/뉴욕/55/2004); WY/03(A/와이오밍/3/2003); 및 PM/99(A/파나마/2007/1999).
예시적인 투-웨이 HI 시험.
다음에 대해 발생된 페럿 항혈청:
바이러스 WI/05 PM/99 WY/03 NY/04
WI/05 2,560 <20 160 1,280
PM/99 1,280 5,120 1,280 320
WY/03 1,280 1,280 2,560 1,280
NY/04 2,560 20 640 2,560
산업 표준에 의해, HI에서 =4배 차이를 가진 바이러스들은 "유사한"(즉 항원적으로 유사한) 것으로 여겨진다(예컨대 WY/03 및 PM/99). HI 분석은 본질적으로 HA가 항원성에 기여하는 에피토프들의 (i) 존재, (ii) 접근 가능성 및 (iii) 면역우성을 측정한다. 그러므로, HI는 항원이 면역 반응을 발생시키는 가능성이 있고 항원성 관련성(예컨대 매치 또는 미스매치)에 대한 정보를 제공하는지의 여부를 측정하기 위한 기능적 분석이다. 상기 표 1을 사용하여 한층 더 예시하기 위하여, WI/05는 PM/99(HI=1,280)와 공유하고, PM/99에서 접근 가능한 면역우성 에피토프(들)에 대한 반응을 발생시킬 수 있는 한편, PM/99는 WI/05(HI ≤20)와 공유하고, WI/05에서 접근 가능한 면역우성 에피토프들에 대한 반응을 발생시키지 않는다.
보다 최근에, 인플루엔자 바이러스의 특정 스트레인들 또는 클레다의 HA는 적혈구에 잘 결합하지 않는 것이 분명해졌다. 믿을만한 HI 분석이 바이러스의 HA가 적혈구에 결합하는(적혈구 응집) 능력을 필요로 하기 때문에, 그런 바이러스는 표준 HI 분석에 의해 시험될 수 없다.
미세-중화("MN") 분석은 바이러스의 항원성을 특성화하기 위한 대체 수단이다. MN 분석은 특히 적혈구에 충분히 결합하는 능력을 가지는 HA를 갖지 않은 특정 바이러스에 대해, HI 분석 대신 사용될 수 있는데, HI 분석이 바이러스의 HA가 적혈구를 응집시킬 수 있는 경우에만 유용하기 때문이다. 예를 들어, 3C.2A 바이러스와 같은 특정 H3N2 바이러스는 그것들의 HA로 적혈구에 결합하지 않는다. 그러므로, 일부 바람직한 구체예에서, 그런 바이러스들로부터의 항원의 항원성 매치는 MN 분석에 의해 측정된다.
MN 분석은 인간 또는 동물 혈청에서 인플루엔자 바이러스에 대한 바이러스-특이적 중화 항체들을 검출하기 위한 고도로 민감하고 특이적인 분석이다. (참조: WHO Global Influenza Surveillance Network: 인플루엔자의 실험실 진단 및 바이러스학적 감시에 대한 매뉴얼; 2011; ISBN 978 92 4 154809 0; http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/44518/1/9789241548090_eng.pdf에서 활용할 수 있음). MN 분석은 인플루엔자 바이러스 HA에 대한 혈청-중화 항체들이 MDCK 세포들의 바이러스로의 감염을 억제할 것이라는 가정을 기반으로 한다. 연속적으로 희석된 혈청은 MDCK 세포들의 첨가 전에 바이러스의 표준양과 사전-인큐베이션된다. 밤새 인큐베이션된 후, 세포들은 고정되고, 바이러스-감염된 세포들의 존재는 항-인플루엔자 핵단백질 ELISA에 의해 또는 플라크 환원에 의해 검출된다. 감염성의 부재는 포지티브 중화 반응을 구성하고 바이러스에 결합할 수 있는 혈청 샘플 중의 특이적 항체들의 존재를 가리킨다. 중화 역가는 바이러스 감염이 차단되는 혈청의 최고 희석률의 역수로서 표시된다. 만약 시험 혈청이 두 바이러스에 대해 유사한 중화 역가를 생성한다면, 시험 혈청 중의 항체들이 두 바이러스와 모두 효과적으로 교차-반응할 수 있음을 의미하고, 그것은 두 바이러스가 항원적으로 관련이 있음을 시사한다.
그러므로, 하기에서 설명되는 것과 같이, 기술분야의 숙련자들은 한 인플루엔자 항원 또는 백신이 참조 스트레인(예컨대 순환하는 스트레인)에 대해 다른 항원 또는 백신보다 더 밀접하게 항원적으로 매치되는지를 평가하기 위해 표준 분석을 사용할 수 있다. 항원성 매치는 HI 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 다르게는, 또는 또한, 항원성 매치는 MN 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 만약 제2 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들이 동일한 조건하에서 제1 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들에 비교하여 분석에서 더 높은 정도의 교차-반응을 보인다면 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 밀접하게 순환하는 스트레인에 항원적으로 매치된다.
일부 경우에, 항원성 미스매치는 다가오는 계절에 어떤 바이러스들이 질병을 유발할 가능성이 가장 많은지에 대한 부정확한 예측으로부터 유발할 수 있다. 계절성 독감 백신 중의 바이러스들은 매년 바이러스들에 대한 감시-기반 예측을 기반으로 선택되고, WHO는 인플루엔자 백신에 포함시키기 위한 특이적 백신 바이러스를 권고하지만, 그런 다음에는 각 개별 국가들이 어던 스트레인들을 그들의 나라에서 허가된 인플루엔자 백신에 포함되어야 할 것인지에 대해 그들 자신만의 결정을 내린다. 백신 제조자에 의해 생성된 정기적인 계절성 인플루엔자 백신을 기반으로 한 "권고된" 스트레인(또는 "참조" 스트레인)은 독감 계절에 순환하는 두드러진 스트레인들과는 상이할 수 있다. 그러나, 일부 경우에, WHO로부터의 정확한 권고에 따라 제조된 인플루엔자 백신은 여전히 낮은 효능의 백신을 초래할 수 있다. 이것은 부분적으로는 난 적응으로서 언급된 현상으로 인한 것이다. 난 적응은 바이러스가 난에서 증식되거나 또는 성장할 때 난-특이적 유전적 선택으로 인해 발생할 수 있다. 바이러스는 그런 다음 숙주 세포의 환경 및 유전적 배경에 적응해야 하고, 그 결과 난-기반 시스템에서 제조된 바이러스 항원과 순환하는 또는 권고된 바이러스의 상응하는 항원 사이의 항원성 미스매치를 초래한다.
추가로 또는 다르게는, 일부 상황에서, 권고된 스트레인은 난-기반 시스템에서 잘 성장할 수 없다. 실제로, 인플루엔자 바이러스의 특정 클레이드는 난에서 빈약하게 성장하는 것으로 알려져 있다. 이들 상황에서, 상이하지만 관련된 바이러스, 예를 들면 상이하지만 관련된 클레이드로부터의 바이러스가 백신의 난-기반 제조를 수용하기 위해 독감 백신의 제조를 위해 선택되고 권고될 수 있다. 이것은 클레이드 미스매치를 초래하고, 그것은 항원성 미스매치를 유발할 수 있다.
이들 문제점을 반박하기 위하여, 본 개시는 난-기반 백신이 제공할 수 없는 면역보호를 이루기 위하여 개선된 항원성 매치를 가능하게 하는 비-난-기반 백신을 제공한다.
난 -없는 시드 바이러스
앞서 상기에서 언급된 것과 같이, 인플루엔자 백신 시스템은 인플루엔자 바이러스의 자연적인 진화에 반응하기 위해 개발되었지만, 항원성 미스매치의 문제점은 특정 연도에는 계속해서 도전이 되고 있다. 몇 년 내에, 미스매치는 백신 스트레인 선택이 이미 이루어진 후에 순환하는 바이러스의 항원성 변이로 인해 자연적으로 발생한다. 다른 년도에, 미스매치는 후보 백신 바이러스에 대한 출발 물질로서 난-적응된 분리물의 사용에 의존하는 현재 시스템의 일부로서 도입된다. 기존의 문제점의 근원의 인식 및 백신 바이러스를 제조하기 위한 현재의 방법의 변형은 공중 보건을 개선시키는 것에 대해 대단히 가치있는 것일 수 있다.
백신 제조에서 소위 합성 시드 바이러스 기술의 사용은 이전에 기술되었다(예를 들어 WO 2014/115104; WO 2013/087945; WO 2014/086732; WO 2014/141125; 및 WO 2014/195920 참조). 합성 접근법은 인플루엔자 바이러스를 신속하게 생성하기 위해, 예를 들면 바이러스 구제 효율 및 항원 수율을 증가시키는 신규한, 고-성장 골격(backbone)을 사용하는 백신-승인된 마딘-다비(Madin-Darby) 개과 신장(MDCK) 세포 주에서 사용될 수 있다(참고문헌 124).
본 발명의 발명자들은 이 기술이 또한 유전자 합성을 위해 사용된 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 서열에 따라, 의도된 참조 바이러스들에 대한 항원성 매치(예컨대 순환하는 스트레인에 대한 매칭)을 유지하는 바이러스들을 제조하기 위해 사용될 수 있다는 개념을 시험하였다.
본원에 개시된 작업(실시예 참조)은 이 접근법의 일반적인 유용성을 증명한다. 간단히 설명하면, 합성 바이러스들의 패널은 최근 분리물로부터의 HA 및 NA 서열들을 사용하여 생성되었다. 적혈구 응집 억제 시험에 의해 평가된 것과 같이, 합성 바이러스는 종래의 난- 또는 세포-증식된 참조 스트레인들에 항원적으로 유사한 것으로 나타난다. 중요한 것은, 항원성에 미치는 신규한 골격의 영향이 없고, 그것은 이 합성 접근법이 일반적으로 난- 및 세포-기반 백신 제조 플랫폼 둘 다에 대해 효과적으로 더 나은-매치된 바이러스 후보를 생성하기에 적합한 것을 시사한다. 항원 제조를 위해 세포 배양 기술과 조합될 때, 비-난-적응된 원형으로부터의 HA 및 NA 서열들을 사용하여 생성된 합성 바이러스들은 현재의 계절성 인플루엔자 백신을 괴롭히는 항원성 미스매치 문제들을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 본원에서 기술된 합성 시드 바이러스 접근법은 특히 적응에 민감하고 그러므로 항원성 변이에 민감한 특정 클레이드/스트레인에 적합하다.
본원에서 추가로 상세하게 설명되는 것과 같이, 예를 들면 세포 배양에서 유지된 야생형 3C.2A 바이러스는 HA 및/또는 NA 돌연변이를 보이고, 그것은 숙주 세포 또는 적혈구(RBC)에서 수용체 결합 특성을 변화시킬 수 있다. 그런 돌연변이는 지금까지 세포 적응으로서 여겨졌다 9예를 들면 Chambers et al. (2014) J Virol. 88(18): 10986-9; Lee et al. (2013) PLoS One 8(11): e79252; and Mohr et al. (2015) Virol J. 12:67 참조).
그러나, 예상밖으로, 본원에 제공된 데이터는 뚜렷한 문제 근원을 강조하고 대신 원래의 분리물 중의 혼합종의 존재는 후속되는 항원성 변이의 중요한 공헌자일 가능성을 가리킨다. 발명자들은 규정된 서열로 만들어진 합성 바이러스들의 사용이 이전에 숙주 세포 환경에 대한 적응(예컨대 세포 적응)으로서 여겨진 유사한 변화들을 우회할 수 있음을 발견하였다. 나아가, 본원에 제공된 데이터는 특정 합성 골격이 높음 HA 역가를 이루기 위해 믿을만하게 사용될 수 있다는 것을 지지한다. 그러므로, 발명은 개선된 시드 바이러스, 후보 백신 바이러스(CVV) 또는 참조 스트레인들을 제공하고, 그것들은 야생형 분리물보다 항원성 변이에 덜 민감하다.
따라서, 한 측면으로, 발명은 개선된 후보 백신 바이러스 및 합성 시드 바이러스를 사용하여 후보 백신 바이러스를 제조하는 관련된 방법을 포함한다.
합성 시드 바이러스 기술은 백신(예컨대 본원에서 규정되는 백신)을 제조하기 위해 사용될 수 있는, 시드 바이러스의 유전자적으로 균일한 제제를 얻기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 발명은 또한 비-난-기반 숙주 시스템(들), 예컨대 세포 배양에서 계대된 개선된 시드 바이러스들을 포함한다. 적합한 세포 배양은 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포, 곤충 세포, 조류 세포 등을 포함한다(본원에서 추가로 논의됨). 그런 합성 시드 바이러스들은 그것들이 유전자적으로 안정하고 전형적으로 난에서 계대된 바이러스들보다 높은 역가로 성장하는 것을 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 유전적 안정성은 세포 배양에서 여러 라운드의 계대, 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 6회의 계대 후에 돌연변이/적응에 대한 내성을 나타낸다. 그런 시드 바이러스는 추가로 각 제제가 바이러스의 유전자적으로 균일한 집단으로 구성되는 것을 특징으로 한다(종래의 시드 바이러스 제제에서의 경우일 수 있는, 혼합(즉 이질적인) 하위집단과는 반대로). 본원에서 사용되는, 합성 시드 바이러스 제제는 DNA 생거 서열분석(본질적으로 차세대 딥 서열분석이 아닌)을 기반으로 유전자적으로 균일한 것으로 측정될 수 있다. 유전자적으로 균일한 합성 시드 바이러스 제제는 100% 유전자적으로 '순수'하지 않을 수 있다. 실제로, 세포에서 단일 라운드의 계대는 소량의 서열 다양화를 유도할 수 있다. 그러므로, 유전자적으로 균일한 합성 시드 바이러스 제제는 집단에서 두드러진 합성 바이러스에 유전자적으로 동일하지 않은 작은 비율(예컨대 10% 미만, 보다 바람직하게는 5%, 3% 또는 1% 미만)의 합성 바이러스를 함유할 수 있다.
따라서, 발명은 백신(본 발명에 따라 사용하기 위한 인플루엔자 백신일 수 있음)의 제조 방법을 포함하는데, 그 방법은 난-없는 프로세스로 합성 시드 바이러스를 제조하는 단계를 포함하고, 합성 시드 바이러스는 난에서 계대되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 합성 시드 바이러스로부터 제조된 항원(본원에서 규정된 제2 인플루엔자 백신의 항원일 수 있음)은 난-기반 대응물(예컨대 본원에서 규정된 제1 인플루엔자 백신)로부터의 항원과 비교하여, 참조 스트레인(예컨대 순환하는 스트레인)에 보다 밀접하게 항원적으로 매치된다. 특히 유용한 구체예에서, 합성 시드 바이러스는 (i) 난-적응에 민감하고; 및/또는 (ii) 적혈구에 잘 결합하지 않는 HA를 가지는 스트레인으로부터 분리된다. 표현 "적혈구에 잘 결합하지 않는"은 그 특정 바이러스 스트레인/클레이드의 HA가 적혈구에 대해 빈약한 친화성을 가져서 표준 HI 분석을 믿을수 없게 만드는 것을 의미한다.
일부 구체예에서, 백신은 H3N2 및/또는 B 스트레인(들)로부터의 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원은 HA, NA 또는 그것들의 조합이다.
그러므로 발명은 유전자적으로 균일한 바이러스 집단의 HA가 유전자적으로 규정된 서열로부터 합성으로 제조된 것을 특징으로 하는, 유전자적으로 균일한 바이러스 집단을 포함하는 시드 바이러스 제제를 제공한다. 발명은 또한 조성물의 제조에 시드 바이러스 제제의 사용을 포함한다. 관련된 구체예에서, 발명은 유전자적으로 균일한 바이러스 집단의 항원이 유전자적으로 규정된 서열로부터 합성으로 제조된 것을 특징으로 하는, 유전자적으로 균일한 바이러스 집단을 포함하는 시드 바이러스 제제를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 만들어진 백신을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 항원은 HA, NA 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 백신은 난-없는 프로세스로 제조되어서, 바이러스는 전체 백신 제조 프로세스를 통해 난에서 결코 계대되지 않는다. 유전자적으로 규정된 서열은 예를 들면, 세포-기반 분리물의 HA 서열일 수 있고, 본원에서 기술된 분리물일 수 있다.
따라서, 상기 기술된 합성 시드 바이러스는 본원에서 규정된 조성물, 제2 인플루엔자 바이러스 백신, 구제 백신 또는 하이브리드 백신의 제조를 위해 사용될 수 있다. 발명에 사용하기 위한 합성 시드 바이러스는 난-없는 프로세스로 제조될 수 있고, 난에서 계대되지 않을 수 있다. 바람직하게, 합성 시드 바이러스는 세포 배양 중에 성장한다.
합성 시드 바이러스는 참조 인플루엔자 바이러스 스트레인(예컨대 순환하는 바이러스 스트레인)의 분리물로부터의 HA 및 NA 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 분리물은 난-적응되지 않는다. 추가로, 분리물은 바람직하게 세포 배양에서(예컨대 백신 제조를 위해 정성된 포유류 세포 주에서) 분리된다. 분리물은 고성장 난-기반 재조합체가 아닐 수 있다.
분리물은 바람직하게 순환하는 스트레인의 분리물이다. 예를 들어, 분리물은 주어진 인플루엔자 계절에 대해 우세한 순환하는 인플루엔자 스트레인의 목록에 포함될 수 있다(예컨대 WHO 및/또는 FDA에 의해 공개된 목록). 분리물은 하나 이상의 세계 보건 기구(WHO) 국립 인플루엔자 센터에 의해 임상 샘플로부터 분리될 수 있다.
분리물은 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 클레이드 또는 스트레인의 분리물일 수 있다.
합성 시드 바이러스는 전형적으로 본원에 기술된 역 유전학 기법을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 바이러스는 인플루엔자 바이러스 단백질(HA 및 NA 이외의)을 암호화하는 바이러스 게놈 분절들의 세트를 포함하는 바이러스 골격을 사용하여 제조될 수 있다. 합성 시드 바이러스가 A 스트레인 바이러스(예컨대 H3N2 바이러스)인 경우에, 합성 시드 바이러스는 PR8, PR8x, #19 및 #21로부터 선택된 골격을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 스트레인은 H3N2 스트레인이고 골격은 PR8x이다. 합성 시드 바이러스가 B 스트레인 바이러스(예컨대 B/Victoria 계통으로부터의 스트레인)인 경우에, 합성 시드 바이러스는 B/Brisbane/60/2008로부터의 6개의 모든 골격 분절을 포함한 골격을 사용하여 제조될 수 있다.
구제 백신
다른 측면으로, 본 발명은 구제 백신으로서 본원에서 언급된 그런 백신들을 제공한다. 구제 백신은 원하는 유효성이 없는 것으로 밝혀진 정기적인 계절성 백신을, 예컨대 동일한 독감 계절 내에서 보충하기 위한 시정 대책으로서 제조될 수 있다. 그러므로, 정기적인 계절성 백신은 WHO 권고를 따라 관례적으로 제조될 수 있고 백신접종을 위해 활용할 수 있게 상업적으로 제조된다. 계속해서, 만약 그런 정기적인 백신이 항원성 미스매치로 인해 빈약하게 효과적인 것으로, 예컨대 50% VE(백신 유효성)인 것으로 관찰되거나 측정된다면, 순환하는 바이러스에 대한 더 나은 항원성 매치를 제공할 수 있을 구제 백신이 비-난-기반 제제로 동일한 독감 계절 내에 후속 대책으로서 제조될 수 있다. 그러므로, 구제 백신이 난 없이 제조되거나 증식되는 것으로 예상된다.
일부 구체예에서, 구제 백신은 (a) 조류 세포 배양 및 포유류 세포 배양과 같은 세포 배양-기반 제제로 제조된 항원; (b) 재조합 단백질-기반 항원; (c) 항원을 암호화하는 RNA 레플리콘(예컨대 자체-증폭 RNA)을 포함한다. 일부 구체예에서, 구제 백신은 그것들의 임의 조합을 포함한다. 구제 백신은 (a), (b) 및 (c) 중 하나, 하나 이상 또는 모두를 포함할 수 있다. 재조합 단백질-기반 항원은 재조합적으로 발현된 항원일 수 있다. 본 발명에 따라서, 항원은 인플루엔자 항원이다.
상기 표시된 것과 같이, 발명은 숙주 세포에서 제조된 항원을 포함하는 구제 인플루엔자 백신을 제공하며, 항원은 동일한 인플루엔자 계절에 초기에 활용 가능한 계절성 인플루엔자 백신보다 순환하는 인플루엔자 바이러스의 항원들(예컨대 순환하는 스트레인의 항원)에 대해 더 큰(즉 더 밀접한) 항원성 매치를 가지며, 이때 계절성 인플루엔자 백신은 순환하는 인플루엔자 바이러스에 대해 ≤50%의 백신 유효성을 가진다. 항원은 난에서 계대되지 않은, 본원에서 기술된 항원일 수 있다. 계절성 인플루엔자 백신은 본원에서 기술된 제1 인플루엔자 백신일 수 있다.
상기 논의된 것과 같이, 합성 시드 바이러스는 본 발명의 구제 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 합성 시드 바이러스는 본원에 제공된 합성 시드 바이러스일 수 있다. 합성 시드의 제조는 더 빠를 수 있어서, 일시적인 조정을 허용한다. 나아가, 합성 시드 바이러스 기술의 사용은 유전자 안정성에 기여할 수 있는, 시드 바이러스의 유전자적으로 균일한 제조를 가능하게 한다. 대조적으로, 종래의 시드 바이러스 제제는 바이러스 서열의 유전자적으로 이질적인(예컨대 혼합된) 집단을 함유할 수 있고, 그것은 시간이 지남에 따라(예컨대 계대를 통해) 더 우세하게 되는 특정 하위집단(들)을 향해 변화한다. 그런 경우에, 시드 바이러스 제제에서 우세한 그 결과의 하위집단은 참조 스트레인에서 우세한 원래의 하위집단과 상이할 수 있다.
본 발명의 구제 백신은 1가 인플루엔자 백신일 수 있다. 일부 구체예에서, 정기적인 계절성 백신(전형적으로 3가 또는 4가)은 그런 제품에 포함된 스트레인들 중 하나의 항원이 항원적으로 미스매치된 것을 나타낼 수 있다. 계속해서, 매치된 항원을 제공하는 1가 구제 백신이 제조될 수 있고, 동일한 독감 계절 내에 면역보호를 제공하기 위해 활용 가능하게 만들어질 수 있다. 정기적인 계절성 백신(전형적으로 3가 또는 4가)이 그런 제품에 포함된 하나 이상의 스트레인의 항원이 순환하는 바이러스에 비해 항원적으로 미스매치된 것을 나타내는 경우에, 구제 백신은 따라서 하나 이상의 매치된 항원을 포함하도록 제조될 수 있다. 그러므로 구제 백신은 예를 들면 2가 구제 백신일 수 있다. 유사하게, 정기적인 계절성 백신(전형적으로 3가 또는 4가)이 그런 제품에 포함된 하나(또는 하나 이상)의 스트레인(들)의 항원이 순환하는 바이러스에 비해 항원적으로 미스매치된 것을 나타내는 경우에, 구제 백신은 따라서 하나(또는 하나 이상)의 매치된 항원(들)을 포함하도록 제조될 수 있다. 그러므로 구제 백신은 1 구제 백신일 수 있다.
본 발명의 구제 백신은 보조제가 첨가되지 않거나 보조제가 첨가될 수 있다. 보조제 첨가된 구제 백신에 대해, 일부 구체예에서, 구제 백신은 저용량 항원을 필요로 할 수 있다. 이 맥락에서 "저용량"은 대상체에서 통계학적으로 허용되는 면역 반응을 유도하기 위해 필요한 용량당 항원의 양이 표준양보다 적은 것을 의미한다. 전형적으로, 표준 계절성 인플루엔자 백신은 각 단위용량 형태로 스트레인당 약 15 μg의 HA를 함유한다. 그러므로, "저용량" 백신은 스트레인당 약 15 μg, 예컨대 약 12 μg, 약 9 μg, 약 7.5 μg, 약 5 μg, 약 3.75 μg의 HA를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 보조제 첨가된 구제 백신은 그렇지 않으면 동일한 성분을 함유한 보조제가 첨가되지 않은 구제 백신과 비교하여, 대상체에서 더 빠른 면역 반응을 제공할 수 있다. 구제 백신이 여전히 어느 정도의 항원성 미스매치를 함유할 수 있는 상황에서(난-기반 백신보다는 적은 정도이지만), 그런 구제 백신은 완벽하지 못한 항원성 매치(예컨대 교차 보호)에도 불구하고 환자들에서 더 광범위한 면역 보호를 허용하기 위하여, 보조제가 첨가될 수 있다. 전체적으로, 보조제는 더 왕성한 반응을 생성할 수 있고 우성 및 하위우성 에피토프에 대한 총 역가를 증가시킬 수 있다.
보조제 첨가된 구제 백신은 그러므로 그렇지 않으면 동일한 성분을 함유하는 보조제-첨가되지 않은 구제 백신과 비교하여 대상체에서 더 빠른 면역 반응을 제공할 수 있고, 더불어 항원 절약 효과를 제공할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 구제 백신(또는 본원에서 규정된 제2 인플루엔자 백신)은, 특히 항원이 순환하는 스트레인에 비교하여 어느 정도의 항원성 미스매치를 함유한 경우에 보조제가 첨가된다. 어느 정도의 미스매치는, 예를 들면 HI의 4-배, 3-배, 2-배 또는 1-배 차이 또는 동종 바이러스 역가에 비교하여 순환하는 스트레인에 대한 MN 역가의 2-배 또는 1-배 차이로 표시될 수 있다.
본 발명의 구제 백신은 독감 계절 초기에 정기적인 계절성 독감 백신으로 사전에 투여되었던 인간 대상체를 면역화하기에 적합하다. 본 발명의 구제 백신은 독감 계절 초기에 정기적인 계절성 독감 백신으로 투여되지 않았던 인간 대상체를 면역화하기에 적합하다. 구제 백신은 건강한 대상체, 위험군 대상체 및/또는 면역손상된 대상체를 면역화하기 위해 사용될 수 있다. 구제 백신은 고령 및 소아 집단을 포함하여, 다양한 연령 그룹의 대상체들을 면역화하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 연령 그룹은 본원에서 한층 더 기술된다.
하이브리드 백신
다른 측면으로, 본 발명은 하이브리드 백신, 및 그것을 제조하기 위해 활용될 수 있는 임의의 중간 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 "하이브리드 백신"은 상이한 제조 수단(예컨대 공급원 또는 시스템)의 둘 이상의 항원을 함유하는 백신 조성물을 나타낸다. 예를 들어, "하이브리드 백신"은 상이한 제조 플랫폼으로부터 제조된 둘 이상의 항원을 함유할 수 있다. 그러므로, 하이브리드 백신은 하나 이상의 난-기반 항원(들), 하나 이상의 세포 배양-기반 항원(들), 하나 이상의 재조합 단백질 항원(들), 하나 이상의 RNA 레플리콘(들) 등의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 바람직하게, 그런 항원들은 인간 대상체에 투여하기에 적합한 단일 제형으로서 제공된다. 그러나, 특정 구체예에서, 원하는 항원들의 전체 패널은 다중 제형으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 다중 제형 중 적어도 하나는 구제 백신일 수 있다(상기 참조). 본 발명에 따르면, 항원은 인플루엔자 항원이다.
본 발명에 따르면, 하이브리드 백신은 난-없는 프로세스로 제조된 항원을 포함하도록 제조될 수 있다. 난-없는 프로세스는 세포 배양, 재조합 발현 시스템, RNA 레플리콘의 시험관 내 전사 등일 수 있다. 이것은 특히 순환에서 질병-유발 바이러스일 것으로 예측된 바이러스 스트레인들 중 하나 이상이 난 적응에 민감한 것으로 알려져 있는 것들일 때 및/또는 특정 클레이드가 난에서 빈약하게 성장하는 것으로 알려져 있을 때 적합하다. 이것은 또한 특히 특정 클레이드 또는 스트레인으로부터의 HA가 적혈구에 결합하지 않거나 및/또는 적혈구를 응집시킬 수 없을 때(예컨대 HI 분석에서) 적합할 수 있다. 일부 구체예에서, 그런 바이러스 스트레인은 H3N2이거나 H3N2를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 그런 바이러스 클레이드는 클레이드 3C.3A 또는 클레이드 3C.2A이거나 클레이드 3C.3A 또는 클레이드 3C.2A를 포함한다. 그런 스트레인 또는 클레이드의 추가의 실례가 본원에서 기술된다.
일부 구체예에서, 클레이드의 난-적응된 버전은 항원성 미스매치를 초래하는 한편, 세포 버전은 더 큰 항원성 매치를 초래한다. 일부 구체예에서, 난 적응은 HA의 헤드 영역에서 글리코실화 패턴의 변화, 예컨대 글리코실화 손실을 통해 항원성 미스매치를 초래하는 한편, 세포 버전에서 항원성에 관련된 글리코실화 패턴은 보존되어 항원성 매치가 유지된다. 관련된 글리코실화 부위는 항원의 항원성에 기여하는, 예컨대 에피토프의 존재, 접근 가능성 및/또는 면역우성에 영향을 미치는 것들이다. 예를 들어, 클레이드 3C.2A는 난 적응시 항원성 미스매치에 수반될 수 있는 핵심 HA 당을 잃을 수 있다. 특정 B 스트레인들은 난 적응시 핵심 HA 당을 손실하여 가능한 항원성 미스매치를 유도하는 것으로 보고되었다(예를 들면 참고문헌 119 참조). 항원성 미스매치 및 더 큰 항원성 매치는 본원에서 기술된 것과 같이, HI 또는 MN에 의해 측정될 수 있다(예를 들면 상동성 바이러스 역가에 비교하여, 각각, 순환하는 스트레인에 대해 HI 역가에서 >4-배 차이 및 순환하는 스트레인에 대해 HI 역가에서 ≤4-배 차이).
본 발명은 다가오는 계절에 질환을 유발하는 것으로 예측된 하나 이상의 스트레인이 항원성 매치를 이루기 위해 난-기반 제조에 대한 불량한 후보인 것으로 여겨질 때, 그런 스트레인(들)은 난-없는 시스템에서 제조될 수 있어서, 항원성 매치가 결과적으로 생성되는 백신에서 이루어질 수 있는 것으로 생각한다. 그러므로 일부 구체예에서, 난-없는 프로세스(들)에 의해 제조된 하나 이상의 항원은 난에서 제조된 하나 이상의 항원과 선택적으로 조합될 수 있다. 따라서, 발명은 제조 방법의 둘 이상의 공급원(예컨대 난-기반; 세포 배양-기반, 재조합, RNA 레플리콘 등)으로부터의 둘 이상의 항원을 포함하는 제형(예컨대 하이브리드 백신)을 제조하기 위해 추가의 항원(들)과 조합될 수 있는 중간 성분일 수 있는, 난 없이 제조된 항원을 포함하는 조성물을 제공한다.
따라서, 발명의 하이브리드 백신은 (i) 난-기반 제제로부터의 바이러스 항원; (ii) 세포 배양-기반 제제로부터의 바이러스 항원; (iii) 재조합 단백질 제제로부터의 바이러스 항원; 및 (iv) 바이러스 항원을 암호화하는 RNA 레플리콘으로 구성되는 군으로부터 선택된 둘 이상의 성분을 포함할 수 있다. 바이러스 항원은 인플루엔자 항원일 수 있다. 하이브리드 백신은 3가 또는 4가일 수 있다. 하이브리드 백신은 추가로 보조제를 포함할 수 있다. 세포 배양-기반 제제는 포유류 또는 조류 세포-기반 제제일 수 있다. '세포 배양-기반 제제'는 세포 배양에서 성장한 항원을 나타낸다.
(i) 난-기반 제제로부터의 바이러스 항원은 난에서 계대된 바이러스 항원일 수 있다. 난-없는 프로세스로 제조된 바이러스 항원은 세포 배양-기반 제제로부터의 항원, 재조합 단백질 제제로부터의 바이러스 항원 및/또는 RNA 레플리콘에 의해 암호화된(시험관 내에서) 바이러스 항원일 수 있다. 전형적으로, (i) 난-기반 제제로부터의 바이러스 항원은 본원에서 기술된 것과 같이, 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감하지 않은 스트레인 또는 클레이드로부터 유래될 것이다. 바람직한 구체예에서, 난-없는 프로세스로 제조된 바이러스 항원 ((ii), (iii) 및/또는 (iv))은 본원에 기술된 것과 같이, 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 스트레인 또는 클레이드로부터의 항원이다. 다르게는 또는 추가로, 난-없는 프로세스로 제조된 바이러스 항원은 본원에서 기술된 것과 같이, 적혈구에 결합하지 않는 및/또는 적혈구를 응집할 수 없는(예컨대 HI 분석에서) 스트레인 또는 클레이드로부터의 항원이다. 본원에 기술된 하이브리드 백신에서, 난-없는 프로세스로 제조된 바이러스 항원은 인플루엔자 항원(예컨대 제2 인플루엔자 백신 또는 구제 백신 중의)일 수 있고 바람직하게는 참조 백신 중의 상응하는 항원보다 순환하는 인플루엔자 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다. 참조 백신은 본원에서 규정된 제1 인플루엔자 백신일 수 있고, 및/또는 난에서 계대된 것일 수 있다. 참조 백신은, 예를 들면 주어진 인플루엔자 계절에 초기에 활용할 수 있도록 만들어진 백신일 수 있다. 상대적인 항원성 매치 정도는 본원에서 기술된 것과 같이(예컨대 HI 및/또는 MN 분석에 의해) 측정될 수 있다. 다르게는, 또는 또한, 본원에서 기술된 백신에 사용되는, 난-기반 제제(예컨대 난-적응된 클레이드 또는 스트레인)로부터의 항원은 순환하는 스트레인에 대해 ≤50%의 백신 유효성을 나타낼 수 있고 세포 배양에서 성장된 항원(선택적으로, 난에서 계대되지 않은)은 >50%의 백신 유효성을 나타낼 수 있다.
면역화 방법
발명은 백신접종 처방을 제공함으로써 기존의 항원성 미스매치 문제들을 극복하는 것을 목표로 하며, 이때 난에서 계대된, 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신으로의 백신접종 후에 세포 배양에서 성장된, 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신으로의 백신접종이 이어진다. 인간 순환하는 인플루엔자 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된 제2 백신을 사용함으로써, 발명의 방법은, 특히 정기적인 계절성 백신이 미스매치된 인플루엔자 스트레인의 접종으로 인해 최적이 아닌 상황에서 인플루엔자에 대한 더 나은 보호를 제공한다.
그러므로 발명은 (a) 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신을 인간에게 투여하는 단계; 및 계속해서 (b) 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 동일한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 면역시키는 방법을 제공하고, 여기서 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 인플루엔자 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다.
또한 이전에 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신이 투여되었던 인간을 면역시키는 방법이 제공되는데, 그 방법은 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 동일한 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 인플루엔자 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다. 다르게는, 또는 또한, 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원은 난에서 계대되지 않을 수 있다.
발명은 또한 임의의 선행 청구범위의 방법에 의해 인간을 면역화하ㅡㄴ 데 사용하기 위한, 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신 및 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 제공한다.
추가로 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 받게 될 인간을 사전-면역화하기 위한 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신이 제공되며, 여기서 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다.
또한 난에서 계대된 제1 인플루엔자 백신을 사전이 받은 인간을 면역화하는 데 사용하기 위한, 난에서 계대되지 않은(예컨대 세포 배양에서 성장된) 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신이 제공되며, 여기서 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다.
두 인플루엔자 백신은 동일한 인플루엔자 계절 내에서 투여된다. 제2 인플루엔자 백신은 제1 인플루엔자 백신 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 5개월 후에 투여될 수 있다. 바람직하게, 제2 인플루엔자 백신은 제1 인플루엔자 백신 후 3개월 내에 투여된다.
발명은 또한 (i) 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신; 및 (ii) 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 포함하는 키트를 제공하고, 여기서 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다. 키트는 발명의 방법에 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
인플루엔자 스트레인
인간 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 계절성 백신을 제조하기 위한 본 발명의 방법은 다음 단계들을 포함한다(참고문헌 1 및 2): (a) 순환하는 바이러스 스트레인을 분리하는 단계; (b) 분리된 바이러스들의 항원성 및 유전자적 분석 단계; (c) 다가오는 계절 동안 사용하기 위한 바이러스 스트레인의 선택 단계; (d) 재조합 또는 역 유전학의 사용에 의해(또는 난 또는 세포 배양에서의 계대에 의해, 예컨대 하기에서 언급되는 것과 같이, 재조합을 필요로 하지 않는 B 바이러스 원형 스트레인에 대해) 고성장 시드 스트레인(즉 CVV)의 제조 단계; (e) 백신 제조자에게 시드 스트레인(CVV)의 방출 단계; (f) 제조자들에 의한, 산업적 제조에 대한 스트레인들의 적합성의 평가 단계; 및 (g) 바이러스(즉 시드 바이러스 스톡)를 제조하기 위한 시드 스트레인의 성장 단계(즉 CVV의 계대 및 팽창) 후 그것으로부터 백신에 제조되는 단계.
이 방법의 단계 (a) 내지 (e)는 FDA 및 정부-승인 국제 인플루엔자 센터들에 의해, 전형적으로 세계 보건 기구(WHO)의 원조하에 수행되고; 단계 (f) 및 (g)는 제조자들 자체적으로 수행된다.
단계 (d) 및 (g)는 인간을 감염시키기 위해 자연적으로 적응된 것으로부터 산업적 성장 조건하에서 고역가로 성장할 것으로 바이러스를 전이시킨다. 인플루엔자 A 바이러스에 대해, 단계 (d)는 전형적으로 (c)에서 선택된 스트레인들로부터의 게놈 분절들과 계란에서 효과적으로 성장하는 스트레인으로부터의 나머지 6개의 게놈 분절들을 암호화하는 HA 및 NA를 포함하는 6:2 재조합 스트레인을 생성하는 단계를 포함하는데, 이 스트레인은 보통 A/PR/8/34이다. 그 다음 재조합 과정은 난 적응 및 성장 증대를 허용하는 배양된 계란에서의 스트레인의 반복된 계대가 이어진다. 인플루엔자 B 바이러스에 대해, 양호한 성장 특징을 가진 원형 스트레인들은 보통 발육란에서 재조합체를 생성하기 위한 시도 없이 직접적이고 반복되는 계대에 의해 얻어진다. 일부 경우에, 단계 (d)는 대신 비-6:2 재조합체, 예를 들면 5:3 또는 4;4 재조합체를 생성하는 단계를 포함한다.
그러므로 백신 제조자에게 방출전에 수행된 단계들은 난을 통해 인플루엔자 바이러스를 계대시키는 것을 포함한다. 바이러스들이 난에서보다는 세포 기질에서 단계 (g)에서 제조자에 의해 성장된다 해도, 바이러스는 여전히 단계 (a)의 분리와 단계 (e)에서 제조자에 의한 수령 사이의 일부 스테이지에서 난들을 통해 계대될 것이다.
항원이 세포 배양 또는 난에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 경우에, 이것은 일반적으로 단계 (g)에서의 성장을 나타낸다. 그러므로, 난 또는 세포 배양에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터의 항원은 난 또는 세포 배양으로부터 수득된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 항원을 나타낸다. 예를 들어, 항원이 난에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 경우, 인플루엔자 바이러스는 난에서 성장할 것이고, 인플루엔자 바이러스는 난에서 수득될 것이며, 항원은 수득된인플루엔자 바이러스로부터 제조될 것이다. 대조적으로, 바이러스가 난에서 계대된 경우에 인플루엔자 바이러스는 제조 방법 중 임의의 스테이지에서, 즉 제조 방법 중 임의의 스테이지에서 난에서 성장될 수 있다. 전형적으로, 난 계대 후에도 추가의 배양 단계들이 있을 것이고 이들 추가의 배양 단계들은 난 또는 세포 배양에서 수행될 수 있다.
난에서의 계대 단계는 당국에 의해 특히 중요한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 북반구에서 2003/2004 인플루엔자 계절은 A/푸젠성/411/2002-유사 변종이 우세하였지만, 이전의 해로부터의 H3N2를 함유한 백신 스트레인(A/파나마/2007/1999)이 사용되고 있다. 이 스트레인은 푸젠성 스트레인에 불량하게 항원성 매치되었고, 그것은 감소된 백신 유효성을 유발하였다. 푸젠성 스트레인은 난에서 계대되지 않았고(참고문헌 2 및 3), 항원적으로-유사한 난-분리된 스트레인들이 활용될 수 없기 때문에, 미국 식품의약국(FDA)에 의해 거부되었다.
효과적인 인플루엔자 백신을 제공하기 위하여, 백신에서 발견된 인플루엔자 스트레인은 순환하는 인플루엔자 스트레인에 대해 가능한 밀접하게 매치될 필요가 있다. WHO 및 FDA와 같은 당국은 매년 두드러진 순환하는 인플루엔자 스트레인들의 목록을 공개하고 추가로 인플루엔자 백신에 포함시키기 위한 권고된 인플루엔자 스트레인들, 또는 인플루엔자 백신에 포함시키기 위한 스트레인들의 선택을 안내하기 위한 참조 스트레인들을 공개한다.
발명의 제1 및 제2 인플루엔자 백신에 사용된 인플루엔자 항원들은 순환하는 스트레인에 매치된다. 이것은 상기 인플루엔자 스트레인에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 허용하기 위해 필요하다. 제2 인플루엔자 백신 중의 인플루엔자 항원은 일반적으로 제1 인플루엔자 백신 중의 인플루엔자 항원보다 순환하는 인플루엔자 스트레인에 더 밀접한 항원성 매치를 제공할 것이다.
항원적으로 매치된 인플루엔자 항원들은 일반적으로 동일한 인플루엔자 아형에 속하는 인플루엔자 스트레인들로부터 유래하고(예를 들면 H1N1, H3N2 또는 H5N1) 항원적으로 유사하다. 두 인플루엔자 항원이 항원적으로 매치되는지의 여부는, 예를 들면 헤마글루티닌 억제(HI) 분석을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다. 특히, 두 인플루엔자 항원은 HI 분석에서 고도의 교차-반응(예컨대 4배 미만의 역가)을 나타낸다면 항원적으로 매치된 것으로 여겨질 것이다.
제2 인플루엔자 백신 중의 인플루엔자 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 인플루엔자 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 매치된다. 다시, 이것은 HI 분석과 같은, 표준 분석을 통해 기술분야의 숙련자에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 다르게는, 또는 또한, MN 분석이 사용될 수 있다.
예를 들어, 제2 인플루엔자 항원이 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치되는지의 여부를 평가하기 위하여, 비-인간 동물(예컨대 페럿 또는 마우스)은 살아있는 바이러스로 감염되거나 또는 제1 또는 제2 인플루엔자 항원으로 주입된다. 인플루엔자 항원에 대한 항체를 개발하기 위한 충분한 시간 후에, 혈액이 비-인간 동물로부터 추출되고, 혈청이 제조되고 연속적인 희석이 수행된다(예를 들어 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, 1:5120, 1:10240 및 1:20480의 시리즈). 그런 다음 동등한 부피의 각 희석점이 적혈구 및 순환하는 인플루엔자 스트레인과 조합되고, 적혈구 및 순환하는 인플루엔자 스트레인의 최종 농도는 각 희석에 대해 동일하다. 반응은 다음에 적혈구 응집에 대해 세심하게 모니터링된다. 항체가 여전히 적혈구 응집을 억제할 수 있는 희석률이 높을수록, 더 나은 항원이 순환하는 스트레인에 대해 매치된 것으로 여겨질 수 있다. 그러므로, 제1 및 제2 인플루엔자 항원에 대한 항체들이 여전히 적혈구 응집을 억제할 수 있는 최고 희석률을 비교함으로써, 당업자는 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 매치되는 항원을 측정할 수 있다.
항원성 매치는 관심의 항원(예컨대 제1 또는 제2 인플루엔자 항원)을 함유하는 살아있는 바이러스(제1 또는 제2 바이러스)로 비-인간 동물을 감염시킴으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 살아있는 바이러스는 제1 또는 제2 인플루엔자 백신이 제조될 수 있는 시드 바이러스 스트레인일 수 있다.
제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 만약 제2 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들이 동일한 조건하에서 제1 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들과 비교하여 HI 분석에서 고도의 교차-반응을 나타낸다면, 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다. 특히, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 만약 제2 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들이 적혈구 응집을 억제할 수 있는 최고 희석률이 동일한 조건하에서 HI 분석을 사용하여, 제1 항원에 대해 발생된 항체들이 적혈구 응집을 억제할 수 있는 최고 희석률과 비교하여 더 높다면, 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다. 예를 들어, 만약 제2 인플루엔자 항원에 대해 발생된 항체가 1:2560의 희석률까지 적혈구 응집을 억제할 수 있는 반면 제1 인플루엔자 항원에 대해 발생된 항체가 1:1280의 희석률까지만 적혈구 응집을 억제할 수 있다면, 제2 인플루엔자 항원은 더 밀접하게 항원적으로 매치될 것으로 여겨질 것이다. 이 맥락에서 "동일한"은 모든 조건이 동일하지만 분석에서 이 항체로서 사용된 항체는 개별적인 항원들에 대해 발생될 것임을 의미하는 것으로 인지된다.
바람직한 실례에서, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 만약 제2 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들이 순환하는 스트레인에 의해 적혈구 응집을 억제할 수 있는 최고 희석률이, 제1 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들이 동일한 조건하에서 순환하는 스트레인에 의해 적혈구 응집을 억제할 수 있는 최고 희석률보다, 순환하는 스트레인에 대해 발생된 항체들이 순환하는 스트레인에 의해 적혈구 응집을 억제할 수 있는 최고 희석률에 더 가깝다면, 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 더 밀접하게 순환하는 스트레인에 항원적으로 매치된다(즉 상동성 바이러스 역가에 더 가깝다).
예를 들어, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 상동성 바이러스 역가에 비교하여 순환하는 스트레인에 대한 HI 역가에서 ≤4-배의 차이를 나타낼 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 상동성 바이러스 역가에 비교하여 순환하는 스트레인에 대한 HI 역가에서 4-배 미만의 차이(예컨대 ≤3-배, ≤2-배, ≤1-배의 차이)를 나타낼 것이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 상동성 바이러스 역가에 비교하여 순환하는 스트레인에 대한 HI 역가에서 ≤2-배의 차이를 나타낼 것이다.
제1 인플루엔자 백신 중의 항원은, 예를 들면 상동성 바이러스 역가에 비교하여 순환하는 스트레인에 대한 HI 역가에서 >4-배의 차이를 나타낼 수 있다.
다르게는, 또는 또한, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 만약 제2 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들에 대한 순환하는 스트레인에 대한 MN 중화 역가가, 동일한 조건하에서, 제1 인플루엔자 백신 중의 항원에 대해 발생된 항체들에 대한 순환하는 스트레인에 대한 MN 중화 역가보다 상동성 MN 역가에 더 밀접하다면, 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치된다.
제2 인플루엔자 백신 중의 항원은, 예를 들면 상동성 MN 역가에 비교하여 순환하는 스트레인에 대한 MN 역가에서 ≤2-배의 차이를 나타낼 수 있다.
제1 인플루엔자 백신 중의 항원은 상동성 MN 역가에 비교하여 순환하는 스트레인에 대한 MN 역가에서 >2-배의 차이를 나타낼 수 있다.
그러므로, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 순환하는 스트레인에 비교할 때, 상기 분석(들)에서 순환하는 스트레인에 비교할 때의 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 HI 분석(예컨대 투-웨이 HI 시험) 및/또는 MN 분석에서 고도의 교차-반응을 나타낼 수 있다.
제2 인플루엔자 백신은 본원에 기술된 구제 백신, 하이브리드 백신 또는 조성물일 수 있다. 제1 인플루엔자 백신은 계절성 인플루엔자 백신일 수 있다.
제1 및 제2 인플루엔자 백신은 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 스트레인으로부터의 항원을 포함할 수 있다.
난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 바이러스 스트레인은 본원에서 언급된 것과 같이, H3N2 스트레인일 수 있다. 클레이드는 클레이드 3C.2A(A/Hong Kong/5738/2014-유사 또는 A/Hong Kong/4801/2014-유사), 클레이드 3C.3A(예컨대 A/Switzerland/9715293/2013-유사) 또는 3C.1(예컨대 A/Texas/50/2012-유사 바이러스 분리물)이다. 다르게는, 또는 또한, 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 바이러스 스트레인 또는 클레이드는 B 스트레인, 예를 들면 B-Victoria 계통으로부터의 스트레인(예컨대 B/Brisbane/60/2008-유사)일 수 있다. 기술분야의 숙련자는 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 스트레인 또는 클레이드를 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, 그런 스트레인의 분리물을 난에서 계대시키는 것은 원래의 분리물 및/또는 순환하는 스트레인에 비교하여 덜 밀접하게 항원적으로 매치된 바이러스를 초래할 수 있다. 대조적으로, 분리물이 포유류 세포에서 계대될 때, 그 결과의 바이러스에서의 그런 미스매치는 관찰되지 않는다(또는 동일한 정도로 관찰되지 않는다).
순환하는 스트레인은 계절성 순환하는 스트레인일 수 있다. 계절성 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 스트레인은 계절마다 바뀐다. 상기에서 논의된 것과 같이, 당국은 매년 순환하는 인플루엔자 스트레인들의 목록을 공개하고 그래서 숙련자는 이것들을 의식한다.
순환하는 스트레인은 또한 유행하는 인플루엔자 스트레인(즉 백신 수령체와 일반적인 인간 집단이 그것에 대해 면역학적으로 순수한 스트레인), 예컨대 H2, H5, H7 또는 H9 아형 스트레인(특히 인플루엔자 A 바이러스)일 수 있다.
제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 난에서 계대된 제1 인플루엔자 백신 중의 항원과 동일한 인플루엔자 아형으로부터 유래된다. 예를 들어, 제1 인플루엔자 백신이 H1 스트레인, H3 스트레인 및 난에서 계대된 인플루엔자 B 스트레인 및 모든 3개로부터의 항원들을 포함하는 경우에, 제2 인플루엔자 백신 중의 인플루엔자 항원은 H1 스트레인, H3 스트레인 또는 인플루엔자 B 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 마찬가지로, 제1 인플루엔자 백신이 1가 H1 인플루엔자 백신인 경우에, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 또한 H1 아형의 것일 것이다.
제1 인플루엔자 백신 중의 인플루엔자 항원들의 일부만이 난에서 계대된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 경우라면, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 그런 스트레인들과 동일한 아형의 것일 것이다. 예를 들어, 3가 인플루엔자 백신 중의 H1 및 H3 스트레인만이 난에서 계대된 경우에, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 H1 스트레인 및/또는 H3 스트레인으로부터의 인플루엔자 항원 중 하나 또는 둘 다를 함유할 수 있다.
순환하는 스트레인에 대한 항원성 매치에 대해 평가되는 제1 인플루엔자 백신 중의 항원 및 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 동일한 인플루엔자 아형의 것일 것이라는 것이 인지될 것이다.
백신
다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신이 현재 활용될 수 있고, 백신은 일반적으로 살아있는 바이러스 또는 비활성화된 바이러스를 기반으로 한다. 비활성화된 백신은 전체 비리온, 스플릿 비리온 또는 정제된 하위유닛(예컨대 정제된 표면) 항원을 기반으로 할 수 있다. 인플루엔자 항원은 또한 비로좀의 형태로 제공될 수 있다. 발명은 이들 유형의 백신 중 임의의 것으로 사용될 수 있지만, 전형적으로는 비활성화된 백신으로 사용될 것이다.
항원은 살아있는 바이러스 또는 비활성화된 바이러스의 형태를 취할 수 있다. 바이러스를 비활성화하기 위한 화학적 수단은 유효량의 다음 제제들 중 하나 이상으로 처리하는 것을 포함한다: 계면활성제, 포름알데하이드, 포르말린, β 프로피오락톤 또는 UV 광. 비활성화를 위한 추가의 화학적 수단은 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌(C60) 또는 그것들 중 임의의 것들의 조합으로의 처리를 포함한다. 바이러스 비활성화의 다른 방법들은 기술분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 두 성분 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 감마 방사선 조사이다. INFLEXALTM 제품이 전체 비리온 비활성화 백신이다.
비활성화된 바이러스가 사용되는 경우에, 백신은 전체 비리온, 스플릿 비리온 또는 정제된 표면 항원을 포함할 수 있다(헤마글루티닌을 포함하고, 통상적으로 뉴라미니다제도 포함함).
비리온은 다양한 방법에 의해 바이러스 함유 유체로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 정제 방법은 비리온을 파괴하기 위해 계면활성제를 포함하는 선형 수크로오스 구배 용액을 사용하는 구역별 원심분리를 포함한다. 항원들은 다음에 임의의 희석 후에 투석여과에 의해 정제될 수 있다.
스플릿 비리온은 하위비리온 제제를 제조하기 위하여, '트윈-에테르' 스플리팅 방법을 포함하여, 계면활성제 또는 용매(예컨대 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트라이-N-부틸 포스페이트, 트리톤-X-100, 트리톤 N101, 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드 등)로 비리온을 처리함으로써 얻어진다. 인플루엔자 바이러스를 스플릿팅하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대 참고문헌 4 내지 9 등 참조). 바이러스의 스플릿팅은 전형적으로 스플릿팅 제제의 파괴 농도를 가지는 감염성이거나 비-감염성이거나 간에, 전체 바이러스를 파괴함으로써 또는 단편화함으로써 수행된다. 파괴는 바이러스 단백질의 전체적인 또는 부분적인 가용화를 초래하여 바이러스의 통합성을 변경시킨다. 바람직한 스플릿팅 제제는 비-이온성 및 이온성(예컨대 양이온성) 계면활성제, 예컨대 알킬글리코사이드, 알킬티오글리코사이드, 아실 당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-다이알킬-글루카미드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드), 트라이-N-부틸 포스페이트, 카타블론, 미리스틸트라이메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대 트리톤 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등이다. 한 가지 유용한 스플릿팅 과정은 소디움 데옥시콜레이트 및 포름알데하이드의 구성성 효과를 사용하고, 스플릿팅은 초기 비리온 정제 중에(예컨대 수크로오스 밀도 구배 용액에서) 일어날 수 있다. 스플릿 비리온은 인산 나트륨-완충된 등장성 염화나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. AFLURIATM, BEGRIVACTM, FLUARIXTM, FLUZONETM 및 FLUSHIELDTM 제품이 스플릿 백신이다.
정제된 표면 항원(또는 정제된 하위유닛) 백신은 인플루엔자 표면 항원 헤마글루티닌을 포함하고 또한 뉴라미니다제를 포함할 수 있다. 정제된 형태로 이들 단백질에 대한 제조 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. FLUVIRINTM, AGRIPPALTM, FLUCELVAXTM, FLUADTM 및 INFLUVACTM 제품이 하위유닛 백신이다.
조성물에 유용하게 포함될 수 있는 다른 스트레인들은 내성 유행성 스트레인들(참고문헌 11)을 포함하여, 항바이러스 요법에 내성인(예컨대 오셀타미비어(참고문헌 10) 및/또는 자나미비어에 내성인) 스트레인들이다.
인플루엔자 바이러스는 약화될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 온도-민감성일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 저온 적응될 수 있다. 이들 세 가지 가능성은 특히 살아있는 바이러스에 적용된다.
제1 인플루엔자 백신은 3가 인플루엔자 백신일 수 있다. 제1 인플루엔자 백신은 또한 4가 인플루엔자 백신일 수 있다. 그런 4가 인플루엔자 백신은 빈번하게 두 인플루엔자 A 및 두 인플루엔자 B 스트레인을 함유하고 그것들이 인플루엔자 B 바이러스의 두 상이한 계통을 포함할 수 있다는 장점을 가진다. 그러므로 그런 백신들은 순환하는 인플루엔자 바이러스에 대한 더 광범위한 보호를 제공할 수 있다. 제1 인플루엔자 백신은 또한 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하여, 1, 2, 5, 6 또는 그 이상의 인플루엔자 스트레인으로부터의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 인플루엔자의 하나 이상의 스트레인을 포함하는 경우에, 상이한 스트레인들은 전형적으로 별도로 성장하고 바이러스들이 수득되고 항원들이 제조된 후에 혼합된다.
제1 백신 중의 인플루엔자 항원들 중 적어도 하나는 난에서 계대된 인플루엔자 바이러스로부터 제조될 것이다. 인간 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,6)Gal 말단 이당(갈락토오스에 α 2,6 결합된 시알산)을 가지는 수용체 올리고당에 결합하지만, 난은 대신 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 가지는 수용체 올리고당을 가진다. 그러므로 난에서 인간 인플루엔자 바이러스의 성장은 Sia(α2,3)Gal 결합을 향해 Sia(α2,6)Gal 결합으로부터 멀리 있는 헤마글루티닌에 대한 선택 압박을 제공한다. 그러므로 난에서 계대된 인플루엔자 바이러스는 그것들이 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 가지는 올리고당에 비교하여 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 가지는 올리고당에 대한 결합 선호도를 가진다는 점에서 확인될 수 있다.
바이러스가 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 가지는 올리고당에 비교하여 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 가지는 올리고당에 대한 결합 선호도를 가지는지를 측정하기 위하여, 다양한 분석이 사용될 수 있다. 예를 들어, 참고문헌 12는 친화성 상수의 민감하고 정량적인 측정을 제공하는 인플루엔자 바이러스 수용체-결합 활성에 대한 고상 효소-결합 분석을 기술한다. 참고문헌 13은 두 상이한 시알릴당당백질에 대한 바이러스들의 결합이 평가되는 고상 분석을 사용하였고(Sia(α2,3)Gal 결정기를 가진 오보뮤코이드; 및 Sia(α2,6)Gal 결정기인 돼지 α2 마크로글로불린), 또한 바이러스의 결합이 두 수용체 유사체: 유리 시알산(Neu5Ac) 및 3' 시알릴락토오스(Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc)에 대해 평가된 분석을 기술한다. 참고문헌 14는 α2,3 또는 α2,6 결합에 대한 수용체 선호도를 분명하게 구별할 수 있었던 글리칸 어레이를 사용하는 분석을 보고한다. 참고문헌 15는 Sia(α2,6)Gal 또는 Sia(α2,3)Gal을 함유하도록 효소적으로 변형된 인간 적혈구의 응집을 기반으로 한 분석을 보고한다. 분석의 유형에 따라, 분석은 바이러스 자체로 직접적으로 수행되거나, 또는 바이러스로부터 정제된 헤마글루티닌으로 간접적으로 수행될 수 있다.
제1 인플루엔자 백신이 다가 인플루엔자 백신인 경우에, 백신 중의 모든 인플루엔자 항원은 보통 난에서 계대된 인플루엔자 바이러스로부터 제조될 것이다. 그러나, 발명은 또한 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 인플루엔자 항원이 난에서 계대된 인플루엔자 바이러스로부터 제조되는 제1 인플루엔자 백신으로 실시될 수 있다.
제1 인플루엔자 백신은 또한 난에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 바이러스로부터의 항원들을 포함할 수 있다. 이것은 그것으로부터 백신 중의 항원이 제조되는 인플루엔자 바이러스가 난에서 성장한 것을 의미한다.
대조적으로, 바이러스가 단순히 난에서 계대된 경우에, 그것은 원래 난에서 성장될 수 있고 다음에 세포 배양으로 전달되어서 그것으로부터 인플루엔자 항원이 최종적으로 제조된 인플루엔자 바이러스가 세포 배양에서 성장하였다. 그런 바이러스는 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 가진 올리고당에 비교하여 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 가진 올리고당에 대한 결합 선호도를 보유할 것이고 그로써 발명의 방법은 여전히 그런 백신의 효능에 유익할 것이다.
일부 바람직한 구체예에서, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원들은 세포 배양에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 제조된다. 세포 배양에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키면 인플루엔자 바이러스가 난에서 성장할 때 발견되는 Sia(α2,3)Gal 결합을 향해 Sia(α2,6)Gal 결합으로부터 멀리 있는 헤마글루티닌에 대한 선택 압박을 피할 수 있다. 나아가, 그것은 다시, 순환하는 스트레인을 더 밀접하게 닮은 인플루엔자 바이러스의 제조를 선호하는, 난에서의 고성장에 적응되지 않은 인플루엔자 바이러스의 사용을 허용한다. 따라서, 이들 인플루엔자 바이러스는 순환하는 인간 인플루엔자 바이러스에 대해 훨씬 더 나은 매치일 것이고 그러므로 더 나은 보호를 제공하는 것으로 예상될 수 있다.
다르게는, 제2 인플루엔자 백신으로부터의 항원(들)은 재조합 단백질 항원(들)일 수 있다.
바람직하게, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원(들)은 난에서 계대되지 않았다.
제2 인플루엔자 백신은 1가 인플루엔자 백신일 수 있다. 그것은 또한 하나 이상, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 인플루엔자 항원을 함유할 수 있고, 단 적어도 하나의 인플루엔자 항원은 세포 배양에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 제조되었다. 상기에서 논의된 것과 같이, 세포 배양에서 성장된 적어도 하나의 인플루엔자 항원은 난에서 계대된 제1 인플루엔자 백신 중의 인플루엔자 항원과 동일한 아형의 것일 것임이 인지된다.
바람직하게, 세포 배양에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 결코 난에서 계대되지 않았다. 상기에서 논의된 것과 같이, 그런 항원들은 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 가진 올리고당에 비교하여 Sia(α2,3)Gal 말단 이당에 대한 우선적인 결합 선호도에 의해 난에서 계대된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 항원과 구별될 수 있다.
세포 배양이 사용될 때, 바이러스 성장 기질은 전형적으로 포유류 기원의 세포주일 것이다. 적합한 포유류 세포는, 한정하는 것은 아니지만, 햄스터, 소, 영장류(인간 및 원숭이를 포함함) 및 개 세포를 포함한다. 다양한 세포 유형, 예컨대 신장 세포, 섬유모세포, 망막 세포, 폐 세포 등이 사용될 수 있다. 적합한 햄스터 세포의 실례는 BHK21 또는 HKCC 이름을 가진 세포 주이다. 적합한 원숭이 세포는 예컨대 아프리카 녹색 원숭이 세포, 예컨대 Vero 세포 주에서와 같은 신장 세포이다. 적합한 개 세포는 예컨대 MDCK 세포 주에서와 같은 신장 세포이다. 그러므로 적합한 세포주는, 한정하는 것은 아니지만 MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC 5; PER.C6; WI-38; 등을 포함한다. 인플루엔자 바이러스를 성장시키기에 바람직한 포유류 세포주는 마딘 다비 개과 신장으로부터 유도된 MDCK 세포(참고문헌 16 내지 19); 아프리카 녹색 원숭이(Cercopithecus aethiops) 신장으로부터 유도된 Vero 세포(참고문헌 20 내지 22); 또는 인간 배아 망막모세포로부터 유도된 PER.C6 세포(참고문헌 23)를 포함한다. 이들 세포 주는 예컨대 아메리칸 타입 세포 컬춰(ATCC) 콜렉션으로부터(참고문헌 24), 코리엘 세포 저장소(Coriell Cell Repositories)로부터(참고문헌 25) 또는 유럽 콜렉션 오브 셀 컬춰(ECACC)로부터 광범위하게 활용될 수 있다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587 하에 다양한 상이한 Vero 세포를 공급하고, 카탈로그 번호 CCL 34 하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940 하에 ECACC로부터 활용 가능하다.
인플루엔자 바이러스는 또한 배아 줄기 세포(참고문헌 26 및 29) 및 오리로부터(예컨대 오리 망막) 또는 암탉으로부터 유도된 세포 주를 포함하여, 조류 세포 주에서 성장할 수 있다(예컨대 참고문헌 26 내지 28). 적합한 조류 배아 줄기 세포는 닭의 배아 줄기 세포로부터 유도된 EBx 세포 주, EB45, EB14 및 EB14-074를 포함한다(참고문헌 30). 닭의 배아 섬유모세포(CEF)가 또한 사용될 수 있다. 가장 바람직한 조류 세포 주는 오리 배아 줄기 세포로부터 유도된 EB66 세포 주이다. 이 세포 주는 인플루엔자 항원을 제조하기 위해 잘 작업되는 것으로 보고되었다 (참고문헌 31).
바람직하게, 본 발명의 세포 배양은 포유류이다. 포유류 세포의 사용은 본원에서 기술된 백신 중의 스트레인이 난 적응에 민감한 스트레인인 경우에 특히 바람직하다. 예를 들어, 만약 제1 인플루엔자 백신의 항원성 미스매치가 난-적응성 돌연변이와 관련된다면, 제2 인플루엔자 백신(예컨대 구제 백신)은 난-없는 프로세스로, 예컨대 포유류 세포-기반 플랫폼에서 제조되어야 한다.
세포 배양이 사용될 때, 세포는 Sia(α2,6)Gal 결합으로부터 멀리 있는 헤마글루티닌에 대한 선택 압박을 피할 수 있다. 실제로, 특정 비-포유류 세포(예컨대 조류 세포)는 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 가진 수용체 올리고당을 가지도록 적응될 수 있다. 예를 들어, 비-포유류 세포는 포유류 효소 또는 효소들을 발현하도록 유전자적으로 엔지니어링될 수 있다. 그런 세포에서 성장된 바이러스로부터의 항원은 그러므로 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 가진 올리고당에 비교하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 가진 올리고당에 대한 결합 선호도를 가질 수 있다.
인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위한 가장 바람직한 세포 주는 MDCK 세포이다. 원래의 MDCK 세포 주는 ATCC로부터 CCL 34로서 활용 가능하지만, 이 세포 주의 유도체 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 참고문헌 16은 현탁액 배양에서의 성장을 위해 적응된 MDCK 세포 주를 개시한다('MDCK 33016', DSM ACC 2219로서 기탁됨). 마찬가지로, 참고문헌 32는 혈청이 없는 배양으로 현탁액에서 성장하는 MDCK-유도된 세포 주를 개시한다('B-702', FERM BP-7449로서 기탁됨). 참고문헌 33은 'MDCK-S'(ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103'(PTA-6503)을 포함하여, 비-종양 형성성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 34는 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL 12042)를 포함하여, 감염에 대한 고도 민감성을 가진 MDCK 세포 주를 개시한다. 이들 MDCK 세포 주들 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
바이러스가 세포 주에서 성장되면 조성물은 유익하게도 난백(예컨대 오브알부민 및 오보뮤코이드) 및 닭의 DNA가 없고, 그로써 알레르기 항원성이 감소될 것이다.
바이러스가 세포 주에서 성장된 경우에 성장을 위한 배양, 및 또한 배양을 시작하기 위해 사용된 바이러스 접종물은 바람직하게는 단순 포진 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 비르나바이러스, 시르코바이러스(특히 돼지의 시르코바이러스) 및/또는 파르보바이러스가 없을 것이다(즉 바이러스들에 의한 오염 및 오염에 대한 네거티브 결과에 대해 시험될 것이다)(참고문헌 35). 단순 포진 바이러스의 부재가 특히 바람직하다.
바이러스가 세포주에서 성장된 경우 조성물은 용량(전형적으로 아동에 대해 0.25 mL 또는 성인에 대해 0.5 mL)당 바람직하게 10 ng 미만(바람직하게는 1 ng 미만, 보다 바람직하게는 100 pg 미만)의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하지만, 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있다. 일반적으로, 발명의 조성물로부터 배제되는 것이 바람직한 숙주 세포 DNA는 100 bp보다 길다, 예컨대 150 bp보다 길고, 200 bp보다 길다, 등등.
잔류하는 숙주 세포 DNA의 측정은 이제 생물학에 대해 관습적인 규제 요구제건이고 숙련된 사람의 정상적인 능력 내에 있다. DNA를 측정하기 위해 사용된 분석은 전형적으로 입증된 분석일 것이다(참고문헌 36 및 37). 입증된 분석의 성능 특징은 수학적 및 수량화할 수 있는 용어로 기술될 수 있고, 그것의 가능한 오류 근원이 확인될 것이다. 분석은 일반적으로 정확성, 정밀성, 특이성과 같은 특징들에 대해 시험될 것이다. 일단 분석이 보정되고(예컨대 숙주 세포 DNA의 공지된 표준 양에 대해) 시험되면 다음에 정량적인 DNA 측정이 정례적으로 수행될 수 있다. DNA 정량을 위해 3가지 원칙적인 기법이 사용될 수 있다: 혼성화 방법, 예컨대 서던 블롯 또는 슬롯 블롯(참고문헌 38); 면역분석 방법, 예컨대 ThresholdTM 시스템(참고문헌 39); 및 정량적 PCR(참고문헌 40). 이들 방법은 모두 숙련자에게 친숙하지만, 각 방법의 정확한 특징들은 의문의 숙주 세포, 예컨대 혼성화를 위한 프로브의 선택, 프라이머 및/또는 증폭을 위한 프로브의 선택 등에 좌우될 수 있다. Molecular Devices로부터의 ThresholdTM 시스템은 총 DNA의 피코그램 수준에 대한 정량적인 분석이고, 생물약제학에서 오염시키는 DNA의 수준을 모니터링하기 위해 사용되었다(참고문헌 38). 전형적인 분석은 비오티닐화된 ssDNA 결합 단백질, 우레아제-콘쥬게이트된 항-ssDNA 항체 및 DNA 사이의 반응 복합체의 비-서열-특이적 형성을 포함한다. 모든 분석 성분들은 제조자로부터 활용할 수 있는 완전한 총 DNA 분석 키트에 포함된다. 다양한 상업적 제조자들은 잔류하는 숙주 세포 DNA를 검출하기 위한 정량적인 PCR 분석, 예컨대 AppTecTM Laboratory Services, BioRelianceTM, Althea Technologies, 등을 제공한다. 인간 바이러스 백신의 숙주 세포 DNA 오염을 측정하기 위한 화학발광 혼성화 분석과 총 DNA ThresholdTM 시스템의 비교는 참고문헌 41에서 찾아볼 수 있다.
오염시키는 DNA는 표준 정제 과정, 예컨대 크로마토그래피 등을 사용하여 백신 제조 중에 제거될 수 있다. 잔류하는 숙주 세포 DNA의 제거는 핵화제 처리에 의해, 예컨대 DNase를 사용함으로써 증대될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키기 위한 편리한 방법은 참고문헌 42 및 43에서 개시되고, 2-단계 처리, 먼저, 바이러스 성장 중에 사용될 수 있는 DNase(예컨대 벤조나아제)를 사용하는 처리, 및 비리온 파괴 중에 사용될 수 있는 양이온성 계면활성제(예컨대 CTAB)를 사용하는 처리를 포함한다. 알킬화제, 예컨대 β-프로피오락톤으로의 처리는 또한 숙주 세포 DNA를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 유익하게도 또한 비리온을 비활성화하기 위해 사용될 수 있다(참고문헌 44). 알킬화제 또는 DNase와 알킬화제의 조합으로의 처리의 두 단계를 사용하는 방법이 또한 기술되었다(참고문헌 45).
0.25 ml의 부피당 <10 ng(예컨대 <1 ng, <100 pg)의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신처럼, 15 μg의 헤마글루티닌당 <10 ng(예컨대 <1 ng, <100 pg)의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 바람직하다. 0.5 ml의 부피당 <10 ng(예컨대 <1 ng, <100 pg)의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신처럼, 50 μg의 헤마글루티닌당 <10 ng(예컨대 <1 ng, <100 pg)의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 보다 바람직하다.
임의의 잔류 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500 bp 미만, 예컨대 400 bp 미만, 300 bp 미만, 200 bp 미만, 100 bp 미만, 등인 것이 바람직하다.
세포 주에서, 예컨대 MDCK 세포에서의 성장을 위해, 바이러스는 현탁액 중의 세포에서(참고문헌 16, 46 및 47) 또는 부착 배양에서 성장될 수 있다. 현탁 배양을 위한 한 가지 적합한 MDCK 세포 주는 MDCK 33016(DSM ACC 2219로서 기탁됨)이다. 대안으로서, 마이크로캐리어 배양이 사용될 수 있다.
본 개시에 따라, 세포 배양은 야생형 샘플(예컨대 임상 샘플)로부터 바이러스를 분리하고 성장시키기 위해 사용될 수 있는데, 그 바이러스는 발명에 따라 사용하기 위한 백신 또는 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 분리물은 바람직하게는 순환하는 스트레인(샘플로부터 얻어짐)의 분리물이다. 분리물은 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감함 클레이드 또는 스트레인의 분리물일 수 있다. 세포 배양에서의 분리 및 성장은 난에서 분리되고 성장된 바이러스와 비교할 때 조성물 및 제조 방법에 추가의 장점들을 제공할 수 있다. 세포 배양에서의 분리는 난을 사용하여 분리된 바이러스와 비교하여 임상 샘플로부터의 분리 속도를 상당히 개선할 수 있다. 세포 배양에서의 분리 및 성장은 난-기반 프로세스로 분리되고 성장된 바이러스에 비교하여 더 높은 성장 속도 및/또는 증가된 바이러스 수율을 유도할 수 있다. 나아가, 세포 배양에서의 분리 및 성장은 개선된 유전자 안정성(상기 기술된 것과 같은), 즉 항원성 미스매치를 유발하는 숙주 적응성 돌연변이를 도입하지 않고서도, 원래의 임상 샘플의 유전자 서열을 보유하는 능력을 제공할 수 있다. 이들 효과는 클레이드 또는 스트레인이 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 경우에(예컨대 B/Victoria 계통으로부터의 스트레인), 및/또는 제1 인플루엔자 백신보다 특정 순환하는 스트레인에 대해 더 밀접한 항원성 매치를 가진 구제 백신(예컨대 제2 인플루엔자 백신)이 제공되어야 하는 경우에(특히 제1 인플루엔자 백신과 동일한 계절 내에 투여하기 위해 제공되어야 할 때) 특히 유익할 수 있다. 이들 효과는 또한 백신이 하나 또는 두 개의 B 스트레인을 함유하는 구체예에서 특히 유익할 수 있다. B 스트레인(들)은 B/Victoria 계통 및/또는 B/야마가타 계통으로부터 유래될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, B/Victoria 스트레인이 존재하고 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한 스트레인 또는 클레이드이다. 백신은, 예를 들면 두 A 스트레인 및 두 B 스트레인(AABB)을 포함하는 4가 백신 또는 두 A 스트레인 및 하나의 B 스트레인(AAB)을 포함하는 3가 백신일 수 있다. 바람직하게, 백신은 적어도 두 개의 B 스트레인을 포함한다, 예컨대 4가 AABB 백신이다. 세포 배양-기반 분리 및 성장은 특히 임상 샘플로부터, 본원에 기술된 구제 백신 및 조성물을 제조하는데 사용하기 위한 다중 B 스트레인을 제조하기에 유익할 수 있다. 세포 배양에서 제조된 B 스트레인들은 난에서 제조된 B 스트레인보다 월등한 분리 속도, 성장 속도, 수율 및/또는 유전자 안정성을 나타낼 수 있다. 세포 배양은 바람직하게는 본원에 기술된 것과 같은 MDCK 세포 배양이다(MDCK 33016PF 세포 배양일 수 있다).
인플루엔자 바이러스 복제를 지지하는 세포 주들은 바람직하게 혈청 유리 배양 배지 및/또는 단백질 유리 배지에서 성장된다. 배지는 인간 또는 동물 기원의 혈청으로부터의 첨가물이 없는 본 발명의 맥락에서 혈청-유리 배지로서 언급된다. 단백질-유리는 세포의 다중화가 단백질, 성장 인자, 다른 단백질 첨가물 및 비-혈청 단백질을 배제하면서 발생하지만, 트립신 또는 바이러스 성장에 필요할 수 있는 다른 프로테아제와 같은 단백질을 선택적으로 포함할 수 있는 배양을 의미하는 것으로 인지된다. 그런 배양에서 성장하는 세포들은 자연적으로 단백질 자체를 함유한다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지지하는 세포 주들은, 예를 들면 바이러스 복제 중에, 37℃ 아래에서(참고문헌 48)(예컨대 30 내지 36℃, 또는 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃에서) 바람직하게 성장된다.
배양된 세포에서 바이러스를 증식시키는 방법은 일반적으로 배양된 세포를 배양하고자 하는 스트레인으로 접종하는 단계, 감염된 세포를 원하는 시간 동안, 예컨대 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 측정되는 바 바이러스 증식을 위해 배양하는 단계(예컨대 접종 후 24 내지 168 시간) 및 증식된 바이러스를 수집하는 다네를 포함한다. 배양된 세포는 바이러스로 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 보다 바람직하게는 1:50 내지 1:10의 세포 비율로 접종된다(PFU 또는 TCID50에 의해 측정됨). 바이러스는 세포 현탁액에 첨가되거나 또는 세포의 단층에 적용되고, 바이러스는 적어도 60분 동안 그러나 통상 300분 미만, 바람직하게는 90 내지 240분 동안, 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃에서 세포에 흡수된다. 감염된 세포 배양(예컨대 단층)은 냉동-해동에 의해 또는 효소적 작용에 의해 제거되어 수득된 배양 상층액의 바이러스 함량이 증가될 수 있다. 수득된 유체는 다음에 비활성화되거나 냉동 보관된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 보다 바람직하게는 0.001 내지 2의 감염 다중도("m.o.i")로 감염될 수 있다. 보다 바람직하게, 세포들은 약 0.01의 m.o.i로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60시간 후에 수득될 수 있다. 바람직하게, 세포는 감염 후 34 내지 48시간 후에 수득된다. 보다 바람직하게, 세포는 감염 후 38 내지 40시간 후에 수득된다. 그럼에도 불구하고, 최적 수득 시간의 측정은 기술분야의 숙련자의 정상적인 능력 내에 있다. 프로테아제(전형적으로 트립신)는 일반적으로 세포 배양 중에 첨가되어 바이러스 방출이 허용되고, 프로테아제는 배양 중 임의의 적합한 스테이지에서 첨가될 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 재조합 스트레인일 수 있고, 역 유전학 기법에 의해 얻어질 수 있다. 역 유전학 기법(예컨대 참고문헌 49 내지 53)은 원하는 게놈 분절을 가진 인플루엔자 바이러스가 플라스미드를 사용하여 시험관 내에서 제조되는 것을 허용한다. 전형적으로, 그것은 (a) 예컨대 polI 프로모터로부터 원하는 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자 및 (b) 예컨대 polII 프로모터로부터 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 발현시키는 것을 포함하여서, 세포에서 두 유형의 DNA의 발현은 완전한 무상 감염성 비리온의 조립을 유도한다. DNA는 바람직하게는 모든 바이러스 RNA 및 단백질을 제공하지만, 또한 RNA와 단백질의 일부를 제공하기 위해 헬퍼 바이러스를 사용하는 것도 가능하다. 각 바이러스 RNA를 제조하기 위해 별도의 플라스미를 사용하는 플라스미드-기반 방법이 바람직하고(참고문헌 54 내지 56), 이들 방법은 또한 바이러스 단백질의 전부 또는 일부(예컨대 단지 PB1, PB2, PA 및 NP 단백질)를 발현시키기 위해 플라스미드의 사용을 포함할 것이며, 일부 방법에서는 12개의 플라스미드가 사용된다. 선형 발현 구성물의 사용이 또한 가능하다(참고문헌 57).
필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위하여, 최근 접근법(참고문헌 58)은 동일한 플라스미드(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모두 8개의 인플루엔자 A vRNA 분절을 암호화하는 서열) 상의 다수의 RNA 중합효소 I 전사 카세트(바이러스 RNA 합성을 위해)를 다른 플라스미드(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모두 8개의 인플루엔자 A mRNA 전사물을 암호화하는 서열) 상의 RNA 중합효소 II 프로모터를 가진 다수의 단백질 암호화 영역과 조합시킨다. 참고문헌 55 방법의 바람직한 측면은 (a) 단일 플라스미드 상의 PB1, PB2 및 PA mRNA 암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상의 모두 8개의 vRNA 암호화 분절을 포함한다. 한 플라스미드 상의 NA 및 HA 분절과 다른 플라스미드 상의 6개의 다른 분절을 포함하는 것이 또한 사안을 용이하게 할 수 있다.
바이러스 RNA 분절을 암호화하기 위해 polI 프로모터를 사용하는 것에 대한 대안으로서, 박테리오파지 중합효소 프로모터를 사용하는 것이 가능하다(참고문헌 59). 예를 들어, SP6, T3 또는 T7 중합효소에 대한 프로모터들이 편리하게 사용될 수 있다. polI 프로모터의 종 특이성 때문에, 박테리오파지 중합효소 프로모터는 많은 세포 유형(예컨대 MDCK)에 대해 더 편리할 수 있지만, 세포는 또한 외인성 중합효소 효소를 암호화하는 플라스미드로도 트랜스펙션되어야 한다.
다른 기법에서 동시에 단일 주형으로부터의 바이러스 RNA 및 발현 가능한 mRNA를 암호화하기 위해 이중 polI 및 polII 프로모터를 사용하는 것이 가능하다(참고문헌 60 및 61).
그러므로 인플루엔자 A 바이러스는 특히 바이러스가 난에서 성장될 때, A/PR/8/34 바이러스로부터의 하나 이상의 RNA 분절을 포함할 수 있다(전형적으로 A/PR/8/34로부터 6개의 분절, HA 및 NA 분절은 백신 스트레인으로부터 유래됨, 즉 6:2 재조합체). 또한 A/WSN/33 바이러스로부터의, 또는 백신 제조를 위해 재조합 바이러스를 생성하는 데 유용한 임의의 다른 바이러스 스트레인으로부터의 하나 이상의 RNA 분절을 포함할 수 있다. 참고문헌 62 및 63은 또한 인플루엔자 A 및 B 스트레인을 재조합하기에 적합한 골격을 논의한다.
전형적으로, 발명은 인간-대-인간 전염시킬 수 있는 스트레인에 대해 보호하고, 그로써 그 스트레인의 게놈은 통상 포유류(예컨대 인간) 인플루엔자 바이러스에서 기원된 적어도 하나의 RNA 분절을 포함할 것이다. 그것은 조류 인플루엔자 바이러스에서 기원된 NS 분절을 포함할 수 있다.
헤마글루티닌(HA)은 비활성화된 인플루엔자 백신의 주요 면역원이고, 백신 용량은 HA 수준을 참조하여, 전형적으로 단일 방사상 면역확산(SRID) 분석에 의해 측정되는 것과 같이 표준화된다. 백신은 전형적으로 스트레인당 약 15 μg의 HA를 함유하지만, 저용량 또한, 예컨대 아동에 대해, 또는 유행병 상황에서 사용된다. ½(즉 스트레인당 7.5 μg의 HA), ¼ 및 ⅛과 같은 부분 용량이 고용량(예컨대 3x 또는 9x 용량(참고문헌 66 및 67))과 같이, 사용되었다(참고문헌 64 및 65). 그러므로 백신은 인플루엔자 스트레인당 0.1 내지 150 μg의 HA, 바람직하게는 0.1 내지 50 μg, 예컨대 0.1 내지 20 μg, 0.1 내지 15 μg, 0.1 내지 10 μg, 0.1 내지 7.5 μg, 0.5 내지 5 μg, 등을 포함할 수 있다. 특정 용량은 스트레인당 예컨대 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5 μg 등을 포함한다. 이들 저용량은 보조제가 백신에 존재할 때 가장 유용하다. 발명의 백신, 키트 및 방법의 성분들(예컨대 그것들의 부피 및 농도)은 최종 제품에 이들 항원 용량을 제공하기 위해 선택될 수 있다.
살아있는 백신에 대해, 용량은 HA 함량보다는 중간 조직 배양 감염성 용량(TCID50)에 의해 측정되고, 스트레인당 106 내지 108(바람직하게는 106.5 내지 107.5)의 TCID50이 전형적이다.
발명과 함께 사용된 HA는 바이러스에서 발견된 대로의 자연 HA이거나, 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 조류 종에서 고도로 병원성일 바이러스를 유발하는 결정기(예컨대 HA1과 HA2 사이의 절단 부위 주변의 과-염기성 영역)를, 이들 결정기가 그렇지 않으면 난에서 바이러스가 성장되는 것을 방해할 수 있기 때문에, 제거하기 위해 HA를 변형시키는 것이 알려져 있다.
조성물은 특히 스플릿 또는 표면 항원 백신에 대해 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('트윈'으로 알려짐), 옥톡시놀(예컨대 옥톡시놀-9(트리톤 X-100) 또는 t 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드('CTAB') 또는 데옥시콜산 나트륨을 포함할 수 있다. 계면활성제는 미량으로만 존재할 수 있다. 그러므로 백신은 옥톡시놀 10, α-토코페릴 하이드로겐 석시네이트 및 폴리소르베이트 80의 각각을 1 mg/ml 미만으로 포함할 수 있다. 미량 중의 다른 잔류 성분들은 항생물질일 수 있다(예컨대 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B).
비활성화된, 그러나 비-전체 세포 백신(예컨대 스플릿 바이러스 백신 또는 정제된 표면 항원 백신)은 이 항원 내에 위치한 추가의 T 세포 에피토프로부터 유익을 얻기 위해 매트릭스 단백질을 포함할 수 있다. 그러므로 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함하는 비-전체 세포 백신(특히 스플릿 백신)은 추가로 M1 및/또는 M2 매트릭스 단백질을 포함할 수 있다. 매트릭스 단백질이 존재하는 경우에, 검출 가능한 수준의 M1 매트릭스 단백질의 포함이 바람직하다. 핵단백질이 또한 존재할 수 있다.
제1 인플루엔자 백신의 항원은 전형적으로 인플루엔자 비리온으로부터 제조되겠지만, 대안으로서, 헤마글루티닌과 같은 항원이 재조합 숙주에서(예컨대 플라스미드 발현 시스템을 사용하여 효모에서, 또는 배큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포 주에서) 발현될 수 있고 정제된 형태로 사용될 수 있다(참고문헌 68 및 69). 그러나, 일반적으로 항원들은 비리온으로부터 유래할 것이다.
제약학적 조성물
발명과 함께 사용된 백신들은 제약학적으로 허용된다. 그것들은 항원과 보조제 외에 성분들을 포함할 수 있다, 예컨대 그것들은 전형적으로 하나 이상의 제약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함할 것이다. 그런 성분들의 철저한 논의는 참고문헌 70에서 활용된다. 점막 백신에서 사용된 담체(들)/부형제(들)은 비경구 백신에서 사용된 것들과 동일하거나 상이할 수 있다.
조성물은 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 백신은 실질적으로 수은 물질이 없어야(즉 5 μg/ml 미만) 하고, 예컨대 티오메르살이 없어야 한다(참고문헌 8 및 71). 수은을 함유하지 않는 백신이 보다 바람직하다.
특히 주사용 백신의 등장성을 제어하기 위하여, 생리적 염, 예컨대 나트륨 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화 나트륨(NaCl)이 바람직하고, 그것은 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화 칼륨, 이수소 인산 칼륨, 인산 이나트륨 탈수화물, 염화 마그네슘, 염화 칼슘 등을 포함한다.
주사용 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240 내지 360 mOsm/kg, 더 바람직하게는 290 내지 310 mOsm/kg의 범위에 속하는 오스몰 농도를 가질 것이다. 오스몰 농도는 백신접종에 의해 유발된 통증에 영향을 미치지 않는 것으로 앞서 보고되었지만(참고문헌 72), 그럼에도 불구하고 이 범위로 오스몰 농도를 유지하는 것이 바람직하다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제는 포스페이트 완충제; Tris 완충제; 보레이트 완충제; 석시네이트 완충제; 히스티딘 완충제; 또는 시트레이트 완충제를 포함한다. 완충제는 전형적으로 5 내지 20 mM 범위로 포함될 것이다.
조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1. 보다 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다. 그러므로 발명의 방법은 포장 전에 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.
조성물은 바람직하게는 멸균된다. 조성물은 바람직하게는 발열원이 없다, 예컨대 용량당 <1 EU(내독소 유닛, 표준 측정), 바람직하게는 용량당 <0.1 EU를 함유한다. 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.
조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함하거나 다중 면역화를 위한 물질(즉 '다중' 키트)를 포함할 수 있다. 보존제의 포함이 다중용량 배열에 바람직하다. 다중용량 조성물에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안 으로서(또는 또한), 조성물은 물질의 제거를 위한 무균성 어댑터를 가진 용기에 함유될 수 있다.
인플루엔자 백신은 전형적으로 약 0.5 ml의 단위용량 부피로 투여되지만, 절반의 부피(즉 약 0.25 ml)가 아동에게 투여될 수 있다. 비강내 투여를 위해, 이 총 단위용량 부피는 콧구멍 사이에서, 예컨대 각 콧구멍에서 나누어질 수 있다.
조성물 및 키트는 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 보관된다. 전형적으로, 그것들은 냉동되지 않아야 한다. 그것드른 이상적으로 직사광 외에서 유지되어야 한다.
조성물 또는 키트 성분의 포장
발명의 조성물에 적합한 용기(또는 키트 성분)는 바이알, 주사기(예컨대 일회용 주사기), 비강용 시럽 등을 포함한다. 이들 용기는 멸균되어야 한다.
조성물/성분이 바이알에 위치된 경우에, 바이알은 바람직하게는 유리 또는 플라스틱 물질로 만들어진다. 바이알은 바람직하게는 조성물이 그것에 첨가되기 전에 멸균된다. 라텍스 민감성 환자들이 가진 문제를 피하기 위하여, 바이알은 바람직하게는 라텍스-유리 스톱퍼로 밀봉되고, 모든 포장 물질에서 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 바이알은 백신의 단일 용량을 포함하거나, 또는 하나 이상의 용량('다중용량' 바이알), 예컨대 10 용량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 만들어진다.
바이알은 캡(예컨대 Luer 락)을 가질 수 있어서 사전에 충전된 주사기가 캡에 삽입될 수 있고, 주사기의 내용물이 바이알 안으로 밀려날 수 있으며(예컨대 그 안에서 동결건조된 물질을 복원시키기 위하여), 바이알의 내용물이 주사기 안으로 다시 제거될 수 있다. 바이알로부터 주사기가 제거된 후, 바늘이 다음에 부착되고 조성물이 환자에게 투여될 수 있다. 캡은 바람직하게는 밀봉 또는 커버 내부에 위치하여서, 밀봉 또는 커버가 제거된 후에 캡이 접근할 수 있어야 한다. 바이알은, 특히 다중용량 바이알에 대해 그것의 내용물의 무균성 제거를 허용하는 캡을 가질 수 있다.
조성물/성분이 주사기 안에 포장되는 경우에, 주사기는 정상적으로는 그것에 부착된 바늘을 갖지 않겠지만, 조립 및 사용을 위해 별도의 바늘이 주사기에 공급될 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 주사기에는 기록 유지를 용이하게 하기 위해, 그 위에 롯트 번호, 인플루엔자 계절 및 내용물의 유효기한이 인쇄될 수 있는 박리성 표지가 제공될 수 있다. 주사기의 플런저는 바람직하게는 흡인 중에 플런저가 우연히 제거되는 것을 방지하기 위한 스톱퍼를 가진다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 일회용 주사기는 단일 용량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘이 부착되기 전에 팁을 밀봉하기 위해 팁 캡을 가지며, 팁 캡은 바람직하게는 부틸 고무로 만들어진다. 만약 주사기 및 바늘이 별도로 포장된다면 바늘은 바람직하게는 부틸 고무 쉴드에 꼭 맞는다. 바람직한 주사기는 상표명 "Tip-Lok"TM으로 시판되는 것들이다.
용기들은 절반 용량 부피를 나타내기 위해, 예컨대 아동에게의 전달을 용이하게 하기 위해 표시될 수 있다. 예를 들어, 0.5 ml의 용량을 함유하는 주사기는 0.25 ml 부피를 나타내는 표시를 가질 수 있다.
유리 용기(예컨대 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우라면, 소다 석회 유리로 만들어진 것보다는 보로실리케이트 유리로 만들어진 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
키트 또는 조성물은 백신의 상세한 설명을 포함한 전단지, 예컨대 투여, 백신 내 항원의 상세한 설명 등을 위한 설명서와 함께(예컨대 동일한 박스에) 포장될 수 있다. 설명서는 또한 예컨대 백신접종 후 아나필락시스 반응의 경우에 쉽게 활용할 수 있는 아드레날린의 용액을 유지하기 위한 경고 등을 함유할 수 있다.
치료, 및 백신의 투여 방법
발명의 방법 및 사용에 의해 발생된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함할 것이다. 인플루엔자 바이러스 백신접종 후 항체 반응, 중화 용량 및 보호를 평가하기 위한 방법들은 기술분야에 잘 알려져 있다. 인간 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체 역가를 나타낸 인간 연구들은 보호와 상관이 있다(약 30 내지 40의 혈청 샘플 적혈구 응집-억제 역가는 상동성 바이러스에 의한 감염으로부터 대략 50%의 보호를 제공한다)(참고문헌 73). 항체 반응은 전형적으로 적혈구 응집 억제에 의해, 미세중화에 의해, 단일 방사상 면역확산(SRID)에 의해 및/또는 단일 방사상 용혈(SRH)에 의해 측정된다. 이들 분석 기법은 기술분야에 잘 알려져 있다.
백신의 점막 투여를 위해, 사용될 수 있는 경로로는, 한정하는 것은 아니지만, 직장, 경구(예컨대 정제, 분무), 인두, 볼, 질, 국소, 경피 또는 피부를 통한, 비강 내, 눈의, 폐, 등을 포함한다. 상기에서 언급된 것과 같이, 바람직한 점막 투여 경로는 비강내 주사에 의한 것이다. 비강 투여는, 예컨대 분무, 적하, 에어로졸, 등에 의한 것일 수 있다.
백신의 비경구 투여를 위해, 사용될 수 있는 경로로는, 한정하는 것은 아니지만, 근육내 주사, 피하 주사, 정맥내 주사, 복막내 주사(활용할 수 있는 경우에), 피내 주사 등과, 다른 전신적인 경로를 포함한다. 상기에서 언급된 것과 같이, 바람직한 비경구 투여 경로는 근육내 주사(예컨대 팔 또는 다리에)에 의한 것이다.
발명에 따르는 투여 처방은 아동 및 성인 둘 다를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재, 6개월부터의 소아 및 성인 면역화에 사용하기 위해 권고된다. 그러므로 환자는 1세 미만, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신을 수령하기에 바람직한 환자들은 노인(예컨대 ≥50세, ≥60세, 바람직하게는 ≥65세), 젊은이(예컨대 ≤5세), 입원 환자, 건강관리 종사자들, 군인 및 군 인력, 임산부, 만성 질환자, 면역결핍 환자, 백신을 받기 전 7일 전에 항바이러스 화합물(예컨대 오셀타미비어 또는 자나미비어 화합물; 하기 참조)을 취한 적이 있는 환자, 난 알레르기가 있는 사람 및 해외 여행중인 사람이다. 그러나 백신은 이들 그룹에 대해 단독으로는 적합하지 않고, 보다 일반적으로는 집단에 사용될 수 있다. 유행성 스트레인에 대해서는, 모든 연령 그룹에의 투여가 바람직하다.
미스매치된 항원을 함유하는 종래의 백신은 특히 "고-위험"한 것으로 여겨진 개체들에 대해 제한된 보호만을 제공할 수 있다(예를 들면 http://www.cdc.gov/flu/about/disease/high_risk.htm 참조). 고-위험 개체는 전형적으로 더 심각한 감염, 이차 감염에 더 민감한데, 둘 다 더 큰 발생률 및 더 긴 입원 기간 및/또는 사망을 나타낸다. 고-위험 개체는 또한 바이러스에 더 쉽게 노출되는 사람들을 포함한다. 예를 들어, 고-위험 환자는 =65세, ≤5세(보다 바람직하게는 ≤2세) 환자들, 입원 환자, 건강관리 종사자, 군인 및 군 인력, 임산부, 만성 질환자, 면역결핍 환자, 및 백신을 받기 전 7일 전에 항바이러스 화합물을 취한 적이 있는 환자들로부터 선택된다. 본원에 제공된 백신 및 방법은 그런 고-위험 환자들에서 면역-보호를 제공하기에 유용하다. 따라서, 발명은 환자에게 본원에 기술된 구체예들 중 임의의 한 구체예의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 면역시키는 방법을 포함하고, 여기서 환자는 고-위험 환자이다.
발명의 바람직한 조성물은 인간 사용을 위한 의료 제품에 대한 유럽 위원회(European Committee for Medicinal Products for Human Use)(CHMP, 이전에는 CPMP로 알려짐)의 1, 2 또는 3개의 효능을 위한 기준을 만족시킨다. 성인(18 내지 60세)에서 이들 기준은 (1) ≥70% 혈청보호; (2) ≥40% 혈청변환; 및/또는 (3) ≥2.5-배의 GMT 증가이다. 노인(>60세)에서, 이들 기준은 (1) ≥60% 혈청보호; (2) ≥30% 혈청변환; 및/또는 (3) ≥2-배의 GMT 증가이다. 이들 기준은 적어도 50명의 환자들을 사용한 개방 표지 연구를 기반으로 한다. CHMP 기준에 따라, 항-HA 항체 반응에 대한 혈청변환율은 ≥1:40의 보호성 후-백신접종 역가를 가지는 각 그룹의 대상체들의 비율로서 규정된다. 혈청변환율은 백신접종 전 <1:10 및 백신접종 후 ≥1:40의 HI 역가를 가지는 대상체들의 %이다. 그러나, 만약 초기 역가가 ≥1:10이면 백신접종 후 항체의 양에 적어도 4배의 증가가 있을 필요가 있다.
다르게는, 또는 또한, 발명의 바람직한 조성물은 생물학적 평가 및 연구 센터(CBER)에 의해 인플루엔자 백신에 대해 수립된 면역학적 기준 중 1 또는 2가지를 만족시킨다. 성인(18 내지 64세)에서, 이들 기준은 (1) ≥1:40의 HI 항체 역가를 이루는 대상체의 %가 ≥70%이어야 할 것; (2) ≥40% 혈청변환이다. 노인(>64세)에서, 이들 기준은 (1) ≥1:40의 HI 항체 역가를 이루는 대상체의 %가 ≥60%이어야 할 것; (2) ≥30% 혈청변환이다. CBER 기준에 따라, 혈청변환율은 a) ≥40% 혈청변환율의 기준선 역가를 가진 대상체에 대해 4-배 이상의 상승; 또는 b) <1:10의 기준선 역가를 가진 대상체에 대해, ≥1:40의 상승으로서 규정된다. 이들 기준은 참값에 대해 95% CI의 하부 경계선에서 충족되어야 한다.
종점은 백신접종 후 3주째에(예컨대 22일에) 측정될 수 있다(2-용량 투여 스케줄로, 이것은 전형적으로 제2 용량 후에 계산된다).
동일한(예컨대 성인) 기준은 소아 환자 그룹(예컨대 <18세)에 대해 좌우될 수 있다.
상기 언급된 "통계학적으로 허용되는" 면역 반응이 주어진 조성물에 의해 제공되는지의 여부를 평가하는 것은 숙련된 사람들의 정상적인 능력 범위 내에 있다. 통계학적으로 허용되는 반응은 예를 들면 CHMP 또는 CBER 기준에 따라 증명된 면역원성이어서 상기 기준 중 적어도 하나는 참값에 대해 95% CI의 하부 경계선에서 충족될 수 있다.
발명에 따라 투여된 백신은 동일한 인플루엔자 계절 중에 투여된다. 북반구에서 인플루엔자 계절은 전형적으로 10월에서 5월까지 지속되고 이때 인플루엔자 활성은 12월과 2월 사이에 피크를 이룬다. 남반구에서, 인플루엔자 계절은 5월에 시작하여 7월에 피크를 나타내고 10월에 끝난다. 제2 인플루엔자 백신은 제1 인플루엔자 백신 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 5개월 내에 투여될 수 있다. 바람직하게, 제2 인플루엔자 백신은 제1 인플루엔자 백신 후 3개월 내에 투여된다.
백신은 다른 백신과 실질적으로 동일한 시간에(예컨대 동일한 의료 상담 중에 또는 건강관리 전문의 또는 백신접종 센터에 방문할 때), 예컨대 홍역 백신, 유행성 이하선염 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 바리셀라 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 콘쥬게이트된 H. 인플루엔자(H.influenzae) b형 백신, 비활성화된 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막염구균성 콘쥬게이트 백신(예컨대 4가 A C W135 Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균성 콘쥬게이트 백신 등과 실질적으로 동시에 환자에게 투여될 수 있다. 폐렴구균성 백신 및/또는 수막염구균성 백신과 실질적으로 동시에 투여하는 것이 노인 환자에게 특히 유용하다.
유사하게, 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 활성인 항바이러스 화합물(예컨대 오셀타미비어 및/또는 자나미비어)과 실질적으로 동시에 환자에게 투여될 수 있다. 이들 항바이러스제는 뉴라미니다제 억제제, 예컨대(3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥센-1-카르복실산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-무수-3,4,5-트라이데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산과, 그것들의 에스테르(예컨대 에틸 에스테르) 및 염(예컨대 포스페이트 염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스제는 오셀타미비어 포스페이트(TAMIFLUTM)로서도 알려져 있는(3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥센-1-카르복실산, 에틸 에스테르, 포스페이트(1:1)이다.
용어 "백신 유효성"(또는 "VE")는 독감 백신에 의해 제공된 위험의 감소를 나타낸다. 예를 들어, 미국에서, 질병통제센터(CDC) 백신 유효성 연구는 통상적으로 결과적으로 의사의 방문 또는 응급조치 방문을 초래하는 실험실 확인된 독감 질병을 측정한다. 이 결과에 대해, 50%의 VE 포인트 추정치는 독감 백신이 의사의 진료실 또는 응급조치 제공자에게의 방문을 초래하는 독감 질병을 한 사람이 발생시킬 위험을 50% 감소시키는 것을 의미한다. VE를 측정하는 것은 숙련자의 정상적인 능력 범위 내에 있다. VE는 US CDC와 같은 규제 기관에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, VE는 선행 기술(참고문헌 111)에서 기술된 방법을 사용하여 측정될 수 있는데, 그 방법에서 VE(%)는 [1-조정된OR]x100으로서 계산되고, 여기서 OR은 백신접종된 대비 비-백신접종된 대상체에서 의학적으로 약화된, 실험실 확인된 인플루엔자에 대한 추정된 오즈비(odds ratio)이다. 추정된 조정된OR은 임상적으로 관련된 교란 요인에 대한 조정을 포함한 로지스틱 회귀에 의해 측정될 수 있다. 이전 VE 분석마다, 공변량은 연령, 동방이환율, 지역, 시편 수집 주(week) 및 인플루엔자-유사 질병(ILI) 개시와 시편 수집 사이의 간격을 포함한다.
보조제(들)
제1 및/또는 제2 인플루엔자 백신(들)은 보조제가 첨가되지 않거나, 보조제와 함께 투여될 수 있다. 보조제(들)은 조성물을 받는 환자에서 유도된 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 증대시키는 기능을 할 수 있다. 일부 보조제는 비경구 투여에는 효과적이지만 점막 투여(예컨대 알루미늄 염)에는 그렇지 않으며, 그 역도 가능하지만, 일부 보조제는 두 경로에 대해 모두 효과적이다. 보조제가 사용되는 경우에 그것들은 그에 맞춰 선택될 것이다.
수-중-유 에멀션 보조제
수-중-유 에멀션은 인플루엔자 바이러스 백신을 보조하는 데 사용하기에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 다양한 그런 에멀션이 공지되어 있고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하며, 이때 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생체분해성(대사 가능한) 및 생체적합성인 것들이다. 에멀션 중의 오일 방울은 일반적으로 직경이 5 μm 미만이고, 심지어 마이크론 미만의 직경을 가질 수 있으며, 이들 작은 크기는 미세유동화기를 사용하여 이루어져서 안정한 에멀션을 제공한다. 220 nm 미만의 크기를 가진 방울들이 바람직한데 그것들이 필터 멸균이 수행될 수 있기 때문이다.
바람직한 구체예에서, 에멀션은 균일하다. 균일한 에멀션은 그 안에 분산된 대부분의 방울들(입자들)이 명시된 크기 범위(예컨대 직경으로) 내에 있는 것을 특징으로 한다. 명시된 입자 크기의 적합한 범위는, 예를 들면 50 내지 220 nm, 50 내지 180 nm, 80 내지 180 nm, 100 내지 175 nm, 120 내지 185 nm, 130 내지 190 nm, 135 내지 175 nm, 150 내지 175 nm이다. 일부 구체예에서, 균일한 에멀션은 ≤10%의 명시된 직경 범위 밖에 있는 방울들(입자들)의 수를 함유한다. 일부 구체예에서, 수-중-유 에멀션 제제 중의 오일 방울들의 평균 입자 크기는 동적 광산란에 의해 측정되는 바 135 내지 175 nm, 예컨대 155 nm ± 20 nm이고, 그런 제제는 광학 입자 감작에 의해 측정되는 바, 제제의 mL당 1 x 107 이하의 큰 입자들을 함유한다. 본원에서 사용된 "큰 입자"는 >1.2 μm, 전형적으로 1.2 내지 400 μm의 직경을 가지는 것들을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 균일한 에멀션은 10% 미만, 5% 미만 또는 3% 미만의, 바람직한 크기 범위 밖에 속하는 방울들을 함유한다. 일부 구체예에서, 수-중-유 에멀션 제제 중의 입자들의 평균 방울 크기는 125 내지 185 nm, 예컨대 약 130 nm, 약 140 nm, 약 150 nm, 약 155 nm, 약 160 nm, 약 170 nm, or 약 180 nm이고, 수-중-유 에멀션은 제제의 방울 수의 5% 미만이 125 내지 185 nm 범위 밖에 속한다는 점에서 균일하다.
발명은 동물(예컨대 어류) 또는 식물성 공급원으로부터의 오일과 같은 오일로 사용될 수 있다. 식물성 오일에 대한 공급원은 견과류, 씨 및 곡물을 포함한다. 가장 흔하게 이용할 수 있는 땅콩 기름, 대두유, 코코넛유 및 올리브유가 견과류 오일을 대표한다. 호호바 오일, 예컨대 호호바 콩으로부터 얻어진 것이 사용될 수 있다. 종자유는 홍화유, 면실유, 해바라기씨 기름, 참기름 등을 포함한다. 곡물 그룹에서, 옥수수유가 가장 쉽게 이용될 수 있지만, 다른 곡물, 예컨대 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등의 오일 또한 사용될 수 있다. 종자유에서 자연적으로 발생하지 않는, 글리세롤 및 1,2-프로판다이올의 6 내지 10 탄소 지방산 에스테르가 견과류 및 종자유로부터 출발하여 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유류의 젖으로부터의 지방 및 오일은 대사 가능하고, 따라서 본 발명의 실시예 사용될 수 있다. 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 얻는데 필요한 분리, 정제, 사포닌화 및 다른 수단에 대한 과정들이 기술분야에 잘 알려져 있다. 대부분의 어류는 쉽게 회수될 수 있는 대사 가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구 간유, 상어 간유 및 고래 오일, 예컨대 경뇌는 본원에서 사용될 수있는 여러 어류 오일을 예시한다. 많은 분지쇄 오일이 5-탄소 아이소프렌 단위로 생화학적으로 합성되고 일반적으로 테르페노이드로 언급된다. 상어 간유는 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산으로 알려져 있는 분지되, 불포화 테르페노이드를 함유하고, 그것이 본원에서 특히 바람직하다. 스쿠알렌에 대한 포화 유사체인 스쿠알란이 또한 바람직한 오일이다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하여, 어류 오일은 상업적인 공급원으로부터 쉽게 이용할 수 있거나 기술분야에 공지된 방법들에 의해 얻을 수 있다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다(하기 참조). 오일 혼합물이 사용될 수 있다.
계면활성제는 그것들의 "HLB"(친수성/친유성 균형)에 의해 분류될 수 있다. 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 보다 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 가진다. 발명은 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함하는 계면활성제들로 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(통상 트윈으로 언급됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAXTM 상표명으로 시판되는, 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO) 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 공중합체, 예컨대 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복되는 에톡시(옥시-1,2-에탄다이일)의 수가 다를 수 있는 옥톡시놀, 옥톡시놀-9(트리톤 X-100 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)가 특히 관심있음; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로서 알려짐), 예컨대 트라이에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르(통상 SPAN으로 알려짐), 예컨대 소르비탄 트라이올레에이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀션에 포함시키기 위한 바람직한 계면활성제는 트윈 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), Span 85(소르비탄 트라이올레에이트), 레시틴 및 트리톤 X-100이다.
계면활성제들의 혼합물, 예컨대 트윈 80/Span 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(트윈 80)와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100)과 같은 옥톡시놀의 조합이 또한 적합하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9 플러스 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.
계면활성제의 바람직한 양(중량%)은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예컨대 트윈 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대 트리톤 X-100 또는 트리톤 계열의 다른 계면활성제) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대 라우레스 9) 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%이다.
가장 바람직한 수-중-유 에멀션은 수-중-스쿠알렌 에멀션, 바람직하게는 마이크론 미만의 수-중-스쿠알렌 에멀션이다.
발명에 유용한, 특이적인 수-중-유 에멀션 보조제는 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함한다:
스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트라이올레에이트의 마이크론 미만의 에멀션: 부피에 의한 에멀션의 조성은 약 5%의 스쿠알렌, 약 0.5%의 폴리소르베이트 80 및 약 0.5%의 소르비탄 트라이올레에이트일 수 있다. 중량 관점에서, 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% 소르비탄 트라이올레에이트이다. 에멀션은 시트레이트 이온, 예컨대 10 mM 소디움 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다. 시트레이트 이온은 수성 상으로 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 부피에 의한 에멀션의 조성은 약 4.6%의 스쿠알렌, 약 0.45%의 폴리소르베이트 80 및 약 0.5%의 소르비탄 트라이올레에이트일 수 있다. "MF59"(참고문헌 74 내지 76 및 133)로 알려진 보조제가 참고문헌 133의 10장 및 참고문헌 77의 12장에서 더 상세하게 기술된다. 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트라이올레에이트는 9750:1175:1175의 중량비로 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 에멀션은 RP-HPLC에 의해 측정되는 바 36 내지 42 mg/ml의 스쿠알렌; RP-LC에 의해 측정되는 바 4.1 내지 5.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80; 및 RP-LC에 의해 측정되는 바 4.1 내지 5.3 mg/ml의 소르비탄 트라이올레에이트를 함유할 수 있다. 약 39 mg/mL의 스쿠알렌, 약 4.7 mg/mL의 폴리소르베이트 80 및 약 4.7 mg/mL의 소르비탄 트라이올레에이트의 농도가 전형적이다. 일부 구체예에서, 동적 광산란에 의해 측정되는 바, 155 ± 20 nm의 평균 입자 크기가 바람직하다. 155 내지 185 nm의 Z-평균 방울 크기가 바람직한데 이때 다중분산도는 <0.2이다. 바람직하게, 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트라이올레에이트를 포함하는 마이크론 미만의 에멀션은 균일하다(상기 참조).
스쿠알렌, 토코페롤 및 트윈 80의 에멀션: 에멀션은 포스페이트 완충된 식염수를 포함할 수 있다. 그것은 또한 Span 85(예컨대 1%로) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이들 에멀션은 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 트윈 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 바람직하게는 <1인데, 이것이 보다 안정한 에멀션을 제공하기 때문이다. 스쿠알렌 및 트윈 80은 약 5:2의 부피비로 존재할 수 있다. 한 가지 그런 에멀션은 트윈 80을 PBS에 용해시켜서 2% 용액을 제공한 후, 90 ml의 이 용액을 (5 g의 DL-α-토코페롤과 5 ml의 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합한 후, 그 혼합물을 미세유동화함으로써 만들어질 수 있다. 그 결과의 에멀션은 마이크론 미만, 예컨대 100 내지 250 nm, 바람직하게는 약 150 내지 180 nm, 예컨대 약 150 nm, 약 160 nm, 약 170 nm 또는 약 180 nm의 평균 직경을 가지는 오일 방울을 가질 수 있다.
스쿠알렌, 토코페롤 및 트리톤 계면활성제의 에멀션: 에멀션은 3d MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀션의 트리톤 계면활성제는 트리톤 X-100일 수 있다. 토코페롤은 α-토코페롤일 수 있다. 에멀션은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
폴리소르베이트(예컨대 폴리소르베이트 80), 트리톤 계면활성제(예컨대 트리톤 X-100) 및 토코페롤(예컨대 α-토코페롤 석시네이트)를 포함하는 에멀션: 에멀션은 이들 세 가지 성분을 약 75:11:10의 질량비로 포함할 수 있고(예컨대 750 μg/ml의 폴리소르베이트 80, 110 μg/ml의 트리톤 X-100 및 100 μg/ml의 α-토코페롤 석시네이트), 이들 농도는 항원으로부터의 이들 성분의 임의의 기여를 포함해야 한다. 에멀션은 폴리소르베이트 80, X-100 및 α-토코페롤 석시네이트를 포함할 수 있다. 에멀션은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀션은 또한 3d MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 수성 상은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401("플루로닉 TM L121")의 에멀션: 에멀션은 포스페이트 완충괸 식염수, pH 7.4에 제형될 수 있다. 이 에멀션은 뮤라밀 다이펩타이드에 대한 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1" 보조제에서 트레오닐 MDP와 함께 사용될 수 있다(참고문헌 78) (0.05 내지 1%의 Thr MDP, 5%의 스쿠알란, 2.5%의 플루로닉 L121 및 0.2%의 폴리소르베이트 80). 그것은 또한 "AF" 보조제에서와 같이 Trh MDP 없이 사용될 수 있다(참고문헌 79) (5%의 스쿠알란, 1.25%의 플루로닉 L121 및 0.2%의 폴리소르베이트 80). 미세유동화가 바람직하다.
0.5 내지 50%의 오일, 0.1 내지 10%의 인지질 및 0.05 내지 5%의 비-이온성 계면활성제를 가지는 에멀션: 참고문헌 80에서 기술된 것과 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디올리핀이다. 마이크론 미만의 방울 크기가 유익하다.
비-대사성 오일(예컨대 경광물유) 및 적어도 하나의 계면활성제(예컨대 레시틴, 트윈 80 또는 Span 80)의 마이크론 미만의 수-중-유 에멀션: 첨가제, 예컨대 QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 콘쥬게이트(예컨대, 참고문헌 81에 기술되고 지방족 아민의 글루쿠론산의 카르복실기를 통한 데스아실사포닌에의 첨가에 의해 생성된 GPI-0100), 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-다이옥타데실-N,N-비스 (2-하이드록시에틸)프로판다이아민이 포함될 수 있다.
사포닌(예컨대 QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예컨대 콜레스테롤)이 나선형 미셸로서 회합되어 있는 에멀션: 사포닌은 QuilA 및/또는 QS21일 수 있고, 스테롤은 스테롤은 콜레스테롤일 수 있다(참고문헌 82).
미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화된 지방 알코올 및 비-이온성 친수성 계면활성제를 포함하는 에멀션: 에멀션은 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체를 포함할 수 있다(참고문헌 83).
미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화된 지방 알코올 및 비-이온성 친수성 계면활성제를 포함하는 에멀션: 에멀션은 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체를 포함할 수 있다(참고문헌 83).
발명에 따라서, 에멀션은 전달시에 항원과 즉석에서 혼합될 수 있다. 그러므로 보조제 및 항원은 사용시점에 최종 제형을 위해 준비되어 있는, 포장된 또는 분배된 백신에 별도로 유지될 수 있다. 항원은 일반적으로 수성 형태로 있어서, 백신은 두 액체를 혼합함으로써 최종적으로 제조된다. 혼합에 대한 두 액체의 부피비는 다를 수 있지만(예컨대 5:1 내지 1:5) 일반적으로는 약 1:1이다.
항원과 보조제가 혼합된 후, 헤마글루티닌 항원이 일반적으로 수용액으로 남아 있지만 그 자체는 오일/물 계면 주변에 분포할 수 있다. 일반적으로, 임의의 헤마글루티닌이 있다면 에멀션의 오일상으로 거의 유입되지 않을 것이다.
조성물이 토코페롤을 포함하는 경우에, α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤 중 임의의 것이 사용될 수 있지만, α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 여러 형태, 예컨대 상이한 염 및/또는 이성질체를 취할 수 있다. 염은 유기 염, 예컨대 석시네이트, 아세테이트, 니코티네이트 등을 포함한다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤 둘 다 사용될 수 있다. 토코페롤은 유익하게도 노인 환자(예컨대 60세 이상, 61세 이상, 65세 이상의 노인, 등)에게 사용하기 위한 백신에 포함되는데, 비타민 E가 이 환자 그룹에서 면역 반응에 포지티브 효과를 나타내는 것으로 보고되었기 때문이다(참고문헌 84). 그것은 또한 에멀션 안정화를 도울 수 있는 항산화제 특성을 가진다(참고문헌 85). 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이고, 이 토코페롤의 바람직한 염은 석시네이트이다. 석시네이트 염은 생체 내에서 TNF-관련 리간드와 협력하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, α-토코페롤 석시네이트는 인플루엔자 백신과 부합하고 수은 화합물에 대한 대안으로서 유용한 보존제인 것으로 알려진다(참고문헌 8). 보존제-없는 백신이 특히 바람직하다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드
면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 변형과 같은 뉴클레오타이드 변형/유사체를 포함할 수 있고 이중-가닥 또는(RNA 제외) 단일-가닥일 수 있다. 참고문헌 86, 87 및 88은 가능한 유사체 치환, 예컨대 구아노신의 2'-데옥시-7-데아자구아노신으로의 대체를 개시한다. CpG 올리고뉴클레오타이드의 보조제 효과는 추가로 참고문헌 89 내지 94에서 논의된다. CpG 서열은 TLR9, 예컨대 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT 에 대해 지시될 수 있다(참고문헌 95). CpG 서열은 Th1 면역 반응, 예컨대 CpG-A ODN(올리고데옥시뉴클레오타이드)을 유도하는 데 특이적이거나, 또는 B 세포 반응, 예컨대 CpG-B ODN을 유도하는 데 더 특이적일 수 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고문헌 96 내지 98에서 논의된다. 바람직하게, CpG는 CpG-A ODN이다. 바람직하게, CpG 올리고뉴클레오타이드는 5' 단부가 수용체 인식을 위해 접근 가능하도록 구성된다. 선택적으로, 두 CpG 올리고뉴클레오타이드 서열은 그것들의 3' 단부에서 부착되어 "이뮤노머(immunomer)"를 형성할 수 있다. 예를 들면 참고문헌 95 및 99 내지 101 참조. 유용한 CpG 보조제는 ProMuneTM(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)으로도 알려져 있는 CpG7909이다.
CpG 서열을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 또는 또한, TpG 서열이 사용될 수 있다(참고문헌 102). 이들 올리고뉴클레오타이드는 메틸화되지 않은 CpG 모티프가 없을 수 있다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 피리미딘이 풍부할 수 있다. 예를 들어, 그것은 하나 이상의 구성성 티미딘 뉴클레오타이드(예컨대 참고문헌 102에서 개시된 TTTT)를 포함할 수 있고, 및/또는 >25% 티미딘(예컨대 >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등)을 가진 뉴클레오타이드 조성을 가질 수 있다. 예를 들어, 그것은 하나 이상의 구성성 시토신 뉴클레오타이드(예컨대 참고문헌 102에서 개시된 CCCC)를 포함할 수 있고, 및/또는 >25% 시토신(예컨대 >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등)을 가진 뉴클레오타이드 조성을 가질 수 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 메틸화되지 않은 CpG 모티프가 없을 수 있다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 그것들은 100개보다 적은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
3 탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A
3dMPL(3 탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A 또는 3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A로도 알려짐)은 모노포스포릴 지질 A의 환원 단부 글루코사민의 위치 3이 탈-아실화되어 있는 보조제이다. 3dMPL은 살모넬라 미네소타의 헵토오스가 없는 돌연변이체로부터 제조되었고, 화학적으로는 지질 A와 유사하지만 산-가변성 포스포릴기 및 염기-가변성 아실기가 없다. 그것은 단핵세포/대식세포 계통의 세포들을 활성화하고 IL-1, IL-12, TNF-α 및 GM-CSF를 포함하여 여러 사이토킨의 방출을 자극한다(또한 참고문헌 103 참조). 3dMPL의 제조는 원래 참고문헌 104에서 기술되었다.
3dMPL은 아실화에 의해 달라지는(예컨대 상이한 길이의 것일 수 있는 3, 4, 5 또는 6개의 아실 사슬을 가지는), 관련된 분자들의 혼합물 형태를 취할 수 있다. 두 글루코사민(2-데옥시-2-아미노-글루코오스로도 알려짐) 단당이 그것들의 2-위치 탄소(즉 위치 2 및 2')에서 N-아실화되고, 또한 3' 위치에는 O-아실화가 있다. 탄소 2에 부착된 기는 식 -NH-CO-CH2-CR1R1'를 가진다. 탄소 2'에 부착된 기는 식 -NH-CO-CH2-CR2R2'를 가진다. 탄소 3'에 부착된 기는 식 -O-CO-CH2-CR3R3'를 가진다. 대표적인 구제는
Figure pct00001
이다.
기 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 -(CH2)n-CH3이다. n의 값은 바람직하게는 8 내지 16, 보다 바람직하게는 9 내지 12이며, 가장 바람직하게는 10이다.
기 R1', R2' 및 R3'는 각각 독립적으로 (a) -H; (b) -OH; 또는 (c) -O-CO-R4이고, 여기서 R4는 H 또는 -(CH2)m-CH3이며, m의 값은 바람직하게는 8 내지 16이고, 보다 바람직하게는 10, 12 또는 14이다. 2 위치에서, m은 바람직하게는 14이다. 2' 위치에서, m은 바람직하게는 10이다. 3' 위치에서, m은 바람직하게는 12이다. 그러므로 기 R1', R2' 및 R3'는 바람직하게는 도데칸산, 테트라데칸산 또는 헥사데칸산으로부터의 -O-아실 기이다.
R1', R2' 및 R3'가 모두 -H인 때, 3dMPL은 단지 3개의 아실 사슬(위치 2, 2' 및 3'의 각각에 하나씩)을 가진다. R1', R2' 및 R3' 중 단지 두개가 -H인 때에는, 3dMPL은 4개의 아실 사슬을 가질 수 있다. R1', R2' 및 R3' 중 단지 하나만이 -H인 때에는, 3dMPL은 5개의 아실 사슬을 가질 수 있다. R1', R2' 및 R3' 중 하나도 -H가 아닌 때에는, 3dMPL은 6개의 아실 사슬을 가질 수 있다. 발명에 따라 사용된 3dMPL 보조제는 3 내지 6개의 아실 사슬을 가지는, 이들 형태의 혼합물일 수 있지만, 혼합물 중에 6개의 아실 사슬을 가지는 3dMPL을 포함하는 것이 바람직하고, 특히 헥사아실 사슬 형태가 총 3dMPL의 적어도 10 중량%, 예컨대 ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50% 또는 그 이상을 구성하는 것을 보장하는 것이 바람직하다. 6개의 아실 사슬을 가지는 3dMPL이 대부분의 보조제 활성 형태인 것으로 밝혀졌다.
그러므로 발명의 조성물에 포함시키기에 가장 바람직한 형태의 3dMPL은
Figure pct00002
이다.
3dMPL이 혼합물의 형태로 사용된다면 발명의 조성물에서 3dMPL의 양 또는 농도에 대한 언급은 혼합물 중의 조합된 3dMPL 종을 나타낸다.
수성 조건에서, 3dMPL은 상이한 크기, 예컨대 <150 nm 또는 >500 nm의 직경을 가지는 미셸 응집물 또는 입자를 형성할 수 있다. 이들 중 어느 하나 또는 둘 다는 발명과 함께 사용될 수 있고, 더 나은 입자가 관습적인 분석에 의해 선택될 수 있다. 더 작은 입자들(예컨대 3dMPL의 투명한 수성 현탁액을 제공하기에 충분히 작은)이 그것들의 월등한 활성 때문에 발명에 따라 사용하기에 바람직하다(참고문헌 105). 바람직한 입자들은 220 nm 미만, 보다 바람직하게는 200 nm 미만 또는 150 nm 미만 또는 120 nm 미만의 평균 직경을 가지고, 심지어 100 nm 미만의 평균 직경을 가질 수도 있다. 그러나, 대부분의 경우에, 평균 직경은 50 nm보다 적지 않을 것이다. 이들 입자는 필터 멸균에 적합할 정도로 충분히 작다. 입자 직경은 평균 입자 직경을 나타내는, 동적 광산란의 관습적인 기법에 의해 평가될 수 있다. 입자가 x nm의 직경을 가진다고 말할 때, 일반적으로 이 평균값 주변에 입자들이 분포할 것이지만, 입자들의 수의 적어도 50%(예컨대 ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% 또는 그 이상)는 x ± 25%의 범위 내에 있는 직경을 가질 것이다.
3dMPL은 유익하게도 수-중-유 에멀션과 조합하여 사용될 수 있다. 실질적으로 모든 3dMPL은 에멀션의 수성 상에 위치할 수 있다.
백신 중의 3dMPL의 전형적인 양은 10 내지 100 μg/용량, 예컨대 약 25 μg 또는 약 50 μg이다.
3dMPL은 그것 자체로, 또는 하나 이상의 추가의 화합물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 3dMPL을 QS21 사포닌과 함께(참고문헌 106)(수-중-유 에멀션으로 사용하는 것을 포함하여(참고문헌 107)), 면역자극성 올리고뉴클레오타이드와 함께, QS21 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 함께, 알루미늄 포스페이트와 함께(참고문헌 108), 알루미늄 하이드록사이드와 함께(참고문헌 109) 또는 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 하이드록사이드 둘 다와 함께 사용될 수 있다.
일반적 사항
용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "구성하는"을 포함하는데, 예컨대 "X를 포함하는 조성물"은 독점적으로 X로 구성될 수 있거나 추가의 어떤 것, 예컨대 X+Y를 포함할 수 있다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는데, 예컨대 "실질적으로 Y가 없는 조성물"은 완전히 Y가 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 x와 관련하여 용어 "약"은 예를 들면 x ± 10%를 의미한다.
구체적으로 진술되지 않는 한, 둘 이상의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 방법은 임의의 특정 혼합 순서를 필요로 하지 않는다. 그러므로 성분들은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3가지 성분이 있다면 두 성분이 서로 조합된 후, 그 조합이 세 번째 성분과 조합될 수 있고, 등등이다.
동물(및 특히 소과 동물)의 물질이 세포 배양에 사용되는 경우에, 그것들은 전염성 해면상 뇌병증(TSE)이 없는, 특히 소해면상뇌병증(BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 전체적으로, 세포는 동물 유도된 물질의 총 부재하에 배양되는 것이 바람직하다.
세포 기질이 재조합 또는 역 유전학 과정에 사용되는 경우에, 예컨대 Ph Eur 일반 챕터 5.2.3에서와 같이, 인간 백신 제조에 사용하기 위해 승인된 것이 바람직하다.
본 발명은 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는, 다음의 실시예에 의해 한층 더 예시된다.
실시예
발명은 실시예에 의해서만 기술되었고 변형이 이루어질 수 있는 한편 발명의 범주 및 사상 내에 존재하는 것이 인지될 것이다.
실시예 1: H3N2에서의 항원성 미스매치.
병원체와 인간은 동시에 진화되었다. 면역 시스템이 병원체를 중화시키기 위해 발달한 방법과 병원체가 면역 시스템을 피하기 위해 발달한 방법 사이에는 상호작용이 있었다.
인플루엔자 바이러스는 표면 항원 특징에 의해 분류된 다양한 아형을 포함한다. 추가의 변이가 존재하고; 그로써 특이적인 인플루엔자 스트레인 분리물은 바이러스 유형, 첫 번째로 분리된 지리학적 위치, 분리의 순차적인 번호, 분리된 해 및 HA 및 NA 아형을 명시하는 표준 명명법에 의해 확인된다. 표면 항원의 고도의 항원성 변이로 인해, 충분한 보호를 제공하기 위해 인플루엔자 백신이 우성의 순환하는(예컨대 질환-유발) 스트레인에 매치되도록 제조되는 것이 중요하다.
최근에, 미국, 유럽 및 그 밖의 곳에서 놀랄만큼 낮은 백신 유효성이 있었다. 예를 들어, 미국에서, 질병 통제 및 예방 센터(CDC)는 실험실-확인된 H3N2 인플루엔자에 대해 23%의 백신 유효성(VE)이 의학적으로 약화된 급성 호흡기 질병(ARI)과 관련되었음을 보고하였다. 순환하는 H3N2 바이러스의 68%가 백신 스트레인으로부터 상당한 항원성 미스매치를 나타낸 것으로 관찰되었다. 동일한 계절에, 미스매치된 클레이드인, A/Texas/50/2012-유사 바이러스(클레이드 3C.1)가 권고되었다.
더욱이, 난-적응된 A/Texas/50/2012-유사 바이러스는 관련된 순환하는 바이러스에 약하게 매치된다. 난-적응성 돌연변이는 항원성에 영향을 미치는 것으로 인지되었다. 2013-14 계절 권고는 항원성 매치를 보장하는 중요성을 강조하였고 비-난-기반 프로세스에 의해 더 나은 매치를 가능하게 하기 위해 새로운 시스템이 필요한 것을 시사하였다.
유사하게, 캐나다에서, 의학적으로 약화된 ARI(Eurosurveillance 1/2015)와 관련된 실험실-확인된 인플루엔자에 대한 -8%의 VE가 보고되었고, 그 중 99%는 H3N2인 것으로 확인되었으며, 서열이 분석된 스트레인 중 91%가 3C.2A 클레이드인 것으로 확인되었다. 영국에서, 상응하는 수는 실험실-확인된 인플루엔자로의 일차 의료 상담에 대해 3.4% VE이고; A(H3N2)(Eurosurveillance 2/2015)에 대해서는 -2.3% VE이다.
독감 백신이 독감 질병으로부터 사람을 보호할 가능성을 측정하는 데에는 적어도 두 가지의 핵심 인자가 있다: 1) 백신접종되는 사람의 특징(예컨대 그들의 연령 및 건강), 및 2) 독감 바이러스와 독감 백신 사이의 유사성 또는 "매치"가 공동체에서 확산되는 독감 바이러스에 대해 보호하도록 디자인된다. 이런 관점에서, CDC는 독감 백신이 순환하는 바이러스에 잘 매치되지 않는 년도 중에, 독감 백신접종으로부터 어떠한 유익도 관찰될 수 없을 것이 가능하다고 논평하였다(참조: www.cdc.gov/flu/about/qa/vaccineeffect.htm).
도 1은 6개의 인플루엔자 계절의 각각에 대해 계절이 지나는 동안 독감-관련 질병(병원 방문의 분율에 의해 측정됨) 사이의 관계를 도시한다. 그것이 가리키는 것은 시스템이 항원성 변화를 해명하는 것은 매우 도전적이라는 것이다. 더욱이, 난 적응은 인지되지 못한 백신 항원성 변화에 대한 동인일 수 있다. 그것은 또한 현재 우리가 제자리에서 갖고 있는 시스템에 의해, H3N2에 대한 효과적인 백신접종이 성공적이지 못하였음을 강조한다. 이런 인식은 H3N2가 두드러지는 미래의 독감 계절에, 활용할 수 있는 계절성 백신의 유사한 항원성 미스매치가 일어날 수 있는 가능성을 불러일으킨다. 즉, 난 적응 및/또는 부정확한 클레이드로 인해 권고가 미스매치될 수 있다.
본원에서 예시된 것과 같이, 낮은 백신 유효성은 클레이드 미스매치 및 난/세포 적응 미스매치에 의해 지배된 인플루엔자 계절과 상관이 있다.
예를 들어, 특정 클레이드는 특히 항원성 미스매치를 유발하는 데 민감하다.
클레이드 3C.3A 스트레인은 다가오는 북반구 계절에 대해 선택되었다. 난-적응된 버전(A/Switzerland/9715293/2013)이 세포 버전에 미스매치되는 것은 가치있다 - 영국 WHO 협력 센터에 의해 보고된 바 시험된 바이러스의 13%는 매치되었다. 비교하면, 세포 버전이 시험된 순환하는 바이러스의 80%에 더 밀접하게 매치된다.
본 출원의 초안을 작성할 때, 클레이드 3C.2A는 실제로 부상 중이고 두드러지는 중이었다. Flannery 등(CDC Report; June 24, 2015)에 따르면, 3C.2A는 미국 실험실로부터의 감시를 기반으로 순환하는 H3N2 스트레인들의 81% 이상을 나타냈다. 3C.2A 세포 버전은 순환하는 바이러스에 매치하는 한편, 난-적응은 항원성 미스매치 및 HA 항원의 헤드 영역에 부수적인 글리코실화 손실을 초래한다.
도 2로부터 명백한 것처럼, 백신 효능은 인플루엔자-관련된 의학적 요구와 반비례한다. 이런 관계는 특히 환자들의 특정 하위집단, 예컨대 면역 시스템이 미성숙하거나 억제될 수 있는 매우 어린 아동 및 노인에 대해 강력하다. 질병 또는 약물치료로 인해 면역손상된 개체들에 대해서도 동일하다고 말할 수 있다.
H3N2 바이러스는 HI 분석에서 관찰된 기술적 어려움으로 지지되는 바, 적혈구에 결합하지 않는 것으로 진화하고 있다. 실제로, 초기에 큰 세트의 3C.2A 바이러스가 HI-기반 초기 스크리닝에 필수적인, 그것들의 적혈구(RBC)에 결합하는 능력의 결핍으로 인해 검출되지 않았고, 많은 3C.2A 바이러스가 그것들이 표준 HI 분석에 의해 시험될 수 없었기 때문에 특성화되지 않은 채로 남아 있었다. 중요하게도, 난-적응된 3C.2A 바이러스는 RBC를 응집시키는 능력을 다시 얻었지만 핵심 글리코실화를 잃었고 순환하는 바이러스로부터 항원적으로 미스매치되었다. 도 4는 MDCK 세포에서 연속적으로 계대된, A/Hong Kong/5738/2014(3C.2A)의 HA 역가를 도시한다. 그 결과는 합성, 포유류 세포-제조된 바이러스가 계대 후에 RBC를 응집시키는 능력을 얻지 못한 한편, 야생형 포유류 세포-제조된 바이러스는 RBC에 결합하는 능력을 획득하였고, 그것은 계대 5에 의한 HA 글리코실화 부위의 손실과 일치한다. 모든 난-적응된 바이러스는 HA 역가를 가졌다.
나아가, 도 3에 도시된 것과 같이, H3N2에 대한 난에서의 분리 속도는 극적으로 강하된 한편, 세포 특이적 적응이 없는 세포에서는 여전히 높다. 이들 관찰 및 충족되지 않은 요구를 예시하는 도전의 관점에서, 본 개시는 특정 인플루엔자 바이러스, 특히 난-적응된 제조와 관련된 문제들에 민감한 것들에 대한 더 나은 보호를 위한 해결책을 제공한다.
실시예 2: 합성 DNA 및 신규한 골격을 사용하여 제조된 인플루엔자 바이러스의 항원성 특성화.
수십년 동안 인플루엔자 바이러스가 그것들의 RNA 게놈에서 높은 돌연변이율을 가지고 그것들의 자연적인 변이를 용이하게 하고 계속해서 백신 제조를 도전하는 특성인 복잡한 유사-종으로서 존재하는 것이 인지되어 왔다. 인간에서 순환하는 인플루엔자 스트레인은 면역학적 압력을 탈피하기 위해 항원적으로 중요한 돌연변이를 빈번하게 획득하여, 우성이 될 수 있고 계절성 재-감염을 유발할 수 있는 새로운 변종을 일으킨다. 이들 항원성 변화는 인플루엔자 백신이 해마다 검토되고 거의 매번 업데이트할 것을 지시한다. 백신접종은 계절성 인플루엔자에 대해 보호하기에 가장 효과적인 전략이다; 그러나, 백신 성능은 해마다 다르고, 유효성의 감소는 백신 항원과 순환하는 스트레인들의 백신 항원 사이의 미스매치와 관련된다(참고문헌 110 내지 112).
현재 시스템 하에서, 포유류 세포, 특히 MDCK 세포 주는 감염에 대한 고민감성으로 인한 감시 활성을 위한 인플루엔자 바이러스 분리를 위한 바람직한 기질이다(참고문헌 113). 그러나, 발육란에서 재-분리되고 배타적으로 증식될 수 있는 인플루엔자 바이러스만이 포유류 세포-기반 및 난-기반 백신 제조 플랫폼 둘 다에 대한 후보로서 권고된다. 이런 표준 실시는 백신 미스매치가 생성될 가능성을 영구화한다.
난, 특히 최근 H3N2 스트레인에 대한 바이러스 분리 속도의 가변성(참고문헌 114)은 몇년 동안 활용할 수 있는 적합한 백신 후보의 수를 제한할 수 있다. 2004년에, 계절성 백신을 제조하기 위해 제때에 난에서 분리될 수 있는 잘-매치된 H3N2 스트레인이 없었고, 그 아형에 대한 실질적인 백신 미스매치 및 백신 유효성의 관련된 감소를 초래하였다(참고문헌 111 및 115). 나아가, 난에서 증식된 인간-유도된 인플루엔자 바이러스는 선택적 압력을 진행하였고 인간 호흡기 상피에서 두드러진(참고문헌 116) α-2,6-결합 시알산으로부터 난 요막 공간에서 두드러진 (참고문헌 117 및 118) α-2,3-결합 시알산으로의 그것들의 친화도를 변경시키는 HA의 돌연변이를 얻을 수 있다. 최근에, 권고된 H3N2 및 B-Victoria 계통 백신 바이러스는 이들 난-적응성 돌연변이로 인해 순환하는 스트레인에 대해 상당히 감소된 매치를 나타냈다(참고문헌 110, 119 및 120).
비록 순환하는 바이러스에서 진화성 변이는 제어될 수 없지만, 현재 난-기반 인플루엔자 백신 제조 시스템의 일부로서 도입된 항원성 미스매치는 개선될 수 있다. 포유류 세포에서 증식된 인플루엔자 바이러스는 자주 임상 물질에 존재하는 바이러스에 유전자적으로 및 항원적으로 유사한 채로 남아 있는 것으로 알려진다(참고문헌 121 내지 123). 그러므로, 백신 제조를 위해 정성된 포유류 세포 주에서 분리된 바이러스들의 사용은 순환하는 바이러스에 대한 백신 스트레인의 항원성 매치를 유지하는 것을 도울 수 있다(참고문헌 123).
다르게는, 본 발명자들은 백신-정성된 MDCK 세포에서 배타적으로 고-수율 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위한 효과적인 합성 접근법을 개발하였다(참고문헌 124). 이들 바이러스는 보고된 HA 및 NA 서열을 기반으로 합성적으로-유도된 핵산으로부터 역-유전학에 의해 제조하고 최적화된 골격 유전자 분절과 조합한다(참고문헌 124). 이들 고-성장 골격은 바이러스 구제 효율을 증가시키고 바이러스 HA 수율을 증가시킬 수 있다(참고문헌 124). 이들 골격의 잠재적인 유용성은 부분적으로는 그것들이 항원성에 미치는 영향에 좌우된다. 이 합성 접근법이 의도된 참조 스트레인에 대한 유전자적 및 항원적 매치를 유지하는 바이러스를 제공하는 능력을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 계절성 A/H1N1, A/H3N2 및 B 스트레인들을 포함하는 합성 바이러스의 패널의 항원성을 그것들의 각각의 난- 또는 포유류 세포-성장된 참조 대응물과 비교한 연구를 수행하였다.
물질 및 방법
세포 및 바이러스
MDCK 33016PF 세포를 앞서 기술한 것과 같이 유지하였다(참고문헌 124). 야생형 인플루엔자 바이러스를 임상 샘플로부터 세계 보건 기구(WHO) 국립 인플루엔자 센터에 의해 분리하였다. 난-기반 재조합 바이러스를 WHO 협력 센터(WHO CC)에서 생성하였다. 모든 바이러스는 Crick Institute, Mill Hill laboratory, UK에서 보유한 스톡으로부터 유래하였다.
합성 DNA
HA 및 NA 분절을 앞서 기술한 것과 같이 조립하거나(참고문헌 124), 다음의 변형으로 조립하였다. 중복하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머 BMP_13 및 BMP_14를 사용하여 조립하였다(참고문헌 124). PCR 생성물을 변성시키고 재-어닐링하여 미스매치된 듀플렉스 DNA를 형성하였고, 이어서 Surveyor 뉴클레아제(Transgenomic, Inc.) 및 엑소뉴클레아제 III(NEB)과 함께 인큐베이션하였다. 오류-수정된 DNA를 중첩(nested) 프라이머 BMP_27(TTGGGTAACGCCAGGGTTTTCC) (SEQ ID NO:1) 및 BMP_34(TTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTA) (SEQ ID NO:2)를 사용하여 증폭시켰고, 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 최종 생성물은 상류 및 하류 조절 제어 요소가 양옆에 있는 선형 유전자 분절이다.
역 유전학
합성 바이러스를 앞서 기술한 것과 같이 생성하였다(참고문헌 124). 간단히 설명하면, 합성 HA 및 NA 유전자 카세트 및 6개의 골격 유전자(PB2, PB1, PA, NP, M, NS)를 운반하는 플라스미드 및 플라스미드 TMPRSS2(세린 프로테아제를 암호화함(참고문헌 125))를 MDCK 세포에 트랜스펙션하였다. 정화된 배양 배지를 트랜스펙션 후 적어도 72시간 후에 수득하였고, 바이러스를 초점-형성 분석에 의해 검출하였다(참고문헌 124). 모든 실험을 구제된 바이러스로 수행하였고 MDCK 세포에서 3회까지 계대시켰다.
합성 바이러스를 생성하기 위해 사용한 HA 아미노산 서열을 하기에서 표준 단일-문자 포맷으로 열거한다:
A/H1N1/Christchurch/16/2010 (NIB74) - 난
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LRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGNFIDYEELRE
QLSSVSSFERFEIFPKTSSWPDHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPTLSK
SYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIAIRPKVRNQ
EGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVAPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPK
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MVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKR
IENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNG
CFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASS
LVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO:3)
A/H3N2/Victoria/210/2009 (X187) - 난
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A/H3N2/Victoria/210/2009 - 포유류 세포
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FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:5)
A/H3N2/Victoria/361/2011 (IVR165) - 난
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A/H3N2/Victoria/361/2011 - 포유류 세포
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A/H3N2/Texas/50/2012 - 난
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FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:8)
A/H3N2/Texas/50/2012 - 포유류 세포
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FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:9)
A/H3N2/Uruguay/716/2007 (X175C) - 난
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FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:10)
A/H3N2/Brisbane/299/2011 (IVR164) - 난
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FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:11)
A/H3N2/Berlin/93/2011 - 난
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NIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITP
NGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWE
GMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEG
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGN
GCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFATSC
FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:12)
A/H3N2/SouthAustralia/3/2011 - 포유류 세포
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQ
NSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPD
YASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSNNSFFSRLNWLTHLNFKYPAL
NVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIR
NIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITP
NGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWE
GMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEG
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGN
GCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISC
FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:13)
A/H3N2/Switzerland/9715293/2013 - 포유류 세포
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQ
NSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPD
YASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSSCIRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPAL
NVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIR
DIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITP
NGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWE
GMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEG
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGN
GCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISC
FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:14)
A/H3N2/Switzerland/9715293/2013 - 난
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQ
NSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPD
YASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSSCRRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPAL
NVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPVTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIR
DIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITP
NGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWE
GMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEG
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGN
GCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISC
FLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO:15)
B/Brisbane/60/2008 - 난
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLK
GTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIR
QLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDK
NKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNEAQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYV
SQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKG
SLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLK
ERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSEL
EVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLAL
ERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLN
DDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFVVYMVSRDNVSCSICL (SEQ ID NO:16)
B/Brisbane/60/2008 - 포유류 세포
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLK
GTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIR
QLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDK
NKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYV
SQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKG
SLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLK
ERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSEL
EVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLAL
ERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLN
DDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFVVYMVSRDNVSCSICL (SEQ ID NO:17)
바이러스 서열분석
바이러스 RNA를 QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하고 cDNA를 Monsterscript 역전사효소(Epicentre)를 사용하여 생성하였다. HA 및 NA 유전자를 백금 PCR SuperMix 고신뢰도 DNA 중합효소(Life Technologies)를 사용하여 증폭시켰고 서열을 Sanger DNA 서열분석에 의해 분석하였다.
헤마글루티닌 억제(HI) 분석
적혈구 응집 및 HI 분석을 표준 WHO 방법에 따라 기니아 피그 적혈구의 0.1% 현탁액 및 20 nM의 오셀타미비어 카르복실레이트를 사용하여 수행하였다. HA 역가를 약물의 존재하에 측정하였다. HI 역가는 적혈구 응집을 억제한 혈청의 최고 희석률에 상반되었다. 다양한 참조 바이러스에 대한 감염-후 페럿 항혈청을 비브리오 콜레라로부터의 수용체-파괴 효소로 처리하였다.
페럿 접종
감염-후 항혈청은 가벼운 진정하에 희석된 바이러스의 비강내 점적 후에 페럿(Mustela putorius furo)에서 생성시켰고 혈청을 영국 내무성 프로젝트 라이센스 PPL/80/2541 하에 Crick Institute Mill Hill 실험실에서 말초 마취하에 수집하거나, 또는 영국 내무성 프로젝트 라이센스 PIL/80/2530 하에 영국 국립생물표준통제연구원(National Institute for Biological Standards and Control)에 의해 만들었다. 다른 항혈청은 미국 조지아주 아틀랜타의 질병 예방 및 통제 센터, 미국 테네시주 멤피스의 세인트 쥬드 아동 연구 병원, 및 오스트레일리아 멜버른의 감염 및 면역력에 대한 피터 도허티 연구소(Peter Doherty Institute for Infection & Immunity)에서 WHO CC로부터 유래하였다.
결과
합성 바이러스의 생성
합성 및 역 유전학 기술은 공지된 바이러스 서열을 기반으로, 게놈의 선택으로 새로운 백신 바이러스를 생성하는 것을 가능하게 한다. 저병원성 바이러스로부터 유도된 3개의 최적화된 골격(PR8x, #19 및 #21)(참고문헌 124)을 사용하여 아형 A 바이러스를 만들었다. PR8x 골격은 MDCK-적응된 A/푸에르토리코/8/1934 스트레인으로부터의 6개의 내부 게놈 분절을 함유한다. #19 골격은 MDCK-적응된 A/헤센/105/2007 스트레인으로부터의 PB2, PB1 및 NP와 PR8x로부터의 나머지 분절을 함유한다. #21 골격은 A/캘리포니아/07/2009 PB1 및 PR8x로부터의 나머지 분절을 함유한다. 아형 B 바이러스들은 B/Brisbane/60/2008로부터의 모두 6개의 골격 분절을 사용하여 만들었다. 구제된 바이러스를 MDCK 세포에서 배타적으로 3회 계대시켰다. 모든 바이러스의 HA 및 NA 게놈을 합성을 위해 사용한 암호화 서열(상기 제공된 서열)에 대해 100% 유전자 동일성을 가지는 것으로 확인하였다. 항원성 시험을 위해 생성한 바이러스들은 4개의 난- 및 포유류 세포-유도된 매치된 쌍을 포함하여, 계절성 인플루엔자 스트레인(A/H1N1, A/H3N2 및 B-Victoria 계통)을 포함하였다(도 5). 백신 제조에 사용된 H3N2 후보 백신 바이러스(CCV)가 과거 수년 동안 순환하는 스트레인에 매치하지 못하였고 계속해서 도전을 제공하지 못한 것을 고려하여 H3N2 아형을 이 연구에서 우선순위를 매겼다.
합성 바이러스들의 항원성 특성화
본 발명자들은 합성 바이러스가 결코 난에서 계대되지 않았음에도 불구하고, 먼저 이 MDCK 세포-기반 합성 기술이 종래의 난-적응된 CVV에 항원적으로 유사한 바이러스를 생성할 수 있는지를 증명하였다. 합성 바이러스들을 5개의 난-적응된, 고-성장, 재조합 CVV(NIB-74, X-187, IVR-165, X-175 또는 IVR-164)로부터의 HA 및 NA 서열을 사용하여 제조하였고, 바이러스들의 항원성을 원-웨이 HI 분석에 의해 난-적응된 CVV 또는 상응하는 난-적응된 야생형 분리물에 대해 발생된 페럿 항혈청을 사용하여 시험하였다(도 6). 모든 5개의 시험된 스트레인에 대하여, CVV에 대해 발생된 항혈청은 사용된 골격과 관계없이, 상동성 바이러스 역가와 ≤ 2-배 상이한 역가에서 상응하는 합성 바이러스를 인식하였다. 모든 합성 바이러스는 또한 HI 분석에서 유사하게 난-적응된 야생형 스트레인에 대해 발생된 페럿 항혈청과 반응하였고, 이때 역가는 상동성 바이러스 역가와 ≤ 4-배 상이하였다.
본 발명자들이 임의의 새롭게 분리된 야생형 스트레인에 항원적으로 매치하는 고-성장 골격에서 직접적으로 CVV를 생성하는 것을 목표로 하기 때문에, 본 발명자들은 우리들의 분석을 고-성장 재조합체보다는 H3N2 야생형 분리물로부터의 HA 및 NA 서열들을 사용하는 것으로 확대시켰다. 합성 바이러스들을 두 포유류 세포-성장된, 야생형 분리물, A/Victoria/210/2009 및 A/사우스 오스트레일리아/3/2011로부터의, 및 두 난-적응된 스트레인, A/Texas/50/2012 및 A/Berlin/93/2011로부터의 HA 및 NA 서열들을 사용하여 제조하였다(도 7). MDCK 세포에서 1회 계대 후에, 항원성 특성화를 HI 시험에 의해 세포- 또는 난-증식된 야생형 스트레인에 대해 발생된 페럿 항혈청을 사용하여 수행하였다. 상이한 골격으로 제조된 바이러스들은 주어진 항혈청에 대해 유사하게 반응하였고, 모든 시험된 바이러스로부터 얻어진 HI 역가는 상동성 바이러스 역가의 ≤ 4-배 내에 있었다.
합성 바이러스는 인간 질환을 유발하는 스트레인에 대한 매치를 개선시킬 수 있다
합성 바이러스들은 난- 또는 포유류 세포-성장된 분리물 중 어느 하나로부터의 HA 및 NA 서열을 사용하여 제조될 수 있지만, 포유류 세포-성장된 바이러스에 유전자적으로 매치하는 능력은 인간 집단에서 순환하는 스트레인에 대한 항원성 매치를 개선시킬 것으로 예상할 수 있다. 최근 계절성 백신에서 사용된 H3N2 및 B-Victoria 계통 CVV에 대한 HA 유전자의 난-선택된 변화는 감소된 백신 유효성과 관련된 것으로 증명되었다(참고문헌 110 및 119). 그러므로, 본 발명자들은 3개의 최근 H3N2 스트레인과 하나의 B-Victoria 계통 스트레인에 대한 포유류 세포- 및 난-유도된 매치된 항원들 사이의 항원성의 차이를 평가하기 위해 합성 기술을 사용하였다. 북반구에서, A/Victoria/210/2009는 2010-11 및 2011-12 백신에 대한 H3N2 성분이었고; A/Victoria/361/2011-유사는 2012-13 및 2013-14 백신에 대한 H3N2 성분이었고; A/Switzerland/9715293/2013은 2015-16 백신에 대한 H3N2 성분이었다. B/Brisbane/60/2008은 2009-10, 2010-11 및 2011-12 3가 백신에 대한 B 스트레인 성분이었고, 2012-13 이래로 4가 백신에 대한 B-Victoria 성분이었다. 모든 포유류 세포- 및 난-유도된 항원 쌍의 HA 서열들은 1 내지 3 아미노산이 상이하였다(하기 표 2 참조).
합성 난- 및 포유류 세포-유도된 항원-매치된 쌍의 서열 차이.
위치 세포 난
A/H3N2/Victoria/210/2009 186 G V
228 S T
A/H3N2/Victoria/361/2011 156 H Q
186 G V
219 S Y
A/H3N2/Texas/50/2012 186 G V
219 S F
A/H3N2/SSwitzerland/9715293/2013 140 I R
186 G V
B/Brisbane/60/2008 199 T A
주지할 것은, 모든 난-유도된 H3 항원이 난에서 바이러스 성장을 개선하지만 MDCK 세포-증식된 바이러스와 관련하여 항원성을 변경시키는 G186V 돌연변이를 함유하였다(참고문헌 126). 난-유도된 B/Brisbane/60/2008 HA는 수용체 결합 부위 가까이의 잠재적인 글리코실화 부위를 잃어버린다. 난 적응시 이 글리칸의 손실은 항원성에 영향을 미친다(참고문헌 119).
포유류 세포- 또는 난-유도된 HA 및 NA 서열들로부터 제조한 합성 바이러스를 HI 분석에 의하여 포유류 세포- 및 난-성장된 참조 바이러스를 사용하여 그것들의 매치된 합성 대응물 및 종래의 참조 스트레인에 비교하였다. 도 8 및 9에서 알 수 있는 것과 같이, 대부분의 경우에, 본 발명자들은 포유류-성장된 바이러스에 대해 발생된 항혈청으로 분석될 때가 아니라 난-성장된 바이러스에 대해 발생된 페럿 항혈청으로 분석될 때, 세포- 및 난-유도된 항원들 사이에서 반응성의 차이를 관찰하였다. 특히, 난-성장된 백신 바이러스에 대해 발생된 페럿 항혈청은 일반적으로 상동성 역가의 2-배 내의 역가에서 난-적응된 HA 서열을 함유하는 합성 시험 바이러스들을 인식하였지만, HI 분석에서는 사응하는 포유류 세포-유도된 항원들을 발현하는 모든 바이러스에 잘 반응하지 못하였다(> 4-배 감소). 이런 실험 디자인은 난-유도된 백신 항원에 대한 면역 반응이 난 적응이 부족한 순환하는 스트레인에 대해 보호하고자 의도된 현재의 인간 면역화 상황을 모델로 한다. 그러나, 세포-성장된 분리물에 대해 발생된 페럿 항혈청은 세포- 또는 난-유도된 항원 중 어느 하나를 발현하는 바이러스를 인식하였다. 대부분의 바이러스는 포유류 세포 성장된 바이러스에 대해 발생된 주어진 할혈청에 상응하는 상동성 역가의 ≤ 4-배 내에서 반응하였고, 단 320의 낮은 상동성 역가를 생성하지만 난-적응된 항원을 발현하는 바이러스에 훨씬 더 낫게 반응한(> 4-배 증가), 세포-성장된 A/Victoria/361/2011 바이러스에 대해 발생된 항혈청은 예외였다(도 8B). 이 놀라운 발견은 난-적응된 및 세포-성장된 바이러스 사이의 수용체 결합력의 차이에 기여할 수 있고, 그것은 HI 분석의 동역학에 영향을 미칠 수 있다. 최근의 세포-성장된 H3N2 바이러스가 시알산 수용체에 대해 더 낮은 결합력을 가지는 것으로 나타나기 대문에, 더 많은 세포-성장된 A/Victoria/361/2011 바이러스가 HI 분석에 사용되어 난-적응된 바이러스에 비교하여 4 HA 유닛을 얻었고, 적혈구에 대한 결합을 억제하기 위해 더 많은 항체를 필요로 한다.
원-웨이 HI 시험(도 10)에 의해 난- 및 포유류 세포-성장된 A/Switzerland/9715293/2013 참조 바이러스 사이에 관찰된 미스매치는 본 발명자가 추가의 투-웨이 항원성 특성화에 대해 이 2015-16 백신 스트레인을 선택하도록 촉진하였다. 포유류 세포- 또는 난-유도된 항원 중 어느 하나를 발현하는 두 합성 바이러스에 대해 발생된 페럿 항혈청을 종래의 참조 스트레인으로 및 상이한 골격에 대해 만들어진 합성 바이러스로 시험하였다(도 10). 투-웨이 HI 데이터는 합성 바이러스들이 그것들의 상응하는 참조 스트레인에 항원적으로 유사하였고, HI 역가 차이는 2-배 이내였음을 확인하였다. 한 골격을 가진 바이러스에 대해 발생된 페럿 항혈청은 또한 상이한 골격에서 구제된 바이러스를 효과적으로 인식하였고, 그것은 항원성을 변경시키지 않는 동일한 HA 및 NA 서열을 가진 대체 골격의 사용을 확인해주었다. 흥미롭게도, 세포-유도된 합성 및 야생형 항원은 난-적응된 참조 바이러스에 대해 발생된 항혈청보다 난-적응된 HA를 발현하는 합성 바이러스(RG-PS-2404)에 대해 발생딘 항혈청에 더 낫게 반응하였다(각각 상동성 역가보다 ≤ 2-배 대비 4 내지 8-배 더 낮음). 고성장 골격이 비리온 표면에 통합되고 제공된 HA의 양에 영향을 미치고, 그것이 적혈구에 대한 바이러스의 결합력 및/또는 그런 바이러스들로의 페럿 감염에 의해 유도된 항체들의 양에 영향을 미칠 수 있다는 것이 타당한 것으로 보인다. 이들 인자는 둘 다 HI 분석의 동역학에 영향을 줄 수 있을 것이고 조사 중이다. 전체적으로, 본 발명자들은 현재의 난-적응된 백신 바이러스에 비교하여 포유류 세포-성장된 원형에 더 잘 매치되는 바이러스들을 생성하는 합성 기술의 능력을 증명하였다.
논의
권고된 백신 바이러스와 최근 수년의 순환하는 바이러스, 특히 H3N2 스트레인에 대한 바이러스(참고문헌 110 내지 112, 119 및 120) 사이의 항원성 미스매치의 보고는 계절성 인플루엔자 백신의 유효성에 관한 대중의 경각심 및 관심을 고조시켰다. 이런 관심은 유산인, 난-기반 기술에 의존하지 않는 개선된 CVV 생성 시스템에 대한 요구를 강조한다. 항원성 미스매치는 순환하는 바이러스의 항원성 변이, 난-적응성 돌연변이 또는 둘 다로부터 유발될 수 있다. 2010년 내지 2014년에, 난-적응된 H3N2 백신 스트레인의 HA 돌연변이는 순환하는 스트레인과의 항원성 미스매치를 초래하였고 낮은 백신 유효성과 관련되었다(참고문헌 110 및 119). 2014년에서 2015년에, 변이된 H3N2 스트레인 A/Texas/50/2012 스트레인은 우성의 순환하는 스트레인과 항원적으로 구별되었다(참고문헌 112 및 120). 나아가, 최근 몇년 동안 난에서의 H3N2 인플루엔자 바이러스 분리 속도의 가변성(참고문헌 127 및 128)은 현재 시스템에 추가의 미스매치 위험을 부가할 수 있다. 그러므로, 인증된 포유류 세포에서 분리된 또는 합성적으로 생성된 CVV의 사용은 백신 바이러스 선택에 활용할 수 있는 바이러스들의 수를 증가시키는 것을 도울 수 있고, 일부 상황에서는, 백신 제조에 대한 더 나은 매치된 바이러스를 제공할 수 있을 것이다.
MDCK 세포는 표면에 α-2, 6- 및 α-2, 3-결합된 시알산을 가지고 있어서, 세포를 인플루엔자 바이러스의 변경된 변종의 선택과 관련하여 보다 중성의 기질로 만든다(참고문헌 117). 임상 샘플 및 그것들의 실험실-계대된 유도체에서 인플루엔자 바이러스의 서열 분석은 MDCK 세포가 임상 물질에 존재하는 만연된 HA 유전자형을 유지할 가능성이 계란보다 더 많은 것을 확증해주었다(참고문헌 122). MDCK 세포-성장된 바이러스드른 또한 감염-후 인간 혈청에서 중화 및 HI 항체들에 의한 더 큰 인식에 의해 증명되는 바, 난-성장된 대응물보다 인간에서 바이러스 복제에 더 항원적으로 유사하다(참고문헌 129 및 130).
그 목적을 위해, 본 발명자들은 서열 정보로부터 MDCK 세포에서 배타적으로 백신 바이러스를 생성하기 위한 합성 시스템을 수립하였다(참고문헌 124). 이 시스템은 인간 질환을 유발하는 스트레인들에 대한 매칭을 개선하는 잠재력을 가진다. 각각의 새로운 유형의 A 바이러스에 대해, 고-성장 골격 세트를 실험적으로 시험하여 포유류 세포 및 난에서의 그 특정 HA 및 NA에 대한 최고-수율의 골격을 확인하였다. 본 발명자들이 A형 바이러스에 대해 수립한 골격들은 MDCK 세포에서 바이러스 구제 효율 및 MDCK 세포와 난에서 모두 HA 수율을 증가시킬 수 있다(참고문헌 124). 이 합성 기술은 표준 PR8 골격과 조합하여, 양호한 안전성 프로파일을 가지고 단계 I 실험에서 보호성인 것으로 여겨지는 항체 역가를 유도한 H7N9 백신 후보를 제조하기 위해 이미 사용되었다(참고문헌 131). 인간 백신에 대한 CVV를 제조하기 위하여 더 높은 수율의 키메라 골격을 사용하는 것을 용이하게 하기 위하여, 본 발명자들은 합성 백신 바이러스의 항원성을 변경시키지 않는 대체 골격의 사용을 증명하고자 하였다.
이 연구에서, 본 발명자들은 합성 시스템이 게놈 선택 및 그 결과의 새로운 백신 바이러스의 항원성에 대한 제어를 허용하는 것을 보였다. 합성 바이러스들은 난- 또는 포유류 세포-증식된 분리물 중 어느 하나를, 유전자 합성에 대해 선택한 HA 및 NA 서열을 기반으로, 항원적으로 매치되도록 제조될 수 있었다. 합성 DNA 및 대체 골격으로 생성된 계절성 바이러스들을 백신-승인된 MDCK 세포 주에서 3회까지 계대시켰고, 항원성 안정성을 상응하는 종래의 참조 스트레인들의 HI 역가에 비교할만한 HI 역가에 의해 수립하였다. 특히, 본 발명자들은 동일한 HA 및 NA 서열을 가지는 바이러스를 생성하기 위하여 상이한 골격을 사용하는 것이 항원성을 변경시키지 않는 것을 보였다.
비록 MDCK 세포에서 계대된 바이러스들이 일반적으로 HA에서 적응성 돌연변이를 획득하지는 않지만, 일부 H3N2 바이러스들(세포 표면 시알산에 대해 낮은 친화성을 가지는 HA 분자를 가질 수 있음)은 MDCK 세포에의 결합을 용이하게 하는 NA 시알산 결합 부위에 계대시에 돌연변이를 획득하는 것으로 보고되었다(참고문헌 132). 비록 선택된 NA 돌연변이가 돌연변이된 바이러스의 항원성 및 면역원성 특성을 그 자체로는 간섭하지 않지만, NA의 변경된 특성은 NA-매개된 적혈구 응집 및 결과적으로 HI 역가에 대한 변화를 초래한다. 이런 NA-매개된 적혈구 응집을 차단하기 위하여, NA 억제제 오셀타미비어를 본 발명자들이 보고하고 있는 연구의 모든 H3N2 스트레인에 대해 HI 분석에 첨가하였다.
분리될 수 있는 새로운 HA 및 NA를 가지는 스트레인의 수를 증가시키고 포유류 세포-성장된 원형 바이러스에 더 유사한 스트레인들을 제공하는 합성 시드 기술의 능력은 인간에서 순환하는 스트레인들에 대한 백신 매치를 개선시킬 수 있다. 또한, 난-기반 재조합체에 비교하여 이 기술을 사용하여 신속하게 이들 후보 바이러스를 생성하는 능력(참고문헌 124)은 스트레인 권고가 더 늦어지는 것을 잠재적으로 허용하고, 그로써 스트레인 선택과 항원성 변동이 일어날 수 있는 백신 분배 사이이 지체 시간을 줄일 수 있다. 더 나은 매치된 스트레인들을 사용하여 만들어진 백신들의 상대적인 임상적 유효성은 여전히 측정될 필요가 있다. 현재의 데이터를 기반으로, 본 발명자들은 백신 바이러스를 생성하기 위해 그리고 항원 제조를 위해 비-난-기반 플랫폼, 예컨대 포유류 세포의 사용이 순환하는 스트레인들에 대한 백신 항원성 매치의 수준을 개선시킬 수 있을 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 3: 세포-유도된 및 난-적응된 1가 H3N2 백신을 사용한 백신접종에 의해 유도된 마우스 항혈청의 혈청학적 교차-반응성의 탐색
상기에서 나타낸 것과 같이, 최근 인플루엔자 계절에, H3N2 백신 스트레인과 순환하는 스트레인 사이의 항원성 미스매치는 낮은 백신 유효성과 관련이 있었다. 2012-2013에, A/Victoria/361/2011-유사 클레이드 3C.1 백신 스트레인은 난-적응되었고 상응하는 순환하는 스트레인에 대해 밀접하게 항원적으로 매치되지 않았다. 2014-2015에, A/Texas/50/2012 클레이드 3C.1 백신 스트레인은 항원성 변이로 인해 우성의 순환하는 스트레인과 항원적으로 구별되었다. 2015-2016에, A/Switzerland/9715293/2013 클레이드 3C.3a 백신 스트레인은 난-적응 및 항원성 변이 둘 다로 인해 상응하는 순환하는 스트레인에 밀접하게 항원적으로 매치하지 않았다.
H3N2 백신 항원의 맥락에서 미스매치의 문제를 조사하기 위하여, 3개의 주요 클레이드(3C.1, 3C.2a, 3C.3a)로부터 유도된, 세포-유도된 및 난-적응된 1가 H3N2 백신으로의 백신접종에 의해 유도된 마우스 항혈청의 교차-반응성을 탐색하기 위한 마우스 연구를 디자인하였다. 하기 표 3에 나타낸 것과 같이, 각 클레이드에 상응하는 난- 및 세포-유도된 비활성화된 인플루엔자 바이러스 항원 모노벌크를 세포 배양에서 제조하였다(PR8x 골격을 기반으로 한 합성 바이러스를 사용하고 세포-유도된 또는 난-적응된 바이러스 중 어느 하나로부터의 HA 및 NA 서열을 사용함). 그러므로, 상기 주지된 것과 같이, 표시 "난" 또는 "세포"는 합성을 위한 HA 및 NA 서열을 제공한 바이러스들의 계대 이력을 나타낸다. 혼합된 계대 이력의 경우에, 난에서의 임의의 계대는 "난" 표시를 촉발시키기에 충분하다. HA 수준을 SRID에 의해 정량하였고 HA 서열을 확인하였다. SRID 값은 A/Switzerland9715293/2013 시약을 기준으로 한다.
마우스 연구를 위해 제조한 난- 및 세포-유도된 H3N2 모노벌크
클레이드 H3N2 바이러스 스트레인 바이러스 번호 SRID(μg/ml)
3C.1 A/Texas/50/2012 - 난 RG-ID-1958 287
A/Texas/50/2012 - 세포 RG-PS-2341 182
3C.2a A/Hong Kong/5738/2014 - 난 RG-ID-2012 156
A/Hong Kong/5738/2014 - 세포 RG-PS-2419 340
3C.3a A/Switzerland/9715293/2013 - 난 RG-PS-2404 296
A/Switzerland/9715293/2013 - 세포 RG-PS-2407 217
모노벌크로부터 제조한 백신들을 표 4에서 나타낸 것과 같이(MF59 보조제가 있거나 없이), BALB/c 마우스(그룹당 10마리의 마우스)에 투여하였다.
마우스 연구 디자인
그룹 0, 21, 42일 백신접종 HA 용량(mcg) 출혈일
1 (TXe) 3C.1 (난) 1 0, 20, 41, 63, 84
2 (TXc) 3C.1 (세포) 1 0, 20, 41, 63, 84
3 (HKe) 3C.2a (난) 1 0, 20, 41, 63, 84
4 (HKc) 3C.2a (세포) 1 20, 41, 63, 84
5 (SWe) 3C.3a (난) 1 20, 41, 63, 84
6 (SWc) 3C.3a (세포) 1 20, 41, 63, 84
7 (TXe) 3C.1 (난) + MF59 0.1 20, 41, 63, 84
8 (TXc) 3C.1 (세포) + MF59 0.1 20, 41, 63, 84
9 (HKe) 3C.2a (난) + MF59 0.1 20, 41, 63, 84
10 (HKc) 3C.2a (세포) + MF59 0.1 20, 41, 63, 84
11 (SWe) 3C.3a (난) + MF59 0.1 20, 41, 63, 84
12 (SWc) 3C.3a (세포) + MF59 0.1 20, 41, 63, 84
HI 및 MN 분석을 사용하여 마우스 항혈청과 바이러스 항원 사이의 혈청학적 교차-반응성을 연구하였다. MN 결과를 도 11A 및 11B에 나타낸다. 도시된 데이터는 41 출혈(제2 면역화 후 3주 후)을 사용하여 생성하였다. 일반적으로 항체 역가는 상동성 바이러스에 대해 최고였다. MF59는 전체적인 항체 역가를 증가시키지만(HI 및 MN 분석 둘 다에서), 특이성은 변화하지 않는다. 특히, 클레이드 3C.2a A/Hong Kong/5738/2014(A/HK) 백신에 대한 분명한 난-세포 항원성 미스매치가 있었다(예컨대 도 11A의 제3 및 제4 칼럼을 11B와 비교함). 특히, 시험 바이러스가 난-적응된 HA 및 NA 서열을 함유하는 A/HK였을 때, 바이러스를 상동성 난-유도된 A/HK 바이러스 항원 및 세포-유도된 A/HK 바이러스 항원 둘 다에 대한 항혈청을 포함하여, 모든 시험된 마우스 항혈청에 의해 중화시켰EK(도 11A). 그러나, 시험 바이러스가 세포-유도된 HA 및 NA 서열을 함유하는 A/HK였을 때, 바이러스는 난-유도된 A/HK 바이러수 항원에 대한 항혈청에 의해서가 아니라, 상동성 세포-유도된 A/HK 항혈청에 의해 중화시켰다(도 11B). 얻어진 데이터는 A/HK 난-유도된 항원이 세포-유도된 바이러스에는 존재하지 않는 면역우성 에피토프(들)을 함유하는 한편, A/HK 세포-유도된 항원은 난-유도된 바이러스와 공통 에피토프를 공유하고 난-유도된 바이러스와 교차-반응할 수 있는 항체들을 분비하는 것을 시사한다.
A/HK 세포-유도된 항원 및 A/HK 난-유도된 항원에 대한 MN 분석에서 페럿 항혈청을 사용하여 얻어진 교차-반응성 데이터는 마우스 항혈청을 사용하여 얻어진 데이터와 유사한 경향을 나타냈다(데이터는 제시하지 않음).
실시예 4: 구제 백신으로서 1가, 비활성화된 인플루엔자 A 바이러스(H3N2) 백신을 조사하기 위한 동물 연구.
발명자들은 세포-유도된 1가, 비활성화된 인플루엔자 A 바이러스(H3N2) 백신이 난-유도된 3가 백신의 상응하는 백신 항원과 순환하는 바이러스 사이의 항원성 미스매치를 극복하기 위한 구제 백신으로서 사용되는 생체 내 연구를 디자인하고 시작하였다.
난-유도된 3가(TIV) 및 세포-유도된 1가(MIV) 백신을 표 5에 나타낸 것과 같이(MF59 보조제가 있거나 없이) BALB/c 마우스(그룹당 10마리 마우스)에 투여하였다. TIV는 난-유도된 A/Switzerland/9715293/2013(H3N2), A/캘리포니아/07/2009(H1N1) 및 B/Brisbane/9/2014 바이러스 항원을 함유한다. MIV는 MIV contains 세포-유도된 A/Hong Kong/5738/2014(H3N2) 바이러스 항원을 함유한다. TIV 항원은 2015-2016(북반구) 계절성 백신접종 캠페인 중에 인간에게 투여된 3가 인플루엔자 백신을 제조하기 위해 사용된 것들과 동등한 난-유도된 모노벌크로부터 유래하였다. MIV 항원을 세포-유도된 A/HK 바이러스(즉 난에서 계대되지 않은 바이러스)로부터의 HA 및 NA 서열을 사용하여 합성 시드 바이러스로부터의 세포 배양에서 제조하였다.
구제 백신 / H3N2 항원성 미스매치 연구 디자인
그룹 0 일 21 일 42 일 출혈일 해설
1 TIV TIV -- 0, 20, 41, 63, 84 TIV 단독
2 TIV TIV MIV 0, 20, 41, 63, 84 TIV에 이어서 MIV
3 TIV + MIV TIV + MIV -- 0, 20, 41, 63, 84 동시에
4 TIV TIV TIV 20, 41, 63, 84 TIV 기준
5 MIV MIV MIV 20, 41, 63, 84 MIV 기준
6 MIV MIV TIV 20, 41, 63, 84 반대 순서
7 aTIV aTIV -- 20, 41, 63, 84 TIV 단독
8 aTIV aTIV aMIV 20, 41, 63, 84 TIV에 이어서 MIV
9 aTIV + aMIV aTIV + aMIV -- 20, 41, 63, 84 동시에
10 aTIV aTIV aTIV 20, 41, 63, 84 TIV 기준
11 aMIV aMIV aMIV 20, 41, 63, 84 MIV 기준
12 aMIV aMIV aTIV 20, 41, 63, 84 반대 순서
그룹 1 내지 6: 보조제 첨가되지 않음, 용량 = 스트레인당 1 mcg HA
그룹 7 내지 12: MF59-보조제 첨가됨, 용량 = 스트레인당 0.1 mcg HA
연구는 실시예 3과 유사한 방식으로, HI 및 MN 분석을 사용하여, 마우스 항혈청(예컨대 41일 및/또는 63일 출혈로부터 얻어짐)과 바이러스 항원 사이의 혈청학적 교차-반응성을 조사할 것이다. 예를 들어, MN 및 HI 역가는 각 그룹으로부터의 항혈청을 사용하여 얻어질 것이고, 세포-유도된 A/HK 바이러스(그것으로부터 MIV 항원이 유도됨)와 A/Switzerland 난-유도된 바이러스(그것으로부터 TIV의 H3N2 성분이 유도됨)에 대해 시험될 것이다.
연구는 구제 백신으로서 더 낫게 매치된 세포-유도된 MIV의 투여가, TIV 투여 단독과 비교하여, 생체 내에서 상응하는 순환하는 스트레인에 대한 중화 항체 역가를 유익하게 개선시킬 것이라는 확증을 제공할 것으로 예상된다.
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상기 개별 섹션에서 언급된 본 발명의 다양한 특징 및 구체예들은 적절하게, 다른 섹션에도 약간씩 수정되어 적용된다. 따라서 한 섹션에서 명시된 특징들은 적절하게, 다른 섹션에서 명시된 특징들과 조합될 수 있다.
기술분야의 숙련자들은 관습적인 정도의 실험을 사용하여 본원에 기술된 발명의 특정 구체예들에 대한 많은 동등물을 인식, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그런 동등물은 이어지는 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> SEQIRUS UK LIMITED <120> ANTIGENICALLY MATCHED INFLUENZA VACCINES <130> P068166WO <140> PCT/IB2016/______ <141> 2016-06-24 <150> US62/185532 <151> 2015-06-26 <150> US62/313184 <151> 2016-03-25 <160> 17 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ttgggtaacg ccagggtttt cc 22 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt a 31 <210> 3 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 3 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu His Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Ser 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Arg 565 570 575 Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu 580 585

Claims (29)

  1. 숙주 세포에서 제조된 항원을 포함하는 구제 인플루엔자 백신으로서, 항원은 동일한 인플루엔자 계절 초기에 활용할 수 있는 계절성 인플루엔자 백신보다 순환하는 인플루엔자 바이러스에 대해 더 큰 항원성 매치를 가지며, 계절성 인플루엔자 백신은 순환하는 인플루엔자 바이러스에 대해 ≤50%의 백신 유효성을 가지는, 구제 인플루엔자 백신.
  2. 인플루엔자 스트레인의 항원을 포함하는 조성물로서, 조성물은 비-난-기반 제제로 제조되고, 스트레인은 난 적응 및/또는 클레이드 미스매치에 민감한, 조성물.
  3. 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신이 사전에 투여된 인간을 면역시키는 방법으로서, 동일한 인간에게 난에서 계대되지 않은 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 투여하는 단계를 포함하고, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치되는, 방법.
  4. 인간의 면역화 방법으로서, (a) 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신을 인간에게 투여하는 단계; 및 계속해서 (b) 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 동일한 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치되는, 방법.
  5. 제3 항에 있어서, 제2 인플루엔자 바이러스는 세포 배양에서 성장된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3 항에 있어서, 제2 인플루엔자 백신으로부터의 항원은 재조합 단백질 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3 항 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인플루엔자 백신 및 제2 인플루엔자 백신은 한 인플루엔자 계절로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제3 항 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인플루엔자 백신은 제2 인플루엔자 백신 전에 활용할 수 있도록 만들어진 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제3 항 내지 제8 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 인간을 면역시키는 데 사용하기 위한, 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신 및 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신.
  10. 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 받게 될 인간을 사전-면역화하기 위한, 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신으로서, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치되는, 제1 인플루엔자 백신.
  11. 제3 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 백신 중의 인플루엔자 항원은 난에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  12. 제3 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인플루엔자 백신은 3가 인플루엔자 백신 또는 4가 인플루엔자 백신인 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  13. 제3 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인플루엔자 백신은 1가 인플루엔자 백신인 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  14. 제3 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인플루엔자 백신은 동일한 인플루엔자 계절 내에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  15. 제10 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인플루엔자 백신은 제1 인플루엔자 백신 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 5개월 내에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  16. 제3 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인플루엔자 백신은 오브알부민 및 오보뮤코이드가 없는 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  17. 제3 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 제1 인플루엔자 백신은 비활성화된 바이러스 백신이거나, (ii) 제2 인플루엔자 백신은 비활성화된 바이러스 백신이거나, 또는 (iii) 제1 및 제2 인플루엔자 백신은 비활성화된 바이러스 백신인 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  18. 제3 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 결코 난에서 계대되지 않은 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  19. 제3 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 인플루엔자 백신은 보조제가 첨가된 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  20. 제19 항에 있어서, 보조제는 수-중-유 에멀션 보조제인 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
  21. (i) 난에서 계대된 제1 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제1 인플루엔자 백신; 및 (ii) 세포 배양에서 성장된 제2 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함하는 제2 인플루엔자 백신을 포함하는 키트로서, 제2 인플루엔자 백신 중의 항원은 제1 인플루엔자 백신 중의 항원보다 순환하는 스트레인에 더 밀접하게 항원적으로 매치되는, 키트.
  22. (i) 난-기반 제제로부터의 바이러스 항원; (ii) 세포 배양-기반 제제로부터의 바이러스 항원; (iii) 재조합 단백질 제제로부터의 바이러스 항원; 및 (iv) 바이러스 항원을 암호화하는 RNA 레플리콘으로 구성되는 군으로부터 선택된 둘 이상의 성분을 포함하는 하이브리드 백신.
  23. 제22 항에 있어서, 하이브리드 백신은 3가 또는 4가 인플루엔자 백신인 것을 특징으로 하는 하이브리드 백신.
  24. 제22 항 또는 제23 항에 있어서, 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 백신.
  25. 제22 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양-기반 제제는 포유류 또는 조류 세포-기반 제제인 것을 특징으로 하는 하이브리드 백신.
  26. 제3 항 내지 제5항 또는 제7 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인플루엔자 백신으로부터의 항원은 합성 시드 바이러스로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법, 사용하기 위한 백신 또는 키트.
  27. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 제2 인플루엔자 백신으로부터의 항원은 합성 시드 바이러스로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 구제 백신 또는 조성물.
  28. 제22 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양-기반 제제로부터의 항원은 합성 시드 바이러스로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 백신.
  29. 제1 항 또는 제2 항의 구제 백신 또는 조성물의 제조를 위한 또는 제22 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 따르는 하이브리드 백신의 세포 배양-기반 제제로부터의 바이러스 항원의 제조를 위한 합성 시드 바이러스의 사용.
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