KR20180034366A - Egfr-표적제제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측하기 위한 신규한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, RON(Recepteur d＇Origine Nantais) 유전자를 포함하는, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-표적제제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커; 상기 바이오 마커의 유전자 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 조성물; 상기 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 키트; 및 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 대장암에서의 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측 효과가 우수하므로, 본 발명은 대장암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 항암 요법에서, 항암제를 투여하였을 때의 생체의 반응성은 약제의 표적이 되는 암세포의 이 약제에 대한 감수성에 크게 의존한다. 이러한 암세포의 약제에 대한 감수성은, 암세포마다 크게 상이하다. 이러한 감수성의 차이는, 이 약제의 표적 분자 또는 이에 관련하는 인자의 양적 또는 질적 차이, 또는 약제 내성의 획득 등에 기인한다. 이러한 배경을 근거로, 표적이 되는 암세포가 약제에 대하여 감수성을 나타낼 경우에 특이적으로 나타나는 암세포의 유전적 변화를 확인할 수 있다면, 조기에 약제의 효과 판정, 치료법의 확립, 새로운 치료법의 선택 등이 가능해져 대단히 유익하다. 또한, 치료에 앞서 생체 조직편 등에 의해 취득된 암조직에서, 통상의 방법에 따라 암세포를 분리한 후 약제 처리를 실시하여, 이 암세포가 약제 감수성인지 여부를 상기 변화에 의해 측정하면, 이 약제에 의한 치료가 유효한지 여부를 미리 예측할 수 있기 때문에 임상적으로 매우 유용하다.
일반적으로 KRAS, NRAS 또는 BRAF 유전자에서의 변이는 종양 세포에서 변형된 시그널링 특징을 가진 단백질을 만들어내고, 이러한 변이는 상피 성장 인자 수용체를 타겟으로 하는 치료 항체, 예컨대 세툭시맙(cetuximab) 또는 파니투무맙(panitumumab)을 이용하는 암 치료에서, 성공적이지 못한 결과와 연계되는 것으로 알려져 있다(Amado, Wolf et al. 2008; Karapetis, Khambata-Ford et al. 2008; Di Nicolantonio, Martini et al. 2008; Loupakis, Ruzzo et al. 2009; Lievre, Bachet et al. 2006).
그러나, 이러한 변이가 아닌 KRAS, NRAS 또는 BRAF 야생형 유전자형을 갖는 암환자의 경우에도, 세툭시맙(cetuximab) 등과 같은 표적항암제제의 항암효과가 크지 않은 경우가 많다.
세툭시맙(Cetuximab)은 재조합 항-EGFR 인간/마우스 키메릭 모노클로날 항체(MoAb)로, 항체-의존성 세포 독성 및 화학요법 및 방사선요법에 대해 종양 세포를 민감화시키는 것으로 알려져 있다(Graham J, et al., Nat Rev Drug Discov. Jul2004;3(7):549-50.; Kimura H, et al., Cancer Sci. Aug 2007;98(8):1275-80.; Kurai J, et al., Clin Cancer Res. Mar 1 2007;13(5):1552-61.; Dittmann K, et al., Radiother Oncol. Aug 2005;76(2):157-61.). 이러한 이점을 가져, 단독 요법 또는 화학요법 및/또는 방사선요법과의 병행 요법으로써 세툭시맙을 이용하는 임상적 이점이 두부와 경부 암 및 전이성 결장 암에서 증명된 바 있다 (Marshall J. et al., Cancer. Sep 15 2006;107(6):1207-18).
한편, RON(Recepteur d＇Origine Nantais)은 c-MET 계열에 속하는 단백질 수용체로서, 간에서 분비되며 대식세포의 작용을 조절하는 혈청 단백질 macrophage-stimulating protein(MSP)의 수용체이다(Zhou YQ, He C, Chen YQ, Wang D, Wang MH: Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in primary human colorectal adenocarcinomas: generation of different splicing RON variants and their oncogenic potential. Oncogene 2003, 22(2):186-197). RON의 발현은 유방암 및 대장 직장암에서 비정상적으로 조절되어 있으며, 특히 대장직장암의 전이와 밀접히 관련되어 있다. 예를 들어, RON에 결합하는 단일클론 항체 IMC-41A10가 세포전이와 종양형성을 저해함이 보고됨에 따라, RON 저해제가 항암 및 암 전이에 뛰어난 효능을 보일 수 있을 것이다.
즉, 항암제는 내성과 독성에 관해서 개인차가 크며 동일한 환자에서도 약 반수이상에서 내성을 보이는 문제가 있으므로 적합한 치료반응성 표식자를 이용한 선별은 항암제 치료의 획기적인 진보를 초래할 수 있다. 이에, 특정 유전자에 따른 개별 항암제의 치료반응성에 관한 연구가 최근 지속적으로 활발하게 전개되고 있다.
그러나 특정약제에 대한 생체반응 관련요소의 복합적 작용, 치료제 및 투여방식의 다양성과 방대한 시료확보의 어려움으로 아직 괄목할 만한 성과가 미약한 현실이다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 대장암에서 항암제인 EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, EGFR-표적제제 중 하나인 세툭시맙(Cetuximab)의 대장암에서의 감수성을 예측하는 바이오 마커로서 RON 유전자 및/또는 단백질의 활성 양상을 분석하였고, 그 결과, 대장암 세포에서 RON 유전자 및/또는 단백질의 활성 양상에 따라 EGFR-전사활성(transactivation)-관련 유전자들인 Adam11, Adam32, FZD4, GPER 및 GPR101 유전자에 영향을 미쳐서 EGFR-표적제제인 세툭시맙의 약물 감수성으로 인한 세포사멸 정도가 상이한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진제를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진제 및 EGFR-표적제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진제 및 EGFR-표적제제를 대상에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진 방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 RON(Recepteur d＇Origine Nantais, NM_002447.1) 유전자를 포함하는, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-표적제제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 또는 바이오 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 가장 큰 특징은 RON 유전자의 활성 및 이의 산물인 활성형 단백질을 바이오 마커로 이용하여 EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측하는 것이다.
본 발명의 바이오 마커는 EGFR-표적제제인 항암제에 대한 감수성의 지표가 될 수 있으며, 항암제에 대한 감수성 마커로서의 정확성 및 신뢰도도 탁월하므로 암의 발생, 발전 및/또는 전이의 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감수성"은 개개의 환자의 암에 대하여 특정약물이 효과를 나타내는 지 여부를 의미한다.
본 명세서에서 감수성을 언급하면서 사용되는 용어 "민감성"은 해당 약물에 대하여 민감하게 반응하여 약물의 효능이 작용하는 것을 의미하고, 본 명세서 내에서 감수성과 혼용된다.
본 명세서에서 감수성을 언급하면서 사용되는 용어 "저항성"은 해당 약물에 대하여 민감하게 반응하지 아니하여 약물의 효능이 작용하지 않는 것을 의미한다.
예컨대, 상기 특정약물은 주로 항암제이며, 이들 항암제에는 암의 종류에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있다. 또한, 유효한 것으로 인정되고 있는 종류의 암이어도, 개개의 환자에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 개개의 환자의 암에 대해 항암제가 효과를 나타내는 지 여부를 항암제 감수성이라고 한다. 따라서, 본 발명에 따라 치료 개시 전에 효과를 기대할 수 있는 환자(반응자)와, 효과를 기대할 수 없는 환자(무반응자)를 예측할 수 있으면, 유효성과 안전성이 높은 화학 요법이 실현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예측"은 본원에서 대상 환자가 약물 또는 약물 세트에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하는데 사용된다. 한 실시 양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 예컨대, 예측은 환자가 처치 후, 예를 들어 특정한 치료제의 처치 및/또는 원발성 종양의수술적 제거 및/또는 특정 기간 동안의 화학요법 후에 암 재발 없이 생존할 지의 여부 및/또는 그러할 확률에 관한 것이다. 본 발명의 예측은 대장암 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측은 환자가 치료 처치, 예컨대 주어진 치료적 처치, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 화학요법 등에 유리하게 반응할 것인지 또는 치료적 처치 후에 환자의 장기 생존이 가능한 지의 여부를 예측하는데 있어서 유용한 도구이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이오 마커는 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, Gene Bank 등재번호 U48722.1), Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11, Gene Bank 등재번호 NM_002390.4), Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32, Gene Bank 등재번호 NM_145004.5), FZD4(Frizzled family receptor 4, Gene Bank 등재번호 NM_012193.2), GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1, NM_001505.2), 및 GPR101(G protein-coupled receptor 101, Gene Bank 등재번호 NM_054021.1) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 더 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이오 마커는 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, NP_004324.2) 유전자가 야생형인 경우, EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측하는 것으로, KRAS, NRAS 또는 BRAF 변이를 갖는 암세포에는 소망하는 효과를 얻지 못하는 경우에 적용할 수 있다.
즉, 본 발명에서는, 본 바이오 마커인 RON, KRAS, NRAS 또는 BRAF 유전자를 이용하며, KRAS, NRAS 또는 BRAF 야생형 유전자를 갖는 암세포 또는 암을 갖는 객체를 대상으로 하여, 세포 내 상기 유전자들이 야생형으로 존재하는 지를 확인하고, 상기 RON 유전자의 발현 수준 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상(또는 야생형 유전자/ 또는 단백질의 발현 수준)에 비하여 저발현 또는 저활성화된 경우, EGFR-표적제제에 대한 감수성이 있는 것으로 판정하고; 상기 RON 유전자의 발현 수준 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 고발현 또는 고활성화된 경우, EGFR-표적제제에 대한 저항성이 있는 것으로 판정할 수 있다.
또한, 상기 Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11, NM_002390.4), Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32, NM_145004.5), FZD4(Frizzled family receptor 4, NM_012193.2), GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1, NM_001505.2), GPR101(G protein-coupled receptor 101, NM_054021.1) 유전자들은 EGFR 전사활성-관련 유전자들로서, 본 발명의 바이오 마커인 RON 유전자의 활성 및 이의 산물인 활성형 단백질에 따라 발현이 유도되므로, 상기 RON 유전자에 의한 EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측하는 바이오 마커로서 포함될 수 있다.
또한, 상기 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, Gene Bank 등재번호 U48722.1) 유전자는, 본 발명의 바이오 마커인 RON 유전자의 활성 및 이의 산물인 활성형 단백질에 따라 활성화가 유도 또는 증가되므로, 상기 RON 유전자에 의한 EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측하는 바이오 마커로서 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 RON(Recepteur d＇Origine Nantais, Gene Bank 등재번호 NM_002447.1) 유전자 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-표적제제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, Gene Bank 등재번호 U48722.1), Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11, Gene Bank 등재번호 NM_002390.4), Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32, Gene Bank 등재번호 NM_145004.5), FZD4(Frizzled family receptor 4, Gene Bank 등재번호 NM_012193.2), GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1, NM_001505.2), 및 GPR101(G protein-coupled receptor 101, Gene Bank 등재번호 NM_054021.1) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 더 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcom a viral oncogene homolog B, NP_004324.2) 유전자가 야생형인 경우, EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측하는 것으로, KRAS, NRAS 또는 BRAF 변이를 갖는 암세포에는 소망하는 효과를 얻지 못하는 경우에 적용할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 EGFR-표적제제는 ACTH(adrenocorticotropic hormone) 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 자궁내막증, 식도암, 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 유선암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양 및 트로포블라스토마로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대한 치료제이다. 보다 바람직하게는 ACTH 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 장암, T-존 림프종, 자궁내막증, 식도암, 담즙 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 두 및 목암, 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 신경아세포종, 유선암, 경관암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양, 또는 트로포블라스토마이며, 가장 바람직하게는 대장암이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대장암(colon cancer)"은 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 EGFR-표적제제는 항암제를 의미하며, 항암효과를 나타내는 한, 어떠한 EGFR-표적제제도 적용할 수 있으며, 바람직하게는 세툭시맙(cetuximab), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 파니투무맙(panitumumab), PKI-166, EKB-569, HKI-272(WAY-177820), 이코티닙(icotinib), 브리가티닙(brigatinib), 아파티닙(afatinib), 라파티닙(lapatinib), 카네르티닙(canertinib), AEE788, XL647, 및 작티마(Zactima)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상이다. 보다 바람직하게는 세툭시맙(cetuximab), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib) 또는 파니투무맙(panitumumab)이며, 가장 바람직하게는 세툭시맙(cetuximab)이다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 표현 "유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정"은 해당 시료 내에서 검출하고자 하는 대상을 검출하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 검출하고자 하는 대상은 시료 내 해당 유전자의 mRNA 및/또는 단백질이다. 즉, 유전자의 전사 산물인 RNA 또는 유전자 산물인 단백질(바람직하게는, 활성형)을 검출함으로써 상기 유전자의 발현 여부를 확인 할 수 있다.
RNA 또는 단백질의 검출은 통상적으로는 시료부터 RNA 또는 단백질을 추출하여, 추출물 중의 RNA 또는 단백질을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 RNA 또는 단백질의 검출은 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함한다.
상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.
예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함한다.
상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 유전자의 발현 여부를 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈옥시다제와루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트카복실라제, 아스파르테이트아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 바이오 마커를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 상기 유전자의 발현; 또는 상기 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 바이오 마커 및 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 RON(Recepteur d＇Origine Nantais, NM_002447.1) 유전자의 발현; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대상의 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-표적제제에 대한 감수성 증진제 또는 감수성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대상은 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, NP_004324.2) 유전자가 야생형인 경우, EGFR-표적제제에 대한 감수성을 예측하는 것으로, KRAS, NRAS 또는 BRAF 변이를 갖는 암세포에는 소망하는 효과를 얻지 못하는 경우에 적용할 수 있다.
본 발명에 따르면, KRAS, NRAS 또는 BRAF 야생형 유전자를 갖고, RON 유전자의 활성 및 이의 산물인 활성형 단백질이 발현되는 암세포는, 그렇지 않은 암세포에 비해 세툭시맙에 의한 암세포의 사멸율이 현저히 떨어지는 결과를 나타낸다.
또한, 본 발명에서 KRAS, NRAS 또는 BRAF 야생형 유전자를 갖고, RON 유전자의 활성 및 이의 산물인 활성형 단백질이 발현되는 암세포에 RON 유전자의 발현; 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킨 경우, 세툭시맙에 의한 암세포의 사멸율이 현저히 증가하는 결과를 나타낸다.
따라서, 이는 KRAS, NRAS 또는 BRAF 야생형(정상) 유전자의 존재(정상 유전자의 정상적인 발현 및 기능); 및 RON 유전자의 발현 억제가 세툭시맙에 대한 암세포의 감수성을 증진시킨다는 것을 제시하며, 이를 기반으로 하여 본 발명은 대상의 EGFR-표적제제에 대한 탁월한 감수성 증진 효과를 제공한다.
본 발명의 감수성 증진제 또는 증진용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 기타 첨가제, 예를 들면, 안정제, 완화제, 유화제 등을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 부형제로서 미결정 셀룰로오소, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 KRAS, NRAS 또는 BRAF 야생형 유전자의 존재 및 RON 유전자의 발현 억제는 EGFR-표적제제 처리시 암세포의 성장을 감소시킨다.
상기 RON 유전자의 발현은 RON 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상에 의해 억제된다.
보다 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 miRNA(microRNA)이며, 가장 바람직하게는 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
*본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA"는, 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 RON mRNA에 특이적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열번호 13의 염기서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지는 않으나 안티센스 RNA, 안티센스 DNA 및 안타고니스트(antagonist) mRNA를 포함한다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커의 발현 수준을 이용하여 EGFR-표적제제에 대한 감수성을 증진시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진제 및 EGFR-표적제제를 유효성분으로 포함하는, EGFR 신호전달 경로의 조절이상과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 EGFR 신호전달 경로의 조절이상과 관련된 질환은 암, 아테롬성 동맥경화증, 폐 섬유증, 신장 섬유증 및 재생, 간 질환, 알러지 질환, 염증 질환, 자가면역 질환, 뇌혈관 질환, 심혈관 질환, 또는 기관 이식과 관련된 증상이며, 바람직하게는, 암이다.
즉, 본 발명의 EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진제인 RON(Recepteur d＇Origine Nantais, NM_002447.1) 유전자의 발현; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 항암제에 대한 감수성을 증가시켜, 이들 항암제와 함께 투여되는 경우 항암제의 항암작용을 증가시킴으로써 암의 치료를 더욱 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "암(cancer) "은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)과 동일한 의미로도 사용된다.
본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 암은 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 위암(stomach cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 대장암(colon cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer), 골수암(bone marrow tumor)등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 대장암(colon cancer)의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (i) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ii) 질환 또는 질병의 경감; 및 (iii) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 증진제 내 해당 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 감수성 증진제 및 항암제인 EGFR-표적제제를 이용하여 암세포의 세포사를 향상시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(a) 대상으로부터 생물학적 시료를 준비하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료 내 RON(Recepteur d＇Origine Nantais, NM_002447.1) 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) (b) 단계에서 측정한 수준 확인 결과에 기초하여 상기 대상의 EGFR-표적제제에 대한 감수성을 판정하는 단계;
를 포함하는 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대상은 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, NP_004324.2) 야생형 유전자를 갖는다.
본 발명의 예측 방법은, 대상 환자로부터 생물학적 시료를 획득하고, 상기 시료 내에서 상술한 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 복수개 유전자의 발현 여부를 측정한 후, 정상 시료와 비교하여, 기재된 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제되었거나 감소한 경우에, 당해 시료가 EGFR-표적제제에 대하여 감수성이 있다라고 판정; 및 기재된 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 증가되었거나 향상된 경우에, 당해 시료가 EGFR-표적제제에 대하여 저항성이 있다라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 예측 방법은 시료 내에서의 특정 유전자 또는 단백질의 발현(바람직하게는, 활성형) 여부를 암세포의 항암제에 대한 감수성의 지표로 하는 점을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, Gene Bank 등재번호 U48722.1), Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11, NM_002390.4), Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32, NM_145004.5), FZD4(Frizzled family receptor 4, NM_012193.2), GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1, NM_001505.2), GPR101(G protein-coupled receptor 101, NM_054021.1) 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 추가적으로 측정한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 저발현 또는 저활성화된 경우, 대상의 EGFR-표적제제에 대한 감수성(민감성)이 있는 것으로 판정한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 고발현 또는 고활성화된 경우, 대상의 EGFR-표적제제에 대한 저항성이 있는 것으로 판정한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 저발현인 경우, 대상의 EGFR-표적제제에 대한 감수성(민감성)이 있는 것으로 판정한다.
보다 상세하게는, 본 발명의 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 결과를 기초로 하여, KRAS, NRAS 또는 BRAF 야생형 유전자를 갖고, RON 유전자의 활성 및 이의 산물인 활성형 단백질의 수준이 정상(야생형)의 값에 비하여 억제 및/또는 감소된 것으로 확인된 경우, 대상 환자로부터 획득된 당해 종양 세포가 항암제인 EGFR-표적제제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판정하는 것이다. 이때, 추가적으로 상기 Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하여, 정상(야생형)의 값에 비하여 억제 및/또는 감소된 것으로 확인된 경우, 대상 환자로부터 획득된 당해 종양 세포가 항암제인 EGFR-표적제제에 대하여 감수성(민감성)이 있는 것으로 판정하는 것이다.
본 명세서에서 상기 유전자들의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저발현" 또는 "저활성"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다. 또한, 바이오 마커의 "정상" 발현 수준 혹은 값과 비교해서 "차동(differential) 수준" 혹은 "차동 값"을 지니거나 "상이하게 발현된" 것으로서 지칭될 수 있으며, 발현에 있어서 정량적 차이뿐만 아니라 정성적 차이의 둘 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 RON 유전자 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준의 측정은, 상기 유전자의 스플라이싱 변이체(Splicing variant) 또는 돌연변이(Mutant) 존재 여부 측정을 추가적으로 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 유전자의 변이체 또는 상기 유전자 내 하나 이상의 변이의 존재는 상기 유전자의 발현 양상의 변화를 유발하여, EGFR-표적제제에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있다(실시예 3 참조).
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체(variant)"는 해당 유전자가 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 엑손 부위가 삭제되어 생성된 RON isoform을 의미하며, 진핵 생물에서 유전자 발현 조절의 중요한 과정 중 하나인 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해서 RON의 활성 정도는 조절된다.
본 발명에서 이용한 RON△155(또는 RON Delta 155), RON△160(또는 RON Delta 160) 및 RON△165(또는 RON Delta 165)는 이러한 스플라이싱에 의한 엑손들의 스키핑(skipping)에 의해 생성되는 형태로서 리간드 없이도 구조적으로 항상 활성화되어 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 RON의 선택적 스플라이싱(Alternative splicing) 기작에 의하여 엑손이 결실되어 있는 스플라이싱 변이체들은 그 발현 여부에 따라 약물에 대한 감수성이 상이하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "돌연변이(mutant)" 또는 "변이"는 해당 유전자의 해당 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 염기 치환, 결실, 삽입, 증폭 및 재배열된 것을 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열의 변화 (예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 역위 또는 치환, 예컨대 단일 뉴클레오티드다형성 (SNP))를 지칭한다. 이 용어는 또한 달리 나타내지 않는다면, 뉴클레오티드 서열의 보체에서의 상응하는 변화도 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 체세포 돌연변이 또는 배선 다형성일 수 있다.
또한, 아미노산 변이는 참조 서열 (예를 들어, 야생형 서열)에 비해 아미노산 서열의 변화(예를 들어, 1개 이상의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 예컨대 내부 결실 또는 N- 또는 C-말단의 말단절단(truncation))를 지칭한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 돌연변이는 1 개의 아미노산이 치환된 E387A 및 H424L 점 돌연변이(point mutant)이다.
또한, 본 발명에서는 RON 단백질의 아미노산 E387 부위와 H424 부위가 EGFR 단백질과 결합할 수 있는 부위임을 확인하였다.
상기 변이의 검출은 당업계에 널리 공지되어 있는 기술을 이용하여 표적 분자 클로닝 및 서열 분석에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, DNA 서열분석; 대립유전자-특이적 뉴클레오티드 혼입 검정 및 대립유전자-특이적 프라이머 연장 검정 (예를 들어, 대립유전자-특이적 PCR, 대립유전자-특이적 라이게이션 연쇄 반응 (LCR) 및 갭-LCR)을 비롯한 프라이머 연장 검정; 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 검정 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드라이게이션검정); 절단제로부터의 보호를 이용하여 핵산 이중나선 내의 미스매치된 염기를 검출하는 절단 보호 검정; MutS단백질 결합 분석; 변이체 및 야생형 핵산 분자의 이동성을 비교하는 전기영동 분석; 변성-구배 겔 전기영동(DGGE, 예를 들어 문헌 [Myers et al. (1985) Nature 313:495]에서와 같음); 미스매치된 염기 쌍에서의 RNase절단의 분석; 헤테로 이중나선 DNA의 화학적 또는 효소적 절단의 분석; 질량 분광측정법 (예를 들어, MALDITOF); 유전적 비트 분석 (GBA); 5' 뉴클레아제 검정 (예를 들어, 택맨(TaqMan); 및 분자 비콘을 사용하는 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 바이오 마커의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커를 이용하여 감수성이 있는 것으로 판정하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진제 및 EGFR-표적제제를 대상에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, EGFR-표적제제에 대한 감수성 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상술한 감수성 증진제 및 항암제인 EGFR-표적제제를 이용하여 감수성을 증진시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 EGFR-표적제제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 이용하면, 개개의 환자의 상기 감수성을 치료 개시 전에 확실하게 판정할 수 있어, 치료 효과가 높은 항암제의 선택이 가능해진다. 또한, 효과가 얻어지지 않는 항암제의 사용을 회피할 수 있기 때문에 불필요한 부작용을 회피할 수 있다.
도 1a은 인간 대장암 세포주에서의 RON 단백질의 활성화 유무를 보여준다.
도 1b는 RON 유전자에 의해서만 변화하는 유전자들의 분석 결과를 보여준다.
도 1c는 RON 활성화에 의한 EGFR transactivation 관련된 유전자들의 real-time PCR 분석 결과를 보여준다.
도 1d는 RON 활성화에 의해 EGFR transactivation에 관련된 유전자들의 RT-PCR 발현 분석 결과를 보여준다.
도 1e는 RON 억제에 의한 EGFR transactivation 관련 유전자들의 real-time PCR 분석 결과를 보여준다.
도 1f는 RON 활성화에 의한 EGFR 단백질 활성 분석 결과를 보여준다.
도 2a는 RON 활성화에 의한 EGFR의 인산화 유도 결과를 보여준다.
도 2b는 RON 억제에 의한 EGFR 단백질의 활성 변화 분석 결과를 보여준다.
도 2c는 RON 억제에 의한 EGFR ligand 의존적 EGFR 활성 변화 분석 결과를 보여준다.
도 3a는 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 내인성(endogenous) 세포 내 결합 분석결과를 보여준다.
도 3b는 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 외인성(exogenous) 세포 내 결합 분석 결과를 보여준다.
도 3c는 in vivo full down assay를 통한 RON 단백질과 결합하는 EGFR 단백질 domain 분석 결과를 보여준다.
도 3d는 in vitro cell free full down assay를 통한 RON 단백질과 결합하는 EGFR 단백질 domain 분석 결과를 보여준다.
도 3e는 Computer modeling을 이용한 EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질 결합 부위 예측 분석 결과를 보여준다.
도 3f는 EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질의 결합 부위 분석 결과를 보여준다.
도 3g는 EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질의 결합 부위에 따른 EGFR 활성 분석 결과를 보여준다.
도 4a는 RON 활성형 단백질 유무에 따른 ligand 의존적 EGFR 활성 여부 분석 결과를 보여준다.
도 4b는 RON의 ligand 의존적 활성 유무에 따른 ligand 의존적 EGFR 활성 여부 분석 결과를 보여준다.
도 5a는 RON 활성 억제를 통한 EGFR의 활성 억제 와 cetuximab에 대한 EGFR 활성 억제 분석 결과를 보여준다.
도 5b는 RON 활성 유무에 의한 cetuximab 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5c는 RON 발현 억제 후 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5d는 RON 발현 억제 후 cetuximab에 의한 하위 신호 기전 분석 결과를 보여준다.
도 5e는 RON 활성 억제 후 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5f는 RON의 활성 유무에 따른 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5g는 RON의 활성 유무에 따른 cetuximab에 의한 세포 성장 억제 분석 결과를 보여준다.
도 5h는 RON knockout isogenic 세포주에서 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5i는 RON knockout isogenic 세포주에서 cetuximab에 의한 세포 성장 억제 분석 결과를 보여준다.
도 6은 RON knockout isogenic 세포주를 이용한 in vivo xenograft 모델에서 RON 존재 유무에 따른 cetuximab의 종양 억제 효능 분석 결과를 보여준다.
도 7은 RON 활성이 있는 세포주에서 RON 항체 항암제와 cetuximab을 병용 처리한 결과를 보여준다
도 8은 대장암 환자 조직(cetuximab을 처방 받은 환자)에서 RON 활성을 분석한 결과를 보여준다.
도 1b는 RON 유전자에 의해서만 변화하는 유전자들의 분석 결과를 보여준다.
도 1c는 RON 활성화에 의한 EGFR transactivation 관련된 유전자들의 real-time PCR 분석 결과를 보여준다.
도 1d는 RON 활성화에 의해 EGFR transactivation에 관련된 유전자들의 RT-PCR 발현 분석 결과를 보여준다.
도 1e는 RON 억제에 의한 EGFR transactivation 관련 유전자들의 real-time PCR 분석 결과를 보여준다.
도 1f는 RON 활성화에 의한 EGFR 단백질 활성 분석 결과를 보여준다.
도 2a는 RON 활성화에 의한 EGFR의 인산화 유도 결과를 보여준다.
도 2b는 RON 억제에 의한 EGFR 단백질의 활성 변화 분석 결과를 보여준다.
도 2c는 RON 억제에 의한 EGFR ligand 의존적 EGFR 활성 변화 분석 결과를 보여준다.
도 3a는 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 내인성(endogenous) 세포 내 결합 분석결과를 보여준다.
도 3b는 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 외인성(exogenous) 세포 내 결합 분석 결과를 보여준다.
도 3c는 in vivo full down assay를 통한 RON 단백질과 결합하는 EGFR 단백질 domain 분석 결과를 보여준다.
도 3d는 in vitro cell free full down assay를 통한 RON 단백질과 결합하는 EGFR 단백질 domain 분석 결과를 보여준다.
도 3e는 Computer modeling을 이용한 EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질 결합 부위 예측 분석 결과를 보여준다.
도 3f는 EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질의 결합 부위 분석 결과를 보여준다.
도 3g는 EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질의 결합 부위에 따른 EGFR 활성 분석 결과를 보여준다.
도 4a는 RON 활성형 단백질 유무에 따른 ligand 의존적 EGFR 활성 여부 분석 결과를 보여준다.
도 4b는 RON의 ligand 의존적 활성 유무에 따른 ligand 의존적 EGFR 활성 여부 분석 결과를 보여준다.
도 5a는 RON 활성 억제를 통한 EGFR의 활성 억제 와 cetuximab에 대한 EGFR 활성 억제 분석 결과를 보여준다.
도 5b는 RON 활성 유무에 의한 cetuximab 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5c는 RON 발현 억제 후 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5d는 RON 발현 억제 후 cetuximab에 의한 하위 신호 기전 분석 결과를 보여준다.
도 5e는 RON 활성 억제 후 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5f는 RON의 활성 유무에 따른 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5g는 RON의 활성 유무에 따른 cetuximab에 의한 세포 성장 억제 분석 결과를 보여준다.
도 5h는 RON knockout isogenic 세포주에서 cetuximab에 의한 세포 사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5i는 RON knockout isogenic 세포주에서 cetuximab에 의한 세포 성장 억제 분석 결과를 보여준다.
도 6은 RON knockout isogenic 세포주를 이용한 in vivo xenograft 모델에서 RON 존재 유무에 따른 cetuximab의 종양 억제 효능 분석 결과를 보여준다.
도 7은 RON 활성이 있는 세포주에서 RON 항체 항암제와 cetuximab을 병용 처리한 결과를 보여준다
도 8은 대장암 환자 조직(cetuximab을 처방 받은 환자)에서 RON 활성을 분석한 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 방법 및 조건
면역침강법(immunoprecipitation)
대장암 세포주에서 RON 활성형을 분석하기 위하여, 대장암 세포주 용해액 500㎍을 항-RON 항체 1㎍과 혼합한 후, 4℃에서 12시간 동안 배양한 후 Protein-Sepharose bead (Santa Cruz Biotehcnology, Santa Cruz, CA, USA) 20㎕를 첨가한 후 2시간동안 추가 반응하였다. 면역침강물을 완충액(Nondiet P-40 lysis buffer)으로 5회 세척한 후, 2XSDS 샘플 용액 20㎕ 를 첨가하고 가열한 후 anti-RON (Santa Cruz Biotechonology), anti-phospho-Tyrosine (Cell Signaling, Beverly, CA, USA) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
내인성 RON과 EGFR의 상호작용을 분석하고자, HCT-8 세포주의 용해액 300㎍과 항-RON 항체 1㎍ 혹은 항-rabbit IgG 항체 1㎍을 혼합한 후 4℃에서 12시간 동안 배양한 후 Protein-Sepharose bead (Santa Cruz Biotehcnology, Santa Cruz, CA, USA) 20㎕를 첨가한 후 2시간동안 추가 반응하였다. 면역침강물을 완충액(Nondiet P-40 lysis buffer)으로 5회 세척한 후, 2XSDS 샘플 용액 20㎕를 첨가하고 가열한 후 anti-RON (Santa Cruz Biotechonology), anti-EGFR(Cell Signaling, Beverly, CA, USA) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 외인성 RON과 EGFR의 상호작용을 분석하고자, RON 단백질 자체를 발현하고 있지 않는 LoVo 대장암 세포주에 RON 활성형인 △160 유전자형을 트랜스펙션 한 후 48시간 뒤에 세포액을 수거하여 세포액 300㎍과 항-RON 항체 1㎍ 혹은 항-rabbit IgG 항체 1㎍을 혼합한 후 4℃에서 12시간 동안 배양한 후 Protein-Sepharose bead (Santa Cruz Biotehcnology, Santa Cruz, CA, USA) 20㎕를 첨가한 후 2시간동안 추가 반응하였다. 면역침강물을 완충액(Nondiet P-40 lysis buffer)으로 5회 세척한 후, 2XSDS 샘플 용액 20㎕를 첨가하고 가열한 후 anti-RON (Santa Cruz Biotechonology), anti-EGFR(Cell Signaling, Beverly, CA, USA) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
마이크로어레이 분석
RON을 단백질을 발현하고 있지 않는 Colo320HSR 대장암 세포주에 RON 활성형인 △160 및/또는 c-MET을 발현하는 구조물(plasmid)로 48시간 동안 트랜스펙션시켰다. 이 후, 세포의 용해물을 마이크로어레이 분석하였다.
유전자 과발현 및 억제 방법
RON과 EGFR의 외인성 상호작용을 분석하고자, RON 단백질을 발현하고 있지 않는 LoVo 대장암 세포주에 RON 활성형인 △160을 발현하는 구조물로 48시간 동안 트랜스펙션하였다.
RON과 EGFR의 내인성 상호작용을 분석하고자, RON이 활성화 되어 있는 HCT-8 대장암 세포주에 RON siRNA(small interfering RNA)로 48시간 동안 트랜스펙션하였다.
상기 RON siRNA 서열(서열번호 13)은 다음과 같다: 5'-ACUUUGUAGAGGAGUUUGAUU-3'.
RT-PCR(Reverse Transcription-PCR) 및 실시간 PCR
RT-PCR을 수행하기 위하여 RON을 발현하고 있지 않는 Colo320HSR 대장암 세포주와 RON 활성형인 RON△160을 발현하는 구조물로 48시간 동안 트랜스펙션 시킨 세포주, RON이 활성화 되어 있는 KM12C 대장암 세포주에 RON siRNA를 이용하여 48시간 트랜스펙션시킨 세포주로부터 Trizol(Cat. #15596-026, Life technologiesTM)을 이용하여 각각 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR Kit (AccuPower RT PreMix, Bioneer) 를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 해당 유전자의 발현정도 차이는 합성된 cDNA, 유전자 특이적인 primer를 이용하여 PCR (AccuPower PCRPreMix, Bioneer) 로 확인하였고, real-time PCR (LightCycler 480 SYBR Green, Roche)을 이용하여 정량화하였다.
| 유전자 | 정방향 | 역방향 |
| Adam11 | 5'-TGGCTTCCTCCTCTGTGTCAA-3'(서열번호 1) | 5'-GCACTTCCCTTCATTGCTGC-3'(서열번호 2) |
| Adam32 | 5'-AATGGCAGATTGGAGGGAAATG-3'(서열번호 3) | 5'-TTCATAGCAGGCAAATGGAGCA-3'(서열번호 4) |
| FZD4 | 5'-TGACTGGCTTGTGCTATGTTGG-3'(서열번호 5) | 5'-ATGCCTGAAGTGATGCCCAC-3'(서열번호 6) |
| GPR101 | 5'-GGCAGAATGGAAGCCAAGGA-3' (서열번호 7) |
5'-TTGCTGTTACGACGACTGGGTG-3'(서열번호 8) |
| GPER | 5'-ATCGTGCCCTTCGCCATCAT-3'(서열번호 9) | 5'-CCAGTCGTGAGGTTTCCTAAGCAG-3'(서열번호 10) |
| GAPDH | 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'(서열번호 11) | 5'-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'(서열번호 12) |
| 42℃ | 90℃ |
| 60분 | 5분 |
| 1회 | 35회 | 1회 | ||
| 95℃ | 95℃ | 60℃ | 72℃ | 72℃ |
| 5분 | 30초 | 1분 | 1분 | 10분 |
| 1회 | 50회 | 1회 | ||
| 95℃ | 95℃ | 58℃ | 72℃ | 72℃ |
| 5분 | 30초 | 30초 | 1분 | 10분 |
웨스턴 블롯웨스턴 블롯을 수행하기 위하여, 각 세포로부터 분리한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리한 후, 이를 멤브레인 (PolyScreen membranes (New England Nuclear, Boston, MA, USA)으로 옮긴 후, 다양한 항체 (anti-phospho RON (MyBioSource, San Diego, California, USA), anti-phospho Tyrosine, anti-EGFR, anti-phospho EGFR (Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-RON 및 anti-r-tubulin (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 1XTBS-T 완충액으로 10분간 3번 세척하였다. 적절한 항 rabbit-HRP 혹은 항 mouse-HRP secondary 항체를 상온에서 2시간 반응시킨 후에 1XTBS-T 완충액으로 10분간 3번 세척한 후 ECL solution (Amersham, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 단백질의 발현을 검증하였다.
phospho-RTK 어레이
RON 단백질을 발현하고 있지 않는 Colo320HSR 세포주에 RON 활성형인 △160 구조물을 48시간 동안 트랜스펙션 한 후, 세포 용해물을 수거하였다. 수거된 세포용해물 50㎍과 Human phospho-RTK array kit (R&D Systems, Inc, Minneapolis, MN, USA)에 포함되어 있는 멤브레인과 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 TBS-T 완충액으로 3번씩 세척한 후, anti-phospho-Tyrosine HRP 항체를 상온에서 2시간동안 반응시킨 후 TBS-T 완충액으로 3번씩 세척하였다. 이 후 멤브레인을 ECL solution (Amersham, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 RTK (Receptor tyrosine kinase) 단백질들의 발현 변화를 검증하였다.
항암제 처리
RON이 활성화 되어 있지 않는 CaCo2 및 LIM1215 대장암 세포주와 활성화 되어 있는 KM12C 세포주에 세툭시맙(Cetuximab)(Merck & Co., Inc, NJ, USA)을 5, 10, 20㎍/ml 로 48시간 동안 처리한 후, 세포액을 수거하여 트립판 블루 계수법(trypan blue counting)을 실시하였다(도 3a).
RON이 활성화 되어 있는 KM12C 대장암 세포주에 RON siRNA를 48시간 동안 처리한 후 Cetuximab 20㎍/ml로 48시간 처리한 후, 세포액을 수거하여 트립판 블루 계수법을 실시하였다.
저해제 처리
RON이 활성화 되어 있는 KM12C 대장암 세포주에 RON 저해제(LY2801653) 3 μM과 EGFR 표적제제(cetuximab) 20㎍/ml을 48시간 처리하였다. 처리 후에 세포 용해물을 수거하여 트립판 블루 계수법을 실시하였다.
또한, RON-타겟 항체 항암제인 나르나투맙(Narnatumab)(Creative Diagnostic #TAB-184 Anti-Human RON Therapeutic Antibody)과 EGFR 표적제제(cetuximab) 100㎍/ml을 48시간 처리하였다. 처리 후 위와 동일한 방법으로 세포 사멸 유도 정도를 확인하였다.
돌연변이(point mutant) 제작
돌연변이 제작은 Muta-Direct mutagenesis 키트(Intron, Cat No. 15071)을 이용하여 키트에서 제공하는 지침에 따라 실시하였다. 돌연변이 제작(Mutagenesis)에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:
RON (E387A); Forward: 5'-GGA GCG CTG TTG TGC ATC CCC AGT CCA TCC-3', Reverse: 5'-GGA TGG ACT GGG GAT GCA CAA CAG CGC TCC-3', RON (H424L); Forward: 5'-ACA CCA GCT GCC GCC TCT TCC CTC TGC TGG-3', Reverse: 5'-CCA GCA GAG GGA AGA GGC GGC AGC TGG TGT-3', RON (K1114M); Forward: 5'-AAT GTG CCA TCA TGT CAC TAA GTC G-3', Reverse: 5'-CGA CTT AGT GAC ATG ATG GCA CAT T-3', EGFR (D813N); Forward: 5'-TTG GTG CAC CGC AAC CTG GCA GCC AGG-3', Reverse: 5'-CCT GGC TGC CAG GTT GCG GTG CAC CAA-3'.
상기 프라이머와 Muta-direct enzyme을 이용하여 mutation 진행 후 E-Coli에 형질전환(transformation)을 진행하였다. Colonies에서 DNA 추출 후 시퀀싱 분석 방법을 통해 변이(mutation) 여부를 확인하였다.
대장암 세포주 혹은 대장암 환자 조직에서 RON 활성 분석
RON 활성 분석을 위해 세포주 또는 대장암 환자 조직에서 단백질을 추출 (RIPA buffer 사용)한 후, 20ug의 세포 및 50ug의 대장암 환자 조직에 phospho-RON 항체(Mybiosource, MBS462024, dilution factor 1:1000)를 이용하여 활성 여부를 확인하였다.
또한, RON 항체(santa cruz; sc-322, Lot#G1514, 2ug으로 2일 incubation)로 면역침강을 한 후(세포주와 대장암 환자 조직 300ug 사용), phospho-Tyrosine 항체(Cell signaling;9411, dilution factor 1:1000)로 인산화(phosphorylation) 여부를 확인하였다. RON 활성형(form)인 RON△155 및 RON△160(alternative splicing form)을 확인하기 위해 대장암 세포주 혹은 대장암 환자 조직에서 Trizol 시약으로 RNA를 추출하였다.
cDNA 합성 후, 두 가지 프라이머를 사용하여 분석을 하였다.
첫 번째는 RON△155 및 RON△160을 구별하기 위해 디자인한 프라이머를 사용하였고, 상기 프라이머는 다음과 같다: Forward: 5'-CTCTGGGGACCAGGTTTTCC-3', Reverse: 5'-ACCATCAATGGCAGGGAGTG-3'. RT-PCR 조건은 94℃에서 5 분, 94℃에서 30 초, 63℃에서 30 초, 72℃에서 1 분 30 초로 37 사이클(cycles)을 실시하였고, 72℃에서 10 분간 연장시켰다. RON 야생형인 경우 1552bp, RON△155인 경우 1078bp, RON△160인 경우 1225bp로 확인되었다.
이를 한 번 더 확인하기 위해 기존 문헌에 보고된 프라이머를 사용하였고, 상기 프라이머는 다음과 같다: Forward: 5'-TGG TCA GTA GCA GCT TCT CA-3', Reverse: 5'-AGG CAG CAG GAT ACC AAG GA-3'. RT-PCR 조건은 94℃에서 5 분, 94℃에서 30 초, 57℃에서 45 초, 72℃에서 1 분으로 38 사이클을 실시하였고, 72℃에서 10 분간 연장시켰다. RON 야생형인 경우 1.6kb, RON△160인 경우 1.3kb, RON△155인 경우 1.1kb로 확인되었다.
실시예 1. RON 단백질의 활성 유무에 따른 EGFR의 활성
1-1. 인간 대장암 세포주에서의 RON 단백질 활성형 존재 유무
본 발명자들은 RON 단백질이 활성화 또는 비활성화되어 있는 대장암 세포주를 선별하고자, 총 19 종의 인간 대장암 세포주에서 RON 인산화를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 확인하였다.
이러한 인산화된 RON 단백질은 RON 활성형 단백질로 간주하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 18 종의 세포주 중 4 개의 세포주 (HT-29, KM12C, KM12L4, SW1417)에서 RON의 인산화 단백질 발현이 관찰되어 이들 4 개의 세포주가 RON 활성을 갖는 것을 알 수 있다.
한편, LoVo, Colo320HSR 대장암 세포주에서는 RON 단백질 자체가 존재하지 않음을 보여준다.
1-2. DNA 마이크로어레이 분석을 이용한 RON 단백질 활성화에 따른 유전자 발현 분석
본 발명자들은 RON 단백질이 존재하지 않는 Colo320HSR 세포주에서의 RON 발현에 따른 유전자 발현 양상을 분석하고자, RON 단백질이 존재하지 않는 Colo320HSR 세포주에 MET 및 RON 활성화형인 △160 유전자를 동시에 과발현시킨 후 마이크로어레이를 실시하였다.
RON 유전자의 과발현은 RON 유전자 또는 단백질의 활성화로 간주하였다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, RON 활성화에 의해서만 변화하는 유전자들을 MET 유전자만 과발현시킨 샘플군의 유전자들과 비교하여 분석한 결과 EGFR에 연관된 5 개의 유전자들(Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101)이 RON에 의해 변화하는 유전자들로 동정되었다.
1-3. 대장암 세포주에서의 RON 활성화에 따른 EGFR 전사활성(transactivation)-관련 유전자들의 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction) 분석
본 발명자들은 RON 활성화에 따른 EGFR 전사활성-관련 유전자들의 발현 변화 양상을 분석하고자, RON이 발현하지 않는 Colo320HSR 대장암 세포주에 RON 활성화형인 △160 유전자를 과발현시킨 후, RON에 의해 발현이 변화하는 것으로 추정되는 EGFR 전사활성에 관여하는 5 개의 유전자들(Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101)에 대하여 실시간 PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, RON 과발현에 의하여 Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101 유전자의 발현이 유의적으로 증가하는 것으로 관찰되었다.
1-4. 대장암 세포주에서의 RON 활성화에 따른 EGFR 전사활성-관련 유전자들의 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 분석
본 발명자들은 RON 활성화에 따른 EGFR 전사활성-관련 유전자들의 발현 변화 양상을 분석하고자, RON이 발현하지 않는 Colo320HSR 대장암 세포주에 RON 유전자의 활성화형인 △160 유전자를 과발현시킨 후, RON에 의해 발현이 변화하는 것으로 추정되는 EGFR 전사활성에 관여하는 5 개의 유전자들(Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101)에 대하여 PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, RON 활성화에 의하여 Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101 유전자의 발현이 RON 유전자의 활성화형인 △160 유전자를 과발현시킨 샘플군에서만 유의적으로 증가하는 것으로 관찰되었다.
1-5. RON 억제시킨 대장암 세포주에서의 EGFR 전사활성-관련 유전자들의 실시간 PCR 분석
본 발명자들은 RON 억제에 따른 EGFR 전사활성-관련 유전자들의 발현 변화 양상을 분석하고자, RON이 활성화 되어 있는 KM12C 대장암 세포주에 siRNA 기법을 사용하여 RON 활성을 인위적으로 억제시킨 후에 EGFR 전사활성에 관련된 유전자들(Adam11, Adam32, FZD4, GPER, GPR101)의 발현을 실시간(real-time) PCR로 분석하였다.
그 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이, RON 활성화 억제에 의하여 FZD4, GPR101 유전자가 유의적으로 감소하는 것을 보여준다.
1-6. RON 활성화에 의한 EGFR 단백질 활성 분석
상술한 바와 같이, 실시예 1-2(도 1b)에서 동정되고 실시예 1-3 내지 1-5(도 1c-e)에서 검증되었던 EGFR 전사활성(transactivation) 관련 유전자들의 발현이 RON 활성화에 의한 것으로 확인되었다. 이에 본 발명자들은 실제 RON 활성화에 따라 EGFR 단백질의 활성화가 유도되는지 확인하기 위하여, RON이 발현되지 않는 Colo320HSR 대장암 세포주에 RON 활성화 형인 △160 유전자를 과발현시킨 후 웨스턴 블롯팅을 이용하여 EGFR의 인산화 단백질 발현 유무를 확인하였다.
그 결과, 도 1f에 나타낸 바와 같이, RON이 활성화된 경우 EGFR의 인산화 단백질이 증가되는 것이 관찰되었고(a), RON 활성화 형인 △160 유전자를 과발현 시킨 후 RTK-protein array를 통하여 EGFR의 인산화가 유도되는 것이 확인되었다. 따라서, RON의 활성화에 따라 EGFR의 활성이 유도되는 것을 알 수 있었다
실시예 2. RON 활성 유무에 따른 EGFR 활성의 변화
2-1. RON 단백질의 활성화에 의한 EGFR 단백질의 활성화
본 발명자들은 RON 활성화에 의한 EGFR 단백질의 활성화를 확인하고자, RON이 발현하지 않는 LoVo 및 Colo320HSR 대장암 세포주에 RON 유전자의 활성화 형인 △160 유전자를 과발현시킨 후, 웨스턴 블롯을 실시하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, RON 활성화에 따라 EGFR의 활성이 증가되는 것을 확인하였다.
2-2. RON 억제에 의한 EGFR 단백질의 활성 변화
본 발명자들은 RON 단백질의 활성화에 의한 EGFR 단백질의 활성 변화를 확인하고자, RON이 발현되고 활성화되어 있는 KM12C 및 HT29 대장암 세포주에 siRNA 기법을 사용하여 RON을 인위적으로 억제시킨 후, 웨스턴 블롯을 실시하여 EGFR의 인산화 유도를 확인하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, RON 억제에 따라 EGFR의 활성 또한 감소되는 것을 확인하였다.
2-3. RON 억제에 의한 EGFR 리간드(ligand) 의존적 EGFR 활성 변화
본 발명자들은 EGFR 리간드(ligand) 의존적 EGFR 활성 변화를 확인하고자, RON이 발현되고 활성화되어 있는 KM12C 대장암 세포주에 siRNA 기법을 사용하여 RON을 억제시킨 후, EGFR의 활성을 유도하는 EGF 리간드(ligand) 처리 시간에 따른 EGFR의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, RON의 억제에 따라 EGF에 의해 유도된 EGFR의 인산화가 감소되어 활성이 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 3. RON 단백질의 활성화에 따른 세툭시맙(cetuximab)의 약물 감수성 분석
3-1. RON 단백질과 EGFR 단백질 간의 내인성(endogenous) 세포 내 결합 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있지 않은 CaCO2 대장암 세포주 및 RON이 활성화 되어 있는 KM12C 대장암 세포주의 세포 내 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 결합 유무를 분석하기 위해. RON 항체를 이용하여 면역침강법(immunoprecipitation)으로 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 결합 유무를 관찰하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, RON의 활성이 없는 CaCO2 세포에서는 RON 단백질과 EGFR 단백질의 결합이 이루어지지 않고 RON의 활성이 있는 KM12C 세포에서는 RON 단백질과 EGFR 단백질의 결합이 이루어지는 것을 알 수 있다.
3-2. RON 단백질과 EGFR 단백질 간의 외인성(exogenous) 세포 내 결합 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있지 않은 대장암 세포주 CaCO2에 RON 정상형 유전자와 EGFR 정상형 유전자를 각각 과발현 시킨 것과 RON 정상형 유전자와 EGFR 정상형 유전자를 동시에 과발현 시킨 후 RON 항체를 이용하여 면역침강법(immunoprecipitation)으로 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 결합 유무를 관찰하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, RON 정상형 유전자와 EGFR 정상형 유전자를 동시에 과발현시킨 경우 RON 단백질과 EGFR 단백질의 결합이 이루어지는 것을 알 수 있다.
3-3. 인 비보 풀다운 어세이(in vivo full down assay)를 통한 RON 단백질과 결합하는 EGFR 단백질 도메인(domain) 분석
본 발명자들은 대장암 세포주가 아닌 RON과 EGFR의 발현이 없는 293T 세포주에 RON 단백질과 EGFR의 키나제 도메인(kinase domain) 단백질 및 EC(extracellular domain) 단백질을 각각 과발현시킨 것과 RON과 EGFR의 키나제 도메인 단백질을 동시에 과발현시킨 후 RON 항체를 이용하여 면역침강법(immunoprecipitation)으로 RON 단백질과 결합하는 EGFR의 domain을 관찰하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, RON과 EGFR의 EC 단백질이 결합하는 것을 알 수 있다.
3-4. 인 비트로 셀 프리 풀 다운 어세이(in vitro cell free full down assay)를 통한 RON 단백질과 결합하는 EGFR 단백질 도메인 분석
본 발명자들은 RON 단백질과 EGFR의 EC(extracellular domain) 단백질과의 결합을 재확인하기 위하여, 인 비트로 셀 프리 풀 다운 어세이를 이용하여 RON 정상형 단백질과 활성형 △160 단백질을 각각 EGFR의 키나제 도메인 단백질과 EC(extracellular domain) 단백질에 반응시켜 결합 유무를 관찰하였다.
그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, RON의 정상형 단백질과 활성형 △160 단백질 모두 EGFR의 EC 단백질과 결합하는 것을 알 수 있다.
3-5. 컴퓨터 모델링(Computer modeling)을 이용한 EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질 결합 부위 예측 분석
본 발명자들은 EGFR 단백질과 결합하는 RON의 중요 결합부위를 분석하기 위해, 컴퓨터 모델링 시스템을 이용하여 EGFR 단백질의 구조와 RON 단백질의 구조를 대입하여 EGFR과 결합하는 RON의 결합 부위를 예측하였다.
그 결과, 도 3e에 나타낸 바와 같이, RON 단백질의 아미노산 E387 부위와 H424 부위가 EGFR 단백질과 결합할 수 있는 부위로 예측 분석되었다.
3-6. EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질의 결합 부위 분석
본 발명자들은 EGFR 단백질과 결합하는 RON의 중요 결합부위를 분석하기 위해, RON과 EGFR의 발현이 없는 293T 세포주에 RON 정상형 유전자 및 활성형 △160와 RON의 E387A 및 H424L 점 돌연변이(point mutant) 유전자를 각각 과발현 시키고 EGFR 유전자와 동시에 과발현 시켜 후 RON 항체를 이용하여 면역침강법(immunoprecipitation)으로 정상형, 활성형, 돌연변이형 RON 단백질과 EGFR 단백질간의 결합을 관찰하였다.
그 결과, 도 3f에 나타낸 바와 같이, RON의 정상형, 활성형 및 E387A 돌연변이형에서만 결합하는 것이 확인되었고, RON의 H424L 돌연변이형에서는 EGFR 단백질이 결합하지 않는 것을 알 수 있다.
3-7. EGFR 단백질과 결합하는 RON 단백질의 결합 부위에 따른 EGFR 활성 분석
본 발명자들은 EGFR 단백질과 결합하는 RON의 결합부위에 따라 EGFR 활성 유무를 분석하기 위해 RON과 EGFR의 발현이 없는 293T 세포주에 RON 정상형 유전자 및 활성형 △160 유전자와 실시예 3-6(도 3f)에서 확인한 H424L 돌연변이 유전자를 각각 과발현시키고 EGFR 정상형 유전자를 동시에 과발현시켜 EGFR의 활성을 웨스턴 블롯으로 EGFR의 인산화를 확인하였다.
그 결과, 도 3g에 나타낸 바와 같이, EGFR 활성형 돌연변이(EGFR del19)에서와 같이 EGFR 정상형과 RON의 활성형 △160 유전자를 동시에 과발현한 곳에서만 EGFR의 인산화가 유도되고 RON의 정상형 및 H424L 돌연변이형에서는 EGFR의 인산화가 유도되지 않은 것이 확인되어 EGFR의 활성은 RON의 활성화 유무에 따라 활성이 나타나는 것을 알 수 있다.
실시예 4. RON 활성에 따른 EGFR의 활성 여부 분석
4-1. RON 활성형 단백질 유무에 따른 리간드(ligand)-의존적 EGFR 활성 여부 분석
본 발명자들은 RON과 EGFR의 발현이 없는 293T 세포주에 EGFR의 정상형 단백질과 EGFR의 키나제 억제(kinase dead) 단백질을 각각 과발현시킨 후 RON의 활성화 형인 △160 단백질의 존재 유무에 따라 EGFR의 리간드(ligand)인 EGF에 의한 EGFR의 활성 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, RON의 활성화 형인 △160이 존재하지 않은 경우에는 EGF에 의해 EGFR의 정상형 단백질에서만 EGFR의 활성화가 확인 되었고 RON의 활성화 형인 △160 단백질이 존재하였을 경우에는 EGF 및 EGFR 키나제 억제(kinase dead) 단백질과 상관없이 EGFR의 활성화가 관찰되어 이는 RON의 활성화 형인 △160이 EGFR의 리간드-비의존적으로 EGFR의 활성화를 유도하는 것을 알 수 있다.
4-2. RON의 리간드-의존적 활성 유무에 따른 리간드-의존적 EGFR 활성 여부 분석
본 발명자들은 RON과 EGFR의 발현이 없는 293T 세포주에 EGFR의 정상형 단백질과 EGFR의 kinase dead 단백질을 각각 과발현 시킨 후 RON의 활성을 유도하는 리간드인 MSP의 존재 유무에 따라 EGFR의 리간드인 EGF에 의한 EGFR의 활성 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, RON의 활성을 유도하는 리간드인 MSP가 존재 하지 않은 경우 EGF에 의해 EGFR의 정상형 단백질에서만 EGFR의 활성화가 확인되었고, RON의 활성을 유도하는 리간드인 MSP가 존재하였을 경우에는 EGF 및 EGFR 키나제 억제(kinase dead) 단백질과 상관없이 EGFR의 활성화가 관찰되어, 이는 RON의 활성을 유도하는 리간드인 MSP에 의해 RON이 활성형이 되면 EGFR의 리간드-비의존적으로 EGFR의 활성화를 유도하는 것을 알 수 있다.
또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, RON△155/K1114N(kinase dead RON mutant로서 kinase activity 억제형)과 EGFR을 함께 과발현시킨 결과, RON 활성화형만 과발현시킨 경우와 비교하여, EGFR의 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. RON 활성에 따른 세툭시맙에 대한 EGFR 활성 및 연관성 분석
5-1. RON 활성 억제를 통한 EGFR의 활성 억제 및 세툭시맙(cetuximab)에 대한 EGFR 활성 억제 분석
표 5에 나타낸 바와 같이, KM12C 대장암 세포주는 KRAS, NRAS, BRAF 야생형 유전자형을 가지며, 세툭시맙에 대하여 저항성이 있는 것으로 알려져 있다 (Todd M. et al, Dual Pharmacological Targeting of the MAP Kinase and PI3K/mTOR Pathway in Preclinical Models of Colorectal Cancer. PLOS 2014, Volume 9, Issue 11, e113037).
앞서, 본 발명자들은 이러한 KM12C 대장암 세포주에서 RON이 활성화되어 있다는 것을 실시예 1-1에서 확인한 바 있다.
이에, RON 활성 억제를 통한 EGFR의 활성 억제 및 세툭시맙(cetuximab)에 대한 EGFR 활성 억제를 분석하기 위하여, 상술한 바와 같이, KRAS, NRAS, BRAF 야생형 유전자형을 가지며, 세툭시맙에 대하여 저항성이 있고, RON이 활성화되어 있는 KM12C 대장암 세포주에서 RON을 siRNA 기법으로 인위적으로 억제시킨 후 세툭시맙을 시간 별로 처리하여 EGFR의 활성화 정도를 웨스턴 블롯으로 관찰하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, RON을 억제하지 않은 KM12C 세포주에서는 세툭시맙을 처리하여도 시간이 지남에 따라 EGFR의 활성이 감소되었다가 다시 증가되는 반면, RON을 siRNA로 억제하고 세툭시맙을 처리한 KM12C 세포주에서는 EGFR의 활성이 급격하게 감소되어 다시 증가되지 않는 것이 확인되어 RON 존재 유무에 따라 세툭시맙에 대한 EGFR의 활성이 조절되는 것을 알 수 있다.
5-2. RON 활성 유무에 의한 세툭시맙 세포 사멸 분석
표 6에 나타낸 바와 같이, CaCo-2 대장암 세포주는 KRAS, NRAS, BRAF 야생형 유전자형을 가지며, 세툭시맙에 대하여 민감성이 있는 것으로 알려져 있다 (Giovanni B. et al, Antitumoral Efficacy of the Protease Inhibitor Gabexate Mesilate in Colon Cancer Cells Harbouring KRAS, BRAF and PIK3CA Mutations. PLOS 2012, Volume 7, Issue 7, e41347).
앞서, 본 발명자들은 이러한 CaCo-2 대장암 세포주에서 RON이 활성화되어 있지 않다는 것을 실시예 1-1에서 확인한 바 있다.
이에, 세툭시맙 처리시 RON 활성 유무에 따른 세포 사멸 정도를 분석하기 위하여, 상술한 바와 같이, KRAS, NRAS, BRAF 야생형 유전자형을 가지며, 세툭시맙에 대하여 민감성이 있고, RON이 활성화되어 있지 않은 CaCo-2 대장암 세포주, LIM1215 세포주와 RON이 활성화 되어 있고 세툭시맙에 저항성을 갖는 KM12C 대장암 세포주에서의 세툭시맙 반응성을 확인하기 위하여 트립판 블루 세포 계수법(trypan blue cell counting)으로 세포 사멸을 분석하였다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, RON이 활성화 되어 있지 않은 CaCo-2 세포주와 LIM1215세포주는 세툭시맙에 의한 세포사멸이 관찰되는 반면, RON이 활성화 되어 있는 KM12C 세포주는 세툭시맙에 의한 세포사멸이 관찰되어 않아 저항성을 갖는 것을 알 수 있다.
5-3. RON 발현 억제 후 세툭시맙에 의한 세포 사멸 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있고 세툭시맙에 저항성을 갖는 KM12C 대장암 세포주에 RON을 siRNA 기법으로 인위적으로 억제시킨 후 세툭시맙을 처리하여 트립판 블루 세포 계수법(trypan blue cell counting)으로 세포 사멸을 분석하였다.
그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, RON을 억제하였을 경우 세툭시맙에 대한 감수성이 증가되어 세포 사멸이 증가한다는 것을 알 수 있다.
5-4. RON 발현 억제 후 세툭시맙에 의한 하위 신호 기전 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있고 세툭시맙에 저항성을 갖는 KM12C 대장암 세포주에 RON을 siRNA 기법으로 인위적으로 억제시킨 후 세툭시맙을 처리 하여 웨스턴 블롯으로 하위 신호기전을 관찰하였다.
그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, RON의 발현을 억제하고 세툭시맙을 처리한 그룹에서 세포 생존에 중요한 역할을 하는 p-ERK 단백질이 감소되고 아폽토시스(apoptosis) 표지 단백질인 cleaved caspase-3가 증가되는 것을 알 수 있다.
5-5. RON 활성 억제 후 세툭시맙에 의한 세포 사멸 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있고 세툭시맙에 저항성을 갖는 KM12C 대장암 세포주에 RON의 활성을 억제할 수 있는 저해제 LY2801653과 세툭시맙을 각각 처리한 그룹과 LY2801653과 세툭시맙을 병용 처리한 그룹을 트립판 블루 세포 계수법(trypan blue cell counting)으로 세포 사멸을 분석하였다.
그 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, RON의 활성 저해제 LY2801653과 세툭시맙을 병용 처리한 그룹에서 세포 사멸이 증가한다는 것을 알 수 있다.
5-6. RON의 활성 유무에 따른 세툭시맙에 의한 세포 사멸 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있지 않고 세툭시맙에 민감성을 갖는 CaCo-2와 SW48 대장암 세포주에 RON의 활성화 형인 △160과 △155을 과발현시킨 후 세툭시맙에 대한 세포 사멸을 관찰하였다.
그 결과, 도 5f에 나타낸 바와 같이, 세툭시맙에 민감성을 보였던 CaCo-2와 SW48 세포주가 RON의 활성화 형인 △160과 △155을 과발현시켰을 경우 세툭시맙에 의해 세포 사멸이 억제되어 저항성을 보이는 것을 알 수 있다.
5-7. RON의 활성 유무에 따른 세툭시맙에 의한 세포 성장 억제 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있지 않고 세툭시맙에 민감성을 갖는 CaCo-2 대장암 세포주에 RON의 활성화 형인 △160 유전자를 과발현시켜서 콜로니 형성(colony formation) 방법으로 세툭시맙에 대한 세포 성장을 관찰하였다.
그 결과, 도 5g에 나타낸 바와 같이, 세툭시맙에 의해 콜로니의 수가 감소된 모(parent) CaCo-2 세포주가 RON의 활성화 형인 △160 유전자를 과발현시켰을 경우 세툭시맙을 처리하여도 콜로니의 수가 거의 감소되지 않아 RON의 활성화 형인 △160 단백질에 의해 세툭시맙에 대한 세포 성장의 저항성을 보이는 것을 알 수 있다.
5-8. RON 넉아웃 동종유전자(knockout isogenic) 세포주에서 세툭시맙에 의한 세포 사멸 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있고 세툭시맙에 저항성을 갖는 KM12C 대장암 세포주에 RON을 CRISPR/Cas9 기법을 이용하여 RON 유전자를 넉아웃(Knockout)시킨 세포주를 제작하여 세툭시맙에 대한 세포 사멸과 세포 성장 분석을 하기 위해 RON 넉아웃 효율이 좋은 #1 클론(clone)에 세툭시맙을 농도 별로 처리하여 세포 사멸을 관찰하였다.
그 결과, 도 5h에 나타낸 바와 같이, 모 세포주(parent)에 비해 세포 사멸이 증가되는 것이 확인되어 RON을 넉아웃시켰을 경우 세툭시맙에 의한 민감성이 증가되는 것을 알 수 있다.
5-9. RON 넉아웃 동종유전자(knockout isogenic) 세포주에서 세툭시맙에 의한 세포 성장 억제 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있고 세툭시맙에 저항성을 갖는 KM12C 대장암 세포주에 RON을 CRISPR/Cas9 기법을 이용하여 RON 유전자를 넉아웃시킨 세포주를 이용하여 세툭시맙에 대한 세포 성장을 콜로니 형성 방법으로 관찰하였다.
그 결과, 도 5i에 나타낸 바와 같이, 모 세포주(parent)에 비해 콜로니의 수가 감소되는 것이 확인되어 RON을 넉아웃시켰을 경우 세툭시맙에 의한 민감성이 증가되는 것을 알 수 있다.
실시예 6. RON 넉아웃 동종유전자(knockout isogenic) 세포주를 이용한 인 비보 이종 이식(In vivo xenograft) 모델에서 RON 존재 유무에 따른 세툭시맙의 종양 억제 효능 분석
본 발명자들은 RON이 활성화 되어 있고 세툭시맙에 저항성을 갖는 KM12C 대장암 세포주에 RON을 CRISPR/Cas9 기법을 이용하여 RON 유전자를 넉아웃시킨 세포주를 이용한 인 비보 이종 이식 모델에서 세툭시맙에 의한 종양 억제 효능을 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 모 세포주(parent)에 비해 RON 넉아웃 이종이식(knockout xenograft) 마우스에서 종양의 크기가 현저하게 감소되는 것이 관찰되어 RON의 활성화를 넉아웃시켰을 경우 세툭시맙에 의한 인 비보(in vivo) 민감성이 증가되는 것을 알 수 있다.
따라서, RON의 활성화는 EGFR-표적제제인 세툭시맙에 대한 감수성 예측용 바이오 마커로서의 가능성을 보여준다.
실시예 7. RON 항체 항암제와 세툭시맙 병용 처리에 의한 세포 사멸 유도 확인
본 발명자들은 RON 항체 항암제와 세툭시맙 병용 처리에 의한 세포 사멸 유도를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, RON을 타겟으로 하는 항체 항암제인 나르나투맙(Narnatumab)와 세툭시맙을 병용 처리했을 때 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 이 때, 단백질들의 발현 변화를 확인한 결과 EGFR과 RON의 활성이 억제되고, ERK의 활성이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 8. 세툭시맙 반응성 여부와 RON 활성과 관계 분석
본 발명자들은 세툭시맙 반응성 여부와 RON 활성과의 관계를 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 실제 대장암 환자들은 RON 활성형(p-RON positive) 및 EGFR 활성형(P-EGFR positive)으로 확인되었고(왼쪽 그래프), 또한, 실제 대장암 환자(double positive) 중 세툭시맙을 처방 받은 환자는 RON 활성 여부에 따라 세툭시맙에 대하여 상이한 감수성을 나타내는 것으로 확인되었다.
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acuuuguaga ggaguuugau u 21
Claims (19)
- 대장암에서의 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 조성물로서,
상기 조성물은,
RON(Recepteur d＇Origine Nantais, Gene Bank 등재번호 NM_002447.1) 유전자; 및
KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, Gene Bank 등재번호 U48722.1), Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11, Gene Bank 등재번호 NM_002390.4), Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32, Gene Bank 등재번호 NM_145004.5), FZD4(Frizzled family receptor 4, Gene Bank 등재번호 NM_012193.2), GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1, NM_001505.2), 및 GPR101(G protein-coupled receptor 101, Gene Bank 등재번호 NM_054021.1) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2) 유전자가 야생형인 경우인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 저발현 또는 저활성화된 경우, 세툭시맙에 대한 감수성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 고발현 또는 고활성화된 경우, 세툭시맙에 대한 저항성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 대장암에서의 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성 예측용 조성물로서,
상기 조성물은,
RON(Recepteur d＇Origine Nantais, Gene Bank 등재번호 NM_002447.1) 유전자; 및
KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, Gene Bank 등재번호 U48722.1), Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11, Gene Bank 등재번호 NM_002390.4), Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32, Gene Bank 등재번호 NM_145004.5), FZD4(Frizzled family receptor 4, Gene Bank 등재번호 NM_012193.2), GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1, NM_001505.2), 및 GPR101(G protein-coupled receptor 101, Gene Bank 등재번호 NM_054021.1) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자;
의 발현 수준; 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준; 또는 유전자형을 확인하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제 5 항에 있어서, 상기 유전자 발현 수준 또는 상기 유전자형을 확인하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 확인하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2) 유전자가 야생형이고;
상기 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 저발현 또는 저활성화된 경우,
세툭시맙(cetuximab)에 대한 민감성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2) 유전자가 야생형이고;
상기 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 고발현 또는 고활성화된 경우,
세툭시맙(cetuximab)에 대한 저항성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제 5 항의 조성물을 포함하는, 대장암에서의 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성 예측용 키트.
- RON(Recepteur d＇Origine Nantais, Gene Bank 등재번호 NM_002447.1) 유전자의 발현; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대상의 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성 증진제로서,
상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제. - 제 11 항에 있어서, 상기 대상은 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2) 유전자가 야생형인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
- 제 11 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
- (a) 대장암 환자 유래의 생물학적 시료 내 RON(Recepteur d＇Origine Nantais, Gene Bank 등재번호 NM_002447.1) 유전자; 및 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, Gene Bank 등재번호 U48722.1), Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11, Gene Bank 등재번호 NM_002390.4), Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32, Gene Bank 등재번호 NM_145004.5), FZD4(Frizzled family receptor 4, Gene Bank 등재번호 NM_012193.2), GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1, NM_001505.2), 및 GPR101(G protein-coupled receptor 101, Gene Bank 등재번호 NM_054021.1) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자;의 발현 수준; 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준; 또는 유전자형을 확인하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 확인한 결과에 기초하여 상기 대장암 환자의 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성 또는 저항성을 판정하는 단계;
를 포함하는 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공 방법. - 제 14 항에 있어서, 상기 (b) 단계에서,
상기 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2) 유전자는 야생형이고;
상기 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 저발현 또는 저활성화된 경우,
상기 대장암 환자는 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 14 항에 있어서, 상기 (b) 단계에서,
상기 KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NM_033360.2), NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog, Gene Bank 등재번호 NP_002515.1), 또는 BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, Gene Bank 등재번호 NP_004324.2) 유전자는 야생형이고;
상기 RON 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 고발현 또는 고활성화된 경우,
상기 대장암 환자는 세툭시맙(cetuximab)에 대한 저항성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 14 항에 있어서, 상기 Adam11, Adam32, FZD4, GPER, 및 GPR101 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상에 비하여 저발현인 경우, 대장암 환자는 세툭시맙(cetuximab)에 대한 감수성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 RON 유전자 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 또는 활성 수준의 확인은, 상기 유전자의 스플라이싱 변이체(Splicing variant) 또는 돌연변이(Mutant) 존재 여부 확인을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 11 항의 감수성 증진제 및 세툭시맙(cetuximab)을 유효성분으로 포함하는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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