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KR20180033587A - 제자리 증폭에 의한 세포-유리 핵산 분자의 제조 방법 - Google Patents

제자리 증폭에 의한 세포-유리 핵산 분자의 제조 방법 Download PDF

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KR20180033587A
KR20180033587A KR1020187006885A KR20187006885A KR20180033587A KR 20180033587 A KR20180033587 A KR 20180033587A KR 1020187006885 A KR1020187006885 A KR 1020187006885A KR 20187006885 A KR20187006885 A KR 20187006885A KR 20180033587 A KR20180033587 A KR 20180033587A
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KR1020187006885A
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Inventor
첸-슝 예
Original Assignee
써큘로진 테라노스틱스, 엘엘씨
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Filing date
Publication date
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Abstract

샘플 중 cfDNA와 같은 cfNA의 제자리 증폭(in situ amplification, ISA)을 위한 방법이 제공되는데, 여기에서 샘플 중 cfNA는 핵산 정제 단계를 받지 않는다. 개시되는 방법은 샘플에 존재하는 cfNA의 분석 가능한 풀(pool)을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 분석 가능한 풀은 샘플에서 핵산을 특성화하기 위한 다양한 분석 기법에 사용될 수 있다. 진단, 치료적 개입의 결정 및 대상의 모니터링 방법이 또한 제공된다.

Description

제자리 증폭에 의한 세포-유리 핵산 분자의 제조 방법
본 출원은 2015년 8월 12일자 출원된 미국 특허 가출원 번호 제62/204,268호(현재 계류중)의 우선권을 주장한다.
올해, 160만의 새로운 사례의 암이 진단되어, 암으로 인해 50만이 넘는 사망을 초래할 것으로 추정된다. 이는 매일 약 1,600명을 의미하여, 미국에서 사망건 넷 중 하나를 차지한다. 고형암 생검의 유전자 검사에서 커다란 발전이 이루어짐에 따라 암이 표적화되고 치료되는 방법을 변화시킴으로써 개선된 생존율을 이끌었다.
현재, 일반적으로 원발성 종양으로부터의 조직 생검이, 표적화된 요법을 시작하기 이전의 단일 시점에서 암의 분자 프로파일을 결정하기 위해 사용된다. 그러나, 고형 종양 샘플링은 몇 가지 단점 및 한계로 곤란을 겪고 있다. 첫째, 고형 종양 샘플링은 침습적 과정이고 여러모로 환자에게 리스크를 준다. 둘째, 일부 경우에 고형 종양 샘플링은 종양의 위치 및/또는 크기로 인해 선택할 수 있는 방법이 아니거나 또는 불가능하다. 셋째, 고형 종양 샘플링은 생검 부위에 대해 공간적으로, 그리고 생검 시기에 종양의 상태에 대해 일시적으로 제한되므로, 종양 이질성이 적절하게 다루어질 수 없다. 종양 게놈은 매우 불안정하고 선택 압력 하에 클론 확장 경향이 있다. 따라서, 암의 게놈 특징은 공간적으로, 그리고 시간적으로 변화하고 사실상 고정적이 아니다. 넷째, 고형 종양 샘플링으로부터 치료 결정을 내리기 위한 관련 정보의 확인은 수일 내지 수주일 또는 수개월이 걸릴 수 있기 때문에, 치료적 적용을 위한 정보의 사용을 복잡하게 만든다. 다섯째, 고형 종양 샘플링은 착수에 비용이 많이 들고, 그에 따라 많은 경우에 그 적용이 제한된다. 마지막으로, 고형 종양 샘플링은 분석에 필요한 시간, 분석의 비용 및 분석을 위한 샘플 수득의 침습적 성질과 같은 수많은 인자로 인해 암 요법의 종적 모니터링(longitudinal monitoring)에 실용적이지 못하다. 그러므로, 종양 조직의 게놈 특성화는 암의 치료 및 관리에서 주요한 과제로 남아있다.
혈액 생검(액체 생검으로도 불림), 특히 순환하는 세포-유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)의 혈액 생검은 종양에 존재하는 특이적 유전적 변화의 확인을 위한 비-침습적 방법으로 부상하고 있다. 이러한 방법은 알려진 암 요법에 의해 치료 가능한 이들 돌연변이를 확인하고 치료를 위한 표적화 요법을 개발하기 위해 연구 중이다. 혈액 중 cfDNA를 분리, 정량, 및 분석하기 위한 진보된 기술은 염색체 이상, 유전자 돌연변이, 메틸화 패턴에서의 차이 및 복제수 변동과 같은 순환에서의 암-특이적 이상현상의 확인으로 이어진다. 이러한 이상현상은 고형 종양 조직으로부터의 이상현상들을 반영하는 것으로 밝혀졌다.
cfDNA 분석을 이용하는 혈액 생검은 고형 종양 샘플링이 직면한 결점에 대한 해법을 제공한다. 혈액 생검은 최소 침습적이어서, 정기적 사무실 방문 중에 분석을 위한 샘플의 정기적 수집을 허용한다. 또한, 혈액 생검은 광범위한 종양 DNA의 샘플링을 허용하고 고형 종양 샘플링에서 보이는 이질성의 결여를 극복한다. 혈액 생검은 또한 건강관리 제공자에게 진단 정보의 신속한 복귀를 제공한다. 최종적으로, 혈액 생검은 이들의 최소 침습적 성질 및 신속한 결과로 인해, 가장 비용-효율적인 방식으로 종양 게놈 진화의 실시간 종적 모니터링에 이상적이다.
순환하는 cfDNA-기반 시험은 임상의에게 치료 효능을 보장하고 약물 저항성, 전이 및 재발을 모니터링하고, 환자를 위한 개별화된 치료적 개입을 실시간으로 조정하는 능력을 제공한다. 치료 결정을 안내하기 위해 순환 cfDNA의 종양 게놈 서열분석을 사용하면 임상적 결과가 매우 개선될 것이다. 따라서, 암 진단 및 요법의 개별적 관리에 있어서 cfDNA의 임상적 효용성은, 현재의 치료 모델을 현저히 변화시키고, 전반적인 암 생존율을 증가시킬 수 있으며 신세대의 암 관리를 위한 관리 기준이 될 능력을 가지고 있다.
그러나, cfDNA의 분석은 또한 몇 가지 결점으로 곤란을 겪고 있다. 이러한 결점으로는, 대형 샘플 용량의 요구, cfDNA의 낮은 수율, 상이한 크기의 cfDNA 단편의 차별적 회수, 그리고 재현성의 결여 등이 있지만, 결점이 이들로만 제한되지는 않는다. 전술한 내용은 임상에서의 cfDNA-기반 시험의 일상적인 적용에 대한 주요 장애에 관한 것이다.
현재, 비록 cfDNA의 추출 및 분리를 위해 수많은 방법들이 이용되지만, 샘플로부터 cfDNA 출발 물질의 불완전한 추출 및 이 과정 중 많은 물질의 손실로 인해 cfDNA 분리의 효율 및 수율은 극히 낮다. 더욱이, 표준화의 결여로 인해 정량화는 가변적이다.
임상적 도구로서 cfDNA의 사용 및 cfDNA의 분석은 최적이 아니다. 본 개시는 샘플로부터 우수한 cfDNA 농축의 방법을 제공하는 것에 의해 cfDNA 분석에서 접하는 문제에 대한 신규하고 독창적인 해법을 제공한다. 이러한 방법은 낮은 샘플 투입 용량을 요구하고 차후의 분석에서의 사용을 위한 핵산 물질의 높은 회수를 제공한다. 그와 같이, 본 개시의 방법은 샘플로부터 직접적으로 cfDNA의 농축을 허용한다. 개시된 방법은 차세대 서열분석(next-generation sequencing, NGS) 및 qPCR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 광범위한 게놈 플랫폼에서 마이크로리터 용량(피 한 방울의 용량)의 샘플로 다중 분석을 가능하게 한다. 본 개시의 방법은 임상의로 하여금 10 마이크로리터만큼 작은 샘플 용량(예를 들어, 손가락 채혈을 통한)으로 작업이 가능하게 한다. 본 개시의 방법은, 시간-효율적이고 비용-효율적인 방식 둘 다의 방식으로, 관련된 유전자 변화의 더 완전한 특성화, 신속한 임상적 의사-결정, 표적화된 요법의 확인 및 적격 환자를 위한 실험적 임상 시험의 확인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 많은 장점을 허용한다. 이에 따라, 본 개시의 방법을 이용함으로써, cfDNA 분석의 가능성이 완전히 실현될 수 있다.
이 요약은 아래의 상세한 설명에 추가로 기술되는 개념의 선택을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 주제의 핵심 또는 필수적 특징을 확인하도록 의도되는 것도 아니고, 청구된 주제의 범위를 한정하기 위해 사용되도록 의도되는 것도 아니다. 청구된 주제의 다른 특성, 세부 사항, 유용성, 및 이점은 첨부된 도면에서 설명되고 첨부된 청구범위에 정의되는 양태를 포함하여 다음의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
제1 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 세포-유리 핵산(cell-free nucleic acid, cfNA)의 제자리 증폭(in situ amplification, ISA) 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제2 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제3 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제4 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 3' 및 5' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제5 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfDNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfDNA 풀을 증폭시켜 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제6 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfDNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfDNA 풀을 증폭시켜 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제7 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfDNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfDNA 풀을 증폭시켜 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제8 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfDNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 3' 및 5' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfDNA 풀을 증폭시켜 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제9 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfRNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfRNA 풀을 증폭시켜 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제10 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfRNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfRNA 풀을 증폭시켜 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제11 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfRNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfRNA 풀을 증폭시켜 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
제12 양태에서, 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 샘플 중 cfRNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 3' 및 5' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하고; 그리고 iv) 증폭 가능한 cfRNA 풀을 증폭시켜 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함한다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, 액체 샘플은 대상으로부터 얻어지는 임의의 액체 샘플이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 타액 샘플, 뇌척수액 샘플 또는 소변 샘플이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플은 처리된다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플을 생산하도록 처리될 수 있다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 용량은 약 1 mL 미만, 약 0.5 mL 미만, 약 0.1 mL 미만, 약 0.05 mL 미만 또는 약 0.025 mL 미만일 수 있다(그러나, 모든 경우에 0.010 mL보다 크다). 특정 구현예에서, 샘플 용량은 약 10 내지 약 150 마이크로리터이다. 특정 구현예에서, 샘플 용량은 약 10 내지 약 100 마이크로리터이다. 특정 구현예에서, 샘플 용량은 약 10 내지 약 75 마이크로리터이다. 특정 구현예에서, 샘플 용량은 약 10 내지 약 50 마이크로리터이다. 특정 구현예에서, 샘플 용량은 약 10 내지 약 25 마이크로리터이다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, 본원에 기술된 범위의 샘플 용량은 대상으로부터 직접적으로 얻어질 수 있다(즉, 25 마이크로리터의 혈액의 샘플은 손가락 채혈을 통해 대상으로부터 얻어질 수 있다). 위에 기술된 제1 내지 제4 양태 각각에서, 본원에 기술된 범위의 샘플 용량은 대상으로부터 얻어지는 더 큰 용량의 샘플로부터 얻어질 수 있다(즉, 혈액 5 mL의 샘플이 대상으로부터 얻어질 수 있고 50 마이크로리터 샘플이 5 mL 샘플로부터 취해지고 샘플 용량으로서 사용될 수 있다).
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA의 3' 말단, 5' 말단 또는 3' 말단과 5' 말단 둘 다에 부가되는 외인성 핵산 서열은 이중-가닥 핵산 서열이다. 위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA의 3' 말단, 5' 말단 또는 3' 말단과 5' 말단 둘 다에 부가되는 외인성 핵산 서열은 앞뒤역순상동 서열(palindromic sequence)을 포함하는 단일-가닥 핵산 서열이다. 전술한 특정 구현예에서, cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA는 이중-가닥이다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, cfNA는 임의의 핵산일 수 있다. 특정 구현예에서, cfNA는 cfDNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 이중-가닥 cfDNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 단일-가닥 cfDNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 세포 유리-RNA(cfRNA)이다. 특정 구현예에서, cfNA는 이중-가닥 cfRNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 단일-가닥 cfRNA이다.
제1 내지 제12 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 각각의 cfDNA 및 cfRNA는 cfDNA 및 cfRNA 분자 둘 다의 분석 가능한 풀을 생산하도록 증폭된다. 제1 내지 제12 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfDNA만이 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하도록 증폭된다. 제1 내지 제12 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfRNA만이 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하도록 증폭된다. 전술한 것에서, cfDNA는 이중-가닥일 수 있고/있거나 cfRNA는 이중-가닥일 수 있다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, 처리 단계는 희석, 완충액 또는 완충 시스템의 첨가, 샘플을 가열하는 것, 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 적어도 일부를 단편화하는 것, 또는 전술한 것의 조합일 수 있다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계는 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 적어도 일부의 말단 회복, 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 적어도 일부를 평활 말단(blunt end) cfNA로 전환시키는 것, 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 적어도 일부의 A-테일링, 연결(ligation), 또는 전술한 것의 조합을 포함한다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계는 다음을 포함하는 효소 혼합물의 사용을 포함한다:
i) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소 및 ii) 리가아제;
i) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제 및 iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제;
i) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 iv) 복제 블록 활성화 활성;
i) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 복제 블록 활성화 활성 및 v) 핵산 절단 효소(nicking enzyme) 활성;
i) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 복제 블록 활성화 활성, v) 핵산 절단 효소 활성 및 vi) 핵산 결합 단백질.
위에 기술된 제5 내지 제8 양태 각각의 특정 구현예에서, cfDNA는 이중-가닥 cfDNA 또는 단일-가닥 cfDNA일 수 있다. 제5 내지 제8 양태의 특정 구현예에서, cfDNA는 이중-가닥 cfDNA이다. 위에 기술된 제5 내지 제8 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfRNA(단일-가닥 또는 이중-가닥)를 추가로 포함할 수 있다. 제5 내지 제8 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfDNA만이 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하도록 증폭된다. 제5 내지 제8 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 각각의 cfDNA 및 cfRNA는 cfDNA 및 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하도록 증폭된다.
위에 기술된 제9 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, cfRNA는 이중-가닥 cfRNA 또는 단일-가닥 cfRNA일 수 있다. 제9 내지 제12 양태의 특정 구현예에서, cfRNA는 이중-가닥 cfRNA이다. 위에 기술된 제9 내지 제12 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA(단일-가닥 또는 이중-가닥)를 추가로 포함할 수 있다. 제9 내지 제12 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfRNA 및 cfDNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfRNA만이 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하도록 증폭된다. 제9 내지 제12 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfRNA 및 cfDNA 둘 다를 포함할 수 있고 각각의 cfRNA 및 cfDNA는 cfRNA 및 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하도록 증폭된다.
위에 기술된 제1 내지 제12 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 중 존재하는 cfNA의 적어도 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 변형된 cfNA로 전환되어 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성한다. cfNA가 제5 내지 제8 양태에서와 같이 cfDNA(이중-가닥 cfDNA를 포함하는)일 때, 샘플 중 존재하는 cfDNA의 적어도 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 변형된 cfDNA로 전환되어 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성한다. cfNA가 제9 내지 제12 양태에서와 같이 cfRNA(이중-가닥 cfRNA를 포함하는)일 때, 샘플 중 존재하는 cfRNA의 적어도 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 변형된 cfRNA로 전환되어 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성한다.
제13 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제14 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제15 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제16 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단 및 5' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제17 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfDNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfDNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제18 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfDNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfDNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제19 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfDNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfDNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제20 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfDNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfDNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단 및 5' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제21 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfRNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfRNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제22 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfRNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfRNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제23 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfRNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfRNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
제24 양태에서, 본 개시는 샘플 중 cfRNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfRNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단 및 5' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
위에 기술된 제13 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, 액체 샘플은 제1 내지 제12 양태에 대하여 기술된 바와 같다.
위에 기술된 제13 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 용량은 제1 내지 제12 양태에 대하여 기술된 바와 같다.
위에 기술된 제13 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, 처리 단계는 제1 내지 제12 양태에 대하여 기술된 바와 같을 수 있다.
위에 기술된 제13 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계는 제1 내지 제12 양태에 대하여 기술된 공정을 포함한다.
위에 기술된 제13 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계는 제1 내지 제12 양태에 대하여 기술된 효소 혼합물의 사용을 포함한다.
위에 기술된 제13 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA의 3' 말단, 5' 말단 또는 3' 말단과 5' 말단 둘 다에 부가되는 외인성 핵산 서열은 제1 내지 제12 양태에 대하여 기술된 바와 같다.
위에 기술된 제13 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, cfNA는 임의의 핵산일 수 있다. 특정 구현예에서, cfNA는 cfDNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 이중-가닥 cfDNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 단일-가닥 cfDNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 세포 유리-RNA(cfRNA)이다. 특정 구현예에서, cfNA는 이중-가닥 cfRNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 단일-가닥 cfRNA이다.
제13 내지 제24 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 각각의 cfDNA 및 cfRNA는 cfDNA 및 cfRNA 분자 둘 다의 증폭 가능한 풀을 생산하도록 변형된다. 제13 내지 제24 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfDNA만이 cfDNA 분자의 증폭 가능한 풀을 생산하도록 변형된다. 제13 내지 제24 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfRNA만이 cfRNA 분자의 증폭 가능한 풀을 생산하도록 변형된다. 전술한 것에서, cfDNA는 이중-가닥일 수 있고/있거나 cfRNA는 이중-가닥일 수 있다.
위에 기술된 제17 내지 제20 양태 각각의 특정 구현예에서, cfDNA는 이중-가닥 cfDNA 또는 단일-가닥 cfDNA일 수 있다. 제17 내지 제20 양태의 특정 구현예에서, cfDNA는 이중-가닥 cfDNA이다. 위에 기술된 제17 내지 제20 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfRNA(단일-가닥 또는 이중-가닥)를 추가로 포함할 수 있다. 제17 내지 제20 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfDNA만이 cfDNA 분자의 증폭 가능한 풀을 생산하도록 변형된다. 제17 내지 제20 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA 및 cfRNA 둘 다를 포함할 수 있고 각각의 cfDNA 및 cfRNA는 cfDNA 및 cfRNA 분자의 증폭 가능한 풀을 생산하도록 변형된다.
위에 기술된 제21 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, cfRNA는 이중-가닥 cfRNA 또는 단일-가닥 cfRNA일 수 있다. 제21 내지 제24 양태의 특정 구현예에서, cfRNA는 이중-가닥 cfRNA이다. 위에 기술된 제21 내지 제24 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfDNA(단일-가닥 또는 이중-가닥)를 추가로 포함할 수 있다. 제21 내지 제24 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfRNA 및 cfDNA 둘 다를 포함할 수 있고 cfRNA만이 cfRNA 분자의 증폭 가능한 풀을 생산하도록 변형된다. 제21 내지 제24 양태의 특정 구현예에서, 샘플은 cfRNA 및 cfDNA 둘 다를 포함할 수 있고 각각의 cfRNA 및 cfDNA는 cfRNA 및 cfDNA 분자의 증폭 가능한 풀을 생산하도록 변형된다.
위에 기술된 제21 내지 제24 양태 각각의 특정 구현예에서, 샘플 중 존재하는 cfNA의 적어도 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 변형된 cfNA로 전환되어 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성한다. cfNA가 제17 내지 제20 양태에서와 같이 cfDNA(이중-가닥 cfDNA를 포함하는)일 때, 샘플 중 존재하는 cfDNA의 적어도 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 변형된 cfDNA로 전환되어 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성한다. cfNA가 제21 내지 제24 양태에서와 같이 cfRNA(이중-가닥 cfRNA를 포함하는)일 때, 샘플 중 존재하는 cfRNA의 적어도 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 변형된 cfRNA로 전환되어 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성한다.
제25 양태에서, 본 개시는 cfNA를 분석하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; 그리고 ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 cfNA 분자의 특징을 결정하는 단계를 포함한다.
제26 양태에서, 본 개시는 cfDNA를 분석하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제5 내지 제8 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; 그리고 ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 cfDNA 분자의 특징을 결정하는 단계를 포함한다.
제27 양태에서, 본 개시는 cfRNA를 분석하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제9 내지 제12 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; 그리고 ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 cfRNA 분자의 특징을 결정하는 단계를 포함한다.
제25 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제1, 제2, 제3 또는 제4 양태의 방법에 의해 생산된다. 제26 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제5, 제6, 제7 또는 제8 양태의 방법에 의해 생산된다. 제27 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제9, 제10, 제11 또는 제12 양태의 방법에 의해 생산된다.
위에 기술된 제25 내지 제27 양태의 각각에서, 분석 단계는 핵산 분자를 분석하는 데 사용하기에 적절한 임의의 기법을 포함할 수 있다. 적절한 기법은 차세대 서열분석(NGS) 및 PCR-기반의 기술, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 실시간 정량적 PCR, 블로커 PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 방법에 따라 생산되는 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 분석 가능한 풀은 분석 가능한 cfNA 풀의 제조 중에 핵산 분자의 정제를 필요로 하지 않고 이들 및 다른 분석 기법에서의 사용을 위해 충분한 양 및 품질의 cfNA 분자를 제공한다.
위에 기술된 제25 내지 제27 양태의 각각에서, 결정되는 특징은 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 임의의 특징일 수 있다. 1개보다 많은 특징이 동시에 분석될 수 있다. 대표적인 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이(이에 제한되지 않는 예를 들어, 점 돌연변이, 결실 및 삽입), 메틸화 패턴 및 복제수 변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 특징은 질환과 관련된다.
제28 양태에서, 본 개시는 대상을 질환이 있거나 이에 대한 위험이 있는 것으로 진단하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 특징의 존재를 기반으로 하여 대상이 질환이 있고/있거나 이에 대한 위험이 있는지를 결정하거나 특징의 부재를 기반으로 하여 대상이 질환이 없고/없거나 이에 대한 위험이 없는지를 결정하는 단계를 포함한다.
제29 양태에서, 본 개시는 대상을 질환이 있거나 이에 대한 위험이 있는 것으로 진단하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제5 내지 제8 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 특징의 존재를 기반으로 하여 대상이 질환이 있고/있거나 이에 대한 위험이 있는지를 결정하거나 특징의 부재를 기반으로 하여 대상이 질환이 없고/없거나 이에 대한 위험이 없는지를 결정하는 단계를 포함한다.
제30 양태에서, 본 개시는 대상을 질환이 있거나 이에 대한 위험이 있는 것으로 진단하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제9 내지 제12 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 특징의 존재를 기반으로 하여 대상이 질환이 있고/있거나 이에 대한 위험이 있는지를 결정하거나 특징의 부재를 기반으로 하여 대상이 질환이 없고/없거나 이에 대한 위험이 없는지를 결정하는 단계를 포함한다.
제28 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제1, 제2, 제3 또는 제4 양태의 방법에 의해 생산된다. 제29 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제5, 제6, 제7 또는 제8 양태의 방법에 의해 생산된다. 제30 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제9, 제10, 제11 또는 제12 양태의 방법에 의해 생산된다.
위에 기술된 제28 내지 제30 양태의 각각에서, 분석 단계는 핵산 분자를 분석하는 데 사용하기에 적절한 임의의 기법을 포함할 수 있다. 적절한 기법은 차세대 서열분석(NGS) 및 PCR-기반의 기술, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 실시간 정량적 PCR, 블로커 PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 방법에 따라 생산되는 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 분석 가능한 풀은 분석 가능한 cfNA 풀의 제조 중에 핵산 분자의 정제를 필요로 하지 않고 이들 및 다른 분석 기법에서의 사용을 위해 충분한 양 및 품질의 cfNA 분자를 제공한다.
위에 기술된 제28 내지 제30 양태의 각각에서, 결정되는 특징은 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 임의의 특징일 수 있다. 1개보다 많은 특징이 동시에 분석될 수 있다. 대표적인 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이(이에 제한되지 않는 예를 들어, 점 돌연변이, 결실 및 삽입), 메틸화 패턴 및 복제수 변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 특징은 질환과 관련된다.
제31 양태에서, 본 개시는 질환이 있는 대상에 대한 치료적 개입을 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 치료적 개입을 결정하는 단계를 포함한다.
제32 양태에서, 본 개시는 질환이 있는 대상에 대한 치료적 개입을 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제5 내지 제8 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 치료적 개입을 결정하는 단계를 포함한다.
제33 양태에서, 본 개시는 질환이 있는 대상에 대한 치료적 개입을 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제9 내지 제12 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 치료적 개입을 결정하는 단계를 포함한다.
제31 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제1, 제2, 제3 또는 제4 양태의 방법에 의해 생산된다. 제32 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제5, 제6, 제7 또는 제8 양태의 방법에 의해 생산된다. 제33 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제9, 제10, 제11 또는 제12 양태의 방법에 의해 생산된다.
위에 기술된 제31 내지 제33 양태의 각각에서, 분석 단계는 핵산 분자를 분석하는 데 사용하기에 적절한 임의의 기법을 포함할 수 있다. 적절한 기법은 차세대 서열분석(NGS) 및 PCR-기반의 기술, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 실시간 정량적 PCR, 블로커 PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 방법에 따라 생산되는 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 분석 가능한 풀은 분석 가능한 cfNA 풀의 제조 중에 핵산 분자의 정제를 필요로 하지 않고 이들 및 다른 분석 기법에서의 사용을 위해 충분한 양 및 품질의 cfNA 분자를 제공한다.
위에 기술된 제31 내지 제33 양태의 각각에서, 결정되는 특징은 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 임의의 특징일 수 있다. 1개보다 많은 특징이 동시에 분석될 수 있다. 대표적인 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이(이에 제한되지 않는 예를 들어, 점 돌연변이, 결실 및 삽입), 메틸화 패턴 및 복제수 변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 특징은 질환과 관련된다.
제34 양태에서, 본 개시는 질환을 진단받고 질환의 처치를 위한 치료적 양생으로 처치 중인 대상의 처치를 모니터링하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; iii) 결정된 특징이 현재의 치료적 처치 양생과 양립 가능하지를 결정하고; iv) 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하고; 그리고 vi) 선택적으로, 단계 i) 내지 iv)를 반복하여 요망되는 시간 간격으로 치료적 개입을 모니터링하는 단계를 포함한다.
제35 양태에서, 본 개시는 질환을 진단받고 질환의 처치를 위한 치료적 양생으로 처치 중인 대상의 처치를 모니터링하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제5 내지 제8 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; iii) 결정된 특징이 현재의 치료적 처치 양생과 양립 가능하지를 결정하고; iv) 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하고; 그리고 vi) 선택적으로, 단계 i) 내지 iv)를 반복하여 요망되는 시간 간격으로 치료적 개입을 모니터링하는 단계를 포함한다.
제36 양태에서, 본 개시는 질환을 진단받고 질환의 처치를 위한 치료적 양생으로 처치 중인 대상의 처치를 모니터링하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제9 내지 제12 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; iii) 결정된 특징이 현재의 치료적 처치 양생과 양립 가능하지를 결정하고; iv) 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하고; 그리고 vi) 선택적으로, 단계 i) 내지 iv)를 반복하여 요망되는 시간 간격으로 치료적 개입을 모니터링하는 단계를 포함한다.
제34 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제1, 제2, 제3 또는 제4 양태의 방법에 의해 생산된다. 제35 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제5, 제6, 제7 또는 제8 양태의 방법에 의해 생산된다. 제36 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제9, 제10, 제11 또는 제12 양태의 방법에 의해 생산된다.
위에 기술된 제34 내지 제36 양태의 각각에서, 분석 단계는 핵산 분자를 분석하는 데 사용하기에 적절한 임의의 기법을 포함할 수 있다. 적절한 기법은 차세대 서열분석(NGS) 및 PCR-기반의 기술, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 실시간 정량적 PCR, 블로커 PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 방법에 따라 생산되는 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 분석 가능한 풀은 분석 가능한 cfNA 풀의 제조 중에 핵산 분자의 정제를 필요로 하지 않고 이들 및 다른 분석 기법에서의 사용을 위해 충분한 양 및 품질의 cfNA 분자를 제공한다.
위에 기술된 제34 내지 제36 양태의 각각에서, 결정되는 특징은 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 임의의 특징일 수 있다. 1개보다 많은 특징이 동시에 분석될 수 있다. 대표적인 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이(이에 제한되지 않는 예를 들어, 점 돌연변이, 결실 및 삽입), 메틸화 패턴 및 복제수 변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 특징은 질환과 관련된다.
제37 양태에서, 본 개시는 대상을 모니터링하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 대상이 처치의 필요가 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.
제38 양태에서, 본 개시는 대상을 모니터링하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제5 내지 제8 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 대상이 처치의 필요가 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.
제39 양태에서, 본 개시는 대상을 모니터링하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 제9 내지 제12 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 대상이 처치의 필요가 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.
제37 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제1, 제2, 제3 또는 제4 양태의 방법에 의해 생산된다. 제38 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제5, 제6, 제7 또는 제8 양태의 방법에 의해 생산된다. 제39 양태의 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 제9, 제10, 제11 또는 제12 양태의 방법에 의해 생산된다.
위에 기술된 제37 내지 제39 양태의 각각에서, 분석 단계는 핵산 분자를 분석하는 데 사용하기에 적절한 임의의 기법을 포함할 수 있다. 적절한 기법은 차세대 서열분석(NGS) 및 PCR-기반의 기술, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 실시간 정량적 PCR, 블로커 PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 방법에 따라 생산되는 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 분석 가능한 풀은 분석 가능한 cfNA 풀의 제조 중에 핵산 분자의 정제를 필요로 하지 않고 이들 및 다른 분석 기법에서의 사용을 위해 충분한 양 및 품질의 cfNA 분자를 제공한다.
위에 기술된 제37 내지 제39 양태의 각각에서, 결정되는 특징은 cfNA 분자(cfDNA 및 cfRNA를 포함하는)의 임의의 특징일 수 있다. 1개보다 많은 특징이 동시에 분석될 수 있다. 대표적인 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이(이에 제한되지 않는 예를 들어, 점 돌연변이, 결실 및 삽입), 메틸화 패턴 및 복제수 변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 특징은 질환과 관련된다.
도 1a는 20 μL의 혈장으로부터 CGD 방법을 사용하여 생산된 cfDNA의 아가로오스 겔 전기영동을 보여준다. cfDNA는 브롬화에티듐을 사용하여 가시화되었다. 레인 1 내지 4는 암으로 진단받거나 암이 있는 것으로 의심되는 대상으로부터의 동결된 임상적 혈장 샘플이고, 레인 5는 샘플 4로부터의 혈장으로 스파이킹된 건강한 대상으로부터의 신선한 혈장이었다. 레인 6 내지 8은 건강한 대상으로부터의 동결된 혈장 샘플이고 레인 9 및 10은 건강한 대상으로부터의 신선한 혈장 샘플이었다.
도 1b는 10 μL의 소변으로부터 CGD 방법을 사용하여 생산된 cfDNA의 아가로오스 겔 전기영동을 보여준다. cfDNA는 브롬화에티듐을 사용하여 가시화되었다. 레인 1 내지 6은 건강한 대상으로부터의 신선한 소변 샘플이고 레인 7은 비교를 위한 혈장 샘플이었다.
도 2는 각각 CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 20 μL 및 200 μL의 혈장으로부터 제조된 cfDNA에 대하여 TaqMan 정량적 실시간 PCR을 사용하여 생성된 KRAS의 증폭 플롯을 보여준다.
도 3a는 각각 CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 20 μL 및 200 μL의 혈장으로부터 제조된 cfDNA에 대하여 TaqMan 정량적 실시간 PCR을 사용하여 생성된 BRAF의 증폭 플롯을 보여준다.
도 3b는 각각 CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 20 μL 및 200 μL의 혈장으로부터 제조된 cfDNA에 대하여 TaqMan 정량적 실시간 PCR을 사용하여 생성된 PIK3CA의 증폭 플롯을 보여준다.
도 3c는 각각 CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 20 μL 및 200 μL의 혈장으로부터 제조된 cfDNA에 대하여 TaqMan 정량적 실시간 PCR을 사용하여 생성된 NRAS의 증폭 플롯을 보여준다.
도 4는 보존제 존재 및 부재의 상업적 타액 샘플링 키트를 사용하여 수집된 20 μL의 타액으로부터 CGD 방법을 사용하여 생산된 cfDNA의 아가로오스 겔 전기영동(2%)을 보여준다. cfDNA는 브롬화에티듐을 사용하여 가시화되었다. 레인 1 및 2는 보존제 존재의 상업적 샘플링 키트로 얻어진 타액 샘플로부터의 결과를 보여주고 레인 3은 음성 대조(타액 샘플이 존재하지 않음)인 한편, 레인 4 및 5는 보존제 부재의 상업적 샘플링 키트로 얻어진 타액 샘플로부터의 결과이고 레인 6은 음성 대조(타액 샘플이 존재하지 않음)이다.
도 5는 20 μL의 혈장 및 뇌척수액과 10 μL의 소변으로부터 CGD 방법을 사용하여 생산된 cfDNA의 아가로오스 겔 전기영동(2%)을 보여준다. cfDNA는 브롬화에티듐을 사용하여 가시화되었다. 샘플 배치는 다음과 같다(cfDNA 농도는 괄호에): 레인 1 CSF(8.5), 레인 2 소변(5.1), 레인 3 혈장(22), 레인 4 혈장(59), 레인 5 혈장(36.4), 레인 6 음성 대조; 레인 7 소변(52.2), 레인 8 소변(11.2), 레인 9 소변(89.6) 및 레인 10 소변(30).
도 6은 혈장, CSF 및 소변 샘플로부터 CGD 방법에 의해 제조된 cfDNA의 크기 분포 및 정량을 결정하기 위한 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용한 도 5의 샘플 1 내지 5의 분석을 보여준다.
도 7은 PIK3CA, PTEN 및 KRAS 유전자에 대하여, 난소암 환자 처치-전 및 처치-후 CGD 방법 및 조직 생검으로 얻어진 결과 사이의 비교를 보여준다.
도 8a는 폐암으로 진단받은 대상에서 cfDNA 돌연변이의 결정을 보여준다. 요법 중 순환 cfDNA에서 더 낮은 돌연변이 부하 및 50일 동안의 안정적 질환 이후 상승된 돌연변이 부하. 처치의 개시는 흑색 화살표로 표시된다. 돌연변이 부하는 환자 당 검출되는 체세포 돌연변이의 수로서 표현된다(그래프의 우측에서 수직 눈금). 청색 점선은 PET/CT가 수행된 시간을 나타낸다. 시점은 cfDNA 분석이 시행된 시간을 나타낸다.
도 8b는 대상의 PET/CT 이미지를 보여주는데, 11-30-15에서 안정적 질환 및 2016년 3월에 진행성 질환을 나타내고, 도 XA에서의 cfDNA 분석의 결과를 확인한다.
도 9a는 췌장-주위 림프절 선암종으로 진단받은 대상에서 cfDNA 돌연변이의 결정을 보여준다. 순환 cfDNA에서 돌연변이 부하는 요법 중 저하되어 안정적 질환을 나타낸다. 안정적 질환은 단백질 생물표지, PET/CT 이미지(우측 그림) 및 임상적 결과와 일치하였다. 돌연변이 부하는 환자 당 검출되는 체세포 돌연변이의 수로서 표현된다(그래프 우측에서 수직 눈금). 청색 점선은 PET/CT가 수행된 시간을 나타낸다. 시점은 cfDNA 분석이 시행된 시간을 나타낸다.
도 9b는 대상의 PET/CT 이미지를 보여주는데, 요법 후 안정적 질환을 나타내어 도 XA에서의 cfDNA 분석의 결과를 확인한다.
도 10은 -20℃(레인 1 내지 5) 및 4℃(레인 6 내지 10)에서 저장된 시약을 사용하여 CGD 방법에 의해 제조되고 2% 겔에서의 아가로오스 겔 전기영동을 받고 브롬화에티듐을 사용하여 가시화된 분석 가능한 cfDNA 풀을 보여준다(분자량 단계 1 kb).
도 11은 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 및 1 ng/μL의 농도의 정제된 DNA를 사용하여 CGD 방법으로 생성된 표준 곡선을 보여준다.
도 12는 CGD 방법을 사용하여 20 μL의 혈장으로부터의 cfRNA로부터 생성된 cDNA의 증폭 플롯을 보여준다.
다음 기술에서는, 많은 구체적인 세부 사항이 본 발명의 더욱 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 개시된 구현예가 하나 이상의 이들 구체적인 세부 사항 없이 실시될 수 있음은 해당 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해, 해당 분야의 당업자에게 잘 알려진 절차 및 잘 알려진 특성은 기술되지 않았다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭 가능한 핵산 풀"은 핵산 분자의 증폭을 허용하도록 이의 원래 상태로부터 변형된 핵산의 풀을 의미한다. 특정 구현예에서, 증폭 가능한 핵산 풀은 샘플에 존재하는 핵산 분자의 적어도 일부의 3' 말단, 5' 말단 또는 3' 및 5' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 생성된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭 가능한 핵산 풀" 및 "증폭 가능한 cfNA 풀"은 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하도록 변형된 샘플에 존재하는 복수의 핵산을 의미하는데, 여기에서 외인성 핵산 서열은 외인성 핵산 서열이 부착되는 핵산 분자를 증폭시키기 위해 반응에서 사용된다. 특정 구현예에서, 핵산은 1 또는 2개의 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭 가능한 cfDNA 풀"은 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하도록 변형된 샘플에 존재하는 복수의 cfDNA를 의미하는데, 여기에서 외인성 핵산 서열은 외인성 핵산 서열이 부착되는 cfDNA 분자를 증폭시키기 위해 반응에서 사용된다. 특정 구현예에서, cfDNA는 1 또는 2개의 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭 가능한 cfRNA 풀"은 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하도록 변형된 샘플에 존재하는 복수의 cfRNA를 의미하는데, 여기에서 외인성 핵산 서열은 외인성 핵산 서열이 부착되는 cfRNA 분자를 증폭시키기 위해 반응에서 사용된다. 특정 구현예에서, cfRNA는 1 또는 2개의 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성 핵산 서열"은, 샘플에 존재하는 cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는 핵산 분자에 존재하지 않는 서열을 의미한다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 인간 게놈에 존재하지 않는 서열이다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 프라이머를 결합시킬 수 있는 프라이머 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 프라이머 부위는 범용(universal) 프라이머 부위이다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 복제 블록을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 유리 핵산(cell free nucleic acid)" 또는 "cfNA"는, 혈류, 뇌척수액, 타액 또는 소변을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 체액에서와 같이, 세포의 외부에서 발견되는 핵산의 단편을 의미한다. cfNA는 대상으로부터(예를 들어, 대상의 세포로부터) 유래될 수 있거나, 대상 이외의 공급원으로부터(예를 들어, 바이러스 감염으로부터) 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 유리 DNA" 또는 "cfDNA"는, 혈류, 뇌척수액, 타액 또는 소변을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 체액에서와 같이, 세포의 외부에서 발견되는 DNA의 단편을 의미한다. cfDNA는 대상으로부터(예를 들어, 대상의 세포로부터) 유래될 수 있거나, 대상 이외의 공급원으로부터(예를 들어, 바이러스 감염으로부터) 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 유리 RNA" 또는 "cfRNA"는, 혈류, 뇌척수액, 타액 또는 소변을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 체액에서와 같이, 세포의 외부에서 발견되는 RNA의 단편을 의미한다. 용어 "세포-유리 RNA" 또는 "cfRNA"는 또한 RNA의 단편의 단편으로부터 생산되는 DNA(예를 들어, 이중-가닥 cDNA와 같은)를 포함한다. cfRNA는 대상으로부터(예를 들어, 대상의 세포로부터) 유래될 수 있거나, 대상 이외의 공급원으로부터(예를 들어, 바이러스 감염으로부터) 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는", "정제 단계를 받지 않았던", "비정제된" 또는 "정제를 받지 않는"(뿐만 아니라 유사한 용어)은, 샘플 또는 샘플 중 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)을 기술하기 위해 사용될 때, 샘플/핵산이 샘플 중 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)을 특이적으로 분리 또는 정제하기 위한 단계를 받지 않는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 분리하다"는 샘플 중 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)이 핵산의 서열 특이적 특징을 기반으로(예를 들어, 탐침(probe)의 사용을 통하는 것과 같이) 샘플로부터 분리되도록 허용하는 단계 또는 일련의 단계를 의미한다. 샘플 중 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "정제하다"는 샘플 중 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)이 핵산의 결합 특징을 기반으로 샘플로부터 분리되도록 허용하는 단계 또는 일련의 단계(예를 들어, 서열 특이적 방식 이외의 방식으로 핵산에 결합하는 핵산 결합 시약과 함께 배양)를 의미한다. 따라서, 샘플의 성질이 어떠한 것이든 샘플은, 샘플로부터 핵산을 제거하거나 샘플로부터 핵산 이외의 샘플의 구성 성분을 모두 또는 본질적으로 모두 제거하기 위해, i) 샘플에 존재할 수 있는 임의의 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)을 특이적으로 분리하기 위한 단계 또는 단계들을 받지 않거나; 또는 ii) 샘플 중 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)과 핵산 결합 시약과의 상호작용을 포함하는 핵산을 분리하기 위한 단계를 받지 않는다. 특정 경우에 핵산을 포함하는 샘플은 처리될 수 있고(예를 들어, 혈액 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플을 생산하기 위해 원심분리 또는 다른 수단에 의해 처리될 수 있다), 이 처리는 특정 성분(예를 들어, 단백질, 세포 또는 다른 성분)을 제거하고/하거나 샘플 중 핵산의 농도를 증가시킬 수 있다. 이러한 처리는 샘플 중 핵산(cfNA, cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)을 "특이적으로 분리"하거나 "정제"하는 것으로 고려되지 않는데, 핵산 분자가 샘플의 부가적 성분과 함께 여전히 존재하고 처리는 샘플 중 핵산 분자를 특이적으로 겨냥하지 않는 것이기 때문이다. 일 구현예에서, 용어 "특이적으로 분리하다" 및 "정제하다"는 샘플의 원심분리를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 농도를 증가시키는 처리 단계는 샘플의 적어도 하나의 다른 성분도 농도가 증가할 때 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)를 "특이적으로 분리"하거나 "정제"하는 것으로 고려되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "제자리(in situ)"는 반응(핵산의 증폭과 같은)을 기술하기 위해 사용될 때, 반응이 샘플의 추가 조작이 필요 없이 제공되는 샘플에서 일어나는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 대략, 거의, 쯤, 또는 정도를 의미한다. 용어 "약"이 수의 범위와 함께 사용될 때, 이는 그 범위를 제시된 수의 값 위와 아래로 경계를 확장하는 것에 의해 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 1 퍼센트 내지 20 퍼센트 위 또는 아래(더 높거나 더 낮은)의 변동량만큼 기재된 값의 위와 아래로 수의 값을 수정하도록 본원에서 사용되는데; 특정 구현예에서 용어 "약"은 1 퍼센트 내지 5 퍼센트 위 또는 아래(더 높거나 더 낮은)의 변동량만큼 기재된 값의 위와 아래로 수의 값을 수정하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "동물", "대상" 및 "환자"는 포유류, 동물(예를 들어, 고양이, 개, 말, 돼지 등) 및 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 동물계의 모든 구성원을 포함하도록 본원에서 사용된다. 특정 구현예에서, 대상은 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 및/또는 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것" 또는 유사한 용어는 샘플에 존재하는 cfNA의 서열로의 외인성 핵산 서열의 통합 또는 cfNA의 서열의 적어도 일부의 보체인 서열로의 외인성 핵산 서열의 통합을 의미한다. 이러한 통합은 외인성 핵산 서열의 cfNA 서열에 대한 어닐링 및 차후의 cfNA 서열의 복제(이는 외인성 핵산 서열에 의해 프라이밍될 수 있음)를 통해 달성될 수 있다. 이러한 통합은 외인성 핵산 서열의 적어도 하나의 가닥과 cfNA의 적어도 하나의 가닥의 연결에 의해 달성될 수 있다. 어느 경우에나, 본원에서 변형된 cfNA로도 언급될 수 있는 cfNA(또는 cfNA의 보체)가 생산되는데, 여기에서 cfNA의 적어도 5' 및/또는 3' 말단이 외인성 핵산 서열을 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 맥락에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산 분자(a nucleic acid molecule)"에 대한 언급은 이러한 핵산 분자의 하나, 하나보다 많이, 또는 혼합물을 의미하고, "분석(an assay)"에 대한 언급은 해당 분야의 당업자에게 알려진 균등의 단계 및 방법 등에 대한 언급을 포함한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 이 범위의 상한 및 하한 사이에 개입되는 각각의 값, 그리고 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시되거나 개입되는 값은 발명의 범위 내에 포괄됨이 이해될 것이다. 명시된 범위가 상한 및 하한을 포함하는 경우, 이들 포함되는 범위 중 어느 하나를 배제하는 범위 또한 발명에 포함된다.
분명히 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어는 해당 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 분명하고 보통의 의미를 갖도록 의도된다. 정의는 본 발명을 이해하는데 있어서 독자를 돕도록 의도되지만, 구체적으로 지시되지 않는 한 이러한 용어의 의미를 변화시키거나 달리 제한하도록 의도되지 않는다. 본원에 언급되는 모든 공보는 공보에 기술되고 본원에 기술된 발명과 관련하여 사용될 공식 및 방법론을 기술하고 개시하는 목적을 위해 참조로 포함된다.
서론
체내 대부분의 핵산(DNA 및 RNA)은 세포 내에 위치하지만, 상당한 양의 세포외 핵산이 또한 혈류에서 순환하는 것으로 밝혀져 있다. 1948년 Mandel 및 M
Figure pct00001
tais에 의해 혈액에서 cfDNA의 최초 발견 이후, 연구자들은 cfDNA가 질환 또는 병태(예를 들어, 암)가 있는 환자와 건강한 개체를 두 가지 방식: 첫째로, 질환 또는 병태가 있는 환자에서 혈액 중 상승된 농도의 cfDNA에 의해; 그리고 둘째로, 질환 또는 병태가 있는 환자에서 cfDNA의 종양-특이적 변화의 존재에 의해 구별하는 것을 발견하였다. 종양-특이적 cfDNA는 광범위한 암, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 혈액암, 대장암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 폐암, 유방암, 위암, 전립선암, 및 자궁경부암에 상응하는 혈액 중에서 발견된다. 이는 cfDNA가 모든 암에 대한 특징이고, 암을 진단하고 질환 진행을 모니터링하고 치료적 개입을 확인하고 처치 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있는 병리적 과정을 반영하는 것을 시사한다. cfDNA는 새로 합성된 핵산의 "능동적" 방출을 통할 뿐 아니라 괴사 및/또는 세포자멸(apoptotic) 세포사의 최종-산물로서 "수동적" 기전을 통해 혈류로 들어가는 것으로 생각된다.
건강한 대상에서, 순환 cfDNA의 평균 농도는 혈장 mL 당 10 내지 30 ng/mL이고 암 환자의 값은 혈장 mL 당 100 ng/mL를 초과한다. 복수의 방법을 사용한 종양이 원인이 되는 cfDNA의 추정은 0.01 내지 90%이다(Schwarzenbach H, et al., 2008, Ann N Y Acad Sci 1137: 190-196). 대부분의 cfDNA 단편은 길이가 150 내지 200 염기쌍으로, 순환에서 15분 내지 수 시간 범위의 다양한 반감기를 갖는다. 혈류 중 cfDNA의 양은 다양한 인자, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 종양 진행, 종양 위치, 종양의 대사 회전, 종양 크기뿐 아니라 혈액 및 림프 순환에 의한 cfDNA의 청소율, 분해, 및 여과에 의해 영향을 받는다. 가장 통상의 공개된 cfDNA의 추출 방법은 상업적으로 이용 가능한 스핀 컬럼 추출 키트이다. 다른 보고된 추출 방법은 자성 비드, 페놀/클로로포름 추출, 및 알칼리성 가염(alkaline salting)을 포함한다. cfDNA 추출의 효율은 돌연변이(들)을 검출하는 능력에 직접적으로 영향을 미칠 수 있고, 이는 분석 민감도에 직접적으로 영향을 미친다.
순환 cfDNA-기반의 비-침습적 방법은 특정 암의 분자 특성화에 따라 암환자의 적절한 처치를 위한 특이적이고 예측적인 생물표지를 검출하고 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, qPCR, 디지털 PCR 또는 서열분석을 사용하는 것에 의해, KRAS 및 EFGR 돌연변이 상태가 표적화된 요법 이전, 동안 및 이후 암환자에서 cfDNA로부터 얻어질 수 있다(Bidard FC, et al., 2013, Cancer Metastasis Rev. 32(1-2): 179-188). 차세대 서열분석(NGS)에 의한 cfDNA의 전체 엑솜(exome) 서열분석은 종양 진행의 분자 상태에 관하여 전반적이고 완전한 실시간 상황을 제공할 수 있다(Diaz LA Jr, et al., 2013, Oncotarget 4(10):1856-1857). 가장 중요하게는, 종양 부하가 초심도(ultra-deep) cfDNA 돌연변이 프로파일링으로부터 정량적으로 추정될 수 있다(Bettegowda C, et al., 2014, Sci. Transl. Med. 6(224): 224ra24). 종양 게놈의 메틸화 상태 또한 cfDNA 단편에서 검출될 수 있다(Mori T, et al., 2005, J. Clin. Oncol. 23(36): 9351-9358). 전반적으로, 혈액 생검으로 환자-중심의 분자적 진단을 개발하는 것은 환자 관리에 많은 혜택을 제공한다.
정밀 의학의 시대에, 환자는 점점 더 종양의 위치 또는 조직학적 특성보다는 이들의 특정 종양의 유전적 아키텍처를 기반으로 처치될 것으로 예상된다. 그러나, 종양 게놈은 불안정하고 요법의 적용과 같은 선택 압력 하에 변화하는 경향이 있다. 따라서, 유전적으로 조정된 암 요법은 임상적 결과의 개선을 위해 종양 게놈의 연속적 모니터링을 필요로 한다. 이러한 업무는 현재의 기법으로는 임상적으로 실현 가능하지 않다. 원발성 종양에 전형적인 유전적 및 후성유전적 변화가 암환자로부터의 순환 cfDNA에서 검출될 수 있다는 발견은 혈액 중 cfDNA의 적어도 일부가 종양 기원임을 시사한다. 이에 따라, 말초 혈액으로부터의 cfDNA 분석은 비-침습적 양식으로 종적 종양 모니터링을 위한 독특한 기회를 제공한다.
고형 종양 샘플링에 내재하는 결점은 위에 논의되어 있다.
대조적으로, 혈액 생검, 구체적으로 cfDNA 분석은 쉽게 얻을 수 있고, 최소한의 침습으로 정밀 암 관리를 위한 종적 해법을 제공한다. cfDNA를 이용하는 임상 시험은 본래 특이적이고 민감성으로, 종양-내 및 종양-간 이질성을 둘 다 실시간으로 포착할 수 있다(Dawson SJ, et al., 2013, N Engl J Med 368: 1199-1209). 주기적인 "혈액 생검" 분석을 통한 저-빈도 돌연변이의 검출은 병변이 이미징에 의해 검출되도록 충분히 커지기 전에 종양 진행을 모니터링할 수 있을 것이다(Diaz LA Jr, et al., 2012, Nature 486(7404): 537-540). 단일 돌연변이 이상의 분석은 또한 효과적인 처치 의사 결정을 위한 종양 이질성 포착을 보장할 수 있을 것이다(Sequist LV, et al., 2011, Sci. Transl. Med. 23(75): 75ra26). 혈액 생검은 조직 생검만큼 공간적으로 제한되지 않고, 우리 신체에서 암 발생 동안 계속 일어나는 돌연변이의 전반적인 영역을 보여줄 수 있다. 그럼에도 불구하고, Sanger 서열분석과 같은 통상적인 분석 방법의 민감도는 저 빈도 변이를 검출하기에 충분하지 않다. 이 점에 있어서, 진보된 NGS 기술은 높은 민감도로 다중 돌연변이의 고속-처리 분석을 위한 비용-효율적인 대안을 제공할 수 있을 것이다. 또한, 우성인 정상 집단으로부터의 종양-특이적 cfDNA의 단일-분자 증폭 및/또는 선택적 농축의 특성을 갖는 PCR-기반의 플랫폼은 이례적인 분석 민감도를 보여주었다.
cfDNA를 통해 암-관련 유전자 변화를 평가하는 것은 또한 종양의 직접적인 샘플링에 내재된 위치 편향을 회피할 수 있는데, 관찰된 돌연변이의 영역은 동일한 악성 조직 내에서 다른 생검 절편 간에 상이할 수 있다. 비록 혈류로의 DNA 방출의 정확한 기전은 불확실한 것으로 남아있지만, 세포자멸, 괴사 및 종양 세포로부터의 능동적 방출의 조합으로부터 야기되는 것으로 보인다. 이와 같이 유익한 cfDNA 생물표지는 거의 모든 암 유형에서 조기 검출, 진단, 예후, 질환 및 요법 모니터링의 개선에 대한 가능성을 보여주었다(Gormally E, et al., 2007, Mutat. Res. 635(2-3): 105-117; Tong YK, et al., 2006 Clin. Chim. Acta 363(1-2): 187-196; Gautschi O, et al., 2004, J. Clin. Oncol. 22(20): 4157-4164; Xue X, et al., 2006 Ann. N. Y. Acad. Sci. 1075:154-164; Khan S, et al., 2004 Intl. J. Cancer 110(6): 891-895).
혈액 생검 및 고형 종양 샘플링의 핵심적 특징의 비교를 표 A에 나타낸다.
Figure pct00002
비록 건강한 개체와 비교하여 암환자에서 더 높은 수준의 혈장 cfDNA가 지속적으로 검출된다 하더라도, 연구와 방법론 사이에 상당한 변동이 존재한다. 이들 변동은 연구 집단, 분석-전 샘플 제조 및 cfDNA를 분리하고 정량하기 위해 사용되는 방법에서의 차이에 기인할 수 있다(Xue X, et al., 2006, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1075:154-164; Boddy JL, et al., 2005, Clin. Cancer Res. 11(4): 1394-1399; WuTL, et al. 2002, Clin. Chim. Acta 321(1-2): 77-87; Chiu RW, et al. 2001, Clin. Chem. 47(9): 1607-1613). 순환 cfDNA는 혈장 중 이의 낮은 농도, 불균일한 크기 분포 및 단편화 성질로 인해 추출에는 도전적인 분석물이다. 결과적으로, 대용량 투입, 비용, 및 노동-강도의 요구로 인해 cfDNA의 분리는 도전적이다. cfDNA 추출, 정제 또는 정량화를 위한 표준 프로토콜은 존재하지 않는다. 많은 연구소에서 상업적으로 이용 가능한 추출 키트를 이용하는 한편, 자신의 분리 방법을 개발한 연구소도 있다. 가장 대중적인 상업적으로 이용 가능한 키트는 QIAamp 순환 핵산 키트(Qiagen)로, 여기에서는 실리카 멤브레인이 스핀 컬럼 포맷에서 cfDNA의 작은 단편에 우선적으로 결합하여, 추가의 게놈 분석을 위해 cfDNA를 정제하는 신속하고 용이한 방법을 제공한다. 그러나, 결합, 세척 및 용출과 같은 단계에서의 불가피한 손실로 인해, 현재의 방법론에 의한 cfDNA의 회수 효율은 극히 낮아서, 대량의 출발 물질(>10 mL 혈액)의 요구로 이어진다. 더욱이, 이러한 실리카 멤브레인 결합 기법은 다양한 크기의 cfDNA 단편을 효율적으로 회수하지 못하여, 후속 분석을 더욱 편향시킨다.
액체 생검 분야에서 가장 최근의 연구는 대상으로부터 종양-특이적 cfDNA를 선택적으로 농축 또는 증폭시키기 위한 새로운 기술에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 위에 논의된 바와 같이, 현재의 기법에 의해 분리된 cfDNA는 샘플에 원래 존재하는 cfDNA의 일부만을 나타내므로 출발 물질이 불완전한 것으로 남아 있다. 따라서, 후속 농축 및 검출 기술이 아무리 민감하더라도, 이들 기법은 상위 샘플 제조 중에 이미 손실된 cfDNA를 보상할 수 없다. 더욱이, 선행 기술 기법은 다양한 크기의 cfDNA 단편을 회수하는 데 있어서 일관성이 없다.
이에 따라, 본 기술 분야에서는, 동일 샘플에서 세포-유리 핵산으로부터 종양-특이적 돌연변이 프로파일의 검출뿐 아니라 정확한 정량화를 위해, 고-분자량(괴사성 사망) 및 저-분자량(세포자멸 사망) cfNA 종(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는) 둘 다를 효율적으로 회수할 수 있는 목적에 적합한 샘플 제조 방법이 결여되어 있다. 본 개시는 이러한 방법을 제공하고 cfDNA 분석에서 분석 민감도 및 특이성의 개선을 허용한다.
증폭의 방법
본 개시는 환자 관리에 cfNA-기반 액체 생검의 적용을 포함하는, 액체 생검의 임상적 적용에 있어서 적어도 3가지의 주요 미해결된 도전: i) 투입 샘플 용량; ii) 분석을 위한 cfNA의 생산량; 및 iii) 분석을 위한 생산 cfNA의 품질에 대한 해법을 제공한다. 본 개시는 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 요구되는 샘플 용량은 선행 기술 방법보다 더 낮고(적절한 혈장 샘플을 생산하기 위해 10 내지 50 마이크로리터만큼 낮은 전혈이 요구됨), 핵산 정제 단계가 필요하지 않아 오염의 위험이 저하되고, 핵산 정제 단계가 필요하지 않아 샘플 중 전체 영역의 cfNA의 회수가 증가된다. 본 개시는 또한 cfNA의 사용을 위한 방법, 예를 들어 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)를 분석하는 방법을 제공하는데, 여기에서 cfNA는 본 개시의 방법을 사용하여 제조된다(즉, 샘플은 핵산 정제 단계를 받지 않는다).
본 개시의 방법에 의해 제조되는 핵산은, 증폭 및 분석 전에 cfNA를 정제 또는 회수할 필요가 없으므로 샘플 중 cfNA의 우수한 이용률을 제공한다. 본 개시는 샘플 중 cfNA의 제자리 증폭을 제공하고 단일 반응(즉, 단일 튜브 또는 다중-웰 플레이트의 단일 웰)으로 수행될 수 있다. 더욱이, 본 개시의 방법에 의해 제조되는 cfNA는 선행 기술의 방법에 의해 제조되는 cfNA보다 더 높은 품질의 것으로 우수한 후속 분석을 허용한다. 더 추가로, 본 개시의 방법은 단지 작은 용량의 출발 샘플을 필요로 한다. 10 내지 50 마이크로리터만큼 낮은 용량이 사용될 수 있다(액적 용량). 예를 들어, 본 개시는 10 마이크로리터의 소변 및 10 내지 20 마이크로리터의 혈장(이는 대략 50 마이크로리터의 전혈로부터 얻어질 수 있음)으로부터 cfNA의 증폭 및/또는 분석을 보여준다. 이와 같이, 본 개시의 방법은 차세대 액체 생검, 현장현시(point-of-care), 및 나노- 또는 소형화 마이크로유체 "랩온어칩(lab-on-a-chip)" 진단 기구에 적절하다. 또한, 본 개시의 방법을 이용하여 더 넓은 범위의 cfNA 분자가 분석될 수 있다(예를 들어, 소형 및 대형 cfNA 단편 둘 다의 넓은 분포). 예를 들어, 본 개시의 방법은 핵산 단편 크기에 대한 편향을 보이지 않는다.
cfNA의 ISA 방법 및 증폭을 위한 cfNA의 제조 방법
본 개시의 방법은 샘플이 핵산 정제 단계를 받을 필요 없이 액체 샘플 중 cfNA의 제자리 증폭을 이용한다. 따라서, cfNA는 핵산 정제 단계의 필요 없이(예를 들어, cfNA는 특이적으로 분리 또는 정제되지 않음) 액체 샘플(예를 들어, 소변, CSF, 타액, 혈장 또는 혈청)로부터 직접적으로 제자리 증폭될 수 있다. 이 특징은, 적어도 부분적으로, 준비 단계 동안 샘플 중 cfNA의 손실을 제거하여, 샘플 중 완전히 대표적인 cfNA가 후속 분석에 이용 가능하다는 장점이 있다. 본원에 기술되는 방법에서, 샘플 용량은 선행 기술과 비교하여 유의미하게 감소된다.
또한, 본 개시의 방법은 고품질이고 다양한 후속 분석 기법에 사용될 수 있는 cfNA의 분석 가능한 풀을 제공한다. 본 개시의 방법에 의해 생성된 cfNA의 분석 가능한 풀을 분석하기 위해, 임의의 알려진 분석 기법이 본 개시의 방법과 함께 사용될 수 있다. 적절한 기법은 차세대 서열분석(NGS) 및 PCR-기반의 기술, 이에 제한되지 않는 예를 들어 실시간 정량적 PCR, 블로커 PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이전에는, 고도로 정제된 cfNA가 이들 기법의 사용을 위해 요구되는 것으로 생각되었다.
본 개시는 증폭 가능한 핵산 풀을 생산하기 위한 샘플 중 핵산(예를 들어, cfDNA를 포함하는)의 제자리 증폭의 방법을 제공한다. 증폭 가능한 핵산 풀은 분석 가능한 핵산 풀을 생산하도록 증폭될 수 있고 본원에 기술되는 후속 분석을 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 본 개시는 증폭을 위한 샘플 중 핵산(예를 들어, cfDNA를 포함하는) 제조 방법을 제공한다. 기술되는 방법은 샘플이 핵산 정제 단계를 받지 않고(예를 들어, cfNA는 특이적으로 분리 또는 정제되지 않음) 실시된다. 추가로, 특정 구현예에서, 이 방법은 10 내지 50 마이크로리터의 샘플 용량으로 수행된다. 이 방법의 특정 구현예는 아래 제공된다. 더 추가로, 특정 구현예에서 기술된 반응 모두는 단일 반응 용기에서 실시된다.
핵산 분자는 임의의 핵산일 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산은 cfDNA이다. 특정 구현예에서, 핵산은 이중-가닥 cfDNA이다. 특정 구현예에서, 핵산은 이중-가닥 cfRNA이다.
아래 기술은 본원에 개시되는 방법의 각각의 구현예 및 양태에 관련된다. 다음 논의에서는 단순화를 위해 cfDNA를 대표적인 cfNA로서 언급할 수 있는 한편, 본 개시의 방법은 임의 유형의 cfNA에 적용 가능하고 cfDNA로 제한되지 않을 것이다.
본 개시의 방법은 샘플 중 cfNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 1) cfNA(cfDNA 및/또는 RNA를 포함하는)를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; 2) 샘플이 처리 단계를 받도록 하고; 3) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 및/또는 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하고; 그리고 4) 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA의 분석 가능한 풀을 생성하는 것을 포함한다.
본원에서 논의되는 바와 같이, cfNA는 cfDNA(이중-가닥 cfDNA와 같은)일 수 있다. 따라서, 본 개시는 샘플 중 cfDNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 1) cfDNA를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; 2) 샘플이 처리 단계를 받도록 하고; 3) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 5' 및/또는 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하고; 그리고 4) 증폭 가능한 cfDNA 풀을 증폭시켜 cfDNA의 분석 가능한 풀을 생성하는 것을 포함한다.
본원에서 논의되는 바와 같이, cfNA는 cfRNA일 수 있다. 따라서, 본 개시는 샘플 중 cfRNA의 ISA 방법을 제공하는데, 이 방법은 1) cfRNA를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; 2) 샘플이 처리 단계를 받도록 하고; 3) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 5' 및/또는 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하고; 그리고 4) 증폭 가능한 cfRNA 풀을 증폭시켜 cfRNA의 분석 가능한 풀을 생성하는 것을 포함한다.
본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; ii) 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하고; 그리고 iii) 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
본원에서 논의되는 바와 같이, cfNA는 cfDNA(이중-가닥 cfDNA와 같은)일 수 있다. 따라서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 1) cfDNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; 2) 샘플이 처리 단계를 받도록 하고; 그리고 3) 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 5' 및/또는 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfDNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
본원에서 논의되는 바와 같이, cfNA는 cfRNA일 수 있다. 따라서, 본 개시는 샘플 중 cfNA가 핵산 정제 단계를 받지 않는 분석을 위한 샘플 중 cfNA를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 1) cfRNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하고; 2) 샘플이 처리 단계를 받도록 하고; 3) 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부의 5' 및/또는 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 샘플 중 cfRNA 분자의 적어도 일부를 변형된 cfRNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfRNA 풀을 생성하고; 그리고 4) 증폭 가능한 cfRNA 풀을 증폭시켜 cfRNA의 분석 가능한 풀을 생성하는 단계를 포함한다.
본 개시의 방법은 구체적으로, 위의 개시의 요약 부분에서 제시된 제1 내지 제12 및 제13 내지 제24 양태의 방법을 포함한다. 아래 기술은 ISA의 방법 및 분석을 위한 cfNA를 제조하는 방법 둘 다에 적용된다.
특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 적어도 일부는 cfNA의 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나에 1개의 외인성 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는)의 적어도 일부는 2개의 외인성 핵산 서열(5' 말단에 1개 및 3' 말단에 1개)을 포함한다. 복수의 외인성 핵산 서열이 존재할 때, 외인성 핵산 서열은 서로 같거나 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 샘플에 존재하는 cfNA(cfDNA 및/또는 cfRNA를 포함하는) 분자의 적어도 일부의 3' 및 5' 말단 둘 다에 부가된다.
복수의 cfNA 분자(예를 들어, cfDNA 및/또는 cfRNA)를 포함하는 액체 샘플이 제공된다. 액체 샘플은 대상으로부터 얻어지는 임의의 액체 샘플일 수 있다. 특정 구현예에서, 액체 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 타액 샘플, CSF 샘플, 타액 샘플 또는 소변 샘플이다. 액체 샘플은 요망되는 경우 처리될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 세포를 제거하고 혈장/혈청 분획을 제공하기 위해 처리될 수 있다. 액체 샘플은 임의의 처리 없이 직접적으로 사용될 수 있다. 액체 샘플의 성질이, 적어도 부분적으로, 처리 단계가 요구되는지를 결정할 것이다. 일 구현예에서 액체 샘플은 전세포 또는 세포 단편을 포함하지 않는다. 처리 단계는 세포, 세포 단편 등과 같이 샘플로부터 원치 않는 물질을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 샘플의 성질이 무엇이든지, 샘플 중 cfNA는 특이적으로 분리 또는 정제되지 않는다. 특정 구현예에서, 액체 샘플은 인간 대상과 같은 대상으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 액체 샘플은 암, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염과 같은 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는, 인간 대상을 포함하는, 대상으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 액체 샘플은 질환 또는 병태에 대한 처치 중인, 인간 대상을 포함하는, 대상으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상이 질환 또는 병태에 대한 처치를 받는 동안 액체 샘플은, 인간 대상을 포함하는, 대상으로부터 시간 경과에 따라 연속으로 채취된다(처치 개시 전, 처치 동안 및/또는 처치 종료 후를 포함함).
일 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 1 mL 미만이다. 다른 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 0.5 mL 미만이다. 다른 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 0.1 mL 미만이다. 다른 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 0.05 mL 미만이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 10 내지 1000 마이크로리터이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 10 내지 750 μL이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 10 내지 500 μL이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 10 내지 250 μL이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 10 내지 100 μL이다. 특정 구현예에서, 액체 샘플의 용량은 10 내지 50 μL이다. 샘플의 성질이, 적어도 부분적으로, 요구되는 샘플 용량을 결정할 수 있다.
일 구현예에서, 처리 단계는 샘플을 희석하는 것이다. 따라서, cfNA를 포함하는 샘플은 선택적으로 희석될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 본원에 기술되는 추가 반응에 혼화 가능한 용액에서 희석된다. 특정 구현예에서, 샘플은 증폭 허용 가능한 용액에서 희석된다. "증폭 허용 가능한 용액"은 샘플 중 변형된 cfDNA 분자의 증폭을 위해 사용되는 핵산 증폭 반응에 혼화 가능한 용액이고 샘플 중 cfNA를 분해하지 않는 것이다. 사용될 수 있는 대표적인 용액은 해당 분야에 알려져 있고, 인산염 완충 식염수(PBS), PCR 증폭 완충액, 뉴클레아제가 없는 물 및 트리스-기반 완충액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 샘플은 희석되지 않는다. 특정 구현예에서, 혈장 또는 혈청이 사용될 때, 샘플은 증폭 허용 가능한 용액과 같은 것으로 1 내지 20배, 1 내지 10배 또는 1 내지 5배 희석된다. 특정 구현예에서, 용액은 PBS이다. 특정 구현예에서, 용액은 10 mM 트리스, pH 8.0; 1 mM EDTA이다. 특정 구현예에서, 용액은 뉴클레아제가 없는 물이다. 특정 구현예에서, 혈장 및 혈청은 희석된다. 특정 구현예에서, 소변 샘플은 희석되지 않는다. 증폭 허용 가능한 용액은 샘플 중 cfNA의 분해를 방지하기 위한 물질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 증폭 허용 가능한 용액은 샘플 중 cfNA의 분해를 방지하기 위한 물질을 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 처리 단계는 샘플을 가열하는 것이다. 따라서, cfNA를 포함하는 샘플은 선택적으로 가열될 수 있다. 가열은, 적어도 부분적으로, 단백질을 변성시키고, cfNA 복합체를 해리시키고, 샘플 중 뉴클레아제(예를 들어, DNase 및/또는 RNase)를 불활성화시키고 샘플 중 cfDNA를 단편화하도록 작용한다. 가열 단계는 달라질 수 있다. 일 구현예에서, 샘플은 70℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃ 또는 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열된다. 샘플은 1 내지 20분, 1 내지 10분 또는 1 내지 5분 가열될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 95℃에서 4분 동안 가열된다.
일 구현예에서, 처리 단계는 샘플 중 cfNA를 단편화하는 것이다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 다양한 공급원으로부터의 cfNA는 상이한 단편 크기 분포를 가질 수 있다. 본원에 기술되는 방법에 사용되는 바와 같이, 특정 구현예에서 cfNA는 50 bp 내지 2,000 bp의 단편 크기 분포를 갖는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, cfNA는 100 bp 내지 1,000 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA는 50 bp 내지 600 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA는 50 bp 내지 500 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA는 100 bp 내지 500 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA는 100 bp 내지 400 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA는 100 bp 내지 300 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA는 100 bp 내지 200 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA는 200 bp 내지 300 bp, 300 bp 내지 400 bp, 400 bp 내지 500 bp 또는 500 bp 내지 600 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 특정 구현예에서, cfNA의 주요 부분은 100 bp 내지 2,000 bp, 또는 위에 논의된 임의 범위의 단편 크기 분포를 갖는다. "주요 부분"은 샘플 중 cfNA의 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 이상을 의미한다. 이에 따라, cfNA를 포함하는 샘플은 선택적으로 단편화될 수 있다. 특정 구현예에서, 단편화 단계 이후, cfNA는 50 bp 내지 600 bp, 100 bp 내지 500 bp, 100 bp 내지 400 bp, 100 bp 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp, 200 bp 내지 300 bp, 300 bp 내지 400 bp, 400 bp 내지 500 bp 또는 500 bp 내지 600 bp의 단편 크기 분포를 갖는다. 단편화 단계는 해당 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 위에 논의된 바와 같이, 일 구현예에서 단편화는 샘플을 가열하는 것에 의해 달성될 수 있다. 가열이 cfNA를 단편화하기 위해 사용될 때, 이가 양이온(예를 들어, 마그네슘)이 샘플에 첨가될 수 있다. 일 구현예에서, 단편화는 물리적 수단, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 음향 전단(acoustic shearing), 초음파 및 유체역학 전단에 의해 달성된다.
일 구현예에서, 처리 단계는 희석 및 가열이다. 일 구현예에서, 처리 단계는 희석 및 단편화이다. 일 구현예에서, 처리 단계는 가열 및 단편화이다. 일 구현예에서, 처리 단계는 희석, 가열 및 단편화이다.
특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부는 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 변형된 cfNA로 전환되어 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성한다. 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부는 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 3' 말단에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 변형된 cfNA로 전환되어 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성한다. 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부는 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 것에 의해 변형된 cfNA로 전환되어 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성한다.
샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부에 외인성 핵산 서열을 부가하기 위해, cfNA는 외인성 핵산 서열에 효율적으로 연결될 수 있는 cfNA("최적화된 cfNA"로 언급됨)를 생산하도록 처리될 수 있다. 샘플 중 cfNA는, 특히 5' 및/또는 3' 말단에서 균일하지 않다. 따라서, 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA의 적어도 일부는 외인성 핵산 서열(들)의 부가 전에 최적화된 cfDNA로 변환된다. 최적화된 cfNA는 많은 방법에 의해 제조될 수 있고, 이는 부분적으로 부가되는 외인성 핵산 서열(들)의 성질에 의존할 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA는 외인성 핵산 서열을 샘플 중 cfNA의 적어도 일부로 부가하기 전에 본원에서 논의되는 바와 같이 단편화된다.
일 구현예에서, cfNA는 평활 말단을 갖는 cfNA를 생산하도록 말단 보수된다. 이러한 말단 보수에 의해, 임의의 5' 및/또는 3' 오버행(overhang)은 적절한 중합효소를 사용하여 채워진다. 중합효소는, 비록 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 요구되지 않더라도, 5'-3' 중합효소 활성에 더하여 3'-5' 엑소뉴클레아제/교정 활성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, cfDNA T4 DNA 중합효소에서는, Taq DNA 중합효소 또는 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편이 사용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은 연결에 의해 샘플 중 cfNA의 적어도 일부의 3' 및 5' 말단의 하나 또는 둘 다에 직접적으로 부가될 수 있다.
다른 구현예에서, 샘플 중 cfNA는 말단 보수되어(예를 들어, 중합효소를 사용하여) cfNA의 하나 또는 둘 다의 말단에 3' 오버행을 생성한다(이것은 중합효소에 의해 생성되는 단일 아데닌 또는 폴리-아네노신 서열일 수 있다). 외인성 핵산 서열은 3' 오버행에 혼성화되기 위해 상보적 서열을 갖도록 고안되고 다음에 샘플 중 cfDNA 분자의 적어도 일부의 3' 및 5' 말단의 하나 또는 둘 다에 연결된다.
다른 구현예에서, cfNA의 3' 말단의 하나 또는 둘 다는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT)를 사용하여 변형되어 동종중합체 꼬리(예를 들어, 폴리-아데닌 서열)를 생성하는데, 이는 상보적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 폴리-티민)을 갖는 외인성 핵산 서열의 부가를 허용한다. DNA 리가아제는 단일-가닥 닉(nick)을 봉하기 위해 사용될 수 있다.
임의의 전술한 내용에서, 5' 포스페이트는 뉴클레오티드 키나아제 활성(T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 같은)과 함께 첨가될 수 있다.
다양한 효소 혼합물이 전술한 반응을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소 혼합물은 다음 성분을 포함할 수 있다:
1) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소 및 ii) 리가아제;
2) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제 및 iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제;
3) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 iv) 복제 블록 활성화 활성;
4) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 복제 블록 활성화 활성 및 v) 핵산 절단 효소 활성;
5) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 복제 블록 활성화 활성, v) 핵산 절단 효소 활성 및 vi) 핵산 결합 단백질.
특정 구현예에서, 효소 혼합물은 다음 성분을 포함할 수 있다:
1) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 ii) DNA 리가아제;
2) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제 및 iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제;
3) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제, iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성;
4) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제, iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성 및 v) 단일-가닥 DNA 핵산 절단 효소 활성;
5) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제, iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성, v) 단일-가닥 DNA 핵산 절단 효소 활성 및 vi) 단일-가닥 DNA 결합 단백질.
특정 구현예에서, 효소 혼합물은 다음 성분을 포함할 수 있다:
1) T4 DNA 중합효소 및 ii) T4 DNA 리가아제 또는 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편 및 ii) T4 DNA 리가아제;
2) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제 및 iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편
3) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제, iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, 및 iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제;
4) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제, iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 및 v) 우라실-DNA 글리코실라아제; 또는
5) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제, iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, v) 우라실-DNA 글리코실라아제 및 Nb.BbvC1.
임의의 전술한 것은 단일-가닥 결합 단백질(예를 들어, 대장균(E. coli) 단일-가닥 결합 단백질과 같은)을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제; DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 우라실-DNA 글리코실라아제 및 Nb.BbvC1를 포함한다. 특정 구현예에서, 효소 혼합물은 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편 및 T4 DNA 리가아제를 포함한다.
본원에 개시되는 방법에 사용될 수 있는 다양한 효소의 농도는 달라질 수 있다. 일 구현예에서, 효소는 다음 농도 범위로 사용된다: T4 DNA 중합효소 2 내지 15 U, Klenow 단편 2 내지 20 U, T4 DNA 리가아제 100 내지 1,000 U, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5 내지 20 U, Nb.BbvC1 5 내지 20 U, 및 우라실-DNA 글리코실라아제 1 내지 6 U; 대장균(E. coli) 단일-가닥 결합 단백질은 50 내지 500 ng으로 존재할 수 있다.
해당 분야에 알려진 바와 같이 다양한 완충액/반응 용액이 본 개시의 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 반응 용액은 20 내지 75 mM 아세트산칼륨, 10 내지 100 mM 트리스-아세테이트(25℃에서 pH 7.9), 1 내지 30 mM 아세트산마그네슘, 0.1 내지 20 mM DTT, 5 내지 100 μM dNTP, 0.5 내지 2 mM의 ATP, 및 100 내지 400 ug/mL BSA를 포함한다. 다른 구현예에서, 반응 용액은 20 내지 75 mM NaCl, 10 내지 100 mM 트리스-Cl, pH 7.0-8.0, 1 내지 30 mM MgCl2, 0.1 내지 20 mM DTT 5 내지 100 μM dNTP 및 0.5 내지 2 mM의 ATP.
특정 구현예에서, 효소 혼합물은 반응을 개시하고 완료하도록 순차적 가열 프로그램(예를 들어, 유전자 증폭기(thermal cycler)를 사용하는 것에 의한)을 받는다. 일 구현예에서, 순차적 가열 프로그램은 정의된 지속 기간의 2 가열 단계, 정의된 지속 기간의 3 가열 단계, 정의된 지속 기간의 4 가열 단계 또는 정의된 지속 기간의 5 이상의 가열 단계로 구성된다. 개별 가열 단계의 지속 기간은 독립적으로 달라질 수 있고, 1 내지 40 분, 예를 들어 5 내지 30 분, 10 내지 25 분, 1 내지 5 분, 20 분 또는 5 분 계속될 수 있다. 순차적 가열 프로그램은 샘플의 온도를 변화시킴으로써 정의된 시간에 효소 혼합물 중 특정 효소가 우선적으로 활동하는 것을 허용하도록 작용한다. 우선적으로 활동한다는 것은, 효소 혼합물 중 1개 이상의 효소가 효소 혼합물 중 적어도 하나의 다른 효소보다 더 큰 활성을 보일 것을 의미한다. 이러한 방식으로, 증폭 가능한 cfNA 풀의 생산을 위해 요구되는 다양한 반응이, 적어도 부분적인 정도까지 차례로 일어날 수 있다. 순차적 가열 프로그램은 중합효소 활성이 우선적으로 활동하는(예를 들어, T4 DNA 중합효소 및/또는 Klenow 단편) 온도에서 시작하여 최적 cfNA의 형성을 허용한 다음, 리가아제가 우선적으로 활동하는 온도에서 외인성 핵산 서열(들)의 cfNA에 대한 연결을 허용한다. 다른 가열 단계도 포함될 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산 서열의 절단을 허용하는 온도 단계가 포함될 수 있다. 추가의 예로서, 효소 혼합물 중 효소의 전부 또는 일부를 불활성화시키는 온도 단계가 포함될 수 있다.
순차적 가열 프로그램을 위한 예시적인 온도 범위는 12℃ 내지 20℃, 20℃ 내지 30℃, 30℃ 내지 40℃ 및 60℃ 내지 90℃를 포함한다. 특정 구현예에서, 순차적 가열 프로그램을 위한 예시적인 온도 범위는 다음과 같다: 14℃ 내지 18℃ 및 22℃ 내지 26℃; 14℃ 내지 18℃, 22℃ 내지 26℃ 및 70℃ 내지 80℃; 또는 14℃ 내지 18℃, 22℃ 내지 26℃, 35℃ 내지 39℃ 및 70℃ 내지 80℃. 각각의 온도 범위는 다음 온도 범위로 진행하기 전 정의된 지속 기간 동안 유지될 수 있다.
본 개시의 방법과 함께 사용될 수 있는 대표적인 순차적 가열 프로그램은 다음과 같다: i) 16℃ 20분 동안; ii) 24℃ 20분 동안; iii) 37℃ 20분 동안; iv) 75℃ 5분 동안(불활성화); 및 v) 4℃(유지; 즉각적인 PCR 증폭이 요망될 경우 이 단계는 선택적). 공정의 결과는 변형된 cfDNA 분자의 5' 및 3' 말단의 하나 또는 둘 다에서 프라이머 부위를 갖는 cfDNA 분자의 증폭 가능한 풀이다. 이 반응의 결과는 cfDNA 분자의 증폭 가능한 풀이다.
전술한 내용에서, 모든 효소 반응은 cfNA 정제의 필요 없이(cfNA는 특이적으로 분리 또는 정제되지 않음) 원래의 샘플에서 일어나고 성분을 제거하거나, 산물 또는 기질을 제거하거나, 달리 단계 사이에 반응을 "정화((clean-up)"할 필요 없이 단일 반응 용기에서 일어난다.
전술한 내용의 결과는 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 생성하기 위해 사용될 수 있는 cfNA 분자의 증폭 가능한 풀의 생성이다.
외인성 핵산 서열은 프라이머에 결합할 수 있는 프라이머 부위를 포함하는데, 이것은 cfNA의 증폭 가능한 풀의 증폭에 사용된다. 용어 "프라이머에 결합할 수 있는"은 특이적 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 부위뿐 아니라 특이적 프라이머의 서열과 동일한 서열을 갖는 프라이머 부위(이 경우 프라이머에 상보적인 서열은 본원에서 논의되는 바와 같이 초기 복제 단계 중에 생산된다)를 포함하는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 특이적 프라이머에 상보적인 프라이머 부위 또는 특이적 프라이머와 동일한 서열을 포함하는데, 이는 DNA 합성의 초기 라운드 이후 프라이머 부위에서 생성된다. 특정 구현예에서, 프라이머 부위는 범용 프라이머 부위이다. 이러한 범용 프라이머 부위는 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 3', 5' 또는 3' 및 5' 말단 둘 다에 부가된다. 3' 말단에 부가되는 프라이머 부위는 3' 프라이머 부위로 불리고 5' 말단에 부가되는 프라이머 부위는 5' 프라이머 부위로 불린다. 일 구현예에서, 각각의 3' 프라이머 부위는 변형된 각각의 cfNA 분자에서 동일하고 각각의 5' 프라이머 부위는 변형된 각각의 cfNA 분자에서 동일한데, 3' 및 5' 프라이머 부위는 서로 별개이다(즉, 서열 특이적 방식으로 별개의 프라이머에 결합할 수 있다). 이와 같이, 단일 쌍의 프라이머가 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭하기 위해 사용될 수 있어, 복수의 프라이머 부위에 대한 증폭 조건을 최적화하는 복잡성을 제거함으로써 증폭에 대한 조건을 단순화시킨다. 일 구현예에서, 각각의 3' 및 5' 프라이머 부위는 변형된 각각의 cfNA 분자에서 동일하고 각각의 3' 및 5' 프라이머 부위는 서열 특이적 방식으로 동일한 프라이머에 결합할 수 있다. 단일 프라이머가 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시키기 위해 사용될 수 있어, 복수의 프라이머 부위에 대한 증폭 조건을 최적화하는 복잡성을 제거함으로써 증폭에 대한 조건을 추가로 단순화시킨다. 특정 구현예에서, 3' 및/또는 5' 프라이머 결합 부위는 인간 게놈에서 발견되지 않는 서열이다. 특정 구현예에서, 3' 및/또는 5' 프라이머 부위는 각각의 프라이머가 실질적으로 동일한 증폭 조건 하에서 3' 및/또는 5' 결합 부위에 결합하도록 고안된다. 특정 구현예에서, 3' 및/또는 5' 프라이머 부위는 각각의 프라이머가 서로 1℃ 내지 2℃ 이내 또는 서로 2℃ 내지 4℃ 이내인 용융 온도 및/또는 어닐링 온도로 3' 및/또는 5' 결합 부위에 결합하도록 고안된다.
일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 아래 나타낸 서열을 갖고, N6-10 및 N3-6은 임의의 핵산 서열을 나타낸다. 각 부위에 대한 각각의 프라이머가 또한 제공된다.
어댑터 1: 5' - (N6-10)ATTAACCCTCACTAAAG(N3-6) - 3' (서열번호: 1)
어댑터 2: 5'- (N6-10)TAATACGACTCACTATAGGG(N3-6) - 3' (서열번호: 2)
5' 프라이머: 5' - ATTAACCCTCACTAAAG- 3´ - (서열번호: 3)
3' 프라이머: 5' - TAATACGACTCACTATAGGG- 3´- (서열번호: 4)
다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 아래 나타낸 서열을 갖는다. 각 부위에 대한 각각의 프라이머가 또한 제공된다.
어댑터:
5'-OH-
TGTGTTGGGTGTGGUUUUUATTTAATACGACTCACTATAGACCCTCAGCACC
ACCACACCCAACACA-3' (서열번호: 5)
프라이머: 5'-ACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC-3' (서열번호: 6)
다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 아래 나타낸 서열을 갖는다. 각 부위에 대한 각각의 프라이머가 또한 제공된다.
어댑터:
5'-
TGTGTTGGGTGTGGUUUUUATTTAATACGACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC
CACACCCAACACA(N)n-3' (서열번호: 7), 여기에서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 n은 0 내지 10의 정수이다. 특정 구현예에서, N은 아데닌이고 n은 1 내지 5이거나 n은 1이다(예를 들어, 서열번호: 9). 특정 구현예에서, n은 0이다(예를 들어, 서열번호: 10).
5'-
TGTGTTGGGTGTGGUUUUUATTTAATACGACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC
CACACCCAACACAA-3' (서열번호: 9)
5'-
TGTGTTGGGTGTGGUUUUUATTTAATACGACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC
CACACCCAACACA (서열번호: 10)
프라이머: 5'-TGAGTGATATCTGGGAGTCGAGGTG (서열번호: 8)
특정 구현예에서, 외인성 핵산은 복제 블록을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "복제 블록"은 DNA 중합효소가 복제 블록을 지나서 상보적 핵산 가닥을 생성하지 못하도록 DNA 중합효소의 작용을 방해 또는 정지시키는 핵산 서열을 말한다. 특정 구현예에서, 복제 블록의 핵산 서열은 비활성화 형태이고 반응 혼합물의 성분(예를 들어, 효소 혼합물의 성분)에 의해 활성 형태로 전환된다. 위의 외인성 핵산 서열의 특정 구현예에서, 복제 블록은 폴리-U 서열로 표현되는데, 이는 우라실-DNA 글리코실라아제에 의한 작용이 없이는 복제 블록으로서 비활성화되어 있다.
위에 제공되는 서열은 사실상 예시적인 것이고 다른 외인성 핵산 서열이 제공될 수 있다. 본원에 개시되는 방법에서 외인성 핵산 서열은 0.1 내지 5 μM에서 사용될 수 있고 프라이머는 50 내지 1000 nM에서 사용될 수 있다.
샘플 중 cfNA의 적어도 일부의 5' 및/또는 3' 말단에 부가되는 외인성 핵산 서열은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 스템-루프 구조를 형성하고 단일-가닥 루프 부분을 포함하는 서열이다.
특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%가 5' 및/또는 3' 말단의 하나 또는 둘 다에 외인성 핵산 서열을 포함하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%가 5' 및 3' 말단의 둘 다에 외인성 핵산 서열을 포함하도록 변형된다.
다음은 샘플 중 cfNA의 5' 말단, 3' 말단 및/또는 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에 외인성 핵산 서열을 부가하는 몇 가지 예시적인 접근법을 기술한다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 cfNA의 초기 복제에 의해 cfNA의 5' 및/또는 3' 말단에 부가되는데, 이는 외인성 핵산 서열에 의해 준비 또는 개시될 수 있다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열의 적어도 한 가닥은 cfNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 cfNA의 적어도 한 가닥과 연결된다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열의 적어도 한 가닥은 cfNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 cfNA의 적어도 한 가닥과 연결되고 외인성 핵산 서열의 적어도 일부는 초기 복제에 의해 복제되는데, 이는 cfNA에 의해 준비 또는 개시될 수 있다. 본원에 기술되는 구현예에서, 샘플 중 cfNA의 하나 이상이 더 큰 cfNA 단편을 형성하도록 함께 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시의 방법은 범용 5' 말단 프라이머 부위를 갖는 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하는 것에 의해 샘플 중 존재하는 cfNA(예를 들어, cfDNA를 포함하는)의 초기 복제를 이용한다. 어닐링된 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장되고, 이는 다음에 다른 사이클의 프라이머 어닐링 및 연장을 위한 새로운 주형으로서 작용한다. 결과적으로, 샘플 중 cfNA(예를 들어, cfDNA를 포함하는)는 프라이머 부위를 포함하는 외인성 핵산 서열의 부가에 의해 변형되고(이 경우, 초기 복제에 의한 cfNA로의 통합에 의해) 분석 전 기하급수적 증폭에 적절하여, 증폭 가능한 cfNA(예를 들어, cfDNA를 포함하는) 풀을 생산한다. 이와 같이, 외인성 핵산 서열이 초기 복제를 준비시키므로 외인성 핵산 서열은 초기 복제를 통해 5' 및/또는 3' 말단으로 부가된다. 일 구현예에서, 모든 효소적 반응은 물질(핵산을 포함하는)의 이동 또는 cfNA의 정제 없이(예를 들어, cfNA는 특이적으로 분리 또는 정제되지 않음) 원래의 샘플에서 일어난다. 특정 구현예에서, 샘플 중 cfNA 단편은 변성 프라이머가 cfNA 서열에 결합하기 전 또는 후에 더 긴 cfNA 단편을 생산하도록 연결을 받을 수 있다. 이러한 구현예를 위한 적절한 효소 혼합물은 DNA 중합효소 I 및 T4 DNA 리가아제를 포함하거나, 이를 필수 구성 요소로 하거나, 이로 구성되는 효소 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 개시의 방법은 서열-특이적 외인성 핵산 서열을 샘플 중 cfNA(예를 들어, cfDNA를 포함하는)의 적어도 일부로 5'- 및 3'-말단의 하나 또는 둘 다에서 효소적으로 부가하기 위해 분자 클로닝의 개념을 적용하여, PCR 증폭을 위한 프라이머 부위(들)를 생성한다. 일 구현예에서, 모든 효소적 반응은 물질(핵산을 포함하는)의 이동 또는 cfNA의 정제 없이(예를 들어, cfNA는 특이적으로 분리 또는 정제되지 않음) 원래의 샘플에서, 그리고 단일 반응 용기에서 일어난다.
분자 클로닝 접근법의 일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 스템-루프 구조를 형성하고 단일-가닥 루프 부분을 포함하는 서열이고 외인성 핵산 서열의 각 가닥은, 변형된 cfNA가 외인성 핵산 서열과 cfNA 서열 사이의 핵산 가닥에 갭, 닉 또는 중단을 갖지 않도록, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 cfNA의 각 가닥으로 연결된다. 이 접근법의 일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 cfNA에 직접적으로 연결된다. cfNA는 본원에서 논의되는 바와 같이 평활 말단을 갖고 외인성 핵산 서열이 cfNA의 각 가닥으로 5' 및/또는 3' 말단에 직접적으로 연결되도록 제조될 수 있다. 이러한 구현예에서, 외인성 핵산 서열의 루프 부분은, 예를 들어 효소(예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라아제)의 사용을 통해, 절단(또는 개방)될 수 있다. 이러한 구현예를 위해 적절한 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제; iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편; iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제; 및 v) 우라실-DNA 글리코실라아제(선택적으로 Nb.BbvC1를 포함하는)를 포함하거나, 이를 필수 구성 요소로 하거나, 이로 구성되는 효소 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 구현예를 위해 적절한 외인성 핵산 서열은 서열번호: 8의 프라이머와 함께 서열번호: 10의 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
cfNA는 또한 꼬리 서열(예를 들어, 3' 오버행), 예를 들어 단일 뉴클레오티드(예를 들어, 단일 아데닌 잔기) 또는 복수의 뉴클레오티드(예를 들어, 폴리-아데닌 꼬리)을 갖도록 제조될 수 있으며; 특정 구현예에서, 꼬리는 cfNA의 5' 및/또는 3' 말단의 하나 또는 둘 다에 위치한다. 특정 구현예에서, 꼬리는 단일 아데닌 또는 폴리-아데닌 꼬리(예를 들어, 길이가 2 내지 10 뉴클레오티드)이다. 이러한 구현예에서, 외인성 핵산 서열의 루프 부분은, 예를 들어 효소(예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라아제)의 사용을 통해, 절단(또는 개방)될 수 있다. 이러한 구현예에 적절한 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제; iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편; iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제; 및 v) 우라실-DNA 글리코실라아제(선택적으로 Nb.BbvC1를 포함하는)를 포함하거나, 이를 필수 구성 요소로 하거나, 이로 구성되는 효소 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 구현예를 위해 적절한 외인성 핵산 서열은 서열번호: 8의 프라이머와 함께, 서열번호: 7, (예를 들어, 서열번호: 9)의 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
분자 클로닝 접근법의 다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 스템-루프 구조를 형성하고 프라이머 부위의 보체를 포함하는 단일-가닥 루프 부분을 포함하는 서열이며; 외인성 핵산 서열의 한 가닥은, 변형된 cfNA가 cfNA 서열의 말단 3' OH 잔기와 외인성 핵산 서열의 5' OH 사이에 cfNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 핵산 가닥에 갭, 닉 또는 중단을 포함하도록, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 cfNA의 한 가닥으로 연결된다. 이 구현예에서, 본 개시의 방법은 외인성 핵산 서열을 복제하는 cfNA의 유리 3' OH에서 개시되는 닉 번역 기전을 통한 외인성 핵산 서열의 초기 복제를 이용하여, 프라이머 결합 부위를 생성한다. 5' 포스페이트 그룹은 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제에 의해 부가될 수 있으며, 이는 외인성 핵산 서열에 원래 존재하는 3' OH를 포스페이트로 교체한다. 이러한 구현예를 위해 적절한 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 Nb.BbvC1(선택적으로 우라실-DNA 글리코실라아제를 포함하는)를 포함하거나, 이를 필수 구성 요소로 하거나, 이로 구성되는 효소 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 구현예를 위해 적절한 외인성 핵산 서열은 서열번호: 6의 프라이머와 함께 서열번호: 5의 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
분자 클로닝 접근법의 다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 스템-루프 구조를 형성하고 복제 블록 및 프라이머 부위의 보체를 포함하는 단일-가닥 루프 부분을 포함하는 서열이며; 외인성 핵산 서열의 한 가닥은, 변형된 cfNA가 cfNA 서열의 말단 3' OH 잔기와 외인성 핵산 서열의 5' OH 사이에 cfNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 핵산 가닥에 갭, 닉 또는 중단을 포함하도록, 샘플 중 cfNA 분자의 적어도 일부의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 cfNA의 한 가닥으로 연결된다. 이 구현예에서, 본 개시의 방법은 외인성 핵산 서열을 복제 블록까지 복제하는 cfNA의 유리 3' OH에서 개시되는 닉 번역 기전을 통한 외인성 핵산 서열의 초기 복제를 이용한다. 생성된 5' 오버행은 프라이머 결합 부위를 생성하도록 DNA 중합효소를 사용하여 채워질 수 있다. 특정 구현예에서, 원래의 외인성 핵산 서열의 앞뒤역순상동서열의 부분은 차후의 PCR 증폭 공정 중 헤어핀 구조의 형성을 방지하기 위해 변형된 cfNA로부터 제거된다. 이러한 반응은 단일-가닥 절단 효소(예를 들어 NbBbv1) 및 우라실-DNA 글리코실라아제를 사용하여 실시될 수 있다. 5' 포스페이트 그룹은 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제에 의해 부가될 수 있으며, 이는 외인성 핵산 서열에 원래 존재하는 3' OH를 포스페이트로 교체한다. 이러한 구현예를 위해 적절한 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 우라실-DNA 글리코실라아제 및 Nb.BbvC1을 포함하거나, 이를 필수 구성 요소로 하거나, 이로 구성되는 효소 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 구현예를 위해 적절한 외인성 핵산 서열은 서열번호: 6의 프라이머와 함께 서열번호: 5의 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
분자 클로닝 접근법의 특정 구현예에서, 원래의 외인성 핵산 서열의 앞뒤역순상동서열의 부분(이중-가닥 스템 부분을 형성하는)은 차후의 PCR 증폭 공정 중 헤어핀 구조의 형성을 방지하기 위해 변형된 cfNA로부터 제거된다. 이러한 반응은 단일-가닥 절단 효소(예를 들어 NbBbv1) 및 우라실-DNA 글리코실라아제를 사용하여 실시될 수 있다. 분자 클로닝 접근법의 특정 구현예에서, 앞뒤역순상동서열의 부분은 제거되지 않는다.
증폭 가능한 cfNA 풀은 다음에 후속 분석을 위한 충분한 양의 cfNA를 생산하기 위해 임의의 공지된 기법에 의해 증폭될 수 있다. 증폭 반응의 산물은 cfNA의 분석 가능한 풀로 언급된다. 일 구현예에서, 증폭 가능한 cfNA 풀은 3' 및/또는 5' 프라이머 결합 부위에 대한 서열-특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 받는다. 일 구현예에서 3' 및 5' 결합 부위 둘 다 및 이들 각각의 프라이머가 증폭에 사용된다. 일 구현예에서는, 3' 및 5' 결합 부위의 단 하나 및 각각의 프라이머가 증폭에 사용된다. 임의의 PCR 증폭 프로토콜 또는 기법이 증폭 가능한 cfDNA 풀을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다.
PCR 증폭은 cfNA의 분석 가능한 풀에서 요망되는 수율의 cfNA를 생산하도록 요망되는 증폭 사이클 수로 실시될 수 있다. 특정 구현예에서, 10 내지 30 사이클의 증폭이 실시된다. 특정 구현예에서, 12 내지 28 사이클의 증폭이 실시된다. 특정 구현예에서, 15 내지 25 사이클의 증폭이 실시된다. 특정 구현예에서, 17 내지 23 사이클의 증폭이 실시된다. 특정 구현예에서, 18 사이클의 증폭이 실시된다. 특정 구현예에서, 25 사이클의 증폭이 실시된다.
PCR 증폭 반응을 위한 사이클링 조건은 해당 분야에 알려진 바와 같을 수 있고 일반적으로 주형 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 연장을 위한 단계를 포함한다. 초기 단계는 표적 DNA를 94℃ 이상으로 15초 내지 4분 동안 가열하는 것에 의해 변성시킨다. 변성 공정에서, DNA의 가닥은 서로 분리되어, 내열성 중합효소에 의한 복제를 위해 필요한 단일-가닥 DNA 주형을 생산한다. 사이클의 다음 단계에서, 온도는 대략 40 내지 65℃로 감소된다. 이 온도에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변성된 표적 DNA와 안정한 회합(어닐)을 형성하고 중합효소에 대한 프라이머로서 기능할 수 있어 새로운 주형 합성을 초래한다. 이 단계는 일반적으로 65 내지 74℃의 범위에서 1 내지 7분 동안 일어난다. 다음 사이클은 변성을 위해 94℃로 복귀하면서 시작된다. PCR 증폭을 위한 특정 조건은 해당 분야에 알려진 바와 같이 달라질 수 있고 본 개시의 방법에도 여전히 유용하다.
일 구현예에서, 다음 PCR 증폭 조건이 사용된다: i) 95℃에서 3분 동안 초기 변성; ii) 다음에 94℃에서 15초 동안 25 사이클의 변성 및 65℃에서 5분 동안 어닐링/연장.
다른 구현예에서, 다음 PCR 증폭 조건이 사용된다: i) 95℃에서 3분 동안 초기 변성; ii) 다음에 94℃에서 15초 동안 18 사이클의 변성 및 65℃에서 5분 동안 어닐링/연장.
증폭 반응의 결과는 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀이다.
예시적 절차
본원에 기술되는 방법을 실시하기 위한 예시적 절차는 본원의 방법 섹션 및 실시예에서 제공된다.
cfDNA의 분석 가능한 풀의 분석
본원의 방법에 의해 생산된 cfDNA의 분석 가능한 풀은 해당 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 분석될 수 있다. 추가로, 임의의 양의 cfNA가 분석에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 분석의 방법은 차세대 서열분석(NGS)이다. NGS가 사용될 때, 분석 가능한 풀로부터의 cfNA의 양은 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀 중 1 ng 내지 50 ng의 cfNA가 NGS 분석을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀 중 1 ng 내지 10 ng, 예를 들어 1 ng 내지 2 ng, 2 ng 내지 5 ng, 5 ng 내지 7 ng 또는 7 ng 내지 10 ng의 cfNA가 NGS 분석을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 분석 가능한 풀 중 10 ng 내지 25 ng, 예를 들어 13 ng 내지 27 ng, 16 ng 내지 24 ng 또는 19 ng 내지 21 ng의 cfNA가 NGS 분석을 위해 사용된다.
다른 구현예에서, 분석의 방법은 NGS이고 cfNA 샘플(예를 들어, 위에 명시된 양의)은 cfNA의 단일 분석 가능한 풀로부터 채취된다. cfNA의 분석 가능한 풀로부터의 cfNA는 단일 샘플링 또는 복수 샘플링으로 채취될 수 있다.
다른 구현예에서, 분석의 방법은 NGS이고, 예를 들어, 위에 명시된 양의 cfNA 샘플은 동일 샘플로부터 제조된 cfNA의 복수의 분석 가능한 풀로부터 채취된다. cfNA의 분석 가능한 풀의 임의 개수, 예를 들어 2 내지 10개가 샘플링될 수 있다. cfNA의 분석 가능한 풀로부터의 cfNA는 cfNA의 임의의 분석 가능한 풀로부터의 단일 샘플링 또는 복수 샘플링으로 채취될 수 있다. 동일 샘플로부터 제조된 cfNA의 추가적인 복수의 분석 가능한 풀은 샘플링 전에 혼합될 수 있다. cfNA의 분석 가능한 풀의 임의 개수, 예를 들어 2 내지 10개가 혼합될 수 있다(또는 모아질 수 있다). cfNA의 혼합된 분석 가능한 풀로부터의 cfNA는 cfNA의 혼합된 분석 가능한 풀로부터 단일 샘플링 또는 복수 샘플링으로 채취될 수 있다.
사용의 방법
본 개시는 또한 cfNA의 증폭 가능한 풀 및 cfNA의 분석 가능한 풀을 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시는 샘플 중 cfNA(cfDNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는)를 분석하는 방법을 제공한다. 이 방법의 특정 구현예는 아래 제공된다.
일 구현예에서, 본 개시는 세포-유리 핵산을 분석하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고, 그리고 ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 cfNA 분자의 특징을 결정하는 단계를 포함한다.
분석의 방법에서, cfNA는 cfNA일 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산은 cfDNA이다. 특정 구현예에서, 핵산은 이중-가닥 cfDNA이다. 특정 구현예에서, cfNA는 cfRNA, 또는 이러한 cfRNA로부터 유래되고 이의 대표적인 DNA이다.
이에 따라, 일 구현예에서, 본 개시는 cfDNA를 분석하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고, 그리고 ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 cfDNA 분자의 특징을 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 개시는 cfRNA를 분석하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고, 그리고 ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 cfDNA 분자의 특징을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, cfRNA는 cfRNA의 대표적인 DNA로 전환되고 분석 가능한 풀은 cfRNA의 대표적인 DNA를 포함한다.
분석 가능한 풀은 해당 분야에 알려진 임의의 기법에 의해 분석될 수 있다. 적절한 기법은 차세대 서열분석(NGS) 및 PCR-기반의 기술, 이에 제한되지 않는 예를 들어 실시간 정량적 PCR, 블로커 PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 방법에 따라 생산되는 분석 가능한 풀은 이들 및 다른 분석 기법에서의 사용을 위한 충분한 양 및 품질의 cfNA를 제공한다.
특정 구현예에서, 분석 가능한 풀은 분석 가능한 풀에서 하나 이상의 cfNA(cfDNA를 포함하는)의 적어도 하나의 특징을 결정하기 위해 분석된다. 결정되는 특징은 cfNA의 임의의 특징일 수 있다. 하나보다 많은 특징이 동시에 분석될 수 있다. 대표적인 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이(이에 제한되지 않는 예를 들어, 점 돌연변이, 결실 및 삽입), 메틸화 패턴 및 복제수 변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며; 또한 특징은 물질(이에 제한되지 않는 예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 진균)의 존재일 수 있다. 일 구현예에서, 특징은 질환과 관련된다. 일 구현예에서, 특징은 샘플의 제공자가 병에 걸려 있는지를 결정하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 특징은 샘플의 제공자가 병에 걸릴 위험이 있는지를 결정하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 특징은 샘플의 제공자에서 물질(이에 제한되지 않는 예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 진균)의 존재를 결정하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 특징은 대상에 대한 처치 또는 요법의 과정을 결정하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 특징은 현재의 처치 또는 요법의 과정이 효과적인지를 결정하기 위해 사용된다.
특정 특징에 대하여 cfNA(예를 들어, cfDNA를 포함하는)를 분석하는 능력은 질환을 치료하기 위한 치료적 개입을 결정하는 것과 진단적 의미 둘 다에서 유익하다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 본 개시의 방법은 cfNA의 정제가 필요 없이 작은 샘플 용량에서 cfNA(예를 들어, cfDNA를 포함하는)의 분석을 허용한다. 따라서, 환자 관리에 대한 본 개시의 방법의 적용은 크게 확장된다.
본 개시는 대상을 질환이 있거나 이에 대한 위험이 있는 것으로 진단하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 특징의 존재를 기반으로 하여 대상이 질환이 있고/있거나 이에 대한 위험이 있는지를 결정하거나 특징의 부재를 기반으로 하여 대상이 질환이 없고/없거나 이에 대한 위험이 없는지를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 특징의 존재를 기반으로 하여 대상이 질환이 있고/있거나 이에 대한 위험이 있는지를 결정하거나 특징의 부재를 기반으로 하여 대상이 질환이 없고/없거나 이에 대한 위험이 없는지를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 특징의 존재를 기반으로 하여 대상이 질환이 있고/있거나 이에 대한 위험이 있는지를 결정하거나 특징의 부재를 기반으로 하여 대상이 질환이 없고/없거나 이에 대한 위험이 없는지를 결정하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, cfRNA는 cfRNA의 대표적인 DNA로 전환되고 분석 가능한 풀은 cfRNA의 대표적인 DNA를 포함한다.
cfNA의 많은 특징이 본원에 논의되는 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 위 방법의 예시적인 적용으로서, 대상이 진행된 전이성 결장암이 있는 것으로 의심될 경우, 분석 가능한 풀은 진행된 전이성 결장암과 관련되는 특징(예를 들어, KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이)에 대하여 분석될 수 있다. 특징이 분석 가능한 풀에 존재할 경우(KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이) 대상은 결장암이 있거나 이의 위험이 있는 것으로 결정된다.
본 개시는 질환이 있는 대상에 대한 치료적 개입을 결정하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 치료적 개입을 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 치료적 개입을 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 치료적 개입을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, cfRNA는 cfRNA의 대표적인 DNA로 전환되고 분석 가능한 풀은 cfRNA의 대표적인 DNA를 포함한다.
cfNA의 많은 특징이 본원에 논의되는 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 치료적 개입을 결정하는 방법의 예시적인 적용으로서, 결장암 예가 다시 고려된다. 논의된 바와 같이, KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이는 결장암을 가리킨다. 그러나, 존재하는 특정 이상에 따라, 가장 효과적인 처치를 위해 필요한 치료적 개입은 상이하다. 결정된 특징(들)이 KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자에서 돌연변이를 갖지 않을 경우, 세툭시맙 및 파니투무맙(NCCN 및 ASCO 지침에 따른 제1선 처치 선택임)과 같은 항-EGFR 항체 요법이 적절한 요법으로서 결정될 수 있다. 그러나, 결정된 특징이 KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자에서 돌연변이의 존재일 경우, 항-EGFR 항체 요법은 권고되지 않는데, KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자에서의 돌연변이는 항-EGFR 항체 요법에 비-반응성을 나타내기 때문이다.
본 개시는 또한 질환을 진단받고 질환의 처치를 위한 치료적 양생으로 처치 중인 대상의 처치를 모니터링하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; iii) 결정된 특징이 현재의 치료적 처치 양생과 양립 가능하지를 결정하고; iv) 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하고; 그리고 vi) 선택적으로, 단계 i) 내지 iv)를 반복하여 요망되는 시간 간격으로 치료적 개입을 모니터링하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; iii) 결정된 특징이 현재의 치료적 처치 양생과 양립 가능하지를 결정하고; iv) 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하고; 그리고 vi) 선택적으로, 단계 i) 내지 iv)를 반복하여 요망되는 시간 간격으로 치료적 개입을 모니터링하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; iii) 결정된 특징이 현재의 치료적 처치 양생과 양립 가능하지를 결정하고; iv) 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하고; 그리고 vi) 선택적으로, 단계 i) 내지 iv)를 반복하여 요망되는 시간 간격으로 치료적 개입을 모니터링하는 단계를 포함한다.
cfNA의 많은 특징이 본원에 논의되는 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 개시의 방법은 샘플에서 cfNA의 특징을 결정하고, 결정된 특징이 현재의 치료적 처치 양생과 양립 가능하지를 결정하고, 그리고 결정된 특징(들)을 기반으로 처치 결정을 하는 것(예를 들어, 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것을 결정된 특징이 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하는 것)에 의해 대상을 모니터링하는 것을 제공한다. 결장암으로 진단받고 초기 검진 이후 항-EFGR 항체 처치에 적격으로 결정된 대상을 고려한다. 위에 논의된 바와 같이, KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이는 항-EGFR 항체 요법이 적절하지 않을 수 있음을 나타낸다. 항-EGFR 항체 처치가 계속되는 동안 결정된 특징이 KRAS, BRAF, NRAS 및 PIK3CA 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이일 경우, 항-EGFR 항체 처치를 중단시키고 새로운 처치 양생을 개시하도록 결정을 내릴 수 있다.
다른 구현예에서, 특징은 현재의 암에 대한 처치에 영향을 미칠 수 있는 종양에서의 약물 저항성의 발생을 나타내는 특징일 수 있다. 약물 저항성 표현형이 결정될 경우, 처치 요법은 필요할 경우 수정되고 변화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 특징은 종양의 클론 진화를 나타낼 수 있다(예를 들어, 새로운 특징의 출현 또는 이전에 결정된 특징의 소실). 다시, 처치 양생은 필요할 경우 수정되고 변화될 수 있다. 이러한 특징이 결정되는 경우, 처치 양생은 요망되는 경우 이에 따라 변형될 수 있거나 새로운 처치 양생이 개시된다.
본 개시는 또한 대상을 모니터링하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 대상이 처치의 필요가 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfDNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 대상이 처치의 필요가 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 이 방법은 i) 제1 내지 제4 양태와 같은, 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 제공하고; ii) cfRNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfRNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfRNA 분자의 특징을 결정하고; 그리고 iii) 결정된 특징을 기반으로 하여 대상이 처치의 필요가 있는지를 결정하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, cfRNA는 cfRNA의 대표적인 DNA로 전환되고 분석 가능한 풀은 cfRNA의 대표적인 DNA를 포함한다.
cfNA의 많은 특징이 본원에 논의되는 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 결장암 예를 다시 고려한다. 대상이 현재 차도가 있는 경우, 대상은 본 개시의 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 특징이 결장암의 재발을 나타내는 것으로 결정될 경우, 치료적 개입이 재-개시될 수 있다. 치료적 개입은 결정된 특징에 의해, 적어도 부분적으로 안내될 수 있다.
샘플 중 cfNA의 정량화 방법
본 개시의 방법은 또한 샘플 중 cfNA의 원래 농도 또는 양의 결정을 허용한다. 샘플 중 cfDNA 양의 정량화를 위한 현재의 방법은 샘플로부터 cfDNA의 정제(샘플로부터 cfDNA의 손실을 야기함)의 어려움 및 샘플 중 cfDNA의 낮은 농도로 인해 극도의 변동을 받는다. 샘플 중 cfDNA의 농도를 정량하는 강력하고 효율적인 방법이 요망되고 이는 중요한 임상적 적용을 가질 것이다. 예를 들어, 이식 거부, 부상(기관 부전을 포함하는) 후 외상-후 합병증, 허혈성 뇌졸중에서의 위험 계층화, 패혈증의 중증도 및 다른 병태의 예측을 위해서는 높은 수준의 cfDNA가 제안되고 있다. 기술된 CGD 방법은 선형 증폭 과정이다. 따라서, (cfDNA를 함유하는 샘플 대신에) 투입량으로서 DNA의 알려진 양을 사용하여 제조된 표준 곡선과 비교하여 원래 샘플에서 cfDNA의 농도를 정량하는 것이 가능하다. 예를 들어, 표준 곡선은 CGD 방법에서 투입량으로서 DNA, 바람직하게는 정제된 DNA를 사용하고, (예를 들어, 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 및 1 ng/μL의 연속적 농도를 사용하여), 그리고 각각의 농도에서 증폭된 DNA의 수율을 결정하여 표준 곡선을 준비함으로써 확립될 수 있다. 샘플 중 cfDNA로부터의 증폭된 cfDNA의 수율이 다음에 결정되고 샘플 중 cfDNA의 원래 농도가 표준 곡선과의 비교에 의해 결정된다.
일 구현예에서, 이 방법은 i) 본원에 기술되는 임의의 방법에 의해 증폭 가능한 cfNA 풀을 제공하고; ii) 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA 분자의 증폭된 풀을 생산하고; iii) cfNA의 증폭된 풀에서 cfNA의 농도를 결정하고; 그리고 iv) 결정된 cfNA의 농도를 표준 곡선과 비교하여 샘플 중 cfNA의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 표준 곡선은 cfNA의 증폭된 풀을 제조하기 위해 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 작성된다. 특정 구현예에서, 표준 곡선은 정제된 DNA를 사용하여 작성된다. 특정 구현예에서, 표준 곡선은 cfNA의 증폭된 풀과 동시에 작성된다.
키트
본 개시는 또한 기술된 방법에 요구되는 하나 이상의 시약 및/또는 반응 용액을 포함하는 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 방법을 실시하기 위해 요구되는 성분 및 시약의 적어도 일부를 포함하는 키트를 제공한다.
일 구현예에서, 반응이 실시되는 적절한 용기 또는 반응 용기에 수용될 수 있는 키트는: 적어도 하나의 외인성 핵산 서열(즉, 어댑터); 외인성 핵산 서열을 cfNA에 연결하는 데 적절한 반응 용액; 및, 선택적으로 cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수 구성 요소로 한다.
다른 구현예에서, 반응이 실시되는 적절한 용기 또는 반응 용기에 수용될 수 있는 키트는: 외인성 핵산 서열을 cfNA에 연결하는 데 적절한 반응 용액; cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물; 및, 선택적으로 적어도 하나의 외인성 핵산 서열(즉, 어댑터)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수 구성 요소로 한다.
다른 구현예에서, 반응이 실시되는 적절한 용기 또는 반응 용기에 수용될 수 있는 키트는: 외인성 핵산 서열을 cfNA에 연결하는 데 적절한 반응 용액; cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물; 및 적어도 하나의 외인성 핵산 서열(즉, 어댑터)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수 구성 요소로 한다.
위의 임의의 키트는 추가로 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 증폭 가능한 cfNA 풀의 증폭을 위해 적절한 제2 반응 용액; 외인성 핵산 서열과의 사용을 위한 적어도 하나의 프라이머; cfNA의 분석 가능한 풀을 생산하기 위한 증폭 가능한 cfNA 풀의 증폭을 위한 제2 반응 용액 및 방법을 실시하기 위한 설명서. 특정 구현예에서, 위의 임의의 키트는 나열된 부가적 요소 모두를 포함한다.
일 구현예에서, 키트는 -20℃에서 저장될 수 있다. 다른 구현예에서, 키트는 4℃에서 저장될 수 있다. 저장 기간은, 특히 -20℃에서 저장될 때, 수일로부터 수개월 내지 수년일 수 있다.
일 구현예에서, 키트는 다중-웰 플레이트 형식, 예를 들어 96-웰 플레이트로 제공된다.
특정 구현예에서, cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물은 다음 활성을 포함할 수 있다:
1) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소 및 ii) 리가아제; 2) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제 및 iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제;
3) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성;
4) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성 및 v) 핵산 절단 효소 활성;
5) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소, ii) 리가아제, iii) 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성, v) 핵산 절단 효소 활성 및 vi) 핵산 결합 단백질.
특정 구현예에서, cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물은 다음 성분을 포함할 수 있다:
1) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 ii) DNA 리가아제;
2) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제 및 iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제;
3) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제, iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성;
4) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제, iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성 및 v) 단일-가닥 DNA 핵산 절단 효소 활성;
5) 5'-3' 중합효소 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소, ii) DNA 리가아제, iii) DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제, iv) 우라실-DNA 글리코실라아제 활성, v) 단일-가닥 DNA 핵산 절단 효소 활성 및 vi) 단일-가닥 DNA 결합 단백질.
특정 구현예에서, cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물은 다음 성분을 포함할 수 있다:
1) T4 DNA 중합효소 및 ii) T4 DNA 리가아제 또는 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편 및 ii) T4 DNA 리가아제;
2) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제; 및 iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편
3) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제; iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편; 및 iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제;
4) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제; iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편; iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제; 및 v) 우라실-DNA 글리코실라아제; 또는
5) T4 DNA 중합효소, ii) T4 DNA 리가아제; iii) DNA 중합효소 I의 Klenow 단편; iv) T4 폴리뉴클레오티드 키나아제; v) 우라실-DNA 글리코실라아제 및 Nb.BbvC1.
임의의 전술한 것은 단일-가닥 결합 단백질(예를 들어, 대장균(E.coli) 단일-가닥 결합 단백질과 같은)을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제; DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 우라실-DNA 글리코실라아제 및 Nb.BbvC1을 포함한다. 특정 구현예에서, cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물은 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편 및 T4 DNA 리가아제를 포함한다.
본원에 개시되는 방법에 사용될 수 있는 다양한 효소의 농도는 달라질 수 있다. 일 구현예에서, 효소는 다음 농도 범위로 사용된다: T4 DNA 중합효소 2 내지 15 U, Klenow 단편 2 내지 20 U, T4 DNA 리가아제 100 내지 1,000 U, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5 내지 20 U, Nb.BbvC1 5 내지 20 U, 그리고 우라실-DNA 글리코실라아제 1 내지 6 U; 대장균(E.coli) 단일-가닥 결합 단백질은 50 내지 500 ng으로 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, cfNA의 증폭 가능한 풀을 생산하기 위한 반응 용액과의 사용에 적절한 효소 혼합물은 본원의 실시예 12에 기술되는 효소 혼합물을 포함한다.
해당 분야에 알려진 바와 같이, 다양한 완충액/반응 용액이 본 개시의 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 반응 용액은 20 내지 75 mM 아세트산칼륨, 10 내지 100 mM 트리스-아세테이트(25℃에서 pH 7.9), 1 내지 30 mM 아세트산마그네슘, 0.1 내지 20 mM DTT, 5 내지 100 μM dNTP, 0.5 내지 2 mM의 ATP, 및 100 내지 400 ug/mL BSA. 특정 구현예에서, 반응 용액은 20 내지 75 mM NaCl, 10 내지 100 mM 트리스-Cl, pH 7.0 내지 8.0, 1 내지 30 mM MgCl2, 0.1 내지 20 mM DTT, 5 내지 100 μM dNTP 및 0.5 내지 2 mM의 ATP.
특정 구현예에서, 효소 혼합물과의 사용을 위한 반응 용액은 본원의 실시예 13에 기술되는 것이다.
방법
혈장 cfDNA의 제조
혈액을 EDTA-함유 튜브(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 수집하고 2500 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 잔류 파편(예를 들어, 저장된 샘플 중)을 제거하기 위해 필요하다면 추가의 원심분리(10,000 rpm에서 10분 동안)를 이용할 수 있다. 백혈구 연층을 피하기 위해 주의하여 혈장을 저온 바이알로 옮기고, 추가 분석까지 -80℃에서 저장하였다. 본원에 기술되는 cfDNA 농축 및 회수 기술(CGD 방법으로 언급된) 및 QIAamp 순환 핵산 키트(Qiagen, Valencia, CA; 제조자의 설명에 따라 사용)를 각각 사용하여 20 μL 및 200 μL의 혈장 샘플로부터 cfDNA를 제조하였다.
소변으로부터 cfDNA의 제조
달리 명시하지 않는 한, 순환 cfDNA는 CGD 방법을 사용하여 비처리, 비희석된 소변 샘플 10 내지 20 μL로부터 직접 제조되었다.
cfDNA의 ISA
본원에 기술되는 실시예에서, CGD 방법은 몇 가지 변이를 사용하여 cfDNA의 ISA를 위해 수행된다. 특정 실시예는 최적화 목적을 위해 다양한 프로토콜의 비교를 제공하고 CGD 방법이 수행되는 방법은 각각의 이러한 실시예에 제공된다.
다음 기술은 CGD 방법의 일반적 적용을 기술되는 것으로 제한하도록 의도되지 않고 본원에 기술되는 방법을 실시하기 위한 예시적인 프로토콜로서 제공된다. 기술되는 방법은, 예를 들어 PCR 튜브 또는 다중웰 스트립/플레이트와 같은 적절한 용기 또는 반응 용기에서 수행된다.
프로토콜 A
1. 샘플(예를 들어, 20 μL 혈장, 혈청, 소변, 타액 또는 CSF)에 샘플이 희석되는 1x PBS(20 μL 샘플 용적에 80 μL)를 첨가하고 샘플을 선택적으로 혼합하였다.
2. 단계 1로부터의 샘플 10 μL에 1 μL의 10x TE 완충액을 첨가하고 샘플을 95℃에서 4분 동안 가열하였다.
4. 샘플을 즉시 얼음 위에서 냉각하고 내용물을 굳히기 위해 샘플을 잠시 원심분리하였다.
5. 2 μL의 마스터 혼합물(반응 중 최종 농도 40 μM의 dNTPs, 2 μM의 각 어댑터 분자; 즉, 외인성 핵산 서열) 및 2 μL의 범용 완충액(반응 중 최종 농도 50 mM NaCl, 25 mM 트리스-Cl, pH 7.0 내지 8.0, 10 mM MgCl2, 2.5 mM DTT 및 1 mM ATP)을 각각의 샘플에 첨가하였다.
5'-(N6-10)ATTAACCCTCACTAAAG(N3-6)-3' (서열번호: 1)
5'-(N6-10)TAATACGACTCACTATAGGG(N3-6)-3' (서열번호: 2)
6. 샘플을 완전히 소용돌이 혼합하고, 잠시 원심분리하여 95℃에서 2분 동안 가열하였다.
7. 샘플을 얼음 위에서 냉각하고, 원심분리로 굳히고, 다시 얼음에 놓았다.
8. 대장균(E. coli) DNA 중합효소(Klenow 단편) 및 T4 DNA 리가아제를 포함하는 효소 혼합물 1 μL를 각각의 샘플에 첨가하고(최종 농도 5 U의 중합효소 및 100 U 리가아제) 샘플을 완전히 소용돌이 혼합하고 잠시 원심분리하였다.
9. 샘플을 유전자 증폭기(thermal cycler)에 넣고 다음과 같이 인큐베이션하였다:
16℃에서 20분 동안
24℃에서 20분 동안
37℃에서 20분 동안
75℃에서 5분 동안
4℃ 유지
10. 유전자 증폭기로부터 제거한 후, 샘플을 잠시 원심분리하였다. 샘플을 -20℃에서 저장하고(3일까지) 아래 기술된 바와 같이 추가로 처리하거나, 즉시 아래에 기술된 바와 같이 처리하였다.
11. 어댑터 핵산을 함유하는 변형된 cfNA의 증폭을 위해, 다음 시약을 단계 10으로부터의 각각의 샘플에 첨가하였다:
7.5 μL의 10X 마스터 혼합물(반응 중 최종 농도 40 μM의 dNTP 및 500 nM의 서열번호: 3 및 4의 서열을 갖는 프라이머);
47.5 μL의 물(분자 생물학 등급); 및
5 μL의 고-충실도 DNA 중합효소
5' 프라이머 5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3' (서열번호: 3)
3' 프라이머: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (서열번호: 4)
13. 각각의 샘플을 완전히 소용돌이 혼합하고, 잠시 원심분리하여, 유전자 증폭기에 넣고 다음과 같이 인큐베이션하였다:
초기 변성 95℃에서 3분 동안
다음과 같이 25 사이클 수행:
변성 94℃에서 15초 동안
어닐링/연장 65℃에서 5분 동안
사이클링이 완료된 후, 샘플을 4℃에 유지하고 증폭된 cfNA를 본원에 기술된 바와 같이 분석을 받도록 하거나, 본원에 기술된 바와 같이 분석을 받을 때까지 -20℃에서 저장하였다.
프로토콜 B
1. 20 μL의 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 소변 또는 CSF)에 80 μL의 1x PBS를 첨가하고 샘플을 선택적으로 혼합하였다.
2. 단계 1로부터의 샘플 10 μL에 1 μL의 10x TE 완충액(100 mM 트리스-HCL, pH 8.0, 및 10 mM EDTA)을 첨가하고 샘플을 95℃에서 4분 동안 가열하였다.
4. 샘플을 즉시 얼음 위에서 냉각하고 내용물을 굳히기 위해 샘플을 잠시 원심분리하였다.
5. 2 μL의 CG1 완충액(최종 농도: 2 μM의 서열번호: 5의 어댑터 분자(뉴클레아제가 없는 물 중); 즉, 외인성 핵산 서열) 및 1 μL의 CG1 완충액(최종 농도: 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스-아세테이트, pH 7.9, 10 mM 아세트산마그네슘, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 40 μM dNTP 및 200 ㎍/ml BSA)을 각각의 샘플에 첨가하였다.
5'-
OHTGTGTTGGGTGTGGUUUUUATTTAATACGACTCACTATAGACCCTCAGCACC
ACCACACCCAACACA-3' (서열번호: 5)
6. 샘플을 완전히 소용돌이 혼합하고, 잠시 원심분리하여 95℃에서 2분 동안 가열하였다.
7. 샘플을 얼음 위에서 냉각하고, 원심분리로 굳히고, 다시 얼음에 놓았다.
8. T4 DNA 중합효소의 Klenow 단편, T4 DNA 리가아제, 대장균(E. coli) DNA 중합효소 I, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 우라실-DNA 글리코실라아제(UDG), Nb.BbvC1 및 대장균(E. coli) 단일-가닥 결합 단백질을 포함하는 효소 혼합물 1μL를 각각의 샘플에 첨가하고(최종 농도 5 U T4 DNA 중합효소, 800 U T4 DNA 리가아제, 12.5 U Klenow 단편, 12.5 U T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 3.75 U 우라실-DNA 글리코실라아제 및 120 ng 단일-가닥 결합 단백질) 샘플을 완전히 소용돌이 혼합하고 잠시 원심분리하였다.
9. 샘플을 유전자 증폭기(thermal cycler)에 넣고 다음과 같이 인큐베이션하였다:
16℃에서 20분 동안
24℃에서 20분 동안
37℃에서 20분 동안
75℃에서 5분 동안
4℃ 유지
10. 유전자 증폭기로부터 제거한 후, 샘플을 잠시 원심분리하였다. 샘플을 -20℃에서 저장하고(3일까지) 아래 기술된 바와 같이 추가로 처리하거나, 즉시 아래에 기술된 바와 같이 처리하였다.
11. 어댑터 핵산을 함유하는 변형된 cfNA의 증폭을 위해, 다음 시약을 단계 10으로부터의 각각의 샘플에 첨가하였다:
7.5 μL의 10X 마스터 혼합물(40 μM의 dNTP 및 500 nM의 서열번호: 6의 서열을 갖는 프라이머);
47.5 μL의 물(분자 생물학 등급); 및
5 μL의 고-충실도 DNA 중합효소
5'-ACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC-3' (서열번호: 6)
13. 각각의 샘플을 완전히 소용돌이 혼합하고, 잠시 원심분리하여, 유전자 증폭기에 넣고 다음과 같이 인큐베이션하였다:
초기 변성 95℃에서 3분 동안
다음과 같이 25 사이클 수행:
변성 94℃에서 15초 동안
어닐링/연장 65℃에서 5분 동안
사이클링이 완료된 후, 샘플을 4℃에 유지하고 증폭된 cfNA를 본원에 기술된 바와 같이 분석을 받도록 하거나, 본원에 기술된 바와 같이 분석을 받을 때까지 -20℃에서 저장하였다.
cfRNA의 ISA
다음 기술은 cfRNA에 대하여 ISA를 수행하는 예시적인 방법이다. 이 기술은 CGD 방법의 일반적 적용을 기술되는 것으로 제한하도록 의도되지 않고 본원에 기술되는 방법을 실시하기 위한 예시적인 프로토콜로서 제공된다. 기술되는 방법은, 예를 들어 PCR 튜브 또는 다중웰 스트립/플레이트와 같은 적절한 용기 또는 반응 용기에서 수행된다.
1. 10 μL 희석 혈장(1:5)을 95℃에서 2분 동안 가열하여 내인성 뉴클레아제를 불활성화시키고, DNA 복합체를 해리시키고, cfDNA를 단편화/변성시킨다;
2. 1 μL의 DNase I 반응 완충액(최종 농도 10mM 트리스-HCl, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2 pH 7.6) 및 2 유닛의 DNase I을 첨가하고, 완전히 혼합하여 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다;
3. 1 μL의 0.5 M EDTA를 첨가한다(최종 농도 5 mM까지);
4. 85℃에서 15분 동안 열 불활성화시킨다;
5. 역전사 및 cDNA 합성을 수행한다(예를 들어, New England BioLabs, Ipswich, MA로부터의 Protoscript II 키트를 사용하여). 11 μL의 위 DNase I-처리 샘플에, 3 μL 5X 제1 가닥 합성 반응 완충액 및 1 μL 무작위 프라이머를 첨가하고; 샘플을 94℃에서 15분 동안 인큐베이션하여, 튜브를 얼음으로 옮기고; 0.5 μL 뮤린 RNase 저해제(20 U) 및 1 μL 역전사효소를 첨가하고, 물을 넣어 최종 용적 20 μL로 하고; 그리고 샘플을 예열된 유전자 증폭기에서 다음과 같이 인큐베이션한다: 25℃에서 10분; 42℃에서 15분; 70℃에서 15분; 그리고 4℃에서 유지;
6. 제2 가닥 합성을 수행한다(예를 들어, New England BioLabs, Ipswich, MA로부터의 NEBNext 제2 가닥 합성 모듈을 사용하여). 다음 시약을 반응에 첨가한다(20 μL): 뉴클레아제가 없는 물 48 μL; 합성 반응 완충액 8 μL; 합성 효소 혼합물 4 μL(총 용량 80 μL); 완전히 혼합하고 유전자 증폭기에서 1시간 동안 16℃에서, ≤40℃로 리드 셋을 가열하여 인큐베이션한다.
7. 이중-가닥 cDNA를 Agencourt AMPure XP 비드(Beckman Coulter, Brea, CA)를 사용하여 정제한다
8. cfDNA에 대한 ISA 프로토콜의 단계 5를 진행한다(예를 들어, 프로토콜 A 또는 프로토콜 B).
실시간 PCR
cfDNA의 증폭 가능도를, KRAS, BRAF, PIK3CA , 및 NRAS 유전자에 특이적으로 고안된 프라이머(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 가지고 TaqMan 실시간 정량적 PCR을 사용하여, 각각의 샘플에 대하여 2회 실시하였다. 증폭 플롯 및 Ct 값을 내장 소프트웨어에 의해 생성하였다(QuantStudio 12K 기기, Life Technologies, Carlsbad, CA). PCR 반응의 정확도를 조절하기 위해 적절한 공시험 및 양성 대조를 각각의 실행에 포함시켰다.
혈장 cfNA의 정량화
cfNA의 정량화는 dsDNA BR 및 HS 분석 키트와 함께 Qubit 2.0 형광측정기를 사용하여 수행하였다(Life Technologies, Carlsbad, CA). 분석은 제조자의 설명에 따라 수행하였다.
Ion Torrent NGS에 의한 심층 표적 서열분석 및 데이터 분석
간단히, 표적 서열분석 라이브러리를 제조자의 설명에 따라 Ion AmpliSeq 라이브러리 키트 2.0 및 Cancer Hotspot Panel v2를 사용하여 생성하였다(Life Technologies, Carlsbad, CA). 이 시험 패널은 다음 50개의 핵심 암 유전자에서의 2,855개 돌연변이를 표적으로 고안된다: ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, EZH2, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNAQ, GNAS, GNA11, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, 및 VHL. 전체 돌연변이 목록은 (http://path.upmc.edu/divisions/map/)에서 발견할 수 있다. 돌연변이 세부 사항은 Catalogue of Somatic Mutations in Cancer(COSMIC) 데이터베이스로부터 상응하는 COSMIC ID http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/로 입수할 수 있다. 이 유전자의 패널에서 참조로 사용된 DNA 서열은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/rsg/에서 발견할 수 있다. 돌연변이 명명법은 Human Genome Variation Society(http://www.hgvs.org/mutnomen/)에 의해 권고되는 관례를 기반으로 한다.
출발 물질은 CGD 방법을 사용하거나 다른 방법(예를 들어, QIAamp kit)에 의해 제조된 1 내지 20 ng cfDNA로 구성되었다. 각각의 샘플을 총 대략 2,800개 돌연변이에서 정보를 얻은 전체 50-유전자 패널에 대하여 분석하였다. 라이브러리 증폭에 사용되는 프라이머를 다음에 Pfu 효소에 의해 부분적으로 분해한 다음, 상응하는 바코드 어댑터와 연결하고 Ampure 비드를 사용하여 정제하였다. 라이브러리의 품질은 QuantStudio6 실시간 PCR 기기를 사용하여 평가하였다. 각각의 라이브러리 20 피코몰을 에멀젼 PCR 용 Ion Chef 시스템에서 분석하여 시퀀싱 주형을 클론으로 증폭시켰다. 분석된 샘플의 수를 기반으로 칩 314, 316 또는 318을 사용하였다. 심층 서열분석을 1000-4000X의 커버리지 범위로 Ion Torrent PGM에서 수행하였다. 서열분석 데이터를 소마틱 하이 스트린전시 파라미터(somatic high stringency parameter) 및 표적 및 핫스팟 파이프라인을 사용하여 Variant Caller 4.0 소프트웨어에 의해 분석하였다. 확인된 모든 변이는 GenePool(Station X, San Francisco, CA)을 통한 데이터를 분석하여 추가로 확인하였다.
실시예
실시예 1 - cfDNA 회수
CGD 방법의 우수한 특성을 입증하기 위해, CGD 방법을 사용하고 상업적으로 입수 가능한 cfDNA 정제 키트(QIAamp 순환 핵산 키트; Qiagen, Valencia, CA)로 cfDNA를 제조하였다. 혈장(20 μL) 및 소변(10 μL) 샘플로부터의 cfDNA를 프로토콜 A를 사용하여 기술된 바와 같이 제조하였다. 증폭 가능한 cfDNA 풀이 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 PCR 증폭을 받도록 하였다. cfDNA는 혈장(20 μL) 샘플로부터 QIAamp 키트(제조자의 설명에 따라 사용됨)를 사용하여 제조하였다. cfDNA는 17인의 암 환자의 혈장 샘플로부터 제조하였고; 소변 샘플은 건강한 대상으로부터 얻었다. cfDNA를 형광 Qubit dsDNA BR 또는 HS 분석, 그리고 KRAS, BRAF, PIK3CA, 및 NRAS 유전자에 대한 Taqman 실시간 PCR 분석에 의해 정량하였다(혈장 샘플에서만). 추가로, NGS 분석을 혈장 샘플 세트에서 돌연변이를 검출하기 위해 적용하였다(혈장 샘플에서만).
표 1에 나타낸 바와 같이, CGD 방법은 Qubit 측정에 의해 결정된 바와 같이 QIAamp 키트보다 유의미하게 더 많은 cfDNA를 제공하였다. CGD 방법을 사용하여 관찰된 cfDNA의 평균 농도는 QIAamp 키트를 사용한 0.42 ng/μL와 비교하여 92.5 ng/μL였다(n=17, P<0.0001). 이러한 증진된 회수는 투입 샘플 용량이 고려될 때 더욱 현저하다. CGD 방법에서는, QIAamp 키트의 200 μL의 혈장 샘플과 비교하여 20 μL의 혈장 샘플이 사용되었다. CGD 방법은 감소된 샘플 용량에서도 여전히 훨씬 우수한 결과를 제공하였다.
cfDNA는 또한 CGD 방법을 사용하여 소변 샘플로부터 회수하였고 Qubit 측정에 의해 정량하였다. CGD 방법을 사용하여 얻어진 cfDNA의 평균 농도는 40.9ng/μL였다(N=6)(4.52 ng/mL 내지 80.4 ng/mL). 혈장 샘플에서와 같이, CGD 방법은 소변 샘플로부터 효과적인 cfDNA의 제조를 보여주었다. 결과는 표 1에 나타낸다.
Figure pct00003
CGD 방법으로 얻어지는 cfDNA의 더 높은 산출량은 또한 아가로오스 겔 전기영동에 의해 밝혀졌다. CGD 방법에 의해 혈장 및 소변 샘플로부터 제조된 선택된 cfDNA 샘플이 아가로오스 겔 전기영동(2%)을 받도록 하였고 브롬화에티듐을 사용하여 가시화하였다. CGD 방법에 의해 제조된 혈장(도 1b) 및 소변(도 1c)으로부터 얻어진 cfDNA는 강한 DNA 강도를 보였다.
도 1b에서, 분석된 샘플은 7개의 동결 혈장 샘플 및 3개의 신선한 혈장 샘플로부터 추출된 cfDNA를 포함하였다. 레인 1 내지 4는 암으로 진단받거나 암이 있는 것으로 의심되는 대상으로부터의 임상적 혈장 샘플이고, 레인 5는 샘플 4로부터의 혈장으로 스파이킹된 건강한 대상으로부터의 신선한 혈장이었다. 레인 6 내지 8은 건강한 대상으로부터의 동결 혈장 샘플이고 레인 9 및 10은 건강한 대상으로부터의 신선한 혈장 샘플이었다. CGD 방법을 사용하여 제조된 혈장 cfDNA의 분획화는 100- 내지 500-bp 사이에서 일관된 크기 분포를 나타냈고 강한 염색을 보여주었다.
도 1c에서, 10 μL의 소변으로부터 회수된 cfDNA는 아가로오스 겔 전기영동(2%)을 받도록 하였고 브롬화에티듐을 사용하여 가시화하였다. 분석된 샘플은 6인의 건강한 대상으로부터의 소변 샘플(레인 1 내지 6)이고 혈장 샘플을 양성 대조(레인 7)로 하였다. 혈장 샘플에서 보여준 바와 같이, CGD 방법을 사용하여 소변 샘플로부터 얻어진 cfDNA의 분획화는 CGD 방법에 의해 100- 내지 500-bp 사이에서 일관된 크기 분포를 나타냈고 강한 염색을 보여주었다.
위의 결과는 CGD 방법이 다양한 샘플 유형으로부터 높은 함량의 우수한 cfDNA 제제를 제공하는 것을 입증한다. 더욱이, CGD 방법은 시험된 선행 기술 방법보다 우수하였다.
실시예 2 - cfDNA의 증폭 가능도
실시예 1에 기술한 바와 같이 CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 혈장 샘플로부터 제조된 cfDNA의 증폭 가능도를 다음에 4개의 원-종양유전자(KRAS, BRAF, PIK3CA 및 NRAS)에 대한 TaqMan 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 검사하여 생산된 cfDNA의 분석 가능한 풀의 품질을 평가하였다. 혈장 샘플은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되고 qPCR 분석을 받았다.
qPCR 기법은 증폭의 진행의 계속적 모니터링을 포함하고 표적 정량화를 허용한다. 예상된 바와 같이, CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 제조된 cfDNA로부터의 KRAS의 증폭 플롯은, 각각 CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 제조된 cfDNA에서 17 내지 24 및 28 내지 33의 역치 사이클(Ct) 범위를 보여주었다(도 2). 모든 샘플에서, KRAS는 증폭되어 혈장 샘플 중 충분한 cfDNA의 존재를 나타내었다. 그러나, Ct 값의 비교는 CGD 방법이 QIAamp 키트보다 적어도 100-배 더 분석 가능한 cfDNA를 제공한 것을 나타낸다(ΔCt > 7).
3개의 다른 유전자 - BRAF, PIK3CA, 및 NRAS에 대한 측정에 유사한 차이가 존재하는지 여부를 다음에 결정하였다. 혈장 샘플을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 결과는 BRAF, PIK3CA 및 NRAS에 대하여 각각 도 3a 내지 3c에 나타낸다. CGD 방법을 사용하여 제조된 cfDNA로부터의 증폭 플롯은 QIAamp 키트를 사용하여 제조된 cfDNA와 비교하여 더 낮은 Ct 값을 보여주었다. 차이는 3개 유전자 모두에 걸쳐 관찰되었다. ΔCt의 크기는 KRAS의 것과 비슷하다.
이들 실험에 대한 핵심적 특징의 요약은 표 2에 나타낸다.
Figure pct00004
위의 결과는 CGD 방법이 추가 분석을 위해 적절한 높은 품질의 cfDNA의 분석 가능한 풀을 제공하는 것을 입증한다. 더욱이, CGD 방법은 시험된 선행 기술 방법보다 우수하였다.
실시예 3 - 차세대 서열분석
CGD 방법 및 QIAamp 키트로부터 제조된 cfDN의 추가 평가를 차세대 서열분석(NGS) 분석을 사용하여 수행하였다. cfDNA는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. NGS 분석은 위에 기술된 바와 같이 수행하였다.
CGD 방법 및 QIAamp 키트를 사용하여 제조된 1 내지 10 ng의 cfDNA를 총 대략 2,800개 돌연변이에서 정보를 얻은 전체 50-유전자 패널에 대하여 분석하였다(Cancer Hotspot Panel v2, Life Technologies, Carlsbad, CA). 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00005
시험된 17개 샘플 중 QIAamp 키트에 의해 제조된 cfDNA를 사용한 8개 샘플(8/17, 47.1%)은 결과를 내기에는 QNS(양 불충분)로, 실시예 1에서 이전의 Qubit 및 실시간 PCR 결과와 일치하였다. CGD 방법에 의해 제조된 cfDNA를 사용한 모든 샘플은 분석 가능하였다(17/17, 100%). NGS 분석은 4개의 일치하는 사례를 보여주었는데, 이는 CGD 방법 및 QIAamp 키트로부터 제조된 cfDNA를 사용하여 야생형(돌연변이 없음)으로 결정되었다(샘플 4, 10, 13 및 15). NGS 분석은 또한 CGD 방법 및 QIAamp 키트로부터 제조된 cfDNA를 사용하여 5개의 불일치 사례를 밝혔다. 4개 사례에서, QIAamp 키트를 사용하여 제조된 cfDNA는 돌연변이를 밝히지 못한 반면, CGD 방법에 의해 제조된 cfDNA를 사용한 동일 샘플에서 적어도 하나의 돌연변이가 검출되었다(샘플 5, 7, 9 및 12). 하나의 사례에서, QIAamp 키트를 사용하여 제조된 cfDNA는 단일 돌연변이를 밝힌 반면(낮은 커버리지, 463X), 동일 샘플로부터 CGD 방법에 의해 제조된 cfDNA에서는 야생형 결과를 얻었다(샘플 14).
잠재성 돌연변이 및 미확인 체세포 돌연변이를 걸러낸 후, 17 대상 중 11(64.7%)은 CGD 방법에 의해 제조된 cfDNA를 사용할 때 NGS 분석에 의해 검출된 적어도 하나의 돌연변이를 가졌다. 이들 샘플에 대한 리드 정도(read depth)는 1006X 내지 3542X 범위였다. 대조적으로, QIAamp 키트를 사용하여 제조된 cfDNA를 사용한 NGS 분석은 단지 1/17 대상(5.9%)에서 돌연변이를 밝혔다. CGD 방법에 의해 제조된 cfDNA를 사용한 NGS 분석은, QIAamp 키트를 사용하여 제조된 cfDNA를 사용한 NGS 분석에 의해 검출되지 못한 11개 샘플에서 23개 돌연변이의 결정을 허용하였다. 확인된 모든 돌연변이는 치환이었다. 아울러, NGS 결과는 CGD 방법에 의해 추출된 cfDNA가 선행 기술 방법과 비교하여 우수한 분석을 위한 출발 물질을 제공한 것을 입증하였다. 추가로, 비교에서 QIAamp 키트는 cfDNA 제조 단계에서의 손실로 인해 높은 QNS 및 위음성율을 보여주었다.
부가적인 실험에서, 생물표지 검출에서의 실패 가능성 및 샘플 변동성에 관한 문제를 다루기 위해, 스파이크-및-리커버리(spike-and-recovery) 실험을 수행하였다. Horizon Diagnostics로부터의 NGS 참조 표준품을 시험하였다: 표준품 4는 10개 돌연변이를 5%에서 커버하고 표준품 6은 20개 돌연변이를 2.5%에서 지니는데, 둘 다 게놈 DNA 포맷이다. 건강한 개체에서 보통 발견되는 10 내지 30 ng/mL의 cfDNA와 관련하여 두 개의 스파이킹 농도를 사용하였다(5 및 20 ng/mL). 표 4에 나타낸 바와 같이, 2.5% 또는 5%에서 60퍼센트의 돌연변이(6/10 및 12/20)가 CGD 방법에 의해 제조된 샘플에서 NGS 분석에 의해 검출될 수 있는 반면, QIAamp 키트를 사용하여 제조된 동일한 스파이킹된 샘플에서는 NGS 분석에 의해 돌연변이가 검출되지 않았다. 스파이킹 연구의 결과는 이전의 NGS 분석 데이터와 일치하였고, 선행 기술 방법과 비교하여 CGD 방법이 더 적은 혈장으로부터 더 높은 양의 cfDNA를 수득하고 더 많은 돌연변이의 확인을 야기한 것을 추가로 확인하였다.
Figure pct00006
CGD 방법은 액적 용량의 혈장(20 μL만큼 낮은)으로부터 직접 제조된 cfDNA에서 진보된 게놈 분석(예를 들어, 차세대 서열분석)을 허용한다. CGD 방법은 감소된 비용 및 회전 시간으로 최소 샘플 용량, 최대 수율, 능률적인 작업 흐름의 장점을 가지고 광범위한 임상적 유전자 검사에 적용될 수 있다.
실시예 4 - CGD 방법을 사용한 타액 샘플의 ISA
본 실시예는 CGD 방법으로 타액 샘플 사용을 보여준다. 이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜에 따라 수행되었다. 타액 샘플은 2인의 개체 대상으로부터 얻었다. 타액 샘플은 보존제 존재 또는 부재의 상업적 샘플링 키트(Pure-SAL Oral Specimen Collection System; Oasis Diagnostics)로 얻었다. 20 μL의 타액 샘플을 투입량으로 사용하고 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하였다.
이 실시예에서 샘플은 2인의 상이한 대상으로부터 둘 다 상업적 타액 샘플링 키트에 존재하는 보존제와 함께, 그리고 보존제 없이 채취하였고, 20 μL의 샘플이 각각의 실험에 사용되었다. 타액 샘플을 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 처리하여 cfDNA 풀의 분석 가능한 풀을 생산하였다. 증폭된 cfDNA의 총 수율은 위에 기술된 바와 같이 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다.
CGD 방법으로부터 야기된 cfDNA는 2% 겔에서 아가로오스 겔 전기영동을 받도록 하였고 브롬화에티듐을 사용하여 가시화하였다(도 4). 도 4에서, 레인 1 및 2는 보존제가 있는 상업적 샘플링 키트에서 얻어진 타액 샘플로부터의 결과를 보여주고, 레인 3은 음성 대조(타액 샘플이 존재하지 않음)인 한편, 레인 4 및 5는 보존제가 없는 상업적 샘플링 키트에서 얻어진 타액 샘플로부터의 결과를 보여주고, 레인 6은 음성 대조(타액 샘플이 존재하지 않음)이다. 직접 채취된 타액 샘플로부터의 cfDNA는 강한 염색 강도를 보여 CGD 방법에 의해 생산된 풍부한 cfDNA의 존재를 나타냈다. 대조적으로, 보존제 및 다른 물질을 함유하는 상업적 키트를 사용하여 채취한 타액 샘플은 염색을 거의 또는 전혀 보여주지 않았다(레인 1 및 2).
이 실시예는 CGD 방법이 타액 샘플에 존재하는 cfDNA로부터 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하기 위해 효율적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 추가로, 이 실시예는 상업적 샘플링 키트에 존재하는 물질이 CGD 방법에 의한 cfDNA의 증폭을 방해할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5 - CGD 방법을 사용한 혈장, 소변 및 뇌척수액 샘플의 ISA
본 실시예는 CGD 방법에서 혈장, 소변 및 뇌척수액(CSF) 샘플의 사용을 보여준다. 이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 샘플을 처리하여 cfDNA 풀의 분석 가능한 풀을 생산하였다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받았다. 증폭된 cfDNA의 총 수율은 위에 기술된 바와 같이 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다.
동결된 샘플을 다양한 공급원으로부터 얻었다, 혈장 및 CSF 샘플에 대해서는 20 μL의 샘플이 CGD 방법에서 투입량으로 사용된 한편, 소변 샘플에 대해서는 10 μL의 샘플이 CGD 방법에서 투입량으로 사용되었다.
CGD 방법으로부터 야기된 cfDNA는 2% 겔에서 아가로오스 겔 전기영동을 받도록 하였고 브롬화에티듐을 사용하여 1 kb 래더로 가시화하였다(도 5). 도 5에서, 다양한 샘플로부터 제조된 cfDNA는 다음과 같으며, cfDNA 농도는 괄호 안에 ng/μL로 제공된다: 레인 1 CSF(8.5), 레인 2 소변(5.1), 레인 3 혈장(22), 레인 4 혈장(59), 레인 5 혈장(36.4), 레인 6 음성 대조; 레인 7 소변(52.2), 레인 8 소변(11.2), 레인 9 소변(89.6) 및 레인 10 소변(30). 모든 샘플로부터의 cfDNA는 강한 염색 강도를 보여 CGD 방법에 의해 생산된 풍부한 cfDNA의 존재를 나타냈다. 도 5의 레인 1 내지 6에서 보여주는 샘플로부터 제조된 cfDNA 또한 Agilent 2100 Bioanalyzer에 의해 분석하여 CGD 방법에 의해 제조된 cfDNA의 크기 분포 및 정량을 결정하였다(도 6).
이 실시예는 CGD 방법이 다양한 샘플 유형에 존재하는 cfDNA로부터 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하기 위해 효율적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 추가로, CGD 방법을 사용한 cfDNA의 크기 분포는 일반적으로 100 내지 600 kb 범위로, 후속 분석에 유익하다.
실시예 6 - cfDNA를 사용한 돌연변이 분획의 결정
본 실시예는 야생형 및 돌연변이 cfDNA의 절대 복제수의 결정 및 돌연변이 분획의 계산을 보여준다. cfDNA는 QIAamp 키트를 사용하여(제조자의 설명에 따라 사용됨) 혈장 및 CSF 샘플(200 μL)로부터 제조되었다. 샘플은 CGD 방법에 직접 사용되었다. CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 대상으로부터 채취한 혈장 샘플이었다. 혈장 샘플을 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 처리하여 분석 가능한 cfDNA 풀을 생산하였다. CGD 방법을 위한 샘플 투입 용량은 CGD 방법 및 QiaAmp 키트에서 각각 20 μL 및 200 μL였다. cfDNA를 6개의 혈장 샘플 및 1개의 CSF 샘플로부터 양성 및 음성 대조와 함께 제조하였다. cfDNA를 QX200 Droplet Digital PCR System(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 독립 실험실에서 분석하였다.
ddPCR은 핵산 표적 서열의 고-정밀, 완전한 정량화를 허용한다. 유전자 증폭기를 사용한 각 액적 내에서의 PCR 증폭 반응에 따라, 별개의 용량으로 정의된 유중수 액적 구획에 캡슐화된 핵산 분자를 계수하는 것에 의해 절대 복제수를 측정하였다. 액적은 액적 판독기 상에서 한 줄로 흘러, 하나는 야생형 DNA, 다른 하나는 돌연변이 DNA인 두 개의 상이한 형광 신호를 계수한다. 돌연변이 분획은 공식: % 돌연변이 분획 = (돌연변이 복제수/총 복제수)x100을 사용하여 계산하였다. 결과는 표 5에 나타낸다.
표 5에 나타낸 바와 같이, CGD 방법을 사용하여 제조된 cfDNA는 선행 기술의 방법과 비교하여 돌연변이 분획의 농축이 우수하였다. 시험된 7개 샘플 중에서, CGD 방법은 5/7 샘플(71.4%)에서 돌연변이 분획의 우수한 농축을 제공하였다.
표 5
Figure pct00007
실시예 6 - CGD 방법의 재현성
본 실시예는 CGD 방법의 재현성을 보여준다. 6개의 품질 대조 샘플(2개 양성 대조, 2개 음성 대조 및 2개 스파이크 공정 대조)을 10개월의 시기에 걸쳐 분석하였다. 양성 대조를 위해, 상업적으로 입수 가능한 세포주 SW480 및 NCI-H1975를 사용하였다. 음성 대조를 위해, 상업적으로 입수 가능한 세포주 NA12878 및 NA19240을 사용하였다. 모든 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)으로부터 구입하였다. 공정 대조를 위해, 두 개의 앞서 시험된 양성 환자 DNA 샘플을 사용하여 정상 혈장에 스파이킹하여(최종 농도 200 ng/mL) 두 개의 공정 대조를 생성하였다. DNA를 세포로부터 분리하고 10 ng DNA를 CGD 방법에서 투입량으로 사용하였다.
CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 위에 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받게 하였다. 결과는 표 6A에 나타낸다. 표 6A는 COSMIC ID 넘버로 표시된 돌연변이 및 유전자의 배리언트 콜(variant call)을 보여주고, 잠재적 돌연변이 및 미확인 체세포 돌연변이는 걸러냈다. 상이한 COSMIC ID가 동일한 돌연변이를 나타낼 수 있다. COSMIC ID는 Catalogue of Somatic Mutations in Cancer: http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/로부터 얻었다.
표 6A에 나타낸 바와 같이, CGD 방법은 품질 대조 샘플을 사용한 모든 시험 시기에 걸쳐 100% 일치로 시간 경과에도 완전히 재현 가능하였다.
Figure pct00008
Figure pct00009
CGD 방법을 사용한 분석-내 변동 또한 검사하였다. 15개 혈장 샘플(2개는 건강한 대상으로부터; 4개는 암 대상으로부터, 2개의 스파이킹된 혈장 샘플, 4개 세포주 샘플 및 3개 혈청 샘플)을 수집하였다. 스파이크 혈장 샘플은 위와 같이 제조하였다. DNA를 세포주로부터 정제하고 10 ng DNA를 CGD 방법에 투입량으로서 사용하였다. CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 위에 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받도록 하였다. 상이한 빈도의 돌연변이를 갖는 15개 라이브러리를 상이한 바코드, 다중화로 색인을 만들고, Ion Proton NGS 분석을 사용하여 동일한 실행 내에서 5회 시험하였다. 평균 리드 정도(read depth)는 >200X였다.
결과를 표 6B에 나타낸다. 표 6B는 COSMIC ID 넘버로 표시된 돌연변이 및 유전자의 배리언트 콜(variant call)을 보여주고, 잠재적 돌연변이 및 미확인 체세포 돌연변이는 걸러냈다. 상이한 COSMIC ID가 동일한 돌연변이를 나타낼 수 있다. COSMIC ID는 Catalogue of Somatic Mutations in Cancer: http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/로부터 얻었다. 복제 분석 사이의 일치 또한 나타낸다. 결과는 각각의 복제 분석 내에서 돌연변이 콜(call)에 대한 100% 일치를 보여준다. 돌연변이의 변이 빈도는 고도로 재현 가능하였다(%CV <10%).
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
분석-간 재현성 연구는 분석-내 연구에 기술된 15개 샘플을 사용하여 2 조작자에 의해 5개의 상이한 실행에 걸쳐 수행되었다. CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 위에 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받도록 하였다. 상이한 빈도의 돌연변이를 갖는 15개 라이브러리를 상이한 바코드, 다중화로 색인을 만들고, Ion Proton NGS 분석을 사용하여 5회 별개의 실행으로 시험하였다. 평균 리드 정도(read depth)는 >200X이다.
결과를 표 6C에 나타낸다. 표 6C는 COSMIC ID 넘버로 표시된 돌연변이 및 유전자의 배리언트 콜(variant call)을 보여주고, 잠재적 돌연변이 및 미확인 체세포 돌연변이는 걸러냈다. 상이한 COSMIC ID가 동일한 돌연변이를 나타낼 수 있다. COSMIC ID는 Catalogue of Somatic Mutations in Cancer: http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/로부터 얻었다. 복제 분석 사이의 일치 또한 나타낸다. 분석-간 연구에서, 결과는 5개 분석 모두에서 돌연변이 콜(call)에 대한 100% 일치를 보여준다. 돌연변이의 변이 빈도는 고도로 재현 가능하였다(%CV <10%).
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 7 - CGD 방법의 민감도
이 실시예는 CGD 방법의 민감도 및 검출 한계(limit of detection, LOD)를 보여준다. 이 실시예에서는, Horizon Dx NGS 참조 표준 Tru-Q 4 및 Tru-Q 7이 사용되었다. 이들 표준은 알려진 돌연변이를 확정된 빈도로 포함한다. 상이한 수준의 돌연변이를 얻기 위해 두 표준을 정상 인간 게놈 DNA(Promega)에 4:1, 3:2, 2:3 및 1:4 비율로 연속 희석하고 CGD 방법에 의해 분석하였다.
CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 위에 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받도록 하였다. 결과는 Tru-Q 4에 대해서는 표 7A, 그리고 Tru-Q 7에 대해서는 표 7B에 나타낸다. 표는 표준에 존재하는 각각의 돌연변이를 돌연변이 빈도와 함께 보여주고 비희석된 샘플 및 각 연속 희석에서 각각의 돌연변이에 대한 CGD 방법의 민감도(LOD)를 보여준다. 각 샘플의 평균 리드 정도(read depth)는 >4000X이었다. 결과는 가장 활동적인 체세포 돌연변이에 대한 LOD가 1% 내지 3% 범위임을 보여준다.
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 8 - CGD 방법의 특이성
본 실시예는 CGD 방법의 특이성을 보여준다. 혈장 샘플을 17인의 건강한 대상으로부터 얻었다. 혈장 샘플을 CGD 방법에 의해 출원인의 실험실에서 분석하였다. CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 위에 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받도록 하였다. 동일한 혈장 샘플을 상업적으로 입수 가능한 cfDNA 추출 키트를 사용하여 제2 CLIA 보증된 실험실에서 분석하여 cfDNA를 정제하였다. cfDNA를 제조자의 설명에 따라 Ion Torrent PCG 서열분석기로 분석하였다.
결과를 표 8에 나타낸다. 표 8은 COSMIC ID 넘버로 표시된 돌연변이 및 유전자의 배리언트 콜(variant call)을 보여주고, 잠재적 돌연변이 및 미확인 체세포 돌연변이는 걸러냈다. 상이한 COSMIC ID가 동일한 돌연변이를 나타낼 수 있다. COSMIC ID는 Catalogue of Somatic Mutations in Cancer: http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/로부터 얻었다. CGD 방법과 비교 방법 사이의 일치 또한 나타낸다. 결과는 시험 특이성이 유전자 수준에서 99.9%(849/850)이고 제2 CLIA 보증된 실험실에 의해 수행된 시험과 강력한 일치(16/17; 94%)를 보여준다.
Figure pct00018
Figure pct00019
다른 비교에서, 50개의 임상적 혈장 샘플을 얻었다(15인의 췌장암 환자; 15인의 대장암 환자, 1인의 위장관 기질 종양 환자, 4인의 폐암 환자 및 15 CEA-양성 혈청 샘플- S로 표시됨). 혈장 샘플을 CGD 방법에 의해 출원인의 실험실에서 분석하였다. CGD 방법은 프로토콜에 따라 수행되었다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 위에 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받도록 하였다. 동일한 혈장 샘플을 위에 기술된 바와 같이 제2 CLIA 보증된 실험실에서 분석하였다.
결과를 표 9에 나타낸다. 표 9는 COSMIC ID 넘버로 표시된 돌연변이 및 유전자의 배리언트 콜(variant call)을 보여주고, 잠재적 돌연변이 및 미확인 체세포 돌연변이는 걸러냈다. 상이한 COSMIC ID가 동일한 돌연변이를 나타낼 수 있다. COSMIC ID는 Catalogue of Somatic Mutations in Cancer: http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/로부터 얻었다. CGD 방법과 비교 방법 사이의 일치 또한 나타낸다. 결과는 96%(48/50)의 일치를 보여주고 샘플 2 및 8은 불일치이다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
이들 결과는 CGD 방법이 해당 기술 분야의 방법의 상태에 매우 유리하게 필적하는 것을 보여준다.
실시예 9 - CGD 방법과 조직 생검 결과의 비교
본 실시예는 CGD 방법과 조직 생검의 비교를 보여준다. 재발을 경험하였던 유방암 환자(n=13) 및 난소암 환자(화학요법-전 및 -후 둘 다)(n=15)로부터 혈장 샘플을 얻었다. 모든 대상은 비교를 위해 이용 가능한 조직 생검 데이터를 가졌다. 유방암 환자에서, 조직 생검 데이터는 종양의 두 개 별개 위치로부터 이용 가능하였다. 난소암 환자에서 조직 생검 데이터는 화학요법 처치-전 및 -후 둘 다로부터 이용 가능하였으며; 또한 매치되는 조직 게놈 DNA도 분석을 위해 추출 및 제공되었다. 혈장 샘플로부터 제조된 cfDNA에서 얻어진 결과를 조직 생검으로부터의 결과와 비교하였다.
CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 얻어진 cfDNA의 분석 가능한 풀은 위에 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받도록 하였다.
재발을 경험하였던 유방암 환자에서, CGD 방법으로 얻어진 결과는 조직 생검으로부터 얻어진 결과와 강한 일치를 보였다. 전반적으로, CGD 방법으로 얻어진 결과와 조직 생검으로 얻어진 결과 사이에 69.2% 일치가 있었으며, 이는 해당 분야에서 보고된 일치 값과 일치하는 것이다. 결과는 표 10에 나타낸다.
Figure pct00025
난소암 비교에서, CGD 방법으로 얻어진 결과는 조직 생검으로부터 얻어진 결과와, 화학요법 처치-전 및 -후 둘 다 강한 일치를 보였다(표 11 및 12 및 도 7 참조). KRAS, BRAF, PIK3CA 및 PTEN 유전자에 대한 두 방법 사이의 결과에는 환자 수준 및 돌연변이 수준 둘 다에서 강한 일치가 있었다(표 11). CGD 방법은 조직 생검과 비교하여 개별 유전자로 더 많은 돌연변이 및 돌연변이를 갖는 더 많은 유전자를 검출하였다. 가장 빈번하게 돌연변이된 유전자에 관한 패턴은 CGD 방법과 조직 생검 사이에 일치하였다(표 12).
Figure pct00026
Figure pct00027
CGD 방법과 조직 생검으로부터의 결과를 처치 기준(예를 들어, 화학요법 처치-전 및 -후)에 따라 비교할 때, CGD 방법 및 조직 생검 결과는 유전자 수준에서 일치하는 결과를 제공하였다(도 7). 도 7에서, 각각의 유전자에 대하여 제시된 데이터는 좌측에서 우측으로, 조직 생검 처치-전, CGD 방법 처치-전, 조직 생검 처치-후 및 CGD 방법 처치-후에 해당한다.
이들 결과는 CGD 방법과 해당 분야 조직 생검 방법의 현재 상태 사이의 우수한 일치를 보여준다.
실시예 10 - 암 요법을 받는 대상의 종적 모니터링
본 실시예에서, 혈장 cfDNA 중 체세포 변화의 종적 모니터링을 2인의 환자에서 요법 중에 수행하였다. 돌연변이 부하의 역학을 플롯팅하고 암 항원(CA) 표지 및 PET/CT 이미지와 처치 과정에 걸쳐 비교하였다. 이미지 스캔은 고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST)를 사용하여 평가하였다.
이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 시간 경과에 따라 두 대상으로부터 채취한 혈장 샘플이었다. 증폭된 DNA의 총 수율은 위에 기술된 바와 같이 Qubit 2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다. 분석 가능한 cfDNA 풀의 1 내지 10 ng의 농도를 사용하여, 공급자의 프로토콜에 따라 50개 암 드라이버 유전자 내에서 2855 핫스팟 돌연변이를 표적으로, AmpliSeq Cancer Hotspot Panel, 버전 2(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여, 207개 표적화된 자리를 증폭하였다. 차후의 반도체-기반 서열분석은 Ion Chef 및 Ion Proton(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 수행되었으며, 리드 수를 샘플 당 >200,000으로 유지하였다.
대상 1은 전이가 있는 폐암의 진단을 받은 69세의 비흡연 중국 여성 환자였다. 조직 생검에서는 표피 성장 인자 수용체(EGF-R)에서 민감화 돌연변이를 보인 한편, ALK, ROS-1, BRAF는 음성이었다(2015년 5월 19일). 이 대상은 타르세바(EGF-R을 표적으로 하는 염산 에를로티닙; 100 mg 매일) 및 아바스틴(베바시주맙) 1개월 1회 요법을 개시하였다. 거의 5-개월의 요법 이후, 대상의 암종 태아성 항원(CEA), CA19-9 및 CA125 수준은 CGD 방법을 사용한 cfDNA 분석에 의해 결정된 바와 같이 모두 유의미하게 떨어졌다(도 XA). PET/CT 스캔 평가에서도 종양 크기 및 활성에서의 저하와 함께 101일 동안 유지된 안정한 질환을 보였다(도 XB). 그러나, CGD 방법을 사용한 혈장 cfDNA 분석에서는 TP53 및 PTEN 유전자에서 대략 50일 동안 유지된 2개의 새로운 체세포 돌연변이를 검출하였다. 검출된 종양 돌연변이는 2016년 3월 말까지 3, 7 및 8개 돌연변이로 점차 증가하여, 진행성 질환을 나타내었다. 2016년 3월의 cfDNA 분석은 EGFR, E114K(4.2%) 및 E868G(2.4%)의 2개 낮은 대립유전자-빈도의 서브클론을 밝혀, 약물에 의한 선택 압력에 대한 클론 진화를 암시하였다. 2016년 3월 31일의 PET/CT 스캔에서는 새로운 종양 덩어리(해상도의 수준을 막 넘는; 약 1㎤)를 확인하여, cfDNA 분석을 확인하였다. 전반적으로, 이 사례는 CGD 방법을 사용한 cfDNA 분석에 의해 검출된 돌연변이가 방사선학적으로 안정한 질환과 밀접하게 관련되고, 돌연변이 부하에서의 증가는 방사선 물질에 의한 진행보다 대략 2개월 일찍 나타난 것을 보여준다. 더욱이, PET/CT 스캔은 년간 2회 이하로 권고되므로, CGD 방법은 대상의 종적 평가에 효과적이고 안전한 대안을 제공한다.
대상 2는 원발 병소 불명의 전이성 췌장주위 림프절 선암종 진단을 받은 79세의 이란 여성 환자였다. 미세-침 생검에서의 면역조직화학에서는 CK7 양성인 한편, CK20, TTF, S100 및 CD45는 2015년 10월 26일에 모두 음성이었다. 이 대상은 초기에 XELOX 요법(옥살리플라틴과 조합된 카페시타빈으로 구성되는 화학요법 양생)을 받았다. 후에, 면역염색에서는 또한 PD-L1 과발현을 확인하였고, 따라서 그녀는 다음에 XELIRI(이리노테칸과 조합된 카페시타빈으로 구성되는 화학요법 양생), 아바스틴(베바시주맙), 및 오프디보(니볼루맙)으로 처치받았다. 2016년 2월 11일의 PET/CT 스캔에서는 >90% 반응율로 종양 크기 및 활성에서의 유의미한 저하를 보여주었다(도 XB). 혈장 cfDNA 분석 결과는 이미지 결과와 일치하였고, CEA 및 CA 표지(CA125, CA27-29, CA19-9)에서의 저하를 보여주어, 적어도 41일 동안 유지된 안정적 질환을 나타냈다(도 XA). 4개의 체세포 돌연변이가 초기에 검출되었고(FLT3 Y572C 6.5%; TP53 E165G 5.2%; TP53 Y104C 4.1%; TP53 C137Y 4.0%), 다음에 처치 과정 중에 1 및 0 돌연변이로 하락하였다. 이 사례는 혈액 한 방울의 액체 생검에 의한 돌연변이 분석이 요법에 대한 반응에서의 임상적 결과와 강력하게 상관되는 것을 또 다시 보여주었다.
중요하게는, CEA 및 CA 단백질 표지는 암세포에 반드시 특이적인 것은 아니고 PET/CT 스캔은 해상도 한계를 겪는다. 대조적으로, 본원에서 CGD 방법에 의해 검출되는 암-관련 체세포 돌연변이는 악성 종양에 특이적이고, 이들 돌연변이를 갖는 혈장 cfDNA는 악성 종양의 존재를 나타내는 것으로 보였다. 이 실시예에서의 결과는 CGD 방법을 사용한 cfDNA 분석에 의해 검출된 체세포 돌연변이의 수준이 현재의 표준 케어 시험 결과 및 임상적 결과와 잘 상관되었고 가장 이른 재발의 징후를 제공할 수 있음을 보여준다.
실시예 11 - CGD 방법을 사용한 종적 모니터링
본 실시예는 암환자의 종적 모니터링에서 CGD 방법의 사용을 보여준다. CGD 방법을 사용하는 것은 임상의가 치료 효능, 잔존 질환, 클론 진화, 약물 저항성 진화 및 종양 재발에 관한 실시간 종적 정보를 얻을 수 있게 한다. 정확한 실시간 정보를 가지고, 임상의는 치료적 개입에 관한 더욱 정확한 결정을 내릴 수 있어, 임상의가 가장 효과적인 치료를 비용-효율적인 방식으로 제공하도록 현재의 처치를 변경하는 것을 허용한다.
이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 대상으로부터 채취한 혈장 샘플이었다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받도록 하였다.
표 13은 다양한 암(CRC는 대장암을 나타내고; GIST는 위장관 기질 종양을 나타냄)이 있는 환자의 분석으로부터의 예시적 결과를 보여준다. CGD 방법을 사용한 종적 모니터링의 유용성은 표 13으로부터 명백하다. 예를 들어, CRC가 있는 대상 1은 2015년 11월의 초기 시험에서 NRAS 및 PTEN 돌연변이를 보여주었다. 처치 중, 환자는 2015년 12월에 재시험을 받고 돌연변이가 검출되지 않았다. 2016년 2월에 환자는 재시험을 받았고 BRAF 돌연변이에 대하여 양성이었다(낮은 빈도). 다른 예로서, 대상 5(폐암)는 2015년 11월에 초기 시험을 받았고 TP53 유전자에서 돌연변이를 보여주었다. 2015년 12월, 2016년 1월 및 2016년 2월에 추가의 종적 시험 이후, 종양 돌연변이 패턴에서의 변화가 명백하였다. 이 환자에서 원래의 TP53 돌연변이는 빈도에서의 저하를 보여주었고(비록 2016년 2월에 여전히 존재하지만), KDR, ERBB4, VHL, CTNNb1 및 RB1 유전자에서의 돌연변이의 출현이 2016년 2월에 검출되었다. 실시간으로 제공되는 이러한 정보를 이용하여, 임상의는 환자의 종양 프로파일의 모든 변화하는 성질을 다루기 위해 치료적 개입을 변경할 수 있다.
Figure pct00028
실시예 12 - ISA 효소 혼합물의 최적화
본원에서 논의되는 바와 같이, CGD 방법은 샘플에 존재하는 cfNA로부터 증폭 가능한 cfDNA 풀을 효율적으로 제공하기 위해 다양한 효소 혼합물을 사용할 수 있다. 본 실시예는 CGD 방법의 효율(ng/μL로 나타낸 증폭된 cfDNA의 수율을 기반으로 하는 효율)에 관하여 몇 가지 상이한 효소 혼합물(1 내지 6)의 사용을 보여준다. 효소 혼합물 1 내지 6의 조성은 표 14에 제공된다.
CGD 방법은 아래 언급된 것을 제외하고는 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 단일 대상으로부터 채취된 혈장 샘플로, 20 μL의 샘플이 각각의 실험에 사용되었다. 프로토콜 A의 단계 8에서 효소 혼합물 1 내지 6이 프로토콜 A에 언급된 효소 혼합물을 대체한 것을 제외하고는, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 혈장 샘플을 처리하여 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생산하였다. 증폭 가능한 cfDNA 풀이 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 PCR 증폭을 받도록 하여 cfDNA의 분석 가능한 풀을 생산하였다. 증폭된 DNA의 총 수율은, 위에 기술된 바와 같이 dsDNA BR 및 HS 분석 키트와 함께 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다.
결과는 표 14에 나타낸다. 모든 효소 혼합물은 양호한 결과를 생산하였다. 프로토콜 A의 효소 혼합물은 원래 샘플 cfDNA 투입량으로부터 82.3 ng/μL의 증폭된 DNA를 수득하였다. 효소 혼합물 1은 프로토콜 A와 비교하여 유사한 수율의 증폭된 DNA(82.2 ng/μL)를 생산한 한편, 효소 혼합물 2 및 6은 프로토콜 A와 비교하여 저하된 수율의 증폭된 DNA(각각 70.4 ng/μL 및 58.6 ng/μL)를 생산하였다(비록 이러한 혼합물이 본원에 기술되는 방법에서의 사용에 적절하다 하더라도). 효소 혼합물 3, 4 및 5는 프로토콜 A와 비교하여 증가된 수율의 증폭된 DNA(각각 97.1 ng/μL, 105.0 ng/μL 및 96.4 ng/μL)를 생산하였다.
이들 결과는 CGD 방법이 샘플에 존재하는 cfDNA로부터 cfDNA 분자의 증폭 가능한 풀의 효율적인 생산을 위해 5'-3' 중합효소 활성, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성 및 DNA 리가아제 활성을 필요로 하는 것을 보여준다. 폴리뉴클레오티드 키나아제 활성의 부가 또한 증폭 가능한 cfDNA 풀의 생산 효율을 증가시킨다. 표 14에 나타낸 바와 같이, 부가 활성은 또한 증폭 가능한 cfDNA 풀의 생산의 효율을 유의미하게 저해하는 일 없이 존재할 수 있다.
Figure pct00029
실시예 13 - ISA 완충 용액의 최적화
본원에서 논의되는 바와 같이, CGD 방법은 샘플에 존재하는 cfDNA로부터 분석 가능한 cfNA 풀을 효율적으로 제공하기 위해 다양한 효소 혼합물을 사용할 수 있다. 본 실시예는 본 개시의 방법의 효율(ng/μL로 나타낸 증폭된 cfDNA의 수율을 기반으로 하는 효율)에 관하여 몇 가지 상이한 효소 혼합물의 사용을 보여준다.
이 실시예에서, 프로토콜 A에 사용된 마스터 혼합물 및 범용 완충액이 표 6에 나타낸 조합에서 CG1 완충액 또는 CG2 완충액 중 하나로 대체되었고 증폭된 cfDNA의 총 수율에 대한 효과가 측정되었다. 마스터 혼합물 및/또는 범용 완충액의 대체물로서 사용될 때 CG1 및 CG2는 프로토콜 A에 따라 대체된 성분과 동일 용량으로 첨가되었다.
마스터 혼합물(L 완충액으로도 언급됨)은 40 μM dNTP 및 서열번호: 1 및 2의 어댑터 분자 2 μM의 반응에서 최종 농도를 제공하도록 첨가되었다.
범용 완충액(S 완충액으로도 언급됨)은 50 mM NaCl, 25 mM 트리스-Cl(pH 7 내지 8), 10 mM MgCl2, 2.5 mM DTT 및 1 mM ATP의 반응에서 최종 농도를 제공하도록 첨가되었다.
CG1 완충액은 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스-아세테이트, pH 7.9, 10 mM 아세트산마그네슘, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 40 μM dNTP 및 200 μg/mL BSA의 반응에서 최종 농도를 제공하도록 첨가되었다.
CG2 완충액은 서열번호: 5의 어댑터 분자 2 μM의 반응에서 최종 농도를 제공하도록 첨가되었다(뉴클레아제가 없는 물 중).
CGD 방법은 아래 언급된 것을 제외하고는 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 단일 대상으로부터 채취된 혈장 샘플로, 20 μL의 샘플이 각각의 실험에 사용되었다. 프로토콜 A의 단계 5에서 CG1 및/또는 CG2 완충액이 프로토콜 A에 언급된 마스터 혼합물 및/또는 범용 완충액을 대체한 것을 제외하고는, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 혈장 샘플을 처리하여 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생산하였다. 서열번호: 5의 어댑터 분자가 CG2 완충액에서 사용될 때, 프로토콜 A에 명시된 프라이머보다 프라이머 5'-ACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC-3'(서열번호: 6)가 사용된 것을 제외하고는, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 증폭 가능한 cfDNA 풀이 PCR 증폭을 받도록 하여 cfDNA의 분석 가능한 풀을 생산하였다. 프로토콜 A에 명시된 효소 혼합물이 모든 반응에 사용되었다.
증폭된 DNA의 총 수율은, 위에 기술된 바와 같이 dsDNA BR 및 HS 분석 키트와 함께 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다.
각각의 반응의 성분의 최종 농도는 아래 제공되고, 결과는 표 16에 나타낸다.
시험 1
50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스-아세테이트(pH 7.9), 10 mM 아세트산마그네슘, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 40 μM dNTP, 200 ug/mL BSA은 CG1으로부터, 그리고 50 mM NaCl, 25 mM 트리스-Cl(pH 7 내지 8), 10 mM MgCl2, 2.5 mM DTT 및 1 mM ATP는 S 완충액으로부터
시험 2
2 μM 어댑터는 CG2로부터, 그리고 50 mM NaCl, 25 mM 트리스-Cl(pH 7 내지 8), 10 mM MgCl2, 2.5 mM DTT 및 1 mM ATP는 S 완충액으로부터
시험 3
50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스-아세테이트(pH 7.9), 10 mM 아세트산마그네슘, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 40 μM dNTP, 200 ug/mL BSA는 CG1으로부터, 그리고 40 μM dNTP 및 2 μM 어댑터는 L 완충액으로부터
시험 4
40 μM dNTP는 L 완충액으로부터, 그리고 2 μM 어댑터는 CG2로부터; 마스터 혼합물로부터의 어댑터 분자는 제공되므로 이 시험에서 생략되었음에 주의
시험 5
50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스-아세테이트(pH 7.9), 10 mM 아세트산마그네슘, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 40 μM dNTP, 200 ug/mL BSA는 CG1으로부터, 그리고 2 μM 어댑터는 CG2로부터
프로토콜 A
50 mM NaCl, 25 mM 트리스-Cl(pH 7 내지 8), 10 mM MgCl2, 2.5 mM DTT 및 1 mM ATP는 S 완충액으로부터 40 μM dNTP 및 2 μM 어댑터는 L 완충액으로부터
시험 1은 음성 대조로서 기능하였다(CG1도 범용 완충액도 증폭 가능한 cfDNA 풀에 요구되는 변형된 cfDNA 분자를 생산하기 위해 필요한 어댑터 분자를 포함하지 않음). 시험 2는 dNTP의 존재가 증폭 가능한 cfDNA 풀에 요구되는 변형된 cfDNA의 효율적인 생산을 위해 필요한 것을 보여준다. 시험 3은 범용 완충액의 CG1 완충액으로의 대체가 프로토콜 A와 비교하여 증폭된 cfDNA의 총 수율을 개선한 것을 보여준다. 시험 4는 범용 완충액의 CG2 완충액으로의 대체가 프로토콜 A와 비교하여 증폭된 cfDNA의 총 수율을 개선한 것을 보여준다. 시험 5는 또한 허용 가능한 양의 증폭된 cfDNA를 생산하기 위해 부가적인 완충 성분이 요구되지 않는 것을 보여준다. 시험 5는 마스터 혼합물 및 범용 완충액 둘 다의 CG1 및 CG2 완충액으로의 대체도 증폭된 cfDNA의 총 수율을 개선한 것을 보여준다.
결과는 표 15에 나타낸다. 이들 결과는 본 개시의 방법이 다양한 완충액 조성물로, 그리고 시험 4에서 보여주는 바와 같이 완충 성분의 첨가 없이, cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생산하기 위해 수행될 수 있음을 보여준다.
Figure pct00030
실시예 14 - ISA 효소 혼합물 및 완충 용액의 최적화
실시예 12 및 13에서 보여주는 바와 같이, CGD 방법은 샘플에 존재하는 cfNA로부터 분석 가능한 cfDNA 풀을 효율적으로 제공하기 위해 다양한 효소 혼합물 및 완충 용액을 사용할 수 있다. 본 실시예는 본 개시의 방법의 효율(ng/μL로 나타낸 증폭된 cfDNA의 수율을 기반으로 하는 효율)에 관하여 CG1 및 CG2 완충액을 사용한 효소 혼합물의 최적화를 보여준다.
이 실시예에서, 프로토콜 A에 사용된 마스터 혼합물 및 범용 완충액이 CG1 완충액 및 CG2 완충액으로 대체되었고 실시예 12의 효소 혼합물을 이 조합으로 시험하였다. 마스터 혼합물 및/또는 범용 완충액의 대체물로서 사용될 때 CG1 및 CG2는 프로토콜 A에 따라 대체된 성분과 동일 용량으로 첨가되었다.
CGD 방법은 프로토콜 A에 따라, 또는 아래 언급된 것(효소 혼합물 1 내지 4에 대한)을 제외하고는 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 단일 대상으로부터 채취된 혈장 샘플로, 20 μL의 샘플이 각각의 실험에 사용되었다. 프로토콜 A의 단계 5에서 CG1 및 CG2 완충액이 프로토콜 A에 언급된 마스터 혼합물 및 범용 완충액을 대체하고 단계 8에서 기술된 효소 혼합물 1 내지 5가 프로토콜 A의 효소 혼합물을 대체한 것을 제외하고는, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 혈장 샘플을 처리하여 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생산하였다. 프로토콜 A에 명시된 프라이머보다는 프라이머 5'-ACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC-3'(서열번호: 6)가 사용된 것을 제외하고는, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 증폭 가능한 cfDNA 풀이 PCR 증폭을 받도록 하여 cfDNA의 분석 가능한 풀을 생산하였다.
증폭된 DNA의 총 수율은, 위에 기술된 바와 같이 dsDNA BR 및 HS 분석 키트와 함께 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다.
CG1 완충액은 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스-아세테이트, pH 7.9, 10 mM 아세트산마그네슘, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 40 μM dNTP 및 200 ㎍/mL BSA의 반응에서 최종 농도를 제공하도록 첨가되었다.
CG2 완충액은 서열번호: 5의 어댑터 분자 2 μM의 반응에서 최종 농도를 제공하도록 첨가되었다(뉴클레아제가 없는 물 중).
결과는 표 16에 나타낸다. 모든 효소 혼합물은 양호한 결과를 생산하였다. 이 실시예에서, 효소 혼합물 2 및 3은 원래 샘플 cfDNA 투입량으로부터 140 ng/μL의 증폭된 cfDNA를 제공한 한편, 효소 혼합물 1, 4 및 5는 원래 샘플 cfDNA 투입량으로부터 각각 124 ng/μL, 112 ng/μL 및 99.4 ng/μL의 증폭된 cfDNA를 제공하였다. 시험된 모든 효소 혼합물은 본원에 기술되는 방법에서의 사용에 적절하였다.
이들 결과는 실시예 12와 일치하고 CGD 방법이 샘플에 존재하는 투입 cfDNA로부터 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀의 효율적인 생산을 위해 5'-3' 중합효소 활성, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성 및 DNA 리가아제 활성을 필요로 하는 것을 보여준다. 폴리뉴클레오티드 키나아제 활성 및 우라실-DNA 글리코실라아제 활성의 부가 또한 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀의 생산 효율을 증가시킨다. 표 16에 나타낸 바와 같이, 부가 활성은 또한 cfDNA 분자의 분석 가능한 풀의 생산 효율을 유의미하게 저해하는 일 없이 존재할 수 있다.
Figure pct00031
실시예 15 - 정제된 DNA와 혈장 중 cfDNA 사이에서의 ISA의 효율
본 실시예는 정제된 DNA 및 혈장 샘플로부터의 cfDNA의 ISA의 효율(ng/μL로 나타낸 증폭된 cfDNA 또는 DNA의 수율을 기반으로 하는 효율)을 보여준다.
이 실시예에서, CGD 방법은 아래 언급된 것(효소 혼합물 1 내지 5에 대한)을 제외하고는 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 단일 대상으로부터 채취된 혈장 샘플로, 20 μL의 샘플이 각각의 실험에 사용되었다. 프로토콜 A의 단계 5에서 CG1 및 CG2 완충액이 프로토콜 A에 언급된 마스터 혼합물 및 범용 완충액을 대체하고 단계 8에서 기술된 효소 혼합물 1 내지 5가 프로토콜 A의 효소 혼합물을 대체한 것을 제외하고는, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 혈장 샘플을 처리하여 증폭 가능한 cfDNA 풀을 생산하였다. 프로토콜 A에 명시된 프라이머보다는 프라이머 5'-ACTCACTATAGACCCTCAGCACCAC-3'(서열번호: 6)가 사용된 것을 제외하고는, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 증폭 가능한 cfDNA 풀이 PCR 증폭을 받도록 하여 cfDNA의 분석 가능한 풀을 생산하였다. 정제된 DNA 실험에서는, 10 ng 투입 DNA가 동등 용량의 PBS 중에서 사용되었다.
증폭된 DNA의 총 수율은, 위에 기술된 바와 같이 dsDNA BR 및 HS 분석 키트와 함께 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였고 ng/μL로서 표현된다.
결과는 표 17에 나타내며, 수율은 ng/μL로 보고된다. 모든 효소 혼합물은 양호한 결과를 생산하였다. 이 실시예에서, 효소 혼합물 3, 4 및 5는 원래 샘플 cfDNA 투입량으로부터, 10 ng의 정제된 DNA로 얻어진 수율과 동등하거나 이보다 큰 수율의 증폭된 cfDNA를 생산하였다. 효소 혼합물 1 및 2로부터 얻어진 증폭된 cfDNA의 수율 및 프로토콜 A의 것 역시 양호한 결과를 보였다. 시험된 모든 효소 혼합물은 본원에 기술되는 방법에서의 사용에 적절하였다.
이들 결과는 앞서의 실시예들과 일치하고, 생물학적 샘플로부터 cfDNA를 증폭하는 데 있어서 본 개시의 방법의 효율이 높고 정제된 DNA가 샘플 투입량으로서 사용될 때와 동일 범위에 있음을 입증한다.
Figure pct00032
실시예 16 - ISA에 사용되는 시약의 안정성
CGD 방법을 실시하기 위해 필요로 하는 시약을 함유하는 키트(미리 부하된 96-웰 플레이트와 같은)의 제조 가능성을 평가하기 위해, CGD 방법의 실행에 요구되는 다양한 완충액 및 효소 혼합물을 96 웰 플레이트로 미리 부하하고 5개월 동안 -20℃ 또는 4℃ 중 하나에서 5개월 동안 저장하였다. 또한, 96-웰 플레이트에서 마스터 혼합물 및 효소 성분(범용 완충액에서)을 함께 또는 별개로 저장하는 효과도 검사하였다. 저장된 시약 및 신선한 시약을 사용한 6개 샘플의 결과를 비교하였다.
이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 대상으로부터 채취된 혈장 샘플이었다. 혈장 샘플을 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 처리하여 cfDNA 풀의 분석 가능한 풀을 생산하였다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받았다. cfDNA의 총 수율은 위에 기술된 바와 같이 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다.
결과는 표 18에 나타낸다(증폭된 cfDNA의 수율은 ng/μL로 보여줌). 나타낸 바와 같이, CGD 방법을 수행하기 위해 요구되는 시약의 -20℃ 또는 4℃에서의 저장은 CGD 방법의 수행에 유의미하게 영향을 미치지 않았다. 또한, 마스터 혼합물 및 효소 성분을 함께 저장하는 것(혼합으로 언급됨)이 각각 별개로 저장하는 것(별개로 언급됨)보다 조금 더 효과적이었다.
Figure pct00033
또한, -20℃ 및 4℃에서 저장된 시약을 사용하여 CGD 방법에 의해 제조된 분석 가능한 cfDNA 풀은 2% 겔 상에서 아가로오스 겔 전기영동을 받고 브롬화에티듐을 사용하여 가시화되었다(도 10). 도 10에서, 레인 1 내지 10은 10개 샘플로부터의 결과를 보여주는데, 레인 1 내지 5는 -20℃에서 저장된 시약을 사용하여 제조된 cfDNA로부터의 결과를 보여주고 레인 6 내지 10은 4℃에서 저장된 시약을 사용하여 제조된 cfDNA로부터의 결과를 보여준다. 모든 경우에, cfDNA는 강한 염색 강도 및 정상 크기 분포를 보였다. 이 결과는 CGD 방법을 수행하는 데 사용되는 시약의 안정성을 추가로 확인한다.
이들 결과는 총괄하여 CGD 방법을 수행하는 데 사용되는 시약의 안정성을 확인하고 CGD 방법을 수행하기 위한 키트의 제조를 허용한다.
실시예 17 - 샘플 중 cfDNA의 정량화
본 실시예는 샘플 중 cfDNA 농도의 정량화를 보여준다. 이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 대상으로부터 채취된 혈장 샘플이었다. 혈장 샘플을 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 처리하여 cfDNA의 분석 가능한 풀을 생산하였다. 정제된 DNA를 사용한 표준 곡선의 준비를 위해, 10 μL 용량 중 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 및 1 ng/μL의 농도인 정제된 DNA의 샘플은 프로토콜 A에 따라 CGD 방법으로 실시하였다. 증폭된 cfDNA 또는 정제된 DNA의 총 수율은 위에 기술된 바와 같이 Qubit2.0 형광측정기를 사용하여 정량하였다.
도 11은 18 사이클의 증폭으로 CGD 공정에 투입량으로서 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 및 1 ng/μL의 농도의 정제된 DNA를 사용하여 확립된 표준 곡선의 선형성을 보여준다. 원래의 cfDNA 샘플 투입량으로부터 증폭된 cfDNA의 수율(ng/μL로)을 결정하는 것에 의해, 원래 샘플 중 cfDNA의 농도가 정제된 DNA를 사용하여 생성된 표준 곡선과 비교하여 결정될 수 있다. 표 20은 두 개의 임상적 샘플에 원래 존재한 cfDNA 농도의 결정 결과를 보여준다. cfDNA 농도 (ng/μL로)는 CGD 방법을 사용한 두 개의 임상적 샘플로부터 결정되었다. cfDNA의 생산 수율로부터, 샘플 중 원래의 cfDNA 농도가 도 11에 나타낸 표준 곡선으로부터 결정되었다.
Figure pct00034
이 실시예는 CGD 방법이 임상적 샘플 중 원래의 cfDNA 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있어, 대상에서 cfDNA 농도가 신속하고 정확하게 결정되도록 허용하고 다양한 임상적 배경에서 cfDNA 농도의 진단적 사용을 허용하는 것을 보여준다.
실시예 18 - 복수의 분석 가능한 cfDNA 풀의 분석을 위한 통합
본 실시예는 분석 전 cfDNA 분자의 복수의 분석 가능한 풀을 통합하는 것의 사용을 보여준다. 위에 기술된 바와 같이, 특정 실시예에서 1 내지 10 μL의 cfDNA의 분석 가능한 풀(총 용량 20 μL로부터; 대략 1 내지 2 ng)을 사용하여 NGS 분석(예를 들어, Ion Torrent NGS에 의한)을 위한 시퀀싱 라이브러리를 생성한다. 이러한 샘플링은, 특정 경우에, NGS 시퀀싱 적용에 있어 균일성에 변동을 초래할 수 있다. 이 실시예에서, NGS를 위한 시퀀싱 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 cfDNA 투입량은 생산된 분석 가능한 풀로부터 대략 20 ng의 cfDNA까지 증가하였다. 이 목적을 달성하기 위해, 프로토콜 A에 기술된 CGD 방법이 변형되었다. 첫째로, CGD 방법은 분석 가능한 풀에서 cfDNA의 전체 수율을 감소시키기 위해, cfDNA 분자의 분석 가능한 풀을 생성하기 위해 사용되는 증폭 사이클을 25 사이클로부터 18 사이클로 저하시키도록 변경되었다. 둘째로, 분석을 위한 cfDNA 투입량을 cfDNA의 단일의 분석 가능한 풀로부터 채취하기보다, 복수의 분석 가능한 풀이 단일 샘플로부터 생성되고 혼합되었고(즉, 통합된) cfDNA 투입량은 cfDNA의 혼합된 분석 가능한 풀로부터 채취되었다. 논의된 바와 같이, NGS 분석에 사용된 cfDNA의 양은 대략 20 ng까지 증가하였다. NGS 커버리지 및 NGS 균일성은, NGS 분석을 위해 25 사이클의 증폭을 사용하여 생산된 단일의 분석 가능한 cfDNA의 풀로부터 얻은 cfDNA 샘플을 사용한 것을, NGS 분석을 위해 18 사이클의 증폭을 사용하여 생산된 4개의 별개의 분석 가능한 cfDNA의 풀의 혼합된 풀로부터 얻은 cfDNA 샘플을 사용한 것에 대하여 비교하였다.
이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 대상으로부터 채취된 혈장 샘플이었다. 혈장 샘플을 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 처리하여 분석 가능한 cfDNA 풀을 생산하였다. cfDNA의 분석 가능한 풀은 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받았다. 개선된 CGD 방법(CGD2로 지칭됨)에서, cfDNA의 분석 가능한 풀은 18 사이클의 증폭을 사용하여 생산되었고 NGS 분석을 위한 cfDNA 샘플은 4개의 별개의 분석 가능한 cfDNA의 풀의 혼합된 풀로부터 얻었다. 설명을 위해, 비교 CGD 방법(CGD1으로서 언급됨)에서, cfDNA의 분석 가능한 풀은 25 사이클의 증폭을 사용하여 생산되었고 NGS 분석을 위한 cfDNA 샘플은 단일의 분석 가능한 cfDNA의 풀로부터 얻었다.
결과는 표 20에 나타내며, cfDNA의 혼합된 분석 가능한 풀을 사용한 NGS 커버리지, NGS 균일성 및 NGS 균일성에서의 개선 백분율이 보고된다. 아래 나타낸 바와 같이, cfDNA의 분석 가능한 풀을 혼합하는 것은 NGS 균일성을 지속적으로 증가시켰다. 더욱이, 샘플 14는 단일의 분석 가능한 cfDNA 풀 및 혼합된 분석 가능한 cfDNA 풀 둘 다 Ion Torrent NGS에 의해 분석될 때, CGD 방법의 재현성을 보여준다.
Figure pct00035
실시예 19 - CGD 방법을 사용한 RNA의 ISA
본 개시의 방법은 또한 cfRNA의 ISA에 사용될 수 있다. cfRNA의 ISA의 방법에서, 샘플 중 cfRNA는 표준 방법론을 사용하여 이중-가닥 DNA로 전환된다. 이중-가닥 DNA는 다음에 샘플 중 cfDNA와 동일한 방식으로 처리된다. 본 개시의 방법을 사용하는 것에 대한 예시적 프로토콜은 방법 섹션에 제공된다.
이 실시예에서, CGD 방법은 프로토콜 A에 따라 수행되었다. 이 실시예를 위한 샘플은 대상으로부터 채취된 혈장 샘플이었다. cfRNA를 cDNA로 전환시키기 위한 부가적인 DNase I 및 역전사 단계와 함께, 프로토콜 A에 기술된 바와 같이 혈장 샘플을 처리하여 분석 가능한 cDNA 풀을 생산하였다. cDNA의 분석 가능한 풀은 기술된 바와 같이 NGS 분석을 받았다.
도 12는 cfRNA로부터 생산된 cDNA의 성공적인 ISA를 보여주는 증폭 플롯을 보여준다. NGS 서열분석은 표적에 대한 98.91%의 리드로 933,674 리드를 매핑하였다. 평균 베이스 커버리지 정도(coverage depth)는 4.072였고 베이스 커버리지의 균일성은 59.56%였다. 이 실시예는 CGD 방법의 cfRNA로의 성공적인 적용을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> CirculoGene Theranostics, LLC YEH, Chen-Hsiung <120> Method of Preparing Cell Free Nucleic Acid Molecules by in Situ Amplification <130> 210058-301001 <150> 62/204,268 <151> 2015-08-12 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor sequence 1 <400> 1 attaaccctc actaaag 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor sequence 2 <400> 2 taatacgact cactataggg 20 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial primer 1 <400> 3 attaaccctc actaaag 17 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Primer 2 <400> 4 taatacgact cactataggg 20 <210> 5 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor 3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> thymine at 5' end of sequence contains a free OH rather than free phoshate <220> <221> misc_signal <222> (15)..(19) <223> n is uridine for each occurence <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 tgtgttgggt gtggnnnnna tttaatacga ctcactatag accctcagca ccaccacacc 60 caacaca 67 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence 3 <400> 6 actcactata gaccctcagc accac 25 <210> 7 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor 4 <220> <221> misc_structure <222> (15)..(19) <223> n is uridine for all occurences <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n is any anmino acid <400> 7 tgtgttgggt gtggnnnnna tttaatacga ctcactatag accctcagca ccaccacacc 60 caacacan 68 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer 4 <400> 8 tgagtgatat ctgggagtcg aggtg 25 <210> 9 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor 5 <220> <221> misc-feature <222> (15)..(19) <223> n is uridine for each occurence <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 tgtgttgggt gtggnnnnna tttaatacga ctcactatag accctcagca ccaccacacc 60 caacacaa 68 <210> 10 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor 6 <220> <221> misc-feature <222> (15)..(19) <223> n is uridine for each occurence <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 tgtgttgggt gtggnnnnna tttaatacga ctcactatag accctcagca ccaccacacc 60 caacaca 67

Claims (63)

  1. 세포-유리 핵산(cfNA)의 제자리 증폭 방법에 있어서,
    a. 복수의 cfNA 분자를 포함하는 액체 샘플을 제공하는 단계;
    b. 샘플에 적어도 하나의 처리 단계를 수행하는 단계;
    c. 샘플 중 cfNA의 적어도 일부의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나에 외인성 핵산 서열을 부가하기 위해 효소 혼합물을 사용하여 샘플 중 cfNA의 적어도 일부를 변형된 cfNA로 전환시켜 증폭 가능한 cfNA 풀을 생성하는 단계로서, 외인성 핵산 서열은 프라이머에 결합 가능한 프라이머 부위를 포함하는, 단계; 및
    d. 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA의 분석 가능한 풀을 생산하는 단계를 포함하며,
    샘플 중 cfNA는 핵산 정제 단계를 받지 않는, 증폭 방법.
  2. 제1항에 있어서, cfNA는 cfDNA인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, cfNA는 cfRNA인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, cfRNA는 단계 (c) 아전에 이중-가닥 DNA로 전환되는, 증록 방법.
  5. 제4항에 있어서, 효소 혼합물은 DNase 활성을 포함하는 것인, 증폭 방법.
  6. 제1항에 있어서, 샘플 중 cfNA의 적어도 일부가 함께 연결되는, 증폭 방법.
  7. 제1항에 있어서, 샘플 중 cfNA는 50 bp 내지 2,000 bp, 100 bp 내지 1,000 bp, 50 bp 내지 600 bp, 100 bp 내지 500 bp, 100 bp 내지 400 bp, 100 bp 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp, 200 bp 내지 300 bp, 300 bp 내지 400 bp, 400 bp 내지 500 bp 또는 500 bp 내지 600 bp의 단편 크기 분포를 갖는 것인, 증폭 방법.
  8. 제1항에 있어서, 방법이 단일 반응 용기에서 실시되는 것인, 증폭 방법.
  9. 제1항에 있어서, 프라이머 부위는 범용(universal) 프라이머 부위인, 증폭 방법.
  10. 제1항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 적어도 일부의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에 부가되는, 증폭 방법.
  11. 제1항에 있어서, 샘플 중 cfNA의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%가 외인성 핵산 서열을 포함하도록 변형되는, 증폭 방법.
  12. 제1항에 있어서, 효소 혼합물은 다음의 효소를 포함하는 것인, 증폭 방법:
    a. 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제;
    b. 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, DNA 리가아제 및 DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제;
    c. 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, DNA 리가아제, DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 우라실 DNA 글리코실라아제; 또는
    d. 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, DNA 리가아제, DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제, 우라실 DNA 글리코실라아제 및 단일-가닥 DNA 핵산 절단 효소.
  13. 제1항에 있어서, 효소 혼합물은 다음의 효소를 포함하는 것인, 증폭 방법:
    a. T4 DNA 중합효소 및 T4 DNA 리가아제;
    b. DNA 중합효소 I의 Klenow 단편 및 T4 DNA 리가아제;
    c. T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제 및 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편;
    d. T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제;
    e. T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 우라실-DNA 글리코실라아제; 또는
    f. T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 우라실-DNA 글리코실라아제 및 Nb.BbvC1.
  14. 제1항에 있어서, 샘플은 단계 (c)에서 순차적 가열 프로그램을 받는, 증폭 방법.
  15. 제14항에 있어서, 순차적 가열 프로그램은 다음 단계를 포함하는 증폭 방법: 제1의 정의된 지속 기간 동안 16℃; 제2의 정의된 지속 기간 동안 24℃; 제3의 정의된 지속 기간 동안 37℃; 및 제4의 정의된 지속 기간 동안 75℃.
  16. 제1항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 프라이머 부위의 적어도 한쪽에 측면으로 변성 핵산 서열(degenerate nucleic acid sequence)을 갖는 것인, 증폭 방법.
  17. 제16항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 프라이머 부위의 양쪽에 측면으로 변성 핵산 서열을 갖는 것인, 증폭 방법.
  18. 제16항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 초기 복제 단계 중에 cfNA로 통합되는, 증폭 방법.
  19. 제16항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 서열번호: 1 및 2의 서열을 갖는 것인, 증폭 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  21. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소 및 T4 DNA 리가아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  22. 제1항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 이중-가닥 역위 반복 및 단일-가닥 루프를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 샘플 중 cfNA의 적어도 일부는 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 평활 말단(blunt end)을 갖도록 제조되는 것인, 증폭 방법.
  23. 제22항에 있어서, 외인성 핵산 서열의 각각의 가닥은 샘플 중 cfNA의 적어도 일부에 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 cfNA의 각각의 가닥에 연결되는, 증폭 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단일-가닥 루프는 단계 (d) 이전에 절단되는, 증폭 방법.
  25. 제24항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 서열번호: 10의 서열을 갖는 것인, 증폭 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, DNA 리가아제, DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 우라실-DNA 글리코실라아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  27. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 우라실-DNA 글리코실라아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  28. 제1항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 이중-가닥 역위 반복 및 단일-가닥 루프를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 샘플 중 cfNA의 적어도 일부는 cfNA의 3' 말단 또는 5' 말단 중 적어도 하나에 꼬리 서열(tail sequence)을 갖도록 제조되는 것인, 증폭 방법.
  29. 제28항에 있어서, 외인성 핵산 서열의 각각의 가닥은 샘플 중 cfNA의 적어도 일부에 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 cfNA의 각각의 가닥에 연결되는, 증폭 방법.
  30. 제29항에 있어서, 단일-가닥 루프는 단계 (d) 이전에 절단되는, 증폭 방법.
  31. 제30항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 서열번호: 9 또는 서열번호: 7의 서열을 갖는 것인, 증폭 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, DNA 리가아제, DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 우라실-DNA 글리코실라아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  33. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 우라실-DNA 글리코실라아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  34. 제1항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 이중-가닥 역위 반복 및 단일-가닥 루프를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 샘플 중 cfNA의 적어도 일부는 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 평활 말단을 갖도록 제조되는 것인, 증폭 방법.
  35. 제34항에 있어서, 외인성 핵산 서열의 한 가닥은 샘플 중 cfNA의 적어도 일부에 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 cfNA의 한 가닥에 연결되는, 증폭 방법.
  36. 제35항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 서열번호: 5의 서열을 갖는 것인, 증폭 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, DNA 리가아제, DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제, 단일-가닥 DNA 핵산 절단 효소 및 선택적으로 복제 블록 활성화 활성을 포함하는 것인, 증폭 방법.
  38. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, Nb.BbvC1 및 선택적으로 우라실-DNA 글리코실라아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  39. 제1항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 이중-가닥 역위 반복, 단일-가닥 루프 및 복제 블록을 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 샘플 중 cfNA의 적어도 일부는 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 평활 말단을 갖도록 제조되는 것인, 증폭 방법.
  40. 제39항에 있어서, 복제 블록은 복제 블록 활성화 활성에 의한 작용을 받기까지는 비활성화인, 증폭 방법.
  41. 제39항에 있어서, 외인성 핵산 서열의 한 가닥은 샘플 중 cfNA의 적어도 일부에 cfNA의 5' 말단, cfNA의 3' 말단 또는 cfNA의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 cfNA의 한 가닥에 연결되는, 증폭 방법.
  42. 제41항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 서열번호: 5의 서열을 갖는 것인, 증폭 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성과 함께 또는 없이 5'-3' 중합효소 활성을 갖는 DNA 중합효소, DNA 리가아제, DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제, 단일-가닥 DNA 핵산 절단 효소 및 복제 블록 활성화 활성을 포함하는 것인, 증폭 방법.
  44. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 혼합물은 T4 DNA 중합효소, T4 DNA 리가아제, DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, Nb.BbvC1 및 우라실-DNA 글리코실라아제를 포함하는 것인, 증폭 방법.
  45. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 처리 단계는 액체 샘플을 희석하는 것, 액체 샘플을 가열하는 것, 액체 샘플 중 cfNA를 단편화하는 것 또는 이들의 조합인, 증폭 방법.
  46. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 처리 단계는 액체 샘플을 희석하는 것, 액체 샘플을 가열하는 것 또는 이들의 조합인, 증폭 방법.
  47. 제1항에 있어서, 가열 단계는 cfNA의 단편화를 초래하는, 증폭 방법.
  48. 제48항에 있어서, 액체 샘플 중 cfNA는 가열 단계 이후 50 bp 내지 600 bp, 100 bp 내지 500 bp, 100 bp 내지 400 bp, 100 bp 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp, 200 bp 내지 300 bp, 300 bp 내지 400 bp, 400 bp 내지 500 bp 또는 500 bp 내지 600 bp의 단편 크기 분포를 갖는 것인, 증폭 방법.
  49. 제1항에 있어서, 액체 샘플은 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 또는 뇌척수액 샘플인, 증폭 방법.
  50. 제1항에 있어서, 액체 샘플의 용량은 100 μL 미만인, 증폭 방법.
  51. 제1항에 있어서, 액체 샘플의 용량은 10 μL 내지 50 μL인, 증폭 방법.
  52. 제1항에 있어서, 변형된 cfNA는 샘플에 존재하는 원래의 cfNA 서열의 일부, 또는 이의 보체, 및 외인성 핵산 서열을 포함하는 것인, 증폭 방법.
  53. cfNA의 분석 방법으로서,
    a. 제1항의 방법에 의해 생산되는 cfNA의 분석 가능한 풀을 제공하는 단계; 및
    b. cfNA의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 cfNA의 특징을 결정하는 단계를 포함하는, 분석 방법.
  54. 제53항에 있어서, cfNA의 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 메틸화 패턴 및 복제수 변이로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인, 분석 방법.
  55. 대상을 질환이 있거나 질환의 위험이 있는 것으로 진단하는 방법으로서,
    a. 제1항의 방법에 의해 생산되는 cfNA의 분석 가능한 풀을 제공하는 단계;
    b. cfNA의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA의 특징을 결정하는 단계; 및
    c. 특징의 존재를 기반으로 하여 대상이 질환이 있거나 이에 대한 위험이 있는 것으로 결정하거나 특징의 부재를 기반으로 하여 대상이 질환이 없는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 진단 방법.
  56. 제55항에 있어서, cfNA의 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 메틸화 패턴 및 복제수 변이로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인, 진단 방법.
  57. 질환이 있는 대상에 대한 치료적 개입을 결정하는 방법으로서,
    a. 제1항의 방법에 의해 생산되는 cfNA의 분석 가능한 풀을 제공하는 단계;
    b. cfNA의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA의 특징을 결정하는 단계; 및
    c. 결정된 특징을 기반으로 하여 치료적 개입을 결정하는 단계를 포함하는, 결정 방법.
  58. 제57항에 있어서, cfNA의 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 메틸화 패턴 및 복제수 변이로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
  59. 대상을 모니터링하는 방법으로서,
    a. 제1항의 방법에 의해 대상으로부터 cfNA의 분석 가능한 풀을 제공하는 단계;
    b. cfNA 분자의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA 분자의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA의 특징을 결정하는 단계; 및
    c. 결정된 특징을 기반으로 하여 대상이 처치를 필요로 하는 지를 결정하는 단계를 포함하는, 모니터링 방법.
  60. 제59항에 있어서, cfNA의 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 메틸화 패턴 및 복제수 변이로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
  61. 질환을 진단받고, 그 질환의 치료를 위한 치료적 양생(therapeutic regimen)에 따라 치료 중인 대상의 치료를 모니터링하는 방법으로서,
    a. 제1항의 방법에 의해 대상으로부터 cfNA의 분석 가능한 풀을 제공하는 단계;
    b. cfNA의 분석 가능한 풀을 분석하여 cfNA의 분석 가능한 풀에서 질환과 관련되는 cfNA의 특징을 결정하는 단계;
    c. 결정된 특징이 치료적 양생과 양립 가능한 지를 결정하는 단계;
    d. 결정된 특징이, 치료적 양생이 금지되거나 권고되지 않는 것임을 나타낼 경우 치료적 양생을 변경하거나, 결정된 특징이, 치료적 양생이 계속적으로 권고되는 것임을 나타낼 경우 치료적 양생을 계속하는 단계; 및
    e. 선택적으로, 단계 a) 내지 d)를 요망되는 시간 간격으로 반복하는 단계를 포함하는, 모니터링 방법.
  62. 제61항에 있어서, cfNA의 특징은 염색체 이상, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 돌연변이, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 메틸화 패턴 및 복제수 변이로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인, 모니터링 방법.
  63. 샘플 중 세포-유리 핵산(cfNA)의 원래 농도를 결정하는 방법으로서,
    a. 제1항의 방법에 의해 증폭 가능한 cfNA 풀을 제공하는 단계;
    b. 증폭 가능한 cfNA 풀을 증폭시켜 cfNA 분자의 증폭된 풀을 생산하는 단계;
    c. cfNA의 증폭된 풀에서 cfNA의 농도를 결정하는 단계; 및
    d. 결정된 cfNA의 농도를 표준 곡선과 비교하여 샘플 중 cfNA의 원래 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 결정 방법.
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