KR20180033537A

KR20180033537A - Pd-l1 발현 조혈 줄기 세포 및 용도

Info

Publication number: KR20180033537A
Application number: KR1020187004952A
Authority: KR
Inventors: 파올로 피오리나
Original assignee: 더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2016-07-20
Publication date: 2018-04-03
Also published as: HK1249029A1; US11642378B2; US20200129559A1; EP3324982A4; US20180214487A1; US20200085878A1; US20190099450A1; BR112018001232A2; JP2018520688A; WO2017015320A1; IL257046A; US20230321150A1; RU2018106515A; US10751373B2; RU2018106515A3; AU2016296741A1; US10517899B2; MX2018000897A; CN108135935A; ZA201800798B

Abstract

본원에 개시된 양태는 가공 변형된 조혈 줄기 세포 (HSC), 인공적으로 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)-자극된 HSC, 이들 HSC를 포함하는 조성물, 자가면역 질환 및 장애를 치료하기 위해 그리고 상기 면역계를 억제하기 위해 상기 변형된 HSC를 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 가공 변형된 HSC 또는 PGE₂-자극된 HSC는 표면 마커, 프로그램화된 세포사-1 리간드 (PD-L1)를 발현한다.

Description

PD-L1 발현 조혈 줄기 세포 및 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2015년 7월 21일자로 출원된 35 U.S.C. § 119(e) 하의 미국 가출원 번호 제62/194,969호의 우선권을 주장하고 이의 내용은 전문이 본원에 참조로 인용된다.

서열목록

본원은 ASCII 포맷으로 전자출원되었고 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 서열 목록을 포함한다. 상기 ASCII 카피는 2016년 7월 15일자로 작성되었고 이의 명칭은 701039-082611-PCT_SL.txt이고 크기는 2,286 바이트이다.

면역학적 접근법은 지금까지 자가면역 질환, 예를 들어, 자가면역 1형 당뇨병 (T1D)의 장기 치료에서 실패해 왔다. T1D에서 베타-세포의 파괴를 중지시키거나 지연시키기 위한 상당한 노력에도 불구하고, 성공은 여전히 달성하기 힘들다. 역사적으로, T1D 치료를 목표로 하는 접근법은 무시할만한 수의 대상체를 인슐린-비의존성으로 만들었다. 당뇨병 조절 및 합병증 시험 (DCCT)은 T1D를 갖는 개체에서 글루코스 조절을 개선하고 β-세포 기능을 보존하는 것이 당뇨병 합병증의 발병을 저하시킴을 입증하였다.

줄기 세포는 자가면역 당뇨병 치료를 위해 사용되어 왔다. 간엽 줄기 세포 (MSC)는 섬유아세포-유사 비-조혈 선조 세포이고 지방형성, 연골형성 및 골형성 분화 능력을 갖는다. MSC는 이들의 면역조절 성질 및 이들의 인슐린-생성 세포로 분화하는 잠재력 때문에 자가면역 당뇨병에 대해 실행가능한 치료학적 옵션을 나타낸다. 한 연구는 BALB/c-MSC-처리된 고혈당 NOD 마우스의 88 %에서 당뇨병의 단기 역전을 보여주었다. 그러나, NOD-MSC로 처리된 NOD 마우스는 고혈당을 유지했다. 추가의 보고는 유사유전자형 NOR-MSC를 사용한 처리가 처리된 NOD 마우스에서 고혈당의 보다 현저하고 지속적인 역전 (각각 88 % 및 62 % 단기 및 장기 역전)을 유도함을 지적하였고, 이는 자가면역 당뇨병에서 반일치 (haplo-identical) MSC의 잠재적 용도를 시사한다. 상기 데이터를 기준으로, 기관 (JDRF 및 Osiris Corporation)에 의해 미국에서 임상 시험이 개시되었지만 1년의 추적 관찰에서 비공개된 중간 결과는 실망적이었다. 추가로, 주로 MSC의 잠재적 발암성 형질전환과 관련된 안전 문제는 임상 현장에서 이들의 사용을 제한할 수 있다. (문헌참조: Moufida Ben Nasr et al., (2015), "The rise, fall, and resurgence of immunotherapy in type 1 diabetes. Pharmacological Research", 98:31-38).

조혈 줄기 세포 (HSC) 이식은 T1D의 장기 치료에 있어 유망한 결과를 가져오는 것으로 보고되었다. 그러나, 축적된 임상 데이터는 장기간 인슐린 비의존성에 대해 그리고 병태를 갖는 제한된 집단에 대해 제한된 성공을 보여준다. HSC는, HSC가 면역조절 성질을 부여받고 중추 및 말초 면역학적 관용성을 유도할 수 있기 때문에 치료 해결책을 제공할 수 있다. 2003년에, 문헌 [참조: Voltarelli et al. 2007 (JAMA, 297: 1568-76)]은 (T1D)에서 단계 I/II 연구를 개시하여 티모글로불린 + 사이클로포스파미드의 조합 용법을 사용한 자가 HSC 이식 (AHSCT)의 안전성 및 효능을 평가하였다. 최근의 분석은 평균 30개월 추적 관찰한 치료받은 환자 23명 중 20명이 1년 초과 동안 인슐린-부재임을 보고하였다. 그러나, 상기 언급된 연구에서, 수반되는 면역억제제의 효과와 HSC-매개된 면역조절 메카니즘을 구별하기 어렵다.

이전에 보고된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 AHSCT로 처리된 65명의 새롭게-진단된 T1D 개체에 대한 멀티센터 분석 보고서는 치료받은 대상체의 거의 60 %에서 인슐린 비의존성이 성취됨을 보여주었다. 그러나, 여러 부작용이 보고되었고 이는 이것이 선택된 T1D 개체만을 위한 치료요법임을 시사한다.

더욱이, 이들 연구에 사용된 AHSCT 프로토콜은 T1D를 갖는 소아 대상체에 대한 것이 아닌 성인용으로 디자인하였고 따라서 AHSCT는 상기 치료로부터 이득을 얻을 수 있는 매우 한정된 그룹의 개체에 대해서만 고려될 수 있다.

HSC는 면역조절 성질을 부여받는다. 임상전 연구는 T 세포-고갈된 골수-체류 CD34⁺ 줄기 세포가 치사량에 가깝게 조사된 마우스에서 MHC 장벽을 극복하고 쥐 HSC가 이펙터 세포를 제거할 수 있음을 입증하였다. 상기 효과는 카스파제 억제제의 첨가에 의해 복귀될 수 있고 이는 제거-기반 메카니즘을 시사한다. 인간 HSC와 관련하여, 인간 CD34⁺ 집단은 강력한 거부 활성을 부여받고 이들의 항원에 대해 지시된 세포독성 T 림프구 (CTL)의 전구체를 중화시키는 것으로 나타났다.

상기 원리를 기반으로, T1D가 새롭게 진단된 대상체에서 β-세포 상실을 차단하기 위한 추가의 면역학적 전략을 모색하는 것에 집중된 연구가 개시되었다. 그 이후, 섬 (islet) 자가항원에 대한 관용성을 재확립하기 위해 (그리고 β-세포 기능을 보존하기 위해) 실행가능하고 안전한 면역학적 접근법에 대한 연구가 진행중에 있다.

요약

본원 개시내용의 양태는 프로그램화된 세포사-1 리간드 1 (PD-L1) 발현 조혈 줄기 세포 (HSC), 이들 세포의 제조 방법 및 1형 당뇨병 (T1D)과 같은 자가면역 질환의 치료를 위한 그리고 대상체에서 면역계의 억제를 위한 이들 세포의 치료학적 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 치료학적 방법은 기관 또는 골수 이식 후 그리고 대상체가 예를 들어, 1형 당뇨병 (T1D)에서 PD-L1⁺ 발현 HSC를 제조하는데 있어서 결함을 갖는 경우 유용하다. 본원의 개시내용은 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂) 치료에 의해 또는 핵산의 형질도입 후 세포에서 PL-L1 발현을 촉진시키기 위한 PD-L1 단백질을 암호화하는 핵산의 외인성 카피로 형질도입함에 의해 자극되는 PD-L1⁺ 발현 HSC를 제공한다.

1형 당뇨병 (T1D) 마우스 모델 및 인간 T1D 환자는 PD-L1을 발현하는 소수의 HSC를 갖고 이들 HSC는 보다 낮은 양의 PD-L1을 발현한다. 소실된 PD-L1의 보충은 T1D의 마우스 모델 및 T1D 대상체에서 이식된 섬 그래프트의 면역 관용성 지속적 생존을 촉진시킨다.

본원의 개시내용은 PGE₂-자극된 HSC가 T1D의 마우스 모델에서 면역 관용성을 촉진시키고 이식된 섬 그래프트의 생존을 지속시킴을 제공한다. PGE₂-자극된 HSC는 현재 재프로그램화되어 PGE₂-자극 전 PD-L1을 발현한다. PGE₂-자극된 HSC는 또한 현재 재프로그램화되어 PGE₂-자극 전 보다 많은 PD-L1을 발현한다. 이러한 HSC-매개된 면역 관용성은 프로그램화된 세포사-1 (PD-1) 경로를 통해 일어난다. 프로그램화된 세포사-1 수용체 (PD-1)는 활성화된 T-세포 상에서 발견되고; 프로그램화된 세포사-1 수용체 리간드 (PD-L1, 또한 B7-H1로서 공지된)는 다른 세포, 예를 들어, HSC에서 발현된다. 수용체/리간드 PD-L1/PD-1 상호작용은 T 세포의 세포독성 활성을 불활성화시키고 면역계 억제 및 관용성을 유도한다.

더욱이, 본원의 개시내용은 NOD 마우스에서 항-PD-1 mAb, PIM2의 생체내 투여가 당뇨병의 발병을 지연시키고 또한 섬 동종이식 거부를 지연시킴을 제공한다. NOD 마우스는 인간 T1D의 마우스 모델이다. 인간이 T1D를 발병할 고위험에 있는 경우, PD-L1⁺ 세포의 투여는 또한 T1D의 발병을 지연시킬 수 있다. 추가로, 본원의 개시내용은 HSC에서 PD-L1 발현이 (a) 예를 들어, 렌티바이러스 시스템 또는 조류 바이러스 시스템 또는 아데노-관련 바이러스 시스템을 통한 PD-L1 cDNA의 과발현; 및 (b) PGE₂ 중 HSC의 생체외 배양, 즉 PGE₂를 사용한 접촉에 의해 증가될 수 있음을 제공한다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명의 목적은 HSC에서 PD-L1 cDNA의 외인성 카피의 과발현에 의해 생성되는 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC를 제공하는 것이다. cDNA의 외인성 카피는 HSC로 도입하거나 형질감염시켰다.

한 양태에서, 본 발명의 목적은 PGE₂와의 접촉 또는 이에 의한 자극에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 생체외 방법을 제공하는 것이다. 본원 발명자는 특정 조건하에서 PGE₂가 HSC에서, 심지어 PD-L1의 보다 낮은 발현을 갖는 T1D로부터의 결함 HSC에서 PD-L1의 내인성 발현을 자극함을 발견하였다.

한 양태에서, 본 발명의 목적은 PD-L1 cDNA의 외인성 카피의 과발현에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 생체외 방법을 제공하는 것이다.

한 양태에서, 본 발명의 목적은 본원에 기재된 PD-L1⁺ 발현 HSC를 사용함에 의해 자가면역 질환을 치료하거나 면역계를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 한 양태에서, 본원에서는 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖거나 HSC가 본원에 기재된 PGE₂에 의해 생체외 자극되어 세포에서 PD-L1 발현을 자극하는 변형된 HSC 집단이 제공된다.

한 양태에서, 본원에서는 대상체에서 자가면역 질환 또는 장애의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위한, T1D를 발병할 위험에 처해 있는 대상체에서 T1D의 발병 지연에 사용하기 위한, 대상체에서 동종이계 조직/기관 거부를 예방하거나 지연시키는데 사용하기 위한, 그리고 대상체 (성인 및 소아 T1D 환자)에서 T1D의 치료에 사용하기 위한 변형된 HSC 집단이 제공된다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다. 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 비-변형된 세포와 비교하여 보다 많은 PD-L1을 발현한다. 또 다른 양태에서, 변형된 HSC는 본원에 기재된 방법을 통해 PGE₂에 의해 생체외 자극되어 세포에서 PD-L1 발현을 자극한다. 한 양태에서, PGE₂ 자극 후 세포 집단에서 보다 많은 PD-L1 발현 세포가 있다. 또 다른 양태에서, PGE₂ 자극된 세포는 자극 전과 비교하여 자극 후 보다 많은 PD-L1을 발현한다.

한 양태에서, 본원에서는 대상체에서 자가면역 질환 또는 장애의 예방 및 치료를 위한, 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위한, T1D를 발병할 위험에 처해 있는 대상체에서 T1D의 발병 지연을 위한, 대상체에서 동종이계 조직/기관 거부를 예방하거나 지연시키는데 사용하기 위한, 그리고 대상체 (성인 및 소아 T1D 환자)에서 T1D를 치료하기 위한 약물 제조에 사용하기 위한 변형된 HSC 집단이 제공된다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다. 또 다른 양태에서, 변형된 HSC는 본원에 기재된 방법을 통해 PGE₂에 의해 생체외 자극되어 세포에서 PD-L1 발현을 자극한다.

한 양태에서, 본원에서는 본원에 기재된 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 세포는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다.

한 양태에서, 본원에서는 자가면역 질환 또는 장애의 예방 및 치료를 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하고/감소시키기 위해, T1D를 발병할 위험에 처해 있는 대상체에서 T1D의 발병 지연에 사용하기 위해, 대상체에서 동종이계 조직/기관 거부를 예방하거나 지연시키는데 사용하기 위해, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D의 치료를 위해 대상체로의 이식을 위한 조성물이 제공되고, 본원에 기재된 변형된 HSC를 포함하는 조성물 (여기서, 상기 HSC는 변형되고 PD-L1 또는 HSC를 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다)은 본원에 기재된 방법을 통해 PGE₂에 의해 생체외 자극되어 세포에서 PD-L1 발현을 자극한다. 일부 양태에서, HSC는 PGE₂, 및 덱사메타손과 같은 스테로이드 둘 다로 생체외 자극된다.

한 양태에서, 본원에서는 자가면역 질환 또는 장애의 예방 및 치료를 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하고/감소시키기 위해, T1D를 발병할 위험에 처해 있는 대상체에서 T1D의 발병 지연에 사용하기 위해, 대상체에서 동종이계 조직/기관 거부를 예방하거나 지연시키는데 사용하기 위해, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D의 치료를 위해 대상체로의 이식에 사용하기 위한 약물의 제조를 위한 본원에 기재된 변형된 HSC를 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 HSC는 변형되고 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖거나 상기 HSC는 본원에 기재된 방법을 통해 PGE₂에 의해 생체외 자극되어 세포에서 PD-L1 발현을 자극한다. 일부 양태에서, HSC는 PGE₂, 및 덱사메타손과 같은 스테로이드 둘 다로 생체외 자극된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 PD-L1을 발현한다. 또 다른 양태에서, HSC는 증가된 PD-L1 발현을 나타낸다. 여전히 다른 양태에서, HSC 집단은 PD-L1⁺ 발현 세포의 증가 비율, 예를 들어, 적어도 1배 증가를 나타낸다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 핵산은 카피 DNA (cDNA)이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 핵산은 게놈 DNA이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 핵산은 세포의 게놈으로 통합된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 핵산은 벡터를 통해 HSC에 도입된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 조류 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 포유동물 세포이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 본원에 기재된 벡터를 사용한 변형 또는 기재된 PGE₂를 사용한 자극 전, HSC는 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 동원된 말초혈액으로부터 수득된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 건강한 개체로부터 유래한다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체, 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체로부터 유래한다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 T1D로 새롭게 진단된 개체로부터 유래한다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자기항체 및 섬 항원 2 자기항체를 갖는 것으로 새롭게 검출된 개체로부터 유래한다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 진단된 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 자가면역 질환 또는 장애는 T1D이다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 세포는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전, 또는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 후, 또는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전과 후 둘 다에서 생체외 배양된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 세포는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전, 또는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 후, 또는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전과 후 둘 다에서 냉동보존된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 세포는 사용 전, 예를 들어, 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위해 또는 대상체에서 면역 반응 또는 면역계의 고의적/의도적 억제를 위해 냉동보존된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 변형된 HSC 집단은 HSC 샘플을, PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시켜 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 벡터와의 접촉으로부터 수득한 변형된 세포를 증식시키기 위해 생체외 배양하는 단계를 추가로 포함한다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1의 발현을 변형된 HSC 상에 확립하는 단계를 추가로 포함한다.

HSC 집단 또는 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 비-변형된 세포와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배 증가가 있음을 확립하는 단계를 추가로 포함한다.

기재된 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 조성물은 적어도 추가의 면역억제 치료요법제 또는 약물을 추가로 포함한다.

기재된 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 상기 담체는 세포 또는 조직 배양 배지가 아닌 것이 바람직할 수 있다.

기재된 HSC 집단을 포함하는 조성물 중 어느 하나의 한 양태에서, 조성물은 혈청 또는 혈장을 추가로 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 HSC 샘플을 접촉시켜 HSC를 변형시킴으로써 핵산의 외인성 카피가 HSC에 도입되어 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 집단을 생성하는 단계를 포함한다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와의 접촉으로부터 수득한 변형된 세포의 생체외 배양하는 단계를 추가로 포함한다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1의 발현을 변형된 HSC 상에 확립하는 단계를 추가로 포함한다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 비-변형된 세포와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배 증가가 있음을 확립하는 단계를 추가로 포함한다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 샘플은 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 샘플은 가동화 말초혈액, 예를 들어, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)에 의해 가동화 말초혈액으로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 샘플은 건강한 개체로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 샘플은 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 진단된 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애이다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 자가면역 질환 또는 장애는 T1D이다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 샘플은 T1D로 새롭게 진단된 개체로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 샘플은 T1D과 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자가항체 및 섬 항원 2 자가항체를 갖는 것으로 새롭게 검출된 개체로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 조류 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스이다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 핵산은 cDNA이다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 핵산은 게놈 DNA이다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 핵산은 세포의 게놈으로 통합된다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 예방 또는 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 37 ℃에서 약 60분 동안 10 μM의 농도에서 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 생체외 접촉시키고; 60분 후 PGE₂를 제거함에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 T1D의 발병을 지연시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 37 ℃에서 약 60분 동안 10 μM의 농도에서 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 생체외 접촉시키고; 60분 후 PGE₂를 제거함에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다. 한 양태에서, 대상체는 T1D를 발병할 위험에 처해 있다. 한 양태에서, 대상체는 T1D에 대해 무증상이고 고혈당증이 아니다. 예를 들어, 대상체의 혈당 수준은 11.1 mmol/1 (200 mg/dl) 보다 높지 않다. 한 양태에서, 대상체는 최근에 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, ICA, IAA 및 1A-2A를 갖는 것으로 검출되었다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 동종이계 조직/기관 거부를 예방하거나 지연시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 37 ℃에서 약 60분 동안 10 μM의 농도에서 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 생체외 접촉시키고; 60분 후 PGE₂를 제거함에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다. 한 양태에서, 대상체는 기관 또는 조직 이식 수용자이다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 예방 또는 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 0.1 μM의 농도에서 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 생체외 접촉시키고; 상기 PGE₂를 제거함에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 T1D의 발병을 지연시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 0.1 μM의 농도에서 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 생체외 접촉시키고; 상기 PGE₂를 제거함에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다. 한 양태에서, 대상체는 T1D를 발병할 위험에 처해 있다. 한 양태에서, 대상체는 T1D에 대해 무증상이고 고혈당증이 아니다. 예를 들어, 대상체의 혈당 수준은 11.1 mmol/l (200 mg/dl) 보다 높지 않다. 한 양태에서, 대상체는 최근에 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, ICA, IAA 및 1A-2A를 갖는 것으로 검출되었다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 동종이계 조직/기관 거부를 예방하거나 지연시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 0.1 μM의 농도에서 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 생체외 접촉시키고; 상기 PGE₂를 제거함에 의해 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다. 한 양태에서, 대상체는 기관 또는 조직 이식 수용자이다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 예방 또는 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 생체외 접촉시키고; 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고; PD-L1의 발현을 변형된 HSC 상에 확립하여 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 T1D의 발병을 지연시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 생체외 접촉시키고; 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고; PD-L1의 발현을 변형된 HSC 상에 확립하여 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 동종이계 조직/기관 거부를 예방하거나 지연시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; 상기 HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 생체외 접촉시키고; 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고; PD-L1의 발현을 변형된 HSC 상에 확립하여 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하고; 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절함을 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 자가면역 장애는 T1D이다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 수용자 대상체에 자가성(autologous)이다. 한 양태에서, 대상체는 T1D로 새롭게 진단된다. 또 다른 양태에서, 대상체는 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자가항체 및 섬 항원 2 자가항체를 갖는 것으로 검출되었다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 비-자가성이고 수용자 대상체와 동종이계(allogeneic)이다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 비-자가성이고 수용자 대상체와 이종성(xenogeneic)이다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득된다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 가동화 (mobilized) 말초혈액으로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 건강한 개체로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 T1D로 새롭게 진단된 개체로부터 수득된다.

기재된 생체외 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자가항체 및 섬 항원 2 자가항체를 갖는 것으로 새롭게 검출된 개체로부터 수득된다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 최소 CD 34⁺이다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 최소 CD 34⁺ 및 Lin^-이다.

기재된 방법 중 어느 하나의 또 다른 양태에서, 제공된 HSC 집단은 CD34⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo/-, 및 C-키트/CD117⁺이다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 제공된 HSC 집단은 CD34⁺-선택된 HSC이다. 또 다른 양태에서, HSC는 CD38에 대해 음성으로 선택된다. 즉, CD38^lo/- 세포만이 선택된다. 또 다른 양태에서, HSC는 CD34⁺ 및 CD38^lo/-에 대해 선택된다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, PGE₂ 자극된 HSC는 또한 수용자로의 이식에 사용하기 전에, 생체외에서 덱사메타손과 같은 스테로이드로 처리한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 수용자 대상체로 이식하기 전에, HSC 집단은 과량의 PGE₂의 제거 후 냉동보존되거나 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터로 형질감염시킨 후 HSC 집단을 증식시키기 위한 생체외 배양 후 냉동보존된다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 수용자 대상체로 이식하기 전에, HSC 집단은 과량의 PGE₂의 제거 후 또는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터로 형질감염 후 생체외 배양 증식시킨다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애를 갖는 수용자 대상체 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체를 동정함을 추가로 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애를 갖는 수용자 대상체 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체를 선택함을 추가로 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 면역 반응 또는 면역계의 억제를 필요로 하는 수용자 대상체 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체를 동정함을 추가로 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 면역 반응 또는 면역계의 억제를 필요로 하는 수용자 대상체, 예를 들어, 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체를 선택함을 추가로 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 T1D를 발병할 위험에 처한 대상체, 예를 들어, T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자가항체 및 섬 항원 2 자가항체를 갖는 것으로 검출된 대상체를 동정함을 추가로 포함한다.

본원에 기재된 HSC 집단, 생체외 방법, 조성물 또는 치료 방법의 한 양태에서, HSC에서 PD-L1 발현을 자극하는 PGE₂는 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E₂ (dmPGE₂)이다.

정의

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산"이 PD-L1을 암호화하는 것과 관련하여 사용되는 경우 데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA) 또는 리보뉴클레오타이드 (RNA) 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 이의 중합체 ("폴리뉴클레오타이드")를 언급한다. 구체적으로 제한되지 않는 경우, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연에 존재하는 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지적되지 않는 경우, 특정 핵산 분자/폴리뉴클레오타이드는 또한 명백하게 보존적으로 변형된 이의 변이체 (예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열 및 명백히 지정된 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴에 의해 성취될 수 있다 (문헌참조: Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). 뉴클레오타이드는 하기의 표준 약어에 의해 이들의 염기로 지정된다: 아데닌 (A), 사이토신 (C), 티민 (T), 및 구아닌 (G).

일부 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전적으로 가공된", "유전적으로 변형된" 또는 "변형된"은 세포내 유전적 물질의 첨가, 결실 또는 변형을 언급한다. 일부 양태에서, 용어 "유전적으로 변형된 세포" 및 "변형된 세포"는 상호교환적으로 사용된다. 다른 양태에서, "변형된 세포"는 자극 전과 비교하여 PD-L1을 발현하는 약리학적으로 PGE₂-자극된 HSC 또는 약리학적으로 PGE₂-변형된 HSC를 언급한다.

한 양태에서, 용어 "비-변형된 HSC"는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 HSC를 언급한다. 또 다른 양태에서, 용어 "비-변형된 HSC"는 PGE₂에 의해 약리학적으로 생체외 자극되지 않은 HSC를 언급한다.

코딩 핵산과 관련되어 본원에 사용된 바와 같은 용어 "외인성 카피"는 HSC의 게놈에서 발견된 유전자의 본래의 카피가 아닌 코딩 핵산의 엑스트라 카피를 언급한다. 코딩 핵산의 엑스트라 카피는 전형적으로 세포에 도입된다. 예를 들어, 엑스트라 카피는 벡터에서 운반된다. 엑스트라 카피는 세포의 게놈에 통합될 수 있다.

PD-L1을 암호화하는 핵산과 관련되어 본원에 사용된 바와 같은 용어 "코딩" 또는 "암호화"는 핵산이 단백질, 예를 들어, 세포 표면 단백질 PD-L1에 대한 유전적 코드를 특정하기 위해 지시 또는 정보를 함유한다. 코딩 핵산에서 지시 또는 정보는 전사되고 암호화된 단백질로 해독될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "cDNA"는 효소 역전사효소에 의해 촉매된 반응에서 전령 RNA (mRNA) 주형으로부터 합성되는 이중 가닥 DNA인 상보적 DNA를 언급한다. cDNA는 인트론이 없다.

본원에 사용된 바와 같은 PD-L1을 암호화하는 게놈 DNA란, 세포의 게놈에서 발견된 바와 같은 유전자의 카피를 의미한다. PD-L1을 암호화하는 게놈 DNA는 코딩 엑손에 추가로 인트론 및 다른 조절 서열을 포함한다.

PD-L1을 암호화하는 핵산과 관련되어 사용되는 경우 본원에 사용된 바와 같은 용어 "통합된"은 핵산이 세포의 게놈 또는 게놈 서열로 삽입됨을 의미한다. 통합되는 경우, 상기 통합된 핵산은 복제되고 세포의 본래의 게놈과 동일한 방식으로 딸 분열 세포로 분열된다.

PD-L1 벡터를 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 것과 관련되어 사용되는 경우 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 광범위하게 외인성 핵산의 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 간의 전달을 위해 디자인된 핵산 작제물을 언급한다. 한 양태에서, 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스일 수 있다. 다른 양태에서, 벡터는 외인성 핵산을 암호화하는 임의의 플라스미드, 파지미드 또는 바이러스를 언급한다. 다른 양태에서, 상기 용어는 또한, 핵산을 비리온 또는 세포로의 전달을 촉진시키는, 예를 들어, 폴리-라이신 화합물 등과 같은 비-플라스미드, 비-파지미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석된다. 벡터는 핵산 또는 이의 돌연변이체의 세포로의 전달을 위한 전달 비히클로서 적합한 바이러스 벡터일 수 있거나, 상기 벡터는 동일한 목적을 위해 적합한 비-바이러스 벡터일 수 있다. DNA의 세포로의 전달을 위한 바이러스 및 비-바이러스 벡터의 예는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다: Ma et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 12744-12746). 바이러스 벡터의 예는 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노-관련 바이러스, 재조합 아비안 폭스 바이러스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (문헌참조: Cranage et al., 1986, EMBO J. 5 : 3057-3063; 1994년 8월 18일자로 공개된 국제 특허 공개 번호 W094/17810; 1994년 10월 27일자로 공개된 국제 공개 번호 W094/23744). 비-바이러스 벡터의 예는 리포좀, DNA의 폴리아민 유도체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이러스 벡터"는 이의 당업계에 인지된 의미에 따라 사용된다. 이것은 바이러스 오리진의 적어도 하나의 요소를 포함하는 핵산 벡터 작제물을 언급하고 바이러스 벡터 입자에 팩키징될 수 있다. 상기 벡터는 DNA, RNA 또는 다른 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 세포로 전달하는 목적을 위해 사용될 수 있다. 수많은 형태의 바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "렌티바이러스"는 느리게 진행하는 질환을 유발하는 레트로바이러스 그룹 (또는 속)을 언급한다. 상기 그룹에 포함되는 바이러스는 HIV (인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형, 및 HIV 2형을 포함하는), 인간 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)의 병인학적 제제; 양에서 뇌염 (비스나) 또는 폐렴 (매디)를 유발하는 비스나-매디, 염소에서 면역 결핍, 관절염 및 뇌증을 유발하는 염소 관절염-뇌염 바이러스; 말에서 자가면역 용혈 빈혈 및 뇌증을 유발하는 말 감염 빈혈 바이러스; 고양이에서 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소에서 림프절병증, 림프구증가증 및 능히 중추 신경계 감염을 유발하는 소 면역결핍 바이러스 (BIV); 및 준-인간 영장류에서 면역 결핍 및 뇌증을 유발하는 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함한다. 이들 바이러스에 의해 유발되는 질환은 긴 잠복 기간 및 지연된 과정을 특징으로 한다. 일반적으로, 상기 바이러스는 잠재적으로 단핵구 및 마크로파아지를 감염시키고 이로부터 이들은 다른 세포로 전파된다. HIV, FIV, 및 SIV는 또한 T 림프구, 즉, T-세포를 용이하게 감염시킨다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "렌티바이러스 벡터"는 렌티바이러스 오리진의 적어도 하나의 요소를 포함하는 핵산 벡터 작제물을 갖는 벡터를 언급한다. 본원의 개시내용의 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV-1, HIV-2), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV), 소 면역결핍 바이러스 (BIV), 및 말 감염 빈혈 바이러스 (EIAV)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 벡터는 치료요법에 사용하기 위한 이들의 안전성을 증가시키고 적합한 발현 요소 및 치료학적 유전자를 포함하도록 당업계 인지된 기술을 사용하여 작제되고 가공될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 본원에서 용어 "자가면역 질환" 또는 "자가면역 질환 또는 장애"는 개체 자신의 조직으로부터 발병하고 이에 대해 지시되는 질환 또는 장애 또는 동시 분리물 또는 이의 증상 또는 이로부터 수득한 병태이다.

자가-면역 관련 질환 및 장애는 달리 자기 또는 자가 물질로서 공지된, 신체에 정상적으로 존재하는 물질 (자가항원) 및 조직에 대한 신체의 과활성 및/또는 비정상적 면역 반응으로부터 발생한다. 이러한 조절불능의 염증 반응은 마크로파아지, 과립구 및/또는 T-림프구에 의한 과도한 반응을 유발하여 비정상적 조직 손상 및 세포사를 유도한다. 후속적 기능 상실은 염증 조직 손상과 관련된다.

본원에 사용된 바와 같은 자가항원은 이러한 병원성 면역 반응을 유발하는 내인성 단백질 또는 이의 단편이다. 자가항원은 자가면역 질환에서 면역계에 의한 공격의 1차 (또는 1차) 표적이 되는 포유동물 내에서 정상적으로 발견되는 임의의 물질 또는 이의 일부일 수 있다. 상기 용어는 또한 포유동물에게 투여되는 경우 자가면역 질환의 특성을 갖는 병태를 유도하는 항원성 물질을 포함한다. 추가로, 상기 용어는 필수적으로 자가항원의 면역우성 에피토프 또는 면역우성 에피토프 영역으로 이루어진 펩신 서브클래스를 포함한다. 유도된 자가면역 병태에서 면역우성 에피토프 또는 영역은 질환을 유도하는 전체 자가항원 대신 사용될 수 있는 자가항원의 단편이다. 자가면역 질환에 걸린 인간에서, 면역우성 에피토프 또는 영역은 자가면역 공격하에 조직 또는 기관에 특이적이고 상당한 백분율 (예를 들어, 필수적으로 절대 대다수가 아닐지라도 대다수)의 자가면역 공격 T-세포에 의해 인지되는 항원의 단편이다.

자가면역 질환과 관련된 것으로 공지된 자가항원은 탈수초 질환, 예를 들어, 다발성 경화증 및 실험 자가면역 척수염과 함께 수초 단백질; 콜라겐 및 류마티스 관절염; 인슐린, 프로인슐린, 글루탐산 데카복실라제 65 (GAD65); 인슐린 의존성 당뇨병과 함께 섬 세포 항원 (ICA512; ICA12)을 포함한다.

다수의 자가면역 관련된 질환 및 염증 병태에서 통상의 특징은 염증 촉진 CD4⁺ T 세포의 관여이다. 이들 T 세포는 염증성 Th1형 사이토킨의 방출에 관여한다. Th1형으로 특징화되는 사이토킨은 인터류킨 2 (IL-2), γ-인터페론, TNFα 및 IL-12를 포함한다. 상기 염증 촉진 사이토킨은 자가 조직의 파괴를 유도하는 많은 경우에 면역 반응을 자극하는 작용을 한다. T 세포 반응의 억제와 관련된 사이토킨은 Th2형이고 IL-10, IL-4 및 TGF-β를 포함한다. Th1 및 Th2형 T 세포는 면역원에 응답하는 동일한 항원 수용체를 사용할 수 있고; 전자는 자극 반응을 생성하고 후자는 억제 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다.

한 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 세 가지 조혈 혈통, 적혈구, 림프구 및 골수구의 모든 혈액 세포 유형을 생성하는 줄기 세포를 언급한다. 이들 세포 유형은 골수구 (단핵구 및 마크로파아지, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포) 및 림프구 혈통 (T-세포, B-세포, NK-세포)을 포함한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 하기의 세포 표면 마커를 갖는 줄기 세포를 언급한다: CD34⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo/-, 및 C-키트/CD117⁺. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD34⁺인 줄기 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD38^1o/-인 줄기 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD34⁺ 및 CD38^lo/-인 줄기 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 lin^-인 줄기 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD34⁺ 및 lin^-인 줄기 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD34⁺, CD38^lo/- 및 lin^-인 줄기 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD34⁺ 및 C-키트/CD117⁺인 줄기 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD34⁺, CD38^lo/- 및 C-키트/CD117⁺인 줄기 세포를 언급한다. 또 다른 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)를 포함한다.

한 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "선조 세포"는 이후 특정 세포 유형, 예를 들어, 혈액 세포, 피부 세포, 골 세포 또는 모발 세포로 성숙 (분화)해지도록 하는 잠재력을 갖는 미성숙 또는 미분화된 세포를 언급한다. 선조 세포는 또한 유사하게 미성숙하거나 미분화된 보다 많은 선조 세포를 제조하기 위해 증식할 수 있다.

본원의 개시내용의 세포는 자가성/자생 ("자기") 또는 비-자가성 ("비-자기", 예를 들어, 동종이계, 동계 또는 이종성)일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "자가성"은 동일한 대상체로부터의 세포를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 "동종이계"은 유전적으로 비교 세포와는 상이한 동일한 종의 세포를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 "동계"는 유전적으로 비교 세포와는 동일한 상이한 대상체의 세포를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 "이종성"은 비교 세포와는 상이한 종의 세포를 언급한다. 바람직한 양태에서, 본원의 개시내용의 세포는 동종이계이다.

"단리된 세포"는 생체내 조직 또는 기관으로부터 수득되고 실질적으로 세포외 매트릭스가 없는 세포를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 조혈계, 면역계 및 HSC를 갖는 임의의 동물을 포함한다. 한 양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 면역계의 병태의 증상, 예를 들어, 본원에 기재된 HSC 및 본원에 고려된 방법으로 치료될 수 있는 자가면역 질환을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체 (예를 들어, 환자)는 실험 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그), 농장 동물 및 가축 또는 애완 동물 (예를 들어, 고양이 또는 개)을 포함한다. 비-인간 영장류 및 바람직하게, 인간 환자가 포함된다. 전형적 대상체는 본원에 기재된 HSC 및 본원에서 다른 곳에 기재된 방법에 의해 조절될 수 있는 하나 이상의 생리학적 활성의 비정상적 양 ("정상" 또는 "건강한" 대상체 보다 낮거나 높은 양)을 나타내는 동물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 대상체는 인간이다.

한 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리학적 병태의 증상 또는 병리학에 대한 임의의 유익한 또는 바람직한 효과를 포함하고, 치료되는 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정가능한 마커에서 심지어 최소 감소를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 치료는 임의로 질환 또는 병태의 증상의 감소 또는 완화, 또는 질환 또는 병태의 진행의 지연을 포함할 수 있다. "치료"는 필연적으로 질환 또는 병태, 또는 이의 관련 증상의 완전한 근절 또는 치유를 지적하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 "T1D와 관련된 자기-자가항체"는 1형 당뇨병에서 베타 세포 자가면역의 마커인 자가항체: 섬 세포 항체 (ICA, 베타 세포에서 세포질 단백질에 대한), 글루탐산 데카복실라제 (GAD-65)에 대한 항체, 인슐린 자가항체 (IAA), 및 단백질 티로신 포스파타제에 대한 IA-2A를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같이, 한 양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 그리고 보다 특히 인간에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 약전에 등재된 것을 의미한다. 구체적으로, 이것은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적 이익/위험 비율에 맞는, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 언급한다.

용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 언급한다. 상기 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등을 포함하는 오일일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 요구되는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 산제, 서방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 결합제 및 담체, 예를 들어, 트리글리세리드와 함께 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990)]에 기재되어 있다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.

한 양태에서, "약제학적으로 허용되는 담체"는 조직 배양 배지를 배제한다. 또 다른 양태에서, "약제학적으로 허용되는 담체"는 혈청 또는 혈장을 포함한다. 혈청 또는 혈장은 인간 또는 대상체 수용자로부터 유래할 수 있다.

용어 "유효량"은 각각 외인성 핵산을 사용한 세포의 성공적인 형질도입을 제공하거나 세포에서 PD-L1 발현의 성공적인 자극을 제공하기에 충분한 양의 생물학적 활성 벡터 입자 또는 PGE₂ 농도를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는"은 본원에 기재된 HSC 또는 본원에 기재된 HSC를 포함하는 조성물을 목적하는 부위에서 HSC의 적어도 부분 국소화를 유도하거나 HSC의 PD-L1 발현 후손 세포로의 증식, 접목 및/또는 분화를 유도하는 방법 또는 경로에 의해 수용자 대상체로 위치시킴을 언급한다. HSC 또는 HSC를 포함하는 조성물은 대상체에서 효과적인 치료를 유도하는 임의의 적당한 경로에 의해 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 본원의 개시내용에 필수적이며 필수적인지의 여부에 상관없이 비특정 요소들의 포함에 개방적인 방법 및 이의 각각의 성분(들)을 언급하는데 사용된다. "포함하는"의 사용은 제한보다는 포함을 지적한다.

도 1은 PD-L1 유전적 결실이 시험관내 HSC 면역조절 성질을 폐지시킴을 보여준다.
도 2a 및 2b는 말초 PD-L1⁺ HSC의 백분율이 B6과 비교하여 NOD 마우스에서 감소됨을 보여준다.
도 2c는 PCR에 의한 NOD 마우스에서 PD-L1 발현 결함의 확인을 보여준다.
도 2d 및 2e는 HSC에 대한 쥐 PD-L1 결함이 약리학적 접근법에 의해 시험관내에서 번복될 수 있음을 보여준다. 시험관내 배양 8일 후, PD-L1⁺ KLS 세포의 백분율 증가는 명백하였다.
도 3a 및 3b는 PD-L1⁺ HSC가 건강한 개체와 비교하여 T1D 개체에서 수적으로 보다 적음을 보여준다.
도 3c는 T1D에 의해 영향받은 개체의 HSC에서 PCR에 의한 PD-L1 결함의 확인을 보여준다.
도 3d 및 3e는 HSC에 대한 인간 PD-L1 결함이 약리학적 접근법에 의해 시험관내에서 번복될 수 있음을 보여준다. 시험관내 배양 7일 후, PD-L1⁺ HSC의 백분율 증가는 명백하였다.
도 4a 및 4b는 PIM2와 PD-L1/PD-1의 가교 결합이 NOD 마우스에서 당뇨병 발병을 지연시키고 (도 4a) (inBALB/c의 B6으로의) 섬 이식 후 섬 생존을 연장시킴 (도 4b)을 보여준다.
도 5a 및 5b는 PDL1 cDNA 함유 렌티바이러스가 형질도입된 HSC가 고도의 PDL1⁺가 되고 새로운 당뇨병성 NOD 마우스에 1회 적응적으로 전달되면 혈당증을 정상화시킴을 보여준다. NOD 미처리된 마우스는 > 250 mg/dl로 고혈당을 유지했다.
도 6은 HSC 상에서 PDL1 발현에 대한 PGE₂의 효과를 보여준다.
도 7은 쥐 PD-L1 형질도입된 KLS 세포가 NOD 마우스에서 고혈당증을 역전시킴을 보여준다.
도 8a는 유전자가 차등적으로 발현됨을 보여주는, NOD 및 B6 마우스의 골수로부터 기원하는 Sca-1⁺혈통^-c-키트⁺HSC의 마이크로어레이 분석을 요약하는 표이다.
도 8b는 정상 B6 대조군 마우스와 비교하여 NOD의 골수로부터 Sca-1⁺혈통^-c-키트⁺HSC에서 PD-L1의 감소된 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 8c는 정상 B6 대조군 마우스와 비교하여 NOD의 골수로부터 기원하는 Sca- 1⁺혈통^-c-키트⁺HSC에서 PD-L1의 상대적 발현을 요약하는 히스토그램이고 웨스턴 블롯 분석 및 정량적 측정에 의해 수득된 데이터이다. 개방 히스토그램은 NOD 마우스이고 폐쇄된 히스토그램은 C57BL/6 마우스이다.
도 8d는 정상 B6 대조군 마우스와 비교하여 NOD의 골수로부터 기원하는 Sca- 1⁺혈통^-c-키트⁺HSC에서 PD-L1의 상대적 mRNA 발현을 요약하는 히스토그램이다. 개방 히스토그램은 NOD 마우스이고, 폐쇄된 히스토그램은 C57BL/6 마우스이다.
도 8e 및 8f는 정상 B6 대조군 마우스와 비교하여 NOD의 골수로부터 기원하는 PD-L1⁺KLS:Sca-1⁺혈통^-c-키트⁺ 세포의 FACS 도트 플롯 및 히스토그램을 보여준다. 개방 히스토그램은 NOD 마우스이고, 폐쇄된 히스토그램은 C57BL/6 마우스이다.
도 8g 및 8h는 정상 B6 대조군 마우스와 비교하여 NOD의 골수로부터 기원하는 PD-L1⁺CD41^-CD48^-CD150⁺ 세포의 FACS 도트 플롯 및 히스토그램을 보여준다. 개방 히스토그램은 NOD 마우스이고, 폐쇄된 히스토그램은 C57BL/6 마우스이다.
도 8i 및 8k는 정상 B6 대조군 마우스와 비교하여 NOD의 골수로부터 기원하는 PD-L1⁺KL:혈통^-c-키트⁺ 세포의 FACS 도트 플롯 및 히스토그램을 보여준다. 개방 히스토그램은 NOD 마우스이고, 폐쇄된 히스토그램은 C57BL/6 마우스이다.
도 8j 및 8l은 정상 B6 대조군 마우스와 비교하여 NOD의 골수로부터 기원하는 PD-L1⁺CD244^_CD48^_CD150⁺ 세포의 FACS 도트 플롯 및 히스토그램을 보여준다. 개방 히스토그램은 NOD 마우스이고, 폐쇄된 히스토그램은 C57BL/6 마우스이다.
도 9a는 야생형 (WT) KL 세포로도 공지된 PD-L1 렌티바이러스를 사용한 형질도입 전 NOD 마우스로부터 추출된 KL 세포 상의 PD-L1 발현의 유동 세포측정 분석을 보여준다.
도 9b는 Tg 세포로서 표지된, PD-L1 렌티바이러스를 사용한 형질도입 후 NOD 마우스로부터의 KL 세포 상의 PD-L1 발현의 유동 세포측정 분석을 보여준다.
도 9c는 PD-L1 렌티바이러스를 사용한 형질도입 후 NOD 마우스로부터 KL 세포 상의 PD-L1 발현에서의 증가를 요약하는 히스토그램을 보여준다.
도 9d는 DC의 존재 및 KL 세포와 PD-L1.Tg KL 세포의 공동배양시 BDC2.5 펩타이드에 의해 자극된 NOD-BDC2.5 TCRtg 마우스로부터 추출된 CD4+T 세포에 의한 INFγ생성의 유동 세포측정 분석을 요약한 히스토그램을 보여준다.
도 9e는 DC의 존재, 및 PD-L1 블록킹/중화 Ab의 존재하에 KL 세포와 PD-L1의 공동배양시 BDC2.5 펩타이드에 의해 자극된 NOD-BDC2.5 TCRtg 마우스로부터 추출된 CD4⁺ T 세포에 의한 INFγ 생성의 유동 세포측정 분석을 보여준다.
도 9f는 KL 세포와 PD-L1.Tg KL 세포의 공동배양시 가용성 항-CD3/항-CD28에 의해 자극된 NOD 마우스로부터 추출된 CD4⁺ 세포에 의한 INFγ 생성의 유동 세포측정 분석을 요약하는 히스토그램을 보여준다.
도 9g는 PD-L1 블록킹/중화 Ab의 존재하에 KL 세포와 PD-L1.Tg KL 세포의 공동배양시 가용성 항-CD3/항-CD28에 의해 자극된 NOD 마우스로부터 추출된 CD4⁺ T 세포에 의한 INFγ 생성의 유동 세포측정 분석을 보여준다.
도 9h 내지 9k는 3×l0⁶ 형질도입되지 않은 KL 세포 또는 PD-L1.Tg KL 세포의 투여 후 혈당 수준에 의해 입증된 바와 같이 형질도입되지 않은 KL 세포 (도 9k) 및 PD-L1.Tg KL 세포 (도 9l)로 처리된 NOD-고혈당증에서 당뇨병의 역전을 그래프로 나타낸 것이다. 어떠한 역전도 독시사이클린으로 성취되지 않았고 (도 9j); (도 9h) 미처리된 그룹은 대조군으로서 사용하였다.
도 10a 내지 10f는 PD-L1이 건강한 대조군 인간 대상체 (HC)와 비교하여 T1D 환자로부터 기원하는 인간 HSC에서 결함되어있음을 입증하였다.
도 10a 내지 10b는 건강한 대조군 (HC)으로부터 (도 10a) 및 1형 당뇨병 개체 (T1D)로부터 (도 10b) 선택된 CD34⁺HSC에서 PD-L1 발현을 보여주는 대표적 유동 세포측정 분석이다.
도 10c는 도 10a-10b에서 유동 세포측정 분석과 관련된 막대 그래프를 보여주고 T1D에서 PD-L1 발현에서의 결함을 설명한다.
도 10d는 HC와 비교하여 T1D 개체의 CD34⁺HSC에서 감소된 PD-L1 발현을 보여주는 대표적 웨스턴-블롯 분석이다.
도 10e는 HC와 비교하여 T1D 개체의 CD34⁺HSC에서 감소된 PD-L1 발현을 보여주는 웨스턴-불롯 분석을 요약하는 히스토그램이다.
도 10f는 HC와 비교하여 T1D 개체의 CD34⁺HSC에서 PD-L1 발현에 대한 RT-PCT 데이터를 요약하는 히스토그램이다.
도 11은 고혈당증의 발병 후 NOD 마우스에서 고혈당증을 정상화시키는데 있어서 2원 PGE₂ 및 덱사메타손-자극된 KL 세포의 효과를 보여준다. 각각의 라인은 시험 NOD 마우스의 혈당을 나타낸다. KL 세포는 고혈당증의 발병 직후 수용자 마우스로의 이식 전 생체외 자극시켰다.
도 12는 PGE₂-자극된 HSC로 치료된 마우스가 지연된 섬 동종이식 거부를 가짐을 보여준다. 유사한 전략은 일반적으로 동종이식 거부를 예방하고 또한 치료하기 위해 사용될 수 있다.

달리 설명되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원의 개시내용이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 개시내용은 본원에 기재된 바와 같이 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고 이와 같이 다양할 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 양태를 기재할 목적을 위한 것이고 본원의 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고 이는 단지 청구범위에 의해 한정된다.

분자 생물학에서 통상의 용어의 정의는 하기 문헌 [참조: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3), (2015 digital online edition at merckmanuals.com), Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)]에서 찾을 수 있고, 이의 내용 모두는 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 추가로, 본원에 달리 요구되지 않는 경우, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.

달리 진술되지 않는 경우, 본원의 개시내용은, 예를 들어, 문헌 [참조: Michael R. Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998), Methods in Molecular biology, Vol.180, Transgenesis Techniques by Alan R. Clark editor, second edition, 2002, Humana Press, and Methods in Meolcular Biology, Vo. 203, 2003, Transgenic Mouse, editored by Marten H. Hofker and Jan van Deursen, 상기 문헌은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다]에서와 같이 당업자에게 공지된 표준 과정을 사용하여 수행하였다.

본원의 개시내용은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고 이와 같이 다양할 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 양태를 기재할 목적을 위한 것이고 본원의 개시내용의 범위를 제한하려는 것으로 의도되지 않고 이는 단지 청구항에 의해 정의된다.

작동 실시예에 기재된 것 외에, 또는 달리 지적되지 않는 경우, 본원에 사용된 성분들의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변경되는 것으로서 이해되어야만 한다. 백분율과 관련하여 사용되는 경우 용어 "약"은 ±1 %를 의미한다.

확인된 모든 특허 및 공보는 예를 들어, 본원의 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 상기 공보에 기재된 방법을 기술하고 기재할 목적을 위해 참조로 본원에 명백히 인용된다. 이들 공보는 본원의 출원일 전에 이들의 공개를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여, 본원 발명자가 사전 공개에 의해 또는 임의의 다른 이유로 인해 상기 공개를 앞당길 자격이 없음을 인정하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 상기 참조문헌의 내용에 관한 날짜 또는 제공에 대한 모든 진술은 출원인에게 가용한 정보를 기준으로 하고 이들 참조문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 인가도 구성하지 않는다.

본원의 개시내용은 자가면역 질환 및 장애를 치료하고 면역계를 조절하기 위한 변형된 조혈 줄기 세포 (HSC), 변형된 HSC를 포함하는 조성물, 이들 변형된 HSC를 사용하는 방법에 관한 것이다. 변형된 HSC는 세포가 변형 전 PD-L1을 발현하지 않는 경우 프로그램화된 세포사-1 수용체 리간드 (PD-L1)를 발현하거나, 변형된 HSC는 지금 변형 전과 비교하여 보다 많은 PD-L1을 발현한다. 변형은 형질도입된 세포에서 PD-L1 단백질 발현을 촉진시키기 위해 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 형질도입함에 의해 또는 PGE₂에 의한 자극과 함께 HSC의 약리학적 재프로그래밍에 의해 이루어진다.

본원에 기재된 개시내용은 바람직한 양태에서 인간을 클로닝하기 위한 공정, 인간의 생식 계열 유전적 실체를 변형시키는 공정, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 용도 또는 인간 또는 동물에게 임의의 실질적 의학적 이득 없이 동물을 고통 받게 할 가능성이 있는 동물의 유전적 실체를 변형시키기 위한 공정 및 또한 상기 공정으로부터 비롯된 동물에 관한 것이 아니다.

일부 양태에서, 본원의 개시내용의 양태는 1형 당뇨병 (T1D)을 갖는 환자의 HSC에서 PD-L1 발현의 증가는 환자의 면역조절에서의 결핍을 완화시킬 수 있다는 발견에 기초한다. NOD 마우스 및 인간 T1D 환자는 감소된 수의 PD-L1 발현 HSC를 갖고 HSC는 보다 낮은 양의 PD-L1을 발현한다. 감소하는 PD-L1은 면역조절에 대한 마우스 및 환자의 능력에서의 결함에 기여한다. 이러한 PD-L1 결핍을 외부적으로 보충하는 것은 면역 관용성을 촉진시킴에 의해 이러한 면역조절 결함을 재보정하는 것을 도와준다.

T1D에서 베타-세포의 파괴를 중단시키거나 지연시키기 위한 상당한 노력에도 불구하고, 성공은 여전히 달성하기 힘들다. 간엽 줄기 세포를 사용한 줄기 세포-기반 치료요법 및 자가 조혈 줄기 세포 이식 (AHSCT)은 단지 NOD 마우스와 T1D 인간에서 그리고 단지 질환에 걸린 선택적 집단에 대해서만 단기간 인슐린-비의존성을 유도한다. 줄기 세포-기반 치료요법 중 어떠한 것도 소아 환자에게 적용되지 않는 것이 없다. 더욱이, 특정 줄기 세포 기반 치료요법은 특히 소아 환자에 대해 잠재적 발암 문제를 제공한다.

따라서, 여기서 해결할 문제는 T1D 환자의 보다 큰 집단인 성인과 소아 환자 둘 다에 적용될 수 있는 치료요법, 및 장기간 인슐린-비의존성이 되도록 하는 치료요법을 제공하는 것이다.

이전에, NOD 마우스에서 HSC의 용도에 대한 임상전 연구는 부족하고 주로 동종이계 HSC를 사용한다. β-gal 유전자전이 공여자로부터의 동종이계 HSC가 NOD 마우스로 이식되는 경우, 당뇨병 발병은 모든 치료된 마우스에서 성공적으로 예방되었지만 완전한 조혈 접목에도 불구하고 50마리 마우스 중 1마리에서만 역전이 수득되었다. 인간이 T1D를 발병하는 고위험에 있는 경우, 아마도 PD-L1⁺ 세포의 투여 또한 질환의 발병을 지연시킬 수 있다. 본원 발명자는 HSC 면역학적 성질이 면역조절 분자 PD-L1 (또한 CD274 또는 B7-H1로서 공지된)의 발현과 관련될 수 있음을 입증하였다. PD-L1은 억제 수용체 프로그램화된 사멸 1 수용체 (PD-1)의 리간드이고 이는 주로 활성화된 T 세포 상에서 발현된다. PD-L1과 PD-1 간의 상호연결은 T 세포 활성화를 억제하고 이들의 고갈/아폽토시스를 호전시킨다. PD-1 녹아웃 마우스는 가속화된 당뇨병을 발병하고 PD-1/PD-L1 시그날 전달은 T 세포 아네르기를 유도하는 억제 시그날을 활성화시킨다.

본원 발명자는 건강한 인간과 비교하여 T1D를 갖는 환자에서 PD-L1을 발현하는 CD34⁺ HSC의 수가 보다 적음을 발견하였다. 면역유동세포측정에 의해 수득된 이러한 발견은 RT-PCR에 의해 추가로 확인되었다. 건강한 인간에 대한 14.5 %의 PD-L1⁺/CD34⁺ HSC와 비교하여 T1D를 갖는 인간 환자에 대해서는 약 3 % PD-L1⁺/CD34⁺ HSC였다. PD-L1은 면역계에서 중요한 면역조절 분자이다.

추가로, 본원 발명자는 T1D 환자로부터의 HSC가 이들의 면역조절 성질에 결함이 있음을 발견하였다. 항-CD3/CD28 ELISPOT 면역검정에서 시험되는 경우, T1D에 의해 영향받은 이들 환자로부터의 HSC는 면역 반응을 억제할 가능성이 적다.

따라서, T1D 또는 다른 자가면역 장애에 의해 영향받은 환자로부터 유래된 HSC에서 PD-L1 발현을 증가시키거나 자극하고/하거나 PD-L1 발현 HSC를 이들 개체에게 제공하는 것은, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는데 있어서 그리고 면역계를 조절하기 위해 유용한 치료학적 전략을 나타낸다. 본원 발명자는 T1D 환자로부터 유래된 HSC와 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)의 생체외 항온처리가 HSC에서 PD-L1의 발현을 자극함을 발견하였다. 추가로, PD-L1을 암호화하는 외인성 핵산을 HSC로 형질감염시키는 것은 형질감염된/형질도입된 HSC에서 PD-L1의 발현을 촉진한다.

PD-L1 ⁺ 발현 조혈 줄기 세포 (HSC) 및 이의 조성물

따라서, 한 양태에서, 본원에서는 변형된 HSC 세포가 프로그램화된 세포사-1 수용체 리간드 (PD-L1)를 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시킴으로써 핵산의 외인성 카피가 HSC로 도입되어 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 벡터와의 접촉 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고/하거나 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립한 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 배양은 치료요법을 위해 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 기재된 벡터와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

한 양태에서, 본원에서는 변형된 HSC 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시킴으로써 핵산의 외인성 카피를 HSC로 도입하고; (b) PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립하여 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 벡터와의 접촉 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고/하거나 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립한 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양함을 추가로 포함한다. 상기 배양은 치료요법을 위해 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 기재된 벡터와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

한 양태에서, 본원에서는 변형된 HSC 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시킴으로써 핵산의 외인성 카피를 HSC로 도입하고; (b) 상기 접촉으로부터 수득한 변형된 세포를 벡터와 함께 생체외 배양하고; (c) PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립하여 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다. 상기 배양은 치료요법을 위해 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 기재된 벡터와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

한 양태에서, 본원에서는 변형된 HSC가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 HSC 집단이 제공된다. 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 비-변형된 세포와 비교하여 보다 많은 PD-L1을 발현한다.

한 양태에서, 본원에서는 변형된 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시켜 핵산의 외인성 카피를 HSC에 도입함으로써 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 한 양태에서, HSC 샘플은 비-변형된 HSC를 포함한다. 한 양태에서, 비-변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는다. 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 벡터와 접촉 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고/하거나 PD-L1의 발현을 상기 수득한 변형된 HSC 상에 확립한 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양함을 추가로 포함한다. 상기 배양은 치료요법에 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 기재된 벡터와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

한 양태에서, 본원에서는 변형된 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 (a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시켜 핵산의 외인성 카피를 HSC에 도입하고; (b) 변형된 HSC 세포 상에 PD-L1의 발현을 확립함으로써 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 한 양태에서, 상기 방법은 벡터와 접촉 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고/하거나 PD-L1의 발현을 상기 수득한 변형된 HSC 상에 확립한 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양함을 추가로 포함한다. 상기 배양은 치료요법에 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 기재된 벡터와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

한 양태에서, 본원에서 변형된 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 (a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시켜 핵산의 외인성 카피를 HSC에 도입하고; (b) 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고; (c) PD-L1의 발현을 상기 변형된 HSC 상에 확립함으로써 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 상기 배양은 치료요법에 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 기재된 벡터와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

한 양태에서, 변형된 HSC는 세포에서 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖도록 가공된 변형된 세포이다. 이들 가공된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 HSC와 비교하여 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 이들 가공된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 HSC와 비교하여 보다 많은 PD-L1을 발현한다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 HSC 집단에서 PD-L1의 발현을 자극하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 37 ℃에서 약 60분 동안 HSC 샘플을 10 μM의 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키고; (b) 상기 접촉된 세포를 세척하여 과도한 PGE₂를 제거하고; (c) PD-L1의 발현을 PGE₂-자극된 HSC 상에 확립하여 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다.

한 양태에서, PGE₂-자극된 HSC는 비-PGE₂-자극된 HSC와 비교하여 증가된 PD-L1 발현을 갖는다. 한 양태에서, PGE₂-자극된 HSC는 비-PGE₂-자극된 HSC와 비교하여 적어도 1 % 증가된 PD-L1 발현을 갖는다. 다른 양태에서, PGE₂-자극된 HSC는 비-PGE₂-자극된 HSC와 비교하여 적어도 2 %, 적어도 3 %, 적어도 5 %, 적어도 8 %, 적어도 10 %, 적어도 15 %, 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 35 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배 높은, 적어도 1000배 높은 또는 더 증가된 PD-L1 발현을 갖는다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 HSC 집단에서의 PD-L1의 발현을 자극하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) HSC 샘플을 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 0.1 μM의 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키고; (b) 상기 접촉된 세포를 세척하여 과량의 PGE₂를 제거하고; (c) PD-L1의 발현을 PGE₂-자극된 HSC 상에 확립함으로써, PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 HSC 집단에서 PD-L1의 발현을 자극하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1 μM 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 HSC 집단에서 PD-L1의 발현을 자극하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 37 ℃에서 약 60분 동안 HSC 샘플을 10 μM 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다.

상기된 방법의 한 양태에서, 상기 방법은 접촉된 세포를 세척하여 과량의 PGE₂를 제거함을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PGE₂와 접촉 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양 및/또는 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양을 추가로 포함한다. 상기 배양은 치료요법에 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 PGE₂와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 HSC 집단에서 PD-L1의 발현을 자극하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 37 ℃에서 약 60분 동안 HSC 샘플을 10 μM 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키고, (b) PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립하여 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성하여 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다. 상기 배양은 치료요법에 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 PGE₂와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 HSC 집단에서 PD-L1의 발현을 자극하는 생체외 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1 μM 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키고, (b) PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립하여 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성하여 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다.

상기된 방법의 한 양태에서, 상기 방법은 PGE₂와 접촉 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양 및/또는 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양을 추가로 포함한다. 상기 배양은 치료요법에 가용한 변형된 세포의 수를 증대시킨다. 한 양태에서, HSC 샘플은 PGE₂와의 접촉 전에 증식된 배양물일 수 있다.

한 양태에서, 본원에서는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 (a) 37 ℃에서 약 60분 동안 HSC 샘플을 10 μM 농도의 PGE₂와 접촉시키고; (b) 상기 접촉된 세포를 세척하여 과량의 PGE₂를 제거하고, (c) 상기 접촉된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립하여 PD-L1을 발현하는 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 (a) 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1 μM 농도의 PGE₂와 접촉시키고; (b) 상기 접촉된 세포를 세척하여 과량의 PGE₂를 제거하고, (c) 상기 접촉된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립하여 PD-L1을 발현하는 HSC 세포 집단을 생성함을 포함한다.

상기된 방법의 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PGE₂와 접촉 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양 및/또는 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양을 추가로 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 PGE₂와 생체외 또는 생체내 또는 시험관내 접촉에 의해 내인성 PD-L1의 발현을 증가시키기 위해 자극되었다.

한 양태에서, 본원에서는 변형된 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 변형된 HSC는 PGE₂로 자극되지 않거나 접촉되지 않은 비-변형된 세포와 비교하여 보다 많은 PD-L1을 발현한다.

한 양태에서, 본원에서는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 37 ℃에서 약 60분 동안 HSC 샘플을 10 μM 농도의 PGE₂와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

한 양태에서, 본원에서는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1 μM 농도의 PGE₂와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

상기된 방법 또는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단의 한 양태에서, 상기 방법은 접촉된 세포를 세척하여 과량의 PGE₂를 제거함을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PGE₂와의 접촉 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양 및/또는 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양을 추가로 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 (a) 37 ℃에서 약 60분 동안 HSC 샘플을 10 μM 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키고; (b) PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립하여 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함으로써 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

한 양태에서, 본원에서는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 제공되고, 여기서, 상기 세포는 (a) 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1 μM 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키고, (b) PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립하여 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함으로써 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

상기된 방법 또는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단의 일부 양태에서, HSC는 또한 덱사메타손과 같은 스테로이드와 접촉시킨다. 일부 양태에서, HSC는 PGE₂와 덱사메타손과 같은 스테로이드 둘 다와 생체외 접촉시키고, 즉, PGE₂와 덱사메타손 둘 다와 동시에 동시-자극시킨다. 예를 들어, 0.1 μΜ-100 μΜ, 0.1 μΜ, 0.5 μΜ, 1μΜ, 5μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 30 μΜ, 40 μΜ, 50 μΜ, 60 μΜ, 70 μΜ, 80 μΜ, 90 μΜ 또는 100 μΜ의 덱사메타손이다.

상기된 방법 또는 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단의 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PGE₂와 접촉 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양 및/또는 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양을 추가로 포함한다.

상기된 방법 또는 본원에서 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단의 한 양태에서, HSC 샘플은 PGE₂의 첨가/접촉 전 PGE₂의 부재하에 생체외 배양한다. 생체외 배양은 PGE₂와 접촉 및 자극 동안 가용한 출발 HSC의 수를 증대시키거나 증가시킨다.

상기된 방법 또는 본원에서 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단의 한 양태에서, PGE₂의 부재하에 생체외 배양은 PGE₂의 제1/초기 첨가 또는 접촉 전 적어도 48시간 동안 수행한다. 생체외 배양은 PGE₂와의 접촉 및 자극 동안 가용한 출발 HSC의 수를 증대시키거나 증가시킨다.

상기된 방법 또는 본원에서 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단의 한 양태에서, HSC는 적어도 24시간 동안 배양 중 PGE₂와 접촉시킨다. 다른 양태에서, HSC는 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 60시간, 적어도 72시간, 적어도 84시간, 적어도 96시간, 적어도 108시간, 적어도 120시간, 적어도 132시간, 적어도 144시간, 적어도 l56시간, 적어도 168시간, 적어도 196시간 및 24 내지 196시간 사이의 시간에 모든 중재 시간 동안 배양 중 PGE₂와 접촉시킨다.

또 다른 양태에서, HSC는 8일 이하 동안 배양 중 PGE₂와 접촉시킨다. 다른 양태에서, HSC는 3일 이하 동안, 4일 이하 동안, 5일 이하 동안, 6일 이하 동안 및 7일 이하 동안 배양 중 PGE₂와 접촉시킨다.

다른 양태에서, HSC는 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 약 108시간, 약 120시간, 약 132시간, 약 144시간, 약 156시간, 약 168시간, 약 196시간 및 24 내지 196시간 사이의 시간에 모든 중재 시간 동안 배양 중 PGE₂와 접촉시킨다.

한 양태에서, 본원에서는 본원에 기재된 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 변형된 HSC는 PD-L1⁺을 발현한다. 예를 들어, 상기 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다. 한 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 배양 배지를 포함하지 않는다.

한 양태에서, 본원에서는 본원에 기재된 변형된 HSC 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

한 양태에서, 본원에서는 본원에 기재된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 HSC이거나, 상기 HSC는 PGE₂와 생체외 접촉시킴에 의해 내인성 PD-L1의 발현을 증가시키도록 생체외 자극된다. 한 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 배양 배지를 포함하지 않는다.

한 양태에서, 본원에서는 이식 과정과 연계하여 사용하기 위한 또는 자가면역 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 또는 면역 반응을 감소시키거나 조절하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖고 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 배양 배지를 포함히지 않는다.

한 양태에서, 본원에서는 이식 과정과 연계하여 사용하기 위한 또는 자가면역 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 또는 면역 반응을 감소시키거나 조절하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 HSC이거나, 상기 HSC는 PGE₂와 생체외 접촉함에 의해 내인성 PD-L1의 발현을 증가시키도록 생체외 자극된다. 한 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 배양 배지를 포함하지 않는다.

한 양태에서, 본원에서는 이식 과정과 연계하여 사용하기 위한 또는 자가면역 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 또는 면역 반응을 감소시키거나 조절하는데 사용하기 위한 약물의 제조를 위한 본원에 기재된 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖고 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 배양 배지를 포함하지 않는다.

한 양태에서, 본원에서는 이식 과정과 연계하여 사용하기 위한 또는 자가면역 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 또는 면역 반응을 감소시키거나 조절하는데 사용하기 위한 약물의 제조를 위한 본원에 기재된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 HSC이거나, 상기 HSC는 PGE₂와 생체외 접촉함에 의해 내인성 PD-L1의 발현을 증가시키도록 생체외 자극된다. 한 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 배양 배지를 포함하지 않는다.

변형된 HSC 집단의 한 양태에서, 생체외 방법, 또는 본원에 기재된 조성물, 변형된 HSC 또는 PGE₂-접촉된 HSC는 각각의 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립하기 위해 추가로 분석된다. PD-L1 발현을 결정하는 방법은 예를 들어, 면역유동세포측정, 형광성-활성화된 세포 분류 (FACS) 또는 당업계에 공지된 임의의 면역검정을 사용함에 의해 그리고 RT-PCR에 의해 당업계에 공지되어 있다.

변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 본원에 기재된 조성물의 한 양태에서, 상기 변형된 HSC는 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 벡터와 접촉되지 않고 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 비-변형된 HSC인 대조군 HSC와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배 증가가 있다. 한 양태에서, 벡터와 접촉되지 않고 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 비-변형된 HSC인 대조군 HSC와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 10배 이하의 증가가 있다.

한 양태에서, 변형된 HSC는 증가된 양의 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 벡터와 접촉되지 않은 HSC이고 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 비-변형된 HSC인 대조군 HSC와 비교하여 발현된 PD-L1⁺의 양에서 적어도 1배 증가가 있다. 한 양태에서, 벡터와 접촉되지 않고 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖지 않는 비-변형된 HSC인 대조군 HSC와 비교하여 발현된 PD-L1⁺의 양에서 10배 이하의 증가가 있다.

PD-L1⁺ 발현 HSC 집단, 생체외 방법 또는 본원에 기재된 조성물의 한 양태에서, PD-L1⁺ 발현 HSC는 증가된 양의 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 비-PGE₂ 항온처리되고 자극된 HSC인 대조군 HSC와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배의 증가가 있다. 한 양태에서, 비-PGE₂ 접촉되고/항온처리되고 자극된 HSC인 대조군 HSC와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 10배 이하의 증가가 있다.

한 양태에서, 변형된 HSC는 대조군인 비-변형된 HSC에 비해 PD-L1의 발현 증가를 나타낸다.

다른 양태에서, PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 증가 또는 발현된 PD-L1의 양에서의 증가는 비교될 수 있는 대조군 비-변형된 HSC 또는 비-PGE₂ 자극된 세포 보다 적어도 1 % 높거나, 적어도 3% 높거나, 적어도 5 % 높거나, 적어도 8 % 높거나, 적어도 10 % 높거나, 적어도 20 % 높거나, 적어도 30 % 높거나, 적어도 40 % 높거나, 적어도 50 % 높거나, 적어도 60 % 높거나, 적어도 70 % 높거나, 적어도 80 % 높거나, 적어도 90 % 높거나, 적어도 1배 높거나, 적어도 2배 높거나, 적어도 5배 높거나, 적어도 10배 높거나, 적어도 100배 높거나, 적어도 1000배 높은 또는 그 이상이다.

PD-1 및 분화 279의 클러스터 (CD279)로도 공지된 프로그램화된 세포사 단백질 1은 인간에서 PDCD1 유전자에 의해 암호화된 수용체 단백질이다. PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하고 활성화된 T 세포 및 프로-B 세포 상에 발현되는 세포 표면 수용체이다. PD-1은 2개의 리간드, PD-L1 (또한 B7 동족체 1 (B7-H1) 또는 분화 274의 클러스터 (CD274)로서 공지된) 및 PD-L2에 결합한다. PD-1의 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 B7 패밀리의 구성원이다.

PD-1 및 이의 리간드는 T-세포의 활성화를 차단함에 의해 면역계를 하향조절하는데 중요한 역할을 수행한다. PD-L1/PD-1 상호작용은 T 세포의 세포독성 활성을 탈활성화하고 면역계의 억제를 유도한다. 이것은 이어서 자가면역력을 감소시키고 자기-관용성을 촉진시킨다. PD-1의 억제 효과는 조절 T 세포 (서프레서 T 세포)에서 아폽토시스를 동시에 감소시키면서 림프절에서 항원 특이적 T-세포에서 아폽토시스 (프로그램화된 세포사)의 이원 메카니즘을 통해 성취된다.

수용체 PD-1의 리간드 중 하나인 PD-L1은 CD274 유전자 (유전자 ID: 29126)에 의해 암호화된 40 kDa 1형 막관통 단백질이다. PD-L1에 대한 다른 약어 기호는 B7-H, B7H1, PD-L1, PDCD1L1, PDCD1LG1, 및 PDL1PD-L1이다. 인간 CD274 유전자는 2014년 12월 5일자 RefSeq 또는 GENBANK 어셈블리 승인 번호: GCF_000001405.28 하에 게놈 참조 콘소시엄 인간 빌드 38 패치 릴리즈 2 (GRCh38.p2)로부터의 어셈블리에 따라 위치 NC_000009.12 (5450381..5470567)에서 염색체 9 상에서 발견될 수 있다. 인간 PD-L1의 mRNA는 GENBANK 승인 번호: NM_001267706.1, NM_014143.3, BC113734.1, BC113736.1, BC074984.2 및 BC069381.1에서 발견될 수 있다.

한 양태에서, 인간 PD-L1의 mRNA는 atgaggatattt gctgtcttta tattcatgac ctactggcat ttgctgaacg ccccatacaa caaaatcaac caaagaattt tggttgtgga tccagtcacc tctgaacatg aactgacatg tcaggctgag ggctacccca aggccgaagt catctggaca agcagtgacc atcaagtcct gagtggtaag accaccacca ccaattccaa gagagaggag aagcttttca atgtgaccag cacactgaga atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg actcacttgg taattctggg agccatctta ttatgccttg gtgtagcact gacattcatc ttccgtttaa gaaaagggag aatgatggat gtgaaaaaat gtggcatcca agatacaaac tcaaagaagc aaagtgatac acatttggag gagacgtaa (서열번호 1)의 DNA 서열을 갖는 mRNA의 아이소타입 b 전구체 (변이체 2)이다. 이러한 변이체 2는 보다 짧은 전사체를 나타내고 보다 짧은 아이소타입 b를 암호화한다.

한 양태에서, 인간 PD-L1의 mRNA는 atgaggatattt gctgtcttta tattcatgac ctactggcat ttgctgaacg catttactgt cacggttccc aaggacctat atgtggtaga gtatggtagc aatatgacaa ttgaatgcaa attcccagta gaaaaacaat tagacctggc tgcactaatt gtctattggg aaatggagga taagaacatt attcaatttg tgcatggaga ggaagacctg aaggttcagc atagtagcta cagacagagg gcccggctgt tgaaggacca gctctccctg ggaaatgctg cacttcagat cacagatgtg aaattgcagg atgcaggggt gtaccgctgc atgatcagct atggtggtgc cgactacaag cgaattactg tgaaagtcaa tgccccatac aacaaaatca accaaagaat tttggttgtg gatccagtca cctctgaaca tgaactgaca tgtcaggctg agggctaccc caaggccgaa gtcatctgga caagcagtga ccatcaagtc ctgagtggta agaccaccac caccaattcc aagagagagg agaagctttt caatgtgacc agcacactga gaatcaacac aacaactaat gagattttct actgcacttt taggagatta gatcctgagg aaaaccatac agctgaattg gtcatcccag aactacctct ggcacatcct ccaaatgaaa ggactcactt ggtaattctg ggagccatct tattatgcct tggtgtagca ctgacattca tcttccgttt aagaaaaggg agaatgatgg atgtgaaaaa atgtggcatc caagatacaa actcaaagaa gcaaagtgat acacatttgg aggagacgtaa (서열번호 2)의 DNA 서열을 갖는 mRNA의 아이소타입 전구체 (변이체 1)이다. 이러한 변이체 1은 가장 긴 전사체를 나타내고 보다 긴 아이소타입 a를 암호화한다.

PD-L1은 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환 및 간염과 같은 다른 질환 상태와 같은 특정 사건들 동안에 면역계를 억제하는데 있어서 주요 역할을 수행한다. 정상적으로 면역계는 항원-특이적 CD8⁺ T 세포의 증식을 유발하는 림프절 또는 비장에서 일부 축적되는 외래 항원과 반응한다. PD-1 수용체/PD-L1 또는 B7.1 수용체/PD-L1 리간드 복합체의 형성은 림프절에서 이들 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 억제 시그날을 전달하고 여기에 보충하여 PD-1은 또한 유전자 BCL-2의 하향 조절에 의해 추가로 매개되는 아폽토시스를 통해 림프절에서 외래 항원 특이적 T 세포의 축적을 조절할 수 있다.

PD-L1 단백질은 LPS 및 GM-CSF 처리에 응답하여 마크로파아지 및 수지상 세포 (DC) 상에서, 그리고 TCR 및 B 세포 수용체 시그날 전달시 T 세포 및 B 세포 상에서 상향조절된다. PD-L1은 다양한 조직 및 세포, 예를 들어, 심장, 폐, 흉선, 비장, 신장 및 HSC에서 발현된다. PD-L1은 IFN-γ를 사용한 처리시 PA1 골수종, P815 비만세포종, 및 B16 흑색종을 포함하는 거의 모든 쥐 종양 세포주 상에서 발현된다.

한 양태에서, PD-L1을 암호화하는 핵산은 인간 PD-L1을 암호화한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, PD-L1을 암호화하는 핵산은 카피 DNA (cDNA)이다. 한 양태에서, PD-L1을 암호화하는 cDNA는 mRNA이다. 한 양태에서, mRNA은 서열번호 1 또는 2이다. 다른 양태에서, mRNA는 GenBank 승인번호: NM_001267706.1, NM_014143.3, BC113734.1, BC113736.1, BC074984.2 또는 BC069381.1로부터 유래한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 또 다른 양태에서, PD-L1을 암호화하는 핵산은 게놈 DNA이다. 한 양태에서, PD-L1을 암호화하는 게놈 DNA는 GenBank 어셈블리 승인 번호: GCF 000001405.28로부터 유래한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 핵산은 HSC 세포의 게놈으로 통합된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 핵산은 벡터를 통해 세포에 도입한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아비안 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스이다.

임의의 방법의 하나의 측면에서, 렌티바이러스는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 인간 면역결핍 바이러스 1형 (HIV-1), 인간 면역결핍 바이러스 2형 (HIV-2), 염소 관절염-뇌염 바이러스 (CAEV), 말 감염 빈혈 바이러스 (EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 소 면역결핍 바이러스 (BIV), 및 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV).

특정 양태에서, 본원에서 고려되는 벡터를 사용하여 형질도입된 세포는 유전적으로 변형된다.

다양한 양태에서, 본원에 고려되는 유전적으로 변형된 세포는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터로 시험관내 또는 생체외 형질도입되고 임의로 배양물은 생체외 증식된다. 이어서 형질도입된 세포는 유전자 치료요법을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대안적으로, 형질도입된 세포는 유전자 치료요법을 필요로 하는 대상체에게 투여되기 전에 냉동보존될 수 있다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 세포는 포유동물 세포이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.

HSC는 유기체의 일생 동안 성숙한 혈액 세포의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 조혈 선조 세포 (HPC)를 유발하는 것으로 공지되어 있다. 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 일반적으로 골수 (예를 들어, 단핵구 및 마크로파아지, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포), 및 골수 혈통 (예를 들어, T-세포, B-세포, NK-세포), 및 당업계에서 공지된 다른 것들 (문헌참조: Fei, R., et al., U.S. Patent No. 5,635,387; McGlave, et al., U.S. Patent No. 5,460,964; Simmons, P., et al., U.S. Patent No. 5,677,136; Tsukamoto, et al., U.S. Patent No. 5,750,397; Schwartz, et al., U.S. Patent No. 5,759,793; DiGuisto, et al., U.S. Patent No. 5,681,599; Tsukamoto, et al., U.S. Patent No. 5,716,827)을 포함하는 유기체의 모든 혈액 세포 유형을 유발하는 만능 줄기 세포를 언급한다. 치명적으로 조사된 동물 또는 인간으로 이식되는 경우, 조혈 줄기 및 선조 세포는 적혈구, 호중구-마크로파아지, 거핵구 및 림프구 조혈 세포 풀을 재구성할 수 있다.

성숙한 혈액 세포는 유한 수명을 갖고 일생 동안 연속적으로 대체되어야만 한다. 혈액 세포는 또한 이들 자체를 자기-재생에 의해 보충하는 능력을 갖는 만능 HSC의 매우 작은 집단의 증식 및 분화에 의해 생성된다. HSC는 중배엽 혈관모세포로부터 발생하는 만능 자기-재생 선조 세포이다. HSC는 적혈구, 림프구 및 골수 혈통으로부터의 모든 분화된 혈액 세포를 포함하는, 모든 다른 혈액 세포를 유발하는 혈액 세포이다. HSC는 성인 골수, 말초혈액 및 제대혈에 위치한다.

분화 동안에, HSC의 후손은 다양한 중간 성숙 단계를 통해 진행하여 성숙에 도달하기 전에 만능 조혈 선조 세포 및 혈통-유도 조혈 선조 세포를 생성한다. 골수 (BM)는 인간에서 주요 조혈 부위이고, 통상의 조건하에서, 단지 소수의 HSC 및 조혈 선조 세포는 말초혈액 (PB)에서 발견될 수 있다. 사이토킨(특히 과립구 콜로니-자극 인자; G-CSF), 암 치료에 사용되는 골수억제성 약물 및 조혈 세포와 BM 기질 세포 간의 상호작용을 붕괴시키는 화합물을 사용한 처리는 다수의 줄기 및 선조 세포를 신속하게 순환계로 이동시킬 수 있다.

용어가 본원에 사용된 바와 같은 "조혈 선조 세포"는 골수 (단핵구 및 마크로파아지, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구 혈통 (T-세포, B-세포, NK-세포)을 포함하는 모든 혈액 세포 유형을 유발하는 조혈 줄기 세포 혈통의 세포를 언급한다. "적혈구 혈통의 세포"는 상기 접촉된 세포가 최종 분화시 이것이 적혈구 또는 적혈구 세포 (RBC)를 형성하도록 적혈구생성을 진행하는 세포임을 지적한다. 상기 세포는 골수 조혈 선조 세포로부터 기원하는 3개의 혈통, 적혈구, 림프구 및 골수 중 하나에 속한다. 조혈 미세환경의 특정 성장 인자 및 다른 성분들로의 노출시, 조혈 선조 세포는 일련의 중간 분화 세포 유형, 적혈구 혈통의 모든 중간체를 통해 RBC로 성숙할 수 있다. 따라서, 용어가 본원에 사용된 바와 같은 "적혈구 혈통"의 세포는 조혈 선조 세포, 전적아구, 호염적아구, 적아구, 후적혈구, 망상적혈구 및 적혈구를 포함한다.

조혈 선조 세포와 유사한 HSC는 증식할 수 있고, 분화되거나 분화할 수 있는 딸 세포를 이어서 생성할 수 있는 다수의 모세포를 생성하는 능력을 갖는 보다 많은 선조 세포를 생성할 수 있다. 딸 세포 자체는 증식하고 후속적으로 하나 이상의 성숙한 세포 유형으로 분화하는 후손을 생성하도록 자극될 수 있고, 또한 하나 이상의 세포를 모계 발육 잠재력을 갖도록 유지한다. 용어 "줄기 세포"는 이어서 특정 환경하에서 보다 특수화되거나 분화된 표현형으로 분화하는 능력 또는 잠재력을 갖고 특정 환경하에 실질적 분화 없이 분화하는 능력을 보유하는 세포를 언급한다. 한 양태에서, 용어 선조 또는 줄기 세포는 이의 자손 (후손)이 흔히 분화에 의해, 예를 들어, 배아 세포 및 조직의 진행성 다양화에서 일어나는 바와 같이 완전한 개별 특성을 획득함에 의해 상이한 방향으로 특수화된, 일반화된 모 세포를 언급한다. 세포 분화는 전형적으로 많은 세포 분열을 통해 일어나는 복잡합 과정이다. 분화된 세포는 이 자체가 만능 세포 등으로부터 유래하는 만능 세포로부터 유래할 수 있다. 이들 만능 세포의 각각은 줄기 세포로 간주될 수 있고 세포 유형 각각의 생성할 수 있는 범위는 상당히 다양할 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 보다 큰 발육 잠재력을 갖는 세포를 생성하는 능력을 갖는다. 상기 능력은 고유한 것일 수 있거나 다양한 인자를 사용한 처리시 인공적으로 유도될 수 있다. 많은 생물학적 경우에, 줄기 세포는 또한 이들이 하나 이상의 고유한 세포 유형의 후손을 생성할 수 있기 때문에 "만능"이지만 이것은 "줄기세포성 (stem-ness)"에 대해서는 요구되지 않는다. 자기-재생은 줄기 세포 정의의 다른 통상적 부분이고 본원에 사용되는 바와 같이 필수적이다. 이론적으로, 자기-재생은 2개의 주요 메카니즘 중 어느 하나에 의해 일어날 수 있다. 줄기 세포는 비대칭을 분열할 수 있어 하나의 딸 세포는 줄기 상태를 유지하고 다른 딸 세포는 일부 고유한 다른 특정 기능 및 표현을 발현한다. 대안적으로, 집단 중 줄기 세포의 일부는 2개의 줄기로 대칭적으로 분열할 수 있고, 따라서, 전반적으로 집단 중에 일부 줄기 세포를 보유하고, 집단 중에 다른 세포는 단지 분화된 후손을 생성한다. 일반적으로, "선조 세포"는 보다 원시적인 (즉, 완전히 분화된 세포 보다 발육 경로 또는 진행을 따라 보다 조기 단계에 있는) 세포 표현형을 갖는다. 흔히, 선조 세포는 또한 상당한 또는 매우 높은 증식성 잠재력을 갖는다. 선조 세포는 발육 경로 및 세포가 발육하고 분화하는 환경에 의존하여 다수의 고유한 분화된 세포 유형 또는 단일 분화된 세포 유형을 생성할 수 있다.

말초혈액 선조 세포 (PBPC)는 접목을 위해 요구되는 수거의 기술적 용이함 및 보다 짧은 시간 때문에 동종이계 및 자가 이식을 위한 조혈 선조 세포 및 HSC의 바람직한 공급원이 되었다. 통상적으로, 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF)는 보다 많은 PBPC를 자극하고 골수로부터 조혈 선조 세포를 방출하기 위해 사용되어왔다. G-CSF를 사용한 용법이 건강한 공여자로부터 적당한 수의 PBPC를 수거하는데 성공하였지만, 5 % 내지 10 %는 줄기 세포를 불량하게 이동시키고 다수의 큰 용량의 성분채집술 또는 골수 수거를 요구할 수 있다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 변형 전, HSC 샘플은 골수, 탯줄, 융모막융모, 양수, 태반혈액, 제대혈 또는 말초혈액으로부터 수득된다. 한 양태에서, HSC는 골수, 탯줄, 융모막융모, 양수, 태반혈액, 제대혈 또는 말초혈액으로부터 단리된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC 샘플은 가동화 말초혈액으로부터 수득한다. 본래의 위치 또는 저장 위치로부터 HSC를 이동시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 사이토킨, 특히, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 및 HSC와 골수 (BM) 기질 세포 간의 상호작용을 붕괴시키는 화합물 (예를 들어, 플레릭사포르, 케목킨 CXCR4 길항제)를 사용한 처리는 다수의 조혈 줄기 및 조혈 선조 세포를 순환계로 신속하게 이동시킬 수 있다. 본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC 샘플은 골수, 탯줄, 융모막융모, 양수, 태반혈액, 제대혈 또는 말초혈액, 또는 가동화 말초혈액으로부터 수득된 세포로부터 선택된 CD34⁺ 세포이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 CD34⁺ 세포이다. 다른 양태에서, HSC는 CD38^lo/- 세포이다. 다른 양태에서, HSC는 c-키트⁺ 세포이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 조혈 선조 세포이다. 한 양태에서, 이들 조혈 선조 세포는 CD34⁺ 세포이다. 다른 양태에서, 이들 조혈 선조 세포는 CD38^lo/- 세포이다. 다른 양태에서, 이들 조혈 선조 세포는 c-키트⁺ 세포이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 적혈구 선조 세포이다. 한 양태에서, 이들 적혈구 선조 세포는 CD34⁺ 세포이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 적혈구 세포이다. 한 양태에서, 이들 적혈구 세포는 CD34⁺ 세포이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 본원에 기재된 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시키기 전 CD34⁺ 표면 마커에 대해 선택된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 본원에 기재된 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시키기 전 CD38^lo/- 표면 마커에 대해 선택된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 본원에 기재된 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시키기 전 c-키트⁺ 표면 마커에 대해 선택된다. 상기된 표면 마커에 대한 양성 또는 음성 선택은 예를 들어, 실시예 섹션에 기재된 항-CD34 면역자기성 비드를 사용하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 단리된 CD34⁺ HSC는 본원에 기재된 PGE₂ 조성물과 접촉시키거나 본원에 기재된 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시킨다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 HSC의 특징인 세포 표면 마커 중 적어도 하나를 갖는다: CD34⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo/-,및 C-키트/CD117⁺. 바람직하게, HSC는 이들 마커들 중 여러개를 갖는다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 CD34⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo/-, 및 C-키트/CD117⁺이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 CD133⁺이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 조혈 선조 세포는 CD133⁺이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 적혈구 혈통의 조혈 선조 세포는 적혈구 혈통의 특징인 세포 표면 마커를 갖는다. CD71 및 Ter119.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 적혈구 혈통의 특징인 세포 표면 마커를 갖는다: CD71 및 Ter119.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 CD34⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo/-, 및 C-키트/CD117⁺로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 마커 중 적어도 하나를 갖는다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 CD34⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, 및 C-키트/CD117⁺로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 마커 중 적어도 하나를 갖는다. 본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 CD38^lo/-에 대해 음성으로 선택된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC 샘플은 건강한 개체 또는 대상체로부터 수득된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체, 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체로부터 수득되거나 단리된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 T1D로 새롭게 진단된 개체로부터 수득되거나 단리된다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 진단된 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 자가면역 질환 또는 장애는 T1D이다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC와 본원에 기재된 핵산의 외신성 카피를 갖는 벡터의 접촉은 적어도 1회 반복된다. 즉, HSC와 본원에 기재된 바이러스 또는 벡터의 처음 1차 접촉 후, 상기 세포를 세척하고 수거하고, 세척된 세포는 이어서 본원에 기재된 핵산 분자를 갖는 바이러스 또는 벡터와 2차로 접촉시킨다. 이어서 이들 세포를 2차 세척하고 수거한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 접촉은 초기 1차 접촉 후 적어도 2회 반복한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 단리되거나 수거된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전 및/또는 도입 후 생체외 배양한다. 한 양태에서, 생체외 배양은 기존 세포 집단을 증식시키거나 성장시키는, 즉 유사 세포의 수를 증가시키는 작용을 한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 단리되거나 수거된 HSC는 PGE₂와의 접촉, 항온처리 또는 자극 전 생체외 배양한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 단리되거나 수거된 HSC는 PGE₂와의 접촉, 항온처리 또는 자극 후 생체외 배양한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 단리되거나 수거된 HSC는 PGE₂와의 접촉, 항온처리 또는 자극 전과 후에 생체외 배양한다.

또 다른 양태에서, 생체외 배양 증식은 사용 전, 예를 들어, 냉동보존에서 사용 전 또는 수용체 대상체로의 이식/접목에서 사용 전 수행한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전 냉동보존한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 후 냉동보존한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전과 후 냉동보존한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, HSC는 PGE₂와의 접촉, 항온처리 또는 자극 전, 또는 PGE₂와의 접촉, 항온처리 또는 자극 후, 또는 PGE₂와의 접촉, 항온처리 또는 자극 전과 후 둘 다에서 냉동보존한다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC는 생체외 배양 증식하고 이어서 사용전 냉동보존한다. 예를 들어, 대상체로의 생체외 세포 증식 및/또는 이식/접목.

본원에 기재된 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 냉동보존될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "냉동보존"은 낮은 영하의 온도, 예를 들어 (전형적으로) 77 K 또는 -196 ℃ (액체 질소의 융점)로 냉각시킴에 의한 세포의 보존을 언급한다. 냉동보존은 또한 세포를 4 내지 10 ℃의 온도에서 보존하는 것을 언급한다. 이들 낮은 온도에서, 세포사를 유도하는 생화학적 반응을 포함하는 임의의 생물학적 활성은 효과적으로 중단된다. 냉동보호제는 흔히 영하의 온도에서 사용되어 보존된 세포가 저온에서의 동결 또는 실온으로의 가온으로 인한 손상으로부터 보호한다.

동결은 대부분의 생세포에 파괴적이다. 냉각시, 외용 배지가 동결함에 따라 세포는 물을 상실함에 의해 균등화함에 따라서 세포내 용질 농도를 증가시킨다. 약 10 ℃ 내지 15 ℃ 미만에서 세포내 동결이 일어난다. 세포내 동결과 용액 효과 둘 다는 세포 손상에 관여한다 (Mazur, P., 1970, Science 168:939-949). 세포외 빙상으로부터의 동결 파괴는 본질적으로 세포의 삼투압 탈수로부터 비롯되는 세포질막 손상임이 제안되었다 (문헌참조: Meryman, H. T., et al., 1977, Cryobiology 14:287-302).

냉동보호제 및 최적의 냉각 속도는 세포 손상에 대해 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 냉동보호제는 디메틸 설폭사이드 (DMSO) (Lovelock, J. E. and Bishop, M.W.H., 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M. J., 1961, Nature 190:1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘 (Rinfret, A. P., 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576), 덱스트란, 트레할로스, CryoSoFree (Signa Aldrich Co.) 및 폴리에틸렌 글리콜 (Sloviter, H. A. and Ravdin, R. G., 1962, Nature 196:548)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 냉각 속도는 1 ℃ 내지 3 ℃/분이다. 적어도 2시간 후, T-세포는 -80 ℃의 온도에 도달하였고 장기간 냉동 저장 용기에서와 같이 영구 보존을 위해 직접적으로 액체 질소 (-196 ℃)에 위치시킬 수 있다.

본원에 기재된 변형된 HSC 집단, 생체외 방법 또는 조성물의 한 양태에서, PGE₂는 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E₂ (dmPGE₂)이다.

PD-L1 발현 HSC 및 이들 HSC를 포함하는 조성물의 용도

본원에 기재된 변형된 PD-L1 발현 HSC는 자가면역 장애의 근본 원인, 면역조절에서 결함에 근접하여 자가면역 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 변형된 PD-L1 발현 HSC는 자가면역 장애를 갖는 대상체에서 면역 반응을 조절하거나 억제하기 위해 사용된다. 한 양태에서, 자가면역 장애는 T1D이다. T1D를 갖는 대상체는 PD-L1 발현 HSC를 생성하는데 결함을 갖는다. 변형된 PD-L1 발현 HSC는 상기 결함을 보완하고 T1D를 갖는 대상체의 췌장의 β섬 세포에 대한 면역 반응을 조절하거나 억제하기 위해 사용된다. 한 양태에서, 본원에 기재된 변형된 PD-L1 발현 HSC는 T1D로 진단된 대상체에서 T1D를 치료하기 위해 사용된다. 한 양태에서, 대상체는 T1D로 새롭게 진단된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "새롭게 진단된"은 1년 미만 동안 장애에 대한 진단을 언급한다. 한 양태에서, 대상체는 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자가항체 및 섬 항원 2 자가항체를 갖는 것으로 새롭게 검출되었다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "새롭게 검출된"은 마지막 6개월에서 T1D와 관련된 자기-자가항체의 검출을 언급한다.

예를 들어, 인간 대상체는 T1D로 새롭게 진단되었다. HSC 샘플은 상기 대상체로부터 수거될 수 있다. 수득된 HSC는 본원에 기재된 과정에 대한 가용한 HSC의 수를 증가시켜 PD-L1 발현을 증가시키기 위해 생체외 증식될 수 있다. HSC 샘플은 외인성 PL-L1 cDNA로 형질감염시켜 형질감염된 HSC에서 PD-L1의 과발현을 유도할 수 있다. 대안적으로, HSC 샘플은 본원에 기재된 바와 같이 PGE₂와 생체외 접촉시켜 PGE₂-접촉된 HSC에서 증가된 PD-L1 발현을 자극할 수 있다. PGE₂와 덱사메타손과 같은 스테로이드 둘 다는 함께 PD-L1 발현을 자극하기 위해 사용될 수 있다. PL-L1 발현을 증가시키는 방법 및 PD-L1 발현 HSC의 풀을 증가시키는 방법 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 이어서 수득된 HSC는 각각 비-형질감염된 HSC 또는 비-PGE₂-접촉된 HSC와 비교하여 증가된 PD-L1 발현을 확인하기 위해 분석한다. 수득한 HSC는 추가로 생체외 증식시켜 대상체에게 재이식시키기 위해 가용한 HSC의 수를 증가시킬 수 있다. 수득한 HSC는 또한 생체외 증식시켜 냉동보존을 위해 그리고 대상체로의 재이식을 위해 가용한 PD-L1 발현 HSC의 수를 증가시킬 수 있는데, 즉, PD-L1 발현 HSC의 일부는 냉동저장에 유지시키고 또 다른 부분은 대상체로 재이식한다. HSC를 발현하는 PD-L1은 본래의 HSC가 동일한 대상체로부터 수득됨에 따라서 HSC는 대상체와 일치하는 HLA이기 때문에 수용자 대상체에 자가성이다.

예를 들어, 인간 대상체는 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자가항체 및 섬 항원 2 자가항체를 갖는 것으로 새롭게 검출되었다. 1형 당뇨병에서 베타 세포 자가면역의 마커인 4개의 자가항체는 섬 세포 항체 (베타 세포에서 세포질 단백질에 대한 ICA), 글루탐산 데카복실라제에 대한 항체 (GAD-65), 인슐린 자가항체 (IAA) 및 단백질 티로신 포스파타제에 대한 IA-2A이다. GAD 65에 대한 자가항체는 임상 제공에서 80 %의 1형 당뇨병에서 발견된다. 1형 당뇨병에 대한 진단에서 ICA 및 IA-2A의 존재는 각각 69 내지 90 % 및 54 내지 75 %이다. IAA 만연성은 당뇨병의 발병시 연령과 서로 반비례하고; 이것은 일반적으로 당뇨병에 걸릴 위험에 처한 유아 어린이에서의 제1 마커이고 진단시에 유아 어린이의 대략 70 %에서 발견된다. 대상체는 아직 T1D (즉, 고혈당증)에 대해 아직 증상이 없다. PD-L1 발현 HSC를 사용한 치료학적 방법은 상기 개체에 대한 고혈당증의 발병을 지연시키기 위해 사용된다. 고혈당증 또는 고혈당은 과량의 글루코스가 혈장에서 순환하는 병태이다. 이것은 일반적으로 혈당 수준이 11.1 mmol/l (200 mg/dl) 초과이지만 심지어 15 내지 20 mmol/l (~250 내지 300 mg/dl)와 같은 보다 높은 값일 때까지 증상이 눈에 띄기 시작하지 않을 수 있다. ~5.6 내지 ~7 mmol/l (100-126 mg/dl) (미국 당뇨병 협회 가이드라인)의 일정한 범위를 갖는 대상체는 고혈당인 것으로 간주되고 7 mmol/l (126 mg/dl) 초과는 일반적으로 당뇨병을 앓는 것으로 판단된다. 한 양태에서, 대상체는 11.1 mmol/l(200 mg/dl) 미만의 혈당을 갖는다. 또 다른 양태에서, 혈당은 15 mmol/l (~250 mg/dl) 미만 또는 20 mmol/l (300 mg/dl) 미만이다. PD-L1⁺을 투여하면 세포는 당뇨병의 발병을 지연시킬 수 있다.

본원에 기재된 변형된 PD-L1 발현 HSC는 또한 기관 또는 골수 이식 수용자인 대상체 또는 추가로 가까운 미래에 수용자가될 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 변형된 PD-L1 발현 HSC는 숙주 대 이식편 질환 (GVHD)을 예방하거나 치료하거나 예방하고 치료하기 위해 사용된다. GVHD는 유전적으로 상이한 사람으로부터 이식된 조직의 수용 후의 의학적 합병증이다. GVHD는 통상적으로 줄기 세포 또는 골수 이식과 관련되지만 상기 용어는 또한 다른 형태의 조직 이식편에 적용한다. HSC 샘플은 상기 대상체로부터 수거될 수 있다. 수득된 HSC는 본원에 기재된 과정에 대한 가용한 HSC의 수를 증가시켜 PD-L1 발현을 증가시키기 위해 생체외 증식될 수 있다. HSC 샘플은 외인성 PL-L1 cDNA로 형질감염시켜 형질감염된 HSC에서 PD-L1의 과발현을 유도할 수 있다. 대안적으로, HSC 샘플은 본원에 기재된 바와 같이 PGE₂와 생체외 접촉시켜 PGE₂-접촉된 HSC에서 증가된 PD-L1을 자극할 수 있다. PGE₂와 덱사메타손과 같은 스테로이드 둘 다는 함께 PD-L1 발현을 자극하기 위해 사용될 수 있다. PL-L1 발현을 증가시키는 방법 및 PD-L1 발현 HSC의 풀을 증가시키는 방법 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 이어서 수득된 HSC는 각각 비-형질감염된 HSC 또는 비-PGE₂-접촉된 HSC와 비교하여 증가된 PD-L1 발현을 확인하기 위해 분석한다. 수득한 HSC는 추가로 생체외 증식시켜 대상체에게 재이식시키기 위해 가용한 HSC의 수를 증가시킬 수 있다. 수득한 HSC는 또한 생체외 증식시켜 냉동보존을 위해 그리고 대상체에게 재이식시키기 위해 가용한 PD-L1 발현 HSC의 수를 증가시킬 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본원에서는 자가면역 질환 또는 장애의 예방 또는 치료하는데 사용하기 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위해, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시 지연에 사용하기 위해, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부의 예방 및 지연을 위해 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D의 치료를 위해 본원에 기재된 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물 또는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생성되는 PD-L1⁺ HSC가 제공된다.

한 양태에서, 본원에서는 자가면역 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시를 지연시키는데, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부를 예방 및 지연하는데, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하는데 사용하기 위한 약물 제조를 위한 본원에 기재된 PD-L1 발현 HSC를 포함하는 조성물 또는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생성되는 PD-L1⁺ HSC가 제공된다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 자가면역 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위해, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시 지연에 사용하기 위해, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부의 예방 및 지연에 사용하기 위해, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D의 치료를 위해 본원에 기재된 PD-L1 발현 HSC 집단 또는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생성되는 PD-L1⁺ HSC가 제공된다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 자가면역 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시를 지연시키는데, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부를 예방 및 지연하는데, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하는데 사용하기 위한 약물 제조를 위한 본원에 기재된 PD-L1 발현 HSC 집단 또는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생성되는 PD-L1⁺ HSC가 제공된다.

따라서, 한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 대조군인 비-변형된 HSC에 비해 PD-L1의 증가된 발현을 나타낸다. 한 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애에 걸린 대상체를 동정함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애를 갖는 대상체, 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체를 선택함을 추가로 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 숙주 대 이식편 질환, 또는 기관 또는 조직 이식편 거부를 예방하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 대상체는 동종이계 조직 또는 기관 이식편을 투여받았다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 대조군인 비-변형된 HSC에 비해 PD-L1의 증가된 발현을 나타낸다.

한 양태에서, 변형된 HSC는 본원에 기재된 PGE₂-자극된, PD-L1⁺ 발현 HSC이다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 본원에 기재된 PGE₂ 및 덱사메타손-자극된, PD-L1⁺ 발현 HSC이다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 1형 당뇨병의 발병개시를 지연시키는 방법이고, 상기 방법은 본원에 기재된 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 대상체는 T1D와 관련된 자기-자가항체의 검출가능한 양을 갖는 것으로 새롭게 주지되었다. 한 양태에서, 대상체는 임상적 고혈당증을 갖지 않는다. 한 양태에서, 대상체는 20세 미만의 소아 환자이다. 다른 양태에서, 대상체는 15세, 10세, 5세 및 1세 미만의 소아 환자이다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 대조군인 비-변형된 HSC에 비해 PD-L1의 증가된 발현을 나타낸다.

다양한 자가면역 질환 또는 장애는 예를 들어, 정의 부분에 기재된 것들로서 당업계에 공지되어 있다. 담당의는 당업계에 공지된 자가면역 질환 또는 장애를 진단할 수 있다.

또 다른 양태에서, 상기 방법은 면역 반응 억제를 필요로 하는 대상체를 선택함을 추가로 포함한다. 일반적으로, 고의적으로 유도된 면역억제는 신체가 기관 이식 또는 동종이식편 이식을 거부하지 못하도록 하고, 기관 또는 골수 이식 후 GVHD를 치료하거나, 전신 홍반성 루프스, 류마티스 관절염 또는 크론 질환과 같은 자가면역 질환을 치료하기 위해 수행된다. 일부 양태에서, 기관 이식은 간, 피부, 폐 이식, 췌장, 신장, 난소, 결장, 장 및 심장 이식을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 변형된 HSC가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 변형된 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 PD-L1을 발현한다. 한 양태에서, 변형된 HSC는 대조군인 비-변형된 HSC에 비해 PD-L1의 증가된 발현을 나타낸다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 변형된 HSC가 생체외 방법에 의해 제조되는 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하고, 상기 생체외 방법은 HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외신성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시킴으로써 핵산의 외인성 카피를 HSC에 도입하여 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성한다. 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립함을 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 상기 방법은 벡터와의 접촉 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립한 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 벡터와 접촉시킨 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립한 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양함을 추가로 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 PGE₂-자극된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애에 걸린 대상체를 동정함을 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애를 갖는 대상체, 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체, 또는 기관 또는 골수 이식 수용자이고 GVHD를 발병할 위험에 처한 대상체를 선택함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 대상체는 동종이계 이식편 이식을 받았다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 면역 반응 억제를 필요로 하는 대상체를 선택함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 대상체는 기관 또는 골수 이식 수용자이고 GVHD를 발병할 위험에 처해있다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서, HSC는 PGE₂와 접촉시킴에 의해 PD-L1⁺을 발현하도록 자극된다. 한 양태에서, 자극된 HSC는 대조군인 비-PGE₂-자극된 HSC에 비해 PD-L1의 증가된 발현을 나타낸다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC는 37 ℃에서 약 60분 동안 HSC 샘플을 10 μM 농도의 PGE₂와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 생체외 방법에 의해 제조된다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC는 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1 μM 농도의 PGE₂와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성함을 포함하는 생체외 방법에 의해 제조된다.

상기된 방법의 한 양태에서, 상기 방법은 상기 접촉된 세포를 세척하여 과량의 PGE₂를 제거함을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PGE₂-자극 전 HSC 샘플의 생체외 배양을 추가로 포함한다. 상기 생체외 배양은 PGE₂-자극에 대해 가용한 세포의 수를 증대시킨다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PGE₂와의 접촉 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양 또는 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 PGE₂-자극된 HSC의 생체외 배양 또는 PGE₂가 접촉한 후 PGE₂ 자극된 HSC의 생체외 배양 및 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 PGE₂ 자극된 HSC의 생체외 배양 둘 다를 추가로 포함한다. 상기 생체외 배양은 치료요법을 위해 가용한 PD-L1 발현 세포의 수를 증대시킨다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하고; 변형된 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체에게 투여하여 수용자 대상체에서 면역조절 및 면역자기-관용성을 촉진시킴을 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 벡터와 접촉시킨 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하고/하거나 PD-L1의 발현을 수득한 변형된 HSC 상에 확립한 후 수득한 변형된 세포를 생체외 배양함을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 치료 방법은 자가면역 질환 또는 장애에 걸리고 증가된 면역조절 및 면역 자기-관용성을 필요로 하는 수용자 대상체를 동정함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 치료 방법은 자가면역 질환 또는 장애를 갖는 또는 면역 반응을 억제할 필요가 있는 수용자 대상체를 선택함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 치료 방법은 공여자 대상체를 동정하고 선택하여 상기된 벡터와 접촉시키거나 PGE₂를 사용한 자극을 위해 HSC 샘플을 제공함을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 공여자 대상체 및 수용자 대상체는 동일한 대상체이고, 즉 수용자 대상체에게 자가 HSC를 투여한다. 또 다른 양태에서, 공여자 대상체 및 수용자 대상체는 상이한 대상체이다. 또 다른 양태에서, 공여자 대상체 및 수용자 대상체는 최소 HLA 유형으로 일치한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; HSC 샘플을 37 ℃에서 약 60분 동안 10 μM 농도의 PGE₂와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성하고; PGE₂-자극된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체에 투여하여 수용자 대상체에서 면역조절 및 면역자기-관용성을 촉진시킴을 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 수득한 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립함을 추가로 포함한다.

한 양태에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하거나 면역 반응을 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HSC 집단을 제공하고; HSC 샘플을 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 0.1 μM 농도의 PGE₂와 접촉시켜 PD-L1을 발현하는 PGE₂-자극된 HSC 세포 집단을 생성하고; PGE₂-자극된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체에게 투여하여 수용자 대상체에서 면역조절 및 면역자기-관용성을 촉진시킴을 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 수득한 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립함을 추가로 포함한다.

상기된 방법의 또 다른 양태에서, PGE₂-자극된 HSC는 또한 덱사메타손과 같은 스테로이드와 접촉시킨다.

상기된 방법의 또 다른 양태에서, 상기 방법은 PGE₂와의 접촉 후 수득한 PGE₂-자극된 세포를 생체외 배양하거나, 수득한 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 수득한 PGE₂-자극된 세포를 생체외 배양하거나, PGE₂와 접촉한 후 수득한 PGE₂-자극된 세포의 생체외 배양 및 수득한 PGE₂-자극된 HSC 상에 PD-L1의 발현을 확립한 후 수득한 PGE₂ 자극된 세포의 생체외 배양 둘 다를 추가로 포함한다.

한 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애에 걸리고 증가된 면역조절 및 면역 자기-관용성을 필요로 하는 수용자 대상체를 동정함을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 방법은 기관 또는 골수 이식 수용자이고 증가된 면역조절 및 면역 자기-관용성을 필요로 하는 수용자 대상체를 동정함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애를 갖는 수용자 대상체, 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 수용자 대상체를 선택함을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 치료 방법은 공여자 대상체를 동정하고 선택하여 PGE₂와 접촉시키기 위해 HSC 샘플을 제공함을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 공여자 대상체 및 수용자 대상체는 동일한 대상체이고, 즉 수용자 대상체에게 자가 HSC를 투여한다. 또 다른 양태에서, 공여자 대상체 및 수용자 대상체는 상이한 대상체이다. 또 다른 양태에서, 공여자 대상체 및 수용자 대상체는 최소로 HLA 유형이 일치한다.

한 양태에서, HSC는 벡터로 형질감염된 숙주 대상체로부터 단리되고, 배양되고 (임의의) 동일한 숙주로 재이식하고, 즉, 자가 세포 이식한다. 또 다른 양태에서, HSC는 자가면역 질환 또는 장애, 또는 T1D로 진단된 숙주 (수용자)와 HLA-유형 일치하는 공여자로부터 단리된다. 공여자-수용자 항원 유형-일치는 당업계에 널리 공지되어 있다. HLA-유형은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 및 HLA-D를 포함한다. 이들은 이식에 필요한 세포 표면 항원 일치의 최소 수를 나타낸다. 즉, 형질감염된 세포는 상이한 숙주, 즉, 수용자 숙주 대상체에 동종이계인 숙주로 이식한다. 공여자의 또는 대상체의 HSC는 벡터 또는 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 핵산으로 형질감염시킬 수 있고 형질감염된 세포는 생체외 배양 증식되고 이어서 숙주 대상체에 이식된다. 한 양태에서, 이식된 세포는 숙주 대상체에 접목한다. 형질감염된 HSC는 또한 형질감염된 후 냉동보존되고 저장될 수 있거나 세포 증식 후 냉동보존되고 저장될 수 있다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 자가면역 장애는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 갑상선염, 1형 진성 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환, 셀리악 질환, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 애디슨 질환, 및 레이노 현상, 굿페이스쳐 질환, 관절염 (류마티스 관절염, 예를 들어, 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍 또는 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 급성 면역학적 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, II형 콜라겐-유도된 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선 관절염, 스틸 질환, 척추 관절염, 및 연소성-발병개시 류마티스 관절염, 관절염 만성 진행, 관절염 변형, 다중관절염 만성 프리마리아, 반응성 관절염 및 강직성 척추염), 염증 과증식성 피부 질환, 건선, 예를 들어, 플라크 건선, 물방울모양 건건, 농포 건선 및 손톱 건선, 건초열 및 잡 증후군과 같은 아토피성 질환을 포함하는 아토피, 접촉성 피부염, 만성 접촉 피부염, 박탈성 피부염, 알레르기 피부염, 알레르기 접촉 피부염, 포진형 피부염, 화폐상 피부염, 지루성 피부염, 비-특이적 피부염, 1차 자극 접촉 피부염 및 아토피성 피부염을 포함하는 피부염, x-관련 하이퍼 IgM 증후군, 알레르기 안내 염증 질환, 만성 자가면역 두드러기, 근염, 다발성근염/피부근염, 연소성 피부근염을 포함하는 만성 알레르기 두드러기 및 만성 특발성 두드러기와 같은 두드러기, 독성 상피 괴사용해, 피부경화증 (전신 피부경화증 포함), 전신 경화증과 같은 경화증, 스피노-광학적 MS와 같은 다발성 경화증 (MS), 1차 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신 경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 운동실조 경화증, 시신경척수염 (NMO), 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론 질환, 자가면역 매개된 위장 질환, 대장염, 예를 들어, 궤양성 대장염, 대장염 궤양, 미시적 대장염, 교원성 대장염, 대장염 용종, 괴사성 장염, 및 경벽성 대장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 장 염증, 괴저성 농피증, 결절성 홍반, 1차 경화성 담관염, 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 포함하는 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액 장애, 류마티스 척추염, 류마티스 활막염, 유전성 혈관부종, 뇌수막염으로서 두개골 신경 손상, 임신 포진, 유천포창 임신, 음낭 가려움증, 자가면역 미성숙 난소 부전증, 자가면역 병태로 인한 돌발성 난청, 아나필락시스 및 알레르기 및 아토피 비염과 같은 IgE-매개된 질환, 라스무센 뇌염 및 대뇌 및/또는 뇌줄기 뇌염과 같은 뇌염, 포도막염, 예를 들어, 전포도막염, 급성 전포도막염, 육아종 포도막염, 비육아종 포도막염, 파코항원성 포도막염, 후포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신증후군의 존재 및 부재하의 사구체신염 (GN), 예를 들어, 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들어, 1차 GN, 면역-매개된 GN, 막 GN (막 신증), 특발성 막 GN 또는 특발성 막 신증, 막 또는 막 증식 GN (MPGN) (I형 및 II형 포함) 및 급속 진행 GN, 증식성 신염, 자가면역 다선성 내분비 부전증, 형질세포성 국한성귀두염을 포함하는 귀두염, 귀두포피염, 원심성환상홍반, 지속색소이상홍반, 육아종 다형태, 환상육아종, 광택태선, 경화성위축성태선, 만성 단순태선, 극상태선, 편평태선, 층판상 어린선, 표피박리 각화과다증, 전암성 각화증, 괴저성 농피증, 알레르기 병태 및 반응, 알레르기 반응, 알레르기 또는 아토피 습진을 포함하는 습진, 건조 습진, 이한성 습진, 및 소낭 건성 습진, 천식, 예를 들어, 천식 기관지, 기관지 천식, 및 자가-면역 천식, T 세포의 침윤을 포함하는 병태 및 만성 염증 반응, 임신 동안에 태아 A-B-O 혈액 그룹과 같은 외래 항원에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 접착 결핍증, 루프스, 예를 들어, 루프스 신염, 루프스 뇌염, 소아 루프스, 비-신장 루프스, 신장외 루프스, 원반모양 루프스 및 원반모양 루프스 홍역, 탈모증 루프스, 전신 홍반성 루프스 (SLE), 예를 들어, 피부형 SLE 또는 아급성 피부형 SLE, 신생아 루프스 증후군 (NLE), 및 파종 홍반성 루프스, 연소성 발병개시 (I형) 진성 당뇨병, 예를 들어, 소아-인슐린-의존성 진성 당뇨병 (IDDM), 성인 발병개시 진성 당뇨병 (II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 당뇨병 신증, 당뇨병 신병증, 당뇨병 대동맥 장애, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연 과민성과 관련된 면역 반응, 유육종증, 림프절 육아종증, 베게너 육아종증을 포함하는 육아종증, 무과립구증, 혈관염, 예를 들어, 혈관염, 대혈관 혈관염 (류마티스성 다발근통 및 거대-세포 (타카야수) 동맥염 포함), 중간-혈관 혈관염 (가와사키 질환 및 결절성 다발동맥염/ 결절성 동맥주위염 포함), 미시적 다발성동맥염, 면역혈관염, CNS 혈관염, 피부 혈관염, 과민성 혈관염, 괴사 혈관염, 예를 들어, 전신 괴사 혈관염, 및 ANCA-관련 혈관염, 예를 들어, 척-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS) 및 ANCA-관련 소혈관 혈관염, 일시적 동맥염, 자가면역 재생 빈혈, 쿰스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 혈액용해 빈혈 또는 면역 혈액용해 빈혈, 예를 들어, 자가면역 혈액용해 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (pernicious anemia (anemia perniciosa)), 애디슨 질환, 순수 적혈구 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 백혈구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출과 관련된 질환, CNS 염증 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 예를 들어, 패혈증, 외상 또는 출혈에 후속적인 것들, 항원-항체 복합체-매개된 질환, 항-사구체 기저 막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기 신경염, 베체트 질환/증후군, 캐슬맨 증후군, 굿페이스쳐 증후군, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 천포창, 예를 들어, 천포창 천포증 및 피부 천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 천포창 점액-막 천포창, 및 홍반성 천포창 포함), 자가면역 다발성 내분비병증, 라이터 질환 또는 증후군, 면역 복합 장애, 예를 들어, 면역 복합 신염, 항체-매개된 신염, 다발성신경염증, 만성 신경병증, 예를 들어, IgM 다발성신경병증 또는 IgM-매개된 신경병증, 및 자가면역 또는 면역-매개된 혈소판감소증, 예를 들어, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 예를 들어, 만성 또는 급성 ITP, 경화증, 예를 들어, 특발성 세라토-공막염, 상공막염, 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 1차 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역 갑상선염과 같은 갑상선염을 포함하는 자가면역 내분비 질환, 하시모토 질환, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브 질환, 다선성 증후군, 예를 들어, 자가면역 다선성 증후군 (또는 다선성 내분비병 증후군), 부종양 증후군, 예를 들어, 신경학적 부신생물 증후군, 예를 들어, 람버트-이튼 근무력증 증후군 또는 이튼-람버트 증후군, 스티프-맨 (stiff-man) 또는 스티프-퍼슨 (stiff-person) 증후군, 뇌척수염, 예를 들어, 알레르기 뇌척수염 또는 뇌척수염 알레르기 및 실험적 알레르기 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예를 들어, 흉선종-관련 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근긴장증, 안간대 또는 안간대 근육간대경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점 운동 신경병증, 쉬한 증후군 (Sheehan's syndrome), 자가면역 간염, 루포이드 간염, 거대-세포 간염, 자가면역 만성 활성 간염, 림프구 간질 폐렴 (LIP), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 베거 질환 (IgA 신장병증), 특발성 IgA 신장병증, 선상 IgA 피부병, 급성 발열성 호중구 피부병, 각질하 농포성 피부병, 일과성 극세포해리성 피부병, 간경병증, 예를 들어, 1차 담즙성 간경병증 및 폐경변, 자가면역 장병증 증후군, 셀리악 또는 코엘리악 질환, 셀리악 스프루 (celiac sprue) (글루텐 장병증), 내화성 스프루, 특발성 스프루, 냉글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예를 들어, 자가면역 속귀 질환 (AIED), 자가면역 청각 상실, 다발연골염, 예를 들어, 난치성 또는 재발된 또는 재발성 다발연골염, 폐 포단백질증, 코간 증후군/비매독성 간질 각막염, 벨 마비 (Bell's palsy), 스위트 질환/증후군, 주사 자가면역, 대상포진-관련 통증, 아밀로이드증, 비-암성 림프구증가증, 1차 림프구증가증, 예를 들어, 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 미결정된 유의성의 모노클로날 감마글로불린병증, MGUS), 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병증, 예를 들어, CNS, 자폐증, 염증성 근병증, 국소 또는 분절 또는 국소 분절 사구체경화증 (FSGS)의 채널병증, 내분비 눈병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역 소화기내과 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전증, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축증, 초로성 치매, 탈수초 질환, 예를 들어, 자가면역 탈수초 질환 및 만성 염증 탈수초 다중신경병증, 드레슬러 증후군, 원형 탈모증, 전두탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노이드 현상, 식도기능장애, 수지경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 예를 들어, 항-정자 항체로 인한, 혼합 연결 조직 질환, 차가스 질환, 류마티스 열, 재발성 낙태, 농부 폐, 다형 홍반, 심근후술 증후군, 쿠싱 증후군, 조류-사육자 폐 (bird-fancier's lung), 알레르기 육아종성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예를 들어, 알레르기 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질 폐 질환, 수혈 반응 (transfusion reaction), 샘프터 증후군, 카플란 증후군, 내분비염, 심근섬유증, 확산 간질 폐 섬유증, 간질 폐 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 안내염, 홍반 상승 및 이뇨, 태아 홍진, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 뇌염, 예를 들어, 만성 모양체염, 비동시성 모양체염 (heterochronic cyclitis), 홍채 모양체염 (급성 또는 만성), 또는 푸흐 모양체염, 헤노흐-쇤라인 자반증, SCID, 패혈증, 내독소증, 백신접종 후 증후군, 에반 증후군, 자가면역 생식선 부전증, 시데남 무도병 (Sydenham's chorea), 연쇄구균감염 후 신장염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수매독, 맥락막염, 거대-세포 다발근육통증, 만성 과민성 폐렴, 건성각결막염, 특발성 신장염 증후군, 최소 변화 신장병증, 양성 가계 및 허혈-재관류 손상, 이식 기관 재관류, 망막 자가면역, 아구창, 아프타성 구내염 (aphthous stomatitis), 동맥경화 장애, 비정자형성 (aspermiogenesis), 자가면역 혈액용해, 보엑 질환 (Boeck's disease), 장염 알레르기, 나성결절홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 열 류마티스, 하만-리치 질환, 감각신경 청각 상실, 국한 회장염, 백혈구 감소증, 횡단 척수염, 1차 특발성 점액수종, 안염 증상, 급성 다발신경근염, 괴저성 농피증, 후천적 비장 위축증, 백반증, 독성-쇼크 증후군, T 세포의 침윤을 포함하는 병태, 백혈구-부착 결핍증, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연 과민성과 관련된 면역 반응, 백혈구 누출과 관련된 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개된 질환, 항사구체 기저 막 질환, 알레르기 신경염, 자가면역 다중내분비병증, 난소염, 1차 점액수종, 자가면역 위축 위염, 류마티스 질환, 혼합 연결 조직 질환, 신장 증후군, 췌도염, 다발성내분비 부전증, 자가면역 다선성 증후군 I형, 성인-발병개시 특발성 갑상선기능 저하증 (AOIH), 심근염, 신장 증후군, 1차 경화 담관염, 급성 또는 만성 축농증, 사골, 전두엽, 상악골, 또는 설상골 굴염, 호산구-관련 장애, 예를 들어, 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가증-근육통 증후군, 로플러 증후군, 만성 호산구 폐렴, 풍토성 폐 호산구증가증, 호산구를 함유하는 육아종, 혈청 반응 음성의 척추관절염, 다발성내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 브루톤 증후군 (Bruton's syndrome), 유아의 일과성 저감마글로불린혈증, 위스코트-알드리치 증후군, 모세혈관확장성 실조 증후군, 혈관확장, 교원병 (collagen disease)과 관련된 자가면역 장애, 류마티스, 알레르기 과민성 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 허혈 재관류 장애, 림프구성 기관기관지염 (lymphomatous tracheobronchitis), 염증성 피부병, 급성 염증 성분을 갖는 피부염 및 자가면역 포도망막염 (AUR).

상기된 방법의 또 다른 양태에서, 상기 방법은 당뇨병 증상의 발병개시를 예방하거나 지연시키기 위해 T1D를 발병할 위험에 처한 대상체를 동정함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 개채는 당업계에 공지된 T1D와 관련된 자기-자가항체의 검출가능한 양을 갖고 있다. 하기의 문헌에 기재된 위험 인자 및 마커를 참조한다: Ping Xu and Jeffrey P. Krischer in "Prognostic classification factors associated with development of multiple autoantibodies, dysglycemia, and Type 1 Diabetes―A recursive partitioning analysis" in Diabetes Care, 2016, 39(6): 1036-1044.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 자가면역 장애는 1형 당뇨병 (T1D)이다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 대상체는 T1D로 새롭게 진단되었다.

상기 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 대상체는 T1D와 관련된 자기-자가항체, 예를 들어, GAD65 자가항체 및 섬 항원 2 자가항체를 갖는 것으로 새롭게 검출되었다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 수용자 대상체에 자가성이다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 수용자 대상체에 비-자가성이고 동종이계이다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC는 수용자 대상체에 비-자가성이고 이종성이다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득된다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 가동화 말초혈액으로부터 수득된다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 CD34⁺ 세포를 포함한다. 또 다른 양태에서, HSC 집단은 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액 또는 가동화 말초혈액으로부터 수득된 CD34⁺ 선택된 세포를 포함한다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 수용자 대상체에 자가성이다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 수용자 대상체와 최소로 HLA 유형이 일치한다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 수용자 대상체로 이식 전에, 과량의 PGE₂의 제거 후 또는 벡터를 사용한 후-형질감염 후 냉동보존하고 변형된 HSC 집단을 증식하기 위해 생체외 배양한다.

본원에 기재된 조성물 및 방법의 다른 양태에서, HSC는 생체외 배양으로 임의의 시점에 증식시켜 본원에 기재된 벡터를 사용한 형질도입을 위해 또는 PGE₂를 사용한 자극 또는 치료요법에 사용하기 위한 출발 HSC의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 생체외 배양 세포 증식은 공여자 대상체로부터 수거 후, 본원에 기재된 벡터를 사용한 형질도입 후, PGE₂와의 접촉 후, 본원에 기재된 임의의 냉동보존 단계 후 수행할 수 있다.

본원에 기재된 조성물 및 방법의 다른 양태에서, HSC의 냉동보존은 공여자 대상체로부터 수거 후, 공여자 대상체로부터 수거 후 배양 증식 후, 본원에 기재된 벡터를 사용한 형질도입 후, PGE₂와의 접촉 후, 과량의 PGE₂의 제거 후, 본원에 기재된 벡터를 사용한 형질도입 후 배양 증식 후, 또는 PGE₂와의 접촉 후 임의의 시점에 수행할 수 있다.

상기된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, HSC 집단은 수용자 대상체로의 이식 전에, 과량의 PGE₂의 제거 후 또는 벡터를 사용한 후-형질감염 후 생체외 배양으로 증식된다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 접촉 후, HSC는 사용 전에, 예를 들어, 생체외 증식 및/또는 대상체로의 이식 전에 냉동보존된다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 접촉 후, HSC는 사용 전에, 예를 들어, 냉동보존 및/또는 대상체로의 이식/접목 전에 생체외 배양 증식한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애에 걸린 대상체 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체를 동정함을 추가로 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 또 다른 양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 장애를 갖는 대상체, 또는 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체를 선택함을 추가로 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 면역 반응 조절을 필요로 하는 수용자 대상체를 선택함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체는 동종이계 이식편을 수여받았다.

기재된 방법 중 어느 하나의 또 다른 양태에서, 상기 방법은 면역 반응 억제를 필요로 하는 대상체를 동정함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체는 동종이계 이식편을 수여받았다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 면역 반응 억제를 필요로 하는 대상체를 선택함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 기관 또는 골수 이식 수용자인 개체는 동종이계 이식편을 수여받았다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단이 생체내 PD-L1⁺ 발현 후손 세포에서 분화하도록 함을 추가로 포함한다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 접촉 후, HSC는 사용 전, 예를 들어, 냉동보존 및/또는 대상체로의 이식/접목 전에 생체외 배양으로 분화시킨다.

본원에 기재된 치료학적 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 화학치료요법 및/또는 방사선은 내인성 줄기 세포를 감소시켜 이식된 세포의 접목 및/또는 재구성을 촉진시키는 것이다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나의 한 양상에서, PD-L1 발현 HSC 또는 이의 후손 세포는 추가로 프로스타글란딘 E₂ 및/또는 항산화제 N-아세틸-L-시스테인 (NAC)으로 생체외 처리하여 수용자 대상체에 이식되는 경우 세포의 후속적 접목 및/또는 재구성을 촉진시킨다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 상기 방법은 추가의 면역억제 치료요법을 대상체에 적용함을 추가로 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 추가의 면역억제 치료요법은 티모글로불린, 사이클로포스파미드 또는 티모글로불린 + 사이클로포스파미드 둘 다를 포함한다.

기재된 방법 중 어느 하나의 한 양태에서, 추가의 면역억제 치료요법은 항흉선세포 항원 (ATG) 또는 CTLA4-융합 면역글로불린 또는 둘 다를 포함한다.

일부 양태에서, 추가의 면역억제 치료요법의 비제한적 예는 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 사이클로스포린, 보클로스포린 및 타크롤리무스); CD80/86:CD28 공동자극 억제제 (CTLA4-융합 면역글로불린, 예를 들어, 아바타셉트 및 벨라타셉트); CD154:CD40 공동자극 억제제 (항-CD40 모노클로날 항체, 예를 들어, ASKP1240; Astellas); CD20 억제제 (항-CD20 항체, 예를 들어, 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 및 벨투주맙); CD22 억제제 (항-CD22 항체, 예를 들어, 에프라투주맙); B 세포 분화 억제제 (예를 들어, 벨리무맙 및 아탁시셉트); 항체-생성 혈장 세포 억제제 (예를 들어, 보르테조밉); 보체 프로세스의 억제제 (예를 들어, 에쿨리주맙); iT 또는 B 세포와 함께 면역 반응에 관여하는 사이토킨의 억제제 (예를 들어, 스테로이드, 예를 들어, 덱사메타솜, 글루코코르티코이드 및 코르티코스테로이드; 야누스 키나제 억제제, 예를 들어, 토파시티닙; IL-6 수용체 억제제, 예를 들어, 바실릭시맙; TNF 억제제, 예를 들어. 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 및 세르톨리주맙; IL-1 억제제, 예를 들어, 아니킨라, 릴로나셉트, 및 카나키누맙; 및 IL-17 억제제, 예를 들어, 세쿠키누맙); 케모킨 및 세포 접착의 억제제 (예를 들어, CCR5 수용체 길항제 마라비록, CXCR4 길항제 플레릭사포르, CCR4 인간화된 mAb 모가물리주맙, 및 CCL2 (또한 단핵구 화학주성 단백질 1로서 공지된)) 억제제 에맙티캅; 수천명의 혈장 공여자로부터 풀링된 정맥내 면역글로불린 (IVIG); 폴리클로날 항흉선세포 글로불린 (ALG) 및 항흉선세포 항원 (ATG); CD52 억제제 (항-CD25 예를 들어, 알렘투주맙); mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신, 시롤리무스 및 에베롤리무스); 및 다른 항-대사물, 예를 들어, DNA 합성 억제제, 예를 들어, 아자티오프린 (AZA), 마이코페놀레이트, 레플루노미드, 및 세포독성제, 예를 들어, 사이클로포스파미드이다.

본원의 개시내용의 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV-1, HIV-2), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV), 소 면역결핍 바이러스 (BIV), 및 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 벡터는 당업계-인지된 기술을 사용하여 작제되고 가공되어 치료요법에 사용하기 위한 이들의 안전성을 증가시키고 상기된 바와 같이 적합한 발현 요소 및 치료학적 유전자를 포함할 수 있다.

바이러스-기반 벡터의 잠재적 독성을 고려하여, 벡터는 상이한 방식으로 디자인하여 유전자 치료요법 응용에서 이들의 안전성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 필요한 렌티바이러스 유전자 (예를 들어, gag 및 pol)를, 예를 들어, 이의 내용이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 제6,365,150호에 기재된 바와 같이 별도의 벡터 상에 분리시킴에 의해 보다 안전하게 제조될 수 있다. 따라서, 재조합 레트로바이러스는 레트로바이러스 암호화 서열 (gag, pol, env)이 목적하는 유전자에 의해 대체되어 상기 레트로바이러스 복제에 결함이 있도록 작제될 수 있다. 복제 결함 레트로바이러스는 이어서 표준 기술에 의해 헬퍼 바이러스 또는 팩키징 세포주의 사용을 통해 비리온으로 팩키징된다. 재조합 레트로바이러스를 제조하기 위한 그리고 상기 바이러스를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 세포를 감염시키기 위한 프로토콜은 문헌 [참조: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 and other standard laboratory manuals]에서 발견할 수 있다.

유전자 전달 벡터로서 바이러스의 사용을 위한 주요 전제조건은 특히 세포 집단에서 야생형 바이러스의 전파 가능성과 관련하여 이들의 사용 안전성을 보장하는 것이다. 단지 복제-결함 레트로바이러스를 생성하는 개발 팩키징 세포주는 유전자 치료요법을 위한 레트로바이러스의 활용을 증가시켰고 결함 레트로바이러스는 유전자 치료요법 목적을 위한 유전자 전달에 사용하기 위해 잘 특징분석되어 있다 (검토를 위해, 문헌 (Miller, A. D. (1990) Blood 76:271)을 참조한다). 따라서, 본원의 개시내용의 한 양태에서, 팩키징 세포주는 본원의 개시내용의 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 번식시켜 벡터 바이러스의 역가를 증가시키기 위해 사용된다. 팩키징 세포주의 사용은 또한, 시스템의 사용이 재조합으로 야생형 바이러스가 생성될 가능성을 감소시킴에 따라 바이러스를 번식시키기 위한 안전한 방법으로서 고려된다. 추가로, 팩키징 단백질의 발현에 의해 유발되는 세포에 대한 독성을 감소시키기 위해, 팩키징 시스템은 바이러스의 팩키징 기능을 암호화하는 플라스미드가 예를 들어, 화학적 수단에 의해 일시적으로 형질감염되는데에만 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서, 벡터는 특정 렌티바이러스 서열을 비-렌티바이러스 서열로 대체함에 의해 보다 안전해질 수 있다. 따라서, 본원의 개시내용의 렌티바이러스 벡터는 이의 기능 (예를 들어, 바이러스 역가, 감염성, 통합 및 치료학적 유전자 발현의 고수준 및 지속기간을 부여하는 능력)이 실질적으로 감소되지 않는 한, 부분적 (예를 들어, 스플릿) 유전자 렌티바이러스 서열 및/또는 비-렌티바이러스 서열 (예를 들어, 다른 레트로바이러스로부터의 서열)을 함유할 수 있다. 바이러스 벡터로 클로닝될 수 있는 요소들은 프로모터, 팩키징 시그날, LTR(들), 폴리퓨린 트랙 및 역 반응 요소 (RRE)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원의 개시내용의 한 양태에서, LTR 영역은 바이러스 LTR 프로모터를 이종성 프로모터로 대체함에 의해 변형시킨다. 한 양태에서, 5’LTR의 프로모터는 이종성 프로모터로 대체된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는 비장 병소-형성 바이러스 (SFFV) 프로모터, 테트라사이클린-유도성 (TET) 프로모터, β-글로빈 유전자좌 조절 영역 및 β-글로빈 프로모터 (LCR), 및 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 상기 프로모터는 PD-L1의 생성을 조절하기 위한, 조절가능한 프로모터, 유도가능한 프로모터이다. 예를 들어, 테트라사이클린-유도성 또는 독시사이클린-유도성 프로모터가 있다.

일부 양태에서, 본원의 개시내용의 렌티바이러스 벡터 또는 AAV 또는 조류 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 또한 유전자 치료요법에서 유전자 전달 제제로서 벡터의 사용에서 안전성이 개선되도록 변형된 벡터를 포함한다. 본원의 개시내용의 한 양태에서, 벡터의 3’LTR과 같은 LTR 영역은 U3 및/또는 U5 영역에서 변형되고, 여기서, SIN 벡터가 생성된다. 상기 변형은 유전자 전달 목적을 위한 벡터의 안전성에서의 증가에 기여한다. 한 양태에서, 벡터는 3’LTR에서 결실을 포함하고 여기서 U3 영역의 부분이 인설레이터 요소로 대체되어 있다. 인설레이터는 벡터내 인핸서/프로모터 서열이 인근 게놈 내 유전자의 발현에 영향을 주지 않도록 그리고 그 반대의 경우도 일어나지 않도록 하고 인근 게놈 서열이 벡터내 유전자의 발현에 영향을 주지않도록 한다. 본원의 개시내용의 추가의 양태에서, 3’ LTR은 U5 영역이 예를 들어, 이상적인 폴리(A) 서열로 대체되도록 변형된다. 3' LTR, 5' LTR, 또는 3' 및 5' LTR 둘 다에 대한 변형과 같은 LTR로의 변형이 또한 본원의 개시내용에 포함되는 것으로 주지되어야만 한다.

렌티바이러스 벡터의 프로모터는 천연적이거나 (즉, 이것이 세포 생체내에 존재하는 것과 같이) 또는 특정 유전자의 5’ 플랭킹 영역과 비천연적으로 관련된 것일 수 있다. 프로모터는 진핵세포 게놈, 바이러스 게놈 또는 합성 서열로부터 유래할 수 있다. 프로모터는 비특이적 (모든 조직에서 활성)(예를 들어, SFFV), 조직 특이적 (예를 들어, LCR), 천연 조절 과정에 의해 조절되도록, 외인성으로 적용된 약물(예를 들어, TET)에 의해 조절되도록 또는 급성 단계 반응 동안에 활성화되는 프로모터 또는 단지 복제 세포에서 활성화되는 것들과 같은 특정 생리학적 상태에 의해 조절되도록 선택될 수 있다. 본원의 개시내용에서 프로모터의 비-제한적인 예는 비장 병소-형성 바이러스 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, β-글로빈 병소 조절 영역 및 β-글로빈 프로모터 (LCR), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, 사이토메갈로바이러스 이메디에이트 어얼리 프로모터, SV40 프로모터, 및 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 또한 HSC 및 이들의 후손과 같은 선택된 세포 유형에서 특이적으로 발현하는 것으로 나타난 것들로부터 선택될 수 있다. 한 양태에서, 벡터의 프로모터는 유전자 발현이 적혈구 세포에 제한되도록 세포 특이적이다. 적혈구-특이적 발현은 인간 β-글로빈 프로모터 영역 및 유전자좌 조절 영역 (LCR)을 사용함에 의해 성취된다.

당업자는 목적하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하기 위한 프로모터의 선택이 벡터, 핵산 카세트, 표적화될 세포 유형 및 목적하는 생물학적 효과에 의존함을 인지할 것이다. 통상의 기술자는 또한 프로모터의 선택에서 상기 프로모터가 생리학적 효과를 성취하기 위해 충분히 고수준의 유전자 발현을 성취하는 것; 유전자 발현의 임계적 수준을 유지하는 것; 유전자 발현의 일시적 조절을 성취하는 것; 세포 유형의 특정 발현을 성취하는 것; 유전자 발현의 약리학적, 내분비, 근거리분비 또는 자가분비 조절을 성취하는 것; 및 부적당하거나 목적하지 않은 수준의 발현을 차단하는 것을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 선택 요건의 임의의 소정의 세트는 조건에 의존하지만 일단 특정 요건이 결정되면 용이하게 결정될 수 있다. 본원의 개시내용의 한 양태에서, 프로모터는 유전자 발현이 적혈구 세포에 제한되도록 세포-특이적이다. 적혈구-특이적 발현은 인간 β-글로빈 프로모터 영역 및 유전자좌 조절 영역 (LCR)을 사용함에 의해 성취된다.

본원의 개시내용에 사용하기에 적합한 발현 벡터의 작제를 위한 표준 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고 문헌 [Michael R. Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012)]과 같은 상기 공보에서 찾을 수 있다. 다양한 전략은 DNA의 단편들을 연결시키기 위해 가용하고 상기 DNA 단편의 선택은 DNA 단편의 말단의 특성에 의존하고 이의 선택은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

세포에서 감염성 바이러스 입자의 생성을 촉진시키는 단계는 표준 세포 배양 성장 기술과 같은 통상의 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 당업자에 의해 요구되는 경우, 렌티바이러스 스톡 용액은 본원의 개시내용의 벡터 및 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 바이러스 스톡 용액을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 [참조: Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, and N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 기재되어 있다. 본원의 개시내용에서 스톡 용액을 제조하는 방법에서, 렌티바이러스-허용되는 세포 (본원에서 생산자 세포로서 언급됨)는 본원의 개시내용의 벡터 시스템으로 형질감염시킨다. 이어서 상기 세포는 적합한 세포 배양 조건하에서 성장시키고 렌티바이러스 입자는 상기된 바와 같이 세포 자체로부터 또는 세포 배지로부터 수거한다. 적합한 생산자 세포주는 인간 배아 신장 세포주 293, 말 피부 세포주 NBL-6, 및 개 태아 흉선 세포주 Cf2TH를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

감염성 바이러스 입자를 수거하는 단계는 또한 통상의 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 감염성 입자는 당업계에 공지된 바와 같이, 세포 용해, 또는 세포 배양의 상등액의 수거에 의해 수거될 수 있다. 임의로, 수거된 바이러스 입자는 목적하는 경우 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

유전자 치료요법에서 바이러스 벡터의 사용에 관한 다른 방법은 예를 들어, 문헌 [참조: Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):1385-1425; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; and Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8]에서 찾을 수 잇다.

한 양태에서, HSC 샘플은 생체외 형질감염 또는 형질도입 과정에서 10⁶ HSC 세포 당 적어도 10³ 벡터 또는 바이러스 벡터 또는 입자와 접촉시킨다. 벡터는 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는다. HSC 샘플과 접촉하는 동안 본원에 제시된 바와 같은 다른 벡터 용량 범위는 단지 예시적이고 본원에 기재된 청구된 조성물 또는 방법의 범위 또는 수행을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 한 양태에서, 상기 벡터 용량은 10³-10⁸ 바이러스 입자/10⁶ HSC 세포 범위이다. 다른 양태에서, 벡터 용량은 10³-10⁵ 바이러스 입자/10⁶ HSC 세포, 10⁴-10⁶ 바이러스 입자/10⁶ HSC 세포, 10⁵-10⁷ 바이러스 입자/10⁶ HSC 세포, 10³-10⁸ 바이러스 입자/10⁶ HSC 세포 범위이다. 한 양태에서, 상기 용량은 약 10⁴ 바이러스 입자/10⁶ HSC 세포이다.

레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 또는 조류 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터는 당업계에 널리 공지된 표준 형질감염 기술을 사용하여 HSC와 생체외 접촉시킨다.

한 양태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 또는 조류 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터는 HSC, 조혈 선조 세포 또는 적혈구의 전구체에 형질도입된다.

본원의 개시내용의 또 다른 양상은 기재된 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 양태에서, 조성물은 HSC 샘플을 형질도입하기 위해 충분한 유효량으로 렌티바이러스 벡터 또는 조류 바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 벡터 형질도입과 관련하여 "유효량"은 핵산을 암호화하는 외인성 PD-L1을 HSC로 도입하는 목적하는 결과를 성취하는데 필요한 용량 및 시기 동안 효과적인 양을 언급한다. 바이러스 벡터의 유효량은 질환 상태, 연령, 성별 및 공여자 개체의 체중 및 형질도입된 HSC에서 목적하는 반응을 유발하는 바이러스 벡터의 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 투여용량 용법은 최적의 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 유효량은 또한 바이러스 벡터의 임의의 독성 또는 치명적인 효과가 이로운 효과 보다 더 중시된다. 본원의 개시내용의 바이러스 벡터의 잠재적 독성은 세포-기반 검정 또는 당업계에 인지된 동물 모델을 사용하여 분석될 수 있고 상당한 독성을 나타내지 않는 효과적인 조절제가 선택될 수 있다.

멸균 용액은 요구되는 바와 같이 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이의 조합으로 적당한 용매 중에서 요구되는 양으로 렌티바이러스 벡터를 혼입시킴에 이어서 여과 멸균시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 배지, 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시킴에 의해 제조된다. 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이고 이는 활성 성분 + 이의 이전의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 산제를 생성시킨다.

일부 양태에서, PD-L1⁺ HSC 세포 또는 PD-L⁺ HSC 세포를 포함하는 조성물은 멸균성이고 대상체에서 치료요법을 위해 제형화된다. 한 양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간이다.

일부 양태에서, PD-L1⁺ HSC 세포 또는 PD-L1⁺ HSC 세포를 포함하는 조성물은 혈청 또는 혈장을 포함한다. 대안적으로, 상기 조성물은 냉동보존제, 예를 들어, DMSO를 포함한다.

일부 양태에서, 조성물 또는 약제학적 조성물은 전신 전달을 위해 제형화된다. 일부 양태에서, 조성물은 예를 들어, 간, 비장, 골수 및 피부에 제한되지 않는 특정 기관으로의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

추가로, 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물은 생물학적 활성제의 다른 성분, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 계면활성제 (예를 들어, 글리세리드), 부형제 (예를 들어, 락토스), 담체, 혈청, 혈장, 희석제 및 비히클과 함께 투여될 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물은 약 1×10⁶ 세포 내지 약 3×10⁶ 세포; 약 1.0×10⁶ 세포 내지 약 5×10⁶ 세포; 약 1.0×10⁶ 세포 내지 약 10×10⁶ 세포, 약 10×10⁶ 세포 내지 약 20×10⁶ 세포, 약 10×10⁶ 세포 내지 약 30×10⁶ 세포, 또는 약 20×10⁶ 세포 내지 약 30×10⁶ PD-L1 발현 세포 또는 HSC 또는 이들의 후손을 함유한다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물은 약 1×10⁶ 세포 내지 약 30×10⁶ 세포; 약 1.0×10⁶ 세포 내지 약 20×10⁶ 세포; 약 1.0×10⁶ 세포 내지 약 10×10⁶ 세포, 약 2.0×10⁶ 세포 내지 약 30×10⁶ 세포, 약 2.0×10⁶ 세포 내지 약 20×10⁶ 세포, 또는 약 20×10⁶ 세포 내지 약 10×10⁶ PD-L1 발현 세포 또는 HSC 또는 이들의 후손을 함유한다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물은 약 1×10⁶ 조혈 줄기 또는 선조 세포, 약 2×10⁶ 세포; 약 5×10⁶ 세포, 약 7×10⁶ 세포, 약 10×10⁶ 세포, 약 15×10⁶ 세포; 약 17×10⁶ 세포; 약 20×10⁶ 세포, 약 25×10⁵ 세포 또는 약 30×10⁵ PD-L1 발현 세포 또는 HSC 또는 이들의 후손을 함유한다.

수용자 대상체에게 투여되는 PD-L1⁺ HSC 세포의 용량은 PD-L1⁺ HSC의 가용한 수, HSC에서 PD-L1의 발현 수준, 투여 경로, 크기, 연령, 성별, 건강, 수용자의 체중 및 식이; 치료받는 질환의 증상의 성질과 정도, 동시 치료 종류, 치료 횟수 및 목적하는 효과를 포함하는 다양한 인자에 의존하여 달라질 것이다.

한 양태에서, PD-L1 발현 HSC의 용량은 대상체로의 이식 후 생체내 충분한 접목 및 재구성을 보장하기 위해 이식된 세포 집단에게 충분히 커야만 한다.

한 양태에서, 용량은 이식 당 적어도 1×10⁴ 세포이다. 다른 양태에서, 용량은 대상체로의 이식 당 적어도 5×10⁴ 세포, 적어도 1×10⁵ 세포, 적어도 5×10⁵ 세포, 적어도 1×10⁶ 세포, 적어도 5×10⁶ 세포, 적어도 1×10⁷ 세포, 적어도 5×10⁷ 세포, 적어도 1×10⁸ 세포, 적어도 5×10⁸ 세포, 적어도 1×10⁹ 세포, 적어도 5×10⁹ 세포, 또는 적어도 1×10¹⁰ 세포 또는 그 이상이다. 제2 또는 후속적 투여는 개체에 투여되는 초기 또는 이전의 용량과 동일하거나, 그 보다 작거나 그 보다 큰 용량으로 투여될 수 있다.

일부 양태에서, 수용자 대상체에게 투여되는 PD-L1⁺ HSC 세포의 용량은 약 적어도 0.1×10⁵ 세포/체중 kg, 적어도 0.5×10⁵ 세포/체중 kg, 적어도 1×10⁵ 세포/체중 kg, 적어도 5×10⁵ 세포/체중 kg, 적어도 10×10⁵ 세포/체중 kg, 적어도 0.5×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 0.75×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 1×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 1.25×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 1.5×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 1.75×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 2×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 2.5×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 3×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 4×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 5×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 10×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 15×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 20×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 25×10⁶ 세포/체중 kg, 또는 적어도 30×10⁶ 세포/체중 kg이고 여기서, 체중은 대상체 수용자의 체중이다.

또 다른 양태에서, 용량은 적어도 2×10⁶ 세포/수용자 대상체의 체중 kg이다. 다른 양태에서, 용량은 적어도 3×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 4×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 5×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 6×10⁶ 세포/체종 kg, 적어도 7×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 8×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 9×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 10×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 15×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 20×10⁶ 세포/체중 kg, 적어도 25×10⁶ 세포/체중 kg, 또는 적어도 30×10⁶ 세포/체중 kg이고, 여기서, 체중은 대상체 수용자의 체중이다.

또 다른 양태에서, 용량은 적어도 5×10⁶ 세포/수용자 대상체의 체중 kg 초과이다.

또 다른 양태에서, 용량은 적어도 10 x 10⁶ 세포/수용자 대상체의 체중 kg 초과이다.

제2 또는 후속적 투여가 바람직하다. 예를 들어, 제2 및 후속적 투여는 이전 투여로부터 약 1일 내지 30주 사이에 주어질 수 있다. 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 총 투여는 요구되는 만큼 개체에게 전달될 수 있다.

제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존하고 임상의의 판단 및 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.

효능 시험은 치료 과정 동안에 본원에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 병과 관련된 다수의 증상의 중증도 측정은 치료 개시 전 및 이어서 상기 치료의 개시 후 이후의 특정 기간에 주지된다. 예를 들어, 식사 후 혈중 인슐린 또는 혈당의 양.

본원의 개시내용은 하기 번호의 문단 중 어느 하나에 정의될 수 있다:

[1] 변형된 조혈 줄기 세포(HSC) 집단으로서, 여기서, 상기 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[2] 문단 1에 있어서, 상기 세포가 PD-L1을 발현하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[3] 문단 1 또는 2에 있어서, 상기 핵산이 cDNA인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[4] 문단 1 또는 2에 있어서, 상기 핵산이 게놈 DNA인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[5] 문단 4에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈으로 통합되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[6] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 핵산이 벡터를 통해 상기 세포로 도입되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[7] 문단 6에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[8] 문단 7에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[9] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[10] 문단 9에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[11] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 변형 전에, 상기 HSC 집단이 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[12] 문단 11에 있어서, 상기 HSC가 가동화된 말초혈액으로부터 수득되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[13] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC가 건강한 개체로부터 유래하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[14] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC가 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터 유래하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[15] 문단 14에 있어서, 상기 진단된 질환 또는 장애가 자가면역 질환 또는 장애인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[16] 문단 15에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 장애가 1형 당뇨병 (T1D)인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[17] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전 또는 도입 후, 또는 도입 전과 후 모두에 생체외 배양되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[18] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전 또는 도입 후, 또는 도입 전과 후 모두에 냉동보존되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[19] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 세포가 사용전 냉동보존되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[20] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 세포가 (a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시키는 단계; (b) 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하는 단계; 및 (c) PD-L1의 발현을 상기 변형된 HSC 상에 확립하여, PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[21] 문단 20에 있어서, 상기 방법이 비-변형된 세포와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배 증가가 있음을 확립하는 단계를 추가로 포함하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.

[22] 변형된 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 생체외 방법으로서, (a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시켜 상기 핵산의 상기 외인성 카피를 상기 HSC에 도입하는 단계; (b) 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하는 단계; 및 (c) PD-L1의 발현을 상기 변형된 HSC 상에 확립하여, PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.

[23] 문단 22에 있어서, 상기 방법이 비-변형된 세포와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배 증가가 있음을 확립하는 단계를 추가로 포함하는, 생체외 방법.

[24] 문단 22 또는 23에 있어서, 상기 HSC 샘플이 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득되는, 생체외 방법.

[25] 문단 24에 있어서, 상기 HSC 샘플이 가동화된 말초혈액으로부터 수득되는, 생체외 방법.

[26] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC 샘플이 건강한 개체로부터 수득되는, 생체외 방법.

[27] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC 샘플이 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터 수득되는, 생체외 방법.

[28] 문단 27에 있어서, 상기 진단된 질환 또는 장애가 자가면역 질환 또는 장애인, 생체외 방법.

[29] 문단 28에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 장애가 1형 당뇨병 (T1D)인, 생체외 방법.

[30] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인, 생체외 방법.

[31] 문단 30에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터, 조류 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스인, 생체외 방법.

[32] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 핵산이 cDNA인, 생체외 방법.

[33] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 핵산이 게놈 DNA인, 생체외 방법.

[34] 문단 33에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈으로 통합되는, 생체외 방법.

[35] 이전의 문단 중 어느 한 문단의 조혈 줄기 세포 또는 이전 방법 문단 중 어느 한 문단에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물.

[36] 대상체로 이식시키거나 대상체에서 면역 반응을 감소시키기 위한 조성물로서, 이전의 문단 중 어느 한 문단의 조혈 줄기 세포 또는 이전의 문단 중 어느 한 문단의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는, 조성물.

[37] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 따른 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법.

[38] 문단 37에 있어서, 상기 자가면역 장애가 T1D인, 방법.

[39] 문단 37 또는 38에 있어서, 상기 HSC가 상기 수용자 대상체에 자가성인, 방법.

[40] 문단 37 또는 38에 있어서, 상기 HSC가 상기 수용자 대상체에 비-자가성이고 동종이계인, 방법.

[41] 문단 37 또는 38에 있어서, 상기 HSC가 상기 수용자 대상체에 비-자가성이고 이종성인, 방법.

[42] 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, (a) HSC 집단을 제공하는 단계; (b) 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1M 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키는 단계; (c) 24시간 후 상기 PGE₂를 제거함으로써 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 단계; (d) 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절하는 단계를 포함하는, 방법.

[43] 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, (a) HSC 집단을 제공하는 단계; (b) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시키는 단계; (c) 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하는 단계; (d) PD-L1의 발현을 변형된 HSC 상에 확립하여, PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (e) 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체에 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절하는 단계를 포함하는, 방법.

[44] 문단 42 또는 43에 있어서, 상기 HSC 집단이 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득되는, 방법.

[45] 문단 44에 있어서, 상기 HSC 집단이 가동화된 말초혈액으로부터 수득되는, 방법.

[46] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체에 자가성인, 방법.

[47] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체에 동종이계인, 방법.

[48] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체에 이종성인, 방법.

[49] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체로의 이식 전에, PGE₂의 제거 후 또는 벡터를 사용해 형질감염-후 생체외 배양한 후, 냉동보존되는, 방법.

[50] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체로의 이식 전에, PGE₂의 제거 후 또는 벡터를 사용해 형질감염-후 생체외 배양한 후, 생체외 배양 증식되는, 방법.

[51] 이전의 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 면역 반응 조절을 필요로 하는 수용자 대상체를 선택함을 추가로 포함하는 방법.

[52] 자가면역 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위해, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시 지연에 사용하기 위해, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부의 예방 및 지연에 사용하기 위해, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D의 치료를 위해 문단 1 내지 21 중 어느 한 문단의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포, 또는 문단 22 내지 34 중 어느 한 문단에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물.

[53] 자가면역 질환 또는 장애의 예방 또는 치료하는데, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시를 지연시키는데, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부를 예방 및 지연시키는데, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하는데 사용하기 위한 약물 제조를 위해 문단 1 내지 21 중 어느 한 문단의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포, 또는 문단 22 내지 34 중 어느 한 문단의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물.

[54] 자가면역 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위해, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시 지연에 사용하기 위해, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부의 예방 및 지연에 사용하기 위해, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하기 위해 문단 1 내지 21 중 어느 한 문단의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포 집단, 또는 문단 22 내지 34 중 어느 한 문단의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포.

[55] 자가면역 질환 또는 장애를 예방 또는 치료에 사용하는데, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시를 지연시키는데, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부를 예방 및 지연하는데, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하는데 사용하기 위한 약물 제조를 위해 문단 1 내지 21 중 어느 한 문단의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포 집단, 또는 문단 22 내지 34 중 어느 한 문단의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포.

당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 일반 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 인자들이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 인지한다.

본원의 개시내용은 제한으로서 해석되어서는 안되는 하기의 실시예로 추가로 설명한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌의 내용 뿐만 아니라 도면과 표는 참조로 본원에 인용된다.

당업자는 단지 통상의 실험을 사용하여, 본원에 기재된 개시내용의 특정 양태에 대한 많은 등가물을 인지하거나 이를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 등가물은 하기의 청구항에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1

PD-L1 발현을 자극하기 위한 PGE ₂ 를 사용한 예시적 HSC 생체외 배양 프로토콜

CD34⁺ 세포는 자기 비드를 사용하여 환자 (혈액 20 ml)로부터 단리시키고 ~1×10⁶ 세포는 200 ㎕의 지정된 배지를 갖는 U-바닥 96웰 플레이트에 분주하였다. STFIA 배지는 10 ㎍/ml 헤파린, 10 ng/ml 인간 SCF, 20 ng/ml 인간 TPO, 10 ng/ml 인간 FGF-1, 100 ng/ml IGFBP2, 및 500 ng/ml Angptl3으로 보충된 무혈청 배지로서 정의된다. PGE₂는 0시간, 24시간, 72시간 및 6일에 배양물에 첨가하였다. 10 μM의 농도의 2 ㎕의 희석된 PGE₂의 적정액을 96-웰 플레이트 내 200 ㎕의 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 웰에서 PGE₂의 대략적 최종 농도는 0.1 μM이다. 따라서, 세포는 ~0.1 μM의 PGE₂에 노출시킨다. 24시간, 72시간 및 6일의 PGE₂의 주기적 첨가는 배양 배지에서 PGE₂를 유지시키는 작용을 한다. 세포는 5 % CO₂ 및 정상적인 수준의 O₂에서 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다.

대안적으로, 세포는 PGE₂의 부재하에 48시간 동안 동일한 조건에서 배양하고, 이후 PGE2를 첨가하고 이어서 이후 처음 첨가 후 24시간째에 첨가한다. PGE₂는 0.1 μM의 PGE₂의 동일한 대략적 최종 농도에 첨가한다. 본원 발명자는 전형적으로 PGE₂의 첨가 없이 동일한 대상체로부터 수득된 세포와 함께 동일한 조건에서 동일한 시간 동안 배양된 동일한 배지를 사용한 세포 배양과 비교하는 경우 8일의 배양 후 세포의 CD34⁺PD-L1⁺의 ~10배 증가를 관찰하였다.

건강한 대상체에서 배양하는 것 없이 0일째 수득된 CD34⁺PD-L1⁺ 세포의 백분율은 개체에서 거의 24 %이고 T1D는 8 내지 10 %이다. 상기 프로토콜은 기준선과 비교하여 PD-L1의 증가된 발현 (적어도 5배 증가)을 생성한다.

실시예 2

시험관내 쥐 연구― 쥐 HSC (Lin^-c-키트⁺Sca-1⁺, KLS)는 PD-L1을 발현한다. 본원 발명자는 FACS 분석에 의한 CXCR4 길항제-가동화 HSC의 특성을 평가하였다. Lin^-c-키트⁺Sca-1⁺ 세포는 치료 7일 및 14일 후 섬-이식되거나 순수 CXCR4 길항제-처리된 마우스로부터 분류되었다. 흥미롭게, 대부분의 양성 공동자극 분자 (CD40, CD80, CD86, PD-L2, ICOS, OX40, OX40L)는 음성이거나 거의 발현되지 않는 것으로 밝혀졌고, PD-L1은 가동화 HSC에 의해 고도로 발현되었다 (58.0±7.1 %). 추출된 HSC는 또한 CXCR34 (38.4±4.2 %)를 발현하였다. 이어서 본원 발명자는 HSC 가동화가 PD-L1⁺ HSC의 생성을 증가시키는지를 평가하였고, PD-L1⁺ HSC가 CXCR4 길항제 처리의 개시 6시간 후 B6 섬-이식된 마우스로부터 골수에서 증가하지 않았다. PD-L1 유전적 결실은 HSC 면역조절 성질을 폐지시킨다. 쥐 HSC에서 PD-L1의 면역조절 역할을 평가하기 위해, 본원 발명자는 시험관내 동종면역 반응에 대한 WT 및 PD-L1 KO 마우스로부터의 가동화 HSC의 효과를 조사하였다. 표준 MLR 검정을 수행하였고 여기서, HSC (WT B6 또는 PD-L1 KO 마우스로부터)는 응답자 세포 (B6로부터의 CD4⁺ 세포)와 동계이지만 골수-유래된 DC (BALB/c로부터)에 동종이계이다. WT B6 마우스로부터의 HSC가 배양물에 첨가되는 경우 MLR 반응을 폐지시키고 PD-L1 KO 마우스로부터의 HSC는 상기 반응을 하는데 실패하였다 (도 1). 말초 PD-L1⁺ HSC의 백분율은 B6과 비교하여 NOD 마우스에서 감소한다. 10주령 NOD 및 B6 마우스에서 말초 PD-L1⁺ KLS의 백분율은 FACS에 의해 평가하였다. PD-L1⁺ KLS의 감소는 B6 마우스 (말초 PD-L1⁺ HSC: B6=55.6±1.8 대 NOD=29.5±1.54 %; p < 0.001)와 비교하여 정상혈당 NOD (10주령)에서 명백하였다. 더욱이, PCR 분석은 PD-L1 mRNA가 NOD 마우스로부터 수득된 것들과 비교하여 B6 마우스로부터 수득된 HSC에서 상향조절되었음을 확인시켜주었다 (도 2a-2c). HSC 상에서 쥐 PD-L1 결함은 약리학적 접근법에 의해 시험관내 역전될 수 있다. 본원 발명자는 파일럿 연구를 수행하여 약리학적 근접법에 의한 시험관내 PD-L1⁺ HSC의 생성 가능성을 평가하였다. KLS 세포는 자기 비드에 의해 B6 및 NOD 마우스의 비장 세포로부터 단리하고 표준 줄기 세포 배지 + PGE₂ (2 ㎕, 10 μM)와 함께 배양하였다. 8일 후, PD-L1⁺ HSC에서 ~30 % 배수 증가는 명백하였다 (각각 B6 및 NOD KLS에서 p=0.002 및 p=0.001)(도 2d-2e).

식험관내 인간 세포 연구 ― 말초 PD-L1⁺ HSC의 백분율은 건강한 대상체와 비교하여 T1D 개체에서 감소한다. CD34⁺ 세포는 자기비드에 의해 성공적으로 정제하고 본원 발명자는 건강한 대조군 및 T1D 개체에서 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 0.05 내지 0.07 %의 CD34⁺ 세포의 백분율을 수득하였다. 건강한 대상체 (T1D=9.5 % 대 대조군=23.5 %; p<0.001)와 비교하여 T1D 개체에서 보다 적은 PD-L1⁺CD34⁺ 세포가 검출가능하였다, (도 3a-3c). PCR 분석은 PBMC로부터 이전에 단리된 CD34⁺ 세포로부터 추출된 RNA에 대해 수행하였고 PD-L1은 T1D 개체로부터 수득된 것들과 비교하여 건강한 대상체로부터 수득된 HSC에서 상향조절되었음을 확인시켜주었다. HSC 상에서 쥐 PD-L1 결함은 약리학적 접근법에 의해 시험관내 역전될 수 있다. 본원 발명자는 파일럿 연구를 수행하여 약리학적 접근법에 의한 생체외 PD-L1⁺ HSC의 생성 가능성을 평가하였다. PBMC는 Ficoll-Plaque 프로토콜을 사용하여 T1D 개체 (n=10)의 말초 혈액으로부터 단리하고 CD34⁺ 세포는 자기 비드에 의해 분류하였다. CD34⁺ 세포는 본원의 개시내용에 기재된 바와 같이 배양하였다. 7일 후, PD-L1⁺ HSC의 백분율에서 ~8배 증가가 명백하였다 (p=0.001), (도 3d-3e).

실시예 3

생체내 쥐 연구 ― PD-L1/PD-1 가교결합은 NOD 마우스에서 당뇨병 발병개시 및 스트렙토조토신화된 B6 마우스에서 섬 이식편 거부를 지연시킨다. 본원 발명자는 PD-1을 자극하기 위해 최근에 개발된 항-PD-1 mAb (하이브리도마 PIM-2, 래트 IgG2a)를 사용하여 PD-1로의 PD-L1 가교결합을 모방하였다. PIM2 Ab는 NOD 마우스에서 당뇨병의 발병개시 및 섬 동종이식편 거부 (B6로의 BALB/c)를 지연시켰다 (도 4a-4b). IPD-L1 형질도입된 KLS의 주입은 NOD 마우스에서 고혈당을 역전시켰다. KLS는 NOD 마우스의 골수로부터 단리하고 형광 마커 ZsGreen 및 PD-L1 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 293TN 생산자 세포를 감염시킴에 의해 이전에 수득된 PD-L1 슈도바이러스 입자로 형질도입하였다. 높은 농도의 바이러스를 수득한 후, KLS를 감염시킬 수 있고 후속적으로 7일 배양에서 PD-L1 형질도입된 KLS로서 증식시켰다. PD-L1의 발현은 doxa 프로모터의 제어하에 있도록 함에 따라서 독사사이클린은 형질도입된 세포 상에 PD-L1 발현을 자극하기 위해 주사될 필요가 있다. 5×10⁶ PD-L1 형질도입된 KLS는 이어서 고혈당 NOD 마우스에서 정맥내 주사하고 독사사이클린은 5일 후 주사하였다. PD-L1-형질도입된 KLS의 주사는 18.5±2.5일 동안 NOD 마우스 (n=2)에서 고혈당을 복귀시켰다 (도 5a-5b). PD-L1⁺ KLS는 시험관내 CD4-제한된 항-BDC2.5 자가면역 반응을 감소시켰다. 본원 발명자는 이미 기재된 약리학적 접근법을 사용하여 생성된 자가성 HSC의 첨가 (이펙터 세포에 대한 HSC의 1:1, 1:10, 1:100의 비)를 사용한 항-BDC2.5 자극 ELISPOT 검정에서 10주령 NOD 마우스의 비장세포로부터 추출된 CD4⁺ T 세포를 챌린지하였다. 그러나, HSC 면역조절 성질에서의 결함은 NOD 마우스에서 명백하였다.

실시예 4

기능성 인간 연구

자가 조혈 줄기 세포 이식 (AHSCT, 골수 이식으로도 공지된)은 면역계의 재건을 돕기 위해 혈액 줄기 세포의 재주입과 조합된 면역억제성 화학치료요법 치료이다. 새로운-발병개시 T1D에서의 AHSCT는 6개월째에 치료받은 개체의 거의 60 %가 정상혈당이 되도록 하였다. 48개월 동안 추적 관찰된 65명의 개체 그룹에서, 골수 비파괴성 세팅에서 AHSCT는 조건화 면역억제 (ATG+사이클로포스파미드) 및 자가 HSC의 단일 주입을 처리받은 후 처음 6개월 이내에 거의 60 %의 T1D 개체에서 인슐린 독립성을 성취하였다. 32 %의 치료받은 대상체는 이들의 추적 관찰의 마지막 시점에서 인슐린-독립적으로 유지하였다. 치료받은 대상체는 전처리와 비교하여 HbA1c에서 감소 및 C-펩타이드 수준에서의 증가를 보여주었다.

치료 후 완전한 면역 회수 (즉, 백혈구 수)에도 불구하고, 52 %의 치료받은 개체는 부작용을 경험하였다. T1D 개체의 HSC는 이들의 면역조절 성질에 결함이 있다. 본원 발명자는 본원 발명의 약리학적 접근법을 사용하여 새롭게 생성된 자가성 CD34⁺ 세포 (인간 HSC)의 첨가 (이펙터 세포에 대한 HSC의 1:1, 1:10, 1:100의 비율)를 사용한 항-CD3/-CD28 자극 검정에서 건강한 대상체의 PBMC 또는 T1D 개체로부터 추출된 CD4⁺ T 세포를 챌린지하였다. 건강한 대상체로부터 수득된 HSC의 첨가는 IFN-γ-생성 CD4⁺ T 세포의 용량-의존적 감소를 유도하였다. 반대로, 면역조절 성질에서 결함은 T1D를 갖는 개체로부터의 HSC가 부가된 경우 명백하였다. HSC는 T1D를 갖는 개체에서 손상된 가동화를 나타냈다. HSC 세포 (CD34⁺)의 가동화가 발현이 아님을 확인하기 위해, 본원 발명자는 T1D 개체에서 HSC의 가동화 성질을 평가하였다. 따라서 본원 발명자는 파두아 대학 (Padua University) (Dr. Gianpaolo Fadini)과 함께 수행된 시험 (NCT01102699)을 확립하였고, 여기서, 본원 발명자는 T1D를 갖는 6명의 개체에서 5 ㎍/kg hrG-CSF에 대한 골수 반응을 시험하였다. CD34⁺ 세포는 건강한 대조군에서 상당히 증가하였지만, CD34⁺의 손상된 가동화가 T1D 개체에서 관찰되었다. 이러한 데이터는 T1D 개체에서 HSC "모빌로퍼씨 (mobilopathy)"의 존재를 확인시켜 준다. CXCR4 길항제를 사용한 HSC 가동화는 T1D 개체의 PD-L1⁺ HSC를 증가시키지 않는다. 가동화가 HSC 상에 PD-L1의 발현을 변화시키는지를 평가하기 위해, 본원 발명자는 5명의 건강한 대상체 및 T1D를 갖는 8명의 개체에서 항-CXCR4와의 가동화 전과 후에 HSC의 면역 표현형을 연구하였다. CD34⁺ 세포 상에서 PD-L1 발현이 가동화 후 건강한 대상체에서 증가하였지만 (6.2±0.6 대 0.6±0.2, p=0.0001), 이것은 T1D 개체의 CD34⁺ 세포에서 변화하지 않았고 (4.7±1.5 대 1.5±0.8) 이는 CD34⁺ 세포가 PD-L1 결함을 복귀시키고 이들의 면역조절 성질을 복구하기 위해 시험관내 조작을 요구함을 강조한다.

실시예 5

PGE ₂ 는 쥐 및 인간 둘 다의 HSC 세포에서 PDL1 발현을 고도로 증강시킨다.

쥐: 본원 발명자는 표준 줄기 세포 성장 인자가 보충된 무혈청 배양 배지에서 단리된 HSC (KL 세포)를 배양하고 8일 배양 동안에 분화 시점에서 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)로부터 유래한 신규 소분자로 펄싱하였다. 간략하게, 말초 Lin^negSca-1⁺키트⁺ 세포는 10주령 NOD 마우스로부터 단리시켰고 150-200개를 이미 기재된 바와 같이 보충된 200 ml의 Stemspan 무혈청 배지 (Stem-Cell Technologies)를 갖는 96-웰 플레이트 상에서 각각의 웰에 분주하였다. 시험관내 쥐/인간 단리된 HSC의 증식을 수행하는 것으로 나타나고 단계 II 임상 시험에서 인간에서 지금 시험되고 있는 PGE₂를 24시간, 96시간 및 6일째에 첨가하여 (2 ㎕, 10 μM, Chemicon) 새롭게 생성된 PD-L1⁺ HSC의 풀을 집적하였다. 세포는 5 % CO₂에서 37 ℃에서 8일 동안 배양하였다.

인간: 인간 HSC는 이전에 보고된 바와 같이 인간 줄기 세포 성장 인자들이 보충된 StemSpan을 사용하여 배양하였다 (22). 간략하게, CD34⁺ 세포는 7일 동안 200 ㎕/웰에서 96웰 플레이트 상에 보충된 StemSpan에서 5×10⁵ 세포/ml로 분주하였다. HSC는 쥐 실험에서 기재된 바와 같이 PGE₂로 펄싱하였다. PD-L1⁺ HSC는 상이한 시점에서 그리고 과정의 말기에서 FACS 분석에 의해 정량하였다.

실시예 6

PD-L1 ⁺ 발현 조혈 줄기 세포를 사용한 치료 프로토콜

초기 평가 ― 환자는 기관의 지침에 따라 자가 골수 이식을 위한 표준 후처리를 진행하고 이어서 백-업 골수 (최소 2×10⁶ CD34⁺ 세포/kg)를 위해 그리고 자가성 골수 (최소 4×10⁶ CD34⁺ 세포/kg과 함께 5×10⁶ CD34⁺ 세포/kg의 표적)를 위해 사용될 최소 4주 이격된 2개의 골수 수거를 진행하였다.

백업-자가 이식편의 수거 ― 조혈 세포는 살비지 (salvage) 과정 ("백-업 이식편")으로서 작용할 미리 치료받은 환자로부터 수거되고 유전적으로 조작된 세포의 주사 6주 후 어떠한 조혈 복구가 관찰되지 않거나 조작된 세포는 방출 기준을 충족하는데 실패할 수 있다. 골수 (20 ml/kg 이하)는 유전자 치료요법 최소 4 전주에 다중 천공에 의해 양 측면 상에서 후장골능으로부터의 일반 마취하에 환자로부터 수거한다. 2×10⁶ CD34⁺ 세포/kg을 함유하는 골수 부분은 백-업 이식을 구성하는 자가 골수 수거를 위한 표준 임상적 과정에 따라 액체 질소 증기 (-162 ℃ 및 -180 ℃)에서 비조작된 상태로 동결시키고 저장한다. 수거된 것의 나머지는 CD34⁺ 세포 (하기된)에 대해 선택되고 유전자 변형 (하기된)에 사용된다.

골수 수거 ― 과량의 요구되는 백업 골수에서 제1 골수 수거의 나머지는 유전자 전달을 위해 제2 골수 수거를 사용하여 사용된다. 제2 수거는 초기 수거 후 4주 이내에 일어난다 (상기). 제2 수거 동안, 골수는 다시 다중 천공에 의한 양쪽 부위 상에 후장골능으로부터 일반 마취하에 환자로부터 수거한다. 수거한 골수의 양은 20 ml/체중 kg 이하이다. 이것은 ~4×10⁸ 세포/kg 초과의 총 핵화된 세포 계수를 제공한다. 이것은 이어서 CD34⁺ 세포 선택 후 4×10⁶ 세포/kg 초과의 CD34⁺ 세포 용량을 산출해야만 한다.

2개 수거물의 평가된 CD34⁺ 계수가 < 4×10⁶ 세포/kg인 대상체는 조건화를 수용하지 않는다. 적어도 6주의 기간 후, 대상체가 연구에 남고 싶은 경우 다시 수거될 수 있다. 형질도입된 CD34₊ 세포의 투여 전 연구로부터 철회된 대상체는 정상의 임상 케어를 재개한다 (지지성 케어 및/또는 동종이계 HSCT). 효능 및 안전성 평가는 철회된 시점으로부터 수행되지 않고 데이터는 데이터베이스에 대해 수거되지 않는다.

CD34 ⁺ 세포 정제 ― 조건화제의 세정을 위해 충분한 시간을 부여하고 사전자극 및 배양 전 시간을 최소화하기 위해, 전체 골수는 밤새 유지한다. 골수는 밀도 구배 원심분리에 의해 적혈구 고갈시킨다. CD34+ 세포는 CliniMACS 시약 및 기구를 사용하여 골수 단핵 세포로부터 양성으로 선택된다. 품질 관리 (QC) 샘플은 순도 및 멸균성을 평가하기 위해 취한다. 정제된 세포는 사전자극 및 형질도입을 위해 즉시 프로세싱한다.

사전자극 및 벡터를 사용한 형질도입된 CD34 ⁺ 세포 ― 형질도입은 1개 또는 둘 다의 수거물에 대해서 수행된다. 제1 수거물로부터 과량의 백-업 골수 표적에서 세포의 형질도입은 향후 사용을 위해 형질도입되고 동결된다. 제2 수거물은 이의 전체가 유전자 전달을 위해 사용되고 제2 수거물의 형질도입된 생성물은 조건화 후 제1 수거물로부터 해동된 형질도입된 세포와 함께 주입된다.

정제된 CD34⁺ 세포는 성장 인자 (IL-3, SCF, FLT3L, TPO)가 보충된 무혈청 배지에서 0.5-1×10⁶/ml의 밀도로 폐쇄된 배양 백에 씨딩하고 37 ℃, 5 % CO₂에서 항온처리기에 넣는다. 24-30시간 후, 세포를 수거하고 계수한다. 추가의 QC 시험은 세포 생존성 및 콜로니 형성 단위 (CFU) 검정을 포함한다. 세포는 새로운 배양 백에 전달하고 렌티바이러스 상등액으로 처리한다. 상기 제1 라운드의 형질도입을 위해, 세포는 18-24시간 동안 항온처리한다. 제2 라운드의 형질도입을 위해 렌티바이러스와 함께 세포를 이어서 수거하고 계수하고 새로운 백에 전달한다.

최종 수거 및 제형 ― 제2 라운드의 형질도입 후, 세포를 수거하고 형질 세포로 세척하고 이들의 50 내지 100 mL 용적의 최종 제형 (PLASMALYTE, 1 % HSA)으로 재현탁시켰다. QC 샘플의 제거 후 가용한 모든 세포는 환자에게 주입한다. QC는 세포 계수, 생존성, 세척 상등액 상의 멸균성, 마이코플라즈마, 상등액 상의 내독소, 표현형, CFU, RCL (취해지고 보관된 샘플), 삽입 분석 및 qPCR에 의한 평균 벡터 카피 수(배양된 세포)를 포함한다. 그람 염색을 위한 샘플은 환자에게 전달 직전 생성물로부터 취한다.

CD34 ⁺ 세포 생체외 배양 및 PGE ₂ 를 사용한 자극 ― 정제된 CD34⁺ 세포는 STFIA 배지에서 0.5-1×10⁶/ml의 밀도로 폐쇄된 배양 백에 씨딩하고 (여기서, 상기 배지는 10 ㎍/ml 헤파린, 10 ng/ml 인간 SCF, 20 ng/ml 인간 TPO, 10 ng/ml 인간 FGF-1, 100 ng/ml IGFBP2, 및 500 ng/ml Angptl3으로 보충된 무혈청 배지로서 정의된다), 37 ℃, 5 % CO₂에서 항온처리기에 위치시키고 48시간 동안 배양하였다. 상기 배지를 변화시키고 PGE₂를 세포에 첨가하여 0.1 μM의 최종 농도를 성취한다. 또 다른 24시간 후, PGE₂는 다시 세포에 첨가한다. 세포는 제2 PGE₂ 첨가 후 1 내지 8일째에 수거한다. 2일 이상의 수거 동안, PGE₂를 2일, 4일 및 6일째에 배양 배지에 첨가하고, 배양 배지를 함께 변화시킨다.

대상체 재주입 전 시험 ― 샘플은 세포 계수 및 생존능 (트립판 블루 배척 또는 균등물), 멸균, 마이코플라스마, 형질도입 효능 (벡터 카피 수), 그람 염색, 내독소 및 RCL 시험에 대한 과정 동안에 및 상기 과정의 말기에 샘플을 수거한다. 이들 중에서 단지 세포 생존능, 멸균성 (프로세스 중, 72시간), 그람 염색 및 내독소 측정은 주입전 가용하다.

미생물학적 배양이 72시간째에 그람 염색 또는 양성 배양에 의해 일시적 세균 오염을 나타내는 경우, 세포 조작 코어 설비 스태프는 PI, 보조 의학적 지시자 및 담당의는 백-업 수거물을 주입할지 또는 항생제 커버리지와 함께 생성물을 주입할지를 결정한다. 백-업 수거물이 주입되는 경우, 대상체는 프로토콜로부터 철회될 것이다. 세포 생존능이 < 70 % 미만이거나, 멸균 시험이 양성이거나 내독소가 > 5 EU/kg/hr이거나, 세포가 복귀하지 못하는 경우, 백-업 수거물은 주입되고 대상체는 프로토콜로부터 철회된다.

수거물/형질도입 둘 다로부터 생존 세포 계수가 형질도입 말기에 4×10⁶ CD34⁺ 세포/kg 이상인 경우, 세포가 주입된다. 수거물/형질도입 둘 다로부터 생존 세포 계수가 형질도입 말기에 4×10⁶ CD34⁺ 세포/kg 미만인 경우, 세포는 주입되지 않고 백-업 수거물은 48시간 후 주입된다.

CD34⁺ 세포의 샘플은 PD-L1 발현을 위해 시험될 수 있다.

형질도입된 CD34⁺ 세포의 투여 전 연구로부터 철회된 대상체는 정상의 임상 케어를 재개한다 (지지성 케어 및/또는 동종이계 HSCT). 효능 및 안전성 평가는 철회된 시점으로부터 수행되지 않고 데이터는 케이스 리포트 형태 (CRF)로 기록되지 않는다.

대상체 조건화 용법 ― 대상체는 형질도입된 세포의 주입 전, -4 내지 -2일째 투여되는, 부설판 (~4 mg/kg 정맥내 매일, 체중에 대해 조정되는 (하루 3시간 마다 투여되는))을 사용한 골수 파괴성 조건화를 적용받는다. 조건화는 골수 세포의 정제 및 형질도입과 동시에 일어난다. 부설판 수준은 투여 3일 모두에 계산되고 1일 및 2일째 수준은 체중 조정을 위해 사용된다.

형질도입된 세포의 주입 ― 세포는 통상적인 병원 조혈 줄기 세포 이식 기관 표준 지침에 따라 표준 예비수화 및 예비투약 후 30 내지 45분에 걸쳐 정맥내 주입한다. 상기 표준은 환자가 주입 전반에 걸쳐 그리고 이후 30분 동안 연속 심장, 호흡 및 산소 포화도 모니터에 있을 필요가 있다. 바이탈 사인은 수혈전, 수혈로의 15분, 주입 지속 기간 동안 매시간 및 수혈 말기에 측정되고 기록된다. RN은 수혈 처음 5분 동안 환자와 함께 유지할 것이다. 2개의 형질도입 생성물이 투여되는 경우, 제2 형질도입된 생성물은 제1 생성물 후 지체 없이 투여된다.

실시예 7

제조사 (Fate Therapeutics, Inc.)의 ToleraCyte^TM, 프로그램화된 CD34⁺/PD-L1⁺ 면역-조절 세포 생성물은 T1D 마우스를 치료하는 것으로 나타났다. ToleraCyte™은 자가면역 및 염증 장애의 치료를 위한 임상전 조사를 진행하는 프로그램화된 CD34⁺ 세포 면역치료요법이다. 상기 면역-조절 세포 치료요법은 약리학적 조절제의 적절한 배합물을 사용하여 생체외 프로그램화된 CD34⁺ 세포로 이루어진다. ToleraCyte는 염증 부위로 효과적으로 이동하는 CD34⁺ 세포의 능력을 최적화하고 PD-L1 및 IDO1을 포함하는 강력한 T-세포 조절 인자들을 발현하도록 디자인한다.

잘 확립된 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스에 대한 임상전 실험에서, 인간 1형 당뇨병 (TID)의 마우스 모델, 프로그램화된 세포 ToleraCyte^TM의 단일 투여는 NOD 마우스 모델에서 T1D 당뇨병의 지속가능한 보정을 유도한다. 고혈당 NOD 마우스는 새로운-발병개시 1형 당뇨병을 모방하도록 디자인한다. 추가로, 예비-고혈당 NOD 마우스에서, 프로그램화된 세포 ToleraCyte^TM의 단일 투여는 통계학적으로 및 유의적으로 NOD 마우스에서 T1D의 발병개시를 지연하고, 여기서, 발병개시까지의 중앙 시간 (median time)은 미처리된 마우스 (발병개시까지의 중앙 시간 = 115일; p=0.0004)와 비교하여 140일째까지 도달되지 않았다.

추가로, 1형 당뇨병의 인간화 모델에서, 프로그램화된 CD34⁺ 세포는 췌장으로의 증진된 이동 (trafficking) 및 T-세포 활성화의 조절을 보여주었다. 종합적으로, 이들 임상전 결과는 ToleraCyte™이 1형 당뇨병을 갖는 환자에 대한 질환-변형 면역치료요법으로서 작용할 수 있다는 전제를 뒷받침한다. (문헌참조: SAN DIEGO, June 11, 2016 (GLOBE NEWSWIRE)).

실시예 8

실험 디자인 및 방법

인간 연구를 위한 디자인 및 방법

환자 특성 ― 혈액 샘플은 기관 검토부 위원회 승인하에 기관 (San Raffaele Scientific Research Institute)에 따라 새로운 발병개시 당뇨병 개체 (새로운-발병개시 T1D), 장기 당뇨병 개체 (T1D) 및 건강한 개체 (CTRL)로부터 수득하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 분획은 세포 배양 실험을 위해 Ficoll 밀도 농도구배 원심분리에 의해 단리하였다. 추가의 혈액 샘플은 파도바의 기관 검토부 위원회 (2996P)에 따라 치료 전 기준선에서 및 0.24 mg/kg의 체중 용량으로 CXCR4-길항제 (Mozobil; Sanofi)를 사용한 치료 후 6시간째에 T1D 대상체 및 CTRL로부터 수득하고 기관 (Declaration of Helsinki (Clinical trial registered on clinicaltrials.gov (NCT02056210))에 따라 수행하였다. 18세 내지 65세의 1형 당뇨병을 갖는 환자는 파도바의 대학 병원의 당뇨병 외래환자 클리닉에 위탁된 환자 중에서 채용하였다. 18세 내지 65세의 당뇨병이 없는 개체는 다른 대사 질환의 스크리닝을 위해 동일한 외래환자 클리닉에 위탁된 환자 중에서 채용하였다. 모두는 서면 통지된 동의서를 제공받았다. 배제 기준은 임신 또는 수유기; 최근 (연구 진입으로부터 2개월 이내) 수술, 외상, 또는 급성 질환; 면역 질환 (1형 당뇨병 및 자가면역 갑상선염을 제외하고); 만성 감염성 질환; 과거 또는 현재의 혈액학적 악성종양; 공지되거나 강하게 의심되는 고형 종양; 백혈구 증가증, 백혈구 감소증, 또는 혈소판 감소증; 고형 기관 이식 또는 면역억제; 간 기능의 변화 (트랜스아미나제 > 정상의 2 상한치); 중증 만성 당뇨병 미소- 또는 대혈관증; HbA_1c>11 %; 신장 기능에서의 결손 (추정된 사구체 여과율 < 50 mL/min/1.73 m²); 말초 림프구 면역표현형의 유의적 비정상; 플레릭사포르 (plerixafor) 또는 이의 부형제에 대한 공지된 고민감성; 및 통지된 동의서의 제공 거절 또는 무능력이다. 경구 피임을 한다면 임신 가능성이 있는 여성도 연구에 참여할 수 있고 음성 임신 시험은 연구 진입 전에 요구되었다. 여성은 또한 플레릭사포르 투여 후 3개월 동안 경구 피임을 계속하도록 요구받았다. 당뇨병 치료 및 다른 의학적 병태를 위한 모든 약물은 연구 동안에 허용되었다.

인간 항체 ― 하기의 항체는 보고된 연구에서 유동 세포측정 분석을 위해 사용하였다: 피코에리트린 (PE)-접합된 항-인간 PD-L1 (CD274) 또는 알로피코시아닌 (APC)-표지된 항-인간 PD-L1 (CD274), PE-접합된 항-인간 PD-1 (CD279), PE-접합된 항-인간 PD-L2 (CD273), PE-접합된 또는 R-피코에리트린시아닌 5.1 (PC5) 접합된 항-인간 CD34, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합된 항-인간 CD45, PE-접합된 항-인간-CD19, 페리딘-클로로필-단백질 복합체 (PerCP)-접합된 항-인간 CD11c 및 퍼시픽 블루 (PB)-접합된 항-인간 Cd16은 제조사 (BD Biosciences, Biolegend or Beckman Coulter)로부터 구입하였다. 하기의 항체는 상기 언급된 인간 항체에 대한 상이한 아이소타입 대조군에 상응하였다: PE-접합된 마우스 IgG1κ, 마우스 PC5-접합된 IgG1, APC-표지된 마우스 IgG2bκ.

인간 유동 세포측정 분석 ― 인간 HSC 상에서 PD-L1, PD-L2 및 PD-1 발현을 평가하기 위해, 건강한 개체로부터 수거된 새로운 혈액, T1D 및 새로운-발병개시 T1D 개체는 PE-Cy5.5 항-인간 CD34, PE 항-인간 PD-L1 또는 PD-L2 또는 PD-1 (BD Biosciences)로 염색하였다. 새로운 혈액은 또한 PE 항-인간 PD-L1과 함께 PECy7 항-인간-CD19, APC 항-인간 CD11c 또는 퍼시픽 블루 항-인간 CD16 (모두 BD Biosciences)으로 염색하여 각각 B 세포, 수지상 세포 또는 단핵구 상에서 PD-L1 발현을 평가하였다. BD LSRFortessa 유동 세포측정기 (BD Biosciences)를 사용하여 줄기 세포 또는 림프구의 광 산란 성질로 세포를 분석하였다. 배경 염색은 비-반응성 세포의 99 %를 배제하기 위해 위치된 게이트와 함께 비반응성 아이소타입-일치된 대조군을 사용하여 결정하였다. FlowJo 소프트웨어 버젼 8.7.3 (Treestar, Ashland, OR)은 분석을 위해 사용하였다. 아폽토시스는 이전에 단리된 CD34⁺ 세포를 침투시키고 이어서 상기 세포를 APC Annexin V (BD Bioscience)로 염색시킴에 의해 평가하였고, 죽은 세포는 고정 가능한 생존능 염료 염색 (Amcyan, eBioscience)을 사용하여 검출하였다.

인간 CD34 ⁺ 세포의 시험관내 증식 검정 및 글루코스 챌린지 ― CD34⁺ 세포는 먼저 등록된 대상체의 혈액 샘플로부터 수득된 PBMC로부터 자기 비드 (Milteny kit)를 사용하여 단리하였다. 이어서, CD34⁺ 세포는 CFSE (FITC, Invitrogen C1157)으로 염색시키고 StemSpam SFEM II 배지 (StemCell Technologies)에서 5 % CO₂에서 72시간 동안 배양하였다. 증식은 24h, 48h 및 72h에 염료 희석에 따라 유동 세포측정에 의해 가시화하였다. 글루코스 노출이 CD34⁺ 세포 상에서 PDL-1 발현에 영향을 주는지를 평가하기 위해, 본원 발명자는 상이한 글루코스 농도 (5 mM, 20 mM 및 35 mM)에서 72시간 동안 혈청 없이 DME에서 CTRL 및 T1D로부터 수득된 PBMC로부터 이전에 단리된 CD34⁺ 세포를 배양하였다. PDL-1 발현은 이전에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 평가하였다.

인간 HSC CD34 ⁺ HSC의 약리학적 조절 ― 1×10⁶의 단리된 인간 CD34⁺ HSC 세포는 5 % CO₂에서 37 ℃에서 U-기저 96-웰 플레이트에서 재조합 인간 SCF (50 ng/ml), 재조합 인간 TPO (50 ng/ml), 재조합 인간 FLT3-L (50 ng/ml), 인간 IFN-β (1000 U/ml), 인간 IFN-γ (5 ng/ml) 및 인간 폴리이노신산-폴리시티딜산 (Poly I:C) (1 ㎍/ml)이 보충된 200 ㎕의 StemSpan SFEM II 배지에서 배양하였다. PD-L1 발현은 항-인간 CD34 및 항-인간 PD-L1을 사용하고 이들의 상응하는 아이소타입 대조군과 함께 유동 세포측정에 의해 24시간의 배양 전과 후에 평가하였다.

인간 ELISpot 검정 ― ELISPOT 검정을 사용하여 본원 발명의 그룹에 의해 이전에 보여진 바와 같이 제조업자의 프로토콜 (BD Biosciences, San Jose, CA)에 따라 IFN-γ-생성 세포의 수를 측정하였다 (16). T1D 환자로부터 단리된 1×10⁶ PBMC는 10 % FBS가 보충된 RPMI 배지에서 IA-2 (100 ㎍/ml) 펩타이드의 존재하에 48시간 동안 배양하였다. 자극 후 1일째에, 500 ㎕의 배지를 상기 배양물에 첨가하였다. 세포는 2일째 수거하고 비보충된 RPMI 배지에서 1:1, 1:2, 1:4, 또는 1:8의 비로 CD34⁺ HSC, 트리펙타-조절된 CD34⁺ HSC의 존재 또는 부재하에 인간 IFN-γ ELISpot 검정에 분주하였다. 스팟은 A.El.VIS Elispot 판독기 (A.EL.VIS GmbH, Hannover, Germany) 또는 면역스팟 판독기를 사용하여 계수하였다.

웨스턴 블롯 ― 장 생검 샘플의 총 단백질은 램리 (Laemmli) 완충액 (Tris-HCl 62.5 mmol/l, pH 6.8, 20 % 글리세롤, 2 % SDS, 5 % β-머캅토에탄올) 중에서 추출하고 이들의 농도를 측정하였다 (Lowry et al., 1951). 35 ㎍의 총 단백질은 7 % SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하고 니트로셀룰로스 (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) 상에 블롯팅하였다. 이어서 블롯은 폰소 에스 (Ponceau S)로 염색시켰다. 막은 TBS (Tris [10 mmol/l], NaCl [150 mmol/l]), 0.1 % Tween-20, 5 % 탈지 분유, pH 7.4 중에서 25 ℃에서 1시간 동안 블록킹하고 1:200으로 희석된 폴리클로날 염소 항-인간 Pdcd-1L1 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 또는 4 ℃에서 TBS-5 % 밀크에서 1:1000으로 희석된 모노클로날 마우스 항-β-액틴 항체 (Santa Cruz Biotechnology)와 12시간 동안 항온처리하고, TBS-0.1 % Tween®-20으로 4회 세척하고, 이어서 TBS-5 % 밀크 중에서 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology)으로 희석된 퍼옥시다제-표지된 마우스 항-염소 IgG 2차 항체 (또는 β-액틴에 대한 토끼 항 마우스)로 항온처리하고 최종적으로 TBS-0.1 % Tween-20으로 세척하였다. 수득한 밴드는 증진된 화학발광을 사용하여 가시화하였다 (SuperSignal; Pierce, Rockford, IL, USA).

qRT-PCR ― 단리된 CD34⁺ 세포로부터의 RNA는 Trizol® 시약 (Invitrogen)을 사용하여 추출하고, qRT-PCR 분석은 제조업자의 지침에 따라 TaqMan 검정 (Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 수행하였다. 정상화된 발현 값은 ΔCt 방법을 사용하여 결정하였다. 정량적 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR) 데이터는 ACTB의 발현에 대해 정상화하고, ΔCt 값을 계산하였다. 통계학적 분석은 원-웨이 ANOVA에 이어서 목적하는 집단과 모든 다른 집단 간의 다중 비교를 위한 본페로니 후-시험 (Bonferroni post-test)을 통해 각각의 환자에 대한 모든 세포 집단에 걸친 유전자 발현을 비교하였다. 통계학적 분석은 또한 소프트웨어 가용한 RT² 프로필러 PCR 어레이 데이터 분석 (Qiagen)을 사용함에 의해 수행하였다. 2개의 그룹 비교를 위해 스튜던트 t 검정을 사용하였다. 분석은 새로운 CD34⁺ 세포의 단리 후 3회 수행하였다. 사용된 프라이머의 주요 특성을 하기에 보고한다:

공초점 현미경 ― 골수는 1형 당뇨병 개체로부터 그리고 건강한 대조군 대상체로부터의 절개하고 이어서 상응하는 항체로 염색시킨다. 이미지는 Zeiss LSM 510 Meta 공초점 현미경 (Carl Zeiss SpA) 상에서 캡쳐하였다. 염색 과정의 세부 사항은 보충 과정에서 발견될 수 있다.

쥐 연구를 위한 디자인 및 방법

동물 ― 암컷 NOD/ShiLtJ (NOD) 및 수컷 C57BL/6J 마우스는 제조사 (The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me))로부터 구입하였다. 모든 마우스는 기관의 지침에 따라 사용하고 동물 프로토콜은 기관 (Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.

당뇨병 모니터링 ― 현성 당뇨병은 연속 2일 동안 250 mg/dL 초과의 혈당 수준으로서 정의되었다. 혈당은 브리즈2 (Bayer S.p.A., Viale Certosa, Milano, Italy) 혈당 측정기를 사용하여 측정하였다.

역전 연구 ― 암컷 NOD 마우스는 10주령에서 개시하여 모니터링하고 고혈당 (> 250 mg/dl) 2일째에 KL-PD-L1로 주사하였다. Tg 세포, 또는 HSC-비조절된 세포, HSC-모의-형질도입된 세포 또는 트리펙타로 조절된 HSC (상기 설명 참조)는 정맥 꼬리를 통해 3×10⁶ 세포로서 투여하였다. 마우스는 희생시 때까지 혈당을 측정함에 의해 매일 모니터링하고 (정상혈당은 처리 후 다음 날 250 mg/dl 미만으로 관찰되었다) 측정은 국가 기관의 건강 지침에 따라 꼬리 채혈에 의해 수행하였다. 골수 세포는 인산 완충 식염수 (PBS)로 세정함에 의해 NOD 및 C57BL/6J 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 수득하였다. 골수 세포는 혈통 음성 고갈 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용함에 의해 혈통 고갈되었다. 고갈시, 혈통 음성 c-키트⁺ 세포는 제조업자의 지침에 따라 CD117 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 단리하였다.

쥐 유동 세포측정 항체 ― 하기 항체는 골수 및 비장으로부터 추출된 KL의 표현형 특성을 평가하기 위한 유동 세포측정 분석을 위해 사용하였다: 피코에리트린 (PE)-접합된 항-인간 PD-L1 (CD274) 또는 알로피코시아닌 (APC)-접합된 래트 항-마우스 PD-L1 (CD274), 피코에리트린 (PE)-접합된 래트 항-마우스 PD-1 (CD279), 피코에리트린 (PE)-접합된 래트 항-마우스 PD-L2 (CD273)는 각각 제조사 (BD Biosciences 또는 Biolegend)로부터 구입하였다. 하기의 항체는 상기 언급된 쥐 항체에 대한 상이한 아이소타입 대조군에 상응하였다: PE 마우스 IgG1, κ아이소타입 Ctrl; 및 APC 마우스 IgG2b, κ아이소타입 Ctrl.

쥐 KL 특징분석의 면역표현형 특징분석 ― 골수로부터 이전에 추출된 쥐 KL 세포는 200 ㎕의 완충액 중에 현탁시키고 이어서 후속 항체로 염색시키고 제조업자의 지침에 따라서 4 ℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포는 완충액으로 세척하고 10분 동안 300 g에서 원심분리하고 300 ㎕의 완충액 중에 현탁시켰다. 하기의 항체는 염색을 위해 사용하였다; 래트 항-마우스 CD274 또는 CD273 또는 항-마우스 CD279. KL 세포 상에서 PD-L1, PD-L2 및 PD-1 발현은 히스토그램으로서 나타냈다.

8주 NOD 및 B6 마우스로부터 추출된 골수는 ACK-용해 완충액 (BD 용해 완충액)을 사용한 적혈구 용해에 이어서 유동 완충액 (BD 염색 완충액) 중에서의 세척 단계에 적용하였다. 골수 세포는 하기의 항체 칵테일로 염색하였다:

항-혈통 음성 칵테일-APC, 항-C-키트-PerCP, 항-Sca1-FITC, 항-CD150-PE, 항 CD41FITC, 항-CD48-PerCP, 항-CD244 PerCP, 항-PD-L1-PE 및 항-PD-L1-APC. 모든 항체는 제조사 (eBioscience 및 BD Pharmingen)로부터 구입하였다. 샘플은 4 ℃에서 암실에서 30분 동안 항온처리하고 이어서 유동 배지로 다시 세척하고 궁극적으로 포르말린 1 %로 고정시켰다. 샘플은 FACS 캘리버에서 조사하고 결과는 Flowjo 소프트웨어를 사용하여 분석한다.

유동 세포측정 분석, 비-조혈 줄기 세포 특징 분석 ― 샘플 당 1×10⁶ 세포는 항-마우스 B220-PE로 염색하여 B 세포를 평가하고 수지상 세포는 항 CD11c-PerCP로 결정하고 단핵구는 항-마우스 F4/80 APC로 결정하였다. B220⁺ 세포, CD11c⁺ 세포 및 CD16⁺ 세포에서 PD-L1 발현은 항-마우스 CD274-PE를 사용함에 의해 평가하였다. 간략하게, 단리된 골수 세포 및 비장세포는 유동 배지 (2 %의 FCS 및 0.05 %의 아지드화나트륨과 함께 PBS)에서 세척하고 적당히 희석된 유동 항체로 염색시켰다. 샘플은 4 ℃에서 암실에서 30분 동안 항온처리하고 이어서 유동 배지로 다시 세척하고 궁극적으로 포르말린 1 %로 고정시켰다. 샘플은 FACS 캘리버에서 조사하고 결과는 Flowjo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 항-마우스 CD11c-PerCP는 제조사 (Biolegend)로부터 구입하였고 항-마우스 F4/80 APC는 제조사 (eBioscience)로부터 구입하였고 사용된 항-마우스 PD-L1은 제조사 (BD Pharmingen)로부터 구입한다.

아폽토시스 검정 ― 단리된 KL 세포는 냉 PBS로 2회 세척하고 이어서 1×10⁶ 세포/ml의 농도에서 1× 결합 완충액 (성분 번호 51-66121E; BD Pharmingen) 중에서 재현탁시킨다. 이어서, 100 ㎕의 용액 (1×10⁵ HSC 함유)을 5 ml의 배양 튜브로 옮기고 5 ㎕의 PE Annexin V 및 5 ㎕의 7-AAD를 사용한 염색에 이어서 세포의 볼텍싱 및 암실에서 실온 (25 ℃)에서 15분 동안 항온처리함에 의해 진행하였다. 항온처리 후, 각각의 튜브에 대한 400 ㎕의 1× 결합 완충액을 유동 세포 측정에 의한 이들의 획득 전 각각의 튜브에 첨가하였다. 하기의 대조군을 사용하여 보상 및 사분면을 설정하였다: 비염색된 세포, PE Annexin V (7-AAD 부재)를 사용하여 염색된 세포 및 7-AAD (PE Annexin V 부재)를 사용하여 염색된 세포. PE Annexin V에 대해 양성으로 염색되고 7-AAD에 대해 음성으로 염색된 세포는 아폽토시스를 진행하였다. PE Annexin V 및 7-AAD 둘 다에 대해 양성으로 염색된 세포는 아폽토시스의 최종 단계에 있거나 괴사를 진행하거나 이미 죽었다. PE Annexin V 및 7-AAD 둘 다에 대해 음성으로 염색된 세포는 생존해 있고 측정가능한 아폽토시스를 진행하지 않는다.

시험관내 증식 검정 ― 단리된 KL 세포는 FSC 없이 냉 PBS 완충액으로 2회 세척하고 이어서 3×10⁷ 세포/ml의 최종 절반 용적의 완충액 중에 재현탁시키고 나머지 절반의 용적은 CFSE로 첨가하여 10 μM의 최종 농도에 도달하도록 하였다. 희석된 CFSE는 세포 현탁액에 첨가하고 이어서 볼텍싱하고 15분 동안 37 ℃에서 항온처리한다. 항온처리 후, FCS는 임의의 나머지 유리된 CFSE를 켄칭하기 위해 세포 현탁액에 첨가하고 상기 튜브는 PBS 완충액으로 완전히 채운다. 제2 세척 후, 세포는 배지에 재현탁시키고 5 % CO₂에서 37 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 72시간 후, KL 세포의 증식은 염료 희석에 따라 유동 세포측정으로 가시화할 수 있다.

쥐 ELISpot 검정 ― ELISPOT 검정을 사용하여 본원 발명의 그룹에 의해 이전에 보여진 바와 같이 제조업자의 프로토콜 (BD Biosciences, San Jose, CA)에 따라 IFN-γ-생성 세포의 수를 측정하였다 (16). NOD-처리된 마우스 (NOD-PD-L1.Tg 처리된, NOD-트리펙타-처리된, NOD-KL-처리된) 및 NOD-미처리된 마우스로부터 단리된 1×10⁶의 비장 세포는 하기의 쥐 섬 펩타이드 (150 ㎍/ml)의 존재하에 24시간 동안 배양하였다: BDC2.5, IGRP, GAD65 및 300 ㎍/ml에서 인슐린. 스팟은 A.El.VIS Elispot 판독기 (A.EL.VIS GmbH, Hannover, Germany)를 사용하여 계수하였다.

세포주 및 세포 배양 ― 본 연구에서 사용된 렌티-XTM 293T 세포주는 추천된 바와 같이 제조사 (Clontech)로부터 구입하였다. 인간 세포주 HEK293T 및 렌티바이러스 방법을 포함하는 모든 과정은 기관 (Institutional Biosafety Committee (IBC) of Boston Children’s Hospital Committee, Harvard Medical School)에 의해 승인되었다.

렌티바이러스 생성 및 형질도입 ― 쥐 PD-L1을 암호화하는 전장 cDNA는 전달 플라스미드 pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen에 클로닝하였다. VSV-G 슈도타입 레트로바이러스는 팩키징 발현 플라스미드 (Gag/Pol, Tat, Rev) 및 VSV-G를 암호화하는 외피 발현 플라스미드와 함께 쥐 PD-L1 전달 플라스미드를 트랜스-IT 293 형질감염 시약 (Mirus)을 사용하여 293T 세포에 동시 형질감염에 의해 생성하였다. 형질감염 24 또는 48시간 후, 바이러스 입자를 함유하는 상등액을 수거하고 5분 동안 1800 rpm에서 원심분리하여 죽은 세포 및 파편을 제거하고 제조업자의 프로토콜 (Takara Clonetech)에 따라 렌티-X 농축기를 사용하여 농축시켰다. 바이러스 스톡은 형질도입 실험이 수행될 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 새롭게 단리된 쥐 KL 세포에 2 ㎍/mL 폴리브렌 (Sigma), 10 ng/ml의 SCF 및 100 ng/ml의 TPO의 존재하에 Stem SFEMI (Stem cell Technology) 중에서 재조합 PD-L1 렌티바이러스 입자를 형질도입하였다. 형질도입 24시간 후, 세포는 FACS 분석에 대해 수거하고 역전 연구를 위해 사용하였다.

루시퍼라제 검정 ― NOD.FVB-Tg(CAG-luc,-GFP)L2G85Chco/FathJ로부터 단리된 KL 세포는 재조사 (Jackson Laboratory)로부터 구입하였고 이어서 PD-L1 렌티바이러스로 형질도입하고 NOD-고혈당에 주사하였다. 24시간 후, 처리된 마우스에 루시페린을 주사하였다. 루시페린 주사 후, 루시페라제 발현은 IVIS 스펙트럼에 의해 평가하였다. 전체 과정의 세부 사항은 보충 방법에서 발견될 수 있다.

쥐 KL 세포 HSC의 조절 ― 쥐 골수 KL 세포는 자기 비드 및 MACS® 분리 칼럼 (Miltenyi)을 사용하여 단리하고 ~2×10⁵ 세포는 200 ㎕의 하기의 배지와 함께 U-기저 96-웰 플레이트 (3799; Corning)에 분주하였다. Stemspan-SFEMII (StemCell Technologies)는 상이한 성장 인자 칵테일로 보충되었다. 세포는 5 % CO₂에서 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. PD-L1 발현은 상응하는 아이소타입 대조군 래트 IgG2a, λ (BD Pharmingen)와 함께 래트 항-마우스 PD-L1 (BD Pharmingen)을 사용하여 FACS에 의해 배양 전에 평가하였다.

트리펙타 조절 ― 단리된 KL 세포는 50 ng/ml의 재조합 인간 SCF (StemCell Technology), 50 ng/ml의 마우스 TPO (StemCell Technology), 50 ng/ml의 재조합 마우스 IL-3 (R&D SYSTEMS), 재조합 마우스 IFN-β (1000 U/ml) (R&D SYSTEMS), 마우스 IFN-γ (5 ng/ml) (R&D SYSTEMS) 및 1 ㎍/ml의 인간 폴리 (I:C) (폴리이노신-폴리시티딘산) (InvivoGen)이 보충된 SFEMII (StemCell Technologies)에서 재현탁시켰다.

웨스턴 블롯 ― 쥐 KL 세포는 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)와 함께 RIPA 완충액 (20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1 % SDS, 0.5 % DOC, 0.5 % triton X-100) 중에서 균질화시켰다. 50 ㎍의 총 단백질에 균등한 세포 용해물은 4 %-20 % SDS-폴리아크릴아미드 농도구배 겔 (Bio-Rad) 상에서 분획화하고 니트로셀룰로스 막 (0.2 ㎛, Bio-Rad) 상으로 이동시켰다. 막은 1시간 동안 실온에서 5 % BSA로 차단시키고 이어서 밤새 항-PD-L1 (Santa Cruz Biotechnology), 항-토끼 GAPDH (Cell Signaling TECHNOLOGY)로 항온처리하였다. 검출은 항-토끼 IgG, HRG-연결된 항체를 사용함에 의해 수행하였다.

qRT-PCR ― KL 세포에서 PD-L1 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 총 RNA는 KL 세포로부터 추출하고 100 ㎕의 추출 완충액 (Arcturus Picopure, Applied Biosystems)으로 30분 동안 42 ℃에서 처리하고 이어서 상이한 세척 단계에 적용하고 제조업자의 지침에 따라 15㎕의 용출 완충액에서 용출시켰다. RNA는 제조업자의 지침에 따라 나노-적가 분광측정기에 이어서 역전사 및 ABI 역전사 및 Taqman PreAmp 키트 (Applied Biosystems)를 사용한 예비 증폭에 의해 정량하였다. TaqMan 유전자 발현 검정 (Applied Biosystems)은 7900HT 신속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 3개의 샘플에 대해 수행하였다. 데이터는 GAPDH 하우스 키핑 유전자에 상대적으로 표준화하였다.

HSC의 공초점 현미경 및 면역형광 ― 8주령 NOD 및 B6 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 추출된 골수는 OCT에 매립하고 에탄올과 드라이 아이스의 슬러리에서 냉각된 -80 ℃ N-메틸부탄 중에서 스냅 동결시켰다. 섹션 (7 ㎛)은 마이크로톰을 사용하여 제조하고 공기 건조시키고 이어서 상응하는 항체로 염색시켰다. 이미지는 Zeiss LSM 510 Meta 공초점 현미경 (Carl Zeiss SpA) 상에서 캡쳐하였다. 염색 과정의 세부 사항은 보충 과정에서 발견될 수 있다.

쥐 GWAS 검정 ― MTA 1.0 및 HTA 2.0 Affymetrix 마이크로어레이를 위한 방법.

게놈-와이드 발현 검정은 Affymetrix 유전자칩 WT 피코 프로토콜에 따라 수행하였다. RNA 단리는 Arcturus PicoPure RNA 단리 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였고 이어서 대략 1.0 ng으로 희석시켰다. RNA 통합은 모든 RNA 샘플에 대해 평가하고 최종 농도는 RNA 피코 칩 (Agilent Technologies)을 사용하여 생분석기 상에서 측정하였다. 7 이상의 RIN 스코어를 갖는 RNA만을 사용하였다. 1 내지 2 ng은 주형으로서 사용하여 cDNA 합성, 어댑터 합성 및 16시간 증폭 단계 (Affymetrix)를 포함하는 일련의 반응을 통해 cRNA를 작제하였다. cRNA 정제 및 정량 후, ss-cDNA를 합성하고 단편화하고 표지시켰다 (Affymetrix). 각각의 MTA 1.0 또는 HTA 2.0 유전자칩은 45 ℃에서 17시간 동안 하이브리드화하였다. 이어서 어레이는 FS450 유체성 스테이션 (Affymetrix) 상에서 염색하고 유전자칩 7G 스캐너 (Affymetrix) 상에서 스캐닝하였다. 프로브 강도는 로그 스케일의 강한 다중-어레이 분석 (Expression Console-RMA, Affymetrix) 방법에 따라 표준화하였고 표준화된 강도는 Spotfire 6.0 (Perkin-Elmer)을 사용하여 플롯팅하였다.

통계학적 분석 ― 달리 지정되지 않는 경우, 모든 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 통계학적 분석은 쌍을 이루지 않은 스튜던트 시험을 사용하여 수행하였다. P ≤ 0.05의 2개 측면의 값은 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되었다. 윌콕손 시험 (Wilcoxon test)을 사용한 카플란-메이어 곡선 (Kaplan-Meier curve)을 사용하여 마우스에서 당뇨병의 발병을 분석하였다. 통계학적 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)를 사용하여 수행하였다.

결과

PD-L1은 NOD 마우스 기원의 HSC에서 결함이다 ― 자가면역 당뇨병 성향이 있는 마우스에서 조혈 줄기 세포 (HSC)의 임의의 잠재적 면역조절 결함을 동정하기 위해, 본원 발명자는 먼저 NOD 마우스로부터의 쥐 HSC의 면역조절성, 항-염증성 및 공동자극 분자에 대한 광범위한 전사체 프로파일링을 수행하였고 이를 C57BL/6 마우스로부터 수득된 것들과 비교하였다. NOD로부터 수득된 Sca-1⁺혈통^-c-키트HSCs, (KLS)는 전사체 프로파일링에서 C57BL/6 마우스로부터 수득된 HSC 기원의 것들과 비교하여 PL-L1 전사체의 감소된 발현을 보여주었다 (도 8a). 이어서 본원 발명자는 NOD HSC에서 PD-L1 결함을 확인하기 위해 광범위한 기술을 사용하였다. 먼저, 본원 발명자는 NOD로부터의 KLS 세포에서 PD-L1의 발현을 결정하고 이를 C57BL/6 마우스와 비교하기 위해 웨스턴 블롯팅 검정을 수행하였고, 본원 발명자는 GAPDH를 내부 대조군 (도 8b)으로서 사용하였다. 웨스턴 블롯팅 검정의 정량 후, PDL-1 상대적 발현에서의 감소는 C57BL/6 마우스와 비교하여 NOD에서 명백하였다 (도 8c). KLS 세포에서 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같은 PD-L1 mRNA 발현은 NOD HSC에서 감소된 PD-L1 mRNA 발현을 확인하였다 (도 8d). 보다 적은 PD-L1⁺ 세포 및 전체 감소된 PD-L1 발현은 C57BL/6 마우스와 비교하여 상이한 골수 선조체에서, 즉 Sca-1⁺혈통^-c-키트⁺HSC (KLS) 세포에, 혈통-c-키트⁺ (KL) 세포에서, 장기 재군집화 HSC (CD41^-CD48^-CD150⁺ 세포) 및 (CD244^-CD48^-CD150⁺)에서 정상혈당 NOD 마우스에서 명백하였다. (도 8f-8l). 흥미롭게도, 다른 골수-유래된 면역 관련 세포 (예를 들어, B220⁺ B 림프구 세포, CD11c⁺ 수지상 세포 및 F4/80+ 마크로파아지)는 PD-L1이 결함이 아니기 때문에 PD-L1 결함은 주로 NOD 마우스에서 HSC 집단으로 제한되었다 (데이터는 나타내지 않음). 다른 공동자극 분자 (예를 들어, PD-L2, PD-1, CD40, CD80 및 CD80)을 또한 평가하였고 본원 발명자는 골수 또는 비장으로부터 수득한 NOD와 C57BL/6 HSC 간의 임의의 유의적 차이를 주지하였고 (데이터는 나타내지 않음) 이는 PD-L1 결함의 단일성을 시사한다. 이어서 본원 발명자는 연령 또는 질환 상태와의 PD-L1 결함의 임의의 연합을 탐구하였고 따라서 본원 발명자는 각각 4주, 10주 및 16주 이상에서 NOD 및 C57BL/6 마우스의 골수 및 비장세포 추출된-KL 세포에 대한 유동 세포측정 분석을 수행하였다. 본원 발명자는 2개의 종에서 PD-L1⁺ 세포의 수에서 약간의 감소를 인지하였다. 본원 발명자는 이어서 HSC 니치 (niche)내 PD-L1의 관련성의 이해를 목표로 하고 따라서 NOD 및 C57BL/6으로부터의 골수 조직을 공초점 이미지화로 분석하였고 PD-L1은 NOD 마우스에서 HSC에 결함이 있음을 결정한다 (데이터는 나타내지 않음). 고혈당이 상기 결함에 대해 역할을 수행할 수 있는지 또는 증가된 아폽토시스와 함께 높은 HSC 턴오버가 NOD 마우스에서 미성숙한 HSC를 생성할 수 있는지를 평가하기 위해, 본원 발명자는 NOD 및 C57BL/6 마우스 기원의 HSC에서 PD-L1 발현에 대한 높은 글루코스의 효과를 시험하였고 이들의 턴오버 및 아폽토시스율을 정량한다. INOD 및 C57BL/6 마우스로부터의 단리된 KL 세포는 높은 글루코스 (20 및 35 mM)에서 3일 동안 배양하였다. 일부 변화는 명백하였고, 어떠한 특정 패턴도 PD-L1 발현에 대한 임의의 잠재적 높은 글루코스-관련 효과의 존재를 시사하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이어서, 본원 발명자는 SFEMII 배지에서 24시간 동안 배양되는 경우와 72시간 동안 배양되는 경우 기준선에서 NOD로부터 및 C57BL/6 마우스로부터 CFSE 표지된-HSC에 대한 증식 검정을 수행하였다. 증식율에서 어떠한 차이도 NOD 또는 C57BL/6으로부터 HSC 중에서 명확하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 본원 발명자는 배양 24시간 후 및 배양 72시간 후 기준선에서 NOD로부터 및 C57BL/6 마우스로부터 HSC의 아폽토시스율을 추가로 연구하였다. 기준선에도 불구하고, NOD로부터 HSC는 배양 24시간 후 및 72시간 후 C57BL/6으로부터의 HSC와 비교하여 AnnexinV+/7-AAD-아폽토시스 세포의 보다 높은 백분율을 나타냈고, 반대 시나리오는 NOD로부터의 HSC와 비교하여 C57BL/6에서 보다 많은 아폽토시스 HSC와 함께 명백하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본원 발명의 데이터는 주로 조혈 줄기 세포 집단에 제한된 NOD 마우스에서 PD-L1 발현에서의 HSC-특이적 결함의 존재를 확인하였다.

유전적으로 가공된 NOD HSC는 시험관내에서 자가면역 반응을 폐지시킨다 ― 본원 발명자는 NOD HSC에서 PD-L1 결함을 극복하기 위한 유전적-기반 가공 접근법의 효과를 시험하였다. 본원 발명자는 생체외 쥐 KL 세포를 유전자 가공하고 3세대 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터 (LV)에 의해 NOD 마우스로부터 PD-L1⁺.Tg HSC를 생성하고 (이는 이의 높은 효율 및 유전자독성의 낮은 위험 때문에 생체내 강한 잠재적 용도를 갖는다)(Kevin D. Bunting and Cheng-Kui Qu, 2014, Methods in Molecular Biology, 1185, DOI 10.1007/978-1-4939-1133-2_21), NOD 마우스에서 실험적 자가면역 당뇨병의 발병개시에 대한 이들의 효과를 조사한다. 단리된 쥐 HSC (KL)은 이의 발현이 독시사이클린 프로모터의 제어하에 있는 PD-L1 유전자 및 ZsGreen으로서 디자인된 형광 마커를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 HEK 293TN 생산자 세포를 감염시킴에 의해 이전에 수득된 PD-L1 슈도바이러스 입자로 형질도입하였다. 본원 발명자는 따라서 PD-L1⁺.Tg HSC를 성공적으로 생성하였고 형질도입전 거의 7 %와 비교하여 양성 PD-L1⁺ 세포의 효율은 60 %였다 (도 9a-9c). 증가된 MFI는 또한 명백하였다 (형질도입 전 = 5.6±1.9; 형질도입 후=47.8±4.8). 면역형광은 PD-L1 LV를 사용한 형질도입 후 증가된 표면 PD-L1 발현을 잘 도시하였다 (데이터는 나타내지 않음). 새롭게 생성된 PD-L1⁺.Tg HSC의 게놈 광범위 분석은 모의-LV 형질도입된 HSC와 비교하여 거의 327배 증가에 의해 PD-L1의 PD-L1 상향조절을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본원 발명자는 시험관내 자가면역 세팅에서 새롭게 생성된 PD-L1⁺.Tg HSC의 면역조절 성질을 조사하였다. 정상혈당 NOD 마우스로부터 생성된 PD-L1⁺Tg.HSC는 CD4⁺ CD25^- T 세포에 대한 3개의 상이한 비 (1:1; 1:5 및 1:10)로 CD11c⁺ DC 및 BDC2.5 유전자전이 CD4⁺CD25-T 세포와 함께 섬 미모토프 펩타이드 BDC2.5의 존재하에 동시배양하였다. 유동 세포측정에 의해 정량된 바와 같이 IFN-γ⁺ CD4⁺ CD25^- T 세포는 높은 비율 (p< 0.005)에서 PD-L1⁺.Tg HSC와의 동시배양이 비형질도입된 HSC (KL 세포)와 비교하여 유의적인 감소를 보여주었다 (도 9d 및 9e). PD-L1⁺.Tg HSC가 항-PD-L1 블록킹 mAb와 예비배양되는 경우, 상기 언급된 면역조절 효과는 상당히 방해되었다 (데이터는 나타내지 않음). PD-L1 의존성 면역조절 성질은 CD8-의존성 검정을 사용함에 의해 확인하였고, 여기서 PD-L1⁺.Tg HSC는 3개의 상이한 비 (1:1; 1:5 및 1:10)로 CD11c⁺ DC 및 8.3 NOD 유전자전이 CD8⁺ T 세포와 섬 미모토프 펩타이드 IGRP의 존재하에 동시배양하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본원 발명자는 이어서 비 자가면역 특이적 검정에서 PD-L1⁺.Tg HSC의 면역조절 효과를 시험하였다. NOD 정상혈당으로부터 추출된 CD4⁺ CD25^- T 세포는 가용성 항-CD3/항-CD28에 의해 자극하였고 CD4⁺ CD25^- T 세포에 대한 3개의 상이한 비율 (1:1; 1:5 및 1:10)로 PD-L1⁺.Tg HSC와 동시배양하였다. 면역조절 효과는 PD-L1⁺.Tg HSC가 첨가되는 경우 IFN-γ⁺ CD4⁺ CD25^- T 세포의 백분율이 상당히 감소하는 것으로 확인되었지만 자가면역 검정과 비교하여 덜 명백하였지만 여전히 PD-L1 의존성이다 (도 9f 및 9g).

유전적으로 가공된 NOD HSC는 고혈당을 복귀시켰다 ― 새롭게 생성된 PD-L1⁺.Tg HSC의 생체내 면역조절 성질을 평가하기 위해, 새롭게 고혈당 NOD 마우스를 각각 3×10⁶ PD-L1⁺.Tg HSC (도 9i) 또는 3×10⁶ 비-형질도입된 (비조작된) HSC (도 9k)와 함께 적응적으로 전달하였다. PD-L1⁺.Tg HSC는 처리된 고혈당 NOD 마우스의 100 %에서 고혈당으로 성공적으로 복귀시켰고 처리된 마우스의 20 %는 연구의 완료때까지 정상혈당으로 유지되었고 미처리된 고혈당 NOD 마우스 (도 9h) 또는 독시사이클린 (도 9j)으로 처리된 고혈당 NOD 마우스의 어떠한 것도 정상혈당으로 복귀하지 못하였다. 비형질도입된 HSC가 사용되는 경우, 1마리 고혈당 NOD 마우스는 정상혈당으로 복귀하였고 1마리는 혈당 수준의 약간 일시적 개선을 보여주었다 (데이터는 나타내지 않음). PD-L1⁺.Tg HSC-처리된 고혈당 NOC 마우스의 췌장 면역-조직병리학은 섬의 침윤 또는 약한 단핵구 침윤의 증거를 밝히지 못하였고 (데이터는 나타내지 않음), 고혈당 처리되지 않은 NOD와 비교하여 보존된 인슐린 염색은 양호하게 감소된 췌도염 스코어를 보여준다. PD-L1⁺.Tg HSC-처리된 고혈당 NOD-마우스의 면역표현형은 미처리된 마우스와 비교하여 처리 후 14일째에 FoxP3⁺ 조절 CD4⁺ T 세포의 백분율에서 2배 증가를 보여주었고 어떠한 변화도 IFN-γ⁺ 및 IL-17⁺ CD4⁺/CD8⁺ T 세포의 백분율에서 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 40일에 섬 펩타이드 (BDC2.5, IGRP, GAD-65 및 인슐린)로 챌린지된 비장세포의 생체외 검정에서 IFN-γ^-생성 세포의 정량은 미처리된 것과 비교하여 PD-L1⁺.Tg HSC-처리된 고혈당 NOD-마우스에서 IFN-γ⁺세포의 감소를 밝혔다 (데이터는 나타내지 않음).

고혈당 NOD 마우스에서 췌장으로의 유전적으로 가공된 HSC 트래픽 ― NOD 마우스에서 주입된 PD-L1⁺.Tg HSC의 운명을 조사하기 위해, 본원 발명자는 PD-L1⁺.Tg HSC 내 ZsGreen으로서 디자인된 GFP 추적자를 사용함에 의해 췌장, 비장, 췌장 배수 림프절 (PLN) 및 골수에서 실험 트랙킹 세트를 수행하였다. PD-L1⁺.Tg HSC는 정상혈당 및 고혈당 NOD 마우스에 적응적으로 전달되고 조직은 주입으로부터 1일, 7일 및 14일 후에 수거하였다. GFP⁺ 세포 및 GFP (ZsGreen mRNA)는 각각 유동 세포측정 및 RT-PCR에 의해 모든 조직에서 정량하였다. 고혈당 NOD로 일단 주입된 PD-L1⁺.Tg HSC는 우선적으로 췌장으로 트래픽하고 (데이터는 나타내지 않음) 보다 낮은 정도로 비장 및 PLN으로 귀소한다 (데이터는 나타내지 않음). 한편, PD-L1⁺.Tg HSC는 우선적으로 정상혈당 NOD에서 골수로 귀소한다 (데이터는 나타내지 않음). GFP⁺ 세포는 PD-L1⁺.Tg HSC 처리된 고혈당 그러나 정상혈당이 아닌 NOD 마우스의 췌장으로 공초점 이미지화에 의해 가시화하였다 (데이터는 나타내지 않음). 처리 24시간 이내 루시퍼라제⁺PD-L1.TgKL 세포로 함께 적응적으로 전달된 NOD-고혈당의 발광 이미지는 본 발명의 데이터를 확인시켜주었다. 결론적으로, 본원 발명자는 고혈당 NOD에서 PD-L1⁺ HSC의 췌장으로의 상당한 귀소를 확인하였다. 본원 발명자는 현재 작동 가설을 제안할 수 있고, 여기서, PD-L1⁺.Tg HSC는 췌장으로 트래픽하고 PD-L1 의존성 메카니즘을 통해 이펙터 자가면역 T 세포를 제거한다.

약리학적으로 조절된 HSC는 시험관내 자가면역 반응을 폐지시킨다 ― T1D를 치유하기 위한 유전적 접근법의 사용은 용이한 작업이 아닐 수 있고 본원 발명자는 소분자에 의한 PD-L1 약리학적 조절의 실행가능성을 조사한다. 본원 발명자는 PD-L1의 상향조절하는 단일 제제의 능력 및 제제 칵테일의 능력을 시험하였다. 본원 발명자는 PD-L1 (트리펙타를 사용한 치료 후 집단에서 PD-L1⁺ 세포의 65 % 이하의 HSC 집단에서 거의 6 %의 PD-L1⁺ 세포)을 강하게 상향조절하고 프로그램화된 HSC (pHSC)를 생성할 수 있는 3개의 제제 (본원 발명자는 트리펙타로 명명하였다: IFN-γ, IFN-β, 폴리I:C)의 칵테일을 개발하였다. 면역형광은 성장 인자들 (SCF, TPO, IL-3, IL-6, IFN-B, IFN-g 및 폴리I:C)의 조합인 소분자들을 사용한 조절 후 증가된 PD-L1 표면 발현을 양호하게 도시하였다 (데이터는 나타내지 않음). 게놈 광범위 분석은 pHSC에서 PD-L1의 상향조절이 비조절된 HSC와 비교하여 거의 13배 증가한 것을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이어서 본원 발명자는 자가면역 세팅에서 pHSC의 면역조절 성질을 조사하였다. 정상혈당 NOD 마우스로부터 생성된 pHSC는 CD4⁺ CD25^- T 세포에 대한 3개의 상이한 비 (1:1; 1:5 및 1:10)로 CD11c⁺ DC 및 BDC2.5 유전자전이 CD4⁺ CD25^- T 세포와 함께 BDC2.5 펩타이드의 존재하에 동시배양하였다. IFN-γ⁺ CD4⁺ CD25^- T 세포의 유동 세포측정에 의한 정량은 pHSC가 대조군과 비교하여 첨가되는 경우 (p< 0.005) 현저하고 상당한 감소를 밝혔다 (데이터는 나타내지 않음). pHSC가 항-PD-L1 블록킹 mAb와 예비배양되는 경우, 면역조절 효과는 방해받았다 (데이터는 나타내지 않음). PD-L1 의존성 면역조절 성질은 CD8-의존성 검정을 사용함에 의해 확인하였고, 여기서 pHSC는 3개의 상이한 비율 (1:1; 1:5 및 1:10)로 CD11c⁺ DC 및 8.3 NOD 유전자전이 CD8⁺ T 세포와 섬 미모토프 펩타이드 IGRP의 존재하에 동시배양하였다. 본원 발명자는 이어서 비 자가면역 특이적 검정에서 pHSC의 면역조절 효과를 시험하였다. NOD 정상혈당으로부터 추출된 CD4⁺ CD25^- T 세포는 가용성 항-CD3/항-CD28에 의해 자극하였고 CD4⁺ CD25^- T 세포에 대한 3개의 상이한 비 (1:1; 1:5 및 1:10)로 pHSC와 동시배양하였다. 면역조절 효과는 pHSC가 첨가되는 경우 IFN-γ⁺ CD4⁺ CD25^- T 세포의 백분율이 상당히 감소하는 것으로 확인되었지만 자가면역 검정과 비교하여 덜 명확하였지만 여전히 PD-L1 의존성이다 (데이터는 나타내지 않음). 이것은 pHSC가 PD-L1-의존성 조절 성질을 생체외 부여받음을 강하게 확인시켜준다.

약리학적으로 조절된 HSC는 고혈당을 복귀시켰다 ― pHSC의 생체내 면역조절 성질을 평가하기 위해, 새롭게 고혈당 NOD 마우스에 3×10⁶ pHSC를 적응적으로 전달하였다. 주입된 pHSC는 NOD 마우스의 40 %에서 당뇨병을 성공적으로 복귀시키고 처리된 고혈당 NOD 마우스의 30 %는 40일째 연구의 완성때까지 정상혈당을 유지한다. 카플란-마이어 곡선은 NOD 마우스에서 고혈당을 복귀시키는데 있어서 PD-L1⁺.Tg HSC의 보다 강한 효과를 보여주었고 pHSC는 약간 덜 양호하게 수행한다. pHSC-처리된 고혈당 NOD 마우스의 췌장의 면역-조직병리 분석은, 섬의 침윤 또는 약한 림프구 침윤의 어떠한 증거도 밝히지 못하였고 미처리된 고혈당 NOD 마우스와 비교하여 보존된 인슐린 염색 및 감소된 췌도염 스코어를 갖는다. 처리된 NOD-마우스의 면역표현형은 처리 후 40일째에 IFN-γ⁺ CD4⁺ 및 IL^-17 및 IFN-γ⁺CD8⁺ T 세포의 백분율에서의 감소를 보여주었고 (데이터는 나타내지 않음) Tregs (FoxP3⁺ 조절 CD4⁺ T 세포)에 대한 어떠한 효과도 검출되지 않았다. 40일에 섬 펩타이드 (BDC2.5, IGRP, GAD-65 및 인슐린)로 챌린지된 비장세포의 생체외 검정에서 IFN-γ-생성 세포의 정량은 pHSC-처리된 고혈당 NOD-마우스에서 IFN-γ⁺세포의 감소를 밝혔다 (데이터는 나타내지 않음).

PD-L1 결함은 T1D 개체로부터의 인간 HSC에서 명백하다 ― T1D를 갖는 개체가 임상전 모델과 유사한 조혈 줄기 세포에서 면역조절 결함을 나타내는지의 여부를 평가하기 위해, PD-L1 발현은 T1D를 앓는 개체 및 건강한 대조군의 말초혈액으로부터 추출된 HSC에 대해 분석하였다. NOD 마우스에서 본원 발명자의 발견과 일치되게 보다 적은 PD-L1⁺, CD34⁺ 세포가 건강한 대상체 (T1D=9.5 % 대 대조군=23.5 %; p<0.001)와 비교하여 T1D 개체에서 검출가능하였다 (도 10a-10c). 웨스턴 블롯 분석 및 PCR 분석은 PBMC로부터 이전에 단리된 CD34⁺ 세포로부터 추출된 RNA에 대해 수행하였고 PD-L1은 T1D 개체로부터 수득된 것들과 비교하여 건강한 대상체로부터 수득된 HSC에서의 PD-L1 감소된 발현을 확인시켜주었다 (도 10d-10f). 그러나, 다른 면역 관련 세포 (예를 들어; CD19⁺ B 림프구 세포, CD11c⁺ 수지상 세포 및 CD16⁺ 세포)는 PD-L1의 결함이 없었고 (데이터는 나타내지 않음), 따라서, PD-L1 결함은 T1D 개체에서 조혈 줄기 세포 집단에 주로 제한되어 있음을 확인시켜 준다. 본원 발명자는 이들의 주요 부위 및 니치 (niche) (골수)에서 PD-L1 및 CD34의 머징을 결정함에 의해 HSC의 공초점 이미지화를 관찰하였고 PD-L1 결함은 또한 이들 자신의 니치에서 명백하다고 결정하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본원 발명자는 T1D 개체 및 건강한 대조군으로부터의 말초 HSC 상에 다른 공동자극 분자(예를 들어; PD-L2 및 PD-1)의 빈도를 조사하였고, 상기 분자는 T1D 개체에서 감소된 것으로 나타나지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이어서, 본원 발명자는 HSC 상에 PD-L1 발현에 대한 높은 글루코스의 효과를 측정하길 원했다. PBMC는 T1D 개체의 말초혈액으로부터 단리하였고 CD34⁺ 세포는 자기 비드에 의해 분류하였다. CD34⁺ 세포 (HSC)는 상이한 조건 (정상 글루코스, 20 mM 높은 글루코스 및 35 mM 높은 글루코스)에서 3일 동안 배양하였다. 일부 변화는 NOD 마우스에서 본원 발명자의 발견과 일치하여 명백하였고, 어떠한 특정 패턴도 PD-L1 발현에 대한 임의의 잠재적 높은 글루코스-관련 효과의 존재를 시사하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이어서, 본원 발명자는 SFEMII 배지에서 24시간 동안 및 72시간 동안 배양되는 경우 T1D 개체 및 대조군으로부터의 CFSF 표지된-HSC에 대한 증식 검정을 수행하였다. 이것은 본원 발명의 발현 분석에서 임의의 아폽토시스 또는 생존-편향을 평가할 목적이었다. 본원 발명의 데이터는 T1D 개체 및 대조군으로부터 HSC의 증식율에서 어떠한 차이를 지적하지 않았다. 본원 발명자는 HSC 아폽토시스율을 추가로 연구하였다. 기준선에서 T1D로부터의 HSC는 HC로부터의 HSC와 비교하여 AnnexinV⁺/7-AAD-아폽토시스 세포의 상당히 보다 높은 백분율을 나타냈지만, 이것은 T1D 및 HSC 개체로부터의 둘 다의 HSC가 유사한 아폽토시스율을 나타내기 때문에 배양 24시간 및 72시간 후 명확하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). HSC 세포 (CD34⁺)의 가동화가 PD-L1 발현의 명백한 복구의 부재에서 치료학적 옵션이 아님을 확인하기 위해, 본원 발명자는 T1D 개체에서 HSC의 가동화 성질을 평가하였다. 따라서, 본원 발명자는 임상 시험 (NCT01102699)에서 PD-L1 발현을 분석하였고, 여기서, 6명의 T1D 개체는 hrG-CSF (5 ㎍/kg)와 함께 HSC 가동화를 진행하였다. CD34⁺ 세포는 건강한 대조군에서 상당히 증가하였지만, CD34⁺의 손상된 가동화는 T1D 개체에서 관찰되었다. 이러한 데이터는 T1D 개체에서 HSC "모빌로퍼씨"의 존재를 확인시켜 준다. 5명의 대조군 및 8명의 T1D 개체에서 항-CXCR4 (플레릭사포르)를 사용한 가동화 전과 후에 HSC 면역표현형. CD34⁺ PD-L1⁺ 세포의 백분율은 T1D와 대조군 둘 다에서 이후 감소하고, PD-L1 결함을 번복하고 이들의 면역조절 성질을 회복하기 위해 시험관내 조절을 요구함을 강조한다 (데이터는 나타내지 않음).

약리학적으로 조절된 HSC는 시험관내 자가면역 반응을 폐지시킨다 ― 인간 HSC에서 PD-L1 결핍을 극복하기 위해, 본원 발명자는 NOD 마우스에서 나타난 소분자의 동일한 칵테일의 효과를 시험하였다. 먼저, 본원 발명자는 소분자들의 칵테일을 사용한 조절 전 후에 T1D 개체로부터 단리된 HSC에서 PD-L1 발현을 평가하였다. 새롭게 인간 프로그램화된 HSC (pHSC)는 비조절된-HSC와 비교하여 PD-L1 발현의 상향조절을 나타냈다. 면역형광은 성장 인자들 (SCF, TPO, IL-3, IL-6, IFN-B, IFN-g 및 폴리I:C)의 조합인 소분자들을 사용한 조절 후 증가된 PD-L1 표면 발현을 양호하게 도시하였다 (데이터는 나타내지 않음). pHSC의 게놈 광범위 분석은 비조절된 HSC와 비교하여 거의 26배 증가를 갖는 PD-L1의 상향조절을 확인시켜 주었다 (데이터는 나타내지 않음). T1D를 앓는 개체로부터 단리된 HSC 세포 또는 pHSC가 생체외 면역조절 기능을 갖는지를 연구하기 위해, HSC로부터 고갈된 PBMC는 인슐린-관련 자가항원-2 (I-A2)의 존재하에 PBMC에 대한 3개의 상이한 비 (1:1; 1:5 및 1:10)로 HSC 또는 hpHSC와 동시배양하였고, I-A2 자극된 PBMC에 의한 IFN-γ 생성은 ELISPOT 검정에서 평가하였다. 흥미롭게도, PBMCs-IA-2-자극된 것과 비교하여, HSC의 첨가는 IFN-γ 생성을 상당히 (P ≤ 0.05) 감소시켰다. 억제는 hpHSC가 첨가된 경우 보다 현저하였고 (데이터는 나타내지 않음), 이는 HSC 및 pHSC가 면역조절 활성을 부여받음을 시사한다. HSC에 의해 나타나는 주요 면역억제가 주로 PD-L1 때문임을 추가로 확인하기 위해, 본원 발명자는 또 다른 Elispot 검정을 수행하여 항-PD-L1 블록킹 Ab 또는 대조군 Ab의 존재하에 IA-2 펩타이드 및 pHSC로 자극된 PBMC에 의한 IFN-γ 생성을 평가하였다. Ab-매개된 PD-L-1 차단은 IFN-γ⁺ PBMC의 백분율에서 명백한 감소의 부재에 의해 밝혀진 바와 같이 pHSC에 의해 이미 평가된 면역조절 효과를 방해하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본원 발명자는 이어서 비 특이적 항-CD3/CD28 검정에서 pHSC의 면역조절 효과를 시험하였다. HC 개체로부터 추출되고 가용성 항-CD3/항-CD28에 의해 자극된 CD4⁺ T 세포는 CD4⁺ T 세포에 대한 3개의 상이한 비 (1:1; 1:5 및 1:10)로 HSC 또는 pHSC와 동시배양하였다. IFN-γ⁺ CD4⁺ T 세포의 백분율에서 명백하고 상당한 감소는 pHSC가 첨가되는 경우 현저하게 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 항-PD-L1 블록킹 Ab의 첨가는 PD-L1에 의해 주로 부여되는 pHSC의 면역억제 효과를 명백하게 폐지시켰다 (데이터는 나타내지 않음). 이것은 HSC 및 pHSC가 PD-L1-의존성 조절 성질을 생체외 부여받음을 강하게 확인시켜준다. 새롭게 생성된 pHSC의 생체내 면역조절 성질을 평가하기 위해, NRG-Akita 고혈당 마우스에 먼저 인간 PBMC (~10×10⁶ 세포)를 투여하고 이어서 인간 섬 (~2000IEQ)으로 섬 이식하고 이어서 여기에 적응적으로 1×10⁶ pHSC를 전달하였다 (데이터는 나타내지 않음). 주입된 pHSC는 연구의 완료 때까지 NRG-Akita 마우스에서 NRG-Akita 마우스를 성공적으로 정상혈당을 유지시켰다. 상이한 처리된 그룹에서 혈당의 역전을 보여주는 카플란-마이어 곡선 (데이터는 나타내지 않음). pHSC를 사용하여 처리된 마우스의 췌장의 면역-조직병리학 분석은 섬의 침윤 또는 약한 림프구 침윤의 증거를 밝히지 못하였고 (데이터는 나타내지 않음), 고혈당 처리되지 않은 NOD와 비교하여 보존된 인슐린 염색은 감소된 췌도염 스코어를 보여준다.

본원 및 본원 명세서 전반에 걸쳐 인용된 참조문헌은 본원에 참조로 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION <120> PD-L1 EXPRESSING HEMATOPOIETIC STEM CELLS AND USES <130> 701039-082611-PCT <140> <141> <150> 62/194,969 <151> 2015-07-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 531 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgccccatac 60 aacaaaatca accaaagaat tttggttgtg gatccagtca cctctgaaca tgaactgaca 120 tgtcaggctg agggctaccc caaggccgaa gtcatctgga caagcagtga ccatcaagtc 180 ctgagtggta agaccaccac caccaattcc aagagagagg agaagctttt caatgtgacc 240 agcacactga gaatcaacac aacaactaat gagattttct actgcacttt taggagatta 300 gatcctgagg aaaaccatac agctgaattg gtcatcccag aactacctct ggcacatcct 360 ccaaatgaaa ggactcactt ggtaattctg ggagccatct tattatgcct tggtgtagca 420 ctgacattca tcttccgttt aagaaaaggg agaatgatgg atgtgaaaaa atgtggcatc 480 caagatacaa actcaaagaa gcaaagtgat acacatttgg aggagacgta a 531 <210> 2 <211> 873 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60 gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120 aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180 gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240 tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300 atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360 gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420 attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480 cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540 accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600 acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660 acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720 ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780 ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840 aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873

Claims

변형된 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단으로서, 여기서, 상기 세포가 프로그램화된 세포사-1 수용체 리간드 (PD-L1)를 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 세포가 PD-L1을 발현하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산이 카피 DNA (cDNA)인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산이 게놈 DNA인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제4항에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈으로 통합되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 핵산이 벡터를 통해 상기 세포로 도입되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제6항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제7항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 HSC 세포가 포유동물 세포인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제9항에 있어서, 상기 HSC 포유동물 세포가 HSC 인간 세포인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 변형 전에, 상기 HSC가 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제11항에 있어서, 상기 HSC가 가동화된 (mobilized) 말초혈액으로부터 수득되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 HSC가 건강한 개체로부터 유래하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 HSC가 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터 유래하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제14항에 있어서, 상기 진단된 질환 또는 장애가 자가면역 질환 또는 장애인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제15항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 장애가 1형 당뇨병 (T1D)인, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 HSC 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전 또는 도입 후, 또는 도입 전과 후 모두에 생체외 배양되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 HSC 세포가 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피의 도입 전 또는 도입 후, 또는 도입 전과 후 모두에 냉동보존되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 변형된 HSC 세포가 사용전 냉동보존되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제1항에 있어서, 상기 HSC 세포가
(a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시키는 단계;
(b) 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하는 단계; 및
(c) PD-L1의 발현을 상기 변형된 HSC 상에 확립하여, PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
제20항에 있어서, 상기 방법이 비-변형된 세포와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배 증가가 있음을 확립하는 단계를 추가로 포함하는, 변형된 조혈 줄기 세포 집단.
변형된 PD-L1⁺ 발현 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 생성하는 생체외 방법으로서, 상기 방법은
(a) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시켜 HSC를 변형시켜 상기 핵산의 상기 외인성 카피를 상기 HSC에 도입하는 단계;
(b) 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하는 단계; 및
(c) PD-L1의 발현을 상기 변형된 HSC 상에 확립하여, PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 방법이 비-변형된 세포와 비교하여 PD-L1⁺ 발현 세포의 수에서 적어도 1배 증가가 있음을 확립하는 단계를 추가로 포함하는, 생체외 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 HSC 샘플이 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득되는, 생체외 방법.
제24항에 있어서, 상기 HSC 샘플이 가동화된 말초혈액으로부터 수득되는, 생체외 방법.
제22항에 있어서, 상기 HSC 샘플이 건강한 개체로부터 수득되는, 생체외 방법.
제22항에 있어서, 상기 HSC 샘플이 진단된 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터 수득되는, 생체외 방법.
제27항에 있어서, 상기 진단된 질환 또는 장애가 자가면역 질환 또는 장애인, 생체외 방법.
제28항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 장애가 1형 당뇨병 (T1D)인, 생체외 방법.
제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인, 생체외 방법.
제30항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 생체외 방법.
제22항에 있어서, 상기 핵산이 카피 DNA (cDNA)인, 생체외 방법.
제22항에 있어서, 상기 핵산이 게놈 DNA인, 생체외 방법.
제33항에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈으로 통합되는, 생체외 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조혈 줄기 세포 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물.
대상체로 이식시키거나 대상체에서 면역 반응을 감소시키기 위한 조성물로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조혈 줄기 세포 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는, 조성물.
제35항에 따른 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 자가면역 장애가 1형 당뇨병 (T1D)인, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 HSC가 상기 수용자 대상체에 자가성 (autologous)인, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 HSC가 상기 수용자 대상체에 비-자가성이고 동종이계(allogenic)인, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 HSC가 상기 수용자 대상체에 비-자가성이고 이종성(xenogeneic)인, 방법.
대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서,
a) 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 제공하는 단계;
b) 37 ℃에서 적어도 24시간 동안 HSC 샘플을 0.1 μM 농도의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)와 접촉시키는 단계;
c) 24시간 후 PGE₂를 제거함으로써 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 생성하는 단계;
(d) 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체로 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절하는 단계를 포함하는, 방법.
대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서,
(a) 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 제공하는 단계;
(b) HSC 샘플을 PD-L1을 암호화하는 핵산의 외인성 카피를 갖는 벡터와 접촉시키는 단계;
(c) 상기 접촉으로부터 상기 수득한 변형된 세포를 생체외 배양하는 단계;
(d) PD-L1의 발현을 변형된 HSC 상에 확립하여, PD-L1을 발현하는 변형된 HSC 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(e) 상기 PD-L1⁺ 발현 HSC 집단을 수용자 대상체에 이식하여 상기 수용자 대상체에서 면역 반응을 조절하는 단계를 포함하는, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 HSC 집단이 골수, 탯줄, 양수, 융모막융모, 제대혈, 태반혈액 또는 말초혈액으로부터 수득되는, 방법.
제44항에 있어서, 상기 HSC 집단이 가동화된 말초혈액으로부터 수득되는, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체에 자가성인, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체에 동종이계인, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체에 이종성인, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체로의 이식 전에, PGE₂의 제거 후 또는 벡터를 사용해 형질감염-후(post-transfection) 생체외 배양한 후, 냉동보존되는, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 HSC 집단이 상기 수용자 대상체로의 이식 전에, PGE₂의 제거 후 또는 벡터를 사용해 형질감염-후 생체외 배양한 후, 생체외 배양 증식되는, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 면역 반응 조절을 필요로 하는 수용자 대상체를 선택함을 추가로 포함하는, 방법.
자가면역 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위해, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시 지연에 사용하기 위해, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부의 예방 및 지연에 사용하기 위해, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D의 치료를 위해 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포, 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물.
자가면역 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시를 지연시키는데, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부를 예방 및 지연하는데, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하는데 사용하기 위한 약물 제조를 위해 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포, 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조성물.
자가면역 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위해, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위해, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시 지연에 사용하기 위해, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부의 예방 및 지연에 사용하기 위해, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하기 위해 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포 집단, 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포.
자가면역 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데, 대상체에서 면역 반응을 억제하는데, T1D를 발병할 위험에 처한 대상체에서 T1D의 발병개시를 지연시키는데, 동종이계 조직 또는 기관 이식 거부를 예방 및 지연시키는데, 그리고 성인 및 소아 대상체에서 T1D를 치료하는데 사용하기 위한 약물 제조를 위해 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 PD-L1 발현 조혈 줄기 세포 집단, 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포.