KR20180031612A - 반응과 분석을 포함한 단일 진단칩의 고감도 신속진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 반응과 분석을 포함한 진단칩을 이용하여 검출 대상 물질을 검출하는 방법으로, 구체적으로는 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하고 졸-겔 스팟이 고정된 검출부를 포함하는 진단칩과 이를 기반으로 검출 대상 물질을 검출하는 방법 또는 시료를 분석하는 방법에 관한 것이다.

Description

반응과 분석을 포함한 단일 진단칩의 고감도 신속진단방법 {A Method of Rapid Diagnosis With High Sensitivity By Using Single Diagnosis Chip Comprising Reaction and Analysis Process}

본 발명은 반응과 분석을 포함한 진단칩을 이용하여 검출 대상 물질을 검출하는 방법으로, 구체적으로는 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하고 졸-겔 스팟이 고정된 검출부를 포함하는 진단칩과 이를 기반으로 검출 대상 물질을 검출하는 방법 또는 시료를 분석하는 방법에 관한 것이다.

임상 검사 분야에서 포인트·오브·케어·테스팅 (이하, POCT 라고도 한다) 분야가 주목받고 있다. 검체로부터 검출 대상 물질을 분리한 후 간편한 장치를 통해 POCT 분석함으로써, 검체를 채취하고 나서 검사 결과가 얻어지기까지의 시간을 단축할 수 있고, 간단하게 측정할 수 있다는 이점이 있다.

POCT 분석에 효소 분석(enzyme assay), 면역분석(immunoassay), 화학 비색 분석(chemical colorimetric assay), 전기화학적 분석(electrochemical assay), 형광 표지(fluorescence labeling) 및 측정, 또는 화학발광 표지 (chemiluminescent labeling) 및 측정 등의 다양한 기술이 사용되고 있다.

종전 생화학적 방법을 이용한 체외 진단 형태는 고가의 분석 장비가 필요하고 대형병원 및 검사실 위주의 시약으로 개발되어 왔다. 이에 따라 진단 의약품의 소비 형태는 종합병원과 검사실 등 일부에 편중 되어 있고 고가의 분석 장비와 병행되어야 하기 때문에 국내 기업에는 많은 위험 요소로 작용하여 대부분 수입에 의존한 시장이 형성되었다. 1980년대 이후 현장형 진단 키트인 포인트??오브??케어??테스팅 (POCT)의 개념이 탄생하였고, 이러한 현장형 진단키트는 이후 임신 진단, 약물남용진단, 감염성 진단, 암 진단, 심장질환 등에 폭 넓게 응용되면서 1990년 이후 진단 시장의 성장을 주도하였다. 전 세계적인 체외 진단 치료법을 이용하는 인구가 증가하는 추세에 있고 POCT의 도입과 함께 저렴해 지는 체외 진단 검사비용으로 인해 보다 많은 사람들이 체외 진단에 관심을 보이고 있다. 체외 진단 중 면역화학적 진단의 시장규모는 2009년 140억불 규모에서 연평균 5.4% 성장률로 성장하여 2016년에는 200억불 이상 매출 규모를 형성할 것으로 전망하고 있다.

한편, 인플루엔자는 겨울철에 유행하는 급성 호흡기바이러스 감염으로 매년 인구의 약 10%가 감염되며 노인, 영유아 및 만성 질환 환자에서 폐렴의 합병 또는 기저질환의 악화로 종종 심각한 질환으로 분류된다. 매년 유행하는 계절 인플루엔자는 인플루엔자 바이러스의 항원의 소 변이에 의한 것인 반면 10-40년 주기로 발생되는 대유행 인플루엔자는 항원 대 변이에 의한 것으로 세계적 유행을 특징으로 인구의 30-50%가 감염되므로 인명 및 사회 경제적 피해가 막대하다.

이러한 인플루엔자 바이러스 검출에 가장 많이 이용되는 항원항체 반응 기반의 신속항원검사법(Rapid test)은 비교적 적은 시간이 소요되고 간편한 장점이 있지만, 감도와 정확도가 낮은 단점이 있다. 인플루엔자의 확진 검사 시에 사용되는 Real-Time PCR 방법은 높은 감도와 정확도를 통해 감염성 질환의 진단에 가장 효과적인 기술로 인정받고 있지만, 검사 시간이 비교적 길고 전문기관에 의뢰가 필요하기 때문에 현장 검사가 거의 불가능한 실정이다. 또한 검사 비용이 높은 수준으로 감염성 질환의 대유행 시에 대규모의 초기 대응 수단으로 적용이 매우 어려운 측면이 있다.

따라서, 비교적 작은 규모의 현장 적용이 가능한 POCT 개념의 제품개발이 필요하며, 또한 높은 감도와 정확도를 가지는 기술 개발 마련이 필요한 실정이다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 3차원 고정화 졸겔 기반의 고민감도 기술을 제시하였다. 이 기술은 다공성 3차원 구조의 졸겔구조를 기반으로 다양한 바이오 마커를 대량으로 고정화 할 수 있는 기술로 기존바이오센서 대비 고민감 검출시스템 구축할 수 있으며 마이크로 어레이 제작기술 융합에 의한 소형화 진단칩 기반기술 제공 구현하고 기존 Rapid kit의 낮은 민감도/특이도 성능과 분자진단의 검출시간 제약성을 3차원 졸겔 바이오 융합기술 개발로 극복할 수 있었다. 또한 하나의 반응부에 졸겔 마이크로 어레이 제작기술로 다중마커를 독립적으로 같은 공간에 고정함으로써 멀티플렉스 (multiplex) 기술 구현이 가능하여 다중진단기술의 플랫폼 기반을 구축할 수 있었다.

따라서 종래 사용되던 웰 또는 플레이트 기반이 아닌, 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하는 졸-겔 스팟이 고정된 시료 분석용 진단칩을 통해 졸-겔 기반의 고민감도/고특이도의 분석적 성능 및 다중진단 플랫폼 기술과 현장진단 기반의 신속하고 정확한 결과를 수득할 수 있게 됨으로써, 분석의 정확도 개선은 물론, 일체형의 시약 보관부 및 폐기물 보관부를 포함함으로써, 사용되는 시료 및 시약의 오염, 오사용으로 인한 문제를 해결할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 진단칩을 이용하여 검출 대상 물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 구성이 일체형으로 포함된 진단칩을 이용하여 검출 대상 물질을 검출하는 방법으로, 검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기 장착부; 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하는 졸-겔 스팟이 고정된 검출부; 검출 대상 물질과 생물학적 검출 물질의 반응 여부 확인을 위해, 생물학적 검출 물질에 대한 생물학적 표지자를 포함하는 반응 시약 보관부; 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액을 포함하는 세척 용액 보관부; 검출부에서 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 제거하는 폐기물 보관부; 및 피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단이 장착된 홀, 상기 용기 장착부에 포함된 검출 대상 물질을 포함하는 샘플을 상기 검출부의 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질과 접촉시키고, 반응 결과를 이미징하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 진단칩을 이용한 검출 대상 물질의 분석방법을 제공한다: 진단칩 중 검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기를 용기 장착부에 삽입하고, 피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단을 홀에 장착시키는 단계; 상기 검출 대상 물질을 포함하는 샘플을 운반 수단으로 흡입하여, 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하는 졸-겔 스팟이 고정된 검출부에 주입하는 단계; 상기 검출부에서 반응 후의 잔존 물질을 흡입하여, 폐기물 보관부에 배출하는 단계; 상기 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액을 포함하는 세척 용액 보관부에서 세척 용액을 검출부로 주입하여 상기 검출부 중 미반응 물질을 세척하는 단계; 상기 미반응 물질을 흡입하여, 폐기물 보관부에 배출하는 단계; 및 상기 검출부의 반응 결과를 이미징하는 단계.

본 발명에 따르면, 종전의 고민감도/고특이도 성능의 다중진단 플랫폼으로 제시된 졸-겔 기반기술을 바탕으로 분석 과정이 일체형으로 구성된 졸-겔 고정화 검출부와 시약 보관부 및 폐기물 보관부를 포함한 직선상의 현장진단용 진단칩을 검사 장비와 함께 사용하여, 기존대비 높은 분석적 성능을 포함, 신속하고 간단한 동작만으로 분석진행에 따른 진단 시간의 단축성능, 시료와 시약 및/또는 반응물질의 정량 보관이 가능한 구조기능, 이들 사이의 교차오염을 방지할 수 있게 됨으로써, 분석 정확도를 높일 수 있다.

도 1은 진단칩의 전면도를 나타낸 것이다.
도 2는 진단칩 중 검출부에 대한 세부도 및 3차원 졸-겔 스팟에 대한 반응모식도이다
도 3은 진단칩 중 반응 시약 보관부에 대한 세부도이다.
도 4는 진단칩 중 세척 용액 보관부에 대한 세부도이다.
도 5는 진단칩 중 폐기물 보관부에 대한 세부도이다.
도 6은 진단칩 중 운반 수단이 장착된 홀에 대한 세부도이다.
도 7은 진단칩 중 용기 장착부에 대한 세부도이다.
도 8은 본 발명에 따른 방법 구현에 사용되는 진단기기에 대한 모식도이다.
도 9및 도 10은 종래 국내 Rapid 제품(S사)을 통한 진단 이미징 결과를 나타낸 것이다.
도 11 및 도 12는 본 발명에 따른 방법에 의한 진단 결과를 나타낸 것이다.
도 13 및 도 14는 Sol-gel을 3차원적 항체 고정한 3차원 솔젤 항체고정화 어세이에 대한 형광 세기 및 형광 이미지 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 15는 음성 검체 샘플을 테스트한 형광이미지를 나타낸 결과이다.
도 16은 음성 검체 샘플을 테스트한 형광 데이터를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 양성 검체 샘플을 Influenza A에 대하여 테스트한 형광이미지를 나타낸 결과이다.
도 18은 양성 검체 샘플을 Influenza A에 대하여 테스트한 형광 데이터를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 양성 검체 샘플을 Influenza B에 대하여 테스트한 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 20은 양성 검체 샘플을 Influenza B에 대하여 테스트한 형광 데이터를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 종양표지자 검출용 3차원 졸-겔 항체 고정화 칩에 대한 구성도이다.
도 22는 종양표지자 항원 검체 반응 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 23 내지 도 26은 종양표지자 항원 농도별로 형광세기 분포도를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 다음의 구성이 일체형으로 포함된 진단칩을 이용하여 검출 대상 물질을 검출하는 방법으로, 검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기 장착부; 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하는 졸-겔 스팟이 고정된 검출부; 검출 대상 물질과 생물학적 검출 물질의 반응 여부 확인을 위해, 생물학적 검출 물질에 대한 생물학적 표지자를 포함하는 반응 시약 보관부; 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액을 포함하는 세척 용액 보관부; 검출부에서 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 제거하는 폐기물 보관부; 및 피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단이 장착된 홀, 상기 용기 장착부에 포함된 검출 대상 물질을 포함하는 샘플을 상기 검출부의 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질과 접촉시키고, 반응 결과를 이미징하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 최적 신속화 반응 단계로 구성 (시약 및 반응단계 정량오차 오류 극복, 측정부 반응 최적화 및 장비 연동 신속화 설계 등)되어, 기존 대비 민감도를 90% 이상의 구현할 수 있으며, 본 발명에 사용된 진단칩은 각 반응 스텝에 맞춰 시약 보관부 및 폐기물 보관부를 구분함으로써, 사용되는 시료 및 시약의 오염, 오사용으로 인한 문제를 해결할 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 검출 대상 물질은 생체 물질일 수 있으며, 예를 들어 예를 들어, 핵산, 펩타이드, 단백질, 저분자 물질, 항원, 바이러스 또는 세포일 수 있다. 상기 생체 물질은 체액으로부터 유래될 수 있다. 상기 체액은 예를 들어 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액, 조직, 조직 균질물, 조직의 부분, 세포, 세포 추출물, 또는 체외 세포 배양물일 수 있다.

상기 바이러스는 예를 들어, 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 인플루엔자 아형 A와 B에 대한 특이적인 항체를 솔젤 고정화 기술로 전용 진단칩에 고정하고 각 아형에 대한 검체에서 특이적인 진단 가능성을 확인할 수 있다. 기존 검사방법의 복잡한 프로세스 부분을 Lab on a chip 형태의 전용 진단칩을 사용하여 검체 채취부터 결과값 산출이 얻어지기까지의 자동화 측정과정으로 단축할 수 있으므로, 인플루엔자 바이러스 존재 여부를 간편하게 측정할 수 있다. 또한, 소형화된 진단칩 구성으로 보관의 용이성 및 현장검사(POCT) 시스템에 적용 가능하다는 이점이 있다.

상기 샘플이 함유된 용기는 진단칩과 분리 가능한 형태로 외부에서 끼워넣을 수 있다. 상기 샘플이 함유된 용기는 진단칩에 포함된 홀에 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 진단칩에 장착될 수 있다. 이러한 용기를 사용함으로써, 다른 시약들과 함께 일체형으로 샘플을 보관하여 발생되는 공간적 및/또는 시간적 제약에서 자유롭게 샘플을 보관 또는 처리할 수 있게 된다.

상기 용기의 형태는 예를 들어, 병, 통(tub), 튜브 또는 앰플일 수 있고, 그 재질에는 제한이 없으며, 예를 들어 용기 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스를 사용하여 제조될 수 있다.

상기 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질은 예를 들어, 단백질, 또는 핵산 및/또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들어 검출 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 이 때, 검출 대상 물질의 검출은 항원-항체 반응에 의한 면역분석(immunoassay) 방식으로 수행될 수 있다.

상기 면역분석은 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 샌드위치 분석, 유세포 분석 (flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

하나의 실시예에서, 상기 검출 대상 물질을 포함하는 샘플과 검출 대상 물질과 상호작용하는 1차 생물학적 검출 물질을 반응시키는 단계; 및 상기 검출 대상 물질과 상호작용이 이루어진 1차 생물학적 검출 물질에 결합하는 2차 생물학적 검출 물질을 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 검출 대상 물질과 상호작용하는 검출 물질이 항체인 경우, 1차 생물학적 검출 물질은 검출 대상 물질에 특이적으로 결합할 수 있고, 검출 대상 물질에 특이적으로 결합한 항체에 특이적으로 결합하는 항체를 2차 생물학적 검출 물질로 하여 반응이 수행될 수 있다.

상기 핵산 및/또는 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 앱타머 (aptamer)일 수 있다. 상기 앱타머는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 및/또는 올리고뉴클레오타이드 분자를 의미하며, 표적 분자에 결합하여 활성을 저해할 수 있다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 상기 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼약 200 뉴클레오타이드일 수 있다.

이 때, 상기 생물학적 검출 물질에 대한 생물학적 표지자는 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광염료, 염료, 단백질, 또는 발광성 물질로 표지된 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 포함된 반응 결과 이미징은 생물학적 표지자가 나타내는 형광, 방사선량, 발광 강도 등을 측정 및 분석하여 수행될 수 있다.

상기 졸-겔 스팟은 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 고정하기 위한 것으로, 졸 용액이 겔화되면서 고정될 수 있고 검출 대상 물질이 포함된 시료와 반응시 스팟이 떨어지지 않도록 고정될 수 있다.

상기 졸-겔 스팟의 크기는 예를 들어, 100-1000μm, 구체적으로 200-400μm일 수 있고, 더욱 구체적으로 250-350μm일 수 있다. 목적하는 범위 내에서 졸-겔 스팟의 크기가 너무 작으면 졸-겔 스팟의 탈착의 문제가 있고, 졸-겔 스팟의 크기가 크면 균일한 다공성 구조체 형성의 문제가 있다.

상기 졸-겔 스팟은 검출부에서 일 방향으로 하나 이상의 졸-겔 스팟이 적어도 하나의 열을 가지도록 마이크로 어레이 형태로 배치될 수 있다. 이를 통해 다양한 검출 대상 물질과 상호작용하는 다양한 생물학적 검출 물질을 고정할 수 있으므로, 한 번에 다중으로 질병 진단할 수 있게 된다.

이하에서, 본 발명에 따른 진단칩의 도면을 통해 상세하게 설명한다. 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가진다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 진단칩 (100)은 검출부 (110), 시약 및/또는 폐기물 보관부 (120), 샘플 및 운반수단 보관부 (130)로 구성된다. 본 발명에 따른 진단칩 (100)는 검출부 (110), 시약 및/또는 폐기물 보관부 (120), 샘플 및 운반수단 보관부 (130)를 포함하여 약 가로 (91.0mm) X 세로 (25mm) X 높이 (12.5mm)의 크기를 가질 수 있다.

샘플 및 운반수단 보관부 (130)는 피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단이 장착된 홀 (131) 및 검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기 장착부 (132)로 구성된다. 용기 장착부 (132)에 고정되는 용기는 예를 들어, 진단칩와 분리 가능한 병, 통(tub), 튜브 또는 앰플일 수 있다. 진단칩 별로 개별 피펫 팁과 용기가 포함되며, 복수의 샘플을 구별하기 위해 샘플에 태그 예를 들어, 바코드 또는 QR 코드 등을 표시할 수 있다.

경우에 따라서, 진단칩 (100) 사용자의 사용편의를 위해 일 측면에 손잡이 (133)가 부착될 수 있다.

검출부 (110)에는 검출 대상 물질 예를 들어, 핵산, 펩타이드, 단백질, 저분자 물질, 바이러스 또는 세포 상호작용하는 생물학적 검출 물질 예를 들어, 항원, 항체 또는 앱타머를 포함하는 졸-겔 스팟이 고정되어 있고, 졸-겔 스팟은 예를 들어 100-1000μm, 구체적으로 200-400μm의 크기, 더욱 구체적으로 250-350 μm의 크기를 가질 수 있다.

검출부 (110)에서 졸-겔 스팟은 하나 이상이 일 방향으로 배열되어 있으며, 적어도 하나 이상의 열을 가지도록 마이크로 어레이 형태로 배치될 수 있다. 이러한 졸-겔 스팟을 통해, 다양한 검출 대상 물질과 상호작용하는 다양한 생물학적 검출 물질 예를 들어, 하나 이상 또는 둘 이상의 생물학적 검출 물질을 고정할 수 있으므로, 한 번에 다중으로 질병 진단할 수 있게 된다.

시약 및/또는 폐기물 보관부 (120)는 검출 대상 물질과 생물학적 검출 물질의 반응 여부 확인을 위해, 생물학적 검출 물질에 대한 생물학적 표지자를 포함하는 반응 시약 보관부 (121), 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액을 포함하는 세척 용액 보관부 (122) 및 검출부에서 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 제거하는 폐기물 보관부 (123)로 구성된다. 도 3 내지 도 5 각각에 반응 시약 보관부 (121), 세척 용액 보관부 (122) 및 폐기물 보관부 (123)가 구체적으로 도시되어 있다.

반응 시약 보관부 (121)에 포함된 생물학적 표지자는 예를 들어, 생물학적 검출 물질을 탐지할 수 있는 방사성 동위원소, 형광염료, 염료, 단백질, 또는 발광성 물질로 표지된 항체 또는 앱타머일 수 있다.

세척 용액 보관부 (122)에 포함된 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 세척하기 위한 용액은 예를 들어 계면활성제, 제단백제 또는 이온화염물질을 소량 포함하는 용액 일 수 있다. 검출부에서 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 제거하는 폐기물 보관부 (123)는 예를 들어, 검출부에서 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 흡수하는 패드 형태일 수 있다. 폐기물 보관부 (123)는 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 흡수할 수 있는 다공성 재료라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 스폰지, 부직포, 천, 또는 솜 일 수 있다. 폐기물 보관부 (123)에서 폐기물을 처리함으로써 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질이 시약과 혼입됨으로써 발생하는 오염에 의해 검사 결과의 정확도가 저하되는 문제를 해결할 수 있다.

경우에 따라서, 검출부 (110)에는 스티커가 부착되고, 반응 시약 보관부 (121), 세척 용액 보관부 (122) 및 폐기물 보관부 (123)는 커버 부재를 실링하여 밀봉될 수 있다.

본 발명에 따른 일체형으로 포함된 단일 진단칩 (100)은 PVdF(polyvinylidene fluoride), 나일론(nylon), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), PU(polyurethane), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PLA(polylatic acid), PAN(polyacrylonitrile), PLGA,(polylactic-co-glycolic acid), PEI(polyethyleneimine), PPI(polypropyleneimine), PMMA (Polymethyl methacrylate), PVC (polyvinylcholride), PVAc(polyvinylacetate), 및 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체(Polystylene divinylbenzene copolymer)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상으로 사출된 플라스틱을 재질로 포함할 수 있으며, 구체적으로 폴리스타이렌(Polystyrene) 및/또는 폴리메틸 메타크릴레이트 (Polymethyl methacrylate)로 사출된 플라스틱을 재질로 포함할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 진단칩을 이용한 검출 대상 물질의 분석방법에 관한 것이다: 진단칩 중 검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기를 용기 장착부에 삽입하고, 피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단을 홀에 장착시키는 단계; 상기 검출 대상 물질을 포함하는 샘플을 운반 수단으로 흡입하여, 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하는 졸-겔 스팟이 고정된 검출부에 주입하는 단계; 상기 검출부에서 반응 후의 잔존 물질을 흡입하여, 폐기물 보관부에 배출하는 단계; 상기 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액을 포함하는 세척 용액 보관부에서 세척 용액을 검출부로 주입하여 상기 검출부 중 미반응 물질을 세척하는 단계; 상기 미반응 물질을 흡입하여, 폐기물 보관부에 배출하는 단계; 및 상기 검출부의 반응 결과를 이미징하는 단계에 관한 것이다.

구체적 분석방법은 다음과 같다.

1. 분석 준비

검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기 예를 들어, 튜브를 용기 장착부 (132)에 삽입하고, 피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단을 홀 (131)에 장착시킨다. 예열이 완료된 분석장치의 장착 커버를 올리고 진단칩 (100)을 장착시킨다. 진단칩 (100)은 진단기기에 장착되는데, 도 8에 나타낸 바와 같이 구동부 (driving part), 시린지 펌프 (Syringe pump) 및 광학부 (Optical portion)를 추가로 포함한다.

상기 구동부는 진단칩을 자동적으로 인식하여 항온시스템으로 갖춰진 기기반응부로 X축 이동시키고 리퀴드 핸들러 (Liquid handler) Y축 구동모듈과 지정된 위치로 작동하는 시스템을 가진다. 동 대한 오차율은 0.1mm로 정밀하게 설계될 수 있다. 진단칩 (100) 측정부의 졸-겔 반응 증폭을 위해 수백~수천 rpm의 컨트롤된 쉐이킹 기능이 추가되며 최종적으로 광학부와 정밀한 위치에서 측정되는 구조로 구성된다. 이러한 구조를 채널화 하여 최대 4개의 진단칩을 동시에 연동할 수 있다.

상기 시린지 펌프는 진단칩(100)의 이동 X축과 연동하여 작동되며 지정된 위치에서 각 단계의 샘플들을 주입-배출한다. 소모성 팁을 자동으로 탈- 부착하는 기능을 추가하며 진단칩(100)에 보관용기 호일을 연산된 압력 결과값 의해 펀칭을 할 수 있는 기능을 추가하여 작동장비의 다기능을 융합시켜 부피를 최소화할 수 있다. 주 기능인 샘플의 흡입-배출은 터치센서에 의해 고정된 특정위치를 인식하여 정확한 부피양을 조절할 수 있다. 흡입 배출의 오차범위를 1마이크로 리터로 극소량 컨트롤 가능할 수 있다.

상기 광학부는 진단칩 측정부의 졸-젤 고정화 스팟에서 형광적인 반응이 완료되면 광학모듈부로 이동 후 광학적 이미지를 센싱한다. 정확한 스팟의 위치를 인지하기 위해 참조 스팟 (Reference spot)으로부터 반응 스팟간의 공간적 알고리즘을 적용하며 반응 스팟의 픽셀 (pixel) 단위의 연산시스템을 포함할 수 있다. 발광부는 고감도 LED로 구성하며 수광부는 고해상도 (High resolution) CCD 모듈로 구성될 수 있다. 사용되는 형광파장 필터는 550~680nm에서 구성되어 장착될 수 있다. 진단칩의 측정창과 LED-CCD간의 광파 가이드 (Light wave guide)를 최적화함으로써 고감도로 센싱할 수 있다. LED 광의 온도변이위험성에 의한 결과값 왜곡현상을 방지하기 위해 측정부 주위를 항온시스템으로 유지할 수 있다.

2. 분석 진행

분석장치의 시작 버튼을 누르고, 진단칩의 샘플에 태그된 바코드를 인식하면서 반응 챔버 내로 이동하면서 단계가 진행될 수 있다. 펀칭으로 커버 부재로 실링되어 밀봉된 파우치를 오픈하여 반응 시약 보관부 (121), 세척 용액 보관부 (122) 및 폐기물 보관부 (123)가 개구되도록 한다.

홀 (131)에 피펫 팁 (pipet tip)을 고정시키고, 피펫 팁을 이동시켜 용기 장착부 (132)에 고정되는 용기에 함유된 샘플을 흡입하여 검출부 (110)에 주입하고, 교반하여 반응이 진행되도록 한다. 반응 시약 보관부 (121)의 생물학적 검출 물질에 대한 생물학적 표지자를 흡입하여 검출부 (110)에 주입하고, 교반하여 반응이 진행되도록 한다.

반응이 완료된 검출부 (110)의 반응 후 잔존 물질을 흡입하여 폐기물 보관부 (123)에 배출하고, 세척 용액 보관부 (122)에 포함된 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액으로 검출부 (110)의 미반응 물질을 흡입하여 폐기물 보관부 (123)에 배출한다. 경우에 따라서, 반응하지 않은 물질을 제거하기 위해 세척 용액으로 세척하는 과정은 3회 반복될 수 있다.

검출부 (110)에서의 반응 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다. 도 2에 따르면, 검출부 (110)의 졸-겔 스팟에 고정된 생물학적 검출 물질과 샘플 중 검출 대상 물질의 선택적 1차 면역 반응이 진행되고, 검출 대상 물질과 생물학적 검출 물질의 반응 여부 확인을 위해 생물학적 검출 물질에 대한 생물학적 표지자와 선택적 2차 면역 반응이 진행될 수 있다.

이후, 반응이 완료된 진단칩 (100)은 광학부로 이동시키고, 표준 시그널 (Raw Signal) 값과 진단칩 (100)으로부터 측정된 바코드값 및 기기 코드값의 연산에 의해 데이터를 처리하고, 디스플레이에 데이터를 송출시킨다.

이후, 진단칩 (100)은 자동으로 트레이에서 분리되고, 반응이 완료된 진단칩 (100)은 제거된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 인플루엔자 기존 Rapid 제품과 진단칩 졸-겔 스팟센서의 반응 결과 비교

기존 제품 Rapid 대비 졸-겔 스팟센서 제작과 전용 분석 장비 어세이에 의한 분석적 특이도 및 민감도 성능 차이에 대한 결과를 규명하고자 한다. 국제 influenza 패널인 Zeptomatrix influenza panel (음성: 8개/ Influenza A 양성: 7개/ Influenza B 양성: 5개)을 이용하여 국내 Rapid 제품 (패널을 스트립의 샘플 주입부에 10~15분간 담금) 및 본 발명에 따른 진단칩 졸-젤 스팟 진단방법을 통해 테스트를 진행하였다.

국내 Rapid 제품을 통한 진단 이미징 결과를 도 9 및 도 10에 각각 나타내었다. 이에 반해, 본 발명에 따른 방법에 의한 결과를 도 11 및 도 12에 각각 나타내었다.

구체적으로, 표 1에 따른 임상적 민감도 특이도 측정 기준에 따라 측정하였다.

[표 1]

민감도 : TP/TP+FN, 특이도 : TN/FP+TN

양성 예측도 : TP/TP+FP, 음성 예측도 : TN/TN+FN

위양성율 : FP/FP+TN = 1-특이도, 위음성율 : FN/TP+FN = 1-민감도

그 결과, 표 2 및 표 3에 따르면, Influenza A에 대한 민감도는 본 발명에 따른 방법이 7/7 = 100%, 특이도 : 13/13 = 100%으로 민감도 및 특이도가 모두 100% (표 2)인데 반해, 공지의 Rapid kit는 민감도 : 3/7 = 43%, 특이도 : 13/13 = 100% (표 3)로 낮아, 본 발명에 따른 방법이 우수한 민감도를 나타냄을 알 수 있다.

[표 2]

[표 3]

표 4 및 표 5에 따르면, Influenza B에 대한 민감도는 본 발명에 따른 방법이 5/5 = 100%, 특이도: 15/15 = 100%으로 민감도 및 특이도가 모두 100% (표 4)인데 반해, 공지의 Rapid kit는 민감도 : 3/5 = 60%, 특이도 : 13/13 = 100% (표 5)로 낮아, 본 발명에 따른 방법이 우수한 민감도를 나타냄을 알 수 있다.

[표 4]

[표 5]

실시예 2. 인플루엔자 2차원 항체 표면 고정화칩과 3차원 졸-젤 항체 고정화 진단 센서의 반응 결과 비교

표면 처리된 기판 위에 2차원으로 고정화된 항체와 본 발명에 따른 방법 중 검출부의 졸-겔에 의해 항체가 3차원적으로 고정화된 칩과의 인플루엔자 항원 어세이에 따른 성능을 평가하였다.

3차원적 고정은 다공성의 졸-겔 매트릭스에 단백질 및 항체와 같은 생물학적 검출 물질을 3차원 고정함으로써 반응하고자 하는 부위나 위치를 공극 부분에 노출시켜 다양한 위치에서 생화학적 반응이 이루어지도록 하는 것이다.

표면에 항체와의 고정화를 위하여 표면 처리(polyelectrolyte polymer)를 진행하여 2차원적으로 항체를 표면 고정화하고, 졸-젤 기법으로 3차원적 항체 고정화 방법을 진행하여 인플루엔자 항원과의 반응을 유도하였다. 이에 따른 항원 항체반응에 신호적 결과를 분석하였다.

[표 6]

표 6, 도 13 및 14에 따르면, 졸-겔 기법의 3차원적 항체 고정화한 본 발명으로 항체-항원반응 형광세기가 농도별 4배~ 9배로 민감도가 높음을 확인할 수 있다.

실시예 3: 인플루엔자 졸-겔 진단 센서를 이용한 임상 샘플 테스트 결과

인플루엔자 졸-겔 진단 칩을 이용하여 임상샘플 테스트에 대한 민감도/특이도 성능을 비교하였다. 고려대학교 구로병원 (임채승 교수)로부터 공급받은 임상샘플(음성검체: 200ea/ 양성검체 A/B 각 50ea)을 바탕으로 인플루엔자 Sol-gel 진단 칩 및 전용장비를 이용하여 인플루엔자를 30분 이내에 검출하고 진단하였다. (고려대학교 구로병원 질병진단 기준장비: Seegene사 Anyplex™ II RV16 Detection kit를 이용한 Bio-RAD사 CFX96™ Real-time PCR System으로 측정)

음성 검체 샘플을 테스트한 형광이미지를 도 15에 나타내었고, 도 16은 형광 데이터를 분석한 결과를 나타낸다. 이와 관련하여 Influenza A에 대한 검출 특이도는 다음 표 7, Influenza B에 대한 검출 특이도는 다음 표 8과 같다.

[표 7] Influenza A에 대한 검출 특이도

[표 8] Influenza B에 대한 검출 특이도

양성 검체 샘플을 Influenza A에 대하여 테스트한 형광이미지를 도 17에 나타내었고, 도 18은 형광 데이터를 분석한 결과를 나타낸다. 이와 관련하여 Influenza A에 대한 검출 특이도는 다음 표 9와 같다. 표 9에 따르면, 민감도는48/50 = 96%이다.

[표 9] Influenza A에 대한 민감도 분석

양성 검체 샘플을 Influenza B에 대하여 테스트한 형광이미지를 도 19에 나타내었고, 도 20은 형광 데이터를 분석한 결과를 나타낸다. 이와 관련하여 Influenza B에 대한 검출 특이도는 다음 표 10과 같다. 표 10에 따르면, 민감도는49/50 = 98%이다.

[표 10] Influenza B에 대한 민감도 분석

실시예 4: 졸-겔 진단 센서를 이용한 종양표지자 검사 (확대 응용 실시예 )

간암, 폐암, 췌장암, 담도암, 전립선암의 종양 표지자 (tumor marker)들을 하나의 졸-겔 마이크로 스팟 형태로 각각 고정한 단백질 면역 진단 센서로 제작하였다. 종양 표지자별 정상 참고치 및 신체기관 관여 분포는 표 11과 같다.

[표 11]

종양표지자 검출용 3차원 졸-겔 진단칩은 도 21에서와 같이 구성된다. 종양표지자 검출방법은 상기 인플루엔자 검사법과 동일하게 진행하였으며 한번에 다중의 종양표지자 검출할 수 있도록 졸-겔 스팟을 한 진단칩에 고정화한다.

상용화로 판매되는 종양표지자 물질을 (Meridian사 Tumor Marker protein, Lot 정보 CA19-9: 10D11915/ AFP: 3G19214/ CEA: 5H21615/ PSA: 8B04915) 정상 검체에 일정농도로 희석하여(CA19-9: 30U/ml, AFP: 10ng/ml, CEA: 5ng/ml, PSA: 5ng/ml) 졸-겔 진단칩과 검체 반응 형광이미지는 도 22에 나타낸 바와 같다. 상호 비특이적 반응은 없으며 경계값 농도구간에서도 충분한 형광세기 검출이 가능하다.

이를 바탕으로 종양표지자 항원 농도별 형광세기 분포도는 도 23 내지 도 26에서와 같다. 항원 농도의 증가에 따라 형광세기가 선형적인 증가추세를 확인 할 수 있고 해당 형광학적 세기를 종양표지자의 임상학적 농도결과값으로 재구성할 수는 기반을 가진다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

1. 다음의 구성이 일체형으로 포함된 단일 진단칩을 이용하여 검출 대상 물질을 검출하는 방법으로,
   검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기 장착부;
   검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하는 졸-겔 스팟이 고정된 검출부;
   검출 대상 물질과 생물학적 검출 물질의 반응 여부 확인을 위해, 생물학적 검출 물질에 대한 생물학적 표지자를 포함하는 반응 시약 보관부;
   검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액을 포함하는 세척 용액 보관부;
   검출부에서 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 제거하는 폐기물 보관부; 및
   피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단이 장착된 홀,
   상기 용기 장착부에 포함된 검출 대상 물질을 포함하는 샘플을 상기 검출부의 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질과 접촉시키고, 반응 결과를 이미징하는 것을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 검출 대상 물질은 생체 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플이 함유된 용기는 진단칩과 분리 가능한 병, 통(tub), 튜브 또는 앰플인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 대상 물질은 핵산, 펩타이드, 단백질, 저분자 물질, 바이러스 또는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질은 항원, 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 졸-겔 스팟은 100-1000μm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 졸-겔 스팟은 하나 이상의 생물학적 검출 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 검출부는 일 방향으로 하나 이상의 졸-겔 스팟이 적어도 하나의 열을 가지도록 마이크로 어레이 형태로 배치된 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 표지자는 생물학적 검출 물질을 탐지할 수 있는 방사성 동위원소, 형광염료, 염료, 단백질, 또는 발광성 물질로 표지된 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 폐기물 보관부는 검출부에서 반응 후의 잔존 물질 또는 미반응 물질을 흡수하는 패드인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 시약 보관부, 세척 용액 보관부 및 폐기물 보관부는 커버 부재를 실링하여 밀봉된 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출 대상 물질을 포함하는 샘플과 검출 대상 물질과 상호작용하는 1차 생물학적 검출 물질을 반응시키는 단계; 및
    상기 검출 대상 물질과 상호작용이 이루어진 1차 생물학적 검출 물질에 결합하는 2차 생물학적 검출 물질을 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 일체형으로 포함된 단일 진단칩은 폴리스타이렌(Polystyrene) 또는 폴리메틸 메타크릴레이트 (Polymethyl methacrylate)로 사출된 플라스틱을 재질로 하는 것을 특징으로 하는 방법
15. 다음의 단계를 포함하는 진단칩을 이용한 검출 대상 물질의 분석방법:
    진단칩 중 검출 대상 물질을 포함하는 샘플이 함유된 용기를 용기 장착부에 삽입하고, 피펫 팁 (pipet tip) 형태의 운반 수단을 홀에 장착시키는 단계;
    상기 검출 대상 물질을 포함하는 샘플을 운반 수단으로 흡입하여, 검출 대상 물질과 상호작용하는 생물학적 검출 물질을 포함하는 졸-겔 스팟이 고정된 검출부에 주입하는 단계;
    상기 검출부에서 반응 후의 잔존 물질을 흡입하여, 폐기물 보관부에 배출하는 단계;
    상기 검출 대상 물질과 반응하지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 용액을 포함하는 세척 용액 보관부에서 세척 용액을 검출부로 주입하여 상기 검출부 중 미반응 물질을 세척하는 단계;
    상기 미반응 물질을 흡입하여, 폐기물 보관부에 배출하는 단계; 및
    상기 검출부의 반응 결과를 이미징하는 단계.
    
    

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