KR20180030613A - Cho 세포에서의 개선된 일시적 단백질 발현을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 현탁 CHO 세포 중의 재조합 단백질의 높은 수준의 발현에 적합한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명의 도입이 상기 과정 동안에 성장 배지를 대체하거나 재충전하거나 보출할 필요를 제거하게끔 한다. 본 발명은 또한 현탁 CHO 세포를 형질전환/형질감염시키는데 유용한 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

CHO 세포에서의 개선된 일시적 단백질 발현을 위한 시스템 및 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은, 35 U.S.C. § 119 (e) 하에, 본원과 공동 소유되고, 이의 전체 내용이 본 명세서에 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에 참고로 명확히 포함된, 2015년 7월 13일에 출원된 발명의 명칭이 "System and Method for Improved Transient Protein Expression in CHO Cells"인 미국 가특허 출원 제62/191,969호에 대한 우선권의 권익을 주장한다.

기술 분야

본 발명은 일반적으로 형질감염 및 세포 배양의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 배양된 현탁 CHO 세포 중의 재조합 단백질의 수율 발현에 적합한 형질감염 시스템을 제공한다. 본 발명은 추가로 배양된 현탁 CHO 세포 중의 재조합 단백질의 고수율 발현을 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.

CHO 세포는 중국 햄스터 난소로부터 유래한 상피 세포 및 섬유아세포 세포 둘 다로서 분류된다. 중국 햄스터 난소(CHO-K1)로부터 시작한 세포주(Kao, F.-T. And Puck, T. T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275-1281 (1968))는 여러 해 동안 배양 중에 있지만, 이의 식별은 아직 확인되지 않았다.

대부분의 1차 포유류 상피 세포, 포유류 섬유아세포 세포, 상피 세포주 및 섬유아세포 세포주는 통상적으로 단층 배양으로 성장한다. 그러나, 몇몇 분야의 경우, 현탁 배양으로서 이러한 세포를 재배하는 것이 유리할 것이다. 예를 들어, 현탁 배양은 3차원 공간으로 성장한다. 그러나, 유사한 크기의 용기 중의 단층 배양은 용기 표면에서 오직 2차원으로 성장할 수 있다. 따라서, 현탁 배양은 단층 배양과 비교하여 더 높은 세포 수율 및 상응하게 더 높은 생물물질(예를 들어, 바이러스, 재조합 폴리펩타이드 등) 수율을 생성할 수 있다. 또한, 현탁 배양은, 단층 배양에 의해 대개 요구되는 것처럼, 트립신화 및 원심분리보다는, 배양 용기에 대한 새로운 배양 배지의 단순한 첨가(희석 계대배양)를 통해, 공급하고 확장하기가 대개 더 쉽다. 공급의 용이함 및 현탁 배양이 확장될 수 있음의 용이함은 필적하는 수의 세포를 취급하는 시간 및 노동력의 실질적인 절약에 상당한다.

그러나, 많은 부착 의존적 세포, 예컨대 1차 상피 세포, 1차 섬유아세포 세포, 상피 세포주 및 섬유아세포 세포주는 현탁 배양에 용이하게 적응되지 않는다. 이들이 통상적으로 최적 성장을 위해 기질에 대한 부착에 의존하므로, 현탁액 중의 이들 세포의 성장은 마이크로캐리어, 예컨대 라텍스 또는 콜라겐 비드에 대한 이의 부착을 요할 수 있다. 따라서, 전통적인 단층 배양보다 더 높은 밀도의 배양을 할 수 있으면서, 이러한 방식으로 성장한 세포는, 여전히 표면에 기술적으로 부착되고; 이들 세포의 계대배양은 따라서 단층 배양의 계대배양에 사용되는 것과 유사한 단계를 요한다. 더욱이, 큰 뱃지 또는 발효장치 배양이 확립될 때, 많은 용적의 마이크로캐리어는 대개 배양 용기의 바닥에 침강하여서, 세포에 전단 손상을 야기하지 않으면서, 마이크로캐리어(및 이에 따라, 세포)를 현탁액 중에 유지시키는 더 복잡한 아지테이션 기전을 요한다(Peshwa, M. V., et al., Biotechnol. Bioeng. 41:179-187 (1993)).

많은 형질전환된 세포가 현탁액 중에 성장할 수 있지만(Freshney, R. I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, New York: Alan R. Liss, Inc., pp. 123-125 (1983)), 성공적인 현탁 배양은 대개 비교적 고 단백질 배지 또는 혈청 또는 혈청 성분(예컨대, 부착 인자 피브로넥틴 및/또는 비트로넥틴)에 의한 배지의 보충, 또는 정교한 관류 배양 제어 시스템을 요하고(Kyung, Y.-S., et al., Cytotechnol. 14:183-190 (1994)), 이는 불리할 수 있다. 또한, 많은 상피 세포는 현탁액 중에 성장할 때 응집체 또는 "클럼프(clump)"를 형성하고, 이들은 성공적인 계대배양을 방해하고, 배양에 의한 생물물질의 성장률 및 생성을 감소시킬 수 있다. 클럼핑이 발생할 때, 배지에 노출된 전체 세포 표면적은 감소하고, 세포는 영양소가 고갈되고, 폐기물을 배지로 효율적으로 교환할 수 없다. 그 결과, 성장은 느려지고, 감소한 세포 밀도가 얻어지고, 단백질 발현이 손상된다.

CHO 세포는 생물치료학적 단백질을 발현하기 위한 우세한 숙주 시스템이고, 허가받은 생물물질의 거의 70%는 CHO에서 제조된다. 복수의 속성은, 혈청 비함유 및 화학적으로 한정된 배지 중의 고밀도 현탁 배양에 적응하는 이의 능력 및 인간에서 생물학적으로 활성인 번역 후 변형의 도입을 포함하는, 생물생성에 CHO 세포가 바람직하게 만든다. 이러한 이유로, 약물 개발 동안 초기에 일시적 CHO 유래한 단백질을 생성하는 능력은 하나로부터 또 다른 숙주 세포로 전환할 때 관찰된 단백질 품질/기능의 변화를 최소화하는 것이 매우 유리하다. 불행하게도, CHO 세포는 일시적 시스템에서 HEK293 세포보다 더 낮은 수준, 몇몇 경우에 최고의 293-기반 시스템보다 50배 내지 100배 낮은 단백질을 발현하는 것으로 널리 공지되어 있다. 추가로, 기존의 일시적 CHO 작업 흐름의 개별 성분의 개선을 통해 얻은 단백질 역가의 증가는 기껏해야 보통인 경향이 있다. 더 높은 일시적 CHO 단백질 생성에 대한 유의미한 충족되지 않은 수요를 해소하기 위해, 시스템 기반 접근법이 이용되고, 이로써 세포 배양 배지, 공급물, 형질감염 시약 및 발현 증강인자(enhancer)에서의 최근의 진전은 293-기반 시스템에서 관찰된 것과 필적하는 단백질 역가를 생성할 수 있는 CHO 세포에서 일시적 단백질 발현에 대한 작업 흐름을 생성하도록 고발현 CHO 클론과 함께 최적화되었다.

따라서, 감소한 양의 조작에 의해 세포의 형질감염을 허용하면서, 현탁액 중의 진핵생물 세포의 성장을 허용하는, 세포 배지 및 일시적 형질감염 시스템에 대한 수요가 당해 분야에서 여전히 존재한다. 이러한 배지는, 포유류 세포의 성장을 높은 밀도로 촉진하고/하거나, 재조합 단백질의 발현의 수준을 증가시키고, 세포 클럼핑을 감소시키고, 동물 단백질, 예컨대 혈청, 트랜스페린, 인슐린 등에 의한 보충을 요하지 않는, 바람직하게는 혈청 비함유 및/또는 화학적으로 한정된 및/또는 단백질 비함유 배지 및/또는 동물 유래한 재료가 결여된 배지이어야 한다. 바람직하게는, 이 유형의 배지는 상피 세포 및 섬유아세포 세포, 예컨대 293 세포 및 CHO 세포를 포함하는 보통 부착 의존적인 포유류 세포의 현탁 재배를 허용할 것이다. 바람직하게는, 이러한 배지는 또한 현재 이용 가능한 배지에 의해 통상적으로 얻어질 수 있는 것보다 더 높은 밀도에서 상기 언급된 세포 유형의 재배 및 배양이 가능하게 할 것이다. 추가로, 이러한 배양 배지는 생물기술 산업에서 배양된 포유류 세포에 의해 생성된 상업적으로 또는 과학적으로 중요한 생물학적 물질(예를 들어, 바이러스, 재조합 단백질, 생물물질, 재조합 항체 등)의 높은 분량의 더 용이하고 더 비용 효과적이고 효율적인 생성을 허용할 것이고, 포유류 세포의 재배를 이용하는 방법에 더 일관된 결과를 제공할 것이다. 이들 및 다른 수요는 본 발명에 의해 충족된다.

본 발명은 세포 배양 및 일시적 형질감염 시스템을 제공하고, 이로써 상기 시스템은 현탁 배양물 중에 복수의 진핵생물 CHO 세포로 하나 이상의 거대분자(예컨대, 적절한 배양 조건 하에 숙주 세포 내에 이의 발현을 허용하는 적어도 하나의 단백질 코딩 영역 및 추가 유전적 유전요소를 함유하는, DNA 또는 RNA 분자와 같은 발현 가능한 핵산 등)의 형질감염 및 후속하는 발현의 방식에 의한 도입을 지지하고, 추가로 도입/형질감염에 후속하는 CHO 세포의 재배 및 성장을 지지하고, 여기서 적어도 하나의 CHO 세포의 성장 및/또는 유지는, 새로운 고밀도 성장 배지에 의해 보충되거나 재충전되거나 대체되는, 고밀도 성장 배지의 부재 하에 고밀도 성장 배지에서 지속한다.

몇몇 실시형태에서, 이의 추가의 성장을 지지하도록 CHO 세포의 존재로부터 CHO 세포의 도입/형질감염 동안에 또는 후에 사용된 고밀도 성장 배지를 제거하거나 보충하거나 재충전하거나 대체하는 것이 필요하지 않다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 도입/형질감염 후에, CHO 세포의 성장 및 발현 가능한 핵산으로부터의 발현된 단백질의 생성은 도입/형질감염이 발생한 고밀도 성장 배지의 용적과 거의 동일한 용적 내지는 이와 약 50% 이하로 많은 배지의 용적 중에 달성될 수 있다. 본 발명의 고밀도 성장 배지를 사용하여, 핵산을 세포로 도입하기 후에, 및 핵산이 도입된 세포가 핵산으로부터 단백질을 일시적으로 발현시키도록 더 배양되기 전에 배지를 재충전하거나 대체하거나 보충하는 것이 필요하지 않다.

일시적 발현은 신속한 포유류 단백질 생성을 위한 선택의 시스템이 빨리 된다. 일시적 형질감염의 융통성은 수중의 단백질에 대한 개념으로부터 신속한 실현 시간이 가능하게 하고, 많은 상이한 단백질은 동시에 또는 순차적으로 생성될 수 있다. 일시적 형질감염 기술에서의 다음의 중요한 진전은, 일시적 포맷의 속도 및 융통성을 잃지 않으면서, 안정한 발현 시스템을 사용하여 획득된 발현 수준에 근접하거나 동일하다는 것이다. 본 발명자들은 처음으로 세포가 형질감염된 후 14일 내에 재조합 단백질, 예컨대 인간 IgG 및 비-IgG 단백질 등의 2g/ℓ 초과(약 4g/ℓ 이하)의 발현 수준을 생성하기 위해 고밀도 CHO-S 세포 배양을 이용하는 신규한 일시적 형질감염 시스템의 개발을 보고하였다.

이러한 높은 수준의 단백질 발현을 달성하기 위해, CHO 세포의 소정의 집단이 40x10⁶개의 세포/㎖ 이하(더 통상적으로 약 20x10⁶개의 세포/㎖ 이하)의 생존 가능한 세포 밀도에 도달하게끔 하는, 이러한 배지 중의 고밀도 성장에 적응된 현탁 CHO 세포의 집단과 조합하여, 추가로 단백질 발현 증강인자 조성물 및 세포 성장 조절제 조성물과 조합하여, 고밀도 성장 배지를 포함하는 신규한 세포 배양 시스템이 개발되었다. 이 고밀도 CHO 배양은 전통적인 프로토콜보다 더 높은 세포 밀도 및 단백질 역가에서 형질감염 및 단백질 발현이 가능하게 하여서, 단백질의 용적측정 수율을 유의미하게 증가시킨다. 형질감염 작업 흐름 후에 또는 동안에 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 발현 증강인자 제제 및 하나 이상의 성장 조절제 조성물의 첨가는 현재의 상업적으로 구입 가능한 일시적 형질감염 시스템에 의해 보이는 발현 수준보다 10배 내지 20배 이하로 높은 수준으로 단백질 발현 수준을 부스팅한다는 것이 또한 발견되었다. 현탁 CHO 세포(이하 CHO-S 세포라 칭함)의 고발현 클론은 선택되고 이후 고밀도 배양 조건 하에 개선된 성장, 생존능력 특징에 적응되고, 발현 시스템 및 작업 흐름은 이후 증가한 단백질 생성에 추가로 최적화되었다. 생성된 고밀도 CHO-S-H2H 세포는, 모 CHO-S 세포주 또는 CHO-S 세포를 생성시키는 세포주와 비교하여, 최적화된 성장률, 증가한 세포 크기, 현탁액 중의 감소한 세포 클럼핑 및 증가한 비생산성을 가진다. 마지막으로, 형질감염 방법 및 작업 흐름은 전체 단백질 수율을 추가로 증가시키도록 하나 이상의 발현 증강인자 제제 및 하나 이상의 성장 조절제 조성물과 조합되어 사용되는 하나 이상의 형질감염 시약의 사용을 통해 최적화되고, 이로써 초기 배양 용적의 1ℓ당 약 1g 내지 약 4g의 범위, 또는 임의의 범위 또는 여기에 해당하는 농도 범위의 단백질 수율이 일상적으로 달성 가능하다.

모든 이들 개선이 단일 발현 시스템으로 조합될 때, 단백질 수준은 상업적으로 구입 가능한 프리스타일(FreeStyle)(상표명) 293 또는 Expi293(상표명) 발현 시스템과 비교하여 IgG 및 비-IgG 재조합 단백질 둘 다에 대해 20배, 30배, 40배까지 증가하고, 2g/ℓ 초과의 발현 수준이 다수의 단백질에 대해 달성되었다. 추가로, 단백질 기능은 대중적인 상업적으로 구입 가능한 프리스타일(상표명) 293 또는 Expi293(상표명) 발현 시스템과 비교할 때 본 발명의 고수율 발현 시스템에서 발현된 몇몇 단백질에 대해 필적하는 것으로 입증되었다. 종합하면, 이들 결과는 기능적 단백질 수율의 유의미한 증가가, 단일의 사용에 용이한 포맷으로 단백질 발현 기술에서의 많은 진전을 통합한, 신규한 일시적 CHO 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명은 또한 CHO 세포를 재배하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 세포를 본 발명의 세포 고밀도 성장 배지와 접촉시키는 단계; (b) 배양물 중의 CHO 세포의 재배를 지지하기에 적합한 조건 하에 세포를 유지시키는 단계; 및 (c) 핵산을 발현시켜 단백질 생성물을 형성하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 배양물 중에 적어도 하나의 CHO 세포로 하나 이상의 거대분자를 도입하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 배양물 중에 고밀도 성장 배지 중에 적어도 하나의 진핵생물 세포를 배양하는 단계; (b) 적어도 하나의 거대분자 중 하나 이상이 적어도 하나의 세포에서 도입되게 하기에 적합한 조건 하에 적어도 하나의 거대분자를 배양물로 도입하는 단계; 및 (c) 생성물을 생성하도록 고밀도 성장 배지 중에 적어도 하나의 세포를 재배하는 단계(이의 생성은 적어도 하나의 분자에 의해 제어됨)를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 CHO 세포의 성장은 새로운 고밀도 성장 배지에 의해 보충되거나 재충전되거나 대체되는, 고밀도 성장 배지의 부재 하에 고밀도 성장 배지 중에 지속하고, 이의 성장을 지지하도록, 또는 내부에 형질감염된 하나 이상의 핵산에 의해 코딩된 단백질의 발현을 지지하도록, 적어도 하나의 CHO 세포의 존재로부터 도입 동안 사용된 고밀도 성장 배지를 제거할 필요가 없고/없거나, 도입 후, 성장은 도입이 발생한 배양물의 용적과 거의 동일한 용적 내지는 이와 약 50% 이하인 최종 배양 용적 중에 달성된다. 특히 배양 용적의 임의의 증가는 바람직하게는, 새로운 고밀도 성장 배지에 의한 고밀도 성장 배지의 첨가 또는 보충으로 인한다기보다는, 세포의 형질감염 후 배양물에 대한 성장 조절제 조성물 또는 발현 증강인자 조성물의 첨가로 인할 것이다.

본 발명은 또한 시험관내 CHO 세포의 재배 및 형질감염을 위한 키트를 제공하고, 키트는 본 발명의 고밀도 성장 배지를 포함하고, 임의로 세포로의 적어도 하나의 분자의 도입을 위한 하나 이상의 물질, 하나 이상의 거대분자, CHO-S-2H2 세포와 같은 CHO-S 세포의 집단, 하나 이상의 발현 증강인자 조성물, 하나 이상의 성장 조절제 조성물 중 하나 이상, 및 배양물 중에 적어도 하나의 CHO 세포를 배양하고/하거나, 배양물 중에 적어도 하나의 CHO 세포로 적어도 하나의 거대분자를 도입하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한, 단백질 발현을 허용하는 적절한 조건 하에 숙주 세포에서 이의 발현이 가능하게 하는 하나 이상의 유전요소 이외에, 본 발명의 CHO 세포 고밀도 성장 배지 및 적어도 하나의 CHO 세포, 적어도 하나의 세포로 적어도 하나의 거대분자를 도입하기 위한 하나 이상의 물질(즉, 바람직하게는 하나 이상의 양이온성 지질일 수 있는, 하나 이상의 형질감염제), 하나 이상의 발현 증강인자 조성물, 하나 이상의 성장 조절제 조성물, 및 적어도 하나의 단백질 코딩 영역을 포함하는 발현 가능한 핵산을 포함하는 하나 이상의 거대분자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 조성물을 제공한다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 CHO 세포의 현탁 배양물을 얻고(상기 CHO 세포는 고밀도 배양 조건 하에 성장에 적응됨), 현탁 CHO 세포의 성장을 허용하도록 적응된 고밀도 성장 배지 중에 상기 CHO 세포를 약 2x10⁶개 내지 약 2x10⁷개의 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하고, 형질감염 시약의 존재 하에 상기 CHO 세포를 발현 벡터에 의해 형질감염시키는 단계(발현 벡터는 발현된 단백질을 생성할 수 있는 핵산 서열을 포함함); 상기 형질감염된 CHO 세포를 제1 시간 기간 동안 항온처리하고, 상기 형질감염된 CHO 세포를 적어도 하나의 발현 증강인자 조성물 및 적어도 하나의 성장 조절제 조성물과 접촉시키고, 상기 발현 벡터가 상기 단백질을 발현하게 하는 조건 하에 제2 시간 기간 동안 상기 형질감염 증강인자 및 성장 조절제의 존재 하에 상기 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계; 및 상기 형질감염된 CHO 세포를 수확하고 발현된 단백질을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은, 상기 언급된 제2 시간 기간 후, 재차 형질감염된 세포를 상기 성장 조절제 조성물과 접촉시키는 단계 및 적어도 제3 시간 기간 동안 상기 형질감염된 세포를 항온처리한 후, 형질감염된 CHO 세포를 수확하고 발현된 단백질을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 상기 언급된 제3 시간 기간은 약 20일 이하, 약 15일 이하, 약 14일 이하, 약 13일 이하, 약 12일 이하, 약 11일 이하, 약 10일 이하, 약 9일 이하, 약 8일 이하, 약 7일 이하, 약 6일 이하, 약 5일 이하, 약 4일 이하, 약 20일, 약 15일, 약 14일, 약 13일, 약 12일, 약 11일, 약 10일, 약 9일, 약 8일, 약 7일, 약 6일, 약 5일, 약 4일일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 형질감염된 세포는 상기 언급된 발현 증강인자 조성물 및 성장 조절제 조성물과 접촉하고 이후 37℃ 미만 및 30℃ 초과, 35℃ 미만 및 31℃ 초과의 온도에서, 또는 약 32℃의 온도에서 추가로 배양될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 CHO-S 세포, 또는 CHO-S 세포의 유도체인 현탁 CHO 세포를 얻는 단계를 포함할 수 있고, 이 세포는 고밀도 배양 조건 하에 성장에 적응되고, 재조합 단백질의 증가한 생성에 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 현탁 CHO 세포는 CHO-S-2H2 세포, CHO-S-클론 14 세포 또는 ExpiCHO-S 세포일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 약 3x10⁶개 내지 약 15x10⁶개의 세포/㎖, 약 3.5x10⁶개 내지 약 12x10⁶개의 세포/㎖, 약 4x10⁶개 내지 약 10x10⁶개의 세포/㎖, 약 4.5x10⁶개 내지 약 9x10⁶개의 세포/㎖, 약 5x10⁶개 내지 약 8x10⁶개의 세포/㎖, 약 5.5x10⁶개 내지 약 7x10⁶개의 세포/㎖, 약 6x10⁶개 내지 약 6.5x10⁶개의 세포/㎖, 약 6x10⁶개 내지 약 6.25x10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 6x10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 적절한 고밀도 성장 배지 중에 현탁 CHO 세포를 배양 또는 재배하는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 이전에 기재된 단백질 발현 시스템에서 사용에 최적화된 형질감염 시약을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 형질감염 시약은 양이온성 지질 또는 중합체성 아민계 형질감염 시약일 수 있다. 실시형태에서, 적합한 형질감염 시약은 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 중합체, 또는 이의 유도체, 예컨대 선형 PEI 등을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 현재 기재된 단백질 발현 시스템에서 사용에 최적화된 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 적합한 양이온성 지질은 발명의 명칭이 "Novel Reagents for Transfection of Eukaryotic Cells"인 PCT 공보 WO 제2007/130073호, 발명의 명칭이 "MEMBRANE-PENETRATING PEPTIDES TO ENHANCE TRANSFECTION AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING SAME"인 PCT 공보 WO 제2015/089487호, 및 발명의 명칭이 "Transfection Reagents"인 PCT 공보 WO 제2000/027795호(본 명세서에서 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에서 참고로 그 전문이 명확히 포함됨)에 개시된 유형의 하나 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 상기 현탁 CHO 세포를 형질감염시키기 전에 양이온성 지질을 발현 벡터 또는 핵산 분자와 접촉시켜 형질감염 복합체를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 양이온성 지질은 적합한 수성 배지 중에 발현 벡터와 접촉할 수 있고, 이는 양이온성 지질과 핵산 분자 사이의 형질감염 복합체의 형성을 촉진한다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, 형질감염 복합체는 0℃ 초과 및 20℃ 미만, 15℃ 미만, 10℃ 미만, 8℃ 미만 또는 5℃ 미만의 온도에서 형성될 수 있다.

본 명세서에 기재된 실시형태와 사용하기에 적합한 현탁 배양물의 적합한 용적은 10㎖ 내지 약 5ℓ의 범위의 임의의 용적을 포함할 수 있지만, 본 명세서에서 고려되는 방법, 시스템, 키트 및 시약이 확장가능하고, 규정되지 않은 배양에 적응하도록 시스템 또는 방법의 변형이 당해 분야의 숙련자의 기술 수준 내에 있고, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 포함될 것 같다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명확할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 현탁 CHO 세포의 형질감염 전에 본 발명에 따라 사용되는 현탁 배양물의 용적은 약 20㎖ 내지 약 1500㎖, 약 25㎖ 내지 약 1000㎖, 약 30㎖ 내지 약 750㎖, 약 50㎖ 내지 약 500㎖, 약 75㎖ 내지 약 400㎖, 약 100㎖ 내지 약 200㎖의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 현탁 CHO 세포의 형질감염 전에 본 발명에 따라 사용되는 현탁 배양물의 용적은 약 20㎖, 약 25㎖, 약 30㎖, 약 35㎖, 약 40㎖, 약 45㎖, 약 50㎖, 약 55㎖, 약 60㎖, 약 65㎖, 약 70㎖, 약 75㎖, 약 80㎖, 약 100㎖, 약 125㎖, 약 150㎖, 약 175㎖, 약 200㎖, 약 250㎖, 약 300㎖, 약 400㎖, 약 500㎖, 약 750㎖, 1000㎖, 또는 약 1500㎖, 또는 이들 사이의 임의의 용적이다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 핵산 분자와의 이의 형질감염 후 현탁 CHO 세포를 발현 증강인자 조성물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 적합한 발현 증강인자 조성물은 발프로산, 나트륨 프로피오네이트, 나트륨 뷰티레이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 갈락토스, 아미노산, 또는 임의의 이들의 조합 중 적어도 1개, 임의로 1개 초과, 임의로, 2개, 임의로 3개, 임의로 4개를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물은 발프로산, 나트륨 프로피오네이트, 나트륨 뷰티레이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 갈락토스, 아미노산, 또는 상기 언급된 임의의 조합 중 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 발현 증강인자 조성물은 발프로산, 나트륨 프로피오네이트 및 나트륨 뷰티레이트를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물은 현탁 세포의 클럼핑을 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도, 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 또는 적어도 50% 감소시키는 조성물을 임의로 포함할 수 있다. 현탁 세포의 클럼핑을 감소시키는 이러한 조성물은 황산덱스트란을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물은 약 10㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖, 약 25㎎/㎖ 내지 약 175㎎/㎖, 약 50㎎/㎖ 내지 약 150㎎/㎖, 약 75㎎/㎖ 내지 약 125㎎/㎖, 약 90㎎/㎖ 내지 약 110㎎/㎖, 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물은 발프로산(VPA)을 포함할 수 있다. VPA는 발현 증강인자 조성물 중에 존재할 수 있다. 발현 증강인자 조성물 중의 발프로산의 농도는 약 5㎎/㎖ 내지 약 50㎎/㎖, 약 5mM 내지 약 200mM의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다. 발현 증강인자 조성물 중의 발프로산의 농도는 약 20mM 내지 약 150mM, 약 25mM 내지 약 125mM, 약 50mM 내지 약 100mM, 약 75mM 내지 약 80mM의 범위일 수 있다. 발현 증강인자 조성물 중의 발프로산의 농도는 약 50mM 내지 약 150mM, 약 75mM 내지 약 125mM, 약 80mM 내지 약 120mM, 약 90mM 내지 약 110mM 또는 약 100mM의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다. 발현 증강인자 조성물 중의 발프로산의 농도는 약 10㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖, 약 12㎎/㎖ 내지 약 18㎎/㎖, 약 14㎎/㎖ 내지 약 16㎎/㎖의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다. 발현 증강인자 조성물 중의 발프로산의 농도는 약 10㎎/㎖, 약 10.5㎎/㎖, 약 11㎎/㎖, 약 11.5㎎/㎖, 약 12㎎/㎖, 약 12.5㎎/㎖, 약 13㎎/㎖, 약 13.5㎎/㎖, 약 14㎎/㎖, 약 14.5㎎/㎖, 약 15㎎/㎖, 약 15.5㎎/㎖, 약 16㎎/㎖, 약 16.5㎎/㎖, 약 17㎎/㎖, 약 17.5㎎/㎖, 약 18㎎/㎖, 약 18.5㎎/㎖, 약 19㎎/㎖, 약 19.5㎎/㎖, 또는 약 20㎎/㎖의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물은 나트륨 프로피오네이트를 포함할 수 있다. 사용될 때, 발현 증강인자 조성물이 배양물에 첨가된 후에 배양물 중의 나트륨 프로피오네이트의 최종 농도는 약 0.2mM 내지 약 100mM, 약 0.5mM 내지 약 50mM, 약 0.75mM 내지 약 25mM, 약 1mM 내지 약 15mM, 약 1.25mM 내지 약 10mM, 약 1.5mM 내지 약 5mM, 약 b0.75mM 약 0.8mM, 약 1mM, 약 1.2mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.5mM, 약 1.7mM, 약 2.0mM의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물이 배양물에 첨가된 후에 배양물 중의 나트륨 프로피오네이트의 최종 농도는 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 0.2㎎/㎖의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물이 배양물에 첨가된 후에 배양물 중의 나트륨 프로피오네이트의 최종 농도는 약 0.5mM 내지 약 5mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 발현 증강인자 조성물이 배양물에 첨가된 후 배양물 중의 나트륨 프로피오네이트의 최종 농도는 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.05mM 내지 약 0.5mM, 약 0.01mM 내지 약 0.25mM, 약 5㎎/ℓ 내지 약 20㎎/ℓ, 약 8㎎/ℓ 내지 약 15㎎/ℓ, 약 10㎎/ℓ 내지 약 14㎎/ℓ의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 약 25㎖ 내지 약 50ℓ의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도의 용적을 가지는 CHO 세포의 현탁 배양물을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 배양 용적은 약 100㎖㎕ 내지 약 1ℓ의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 현탁 배양물의 용적은 약 200㎖㎕ 내지 약 500㎖의 범위일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 약 1x10⁶개 내지 약 50x10⁶개의 세포/㎖, 약 2x10⁶개 내지 약 25x10⁶개, 약 10x10⁶개 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖, 또는 임의의 세포 밀도 또는 여기에 해당하는 세포 밀도의 범위의 형질감염 단계의 세포 밀도를 가지는 CHO 세포의 현탁 배양물 얻는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 고밀도 성장 배지 중의 이의 형질감염 후 연장된 기간 동안, 예를 들어 20일 이하 동안 세포를 배양하는 단계(여기서 이들은 형질감염됨), 및 추가로 고밀도 성장 배지가 형질감염 단계 후 추가 또는 새로운 배지에 의해 대체되거나 재충전되거나 보충될 필요 없이, 재조합 단백질의 발현에 허용 가능한 조건 하에 여기서 세포를 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 고밀도 성장 배지는 발현 가능한 핵산에 의한 세포의 형질감염 후 형질감염 단계 후에 대체되거나 재충전되거나 보충되지 않지만, 몇몇 실시형태에서 형질감염 후 배양은 본 명세서에 정의된 바와 같은 성장 조절제 조성물에 의해 초기 배양 용적의 30%, 40% 또는 50% 이하에 의해 보충될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 초과인 세포 생존능력에 의해 및 초기 세포 배양 용적의 적어도 1㎎/㎖, 1.25㎎/㎖, 1.5㎎/㎖, 1.75㎎/㎖, 2㎎/㎖, 2.25㎎/㎖, 2.5㎎/㎖, 2.75㎎/㎖, 3㎎/㎖, 3.25㎎/㎖, 3.5㎎/㎖, 3.75㎎/㎖, 4㎎/㎖ 이하의 재조합 단백질의 수율로, 2x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 5x10⁷개의 세포/㎖의 초과의 밀도로 형질감염된 CHO 세포의 성장을 촉진하는 혈청 비함유/단백질 비함유의 화학적으로 한정된 배양 배지인 고밀도 성장 배지를 얻는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은, 상기 발현 벡터에 의한 이의 형질감염 후 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 초과로 남은 세포 생존능력에 의해, 2x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 5x10⁷개의 세포/㎖의 초과의 밀도로 형질감염된 CHO 세포의 성장을 촉진하는 혈청 비함유/단백질 비함유의 화학적으로 한정된 배양 배지인 고밀도 성장 배지를 얻는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 고밀도 성장 배지 중의 이의 형질감염 후 연장된 기간 동안, 예를 들어 20일 이하 동안 세포를 배양하는 단계(여기서 이들은 형질감염됨), 및 추가로 고밀도 성장 배지가 형질감염 단계 후 추가 또는 새로운 배지에 의해 대체되거나 재충전되거나 보충될 필요 없이, 재조합 단백질의 발현에 허용 가능한 조건 하에 여기서 세포를 유지시키는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 고밀도 성장 배지 중의 이의 형질감염 후 연장된 기간 동안, 예를 들어 20일 이하 동안 세포를 배양하는 단계(여기서 이들은 형질감염됨), 및 재조합 단백질의 발현에 허용 가능한 조건 하에 여기서 세포를 유지시키는 단계(추가로 여기서 고밀도 성장 배지는 형질감염 단계 후 보충되거나 대체되거나 재충전되지 않음)를 포함할 수 있다.

몇몇 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 발현 가능한 핵산에 의해 현탁 CHO 세포를 형질감염시키는 단계 및 적어도 제1 시간 기간 동안 발현 가능한 핵산으로부터 재조합 단백질의 발현에 허용 가능한 조건 하에 CHO를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 제1 시간 기간은 약 12시간 내지 약 2일, 약 15 내지 약 36시간, 약 16시간 내지 약 30시간, 약 18 내지 약 28시간, 약 19 내지 약 26시간, 약 19 내지 약 25시간, 약 20 내지 약 24시간의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 시간이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 시간 기간은 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 48시간 이하, 또는 이들 사이의 임의의 시간일 수 있다.

몇몇 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법은 발현 가능한 핵산에 의해 현탁 CHO 세포를 형질감염시키는 단계 및 제1 시간 기간 동안 발현 가능한 핵산으로부터 재조합 단백질의 발현에 허용 가능한 조건 하에 CHO를 배양하는 단계, 및 제2 시간 기간 동안 형질감염된 세포를 적어도 발현 증강인자 조성물 및 적어도 성장 조절제 조성물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 제2 시간 기간은 약 20일 이하, 약 19일 이하, 약 18일 이하, 약 17일 이하, 약 16일 이하, 약 15일 이하, 약 14일 이하, 약 13일 이하, 약 12일 이하, 약 11일 이하, 약 10일 이하, 약 9일 이하, 약 8일 이하, 약 7일 이하, 약 6일 이하, 약 5일 이하, 약 4일 이하, 약 3일 이하, 또는 이들 사이의 임의의 시간이다.

몇몇 실시형태에서, 성장 조절제 조성물은 글루코스를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 성장 조절제 조성물 중의 글루코스의 삼투질농도는 약 500mOsm/㎏ 내지 약 700mOsm/㎏, 약 550mOsm/㎏ 내지 약 650mOsm/㎏, 약 575mOsm/㎏ 내지 약 625mOsm/㎏일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 성장 조절제 중의 글루코스의 농도는 약 85㎎/㎖ 내지 약 115㎎/㎖, 약 90㎎/㎖ 내지 약 110㎎/㎖, 약 95㎎/㎖ 내지 약 105㎎/㎖의 범위일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 성장 조절제 조성물은 복수의 아미노산을 포함할 수 있고, 각각의 아미노산은 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 8㎎/㎖의 범위의 농도를 가진다. 몇몇 실시형태에서, 성장 조절제 조성물은 약 1000mOsm/㎏ 내지 약 1500mOsm/㎏, 약 1100mOsm/㎏ 내지 약 1400mOsm/㎏, 약 1200mOsm/㎏ 내지 약 1300mOsm/㎏의 삼투질농도, 또는 이들 사이의 임의의 삼투질농도 또는 범위를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 성장 조절제 조성물은 약 1100mOsm/㎏, 약 1150mOsm/㎏, 약 1200mOsm/㎏, 약 1250mOsm/㎏, 약 1300mOsm/㎏, 약 1350mOsm/㎏, 약 1400mOsm/㎏, 약 1450mOsm/㎏, 약 1500mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 배양물의 용적은 형질감염된 CHO 세포가 수확될 때 현탁 세포가 형질감염된 때의 배양물의 용적의 약 150% 미만, 약 145% 미만, 약 140% 미만, 약 135% 미만, 약 130% 미만, 약 125% 미만, 약 120% 미만일 수 있고, 여기서 용적의 증가는 성장 배지의 첨가, 보충 또는 대체로 인한 것이 아니고, 오히려 성장 조절제 및 발현 증강인자 조성물의 첨가로 인한 것이다.

몇몇 실시형태에서, 배양물의 용적은 형질감염된 CHO 세포가 수확될 때 현탁 세포가 형질감염된 때의 배양물의 용적의 150% 미만, 약 145% 미만, 약 140% 미만, 약 135% 미만, 약 130% 미만, 약 125% 미만, 약 120% 미만일 수 있고, 여기서 용적의 증가는 성장 증강인자 및 발현 증강인자 조성물의 첨가로 인한 것이다.

본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 하기 도면 및 설명, 및 청구항의 견지에서 당업자에게 명확할 것이다.

참고에 의한 포함

본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은, 각각의 공보, 특허 및 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 본 명세서에서 참고로 포함된 것과 동일한 정도로, 본 명세서로 참고로 그 전문이 본 명세서에서 포함된다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서에서의 명세서가 지배할 것이다. 본원에서의 임의의 참고문헌의 인용 또는 확인은 이러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용 가능하다는 인정으로 해석되지 않아야 한다.

본 발명은 동반된 도면을 참조하여, 오직 예로서 본 명세서에 기재되어 있다. 이제 자세히 도면에 대한 구체적인 참고에 의해, 도시된 특정사항이 예의 방식이고 오직 본 발명의 바람직한 실시형태의 예시적인 설명의 목적을 위한 것이고, 가장 유용하다고 믿어지는 것을 제공하는 원인으로 제시되고, 본 발명의 원칙 및 개념 양태의 설명을 용이하게 이해한다는 것이 강조된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해에 필요한 것보다 더 자세히 본 발명의 구조적인 상세사항을 보여주도록 시도가 이루어지지 않았다. 본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구항에 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 이익의 더 양호한 이해는 본 발명의 원칙이 이용되는 예시적인 실시형태를 설명하는 하기 상세한 설명, 및 동반된 도면에 참고하여 얻어질 것이고, 도면에서
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따라 고발현 CHO 클론을 식별하기 위한 예시적이지만 비제한적인 작업 흐름을 예시하는 도식적 다이어그램이다. CHO 세포는 일시적으로 형질감염되고, ClonePix 시스템(Molecular Devices)을 사용하여 단백질 발현에 대해 평가되었다. 3개의 상이한 단백질은, 클론이 다중웰 진탕 플레이트로부터 125㎖ 플라스크로 확장되는 시간 동안에, 발현에 대해 시험되었다;
도 2a는 해동 후 계대배양 10(파선) 또는 계대배양 34(실선)에서의 CHO-S-2H2 세포가 계대배양에 걸쳐 매우 유사한 성장 프로필에 의해 일상적 진탕 플라스크 배양에서 20x10⁶개의 생존 가능 세포/㎖ 이상을 지속적으로 달성한다는 것을 입증하는 그래프이다;
도 2b는 CHO-S-2H2 세포가 광범위한 계대배양에 걸쳐 발현된 단백질의 고역가를 지속적으로 나타낸다는 것을 보여주는 막대 그래프이다;
도 2c는, 1㎍/㎖의 플라스미드 DNA를 요하는 통상적인 일시적 형질감염 프로토콜과 비교하여, 0.5㎍/㎖ 미만의 플라스미드 DNA를 사용하여 Expi펙타민CHO(상표명) 형질감염 시약을 사용하여 최대 단백질 수율이 달성될 수 있다는 것을 보여주는 막대 그래프이다;
도 2d는 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 증강인자 시약의 사용이 본 발명의 일시적 CHO 발현 시스템에서 단백질 역가를 배가시킨다는 것을 입증하는 막대 그래프이다;
도 3a는 프리스타일(상표명) CHO, Expi293(상표명) 발현 시스템, 및 본 발명의 CHO 발현 시스템인 3개의 고유한 단백질을 사용하여 얻어진 인간 IgG 단백질의 평균 단백질 수율을 보여주는 막대 그래프이다. Expi293(상표명) 발현 시스템과 비교하여, 본 CHO 발현 시스템은 인간 IgG의 대략 3배 더 높은 역가를 생성하였다. 프리스타일CHO(상표명) 발현 시스템과 비교하여, 본 CHO 발현 시스템은 인간 IgG의 대략 160배 더 높은 역가를 생성하였다;
도 3b는 프리스타일(상표명) CHO, Expi293(상표명) 발현 시스템, 및 본 발명의 CHO 발현 시스템인 3개의 고유한 단백질을 사용하여 얻어진 토끼 IgG 단백질의 평균 단백질 수율을 보여주는 막대 그래프이다. Expi293(상표명) 발현 시스템과 비교하여, 본 CHO 발현 시스템은 토끼 IgG의 대략 4배 더 높은 역가를 생성하였다. 프리스타일CHO 발현 시스템과 비교하여, 본 CHO 발현 시스템은 토끼 IgG의 대략 95배 더 높은 역가를 생성하였다;
도 3c는 프리스타일(상표명) CHO, Expi293(상표명) 발현 시스템, 및 본 발명의 CHO 발현 시스템인 3개의 고유한 단백질을 사용하여 얻어진 에리쓰로포이에틴(Epo)의 평균 단백질 수율을 보여주는 막대 그래프이다. Expi293(상표명) 발현 시스템과 비교하여, 본 CHO 발현 시스템은 Epo의 대략 2배 더 높은 역가를 생성하였다. 프리스타일CHO 발현 시스템과 비교하여, 본 CHO 발현 시스템은 Epo의 대략 25배 더 높은 역가를 생성하였다;
도 4는 Expi293(상표명) 발현 시스템(뒤의 빗금) 및 ExpiCHO(상표명) 발현 시스템(앞의 빗금)의 높은/최대 역가 프로토콜에서 pcDNA3.4 발현 벡터 DNA로부터 발현된 일련의 20개의 상이한 토끼 단일클론 항체의 발현 수준(㎎/㎖ 단위)을 보여주는 막대 그래프이다;
도 5는 몇몇 비제한적인 실시형태에 따른 CHO 발현 시스템의 표준, 높은 및 최대 역가 수율을 얻기 위한 프로토콜의 도식적 다이어그램이다. TFXR이 "형질감염 시약"(이 경우에 Expi펙타민(상표명) CHO)의 약어라는 것에 주목한다;
도 6a는 표준 역가 프로토콜(빗금 하부 곡선), 고역가 프로토콜(파선 중간 곡선), 및 최대 역가 프로토콜(실선 상부 곡선)을 사용하여 실시형태에 따른 CHO 발현 시스템(이 경우에 Life Technologies의 ExpiCHO(상표명) 발현 시스템)에서 인간 IgG 발현의 상대 수율을 보여주는 그래프이다;
도 6b는 도 6b에 도시된 실험으로부터의 세포의 배양에서 일의 수의 함수로서의 생존능력을 보여주는 그래프이다;
도 7은 Expi293(상표명) 시스템(막힌 사각형), 항체를 안정하게 발현하는 CHO-S 유래한 세포주(열린 삼각형) 및 ExpiCHO(상표명) 발현 시스템(최대 역가 프로토콜)을 사용하여 생성된 단백질 단일클론 항체(mAb)의 리간드 결합 활성의 평가를 보여준다;
도 8은 Expi293(상표명) 발현 시스템(왼쪽), 일시적 CHO 발현 시스템(ExpiCHO(상표명) 발현 시스템, 최대 역가 프로토콜; 중간) 및 안정한 CHO-S 세포주(오른쪽)에서 인간 IgG 단백질의 표시된 N 연결된 글라이코실화 프로필을 입증하는 막대 그래프이다;
도 9a는 일 실시형태에 따른 일시적 CHO 발현 시스템(ExpiCHO(상표명) 발현 시스템, 최대 역가 프로토콜)에서 발현된 인간 IgG1의 HILIC LC-FLD-MS N-글라이칸 프로파일링을 도시하는 그래프이다;
도 9b는 인간 IgG1을 발현하는 안정한 CHO-S 세포주에서 발현된 인간 IgG1의 HILIC LC-FLD-MS N-글라이칸 프로파일링을 도시하는 그래프이다;
도 9c는 Expi293(상표명) 발현 시스템에서 발현된 인간 IgG1의 HILIC LC-FLD-MS N-글라이칸 프로파일링을 도시하는 그래프이다;
도 10은 컨트롤 룸 35㎖ 내지 1ℓ 배양 용적의 15% 내로의 몇몇 실시형태에 따른 CHO 발현 시스템의 확장성을 입증하는 막대 그래프이다.

본 발명은 진핵생물 및 원핵생물 세포 둘 다의 성장을 위한 개선된 배지 제제를 제공한다. 본 발명의 배지는, 성장, 도입 및/또는 재배 사이의 배지의 재충전, 대체, 보충 또는 변경을 요하지 않으면서, 세포 성장, 배양물 중의 세포로의 거대분자의 도입 및 세포 재배를 지지한다. 본 발명의 배지는 임의의 세포의 성장 및 재배를 지지하거나 증대시키도록 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 원치 않는 성분, 예를 들어 동물 유래 성분을 대체하기 위해 또는 치환물로서 사용되는 화합물을 제공한다. 대체 화합물은 원치 않는 성분의 적어도 하나의 원하는 기능을 제공한다.

정의

하기하는 설명에서, 세포 배양 및 재조합 DNA 기술에서 사용된 다수의 용어는 광범위하게 사용된다. 이러한 용어에 주어진 범위를 포함하여, 명세서 및 청구항의 명확하고 더 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다.

배양물로의 거대분자 또는 화합물의 용어 "도입"은 배양 배지로의 거대분자 또는 화합물의 제공을 의미한다.

적어도 하나의 세포로의 거대분자 또는 화합물의 용어 "도입"은 거대분자 또는 화합물이 세포에 내재화되도록 세포에 대한 거대분자 또는 화합물의 제공을 의미한다. 예를 들어, 거대분자 또는 화합물은 형질감염, 형질전환, 주사, 및/또는 리포솜 도입을 이용하여 세포로 도입될 수 있고, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다른 방법을 이용하여 세포로 또한 도입될 수 있다. 바람직하게는, 거대분자 또는 화합물은 리포솜 도입에 의해 세포로 도입된다. 거대분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 거대분자는 단백질일 수 있다. 대안적으로, 거대분자는 펩타이드일 수 있다. 대안적으로, 거대분자는 폴리펩타이드일 수 있다. 거대분자는 또한 핵산일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "거대분자"는 생물분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 거대분자는 핵산을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 용어 거대분자는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 의미한다. 더 바람직하게는, 용어 거대분자는 DNA를 의미한다. 더 바람직하게는, 용어 거대분자는 상보성 DNA(cDNA)를 의미한다. 거대분자는 하전되거나 비하전될 수 있다. DNA 분자는 하전된 거대분자의 예이다. 몇몇 경우에, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "거대분자"는 용어 "발현 가능한 핵산"과 상호 교환되어 사용될 수 있다.

용어 "형질감염"은 핵산, 단백질 또는 다른 거대분자가 세포에서 발현되거나 생물학적 기능을 가지도록, 표적 세포에 대한 핵산, 단백질 또는 다른 거대분자의 전달을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "발현 가능한 핵산"은 분자량과 관련 없이 DNA 및 RNA 둘 다를 포함하고, 용어 "발현"은, 제한 없이, 일시적 발현 및 안정한 발현 둘 다를 포함하는, 세포 내의 핵산의 기능적 존재의 임의의 표시를 의미한다. 기능적 양태는 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질 전달에 의한 발현의 저해를 포함한다.

용어 "핵산의 발현" 및 이의 균등물은 세포에서의 핵산의 복제, 메신저 RNA로의 DNA의 전사, 단백질로의 RNA의 번역, 단백질의 번역 후 변형 및/또는 세포에서의 단백질 수송(trafficking), 또는 이들의 변형 또는 조합을 의미한다.

용어 "성분"은 세포의 성장 또는 증식을 유지시키거나 촉진하도록 세포 배양 배지에서 사용될 수 있는, 화학 또는 생물 기원이든지, 임의의 화합물을 의미한다. 용어 "성분", "영양소" 및 "성분"은 상호교환되어 사용될 수 있고, 모두 이러한 화합물을 의미하도록 의도된다. 세포 배양 배지에서 사용되는 통상적인 성분은 아미노산, 염, 금속, 당, 지질, 핵산, 호르몬, 비타민, 지방산, 단백질 등을 포함한다. 생체외 세포의 재배를 촉진하거나 유지시키는 다른 성분은 특정한 수요에 따라 당해 분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명의 배지는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA) 또는 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA), 천연(동물) 또는 재조합 소스로부터 유래한 하나 이상의 성장 인자, 예컨대 상피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF) 또는 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor: FGF), 하나 이상의 지질, 예컨대 지방산, 스테롤 및 인지질, 하나 이상의 지질 유도체 및 복합체, 예컨대 포스포에탄올아민, 에탄올아민 및 지단백, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 스테로이드 호르몬, 예컨대 인슐린, 하이드로코티손 및 프로게스테론, 하나 이상의 뉴클레오타이드 전구체; 및 하나 이상의 미량 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "세포"는 모든 유형의 진핵생물 및 원핵생물 세포를 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 용어는 포유류 세포, 특히 포유류 CHO 세포를 의미한다. 소정의 예시적이지만 비제한적인 실시형태에서, 용어 "세포"는 현탁 CHO-S 세포, 또는 이의 변이체, 예컨대 현탁액 중에 성장할 수 있는 것과 같은 CHO-S-2H2 변이체(Life Technologies Corp(캘리포니아주 칼스바드)로부터 EXPICHO-S(상표명) 세포로서 상업적으로 구입 가능) 등을 의미하도록 의도된다. 현탁 배양물 중에 성장하고 증식하고 형질감염될 수 있는, 본 명세서에서 CHO-S-2H2 세포라 칭하는, 현탁 CHO-S 세포의 변이체, 특히 고밀도(예를 들어, 약 2x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 더 바람직하게는 약 10x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 또는 심지어 임의로 약 20x10⁶개의 세포/㎖ 초과)로 배양될 수 있는 변이체가 본 명세서에 개시된 실시형태에 필요하지는 않지만 특히 바람직하다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "고밀도"는, 본 발명에 따라 세포를 배양하는 것 및 형질감염 작업 흐름을 수행할 목적을 위해 이를 사용하는 본 발명의 방법의 맥락에서 사용될 때, 일반적으로, 높은 효율로 형질감염되는 능력을 여전히 보유하면서, 60% 초과, 35% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과 또는 90% 초과의 전체 세포 생존능력을 보유하면서, 약 2x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 더 바람직하게는 약 10x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 가장 바람직하게는 약 20x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 또는 심지어 임의로 약 40x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 50x10⁶개의 세포/㎖ 초과까지의 밀도로 적절한 세포 배양 배지 중에 성장하거나 배양될 수 있고, 높은 수준(예를 들어, 1㎎/㎖ 내지 약 4㎎/㎖ 이상을 초과하는 수준)으로 표적 단백질을 발현할 수 있는, 공지된 세포주, 또는 공지된 세포주의 변이체를 의미한다.

구절 "고밀도 배양 배지"는, 약 75%의 초과로 상기 세포의 생존능력을 유지시키면서, 추가로 효율적으로 형질감염되고 많은 양(1.5㎎/㎖ 초과의 배양)의 재조합 단백질을 발현하는 상기 현탁 세포의 능력을 유지시키면서, 약 2x10⁷개의 세포/㎖ 이하의 밀도로 포유류 세포, 바람직하게는 현탁액 중에 성장하는 세포의 성장을 지속할 수 있는 임의의 배양 배지를 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. 본 발명의 실행에서 사용되는 "고밀도 배양 배지"는 상이한 분야 및 용도 사이에 변할 수 있고, 하기 기재된 바대로 사용되는 세포주의 성질, 일시적으로 발현되는 원하는 단백질, 세포로의 발현 벡터의 이동에 선택된 형질감염 양상의 성질 및 시스템에 첨가되는 임의의 발현 증강인자의 양 및 성질에 따라 변할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 일시적 발현 시스템 및 방법에서 사용하도록 고려되는 바람직한 "고밀도 배양 배지"는 통상적으로 혈청 비함유, 단백질 비함유일 것이고, 약 2x10⁷개의 세포/㎖ 이하, 더 통상적으로 약 2x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 1x10⁷개의 세포/㎖의 밀도로 현탁 세포의 재배 및 성장을 허용하고, 추가로 일시적 발현 시스템에서 생성된 단백질의 수율이 세포 배양물의 1㎖당 적어도 200㎍ 내지 세포 배양물의 1㎖당 2㎎, 더 통상적으로 세포 배양물의 1㎖당 약 500㎍ 내지 세포 배양물의 1㎖당 약 1㎎을 초과하게끔 할 것이다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용되는 고밀도 배양 배지는 약 1x10⁶개 내지 약 50x10⁶개의 세포/㎖, 약 2x10⁶개 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 3x10⁶개 내지 약 10x10⁶개의 세포/㎖의 범위의 밀도로 세포의 형질감염을 촉진할 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 예시적인 고밀도 배양 배지는 EXPICHO(상표명) 발현 배지, HuMEC 기본 혈청 비함유 배지, 넉아웃(상표명) CTS(상표명) XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPRO(상표명)-34 SFM 배지, STEMPRO(상표명) NSC 배지, 에센셜(상표명)-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, 에센셜(상표명)-6 배지, STEMPRO(상표명)-34 배지, Gibco(등록상표) 성상교세포 배지, AIM V(등록상표) 배지 CTS(상표명), AMINOMAX(상표명) C-100 기본 배지, AMINOMAX(상표명)-II 컴플리트 배지, CD FORTICHO(상표명) 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) CHO 발현 배지, CD OPTICHO(상표명) 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900(상표명) 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6(등록상표) 세포 배지, AIM V(등록상표) 배지, EXPILIFE(등록상표) 배지, 각질세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 임의의 이들의 유도체 또는 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 고밀도 배양 배지는 CD FORTICHO(상표명) 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) CHO 발현 배지, CD OPTICHO(상표명) 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) 293 발현 배지, Expi293(상표명) 발현 배지, 또는 유사한 배지, 또는 이들의 변형된 버전일 수 있다. 상기 기재된 예시적인 고밀도 배양 배지는 고밀도 배양 시스템에서 사용하도록 적응된 CHO 세포, CHO 세포 변이체, 293 세포, 293 세포 변이체, CapT 세포, CapT 세포 변이체, 또는 임의의 다른 세포의 고밀도 성장, 전파, 형질감염 및 유지에 특히 적합할 수 있다.

구절 "고밀도 배양에 적응된 세포"는, 약 60% 이상에서 세포 생존능력을 보유하면서, 고밀도 배양 배지 중에 고밀도로 성장하도록 적응된, 세포 계통 또는 동일한 모 세포 계통으로부터 유래한 세포의 (클론 또는 비클론) 집단을 의미하도록 의도된다. 이러한 세포는 40 초과, 50 초과, 60 초과, 70 초과 또는 80 초과의 순차 계대배양에 걸쳐 고밀도로 세포를 유지시키고, 원하는 고밀도 배양 배지에 의해 성장 배지의 비율을 점진적으로 대체함으로써 세포의 모 집단으로부터 단리되거나 선택될 수 있다. 임의로, 상기 과정 동안에, 세포의 상이한 풀(pool)은, 형질감염 효율 및 또는 단백질 발현 효율을 동시에 평가하면서, 개별적으로 전파되고 선택 절차로 처리될 수 있어서, 세포의 비클론 집단은 고밀도로 지속되고 성장하고, 높은 효율로 형질감염되고, 높은 수준의 원하는 재조합 단백질을 발현하도록 선택될 수 있다. 다양한 세포 유형 및 계통이 이 선택 절차로 처리될 수 있다는 것이 숙련자에게 용이하게 명확할 것이지만, CHO 세포로부터 유래한 세포 계통, 293 섬유아세포 세포로부터 유래한 세포 계통 및 CapT 세포로부터 유래한 세포가 고밀도 성장 조건에 적응하도록 선택 과정에 특히 수정 가능하다고 결정되었다. 이상적으로, 고밀도 성장 배양에 적응되고 본 발명에서 사용하기에 수정 가능한 세포는 또한 높은 효율로 형질감염될 수 있고/있거나, 재조합 단백질을 적어도 세포 배양물의 1㎖당 약 1㎎ 내지 세포 배양물의 1㎖당 약 4㎎, 더 통상적으로 세포 배양물의 1㎖당 약 150㎎ 내지 세포 배양물의 1㎖당 약 3㎎을 초과하는 수율로 발현할 수 있을 것이다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용되는 고밀도 배양에 적응된 세포는 약 2x10⁶개의 세포/㎖, 더 바람직하게는 약 10x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 가장 바람직하게는 약 20x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 또는 심지어 임의로 약 40x10⁶개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 50x10⁶개의 세포/㎖ 초과까지의 범위의 밀도로 지속되고 형질감염될 수 있다.

"세포 배양" 또는 "배양"이란 인공 시험관내 환경에서 세포의 유지를 의미한다.

"재배"란 성장 및/또는 분화 및/또는 지속된 생존능력을 선호하는 조건 하에 시험관내 세포의 유지를 의미한다. "재배"는 "세포 배양"과 상호교환되어 사용될 수 있다. 재배는 배양 배지의 1㎖당 생존가능 세포의 수에 의해 평가된다. 거대분자의 도입 후 재배는 바람직하게는 생성물, 예를 들어 바이러스 상의 단백질 생성물의 생성을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "배지를 재충전, 대체 또는 보충"은 배양물에 이미 존재하는 배지에 새로운 세포 배양 배지의 용적을 첨가하는 것 및/또는 새로운 배지에 의해 배양물에 이미 존재하는 배지를 대체하는 것 및/또는 새로운 배지에 의해 배양물에 이미 존재하는 배지를 보충하는 것을 의미한다. 새로운 배지는 적어도 하나의 세포로 도입되는 하나 이상의 거대분자 또는 화합물을 함유하지 않는 배지 또는 재배에서 이의 성장을 지지하도록 세포와 접촉하지 않은 배지이다. 숙련자는 당해 분야에 공지된 기법, 예컨대 세포 계수(수동 또는 자동), 트립판 블루 배제, 단백질 또는 다른 물질의 생성, 알라마르 블루 검정(alamar blue assay), 하나 이상의 대사 생성물의 존재 또는 농도, 세포 유착, 형태학적 출현, 소비된 배지의 분석 등에 의해 세포 성장 및/또는 생존능력을 모니터링함으로써 배지를 제거하고/하거나 재충전하거나, 대체하거나 보충하는 것으로부터의 이익 또는 이의 필요가 있는지를 결정할 수 있다. 모니터링 기법 중 하나 또는 이의 조합은 적어도 하나의 거대분자의 도입 후 배지가 적어도 하나의 거대분자의 성장, 도입 및/또는 재배를 지지할 필요가 있는지를 결정하도록 이용될 수 있다.

"재조합 단백질"은 숙주 세포로 도입되는 핵산에 의해 코딩된 단백질을 의미한다. 숙주 세포는 핵산을 발현한다. 용어 "핵산을 발현하는"은 "핵산에 의해 코딩된 RNA로부터 단백질을 발현하는"과 동의어이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "단백질"은 광범위하게 중합된 아미노산, 예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 지단백, 당단백질 등을 의미한다.

용어 "단백질 수율"은 배양된 세포에 의해 발현된 단백질의 양을 의미하고, 예를 들어 배지 1㎖당 생성된 단백질의 그램의 면에서 측정될 수 있다. 단백질이 세포에 의해 분비되지 않는 경우, 단백질은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 세포의 내부로부터 단리될 수 있다. 단백질이 세포에 의해 분비되는 경우, 단백질은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 세포에 의해 발현된 단백질의 양은 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 단백질은 재조합 단백질일 수 있다.

"단백질 생성물"은 단백질에 의한 생성 또는 작용과 연관된 생성물이다. 단백질 생성물은 단백질일 수 있다. 단백질 생성물은 또한 생성물을 생성하도록 하나 이상의 다른 물질에 의해 단백질의 작용으로부터 생긴 생성물일 수 있다. 이러한 작용의 예는 단백질에 의한 효소 작용이다.

"현탁 배양"이란 배양 용기 내의 대부분 또는 모든 세포가 현탁액 중에 존재하고, 배양 용기 내의 소수의 세포가 용기 표면 또는 용기 내의 또 다른 표면에 부착되거나 어떤 세포도 부착되지 않는 세포 배양을 의미한다. 바람직하게는, "현탁 배양"은, 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은, 현탁액 중에 있는 배양 용기 내의 75% 초과의 세포를 가진다. 더 바람직하게는, "현탁 배양"은, 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은, 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 85% 초과의 세포를 가진다. 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 95% 초과의 세포를 가지는 "현탁 배양"이 심지어 더 바람직하다.

본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 세포의 단층 또는 현탁 배양, 형질감염 및 재배, 및 단층 또는 현탁 배양에서의 세포에서의 단백질의 발현에 적합하다. 바람직하게는, 본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 세포의 현탁 배양, 형질감염 및 재배를 위한, 그리고 현탁 배양에서의 세포에서의 단백질 생성물의 발현을 위한 것이다.

"배양 용기"란 세포를 배양하기 위한 무균 환경을 제공할 수 있는 임의의 용기, 예를 들어 유리, 플라스틱 또는 금속 용기를 의미한다.

구절 "세포 배양 배지", "조직 배양 배지", "배양 배지"(각각의 경우에 복수 "배지들") 및 "배지 제제"는 세포 또는 조직을 배양하기 위한 영양제공 용액을 의미한다. 이 구절들은 상호교환되어 사용될 수 있다.

용어 "조합하는"은 성분의 혼합 또는 배합을 의미한다.

분자의 유도체는 기본 분자를 포함하지만, 추가 또는 변형된 측기를 가지는 몇몇 화합물을 포함한다. 바람직하게는, "유도체"는 기본 분자를 오직 1개, 그러나 가능하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 등의 반응물 분자와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 단일 단계 반응, 그러나 다단계, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6 등의 반응은 유도체를 형성하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 치환, 축합 및 가수분해 반응이 바람직하고, 유도체 화합물을 형성하도록 조합될 수 있다. 대안적으로, 유도체 화합물은 바람직하게는 1개, 그러나 가능하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 등인 화합물일 수 있다. 반응은 기본 화합물 또는 이에 대한 치환 또는 축합 생성물을 형성할 수 있다.

세포 배양 배지는 다수의 성분으로 이루어지고, 이들 성분은 배지마다 변할 수 있다. 세포 배양 배지에 사용된 각각의 성분은 이의 고유한 물성 및 화학 특징을 가진다. 성분의 상용성 및 안정성은 수성 용액 중의 성분의 "용해도"에 의해 부분적으로 결정된다. 용어 "용해도" 및 "가용성"은 다른 성분과 용액 중에 있고 형성하고 성분의 능력을 의미한다. 성분은 측정 가능 또는 검출 가능 침전물을 형성하지 않으면서 용액 중에 유지될 수 있는 경우 이로써 상용성이다.

"상용성 성분"이란 용액 중에 함께 유지되고 "안정한" 조합을 형성할 수 있는 배지 성분을 또한 의미한다. "상용성 성분"을 함유하는 용액은, 배지로부터의 세포에 이용 가능한 성분 중 하나 이상의 농도가 세포의 최적 또는 원하는 성장을 더 이상 지지하지 않는 수준으로 감소하도록, 성분이 실질적으로 침전하거나 저하되거나 분해되지 않을 때 "안정"하다고 말해진다. 성분은 1X 세포 배양 배지 제제에서 동일한 성분의 분해와 비교할 때 분해가 검출될 수 없는 경우 또는 분해가 더 느린 속도로 발생할 때 "안정"하다고 또한 생각된다. 예를 들어, 1X 배지 제제에서 글루타민은 피롤리돈, 카복실산 및 암모니아로 분해되는 것으로 공지되어 있다. 글루타민의 아주 약간의 분해가 용액 중에 시간에 걸쳐 검출될 수 있거나 검출될 수 없으므로, 이가 양이온과 조합된 글루타민, 또는 글루타민 및 이가 양이온 둘 다가 존재하는 조합은 "상용성 성분"으로 생각된다. 미국 특허 제5,474,931호를 참조한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "상용성 성분"은 농축된 또는 1X 제제로서 용액 중에 혼합될 때, "안정한" 및 "가용성"인 특정한 배양 배지 성분의 조합을 의미한다.

용어 "1X 제제"는 작업 농도에서 세포 배양 배지에서 발견되는 몇몇 또는 모든 성분을 함유하는 임의의 수성 용액을 의미하도록 의도된다. "1X 제제"는 예를 들어 세포 배양 배지 또는 그 배지에 대한 성분의 임의의 하위그룹을 의미할 수 있다. 1X 용액 중의 성분의 농도는 시험관내 세포를 유지시키거나 배양하기 위해 사용된 세포 배양 제제에서 발견되는 그 성분의 농도와 거의 동일하다. 세포의 시험관내 배양에 사용된 세포 배양 배지는 정의에 의하면 1X 제제이다. 다수의 성분이 존재할 때, 1X 제제에서의 각각의 성분은 세포 배양 동안 배지에서의 각각의 성분의 농도와 거의 동일한 농도를 가진다. 예를 들어, RPMI-1640 배양 배지는, 다른 성분 중에서, 0.2g/ℓ의 L-아르기닌, 0.05g/ℓ의 L-아스파라긴 및 0.02g/ℓ의 L-아스파르트산을 함유한다. 이 아미노산의 "1X 제제"는 용액 중의 이 성분의 거의 동일한 농도를 함유한다. 따라서, "1X 제제"라 칭할 때, 용액 중의 각각의 성분이 기재된 세포 배양 배지에서 발견되는 것과 동일하거나 거의 동일한 농도를 가지는 것으로 의도된다. 세포 배양 배지의 1X 제제 중의 성분의 농도는 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Allen R. Liss, N.Y. (1984), Handbook of Microbiological Media, Second Ed., Ronald M. Atlas, ed. Lawrence C. Parks (1997) CRC Press, Boca Raton, Fla. and Plant Culture Media, Vol. 1: Formulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock, and H. J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA13 4QG England](이들의 각각은 그 전문이 본 명세서에서 참고로 포함됨)을 참조한다. 그러나, 특히 1X 제제에 더 적은 성분이 함유될 때, 오스몰농도 및/또는 pH는 배양 배지와 비교하여 1X 제제에서 다를 수 있다.

"10X 제제"는 그 용액 중의 각각의 성분의 농도가 세포 배양 동안 배지 중의 각각의 성분의 농도보다 약 10배 초과인 용액을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, RPMI-1640 배양 배지의 10X 제제는, 다른 성분 중에서, 2.0g/ℓ의 L-아르기닌, 0.5g/ℓ의 L-아스파라긴 및 0.2g/ℓ의 L-아스파르트산을 함유할 수 있다(상기 1X 제제와 비교). "10X 제제"는 1X 배양 제제에서 발견되는 것의 약 10배인 농도로 다수의 추가 성분을 함유할 수 있다. 용이하게 명확한 것처럼, "25X 제제", "50X 제제", "100X 제제", "500X 제제" 및 "1000X 제제"는, 1X 세포 배양 제제와 비교하여, 각각 약 25배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 농도로 성분을 함유하는 용액을 지칭한다. 다시, 배지 제제 및 농축된 용액의 오스몰농도 및 pH는 변할 수 있다.

용어 "미량 원소" 또는 "미량 원소 모이어티"는, 배양 배지에 존재하는 다른 모이어티 또는 성분의 양 또는 농도에 비해, 오직 매우 낮은(즉, "미량") 양 또는 농도로 세포 배양 배지에 존재하는 모이어티를 의미한다. 본 발명에서, 이들 용어는 Ag⁺, Al^{3 +}, Ba^{2 +}, Cd^{2 +}, Co^{2 +}, Cr^{3 +}, Cu^{1 +}, Cu^{2 +}, Fe^{2 +}, Fe^{3 +}, Ge^{4 +}, Se^{4 +}, Br^-, I^-, Mn^{2 +}, F^-, Si^{4 +}, V⁵⁺, Mo^{6 +}, Ni^{2 +}, Rb⁺, Sn^{2 +} 및 Zr^{4 +} 및 이들의 염을 포함한다. 예를 들어, 하기 염은 본 발명의 배양 배지에서 미량 원소로서 사용될 수 있다: AgNO₃, AlCl₃

6H₂O, Ba(C₂H₃O₂)₂, CdSO₄

8H₂O, CoCl₂

6H₂O, Cr₂(SO₄)₃

1H₂O, GeO₂, Na₂SeO₃, H₂SeO₃, KBr, KI, MnCl₂

4H₂O, NaF, Na₂SiO₃

9H₂O, NaVO₃, (NH₄)₆Mo₇O₂₄

4H₂O, NiSO₄

6H₂O, RbCl, SnCl₂ 및 ZrOCl₂

8H₂O. 미량 원소 모이어티의 적합한 농도는 오직 일상적 실험을 이용하여 당해 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.

용어 "아미노산"은 아미노산 또는 이의 유도체(예를 들어, 아미노산 유사체), 및 이의 D- 및 L-형태를 의미한다. 이러한 아미노산의 예는 글라이신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-아이소류신, L-라이신, L-류신, L-글루타민, L-아르기닌, L-메티오닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신 및 L-발린, N-아세틸 시스테인을 포함한다.

"화학적으로 한정된" 배지는 각각의 화학 종 및 이의 각각의 분량이 세포를 배양하는 이의 사용 전에 공지된 것이다. 화학적으로 한정된 배지는 화학 종이 공지되고/되거나 정량화되지 않은 용해물 또는 가수분해물 없이 제조된다. 화학적으로 한정된 배지는 본 발명의 배지의 하나의 바람직한 실시형태이다.

용어 "혈청 비함유 배양 조건" 및 "혈청 비함유 조건"은 임의의 유형의 혈청을 배제하는 세포 배양 조건을 의미한다. 이들 용어는 상호교환되어 사용될 수 있다.

"혈청 비함유 배지"(때때로 "SFM 배지"라 칭함)는 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청(FBS), 송아지 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 인간 혈청 등)을 함유하지 않는 배지이고, 일반적으로 철자 SFM으로 지칭된다. 숙련자에게 익숙한 예시적이지만 비제한적인 혈청 비함유 배지는 ExpiCHO(상표명) 발현 배지, HuMEC 기본 혈청 비함유 배지, 넉아웃(상표명) CTS(상표명) XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPRO(상표명)-34 SFM 배지, STEMPRO(상표명) NSC 배지, 에센셜(상표명)-8 배지, 배지 254, 배지 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 200PRF, 배지 131, 에센셜(상표명)-6 배지, STEMPRO(상표명)-34 배지, Gibco(등록상표) 성상교세포 배지, AIM V(등록상표) 배지 CTS(상표명), AMINOMAX(상표명) C-100 기본 배지, AMINOMAX(상표명)-II 컴플리트 배지, CD FORTICHO(상표명) 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO(등록상표)프리스타일(상표명) CHO 발현 배지, CD OPTICHO(상표명) 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900(상표명) 배지, Expi293(상표명) 발현 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6(등록상표) 세포 배지, AIM V(등록상표) 배지, EXPILIFE(등록상표) 배지, 각질세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 임의의 이들의 유도체 또는 변형을 포함한다.

구절 "단백질 비함유" 배양 배지는 단백질(예를 들어, 무혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 부착 인자, 영양제공 단백질, 예컨대 성장 인자, 또는 금속 이온 운반 단백질, 예컨대 트랜스페린, 셀룰로플라스민 등)을 함유하지 않는 배양 배지를 의미한다. 바람직하게는, 펩타이드가 존재하는 경우, 펩타이드는 더 작은 펩타이드, 예를 들어 다이-펩타이드 또는 트라이-펩타이드이다. 바람직하게는, 데카-펩타이드 길이 또는 이것 초과의 펩타이드는 단백질 비함유 배지에 존재하는 아미노산의 약 1% 미만, 더 바람직하게는 약 0.1% 미만, 심지어 더 바람직하게는 약 0.01% 미만이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 구절 "저 단백질" 배양 배지는 오직 낮은 양의 단백질을 함유하는 배지(표준 양의 단백질을 함유하는 배양 배지, 예컨대 5-10% 혈청이 보충된 표준 기본 배지에서 발견되는 총 단백질의 양 또는 농도의 통상적으로 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만)를 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "동물 유래" 재료는 재조합 동물 DNA 또는 재조합 동물 단백질 DNA를 포함하는, 동물 소스로부터 전체로 또는 부분적으로 유래한 재료를 의미한다. 바람직한 배지는 동물 원하는 재료를 함유하지 않는다.

용어 "발현 증강인자"는 일반적으로 현재 기재된 실시형태에 따른 배양 배지 제제를 보충하도록 사용되는 하나 이상의 액체(바람직하게는 수성) 첨가제를 의미하고, 상기 첨가제는 현재 기재된 실시형태에 따른 일시적 단백질 발현 시스템에서 생성된 발현된 단백질의 수율을 개선하도록 선택된다. 상기 용어는 세포 주기 진행에 영향을 미치고/미치거나, 아폽토시스를 저해하고/저해하거나, 세포 성장을 느리게 하고/하거나, 단백질 생성을 촉진하는, 몇몇 화합물 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 증강인자"는 일반적으로 일시적 형질감염 시스템에 첨가되는 임의의 하나 이상의 화합물을 의미하고, 이의 존재는 이러한 발현 증강인자(들)의 부재에서 보이는 발현 수준보다 높은 적어도 2배 내지 약 10배의 인자에 의해, 표적 단백질의 발현을 증대시키거나 촉진한다. 현재 기재된 실시형태와 사용하기에 적합한 예시적인 발현 증강인자는 첨가제, 예컨대 발프로산(VPA, 산 및 나트륨 염), 나트륨 프로피오네이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMASO), 당, 예컨대 갈락토스, 아미노산 혼합물, 또는 뷰티르산, 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 각각의 특정한 발현 증강인자의 최적 농도는 발현 시스템의 개별 특징 및 사용자의 요건에 따라 변할 수 있고, 소정의 실험 시나리오에서 임의의 하나 이상의 발현 증강인자의 최적 농도를 구성하는 것의 결정은 당해 분야의 일반 지식 수준을 가지는 실행자의 이해범위 내에 제대로 있다. 오직 예로서, 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 발프로산(VPA)의 최적 최종 농도 범위는 약 0.20mM 내지 약 25mM의 범위일 수 있다. 더 바람직하게는, VPA의 최종 농도는 약 0.25mM 내지 약 24mM, 약 0.26mM 내지 약 23mM, 0.27mM 내지 약 23mM, 0.28mM 내지 약 23mM, 0.29mM 내지 약 22mM, 약 0.30mM 내지 약 21mM, 약 0.31mM 내지 약 20mM, 약 0.32mM 내지 약 19mM, 약 0.33mM 내지 약 17mM, 약 0.34mM 내지 약 18mM, 약 0.35mM 내지 약 17mM, 약 0.36mM 내지 약 16mM, 약 0.37mM 내지 약 15mM, 약 0.40mM 내지 약 14mM, 약 0.41mM 내지 약 13mM, 약 0.42mM 내지 약 12mM, 약 0.43mM 내지 약 11mM, 약 0.44mM 내지 약 10mM, 약 0.45mM 내지 약 9mM, 약 0.46mM 내지 약 8mM, 약 0.47mM 내지 약 7mM, 약 0.48mM 내지 약 6mM, 약 0.49mM 내지 약 5mM, 약 0.50mM 내지 약 4mM, 약 0.50mM 내지 약 4mM, 약 0.55mM 내지 약 3mM, 0.6mM 내지 약 2mM 또는 0.75 내지 약 1.5mM의 범위일 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.15mM 내지 약 1.5mM, 약 0.16mM 내지 약 1.5mM, 약 0.17mM 내지 약 1.5mM, 약 0.18mM 내지 약 1.5mM, 약 0.19mM 내지 약 1.5mM, 약 0.20mM 내지 약 1.5mM, 약 0.25mM 내지 약 1.5mM, 약 0.30mM 내지 약 1.5mM, 약 0.40mM 내지 약 1.5mM, 약 0.50mM 내지 약 1.5mM, 약 0.60mM 내지 약 1.5mM, 약 0.70mM 내지 약 1.5mM, 약 0.80mM 내지 약 1.5mM, 약 0.90mM 내지 약 1.5mM 또는 약 0.10mM 내지 약 1.5mM일 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.20 내지 약 1.5mM, 약 0.21 내지 약 1.4mM, 약 0.22 내지 약 1.4mM, 약 0.23 내지 약 1.4mM, 약 0.24 내지 약 1.4mM, 약 0.25 내지 약 1.3mM, 약 0.25 내지 약 1.2mM, 약 0.25 내지 약 1.1mM, 또는 약 0.25 내지 약 1.0mM일 수 있다.

추가의 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 나트륨 프로피오네이트(NaPP)의 최적 최종 농도는 약 0.2mM 내지 약 100mM의 범위일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 0.5 내지 약 80mM, 약 0.4mM 내지 약 70mM, 약 0.5mM 내지 약 60mM, 약 0.6mM 내지 약 50mM, 약 0.7mM 내지 약 40mM, 약 0.8mM 내지 약 30mM, 약 0.9mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 15mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 또는 약 5mM 내지 약 7mM의 범위일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 또는 약 9mM 내지 약 10mM의 범위일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 2.5mM, 약 3mM, 약 3.5mM, 약 4mM, 약 4.5mM, 약 5mM, 약 5.5mM, 약 6mM, 약 6.5mM, 약 7mM, 약 7.5mM, 약 8mM, 약 8.5mM, 약 9mM, 약 9.5mM, 또는 약 10mM일 수 있다.

추가의 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 리튬 아세테이트(LiAc)의 최적 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25mM, 약 0.26mM 내지 약 20mM, 약 0.27mM 내지 약 15mM, 약 0.28mM 내지 약 10mM, 약 0.29mM 내지 약 5mM, 약 0.3mM 내지 약 4.5mM, 약 0.31mM 내지 약 4mM, 약 0.35mM 내지 약 3mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2mM 내지 약 3mM의 범위일 수 있다.

추가의 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 뷰티르산의 최적 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25mM, 약 0.26mM 내지 약 20mM, 약 0.27mM 내지 약 15mM, 약 0.28mM 내지 약 10mM, 약 0.29mM 내지 약 5mM, 약 0.3mM 내지 약 4.5mM, 약 0.31mM 내지 약 4mM, 약 0.35mM 내지 약 3mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2mM 내지 약 3mM의 범위일 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 발현 증강인자는 세포 및 발현된 단백질의 형질감염 직전에 또는 수확 전 형질감염 후에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 하기 기재된 몇몇 구체적이지만 비제한적인 실시형태에서, "증강인자 1"은 일반적으로 0.25mM 내지 1mM 발프로산을 의미하고, "증강인자 2"는 일반적으로 5mM 내지 7mM 나트륨 프로피오네이트를 의미한다. 그러나, 달리 표시되지 않는 한, 용어 증강인자 1 및 증강인자 2는 상이한 증강인자 화합물을 포함할 수 있다. 발현 증강인자는 순차적으로, 또는 칵테일로서 배양 배지에 첨가될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하도록 의도된다. 일 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 이것은 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 의미한다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 소정의 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈을 따라 복제된다. 게다가, 소정의 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 칭해진다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서의 유용성의 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 벡터의 형태로 가장 흔히 사용되면서, 상호교환되어 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실행에 따라 사용된 소정의 벡터는 당해 분야에 널리 공지된 벡터, 예컨대 pCDNA 3.3, 또는 이의 변형된 버전 등일 수 있다. 본 발명의 실행에서 적합할 수 있는 벡터에 대한 변형의 유형의 비제한적인 예는 하나 이상의 증강인자, 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 리보솜 결합 자리, 하나 이상의 복제 기원 등의 변형의 추가와 같은 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 발현 벡터는 본 일시적 발현 시스템에서 관심 있는 단백질의 발현을 개선하도록 선택된 하나 이상의 증강인자 유전요소를 포함할 수 있다. 선택된 증강인자 유전요소는 관심 있는 단백질을 발현하도록 사용된 발현 가능한 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. 특히 바람직하지만 비제한적인 증강인자 유전요소는 우드척(woodchuck) 간염 전사 후 조절 유전요소(woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element: WPRE)이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 구절 "발현된 단백질을 생성할 수 있는 유전적 서열을 함유하는 발현 벡터"는 일반적으로, 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 이의 발현을 지지하는 데 필요한, 하나 이상의 핵산 서열 또는 유전요소 이외에, 원하는 관심 있는 단백질의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 가지는 발현 가능한 핵산 서열을 수용할 수 있는 상기 정의된 바와 같은 벡터를 의미한다(상기 관심 있는 단백질은 본 발명의 사용자에 의해 선택됨). 본 명세서에 정의된 바와 같은 발현 벡터에 존재할 수 있는 이러한 추가 핵산 서열 또는 유전요소는 하나 이상의 프로모터 서열, 하나 이상의 증강인자 유전요소, 하나 이상의 리보솜 결합 자리, 하나 이상의 번역 개시 서열, 하나 이상의 복제 기원, 또는 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 이 목적에 작용하는 다양한 핵산 서열 또는 유전요소는 숙련자에게 친숙하고, 본 발명의 실행에서 사용하도록 이의 하나 이상의 선택은 숙련된 실행자의 이해범위 내에 제대로 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 임의의 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, "핵산"은 DNA, 예컨대 게놈 DNA, 상보성 DNA(cDNA), 및 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 올리고 DNA를 의미한다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, "핵산"은 게놈 DNA 및/또는 cDNA를 의미한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성, 예컨대 라벨에 대한 접합 후에 이루어진 변형(들)을 포함할 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오타이드의 유사체에 의한 "캡스(caps)" 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예컨대 비하전 연결에 의한 변형(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 등 및 하전 연결에 의한 변형(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등), 펜던트 모이어티, 예컨대 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-라이신 등) 등을 함유한 변형, 인터칼레이터에 의한 변형(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터를 함유한 변형(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등), 알킬레이터를 함유한 변형, 변형된 연결에 의한 변형(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 및 폴리뉴클레오타이드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당에 보통 존재하는 임의의 하이드록실기는 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 추가 뉴클레오타이드에 추가 연결을 준비하도록 활성화될 수 있거나, 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 1개 내지 20개의 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑 기 모이어티에 의해 치환되거나 인산화될 수 있다. 다른 하이드록실은 표준 보호기에 또한 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 라이속스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로오스, 비사이클릭 유사체, 및 염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 메틸 리보사이드를 포함하는, 일반적으로 당해 분야에 공지된, 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태를 또한 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 연결은 대안적인 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR₂("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO, 또는 CH₂("폼아세탈")에 의해 대체된 실시형태(여기서, R 또는 R'는 각각 독립적으로 H 또는 에테르(-O-) 연결, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알킬을 임의로 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬(1-20개의 C)임)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오타이드에서의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 이전의 설명은 RNA 및 DNA를 포함하는 본 명세서에서 칭해지는 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드"는, 반드시는 아니지만, 일반적으로, 약 200개의 뉴클레오타이드 미만 길이인, 일반적으로 짧은, 일반적으로 단일 가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오타이드에 동등하게 및 완전히 적용 가능하다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 구절 "제1 시간 기간"은, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에 따라 세포를 일시적으로 형질감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때, 일반적으로 발현 가능한 핵산에 의한 세포의 집단의 형질감염과 형질감염된 세포에 대한 하나 이상의 발현 증강인자의 첨가 사이의 시간 간격을 의미한다. 통상적으로, 제1 시간 기간은 약 2시간 내지 약 4일의 범위일 것이다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 제1 시간 기간은 약 3 내지 약 90시간, 약 4 내지 약 85시간, 약 5 내지 약 80시간, 약 6 내지 약 75시간, 약 7 내지 약 70시간, 약 8 내지 약 65시간, 약 9 내지 약 60시간, 약 10 내지 약 55시간, 약 11 내지 약 50시간, 약 12 내지 약 45시간, 약 13 내지 약 40시간, 약 14 내지 약 35시간, 약 15 내지 30시간, 약 16 내지 약 24시간, 약 17 내지 약 24시간, 약 18 내지 약 24시간, 약 19 내지 약 24시간, 약 20 내지 약 24시간, 약 21 내지 약 24시간, 약 22 내지 약 24시간 또는 약 23 내지 약 24시간의 범위일 수 있다. 다른 바람직한 내지는 비제한적인 실시형태에서, 제1 시간 기간은 약 15시간 이하, 약 16시간 이하, 약 17시간 이하, 약 18시간 이하, 약 19시간 이하, 약 20시간 이하, 약 21시간 이하, 약 22시간 이하, 약 23시간 이하, 약 24시간 이하, 약 25시간 이하, 약 26시간 이하, 약 27시간 이하, 약 28시간 이하, 약 29시간 이하 또는 약 30시간 이하일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 구절 "제2 시간 기간"은, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에 따라 세포를 일시적으로 형질감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때, 일반적으로 하나 이상의 발현 증강인자의 첨가와 하나 이상의 추가 증강인자의 첨가, 또는 형질감염된 세포의 수확과 이 내부에서 발현된 단백질의 정제 또는 단리 사이의 시간 간격을 의미한다. 통상적으로, 제2 시간 기간은 약 10시간 내지 약 10일의 범위일 것이지만, 다른 시간 간격은 발현되는 단백질에 최적인 것으로 결정되는 경우 사용될 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 제2 시간 기간은 2시간 내지 5일, 2.5시간 내지 4일, 약 3 내지 약 90시간, 약 4 내지 약 85시간, 약 5 내지 약 80시간, 약 6 내지 약 75시간, 약 7 내지 약 70시간, 약 8 내지 약 65시간, 약 9 내지 약 60시간, 약 10 내지 약 55시간, 약 11 내지 약 50시간, 약 12 내지 약 45시간, 약 13 내지 약 40시간, 약 14 내지 약 35시간, 약 15 내지 30시간, 약 16 내지 약 24시간, 약 17 내지 약 24시간, 약 18 내지 약 24시간, 약 19 내지 약 24시간, 약 20 내지 약 24시간, 약 21 내지 약 24시간, 약 22 내지 약 24시간 또는 약 23 내지 약 24시간의 범위일 수 있다. 다른 바람직한 내지는 비제한적인 실시형태에서, 제1 시간 기간은 약 15시간 이하, 약 16시간 이하, 약 17시간 이하, 약 18시간 이하, 약 19시간 이하, 약 20시간 이하, 약 21시간 이하, 약 22시간 이하, 약 23시간 이하, 약 24시간 이하, 약 25시간 이하, 약 26시간 이하, 약 27시간 이하, 약 28시간 이하, 약 29시간 이하 또는 약 30시간 이하일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 구절 "제3 시간 기간"은, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에 따라 세포를 일시적으로 형질감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때, 일반적으로 적어도 제1 발현 증강인자와 적어도 제2 발현 증강인자의 첨가 사이의 시간 간격을 의미한다. 제1 발현 증강인자와 제2 발현 증강인자의 첨가 사이의 시간 간격은 초 내지는 일의 차수일 수 있지만, 몇몇 실시형태에서 이러한 제1 발현 증강인자 및 제2 발현 증강인자는 본질적으로 동시에 첨가될 수 있거나, 임의로 단일 제제로 제공될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "복합체화 반응", "복합체화 배지" 등은 일반적으로 핵산이 형질감염 시약 제제에 복합체화된 생리학적으로 허용 가능한 배양 배지 또는 반응물을 의미한다. 통상적으로, 단백질을 발현할 목적을 위해 세포로 도입되는 핵산은 처음에 지질/핵산 복합체 또는 응집체로 적합한 형질감염 시약(예컨대, 예를 들어 양이온성 지질 제제)과 복합체화된다.

"전이 원소" 또는 "전이 금속"(상호교환되어 사용될 수 있음)이란, 외부 쉘보다는 내부 전자 원자가 쉘이 오직 부분적으로 충전되어서, 원소가 소정의 일련의 원소에서 가장 큰 양전성과 가장 적은 양전성 사이의 전이 링크로서 작용하는, 원소를 의미한다. 전이 원소는 통상적으로 높은 융점, 높은 밀도, 높은 쌍극자 또는 자기 모멘트, 다중 원자가, 및 안정한 복합체 이온을 형성하는 능력에 의해 규명된다. 본 발명에서 유용한 이러한 전이 원소의 예는 스칸듐(Sc), 티탄(Ti), 바나듐(V), 크롬(Cr), 망간(Mn), 철(Fe), 코발트(Co), 니켈(Ni), 구리(Cu), 아연(Zn), 이트류(Y), 지르코늄(Zr), 니오븀(Nb), 몰리브덴(Mo), 테크네튬(Tc), 루비듐(Ru), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 은(Ag), 카드뮴(Cd), 란타늄(La), 하프늄(Hf), 탄탈륨(Ta), 텅스텐(W), 레늄(Re), 오스뮴(Os), 이리듐(Ir), 백금(Pt), 금(Au), 수은(Hg) 및 악티늄(Ac)을 포함한다. 본 발명의 것을 비롯하여, 배양 배지 조성물에서 사용하기 위한 전이 원소로서 철의 이온, 킬레이트, 염 및 복합체(Fe^{2 +} 또는 Fe^{3 +})가 특히 중요하다.

다양한 기법 및 시약은 "형질감염"으로 공지된 과정에서 표적 세포로의 거대분자의 도입에 이용 가능하다. 흔히 사용되는 시약은 예를 들어 인산칼슘, DEAE-덱스트란 및 지질을 포함한다. 이 유형의 시약의 사용에 대한 상세한 프로토콜의 예를 위해, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9, Ausubel, et al. Eds., John Wiley and Sons, 1998]과 같은 많은 참고 논문이 이용 가능하다. 세포를 형질감염시키기 위한 추가 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 전기천공(유전자 전자전달), 초음파천공법(sono-poration), 광학 형질감염, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 또는 바이러스 형질도입을 포함할 수 있다.

세포 또는 "형질감염 시약"으로의 "거대분자의 도입을 위한 시약"은 세포로의 거대분자의 진입을 촉진하는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 재료, 제제 또는 조성물이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,279,833호를 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 시약은 "형질감염 시약"일 수 있고, 하나 이상의 표적 세포로 하나 이상의 핵산의 흡수를 증가시키는 임의의 화합물 및/또는 조성물일 수 있다. 다양한 형질감염 시약은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 적합한 형질감염 시약은 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민(PEI), 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 예컨대 폴리라이신 및 폴리아르기닌, 양으로 하전된 덴드리머 및 분절된 덴드리머, 양이온성 β-사이클로덱스트린 함유 중합체(CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 세포로의 거대분자의 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 천연 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함한다. 바람직한 지질은 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPE), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4'-트라이메틸암모니오) 프로판(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-(4'-트라이메틸암모니오) 뷰타노일-sn-글라이세롤(DOTB), 1,2-다이올레오일-3-숙신일-sn-글라이세롤 콜린 에스터(DOSC), 콜레스테릴(4'-트라이메틸암모니오)뷰타노에이트(ChoTB), 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), O,O'-다이도데실-N-[p(2-트라이메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 접합된 스퍼민(예를 들어, 5-카복시스퍼밀글라이신 다이옥타데실아미드(DOGS), N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스퍼민(TM-TPS) 및 다이팔미토일파스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES)), 리포폴리라이신(DOPE에 접합된 폴리라이신), TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 접합된 지방산(TFA) 및/또는 펩타이드, 예컨대 트리릴실-알라닐-TRIS 모노-, 다이-, 및 트라이-팔미테이트, (3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤(DC-Chol), N-(α-트라이메틸암모니오아세틸)-다이도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 다이메틸 다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미니늄트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

당해 분야의 숙련자는, 상기 언급된 지질의 소정의 조합이 세포로의 핵산의 도입에 특히 적합한 것으로 나타났다는 것을 인식할 것이고, 예를 들어 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 조합이 상표명 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)(상표명) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation)(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 조합이 상표명 리포펙틴(등록상표) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, DMRIE 및 콜레스테롤의 1:1(M/M) 조합이 상표명 DMRIE-C 시약 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, TM-TPS 및 DOPE의 1:1.5(M/M) 조합이 상표명 셀펙틴(등록상표) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, DDAB 및 DOPE의 1:2.5(w/w) 조합이 상표명 LipfectACE(등록상표) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하다. 상기 언급된 지질 조합 이외에, 다른 화합물과 혼합된, 특히 핵 국재화 서열을 포함하는 펩타이드 및 단백질과 혼합된, 지질을 포함하는 다른 제제는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어, WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호(이들 둘 다 본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다.

지질 응집체, 예컨대 리포솜은 세포로의 거대분자의 전달을 위한 물질로서 유용한 것으로 발견되었다. 특히, 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집체는 세포로의 음이온성 거대분자(예를 들어, 핵산)의 전달에 극도로 효율적인 것으로 입증되었다. 하나의 흔히 사용되는 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)이다. 단독으로 또는 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)과의 1:1 혼합물로서 DOTMA를 포함하는 리포솜은 세포로 핵산을 도입하기 위해 사용된다. DOTMA:DOPE의 1:1 혼합물은 상표명 리포펙틴(상표명) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 상업적으로 구입 가능하다. 세포로 핵산을 도입하기 위해 사용된 또 다른 양이온성 지질은 1,2-비스(올레오일-옥시)-3-3-(트라이메틸암모니아) 프로판(DOTAP)이다. DOTAP는 올레오일 모이어티가 DOTAP에서 에테르 결합을 통해 프로필아민 골격에 연결된다는 점에서 DOTMA와 다른 한편, 이들은 DOTMA에서 에스터 결합을 통해 연결된다. DOTAP는 표적 세포에 의해 더 용이하게 분해된다고 여겨진다. 트라이메틸암모늄 모이어티의 메틸기 중 하나가 하이드록시에틸기에 의해 대체된 화합물의 구조적으로 관련된 그룹은 포스포리파제 A의 로젠탈 저해제(Rosenthal inhibitor: RI)와 구조가 유사하다(문헌[Rosenthal, et al., (1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206] 참조). RI는 프로필아민 코어에 연결된 스테아로일 에스터를 가진다. RI의 다이올레오일 유사체는, 프로필아민 코어에 대한 지질 모이어티의 연결에 따라, DOR1-에테르 및 DOR1-에스터라 흔히 축약된다. 하이드록시에틸 모이어티의 하이드록실기는 예를 들어 카복시스퍼민에 대한 에스터화에 의해 추가로 유도체화될 수 있다.

세포로의 거대분자의 도입에 사용된 화합물의 또 다른 종류는 지질에 부착된 카복시스퍼민 모이어티를 포함한다(문헌[Behr, et al., (1989) Proceedings of the National Academy of Sciences], USA 86:6982-6986 및 EPO 0 394 111 참조). 이 유형의 화합물의 예는 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES) 및 5-카복시스퍼밀글라이신 다이옥타데실아미드(DOGS)를 포함한다. DOGS는 TRANSFECTAM(상표명)의 상표명 하에 프로메가(Promega(위스콘신주 메디슨))로부터 상업적으로 구입 가능하다.

콜레스테롤의 양이온성 유도체(3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤, DC-Chol)는 합성되고 DOPE와 리포솜으로 제제화되고(문헌[Gao, et al., (1991) BBRC 179(1):280-285] 참조), 세포로 DNA를 도입하도록 사용된다. 이렇게 제제화된 리포솜은 낮은 수준의 세포 독성을 가지는 세포로 DNA를 효율적으로 도입한다고 보고되어 있다. 폴리라이신을 DOPE에 접합함으로써 형성된 리포폴리라이신(문헌[Zhou, et al., (1991) BBA 1065:8-14] 참조)은 혈청의 존재 하에 세포로 핵산을 도입하는 데 있어서 효과적인 것으로 보고되었다.

세포로 핵산을 도입하기 위해 사용된 양이온성 지질의 다른 유형은 고도로 충전된 폴리양이온성 암모늄, 설포늄 및 포스포늄 지질, 예컨대 미국 특허 제5,674,908호 및 제5,834,439호, 및 WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호에 기재된 것을 포함한다. 본 발명에 따른 거대분자의 전달을 위한 하나의 특히 바람직하지만 비제한적인 형질감염 시약은 라이프 테크놀로지스로부터 구입 가능한 리포펙타민 2000(상표명)이다(WO 00/27795로서 공개된 미국 국제 출원 제PCT/US99/26825호 참조). 세포에 대한 거대분자의 전달에 적합한 또 다른 바람직하지만 비제한적인 형질감염 시약은 Expi펙타민(상표명)이다. 다른 적합한 형질감염 시약은 리오펙타민(LIOFECTAMINE)(상표명) RNAiMAX, 리포펙타민(상표명) LTX, 올리고펙타민(OLIGOFECTAMINE)(상표명), 셀펙틴(Cellfectin)(상표명), 인비보펙타민(INVIVOFECTAMINE)(상표명), 인비보펙타민(상표명) 2.0, 및 미국 특허 출원 공보 제2012/0136073호(Yang 등)(본 명세서에서 여기에 참고로 포함됨)에 개시된 임의의 지질 시약 또는 제제를 포함한다. 다양한 다른 형질감염 시약은 숙련자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 일시적 형질감염 시스템 및 방법에 대한 이의 적합성에 대해 평가될 수 있다.

본 발명은 (a) 배양물 중에 진핵생물 세포로의 적어도 하나의 거대분자, 바람직하게는 발현 가능한 핵산 분자의 도입, (b) 적어도 하나의 거대분자가 도입된 세포의 재배, 및 임의로 (c) 적어도 하나의 거대분자가 도입된 세포에서 재조합 단백질 생성물의 생성 또는 핵산의 발현을 지지하는 고수율 일시적 형질감염 시스템에 관한 것이고, 여기서 거대분자를 함유하는 배지는 세포로의 적어도 하나의 거대분자의 도입 후에 및 단백질 생성물의 재배 및 생성 또는 핵산의 발현 전에 배양물로부터 제거되고 새로운 배지에 의해 대체될 필요가 없다.

본 발명의 일시적 형질감염 시스템, 및 본 명세서에 기재된 방법에 따른 이의 용도는 세포 배양 시스템에서 관심 있는 단백질의 높은 수준의 신속하고 재현 가능한 발현을 생성시킨다. 통상적으로, 본 일시적 형질감염 시스템 및 방법은, 원하는 재조합 단백질의 개별 발현 특징 및 사용된 세포 유형에 따라, 배양물 1ℓ당 약 200㎍의 단백질 내지 배양물 1ℓ당 약 2g의 단백질의 범위의 수준으로 재조합 발현된 단백질을 생성할 수 있다. 본 명세서에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용하여, 사용자는 상업적으로 구입 가능한 표준 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 현재 얻을 수 있는 것 초과로 약 2배 내지 내지 약 20배인 발현된 단백질의 수준을 얻을 수 있다. 본 명세서에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용하여, 사용자는 현대의 일시적 발현 시스템에 의해 보이는 것의 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, 약 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 또는 약 10배 이하 또는 초과까지인 발현된 단백질의 수준을 얻을 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질을 생성하는 본 일시적 형질감염 시스템을 사용하여, 사용자는 현탁 세포에서 재조합 단백질의 생성에 최적화된 상업적으로 구입 가능한 일시적 형질감염 시스템, 예컨대 프리스타일(상표명) 발현 시스템 등을 사용하여 얻은 단백질 수율보다 약 2배 내지 약 50배 더 높은 단백질 수율을 얻을 수 있다.

상기 시스템이, 다른 요소 중에서, 적어도 고밀도 배양 배지, 적어도 고밀도 성장에 적응된 현탁 세포의 집단, 임의로 하나 이상의 발현 벡터, 임의로 하나 이상의 형질감염 시약, 및 임의로 하나 이상의 발현 증강인자를 포함하는 본 발명의 시스템을 사용하여, 적어도 하나의 세포로 적어도 하나의 거대분자를 도입한 후에, 및 적어도 하나의 거대분자가 도입된 세포가 단백질 생성물을 생성하거나 핵산을 발현하도록 추가로 배양되기 전에 배지를 재충전하거나 대체하거나 보충하는 것이 필요하지 않다. 본 발명의 시스템에서, 배지는 이상적으로 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 실질적인 저 단백질 배지, 및/또는 동물 유래 성분을 함유하지 않는 배지, 또는 이들 특징의 조합을 가지는 배지이다.

본 발명의 하나의 비제한적인 양태에서, 배양물 중의 세포로의 화합물 또는 거대분자(예를 들어, 핵산)의 도입과 관련하여, 본 발명의 고수율 배양 배지는 현재 구입 가능한 일시적 형질감염 시스템을 사용하여 통상적으로 얻을 수 있는 것보다 더 높은 세포 형질감염 효율을 촉진한다. 본 발명의 또 다른 관련되지만 비제한적인 양태에서, 상기 시스템은 또한 형질감염 후에 배양되어야 하는 세포보다 더 적은 용적으로 세포를 형질감염시키는 것을 요하지 않는다. 본 발명의 훨씬 또 다른 관련되지만 비제한적인 양태에서, 상기 시스템은 현재 구입 가능한 일시적 형질감염 시스템보다 더 높은 세포 생존능력을 촉진한다. 여전히 훨씬 추가의 관련되지만 비제한적인 양태에서, 상기 시스템은 현재 구입 가능한 일시적 형질감염 시스템보다 더 높은 세포 밀도(즉, 배양 배지 1㎖당 세포)를 촉진한다. 본 발명의 또 다른 관련되지만 비제한적인 양태에서, 상기 시스템은 현재 구입 가능한 일시적 형질감염 시스템보다 배양물 중의 세포에서 더 높은 수준의 재조합 단백질 발현을 촉진한다. 필수적이지는 않지만, 바람직하게는, 동일한 용적의 배지는, 세포의 형질감염이 발생한 배지를 대체하거나 제거하거나 보충하거나 재충전해야 함이 없이, 세포로의 적어도 하나의 거대분자의 도입 및 후속하는 재배에 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 분열되거나, 배지 용적은 적게 약 2배, 약 5배, 약 8배 또는 약 10배 증가한다.

본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 배양 배지의 임의의 용적으로 적어도 하나의 거대분자를 도입하거나, 배양 세포를 형질감염시키도록 사용되도록 의도된다. 이러한 도입은 바람직하게는 형질감염되어야 하는 배양 세포에 사용된 배지의 양의 0.1배 내지 10배로 달성되었다. 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 1밀리리터 초과이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 200㎕ 내지 100리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 2㎖ 내지 약 50리터, 가장 바람직하게는 약 5㎖ 내지 약 5리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 100㎖ 내지 약 50리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 50리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 25리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 10리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 5리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 1리터이다.

본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물에서, 배지는 임의로 거대분자의 도입 또는 형질감염을 방해할 수 있는 화합물, 예를 들어 다음이온성 화합물, 예컨대 폴리설포네이트화 및/또는 폴리설페이트화 화합물을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 배지는 황산덱스트란을 함유하지 않는다.

본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은, 배지를 변경할 필요 없이, (예를 들어, 형질감염에 의해) 배양된 세포로의 화합물 또는 거대분자(특히 거대분자, 예를 들어 핵산, 단백질 및 펩타이드)의 도입을 허용한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 진핵생물 세포의 재배 및 형질감염을 위한 배지를 제공한다.

본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물을 사용하여, 당해 분야의 숙련자는 배양물 중에 세포로 거대분자 또는 화합물(예를 들어, 핵산)을 도입할 수 있다. 바람직하게는, 거대분자 또는 화합물(예를 들어, 핵산)은 세포의 적어도 약 20%로 도입된다. 더 바람직하게는, 거대분자 또는 화합물(예를 들어, 핵산)은 세포의 약 20 내지 약 100%로 도입된다. 더 바람직하게는, 거대분자 또는 화합물(예를 들어, 핵산)은 세포의 약 30 내지 약 100%로 도입된다. 더 바람직하게는, 거대분자 또는 화합물(예를 들어, 핵산)은 세포의 약 50 내지 약 100%로 도입된다. 사실상, 거대분자 또는 화합물은 세포의 약 20% 내지 약 90%, 세포의 약 20% 내지 약 80%, 세포의 약 30% 내지 약 60%, 70%, 80% 또는 90%, 세포의 약 20%, 30%, 40% 또는 50% 내지 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 등으로 도입될 수 있다. 세포의 심지어 약 60%, 70%, 75% 또는 80% 내지 약 90% 또는 100%에 가깝게는 도입된 분자 또는 화합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물의 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 원치 않는 성분(즉, 하나 이상의 혈청 성분, 하나 이상의 비한정된 성분, 하나 이상의 단백질 성분 및/또는 하나 이상의 동물 유래 성분)은 하나 이상의 기능에서 하나 이상의 대체 화합물에 의해 치환되거나 대체된다. 본 발명의 대체 화합물은 임의로 하나 이상의 금속 결합 화합물 및/또는 하나 이상의 전이 원소 복합체를 포함할 수 있고, 상기 복합체는 하나 이상의 금속 결합 화합물과의 복합체로 하나 이상의 전이 원소 또는 이의 염 또는 이온을 포함한다. 바람직하게는, 배지는 하나 이상의 천연 유래 금속 캐리어, 예컨대 트랜스페린, 또는 다른 동물 유래 단백질 또는 추출물의 부재 하에 시험관내 세포의 배양을 지지할 수 있다. 금속 결합 화합물은 배지에 대한 금속 결합 화합물의 첨가 전에 전이 금속과의 복합체로 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 금속 결합 화합물은 배지에 대한 금속 결합 화합물의 첨가 전에 전이 금속과의 복합체로 있지 않다. 바람직하게는, 본 발명의 배지는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않는다.

본 발명은 또한 배지를 하나 이상의 대체 화합물과 조합함으로써 얻어진 세포 배양 배지에 관한 것이다. 바람직하게는, 배지는 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 저 단백질 배지일 수 있고/있거나, 동물 유래 성분이 결여된 배지일 수 있다. 배지는 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않는다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 배지는 시험관내 세포의 재배를 지지할 수 있고/있거나, 세포로의 거대분자의 도입을 허용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 대체 화합물은 금속 결합 화합물일 수 있고/있거나, 전이 원소 복합체일 수 있고, 상기 복합체는 적어도 하나의 금속 결합 화합물에 복합체화된 적어도 하나의 전이 원소 또는 이의 염 또는 이온을 포함한다. 본 발명의 이 양태에서 사용하기 위한 바람직한 전이 원소, 금속 결합 화합물, 및 전이 원소 복합체는 본 명세서에 자세히 기재된 것을 포함한다.

본 발명의 대체 화합물은 시험관내 배양되는 세포에 대한 전이 금속의 전달을 촉진할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 대체 화합물은 철을 전달하고 트랜스페린을 대체할 수 있다. 바람직한 대체 화합물은 하이드록시피리딘 유도체이다. 바람직하게는, 하이드록시피리딘 유도체는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 3-하이드록시-4-피론, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-4-온, 1-하이드록시피리드-2-온, 1,2-다이메틸-3-하이드록시피리드-4-온, 1-메틸-3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시-2(1H)-피리디논, 및 피리독살 아이소니코티닐 하이드라존, 니코틴산-N-옥사이드, 2-하이드록시-니코틴산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 하이드록시피리딘 유도체는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드이다.

본 발명의 대체 화합물은 진핵생물 및/또는 원핵생물 세포, 조직, 장기 등을 재배하거나 성장시키기 위한 배지를 포함하는 임의의 배지와 사용될 수 있다. 이러한 배지는 CD FORTICHO(상표명) 배지, Expi293(상표명) 발현 배지, ExpiCHO(상표명) 발현 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 이글(BME), RPMI-1640, 햄 F-10, 햄 F-12, α최소 필수 배지(αMEM), 글라스고우(Glasgow) 최소 필수 배지(G-MEM) 및 이스코베(Iscove) 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 293 SFM, CD-CHO 배지, VP SFM, BGJb 배지, 브린스터(Brinster) BMOC-3 배지, 세포 배양 동결 배지, CMRL 배지, EHAA 배지, eRDF 배지, 피셔(Fischer) 배지, 감보르그(Gamborg) B-5 배지, GLUTAMAX(상표명) 보충 배지, 그레이스(Grace) 곤충 세포 배지, HEPES 완충 배지, 리히터(Richter) 변형 MEM, IPL-41 곤충 세포 배지, 레이보비츠(Leibovitz) L-15 배지, 맥코이(McCoy) 5A 배지, MCDB 131 배지, 배지 199, 변형 이글 배지(MEM), 배지 NCTC-109, 슈나이더(Schneider) 드로소필라 배지, TC-100 곤충 배지, 웨이마우스(Waymouth) MB 752/1 배지, 윌리암(William) 배지 E, 단백질 비함유 하이브리도마 배지 II(PFHM II), AIM V 배지, 각질세포 SFM, 한정된 각질세포 SFM, STEMPRO(등록상표) SFM, STEMPRO(등록상표) 컴플리트 메틸셀룰로스 배지, HepatoZYME-SFM, 뉴로베이절(상표명) 배지, 뉴로베이절-A 배지, Hibernate(상표명) 배지, Hibernate E 배지, 내피 SFM, 인간 내피 SFM, 하이브리도마 SFM, PFHM II, Sf 900 배지, Sf 900 TI SFM, EXPRESS FIVE(등록상표) 배지, CHO-S-SFM, AMINOMAX-II 컴플리트 배지, AMINOMAX-C100 컴플리트 배지, AMINOMAX-C 100 기본 배지, PB-MAX(상표명) 염색체분석 배지, KARYOMAX 골수 염색체분석 배지, 넉아웃 D-MEM 및 CO2 독립적 배지(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는, 상업적으로 구입 가능한(예를 들어, 테크놀로지스 코포레이션(캘리보티아주 칼스바드)사제) 또는 달리 당해 분야에 공지된 다른 배지는 본 발명에 따라 동등하게 사용될 수 있다. 상기 배지는 JRH, Sigma, HyClone 및 BioWhittaker와 같은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 제조사로부터 얻어진다. 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 배지의 추가 예는 미국 특허 제5,135,866호 및 제5,232,848호, 및 국제 공보 WO 제88/02774호, WO 제98/15614호, WO 제98/08934호 및 유럽 특허 제0 282 942호(이의 전문은 본 명세서에서 참고로 구체적으로 포함됨)에서 발견될 수 있다.

본 발명은 또한 세포로 거대분자를 도입하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 배지에서 세포를 배양하는 단계 및 거대분자가 하나 이상의 세포에 의해 흡수되게 하는 조건 하에 배지에서의 세포를 하나 이상의 거대분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 배지는 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 저 단백질 배지이고/이거나, 동물 유래 성분이 결여된 배지이다. 바람직한 세포는 진핵생물 세포를 포함한다. 더 바람직하게는, 세포는 포유류 세포이다. 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않는다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 배지는 동일한 배지에서 세포의 성장 및 형질감염을 허용한다. 몇몇 실시형태에서, 거대분자는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있고, 핵산 분자가 세포에 의해 흡수되게 하는 조건은 핵산이 하나 이상의 세포로 도입되게 하는 시약과 핵산을 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 배지 및 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 배지는 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 저 단백질 배지 및/또는 동물 유래 성분이 결여된 배지이다. 바람직한 세포는 진핵생물 세포를 포함한다. 더 바람직하게는, 세포는 포유류 세포이다. CHO 세포로부터 유래한 현탁 세포, 특히 현탁 배양물 중의 고발현에 선택된 세포 클론이 가장 바람직하다. 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 배지는 동일한 배지 중에 세포의 성장 및 형질감염을 지지하고, 더 바람직하게는, 배지는 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포의 성장 및 배양을 지지하고, 여기서 상기 배지는 재조합 단백질을 생성할 목적을 위해 여기서 발현 가능한 핵산의 도입 후 재충전하거나 대체하거나 달리 보충될 필요가 없다.

본 발명은 또한 하나 이상의 세포로의 거대분자의 도입을 위해 본 발명의 배지 및 하나 이상의 시약을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 배지는 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 저 단백질 배지 및/또는 동물 유래 성분이 결여된 배지이다. 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 배지는 형질감염 시약을 함유하고, 거대분자는 핵산이다. 거대분자는 또한 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 시약은 하나 이상의 지질을 포함하고 이들 중 하나 이상은 양이온성 지질일 수 있다. 더 바람직하게는, 시약은 중성 지질 및 양이온성 지질의 혼합물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 시약은 단독으로 또는 하나 이상의 지질과 혼합되어 제공될 수 있는 하나 이상의 펩타이드 및/또는 단백질을 포함한다.

본 발명은 또한 세포로 도입되는 본 발명의 배지 및 하나 이상의 거대분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 배지는 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 저 단백질 배지 및/또는 동물 유래 성분이 결여된 배지이다. 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않는다. 거대분자는 예를 들어 핵산 및/또는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있고, 복합체화되지 않을 수 있거나, 세포로의 거대분자의 도입을 위해 하나 이상의 시약과의 복합체의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 거대분자는 핵산이고, 하나 이상의 형질감염 시약과의 복합체의 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 배지, 적어도 하나의 세포, 적어도 하나의 거대분자, 적어도 하나의 세포로 적어도 하나의 거대분자를 도입하기 위한 적어도 하나의 시약으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분(또는 이들의 조합)을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 세포는 진핵생물 세포이다. 더 바람직하게는, 세포는 포유류 세포이다. 바람직하게는, 배지는 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 저 단백질 배지 및/또는 동물 유래 성분이 결여된 배지이다. 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않는다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 시약은 형질감염 시약이고, 거대분자는 핵산, 예를 들어 RNA 및/또는 DNA이다. 대안적으로, 거대분자는 단백질 및/또는 펩타이드이다.

몇몇 실시형태에서, 시약은 하나 이상의 지질을 포함하고, 이들 중 하나 이상은 양이온성 지질일 수 있다. 더 바람직하게는, 시약은 천연 지질 및 양이온성 지질의 혼합물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 시약은 단독으로 또는 하나 이상의 지질과 혼합되어 제공될 수 있는 하나 이상의 펩타이드 및/또는 단백질을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 시약은 세포로 거대분자를 도입하기 위해 거대분자와 복합체화한다.

본 발명은 또한 세포의 배양 및 형질감염을 위한 배지를 포함하는 적어도 하나의 용기를 포함하는 세포의 배양 및 형질감염을 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 또한 본 발명의 배지, 적어도 하나의 세포, 적어도 하나의 거대분자, 적어도 하나의 세포로 적어도 하나의 거대분자를 도입하기 위한 적어도 하나의 시약, 적어도 하나의 완충제 또는 완충 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분(또는 이들의 조합), 및 적어도 하나의 세포로 적어도 하나의 거대분자를 도입하기 위한 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배지는 혈청 비함유 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지 및/또는 단백질 비함유 또는 저 단백질 배지 및/또는 동물 유래 성분이 결여된 배지이다. 배지는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 트랜스페린을 함유하지 않고/않거나, 인슐린을 함유하지 않고/않거나, 동물 성장 인자를 함유하지 않는다. 배지는 금속 결합 화합물일 수 있는 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있고/있거나, 하나 이상의 대체 화합물을 포함하는 하나 이상의 복합체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 배지는 하나 이상의 복합체를 포함할 수 있고, 상기 복합체는 금속 결합 화합물일 수 있는 하나 이상의 대체 화합물과 복합체화된 하나 이상의 전이 원소 또는 이의 염 또는 이온을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 배지는 시험관내 세포의 배양을 지지할 수 있고, 여기서 배양된 세포의 형질감염을 허용한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 키트는 세포를 형질감염시키기 위한 지질을 포함하는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 키트는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 용기를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라, 전이 원소는 바람직하게는 스칸듐, 티탄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 이트류, 지르코늄, 니오븀, 몰리브덴, 테크네튬, 루비듐, 로듐, 팔라듐, 은, 카드뮴, 란타늄, 하프늄, 탄탈륨, 텅스텐, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 수은 및 악티늄, 또는 이의 염 또는 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 철염이다. 적합한 철염은 FeCl₃, Fe(NO₃)₃ 또는 FeSO₄ 또는 Fe⁺⁺⁺ 또는 Fe⁺⁺ 이온을 함유하는 다른 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직한 대체 화합물은 금속 결합 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 국제 특허 출원 제PCT/US00/23580호, 공보 WO 제01/16294호를 참조한다.

본 발명의 금속 결합 화합물은 전이 원소와 상호작용하거나 이에 결합할 수 있는 임의의 거대분자를 포함하고, 세포에 의한 이의 흡수를 촉진한다. 이러한 상호작용/결합은 자연에서 공유 또는 비공유일 수 있다. 본 발명의 이 양태에서 사용되는 금속 결합 화합물은 바람직하게는 폴리올, 하이드록시피리딘 유도체, 1,3,5-N,N',N''-트리스(2,3-다이하이드록시벤조일)아미노-메틸벤젠, 에틸렌다이아민-N,N'-테트라메틸렌포스폰산, 트라이숙신, 산성 사카라이드(예를 들어, 제일철 글루코네이트), 글라이코사미노글라이칸, 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산, 니코틴산-N-옥사이드, 2-하이드록시-니코틴산, 일치환, 이치환 또는 삼치환된 2,2'-바이피리딘, 하이드록사메이트 유도체(예를 들어, 아세토하이드록삼산), 아미노산 유도체, 데페록사민, 페리옥사민, 철 염기성 포르핀 및 이의 유도체, DOTA-라이신, 텍사피린, 사프히린, 폴리아미노카복실산, α-하이드록시카복실산, 폴리에틸렌카바메이트, 에틸 말톨, 3-하이드록시-2-피리딘 및 IRC011로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 금속 금속 화합물은 폴리올, 예컨대 소르비톨 또는 덱스트란, 및 특히 소르비톨이다. 관련된 실시형태에서, 금속 결합 화합물은 하이드록시피리딘 유도체, 예컨대 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 3-하이드록시-4-피론, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시피리드-4-온, 1-하이드록시피리드-2-온, 1,2-다이메틸-3-하이드록시피리드-4-온, 1-메틸-3-하이드록시피리드-2-온, 3-하이드록시-2(1H)-피리디논, 에틸 말톨 또는 피리독살 아이소니코티닐 하이드라존이고, 바람직하게는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드이다. 본 발명의 이 양태에 따른 특히 바람직한 실시형태에서, 전이 금속 복합체는 소르비톨-철 복합체 또는 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드-철 복합체일 수 있다. 본 발명의 금속 결합 화합물은 또한 이가 양이온, 예컨대 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺에 결합할 수 있다.

본 발명은 금속 결합 화합물일 수 있는 하나 이상의 대체 화합물을 포함하고, 적어도 하나의 아미노산(예컨대, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글라이신, L-히스티딘, L-아이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신 또는 L-발린, N-아세틸-시스테인), 적어도 하나의 비타민(예컨대, 바이오틴, 콜린 클로라이드, D-Ca⁺⁺-판토테네이트, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민 또는 비타민 B12), 적어도 하나의 무기 염(예컨대, 칼슘염, CuSO₄, FeSO₄, Fe(NO₃)₃, FeCl₃, KCl, 마그네슘염, 망간염, 나트륨 아세테이트, NaCl, NaHCO₃, Na₂HPO₄, Na₂SO₄, 셀레늄염, 규소염, 몰리브덴염, 바나듐염, 니켈염, 주석염, ZnCl₂, ZnSO₄ 또는 다른 아연염), 아데닌, 에탄올아민, D-글루코스, 하나 이상의 사이토카인, 헤파린, 하이드로코티손, 리포산, 페놀 레드, 포스포에탄올아민, 푸트레신, 나트륨 피류베이트, 트라이-요오도타이로닌, PLURONIC F68 및 타이미딘으로 이루어진 성분의 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는, 세포 배양 배지에 관한 것이다.

본 발명의 배양 배지는 임의로 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄술폰산](HEPES), MOPS, MES, 포스페이트, 중탄산염 및 세포 배양 분야에 사용하기에 적합한 다른 완충제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 완충제는 배양된 세포에 실질적인 세포독성 없이 완충 능력을 제공하는 것이다. 적합한 완충제의 선택은 세포 배양의 분야의 숙련자의 영역 내에 있다.

본 발명에 따라, 본 발명의 세포 배양 배지를 형성하는 데 사용하기에 적합한 배지는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있고, 예를 들어 아데닌, 에탄올아민, D-글루코스, 헤파린, 완충제, 하이드로코티손, 리포산, 페놀 레드, 포스포에탄올아민, 푸트레신, 나트륨 피류베이트, 트라이-요오도티로닌, 타이미딘, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글라이신, L-히스티딘, L-아이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신, L-발린, N-아세틸-시스테인, 바이오틴, 콜린 클로라이드, D-Ca⁺⁺-판토테네이트, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12, Pluronic F68, 재조합 인슐린, 칼슘염, CuSO₄, FeSO₄, FeCl₃, Fe(NO₃)₃, KCl, 마그네슘염, 망간염, 나트륨 아세테이트, NaCl, NaHCO₃, Na₂HPO₄, Na₂SO₄, 셀레늄염, 규소염, 몰리브덴염, 바나듐염, 니켈염, 주석염, ZnCl₂, ZnSO₄ 또는 다른 아연염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 조합함으로써 얻어질 수 있고, 여기서 각각의 성분은 시험관내 세포의 배양을 지지하는 양으로 첨가된다.

본 발명은 또한 에탄올아민, D-글루코스, HEPES, 인슐린, 리놀레산, 리포산, 페놀 레드, PLURONIC F68, 푸트레신, 나트륨 피류베이트, 트랜스페린, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글라이신, L-히스티딘, L-아이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신, L-발린, 바이오틴, 콜린 클로라이드, D-Ca⁺⁺-판토테네이트, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12, 하나 이상의 칼슘염, Fe(NO₃)₃, KCl, 하나 이상의 마그네슘염, 하나 이상의 망간염, NaCl, NaHCO₃, Na₂HPO₄, 하나 이상의 셀레늄염, 하나 이상의 바나듐염 및 하나 이상의 아연염으로부터 선택된 성분을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이고, 여기서 각각의 성분은 시험관내 포유류 상피 세포의 현탁 배양을 지지하는 양으로 존재한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 사이토카인, 헤파린, 하나 이상의 동물 펩타이드, 하나 이상의 효모 펩타이드 및 하나 이상의 식물 펩타이드(가장 바람직하게는 쌀, 알로에베라, 대두, 옥수수, 밀, 완두콩, 호박, 시금치, 당근, 감자, 고구마, 타피오카, 아보카도, 보리, 코코넛 및/또는 생두 중 하나 이상, 및/또는 하나 이상의 다른 식물)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 보충제를 임의로 추가로 포함할 수 있는 배지에 관한 것이고, 예를 들어 WO 98/15614로서 공개된 국제 출원 제PCT/US97/18255호를 참조한다.

본 발명에 의해 제공된 배지는 단백질 비함유일 수 있고, 1X 제제일 수 있거나, 예를 들어 10X, 20X, 25X, 50X, 10X, 500X, 또는 1000X 배지 제제로서 농축될 수 있다.

본 발명의 배지는 상이한 형태, 예컨대 건조 분말 배지("DPM"), 과립 제제(pH 조정과 같은 다른 프로세싱이 아니라 물의 첨가를 요함), 액체 배지로 또는 농축물로서의 배지로서 또한 제조될 수 있다.

생성물의 성장 또는 생성이 아니라 오직 유지에 유용한 배지인 기본 배지는 다수의 성분, 예컨대 아미노산, 비타민, 유기 및 무기 염, 당 및 다른 성분을 포함할 수 있고, 각각의 성분은 시험관내 포유류 상피 세포의 배양을 지지하는 양으로 존재한다.

본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물에서, 배지는 다양한 세포를 배양하도록 사용될 수 있다. 바람직하게는, 배지는 진핵생물 세포를 배양하도록 사용된다. 더 바람직하게는, 배지는 식물 및/또는 동물 세포를 배양하도록 사용된다. 더 바람직하게는, 배지는 포유류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 조류 세포를 배양하도록 사용된다. 더 바람직하게는, 배지는 포유류 세포를 배양하도록 사용된다. 더 바람직하게는, 배지는 포유류 세포, 예컨대 1차 상피 세포(예를 들어, 각질세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주 및 이의 균주(예를 들어, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CapT 세포, CHO 세포, BeWo 세포, Chang 세포, 디트로이트(Detroit) 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS180 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, 또는 이의 유도체), 임의의 조직 또는 장기(심장, 간, 신장, 대장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프구성 조직(림프샘, 선양조직, 편도, 골수, 및 혈액), 비장을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)로부터의 섬유아세포 세포, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주(예를 들어, CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프시(Dempsey) 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C₃H/IOTI/2 세포, HSDM₁C₃ 세포, KLN₂O₅ 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 균주 2071(마우스 L) 세포, L-M 균주(마우스 L) 세포, L-MTK-(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스/3T3 세포, 인도 문자크(muntjac) 세포, SIRC 세포, C_II 세포, 및 얀센(Jensen) 세포, 또는 이의 유도체)를 배양하도록 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 배지는 포유류 CHO 세포, CHO-S 세포 또는 이의 유도체, PER-C6 세포 또는 이의 유도체, CHO 세포 또는 이의 유도체, CapT 세포 또는 이의 유도체, COS-7L 세포 또는 이의 유도체 및 Sp2/0 세포 또는 이의 유도체, 또는 임의의 다른 현탁 세포주 또는 상기 정의된 바와 같은 높은 세포 밀도에서 배양될 수 있는 유도체를 배양하도록 사용된다. 더 바람직하게는, 배지는, 본 발명의 기본을 형성하는 고밀도 성장 배지에서 최적 성장에 특이적으로 적응된, CHO 세포, CHO-S 세포 또는 이의 유도체를 배양하도록 사용된다. 몇몇 바람직한 양태에서, 고밀도 성장 배지는 현탁액 중에 세포를 배양하도록 사용된다.

본 발명의 배지에 의해 지지된 세포는 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 마우스 또는 인간으로부터 유래할 수 있다. 본 배지에서 배양된 세포는 정상 세포 또는 비정상 세포(즉, 형질전환된 세포, 확립된 세포, 또는 이환된 조직 샘플로부터 유래한 세포)일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 세포를 본 발명의 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (b) 세포의 재배를 지지하기에 적합한 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 개시된 배양 배지 제제를 사용하여 포유류 상피 또는 섬유아세포 세포를 재배하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 세포로 하나 이상의 거대분자의 도입을 발생시키는 조건 하에 배양된 세포를 하나 이상의 거대분자(바람직하게는 하나 이상의 핵산을 포함)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 바람직하게는, (상기 기재된 임의의 세포를 포함할 수 있는) 이들 방법에 따라 재배된 세포는 현탁액 중에 재배된다.

몇몇 양태에서, 일시적 형질감염 및 재조합 단백질 시스템은 약 1x10⁶ 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖의 범위, 더 바람직하게는 약 2x10⁶개 내지 약 6x10⁶개의 범위의 밀도로 배양된 포유류 세포의 성장 및 전파에 적합한 고밀도 배양 배지를 포함할 수 있다. 임의의 배양 배지는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있고, 단 사용된 배양 배지는, 약 80% 초과로 상기 세포의 생존능력을 유지시키면서, 추가로 효율적으로 형질감염되고 높은 양의 재조합 단백질을 발현하는 상기 현탁 세포의 능력을 유지시키면서, 약 2x10⁷개의 세포/㎖ 이하의 밀도로 포유류 세포, 예컨대 현탁액 중에 성장하는 세포의 성장을 지속할 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용되는 고밀도 배양 배지는 상이한 분야 및 용도 사이에 변할 수 있고, 하기 기재된 바대로 사용되는 세포주의 성질, 일시적으로 발현되는 원하는 단백질, 세포로의 발현 벡터의 이동에 선택된 형질감염 양상의 성질 및 시스템에 첨가되는 임의의 발현 증강인자의 양 및 성질에 따라 변할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 일시적 발현 시스템 및 방법에서 사용하도록 고려되는 바람직한 고밀도 배양 배지는 통상적으로 혈청 비함유, 단백질 비함유일 것이고, 약 2x10⁷개의 세포/㎖ 이하, 더 통상적으로 약 2x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 1x10⁷개의 세포/㎖의 밀도로 현탁 세포의 재배 및 성장을 허용하고, 추가로 일시적 발현 시스템에서 생성된 단백질의 수율이 세포 배양물의 1㎖당 적어도 200㎍ 내지 세포 배양물의 1㎖당 2㎎, 더 통상적으로 세포 배양물의 1㎖당 약 500㎍ 내지 세포 배양물의 1㎖당 약 1㎎을 초과하게끔 할 것이다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용되는 고밀도 배양 배지는 약 1x10⁶개 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖, 약 2x10⁶개 내지 약 2x10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 2.5x10⁶개 내지 약 6 x10⁶개의 세포/㎖의 범위의 밀도로 세포의 형질감염을 촉진할 수 있다.

본 발명의 실행에 적합한 특히 바람직한 고밀도 성장 배지는 각각의 화학 종 및 이의 각각의 분량이 세포를 배양하는 이의 사용 전에 공지된 화학적으로 한정된 배지일 수 있다. 선택된 화학적으로 한정된 배지는 화학 종이 공지되고/되거나 정량화되지 않은 세포 또는 조직 용해물 또는 가수분해물 없이 임의로 제조될 수 있다.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 실행을 위한 배지의 특히 적합한 유형은 예를 들어 소 태아 혈청(FBS), 송아지 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 인간 혈청 등이 전부 없는 혈청 비함유 배지(때때로 "SFM 배지"라 칭함)이다. 숙련자에게 익숙한 예시적이지만 비제한적인 혈청 비함유 배지는 ExpiCHO 발현 배지, HuMEC 기본 혈청 비함유 배지, 넉아웃(상표명) CTS(상표명) XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPRO(상표명)-34 SFM 배지, STEMPRO(상표명) NSC 배지, 에센셜(상표명)-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) 293 발현 배지, ExpiCHO(상표명) 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, 에센셜(상표명)-6 배지, STEMPRO(상표명)-34 배지, Gibco(등록상표) 성상교세포 배지, AIM V(등록상표) 배지 CTS(상표명), AMINOMAX(상표명) C-100 기본 배지, AMINOMAX(상표명)-II 컴플리트 배지, CD FORTICHO(상표명) 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) CHO 발현 배지, CD OPTICHO(상표명) 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900(상표명) 배지, Expi293(상표명) 발현 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER C6(등록상표) 세포 배지, AIM V(등록상표) 배지, EXPILIFE(등록상표) 배지, 각질세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 임의의 이들의 유도체 또는 변형을 포함한다.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 실행을 위한 배지의 특히 적합한 유형은 단백질(예를 들어, 혈청 무 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 부착 인자, 영양제공 단백질, 예컨대 성장 인자, 또는 금속 이온 운반 단백질, 예컨대 트랜스페린, 셀룰로플라스민 등)이 전부 없는 단백질 비함유 배지(때때로 "PFM 배지"라 칭함)이다. 바람직하게는, 펩타이드가 존재하는 경우, 펩타이드는 더 작은 펩타이드, 예를 들어 다이-펩타이드 또는 트라이-펩타이드이다. 바람직하게는, 데카-펩타이드 길이 또는 이것 초과의 펩타이드는 단백질 비함유 배지에 존재하는 아미노산의 약 1% 미만, 더 바람직하게는 약 0.1% 미만, 심지어 더 바람직하게는 약 0.01% 미만이다.

이상적으로, 본 발명과 사용하기에 고려되는 혈청 비함유 및 단백질 비함유 배지 둘 다는, 임의의 동물 유래 재료, 또는 재조합 동물 DNA 또는 재조합 동물 단백질 DNA를 포함하는, 동물 소스로부터 전체로 또는 부분적으로 유래한, 임의의 재료가 추가로 없을 것이다.

본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 예시적인 고밀도 배양 배지는 ExpiCHO(상표명) 발현 배지, HuMEC 기본 혈청 비함유 배지, 넉아웃(상표명) CTS(상표명) XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPRO(상표명)-34 SFM 배지, STEMPRO(상표명) NSC 배지, 에센셜(상표명)-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, 에센셜(상표명)-6 배지, STEMPRO(상표명)-34 배지, Gibco(등록상표) 성상교세포 배지, AIM V(등록상표) 배지 CTS(상표명), AMINOMAX(상표명) C-100 기본 배지, AMINOMAX(상표명)-II 컴플리트 배지, CD FORTICHO(상표명) 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO(등록상표)프리스타일(상표명) CHO 발현 배지, CD OPTICHO(상표명) 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900(상표명) 배지, LHC 기본 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6(등록상표) 세포 배지, AIM V(등록상표) 배지, EXPILIFE(등록상표) 배지, 각질세포-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 임의의 이들의 유도체 또는 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 고밀도 배양 배지는 CD FORTICHO(상표명) 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO(등록상표)프리스타일(상표명) CHO 발현 배지, CD OPTICHO(상표명) 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, GIBCO(등록상표) 프리스타일(상표명) 293 발현 배지, Expi293(상표명) 발현 배지, 또는 유사 배지, 또는 이의 변형된 버전일 수 있다. 상기 기재된 예시적인 고밀도 배양 배지는 고밀도 배양 시스템에 적응된 CHO 세포, CHO 세포 변이체 또는 임의의 다른 CHO 세포의 고밀도 성장, 전파, 형질감염 및 유지에 특히 적합할 수 있다. 임의로, 사용자는 본 명세서에 기재된 특성을 가지는 새로운 배양 배지를 제제화하도록 바랄 수 있거나, 대신에 기존의 배양 배지를 재제제화하거나 변형시킬 것을 선택할 수 있다.

몇몇 양태에서, 고밀도 성장 배지는 목록으로부터 선택될 수 있다. 이러한 배지는 ExpiCHO(상표명) 발현 배지, CD FORTICHO(상표명) 배지, Expi293(상표명) 발현 배지, ExiCHO(상표명) 발현 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 이글(BME), RPMI-1640, 햄 F-10, 햄 F-12, ?-최소 필수 배지(?-MEM), 글라스고우 최소 필수 배지(G-MEM) 및 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 293 SFM, CD-CHO 배지, VP SFM, BGJb 배지, 브린스터 BMOC-3 배지, 세포 배양 동결 배지, CMRL 배지, EHAA 배지, eRDF 배지, 피셔 배지, 감보르그 B-5 배지, GLUTAMAX(상표명) 보충 배지, 그레이스 곤충 세포 배지, HEPES 완충 배지, 리히터 변형 MEM, IPL-41 곤충 세포 배지, 레이보비츠 L-15 배지, 맥코이 5A 배지, MCDB 131 배지, 배지 199, 변형 이글 배지(MEM), 배지 NCTC-109, 슈나이더 드로소필라 배지, TC-100 곤충 배지, 웨이마우스 MB 752/1 배지, 윌리암 배지 E, 단백질 비함유 하이브리도마 배지 II(PFHM II), AIM V 배지, 각질세포 SFM, 한정된 각질세포 SFM, STEMPRO(등록상표) SFM, STEMPRO(등록상표) 컴플리트 메틸셀룰로스 배지, HepatoZYME-SFM, 뉴로베이절(상표명) 배지, 뉴로베이절-A 배지, Hibernate(상표명) A 배지, Hibernate E 배지, 내피 SFM, 인간 내피 SFM, 하이브리도마 SFM, PFHM II, Sf 900 배지, Sf 900 TI SFM, EXPRESS FIVE(등록상표) 배지, CHO-S-SFM, AMINOMAX-II 컴플리트 배지, AMINOMAX-C100 컴플리트 배지, AMINOMAX-C 100 기본 배지, PB-MAX(상표명) 염색체분석 배지, KARYOMAX 골수 염색체분석 배지, 넉아웃 D-MEM 및 CO2 독립적 배지(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는, 상업적으로 구입 가능한(예를 들어, 테크놀로지스 코포레이션(캘리보티아주 칼스바드)사제) 또는 달리 당해 분야에 공지된 다른 배지는 본 발명에 따라 동등하게 사용될 수 있다. 상기 배지는 JRH, Sigma, HyClone 및 BioWhittaker와 같은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 제조사로부터 얻어진다. 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 배지의 추가 예는 미국 특허 제5,135,866호 및 제5,232,848호, 및 국제 공보 WO 제88/02774호, WO 제98/15614호, WO 제98/08934호 및 유럽 특허 제0 282 942호(이의 전문은 본 명세서에서 참고로 구체적으로 포함됨)에서 발견될 수 있다. 임의로, 사용자는 본 명세서에 기재된 특성을 가지는 새로운 배양 배지를 제제화하도록 바랄 수 있거나, 대신에 기존의 배양 배지를 재제제화하거나 변형시킬 것을 선택할 수 있다.

본 발명은 추가로 본 발명의 배양 배지를 포함하는 조성물을 제공하고, 이것은 임의로 하나 이상의 포유류 상피 또는 섬유아세포 세포, 예컨대 상기 기재된 것, 특히 하나 이상의 CHO 세포, CHO-S 세포, 또는 임의의 이의 유도체, 예컨대 CHO-S-2H2 세포 또는 ExiCHO-S(상표명) 세포를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 고수율 일시적 형질감염 시스템은 이의 생존능력, 효율적으로 형질감염되는 능력 또는 높은 수준의 재조합 단백질을 발현하는 이의 능력의 실질적인 소실 없이 높은 밀도 조건 하에 적응되거나 되었던 하나 이상의 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 약 1x10⁶개 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖의 범위, 더 바람직하게는 약 2x10⁶개 내지 약 6x10⁶개의 범위의 밀도로 배양된 포유류 세포의 성장 및 전파의 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포주이다. 임의의 세포주가 제한 없이 사용될 수 있고, 단 세포주는, 약 80%의 초과로 높은 밀도로 이의 생존능력을 유지시키고 높은 효율로 형질감염시키고 배양물의 1ℓ당 약 2g 이하의 수준으로 재조합 단백질을 발현하는 이의 능력을 유지시키면서, 상기 정의된 바와 같은 높은 밀도 조건 하에 성장할 수 있다. 이러한 세포주의 식별은 숙련자의 이해범위 내에 제대로 있고, 이러한 숙련자는 이의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포주를 식별할 수 있다. 고밀도 배양에 적응된 세포는, 약 80% 이상에서 세포 생존능력을 보유하면서, 고밀도 배양 배지 중에 고밀도로 성장하도록 적응된, 세포 계통 또는 동일한 모 세포 계통으로부터 유래한 세포의 (비클론) 집단일 수 있다. 이러한 세포는 40 초과, 50 초과, 60 초과, 70 초과 또는 80 초과의 순차 계대배양에 걸쳐 고밀도로 세포를 유지시키고, 원하는 고밀도 배양 배지에 의해 성장 배지의 비율을 점진적으로 대체함으로써 세포의 모 집단으로부터 단리되거나 선택될 수 있다. 임의로, 상기 과정 동안에, 세포의 상이한 풀은, 형질감염 효율 및 또는 단백질 발현 효율을 동시에 평가하면서, 개별적으로 전파되고 선택 절차로 처리될 수 있어서, 세포의 비클론 집단은 고밀도로 지속되고 성장하고, 높은 효율로 형질감염되고, 높은 수준의 원하는 재조합 단백질을 발현하도록 선택될 수 있다. 다양한 세포 유형 및 계통이 이 선택 절차로 처리될 수 있다는 것이 숙련자에게 용이하게 명확할 것이지만, CHO 세포로부터 유래한 세포 계통은 고밀도 성장 조건에 적응하도록 선택 과정에 특히 수정 가능하다고 결정되었다. 이상적으로, 고밀도 성장 배양에 적응되고 본 발명에서 사용하기에 수정 가능한 세포는 또한 높은 효율로 형질감염될 수 있고/있거나, 재조합 단백질을 적어도 세포 배양물의 1㎖당 약 200㎍ 내지 세포 배양물의 1㎖당 약 2㎎, 더 통상적으로 세포 배양물의 1㎖당 약 500㎍ 내지 세포 배양물의 1㎖당 약 1㎎을 초과하는 수율로 발현할 수 있을 것이다. 이상적으로, 본 발명에 따라 사용되는 고밀도 배양에 적응된 세포는 약 1x10⁶개 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖, 약 2x10⁶개 내지 약 25x10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 2.5x10⁶개 내지 약 50x10⁶개의 세포/㎖의 범위의 밀도로 지속되고 형질감염될 수 있다.

비제한적인 예로서, 본 명세서에 기재된 실시형태에 따라 고밀도 배양에 적응될 수 있는 세포 또는 세포주는 세포, 예컨대 배양된 진핵생물 세포, 더 바람직하게는, 배양된 식물 및/또는 동물 세포, 더 바람직하게는, 배양된 포유류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 조류 세포를 포함할 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태에 따라 고밀도 배양에 적응될 수 있는 세포 또는 세포주는 배양 포유류 세포, 예컨대 1차 상피 세포(예를 들어, 각질세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주 및 이의 균주(예를 들어, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CapT 세포, CHO 세포, BeWo 세포, Chang 세포, 디트로이트 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS180 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, 또는 이의 유도체), 임의의 조직 또는 장기(심장, 간, 신장, 대장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프구성 조직(림프샘, 선양조직, 편도, 골수, 및 혈액), 비장을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)로부터의 섬유아세포 세포, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주(예를 들어, CHO 세포, 예컨대 CHO-S 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프시 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C₃H/IOTI/2 세포, HSDM₁C₃ 세포, KLN₂O₅ 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 균주 2071(마우스 L) 세포, L-M 균주(마우스 L) 세포, L-MTK-(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스/3T3 세포, 인도 문자크 세포, SIRC 세포, C_II 세포, 및 얀센 세포, 또는 이의 유도체)를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 배지는 293 세포, 293 F 세포 또는 이의 유도체, PER-C6 세포 또는 이의 유도체, CHO 세포 또는 이의 유도체, 예컨대 CHO-S 세포, 현탁 CHO 세포, CHO-S-2H2 세포, ExpiCHO-S(상표명) 세포, CapT 세포 또는 이의 유도체, COS-7L 세포 또는 이의 유도체 및 Sp2/0 세포 또는 이의 유도체, 또는 상기 정의된 바와 같은 높은 세포 밀도에서 배양될 수 있는 임의의 다른 현탁 세포주 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 포유류 세포를 배양하도록 사용된다. 더 바람직하게는, 배지는 CHO 세포 또는 이의 유도체, 예컨대 CHO-S 세포, 현탁 CHO 세포, CHO-S-2H2 세포, ExpiCHO-S(상표명) 세포, 본 발명의 기본을 형성하는 세포 배양 배지에서 최적 성장에 특이적으로 적응된 세포주를 배양하도록 사용된다. 본 발명의 몇몇 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 고밀도 배양에서 사용하도록 적응된 세포는 현탁액 중에 성장하도록 적응된 현탁 세포, 또는 부착성 세포이다.

본 발명의 배지에 의해 지지된 세포는 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 마우스 또는 인간으로부터 유래할 수 있다. 본 배지에서 배양된 세포는 정상 세포 또는 비정상 세포(즉, 형질전환된 세포, 확립된 세포, 또는 이환된 조직 샘플로부터 유래한 세포)일 수 있다.

본 명세서에 기재된 실시형태에 따른 고밀도 배양에 적응된 세포는 임의로 하나 이상의 발현 증대 단백질을 발현할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "발현 증대 단백질"은 세포에 의해 발현된 임의의 단백질을 의미하고; 단백질의 발현은 재조합 단백질의 발현을 증대시킨다. 세포주 또는 세포의 집단에 의한 발현 증대 단백질의 발현은 본 실시형태의 목적을 위해 안정 또는 일시적일 수 있다. 다양한 이러한 발현 증대 단백질은 당해 분야에 공지되어 있고, 단백질, 예컨대 PKBa, Bcl-x_L, P21, P18, AKT 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 고수율 일시적 형질감염 시스템은 관심 있는 재조합 단백질을 일시적으로 발현하기 위한 하나 이상의 발현 벡터를 포함할 수 있다. 발현 가능한 핵산(예컨대, 최적화된 제어 단백질과 비교할 때 발현 효율을 평가하도록 양성 대조군 등)을 이미 함유하는 발현 벡터가 제공될 수 있거나, 대안적으로, 발현 벡터는 사용자가 관심 있는 단백질의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 발현 가능한 핵산을 용이하게 삽입할 수 있는 형태로 제공될 수 있어서, 관심 있는 단백질은 세포에서 재조합으로 및 높은 효율로 발현될 수 있다.

관심 있는 단백질의 재조합 생성을 위해, 단백질을 코딩하는 발현 가능한 핵산은 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 단리되고 복제 가능한 벡터로 삽입된다. 단백질을 코딩하는 DNA는 종래의 절차를 이용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 구입 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 유전요소, 프로모터, 및 전사 개시 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

a) 신호 서열 성분

관심 있는 단백질은 재조합으로 직접적으로뿐만 아니라, 비상동성 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 생성될 수 있고, 이는 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N 말단에서 특정한 결합 부위를 가지는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드이다. 선택된 비상동성 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열, 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용 가능하다.

b) 복제 기원

발현 및 클로닝 벡터 둘 다는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제하게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 벡터를 클로닝하는 데 있어서 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제하게 하는 것이고, 복제 기원 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기원은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기원은 초기 프로모터를 함유하므로 통상적으로 오직 사용될 수 있다).

c) 선택 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선택 가능한 마커라 또한 칭하는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 통상적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합체 배지로부터 이용 가능하지 않은 중요한 영양소, 예를 들어 바실리(Bacilli)에 대한 유전자를 코딩하는 D-알라닌 라세마제를 제공하는, 단백질을 코딩한다.

선택 반응식의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키도록 약물을 사용한다. 비상동성 유전자에 의해 성공적으로 형질전환된 이 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고 이로써 선택 섭생에 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.

포유류 세포에 대한 적합한 선택 가능한 마커의 또 다른 예는 항체 코딩 핵산을 흡수하기 위한 능력있는 세포의 식별이 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR, 글루타민 합성효소(GS), 타이미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 탈아미노효소, 오르니틴 탈탄산효소 등이다.

예를 들어, DHFR 유전자에 의해 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 식별된다. 이 조건 하에, DHFR 유전자는 임의의 다른 동시형질전환된 핵산을 따라 증폭된다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들어, ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.

대안적으로, GS 유전자에 의해 형질전환된 세포는 GS의 저해제인 L-메티오닌 설폭시민(Msx)을 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 식별된다. 이 조건 하에, GS 유전자는 임의의 다른 동시형질전환된 핵산을 따라 증폭된다. GS 선택/증폭 시스템은 상기 기재된 DHFR 선택/증폭 시스템과 조합되어 사용될 수 있다.

대안적으로, 관심 있는 항체, 야생형 DHFR 유전자, 및 또 다른 선택 가능한 마커, 예컨대 아미노글라이코사이드 3'-포스포전환효소(APH)를 코딩하는 DNA 서열에 의해 형질전환 또는 동시형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글라이코시드 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418과 같은 선택 가능한 마커에 대한 선택 물질을 함유하는 배지 중에 세포 성장에 의해 성장할 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.

효모에서 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 44076호 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. Jones, Genetics, 85:12 (1977). 이후, 효모 숙주 세포 게놈에서의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 존재 하의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래한 벡터는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 소 키모신의 대규모 생성을 위한 발현 시스템은 케이. 락티스에 대해 보고되어 있다. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). 클루이베로마이세스의 산업 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중카피 발현 벡터는 또한 개시되어 있다. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

d) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 함유하고, 관심 있는 단백질을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 상류에 대략 25개 내지 30개의 염기에 위치한 AT 농후 영역을 가진다. 많은 유전자의 전사의 시작으로부터 상류에 70개 내지 80개의 염기가 발견된 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역일 수 있다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에서 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 첨가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열은 진핵생물 발현 벡터로 적합하게 삽입된다.

포유류 숙주 세포에서의 벡터로부터의 단백질 전사는 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 유인원 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터에 의해, 또는 비상동성 포유류 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 쇼크 프로모터로부터 제어될 수 있고, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기원을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 단순 포진 바이러스로부터의 타이미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 또한 문헌[Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부는 프로모터로서 사용될 수 있다.

e) 증강인자 유전요소 성분

더 고등의 진핵생물에 의한 본 발명에 따른 관심 있는 단백질을 코딩하는 DNA의 전사는 대개 벡터로 증강인자 서열을 삽입함으로써 증가하거나 증대된다. 많은 증강인자 서열은 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 현재 공지되어 있다. 대개, 배타적이지는 않지만, 진핵생물 세포 바이러스로부터 증강인자를 사용할 것이다. 예는 복제 기원의 후기 측에서의 SV40 증강인자(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 증강인자, 복제 기원의 후기 측에서의 폴리오마 증강인자 및 아데노바이러스 증강인자를 포함한다. 진핵생물 프로모터의 활성화에 대해 유전요소를 증대시키는 것에 대해 문헌[Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 또한 참조한다. 증강인자는 항체 코딩 서열에 대한 위치 5' 또는 3'에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다. 추가 증강인자는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 포유류 또는 바이러스 유전자로부터 얻어지거나 유래된 증강인자를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용하도록 고려되는 하나의 특히 바람직한 증강인자는 우드척 간염 전사 후 조절 유전요소(WPRE)이다.

f) 전사 종결 성분

진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA를 안정화하기 위한 필요한 서열을 또한 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 가끔 3', 비번역된 영역으로부터 흔히 이용 가능하다. 이들 영역은 mRNA 코딩 항체의 비번역된 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 분절을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 여기서 개시된 발현 벡터를 참조한다.

몇몇 양태에서, 본 발명의 실행에 매우 적합한 발현 벡터는 당해 분야에서 사용된 임의의 널리 공지된 벡터, 예컨대 pCDNA 3.3, 또는 이의 변형된 버전 등일 수 있다. 본 발명의 실행에서 적합할 수 있는 벡터에 대한 변형의 유형의 비제한적인 예는 하나 이상의 증강인자, 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 리보솜 결합 자리, 하나 이상의 복제 기원 등의 변형의 추가와 같은 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 발현 벡터는 본 일시적 발현 시스템에서 관심 있는 단백질의 발현을 개선하도록 선택된 하나 이상의 증강인자 유전요소를 포함할 수 있다. 선택된 증강인자 유전요소는 관심 있는 단백질을 발현하도록 사용된 발현 가능한 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. 특히 바람직하지만 비제한적인 증강인자 유전요소는 우드척 간염 전사 후 조절 유전요소(WPRE)이다.

하나의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 이전에 기재된 발명에 따라 사용된 발현 벡터는 pcDNA 벡터, 또는 특히, pcDNA 3.3 벡터, 더 특히 pcDNA 3.3 벡터의 변이체일 수 있다. 벡터는 임의로 증대된 프로모터, 예컨대 증대된 CMV 프로모터 등을 포함할 수 있다. 임의로, 벡터는 아데노 T+M 영역, 임의로 SV40ori 부위, 임의로 SV40 스플라이스 도너/억셉터 부위, 또는 임의로 우드척 간염 전사 후 조절 유전요소(WPRE)를 포함할 수 있다.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 고수율 일시적 형질감염 시스템은 하나 이상의 발현 증강인자를 포함할 수 있다. 발현 증강인자는 일시적 발현 시스템에서 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 하나 이상의 화합물을 함유하는 수성 용액일 수 있다. 다양한 발현 증강인자는 당해 분야에 공지되어 있고, 임의의 하나 이상은 제한 없이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.

일반적으로, 하나 이상의 형질감염 증강인자는 상기 세포는 발현 가능한 핵산 또는 발현 벡터에 의해 형질감염되는 동안에 또는 형질감염된 후에 단백질 발현 세포의 집단과 접촉한다. 2개 이상의 발현 증강인자가 사용될 때, 각각의 발현 증강인자는 실질적으로 동시에 세포와 접촉할 수 있거나, 대안적으로 발현 증강인자는, 임의로 세포가 제1 발현 증강인자와 접촉하는 것과 세포가 제2 발현 증강인자와 접촉하는 것 사이의 시간 기간이 경과한 후에, 순차적으로 단백질 발현 세포와 접촉할 수 있다.

임의의 다수의 발현 증강인자가 제한 없이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있고, 본 실시형태에서 사용하기 위한 적합한 발현 증강인자를 구성하는 것의 식별은 이러한 숙련자의 이해범위 내에 제대로 있다는 것이 숙련자에 의해 용이하게 이해될 것이지만, 다양한 예시적이지만 비제한적인 발현 증강인자는 하기 기재될 것이지만, 이의 인용은 본 발명의 실행에서 사용하기에 고려될 수 있는 적합한 발현의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

몇몇 양태에서, 하나 이상의 발현 증강인자는 현재 기재된 실시형태에 따른 배양 배지 제제를 보충하도록 사용되는 액체(바람직하게는 수성) 첨가제를 포함할 수 있고, 상기 첨가제는 현재 기재된 실시형태에 따른 일시적 단백질 발현 시스템에서 생성된 발현된 단백질의 수율을 개선하도록 선택된다. 하나 이상의 발현 증강인자는 세포 주기 진행에 영향을 미치고/미치거나, 아폽토시스를 저해하고/하거나, 세포 성장을 느리게 하고/하거나, 단백질 생성을 촉진하는 몇몇 화합물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 증강인자"는 일반적으로 일시적 형질감염 시스템에 첨가되는 임의의 하나 이상의 화합물을 의미하고, 이의 존재는 이러한 발현 증강인자(들)의 부재에서 보이는 발현 수준보다 높은 적어도 2배 내지 약 10배의 인자에 의해, 표적 단백질의 발현을 증대시키거나 촉진한다. 현재 기재된 실시형태와 사용하기에 적합한 예시적인 발현 증강인자는 첨가제, 예컨대 발프로산(VPA, 산 및 나트륨 염), 나트륨 프로피오네이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 당, 예컨대 갈락토스, 아미노산 혼합물, 또는 뷰티르산, 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 각각의 특정한 발현 증강인자의 최적 농도는 발현 시스템의 개별 특징 및 사용자의 요건에 따라 변할 수 있고, 소정의 실험 시나리오에서 임의의 하나 이상의 발현 증강인자의 최적 농도를 구성하는 것의 결정은 당해 분야의 일반 지식 수준을 가지는 실행자의 이해범위 내에 제대로 있다.

예시적인 일 실시형태에서, 발현 증강인자는 발프로산을 함유하는 제제일 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용된 발프로산(VPA)의 최적 최종 농도 범위는 변할 수 있지만, 바람직하게는 약 0.20mM 내지 약 25mM의 범위, 또는 이 범위에 의해 포함된 임의의 하위범위 또는 농도 값일 것이다. 더 바람직하게는, VPA의 최종 농도는 약 0.25mM 내지 약 24mM, 약 0.26mM 내지 약 23mM, 0.27mM 내지 약 23mM, 0.28mM 내지 약 23mM, 0.29mM 내지 약 22mM, 약 0.30mM 내지 약 21mM, 약 0.31mM 내지 약 20mM, 약 0.32mM 내지 약 19mM, 약 0.33mM 내지 약 17mM, 약 0.34mM 내지 약 18mM, 약 0.35mM 내지 약 17mM, 약 0.36mM 내지 약 16mM, 약 0.37mM 내지 약 15mM, 약 0.40mM 내지 약 14mM, 약 0.41mM 내지 약 13mM, 약 0.42mM 내지 약 12mM, 약 0.43mM 내지 약 11mM, 약 0.44mM 내지 약 10mM, 약 0.45mM 내지 약 9mM, 약 0.46mM 내지 약 8mM, 약 0.47mM 내지 약 7mM, 약 0.48mM 내지 약 6mM, 약 0.49mM 내지 약 5mM, 약 0.50mM 내지 약 4mM, 약 0.50mM 내지 약 4mM, 약 0.55mM 내지 약 3mM, 0.6mM 내지 약 2mM 또는 0.75 내지 약 1.5mM의 범위일 것이다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.15mM 내지 약 1.5mM, 약 0.16mM 내지 약 1.5mM, 약 0.17mM 내지 약 1.5mM, 약 0.18mM 내지 약 1.5mM, 약 0.19mM 내지 약 1.5mM, 약 0.20mM 내지 약 1.5mM, 약 0.25mM 내지 약 1.5mM, 약 0.30mM 내지 약 1.5mM, 약 0.40mM 내지 약 1.5mM, 약 0.50mM 내지 약 1.5mM, 약 0.60mM 내지 약 1.5mM, 약 0.70mM 내지 약 1.5mM, 약 0.80mM 내지 약 1.5mM, 약 0.90mM 내지 약 1.5mM 또는 약 0.10mM 내지 약 1.5mM일 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.20 내지 약 1.5mM, 약 0.21 내지 약 1.4mM, 약 0.22 내지 약 1.4mM, 약 0.23 내지 약 1.4mM, 약 0.24 내지 약 1.4mM, 약 0.25 내지 약 1.3mM, 약 0.25 내지 약 1.2mM, 약 0.25 내지 약 1.1mM, 또는 약 0.25 내지 약 1.0mM일 수 있다.

또 다른 예시적인 실시형태에서, 발현 증강인자는 나트륨 프로피오네이트(NaPP)를 함유하는 제제일 수 있다. 임의로, NaPP는 상기한 바대로 단독으로 또는 발프로산과 조합되어 제공될 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용된 NaPP의 최적 최종 농도 범위는 변할 수 있지만, 바람직하게는 약 의 범위일 것이다 추가의 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 발프로산(VPA)의 최적 최종 농도 범위는 변할 수 있지만, 바람직하게는 약 0.20mM 내지 약 25mM의 범위, 또는 이 범위에 의해 포함된 임의의 하위범위 또는 농도 값일 것이다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 0.5 내지 약 80mM, 약 0.4mM 내지 약 70mM, 약 0.5mM 내지 약 60mM, 약 0.6mM 내지 약 50mM, 약 0.7mM 내지 약 40mM, 약 0.8mM 내지 약 30mM, 약 0.9mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 15mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 또는 약 5mM 내지 약 7mM의 범위일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 또는 약 9mM 내지 약 10mM의 범위일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 2.5mM, 약 3mM, 약 3.5mM, 약 4mM, 약 4.5mM, 약 5mM, 약 5.5mM, 약 6mM, 약 6.5mM, 약 7mM, 약 7.5mM, 약 8mM, 약 8.5mM, 약 9mM, 약 9.5mM, 또는 약 10mM일 수 있다.

더욱 또 다른 예시적인 실시형태에서, 발현 증강인자는 리튬 아세테이트(LiAc)를 함유하는 제제일 수 있다. 임의로, LiAc는 상기한 바대로 단독으로 또는 NaPP와 조합되어 제공될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 리튬 아세테이트(LiAc)의 최적 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25mM, 약 0.26mM 내지 약 20mM, 약 0.27mM 내지 약 15mM, 약 0.28mM 내지 약 10mM, 약 0.29mM 내지 약 5mM, 약 0.3mM 내지 약 4.5mM, 약 0.31mM 내지 약 4mM, 약 0.35mM 내지 약 3mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2mM 내지 약 3mM의 범위일 수 있다.

여전히 더욱 또 다른 예시적인 실시형태에서, 발현 증강인자는 뷰티르산을 함유하는 제제일 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용된 뷰티르산의 최적 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25mM, 약 0.26mM 내지 약 20mM, 약 0.27mM 내지 약 15mM, 약 0.28mM 내지 약 10mM, 약 0.29mM 내지 약 5mM, 약 0.3mM 내지 약 4.5mM, 약 0.31mM 내지 약 4mM, 약 0.35mM 내지 약 3mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2mM 내지 약 3mM의 범위일 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 발현 증강인자는 형질감염 직전에 또는 동안에, 또는 형질감염 후에 그러나 세포 및 발현된 단백질의 수확 전에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 하기 기재된 몇몇 구체적이지만 비제한적인 실시형태에서, "증강인자 1"은 일반적으로 0.25mM 내지 1mM 발프로산을 의미하고, "증강인자 2"는 일반적으로 5mM 내지 7mM 나트륨 프로피오네이트를 의미한다. 그러나, 달리 표시되지 않는 한, 용어 증강인자 1 및 증강인자 2는 상이한 증강인자 화합물을 포함할 수 있다. 발현 증강인자는 순차적으로, 또는 칵테일로서 배양 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 고수율 일시적 형질감염 시스템은 배양된 세포로의 거대분자의 도입을 위한 하나 이상의 시약(상기 시약은 "형질감염 시약"이라 흔히 언급됨)을 포함할 수 있다. 현재 기재된 실시형태에 따라 사용된 형질감염 시약은 세포로 생물학적 분자, 특히 핵산 분자를 도입하기 위한 임의의 화합물 또는 다른 화학 양상일 수 있고, 이로써 핵산은 생물학적 기능을 발휘할 수 있거나, 발현 가능한 핵산의 경우에, 여기서 상기 발현 가능한 핵산에 의해 코딩된 유전자 또는 단백질은 발현될 수 있다. 다양한 적합한 형질감염 시약은 당해 분야에 공지되어 있고, 임의의 하나 이상은 제한 없이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.

본 실시형태와 사용하기 위한 형질감염 시약은 세포로의 거대분자의 진입을 촉진하는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 제제 또는 조성물이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,279,833호를 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 시약은 "형질감염 시약"일 수 있고, 하나 이상의 표적 세포로 하나 이상의 핵산의 흡수를 증가시키는 임의의 화합물 및/또는 조성물일 수 있다. 다양한 형질감염 시약은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 적합한 형질감염 시약은 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민(PEI), 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 예컨대 폴리라이신 및 폴리아르기닌, 양으로 하전된 덴드리머 및 균열된 덴드리머, 양이온성 β-사이클로덱스트린 함유 중합체(CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 세포로의 거대분자의 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 천연 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPE),1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4'-트라이메틸암모니오) 프로판(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-(4'-트라이메틸암모니오) 뷰타노일-sn-글라이세롤(DOTB), 1,2-다이올레오일-3-숙신일-sn-글라이세롤 콜린 에스터(DOSC), 콜레스테릴(4'-트라이메틸암모니오)뷰타노에이트(ChoTB), 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), O,O'-다이도데실-N-[p(2-트라이메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 접합된 스퍼민(예를 들어, 5-카복시스퍼밀글라이신 다이옥타데실아미드(DOGS), N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스퍼민(TM-TPS) 및 다이팔미토일파스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES)), 리포폴리라이신(OPE에 접합된 폴리라이신), TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 접합된 지방산(TFA) 및/또는 펩타이드, 예컨대 트리릴실-알라닐-TRIS 모노-, 다이-, 및 트라이-팔미테이트, (3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤(DC-Chol), N-(α-트라이메틸암모니오아세틸)-다이도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 다이메틸 다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미니늄트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

당해 분야의 숙련자는, 상기 언급된 지질의 소정의 조합이 세포로의 핵산의 도입에 특히 적합한 것으로 나타났다는 것을 인식할 것이고, 예를 들어 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 조합이 상표명 리포펙타민(상표명) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 조합이 상표명 리포펙틴(등록상표) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, DMRIE 및 콜레스테롤의 1:1(w/w) 조합이 상표명 DMRIE-C 시약 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, TM-TPS 및 DOPE의 1:1.5(M/M) 조합이 상표명 셀펙틴(등록상표) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, DDAB 및 DOPE의 1:2.5(w/w) 조합이 상표명 LipfectACE(등록상표) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하다. 상기 언급된 지질 조합 이외에, 다른 화합물과 혼합된, 특히 핵 국재화 서열을 포함하는 펩타이드 및 단백질과 혼합된, 지질을 포함하는 다른 제제는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어, WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호(이들 둘 다 본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다.

지질 응집체, 예컨대 리포솜은 세포로의 거대분자의 전달을 위한 물질로서 유용한 것으로 발견되었다. 특히, 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집체는 세포로의 음이온성 거대분자(예를 들어, 핵산)의 전달에 극도로 효율적인 것으로 입증되었다. 하나의 흔히 사용되는 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)이다. 단독으로 또는 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)과의 1:1 혼합물로서 DOTMA를 포함하는 리포솜은 세포로 핵산을 도입하기 위해 사용된다. DOTMA:DOPE의 1:1 혼합물은 상표명 리포펙틴(상표명) 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 상업적으로 구입 가능하다. 세포로 핵산을 도입하기 위해 사용된 또 다른 양이온성 지질은 1,2-비스(올레오일-옥시)-3-3-(트라이메틸암모니아) 프로판(DOTAP)이다. DOTAP는 올레오일 모이어티가 DOTAP에서 에테르 결합을 통해 프로필아민 골격에 연결된다는 점에서 DOTMA와 다른 한편, 이들은 DOTMA에서 에스터 결합을 통해 연결된다. DOTAP는 표적 세포에 의해 더 용이하게 분해된다고 여겨진다. 트라이메틸암모늄 모이어티의 메틸기 중 하나가 하이드록시에틸기에 의해 대체된 화합물의 구조적으로 관련된 그룹은 포스포리파제 A의 로젠탈 저해제(RI)와 구조가 유사하다(문헌[Rosenthal, et al., (1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206] 참조). RI는 프로필아민 코어에 연결된 스테아로일 에스터를 가진다. RI의 다이올레오일 유사체는, 프로필아민 코어에 대한 지질 모이어티의 연결에 따라, DOR1-에테르 및 DOR1-에스터라 흔히 축약된다. 하이드록시에틸 모이어티의 하이드록실기는 예를 들어 카복시스퍼민에 대해 에스터화에 의해 추가로 유도체화될 수 있다.

세포로의 거대분자의 도입에 사용된 화합물의 또 다른 종류는 지질에 부착된 카복시스퍼민 모이어티를 포함한다(문헌[Behr, et al., (1989) Proceedings of the National Academy of Sciences], USA 86:6982-6986 및 EPO 0 394 111 참조). 이 유형의 화합물의 예는 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES) 및 5-카복시스퍼밀글라이신 다이옥타데실아미드(DOGS)를 포함한다. DOGS는 TRANSFECTAM(상표명)의 상표명 하에 프로메가(Promega(위스콘신주 메디슨))로부터 상업적으로 구입 가능하다.

콜레스테롤의 양이온성 유도체(3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤, DC-Chol)는 합성되고 DOPE와 리포솜으로 제제화되고(문헌[Gao, et al., (1991) BBRC 179(1):280-285] 참조), 세포로 DNA를 도입하도록 사용된다. 이렇게 제제화된 리포솜은 낮은 수준의 세포 독성을 가지는 세포로 DNA를 효율적으로 도입한다고 보고되어 있다. 폴리라이신을 DOPE에 접합함으로써 형성된 리포폴리라이신(문헌[Zhou, et al., (1991) BBA 1065:8-14] 참조)은 혈청의 존재 하에 세포로 핵산을 도입하는 데 있어서 효과적인 것으로 보고되었다.

세포로 핵산을 도입하기 위해 사용된 양이온성 지질의 다른 유형은 고도로 충전된 폴리양이온성 암모늄, 설포늄 및 포스포늄 지질, 예컨대 미국 특허 제5,674,908호 및 제5,834,439호, 및 WO 00/27795로서 공개된 국제 출원 제PCT/US99/26825호에 기재된 것을 포함한다. 본 발명에 따른 거대분자의 전달을 위한 하나의 특히 바람직하지만 비제한적인 형질감염 시약은 라이프 테크놀로지스로부터 구입 가능한 리포펙타민 2000(상표명)이다. WO 00/27795로서 공개된 미국 국제 출원 제PCT/US99/26825호 참조한다. 세포에 대한 거대분자의 전달에 적합한 또 다른 바람직하지만 비제한적인 형질감염 시약은 Expi펙타민(상표명)이다. 다른 적합한 형질감염 시약은 리오펙타민(상표명) RNAiMAX, 리포펙타민(상표명) LTX, 올리고펙타민(상표명), 셀펙틴(상표명), 인비보펙타민(상표명), 인비보펙타민(상표명) 2.0, 및 미국 특허 출원 공보 제2012/0136073호(Yang 등)(본 명세서에서 여기에 참고로 포함됨)에 개시된 임의의 지질 시약 또는 제제를 포함한다. 다양한 다른 형질감염 시약은 숙련자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 일시적 형질감염 시스템 및 방법에 대한 이의 적합성에 대해 평가될 수 있다.

본 발명은 부분적으로 (a) 배양물 중에 진핵생물 세포로의 적어도 하나의 거대분자, 바람직하게는 발현 가능한 핵산 분자의 도입, (b) 적어도 하나의 거대분자가 도입된 세포의 재배, 및 임의로 (c) 적어도 하나의 거대분자가 도입된 세포에서 재조합 단백질 생성물의 생성 또는 핵산의 발현을 지지하는 고수율 일시적 형질감염 시스템에 관한 것이고, 여기서 거대분자를 함유하는 배지는 세포로의 적어도 하나의 거대분자의 도입 후에 및 단백질 생성물의 재배 및 생성 또는 핵산의 발현 전에 배양물로부터 제거되고 새로운 배지에 의해 대체될 필요가 없다.

본 발명의 일시적 형질감염 시스템, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 이의 용도는 세포 배양 시스템에서 관심 있는 단백질의 높은 수준의 신속하고 재현 가능한 발현을 생성시킨다. 통상적으로, 본 일시적 형질감염 시스템 및 방법은, 원하는 재조합 단백질의 개별 발현 특징 및 사용된 세포 유형에 따라, 배양물 1ℓ당 약 200㎍의 단백질 내지 배양물 1ℓ당 약 2g의 단백질의 범위의 수준으로 재조합 발현된 단백질을 생성할 수 있다. 본 명세서에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용하여, 사용자는 상업적으로 구입 가능한 표준 일시적 형질감염 시스템을 이용하여 현재 얻을 수 있는 것 초과로 약 2배 내지 내지 약 20배인 발현된 단백질의 수준을 얻을 수 있다. 본 명세서에 제공된 일시적 형질감염 시스템 및 방법을 사용하여, 사용자는 현대의 일시적 발현 시스템에 의해 보이는 것의 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, 약 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 또는 약 10배 이하 또는 초과까지인 발현된 단백질의 수준을 얻을 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질을 생성하는 본 일시적 형질감염 시스템을 사용하여, 사용자는 현탁 세포에서 재조합 단백질의 생성에 최적화된 상업적으로 구입 가능한 일시적 형질감염 시스템, 예컨대 프리스타일(상표명) 발현 시스템 등을 사용하여 얻은 단백질 수율보다 약 2배 내지 약 50배 더 높은 단백질 수율을 얻을 수 있다.

방법

본 발명은 추가로 높은 수준의 관심 있는 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, (a) 현탁액 중에 배양되는 포유류 세포를 얻는 단계; 및 (b) 현탁액 중의 세포의 배양을 지지하기에 충분한 조건 하에 세포를 본 발명의 배양 배지와 접촉시키는 단계, 배양된 세포를 관심 있는 단백질을 코딩하는 발현 가능한 핵산에 의해 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 하나 이상의 발현 증강인자와 접촉시키는 단계, 한정된 시간 기간 동안 관심 있는 단백질의 발현에 허용 가능한 조건 하에 형질감염된 세포를 배양하는 단계, 및 세포를 수확하는 단계를 포함하는, 현탁액 중에 포유류 세포(특히 상기 기재된 것 및 가장 특히 293 세포, 293 F 세포, PER-C6 세포, CHO 세포 또는 이의 유도체, 예컨대 CHO-S 세포, 현탁 CHO 세포, CHO-S-2H2 세포, ExpiCHO-S(상표명) 세포, CapT 세포, COS-7L 세포 및 Sp2/0 세포, 또는 임의의 이의 유도체)를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로 폴리펩타이드를 생성하는 방법 및 이 방법에 의해 생성된 폴리펩타이드에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 세포, 바람직하게는 상기 기재된 포유류 세포, 가장 바람직하게는 293 세포, 293 F 세포, PER-C6 세포, CHO 세포 또는 이의 유도체, 예컨대 CHO-S 세포, 현탁 CHO 세포, CHO-S-2H2 세포, ExpiCHO-S(상표명) 세포, CapT 세포, COS-7L 세포 및 Sp2/0 세포, 또는 임의의 이의 유도체를 얻는 단계; (b) 세포로의 핵산의 도입을 발생시키는 조건 하에 세포를 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 (c) 세포에 의한 원하는 폴리펩타이드의 발현을 선호하는 조건 하에 세포를 본 발명의 배양 배지 중에 배양시키는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명에 따라 재조합 단백질을 발현하는 방법은 고밀도 배양 배지에서 세포의 배양물을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 세포는 바람직하게는 293 세포, 293 F 세포, PER-C6 세포, CHO 세포 또는 이의 유도체, 예컨대 CHO-S 세포, 현탁 CHO 세포, CHO-S-2H2 세포, ExpiCHO-S(상표명) 세포, CapT 세포, COS-7L 세포 또는 Sp2/0 세포, 또는 임의의 이의 유도체의 현탁 배양물이고, 세포는 고밀도 배지에서 성장에 적응된다. 세포 배양물의 임의의 용적이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다는 것이 숙련자에 의해 용이하게 이해될 것이지만, 배양물은 통상적으로 약 200㎕ 내지 100리터일 것이고, 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 2㎖ 내지 약 50리터, 가장 바람직하게는 약 5㎖ 내지 약 5리터이다. 몇몇 양태에서, 세포 배양 용적은 약 100㎖ 내지 약 50리터일 수 있다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 50리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 25리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 10리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 5리터이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 용적은 약 500㎖ 내지 약 1리터이다. 몇몇 실시형태에서, 세포 배양 용적은 약 100리터 이하, 약 95리터 이하, 약 90리터 이하, 약 85리터 이하, 약 80리터 이하, 약 75리터 이하, 약 70리터 이하, 약 65리터 이하, 약 60리터 이하, 약 55리터 이하, 약 50리터 이하, 약 45리터 이하, 약 40리터 이하, 약 35리터 이하, 약 30리터 이하, 약 35리터 이하, 약 20리터 이하, 약 15리터 이하, 약 10리터 이하, 약 9리터 이하, 약 8리터 이하, 약 7리터 이하, 약 6리터 이하, 약 5리터 이하, 약 4리터 이하, 약 2리터 이하 또는 약 1리터 이하일 수 있다.

일 양태에서, 세포 배양은 약 1.5x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖, 또는 임의의 농도, 농도 범위 또는 이것 내에 포함된 하위범위의 세포 밀도에서 유지될 수 있다.

이전에 기재된 발명에 따라 세포에서 단백질을 발현시키기 위해, 세포는 통상적으로 배지의 새로운 용적으로 희석될 것이다. 최적 희석을 변할 수 있지만, 예시적인 목적을 위해, 배지의 새로운 용적으로 희석된 세포의 밀도는 0.5x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 10x10⁶개의 세포/㎖, 더 바람직하게는 1x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 5x10⁶개의 세포/㎖, 더 바람직하게는, 1.5x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 3x10⁶개의 세포/㎖일 수 있다.

일 양태에서, 새로운 배양물의 용적 배지로의 세포의 희석 후, 세포는 발현 가능한 핵산에 의해 형질감염되기 전에 시간 기간 동안 상기 용적 중에 배양될 수 있다. 임의로, 세포는 2일 이하, 더 바람직하게는 약 하루 반 이하, 가장 바람직하게는, 약 하루 이하 동안 배양될 수 있다. 임의로, 여기서 배양된 세포의 밀도가 약 100% 이하, 더 바람직하게는 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하 내지 약 55%, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하 또는 약 15% 이하만큼 증가할 때까지, 세포는 배지의 새로운 용적 중에 배양될 수 있다.

일 양태에서, 세포가 상기 기재된 바와 같은 시간 기간 동안 고밀도 성장 배지 중에 배양된 후에 세포는 발현 가능한 핵산 또는 발현 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 사용자가 세포로의 발현 벡터의 도입을 달성하도록 수행하는 단계의 정확한 서열은, 당해 분야의 통상의 기술 수준을 가지는 숙련자가 용이하게 인식하는 것처럼, 선택된 특정한 형질감염 시약, 세포주, 배지 및 다양한 다른 실험 매개변수에 따라 변할 수 있다. 오직 예로서, 지질 기반 형질감염 시스템이 선택된 경우에(특히, 적어도 하나의 양이온성 지질을 가지는 형질감염 시스템), 형질감염 시약은 상기 정의되고 본 명세서에 포함된 바와 같은 약식으로 "복합체화" 또는 "복합체화 반응"이라 공지된 공정에서 지질-DNA 복합체를 형성하도록 수성 용액 중에 핵산과 처음에 접촉할 것이다. 이러한 반응은 세포가 배양되는 별개의 반응 용기에서 통상적으로 달성될 것이다.

양태에서, 상기 기재된 복합체화 단계에서 지질-DNA 복합체의 형성 후, 형질감염 복합체는 배양된 세포와 접촉할 수 있다. 세포가 형질감염 복합체와 접촉한 후, 세포는 제1 시간 기간 동안 형질감염 복합체의 존재 하에 배양될 수 있다. 제1 시간 기간의 지속기간은 세포의 성질, 사용된 형질감염 시약 및 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 다른 인자에 따라 변할 것이다. 구절 "제1 시간 기간"은, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에 따라 세포를 일시적으로 형질감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때, 일반적으로 발현 가능한 핵산에 의해 세포의 집단을 형질감염시키는 것과 형질감염된 세포에 대한 하나 이상의 발현 증강인자의 첨가 사이의 시간 간격을 의미한다. 통상적으로, 제1 시간 기간은 약 2시간 내지 약 4일의 범위, 또는 임의의 범위 또는 이것 내에 포함된 하위범위일 것이다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 제1 시간 기간은 약 3 내지 약 90시간, 약 4 내지 약 85시간, 약 5 내지 약 80시간, 약 6 내지 약 75시간, 약 7 내지 약 70시간, 약 8 내지 약 65시간, 약 9 내지 약 60시간, 약 10 내지 약 55시간, 약 11 내지 약 50시간, 약 12 내지 약 45시간, 약 13 내지 약 40시간, 약 14 내지 약 35시간, 약 15 내지 30시간, 약 16 내지 약 24시간, 약 17 내지 약 24시간, 약 18 내지 약 24시간, 약 19 내지 약 24시간, 약 20 내지 약 24시간, 약 21 내지 약 24시간, 약 22 내지 약 24시간 또는 약 23 내지 약 24시간의 범위일 수 있다. 다른 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 제1 시간 기간은 약 15시간 이하, 약 16시간 이하, 약 17시간 이하, 약 18시간 이하, 약 19시간 이하, 약 20시간 이하, 약 21시간 이하, 약 22시간 이하, 약 23시간 이하, 약 24시간 이하, 약 25시간 이하, 약 26시간 이하, 약 27시간 이하, 약 28시간 이하, 약 29시간 이하 또는 약 30시간 이하일 수 있다.

하나의 매우 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 배양 배지는 세포로의 형질감염 복합체의 도입 후에 및 제1 시간 기간의 지속기간 동안에 대체되거나 보충되거나 재충전되지 않는다.

본 발명의 일 양태에서, 배양물 중의 형질감염된 세포는 제1 시간 기간 후 하나 이상의 발현 증강인자와 접촉할 수 있다. 발현 증강인자는 일시적 발현 시스템에서 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 하나 이상의 화합물을 함유하는 수성 용액일 수 있다. 다양한 발현 증강인자는 당해 분야에 공지되어 있고, 임의의 하나 이상은 제한 없이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.

일반적으로, 하나 이상의 형질감염 증강인자는 상기 세포는 발현 가능한 핵산 또는 발현 벡터에 의해 형질감염되는 동안에 또는 형질감염된 후에 단백질 발현 세포의 집단과 접촉한다. 2개 이상의 발현 증강인자가 사용될 때, 각각의 발현 증강인자는 실질적으로 동시에 세포와 접촉할 수 있거나, 대안적으로 발현 증강인자는, 임의로 세포가 제1 발현 증강인자와 접촉하는 것과 세포가 제2 발현 증강인자와 접촉하는 것 사이의 시간 기간이 경과한 후에, 순차적으로 단백질 발현 세포와 접촉할 수 있다.

임의의 다수의 발현 증강인자가 제한 없이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있고, 본 실시형태에서 사용하기 위한 적합한 발현 증강인자를 구성하는 것의 식별은 이러한 숙련자의 이해범위 내에 제대로 있다는 것이 숙련자에 의해 용이하게 이해될 것이지만, 다양한 예시적이지만 비제한적인 발현 증강인자는 하기 기재될 것이지만, 이의 인용은 본 발명의 실행에서 사용하기에 고려될 수 있는 적합한 발현의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

몇몇 양태에서, 하나 이상의 발현 증강인자는 현재 기재된 실시형태에 따른 배양 배지 제제를 보충하도록 사용되는 액체(바람직하게는 수성) 첨가제를 포함할 수 있고, 상기 첨가제는 현재 기재된 실시형태에 따른 일시적 단백질 발현 시스템에서 생성된 발현된 단백질의 수율을 개선하도록 선택된다. 하나 이상의 발현 증강인자는 세포 주기 진행에 영향을 미치고/미치거나, 아폽토시스를 저해하고/하거나, 세포 성장을 느리게 하고/하거나, 단백질 생성을 촉진하는 몇몇 화합물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 증강인자"는 일반적으로 일시적 형질감염 시스템에 첨가되는 임의의 하나 이상의 화합물을 의미하고, 이의 존재는 이러한 발현 증강인자(들)의 부재에서 보이는 발현 수준보다 높은 적어도 2배 내지 약 10배의 인자에 의해, 표적 단백질의 발현을 증대시키거나 촉진한다. 현재 기재된 실시형태와 사용하기에 적합한 예시적인 발현 증강인자는 첨가제, 예컨대 발프로산(VPA, 산 및 나트륨 염), 나트륨 프로피오네이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 당, 예컨대 갈락토스, 아미노산 혼합물, 또는 뷰티르산, 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 각각의 특정한 발현 증강인자의 최적 농도는 발현 시스템의 개별 특징 및 사용자의 요건에 따라 변할 수 있고, 소정의 실험 시나리오에서 임의의 하나 이상의 발현 증강인자의 최적 농도를 구성하는 것의 결정은 당해 분야의 일반 지식 수준을 가지는 실행자의 이해범위 내에 제대로 있다.

예시적인 일 실시형태에서, 발현 증강인자는 발프로산을 함유하는 제제일 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용된 발프로산(VPA)의 최적 최종 농도 범위는 변할 수 있지만, 바람직하게는 약 0.20mM 내지 약 25mM의 범위, 또는 이 범위에 의해 포함된 임의의 하위범위 또는 농도 값일 것이다. 더 바람직하게는, VPA의 최종 농도는 약 0.25mM 내지 약 24mM, 약 0.26mM 내지 약 23mM, 0.27mM 내지 약 23mM, 0.28mM 내지 약 23mM, 0.29mM 내지 약 22mM, 약 0.30mM 내지 약 21mM, 약 0.31mM 내지 약 20mM, 약 0.32mM 내지 약 19mM, 약 0.33mM 내지 약 17mM, 약 0.34mM 내지 약 18mM, 약 0.35mM 내지 약 17mM, 약 0.36mM 내지 약 16mM, 약 0.37mM 내지 약 15mM, 약 0.40mM 내지 약 14mM, 약 0.41mM 내지 약 13mM, 약 0.42mM 내지 약 12mM, 약 0.43mM 내지 약 11mM, 약 0.44mM 내지 약 10mM, 약 0.45mM 내지 약 9mM, 약 0.46mM 내지 약 8mM, 약 0.47mM 내지 약 7mM, 약 0.48mM 내지 약 6mM, 약 0.49mM 내지 약 5mM, 약 0.50mM 내지 약 4mM, 약 0.50mM 내지 약 4mM, 약 0.55mM 내지 약 3mM, 0.6mM 내지 약 2mM 또는 0.75 내지 약 1.5mM의 범위일 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.15mM 내지 약 1.5mM, 약 0.16mM 내지 약 1.5mM, 약 0.17mM 내지 약 1.5mM, 약 0.18mM 내지 약 1.5mM, 약 0.19mM 내지 약 1.5mM, 약 0.20mM 내지 약 1.5mM, 약 0.25mM 내지 약 1.5mM, 약 0.30mM 내지 약 1.5mM, 약 0.40mM 내지 약 1.5mM, 약 0.50mM 내지 약 1.5mM, 약 0.60mM 내지 약 1.5mM, 약 0.70mM 내지 약 1.5mM, 약 0.80mM 내지 약 1.5mM, 약 0.90mM 내지 약 1.5mM 또는 약 0.10mM 내지 약 1.5mM일 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 VPA의 최종 농도는 약 0.20 내지 약 1.5mM, 약 0.21 내지 약 1.4mM, 약 0.22 내지 약 1.4mM, 약 0.23 내지 약 1.4mM, 약 0.24 내지 약 1.4mM, 약 0.25 내지 약 1.3mM, 약 0.25 내지 약 1.2mM, 약 0.25 내지 약 1.1mM, 또는 약 0.25 내지 약 1.0mM일 수 있다.

또 다른 예시적인 실시형태에서, 발현 증강인자는 나트륨 프로피오네이트(NaPP)를 함유하는 제제일 수 있다. 임의로, NaPP는 상기한 바대로 단독으로 또는 발프로산과 조합되어 제공될 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용된 NaPP의 최적 최종 농도 범위는 변할 수 있지만, 바람직하게는 약 의 범위일 것이다 추가의 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 NaPP의 최적 최종 농도는 약 0.2mM 내지 약 100mM의 범위, 또는 이 범위 내에 포함된 임의의 하위범위 또는 개별 농도일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 0.5 내지 약 80mM, 약 0.4mM 내지 약 70mM, 약 0.5mM 내지 약 60mM, 약 0.6mM 내지 약 50mM, 약 0.7mM 내지 약 40mM, 약 0.8mM 내지 약 30mM, 약 0.9mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 15mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 또는 약 5mM 내지 약 7mM의 범위일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 또는 약 9mM 내지 약 10mM의 범위일 수 있다. 소정의 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, NAPP의 최적 최종 농도는 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 2.5mM, 약 3mM, 약 3.5mM, 약 4mM, 약 4.5mM, 약 5mM, 약 5.5mM, 약 6mM, 약 6.5mM, 약 7mM, 약 7.5mM, 약 8mM, 약 8.5mM, 약 9mM, 약 9.5mM, 또는 약 10mM일 수 있다.

더욱 또 다른 예시적인 실시형태에서, 발현 증강인자는 리튬 아세테이트(LiAc)를 함유하는 제제일 수 있다. 임의로, LiAc는 상기한 바대로 단독으로 또는 NaPP와 조합되어 제공될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 실행에서 사용된 리튬 아세테이트(LiAc)의 최적 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25mM, 약 0.26mM 내지 약 20mM, 약 0.27mM 내지 약 15mM, 약 0.28mM 내지 약 10mM, 약 0.29mM 내지 약 5mM, 약 0.3mM 내지 약 4.5mM, 약 0.31mM 내지 약 4mM, 약 0.35mM 내지 약 3mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2mM 내지 약 3mM의 범위일 수 있다.

여전히 더욱 또 다른 예시적인 실시형태에서, 발현 증강인자는 뷰티르산을 함유하는 제제일 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용된 뷰티르산의 최적 최종 농도는 약 0.25 내지 약 25mM, 약 0.26mM 내지 약 20mM, 약 0.27mM 내지 약 15mM, 약 0.28mM 내지 약 10mM, 약 0.29mM 내지 약 5mM, 약 0.3mM 내지 약 4.5mM, 약 0.31mM 내지 약 4mM, 약 0.35mM 내지 약 3mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2mM 내지 약 3mM의 범위일 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 발현 증강인자는 형질감염 직전에 또는 동안에, 또는 형질감염 후에 그러나 세포 및 발현된 단백질의 수확 전에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 하기 기재된 몇몇 구체적이지만 비제한적인 실시형태에서, "증강인자 1"은 일반적으로 0.25mM 내지 1mM 발프로산을 의미하고, "증강인자 2"는 일반적으로 5mM 내지 7mM 나트륨 프로피오네이트를 의미한다. 그러나, 달리 표시되지 않는 한, 용어 증강인자 1 및 증강인자 2는 상이한 증강인자 화합물을 포함할 수 있다. 발현 증강인자는 순차적으로, 또는 칵테일로서 배양 배지에 첨가될 수 있다.

일 양태에서, 2개 이상의 발현 증강인자가 사용될 때, 2개 이상의 발현 증강인자는 실질적으로 동시에 형질감염된 배양된 세포와 접촉할 수 있거나, 대안적으로 형질감염된 배양된 세포는 처음에 제1 발현 증강인자와 접촉할 수 있고, 제2 시간 기간 후, 형질감염된 배양된 세포는 제2 발현 증강인자와 접촉할 수 있다. 일 양태에서, "제2 시간 기간"은, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에 따라 세포를 일시적으로 형질감염시키는 방법의 맥락에서 사용될 때, 일반적으로 하나 이상의 발현 증강인자의 첨가와 하나 이상의 추가 증강인자의 첨가, 또는 형질감염된 세포의 수확과 이 내부에서 발현된 단백질의 정제 또는 단리 사이의 시간 간격을 의미한다. 통상적으로, 제2 시간 기간은 약 10시간 내지 약 10일의 범위일 것이지만, 발현되는 단백질에 최적인 것으로 결정되는 경우 다른 시간 기간이 이용될 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 제2 시간 기간은 2시간 내지 5일, 2.5시간 내지 4일, 약 3 내지 약 90시간, 약 4 내지 약 85시간, 약 5 내지 약 80시간, 약 6 내지 약 75시간, 약 7 내지 약 70시간, 약 8 내지 약 65시간, 약 9 내지 약 60시간, 약 10 내지 약 55시간, 약 11 내지 약 50시간, 약 12 내지 약 45시간, 약 13 내지 약 40시간, 약 14 내지 약 35시간, 약 15 내지 30시간, 약 16 내지 약 24시간, 약 17 내지 약 24시간, 약 18 내지 약 24시간, 약 19 내지 약 24시간, 약 20 내지 약 24시간, 약 21 내지 약 24시간, 약 22 내지 약 24시간 또는 약 23 내지 약 24시간의 범위일 수 있다. 다른 바람직 내지는 비제한적인 실시형태에서, 제1 시간 기간은 약 15시간 이하, 약 16시간 이하, 약 17시간 이하, 약 18시간 이하, 약 19시간 이하, 약 20시간 이하, 약 21시간 이하, 약 22시간 이하, 약 23시간 이하, 약 24시간 이하, 약 25시간 이하, 약 26시간 이하, 약 27시간 이하, 약 28시간 이하, 약 29시간 이하 또는 약 30시간 이하일 수 있다.

적절한 시간 양이 경과한 후, 사용자는 세포를 수확하고 임의로 발현된 재조합 단백질을 정제할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 과정 동안 배양 배지를 대체하거나 보충하거나 달리 재충전해야 함이 없이, 사용자가 상기 기재된 실시형태에 따라 재조합 단백질을 일시적으로 발현하게 한다. 본 명세서에 기재된 방법은 사용자가 배양된 세포의 1ℓ당 약 2g 이하를 발현하게 한다. 몇몇 실시형태에서, 사용자는 배양된 세포의 1리터당 재조합 단백질의 약 1.9g 이하, 약 1.8g 이하, 약 1.7g 이하, 약 1.6g 이하, 약 1.5g 이하, 약 1.4g 이하, 약 1.3g 이하, 약 1.2g 이하, 약 1.1g 이하, 또는 약 1g 이하를 발현할 수 있다.

본 발명은 또한 임의로 하나 이상의 대체 화합물을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 조성물, 특히 높은 밀도 세포 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 예를 들어 시험관내 진핵생물 세포, 특히 동물 세포를 배양하는 방법을 포함하는, 이러한 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 배양 배지 및 하나 이상의 세포, 특히 본 명세서에 구체적으로 언급된 세포를 포함하는 조성물, 및 하나 이상의 상기 기재된 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 정의되고 본 명세서에 포함된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터, 증강인자, 및 배양된 세포에서 상기 발현 가능한 핵산을 발현하기 위해 필요한 다른 유전요소와 조합된 하나 이상의 발현 가능한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 발현 증강인자 조성물을 포함하는 조성물, 특히 적어도 인자 또는 2배 내지 2.5배만큼 배양된 세포에서 상기 발현 가능한 핵산의 발현을 증대시키도록 선택된 것에 관한 것이다. 임의로, 발현 증강인자는 별개로 동시제제화되거나 제공되는 2개 이상의 발현 증강인자의 조합일 수 있다. 본 발명은 또한 형질감염 시약, 특히 배양된 세포의 내부로 하나 이상의 핵산 분자의 전달을 촉진하도록 최적화된 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 상기 기재된 조성물, 벡터, 발현 증강인자, 형질감염 시약 등을 포함하는 키트, 및 하나 이상의 상기 기재된 조성물, 특히 본 명세서에 구체적으로 언급된 세포를 포함하는 키트에 관한 것이다.

특정한 방법:

CHO 발현 시스템:

몇몇 실시형태에 따른 본 명세서에 기재된 바와 같은 CHO 발현 시스템은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 적응된 현탁액에 기초한 고수율 일시적 발현 시스템(CHO-S-2H2 세포)이다. CHO 발현 시스템은 (1) CHO-S-2H2 세포, (2) 고밀도 성장 배지, 예컨대 ExpiCHO 발현 배지 등, (3) 본 시스템에서 사용에 최적화된 양이온성 형질감염 시약, 예를 들어 Expi펙타민CHO 시약, (4) 발현 증강인자 조성물, (5) 성장 조절제 조성물, (6) 임의로 복합체화 배지, 예를 들어 OptiPro(상표명) SFM 복합체화 배지, 및 (7) 임의로 인간 IgG 항체 양성 대조군 벡터를 포함할 수 있다.

시스템 성분의 상세내용

ExpiCHO-S 세포

CHO-S-2H2 세포주는 CHO-S 세포주의 클론 유도체이다. CHO-S-2H2 세포는 ExpiCHO 발현 배지 중의 고밀도 현탁 배양에 적응된다. 동결된 세포는 ExpiCHO 발현 배지에서 제공되고, 이 배지로 직접적으로 해동될 수 있다.

ExpiCHO-S 세포주는 하기 특징을 나타낸다: CHO-S로서 동일한 모 계통으로부터 유래한, 세포는 높은 단백질 발현에 대해 선택되고, 세포는 해동 후 신속한 회복을 나타내고, 세포는 다수의 계대배양에 걸쳐 안정한 일시적 발현 수준을 나타내고, 세포는 고밀도 성장 배지, 예를 들어 ExpiCHO 발현 배지 중의 높은 밀도, 혈청 비함유, 현탁액 성장에 적응되고, 세포는 최소 응집/클럼핑을 나타내고, 실질적으로 균일한 단일 세포 형태를 나타내고, 세포는 약 15 내지 20시간의 배가 시간을 가진다.

대부분의 실시형태에서 사용된 최대 세포 밀도는 진탕 플라스크 배양에서 20x10⁶개의 세포/㎖ 이상이다.

고밀도 성장 발현 배지

고밀도 성장 배지, 예를 들어 ExpiCHO 발현 배지는 현탁액 중의 CHO-S 세포의 고밀도 배양 및 형질감염에 특이적으로 적응된 화학적으로 한정된 배지이다.

고밀도 배지는 하기 특징을 나타낸다: GlutaMAX(상표명)-I에 의해 보충된, 현탁액 중의 ExpiCHO-S 세포의 고밀도 배양 및 형질감염을 지지하도록 설계된, 최적화된, 화학적으로 한정된, 혈청 비함유, 단백질 비함유, 동물 기원 비함유 제제는, 확장형 일시적 형질감염 및 단백질 발현에 설계된, 시스템에 의해 양이온성 지질 형질감염 시약 사용의 활성을 방해하지도 감소시키지도 않았다.

성장 조절제 조성물:

본 시스템에서 사용하기 위한 성장 조절제 조성물은 장기간, 고밀도 일시적 형질감염을 지지하도록 고밀도 성장 배지와 함께 일하도록 설계된 최적화된, 화학적으로 한정된, 혈청 비함유, 단백질 비함유, 동물 기원 비함유 제제이다. 몇몇 경우에, 용어 "성장 조절제", "성장 증강인자" 및 "공급물"(예컨대, 도 5에 도시된 도식적 서술 등)은 상호교환되어 사용될 수 있다.

형질감염 시약:

양이온성 형질감염 시약, 예를 들어 Exip펙타민(상표명) CHO 시약은 고밀도 CHO-S-H2H 배양물로 핵산의 형질감염에 최적화된다.

Expi펙타민(상표명) CHO 시약은 하기 특징을 나타낸다: ExpiCHO-S 배양물의 높은 형질감염 효율은 ExpiCHO 발현 배지에서 유지되고, Expi펙타민CHO/플라스미드 DNA 복합체는 ExpiCHO 발현 배지에서 세포에 직접적으로 첨가될 수 있고; 형질감염 후 복합체를 제거할 필요도 배지를 바꾸거나 첨가할 필요도 없다.

발현 증강인자:

발현 증강인자 조성물, 예를 들어 Expi펙타민(상표명) CHO 증강인자는, 단백질 생성을 증대시켜서 최대 단백질 수율을 생성시키기 위한, 양이온성 형질감염 시약 조성물, 예를 들어 Expi펙타민(상표명) CHO 시약, 및 성장 조절제 조성물, 예를 들어 ExpiCHO(상표명) 공급물과 함께 사용되도록 개발된 제제이다.

i. Opti-Pro(상표명) SFM 복합체화 배지

OptiPro(상표명) SFM은 플라스미드 DNA를 Expi펙타민CHO 시약과 복합체화하도록 사용된 혈청 비함유, 동물 기원 비함유 배지이어서, 형질감염을 통해 높은 단백질 발현을 제공한다.

ii. 양성 대조군 벡터

pcDNA3.4 벡터에서의 인간 IgG 항체 양성 대조군(1㎎/㎖ 용액의 100㎕)은 ExpiCHO-S 세포에서 형질감염 및 발현을 위한 양성 대조군으로서 제공된다. ExpiCHO-S 세포에서의 이 단백질의 발현은 하기 특징을 가지는 배양 배지로 분비된 IgG를 생성시킨다:

표준 프로토콜: 형질감염 후 8일 내지 10일에 수확된 약 0.5 내지 1g/ℓ

고역가 프로토콜: 형질감염 후 10일 내지 12일에 수확된 1.0 내지 1.5g/ℓ

최대 역가 프로토콜: 형질감염 후 12일 내지 14일에 수확된 1.5g/ℓ 초과

양성 대조군 벡터를 사용하여, 배양물의 생존능력은 형질감염 후 일자에 대략 95%이어야 하고, 형질감염 실행에 걸쳐 거의 70%로 있다.

2. ExpiCHO 발현 시스템에 대한 중요한 배경 정보

통상적인 일시적 CHO 프로토콜과 다를 수 있는 ExpiCHO 발현 시스템의 몇몇 중요한 특징이 하기에 있고, 형질감염에 의한 최고의 결과를 달성하도록 도울 것이다.

ExpiCHO-S는 대략 17시간의 배가 시간에 의해 고밀도 성장 조건에 적응된 튼튼한 세포주이다. ExpiCHO-S 세포는 진탕 플라스크 배양에서 약 20x10⁶개의 세포/㎖의 최대 밀도로 대략 4 내지 15x10⁶개의 세포/㎖에 걸친 광범위 지수증식기 성장 창을 가진다.

계대배양의 시기에, 4 내지 6x10⁶개의 생존가능 세포/㎖(즉, 초기 지수증식기 성장)에 도달한 ExpiCHO-S 세포를 사용하는 것이 이상적이다. 이 초기 지수증식기 성장 창 밖의 밀도에서 계대배양된 세포는 시간에 따라 더 긴 배가 시간 및 더 낮은 역가를 나타낼 수 있다. 필요한 경우 계대배양의 시기에 목표 4 내지 6x10⁶개의 생존가능 세포/㎖ 밀도를 달성하도록 초기 시딩 밀도를 증가시킨다.

형질감염 전에 해동 후 새로 해동된 세포가 2개 이상의 계대배양에 대해 배양물 중에 회복하도록 한다.

플라스미드 DNA 및 Expi펙타민CHO 시약의 복합체화는 차가운 시약(4℃)을 사용하여 실온에서 발생한다. 조합되면, Expi펙타민CHO/DNA 복합체는 즉시 플라스크에 첨가될 수 있지만, 어떠한 성능 소실 없이 5분 이하 동안 유지될 수 있다. 더 긴 보유 시간(10분 이하)은 성능을 약간 소실시킬 수 있다. 10분에 걸친 보유 시간은 추천되지 않는다. 완전한 혼합을 보장하도록 사용 전에 Expi펙타민 시약을 4회 내지 5회 뒤집도록 한다.

최대 융통성을 위해, CHO 발현 시스템은 선호도에 따라 3개의 상이한 프로토콜을 제공한다(추가 정보를 위해 표 1 참조):

ο 표준 프로토콜: 형질감염 후 1일에 단일 공급, 플라스크는 발현 실행에 걸쳐 37℃에서 유지되었다.

ο 고역가 프로토콜: 형질감염 후 1일에 단일 공급, 플라스크는 형질감염 후 1일에 32℃로 이동되었다.

ο 최대 역가 프로토콜: 형질감염 후 1일 및 5일에 공급, 플라스크는 형질감염 후 1일에 32℃로 이동되었다.

주의: 대부분의 단백질에 대해, 최대 역가 프로토콜을 이용하여 얻은 역가는 표준 프로토콜에 의해 2 내지 3X 초과이지만; 몇몇 단백질은 단백질의 성질에 따라 온도 이동 없이 표준 프로토콜을 이용하여 유사하게, 또는 양호하게 발현할 것이다.

이 프로토콜은 하기 코닝(Corning) 폴리카보네이트, 배플이 없는, 환기된 플라스크를 사용하여 개발되었다: 125㎖: #431143, 250㎖: #431144, 500㎖: #431145, 1L: #431147, 3L: #431252.

3. ExpiCHO-S 세포를 배양하기 위한 일반적인 가이드라인

i. 일반적인 세포 취급

CHO-S-2H2 세포를 성장시키고 유지시키기 위해 일반적인 가이드라인을 따른다

세포와 접촉하는 모든 용액 및 장비는 무균이어야 한다. 항상 적절한 무균 기법을 사용하고 층류 후드에서 작업한다.

실험을 시작하기 전에, 새로 해동된 세포가 2개 이상의 계대배양에 대해 배양물 중에 회수되게 한다.

세포 생존능력을 결정하기 위해 자동화 세포 계수기 또는 트립판 블루 배제 방법과 함께 혈구계를 사용한다. 지수증식기 배양은 95% 초과로 생존 가능해야 한다.

ii. 배지 준비

ExpiCHO 발현 배지는 GlutaMAX(상표명)-I 시약에 의해 제제화된다. 추가 보충이 필요하지 않다.

b. CHO-S-2H2 세포의 해동 및 유지

i. 도입

세포 배양을 개시시키도록 ExpiCHO-S 세포를 해동하도록 하기 프로토콜을 따른다. CHO-S-2H2 세포주는 90% ExpiCHO 발현 배지 및 10% DMSO 중에 1x10⁷개의 생존가능 세포/㎖로 1㎖의 세포를 함유하는 바이알에서 제공된다. 키트가 제공된 예열된 ExpiCHO 발현 배지로 CHO-S-2H2 세포를 직접적으로 해동한다.

ii. 필요한 재료

CHO-S-2H2 세포

ExpiCHO 발현 배지

125㎖ 폴리카보네이트, 폐기용, 무균, 배기된 엘렌마이어 진탕 플라스크

생존능력 세포 밀도 및 생존능력(%)을 결정하기 위한 시약 및 장비(예를 들어, 혈구계 또는 자동 세포 계수기, 트립판 블루)

8% CO₂의 습윤 분위기에 의해 37℃ 항온처리기에서 125±5rpm에서 설정된 오비탈 진탕기

주의: 이 프로토콜에서의 진탕 속도는 19㎜(¾ 인치) 오비탈 직경의 사용을 취한다. 다른 오비탈 직경을 가지는 진탕기에 대해, 하기 식을 이용하여 상응하는 진탕 속도를 결정한다:

여기서,

d1 = 오래된 진탕기에 대한 도달 거리

d2 = 새로운 진탕기에 대한 도달 거리

r1 = 오래된 진탕기에 대한 rpm

r2 = 새로운 진탕기에 대한 rpm

흔히 사용되는 전환:

19㎜ 도달에 의한 125rpm = 25㎜ 도달에 의한 110rpm

19㎜ 도달에 의한 70rpm = 25㎜ 도달에 의한 60rpm

iii. CHO-S-2H2 세포를 해동한다

1. 액체 질소 저장으로부터 세포의 바이알을 제거하고, 오직 적은 양의 얼음이 남을 때까지 1 내지 2분 동안 37℃ 물욕에서 스월링(swirling)시켜 세포를 신속히 해동한다. 바이알을 물 중에 액침시키지 않는다.

2. 70% 에탄올에 의해 닦음으로써 바이알을 오염제거한다.

3. 2㎖ 또는 5㎖ 피펫을 사용하여, 30㎖의 예열된 ExpiCHO 발현 배지를 함유하는 125㎖ 폴리카보네이트, 1회용, 무균, 벤트-캡 엘렌마이어 진탕기 플라스크로 바이알의 전체 내용물을 옮긴다.

4. 125±5rpm에서 회전하는 오비탈 진탕기 플랫폼에서 8% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 37℃ 항온처리기에서 세포를 항온처리한다.

5. 해동한 날에, 생존가능 세포 밀도 및 생존능력 백분율을 결정한다. 세포 생존능력은 해동 후 일자에 95% 초과이어야 한다.

6. 배양물이 하기 절차에 따라 4 - 6x10⁶개의 생존능력 세포/㎖(통상적으로 해동 후 3-4일)에 도달하면 계속해서 세포 밀도 및 생존능력을 모니터링하고 세포를 계대배양한다.

iv. ExpiCHO-S 세포의 일상적 계대배양

주의: 하기 가이드라인은 125㎖ 엘렌마이어 플라스크에서 30㎖ 배양물에 기초한다. 배양 용적은 다른 플라스크 크기에 대해 비례하여 확장될 수 있다.

1. 생존가능 세포 밀도 및 생존능력 백분율을 결정한다.

2. 생존가능 세포 밀도를 이용하여, 하기 표에서 추천된 시딩 밀도에 따라 새로운 125㎖ 진탕 플라스크를 시딩하는 데 필요한 세포 현탁액의 용적을 계산한다:

3. 계산된 용적의 세포를 12㎖ 진탕 플라스크에서 새로운, 예열된 ExpiCHO 발현 배지로 옮긴다.

4. 배양물이 4 - 6x10⁶개의 생존가능 세포/㎖의 밀도에 도달할 때까지, 125±5rpm에서 회전하는 오비탈 진탕기 플랫폼에서 8% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 37℃ 항온처리기에서 플라스크를 항온처리한다.

주의: 이 초기 지수증식기 성장 창 밖의 밀도에서 계대배양된 세포는 시간에 따라 더 긴 배가 시간 및 더 낮은 역가를 나타낼 수 있다. 계대배양의 시기에 목표 4 내지 6x10⁶개의 생존가능 세포/㎖ 밀도를 달성하도록 초기 시딩 밀도를 변경한다.

5. 단계 1-4를 반복하여서 형질감염에 대해 세포를 유지시키시고 증식시킨다.

c. ExpiCHO-S 세포의 형질감염

i. 도입

고밀도 현탁액 ExpiCHO-S 배양물의 최적 형질감염을 위해, 형질감염 키트에 포함된 Expi펙타민CHO 시약을 사용할 것이다. 몇몇 다른 혈청 비함유 배지 제제와 달리, ExpiCHO 발현 배지는 형질감염을 저해하지 않는다. ExpiCHO 발현 배지는 배지를 변경하거나 추가할 필요 없이 형질감염이 가능하도록 특별히 제제화된다.

ii. 필요한 재료

ExpiCHO 발현 배지에서 배양된 CHO-S-2H2 세포

플라스미드 DNA 제제, 무균, 페놀 및 염화나트륨 비함유, 및 대부분 슈퍼코일링된 DNA를 함유

인간 IgG 항체 양성 대조군 벡터(키트에 제공된 1㎎/㎖ 용액의 100㎕)

Expi펙타민CHO(상표명) 시약(4℃에서)

OptiPro(상표명) SFM 복합체화 배지(4℃에서)

ExpiCHO 발현 배지, 37℃에서

폴리카보네이트, 1회용, 무균 엘렌마이어 플라스크

8% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 37℃에서의 오비탈 진탕기

5% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 32℃에서의 오비탈 진탕기(임의: 하기 프로토콜 단계 8 참조)

생존가능 세포 밀도 및 생존능력 백분율을 결정하기 위한 시약 및 장비.

iii. 단백질 발현의 최적화

발현 수준은 발현된 특정한 재조합 단백질 및 사용된 벡터에 따라 달라질 것이지만; ExpiCHO 발현 시스템은 하나의 형질감염으로부터 다음으로의 임의의 특정한 단백질에 대한 일관된 발현 수준을 나타낼 것이다. 처음에 단백질을 발현할 때, 발현 실행의 길이를 최적화하기 위해 시간 과정을 수행하기를 원할 수 있다(예를 들어, 형질감염 후 여러 회에 세포 또는 배지를 수확). ExpiCHO 발현 배지는 ExpiCHO 증강인자 및 ExpiCHO 공급물과 함께 14일 이하 동안 형질감염된 배양을 일시적으로 지지하도록 설계된다.

iv. 형질감염의 확장

ExpiCHO 발현 시스템은 125㎖로부터 3ℓ 플라스크 크기로 확장된다. 더 큰 플라스크 크기(즉, 3ℓ 플라스크)를 위해, 배양의 진탕 속도는 125rpm으로부터 70rpm으로 감소할 수 있다(표 1 참조). 형질감염 조건은 사용된 배양 용기의 유형 및 크기에 따라 변할 수 있지만, 본 발명자들은 형질감염 조건을 최적화하기 위해 파일럿 연구를 수행할 것을 추천한다.

ExpiCHO-S 세포의 형질감염

125㎖ 플라스크에서 ExpiCHO-S 세포의 25㎖ 출발 용적의 형질감염에 대해 하기 기재된 절차; 용적은 비례하여 확장될 수 있다(참고를 위해 표 1 참조). 시스템 성능을 보장하기 위해 본 발명자들은 베타 시험 키트(Beta Test kit)의 부분으로서 포함된 인간 IgG 항체 양성 대조군 벡터의 발현의 시험을 추천한다.

1. 세포가 대략 4 - 6x10⁶개의 생존가능 세포/㎖의 밀도에 도달하도록 ExpiCHO-S 세포를 계대배양하고 유지시킨다.

2. 형질감염 전날에, 다음날에 대략 7 - 10x10⁶개의 생존가능 세포/㎖의 밀도를 획득하도록 3 - 3.5x10⁶개의 생존가능 세포/㎖의 최종 밀도로 단계 1로부터 ExpiCHO-S 세포를 계대배양한다. 생존능력은 형질감염에 의해 진행하도록 95% 초과이어야 한다.

3. 새로운, 예열된 ExpiCHO 발현 배지의 첨가에 의해 6x10⁶개의 생존가능 세포/㎖의 최종 밀도로 단계 2로부터 세포를 희석한다.

4. 하기와 같이 Expi펙타민CHO/플라스미드 DNA 복합체를 준비한다:

주의: 형질감염되는 배양 용적의 1㎖당 0.5 - 1.0㎍의 범위의 총 플라스미드 DNA는 대부분의 단백질에 적절하다.

a) 4 - 5회 Expi펙타민CHO 시약 병을 온화하게 뒤집어서 완전히 혼합한다.

b) 차가운 OptiPRO 배지에 의해 플라스미드 DNA를 희석한다. 관을 스왈링함으로써 또는 온화한 와류에 의해 혼합한다.

c) 차가운 OptiPRO 배지에 의해 Expi펙타민CHO 시약을 희석한다. 온화하게 위아래로 피펫팅하여 혼합한다.

d) 희석된 Expi펙타민CHO 시약을 희석된 DNA에 첨가한다. 온화하게 위아래로 피펫팅하여 혼합한다.

5. 1-5분 동안 실온에서 Expi펙타민CHO/플라스미드 DNA 복합체를 항온처리하고, 이후 전체 용액을 단계 3으로부터 진탕기 플라스크로 옮겨서, 첨가 동안 플라스크를 스왈링한다.

6. 125rpm에서 회전하는 오비탈 진탕기 플랫폼(3ℓ 진탕 플라스크에 대해 70rpm)에서 8% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 37℃ 항온처리기에서 세포를 항온처리한다.

7. 다음날(형질감염 후 18-22시간), 선택된 프로토콜에 따라 하기 첨가를 수행한다:

a) 표준 프로토콜: 150㎕의 ExpiCHO 증강인자 및 7.5㎖의 ExpiCHO 공급물을 플라스크에 첨가하여, 첨가 동안 플라스크를 스왈링한다. 진탕에 의해 공기 중에 8% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 37℃ 항온처리기로 플라스크(들)를 다시 놓는다.

b) 고역가 프로토콜: 150㎕의 ExpiCHO 증강인자 및 6㎖의 ExpiCHO 공급물을 플라스크에 첨가하여, 첨가 동안 플라스크를 스왈링한다. 진탕에 의해 공기 중에 5% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 32℃ 항온처리기로 플라스크(들)를 옮긴다.

c) 최대 역가 프로토콜: 150㎕의 ExpiCHO 증강인자 및 4㎖의 ExpiCHO 공급물을 플라스크에 첨가하여, 첨가 동안 플라스크를 스왈링한다. 진탕에 의해 공기 중에 5% CO₂의 습윤 분위기를 가지는 32℃ 항온처리기로 플라스크(들)를 옮긴다. 형질감염 후 5일에, 첨가 4㎖의 ExpiCHO 공급물을 첨가하고 진탕시키면서 32℃ 항온처리기로 플라스크(들)를 다시 놓는다.

8. 단백질을 수확하는 최적 시간은 발현되는 단백질의 특정한 특성 및 선택된 프로토콜에 따라 달라질 것이다. 참고를 위해, 인간 IgG 항체 양성 대조군은 통상적으로 형질감염 후의 일자에 수확된다:

a) 표준 프로토콜: 형질감염 후 8일 내지 10일

b) 고역가 프로토콜: 형질감염 후 10일 내지 12일

c) 최대 역가 프로토콜: 형질감염 후 12일 내지 14일

키트 :

본 발명의 또 다른 양태는 시험관내 세포의 배양을 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 제1 용기는 본 발명의 배양 배지를 함유한다. 키트는 하나 이상의 추가 용기를 추가로 포함할 수 있고, 각각의 용기는 하나 이상의 사이토카인, 헤파린, 하나 이상의 동물 또는 동물 유래 펩타이드, 하나 이상의 효모 펩타이드 및 하나 이상의 식물 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 보충제를 함유한다.

본 발명의 키트는 본 발명의 배지에서 배양된 세포로의 적어도 하나의 거대분자, 예를 들어 핵산의 도입을 촉진하는 핵산 및/또는 시약, 즉 형질감염 시약을 포함하는 하나 이상의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 형질감염 시약은 양이온성 지질 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 양태에 따른 키트는 본 발명의 배양 배지, 하나 이상의 대체 화합물(하나 이상의 금속 결합 화합물, 및/또는 하나 이상의 전이 원소 복합체일 수 있음) 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 하나 이상의 핵산 및 형질감염 시약을 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따른 키트는 하나 이상의 세포 배양 배지(이들 중 하나는 기본 배지일 수 있음) 및 임의로 하나 이상의 대체 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 can 또한 세포를 배양하고/하거나, 세포로 거대분자 또는 화합물(예를 들어, 핵산, 예컨대 DNA)를 도입하기 위한 키트를 사용하기 위한 설명서를 함유한다.

실시예

하기 실시예는 본 개시내용의 소정의 양태를 예시하고, 본 개시내용을 실행하는 데 있어서 당해 분야의 숙련자를 돕도록 제공된다. 이 실시예는 어떤 방식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하도록 결코 생각되지 않는다.

실시예 1: CHO 일시적 발현 시스템의 다양한 성분의 성능 특징

일시적 CHO 시스템에서 생성된 단일클론 항체에 대한 통상적인 수율은 10 내지 100㎎/ℓ 범위이어서, 조사자가 대규모 형질감염, 다수의 형질감염, 또는 둘 다를 수행하게 하여서, 이들의 연구를 위한 충분한 재료를 생성하였다. 일시적 CHO에서 단백질 발현의 1리터당 g 또는 이것 초과의 수준을 달성하기 위해, 발현 시스템의 각각의 성분은 신생 개발되었고, 생성된 CHO 일시적 발현 시스템에서 최대 성능을 얻도록 개별적으로 및 종합적으로 둘 다로 DoE에 의해 최적화되었다. 이 공정에서의 제1 단계로서, 새로운, 고발현 CHO 클론은 기존의 GMP CHO-S 세포 은행으로부터 단리되고, 새로운 화학적으로 한정된 및 동물 기원 비함유 세포 배양 배지(ExpiCHO 발현 배지)와 일치되었다. ExpiCHO 발현 배지에서 유지될 때, 이 새로운 세포(CHO-S-2H2)는, 단일-세포, 비클럼핑 표현형을 유지시키면서, 표준 진탕 플라스크 배양에서 높은 밀도(>20x10⁶ 세포/㎖)로 신속히 성장한다(배가 시간 약 17시간). CHO-S-2H2 세포는 계대배양에 걸쳐 우수한 성장 안정성(도 2a) 및 단백질 발현(도 2b)을 보여주어서 시간에 따른 일관된 성능을 보장한다. ExpiCHO 발현 배지는 6.0x10⁶개의 세포/㎖에서 형질감염이 가능하게 하고, ExpiCHO 공급물과 조합되어 사용될 때 14일까지 단백질 생성에 걸쳐 높은 세포 생존능력(수확시에 70 내지 80%)을 유지시켜서, 단백질 정제 전에 최소/무의 프리프로세싱을 요하는 예외적으로 깨끗한 상청액을 허용한다.

도 2a-2d로 돌아가서: 도 2a, 해동 후 계대배양 10 또는 계대배양 34에서의 CHO-S-2H2 세포는 지속적으로 계대배양에 걸쳐 매우 유사한 성장 프로필에 의해 일상적 진탕 플라스크 배양에서 20x10⁶개 이상의 생존가능 세포/㎖를 획득한다. 도 2b, CHO-S-2H2 세포는 광범위한 계대배양에 걸쳐 발현된 단백질의 일관된 역가를 입증한다. 도 2c, Expi펙타민CHO(상표명) 형질감염 시약은 1㎍/㎖ 플라스미드 DNA를 요하는 통상적인 일시적 형질감염 프로토콜과 비교하여 50-75% 더 적은 DNA의 사용을 허용한다. 도 2d, Expi펙타민CHO 증강인자의 사용은 단백질 역가를 배가시킨다.

실시예 2: 프리스타일(상표명) CHO 및 Expi293 (상표명) 발현 시스템과 비교된 일시적 CHO 발현 시스템에서의 단백질 수율

추천된 제조사 프로토콜 및 상기에 따라 본 발명의 CHO 발현 시스템(CHO ES), 프리스타일(상표명) MAX, 및 Expi293(상표명) 발현 시스템에서 인간 IgG1, 토끼 IgG, 및 에리쓰로포이에틴(Epo)을 일시적으로 발현시켰다. CHO ES에 대해, 최대 역가 프로토콜을 이용하였다. 단백질을 6 또는 7일(프리스타일 MAX CHO 및 Expi293) 또는 10-12일(CHO ES)에 수확하고, 포르테바이오 옥테트 또는 ELISA에 의해 정량화하였다. ExpiCHO에서의 단백질 수율의 배수 증가는 2개의 다른 각각의 시스템에 대해 막대에서 상기 도시되어 있다. 모든 단백질은 pcDNA 3.4 발현 벡터를 이용하여 발현되었다. 데이터는 도 3a-3c에 요약되어 있다. 도 3a에서, Expi293(상표명) 시스템과 비교하여, CHO ES 시스템은 인간 IgG의 3배 더 높은 역가, 토끼 IgG의 4배 더 높은 역가 및 Epo의 2배 더 높은 역가를 생성하였다. 프리스타일CHO 발현 시스템과 비교하여, ExpiCHO 시스템은 인간 IgG의 160배 더 높은 역가, 토끼 IgG의 95배 더 높은 역가 및 Epo의 25배 더 높은 역가를 생성하였다.

실시예 3: CHO ES 또는 Expi293 (상표명) 발현 시스템에서 스크리닝된 pcDNA3.4 벡터에서의 일련의 20개의 토끼 단일클론 항체 플라스미드

CHO ES에 대해, 모든 플라스미드에 최대 역가 프로토콜을 이용하였다. 19/20 항체에 대해, CHO ES 시스템은 Expi293(상표명) 시스템보다 높은 역가를 생성하였다. 이들 20개의 항체 중에, 하나는 Expi293(상표명) 시스템을 사용하여 발현될 수 없었고, CHO ES 시스템에서 82mg/ℓ를 생성하였고, 하나의 항체는 어느 시스템에서도 발현될 수 없었다. Expi293(상표명)과 비교된 CHO ES에 대한 발현의 배수 증가는, 2.4배의 평균 증가로, 1.4배 내지 3.9배의 범위였다.

실시예 4: 인간 IgG에 대한 발현의 동역학

최대 역가 프로토콜(실선, 상부 곡선), 고역가 프로토콜(파선 중간 곡선) 및 표준 역가 프로토콜(빗금 하부 곡선)을 이용하여 CHO ES 시스템에서 인간 IgG를 일시적으로 형질감염하였다(프로토콜 상세내용에 대해 상기 참조). IgG 역가를 발현 기간에 걸쳐 포르테바이오 옥테트에 의해 정량화하고 그래프에 작도하였다. 모든 프로토콜은 형질감염된 배양물의 1리터당 적어도 1그램의 단백질을 달성하였다. 최대 역가 프로토콜은 표준 프로토콜보다 대략 3배 더 높은 수율을 생성한 반면, 고역가 프로토콜은 대략 2배 더 높은 수율을 생성하였다. 단백질 수율은 발현된 특이적 단백질에 매우 의존하고, 3개의 상이한 프로토콜에 의해 달성된 상대 수율은 이 연구에서 관찰된 결과를 반영하지 않을 수 있다. 데이터는 도 6a에 도시되어 있다. 도 6b 데이터는 3개의 CHO ES 프로토콜에 대한 발현 실행 동안 세포 생존능력에 상응한다.

실시예 5: 다양한 시스템에서 발현된 항체의 리간드 결합 검정

도 7은 표시된 발현 시스템에서 발현된 토끼 단일클론 항체의 리간드 결합 검정으로부터의 결과를 보여준다. 데이터는 안정한 및 일시적 CHO, 및 Expi293 유래한 단백질에 걸친 필적하는 성능을 보여준다.

실시예 6: Expi293(상표명)과 비교된 안정한 및 일시적 CHO에 걸쳐 유사한 글라이코실화 패턴

본 발명의 CHO 발현 시스템은 초기 단계 약물 후보자 스크리닝 동안 일시적 단백질 발현에 대한 CHO 세포의 사용을 변혁시키도록 작용할 수 있다. Expi293 및 CHO ES 일시적 발현 시스템에 의해 생성된 재조합 IgG의 글라이코실화 패턴을 안정한 CHO 세포에서 발현된 동일한 단백질과 비교한다. ExpiCHO 시스템에서 생성된 재조합 IgG의 글라이코실화가 안정한 CHO 세포 시스템의 글라이코실화와 훨씬 더 같다는 것이 명확하여서, 일시적으로 발현된 약물 후보자가 CHO에서 제조된 하류 바이오의약품을 모방할 것이라는 확신을 사용자에게 제공한다.

N 연결된 글라이코실화 프로필은 Expi293 및 CHO ES 일시적 형질감염 시스템에서, 및 안정한 CHO-S 세포에서 발현된 인간 IgG에 대해 얻어졌다. 인간 IgG는 도 8에 표시된 발현 시스템에서 일시적으로 발현되었다(Expi293(상표명), CHO ES, 및 안정한 CHO-S). 인간 IgG 상청액 샘플을 수집하고, POROS MabCapture A 수지를 사용하여 정제하였다. PNGase 분해 및 APTS 표지화 후, 글라이칸 프로필을 모세관 전기영동에 의해 Applied Biosystems 3500 Series 유전적 분석장치에서 분석하였다. 결과는 CHO ES 시스템으로부터 일시적으로 발현된 단백질이 안정한 CHO 발현된 단백질과 유사한 글라이코실화를 나타내는 한편, Expi293(상표명) 발현된 단백질이 더 큰 글라이코실화 차이를 나타낸다는 것을 표시한다. 모든 3개의 시스템에서 생성된 인간 IgG의 결합 활성은 동등하다(데이터 비표시).

도 9a-9c는, 안정하게 형질감염된 CHO-S 세포에서 또는 표시된 바대로 Expi293(상표명)에서, CHO ES 시스템에서 발현된 인간 IgG1의 HILIC LC-FLD-MS N-글라이칸 프로파일링을 보여준다.

CHO ES 시스템의 확장가능성

CHO ES 시스템은 35㎖ 내지 1ℓ의 배양 용적의 제어의 15% 내에 확장가능하다.

본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 도시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시형태가 오직 예로서 제공된다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다. 많은 변형, 변화 및 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당해 분야의 숙련자에게 이제 발생할 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행하는 데 이용될 수 있다고 이해되어야 한다. 하기 청구항이 본 발명의 범위를 한정하지 않고, 이 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 이의 균등물이 이에 의해 다뤄지도록 이해된다.

Claims (63)

1. 배양된 현탁 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생성하는 방법으로서,
   CHO 세포의 현탁 배양물을 얻는 단계이되, 상기 CHO 세포는 고밀도 배양 조건 하에 성장에 적응된, 상기 얻는 단계,
   상기 CHO 세포를 현탁 CHO 세포의 성장을 허용하도록 적응된 고밀도 성장 배지 중에 약 2x10⁶개 내지 약 2x10⁷개의 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하는 단계;
   형질감염 시약의 존재 하에 상기 CHO 세포를 발현 벡터에 의해 형질감염시키는 단계이되, 상기 발현 벡터는 발현된 단백질을 생성할 수 있는 핵산 서열을 포함하는, 상기 형질감염시키는 단계;
   상기 형질감염된 CHO 세포를 제1 시간 기간 동안 항온처리하는 단계;
   상기 형질감염된 CHO 세포를 적어도 하나의 발현 증강인자(enhancer) 조성물 및 적어도 하나의 성장 조절제 조성물와 접촉시키는 단계;
   상기 발현 벡터가 상기 단백질을 발현하게 하는 조건 하에 제2 시간 기간 동안 상기 형질감염 증강인자 및 성장 조절제의 존재 하에 상기 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계; 및
   상기 형질감염된 CHO 세포를 수확하고 상기 발현된 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제2 시간 기간 후, 재차 상기 형질감염된 세포를 상기 성장 조절제 조성물과 접촉시키는 단계 및 상기 형질감염된 CHO 세포를 수확하고 상기 발현된 단백질을 단리하기 전에 제3 시간 기간 동안 상기 형질감염된 세포를 항온처리하는 단계를 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 제3 시간 기간은 약 20일 이하, 약 15일 이하, 약 14일 이하, 약 13일 이하, 약 12일 이하, 약 11일 이하, 약 10일 이하, 약 9일 이하, 약 8일 이하, 약 7일 이하, 약 6일 이하, 약 5일 이하, 약 4일 이하, 약 20일, 약 15일, 약 14일, 약 13일, 약 12일, 약 11일, 약 10일, 약 9일, 약 8일, 약 7일, 약 6일, 약 5일, 약 4일인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 형질감염된 세포를 상기 발현 증강인자 조성물 및 상기 성장 조절제 조성물과 접촉시킨 후, 상기 형질감염된 세포는 37℃ 미만 및 30℃ 초과의 온도에서 배양되는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 형질감염된 세포는 35℃ 미만 및 31℃ 초과의 온도에서 배양되는, 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 형질감염된 세포는 약 32℃의 온도에서 배양되는, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 현탁 CHO 세포는 고밀도 배양 조건 하에 성장에 적응된 CHO-S 세포 또는 CHO-S 세포의 유도체인, 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 현탁 CHO 세포는 CHO-S-2H2 세포 또는 CHO-S-클론 14 세포인, 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 현탁 CHO 세포는 형질감염 전에 약 3x10⁶개 내지 약 15x10⁶개의 세포/㎖, 약 3.5x10⁶개 내지 약 12x10⁶개의 세포/㎖, 약 4x10⁶개 내지 약 10x10⁶개의 세포/㎖, 약 4.5x10⁶개 내지 약 9x10⁶개의 세포/㎖, 약 5x10⁶개 내지 약 8x10⁶개의 세포/㎖, 약 5.5x10⁶개 내지 약 7x10⁶개의 세포/㎖, 약 6x10⁶개 내지 약 6.5x10⁶개의 세포/㎖, 약 6x10⁶개 내지 약 6.25x10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 6x10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 배양되는, 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질 또는 중합체성 아민계 형질감염 시약을 포함하는, 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 또는 이의 유도체를 포함하는, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 PEI는 선형 PEI인, 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 양이온성 지질은 상기 현탁 CHO 세포를 형질감염시키기 전에 형질감염 복합체를 형성하도록 상기 발현물과 접촉하는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 형질감염 복합체는 0℃ 초과 및 20℃ 미만, 15℃ 미만, 10℃ 미만, 8℃ 미만 또는 5℃ 미만의 온도에서 형성되는, 방법.
16. 제1항에 있어서, 형질감염 전의 상기 현탁 배양물의 용적은 약 20㎖ 내지 약 1500㎖, 약 25㎖ 내지 약 1000㎖, 약 30㎖ 내지 약 750㎖, 약 50㎖ 내지 약 500㎖, 약 75㎖ 내지 약 400㎖, 약 100㎖ 내지 약 200㎖의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 범위인, 방법.
17. 제1항에 있어서, 형질감염 전의 상기 현탁 배양물의 용적은 약 20㎖, 약 25㎖, 약 30㎖, 약 35㎖, 약 40㎖, 약 45㎖, 약 50㎖, 약 55㎖, 약 60㎖, 약 65㎖, 약 70㎖, 약 75㎖, 약 80㎖, 약 100㎖, 약 125㎖, 약 150㎖, 약 175㎖, 약 200㎖, 약 250㎖, 약 300㎖, 약 400㎖, 약 500㎖, 약 750㎖, 1000㎖, 또는 약 1500㎖, 또는 이들 사이의 임의의 용적인, 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물은 발프로산, 나트륨 프로피오네이트, 나트륨 뷰티레이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 갈락토스, 아미노산 중 적어도 하나, 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물은 발프로산, 나트륨 프로피오네이트, 나트륨 뷰티레이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 갈락토스, 아미노산 중 적어도 2개 이상, 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
20. 제18항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물은 발프로산, 나트륨 프로피오네이트, 나트륨 뷰티레이트, 리튬 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 갈락토스, 아미노산 중 적어도 3개 이상, 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
21. 제18항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물은 발프로산, 나트륨 프로피오네이트 및 나트륨 뷰티레이트를 포함하는, 방법.
22. 제18항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물은 현탁 세포의 클럼핑(clumping)을 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도, 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 또는 적어도 50% 감소시키는 조성물을 추가로 포함하는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 현탁 세포의 클럼핑을 감소시키는 상기 조성물은 황산덱스트란을 포함하는, 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물 중의 상기 황산덱스트란의 농도는 약 10㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖, 약 25㎎/㎖ 내지 약 175㎎/㎖, 약 50㎎/㎖ 내지 약 150㎎/㎖, 약 75㎎/㎖ 내지 약 125㎎/㎖, 약 90㎎/㎖ 내지 약 110㎎/㎖, 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위인, 방법.
25. 제18항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물은 발프로산(VPA)을 포함하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물 중의 상기 발프로산의 농도는 약 5㎎/㎖ 내지 약 50㎎/㎖, 약 5mM 내지 약 200mM의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물 중의 상기 발프로산의 농도는 약 20mM 내지 약 150mM, 약 25mM 내지 약 125mM, 약 50mM 내지 약 100mM, 약 75mM 내지 약 80mM의 범위인, 방법.
28. 제25항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물 중의 상기 발프로산의 농도는 약 50mM 내지 약 150mM, 약 75mM 내지 약 125mM, 약 80mM 내지 약 120mM, 약 90mM 내지 약 110mM 또는 약 100mM인, 방법.
29. 제25항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물 중의 상기 발프로산의 농도는 약 10㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖, 약 12㎎/㎖ 내지 약 18㎎/㎖, 약 14㎎/㎖ 내지 약 16㎎/㎖ 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 발프로산의 농도는 약 10㎎/㎖, 약 10.5㎎/㎖, 약 11㎎/㎖, 약 11.5㎎/㎖, 약 12㎎/㎖, 약 12.5㎎/㎖, 약 13㎎/㎖, 약 13.5㎎/㎖, 약 14, 약 14.5㎎/㎖, 약 15㎎/㎖, 약 15.5㎎/㎖, 약 16㎎/㎖, 약 16.5㎎/㎖, 약 17㎎/㎖, 약 17.5㎎/㎖, 약 18㎎/㎖, 약 18.5㎎/㎖, 약 19㎎/㎖, 약 19.5㎎/㎖, 또는 약 20㎎/㎖, 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
31. 제18항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물은 나트륨 프로피오네이트를 포함하는, 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 배양물 중의 상기 나트륨 프로피오네이트의 최종 농도는 약 0.2mM 내지 약 100mM, 약 0.5mM 내지 약 50mM, 약 0.75mM 내지 약 25mM, 약 1mM 내지 약 15mM, 약 1.25mM 내지 약 10mM, 약 1.5mM 내지 약 5mM, 약 0.75mM 약 0.8mM, 약 1mM, 약 1.2mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.5mM, 약 1.7mM, 약 2.0mM의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
33. 제31항에 있어서, 상기 배양물 중의 상기 나트륨 프로피오네이트의 최종 농도는 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 0.2㎎/㎖의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
34. 제31항에 있어서, 상기 발현 증강인자 조성물 중의 상기 나트륨 프로피오네이트의 최종 농도는 약 0.5mM 내지 약 5mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
35. 제18항에 있어서, 상기 발현 조성물은 나트륨 뷰티레이트를 포함하는, 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 배양물 중의 상기 나트륨 뷰티레이트의 최종 농도는 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.05mM 내지 약 0.5mM, 약 0.01mM 내지 약 0.25mM, 약 5㎎/ℓ 내지 약 20㎎/ℓ, 약 8㎎/ℓ 내지 약 15 m/ℓ, 약 10㎎/ℓ 내지 약 14㎎/ℓ의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
37. 제1항에 있어서, 상기 현탁 배양물의 용적은 약 25㎖㎕ 내지 약 50ℓ의 범위, 또는 이들 사이의 임의의 농도인, 방법.
38. 제1항에 있어서, 상기 현탁 배양물의 용적은 약 100㎖㎕ 내지 약 1ℓ의 범위인, 방법.
39. 제1항에 있어서, 상기 현탁 배양물의 용적은 약 200㎖㎕ 내지 약 500㎖의 범위인, 방법.
40. 제1항에 있어서, 상기 형질감염 단계의 세포 밀도는 약 1x10⁶개 내지 약 20x10⁶개의 세포/㎖인, 방법.
41. 제1항에 있어서, 상기 형질감염 단계의 세포 밀도는 약 2x10⁶ 내지 약 6x10⁶의 범위인, 방법.
42. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 형질감염 단계 후에 상기 고밀도 배양 배지의 대체, 재충전 또는 보충을 요하지 않는, 방법.
43. 제1항에 있어서, 상기 고밀도 배양 배지는 상기 형질감염 단계 후에 대체되거나 재충전되거나 보충되지 않는, 방법.
44. 제1항에 있어서, 상기 고밀도 성장 배지는 2x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 2x10⁷개의 세포/㎖의 초과의 밀도로 형질감염된 CHO 세포의 성장을 촉진하는 혈청 비함유/단백질 비함유의 화학적으로 한정된 배양 배지이되, 상기 세포 생존능력은 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 초과로 있는, 방법.
45. 제1항에 있어서, 상기 고밀도 성장 배지는 2x10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 2x10⁷개의 세포/㎖의 초과의 밀도로 형질감염된 CHO 세포의 성장을 촉진하는 혈청 비함유/단백질 비함유의 화학적으로 한정된 배양 배지이되, 상기 세포 생존능력은 상기 발현 벡터에 의한 이의 형질감염 후 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 초과로 있는, 방법.
46. 제1항에 있어서, 상기 고밀도 성장 배지는 상기 형질감염 단계 후에 상기 배지의 보충, 대체 또는 재충전을 요하지 않는, 방법.
47. 제1항에 있어서, 상기 고밀도 성장 배지는 상기 형질감염 단계 후에 보충되거나 대체되거나 재충전되지 않는, 방법.
48. 제1항에 있어서, 상기 발현된 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
49. 제1항에 있어서, 상기 CHO 세포는 하나 이상의 발현 증대 단백질을 발현하는, 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 발현 증대 단백질은 AKT, P18, P21, Bcl-X_L 및 PKBa로 이루어진 목록으로부터 선택된, 방법.
51. 제49항에 있어서, 상기 CHO 세포는 하나 이상의 발현 증대 단백질을 일시적으로 발현하는, 방법.
52. 제49항에 있어서, 상기 CHO 세포는 하나 이상의 발현 증대 단백질을 안정하게 발현하는, 방법.
53. 제1항에 있어서, 상기 제1 시간 기간은 약 12시간 내지 약 2일, 약 15 내지 약 36시간, 약 16시간 내지 약 30시간, 약 18 내지 약 28시간, 약 19 내지 약 26시간, 약 19 내지 약 25시간, 약 20 내지 약 24시간, 또는 이들 사이의 임의의 시간의 범위인, 방법.
54. 제1항에 있어서, 상기 제1 시간 기간은 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 48시간 이하, 또는 이들 사이의 임의의 시간인, 방법.
55. 제1항에 있어서, 상기 제2 시간 기간은 약 20일 이하, 약 19일 이하, 약 18 이하, 약 17일 이하, 약 16일 이하, 약 15일 이하, 약 14일 이하, 약 13일 이하, 약 12일 이하, 약 11일 이하, 약 10일 이하, 약 9일 이하, 약 8일 이하, 약 7일 이하, 약 6일 이하, 약 5일 이하, 약 4일 이하, 약 3일 이하, 또는 이들 사이의 임의의 시간인, 방법.
56. 제1항에 있어서, 상기 성장 조절제 조성물은 복수의 아미노산을 포함하고, 각각의 아미노산은 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 8㎎/㎖의 범위의 농도를 가지는, 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 성장 조절제 조성물은 글루코스를 추가로 포함하는, 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 성장 조절제 조성물 중의 상기 글루코스의 삼투질농도는 약 500mOsm/㎏ 내지 약 700mOsm/㎏, 약 550mOsm/㎏ 내지 약 650mOsm/㎏, 약 575mOsm/㎏ 내지 약 625mOsm/㎏인, 방법.
59. 제57항에 있어서, 상기 글루코스의 농도는 약 85㎎/㎖ 내지 약 115㎎/㎖, 약 90㎎/㎖ 내지 약 110㎎/㎖, 약 95㎎/㎖ 내지 약 105㎎/㎖의 범위인, 방법.
60. 제56항에 있어서, 상기 성장 조절제 조성물은 약 1000mOsm/㎏ 내지 약 1500mOsm/㎏, 약 1100mOsm/㎏ 내지 약 1400mOsm/㎏, 약 1200mOsm/㎏ 내지 약 1300mOsm/㎏의 삼투질농도, 또는 이들 사이의 임의의 삼투질농도 또는 범위를 가지는, 방법.
61. 제56항에 있어서, 상기 성장 조절제 조성물은 약 1100mOsm/㎏, 약 1150mOsm/㎏, 약 1200mOsm/㎏, 약 1250mOsm/㎏, 약 1300mOsm/㎏, 약 1350mOsm/㎏, 약 1400mOsm/㎏, 약 1450mOsm/㎏, 약 1500mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지는, 방법.
62. 제1항에 있어서, 상기 배양물의 용적은, 상기 형질감염된 CHO 세포가 수확될 때, 상기 현탁 세포가 형질감염된 때의 상기 배양물의 용적의 약 150% 미만, 약 145% 미만, 약 140% 미만, 약 135% 미만, 약 130% 미만, 약 125% 미만, 약 120% 미만이고, 상기 용적의 증가는 성장 배지의 첨가, 보충 또는 대체로 인한 것이 아닌, 방법.
63. 제1항에 있어서, 상기 배양물의 용적은, 상기 형질감염된 CHO 세포가 수확될 때, 상기 현탁 세포가 형질감염된 때의 상기 배양물의 용적의 150% 미만, 약 145% 미만, 약 140% 미만, 약 135% 미만, 약 130% 미만, 약 125% 미만, 약 120% 미만이고, 상기 용적의 증가는 상기 성장 증강인자 및 발현 증강인자 조성물의 첨가로 인한 것인, 방법.
    

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