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KR20180027501A - 맞춤형 전달 벡터-기반 면역 요법을 위한 제조 장치 및 공정 - Google Patents

맞춤형 전달 벡터-기반 면역 요법을 위한 제조 장치 및 공정 Download PDF

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KR20180027501A
KR20180027501A KR1020187000431A KR20187000431A KR20180027501A KR 20180027501 A KR20180027501 A KR 20180027501A KR 1020187000431 A KR1020187000431 A KR 1020187000431A KR 20187000431 A KR20187000431 A KR 20187000431A KR 20180027501 A KR20180027501 A KR 20180027501A
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KR
South Korea
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another embodiment
bag
length
filter
listeria
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020187000431A
Other languages
English (en)
Inventor
아닐 이펜
로버트 페티트
마요 푸홀스
Original Assignee
어드박시스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 어드박시스, 인크. filed Critical 어드박시스, 인크.
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Abstract

본 발명은 질환 또는 상태를 갖는 대상에 대한 맞춤형 면역 요법 조성물을 생성하고 제공하는 시스템으로서, 치료적 백신 전달 벡터 및 이를 만드는 방법을 포함하는 시스템을 제공하며, 여기서 조성물은 하나 이상의 네오-에피토프 또는 대상의 암이나 건강하지 않는 조직에 특이적인 돌연변이를 함유하는 펩티드와 관련된 펩티드를 발현하는 유전자 발현 구축물을 포함한다. 본 발명은 확장가능한 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템을 추가로 제공하며, 여기서 맞춤형 면역 요법 조성물의 전체 제조 공정은 환자로의 전달을 위해 조성물을 용기에 분배하는 단계를 포함하여 단일 밀폐된 유체 유동 경로 내에서 수행된다.

Description

맞춤형 전달 벡터-기반 면역 요법을 위한 제조 장치 및 공정
본 개시는 질환 또는 상태를 가진 대상을 위해 맞춤형 면역 요법 조성물을 병렬로 제조하는 확장가능한 공정을 제공한다. 또한, 본 개시는 질환 또는 상태를 가진 대상 또는 상이한 대상을 위해 다수의 맞춤형 면역 요법 조성물을 생산하기 위한, 몇몇의 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 병렬 사용을 제공한다.
맞춤형 의약 이전에, 특정한 암의 유형 및 병기에 있는 대부분의 환자들은 동일한 치료를 받았다. 그러나, 일부 치료는 특정 환자에게 효과가 있지만 다른 환자에게는 그다지 효과가 없다는 것이 의사들과 환자들에게 분명해졌다. 따라서, 특정 종양에 대해 효과가 있는, 효과적인 맞춤형 암 백신을 개발할 필요가 있다. 맞춤형 치료 전략은 표준 치료로 예상되는 것 보다 더 효과적일 수 있으며 부작용이 더 적을 수 있다.
종양은 사람의 DNA의 돌연변이에 의해 생겨나며, 숙주에 의해 생성된 해당 정상 단백질 내에는 존재하지 않는 네오-에피토프(neo-epitope)를 포함하는, 돌연변이 단백질 또는 비정상 단백질이 생기도록 할 수 있다. 이들 네오-에피토프의 다수는 T 세포 반응을 자극하고 면역 체계에 의해 초기 단계의 암세포 파괴를 야기한다. 그러나, 암이 자리를 잡은 경우라면, 면역 반응이 불충분하다. 다른 예에서, 암에서의 종양 항원을 표적으로 하지만 이의 네오-에피토프를 특이적으로 표적으로 하지 않는 효과적인 장기 백신의 개발은 어려운 것으로 판명되었다. 이의 주된 이유는 종양 자기 항원에 특이적인 T 세포가 내성 기작을 통해 제거되거나 불활성화되기 때문이다.
네오-에피토프는 질환, 예컨대 암과 관련된 단백질 내에 존재하는 에피토프이며, 여기서, 특정 “네오-에피토프”는 질병이 없는 대상 또는 그 안에 질병 보유 조직이 없는 대상과 관련된 상응하는 정상 단백질 내에 존재하지 않는다. 네오-에피토프를 동정하는 것은 어려울 수 있지만, 그렇게 하여 이를 표적으로 하는 치료 방법을 개발하면 맞춤형 치료 전략 내에서 사용하기에 유리할 것이며, 그 이유는 이것이 드물며 개인과 개인간에 다양할 수 있기 때문이다.
리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) (Lm)은 리스테리아증(listeriolysis)을 야기하는 그람 양성 조건 세포내 병원체이다. 일단 숙주 세포에 침입하면, Lm은 기공-형성 단백질 리스테리올리신 O(LLO)의 생산을 통해 파고리소좀으로부터 탈출하여 혈관 세포막을 용해시켜, 세포질에 들어갈 수 있도록 할 수 있는데, 여기에서 그것은 복제되고 액틴-중합화 단백질(ActA)의 이동성을 기반으로 인접 세포들에 전파된다. 세포질 내에서, Lm-분비 단백질은 프로테아좀에 의해 분해되고 소포체에서 MHC 클래스 I 분자와 관련되는 펩티드로 가공된다. 이 독특한 특성은 종양-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)를 활성화시키도록 종양 항원에 MHC 클래스 I 분자가 제공될 수 있다는 점에서 그것을 매우 매력적인 암 백신 벡터로 만든다.
또한, 일단 식균되면, Lm은 다음에 파고리소좀 구획에서 가공되고 Lm-특이적 CD4-T 세포 반응의 활성화를 위해 MHC 클래스 II에 펩티드가 제공될 수 있다. 대안적으로, Lm은 파고좀에서 탈출하고 시토졸로 들어갈 수 있어, 여기에서 핵 올리고머화 도메인-유사 수용체에 의한 펩티도글리칸의, 그리고 DNA 센서 AIM2에 의한 Lm DNA의 인식이 염증 캐스케이드를 활성화시킨다. 염증 반응 및 항원의 MHC I 및 MHC II 경로로의 효과적인 전달의 조합은 종양을 치료, 이에 대한 보호, 그리고 이에 대한 면역 반응을 유도하는 데 있어서 Lm을 강력한 백신 벡터로 만든다.
T 세포 반응을 추가적으로 자극하거나 다른 요법들과 조합하여 사용할 수도 있는 리스테리아 기반의 백신의 성분으로서 대상의 암에 특이적인 네오-에피토프를 표적화함으로써, 암의 치료에 효과적이면서 대상의 암에 맞춰진 백신을 제공할 수 있다. 내성 기작을 벗어난 T 세포를 자극하기 위해 항원의 면역원성 또는 백신의 능력을 증가시키는 항원 융합 전략은 면역요법으로서 특정한 잠재력을 가질 수 있다.
일단 환자가 암으로 진단되면 맞춤형 치료의 신속한 전달을 보장하는 것이 임상 결과에 중요해지는데, 그 이유는 맞춤형 치료의 식별, 시험 및 제조가 환자의 질병 진행과 동시에 이루어지기 때문이다. 적용가능한 규정을 준수하는 절차를 사용하면서 임상적으로 충분한 양으로 종양 네오-에피토프를 표적으로 하는 맞춤형 면역 요법 조성물을 제조하는 것은 이러한 조성물을 식별하고 시험하는 시간 집약적인 공정을 복잡하게 하는 주요 지연 원인일 수 있다. 따라서, 신속한 턴어라운드를 보장하고, 생산 시간을 최소화하고, 동시에 약물 제조를 위해 성립된 표준과 일치하는 면역 요법 조성물을 제조하기 위한 능률적인 공정을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템에 기초한 면역 요법 조성물에 대한 능률적인 제조 공정을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다. 본 발명은 또한 면역 요법 조성물에 대한 제조 공정의 확장성을 제공함으로써 전술된 필요성을 충족시킨다.
일 측면에서, 질환 또는 상태를 갖는 대상에게 투여하기 위한 맞춤형 면역 요법 조성물의 제조 공정이 개시되며, 여기서 상기 맞춤형 면역 요법 조성물은 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하고, 여기서 상기 리스테리아 균주는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 개방형 해독 프레임을 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 상기 공정은
질환 또는 상태를 갖는 대상의 질병 샘플에서 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 수득 및 확인하는 단계;
상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 약독화된 리스테리아 균주를 안정적으로 형질감염시키는 단계;
상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 발현하는 리스테리아 클론을 수득하는 단계;
상기 리스테리아 클론을 소정의 규모로 확장시키는 단계;
상기 확장된 리스테리아 클론을 정제하는 단계;
성장 배지를 제형화 완충액으로 대체하는 단계;
상기 리스테리아 클론을 수확하는 단계,
상기 수확된 리스테리아 클론을 소정의 농도를 갖는 용액 중에 희석하는 단계; 및
후속 보관 또는 대상에게 투여하기 위해, 상기 수확된 리스테리아 클론 용액을 단일 투여량 용기에 분배하는 단계를 포함한다.
여기서, 단계 c 내지 i는 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템에서 수행된다.
관련 측면에서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 접종 섹션, 발효 섹션, 농축 섹션, 정용여과 섹션, 및 제품 분배 섹션을 포함한다.
또 다른 관련 측면에서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 통합된 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 포함한다.
추가의 관련 측면에서, 본 개시는 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템이고, 여기서 상기 시스템은 하나 이상의 일회용 교반된 생물반응기를 추가로 포함한다.
또 다른 관련 측면에서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 제품 분배 섹션은 대상에게 즉각적인 투여를 위해 사용될 수 있거나, 대안적으로 후속 배송 및 보관을 위해 동결될 수 있는 단일 투여량 크기의 제품 용기를 포함한다.
추가의 관련 측면에서, 본 개시는 단일 대상 규모의 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템이다. 또 다른 관련 측면에서, 본 개시는 동일한 대상 또는 상이한 대상을 위한 다수의 맞춤형 면역 요법 조성물을 병렬로 제조하기 위한 여러 가지 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 동시 사용을 제공한다.
또 다른 관련 측면에서, 상기 질환 또는 상태는 감염성 질병 또는 종양 또는 암을 포함한다.
또 다른 관련 측면에서, 본 개시는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 의약품을 농축 및 정용여과하기 위한 농축 섹션 및 정용여과 섹션으로 이루어진 접선 유동 여과 (TFF) 장치에 관한 것으로서, 여기서 이는 유동 유체 도관(5)을 통해 투과물 용기(2)에 작동가능하게 연결된 잔류물 용기(1)를 포함한다.
본원에 개시된 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 실시예들과 도면들로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변경 및 수정은 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내면서 단지 예시적으로만 주어지는 것으로 이해해야 한다.
본 발명으로 간주되는 주제는 본 명세서의 결론 부분에서 특히 지적되고 명확하게 청구된다. 그러나, 본 발명은, 그 목적, 특징 및 장점과 함께, 구성 및 동작 방법 모두에 관하여 첨부된 도면들을 읽을 때 다음과 같은 상세한 설명을 참조하여 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1a 및 도 1b. Lm-E7 및 Lm-LLO-E7(ADXS11-001)은 E7을 발현 및 분비하도록 상이한 발현 시스템을 사용한다. Lm-E7은, 유전자 카세트를 리스테리아 모노사이토게네스 게놈의 orfZ 도메인에 도입함으로써 생성되었다(도 1a). hly 프로모터는, HPV-16 E7이 후속하는 hly 신호 서열 및 LLO의 처음 5 개 아미노산(AA)의 발현을 유도한다. (도 1b), Lm-LLO-E7은 prfA- 균주 XFL-7을 플라스미드 pGG-55로 형질전환함으로써 생성되었다. pGG-55는 LLO-E7의 비용혈성 융합의 발현을 구동하는 hly 프로모터를 갖는다. pGG-55는 또한 생체내 XFL-7에 의한 플라스미드의 보유를 선택하기 위한 prfA 유전자를 포함한다.
도 2. Lm-E7 및 Lm-LLO-E7은 E7을 분비한다. Lm-Gag(레인 1), Lm-E7(레인 2), Lm-LLO-NP(레인 3), Lm-LLO-E7(레인 4), XFL-7(레인 5), 및 10403S(레인 6)를 37℃의 Luria-Bertoni 액체 배지에서 밤새 성장시켰다. 600 nm 흡광도에서 OD에 의해 결정된 바와 같은 균등 개수의 세균을 펠릿 처리하고, 각 상등액 18 ml를 TCA 침전시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 E7 발현을 분석하였다. 블롯을 항-E7 mAb, 다음에 HRP-접합된 항-마우스(Amersham)로 탐지한 다음, ECL 검출 시약을 사용하여 진행시켰다.
도 3. LLO-E7 융합의 종양 면역 요법 효능. 마우스의 밀리미터 단위의 종양 크기가 종양 접종 7일후, 14일후, 21일후, 28일후, 및 56일후에 대하여 도시되어 있다. 미처리(naive) 마우스: 개방 원형; Lm-LLO-E7: 채워진 원형: Lm-E7: 정사각형; Lm-Gag: 개방 다이아몬드형; 및 Lm-LLO-NP: 채워진 삼각형.
도 4. Lm-LLO-E7-면역화된 마우스로부터의 비장세포는 TC-1 세포에 노출시 증식한다. C57BL/6 마우스를 면역화하고 Lm-LLO-E7, Lm-E7, 또는 대조 rLm 균주로 추가투여하였다. 추가투여 6일 후에 비장 세포를 채취하고, 조사된 TC-1 세포를 도시된 비율로 플레이팅하였다. 세포를 3H 티미딘으로 펄스 처리하고 채취하였다. Cpm은 (실험 cpm) - (no-TC-1 대조군)으로서 정의된다.
도 5a 및 도 5b. (도 5a) Lm-ActA-E7이 E7을 분비하는 것을 보여주는 웨스턴 블롯. 레인 1: Lm-LLO-E7; 레인 2: Lm-ActA-E7.001; 레인 3; Lm-ActA-E7-2.5.3; 레인 4: Lm-ActA-E7-2.5.4. (도 5b) Lm-ActA-E7(직사각형), Lm-E7(타원형), Lm-LLO-E7(X)를 투여한 마우스 및 미처리 마우스(비-백신접종; 채워진 삼각형)에서의 종양 크기.
도 6a-6c. (도 6a) 4 LM 백신을 생성하기 위해 사용되는 플라스미드 삽입체의 개략도. Lm-LLO-E7 삽입물은 사용된 리스테리아 유전자 모두를 함유한다. 이는 hly 프로모터, hly 유전자(단백질 LLO를 인코딩함)의 처음 1.3 kb, 및 HPV-16E7 유전자를 포함한다. hly의 처음 1.3 kb는 신호 서열(ss) 및 PEST 영역을 포함한다. Lm-PEST-E7은 hly 프로모터, 신호 서열, PEST 및 E7 서열을 포함하나, 절단된 LLO 유전자의 나머지는 배제한다. Lm-ΔPEST-E7은 PEST 영역은 배제하나, hly 프로모터, 신호 서열, E7 및 절단된 LLO 유전자의 나머지는 포함한다. Lm-E7epi는 hly 프로모터, 신호 서열 및 E7만을 포함한다. (도 6b) 상부 패널: PEST 영역을 함유하는 리스테리아 구축물은 종양 억제를 유도한다. 하부 패널: 2개의 개별 실험에서 종양 접종-후 28일째의 평균 종양 크기. (도 6c) PEST 영역을 포함하는 리스테리아 구축물은 비장에서 더 높은 백분율의 E7-특이적 림프구를 유도한다. 3개 실험으로부터의 데이터의 평균 및 SE가 도시된다.
도 7a 및 도 7b. (도 7a) TC-1 종양 세포 투여 후 Lm-E7, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7을 투여하거나 백신을 투여하지 않은(미처리) 마우스에서, 비장에서의 E7-특이적 IFN-감마-분비 CD8+ T 세포의 유도 및 종양을 침투한 수. (도 7b) (도 7a)에서 기술한 마우스의 비장 및 종양에서 E7 특이적 CD8+ 세포의 유도 및 침투.
도 8a 및 도 8b. PEST 영역을 포함하는 리스테리아 구축물은 종양 내에서 더 높은 백분율의 E7-특이성 림프구를 유도한다. (도 8a) 실험 1로부터의 대표적인 데이터. (도 8b) 모든 3회 실험으로부터의 데이터의 평균 및 SE.
도 9. 실시예 6에 제시된 임상 시험의 환자에게서 관찰된 효능을 나타내는 집단 1 및 2로부터의 데이터.
도 10a 및 도 10b. (도 10a) klk3 통합 및 actA 결실 후 Lmdd-143 및 LmddA-143의 염색체 영역의 개략적 도시; (도 10b) klk3 유전자는 Lmdd 및 LmddA 염색체로 통합된다. klk3 특이적 프라이머를 사용하는 각 구축물로부터의 염색체 DNA 제조로부터의 PCR은 야생주 단백질의 분비 신호 서열이 결여된 klk3 유전자에 해당하는 714 bp 밴드를 증폭시킨다.
도 11a-11d. (도 11a) pADV134 플라스미드의 유전자 지도. (도 11b) LmddA-134 배양 상등액으로부터 얻은 단백질이 침전되고 SDS-PAGE에서 분리되고, LLO-E7 단백질은 항-E7 단일클론 항체를 사용하여 웨스턴-블롯으로 검출되었다. 항원 발현 카세트는 hly 프로모터, 절단된 LLO를 위한 ORF 및 인간 PSA 유전자(klk3)로 구성된다. (도 11c) pADV142 플라스미드의 유전자 지도. (도 11d) 웨스턴 블로팅에서는 항-PSA 및 항-LLO 항체를 사용하여 LLO-PSA 융합 단백질의 발현을 보여주었다.
도 12a 및 도 12b. (도 12a) 선택 압력(D-알라닌) 유무에 따른 LmddA-LLO-PSA의 배양시 시험관내 플라스미드 안정성. 먼저 균주 및 배양 조건을 수록하고 CFU 결정을 위해 사용되는 플레이트를 다음에 수록한다. (도 12b) LmddA-LLO-PSA 생체내 제거율(clearance) 및 이때 잠재적 플라스미드 손실의 평가. 박테리아를 정맥내 주사하고 표시된 시점에서 비장으로부터 분리하였다. CFU를 BHI 및 BHI + D-알라닌 플레이트에서 결정하였다.
도 13a 및 도 13b. (도 13a) C57BL/6 마우스에 108 CFU를 투여한 후 균주 LmddA-LLO-PSA의 생체내 제거율. BHI/str 플레이트 상에 접종하여 CFU 수를 결정하였다. 이 방법의 검출 한계는 100 CFU였다. (도 13b) 10403S, LmddA-LLO-PSA 및 XFL7 균주를 이용한 J774 세포의 세포 감염 분석.
도 14a-14e. (도 14a) 부스터 투여(booster dose) 후 6 일째에 미처리 및 LmddA-LLO-PSA로 면역화된 마우스의 비장세포에서의 PSA 4량체-특이적 세포. (도 14b) 미처리 및 LmddA-LLO-PSA로 면역화된 마우스의 비장세포에서 IFN-γ에 대한 세포내 사이토카인 염색을 PSA 펩티드로 5 시간 동안 촉진시켰다. 카스파제 기반의 분석(도 14c) 및 유로퓸 기반의 분석(도 14d)을 사용하여 상이한 효과기/표적 비율에서 LmddA-LLO-PSA로 면역화된 마우스 및 미처리 마우스로부터 얻은 시험관내 자극된 효과기 T 세포를 이용한 PSA 펩티드로 펄스 자극받은(pulsed) EL4 세포의 특이적 용해. PSA 펩티드의 존재 또는 비존재 중 24 시간 동안 자극 후 얻어진 미처리 및 면역화된 비장세포에서의 IFNγ 스폿의 수(도 14e).
도 15a-15c. LmddA-142로 면역화하면 Tramp-C1-PSA(TPSA) 종양의 퇴행(regression)이 유도된다. 마우스를 비처치 상태로 두거나(n=8)(도 15a) 7, 14 및 21 일째에 LmddA-142(1x108 CFU/마우스)(n=8)(도 15b) 또는 Lm-LLO-PSA(n=8)(도 15c)로 복강내 면역화하였다. 종양 크기를 각각의 개별 종양에 대해 측정하여 그 값을 밀리미터 단위의 평균 직경으로 표시하였다. 각 라인은 개별 마우스를 나타낸다.
도 16a 및 도 16b. (도 16a) 비처치 마우스 및 Lm 대조 균주 또는 LmddA-LLO-PSA(LmddA-142)의 어느 하나로 면역화된 마우스의 비장 및 침윤성 T-PSA-23 종양에서 PSA-4량체+CD8+ T 세포의 분석. (도 16b)비처치 마우스 및 Lm 대조 균주 또는 LmddA-LLO-PSA의 어느 하나로 면역화된 마우스의 비장 및 침윤성 T-PSA-23 종양에서 CD25+FoxP3+로 정의되는 CD4+ 조절 T 세포의 분석.
도 17a 및 도 17b. (도 17a) klk3 통합 및 actA 결실 후 Lmdd-143 및 LmddA-143의 염색체 영역의 개략적 도시; (도 17b) klk3 유전자는 Lmdd 및 LmddA 염색체로 통합된다. klk3 특이적 프라이머를 사용하는 각 구축물로부터의 염색체 DNA 제조로부터의 PCR은 klk3 유전자에 해당하는 760 bp 밴드를 증폭한다.
도 18a-c. (도 18a) Lmdd-143 및 LmddA-143은 LLO-PSA 단백질을 분비한다. 박테리아 배양 상등액에서 얻은 단백질을 침전시켜 SDS-PAGE로 분리하고, LLO 및 LLO-PSA 단백질을 항-LLO 및 항-PSA 항체를 사용하여 웨스턴-블롯으로 검출한다; (도 18b) Lmdd-143 및 LmddA-143에 의해 생산된 LLO는 용혈 활성을 보유한다. 양(sheep)의 적혈구를 박테리아 배양 상등액의 연속 희석액(serial dilutions)에서 배양하고 590 nm 흡광도로 용혈 활성을 측정하였다; (도 18c) Lmdd-143 및 LmddA-143을 마크로파지-유사 J774 세포 내에서 성장시켰다. J774 세포를 박테리아와 함께 1 시간 동안 배양한 후 겐타마이신 처리로 세포외 박테리아를 사멸시켰다. 세포 내 성장은 표시된 시점에서 수득한 일련의 J774 용해물의 희석액을 접종함으로써 측정하였다. 이들 실험에서 Lm 10403S가 대조군으로서 사용되었다.
도 19. Lmdd-143 및 LmddA-143를 사용한 마우스의 면역화는 PSA-특이적 면역 반응을 유도한다. C57BL/6 마우스를 1x108 CFU의 Lmdd-143, LmddA-143 또는 LmddA-142로 2회 1주일 간격으로 면역화하고, 7일 후 비장을 채취하였다. 비장세포를 모넨신(monensin)의 존재 하에 5 시간 동안 1 μM의 PSA65-74 펩티드로 자극하였다. CD8, CD3, CD62L 및 세포내 IFN-γ에 대해 세포를 염색하고 FACS Calibur 세포측정기로 분석하였다.
도 20a 및 도 20b. ADXS31-164의 제작. (도 20a) LmddA 균주에서 염색체 dal-dat 결실의 보완을 위한 구성적 리스테리아 p60 프로모터의 조절 하에서 바실러스 서브틸리스 dal 유전자를 갖는 pAdv164의 플라스미드 맵. 이는 또한, Her2/neu의 하기 3개 단편의 직접 융합에 의해 제작된, 키메라 인간 Her2/neu 유전자로 절단된 LLO(1-441)의 융합을 포함한다: EC1 (aa 40-170), EC2 (aa 359-518) 및 ICI (aa 679-808). (도 20b) tLLO-ChHer2의 발현 및 분비는 항-LLO 항체로 블롯팅된 TCA 침전 세포 배양 상층액의 웨스턴 블롯 분석에 의해 Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138) 및 LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)에서 검출되었다. 104 KD 이하의 차등 밴드는 tLLO-ChHer2에 상응한다. 내인성 LLO는 58 KD 밴드로서 검출된다. 리스테리아 대조군은 ChHer2 발현이 없었다.
도 21a-21c. ADXS31-164의 면역원성 특성(도 21a) 면역화된 마우스로부터의 비장세포에서 Her2/neu 리스테리아-기반 백신에 의해 유발된 세포독성 T 세포 반응은 자극제로서 NT-2 세포 및 표적으로서 3T3/neu 세포를 사용하여 테스트되었다. Lm-대조군은, 모든 면에서 동일했지만 비관련 항원(HPV16-E7)을 발현하는 LmddA 백그라운드에 기초하였다. (도 21b) 면역화 FVB/N 마우스 유래의 비장세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비된 IFN-γ를, 미토신 C 처리된 NT-2 세포로의 시험관내 자극 24시간 후에, ELISA에 의해 측정하였다. (도 21c) 단백질의 상이한 영역들로부터 펩티드의 시험관내 인큐베이션에 반응하여 키메라 백신으로 면역화된 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 유래의 비장세포에 의한 IFN-γ 분비. 재조합 ChHer2 단백질이 양성 대조군으로서 사용되었으며, 비관련 펩티드 또는 펩티드가 없는 그룹이 도면 설명에 열거된 바와 같이 음성 대조군을 구성하였다. IFN-γ 분비는 공-접종 72시간 후에 채취한 세포 배양 상등액을 사용하여 ELISA 분석으로 검출하였다. 각 데이터 포인트는 삼중 데이터 평균 +/- 표준 편차였다. * P 값 < 0.001.
도 22. 리스테리아-ChHer2/neu 백신에 대한 종양 예방 연구 Her2/neu 형질전환 마우스는 각각 재조합 리스테리아-ChHer2 또는 대조 리스테리아 백신으로 6 회 주입되었다. 면역화는 6주령에 시작하였고 21주까지 매 3주마다 지속하였다. 종양의 외관은 매주 측정되었으며 종양이 없는 마우스의 백분율로서 표현되었다. *p < 0.05, 그룹 당 N = 9종.
도 23. ADXS31-164 면역화가 비장의 Treg의 %에 미치는 효과. FVB/N 마우스는 1 x 106 NT-2 세포로 s.c. 접종되었고 1 주 간격으로 각각의 백신으로 3 회 면역화되었다. 비장은 2차 면역화 후 7일째에 채취하였다. 면역 세포를 분리한 후, 항 CD3, CD4, CD25 및 FoxP3 항체에 의한 Treg 검출을 위해 이들을 염색하였다. 상이한 치료 그룹에 걸쳐 전체 CD3+ 또는 CD3+CD4+ T 세포의 백분율로서 표시되는, CD25+/FoxP3+ T 세포의 빈도를 보여주는 대표적인 실험으로부터의 Treg의 점-플롯.
도 24a 및 도 24b. ADXS31-164 면역화가 NT-2 종양의 종양 침윤 Treg의 %에 미치는 효과. FVB/N 마우스는 1 x 106 NT-2 세포로 s.c. 접종되었고 1 주 간격으로 각각의 백신으로 3 회 면역화되었다. 종양은 2차 면역화 후 7일째에 채취하였다. 면역 세포를 분리한 후, 항 CD3, CD4, CD25 및 FoxP3 항체에 의한 Treg 검출을 위해 이들을 염색하였다. (도 24a ). 대표적 실험으로부터 Treg의 점-플롯. (도 24b). 상이한 치료 그룹에 걸쳐 총 CD3+ 또는 CD3+CD4+ T 세포의 백분율(좌측 패널) 및 종양내 CD8/Tregs 비율(우측 패널)로서 표현되는, CD25+/FoxP3+ T 세포의 빈도. 데이터는 2회의 독립 실험으로부터 수득된 평균±SEM으로서 도시된다.
도 25a-25c. ADXS31-164의 백신접종은 뇌에서의 유방암 세포주의 성장을 지연시킬 수 있다. Balb/c 마우스는 ADXS31-164 또는 대조 리스테리아 백신으로 3 회 면역화하였다. EMT6-Luc 세포(5,000)를 마취된 마우스에 두개 내 주입하였다. (도 25a) 마우스의 생체외 이미지화는 Xenogen X-100 CCD 카메라를 사용하여 표시된 일자에 실시되었다. (도 25b) 픽셀 밀도는 표면적 cm2 당 초 당 광자 수를 그래프로 나타냈고; 이는 평균 방사 휘도로 표시된다. (도 25c) EMT6-Luc 세포, 4T1-Luc 및 NT-2 세포주에 의한 Her2/neu의 발현은 항-Her2/neu 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯으로 검출되었다. 뮤린 대식세포 유사 세포주인 J774.A2 세포를 음성 대조로 사용하였다.
도 26a 내지 도 26c는 재조합 리스테리아 단백질 미니유전자 구축물의 도식적인 맵을 나타낸다. (도 26a)는 오브알부민 유래 SIINFEKL 펩티드(서열번호 75)를 생성하는 구축물을 나타낸다. (도 26b)은 GBM 유래 펩티드가 PCR 클로닝에 의해 SIINFEKL 대신 도입된 유사한 재조합 단백질을 나타낸다. (도 26c)는 리스테리아 균주 유래의 4개의 개별 펩티드 항원들을 발현하도록 설계된 구축물을 나타낸다.
도 27. (도 27)에 도시된 플라스미드 pAdv211, pAdv223 및 pAdv224를 생성하기 위한 플라스미드 백본 pAdv142 (도 11c 참조) 중의 상이한 ActA PEST 영역의 클로닝을 나타내는 개략도. 본 개략도는 상이한 ActA 코딩 영역이 XbaI 및 XhoI로 제한된 백본 플라스미드 pAdv142에서 리스테리올린 O 신호 서열로 프레임 내에 클로닝되었음을 나타낸다.
도 28a-28b. (도 28a) 이식 가능한 종양 모델로서 TPSA23을 사용한 종양 퇴행 연구. 8 마리의 마우스로 구성된 3개의 그룹에 1 x 106 종양 세포를 0일차에 이식하고, 6일, 13일 및 20일차에 하기의 다른 요법들의 108 CFU를 처치하였다: LmddA142, LmddA211, LmddA223 및 LmddA224. 미처리 마우스에게는 아무런 처치를 하지 않았다. 종양을 매주 모니터링하고 평균 종양 직경이 14-18 mm이면 마우스를 희생시켰다. 그래프의 각각의 심볼은 개별 마우스의 종양 크기를 나타낸다. 실험을 2회 반복하여 유사한 결과를 얻었다. (도 28b) 실험의 상이한 날짜별 미처리 마우스와 면역화된 마우스의 생존 백분율.
도 29a-29b. PSA 특이적 면역 반응을 IFN-γ에 대한 4량체 염색(도 29a) 및 세포내 사이토카인 염색(도 29b)으로 검사하였다. 마우스에게 매주 간격으로 3주 동안 하기 다른 요법의 108 CFU로 면역화하였다: LmddA142 (ADXS31-142), LmddA211, LmddA223 및 LmddA224. 면역 분석을 위해 2차 추가 투여 후 6일차에 비장을 채취하였다. 본 실험을 위해 그룹당 2마리의 마우스로부터 채취한 비장을 모았다. (A) PSA-에피토프 특이적 4량체 염색을 사용해 미처리 마우스, LmddA142, LmddA211, LmddA223 및 LmddA224 면역화된 마우스의 비장 내 PSA 특이적 T 세포를 검출하였다. 세포를 마우스 항-CD8 (FITC), 항-CD3 (Percp-Cy5.5), 항-CD62L (APC) 및 PSA 4량체-PE로 염색하고 FACS Calibur로 분석하였다. (도 29b) 5 시간 동안 PSA 특이적, H-2Db 펩티드(HCIRNKSVIL) 1μM으로 자극한 후, 미처리 마우스 및 면역화된 마우스에서 IFN-γ 분비 CD8+ CD62Llow 세포의 백분율을 검출하기 위한 세포 내 사이토카인 염색.
도 30a-30c. 종양 모델 TPSA23은 ActA/PEST2(LA229) 융합된 PSA 및 tLLO 융합된 PSA를 사용하여 C57BL6 마우스의 면역 반응 생성을 연구하는데 사용되었다. 5 마리의 마우스로 구성된 4개의 그룹에 1 x 106 종양 세포를 0일차에 이식하고, 6일 및 14일차에 하기의 다른 요법들의 108 CFU를 처치하였다: LmddA274, LmddA142 (ADXS31-142) 및 LmddA211. 미처리 마우스에게는 아무런 처치를 하지 않았다. 마지막 면역화 후 6일차에 각각의 마우스로부터 비장과 종양을 채취하였다. (도 30a) 표는 면역화 후 13일차에 종양의 부피를 나타낸다. PSA 특이적 면역 반응을 비장(도 30b) 및 종양(도 30c)에서의 5량체 염색으로 검사하였다. 면역 분석을 위해서, 그룹당 마우스 2마리 또는 3마리의 비장을 모으고, 그룹당 마우스 5마리의 종양을 모았다. 세포를 마우스 항-CD8 (FITC), 항-CD3 (Percp-Cy5.5), 항-CD62L (APC) 및 PSA 5량체-PE로 염색하고 FACS Calibur로 분석하였다.
도 31a-31c. SOE 돌연변이 유발 전략. LLO의 독성을 감소/낮추는 것은 LLO의 4번째 도메인을 돌연변이화하여 달성되었다. (도 31a-31b). 이 도메인은, 올리고머화되어 기공을 형성하는 막에 결합할 수 있도록하는 콜레스테롤 결합 부위를 포함한다. 도 31c는 전장 LLO(rLLO529)의 단편을 나타낸다. 재조합 LLO, rLLO493은 아미노산 1-493(신호 서열 포함)에 걸친 LLO N-말단 단편을 나타낸다. 재조합 LLO, rLLO482는 아미노산 1-482(신호 서열 포함)에 걸친 LLO 단편(콜레스테롤 결합 도메인의 결실 및 아미노산 483-493 포함)을 나타낸다. 재조합 LLO, rLLO415는 아미노산 1-415(신호 서열 포함)에 걸친 N-말단 LLO 단편(콜레스테롤 결합 도메인의 결실 및 아미노산 483-493 포함)을 나타낸다. 재조합 LLO, rLLO59-415는 아미노산 59-415(콜레스테롤 결합 도메인 제외)에 걸친 N-말단 LLO 단편을 나타낸다. 재조합 LLO, rLLO416-529는, 아미노산 416-529에 걸쳐있고 콜레스테롤 결합 도메인을 포함하는 N-말단 LLO 단편을 나타낸다.
도 32a 및 도 32b. 쿠마시(Coomassie) 염색에 의한 돌연변이 LLO 단백질의 발현은 도 32a에 도시되고, 웨스턴 블롯에 의한 것은 도 32b에 도시된다.
도 33a 및 도 33b. 히스토그램은 pH 5.5(도 33a) 및 pH 7.4(도 33b)에서 돌연변이 LLO(mutLLO 및 ctLLO) 단백질의 용혈 활성을 도시하는 데이터를 나타낸다
도 34. PAK6이 tLLO와의 융합 단백질로서 발현되는 PAK6 구축물(7605 bp)의 플라스미드 맵. PAK6에 대한 개략적인 플라스미드 맵. 플라스미드는 리스테리아(Rep R) 및 복제 원점인 대장균(Escherichia coli)(p15)의 둘 모두를 함유한다. 검은 화살표는 전사의 방향을 나타낸다. 바실러스 서브틸러스 dal 유전자는 D-알라닌의 합성을 보완한다. 항원 발현 카세트는 hly 프로모터, 절단된 LLO를 위한 ORF 및 인간 PAK6 유전자로 구성된다.
도 35. 서열번호 78에 기재된 PAK6의 핵산 서열.
도 36. 서열번호 79에 기재된 PAK6의 아미노산 서열.
도 37a. 종양 시퀀싱 및 DNA 생성 작업 유동에 대한 일반적인 개요.
도 37b. DNA 클로닝 및 면역 요법 제조 작업 유동에 대한 일반적인 개요.
도 38. 맞춤형 면역 요법 조성물의 병행 제조를 위해 배치된 완전 밀폐형 일회용 세포 성장 시스템의 클러스터 다이어그램.
도 39. 완전 밀폐형 일회용 세포 성장 시스템의 접종 및 발효 세그먼트에 대한 세부 다이어그램.
도 40. 완전 밀폐형 일회용 세포 성장 시스템의 농축 세그먼트에 대한 세부 다이어그램.
도 41. 완전 밀폐형 일회용 세포 성장 시스템의 정용여과 세그먼트에 대한 세부 다이어그램.
도 42. 완전 밀폐형 일회용 세포 성장 시스템의 제품 분배 세그먼트에 대한 세부 다이어그램.
도 43a. 면역 요법의 효능을 향상시키기 위해 네오-에피토프의 연속적인 선택을 사용하는 공정 다이어그램.
도 43b. 다수의 네오-에피토프의 병행 선택을 사용하는 공정 다이어그램.
도 44. 발효 배지 제조 공정을 나타낸다
도 45. 1M 수산화 나트륨 (NaOH) 용액 제조 공정을 나타낸다.
도 45. 세척 완충액 제조 공정을 나타낸다.
도 46. 공정 흐름: 접종 백(bag) 제조
도 47. 본원에 개시된 리스테리아 구축물의 발효를 수행하기 위한 공정을 나타낸다.
도 48. 접선 유동 여과 및 충진을 설정하고 수행하기 위한 공정을 나타낸다.
도 49. 본원에 개시된 리스테리아 구축물의 완전한 제조 공정을 나타낸다.
도 50. 제조 시스템을 사용하여 면역 요법 조성물을 제조하기 위한 공정을 나타낸다.
도 51a-51c. 본원에 논의된 일부 구현예에 따른 접선 유동 여과 (TFF) 매니폴드를 나타낸다. 도 51a는 TFF 매니폴드를 나타내고 도 51b는 TFF 매니폴드의 일부 부분의 설명을 나타낸다. 도 51c는 본원에 논의된 일부 구현예에 따른 또 다른 TFF 매니폴드를 나타낸다.
도 52. TFF 매니폴드와 연결될 수 있는 예시적인 충진 매니폴드를 나타낸다.
도 53. 하나 이상의 백(bag)에서 최종 산물을 수집하는데 사용되는 충진 매니폴드를 나타낸다.
도 54. 도 51a 내지 도 53의 표지에 대한 설명을 나타낸다.
도 55. 몇 가지 예시적인 구현예에 대한 레이놀즈 수, 펌프 유속, 섬유 계수, 속도, 동점도, 유동/섬유, 유닛(unit) 길이, 내부 직경, 섬유 부피, 및 전이 시간, 특징적인 길이를 비교한 표를 나타낸다.
예시의 단순성 및 명확성을 위해, 도면들에 도시된 요소들이 반드시 일정한 비율로 도시되지 않았음은 이해될 것이다. 예를 들어, 상기 요소들의 일부의 치수들은 명확성을 위해 다른 요소들에 비해 과장될 수 있다. 또한, 적절하다고 인정되는 경우, 참조 부호들은 대응하거나 유사한 요소들을 나타내기 위해 도면들에 반복될 수도 있다.
하기 상세한 설명에서, 많은 특정 세부사항들은 본 발명의 완벽한 이해를 제공하기 위해 진술된다. 그러나, 본 개시는 이들 특정 세부사항 없이도 실시될 수 있음을 숙련자라면 이해할 것이다. 다른 예에서, 주지의 방법, 절차 및 요소는 본 개시를 불명료하게 하지 않도록 상세하게 설명되지 않았다.
완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템 및 제조 공정
일 구현예에서, 질환 또는 상태를 갖는 대상에게 투여하기 위한 맞춤형 면역 요법 조성물의 제조 공정이 개시되며, 여기서 상기 맞춤형 면역 요법 조성물은 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하고, 여기서 상기 리스테리아 균주는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 개방형 해독 프레임을 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 상기 공정은
질환 또는 상태를 갖는 대상의 질병 샘플에서 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 수득 및 확인하는 단계;
상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 약독화된 리스테리아 균주를 안정적으로 형질감염시키는 단계;
상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 발현하는 리스테리아 클론을 수득하는 단계;
상기 리스테리아 클론을 소정의 규모로 확장시키는 단계;
상기 확장된 리스테리아 클론을 정제하는 단계;
성장 배지를 제형화 완충액으로 대체하는 단계;
상기 리스테리아 클론을 수확하는 단계,
상기 수확된 리스테리아 클론을 소정의 농도를 갖는 용액 중에 희석하는 단계; 및
후속 보관 또는 대상에게 투여하기 위해, 상기 수확된 리스테리아 클론 용액을 단일 투여량 용기에 분배하는 단계를 포함한다.
여기서, 단계 c 내지 i는 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템에서 수행된다.
또 다른 구현예에서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 접종 섹션, 발효 섹션,농축 섹션/ 정용여과(도 51a 내지 15b) 섹션, 및 제품 분배 섹션을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 통합된 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 개시는 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템이고, 여기서 상기 시스템은 하나 이상의 일회용 교반된 생물반응기를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 제품 분배 섹션은 대상에게 즉각적인 투여 또는 대안적으로 후속 배송 및 보관을 위한 동결에 사용될 수 있는 단일 투여량 크기의 제품 용기를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 개시는 단일 대상 크기의 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 공정은 동일한 대상 또는 상이한 대상을 위한 다수의 맞춤형 면역 요법 조성물을 병행하여 제조하기 위한 몇몇 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 동시 사용을 가능케 한다.
또 다른 구현예에서, 상기 질환 또는 상태는 감염성 질병 또는 종양 또는 암을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 것는 완전히 밀폐된 일회용 제조 시스템을 사용하여 맞춤형 면역 요법 조성물을 제조하는 확장가능한 능률적인 공정이다 (도 50 참조).
일 구현예에서, 상기 공정은 질환 또는 상태를 갖는 대상의 질병 샘플에서 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 확인하는 단계; 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 약독화된 리스테리아 균주를 안정적으로 형질감염시키는 단계; 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 발현하는 리스테리아 클론를 수득하는 단계; 상기 리스테리아 클론을 소정의 규모로 확장시키는 단계; 상기 확장된 리스테리아 클론을 정제하는 단계; 성장 배지를 제형화 완충액으로 대체하는 단계; 상기 리스테리아 클론을 수확하는 단계; 상기 수확된 리스테리아 클론을 소정의 농도를 갖는 용액 중에 희석하는 단계; 및 수확된 리스테리아 클론 용액을 후속 보관 또는 대상에게 투여하기 위한 단일 투여량 용기에 분배하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 확장, 정제, 성장 배지 교체, 수확, 희석 및 분배 단계는 본원에 개시된 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템/일회용 제조 시스템에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 통합된 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 포함한다.
일 구현예에서, 개시된 일회용 제조 시스템은 제조 공정이 완료되면 폐기되는 제품 용기 이외에 상기 통합된 완전히 밀폐된 유체 유동 경로의 구성성분을 포함한다.
본 개시에 따른 제조 시스템은 다음의 섹션을 포함한다: 접종 섹션, 발효 섹션, 농축 / 정용여과 섹션 (도 51a 내지 51b 참조), 및/또는 제품 분배 섹션, 이들 모두는 본원에 개시된 리스테리아 균주의 제조 공정에서 사용된다.
일 구현예에서, 상기 제조 공정은 도 50에 나타난 바와 같이 수행된다. 일 구현예에서, 상기 제조 공정의 시작 단계에서, 배지/완충액이 제조되고 리스테리아 구축물을 함유하는 콜로니가 플레이트로부터 피킹되어 소정의 부피의 발효 배지에 접종되어 (접종에 적절한 용기에서) 제1 예비 배양물 (PC1)이 형성된다. PC1의 인큐베이션 후에, PC1의 목적 부피를 수득함으로써 배양물의 크기를 키우고 보다 큰 소정의 부피의 발효 배지에 접종하여 (인큐베이션에 적절한 용기에서) 제2 예비 배양물 (PC2)이 형성된다. 또 다른 구현예에서, 소정의 부피는 10 ml 내지 300 ml의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, PC1에 대한 소정의 부피는 10 ml이다. 또 다른 구현예에서, PC2에 대한 소정의 부피는 190 ml이다. 또 다른 구현예에서, 배양물 (PC1, PC2)은 밤새 인큐베이션 되거나 박테리아, 특히 리스테리아 종의 성장/인큐베이션에 적절한 당업계에 공지된 조건에 있다.
또 다른 구현예에서, PC2의 인큐베이션 후에, 소정의 부피의 PC2는 하나 이상의 접종물 백에 충진된다. 또 다른 구현예에서, PC2의 인큐베이션 후에, 소정의 부피의 PC2는 4개의 접종물 백에 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 최대 250 ml까지 보유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 최대 1 L까지 보유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 최대 5 L까지 보유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 25 ml의 PC2로 충진되고 최대 100 ml까지 발효 배지로 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 1 내지 10 ml의 PC2로 충진되고 최대 50 내지 250 ml까지 발효 배지로 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 1 내지 20 ml의 PC2로 충진되고 최대 50 내지 250 ml까지 발효 배지로 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 1 내지 40 ml의 PC2로 충진되고 최대 100 내지 500 ml까지 발효 배지로 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 1 내지 50 ml의 PC2로 충진되고 최대 100 내지 500 ml까지 발효 배지로 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 1 내지 100 ml의 PC2로 충진되고 최대 150 내지 500 ml까지 발효 배지로 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 접종물 백과 같은 보다 큰 부피의 용기에서 확장 또는 크기 증가에 적절한 바람직한 부피의 PC2로 충진된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 접종물 백은 소정의 보다 큰 부피의 발효 배지를 갖는 보다 큰 부피의 용기에서 확장 또는 크기 증가에 적절한 바람직한 부피의 PC2로 충진된다.
일 구현예에서, 본원의 일 구현예에서 “의약품”또는 “제품”으로 지칭되는 확장된 리스테리아 클론을 함유하는 접종물 백은 향후 사용을 위해 -70 내지 -80℃에서 동결될 수 있다.
또 다른 구현예에서, PC2 인큐베이션 후에, 소정의 부피의 PC2가 발효 공정의 개시를 위해 세포 백 생물반응기 내에 충진된다 (도 50). 또 다른 구현예에서, 발효 공정은 제조 시스템의 발효 섹션에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 발효 섹션은 세포 백 생물반응기를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 제조 시스템의 모든 섹션 또는 구성성분은 발효, 농축 섹션, 정용여과, 및 제품 분배를 가능케 하기 위해 접종 섹션으로부터 단일의 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 생성하도록 작동가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제조 시스템은 유체 유동이 농축 및 정용여과 섹션을 포함하는 잔류물 백을 경유하도록 하는 추가의 커넥터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제조 시스템은 농축 및 정용여과 섹션으로부터 접종 또는 발효 섹션까지 복귀 유체 연결부를 추가로 포함하여 성장 배양물이 추가로 성장되도록 재순환되도록 한다.
일 구현예에서, 상기 유체 연결부는 유체 도관을 포함한다. 적절한 도관은 가요성 또는 비가요성 금속 도관 또는 가요성 또는 비가요성 비금속 도관을 포함할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 상기 금속 도관은 강철, 구리, 황동 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 금속으로부터 제조될 수 있다. 상기 비금속 도관은 고무, 플라스틱 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 유기 또는 무기 중합체로부터 제조될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유체 도관 가요성 비금속 도관이다. 또 다른 구현예에서, 유체 도관은 PVC 또는 PIV 관 라인이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 다양한 섹션을 연결하는 유체 도관은 함께 밀봉되어 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 형성한다. 도관은 멸균 용접, 멸균 관 커넥터, 또는 일부 구현예에서는 일회용 무균 커넥터를 사용하여 밀봉될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 일회용 무균 커넥터는 비-무균 환경에서 건조 대 건조 연결을 할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 일회용 무균 커넥터의 사용은 멸균 용접의 사용을 크게 감소시키고 추가로 또 다른 공정 단계 (즉 바이알 충진)를 제거한다. 다른 구현예에서, 도관은 당업계에 알려져 있는 임의의 방법을 이용하여 밀봉된다.
일 구현예에서, 본 개시는 또한 본원에 개시된 제조 시스템의 모든 유체 연결부에서의 유체 유동 차단 수단이며, 따라서 상기 시스템의 하나 이상의 섹션의 유체 격리를 제공한다. 일 구현예에서, 유체 유동 차단의 수단은 일회용 밸브이다. 또 다른 구현예에서, 유체 유동 차단의 수단은 클램프이다. 상기 클램프는 롤러 클램프, 핀치 클램프 또는 당업계에 공지된 임의의 클램프일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유체 유동 차단의 수단은 당업계에 공지된 임의의 이러한 수단이다.
본 개시는 제조 시스템의 다양한 섹션 사이에 유체 전달을 추가로 제공한다. 유체 전달은 일 구현예에서 자연 중력 유동에 의해 작동될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유체 전달은 펌프와 같은 기계적 수단에 의해 작동될 수 있다. 적절한 펌프가 당업계에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로 원심 펌프, 공기 펌프 및 피스톤 펌프를 포함한다. 일 구현예에서, 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템 내의 유체는 연동 펌프에 의해 작동된다.
본원의 발명에 따르면, 본원에 개시된 제조 공정 중의 하나 이상의 단계는 일정한 소정의 온도에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 제조 공정의 모든 단계는 일정한 소정의 온도에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 제조 공정의 접종 및 성장 단계는 일정한 소정의 온도에서 수행된다. 일 구현예에서, 상기 온도는 약 37 ℃에서 유지된다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 37 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 25 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 27℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기온도는 28 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 30 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 32 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 34 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 35℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 36 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 38 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 39 ℃이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일 구현예에서, 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 접종 섹션은 상기 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 발효 섹션에 작동가능하게 연결된 접종 용기를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 접종 용기는 플라스틱 플라스크이다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 플라스틱 바이알이다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 플라스틱 앰플이다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 유체 백이다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 접종 포트를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 접종 용기는 약 5 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 10 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 15 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 20 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 25 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 30 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 35 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 40 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 45 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기는 약 50 ml의 최대 부피를 갖는다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일 구현예에서, 접종 용기는 재조합 약독화된 리스테리아 균주의 배양물로 충진되고, 여기서 상기 리스테리아 균주는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 개방형 해독 프레임을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 리스테리아 균주는 영양 배지 중에 재현탁된다. 또 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 제형화 완충액 중에 재현탁된다. 또 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 동결 저장 용액 중에 재현탁된다.
일 구현예에서, 접종 용기 중의 영양 배지는 박테리아 배양물의 성장에 사용된 배지와 동일하다. 또 다른 구현예에서, 접종 용기 중의 영양 배지는 박테리아 배양물의 성장에 사용된 배지와 상이하다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 접종 용기를 제외하고 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 모든 섹션에 멸균을 제공한다. 약학적 제조 기구의 멸균에 적절한 방법은 증기 멸균, 건조 열 멸균, 및 기체 멸균을 포함할 수 있음이 당업자에게 의해 이해될 것이다. 일 구현예에서, 완전히 밀폐된 성장 시스템은 이온화된 방사선으로의 노출을 통해 멸균된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 면역 요법 조성물의 제조 공정의 개시를 위해 접종 용기의 내용물을 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 발효 섹션에 전달하는 것을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 접종 분획 및 발효 분획 모두는 전달 전에 소정의 일정한 온도로 가온된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일 구현예에서, 상기 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 발효 섹션은 하나 이상의 교반된 생물반응기를 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 교반된 생물반응기는 웨이브 혼합된 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 교반된 생물반응기는 교반된 탱크 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 교반된 생물반응기는 기계적으로 진탕된 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 교반된 생물반응기는 당업계에 공지된 임의의 다른 유형의 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 교반된 생물반응기는 락커-교반된 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 교반된 생물반응기는 락커 백 미생물 성장 시스템이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일 구현예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 생물반응기 각각은 접종 분획 및 농축 / 정용여과 섹션 및/또는 제품 분배 섹션에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발효 용기를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 발효 용기는 플라스틱 용기이다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 발효 용기는 조직 배양 백이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 발효 용기는 약 100 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 약 150 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 200 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 250 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 300 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 350 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 약 400 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 약 450 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 발효 용기는 약 500 ml의 최대 부피를 갖는다.
일 구현예에서, 각각의 생물반응기는 하나 이상의 발효 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 생물반응기는 하나 초과의 발효 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 생물반응기는 적어도 2개의 발효 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 생물반응기는 적어도 3개의 발효 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 생물반응기는 적어도 4개의 발효 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 생물반응기는 4개 초과의 발효 용기를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 발효 용기는 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 샘플링 포트는 샘플링 용기 및 발효 용기에 대한 유체 도관을 포함하고, 상기 샘플링 용기는 샘플링 루어를 포함하고, 상기 유체 도관은 샘플링 용기를 발효 용기로부터 격리시키기 위해 도관을 영구적으로 밀봉하기 위한 수단을 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.1 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.2 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.3 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.4 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.5 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.6 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.7 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.8 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 0.9 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 각각의 샘플링 용기는 약 1 ml의 최대 부피를 갖는다.
일 구현예에서, 각각의 발효 용기는 하나의 샘플링 포트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 발효 용기는 하나 초과의 샘플링 포트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 발효 용기는 적어도 2개의 샘플링 포트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 발효 용기는 적어도 3개의 샘플링 포트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 발효 용기는 적어도 4개의 샘플링 포트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 각각의 발효 용기는 4개 초과의 샘플링 포트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 모든 샘플링 포트는 일회용 포트이다.
샘플링 포트는 품질 시험 및 순도를 위한 샘플의 수집을 위한 샘플링 백 매니폴드 (도 52 참조)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 샘플은 모양, 생존 세포 계수 (VCC), 리스테리아 균주 내의 actA 유전자의 부재 (PCR, 단백질의 경우 웨스턴 블롯 등을 통함), SIINFEKL 펩티드 태그의 존재 (항원 제시를 시험하기 위함)를 결정하고, 콜로니 PCR 및 모노셉시스 (순도) 분석을 수행하기 위해 수집된다.
또 다른 구현예에서, 샘플은 간헐적으로 수집된다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60분마다 수집된다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 2시간 마다, 3시간 마다, 4시간 마다, 또는 5시간 마다 수집된다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 샘플링에서 1 내지 60분마다 수집된다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 샘플링에서 1 내지 10시간 마다 수집된다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 임의의 하나의 구현예에 명시된 바와 같이 간헐적으로 그리고 최종 광학 밀도 (OD) 샘플링이 수행될 때까지 수집된다.
또 다른 구현예에서, 샘플링 백은 5-100 ml, 101-200 ml, 201-300 ml 401-500 ml, 또는 501-1000 ml의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 샘플링 백은 25 ml의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 샘플링 백은 100 ml의 부피를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 발효 용기는 영양 배지로 충진되고 접종물이 접종 분획으로 전달되기 전에 소정의 온도로 미리 가온된다. 또 다른 구현예에서, 리스테리아 균주의 배양물을 성장시키기 위해 사용되는 영양 배지는 리소제니 브로쓰 (LB) 배지이다. 또 다른 구현예에서, 영양 배지는 테리픽 브로쓰 (TB) 배지이다. 또 다른 구현예에서, 영양 배지는 트립틱 대두 브로쓰 (TSB)이다. 또 다른 구현예에서, 영양 배지는 한정 배지이다. 또 다른 구현예에서, 영양 배지는 본원에 개시된 한정 배지이다. 또 다른 구현예에서, 영양 배지는 당업계에 공지된 임의의 다른 유형의 영양 배지이다.
또 다른 구현예에서, 일정한 pH가 배양물의 성장 동안 유지된다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7.0으로 유지된다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6.5이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7.5이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 8이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6.5-7.5이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6-8이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 6-7이다. 또 다른 구현예에서, pH는 약 7-8이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일구현예에서, 재조합 약독화된 리스테리아 균주의 배양물은 OD600이 소정의 값에 도달할 때까지 성장된다. 일 구현예에서, OD600은 약 0.7 유닛이다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 0.8 유닛의 OD600을 갖는다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.7 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.8 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD60은 약 0.6 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.65 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.75 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.85 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.9 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.6-0.9 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.65-0.9 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.7-0.9 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.75-0.9 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.8-0.9 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.75-1 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 0.9-1 유닛이다. 다른 구현예에서, OD600은 1 유닛보다 더 크다.
또 다른 구현예에서, OD600은 1 유닛보다 유의하게 더 크다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 7.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.2 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 6 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 6.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 7 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 8 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 9 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 9.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 10 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 10 초과 유닛이다.
또 다른 구현예에서, OD600은 약 1-2 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.5-2.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2-3 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2.5-3.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3-4 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3.5-4.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4-5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4.5-5.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5-6 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5.5-6.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1-3 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.5-3.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2-4 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2.5-4.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3-5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4-6 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5-7 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2-5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3-6 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4-7 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5-8 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.2-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.5-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2.5-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3.5-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4.5-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5.5-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 6-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 6.5-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 7-7.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 10 초과 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.2-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 1.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 2.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 3.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 4.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 5.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 6-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 6.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 7-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 7.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 8-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 약 9.5-8.5 유닛이다. 또 다른 구현예에서, OD600은 10 유닛이다.
또 다른 구현예에서, 재조합 약독화된 리스테리아 균주의 배양물은 배양물의 바이오매스가 소정의 값에 도달할 때까지 성장된다. 일 구현예에서, 바이오매스는 약 1 x 109 콜로니-형성 단위 (CFU)/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 1.5 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 1.5 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 2 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 3 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 4 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 5 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 7 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 9 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 10 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 12 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 15 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 20 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 25 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 30 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 33 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 40 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 50 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 50 x 109 CFR/ml 초과이다.
접선 유동 여과 매니폴드
일 구현예에서 재조합 약독화된 리스테리아의 배양물이 소정의 OD600 또는 바이오매스에 도달한 경우, 배양물은 이어서 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 농축 및 정용여과 분획에 전달된다.
도 51a 내지 51c를 참조하면, 일부 구현예예서, 개시된 제조 시스템의 농축 및 정용여과 섹션은 “접선 유동 여과 매니폴드”로 지칭된다. 일 구현예에서, 농축 및 정용여과 섹션은 잔류물 용기(1)로도 지칭되는 농축된 배양물 용기, 하나 이상의 필터(23) 및 투과물 용기(2)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 농축 및 정용여과 섹션은 발효 섹션의 하나 이상의 발효 용기에 상기 농축된 배양물 용기(1)를 연결하는 하나 이상의 유체 도관(5) (예컨대, 5A-5Q, 일반적으로 "5"로 지칭됨)을 추가로 포함한다 (도 50 참조). 또 다른 구현예에서, 잔류물(1)과 발효 용기 사이의 도관(5)의 각각의 유체는 클램프(17) 또는 핀치 밸브(20)와 같이 유체 유동을 영구적으로 차단하는 수단을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 농축 섹션은 상기 하나 이상의 필터(23)에 잔류물 용기(1)를 연결하는 하나 이상의 유체 도관(5)을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 잔류물 용기(1)를 연결하는 유체 도관(5) 및 상기 필터(23)는 잔류물 용기(1)에서 필터(23)까지 (예컨대, 도관 5A 및 5B를 통해) 그리고 반대로 필터(23)에서 잔류물 용기(1)까지 (예컨대, 도관 5D, 5E, 및 5F를 통해) 루프를 형성하여, 필터와 잔류물 용기 사이에 재순환 루프를 형성한다. 유체를 잔류물 백(1)에서 필터(23)로 운송하는 유체 도관 5A, 5B(예컨대, 도 51a에 나타난 구현예에서 반시계방향 루프에서)는 선택적으로 연동 펌프(40)와 같은 유동 작동기를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 필터(23)에서 다시 잔류물 백(1)으로 유체를 전달하는 유체 도관 5C, 5D, 5E는 밸브(20) 또는 클램프(17)와 같은 유체 유동을 차단하는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 필터(23)는 필터 어레이 내에 배열되고, 여기서, 일 구현예에서, 상기 필터는 직렬로 배열되거나, 또 다른 구현예에서, 상기 필터는 병렬로 배열된다.
계속해서 도 51a 내지 51c를 참조하면, 잔류물 백(1)은 하나 이상의 도관(5)과의 결합, 혼합물의 순환, 및 하기 정용여과 완충액의 도입을 허용하는 복수의 무균 개구를 포함할 수 있다. 잔류물 백(1)은 혼합물이 잔류물 백으로부터 인출되는 재순환 배출구(P3), 필터(23)를 통과한 후에 잔류 혼합물이 잔류물 백에 재도입 되는 재순환 유입구(P5), 완충액이 도입될 수 있는 정용여과 유입구(P11) (도 51a의 세부사항 C에 나타나 있음)를 포함할 수 있다. 잔류물 백(1) 및/또는 투과물 백(2)은 각각의 백 내의 압력을 동일하게 하기 위한 공기 교환 장치(22)를 추가로 포함할 수 있다. 공기 교환 장치(22)는 유입되는 공기를 정화하고 유출을 방지하기 위한 하나 이상의 밸브 및 필터를 포함할 수 있다. 잔류물 백(1)은 작동 중에 온도계를 수용하기 위한 온도계 포트 (P10)를 추가로 포함할 수 있다. 도 51c를 참조하면, 일부 구현예에서, 온도계(41)는 유체 순환 루프의 도관(4) 상에 배치될 수 있다. 본원에 상세하게 설명된 바와 같이, 잔류물 백(1)은 추가의 특징, 매니폴드, 또는 샘플링 장치를 위한 하나 이상의 추가의 포트(P1, P2, P9)를 포함할 수 있고, 유사하게, 투과물 백(2)은 유사한 공기 교환 장치, 샘플링 포트, 및 필터(23)가 연결될 수 있는 하나 이상의 포트(P6, P7, P8)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 클램프(8, 9, 17)는 이를 통한 유동을 제어하기 위한 농축 및 정용여과 시스템의 하나 이상의 도관(5) 상에 배치될 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 도 51a 내지 51c에 나타난 농축 및 정용여과 섹션은 농축 단계에서 구축물을 농축시키기 위해 구축물의 유동 혼합물로부터 배지를 제거할 수 있다. 도 51a, 51c에 도시된 구현예에서, 배지는 잔류물 용기(1)로부터, 도관(5)을 통해, 필터(23)를 지나서, 그리고 펌프(40)에 의해 잔류물 백(1)으로 되돌아 감으로써 잔류물 용기(1)로부터 펌핑됨에 따라 필터(23)(예컨대, 중공 섬유 필터)의 막을 통과하여 투과물 백(2)으로 통과한다. 오래된 배지를 분리함으로써, 잔류물 백(1) 및 도관(5)에 구축물을 유지하면서, 농축 및 정용여과 섹션은 구축물을 농축할 수 있다. 예컨대, 농축 및 정용여과 섹션은 구축물의 2배 농축을 수행할 수 있다. 필터는 도관(5)에서 유동 방향에 실질적으로 수직으로 배향된 적어도 하나의 필터 표면을 포함할 수 있으므로, 혼합물은 실질적으로 접선 방향으로 필터와 결합한다.
농축 및 정용여과 섹션은 잔류물 백(1)이 배치될 수 있는 스케일 (도시되지 않음)을 추가로 포함할 수 있다. 잔류물 백(1)의 초기 중량 및 농축 공정 중의 중량의 모니터링에 기초하여, 농도 변화는 제거된 배지의 중량에 기초하여 간접적으로 계산될 수 있다. 일부 구현예에서, 밸브(20)(예컨대, 스크류 밸브 또는 핀치 밸브)는, 도관(5)에서의 유동을 제한하고 필터(23)에서 도관(5)의 압력을 유지하기 위해 컴퓨터 조작된 작동기에 의해 또는 수동적으로 조정될 수 있다. 순환 시스템 중의 혼합물은 필터의 막을 통과하는 배지의 통과를 용이하게 하기 위해 소정의 압력 (예컨대, 3 psi)에서 유지될 수 있다. 도 51a 및 51c에 도시된 구현예에서, 압력 센서(예컨대, 도 51c에 도시된 압력 센서(12))는 필터(23)에서의 압력을 포함하여, 펌프(40)와 밸브(20) 사이의 시스템 내의 압력을 효과적으로 측정하기 위해 핀치 밸브(20)의 상류에 배치된다. 일 구현예에서, 필터 어레이는 하나의 필터(23)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 1개 초과의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 2개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 3개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 4개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 5개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 5개 초과의 필터 유닛을 포함한다.
일 구현예에서, 필터(23)는 유체, 예컨대 배지가 막을 통해 투과물 백(2)으로 통과하는 것을 허용하면서 잔류물 백(1)으로 재순환 루프 내의 박테리아를 보유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 필터는 추가적으로 거대입자, 예컨대 바이러스 입자 및 거대분자를 통과시킨다.
일 구현예에서, 필터는 적어도 약 0.01-100 μm2의 막 공극 크기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 정용여과를 통해 작동한다.
농축 섹션은 필터(23)를 투과물 용기(2) (예컨대, 백)에 연결하는 유체 도관(5C, 5G)을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유체 도관은 투과물 용기쪽으로 일방향으로의 유동을 허용하는 밸브 또는 클램프를 추가로 포함하고, 선택적으로 유동 작동기 예컨대 펌프를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1) 및 투과물 용기(2)는 플라스틱 용기이다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1) 및 투과물 용기(2)는 조직 배양 백이다.
일 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 100 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 150 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 200 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 250 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 300 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 350 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 400 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 450 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 농축된 배양물 용기(1)는 약 500 ml의 최대 부피를 갖는다.
일 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 100 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 150 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 200 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 250 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 300 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 350 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 400 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기는 약 450 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 500 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 600 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 700 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 800 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 900 ml 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 1 L의 최대 부피를 갖는다.또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 1.2 L 의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 1.4 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 1.6 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 1.8 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 약 2 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 투과물 용기(2)는 2 L 초과의 최대 부피를 갖는다.
일 구현예에서, 발효 섹션에서 잔류물 용기(1)로 옮겨진 개시된 배양 배지는 필터 어레이를 통해 순환되고, 필터(23)를 통과한 배지는 투과물 용기(2) 내로 회수되어, 배양물의 부피가 감소되고 배양물 내의 박테리아의 농도가 증가한다. 또 다른 구현예에서, 박테리아는 일회용 필터 어레이를 통해 단일 통과를 통해 농축된다. 일부 구현예에서, 필터(23)는 중공 섬유 필터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 여과 공정은 세포 농축물을 회수하기 위해 막투과 압력 정용여과를 사용한다. 이는 막투과 압력을 사용하는 다른 공정으로부터 본원에 개시된 공정을 구별할 수 있다.
일 구현예에서, 배양물 내의 박테리아의 최종 목표 농도는 약 1-109 박테리아/ml이다.
또 다른 구현예에서, 재조합 약독화된 리스테리아 균주의 배양물은 배양물의 바이오매스가 소정의 값에 도달할 때까지 농축된다. 일 구현예에서, 바이오매스는 약 7 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 9 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 10 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 12 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 15 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 20 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 25 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 30 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 33 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 40 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 약 50 x 109 CFR/ml이다. 또 다른 구현예에서, 바이오매스는 50 x 109 CFR/ml 초과이다.
추가의 구현예에서, 잔류물 용기는 발효 섹션 및/또는 농축 섹션의 샘플러 포트와 유사한, 샘플링 및 제품의 용기의 충진을 위한 하나 이상의 매니폴드 (예컨대, 도 52 내지 도 53에 도시된 매니폴드(39))를 연결하기 위한 적어도 하나의 선택적인 포트(P1, P2)를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 접선 유동 여과 매니폴드는 잔류물 용기, 하나 이상의 정용여과 유입구(P11)를 통해 잔류물 용기에 연결되도록 구성된 제형화 완충액; 하나 이상의 필터(23); 및 투과물 용기(2)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 농축 및 정용여과 섹션은 투과물 용기(2)를 농축 및 정용여과 섹션의 잔류물 용기(1)에 연결하는 유체 도관(5)을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 농축 및 정용여과 섹션은 잔류물 용기(1)를 상기 하나 이상의 필터(23)에 연결하는 하나 이상의 유체 도관(5)을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 잔류물 용기(1) 및 필터(23)를 연결하는 유체 도관은 유체를 잔류물 백(1)에서 필터(23)로 운반하도록 구성된 유동 직접적인 유체 도관(5) 및 유체를 필터로부터 다시 잔류물 백으로 운반하도록 구성된 역 유체 도관 모두를 포함하므로, 필터와 잔류물 용기 사이에 재순환 루프를 형성한다. 추가의 구현예에서, 상기 직접적인 유동 유체 도관은 선택적으로 연동 펌프와 같은 유동 작동기(40)를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 역 유동 유체 도관은 밸브(20) 또는 클램프(17)와 같이 유체 유동을 늦추거나 차단하는 수단을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 필터는 필터 어레이에 배열되고, 일 구현예에서, 상기 필터는 직렬로 배열되거나, 또 다른 구현예에서, 상기 필터는 병렬로 배열된다.
농축 공정 동안 구축물 생성물을 농축한 후에, 제품을 세척하고 오래된 배지를 완충 용액으로 대체하기 위해 정용여과가 수행될 수 있다. 정용여과 동안, 형성 완충액 용기는 하나 이상의 정용여과 유입구(P11)를 통해 잔류물 백(1)에 연결된다. 형성 완충액 용기 (예컨대, 백(28, 29)과 유사한 용기)는 도관(5M)을 통해 연결된 무균 커플링(11)을 정용여과 유입구(P11)에 연결할 수 있다. 연결되고 나면, 형성 완충액 용기는 완충액 (예컨대, 인산 완충된 식염수 (PBS) 완충액)을 제어된 속도로 잔류물 백(1) 내로 도입할 수 있다. 농축 및 정용여과 섹션은 필터(23)를 지나 혼합물을 계속 순환시켜 혼합물로부터 오래된 배지를 포함하여 유체를 제거할 수 있다. 완충액이 도입됨에 따라, 구조물의 전체 농축이 유지되면서 오래된 배지가 희석될 수 있다. 일부 구현예에서, 정용여과는 완충액을 잔류물 백(1)으로 압착 또는 펌핑함으로써 수동으로 제어될 수 있다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템 (예컨대, 일시적인 메모리와 결합된 제어기, 마이크로처리기 등)이 완충액 유입구를 제어할 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 수동 또는 컴퓨터화된 작동기는 잔류물 백(1)의 일정한 중량을 유지하기 위해 크기를 모니터링할 수 있다. 도 51c를 참조하면, 도관(5M)에 연결된 추가의 펌프(42)가 완충액을 공급하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 새로운 완충액이 첨가될 때 구축물의 적어도 일부가 농축되도록 정용여과가 대안적으로 농축 공정과 중첩될 수 있다.
일부 구현예에서, 완충액은 이후 동결 공정 동안 동결 손상으로부터 구축물을 보호하기 위해 동결방지제를 포함할 수 있다. 예컨대, 완충액은 2% 수크로오스를 포함할 수 있다. 일부 대안적인 구현예에서, 당업자에게 본 개시의 내용에 비추어 이해되는 바와 같이, 동결 방지 효과를 달성하기 위해 글리세롤, 글리콜 화합물, 및 다른 동결방지제와 같은 임의의 용액이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 재순환 배출구(P3), 재순환 유입구(P5), 및/또는 정용여과 유입구(P11)가 잔류물 백 내의 구축물의 침전을 방지하도록 배치될 수 있다. 예컨대, 도시된 구현예에서, 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11)는 작동 위치에서 잔류물 백(1)의 바닥 근처에 배치된다. 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11)는 잔류물 백(1)의 바닥에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11)는 잔류물 백(1) 내의 와류를 생성하고 침전을 방지하도록 서로 근접하게 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11)는 서로 1인치 미만으로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11)는 서로 2인치 미만으로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11)는 서로 3인치 미만으로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11)는 서로 4인치 미만으로 배치될 수 있다. 일부 대안적인 구현예에서, 재순환 유입구(P5)는 와류를 생성하기 위해 재순환 배출구(P3) 및 정용여과 유입구(P11) 중 적어도 하나에 근접하게 배치될 수 있다.
일부 구현예에서, 재순환 루프를 통한 유속은 결정된 유속에서 유지될 수 있다. 유속은 생물막 및 막힘의 형성을 방치하기에 충분히 높을 수 있고, 유속은 구축물의 전단 및 살상을 방지하기에 충분히 낮을 수 있다. 유속은 혼합물의 점도 및 필터 크기/유속 (예컨대, 중공 섬유 필터에서의 섬유 수)에 기초하여 실험적으로 설정될 수 있고, 레이놀즈 수에 의존한다. 일부 구현예에서, 유속은 순환 루프에서 난류를 야기하기에 충분히 높을 수 있으며, 상기 난류는 생물막 형성을 방지하는데 도움을 준다. 펌프(40)는 유속을 유지하기 위해 수동적으로 제어되거나, 소정의 유속으로 사전 설정되거나, 컴퓨터 시스템에 의해 자동 제어될 수 있다.
일부 구현예에서, 유속은 0.450 L/분 내지 0.850 L/분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.250 L/분 내지 1 L/분일 수 있거나 이의 임의의 개별적인 하위-증가분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.600 L/분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.650 L/분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.650 L/분 내지 0.850 L/분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.600 L/분 내지 0.850 L/분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.450 L/분 내지 0.650 L/분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.450 L/분 내지 0.600 L/분일 수 있다. 일부 구현예에서, 유속은 0.600 L/분 내지 0.650 L/분일 수 있다. 도 55를 참조하면, 몇몇 예시적인 구현예에 대한 레이놀즈 수, 펌프 유속, 섬유 계수, 속도, 동점도, 유동/섬유, 단위 길이, 내부 직경, 섬유 부피, 및 이동 시간, 특성 길이를 비교한 표가 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 약 700의 레이놀즈 수가 바람직하다. 일부 구현예에서, 농축 및 정용여과 동안 펌프 속도가 일정하게 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펌수 속도는 레이놀즈 수가 변화함에 따라 증가하거나 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펌프 속도는 농축 및/또는 정용여과 동안 증가할 수 있다.
본원의 상세한 설명과 같이, 당업자에게 본 개시의 내용에 비추어 이해되는 바와 같이, 농축 및 정용여과는 처리기, 메모리, 하나 이상의 센서, 하나 이상의 작동기 및 관련 분석 및 제어 소프트웨어 및 하드웨어를 포함하는 하나 이상의 컴퓨터 시스템에 의해 제어될 수 있다. 하나 이상의 센서는 사용자 또는 컴퓨터에 작동적인 데이터를 제공하기 위해 농축 및 정용여과 섹션에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 생물막의 축적은 도관(5)에 배치된 하나 이상의 압력 센서 (예컨대, 도 51c에 도시된 압력 센서(12))에 의해 탐지될 수 있다. 압력 판독은 루프 내의 압력 감소를 탐지하기 위해 2개 이상의 위치에서 취해질 수 있다. 기준 압력 차이로부터의 변화를 탐지하는 것은 생물막 형성을 나타낼 수 있으며, 따라서 루프를 통과하는 유속이 너무 낮다는 것을 나타낼 수 있다. 2개 이상의 압력 센서 사이의 압력 차이에 대한 반응으로, 섹션은 펌프 속도를 증가시키거나 생물막이 제거되지 않으면 오류 신호를 보낸다. 일부 구현예에서, 2개의 압력 센서가 필터(23)의 측면 중 하나에 배치될 수 있다.
일부 구현예에서, 구축물의 전단이 하나 이상의 광학 밀도 센서에 의해 탐지될 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 광학 밀도로부터 혼합물의 광학 밀도의 변화는 전단을 나타낼 수 있다. 기준선은 농축 또는 정용여과 단계의 시작에서 취해질 수 있다. 일부 구현예에서, 최대 유속을 결정하기 위해 살아있는/죽은 계수가 취해질 수 있다.
광학 밀도 센서는 순환 혼합물의 광학 밀도를 탐지하기 위해 잔류물 백(1) 또는 도관(5)에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 광학 밀도 센서가 광학 밀도의 변화를 탐지하기 위해 재순환 루프의 상이한 위치에 배치될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 광학 밀도 센서는 광학 밀도 변화를 탐지하기 위해 투과물 백(2) 내에 배치될 수 있다. 전형적으로, 투과물 백(2)은 구축물을 거의 함유하지 않을 것이고 따라서 불투명도가 낮거나 없을 것이다. 전단된 구축물은 농축 루프에서 재순환되기 보다는 필터(23)를 통과할 수 있고, 이와 같이, 투과물 백(2)의 광학 밀도의 변화(예컨대 증가)는 전단이 발생했음을 나타낼 수 있다. 광학 밀도의 변화에 대한 반응으로, 펌프(40) 속도가 컴퓨터 시스템 또는 사용자에 의해 증가될 수 있다.
일 구현예에서, 필터 어레이는 하나의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 1개 초과의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 2개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 3개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 4개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 5개의 필터 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터 어레이는 5개 초과의 필터 유닛을 포함한다.
본원에 개시된 필터는 백 막 필터, 평판 표면 막 필터, 카트리지 필터, 흡착제 필터 또는 흡착 필터일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 필터는 중공 섬유 필터이다.
일 구현예에서, 필터는 배지를 통과시키면서 박테리아를 보유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 필터는 추가적으로 거대입자, 예컨대 바이러스 입자 및 거대분자를 통과시킨다.
일 구현예에서, 필터는 적어도 약 0.01-100 μm2의 막 공극 크기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 접선 유동 여과를 통해 작동한다.
또 다른 구현예에서, 농축 및 정용여과 섹션은 필터 어레이를 투과물 백에 연결시키는 유체 도관을 추가로 포함하며, 상기 유체 도관은 투과물 용기를 향하는 일방향성 유동을 가능케 하는 밸브를 추가로 포함하고, 선택적으로 펌프와 같은 유동 작동기를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 농축 및 정용여과 섹션은 제형화 완충액 용기를 잔류물 용기에 연결시키는 유체 도관을 추가로 포함하며, 상기 유체 도관은 잔류물 용기를 향하는 일방향성 유동을 가능케 하는 밸브를 추가로 포함하고, 선택적으로 펌프와 같은 유동 작동기를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 잔류물, 제형화 완충액, 및 투과물 용기는 플라스틱 용기이다. 또 다른 구현예에서, 잔류물, 제형화 완충액, 및 투과물 용기는 플라스틱 조직 배양 백이다.
일 구현예에서, 잔류물 용기는 약 100 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 150 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 200 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 250 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 300 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 350 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 400 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 450 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기는 약 500 ml의 최대 부피를 갖는다.
일 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 100 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 150 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 200 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 250 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 300 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 350 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 400 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 450 ml의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 약 500 ml의 최대 부피를 갖는다.
일 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 제형화 완충액 용기로 충진되고 제조 공정의 시작 전에 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템으로 통합된다. 또 다른 구현예에서, 제형화 완충액 용기는 제형화 완충액으로 충진되고 제조 공정이 진행되는 동안 예컨대 일회용 무균 커넥터를 통해 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템으로 통합된다.
또 다른 구현예에서, 제형화 완충액은 사용 전에 소정의 온도로 동등해진다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 용기와 제형화 완충액 용기는 모두 정용여과 공정 전에 소정의 온도로 동등해진다. 일 구현예에서, 온도는 약 37 ℃로 유지된다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 37 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 4 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 8 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 12 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 16 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 12 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 20 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 25 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 27℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 28 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 30 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 32 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 34 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 35℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 36 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 38 ℃이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 약 39 ℃이다.
또 다른 구현예에서, 농축 섹션에서 잔류물 용기(1)로 옮겨진 배양 배지는 상기 필터 어레이를 통해 순환되고, 여기서 상기 필터(23)를 통과한 배지는 투과물 용기(2)로 배출되고, 동시에 제형화 완충액이 잔류물 용기(1)에 첨가됨에 따라 영양 배지가 제형화 완충액으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 완충액은 일회용 필터 어레이를 통해 단일 통과를 통해로 대체된다. 추가의 구현예에서, 잔류물 백(1)에 첨가되는 제형화 완충액의 부피는 투과물 용기(2) 내로 제거된 배지 부피보다 적으며, 이에 따라 배양물의 부피가 감소되고 따라서 면역 요법 조성물 중의 박테리아 농도가 증가한다. 또 다른 구현예에서, 잔류물 백(1) 내에 첨가되는 제형화 완충액의 부피는 투과물 용기(2) 내로 제거된 배지 부피보다 크며, 이에 따라 배양물의 부피가 증가하고 따라서 면역 요법 조성물 중의 박테리아 농도가 감소한다. 또 다른 구현예에서, 여과 공정은 면역 요법 조성물을 회수하기 위해 막횡단 압력 정용여과를 사용한다. 이는 막 횡단 압력 여과를 사용하는 다른 공정과 본 발명의 공정을 구별한다. 일 구현예에서, 배양물 내의 박테리아의 최종 목표 농도는 약 1-109 박테리아/ml이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일 구현예에서, 제형화 완충액 중에 재조합 약독화된 리스테리아를 포함하는 면역 요법 조성물은 후속하여 전술된 유체 도관을 통해 잔류물 용기(1)에서 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 제품 분배 섹션으로 옮겨지며, 상기 유체 도관은 제품 분배 섹션 (도 53)을 향한 일방향 유동을 위한 밸브(20), 유체 유동을 영구적으로 차단하는 수단, 예컨대 밸브(20) 또는 클램프(17)를 포함하며 선택적으로 펌프와 같은 유동 작동기를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 제조 시스템의 제품 분배 섹션(39)은 또한 “제품 은행 매니폴드”또는 “매니폴드”로 지칭된다 (도 52 내지 53 참조). 일 구현예에서, 제품 분배 섹션은 벌크 용기 (예컨대, 잔류물 용기(1)), 퍼지 용기, 및 하나 이상의 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 벌크 용기를 상기 퍼지 용기(예컨대, 100 mL 백(29)) 및 상기 하나 이상의 제품 용기(예컨대, 25 mL 백(28))에 직렬로 연결시키는 하나 이상의 유체 도관(30)을 추가로 포함하며, 여기서 퍼지 용기는 직렬 연결부의 원위 말단부에 배치되는 반면, 제품 용기는 직렬 연결부의 중간 위치를 갖는다. 추가의 구현예에서, 벌크 용기, 퍼지 용기 및 제품 용기를 연결하는 도관은 각각의 제품 용기로의 유동을 영구적으로 차단하는 수단, 예컨대 밸브(20), 클램프(17), 또는 도관을 영구적으로 밀봉하는 수단을 추가로 포함하며, 선택적으로 유동 작동기, 예컨대 펌프를 포함하며, 여기서 상기 작동기는 벌크 용기에 근접하게 배치된다. 매니폴드(39)는 하나 이상의 커넥터(11)를 사용하여 잔류물 백(예컨대, 도 51a 내지 51c에 도시된 잔류물 백(1)의 P1 또는 P2)에 무균적으로 부착될 수 있다.
일 구현예에서, 벌크 용기 및 퍼지 용기는 플라스틱 용기이다. 또 다른 구현예에서, 벌크 용기 및 퍼지 용기는 조직 배양 백이다.
일 구현예에서, 제품 용기는 플라스틱 용기, 플라스틱 앰플, 유리 앰플 또는 일회용 주사기이다. 또 다른 구현예에서, 제품 용기는 IV 전달 포트를 추가로 포함하는 IV 백이다. 또 다른 구현예에서, 제품 용기는 단일 투여량 IV 백이다.
일 구현예에서, 본원에서 “제품 은행 매니폴드”로도 지칭되는 제품 분배 섹션은 하나의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 2개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 3개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 4개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 5개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 6개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 7개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 8개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 9개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 10개의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제품 분배 섹션은 10개 초과의 단일 투여량 제품 용기를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 제품 용기는 약 1 내지 500 ml의 부피를 갖는다.
추가의 구현에에서, 벌크 용기는 발효 및 농축/정용여과 섹션 내의 샘플러 포트와 유사한 적어도 하나의 선택적인 샘플러 포트를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 상기 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템은 중앙화된 구조를 가지며, 여기서 발효 섹션의 발효 용기는 농축 섹션 및 정용여과 섹션의 잔류물 용기, 및 제품 분배 섹션의 벌크 용기로도 기능한다. 또 다른 구현예에서, 중앙화된 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템은 발효/농축된 배양물/잔류물/벌크 용기를 각각의 접종, 농축/정용여과 및 제품 분배 섹션에 연결시키는, 특히 접종 용기, 농축 섹션/정용여과 섹션의 하나 이상의 필터, 및 제품 분배 섹션의 제품 및 퍼지 용기에 연결시키는 배출 유체 도관의 분리된 세트를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 중앙화된 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템은 하나 이상의 농축/정용여과 섹션을 발효/농축된 배양물/잔류물/벌크 용기에 연결시키는 재순환 도관의 세트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 발효/농축된 배양물/잔류물/벌크 용기를 중앙화된 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 다른 섹션에 연결시키는 배출 유체 도관은 발효/농축된 배양물/잔류물/벌크 용기로부터 일방향 유동을 가능케하는 선택적인 밸브를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 배출 유체 도관은 선택적으로 펌프와 같은 유체 유동 작동기를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 농축 섹션 / 정용여과 섹션의 하나 이상의 필터를 발효/농축된 배양물/잔류물/벌크 용기에 연결시키는 재순환 도관은 발효/농축된 배양물/잔류물/벌크 용기로부터 일방향 유동을 가능케하는 선택적인 밸브를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 중앙화된 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 발효/농축된 배양물/잔류물/벌크 용기에 연결된 각각의 유체 도관은 유체의 유동을 영구적으로 차단하는 수단, 예컨대 밸브(20) 또는 클램프(17), 또는 도관을 영구적으로 밀봉하는 수단을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 것은 본원에 전술된 바와 같이 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템을 병행 사용하여 맞춤형 면역 요법 조성물의 제조 공정을 확대하는 공정이다. 일 구현예에서, 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 세트는 동일한 환자에 대해 여러 상이한 맞춤형 면역 요법 조성물을 제조하는데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 세트는 상이한 환자에 대해 여러 상이한 맞춤형 면역 요법 조성물을 제조하는데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템의 세트의 병행 사용은 맞춤형 면역 요법 조성물의 결과를 크게 증가시킨다.
일 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 2개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 3개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 4개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 5개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 6개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 7개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 8개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 9개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 10개의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 세트는 병렬로 작동하는 10개 초과의 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템을 포함한다.
본원에 개시된 것은 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템 또는 폐쇄된 환경 챔버 내의 시스템 세트를 작동시키기 위한 공정이다. 일 구현예에서, 폐쇄된 환경 챔버는 클린 룸이다. 또 다른 구현예에서, 폐쇄된 환경 챔버는 바이오 후드이다.
일 구현예에서, 용어 “폐쇄된 환경 챔버”는 외부 환경으로부터 완전히 또는 부분적으로 밀봉 또는 격리된 임의의 크기의 엔클로져(enclosure)를 지칭하며, 여기서 하나 이상의 환경 파라미터 예컨대 온도, 압력, 대기, 및 공기 중 입자상 물질의 수준은 특정 사전 설정 수준으로 유지된다.
또 다른 구현예에서, 맞춤형 면역 요법 조성물의 제조 방법은 제조 공정과 동시에, 또는 제조 공정의 완료 후에 제조된 조성물을 시험하는 단계를 추가로 제공한다. 동시 시험은 제조 공정의 임의의 단계에서 수행될 수 있고, 제조 공정 전체에 걸쳐 제품의 품질을 지속적으로 모니터링하는 상당한 이점을 제공한다. 동시 시험은 상당한 시간 절약을 야기하는 제조 후 시험을 제거하는 추가의 이점을 추가로 제공한다. 일 구현예에서, 상기 시험은 비제한적으로 순도 제어, 안전 제어, 효능 제어, 동일성 제어 및 안정성 제어를 포함한다.
일 구현예에서, 용어 “순도 제어”는 공정 불순물, 예컨대 잔여 배지 성분, 제품 불순물, 및 오염되기 쉬운 제제, 예컨대 박테리오파지의 존재에 대해 맞춤형 면역 요법 조성물을 시험하는 것을 의미한다.
또 다른 구현예에서, 용어 “안전 제어”는 병독성에 대한 맞춤형 면역 요법 조성물의 시험을 의미하며, 특히 리스테리아의 경우 제조된 조성물은 약독화에 대해 시험될 것이다. 또 다른 구현예에서, 용어 “동일성 제어”는 항생제 민감성과 같은 예측된 품질 속성의 존재에 대해 맞춤형 면역 요법 조성물을 시험하는 것을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 용어 “효능 제어”는 치료 효능에 대해 맞춤형 면역 요법 조성물을 시험하는 것을 지칭한다. 치료 효능은 예컨대 모델 시험관 내 시스템에서 시험될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 용어 “안정성 제어”는 예측된 용도를 통해 품질 속성을 유지하는 능력에 대해 맞춤형 면역 요법 조성물을 시험하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 것은 제조 공정이 완료 되면 즉시 환자에 맞춤형 면역원성 조성물을 전달할 수 있게 하는 주문 제작이다. 일 구현예에서, 제품이 제품 용기에 전달되면, 적어도 하나의 단일 투여 제품 용기, 바람직하게는 IV 백이 일회용 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템으로부터 분리되고, 제품 용기를 세포 성장 시스템에 연결시키는 유체 도관은 영구적으로 밀봉된다. 분리 후에 제품 용기는 예컨대 IV 주입을 통해 환자에 맞춤형 면역 요법 조성물을 직접 투여하기 위해 사용된다.
본원에 개시된 것은 원격 위치에서 환자에 후속 사용 또는 배송을 위한 맞춤형 면역 요법 조성물을 저장하는 시스템이다. 본 발명에 의해 고려되는 바와 같이, 하나 이상의 단일 투여량 제품 용기, 바람직하게는 일회용 IV 백은 제품이 제품 용기에 전달되면 일회용 완전히 밀폐된 세포 성장 시스템으로부터 분리되고, 제품 용기를 세포 성장 시스템에 연결하는 유체 도관은 영구적으로 밀봉된다. 분리 후에, 제품 용기는 즉시 동결되고 보관되거나 배송된다. 일 구현예에서, 맞춤형 면역원성 조성물은 섭씨 -20도 미만의 온도에서 동결, 보관 및 배송된다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 섭씨 약 -70도이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 섭씨 약 -70 내지 -80도이다. 또 다른 구현예에서, 맞춤형 면역 요법 조성물은 해동되고 박테리아 세포는 환자에 전달되기 직전에 제형화 완충액 중에 고르게 재현탁된다. 일 구현예에서, 맞춤형 면역 요법 조성물은 환자에 전달되기 직전에 소정의 온도로 동등해진다. 또 다른 구현예에서, 온도는 주위 온도이다. 또 다른 구현예에서, 상기 온도는 섭씨 약 37도이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 제조 공정은 추가 공정 (즉, 바이알 충진)을 위해 별도의 설비로 약물을 이송할 필요가 없게 함으로서 오염의 위험 및 시간을 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 제조 공정은 D 등급/ 클래스 100,000/ISO 8 또는 그 이상의 환경에서의 제조를 가능케 한다.
본원의 개시에 의해 제공되는 바와 같이, 제조 단계는 2주 이상 소요되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 제조 단계는 약 1 내지 2주일 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 제조 단계는 약 1주일 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 제조 단계는 1주일 미만 소요될 것이다.
본원의 개시에 의해 추가로 제공되는 바와 같이, 면역 요법 제제의 시제품 시험 및 방출 단계는 5주 이상 소요되지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, 면역 요법 제제의 시제품 시험 및 방출 단계는 약 4 내지 5주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 면역 요법 제제의 시제품 시험 및 방출 단계는 약 4주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 면역 요법 제제의 시제품 시험 및 방출 단계는 약 4주 미만 소요될 것이다.
본 개시에 의해 추가로 제공되는 바와 같이, 배송 단계는 1주 미만 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 배송 단계는 1주 미만 소요될 것이다.
맞춤형 면역 요법 공정
일 구현예에서, 질환 또는 상태를 갖는 대상을 위해 생성된 맞춤형 면역 요법 시스템을 제공하기 위한 시스템이 개시되며, 상기 시스템은
약독화된 리스테리아 균주 전달 벡터; 및
하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는, 상기 리스테리아 균주를 형질전환시키기위한 플라스미드 벡터를 포함하며, 여기서 상기 네오-에피토프(들)는 상기 질환 또는 상태를 갖는 상기 대상의 질병 보유 조직 또는 세포에 존재하는 면역원성 에피토프를 포함하고,
여기서 상기 플라스미드 벡터로 상기 리스테리아 균주를 형질전환시킴으로써 상기 대상의 질환 또는 상태에 표적화된 맞춤형 면역 요법 시스템이 생성된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 것은 질환 또는 상태를 갖는 대상에 대한 맞춤형 면역 요법을 생성하기 위한 공정으로, 상기 공정은
질병 보유 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열 중의 하나 이상의 개방 해독 프레임(ORF)을 건강한 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열 중의 하나 이상의 ORF와 비교하고, 여기서 상기 비교는 질병 보유 샘플로부터의 상기 하나 이상의 ORF 내에 인코딩된 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 동정하는, 단계;
약독화된 리스테리아 균주를 a 단계에서 동정된 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계; 및 택일적으로, 소정의 기간 동안 대상에게 투여하기 위해 상기 약독화된 재조합 리스테리아 균주를 저장하거나, 상기 약독화된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여함으로써, 상기 질병이나 상기 질환에 대한 맞춤형 T 세포 면역 반응을 생성시키는 단계; 선택적으로,
상기 T 세포 면역 반응으로부터 T 세포 클론 또는 T 침윤 세포를 포함하는 제2 생물학적 샘플을 대상으로부터 수득하고, 상기 T 세포 상에서 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 결합된 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 특정 펩티드를 특성화시키되, 상기 하나 이상의 네오-에피토프는 면역원성인, 단계;
c 단계에서 동정된 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 핵산 구축물을 검사하여 선택하는 단계; 및,
제2 약독화된 재조합 리스테리아 균주를 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계; 및 대안적으로, 소정의 기간 동안 대상에게 투여하기 위해 상기 제2 약독화된 재조합 리스테리아 균주를 저장하거나, 상기 제2 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 제2 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 공정은 상기 대상에 대한 맞춤형 면역 요법을 생성시킨다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 것은 질환 또는 상태를 갖는 대상에 대한 맞춤형 면역 요법을 생성하기 위한 공정으로, 상기 공정은
질병 보유 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열 중의 하나 이상의 개방 해독 프레임(ORF)을 건강한 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열 중의 하나 이상의 ORF와 비교하고, 여기서 상기 비교는 질병 보유 샘플로부터의 상기 하나 이상의 ORF 내에 인코딩된 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 동정하는, 단계;
벡터를 a. 단계에서 동정된 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키거나, a. 단계에서 동정된 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 ORF를 포함하는 상기 핵산 서열을 이용해 DNA 백신 또는 펩티드 백신 벡터를 생성하는 단계; 및 택일적으로, 소정의 기간 동안 상기 대상에게 투여하기 위해 상기 벡터 또는 상기 DNA 백신 또는 상기 펩티드 백신을 저장하거나, 상기 벡터, 상기 DNA 백신, 또는 상기 펩티드 백신을 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여함으로써, 상기 질병이나 상기 질환에 대한 맞춤형 T 세포 면역 반응을 생성시키는 단계; 및 선택적으로,
잠재적 네오-에피토프 펩티드에 대한 반응을 증가하거나 변화된 T 세포 면역 반응에 기초하여 동정하여 선택할 수 있는 T 세포 클론 또는 T 침윤 세포 또는 혈액 또는 조직 견본을 포함하는 제2 생물학적 샘플을 상기 대상으로부터 수득하고, 상기 T 세포 상에서 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 결합된 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 특정 펩티드와 반응에 의하거나, T 세포 수용체 특이성의 딥 시퀀싱 및 네오-에피토프와 관련된 증가된 T 세포 반응의 평가에 의해 특성화시키는 단계;
c 단계에서 동정된 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 핵산 구축물을 검사하여 선택하는 단계; 및,
제2 벡터를 상기 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키거나, c. 단계에서 동정된 상기 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 이용해 DNA 백신 벡터 또는 펩티드 백신 벡터를 생성하는 단계; 및 대안적으로, 소정의 기간 동안 상기 대상에게 투여하기 위해 상기 벡터 또는 상기 DNA 백신 또는 상기 펩티드 백신을 저장하거나, 상기 벡터, 상기 DNA 백신, 또는 상기 펩티드 백신을 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 공정은 상기 대상에 대한 맞춤형 면역 요법을 생성시킨다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 것은 질환 또는 상태를 갖는 대상을 위해 맞춤형 면역 요법을 제공하기 위한 시스템으로, 하기 구성요소들을 포함한다:
상기 질환 또는 상태를 갖는 상기 대상으로부터 수득한 질병 보유 생물학적 샘플;
상기 질환 또는 상태를 갖는 상기 인간 개체 또는 다른 건강한 인간 개체로부터 수득한 건강한 생물학적 샘플;
상기 질병 보유 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열의 하나 이상의 개방 해독 프레임(ORF)을 상기 건강한 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열의 개방 해독 프레임과 비교하고, 상기 질병 보유 샘플의 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 ORF에서 돌연변이를 동정하기 위한 스크리닝 분석 또는 스크리닝 도구 및 관련된 디지털 소프트웨어 (여기서 상기 돌연변이는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하고,
여기서 상기 관련 디지털 소프트웨어는 T 세포 에피토프(들) 또는 면역원성 잠재력, 또는 이들의 임의의 조합을 동정하기 위해 상기 ORF 내의 상기 돌연변이의 스크리닝을 가능하게 하는 서열 데이터베이스에 대한 액세스를 포함함);
상기 질병 보유 샘플로부터의 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 핵산을 클로닝하고 발현하기 위한 핵산 클로닝 및 발현 키트;
하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 후보 펩티드의 결합 및/또는 T 세포 면역원성 시험을 위한 면역원성 분석;
핵산 서열, 펩티드 아미노산 서열 및 T 세포 수용체 아미노산 서열의 시퀀싱 및 분석을 위한 분석 장비, 및 관련 소프트웨어;
(e) 단계의 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 상기 동정된 면역원성 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질전환 시키기 위한 약독화된 리스테리아 전달 벡터를 포함하되,
여기서 일단 형질전환되면, 상기 리스테리아는 저장되거나, (a) 단계의 상기 인간 개체에 면역원성 조성물의 일부로서 투여되는, 리스테리아 전달 벡터; 또는
전달 벡터; 및 선택적으로
상기 전달 벡터를 형질전환시키기 위한 벡터를 포함하고, 상기 벡터는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 구축물을 포함하되, 상기 네오-에피토프(들)는 상기 질환 또는 상태를 갖는 상기 대상의 질병 보유 조직이나 세포에 존재하는 면역원성 에피토프를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 펩티드는 상기 핵산 서열의 하나 이상의 개방 해독 프레임(ORF)에 의해 인코딩된다.
다른 구현예에서, 질병은 감염성 질환, 또는 종양 또는 암이다.
다른 구현예에서, 상기 전달 벡터는 세균성 전달 벡터를 포함한다. 관련된 다른 측면에서, 상기 전달 벡터는 바이러스성 전달 벡터를 포함한다. 관련된 다른 측면에서, 상기 전달 벡터는 펩티드 백신 전달 벡터를 포함한다. 관련된 다른 측면에서, 상기 전달 벡터는 DNA 백신 전달 벡터를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 것은 맞춤형 면역 요법을 생성하기 위한 공정으로, 상기 공정은
상기 질환 또는 상태를 갖는 대상으로부터 질병 보유 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
상기 질병 보유 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계;
(a) 단계의 상기 대상 또는 동일 종의 다른 개체로부터 건강한 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
상기 건강한 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계;
(b) 및 (d) 단계로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계;
상기 질병 보유 샘플의 ORF 내의 변이된 핵산 서열을 동정하기 위해, 상기 질병 보유 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열의 하나 이상의 개방 해독 프레임(ORF)을 상기 건강한 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열의 개방 해독 프레임과 비교하되, 상기 ORF는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 인코딩하는, 단계;
상기 질병 보유 샘플의 상기 ORF 내의 변이된 서열을 동정하는 단계로서, (여기서, 상기 ORF는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 인코딩하고,
상기 네오-에피토프는 T 세포 수용체(TCR) 시퀀싱 또는 전체 엑솜 시퀀싱을 포함하되 이에 한정되지 않는 당업계의 공지된 방법을 사용해 동정되는 단계);
상기 동정된 변이된 핵산 서열을 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 발현하는 단계;
면역원성 T 세포 반응에 대해 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 각각의 펩티드를 스크리닝하되, 면역원성 T 세포 반응의 존재는 T 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 네오-에피토프의 존재와 상관되는 단계;
T 세포 에피토프인 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 동정하여 선택하고, 약독화된 리스테리아 균주를 상기 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질전환시키는 단계;
상기 약독화된 리스테리아 균주를 배양하고 특성화시켜 상기 하나 이상의 면역원성 펩티드의 발현과 분비를 확인하는 단계; 및,
상기 대상에게 소정의 기간 동안 투여하기 위해 상기 약독화된 리스테리아를 저장하거나, 상기 대상에게 상기 약독화된 리스테리아 균주를 투여하되, 상기 약독화된 리스테리아 균주는 면역원성 조성물의 일부로서 투여되는, 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 제2 생물학적 샘플을 상기 대상으로부터 수득하는 방법은 상기 약독화된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 상기 제2 조성물의 투여 후에 확장되는 T 세포 클론 또는 T 침윤 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, T 세포 상의 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 결합된 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 특정 펩티드를 특성화시키는 공정은:
상기 질병에 대해 반응하는 T 세포 클론 또는 T 침윤 세포를 동정하고, 단리하고, 확장시키는 단계; 및
상기 T 세포 상의 T 세포 수용체가 결합되는 특정 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자 상에 로딩된 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 스크리닝하여 동정하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 특정 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자 상에 로딩된 하나 이상의 면역원성 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드에 대해 스크리닝하여 동정하는 단계는 상기 T 세포를 상기 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 스크리닝하여 동정하는 단계는 T 세포 수용체 시퀀싱, 멀티 플렉스 기반 유동 세포 계측법, 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 수행하여 펩티드 특이성을 결정하는 단계를 포함한다. 당업자는 T 세포 수용체에 결합되는 펩티드를 결정하기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있음을 이해할 것이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 맞춤형 면역 요법을 생성하는 시스템 또는 공정에서, 상기 비교하는 단계는 상기 질병 보유 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열의 하나 이상의 개방 해독 프레임(ORF)을 상기 건강한 생물학적 샘플로부터 추출한 핵산 서열의 개방 해독 프레임과 비교하고, 상기 질병 보유 샘플의 상기 ORF 내의 변이된 핵산 서열을 동정하기 위한 스크리닝 분석 또는 스크리닝 도구 및 관련된 디지털 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 변이된 핵산 서열은 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 인코딩하거나 이에 포함된다. 다른 구현예에서, 관련된 디지털 소프트웨어는 상기 ORF 내의 상기 질병 보유 핵산 서열의 스크리닝을 가능하게하는 서열 데이터베이스, 또는 T 세포 에피토프 또는 면역원성 잠재성을 동정하기 위한 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 펩티드를 인코딩하는 디지털 방식으로 해석된 해당 아미노산 서열, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 엑세스를 포함한다.
일 구현예에서, 제공된 맞춤형 면역 요법을 생성하기 위한 시스템 또는 공정에서 면역원성 T 세포 반응을 스크리닝하는 단계는, 예를 들어 T 세포 증식 분석, 상기 네오-에피토프로 활성화되고 51Cr-방출 분석 또는 3H-티미딘 분석을 사용하여 종양 세포와 공-배양된 T 세포를 사용하는 시험관 내 종양 퇴행 분석, ELISA 분석, ELIspot 분석, 및 FACS 분석(analysis)을 포함하는 당업계에 공지된 면역 반응 분석을 포함한다. (예를 들어 그 전체가 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 제8,771,702호 참조할 것)
일 구현예에서, 본 발명은 약독화된 재조합 리스테리아 균주에 관한 것으로:
융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하되, 상기 융합 폴리펩티드는 본원에 개시된 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드에 융합된 면역원성 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 포함하거나; 또는
키메라 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 개방 해독 프레임을 포함하는 미니유전자 핵산 구축물을 포함하고, 여기서 상기 키메라 단백질은
박테리아 분비 신호 서열,
유비퀴틴(Ub) 단백질,
본원에 개시된 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하고; 그리고,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩티드는 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 작동 가능하게 연결되거나 일렬로 배열된다.
다른 구현예에서, 박테리아 서열은 리스테리아 서열이되, 일부 구현예에서, 상기 리스테리아 서열은 hly 신호 서열이거나 actA 신호 서열이다.
다른 구현예에서, 질병은 국소화된 질병이다. 다른 구현예에서, 질병은 종양 또는 암이다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 고형 종양 또는 암이다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 액체 종양 또는 암이다. 다른 구현예에서, 비정상적이거나 건강하지 않은 생물학적 샘플은 종양, 또는 암, 또는 이들의 일부를 포함한다.
일 구현예에서, 질병은 감염성 질환이다. 다른 구현예에서, 감염성 질환은 감염성 바이러스성 또는 감염성 세균성 질환이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 공정에 의해 동정된 네오-에피토프는 감염성 질환-관련-특이적 에피토프이다.
다른 구현예에서, 네오-에피토프는 고유한 종양 또는 암 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 암-특이적 또는 종양-특이적 에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 면역원성이다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 T 세포에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 펩티드는 종양이나 암에 대한 T 세포 반응을 활성화하되, 상기 반응은 상기 대상에 맞추어진 것이다.
다른 구현예에서, 네오-에피토프는 고유한 종양 또는 암 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 감염성 질환과 관련된 고유한 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 감염성 질환 에피토프는 질환과 직접적으로 상관된다. 대안적인 일 구현예에서, 감염성 질환 에피토프는 감염성 질환과 관련된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 공정은 질환이 있는 상기 대상에게 맞춤형 강화된 항질병, 또는 항감염, 또는 항감염성 질환, 또는 항종양 면역 반응이 생성되도록 한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 공정은 대상의 상기 질병, 또는 상기 감염 또는 감염성 질환, 또는 상기 종양이나 암의 맞춤형 처리 또는 예방을 가능하게 한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 공정은 상기 질병, 또는 상기 감염 또는 감염성 질환, 또는 상기 종양이나 암이 있는 상기 대상의 생존 시간을 증가시킨다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 것은 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 하나 이상의 면역원성 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 리스테리아 균주는 하나 이상의 상이한 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 상이한 펩티드를 발현한다. 다른 구현예에서, 각각의 리스테리아는 다양한 네오-에피토프를 발현한다. 다른 구현예에서, 각각의의 펩티드는 T-세포 에피토프인 하나 이상의 네오-에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 것은 대상에게서 표적화된 맞춤형 항종양 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 리스테리아 균주는 하나 이상의 네오-에피토프를 발현한다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는: 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자; 또는 키메라 단백질을 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 미니유전자 핵산 구축물, 중 하나를 포함하되, 상기 융합 폴리펩티드는 암 질환과 관련된 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 펩티드에 융합된 면역원성 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하며, 상기 키메라 단백질은 리스테리아 분비 신호 서열, 유비퀴틴(Ub) 단백질, 및 종양이나 암과 관련된 하나 이상의 네오-에피토프를 각각 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하고, 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 하나 이상의 펩티드는 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 각각 직렬로 배열되거나 작동 가능하게 연결된다.
다른 구현예에서, 융합 펩티드는 HIS 태그 또는 SIINFEKL 태그에 더 연결된다. 당업자는, 태그용 서열을 플라스미드 또는 파지 벡터 상의 융합 펩티드 서열 내에 혼입시킬 수 있음을 이해할 것이다. 이들 태그는 발현될 수 있고, 제시된 항원 에피토프는 임상의가 이들 "태그" 서열 펩티드에 대한 면역 반응을 추적함으로써 분비된 펩티드의 면역원성을 추적할 수 있게 한다. 이러한 면역 반응은 이들 태그에 특이적인 단일클론 항체 및 DNA 프로브 또는 RNA 프로브를 포함하되 이에 한정되지 않는 다수의 시약들을 사용하여 모니터링 될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상의 비장 및 종양 내에서 T 효과기 세포 대 조절 T 세포(Tregs)의 비를 증가시키는 것으로서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 T 효과기 세포는 대상의 비정상적이거나 건강하지 않은 조직, 예컨대 종양 조직이나 암에 존재하는 네오-에피토프를 표적으로 한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상의 항원-특이적 T 세포를 증가시키기 위한 것으로서, 대상에게 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역 요법 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항원 또는 이의 펩티드 단편은 하나 이상의 네오-에피토프를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 종양이 있거나, 암을 앓고 있거나, 감염성 질환을 앓고 있는 대상의 생존 시간을 증가시키기 위한 것으로서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상에서 종양 또는 암 또는 감염 또는 감염성 질환을 치료하는 것으로서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
I. 맞춤형 면역 요법
일 구현예에서, 본 발명의 방법으로 맞춤형 면역 요법이 생성된다. 다른 구현예에서, 질환 또는 상태를 갖는 대상에 대한 맞춤형 면역 요법을 생성하는 방법은 상기 환자의 질병에 특이적인 돌연변이 항원 및 변이체 항원(신항원) 내의 네오-에피토프를 동정하여 선택하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 대상에 대한 맞춤형 면역 요법을 생성하는 방법은 상기 대상에 대한 치료를 제공하기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 맞춤형 면역 요법은 암, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부 반응, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 및 HIV와 같은 만성 바이러스성 질환과 같은 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 맞춤형 면역 요법을 생성하는 방법의 일 단계는 질환 또는 상태를 갖는 대상으로부터 비정상적이거나 건강하지 않은 생물학적 샘플을 수득하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “비정상적이거나 건강하지 않은 생물학적 샘플”은 동일한 의미와 특징을 모두 가지며 “질병 보유 생물학적 샘플”또는 “질병 보유 샘플”과 교환 가능하게 사용된다. 일 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직, 세포, 혈액, 개체로부터 수득한 림프구를 포함하는 임의의 샘플, 개체로부터 수득한 질병 보유 세포를 포함하는 임의의 샘플, 또는 건강한 개체로부터 수득하였지만 동일한 개체 또는 유사한 개체로부터 수득한 질병 보유 샘플과도 비슷한 임의의 샘플이다.
일 구현예에서, 비정상적이거나 건강하지 않은 생물학적 샘플은 종양 조직, 또는 암 조직 또는 이들의 일부를 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 고형 종양일 수 있다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 액체 종양 또는 암으로, 예를 들어 종양이 형성되는 않는 혈액암 또는 유방암이다.
다른 구현예에서, 종양 샘플은 종양 또는 암세포를 보유하고 있거나 보유할 것이 예상되는 환자 유래의 신체 샘플과 같은 임의의 샘플에 관한 것이다. 신체 샘플은 혈액, 원발 종양이나 종양 전이로부터 수득한 조직 샘플, 또는 종양이나 암세포를 보유한 임의의 다른 샘플과 같은 임의의 조직 샘플이다. 또 다른 구현예에서, 신체 샘플은 혈액, 타액 유래의 세포, 또는 뇌척수액 유래의 세포이다. 다른 구현예에서, 종양 샘플은 순환 종양 세포(CTC)와 같은 하나 이상의 단리된 종양 또는 암세포, 또는 순환 종양 세포(CTC)와 같은 하나 이상의 단리된 종양 또는 암세포를 포함하는 샘플에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 유방암 또는 종양을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 자궁경부암 또는 종양을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 Her2 함유 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 흑색종 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 췌장 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 난소 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 위 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 췌장의 암종 병변을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 폐선암종 또는 폐선암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 다형성 교모세포종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 결장 직장 선종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 폐 편평 상피종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 위 선종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 난소 표면 상피 종양(예를 들어, 이의 양성, 증식성 또는 악성 변종) 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 구강 편평 세포 암종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 비-소세포 폐 암종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 자궁 내막 암종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 방광 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 두경부 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 전립선 암종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 위 선종 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 구강 인두 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 폐 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 항문 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 대장 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 식도 종양 또는 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 또는 암은 악성 종양 또는 암을 포함한다.
다른 구현예에서, 비정상적이거나 건강하지 않은 생물학적 샘플은 비-종양 또는 암적 조직을 포함한다. 다른 구현예에서, 비정상적이거나 건강하지 않은 생물학적 샘플은 혈액 샘플로부터 단리된 네포, 타액 유래의 세포, 또는 대뇌 척수액 유래의 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 비정상적이거나 건강하지 않은 생물학적 샘플은 비정상적이거나 건강하지 않은 것으로 여겨지는 임의의 조직 또는 그의 일부의 샘플을 포함한다.
다른 구현예에서, 질병 보유 생물학적 샘플이 본원에 개시된 공정에 따라 분석을 위해 수득될 수 있는 감염성 질환을 포함하는 기타 비-종양적 또는 비-암적 질환들이 본 발명에 포함된다. 다른 구현예에서, 감염성 질환은 바이러스성 감염을 포함한다. 다른 구현예에서, 감염성 질환은 만성 바이러스성 감염을 포함한다. 다른 구현예에서, 감염성 질환은 HIV와 같은 만성 바이러스성 질환을 포함한다. 다른 구현예에서, 감염성 질환은 세균성 감염을 포함한다. 다른 구현예에서, 감염성 질환은 기생충 감염이다.
일 구현예에서, 감염성 질환은 하기 병원균들 중 임의의 병원균에 의해 유발되는 질환이지만 이에 한정되지는 않는다: 리슈만편모충, 이질아메바(아메바성 감염을 유발함), 트리쿠리스, BCG/결핵, 말라리아, 열대열원충, 사일열원충, 삼일열원충, 로타바이러스, 콜레라, 디프테리아-파상풍, 백일해, 인플루엔자 균, B 형 간염, 인간 유두종 바이러스, 계절성 인플루엔자), 대유행 인플루엔자 A (H1N1), 홍역과 풍진, 유행성 이하선염, 수막염 A+C, 경구 소아마비 백신, 1가, 2가, 3가, 폐렴 구균, 광견병, 파상풍 톡소이드, 황열병, 탄저균 (탄저병), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소 (보툴리누스 중독), 페스트 균 (전염병), 천연두 (마마) 및 기타 관련 수두 바이러스, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) (야토병), 바이러스성 출혈열, 아레나바이러스 (LCM, 후닌 바이러스, 맞추포 바이러스(Machupo virus), 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 라사 발열(Lassa Fever), 버냐바이러스(Bunyaviruses) (한타바이러스(Hantaviruses), 리프트 밸리 열병), 플라비바이러스(Flaviruses) (뎅기열), 필로바이러스 (에볼라, 마르부르크), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii) (Q 열병), 브루셀라 종 (브루셀라증), 부르크홀데리아 말레이 (마비저(glanders)), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) (앵무새병), 리신 독소 (피마자 유래), 클로스트리디움 퍼프린젠스의 엡실론 독소, 황색포도상구균 장독소 B, 발진티푸스 발열 (리케치아 프로바제키), 기타 리케치아, 식품- 및 수용성 병원균, 박테리아 (설사유발 대장균, 병원성 비브리오스, 시겔라 종, 살모넬라 BCG/, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)) 바이러스 (칼리시바이러스, A 형 간염, 웨스트 나일 바이러스, 라크로스(LaCrosse), 캘리포니아 뇌염, VEE, EEE, WEE, 일본 뇌염 바이러스, 키아사누 포레스트(Kyasanur Forest) 바이러스, 니파 바이러스, 한타바이러스(hantaviruses), 참진드기 매개 출혈열 바이러스, 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 크림-콩고 출혈열 바이러스, 참진드기 매개 뇌염 바이러스, B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종 바이러스 (HPV)), 원생동물 (작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 원포자충(Cyclospora cayatanensis), 람블편모충(Giardia lamblia), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 톡소포자충(Toxoplasma)), 균류 (미포자충), 황열, 약제 내성 결핵 포함 결핵, 광견병, 프리온, 중증 급성 호흡기 증후군 연관 코로나 바이러스 (SARS-CoV), 콕시디오이데스 포사다시(Coccidioides posadasii), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 박테리아성 질증, 클라미디아 트라코마티스, 거대세포 바이러스, 서혜부 육아종, 헤모필루스 듀크레이(Hemophilus ducreyi), 나이세리아 임질, 매독 균, 질트리코모나스, 또는 여기에 열거되지 않은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 감염성 질환.
일 구현예에서, 병원성 원생동물 및 기생충 감염은 : 아메바증; 말라리아; 리슈만편모충증; 트리파노소마증; 톡소플라즈마증; 뉴모시스티스 카리니; 바베시아증; 편모충증; 선모충증; 필라리아병; 주혈흡충병; 선충류; 디스토마류 또는 흡충류; 및 촌총류(조충류) 감염을 포함한다.
다른 구현예에서, 감염성 질환은 가축 감염성 질환이다. 다른 구현예에서, 가축 질환은 사람에게 전염될 수 있으며, "동물원성 질환"이라고 부른다. 다른 구현예에서, 이들 질환은 구제역, 웨스트 나일 바이러스, 광견병, 개 파보 바이러스(canine parvovirus), 고양이 백혈병 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 소의 전염성비기관염 (IBR), 위광견병(pseudorabies), 고전적 돼지열 (CSF), 소의 소 헤르페스 바이러스 1 형 (BHV-1) 감염에 의해 야기된, IBR, 및 돼지 내 위광견병 (아제스즈키 병), 톡소플라즈마증, 탄저병, 수포성 구내염 바이러스, 로도코커스 에쿠이(rhodococcus equi), 야토 병, 전염병 (예르시니아 페스티스), 트리코모나스를 포함하되, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 질병 보유 생물학적 샘플이 본원에 제공된 방법에 따라 분석을 위해 수득될 수 있는 자가 면역 질환을 포함하는 기타 비-종양적 또는 비-암적 질환들이 본 발명에 포함된다. 당업자는, 용어 “자가 면역 질환”이 개체의 자가 조직이나 장기를 향하는 면역 반응이나 이의 징후 또는 이로부터 유발되는 질환으로부터 발생하는 질병이나 질환을 의미함을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “자가 면역 질환”은 자가 조직을 향하는 항체가 질병 상태에 반드시 관여하지는 않지만 진단에 있어서 여전히 중요한 질병 상태 및 암을 포함한다. 또한, 일 구현예에서, 이는 정상적인 신체 조직 및 항원과 반응성인 항체의 B 세포에 의한 자기항체의 생산에 기인하거나 그로 인해 악화되는 질환을 지칭한다. 다른 구현예에서, 자가 면역 질환은 자기항원(가령 핵항원)으로부터의 에피토프에 특이적인 자기항체의 분비를 포함한다.
일 구현예에서, 자가 면역 질환이 있는 대상을 치료하기 위한 노력으로, 본 발명은 자가 반응성 네오-에피토프를 동정하기 위한 시스템 및 방법을 포함하며, 여기서 상기 시스템 또는 방법은, 항체 또는 면역 억제 세포(예: Treg 또는 MDSC)에 의해 매개되는 내성을 유도하기 위해, 자가 면역 질환이 있는 대상을 이들 자가 반응성 네오-에피토프에 대해 면역화하는 방법을 포함한다.
일 구현예에서, 자가 면역 질환은 전신 자가 면역 질환을 포함한다. 용어 “전신 자가 면역 질환”은 둘 이상의 장기에 영향을 미치는 자가 면역 반응에 의해 유발된 질병, 장애, 또는 증상의 조합을 지칭한다. 다른 구현예에서, 전신 자가 면역 질환은 항-GBM 신염(굿파스쳐 병), 다발 혈관염(GPA), 현미경적 다발 혈관염(MP A), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 근염(PM) 또는 소아 지방변증을 포함하되, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 자가 면역 질환은 결합조직병을 포함한다. 용어 “결합조직병”은 신체의 결합조직에 영향을 미치는 자가 면역 반응에 의해 유발된 질병, 질환 또는 증상의 조합을 지칭한다. 다른 구현예에서, 결합조직병은 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 근염(PM), 전신 경화증 또는 혼합 결합조직병(MCTD)을 포함하되, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 질병 보유 생물학적 샘플이 본원에 개시된 공정에 따라 분석을 위해 수득될 수 있는 장기 이식 거부 반응을 포함하는 기타 비-종양적 또는 비-암적 질환들이 본 발명에 포함된다. 다른 구현예에서, 거부된 장기는 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 위, 고환, 각막, 피부, 심장 판막, 혈관 또는 뼈를 포함하되 이에 한정되지 않는 고형 장기이다 . 다른 구현예에서, 거부된 장기는 혈액 조직, 골수 또는 랑게르한스 섬 세포를 포함하되 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 장기 이식 거부 반응이 있거나 이식편대숙주병을 앓고 있는 이식 대상을 치료하기 위한 노력으로, 본 발명은 자가 반응성 네오-에피토프를 동정하기 위한 시스템 및 방법을 포함하며, 여기서 상기 시스템 또는 방법은, 항체 또는 면역 억제 세포(예: Treg 또는 MDSC)에 의해 매개되는 내성을 유도하기 위해, 자가 면역 질환이 있는 대상을 이들 자가 반응성 네오-에피토프에 대해 면역화하는 방법을 포함한다.
샘플은 당업계에 널리 공지된 일상적 생검 절차를 사용하여 수득할 수 있다. 생검(biopsy)은 숙련 된 의료요원, 예를 들어 병리학자에 의해 대상으로부터 세포 또는 조직을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 생검 절차에는 여러가지 유형이 있다. 가장 일반적인 유형은: (1) 조직 표본만 제거하는 절개 생검; (2) 전체 덩어리 또는 의심 부위를 제거하는 절제 생검; 및 (3) 조직 또는 유체의 샘플을 바늘로 제거하는 바늘 생검을 포함한다. 넓은 바늘을 사용하는 경우, 이 절차는 핵심 생검이라 한다. 가는 바늘을 사용하는 경우, 이 절차는 미세바늘 흡입 생검이라 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 샘플은 절개 생검에 의해 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 절제 생검에 의해 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 바늘 생검을 사용해 수득된다. 다른 구현예에서, 바늘 생검은 핵심 생검이다. 다른 구현예에서, 생검은 미세바늘 흡입 생검이다. 다른 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플의 일부로서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 볼에서 면봉으로 채취한 것의 일부로서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 타액 샘플링의 일부로서 수득된다. 다른 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 생검의 전부 또는 일부를 포함한다. 다른 구현예에서, 조직 생검이 취해지고, 상기 조직 샘플로부터의 본 발명의 생물학적 샘플을 포함하는 세포가 수집된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 샘플은 세포 생검의 일부로서 수득된다. 다른 구현예에서, 동일한 대상으로부터 다중 생검이 취해질 수 있다. 다른 구현예에서, 동일한 대상으로부터의 다중 생검은 동일한 조직이나 세포로부터 수집된 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 동일한 대상으로부터의 다중 생검은 대상 내의 상이한 조직이나 세포원으로부터 수집된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 생검은 골수 조직을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 바이오 샘플을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 예를 들어 식도, 위, 십이지장, 직장, 결장 및 말단 회장과 같은 위장 조직의 생검을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 폐 조직을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 전립선 조직을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 간 조직을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 신경계 조직, 예를 들어 뇌 생검, 신경 생검, 또는 수막 생검을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 비뇨 생식기 조직, 예를 들어 신장 생검, 자궁 내막 생검 또는 자궁 경부 조직을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 유방 생검을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 림프절 생검을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 근육 생검을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 생검은 피부 생검을 포함한다. 다른 구현예에서, 생검은 뼈 생검을 포함한다. 다른 구현예에서, 각 샘플의 질병 보유 샘플 병상을 조사하여 이병(diseased) 조직의 진단을 확인한다. 다른 구현예에서, 건강한 샘플을 조사하여 건강한 조직의 진단을 확인한다.
일 구현예에서, 정상적이거나 건강한 생물학적 샘플을 대상으로부터 수득한다. 다른 구현예에서, 상기 정상적이거나 건강한 생물학적 샘플은 대상으로부터 유래된 신체 샘플과 같은 임의의 샘플과 관련된 비-종양적 샘플이다. 샘플은 본원에 개시된 생물학적 샘플로부터 수득한 건강한 세포와 같은 임의의 조직 샘플일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 정상적이거나 건강한 생물학적 샘플은, 일 구현예에서 관련된 개체인 다른 개체로부터 수득된다. 다른 구현예에서, 다른 개체는 대상과와 동일한 종이다. 다른 구현예에서, 다른 개체는 질병 보유 생물학적 샘플을 함유하지 않거나 함유할 것으로 기대되지 않는 건강한 개체이다. 다른 구현예에서, 다른 개체는 종양이나 암 세포를 함유하지 않거나 함유할 것으로 기대되지 않는 건강한 개체이다. 당업자는, 개체(그 또는 그녀)가 건강하다는 것을 판단하기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용해 질병의 존재 여부에 대해 개체를 스크리닝할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
다른 구현예에서, 정상적이거나 건강한 생물학적 샘플은 동시에 수득된다. 용어 “정상적이거나 건강한 생물학적 샘플”및 “기준 샘플(reference sample)”또는 “기준 조직”은 동일한 의미와 특징을 모두 가지며 명세서 전체에 걸쳐 교환 가능하게 사용된다. 다른 구현예에서, “기준(reference)”은 종양 견본으로부터 수득한 결과들을 상관시키고 비교하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, “기준”은 동일한 종으로부터의 충분히 많은 수의 정상 견본들을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, 정상적이거나 건강한 생물학적 샘플은 상이한 시간에 수득되며, 여기서 상기 시간은 정상적이거나 건강한 샘플이 비정상적이거나 건강하지 않은 샘플의 수득 이전 또는 이후에 수득된다는 것이다. 수득 방법은 생체 검사 또는 혈액 수집을 위해 당업계에서 일상적으로 사용되는 방법을 포함한다. 다른 구현예에서, 샘플은 동결된 샘플이다. 다른 구현예에서, 샘플은 파라핀 포매(FFPE) 조직 블럭을 조직으로서 포함한다.
일 구현예에서, 상기 정상적이거나 건강한 생물학적 샘플의 수득 이후, 상기 샘플은 당업계에 공지된 기술 및 방법을 사용하여 핵산 추출을 위해 처리된다. 다른 구현예에서, 추출된 핵산은 DNA를 포함한다. 다른 구현예에서, 추출된 핵산은 RNA를 포함한다. 다른 구현예에서, RNA는 mRNA이다. 다른 구현예에서, 차세대 시퀀싱(NGS) 라이브러리가 준비된다. 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing) 라이브러리는 구축될 수 있으며, 엑솜 또는 표적화된 유전자 포획을 거칠 수 있다. 다른 구현예에서, cDNA 발현 라이브러리는 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 참고로 그 전체가 본원에 통합된 US20140141992를 사용해 만들어진다.
맞춤형 면역 요법을 생성하기 위한 본 발명의 방법은, 정상적이거나 건강한 샘플과 비교하여 비정상적이거나 건강하지 않은 샘플에 존재하는 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 동정하기 위해 건강하지 않은 샘플로부터 추출된 핵산 및 정상적이고 건강한 기준 샘플로부터 추출된 핵산을 사용하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 체세포 돌연변이를 또는 차이를 갖는 이들 서열은 발현된 아미노산 서열을 인코딩한다. 일 구현예에서, 상기 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 발현하는 펩티드는, 특정 구현예에서 “네오-에피토프”로서 명세서 전체에 걸쳐 지칭될 수 있다.
당업자는, 용어 "네오-에피토프"가 정상적이고 비-암성 세포나 조직, 또는 배아 세포나 조직과 같은 기준 샘플에 존재하지 않지만, 질병 보유 조직, 예를 들어 암 세포에서 발견되는 에피토프를 지칭할 수도 있음을 이해할 것이다. 다른 구현예에서, 이는 대응하는 에피토프가 정상적인 비-암성 세포 또는 배아 세포에서 발견되지만, 암 세포 내의 하나 이상의 돌연변이로 인해 에피토프의 서열이 변화되어 네오-에피토프가 생성되는 상황을 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 돌연변이된 에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 에피토프의 양측면 상에 비-돌연변이된 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 네오-에피토프는 선형 에피토프이다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 용매-노출된 것으로 간주되고, 따라서 T 세포 항원 수용체에 접근 가능하다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 펩티드는 하나 이상의 면역 억제성 T 조절 네오-에피토프를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 동정되고 사용된 네오-에피토프는 면역 억제성 에피토프를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 동정되고 사용된 에피토프는 T 조절(T-reg) 세포를 활성화시키지 않는다.
다른 구현예에서, 네오-에피토프는 면역원성이다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 T-세포 에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적응 면역 반응 에피토프를 포함한다.
다른 구현예에서, 네오-에피토프는 단일 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 2개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 2개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 3개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 4개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 5개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 6개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 7개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 8개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 9개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 10개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 20개의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 적어도 1-10개, 11-20개, 20-30개, 및 31-40개의 돌연변이를 포함한다.
다른 구현예에서, 네오-에피토프는 상기 대상의 상기 질병이나 질환과 관련된다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 상기 대상의 상기 질병이나 질환의 원인이 된다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 상기 질병 보유 생물학적 샘플 내에 존재한다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 상기 질병 보유 생물학적 조직 내에 존재하지만 상기 질병이나 질환과 관련되거나 이의 원인이 되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 하나의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 2개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 3개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 4개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 5개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 6개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 7개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 8개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 9개의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 융합 펩티드는 10개 이상의 네오-에피토프를 포함한다.
일 구현예에서, 네오-에피토프를 동정하기 위한 단계는 비정상적이거나 또는 건강하지 않은 생물학적 샘플로부터 수득한 추출한 핵산을 시퀀싱하는 단계, 및 정상적이거나 건강한 생물학적 참고 샘플로부터 수득한 추출한 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 전체 게놈이 시퀀싱된다. 다른 구현예에서, 엑솜(exome)이 시퀀싱된다. 또 다른 구현예에서, 전사체가 시퀀싱된다. 다른 구현예에서, 네오-에피토프는 T 세포 수용체 시퀀싱을 사용해 동정된다.
다른 구현예에서, 네오-에피토프는 Pavlenko M, Leder C, Roos AK, Levitsky V, Pisa P. (2005) Identification of an immunodominant H-2D(b)-restricted CTL epitope of human PSA. Prostate. 15;64(1):50-9 (PSA neo-epitope); Maciag PC, Seavey MM, Pan ZK, Ferrone S, Paterson Y. (2008) Cancer immunotherapy targeting the high molecular weight melanoma-associated antigen protein results in a broad antitumor response and reduction of pericytes in the tumor vasculature. Cancer Res. 1;68(19):8066-75 (HMW-MAA epitope in HLA-A2 mice); Zhang KQ, Yang F, Ye J, Jiang M, Liu Y, Jin FS, Wu YZ. (2012) A novel DNA/peptide combined vaccine induces PSCA-specific cytotoxic T-lymphocyte responses and suppresses tumor growth in experimental prostate cancer. Urology.;79(6):1410.e7-13. doi: 10.1016/j.urology.2012.02.011. Epub 2012 Apr 17 (HLA-A2 epitope PSCA); Kouiavskaia DV, Berard CA, Datena E, Hussain A, Dawson N, Klyushnenkova EN, Alexander RB. (2009)Vaccination with agonist peptide PSA: 154-163 (155L) derived from prostate specific antigen induced CD8 T-cell response to the native peptide PSA: 154-163 but failed to induce the reactivity against tumor targets expressing PSA: a phase 2 study in patients with recurrent prostate cancer .J Immunother.;32(6):655-66 (HLA-A2 epitope PSA)에 개시된 바와 같은, 당업계에 공지된 네오-에피토프를 포함한다.
일 구현예에서, 용어 “게놈”은 생물체의 염색체에 있는 유전 정보의 총량에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 용어 “엑솜(exome)”은 게놈의 코딩 영역을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 “전사체(transcriptome)"는 모든 RNA 분자의 세트에 관한 것이다.
일 구현예에 따르면, 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)이고, 더 바람직하게는 RNA이고, 가장 바람직하게는 시험관 내 전사 RNA(Γν RNA) 또는 합성 RNA이다. 본 발명에 따라 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합에 의해 생산되고 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥이면서 선형 또는 공유적으로 원형으로 폐쇄된 분자로서 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산은 단리될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 “단리된 핵산”은 핵산이 (i) 시험관 내에서, 가령 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭되었거나, (ii) 클리닝에 의해 재조합적으로 생산되었거나, (iii) 예를 들어, 겔 전기 영동에 의한 절단 및 분리에 의해 정제되었거나, (iv) 예를 들어, 화학 합성에 의해 합성되었음을 의미한다. 핵은 세포 내 도입, 즉 세포의 형질감염을 위해, 특히, DNA 템플릿으로부터 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있는 RNA 형태로 사용될 수 있다. 또한, RNA는 안정화 서열, 캡핑 및 폴리아데닐화에 의해 적용 전에 변형될 수 있다.
당업자는, 기준 서열 대비 핵산 서열의 변화 또는 차이(뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실)가 용어 “돌연변이”에 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 비정상적인 샘플에 존재하며 정상 샘플에서 발견된지 않는 변화 또는 차이. "체세포 돌연변이(somatic mutation)"는 생식 세포(정자와 난자)를 제외한 임의의 신체 세포에서 발생할수 있고, 따라서 아이들에게 전해지지 않는다. 이들 변경은 (항상 그렇지는 않지만) 암이나 기타 질병을 유발할 수 있다. 일 구현예에서, 돌연변이는 비동의(non-synonymous) 돌연변이이다. 용어 “비동의 돌연변이”는 돌연변이, 바람직하게는 뉴클레오티드 치환이며, 번역 생성물의 아미노산 치환과 같은 아미노산 변화를 초래한다.
비정상적인 샘플이 종양이나 암 조직인 경우, 일 구현예에서, 돌연변이는 “암 돌연변이 시그너처”를 포함할 수 있다. 용어 “암 돌연변이 시그너처”는 비-암성 기준 세포와 비교하여 암 세포에 존재하는 돌연변이의 세트를 지칭한다.
디지털 핵형 검사(karyotyping)는 유전자 조건을 유발할 수 있는 주요 염색체 이상을 찾기 위해 염색체를 분석하는데 사용되는 기법이다. 일 구현예에서, 디지털 핵형 검사는 시퀀싱 및 비교 분석을 위해 염색체의 영역에 초점을 맞추기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 디지털 핵형 검사는 게놈 전체에 걸쳐 단리되고 열거된 특정 유전자좌로부터의 DNA의 짧은 서열을 사실상 분석하여 수행된다.
임의의 적합한 시퀀싱 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 차세대 시퀀싱(NGS) 기술이 사용된다. 3세대 시퀀싱 방법은 미래에 본 방법의 시퀀싱 단계를 가속화하기 위해 NGS 기술을 대체할 수 있다. 명료성을 위해: 본 발명의 문맥에 있어서의 용어 “차세대 시퀀싱”또는 “NGS”는 Sanger 화학으로 알려진 "통상의" 시퀀싱 방법과는 대조적으로, 전체 게놈을 작은 조각들로 분해함으로써 핵산 탬플릿을 전체 게놈을 따라 무작위로 병렬 판독하는 모든 새로운 고 처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술(대량 병렬 시퀀싱 기술로도 공지된)은 전체 게놈, 엑솜, 전사체(게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(methylome)(게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매주 짧은 기간에, 가령 1-2주 내에, 바람직하게는 1-7일 내에, 또는 가장 바람직하게는 24시간 내에 전달할 수 있고, 원칙적으로, 단일 세포 시퀀싱 접근법을 가능하게 한다. 상업적으로 이용 가능하거나 문헌에 언급된 다수의 NGS 플랫폼이 본 발명과 관련하여 사용될 수있으며, 이들은 다음에 상세히 개시되어 있다: Zhang 등의 2011: The impact of next- generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; 또는 Voelkerding 등의 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. 이러한 NGS 기술/플랫폼에 대한 비제한적인 예는 다음을 포함한다.
1) 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로 알려진 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis) 기술은 Roche-associated company 454 Life Sciences (Branford, Connecticut)의 GS-FLX 454 Genome Sequencer™에 적용되었으며, Ronaghi 등의 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365에 처음 설명되었다. 이 기술은 유제 PCR 증폭용 오일로 둘러싸인 PCR 반응물을 함유한 수성 미셀 내로 단일 가닥 DNA 결합 비드가 격렬하게 와류되어 캡슐화된 유제 PCR을 사용한다. 파이로시퀀싱 과정 중에, 뉴클레오티드 혼입이 중합효소로서 기록되는 동안 인산염 분자로부터 방출된 빛이 DNA 가닥을 합성한다.
2) Solexa(현재 캘리포니아 샌디에고 소재 Illumina Inc.,에 통합됨)에 의해 개발된 가역성 염료-터미네이터 기반의 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis) 접근법은, 예를 들어 Illumina Solexa Genome Analyzer™ 및 Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™에 적용되었다. 이 기술에서는 4개의 뉴클레오티드 모두가 DNA 중합 효소와 함께 플로우-셀 채널의 올리고-프라이밍된 클러스터 단편에 동시에 첨가된다. 브릿지 증폭은, 시퀀싱을 위해 형광 염색된 4 개의 뉴클레오티드로 클러스터 가닥을 연장시킨다.
3) 연결에 의한 시퀀싱(sequencing-by-ligation) 접근법은, 예를 들어 Applied Biosystems (Life Technologies Corporation, 칼스배드, 캘리포니아의 전신)의 SOLid™ 플랫폼에 적용되었다. 이 기술에서는 길이가 고정된 모든 가능한 올리고뉴클레오티드의 풀이 서열화된 위치에 따라 표지된다. 올리고뉴클레오티드는 어닐링되고 연결되며; 서열 일치를 위한 DNA 리가아제에 의한 우선적 연결은 그 위치에서 뉴클레오티드에 대한 참고 신호로 나타난다. 시퀀싱 전에, DNA는 유제 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 비드는 각각 동일 DNA 분자의 사본만을 함유하며, 유리 슬라이드 상에 침전된다. 두 번째 예로서, Dover Systems(살렘, 뉴 햄프셔)의 Polonator™ G.007 플랫폼 또한, 병렬 시퀀싱을 위해 무작위로 배열된, 비드계의 유제 PCR를 사용하여 DNA 단편을 증폭시킴으로써, 연결에 의한 시퀸싱 접근법을 사용한다.
4) 단일 분자 시퀀싱(single-molecule sequencing) 기술은 예컨대, Pacific Biosciences(먼로 파크, 캘리포니아)의 PacBio RS 시스템, 또는 Helicos Biosciences(캠브리지, 매사추세츠)의 HeliScope™ 플랫폼 등에 적용되었다. 이 기술의 뚜렷한 특징은 단일 DNA 또는 RNA 분자를 증폭없이 시퀀싱하는 능력이며, 이는 단일 분자 실시간(SMRT) DNA 시퀀싱으로서 정의된다. 예를 들어, HeliScope는 는 매우 민감한 형광 검출 시스템을 사용하여 각각의 뉴클레오티드가 합성될 때 직접 검출한다. 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 기초한 유사한 접근법이 Visigen Biotechnology(휴스턴, 텍사스)로부터 개발되었다. 기타 형광 기반 단일 분자 기술(fluorescence-based single-molecule techniques)은 U.S. Genomics(GeneEngine™) 및 Genovoxx(AnyGene™)에 의해 개발되었다.
5) 다양한 나노 구축물들이 사용되는, 단일 분자 시퀀싱을 위한 나노 기술이 사용되며, 이들은 가령, 칩에 배치되어 복제 중인 단일 가닥 상의 중합효소 분자의 움직임을 모니터링한다. 나노 기술에 기반한 접근법의 비제한적인 예는: Oxford Nanopore Technologies(옥스포드, 영국)의 GridON™ 플랫폼; Nabsys(프로비던스, 로드 아일랜드)에 의해 개발된 하이브리드화 지원형 나노 기공 시퀀싱(hybridization-assisted nano-pore sequencing, HANS™) 플랫폼; 및 프로브-앵커 조합 리게이션(cPAL™)으로 불리는 DNA 나노볼(DNB)을 이용한 독점적 리가아제 기반의 DNA 시퀀싱 플랫폼 기술 염기 서열 결정 플랫폼 등이다.
6) 단일 분자 시퀀싱을 위한 전자 현미경 기반의 기술은, 예를 들어 LightSpeed Genomics(서니베일, 캘리포니아) 및 Halcyon Molecular(레드우드 시티, 캘리포니아)에 의해 개발된 것들이다.
7) DNA의 중합화 도중에 방출되는 수소 이온의 검출에 기반한 이온 반도체 시퀀싱. 예를 들어, Ion Torrent Systems(샌프란시스코, 캘리포니아)는 마이크로 가공된 웰(wells)의 고밀도 어레이를 사용해 이 생화학 과정을 대량 병렬 방식으로 수행한다. 각각의 웰은 상이한 DNA 템플릿을 보유한다. 웰 아래는 이온 감지층이고, 그 아래는 독점적 이온 센서가 있다.
일부 구현예에서, DNA 및 RNA 제제들은 NGS에 대한 출발 물질로서의 역할을 한다. 이러한 핵산은, 가령 신선하거나, 급속냉동 되었거나, 프르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 종양 조직유래의 생물학적 샘플, 갓 단리된 세포 유래의 생물학적 샘플, 또는 환자의 말초 혈액에 존재하는 CTC 유래의 생물학적 샘플과 같은 샘플들로부터 쉽게 수득할 수 있다. 정상적인 비-돌연변이 게놈 DNA 또는 RNA는 정상 체세포 조직으로부터 추출될 수 있지만, 본 발명과 관련하여 생식 세포가 바람직하다. 생식 DNA 또는 RNA는 비혈액학적 악성 종양 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 추출된다. 비록 FFPE 조직이나 갓 단리된 단일 세포로부터 추출된 핵산이 고도로 단편화(fragmented)되어도, 이들은 NGS 응용에 적합하다.
엑솜 시퀀싱을 위한 몇 가지 표적화된 NGS 방법들이 문헌에 기술되어 있으며, 이들 모두는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다(검토는 Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51 참조). 이들 방법 중 많은 것들이(예를 들어, 게놈 포획, 게놈 파티셔닝, 게놈 농축 등으로 기술된) 하이브리드화 기술을 사용하며, 어레이기반(예: Hodges 등의 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) 및 액체기반(Choi 등의 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101) 하이브리드화 접근법을 포함한다. DNA 샘플 준비용 상업용 키트, 및 후속하여 엑솜 포획을 위한 상업용 키트도 판매되고 있는데: 예를 들어, Illumina Inc.(샌디에고, 캘리포니아)는 TruSeq™ DNA Sample Preparation Kit와 Exome Enrichment Kit TruSeq™ Exome Enrichment Kit를 제공하고 있다.
개시에 의해 제공되는 바와 같이, 돌연변이의 환자 종양 식별의 생검을 포함하여 종양 시퀀싱의 단계는 2주 이상 소요되지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, 종양 시퀀싱 단계는 약 1 내지 2주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 종양 시퀀싱 단계는 약 1주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 종양 시퀀싱 단계는 1주 미만 소요될 것이다.
본 발명과 관련하여, 용어 “RNA”는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고, 바람직하게는 리보뉴클레오티드 잔기로 완전히 또는 실질적으로 구성된 분자에 관한 것이다. “리보뉴클레오티드”는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 수산기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 “RNA”는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA와 같은 단리된 RNA, 본질적으로 순수 RNA, 합성 RNA 및 하나 이상의 뉴클레오티드를 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경함에 의해 자연 발생 RNA와 달라지는 수정된 RNA와 같은 재조합적에 의해 생성된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은, 예컨대 RNA의 말단에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드 등에 비-뉴클레오티드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-자연발생 뉴클레오티드 또는 합성된 뉴클레오티드나 데옥시뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연발생 RNA의 유사체라 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 “RNA”는 “mRNA”를 포함하고, 바람직하게는 “mRNA”에 관한 것이다. 용어 “mRNA”는 “메신저-RNA”를 의미하며, DNA 템플릿을 사용해 생성되고 펩티드나 폴리펩티드를 인코딩하는 “전사물(transcript)”에 관한 것이다. 일반적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA는 세포 내에서 및 시험관 내에서 제한된 반감기만을 가진다. 본 발명과 관련하여 mRNA는 DNA 템플릿으로부터의 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관 내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 다양한 시험관 내 전사 키트들이 시판되고 있다.
일 구현예에서, 질병 보유 샘플 및 건강한 샘플 유래의 핵산 서열들은 네오-에피토프를 동정하기 위해 비교된다. 네오-에피토프는 ORF 서열 내에서의 아미노산 서열 변화를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 펩티드 또는 단백질에 대한 “서열 변화”라는 용어는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및 아미노산 치환 변이체, 바람직하게는 아미노산 치환 변이체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이들 모든 서열 변화는 잠재적으로 새로운 에피토프를 생성할 수 있다.
일 구현예에서, 아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 단일 또는 둘 이상의 아미노산이 삽입된 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산의 아미노산-말단 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 아미노산 결실 변이체는 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산이 제거되는 것을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 아미노산 치환 변이체는 서열 중 하나 이상의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로한다.
모든 샘플은 ORF 내의 새로운 유전자 시퀀싱에 대해 분석된다. 상기 질병 보유 생물학적 샘플 및 건강한 생물학적 샘플로부터 추출된 핵산 서열 중의 하나 이상의 개방 해독 프레임(ORF)을 비교하기 위한 방법은 스크리닝 분석 또는 스크리닝 도구 및 관련된 디지털 소프트웨어를 사용하는 것을 포함한다. 생물정보학 분석을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 본 출원에 그 전체가 각각 참고로 통합된 미국 공개 번호 US 2013/0210645, US 2014/0045881 및 국제 공개 WO 2014/052707를 참조한다.
인간 종양은 일반적으로 많은 수의 체세포 돌연변이를 가지고 있다. 그러나, 임의의 특정한 유전자의 동일한 돌연변이는 종양에서 거의 발견되지 않는다(심지어 가장 일반적인 원인 돌연변이(driver mutation)의 대해서도 빈도가 낮다). 따라서, 일 구현예어서, 환자-특이적 종양 돌연변이를 포괄적으로 동정하는 본 발명의 방법은 맞춤형 면역 요법을 위한 표적을 제공한다.
개시에 의해 제공되는 바와 같이, 시퀀스 데이터로부터 항원을 식별하는 단계는 2주 이상 소요되지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, 시퀀스 데이터로부터 항원을 식별하는 단계는 약 1 내지 2주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 시퀀스 데이터로부터 항원을 식별하는 단계는 약 1주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 시퀀스 데이터로부터 항원을 식별하는 단계는주 미만 소요될 것이다.
일 구현예에서, 질병 보유 샘플로부터 동정된 돌연변이는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I 분자(MHCI) 상에 제시될 수있다. 일 구현예에서, 네오-에피토프 돌연변이를 포함하는 펩티드는 면역원성이며, 적응 면역계에 의해 '비-자가' 신항원으로서 인식된다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열을 사용하는 것은 표적화 면역 요법을 제공하며, 특정 구현예에서 상기 질환 또는 상태에 대한 T-세포 면역 반응을 치료적으로 활성화시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열을 사용하는 것은 표적화 면역 요법을 제공하며, 특정 구현예에서 상기 질환 또는 상태에 대한 적응 면역 반응을 치료적으로 활성화시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열은 치료적 항종양 또는 항암 T 세포 면역 반응을 제공하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열을 사용하는 것은 표적화 면역 요법을 제공하며, 특정 구현예에서 항종양 또는 항암 적응 면역 반응을 치료적으로 활성화시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열은 치료적 항자가면역 질환 T 세포 면역 반응을 제공하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열을 사용하는 것은 표적화 면역 요법을 제공하며, 특정 구현예에서 항자가면역 질환 적응 면역 반응을 치료적으로 활성화시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열은 치료적 항감염성 질환 T 세포 면역 반응을 제공하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열을 사용하는 것은 표적화 면역 요법을 제공하며, 특정 구현예에서 항자가면역 질환 적응 면역 반응을 치료적으로 활성화시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열은 치료적 항장기이식 거부반응 T 세포 면역 반응을 제공하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 네오-에피토프 서열을 사용하는 것은 표적화 면역 요법을 제공하며, 특정 구현예에서 항장기이식 거부반응 적응 면역 반응을 치료적으로 활성화시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 면역원성 반응의 존재는 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프의 존재와 상관된다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 T 세포 에피토프, 또는 적응 면역 반응 에피토프, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 네오-에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 면역원성 반응을 위해 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 각각의 아미노산 서열을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 면역원성 반응의 존재는 면역원성 에피토프를 포함하는 하나 이상의 네오-에피토프와 상관된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프는 펩티드에 포함된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프는 폴리펩티드에 포함된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프는 융합-폴리펩티드에 포함된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프는 유비퀴틴 폴리펩티드에 융합된다.
다른 구현예에서, 방법은 면역원성 T 세포 반응을 위해 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 각각의 아미노산 서열을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 면역원성 T 세포 반응의 존재는 T 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 네오-에피토프와 상관된다. 다른 구현예에서, 방법은 적응 면역 반응을 위해 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 각각의 아미노산 서열을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 적응 면역 반응의 존재는 적응 면역 에피토프를 포함하는 하나 이상의 네오-에피토프와 상관된다.
일 구현예에서, 제공된 맞춤형 면역 요법을 생성하기 위한 시스템 또는 방법에서 면역원성 T 세포 반응을 스크리닝하는 단계는, 예를 들어 T 세포 증식 분석, 상기 네오-에피토프로 활성화되고 51Cr-방출 분석 또는 3H-티미딘 분석을 사용하여 종양 세포와 공-배양된 T 세포를 사용하는 시험관 내 종양 퇴행 분석, ELISA 분석, ELIspot 분석, 및 FACS 분석(analysis)을 포함하는 당업계에 공지된 면역 반응 분석을 포함한다. (예컨대 미국특허 제8,771,702호, 및 유럽특허 EP_1774332_B1 참조, 이들은 그 전체가 본원에 포함되어 있다) 또 다른 구현예에서, 면역 반응 시험을 위한 스크리닝 단계는 비-T-세포 반응을 시험한다. 다른 구현예에서, 제공된 맞춤형 면역 요법을 생성하기 위한 시스템 또는 방법에서 비-T 세포 반응을 스크리닝하는 단계는, 사이토카인 생산을 검사하는 것이 사이토카인의 상이한 서브세트, 즉 IL-10 및 IL-1β에 초점이 맞추어 진다는 것을(예: 그 전체가 본원에 통합된 미국 특허 제8962319호 및 제177432호를 참조) 제외하고는, 예를 들어 T 세포에 대해 전술한 것과 유사한 분석을 포함하는, 당업계에 공지된 면역 반응 분석의 사용을 포함한다. 예를 들어, T 세포 면역 반응은 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 면역 요법으로 마우스를 면역화시킨 다음 면역화 후 약 10일 째에 비장을 채취하는 단계를 포함하는 51Cr 방출 분석에 의해 분석될 수 있으며, 여기서 비장세포는 이어서 피더세포로서 방사능 처리된 TC-1 세포(100 : 1, 비장 세포 : TC-1)와 함께 배양되고; 5일 동안 시험관 내에서 자극된 다음, 하나 이상의 네오-에피토프를 표적으로 하는 펩티드/폴리펩티드를 사용하여 표준 51Cr 방출 분석에 사용된다.
다른 구현예에서, 면역 반응을 스크리닝하는 단계는, 예를 들어 그 전체가 본원에 통합된 미국 특허 출원 공개 US-2011-0129499에 개시된 HLA-A2 트랜스제닉 마우스의 사용을 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 동정된 T 세포 네오-에피토프를 인코딩하거나 상기 동정된 T 세포 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 선택하고, 상기 서열을 약독화된 재조합 리스테리아 균주로 형질전환시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 동정된 적응 면역 반응 네오-에피토프를 인코딩하거나 상기 동정된 적응 면역 반응 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 선택하고, 상기 서열을 약독화된 재조합 리스테리아 균주로 형질전환시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 식별된 네오-에피토프를 인코딩하는 핵산은 PCR과 같은 표준 DNA 증폭 방법을 사용하여 생성된다.
개시에 의해 제공되는 바와 같이, 식별된 표적에 기초하여 DNA를 생성하는 단계는 4주 이상 소요되지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, 식별된 표적에 기초하여 DNA를 생성하는 단계는 약 3 내지 4주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 식별된 표적에 기초하여 DNA를 생성하는 단계는 약 2 내지 3주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 식별된 표적에 기초하여 DNA를 생성하는 단계는 약 1 내지 2주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 식별된 표적에 기초하여 DNA를 생성하는 단계는 약 1주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 종양 시퀀싱 단계는 1주 미만 소요될 것이다.
개시에 의해 제공되는 바와 같이, DNA를 태깅된 플라스미드로 클로닝하고 후속하여 리스테리아로 형질감염시키는 단계는 4주 이상 소요되지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, DNA를 태깅된 플라스미드로 클로닝하고 후속하여 리스테리아로 형질감염시키는 단계는 약 2 내지 4주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, DNA를 태깅된 플라스미드로 클로닝하고 후속하여 리스테리아로 형질감염시키는 단계는 약 2 내지 3주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, DNA를 태깅된 플라스미드로 클로닝하고 후속하여 리스테리아로 형질감염시키는 단계는 약 3주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, DNA를 태깅된 플라스미드로 클로닝하고 후속하여 리스테리아로 형질감염시키는 단계는 약 2주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, DNA를 태깅된 플라스미드로 클로닝하고 후속하여 리스테리아로 형질감염시키는 단계는 2주 미만 소요될 것이다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 시스템 또는 방법은 상기 T 세포 네오-에피토프의 발현과 분비를 확인하기 위해 상기 리스테리아 균주를 배양하고 특성화시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 시스템 또는 방법은 상기 적응 면역 반응 네오-에피토프의 발현과 분비를 확인하기 위해 상기 리스테리아 균주를 배양하고 특성화시키는 단계를 포함한다.
개시에 의해 제공되는 바와 같이, 배양 및 최적의 제품을 식별하기 위한 특성분석 단계는 2주 이상 소요되지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, 배양 및 최적의 제품을 식별하기 위한 특성분석 단계는 약 1 내지 2주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 배양 및 최적의 제품을 식별하기 위한 특성분석 단계는 약 1주 소요될 것이다. 또 다른 구현예에서, 배양 및 최적의 제품을 식별하기 위한 특성분석 단계는 1주 미만 소요될 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 시스템 또는 방법은 소정의 기간 동안 상기 대상에게 투여하기 위해 상기 리스테리아를 저장하거나, 상기 대상에게 상기 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 리스테리아 균주는 면역원성 조성물의 일부로서 투여된다.
II. 재조합 리스테리아 균주
일 구현예에서, 본 발명의 재조합 리스테리아 균주는 핵산 분자를 포함하며, 핵산 분자는 융합 폴리펩티드를 인코딩화하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드에 융합된 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 포함한다. 당업자는, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 본원에 개시된 하나 이상의 펩티드는 원래부터 면역원성일 수 있고, 그 면역원성은 면역원성 폴리펩티드, 예컨대 tLLO, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열 등과 융합되거나 혼합됨으로써 강화될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 재조합 리스테리아 균주는 핵산 분자를 포함하며, 핵산 분자는 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함한다. 일 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 약독화된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드는 면역원성 폴리펩티드 또는 그의 단편에 각각 융합된다.
다른 구현예에서, 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열은 이종 항원이나 이의 단편에 융합되지 않는다. 다른 구현예에서, 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열은 본원에 개시된 하나 이상의 펩티드에 융합되지 않는다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 면역원성 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드는 면역원성 폴리펩티드 또는 그의 단편에 면역원성 조성물의 일부로서 혼합된다.
일 구현예에서, 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질은 추정 PEST 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 절단된 actA 단백질은 PEST-포함 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 절단된 actA 단백질은 추정 PEST-포함 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, PEST 아미노산(AA) 서열은 절단된 LLO 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열은 KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (서열번호 1)이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 유래의 다른 LM PEST AA 서열에 대한 항원의 융합은 또한 항원의 면역원성을 향상시킬 것이다.
본 개시의 방법 및 조성물의 N-말단 LLO 단백질 단편은, 다른 구현예에서, 서열번호 3을 포함한다. 다른 구현예에서, 단편은 LLO 신호 펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 단편은 서열번호 4를 포함한다. 다른 구현예에서, 단편은 서열번호 4로 대략 구성된다. 다른 구현예에서, 단편은 서열번호 4로 필수적으로 구성된다. 다른 구현예에서, 단편은 서열번호 4에 상응한다. 다른 구현예에서, 단편은 서열번호 4와 상동이다. 다른 구현예에서, 단편은 서열번호 4의 단편과 상동이다. 일 구현예에서, 사용된 절단된 LLO는 신호 서열을 배제한다. 다른 구현예에서, 절단된 LLO는 신호 서열을 포함한다. 활성 도메인이 없는, 특히 시스테인 484가 없는, 어떤 절단된 LLO라도 본 개시의 방법 및 조성물에 적합하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예에서, PEST AA 서열, 서열번호 1을 포함하여 임의의 절단된 LLO에 대해 이종 항원의 융합은 항원의 세포 매개된 및 항종양 면역원성을 증가시킨다.
본 개시의 백신을 구축하기 위해 이용되는 LLO 단백질은, 다른 구현예에서, 다음 서열을 갖는다:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE (유전자은행 수탁번호 P13128; 서열번호 2; 핵산서열은 유전자은행 수탁번호 X15127에 명시된다 (서열번호81)). 이 서열에 해당하는 프로단백질의 처음 25 AA는 신호서열이고 박테리아에 의해 분비되는 경우 LLO로부터 절단된다. 따라서, 본구현예에서 전장 활성 LLO 단백질은 504 잔기 길이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 LLO 단편은 본원에 개시된 백신에 포함되는 LLO 단편의 소스로서 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 조성물 및 방법에 이용되는 LLO 단백질의 N-말단 단편은 다음 서열을 갖는다:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD (서열번호 3).
다른 구현예에서, LLO 단편은 본원에서 사용된 LLO 단백질의 약 AA 20-442에 해당한다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 다음 서열을 가진다:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD (서열번호 4).
다른 구현예에서, 용어 “N-말단 LLO 단편”, “절단된 LLO”, “ΔLLO” 또는 이들의 문법적 동등물은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 비-용혈성인 LLO의 단편을 가리킨다. 다른 구현예에서, 이 용어는 추정 PEST 서열을 포함하는 LLO 단편을 지칭한다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 활성화 도메인의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 시스테인 484를 포함하는 영역의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다. 다른 구현예에서, 상기 LLO 단편은 전체가 참조로 본원에 통합된 미국 특허 제8,771,702호에 상세하게 기재된 콜레스테롤 결합 도메인(CBD)의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다.
일 구현예에서, 본 발명은 리스테리오리신 O(LLO) 단백질을 포함하는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 LLO 단백질은 상기 LLO 단백질의 콜레스테롤 결합 도메인(CBD)의 잔기 C484, W491, W492, 또는 이들의 조합의 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 C484, W491, 및 W492 잔기는 서열번호 2 또는 80의 잔기 C484, W491, 및 W492인 반면, 또 다른 구현예에서, 당업자에게 공지된 바와 같이, 이들은 서열 정렬을 사용하여 추론될 수 있는 상응하는 잔기이다. 일 구현예에서, 잔기 C484, W491, W492는 돌연변이된 것이다. 일 구현예에서 돌연변이는 치환이고, 다른 구현예에서는 결실이다. 일 구현예에서 전체 CBD가 돌연변이되는 반면, 다른 구현예에서는 CBD의 일부가 돌연변이되며, 다른 구현예에서는 CBD 내의 특정 잔기만이 돌연변이된다.
일 구현예에서, 본 발명은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 돌연변이된 LLO 단백질 또는 그의 단편은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 그의 단편의 돌연변이된 영역에 대한 비-LLO 펩티드의 치환을 포함하며, 돌연변이된 영역은 C484, W491 및 W492으로부터 선택된 잔기를 포함한다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 N-말단 LLO 단편이다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 적어도 492개 아미노산(AA) 길이이다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 492-528개 AA 길이이다. 다른 구현예에서, 비-LLO 펩티드는 1-50개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 돌연변이된 영역은 1-50개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 비-LLO 펩티드는 돌연변이된 영역과 동일한 길이이다. 다른 구현예에서, 비-LLO 펩티드는 돌연변이된 영역과 상이한 길이를 가진다. 다른 구현예에서, 치환은 용혈성 활성과 관련하여 불활성화 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 야생주 LLO에 비해 용혈 활성에서의 감소를 나타낸다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 비용혈성이다.
본원에 개시된 바와 같이, 돌연변이 LLO 단백질이 생성되었고, LLO의 잔기 C484, W491, 및 W492는 알라닌 잔기로 치환되었다(실시예 25). 돌연변이된 LLO 단백질, mutLLO는 대장균(E. coli) 발현 시스템에서 발현되고 정제될 수 있었으며(실시예 27), 야생주 LLO에 비해 실질적으로 감소된 용혈 활성을 나타냈다(실시예 28).
다른 구현예에서, 본 발명은 (a) 돌연변이 LLO 단백질의 콜레스테롤-결합 도메인을 포함하는 내부 결실을 함유하는 돌연변이 LLO 단백질; 및 (b) 관심 이종 펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 구현예에서, 콜레스테롤-결합 도메인의 서열은 서열번호 68 또는 69에 제시된다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 11-50개 아미노산 내부 결실이다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 용혈 활성에 대해 불활성화 시킨다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 야생주 LLO에 비해 용혈 활성에서의 감소를 나타낸다.
다른 구현예에서, 본 발명은 (a) 돌연변이된 LLO 단백질; 및 (b) 관심 이종 펩티드를 포함하는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 돌연변이된 LLO 단백질은 내부 결실을 포함하며, 상기 내부 결실은 돌연변이된 LLO 단백질의 콜레스테롤-결합 도메인의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 1-11개 아미노산 내부 결실이다. 다른 구현예에서, 콜레스테롤-결합 도메인의 서열은 서열번호 68 또는 69에 제시된다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 용혈 활성에 대해 불활성화 시킨다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 야생주 LLO에 비해 용혈 활성에서의 감소를 나타낸다.
본 발명의 방법 및 조성물의 돌연변이 영역은, 다른 구현예에서, 서열번호 2 또는 80의 잔기 C484를 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 상동성 LLO 단백질의 상응하는 시스테인 잔기를 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 서열번호 2 또는 80의 잔기 W491을 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 상동 LLO 단백질의 상응하는 트립토판 잔기를 포함한다.　 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 서열번호 2 또는 80의 잔기 W492를 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 상동 LLO 단백질의 상응하는 트립토판 잔기를 포함한다. 상동 단백질의 상응하는 잔기를 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 서열 정렬을 포함한다.　
다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 잔기 C484 및 W491을 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 잔기 C484 및 W492를 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 잔기 W491 및 W492를 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 잔기 C484, W491 및 W492를 포함한다.　
다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 돌연변이 영역은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 그의 단편의 콜레스테롤-결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열번호 2 또는 80의 잔기 470-500, 470-510 또는 480-500으로 이루어진 돌연변이 영역은 이의 CBD(잔기 483-493)를 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 이의 단편의 CBD의 단편이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 각각 CBD의 단편인 잔기 C484, W491, 및 W492는 알라닌 잔기로 돌연변이 되었다(실시예 25). 또한, 본원에 개시된 바와 같이, CBD의 단편인 잔기 484-492는 NY-ESO-1로부터의 이종 서열로 치환되었다(실시예 26). 다른 구현예에서, 돌연변이 영역은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 이의 단편의 CBD와 중복된다. 예를 들어, 서열번호 2 또는 80의 잔기 470-490, 480-488, 490-500, 또는 486-510으로 이루어진 돌연변이 영역은 이의 CBD를 포함한다. 다른 구현예에서, 단일 펩티드는 신호 서열에서 결실을 가질 수 있고 CBD에서 돌연변이 또는 치환을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 돌연변이 영역의 길이는 1-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 4-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 5-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 6-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 7-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 8-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 9-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 10-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-2개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-3개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-3개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 12-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-15개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-20개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-20개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-150개 AA이다.
본 발명의 방법 및 조성물의 치환 돌연변이는, 다른 구현예에서, LLO 단백질 또는 그의 단편의 돌연변이된 영역이 동등한 수의 이종 AA로 대체된 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 돌연변이된 영역의 크기보다 더 많은 수의 이종 AA가 도입된다. 다른 구현예에서, 돌연변이된 영역의 크기보다 더 적은 수의 이종 AA가 도입된다.
다른 구현예에서, 치환 돌연변이는 단일 잔기의 점 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 치환 돌연변이는 2개 잔기의 점 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 치환 돌연변이는 3개 잔기의 점 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 치환 돌연변이는 3개 초과 잔기의 점 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 치환 돌연변이는 여러개의 잔기의 점 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 점 돌연변이에 포함된 다수의 잔기는 인접한다. 다른 구현예에서, 점 돌연변이에 포함된 다수의 잔기는 인접하지 않는다.
본 발명의 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 돌연변이된 영역을 대체하는 비-LLO 펩티드의 길이는, 다른 구현예에서, 1-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 4-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 5-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 6-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 7-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 8-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 9-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 10-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-2개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-3개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-3개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 12-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-15개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-20개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-20개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-150개 AA이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 LLO 단편의 길이는 적어도 484개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 484개 AA 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 489개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 489개 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 493개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 493개 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 500개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 500개 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 505개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 505개 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 510개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 510개 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 515개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 515개 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 520개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 520개 초과이다. 다른 구현예에서, 길이는 적어도 525개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 520개 초과이다. 본원의 LLO 단편의 길이를 언급할 때, 신호 서열이 포함된다. 따라서, CBD의 제1 시스테인의 번호는 484이고, AA 잔기의 총 숫자는 529개이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 (a) 돌연변이된 LLO 단백질; 및 (b) 본원에 개시된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 포함하는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이를 포함하는 본원에 개시된 약독화된 리스테리아 균주를 제공하고, 여기서 상기 돌연변이된 LLO 단백질은 내부 결실을 포함하며, 상기 내부 결실은 돌연변이된 LLO 단백질의 콜레스테롤-결합 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 콜레스테롤-결합 도메인의 서열은 서열번호 68 또는 69에 제시된다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 1-11, 1-50, 또는 11-50개 아미노산 내부 결실이다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 용혈 활성에 대해 불활성화 시킨다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 야생주 LLO에 비해 용혈 활성에서의 감소를 나타낸다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 융합 펩티드다. 다른 구현예에서, "융합 펩티드"는 펩티드 결합 또는 다른 화학 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 단백질을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 다른 구현예에서, 단백질은 펩티드 또는 다른 화학 결합에 의해 직접 서로 연결되어 있다. 다른 구현예에서, 단백질은 2개 이상의 단백질 사이에서 하나 이상의 AA(예, "스페이서")와 함께 연결되어 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 돌연변이 LLO 단백질이 생성되었고, LLO의 잔기 C484, W491, 및 W492는 항원 NY-ESO-1로부터의 CTL 에피토프로 치환되었다(실시예 26). 돌연변이된 LLO 단백질, mutLLO는 대장균(E. coli) 발현 시스템에서 발현되고 정제될 수 있었으며(실시예 27), 야생주 LLO에 비해 실질적으로 감소된 용혈 활성을 나타냈다(실시예 28). 당업자는, 본원에 개시된 방법 또는 공정에 의해 동정된 임의의 네오-에피토프가 LLO의 CBD를 치환하거나 대체하기 위해 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물의 내부 결실의 길이는 다른 구현예에서는, 1-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 4-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 5-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 6-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 7-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 8-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 9-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 10-11개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-2개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-3개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 1-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-3개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 2-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-4개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-5개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-6개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-7개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-8개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-9개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 3-10개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 12-50개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-15개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-20개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 11-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-20개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 15-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-25개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-30개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 20-150개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-35개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-40개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-60개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-70개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-80개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-90개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-100개 AA이다. 다른 구현예에서, 길이는 30-150개 AA이다.
다른 구현예에서, 내부 결실을 포함하는 본 발명의 돌연변이된 LLO 단백질은 내부 결실을 제외하고는 전체 길이이다. 다른 구현예에서, 돌연변이된 LLO 단백질은 추가적인 내부 결실을 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이된 LLO 단백질은 2개 이상의 추가적인 내부 결실을 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이된 LLO 단백질은 C-말단 단부로부터 절단된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 내부 결실은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 이의 단편의 CBD를 포함한다.　 예를 들어, 서열번호 2 또는 80의 잔기 470-500, 470-510, 또는 480-500으로 이루어진 내부 결실은 이의 CBD(잔기 483-493)를 포함한다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 이의 단편의 CBD의 단편이다. 예를 들어, 잔기 484-492, 485-490, 및 486-488은 서열번호 2 또는 80의 CBD의 모든 단편이다. 다른 구현예에서, 내부 결실은 돌연변이된 LLO 단백질 또는 이의 단편의 CBD와 중복된다. 예를 들어, 서열번호 2 또는 80의 470-490, 480-488, 490-500, 또는 486-510으로 이루어진 내부 결실은 이의 CBD를 포함한다.
다른 구현예에서, 절단된 LLO 단편은 LLO 단백질의 첫 441개 AA를 포함한다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 LLO의 첫 420개 AA를 포함한다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 야생형 LLO 단백질의 비용혈성 형태이다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-25로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-50으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-75로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-100으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-125로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-150으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1175로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-200으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-225로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-250으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-275로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-300으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-325로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-350으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-375로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-400으로 이루어진다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 약 잔기 1-425로 이루어진다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 상기 AA 범위 중 하나에 상응하는 상동 LLO 단백질의 잔기들을 포함하고 있다. 다른 구현예에서, 잔기 번호들은 위에 열거된 잔기 번호들과 정확히 일치할 필요는 없으며; 예를 들어, 상동 LLO 단백질이 본원에서 이용되는 LLO 단백질에 대해 삽입체나 결실을 가지는 경우, 그 잔기 번호는 적절히 조정될 수 있다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 당업계에 공지된 임의의 다른 LLO 단편이다.
상동 단백질의 상응하는 잔기를 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 서열 정렬을 포함한다.　 다른 구현예에서, 상동 LLO는 70% 초과의 LLO 서열에 대한(예, 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한) 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동 LLO는 72% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다 다른 구현예에서, 상동성은 75% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 78% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 80% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 82% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 83% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 85% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 87% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 88% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 90% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 92% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 93% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 95% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 96% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 97% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 98% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 99% 초과의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 100%의 서열번호 2-4 또는 80 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다.
용어 “PEST 아미노산 서열”, “PEST 서열”, “PEST 서열 펩티드”, “펩티드” 또는 “PEST 서열 포함 단백질 또는 펩티드”는 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 당업자는, 이들 용어가 일 구현예에서는 N-말단 LLO이거나, 다른 구현예에서는 절단된 ActA 단백질인, 절단된 LLO 단백질을 포함한다는 것을 이해할 것이다. PEST 서열 펩티드는 당업계에 공지되어 있고, 전체가 참조로 본원에 통합된 미국 특허 일련번호 제7,635,479호 및 미국 특허 공보 일련번호 제2014/0186387호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 원핵 생물의 PEST 서열은 Rechsteiner 및 Roberts(TBS 21:267-271,1996)가 L. 모노사이토게네스에 대해 기술한 것과 같은 방법에 따라 일상적으로 동정될 수 있다. 대안적으로, 다른 원핵 생물의 PEST 아미노산 서열도 이 방법에 기초하여 동정할 수 있다. PEST 아미노산 서열이 기대되는 다른 원핵 생물은 다른 리스테리아 종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, L. 모노사이토게네스 단백질 ActA는 4개의 이러한 서열을 포함한다. 이들은 KTEEQPSEVNTGPR(서열번호 5), KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(서열번호 6), KNEEVNASDFPPPPTDEELR(서열번호 7), 및 RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(서열번호 8)이다. 또한 스트렙토코쿠스 종 유래의 스트렙톨리신 O는 PEST 서열을 포함한다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 스트렙톨리신 O는 아미노산 35-51에서 PEST 서열 KQNTASTETTTTNEQPK(서열번호 9)를 포함하며 스트렙토코쿠스 이퀴시밀리스 스트렙톨리신 O는 아미노산 38-54에서 PEST-유사 서열 KQNTANTETTTTNEQPK(서열번호 10)를 포함한다. 또한, PEST 서열은 항원 단백질 내에 포매(embedded)될 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 본원 개시의 목적을 위해, PEST 서열 융합에 관한 경우 "융합"이란, 항원 단백질이 항원과 항원의 한쪽 말단에 연결되거나 또는 항원 내에 내장된 PEST 아미노산 서열을 둘 다 포함한다는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, PEST 서열 또는 PEST 포함 폴리펩티드는 융합 단백질의 일부가 아니며, 폴리펩티드는 이종 항원을 포함하지 않는다.
용어 “핵산 서열", “핵산 분자”“폴리뉴클레오티드”또는 “핵산 구축물”은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 원핵 서열, 진핵 mRNA, 진핵 mRNA 유래 cDNA, 진핵 생물(예, 포유류) DNA의 게놈 DNA 서열, 심지어 합성 DNA 서열을 포함하되 이에 한정되지 않는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭할 수 있다. 또한, 이 용어는 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체를 포함하는 서열을 지칭한다. 용어는 한 줄로 늘어선 적어도 두 개의 염기-당-붕산 조합물을 지칭할 수도 있다. 용어는 핵산 중합체의 단량체 단위를 지칭할 수도 있다. RNA는, 일 구현예에서, tRNA(전이 RNA), snRNA(작은 핵 RNA), rRNA(리보솜 RNA), mRNA(메신저 RNA), 안티센스 RNA, 작은 억제성 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 및 리보자임의 형태일 수 있다. siRNA 및 miRNA의 사용이 기술되었다(Caudy AA 외, Genes & Devel 16:2491-96 및 여기에 인용된 참조 문헌). DNA는 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 선형 DNA, 또는 염색체 DNA 또는 이들 군의 유도체의 형태일 수 있다. 또한, 이들 형태의 DNA 및 RNA는 단일, 이중, 삼중 또는 사중 가닥일 수 있다. 이 용어는 또한, 다른 유형의 백본을 포함하지만 동일한 염기를 포함할 수 있는 인공 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 인공 핵산은 PNA(펩티드 핵산)이다. PNA는 펩티드 백본 및 뉴클레오티드 염기를 포함하며, 일 구현예에서, DNA 및 RNA 분자 모두에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 뉴클레오티드는 변형된 옥세탄이다. 다른 구현예에서, 뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 변형된다. 다른 구현예에서, 인공 핵산은 당업계에 공지된 자생 핵산의 인산염 백본의 임의의 다른 변이체를 포함한다. 포스포로티오에이트 핵산 및 PNA의 사용은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Neilsen PE의 문헌(Curr Opin Struct Biol 9:353-57); 및 Raz NK 등의 문헌(Biochem Biophys Res Commun. 297: 1075-84)에 기재되어 있다. 핵산의 생산 및 사용은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds. 및 Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in in eukaryotic cells(2003) Purchio 및 G. C. Fareed에 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자는 에피솜 또는 플라스미드로 벡터로부터 발현된다. 또 다른 구현예에서, 플라스미드는 항생제 선택의 부재 시에 재조합 리스테리아 백신 균주에 안정적으로 유지된다. 다른 구현예에서, 플라스미드는 재조합 리스테리아에 항생제 내성을 부여하지 않는다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 면역원성 폴리펩티드 또는 이의 단편은 ActA 단백질 또는 이의 단편이다. 일 구현예에서, ActA 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함한다:
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPLIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHTTLILAMLAIGVFSLGAFIKIIQLRKNN (서열번호 11).
이 서열에 대응하는 전단백질의 첫 29개의 AA는 신호 서열이며, 박테리아에 의해 분비될 때 ActA 단백질로부터 절단된다. 일 구현예에서, ActA 폴리펩티드 또는 펩티드는 상기 서열번호 11의 AA 1-29인 신호 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, ActA 폴리펩티드 또는 펩티드는 상기 서열번호 11의 AA 1-29인 신호 서열을 포함하지 않는다.
일 구현예에서,절단된 ActA 단백질은 ActA 단백질의 N-말단 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA 단백질은 ActA 단백질의 N-말단 단편이다. 일 구현예에서, 절단된 ActA 단백질은 서열번호 12에 제시된 서열을 포함한다:
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP (서열번호 12).
다른 구현예에서, ActA 단편은 서열번호 12에서 제시되는 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 절단된 ActA 단백질은 서열번호 13에 명시된 서열을 포함한다: MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKG (서열번호 13).
다른 구현예에서, ActA 단편은 당업계에 공지된 임의의 다른 ActA 단편이다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 면역원성 단편이다.
다른 구현예에서, ActA 단백질은 서열번호 14에 제시된 서열을 포함한다.
M G L N R F M R A M M V V F I T A N C I T I N P D I I F A A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S F E F P P P P T E D E L E I M R E T A P S L D S S F T S G D L A S L R S A I N R H S E N F S D F P L I P T E E E L N G R G G R P T S E E F S S L N S G D F T D D E N S E T T E E E I D R L A D L R D R G T G K H S R N A G F L P L N P F I S S P V P S L T P K V P K I S A P A L I S D I T K K A P F K N P S Q P L N V F N K K T T T K T V T K K P T P V K T A P K L A E L P A T K P Q E T V L R E N K T P F I E K Q A E T N K Q S I N M P S L P V I Q K E A T E S D K E E M K P Q T E E K M V E E S E S A N N A N G K N R S A G I E E G K L I A K S A E D E K A K E E P G N H T T L I L A M L A I G V F S L G A F I K I I Q L R K N N (서열변호 14). 이 서열에 대응하는 전단백질의 첫 29개의 AA는 신호 서열이며, 박테리아에 의해 분비될 때 ActA 단백질로부터 절단된다. 일 구현예에서, ActA 폴리펩티드 또는 펩티드는 서열번호 14의 AA 1-29인 신호 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, ActA 폴리펩티드 또는 펩티드는 서열번호 14의 AA 1-29인 신호 서열을 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 절단된 ActA 단백질은 서열번호 15에 명시된 서열을 포함한다:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G (서열번호 15). 다른 구현예에서, 서열번호 15에 명시된 절단된 ActA는 ActA/PEST1로 지칭된다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 첫 30개부터 아미노산 122까지 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호 15는 전장 ActA 서열의 첫 30개부터 아미노산 122까지 포함한다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 서열번호 14의 첫 30개부터 아미노산 122까지 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호 15는 서열번호 14의 첫 30개부터 아미노산 122까지 포함한다.
다른 구현예에서, 절단된 ActA 단백질은 서열번호 16에 명시된 서열을 포함한다:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K (서열번호 16). 다른 구현예에서, 서열번호 16에 명시된 절단된 ActA는 ActA/PEST2로 지칭된다. 다른 구현예에서, 서열번호 16에 명시된 절단된 ActA는 LA229로 지칭된다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 아미노산 30부터 아미노산 229까지 포함한다. 서열번호 16은 전장 ActA 서열의 약 아미노산 30부터 약 아미노산 229까지 포함한다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 서열번호 14의 약 아미노산 30부터 약 아미노산 229까지 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호 16은 서열번호 14의 약 아미노산 30부터 약 아미노산 229까지 포함한다.
다른 구현예에서, 절단된 ActA 단백질은 서열번호 17에 명시된 서열을 포함한다:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S (서열번호 17). 다른 구현예에서, 서열번호 17에 명시된 절단된 ActA는 ActA/PEST3으로 지칭된다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 첫 30개부터 아미노산 332까지 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호 17은 전장 ActA 서열의 첫 30개부터 아미노산 332까지 포함한다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 서열번호 14의 약 첫 30개부터 아미노산 332까지 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호 17은 서열번호 14의 첫 30개부터 아미노산 332까지 포함한다.
다른 구현예에서, 절단된 ActA 단백질은 서열번호 18에 명시된 서열을 포함한다:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S F E F P P P P T E D E L E I M R E T A P S L D S S F T S G D L A S L R S A I N R H S E N F S D F P L I P T E E E L N G R G G R P T S E (서열번호 18). 다른 구현예에서, 서열번호 18에 명시된 절단된 ActA는 ActA/PEST4를 지칭한다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 첫 30개부터 아미노산 399까지 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호 18은 전장 ActA 서열의 첫 30개부터 아미노산 399까지 포함한다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 서열번호 14의 첫 30개부터 아미노산 399까지 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호 18은 서열번호 14의 첫 30개부터 아미노산 399까지 포함한다.
다른 구현예에서, “절단된 ActA” 또는 “ΔActA”는 PEST 도메인을 포함하는 ActA의 단편을 지칭한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 PEST 서열을 포함하는 ActA 단편을 지칭한다.
다른 구현예에서, 절단된 ActA 단백질을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드는 서열번호 19에 명시된 서열을 포함한다:
atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca.
다른 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 서열번호 19에서 제시되는 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 ActA 단백질의 단편을 인코딩하는 임의의 다른 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, ActA 단편은 ActA 단백질의 약 첫 100개의 AA로 이루어진다.
다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-25로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-50으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-75로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-100으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-125로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-150으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-175로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-200으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-225로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-250으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-275로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-300으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-325로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-338로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-350으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-375로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-400으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-450으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-500으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-550으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-600으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-639로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-100으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-125로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-150으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-175로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-200으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-225로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-250으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-275로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-300으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-325로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-338로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-350으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-375로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-400으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-450으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-500으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-550으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 1-600으로 이루어진다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 약 잔기 30-604로 이루어진다.
다른 구현예에서, ActA 단편은 상기 AA 범위 중 하나에 대응하는 상동 ActA 단백질의 잔기를 함유한다. 다른 구현예에서, 잔기 번호들은 위에 열거된 잔기 번호들과 정확히 일치할 필요는 없으며; 예를 들어, 상동 ActA 단백질이 본원에서 이용되는 ActA 단백질에 대해 삽입체 또는 결실을 가지는 경우, 그에 따라 잔기 번호는 조정될 수 있다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 당업계에 공지된 임의의 다른 ActA 단편이다.
다른 구현예에서, 상동 ActA는 70% 초과의 ActA 서열에 대한(예를 들어, 서열번호 11-18 중 하나에 대한) 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동 ActA는 72% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 75% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 78% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 80% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 82% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 83% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 85% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 87% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 88% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 90% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 92% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 93% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 95% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 96% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 97% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 98% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 99% 초과의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상동성은 100%의 서열번호 11-18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다.
당업자는, 본원에 개시된 임의의 핵산 서열과 관련하여 용어 "상동성"은 상응하는 고유 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
상동성은, 일 구현예에서, 당업계에 널리 기재된 방법에 의해 서열 정렬을 위한 컴퓨터 알고리즘으로 결정된다. 예를 들어, 핵산 서열 상동성의 컴퓨터 알고리즘 분석은, 가령 BLAST, DOMAIN, BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT 및 TREMBL 패키지와 같은 사용 가능한 많은 수의 소프트웨어 패키지를 활용하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, “상동성”은 68% 초과의 본원에 개시된 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, “상동성”은 70% 초과의 본원에 개시된 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, “상동성”은 72% 초과의 본원에 개시된 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 구현예에서, 동일성은 75% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 78% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 80% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 82% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 83% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 85% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 87% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 88% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 90% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 92% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 93% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 95% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 96% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 97% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 98% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 99% 초과이다. 다른 구현예에서, 동일성은 100%이다.
다른 구현예에서, 상동성은 당업계에 널리 기재된 방법인 후보 서열 하이브리드화를 통해 결정된다(예: “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds.(1985); Sambrook 외, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel 외, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 참조). 예를 들어, 하이브리드화 방법들은 적당한 조건 내지 엄격한 조건 하에서 천연 카스파제 펩티드를 인코딩하는 DNA의 보체에 대하여 수행될 수 있다. 하이브리드화 조건은, 예를 들어, 하기를 포함하는 용액 내에서 42℃에서 밤새 인큐베이션하는 것이다: 10% 내지 20% 포름아미드, 5 X SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란황산, 및 20 μg/ml 변성되고 전단된 연어 정자 DNA.
일 구현예에서, 본원에서 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 항생제 저항성 유전자가 결여되어 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아는 파고리소좀(phagolysosome)을 탈출할 수 있다.
일 구현예에서 리스테리아 게놈은 일 구현예에서 독성 인자인, 내인성 actA 유전자의 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 이종 항원 또는 항원 폴리펩티드는 리스테리아 염색체에서 LLO를 갖는 프레임에 통합된다. 다른 구현예에서, 통합된 핵산 분자는 ActA와 함께 프레임에서 actA 유전자 자리로 통합된다. 다른 구현예에서, ActA를 인코딩하는 염색체 핵산은 항원을 인코딩하는 핵산 분자로 대체된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 항원에 의해 구성된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 항원 단편이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 항원은 하나 이상의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원은 이종 항원이거나 자기항원이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 이종 항원 또는 자기항원은 종양-관련 항원이다. 당업자는, 용어 “이종(heterologous)”이 박테리아로부터 자연적으로 또는 정상적으로 발현되지 않는 항원 또는 그의 부분을 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 이종 항원은 리스테리아 균주로부터 자연적으로 또는 정상적으로 발현되지 않는 항원을 포함한다. 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 자연 발생 종양-관련 항원이다. 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 합성 종양-관련 항원이다. 또 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 키메라 종양-관련 항원이다. 또 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 하나 이상의 네오-에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원은 종양-관련 신항원이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 하나 이상의 펩티드는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 폴리펩티드는 본원에 개시된 펩티드에 융합된 절단된 LLO 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 서열을 더 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자는 절단된 LLO 단백질, 절단된 ActA 단백질 또는 PEST 서열 펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는데, 여기에서 절단된 LLO 단백질, 절단된 ActA 단백질 또는 PEST 서열 펩티드는 이종 항원에 융합되지 않는다. 다른 구현예에서, 제1 개방 해독 프레임은 절단된 LLO 단백질을 인코딩한다. 다른 구현예에서, 제1 개방 해독 프레임은 절단된 ActA 단백질을 인코딩한다. 다른 구현예에서, 제1 개방 해독 프레임은 절단된 LLO 단백질을 인코딩한다. 다른 구현예에서, 제1 개방 해독 프레임은 절단된 ActA 단백질을 인코딩한다. 다른 구현예에서, 제1 개방 해독 프레임은 절단된 LLO 단백질을 인코딩한다. 다른 구현예에서, 제1 개방 해독 프레임은 N-말단 ActA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되는 절단된 ActA 단백질을 인코딩한다.
당업자는, 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 “항원,”, “항원 단편,”“항원 부분,”“이종 단백질,”“이종 단백질 항원,”“단백질 항원,”“항원,”“항원성 폴리펩티드,”또는 이들의 문법적 동등물은 대상의 세포에 존재하는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 가공되어 제시되는 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드, 펩티드, 또는 재조합 펩티드를 지칭할 수 있으며, 이는 숙주에 존재하거나, 다른 구현예에서는 숙주에 의해 검출될 때 면역 반응의 탑재를 유도한다는 것을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 항원은 숙주에 대하여 이물일 수 있다. 다른 구현예에서, 항원은 숙주에 존재할 수 있지만 면역학적 내성 때문에 숙주가 이에 대하여 면역 반응을 유발하지 않는다. 다른 구현예에서, 항원은 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 신항원이며, 여기서 하나 이상의 네오-에피토프는 T 세포 에피토프이다. 다른 구현예에서, 항원 또는 이의 펩티드 단편은 T 세포 에피토프인 하나 이상의 네오-에피토프를 포함한다.
다른 구현예에서, 항원은 적어도 하나의 네오-에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 항원은 적어도 하나의 네오-에피토프를 포함하는 신항원이다. 일 구현예에서, 네오-에피토프는 면역계에 의해 이전에 인지되지 않은 에피토프이다. 신항원은 종종 종양 항원과 관련되며 종양 형성 세포에서 발견된다. 단백질이 생화학적 경로 내에서 글리코실화, 인산화, 또는 단백질 가수분해와 같은 추가 변형을 겪게되면 신항원 및, 더 나아가, 신항원 결정 인자(네오-에피토프)가 형성될 수 있다. 이는, 단백질 구조를 변경함으로써 새로운 또는 “네오”에피토프를 생산할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 미니 유전자 핵산 구축물을 포함하고, 상기 구축물은 키메라 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 상기 키메라 단백질은:
박테리아 분비 신호 서열;
유비퀴틴(Ub) 단백질;
상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하며,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 하나 이상의 펩티드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배치되거나 작동 가능하게 연결된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 박테리아 신호 서열은 리스테리아 신호 서열이며, 이는 다른 구현예에서 hly 신호 서열 또는 actA 신호 서열이다. 다른 구현예에서, 박테리아 신호 서열은 당업계에 공지된 임의의 다른 신호 서열이다. 다른 구현예에서, 미니유전자 핵산 구축물을 포함하는 재조합 리스테리아는 각각의 개방 해독 프레임 사이에서 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 리보좀 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2개 이상의 개방 해독 프레임을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 미니유전자 핵산 구축물을 포함하는 재조합 리스테리아는 각각의 개방 해독 프레임 사이에서 샤인-달가노 리보좀 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 1개 내지 4개의 개방 해독 프레임을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 각각의 개방 해독 프레임은 상이한 펩티드를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 것은 박테리아 분비 신호 서열(SS), 유비퀴틴(Ub) 단백질 및 펩티드 서열을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주이다. 다른 구현예에서, 핵산 구축물은 박테리아 분비 신호 서열, 유비퀴틴 단백질 및 펩티드 서열을 포함하는 키메라 단백질을 인코딩한다. 일 구현예에서, 키메라 단백질은 하기의 방식(SS-Ub-펩티드)으로 배열된다.
일 구현예에서, 핵산 구축물은 펩티드 모이어티의 카르복시-말단에 대응하는 코돈을 포함하고, 이어서 단백질 합성의 종료를 보장하기 위해 2개의 정지 코돈을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 제공된 미니유전자 핵산 구축물은 카르복시 말단에서 구별되는 펩티드 모이어티를 함유하는 재조합 단백질의 패널을 용이하게 하도록 설계된 발현 시스템을 포함한다. 이는, 일 구현예에서, 박테리아 분비 신호 서열-유비퀴틴-펩티드(SS-Ub-펩티드) 구축물 중 하나를 인코딩하는 서열을 템플릿으로서 이용하는 PCR 반응에 의해 달성된다. 일 구현예에서, Ub 서열의 카르복시-말단 영역 내로 연장되는 프라이머를 사용하고 원하는 펩티드 서열에 대한 코돈을 프라이머의 3' 단부에 도입하면, 새로운 SS-Ub-펩티드 서열이 단일 PCR 반응에서 생성될 수 있다(본원의 구현예 참조). 박테리아 프로모터 및 박테리아 분비 신호 서열의 처음 몇 개의 뉴클레오티드를 인코딩하는 5' 프라이머는 모든 구축물들에 대해 동일할 수 있다. 이 구축물의 개략적인 표시는 본원의 도 26a 내지 26c에 제공되어 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 또한, 신호 펩티드 또는 신호 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 구축물 또는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 박테리아 분비 신호 서열은 리스테리아 분비 신호 서열이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 것의 방법 및 조성물의 융합 단백질은 리스테리오리신 O(LLO) 유래의 LLO 신호 서열을 포함한다. 당업자는, 본원에 개시된 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 항원 또는 펩티드는 신호 서열, 예컨대 리스테리아 신호 서열, 예컨대 용혈소(hly) 신호 서열 또는 actA 신호 서열 등의 사용을 통해 발현될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대안적으로, 예를 들어, 외부 유전자가 융합 단백질의 생성 없이 리스테리아 모노사이토게네스 프로모터로부터 다운스트림 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 박테리아성이다(리스테리아성 또는 비-리스테리아성). 일 구현예에서, 신호 펩티드는 박테리아 고유의 것이다. 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 박테리아에 이질적인 것이다. 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 secA1 신호 펩티드와 같은 리스테리아 모노사이토게네스 유래의 신호 펩티드이다. 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 락토콕커스 락티스 유래의 Usp45 신호 펩티드, 또는 바실러스 안트라시스 유래의 보호 항원 신호 펩티드이다. 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 리스테리아 모노사이토게네스 유래의 p60 신호 펩티드와 같은 secA2 신호 펩티드이다. 또한, 재조합 핵산 분자는 p60 또는 이의 단편을 인코딩하는 제3 폴리펩티드를 임의로 포함한다. 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 Tat 신호 펩티드, 예컨대 B. 서브틸리스 Tat 신호 펩티드이다(예를 들어, PhoD). 일 구현예에서, 신호 펩티드는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 동일한 번역 판독 프레임 내에 있다.
다른 구현예에서, 분비 신호 서열은 리스테리아 단백질 유래이다. 다른 구현예에서, 분비 신호는 ActA300 분비 신호이다. 다른 구현예에서, 분비 신호는 ActA100 분비 신호이다.
일 구현예에서, 핵산 구축물은 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함한다. 일 구현예에서, 유비퀴틴은 전장 단백질이다. 당업자는, 본원에 개시된 발현된 구축물(본원에 개시된 핵산 구축물로부터 발현된) 내 유비퀴틴은 숙주 세포 시토졸로의 도입 시 가수분해효소의 작용을 통해, 핵산 구축물로부터 발현된 재조합 키메라 단백질의 나머지로부터 카르복시-말단에서 절단됨을 이해할 것이다. 이는 펩티드 모이어티의 아미노-말단을 유리시켜, 숙주 세포 시토졸에서 펩티드(길이는 특정 펩티드에 따라 다름)를 생성한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 구축물에 의해 인코딩된 펩티드의 길이는 8 내지 10개의 아미노산(AA)이다. 다른 구현예에서, 펩티드는 10-20개 AA 길이이다. 다른 구현예에서, 펩티드는 21-30개 AA 길이이다. 다른 구현예에서, 펩티드는 31-50개 AA 길이이다. 다른 구현예에서, 펩티드는 51-100개 AA 길이이다.
일 구현예에서, 본원에 개시되는 핵산 분자는 대사 효소를 인코딩하는 제2 개방 해독 프레임을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 결여되어 있는 내인성 유전자를 보완한다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 재조합 리스테리아 균주의 염색체에서 돌연변이화되어 있는 내인성 유전자를 보완한다. 다른 구현예에서, 제2 개방 해독 프레임에 의해 인코딩되는 대사 효소는 알라닌 라세마아제 효소(dal)이다. 다른 구현예에서, 제2 개방 해독 프레임에 의해 인코딩되는 대사 효소는 D-아미노산 전이효소(dat)이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아 균주는 내인성 dal/dat 유전자에 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 리스테리아는 dal/dat 유전자가 결여되어 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 핵산 분자는 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 제1 개방 해독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 제2 개방 해독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 각각의 개방 해독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.
“대사 효소”는, 다른 구현예에서, 숙주 박테리아에 의해 필요한 영양소의 합성에 관여된 효소를 의미한다. 다른 구현예에서, 상기 용어는 숙주 박테리아에 의해 필요한 영양소의 합성에 필요한 효소를 지칭한다. 다른 구현예에서, 상기 용어는 숙주 박테리아에 의해 사용되는 영양소의 합성에 관여된 효소를 가리킨다. 다른 구현예에서, 용어는 숙주 박테리아의 지속되는 성장을 위해 요구되는 영양소의 합성에 관여된 효소를 가리킨다. 다른 구현예에서, 효소는 영양소의 합성을 위해 요구된다.
다른 구현예에서, 재조합리스테리아는 약독화된 영양요구성 균주이다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 그 전체가 참조로 본원에 통합된 미국특허 제8,114,414호에 기재된 Lm-LLO-E7 균주이다.
일 구현예에서, 약독화된 균주는 Lm dal(-)dat(-) (Lmdd)이다. 다른 구현예에서, 약독화된 균주는 Lm dal(-)dat(-)ΔactA (LmddA)이다. LmddA는, 독성 유전자 actA 의 결실로 인해 약독화되고 원하는 이형 항원를 위한 플라스미드 또는 dal 유전자의 보완에 의한 생체 내 및 시험관 내 절단 LLO 발현을 보유하는 리스테리아 백신 벡터에 기반한다.
또 다른 구현예에서 약독화 균주는 LmddA이다. 다른 구현예에서, 약독화된 균주는 LmΔactA이다. 다른 구현예에서, 약독화된 균주는 LmΔPrfA이다. 다른 구현예에서, 약독화된 균주는 LmΔPrfA*이다. 다른 구현예에서, 약독화된 균주는 LmΔPlcB이다. 다른 구현예에서, 약독화된 균주는 LmΔPlcA이다. 다른 구현예에서, 균주는 상기 언급된 균주들 중 어느 하나의 이중 돌연변이체 또는 삼중 돌연변이체이다. 다른 구현예에서, 이 균주는 리스테리아 기반 백신의 고유한 속성인 강력한 보강제(adjuvant) 효과를 발휘한다. 다른 구현예에서, 이 균주는 EGD 리스테리아 백본으로부터 구축된다. 다른 구현예에서, 본 발명에 사용되는 균주는 비용혈 LLO를 발현하는 리스테리아 균주이다.
다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 영양요구성 돌연변이체이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 비타민 합성 유전자를 인코딩하는 유전자가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 판토텐산 합성 효소를 인코딩하는 유전자가 결핍되어 있다.
일 구현예에서, D-알라닌이 결핍된 리스테리아의 AA 균주의 생성은, 예를 들어, 당업자에게 공지된 많은 방법으로 달성될 수 있는데, 상기 방법은 결실 돌연변이 유발, 삽입 돌연변이 유발, 그리고 프레임 이동 돌연변이의 생성을 야기하는 돌연변이 유발, 단백질의 조기 종결을 야기하는 돌연변이, 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 조절 서열의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 돌연변이는 재조합 DNA 기술을 이용하거나 돌연변이 화학 물질이나 방사선에 이어서 돌연변이체의 선택을 이용하여 기존의 돌연변이 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 다른 구현예에서, 결실 돌연변이체가 바람직한데, 영양 요구성 표현형의 낮은 복귀 가능성을 동반하기 때문이다. 다른 구현예에서, 본원에 제시된 프로토콜에 따라 생성되는 D-알라닌의 돌연변이체는 간단한 실험실 배양 분석으로 D-알라닌의 부재시에 성장할 수 있는 능력에 대해 시험될 수 있다. 다른 구현예에서, 이 화합물의 부재 시에 성장할 수 없는 돌연변이체들은 추가 연구를 위해 선택된다.
다른 구현예에서, 상기 언급된 D-알라닌 관련 유전자에 더하여, 본원에 개시된, 대사 효소의 합성에 수반하는 다른 유전자들이 리스테리아의 돌연변이 생성을 위한 표적으로 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 대사 효소는 재조합 박테리아 균주의 염색체의 나머지 부분이 결여된 내인성 대사 유전자를 보완한다. 일 구현예에서, 내인성 대사 유전자는 염색체에서 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 내인성 대사 유전자는 염색체로부터 결실된다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 아미노산 대사 효소이다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 세포벽 합성에 사용되는 아미노산의 형성을 촉매한다. 다른 구현예에서, 상기 대사 효소는 알라닌 라세마제 효소이다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 D-아미노산 전이효소 효소이다. 각각의 가능성은, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 개별적인 구현예를 나타낸다.
일 구현예에서, 영양요구성 리스테리아 균주는 상기 영양요구성 리스테리아 균주의 영양요구성을 보완하는 대사 효소를 포함하는 에피솜 발현 벡터를 포함한다. 다른 구현예에서, 구축물은 에피솜 방식으로 리스테리아 균주에 포함되어 있다. 다른 구현예에서, 외래 항원은 재조합 리스테리아 균주에 들어있는 플라스미드 벡터로부터 발현된다. 다른 구현예에서, 에피솜 발현 벡터는 항생제 내성 마커가 결여되어 있다. 일 구현예에서, 본원에 개시되는 방법 및 조성물의 항원은 PEST 서열을 포함하는 폴리펩티드에 융합된다.
다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 아미노산(AA) 대사 효소가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 D-글루탐산 합성효소 유전자가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 dat 유전자가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 dal 유전자가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 dga 유전자가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 디아미노피멜산(diaminopimelic acid)의 합성에 관여하는 유전자가 결핍되어 있다. CysK. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 비타민 B12 독립적 메티오닌 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 trpA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 trpB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 trpE이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 asnB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 gltD이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 gltB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 leuA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 argG이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 thrC이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 상술한 유전자들 중 하나 이상이 결핍되어 있다.
다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 합성효소 유전자가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 AA 합성 유전자이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 folP이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 디하이드로우리딘 합성효소 과 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ispD이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ispF이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 포스포에놀피루베이트 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 hisF이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 hisH이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 fliI이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 리보솜 큰 소단위 슈도우리딘 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ispD이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 2작용 GMP 합성효소/글루타민 아미도전이효소 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 cobS이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 cobB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 cbiD이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 유로포르피린-III C-메틸전이효소/ 유로포르피리노겐-III 합성효소 이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 cobQ이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 uppS이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 truB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 dxs이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 mvaS이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 dapA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ispG이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 folC이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 시트르산염 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 argJ이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 3-데옥시-7-포스포헵투론산 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 인돌-3-글리세롤-인산 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 안트라닐산염 합성효소/글루타민 아미도전이효소 성분이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 menB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 메나퀴논-특이적 이소코리스민산염 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 I 또는 II이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 포스포리보실아미노이미다졸-숙시노카르복사이미드 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 carB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 carA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 thyA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 mgsA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 aroB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 hepB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 rluB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ilvB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ilvN이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 alsS이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 fabF이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 fabH이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 슈도우리딘 합성효소이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 pyrG이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 truA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 pabB이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 atp 합성효소 유전자이다(예를 들어, atpC, atpD-2, aptG, atpA-2 등).
다른 구현예에서, 상기 유전자는 phoP이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 aroA이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 aroC이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 aroD이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 plcB이다.
다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 펩티드 수송체가 결핍되어 있다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ABC 수송체/ATP-결합/투과효소 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 올리고펩티드 ABC 수송체/올리고펩티드-결합 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 올리고펩티드 ABC 수송체/ 투과효소 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 아연 ABC 수송체/ 아연-결합 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 당 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 인산염 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 ZIP 아연 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 EmrB/QacA 과의 약물 내성 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 황산염 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 양성자-의존성 올리고펩티드 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 마그네슘 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 포름산염/아질산염 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 스퍼미딘/퓨트레신 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 Na/Pi-공동수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 당 인산염 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 글루타민 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 주 촉진자(Major Facilitator) 과 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 글리신 베타인/L-프롤린 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 몰리브덴 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 테코익산 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 코발트 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 암모늄 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 아미노산 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 세포 분열 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 망간 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 철 화합물 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 말토오스/말토덱스트린 ABC 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 Bcr/CflA 과 약물 내성 수송체이다. 다른 구현예에서, 상기 유전자는 상기한 단백질(들) 중 하나의 서브유닛이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 것은 재조합 리스테리아에 도달하기 위해 리스테리아를 형질전환시키는 데 사용되는 핵산 분자이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 핵산은 독성 유전자가 결여된 리스테리아를 형질전환시키는 데 사용된다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 리스테리아 게놈 내에 통합되고 비-작용성 독성 유전자를 운반한다. 다른 구현예에서, 독성 유전자는 재조합 리스테리아 게놈에서 변이된다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 리스테리아 게놈에 존재하는 내인성 유전자를 비활성화시키는 데에 사용된다. 또 다른 구현예에서, 독성 유전자는 actA 유전자, inlA 유전자, 및 inlB 유전자, inlC 유전자, inlJ 유전자, plbC 유전자, bsh 유전자, 또는 prfA 유전자이다. 당업자는, 독성 유전자가 재조합 리스테리아 내의 독성과 연관되기 위한, 당업계에 공지된 임의의 유전자일 수 있다는 것을 이해해야 한다.
또 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 inlA 돌연변이체, inlB 돌연변이체, inlC 돌연변이체, inlJ 돌연변이체, prfA 돌연변이체, actA 돌연변이체, dal/dat 돌연변이체, prfA 돌연변이체, plcB 결실 돌연변이체, 또는 plcA와 plcB, 또는 actA와 inlB 모두가 결여된 이중 돌연변이체이다. 다른 구현예에서, 리스테리아는 이들 유전자의 개별적 또는 조합 형태의 결실 또는 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 유전자들 중 각각 하나가 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 actA, prfA 및 dal/dat 유전자를 포함하여, 본원에 개시된 임의의 유전자 중 적어도 하나 및 최대 10개까지 결여되어 있다. 다른 구현예에서, prfA 돌연변이체는 D133V prfA 돌연변이체이다.
일 구현예에서, 생 약독화된 리스테리아는 재조합 리스테리아이다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 게놈 internalin C(inlC) 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 게놈 actA 유전자 및 게놈 internalin C 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 인접하는 세포로의 리스테리아의 전위(translocation)는 actA 유전자 및/또는 inlC 유전자의 결실에 의해 억제되는데, 이는 상기 과정에 연관되어서, 백신 골격으로서 증가된 면역원성 및 유용성을 가지고 예기치 않게 높은 수준의 약독화 결과를 야기하게 된다.
일 구현예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등은 리스테리아 균주의 염색체가 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등은 리스테리아 균주의 염색체 및 임의의 에피솜 유전적 요소에서 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등은 독성 균주의 게놈에서 결여되어 있다. 일 구현예에서, 독성 유전자는 염색체에서 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 독성 유전자는 염색체로부터 결실된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 약독화된다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 actA 독성 유전자가 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 prfA 독성 유전자가 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 inlB 유전자가 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 상기 actA와 inlB 유전자가 모두 결여되어 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 inlB유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 및 inlB 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB, 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB, 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB, 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 재조합 리스테리아 균주는 다음 유전자 중 임의의 단일 유전자 또는 조합의 불활성화 돌연변이를 포함한다: actA, dal, dat, inlB, inlC, prfA, plcA, plcB.
용어 "돌연변이" 및 그 문법적 상당물은, 서열(핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 돌연변이 또는 개질 중 어느 유형을 포함하며, 및 결실 돌연변이, 말단 절단(truncation), 불활성화, 파괴(disruption), 또는 전좌를 포함한다는 것이 숙련자에 의해 이해될 것이다. 이러한 종류의 돌연변이는 본 기술분야에 쉽게 공지되어 있다.
일 구현예에서, 대사 효소를 인코딩하는 플라스미드 또는 본원에서 개시된 보완 유전자를 포함하는 영양요구성 박테리아를 선별하기 위해, 형질전환된 영양요구성 박테리아는, 아미노산 대사 유전자 또는 보완 유전자의 발현을 위해 선별될 배지에서 성장된다. 다른 구현예에서, D-글루탐산 합성을 위한 영양 요구성 세균은 D-글루탐산 합성을 위한 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되고, 영양 요구성 세균은 D-글루탐산의 부재에서 성장할 것이며, 플라스미드로 형질전환되지 않았거나, 또는 D-글루탐산 합성을 위한 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 발현하지 않는 영양 요구성 세균은 성장하지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, D-알라닌 합성을 위한 영양 요구성 박테리아는, 플라스미드가 D-알라닌 합성을 위한 아미노산 대사 효소를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함할 경우 본 개시의 플라스미드로 형질전환되고 발현할 때, D-알라닌의 부재 중 성장할 것이다. 필요한 성장 인자, 보충제, 아미노산, 비타민, 항생제 기타 등등을 포함하거나 결여된 적절한 배지를 제조하는 이러한 방법은, 본 기술분야에서 주지되어 있고,(Becton-Dickinson, 뉴저지 프랭클린 레이크스)에서 시판되고 있다. 각각의 방법은 본원에 개시된 개별적인 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 플라스미드를 포함하는 영양요구성 박테리아가 적절한 배지에 선택되었다면, 박테리아는 선택적 압력의 존재 중 증식된다. 이러한 전파는 영양요구성 인자 없는 배지에서 세균을 성장시키는 것을 포함한다. 영양 요구성 세균 내의 아미노산 대사효소를 발현하는 플라스미드의 존재는 이 플라스미드가 세균과 함께 복제할 것이며, 이에 따라 지속적으로 플라스미드를 숨기는 세균을 위해 선별하는 것을 보장한다. 숙련자라면, 본 발명과 본원에서의 방법들이 장착되는 경우, 플라스미드를 포함하는 영양 요구성 세균이 성장하고 있는 배지의 부피를 조정함으로써 리스테리아 백신 벡터의 생산 규모를 용이하게 크게 할 수 있을 것이다.
숙련자라면 다른 구현예에서, 다른 영양 요구성 균주들과 보완 시스템이 본 발명에 사용하기 위해 채택된다는 것을 이해할 것이다.
일 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원은 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원을 인코딩하는 유전자는 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원은 링커 펩티드를 통해 작동 가능하게 부착된다. 다른구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편 및 이종 항원은 이종 펩티드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편은 이종 항원에 대하여 N-말단이다. 다른 구현예에서,말단 LLO 단백질 단편은 단독으로, 즉 비융합된 형태로, 발현 및사용된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편은 융합 단백질의 N-최말단부이다. 다른 구현예에서, 절단된 LLO는 N-말단 LLO에 이르도록 C-말단에서 절단된다. 다른 구현예에서, 절단된 LLO는 비-용혈성 LLO이다.
일 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편 및 이종 항원은 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편 및 이종 항원을 인코딩하는 유전자는 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편 및 이종 항원은 링커 펩티드를 통해 작동 가능하게부착된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편 및 이종 항원은 이종 펩티드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편은 이종 항원에 대하여 N-말단이다. 다른 구현예에서,말단 ActA 단백질 단편은 단독으로, 즉 비융합된 형태로, 발현 및사용된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편은 융합 단백질의 N-최말단부이다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 N-말단 ActA에 이르도록 C-말단에서 절단된다.
일 구현예에서, 본원에 개시되는재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩티드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 플라스미드를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 핵산은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주 내 플라스미드 내에 있다. 다른 구현예에서, 플라스미드는 상기 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 통합하지 않는 에피솜 플라스미드이다. 다른 구현예에서, 플라스미드는 상기 리스테리아 균주의 염색체에 통합하는 통합 플라스미드(integrative plasmid)이다. 다른 구현예에서, 플라스미드는 멀티카피 플라스미드이다.
일 구현예에서, 이종 항원은 종양-관련 항원이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된조성물 및 방법의재조합 리스테리아 균주는 종양 세포에 의해 발현되는 이종 항원성 폴리펩티드를 발현한다. 일 구현예에서, 종양-관련 항원은 전립선 특이적 항원(PSA)이다. 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원이다. 또 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 미국 특허 공보 제US2011/014279호에 기술된 Her2/neu 키메라 항원으로, 상기 공보는 그 전체가 참고로서 본원에 통합된다. 또 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 혈관형성 항원이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 항원 펩티드이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 종양 항원으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 감염성 질환 항원으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 자기항원으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드는 혈관신생 항원으로부터 유래된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드가 유래되는 항원은 진균류 병원균, 박테리아, 기생충, 연충(helminth) 또는 바이러스이다. 다른 구현예에서, 본원의 펩티드가 유래되는 항원은 파상풍 톡소이드, 인플루엔자 바이러스 유래 헤마글루티닌 분자, 디프테리아 톡소이드, HIV gp120, HIV gag 단백질, IgA 프로테아제, 인슐린 펩티드 B, 스폰고스포라 수브테라네아 항원, 비브리오스(vibriose) 항원, 살모넬라 항원, 폐렴 구균 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 헤모필루스 인플루엔자 외막 단백질, 헬리코박터 파이로리 우레아제, 나이세리아 뇌수막염 필린, N. 임질 필린, 흑색종 관련 항원 (TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나제, MART-1, HSP-70, 베타-HCG), HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35 또는 HPV-45 인간 유두종 바이러스 유래 인간 유두종 바이러스 항원 E1 및 E2, 종양 항원 CEA, ras 단백질, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 p53 단백질, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 Muc1, 메소텔린(mesothelin), EGFRVIII 또는 pSA로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 펩티드는 하기 질병 중 하나와 연관된 항원으로부터 유래된다: 콜레라, 디프테리아, 헤모필루스, A형 간염, B형 간염, 인플루엔자, 홍역, 뇌수막염, 볼거리, 백일해, 천연두, 페렴구균성 폐렴, 소아마비, 광견병, 풍진, 파상풍, 폐결핵, 장티푸스, 대상포진, 백일해, 황열병, 에디슨병으로부터의 면역원 및 항원, 알러지, 아나필락시스, 부르턴 증후군, 고형 종양 및 혈액 매개 종양을 포함하는 암, 하시모토 갑상선염, 다발성 근염, 피부근염, 제1 당뇨병, 후천성 면역결핍증, 신장, 심장, 췌장, 폐, 뼈 및 간 이식과 같은 이식 거부, 그레이브스병, 다선 자가면역 질병, 간염, 현미경적 다발성동맥염, 결절성 다발동맥염, 천포창, 원발 쓸개관간경화증, 악성 빈혈, 만성 소화 장애증, 항체-매게 신염, 사구체 신염, 류미티스성 질병, 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 혈청반응 음성 척추관절염, 비염, 소그렌 증후군, 전신 경화증, 경화성 담관염, 베게너 육아종증, 포진성 피부염, 건선, 백반증, 다발성 경화증, 뇌척수염, 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 램버트-이튼 증후군, 공막, 상공막, 포도막염, 만성 피부점막 칸디다증, 두드러기, 유아기 일과성 저감마글로불린혈증, 골수종, X-연성 과IgM혈증, 비스코트-올드리치 증후군, 모세혈관 확장성 운동실조증, 자가면역 용혈성 빈열, 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 호중구감소증, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 아밀로이드증, 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 말라리아 시르쿰스포로자이트 단백질(malarial circumsporozite protein), 미생물 항원, 바이러스 항원, 자가항원, 및 리스테리아증.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드가 유래되는 항원은 종양-연관 항원으로서, 일 구현예에서, 다음과 같은 종양 항원들 중 하나이다: MAGE(흑색종-연관 항원 E) 단백질, 예를 들어, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, 티로시나제; 돌연변이체 ras 단백질; 돌연변이체 p53 단백질; p97 흑색종 항원, 진행 암과 연관된 ras 펩티드 또는 p53의 펩티드; 자궁경부암과 연관된 HPV 16/18 항원, 유방암과 연관된 KLH 항원, 대장암과 연관된 CEA(암 배아 항원), gp100, 흑색종과 연관된 MART1 항원, 또는 전립선암과 연관된 PSA 항원. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 대한 항원은 흑색종-연관 항원으로서, 일 구현예에서, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나제, HSP-70, 베타-HCG 또는 이들의 조합이다. 본 분야에서 공지된 다른 종양-연관 항원은 본 발명에서 또한 고려된다.
일 구현예에서, 펩티드는 미국 특허 출원 제12/945,386호에 기재된 키메라 Her2 항원으로부터 유래되며, 상기 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다른 구현예에서, 펩티드는 HPV-E7(HPV16 또는 HPV18 균주로부터), HPV-E6(HPV16 또는 HPV18 균주로부터), Her-2/neu, NY-ESO-1, 텔로머라아제(TERT, SCCE, CEA, LMP-1, p53, 카르복시 안하이드라아제 IX(CAIX), PSMA, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), HMW-MAA, WT-1, HIV-1 Gag, 프로테이나제 3, 티로시나제 관련 단백질 2, PSA(전립선-특이 항원), EGFR-III, 서바이빈, 아폽토시스 반복의 바큘로 저해제-함유 5(BIRC5), LMP-1, p53, PSMA, PSCA, Muc1, PSA(전립선-특이 항원) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 항원으로부터 유래된다.
일 구현예에서, 본 발명의 리스테리아에 의해 발현되는 폴리펩티드는 신경펩티드 성장 인자 길항제일 수도 있으며, 일 구현예에서는 [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] 물질 P, [Arg6, D-Trp7,9, NmePhe8]물질 P(6-11)이다. 이들 및 관련된 구현예들은 당업자에 의해 이해된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 종양 관련 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는데, 여기에서 항원은 HPV-E7 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 HPV-E7 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 전체 E7 단백질 또는 이의 단편은 LLO 단백질 또는 이의 절단 또는펩티드,단백질 또는 이의 절단 또는 펩티드, 또는유사 서열-포함 펩티드에 융합되어 본 개시의 조성물 및 방법의 재조합 폴리펩티드 또는 펩티드를 생성한다. 전체 또는 단편의 공급원으로서 이용되는 E7 단백질은, 다른 구현예에서, 서열을 갖는다
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (서열번호 20). 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 20의 상동체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 20의 변이체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 20의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 20의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 20의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 20의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 20의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, E7 단백질의 서열은:
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ (서열번호 21)이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 21의 상동체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 21의 변이체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 21의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 21의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 21의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 21의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 21의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, E7 단백질은 다음의 GenBank 항목 중 하나에 명시된 서열을 갖는다: M24215 (서열번호 83), NC_004500 (서열번호 84), V01116 (서열번호 85), X62843 (서열번호 86), 또는 M14119 (서열번호 87). 다른 구현예에서, E7 단백질은 위 GenBank 항목 중 하나로부터의 서열의 상동체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 위 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 변이체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 위 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 위 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 위 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 위 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 위 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 이성질체의 단편이다.
일 구현예에서, HPV 항원은 HPV 16이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-18이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-16 및 HPV-18로부터 선택된다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-31이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-35이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-39이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-45이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-51이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-52이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-58이다. 다른 구현예에서, HPV는 고-위험 HPV 유형이다. 다른 구현예에서, HPV는 점막 HPV 유형이다.
일 구현예에서, HPV E6는 HPV-16 유래이다. 다른 구현예에서, HPV E7는 HPV-16 유래이다. 다른 구현예에서, HPV E6는 HPV-18 유래이다. 다른 구현예에서, HPV E7는 HPV-18 유래이다. 다른 구현예에서, HPV-매개 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 개선시키기 위한 본 개시의 조성물 또는 방법에서 E7 항원 대신 또는 이에 추가하여 HPV E6 항원이 이용된다. 다른 구현예에서, HPV-16 E6 및 E7은 HPV-18 E6 및 E7 대신 또는 이와 조합하여 이용된다. 이러한 구현예에서, 재조합 리스테리아는 염색체로부터 HPV-16 E6 및 E7을, 그리고 플라스미드로부터 HPV-18 E6 및 E7을 발현할 수 있거나, 또는 그 역으로 발현할 수도 있다. 다른 구현예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 본원에서 개시된 재조합 리스테리아에 존재하는 플라스미드로부터 발현된다. 다른 구현예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 본원에서 개시된 재조합 리스테리아의 염색체로부터 발현된다. 다른 구현예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 각각의 HPV 균주로부터의 각각의 E6 및 E7 항원이 플라스미드 또는 염색체로부터 발현되는 경우를 비롯하여, 상기 구현예들과 임의의 조합으로 발현된다.
일 구현예에서, 본원에서 개시된 재조합 리스테리아 균주는 종양 관련 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는데, 여기에서 종양 관련 항원은 Her-2/neu펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 종양 관련 항원은 Her-2/neu 항원을 포함한다. 일 구현예에서, Her-2/neu 펩티드는 키메라 Her-2/neu 항원(cHer-2)을 포함한다.
일 구현예에서, 약독화된 영양요구성 리스테리아 백신 균주는병독성 유전자 actA 의 결실에 의해 약독화되고 dal 유전자의 보완에 의해 생체내 및 시험관내Her2/neu 발현을 위한 플라스미드를 보유하는 리스테리아 백신 벡터를 기반으로 한다. 일 구현예에서, 리스테리아 균주는 리스테리올리신 O(LLO)의 처음 441개 아미노산에 융합된 키메라 Her2/neu 단백질을 발현하고 분비한다. 다른 구현예에서, 리스테리아는 dal, dat 및 actA 내인성 유전자에서 돌연변이를 갖는 dal/dat/actA 리스테리아이다. 다른 구현예에서, 돌연변이는 돌연변이 유전자의 결실, 절단 또는 불활성화이다. 다른 구현예에서, 리스테리아균주는 형질전환 동물에서 HER2/neu를 향한 내성을 약화시키는 능력을 갖는 강한 항원 특이적 항-종양 반응을 행사한다. 다른 구현예에서, dal/dat/actA 균주는 고도로 약독화되고 이전의 리스테리아 백신 세대보다 더 나은 안전성 프로파일을 가지는데, 이는 면역화된 마우스의 비장으로부터 더 신속하게 제거되기 때문이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 이 백신의 항생제 저항성이고 더 병독성 버전인 Lm-LLO-ChHer2보다 형질전환 동물에서 종양 발생의 더 긴 지연을 야기한다(본원에 전체가 참조로 도입되는 USSN 12/945,386; 미국출원 공개번호/0142791 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 종양내 T 조절 세포(Treg)의 상당한 감소를 야기한다. 다른 구현예에서, LmddA 백신으로 처리된 종양에서의 Treg의 더 낮은 빈도는 증가된 종양내 CD8/Treg 비율을 야기하며, 이는 더 유망한 종양 미세환경이 LmddA 백신으로의 면역화 후 수득될 수 있음을 제안한다. 일 구현예에서, 본 개시는 Her-2 키메라 단백질에 융합되거나 이의 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시는 Her-2 키메라 단백질에 융합되거나 이의 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편으로 구성되는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이 구현예에서, 이종 항원은 Her-2 키메라 단백질 또는 이의 단편이다.
다른 구현예에서, 본 개시의 방법 및 조성물의 Her-2 키메라 단백질은 인간 Her-2 키메라 단백질이다. 다른 구현예에서, Her-2 단백질은 마우스 Her-2 키메라 단백질이다. 다른 구현예에서, Her-2 단백질은 래트 Her-2 키메라 단백질이다. 다른 구현예에서, Her-2 단백질은 영장류 Her-2 키메라 단백질이다. 다른 구현예에서, Her-2 단백질은 인간 또는 본 기술분야에서 공지된 임의의 다른 동물종 또는 이의 조합의 Her-2 키메라 단백질이다.
다른 구현예에서, Her-2 단백질은 “Her-2/neu”, “Erbb2”, “v-erb-b2”, “c-erb-b2”, “neu” 또는 “cNeu”로서 언급되는 단백질이다.
일 구현예에서, Her2-neu 키메라 단백질은 종양 유전자의 MHC-클래스 I 에피토프의 클로스터를 보이는 Her2/neu 항원의 2 개의 세포외 단편 및 1 개의 세포내 단편을 보유하며, 다른 구현예에서, 키메라 단백질은 Her2/neu 항원의 3 개 H2Dq 및 적어도 17 개의 맵핑된 인간 MHC-클래스 I 에피토프를 보유한다(단편 EC1, EC2, 및 IC1)(도 20a). 다른 구현예에서, 키메라 단백질은 적어도 13 개의 맵핑된 인간 MHC-클래스 I 에피토프를 보유한다(단편 EC2 및 IC1). 다른 구현예에서, 키메라 단백질은 적어도 14 개의 맵핑된 인간 MHC-클래스 I 에피토프를 보유한다(단편 EC1 및 IC1). 다른 구현예에서, 키메라 단백질은 적어도 9 개의 맵핑된 인간 MHC-클래스 I 에피토프를 보유한다(단편 EC1 및 IC2). 다른 구현예에서, Her2-neu 키메라 단백질은 비-용혈 리스테리올리신 O(LLO)에 융합된다. 다른 구현예에서, Her2-neu 키메라 단백질은 리스테리아-모노사이토게네스 리스테리올리신 O(LLO) 단백질의 처음 441개 아미노산에 융합되고 리스테리아 모노사이토게네스 약독화 영양요구성 균주 LmddA에 의해 발현 및 분비된다. 다른 구현예에서, 키메라 Her2/neu 항원/LLO 융합 단백질을 발현하는 본원에 개시되는 약독화 영양요구성 균주로부터의 융합 단백질 tLLO-ChHer2의 발현 및 분비는 8시간의 시험관내 성장 후 TCA 침전 세포 배양 상등액 내의 Lm-LLO-ChHer2에서와 비슷하다(도 20b).
일 구현예에서, CTL 활성은 미처리동물 또는 비관련 리스테리아 백신이 주입된 마우스에서 검출되지 않는다(도 21a). 반면에 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 약독화 영양요구성 균주는 야생형 FVB/N 마우스로부터의 비장세포에 의한 IFN-γ의 분비를 자극할 수 있다(도 21b 및 21c).
다른 구현예에서, Her-2 키메라 단백질은 서열번호 22에 명시된 하기 핵산 서열에 의해 인코딩된다:
gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa (서열번호 22).
다른 구현예에서, Her-2 키메라 단백질은 하기 서열을 갖는다:
E T H L D M L R H L Y Q G C Q V V Q G N L E L T Y L P T N A S L S F L Q D I Q E V Q G Y V L I A H N Q V R Q V P L Q R L R I V R G T Q L F E D N Y A L A V L D N G D P L N N T T P V T G A S P G G L R E L Q L R S L T E I L K G G V L I Q R N P Q L C Y Q D T I L W K N I Q E F A G C K K I F G S L A F L P E S F D G D P A S N T A P L Q P E Q L Q V F E T L E E I T G Y L Y I S A W P D S L P D L S V F Q N L Q V I R G R I L H N G A Y S L T L Q G L G I S W L G L R S L R E L G S G L A L I H H N T H L C F V H T V P W D Q L F R N P H Q A L L H T A N R P E D E C V G E G L A C H Q L C A R G Q Q K I R K Y T M R R L L Q E T E L V E P L T P S G A M P N Q A Q M R I L K E T E L R K V K V L G S G A F G T V Y K G I W I P D G E N V K I P V A I K V L R E N T S P K A N K E I L D E A Y V M A G V G S P Y V S R L L G I C L T S T V Q L V T Q L M P Y G C L L D (서열번호 23).
일 구현예에서, 본원에 개시되는 방법 및 조성물의 Her2 키메라 단백질 또는 이의 단편은 이의 신호 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 신호 서열의 생략은 신호 서열의 높은 소수성에 기인하여, Her2 단편이 리스테리아에서 성공적으로 발현될 수 있게 한다.
다른 구현예에서, 본 개시의 방법 및 조성물의 Her2 키메라 단백질의 단편은 이의 막통과 도메인(TM)을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, TM의 생략은, TM의 높은 소수성에 기인하여, Her-2 단편이 리스테리아에서 성공적으로 발현될 수 있게 한다.
종양형성 단백질 Her2/neu 내의 점 돌연변이 또는 아미노산 결실은, 이들 종양이 작은 단편 리스테리아-기반 백신 또는 트라스투주맙(Her2/neu 항원의 세포외 도메인에 위치하는 에피토프에 대한 단일클론 항체)에 의해 표적화될 때, 저항성 종양 세포의 치료를 매개하는 것으로 보고되어 있다. 종양유전자의 MHC-클래스 I 에피토프의 클러스터를 보이는 Her2/neu 항원의 2 개의 세포외 단편 및 1 개의 세포내 단편을 보유하는 키메라 Her2/neu 기반의 조성물이 본원에 기술된다. Her2/neu 항원의 3 개 H2Dq 및 적어도 17 개의 맵핑된 인간 MHC-클래스 I 에피토프를 보유하는 이 키메라 단백질은 리스테리아-모노사이토게네스 리스테리올리신 O 단백질의 처음 441개 아미노산에 융합되고 리스테리아 모노사이토게네스 약독화 균주 LmddA에 의해 발현 및 분비된다.
다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 혈관형성 항원이다. 다른 구현예에서, 혈관형성 항원은 종양 혈관형성 맥관구조에서 혈관주위세포(pericyte) 및 활성화된 혈관주위세포 둘 다에서 발현되는데, 이는 또 다른 구현예에서는, 생체내 혈관신생과 관련된다. 다른 구현예에서, 혈관형성 항원은 HMW-MAA이다. 또 다른 구현예에서, 혈관형성 항원은 본 기술분야에 공지된 것이고 본원에서 참고로 인용된 WO2010/102140에 제공된다.
본원에서 열거된 임의의 아미노산 서열에 대한 단백질 및/또는 펩티드 상동성은, 일 구현예에서, 면역블롯 분석법을 포함하는 본 분야에서 널리 기재된 방법에 의해 또는 구축된 방법을 통해, 입수가능한 임의의 많은 소프트웨어 패키지를 사용하여 아미노산 서열의 컴퓨터 알고리즘 분석을 통해 결정된다. 이들 패키지의 일부는 FASTA, BLAST, MPsrch 또는 Scanps 패키지를 포함할 수 있으며, Smith 및 Waterman 알고리즘, 및/또는 예를 들어, 분석을 위해 국제적/지역적 정렬 또는 BLOCKS 정렬의 이용을 채택할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 미니유전자 핵산 서열 구축물을 포함하는 플라스미드 또는 본원에 개시된 하나 이상의 펩티드에 융합된 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 상동성 재조합을 이용해 리스테리아 염색체에 통합된다. 상동성 재조합에 대한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Baloglu S, Boyle SM, 외. (Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein. Vet Microbiol 2005, 109(1-2): 11-7); 및 Jiang LL, Song HH, 외,(Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing green fluorescent protein. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2005, 37(1): 19-24)에 기재되어 있다. 다른 구현예에서, 상동성 재조합은 미국 특허 번호 제6,855,320호에 기재된 바와 같이 수행된다. 이 경우, E7을 발현하는 재조합체 Lm 균주는, Lm-AZ/E7이라 칭하는 재조합체를 형성하게끔 유전자 산물의 분비를 확실히 하도록 hly 신호 서열의 포함 및 hly 촉진자의 제어 하에 E7 유전자의 염색체 통합에 의해 제조되었다. 다른 구현예에서, 온도 민감성 플라스미드가 재조합체를 선택하기 위해 사용된다.
다른 구현예에서, 구축물 또는 핵산 분자는 트랜스포존 삽입을 이용하여 리스테리아 염색체에 통합된다. 트랜스포존 삽입에 대한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 그 중에서, DP-L967의 구축에 대해서는 Sun 외의 문헌 (Infection and Immunity 1990, 58: 3770-3778)에 기재되어 있다. 트랜스포존 돌연변이 생성은, 다른 구현예에서, 안정한 게놈 삽입 돌연변이가 형성될 수 있는 이점을 갖지만 외부 유전자가 삽입된 게놈에서의 위치가 공지되지 않은 단점을 갖는다.
일 구현예에서 본원에 개시된 벡터는 플라스미드나 파지 벡터를 포함하는 당업계에 공지된 벡터이다. 다른 구현예에서, 구축물 또는 핵산 분자는 파지 통합 부위를 포함하는 파지 벡터를 사용하여 리스테리아 염색체로 통합된다(Lauer P, Chow MY 외, Construction, characterization, and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002; 184(15):4177-86). 이 방법의 특정 구현예에서, 박테리오파지(예를 들어, U153 또는 PSA 리스테리오파아지)의 인테그라아제 유전자 및 부착 부위는 이종 유전자를 상응하는 부착 부위 내로 삽입하기 위해 사용되며, 이는 게놈 내에서의 임의의 적절한 부위일 수 있다(예를 들어, comK 또는 arg tRNA 유전자의 3’말단). 다른 구현예에서, 내인성 프로파아지는 구축물 또는 이종 유전자의 통합 전에 사용되는 부착 부위로부터 치유된다. 다른 구현예에서, 이 방법은 단일-카피 통합물을 야기한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 임상적 응용을 위한 파아지 기반의 염색체 통합 시스템을 추가로 포함하는데, 여기에서 d-알라닌 라세미화효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 필수 효소를 위한 영양요구성 숙주 균주, 예를 들어, Lmdal(-)dat(-)를 사용할 수 있다. 다른 구현예에서는, “파지 치유 단계”를 피하도록, PSA에 기초하는 파지 통합 시스템을 사용한다. 다른 구현예에서, 통합된 유전자를 유지하기 위해 항생제에 의한 지속적인 선별을 필요로 한다. 그러므로, 다른 구현예에서, 본 발명은 항생제로의 선별을 필요로 하지 않는 파아지 기반 염색체 통합 시스템의 구축을 가능하게 한다. 대신, 영양 요구성 숙주 균주가 상보화될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 박테리아성 전달 벡터, 바이러스성 전달 벡터, 펩티드 백신 전달 벡터, 및 DNA 백신 전달 벡터를 포함하는 당업계에 공지된 전달 벡터이다. 당업자는, 용어 “전달 벡터”가 하나 이상의 네오-에피토프 또는 숙주 세포에 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 전달하고, 특정 구현예에서는 발현할 수 있는 구축물을 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 벡터의 대표적인 예는 바이러스성 벡터, 핵산 발현 벡터, 네이키드 DNA(naked DNA), 및 특정 진핵 세포(예, 생산 세포)를 포함한다. 일 구현예에서, 전달 벡터는 플라스미드나 파지 벡터와 차별화된다. 다른 구현예에서, 전달 벡터와 본 발명의 플라스미드나 파지 벡터는 동일하다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일 구현예에서, 용어 "재조합 부위" 또는 "부위-특이적 재조합 부위"는 재조합 부위에 인접한 핵산 분절의 교환 또는 절단을 매개하는 리컴비라제(일부 경우에 연관된 단백질과 함께)에 의해 인지되는 핵산 분자 내의 염기 서열을 지칭한다. 재조합효소 및 연관 단백질은 총칭하여 "재조합 단백질"이라 칭하며, 예를 들어, Landy, A.,(Current Opinion in Genetics & Development) 3:699-707; 1993)를 참조한다.
“파지 발현 벡터,”“파지 벡터” 또는 “파지미드”는 원핵, 효모, 진균류, 식물, 곤충 또는 포유류 세포를 포함하는 임의의 세포에서 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 핵산 서열을 구성적으로 또는 유도적으로 실험관 내 또는 생체 내 발현시키는 것을 목적으로 하는 임의의 파지-계 재조합 발현 시스템을 의미한다. 파지 발현 벡터는 전형적으로 박테리아 세포내에서 재생되고 적절한 조건 하에서 파지 입자를 생산할 수 있다. 용어는 선형 또는 순환 발현 시스템을 포함하며 에피솜을 유지하거나 숙주 세포 게놈 내로 통합하는 파지-계 발현 벡터 모두를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 전사 및 번역 조절 핵산이 전사가 개시되는 방식으로 임의의 코딩 서열에 대하여 위치하는 것을 의미한다. 일반적으로, 이는 프로모터 및 전사 개시 또는 개시 서열이 코딩 영역의 5'에 위치한다는 것을 의미한다.
일 구현예에서, “개방형 해독 프레임” 또는 “ORF”는 단백질을 잠재적으로 인코딩할 수 있는 염기의 서열을 포함하는 생물의 게놈 부분이다. 다른 구현예에서, ORF의 시작 및 정지 말단은 mRNA의 말단과 동등하지 않으나, 이들은 보통 mRNA 내에 포함된다. 일 구현예에서, ORF는 유전자의 시작-코드 서열(개시 코돈) 및 정지-코돈 서열(종결 코돈) 사이에 위치한다. 그러므로, 일 구현예에서, 내인성 폴리펩티드와 함께 개방 해독 프레임로서 게놈 내로 작동 가능하게 통합되는 핵산 분자는 내인성 폴리펩티드와 동일한 개방 해독 프레임에서 게놈 내로 통합되는 핵산 분자이다.
일 구현예에서, 본 개시는 링커 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일 구현예에서, "링커 서열"은 두 개의 이종 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 도메인을 연결하는 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 링커는 폴리펩티드를 공유적으로 연결하여 융합 폴리펩티드를 형성하는 아미노산 서열이다. 일반적으로, 링커는 디스플레이 단백질과 개방 해독 프레임에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 생성하기 위해 디스플레이 벡터로부터 리포터 유전자를 제거한 후 나머지 재조합 신호로부터 번역된 아미노산을 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 링커는 글리신 및 기타 소(small) 중성 아미노산과 같은 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에서 사용된 “내인성”은 참조 생물체 내에서 발생 또는 유래하였거나 참조 생물체 내의 원인으로부터 발생된 것을 말한다. 다른 구현예에서, 내인성은 원생을 의미한다.
"안정적으로 유지된다"는 것은, 다른 구현예에서, 검출 가능한 손실 없이 10 세대 동안 선택(예를 들어, 항생제 선택)의 부재중 핵산 분자 또는 플라스미드의 유지를 가리킨다. 다른 구현예에서, 기간은 15세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 20세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 25세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 30세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 40세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 50세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 60세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 80세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 100세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 150세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 200세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 300세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 500세대이다. 다른 구현예에서, 기간은 세대들보다 길다. 다른 구현예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 실험관 내(예를 들어, 배양에서) 안정적으로 유지된다. 다른 구현예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 생체 내에서 안정적으로 유지된다. 다른 구현예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 실험관 내 및 생체 내 모두에서 안정적으로 유지된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 것은 리스테리아 게놈 내에 작동 가능하게 통합된 핵산 분자를 내인성 ActA 서열을 갖는 개방 해독 프레임로서 포함하는 재조합 리스테리아 균주이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는 ActA 또는 절단된 ActA에 융합된 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 에피솜 발현 플라스미드 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 항원의 발현 및 분비는 actA 프로모터 및 ActA 신호 서열로 통제되며 ActA(절단된 ActA 또는 tActA)의 1-233 아미노산에 융합되어 발현된다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는, 그 전체가 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 일련 번호 제7,655,238호에 기재된 바와 같이 야생주 ActA 단백질의 처음 390개 아미노산으로 구성된다. 다른 구현예에서, 절단된 ActA는 PEST 모티프가 결실되고 미국 특허 공개 번호 제2014/0186387호에 기재된 바와 같이 비보존성 QDNKR 치환을 함유하는 ActA-N100 또는 이의 변형된 버전(ActA-N100*으로서 지칭됨)이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 단편은 기능성 단편이다. 또 다른 구현예에서, "기능성 단편"은 면역원성 단편이며 대상에 단독으로 또는 본원에 개시된 백신으로 투여될 때 면역 반응을 유발할 수 있다. 다른 구현예에서, 기능성 단편은 당업자에 의해 이해되고 본원에서 더 개시되는 바와 같이, 생물학적 활성을 가지고 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아 균주는 약독화된 균주이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아 균주는 재조합 균주이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아 균주는 생 약독화된 재조합 리스테리아 균주이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는, 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 실링게리 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 그라이 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 이바노비 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 무라이 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 웰쉬메리 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 당업계에 공지된 임의의 다른 리스테리아 종의 재조합 균주이다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 동물 숙주를 통해 계대된다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 백신 벡터로서 균주의 효능을 극대화한다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 면역원성을 안정화시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 안정화시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 면역원성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정한 서브-균주를 제거한다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정한 서브-균주의 유병률을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 항원-포함 재조합 펩티드를 인코딩하는 유전자의 게놈 삽입을 포함한다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 항원-포함 재조합 펩티드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 운반한다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 본원에서 기재된 바와 같이 수행된다. 다른 구현예에서, 계대는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수행된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시되는 재조합 핵산은, 리스테리아 균주에서 인코딩된 펩티드의 발현을 구동하는 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 유전자의 기본구성 발현을 구동하는 데 유용한 프로모터/조절 서열은, 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 리스테리아의 PhlyA, PActA, 및 p60 프로모터, Streptococcus bac 프로모터, Streptomyces griseus sgiA 프로모터, 및 B. thuringiensis phaZ 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 본원에 개시되는 펩티드를 인코딩하는 핵산의 유도 가능 및 조직 특이적 발현은, 유도 가능 또는 조직 특이적 프로모터/조절 서열의 조절 하에 펩티드를 인코딩하는 핵산을 배치함으로써 달성된다. 이 목적에 유용한 조직 특이성 또는 유도가능 프로모터/조절 서열의 예는, MMTV LTR 유도가능 프로모터 및 SV40 만기 증강제/프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, 금속, 글루코코르티코이드 등의 유도제에 반응하여 유도되는 프로모터가 이용된다. 따라서, 본 발명이 이에 작동 가능하게 연결된 원하는 단백질의 발현을 구동할 수 있는, 알려져 있거나 알려져 있지 않은 임의의 프로모터/조절 서열의 사용을 포함한다는 점이 인정될 것이다. 당업자는 용어 “이종”이 기준 종과는 상이한 종 유래의 핵산, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 일 구현예에서 이종 폴리펩티드를 발현하는 리스테리아 균주는 리스테리아 균주에 내인성이 아닌 폴리펩티드를 발현하거나, 다른 구현예에서는 상기 리스테리아 균주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 폴리펩티드를 발현하거나, 다른 구현예에서는 상기 리스테리아 균주 외의 다른 출처로부터의 폴리펩티드를 발현할 것이다. 다른 구현예에서, “이종”은 동일한 종 내의 상이한 생물체로부터 유래된 것을 기술하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 이종 항원은 리스테리아의 재조합 균주에 의해 발현되고, 가공되어 포유류 세포가 재조합 균주에 의해 감염될 때 세포독성 T 세포에게 제공된다. 다른 구현예에서, 리스테리아 종에 의해 발현된 상기 이종 항원은 그것이 포유류에서 자연적으로 발현되는 비개질된 항원 또는 단백질을 인식하는 T 세포 반응을 초래하는 한, 감염원이나 종양 세포 중의 단백질이나 대응하는 비개질된 항원과 정확히 일치할 필요는 없다. 용어 이종 항원은 본원에서 “항원 폴리펩티드”, “이종 단백질”, “이종 단백질 항원”, “단백질 항원”, “항원”등으로 지칭될 수 있다.
당업자는 용어 “에피솜 발현 벡터”가 핵산 플라스미드 벡터를 포함하며, 상기 핵산 플라스미드 벡터는 선형 또는 환형일 수 있고, 통상적으로 이중 가닥 형태이고, 박테리아의 게놈 또는 세포의 게놈에 통합되는 것과는 반대로 숙주 박테리아 또는 숙주 세포의 세포질에 존재한다는 점에서 염색체외적이라는 것을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 에피솜 발현 벡터는 관심 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 에피솜 벡터는 박테리아 세포질에서 다중 복사체로서 지속되어, 관심 유전자의 증폭이 초래되고, 또 다른 구현예에서는 필요한 경우 바이러스성 작용전달 인자가 공급된다. 다른 구현예에서, 에피솜 발현 벡터는 본원에서 플라스미드로 지칭될 수 있다. 다른 구현예에서, “통합 플라스미드”는 숙주 게놈으로 해당 서열 자체의 삽입 또는 운반되는 관심 유전자의 삽입을 표적으로 하는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 삽입된, 관심 유전자는 세포 DNA로에 통합될 때 종종 발생하는 조절 제약을 받지 않거나 이에 방해받지 않는다. 다른 구현예에서, 삽입된 이종 유전자의 존재는 세포 고유의 중요 영역의 재배치 또는 방해로 이어지지 않는다. 다른 구현예에서, 안정한 형질 감염 과정에서, 에피솜 벡터를 사용하면 염색체 통합 플라스미드를 사용하는 것 보다 높은 형질 감염 효율이 종종을 초래된다(Belt, P.B.G.M., 등 (1991) Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of mutant human cell line (HPRT2) using Epstein-Barr virus-derived cDNA experssion vector. Nucleic Acids Res. 19, 4861-4866; Mazda, O., 등 (1997) Extremely efficient gene transfection into lympho-hemotopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-based vectors. J. Immunol. Methods 204, 143-151). 일 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 에피솜 발현 벡터는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서, DNA 분자를 세포에 전달하기 위해 사용되는 다양한 방법 중 임의의 것에 의해서 세포에 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터는 단독으로 또는 대상의 세포로의 전달을 향상시키는 약제학적 조성물의 형태로서 전달될 수도 있다.
일 구현예에서, 용어 "융합된"은 공유 결합에 의한 작동 가능한 연결을 의미한다. 일 구현예에서, 이 용어는 (핵산 서열 또는 이의 개방 해독 프레임의) 재조합 융합을 포함한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 화학적 접합을 포함한다.
일 구현예에서, “형질전환”은 플라스미드 또는 다른 이종 DNA 분자를 채택하도록 박테리아 세포를 조작하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “형질전환”은 플라스미드 또는 다른 이종 DNA 분자의 유전자를 발현하도록 박테리아성 세포를 조작하는 것을 지칭한다.
다른 구현예에서, 접합은 유전 물질 및/또는 플라스미드를 박테리아 내로 도입하기 위해 사용된다. 접합을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Nikodinovic J 외 (A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation. Plasmid.2006 Nov;56(3):223-7) 및 Auchtung JM 등(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 30;102(35):12554-9)에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 용어 "약독화(attenuation)"는 박테리아가 동물에서 질환을 일으키는 능력의 감소를 의미한다. 다시 말하면, 약독화된 리스테리아 균주의 병리적 특징은, 야생형 리스테리아에 비해 감소되었지만, 약독화된 리스테리아는 배양액에서 성장 및 유지될 수 있다. 약독화된 리스테리아에 의한 Balb/c 마우스의 정맥 접종을 일례로 사용하여, 접종된 동물들의 50%가 생존하는(LD50) 치사용량이 바람직하게 적어도 약 10배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 100배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 1,000배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 10,000배 만큼, 가장 바람직하게 적어도 약 100,000배만큼 야생형 리스테리아의 LD50을 초과하여 증가한다. 따라서, 리스테리아의 약독화된 균주는, 투여되는 동물을 사멸하지 않는 것, 또는 투여되는 세균의 개수가 동일한 동물을 사멸하는 데 요구되는 야생형 비약독화 세균의 개수보다 매우 많을 때에만 동물을 사멸하는 것이다. 약독화된 세균은, 또한, 그 세균의 성장에 요구되는 영양분이 내부에 존재하지 않기 때문에, 일반적인 환경에서 복제될 수 없는 것을 의미하도록 해석되어야 한다. 따라서, 세균은, 필요 영양소가 제공되는 피제어 환경에서의 복제로 한정된다. 따라서, 본 개시의 약독화된 균주는, 이들이 비조절된 복제가 가능하지 않다는 점에서 환경적으로 안전하다.
조성물
일 구현예에서, 본 개시의 조성물은 면역원성 조성물이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은, 일 구현예에서 항-혈관형성 특성을 갖는, 인터페론-감마의 강한 선천적 자극을 유도한다. 일 구현예에서, 본원에 개시되는 리스테리아는, 일 구현예에서 항-혈관형성 특성을 갖는, 인터페론-감마의 강한 선천적 자극을 유도한다(Dominiecki 등, Cancer Immunol Immunother. 2005 May;54(5):477-88. Epub 2004 Oct 6, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨; Beatty and Paterson, J Immunol. 2001 Feb 15;166(4):2276-82, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 일 구현예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD4+ T 세포에 의해 매개된다 (Beatty 및 Paterson, 2001). 다른 구현예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD8+ T 세포에 의해 매개된다. 다른 구현예에서, 리스테리아 예방접종의 결과로서 IFN-γ 분비는 NK 세포, NKT 세포, Th1 CD4+ T 세포, TC1 CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합에 의해 매개된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시되는 조성물의 투여는 하나 이상의 항-혈관형성 단백질 또는 인자의 생산을 유도한다. 일 구현예에서, 항-혈관형성 단백질은 IFN-감마이다. 다른 구현예에서, 항-혈관형성 단백질은 색소 상피세포 유래 인자(PEDF); 안지오스타틴; 엔도스타틴; fms-유사 티로신 키나제(sFlt)-1; 또는 수용성 엔도글린(endoglin) (sEng)이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 항-혈관형성 인자의 방출에 관여하므로, 일 구현예에서, 대상에 항원을 도입하기 위한 벡터 역할뿐만 아니라 치료제 역할을 갖는다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 유도되는 면역 반응은, 다른 구현예에서, T 세포 반응이다. 다른 구현예에서, 면역 반응은 T 세포 반응을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 다른 구현예에서, 상기 반응은 CD8+ T 세포 반응을 포함한다. 각각의 가능성은 본원에 개시되는 개별적인 구현예를 나타낸다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물의 투여는 항원-특이적 T 세포의 개수를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 조성물을 투여하면 T 세포 상의 공동-자극성 수용체가 활성화된다. 다른 구현예에서, 조성물을 투여하면 기억 T 세포 및/또는 효과기 T 세포의 증식이 유도된다. 다른 구현예에서, 조성물을 투여하면 T 세포의 증식이 증가된다. 각각의 가능성은 본원에 개시되는 개별적인 구현예를 나타낸다.
본원 전체에 걸쳐 사용되는 용어 “조성물” 및 “면역원성 조성물”은, 모두 동일한 의미와 특징을 갖는 것으로서 상호 교환 가능하다. 일 구현예에서, 각각의 성분의 동시 또는 순차적 투여를 위해 재조합 리스테리아 균주를 포함하고 추가로 항체를 포함하는 본원에 개시되는 면역원성 조성물은 또한 “병용 요법”으로 언급된다. 당업자는 병용 요법이 부가적 성분, 항체, 치료제 등을 포함할 수도 있다는 것을 이해할 것이다. “약제학적 조성물”이라는 용어는, 일부 구현예에서, 예를 들어, 필요로 하는 대상에 투여하기 위한 약제학적 용도에 적절한 조성물을 가리킨다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 DNA 백신을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 우두증 바이러스 균주 또는 바이러스 유사 입자를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 펩티드 백신을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 백신 벡터를 제공한다. 다른 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 다른 구현예에서, 발현 벡터는 플라스미드이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시된 뉴클레오티드 분자를 세포에 도입하는 방법을 제공한다. 재조합 벡터를 구성하고 활용하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook 등의 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 Brent 등의 (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)에 기재되어 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 박테리아성 벡터이다. 다른 구현예에서, 벡터는 살모넬라 종, 쉬겔라 종, BCG, L. 모노사이토게네스, 및 S. 고르도니로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 펩티드는 포식리포솜 융합을 벗어나 세포의 세포질 내에 살도록 변형된 재조합 박테리아 벡터에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스성 벡터이다. 다른 구현예에서, 벡터는 우두증, 아비폭스, 아데노바이러스, AAV, 우드증 바이러스 NYVAC, 개질된 우두증 균주 안카라(MVA), 샘리키 삼림열 바이러스, 베네주엘라 마뇌염 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 레트로바이러스로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 벡터는 네이키드 DNA 벡터이다. 다른 구현예에서, 벡터는 당업계에 공지된 임의의 다른 벡터이다.
본 발명의 조성물은, 대상에서 향상된 항-종양 T 세포 반응을 유발하기 위해, 대상에서 종양-매개의 면역억제를 저해하기 위해, 또는 대상의 비장 및 종양에서 T 효과기 세포 대 조절 T 세포(Treg)의 비율을 증가시키기 위해, 또는 이들의 임의의 조합을 위해, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 리스테리아 균주를 포함하는 조성물은 보강제(adjuvant)를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시의 조성물은 보강제를 추가로 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용되는 보강제는, 다른 구현예에서, 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 단백질이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 GM-CSF 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 GM-CSF를 인코딩하는 뉴클레오티드 분자이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 GM-CSF를 인코딩하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 사포닌 QS21이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 사포닌 QS21을 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 모노포스포릴 리피드 A이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 모노포스포릴 리피드 A를 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 SBAS2이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 SBAS2을 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 면역 자극 사이토카인이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 면역 자극 사이토카인을 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 면역 자극 사이토카인을 인코딩하는 뉴클레오티드 분자이다. 다른 구현예에서, 애주번트는 면역 자극 사이토카인을 인코딩하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 퀼 글리코시드이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 세균 미토겐이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 세균 독소이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 애주번트는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 애주번트이거나 이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하고, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 이종 항원이나 이의 단편에 융합된 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하고, 상기 핵산 분자는 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하고, 상기 핵산 분자는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 이종 항원이나 이의 단편에 융합된 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 항체 또는 이의 단편을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 다클론 항체, 단일클론 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단일 사슬 항체, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하고, 상기 조성물은 항체 또는 이의 단편을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 다클론 항체, 단일클론 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단일 사슬 항체, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 재조합 리스테리아 균주를 포함하고, 상기 조성물은 항체 또는 이의 단편을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 다클론 항체, 단일클론 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단일 사슬 항체, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예들에서, 용어 “항체”는 손상되지 않은 분자 및 이의 기능적 단편을 지칭하며, 이들은 원하는 표적과 특이적으로 상호작용할 수 있는(예를 들어, 체크포인트 억제제의 결합을 방해할 수 있는) Fab, F(ab')2, 및 Fv와 같은 "항원 결합 단편"으로도 본원에서 지칭된다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편은 면역 체크포인트 억제제 대항물질을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편은 항-PD-L1/PD-L2 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편은 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편은 항-CTLA-4 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편은 항-B7-H4 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 단편은 다음을 포함한다: (1) 무손상 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 생성하도록 전체 항체의 효소 파파인 소화에 의해 생산될 수 있는, 항체 분자의 1가 항원-결합 단편을 포함하는 단편인 Fab; (2) 무손상 경쇄 및 중쇄의 일부를 생성하도록 전체 항체를 펩신 처리 후 환원시킴으로써 수득될 수 있는, 항체 분자의 단편인 Fab'; 항체 분자당 두 개의 Fab' 단편이 수득됨; (3) 전체 항체를 후속 환원 없이 효소 펩신으로 처리함으로써 수득될 수 있는 항체의 단편인 (Fab')2; F(ab')2는 두 개의 이황화 결합에 의해 유지되는 두 개의 Fab' 단편의 이량체임; (4) 두 개의 사슬로서 발현되는, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전자 조작된 단편인 Fv; 또는 (5) 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적절한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전자 조작된 분자인 단일 사슬 항체("SCA").
이들 단편을 제조하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. (예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조).
일부 구현예에서, 항체 단편은, 항체의 단백질 가수분해에 의해 또는 그 단편을 인코딩하는 DNA의 대장균이나 포유류 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포 배양 또는 기타 단백질 발현 시스템)에서의 발현에 의해 제조될 수 있다.
항체 단편은, 일부 구현예에서, 종래의 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은, F(ab')2로 표시되는 5S 단편을 제공하도록 펩신에 의한 항체의 효소적 분해에 의해 생산될 수 있다. 이 단편은, 티올 환원제를 사용하여, 그리고 선택적으로 이황화 연결의 절단으로부터 생성되는 설프히드릴기에 대한 차단 그룹을 사용하여, 추가로 절단되어 3.5S Fab’일가 단편을 생산할 수 있다. 대안으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은, 두 개의 일가 Fab’단편 및 Fc 단편을 직접 생산한다. 이들 방법은, 예를 들어, Goldenberg의 미국특허 제4,036,945호 및 제4,331,647호, 그리고 이에 포함되어 있는 문헌들에 개시되어 있으며, 이들 특허 문헌의 전문은 본원에 참고로 원용된다. 또한, Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959를 참조한다. 항체를 절단하는 다른 방법, 예를 들어 일가 경쇄-중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄의 분리, 단편의 추가 절단, 또는 기타 효소적, 화학적, 또는 유전자적 기술 또한, 단편이 무손상 항체에 의해 인식되는 항원에 결합되는 한, 사용할 수 있다.
Fv 단편은 VH 및 VL 사슬의 결합을 포함한다. 이 결합은, Inbar 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972에 개시되어 있는 바와 같이, 비공유성일 수 있다. 대안으로, 가변 사슬은 분자간 이황화 결합에 의해 연결되거나, 글루타르알데히드 등의 화학 물질에 의해 교차-결합될 수 있다. 바람직하게, Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함한다. 이들 단일-사슬 항원 결합 단백질(sFv)은, 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조적 유전자를 구축함으로써 제조된다. 구조적 유전자는 발현 벡터 내로 삽입되며, 발현 벡터는 이어서 대장균 등의 숙주 세포 내로 도입된다. 재조합 숙주 세포는, 두 개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩티드로 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. sFv를 생산하는 방법은, 예를 들어, Whitlow and Filpula의 Methods, 2: 97-105, 1991; Bird 등, Science 242:423-426, 1988; Pack 등, Bio/Technology 11:1271-77, 1993; 및 Ladner 등의 미국 특허 제4,946,778호에 개시되어 있으며, 이는 전체가 본원에 참고로 원용된다.
항체 단편의 다른 형태는 단일 상보성-결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드(“최소 인식 단위”)는, 관심 항체의 CDR을 인코딩하는 유전자를 구축함으로써 수득할 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하도록 폴리머라제 연쇄 반응을 사용함으로써 제조된다. 예를 들어, Larrick and Fry, Methods, 2: 106-10, 1991을 참조한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기술되는 항체 또는 단편은, 항체의 “인간화 형태”를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, “항체의 인간화 형태”라는 용어는, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열을 포함하는 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab’, F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 서브서열)의 키메라 분자인 비-인간(예를 들어, 쥣과) 항체를 가리킨다. 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 교체되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 인간화 항체는, 또한, 수용자 항체에서도 발견되지 않으며 임포트된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두가 비-인간 면역글로불린의 그것에 대응하고 FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두가 인간 면역글로불린 공통 서열의 그것인, 적어도 하나, 통상적으로는 두 개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 최적으로, 면역글로불린 불변 영역(Fc), 통상적으로는 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다[Jones 등의 Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 등의 Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그것에 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 임포트 가변 도메인으로부터 취해지는 임포트 잔기로 종종 언급된다. 인간화는 본질적으로, 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써, Winter 등의 방법에 따라 수행될 수 있다[Jones 등, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science, 239:1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메라 항체로(미국 특허 제4,816,567호), 여기에서는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적게 비-인간 종으로부터의 대응하는 서열로 치환된다. 사실상, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간 항체는 또한, 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함한 본 기술분야에 알려져 있는 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Cole 등 및 Boerner 등의 기법은 또한, 인간 단일클론 항체의 제조에 이용할 수 있다(Cole 등의 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner 등, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 유사하게, 인간 항체는, 인간 면역글로불린 유전자 자리를 형질전환 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 마우스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 접종시, 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 면에서 인간에게서 보이는 것과 매우 닮은 인간 항체 생산이 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 미국특허 번호 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 다음의 과학 출판물에 개시되어 있다: Marks 등, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg 등, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild 등, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
일 구현예에서, 본원에 개시된 질환은 암 또는 종양이다. 일 구현예에서, 본 개시의 방법에 의해 치료되는 암은 유방암이다. 다른 구현예에서, 암은 자궁 경부암이다. 다른 구현예에서, 암은 Her2 함유 암이다. 다른 구현예에서, 암은 흑색종이다. 다른 구현예에서, 암은 췌장암이다. 다른 구현예에서, 암은 난소암이다. 다른 구현예에서, 암은 위암이다. 다른 구현예에서, 암은 췌장의 암종 병변이다. 다른 구현예에서, 암은 폐 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 폐 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 다형성 교아종이다. 다른 구현예에서, 암은 대장 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 폐 편평상피 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 위 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 난소 표면 상피 종양(예를 들어, 이의 양성, 증식성 또는 악성 변종)이다. 다른 구현예에서, 암은 구강 편평 세포 암종이다. 다른 구현예에서, 암은 비소세포 폐암종이다. 다른 구현예에서, 암은 자궁내막 암종이다. 다른 구현예에서, 암은 방광 암이다. 다른 구현예에서, 암은 두경부 암이다. 다른 구현예에서, 암은 전립선 암종이다. 다른 구현예에서, 암은 구강인두암이다. 다른 구현예에서, 암은 폐암이다. 다른 구현예에서, 암은 항문암이다. 다른 구현예에서, 암은 대장암이다. 다른 구현예에서, 암은 식도암이다. 다른 구현예에서, 암은 중피종이다.
일 구현예에서, 본원에 개시되는 이종 항원은 HPV-E7이다. 다른 구현예에서, 항원은 HPV-E6이다. 다른 구현예에서, HPV-E7는 HPV 균주 16 유래이다. 다른 구현예에서, HPV-E7는 HPV 균주 18 유래이다. 다른 구현예에서, HPV-E6은 HPV 균주 16 유래이다. 다른 구현예에서, HPV-E7는 HPV 균주 18 유래이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 이종 항원의 단편은 또한 본 발명에 포함된다.
다른 구현예에서, 항원은 Her-2/neu이다. 다른 구현예에서, 항원은 NY-ESO-1이다. 다른 구현예에서, 항원은 텔로머라제(TERT)이다. 다른 구현예에서, 항원은 SCCE이다. 다른 구현예에서, 항원은 CEA이다. 다른 구현예에서, 항원은 LMP-1이다. 다른 구현예에서, 항원은 p53이다. 다른 구현예에서, 항원은 탄산 탈수효소 IX(CAIX)이다. 다른 구현예에서, 항원은 PSMA이다. 다른 구현예에서, 항원은 전립선 줄기 세포 항원(PSCA)이다. 다른 구현예에서, 항원은 HMW-MAA이다. 다른 구현예에서, 항원은 WT-1이다. 다른 구현예에서, 항원은 HIV-1 Gag이다. 다른 구현예에서, 항원은 단백질분해효소 3이다. 다른 구현예에서, 항원은 티로시나제 관련 단백질 2이다. 다른 구현예에서, 항원은 PSA(전립선-특이적 항원)이다. 다른 구현예에서, 항원은 2가 PSA이다. 다른 구현예에서, 항원은 ERG이다. 다른 구현예에서, 항원은 ERG 구축물 유형 III이다. 다른 구현예에서, 항원은 ERG 구축물 유형 VI이다. 다른 구현예에서, 항원은 안드로겐 수용체(AR)이다. 다른 구현예에서, 항원은 PAK6이다. 다른 구현예에서, 항원은 PAK6의 에피토프 풍부 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항원은 HPV-E7, HPV-E6, Her-2, NY-ESO-1, 텔로머라아제 (TERT), SCCE, HMW-MAA, EGFR-III, 서바이빈, 바큘로바이러스 세포자멸 억제자 반복서열-함유 5(BIRC5), WT-1, HIV-1 Gag, CEA, LMP-1, p53, PSMA, PSCA, 단백질 분해효소 3, 티로시나제 관련 단백질 2, Muc1, PSA (전립선-특이적 항원), 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 항원은 항원의 야생주 형태를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원은 항원의 돌연변이 형태를 포함한다.
일 구현예에서, PAK6의 핵산 서열은 서열번호 78에 제시되어 있다. 다른 구현예에서, PAK6의 아미노산 서열은 서열번호 79에 제시되어 있다. (전체가 본원에 참조로서 통합된 Kwek 등의 (2012) J Immunol 2012년 9월 5일 온라인 출간본 참조.)
다른 구현예에서, "면역원성 단편"은 대상에 단독으로 또는 본원에 개시된 백신 조성물로 투여할 때 면역 반응을 유발하는 것이다. 이러한 단편은, 다른 구현예에서, 체액성 면역 반응, 및/또는 입양 면역 반응 중 어느 하나를 유발하기 위해 필요한 에피토프를 포함하고 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 2 개의 항체, 3 개의 항체, 4 개의 항체, 또는 4 개 초과의 항체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Lm 균주 및 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Lm 균주 및 적어도 하나의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Lm 균주 및 2 개의 항체, 3 개의 항체, 4 개의 항체, 또는 4 개 초과의 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하되, 상기 조성물은 본원에 개시된 리스테리아 균주를 포함하지 않는다. 동일하거나 상이한 조성물 내에 존재하는 상이한 항원은 동일한 형태일 필요가 없으며, 예를 들어, 하나의 항체가 단일클론 항체일 수 있고 다른 항체는 FAb 단편일 수 있다. 각각의 가능성은 상이한 구현예를 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 GITR 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 OX40 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 GITR 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체, 및 OX40에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Lm 균주 및 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Lm 균주 및 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Lm 균주 및 GITR 또는 이의 부분에 특이적으로 결합하는 항체, 및 OX40 또는 이의 부분에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는데, 여기에서 이 조성물은 본원에 개시되는 리스테리아 균주를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는데, 여기에서 이 조성물은 본원에 개시되는 리스테리아 균주를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 GITR에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 여기에서 이 조성물은 본원에 개시되는 리스테리아 균주를 포함하지 않는다. 동일하거나 상이한 조성물 내에 존재하는 상이한 항원은 동일한 형태일 필요가 없으며, 예를 들어, 하나의 항체가 단일클론 항체일 수 있고 다른 항체는 FAb 단편일 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 상이한 구현예를 나타낸다.
용어 “항체 기능적 단편”은 본 발명에 의해 의도되는 생물학적 효과를 야기하도록 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 온전한 항체의 부분을 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "항체 중쇄"는 이들의 천연적으로 존재하는 형태에서 모든 항체 분자에 존재하는 폴리펩티드 사슬의 2 개 유형 중 더 큰 것을 말한다.
본원에서 사용되는 "항체 경쇄"는 이들의 천연적으로 존재하는 형태에서 모든 항체 분자에 존재하는 폴리펩티드 사슬의 2 개 유형 중 더 작은 것을 말하는데, κ 및 λ 경쇄는 두 개의 주요 항체 경쇄 동형을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "합성 항체"는, 예를 들어 본원에 기술되는 박테리오파아지에 의해 발현되는 항체와 같이, 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 이 용어는 또한, DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 발현하고 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되는 항체를 의미하도록 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 이용 가능한 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기법을 사용하여 얻어진다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편은 항원 결합 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 도메인이다. 일 구현예에서, 이의 항원-결합 도메인은 Fab 또는 scFv이다.
항체와 관련하여 용어 “결합하다” 또는 “특이적으로 결합한다”는 특이적 항원을 인식하지만 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 포괄한다는 것이 당업자에 의해 인정될 것이다. 예를 들어, 한 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있으나, 이러한 교차-종 반응성은 그 자체가 특이성으로서 항체의 분류를 바꾸지 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립형질 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 그 자체가 특이성으로서 항체의 분류를 바꾸지 않는다. 일부 예에서, 용어 “특이적 결합” 또는 “특이적으로 결합”은 제2 화학종과 항체, 단백질 또는 펩티드의 상호작용에 대하여 사용될 수 있으며, 이는 상호작용이 화학종의 특정 구조(예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존함을 의미하는데; 예를 들어, 항체는 특이적 아미노산 서열보다는 특이적 단백질 구조를 인식하고 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 (Lm) 균주를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 기능적 다편을 포함한다.
일 구현예에서, 면역원성 조성물은 본원에 개시되는 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 본원에 개시되는 재조합 약독화 리스테리아를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 면역원성 조성물의 각 성분은 본원에 개시되는 면역원성 조성물의 다른 성분 전, 이와 동시 또는 후에 투여된다. 일 구현예에서, 동시에 투여되는 경우일지라도 Lm 조성물 및 항체 또는 이의 기능적 단편은 두 개의 별개 조성물로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 다른 구현예에서, Lm 조성물은 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예컨대 비경구, 파라-암(paracancerally), 경점막, 경피, 근육내, 정맥내, 피내, 피하, 복강내, 심실내, 두개내, 질내 또는 종양내로 대상에게 투여된다.
다른 구현예에서, 조성물은 경구 투여되고, 따라서 경구 투여에 적절한 형태로, 즉, 고체 또는 액체 제제로 제형화된다. 적절한 고체 경구 제형은, 태블릿, 캡슐, 알약, 과립, 펠릿 등을 포함한다. 적절한 액체 경구 제형은, 용액, 현탁액, 분산제, 유탁액, 오일 등을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 활성 성분은 캡슐로 제형화된다. 이 구현예에 따르면, 본 개시의 조성물은, 활성 화합물과 불활성 담체 또는 희석액에 더하여, 경질 젤라틴 캡슐을 포함한다.
다른 구현예에서, 조성물은 액체 제제의 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 적절한 액체 제형은, 용액, 현탁액, 분산제, 유탁액, 오일 등을 포함한다. 일 구현예에서, 제약 조성물은, 정맥내 투여되며, 따라서, 정맥내 투여에 적절한 형태로 조제된다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은, 동맥내 투여되고, 따라서 동맥내 투여에 적절한 형태로 제형화된다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은, 근육내 투여되고, 따라서 근육내 투여에 적절한 형태로 제형화된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편이 재조합 Lm 균주를 포함하는 조성물과 별도로 투여될 때, 항체는 정맥내, 피하 또는 종양 또는 종양 베드 내로 직접 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체를 포함하는 조성물은 종양이 수술로 제거된 후 남아있는 공간, 예를 들어 전립선 종양의 제거 후 전립선 내의 공간에 주입된다.
일 구현예에서, 용어 “면역원성 조성물”은 본원에 개시되는 재조합 리스테리아, 및 보강제, 및 항체 또는 이의 기능적 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 본원에 개시된 재조합 리스테리아를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은, 당업계에 알려져 있거나 본원에 개시된 바와 같은 애쥬번트를 포함한다. 또한, 이러한 조성물의 투여는 본원에서 추가로 개시되는 바와 같이, 면역 반응을 증강시키거나 조절 T 세포에 대한 T 효과기 세포의 비율을 증가시키거나 항종양 면역 반응을 유도함을 이해해야 한다.
일 구현예에서, 본 발명은 기술된 리스테리아 균주를 포함하고, 추가로 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 사용 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 사용 방법은 동일하거나 상이한 조성물에 존재할 수 있고, 리스테리아와 동일한 조성물 또는 별개의 조성물에 존재할 수 있는, 본원에 개시되는 하나 보다 많은 항체를 투여하는 것을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 상이한 구현예를 나타낸다.
일 구현예에서, 용어 “약제학적 조성물”은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께, 치료적으로 유효한 양의 리스테리아 균주를 포함하는 성분 또는 활성 성분, 및 적어도 하나의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. “치료적으로 유효한 양”이라는 용어는, 주어진 조건 및 투여 요법에서 치료 효과를 제공하는 양을 가리킨다는 점이 이해될 것이다.
숙련자라면, “투여”라는 용어가 대상을 본 개시의 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다는 점을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 투여는, 시험관내에서, 즉, 테스트 튜브에서, 또는 생체내에서, 즉, 생물, 예를 들어, 인간의 세포들이나 조직들에서 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 리스테리아 균주 및 이의 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 “약”은 정량적 측면에서 ±5%, 또는 다른 구현예에서 ±10%, 또는 다른 구현예에서 ±15%, 또는 다른 구현예에서 ±20%를 의미한다. 당업자는, “대상”이라는 용어가, 병태 또는 그 후유증에 대한 요법을 필요로 하거나 이에 민감한 성인 인간 또는 인간 어린이, 십대 또는 청소년을 포함하는 포유 동물을 포함할 수 있으며, 또한 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트, 및 마우스 같은 비-인간 포유류를 포함할 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 또한 상기 용어는 가축을 포괄할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 용어 "대상"은 모든 면에서 정상적인 개인을 배제하지 않는다.
본원에 개시되는 면역원성 조성물의 투여 후에, 본원에 개시되는 방법은 말초 림프 장기에서 T 효과기 세포의 팽창을 유도하여 종양 부위에서 T 효과기 세포의 존재를 증진시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법들은, 말초 림프 장기에서의 T 효과기 세포들의 증식을 유도하여 그 말초 부분에서의 증강된 T 효과기 세포들의 존재를 초래한다. 이러한 T 효과기 세포들의 팽창에 따라, Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 말초 부분과 종양 부위에서의 T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 비가 증가한다. 당업자는, 말초 림프 장기가 비장, 페이어스 패치, 림프절, 아데노이드 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 일 구현예에서, T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 증가된 비는, Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 말초 부분에서 발생한다. 다른 구현예에서, T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 증가된 비는, 말초 부분, 림프 장기, 및 종양 부위에서 이러한 부위들에서의 Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 발생한다. 또 다른 구현예에서, T 효과기 세포의 비율이 증가하면 Treg의 빈도가 감소하지만, 이들 부위에서의 Treg의 총 개수는 감소되지 않는다.
병용 요법 및 이의 사용 방법
일 구현예에서, 본 발명은 대상에서 강화된 항종양 T 세포 반응을 유발하는 방법으로서, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 융합 폴리펩티드는 이종 항원이나 이의 단편에 융합된 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 방법은 면역 체크포인트 억제제 대항물질을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제 대항물질은 항-PD-L1/PD-L2 항체 또는 그의 단편, 항-PD-1 항체 또는 그의 단편, 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편, 또는 항-B7-H4 항체 또는 그의 단편이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상에서 강화된 항-종양 T 세포 반응을 유발하는 방법으로서, 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 상기 핵산 분자는 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하며, 여기서 상기 방법은 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상에 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 효능제 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 구현예에서, 항체는 항-TNF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 구현예에서, 항체는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 구현예에서, 항체는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 부가적 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는데, 이는 상기 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물에 포함될 수 있거나 별개의 조성물에 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 리스테리아 균주를 포함하는 임의의 조성물이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 리스테리아 균주 및 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 본원에 기술되는 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체, 또는 T-세포 수용체 공동-자극 분자에 결합하는 항체 또는 공동-자극 분자에 결합하는 항원 제시 세포 수용체에 결합하는 항체를 포함하는 임의의 조성물이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 임의의 조성물이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 리스테리아 균주를 항체 없이 또는 이와 함께 포함하는 조성물은 위에 구체적으로 기술된다. 항체를 갖는 조성물 또한 위에 구체적으로 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체, 또는 T-세포 수용체 공동-자극 분자에 결합하는 항체 또는 공동-자극 분자에 결합하는 항원 제시 세포 수용체에 결합하는 항체를 포함하는 조성물은 리스테리아 균주를 포함하는 조성물의 투여 전, 이와 동시 또는 후에 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물의 반복 투여 (용량)은 첫 번째 치료 과정 직후 또는 종양 퇴화를 달성하기 위한 수 일, 수 주 또는 수 개월의 기간 후 수행될 수도 있다. 다른 구현예에서, 반복 투여량은 첫 번째 치료 과정 직후 또는 종양 성장의 억제를 달성하기 위한 수 일, 수 주 또는 수 개월의 기간 후 수행될 수도 있다. 평가는 이미징 기술, 혈청 종양 마커 분석, 생검, 또는 종양 관련 증상의 존재, 부재 또는 경감 같은 진단 방법을 포함하여, 본 기술분야에 공지된 기술들 중 어느 것에 의해 결정될 수도 있다.
일 구현예에서는, 본원에 개시된 것은 종양의 회피 돌연변이를 방지하면서, 이종 항원-발현 종양을 예방하고, 치료하고, 이에 대하여 백신접종하고 이종 항원의 서브-우성 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하는 조성물 및 방법이다.
일 구현예에서, 이종 항원-발현 종양을 예방하고, 치료하고, 이에 대하여 백신접종하기 위한 방법 및 조성물은 절단된 리스테리올리신(tLLO) 단백질의 사용을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 방법 및 조성물은 tLLO를 과발현하는 재조합 리스테리아를 포함한다. 다른 구현예에서, tLLO는 리스테리아 내의 플라스미드로부터 발현된다.
다른 구현예에서는, 본원에 개시된 것은 대상에서 종양 성장 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법으로, 이 방법은 본원에 기술되는 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 백신 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 핵산 분자는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기에서 융합 폴리펩티드는 이종 항원이나 이의 단편에 융합된 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서는, 본원에 개시된 것은 대상에서 종양 성장 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법으로, 이 방법은 본원에 기술되는 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 백신균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 핵산 분자는 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함한다.
일 구현예에서, 용어 “치료하는”은 질병을 치유하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “치료하는”은 질병을 예방하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “치료하는”은 질병의 발생을 감소시키는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “치료하는”은 질병의 증상을 개선시키는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “치료하는”은 환자의 무실행 생존율 또는 전체 생존률을 증가시키는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “치료하는”은 질병의 진행을 안정화하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “치료하는”은 차도를 유도하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, “치료하는”은 질병의 진행을 늦추는 것을 의미한다. 용어 “감소시키는 것,”“억압하는 것” 및 “억제하는 것”은 다른 구현예에서 줄이거나 저하시키는 것을 의미한다.
일 구현예에서는, 본원에 개시된 것은 대상의 비장 및 종양 미세환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비율의 증가 방법으로, 상기 증가 방법은 본원에 개시된 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 대상물의 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비를 증가시킴으로써, 대상물의 더욱 깊은 항종양 반응이 가능해진다.
다른 구현예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포이다. 다른 구현예에서,조절 T 세포는 CD4+FoxP3+ T 세포이다.
일 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 또는 암을 치료, 이에 대한 보호, 및 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 면역원성 조성물 균주인, LLO 단백질의 N-말단 단편 및 종양-관련 항원을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 포함하는재조합 리스테리아 균주를 대상에 투여하고, 이에 의해 재조합 리스테리아 균주가 종양-관련 항원에 대한 면역 반응을 유도하여,인간 대상에서 종양 또는 암을 치료하는 단계를 포함하는, 인간 대상에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 상기 면역 반응은 T-세포 반응이다. 다른 구현예에서, 상기 T-세포 반응은 CD4+FoxP3- T 세포 반응이다. 다른 구현예에서, 상기 T-세포 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 다른 구현예에서, 상기 T-세포 반응은 CD4+FoxP3- 및 CD8+ T 세포 반응이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 또는 암에 대해 대상을 보호하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양의 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 또는 암의 발생 또는 재발을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서는, 본원에 개시되는면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양의 형성을 억제하는 방법이 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 암의 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는핵산 분자는 리스테리아 게놈으로 통합된다. 다른 구현예에서, 핵산은 재조합 리스테리아 백신 균주 내의 플라스미드에 있다. 또 다른 구현예에서, 핵산 분자는 상기 재조합 리스테리아 백신 균주 내의 박테리아 인공 염색체에 있다.
일 구현예에서, 방법은 추가 요법과 함께 재조합 리스테리아를 공-투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 추가 요법은 수술, 화학요법, 면역 요법, 방사선 요법, 항체-기반 면역 요법 또는 이들의 조합이다. 다른 구현예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아의 투여에 선행한다. 다른 구현예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아의 투여에 뒤따른다. 다른 구현예에서, 추가 요법은 항체 요법이다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 T-효과기 세포 대 조절 T 세포 비율을 증가시키고 더 강력한 항-종양 면역 반응을 생성하기 위해 투여량을 늘리면서 투여된다. 항-종양 면역 반응은 IFN-γ, TNF-α를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 사이토카인, 및 세포 면역 반응을 강화하는 것으로 당해 기술 분야에서 공지된 기타 사이토카인을 종양을 갖는 상기 대상물에 제공함으로써 더욱 강화될 수 있다는 사실이 숙련자에 의해 이해될 것이며, 이들 중 일부는 본원에 참고로서 통합된 미국 특허 번호 제6,991,785호에서 찾을 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 상기 대상에서 본원에 개시된 면역원성 조성물을 항종양 면역 반응을 증강시키는 항체 또는 이의 기능성 단편과 함께 공동-투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시되는 방법은 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO) 경로 저해제와 함께 본원에 개시되는 면역원성 조성물을 공동-투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본 개시에서 사용하기 위한 IDO 경로 저해제는 1-메틸트립토판(1MT), 1- 메틸트립토판(1MT), 네크로스타틴-1, 피리독살 이소니코티노일 히드라존, 엡셀렌, 5-메틸인돌-3-카르복스알데히드, CAY10581, 항-IDO 항체 또는 소분자 IDO 저해제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는,본 분야에 알려진 임의의 IDO 경로 저해제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시되는 조성물 및 방법은 또한 화학치료 또는 방사선치료 요법과 함께, 그 전 또는 후에 사용된다. 다른 구현예에서, IDO 억제는 화학요법제의 효능을 강화시킨다.
다른 구현예에서는, 본원에 개시된 것은 암으로 고통받거나 종양을 갖는 대상의 생존을 증가시키는 방법으로, 이 방법은 본원에 기술되는 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 백신 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 핵산 분자는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기에서 융합 폴리펩티드는 이종 항원이나 이의 단편에 융합된 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서는, 본원에 개시된 것은 암으로 고통받거나 종양을 갖는 대상에서 항원-특이적 T-세포를 증가시키는 방법으로, 이 방법은 본원에 기술되는 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 백신 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 핵산 분자는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기에서 융합 폴리펩티드는 이종 항원이나 이의 단편에 융합된 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서는, 본원에 개시된 것은 암으로 고통받거나 종양을 갖는 대상에서 T 세포를 증가시키는 방법으로, 이 방법은 본원에 기술되는 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 백신 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 핵산 분자는 절단된 리스테리올리신 O(LLO) 단백질, 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열을 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 개시되는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 재조합 리스테리아 균주로 대상을 부스팅하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 부스터 접종에 사용되는 재조합 리스테리아 균주는 초기 "프라이밍" 접종에 사용되는 균주와 동일하다. 다른 구현예에서, 부스터 균주는 프라이밍 균주와 상이하다. 다른 구현예에서, 부스터 접종에 사용되는 항체는 초기 "프라이밍" 접종에 사용되는 항체와 동일한 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, 부스터 항체는 프라이밍 항체와 상이하다. 다른 구현예에서, 동일한 용량이 프라이밍 및 부스팅 접종에 사용된다. 다른 구현예에서, 더 큰 용량이 부스터에 사용된다. 다른 구현예에서, 더 작은 용량이 부스터에 사용된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 방법은 부스터 백신접종을 대상에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 부스터 백신접종은 단일 프라이밍 백신접종을 뒤따른다. 다른 구현예에서, 단일 부스터 백신접종은 프라이밍 백신접종 후 투여된다. 다른 구현예에서, 두 개의 부스터 백신접종이 프라이밍 백신접종 후 투여된다. 다른 구현예에서, 세 개의 부스터 백신접종이 프라이밍 백신접종 후 투여된다. 일 구현예에서, 프라임 및 부스터 균주 사이의 기간은 당업자에 의해 실험적으로 결정된다. 다른 구현예에서, 프라임 및 부스트 균주 사이의 기간은 1 주이고, 다른 구현예에서는 2 주이고, 다른 구현예에서는 3 주이고, 다른 구현예에서는 4 주이고, 다른 구현예에서는 5 주이고, 다른 구현예에서는 6-8 주이고, 또 다른 구현예에서 부스트 균주는 프라임 균주 8-10 주 후에 투여된다.
다른 구현예에서, 본 개시의 방법은 본원에 개시되는 약독화 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물로 대상을 부스팅하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시의 방법은 본원에 개시되는 약독화 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 부스터 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 추가용량은 상기 면역원성 조성물의 대안 형태이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 방법은 부스터 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 추가용량은 상기 면역원성 조성물의 단일 시동투여량을 뒤따른다. 다른 구현예에서, 시동투여 후 추가용량이 한 번 투여된다. 다른 구현예에서, 시동투여 후 추가용량이 두 번 투여된다. 다른 구현예에서, 시동투여 후 추가용량이 세 번 투여된다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 약독화된 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물의 시동 투여량과 부스터 투여량 사이의 기간은 당업자에 의해 실험적으로 결정된다. 다른 구현예에서, 용량은 당업자에 의해 실험적으로 결정된다. 다른 구현예에서, 시동투여와 추가용량 투여 사이의 기간은 1 주이고, 다른 구현예에서는 2 주이고, 다른 구현예에서는 3 주이고, 다른 구현예에서는 4 주이고, 다른 구현예에서는 5 주이고, 다른 구현예에서는 6-8 주이고, 또 다른 구현예에서 추가용량은 면역원성 조성물의 시동 투여 후 8-10 주에 투여된다.
이종 "프라임 부스트" 전략은 면역 반응 증진 및 다수의 병원체에 대한 보호에 효과가 있었다. Schneider 등, Immunol. Rev. 170:29-38(1999); Robinson, H. L., Nat. Rev. Immunol. 2:239-50(2002); Gonzalo, R. M. 등, Strain 20:1226-31(2002); Tanghe, A., Infect. Immun. 69:3041-7(2001). 상기 시동 및 추가투여 주사에 다양한 형태의 항원을 제공하는 것은 항원에 대한 면역 반응을 극대화하는 것처럼 보인다. 애주번트 내 단백질로 추가투여하거나 또는 항원을 인코딩하는 DNA의 바이러스 벡터 전달이 뒤따르는 DNA 균주 시동투여가, 항원 특이적 항체 및 CD4+ T-세포 반응 또는 CD8+ T-세포 반응 각각을 향상시키는 가장 효과적인 방법인 것처럼 보인다. Shiver J. W. 등, Nature 415: 331-5(2002); Gilbert, S. C. 등, Strain 20:1039-45(2002); Billaut-Mulot, O. 등, Strain 19:95-102(2000); Sin, J. I. 등, DNA Cell Biol. 18:771-9(1999). 원숭이 예방접종 연구의 최근 데이터는, HIV gag 항원을 인코딩하는 DNA에, CRL1005 폴록사머(12kDa, 5% POE)를 첨가하는 것은 HIV gag를 발현하는 아데노바이러스 벡터(Ad5-gag)로 추가투여하는 것이 뒤따르는 HIV gag DNA 시동투여로 원숭이가 예방접종되는 경우 T-세포 반응을 향상시킨다고 제시하고 있다. Ad5-gag 추가투여가 뒤따르는 DNA/폴록사머 시동투여에 대한 세포 면역 반응은 Ad5-gag 추가투여가 뒤따르는 DNA(폴록사머 없음) 시동투여 또는 Ad5-gag 만에 대해서만 유도된 반응보다 컸다. Shiver, J. W. 외. Nature 415:331-5(2002). 미국 특허 출원 공개 번호 US 2002/0165172 A1은 항원의 면역원성 부분을 인코딩하는 벡터 구축물 및 항원의 면역원성 부분을 포함하는 단백질을 공동 투여해서 면역 반응이 생성되는 것을 설명한다. 이 문서는 B 형 간염 항원들과 HIV 항원에 제한된다. 또한, 미국 특허. 번호 제6,500,432호는 관심있는 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 공동 투여에 의해 핵산 예방접종의 면역 반응을 강화하는 방법에 관한 것이다. 상기 특허에 따르면, 공동 투여는 동일한 면역 반응 동안, 바람직하게는 서로의 0-10 또는 3-7일 이내에서 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 투여를 가리킨다. 특허에 의해 고려되는 항원은, 그 중에서도, 간염(모든 형태), HSV, HIV, CMV, EBV, RSV, VZV, HPV, 소아마비, 인플루엔자, 기생충(예를 들어, 플라스모듐 속 유래), 및 병원성 박테리아(M. 튜버큘로시스, M. 레프래, 클라미디아, 쉬겔라, B. 부르그도르페리, 독소원성 E. coli, S. 티포사, H. 파일로리, V. 콜레라, B. 페르투시스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않음)의 항원을 포함한다. 상기 참고 문헌들 모두는 본원에 그 전체가 참조로 인용된다.
일 구현예에서, 본 개시의 치료 프로토콜은 치료적이다. 다른 구현예에서, 프로토콜은 예방적이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 조성물은 유방암 같은 암 또는 가족 유전학으로 인한 기타 유형의 종양 또는 숙련된 기술자에 의해 이해될 것과 같이 이러한 유형의 질환에 걸리기 쉽게 하는 다른 상황에 대한 위험에 있는 사람들을 보호하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 백신은 수술, 통상의 화학요법 또는 방사선 치료에 의해 종양 성장을 감축시킨 후 암 면역요법으로서 사용된다. 이러한 치료 후, 본 개시의 백신은 백신의 종양 항원에 대한 CTL 반응이 남아 있는 전이를 파괴하고 암으로부터의 차도를 연장시키기 위해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 백신은 이전에 확립된 종양의 성장에 영향을 미치고 기존의 종양 세포를 죽이기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 용어 “포함하다”또는 이의 문법적 형태는 표시된 활성 물질, 예를 들어 본 발명의 Lm 균주의 포함뿐 아니라 다른 활성 물질, 예를 들어 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 제약 산업에 알려진 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 연화제, 안정화제 등의 포함을 가리킨다. 일부 구현예에서, 용어 “필수적으로 구성되는”은 유일한 활성 성분이 표시된 활성 성분이지만, 제형의 안정화, 보존 등을 위하여 포함될 수 있지만 표시된 활성 성분의 치료적 효과에 직접적으로 연관되지 않는 다른 화합물이 포함될 수 있는 조성물을 가리킨다. 일부 구현예에서, 용어 “필수적으로 구성되는”은 표시된 활성 성분과 구분되는 기전을 통해 치료적 효과를 발휘하는 성분을 가리킬 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 “필수적으로 구성되는”은 표시된 활성 성분과 구분되는 계열의 화합물에 속하고 치료적 효과를 발휘하는 성분을 가리킬 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 “필수적 구성요소”는, 예를 들어 상이한 작용 기전을 통해 작용함으로써, 표시된 활성 성분과 구분될 수 있고 치료적 효과를 발휘하는 성분을 가리킬 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 “필수적 구성요소”는 활성 성분의 방출을 용이하게 하는 성분을 가리킬 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 “구성요소(consisting)”는 활성 성분 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “한”“하나”“그”라는 단수 형태는, 문맥상 명백하게 다르게 명시하지 않는 한 참조되는 부분의 복수 개를 포함한다. 예를 들어, “한 화합물”또는 “적어도 하나의 화합물”이라는 용어는, 복수의 화합물의 혼합물을 포함한 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본원 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예들은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형태의 설명은, 편의성과 간략성을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 변경할 수 없게 한정하는 것으로서 해석해서는 안 된다는 점을 이해하도록 한다. 이에 따라, 범위 설명은, 모든 가능한 부 범위 및 그 범위 내의 개별적인 수치를 특정하게 개시한 것으로서 고려해야 한다. 예를 들어, 1 내지 6 등의 범위 설명은, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등의 부 범위, 및 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6을 특정하게 개시한 것으로서 고려해야 한다. 이는 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
본원에서 수치 범위가 표시될 때마다, 이것은, 표시된 범위 내에서의 임의의 언급되는 수치(분수 형태 또는 정수 형태)를 포함하는 것을 의미한다. 제1 표시 수와 제2 표시 수 사이에 “걸치는/걸치다”및 제1 표시 수로부터 제2 표시 수까지 “걸치는/걸치다”라는 구들은, 본원에서 상호 교환가능하게 사용되며, 제1 표시 수와 제2 표시 수 및 이들 사이의 모든 분수와 정수 형태의 수를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 “방법”이라는 용어는, 화학적, 약학적, 생물학적, 생화학적 및 의료 분야의 실무자에게 알려져 있거나 이들에 의해 알려져 있는 방식, 수단, 기법 및 절차로부터 용이하게 개발되는 방식, 수단, 기법 및 절차를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 주어진 작업을 달성하기 위한 방식, 수단, 기법 및 절차를 가리킨다.
다음의 실시예들에서, 다수의 특정 세부사항들이 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 명시된다. 그러나, 본 개시는 이들 특정 세부사항 없이도 실시될 수 있음을 숙련자라면 이해할 것이다. 다른 예에서, 주지의 방법, 절차 및 요소는 본 개시를 불명료하게 하지 않도록 상세하게 설명되지 않았다.
실시예
재료 및 실험 방법(실시예 1-2)
세포주
C57BL/6 동계 TC-1 종양을, HPV-16 E6 및 E7로 무한증식하고 c-Ha-ras 종양유전자로 형질전환하였다. T. C. Wu (존스홉킨스 의과대학, 메릴랜드주 볼티모어) 에 의해 제공되는 TC-1은, 낮은 수준의 HPV-16 E6과 E7을 발현하고 c-Ha-ras 종양 유전자로 형질전환된 고 종양 형성 폐 상피 세포이다. 10% CO2와 37℃에서, RPM 1640, 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 100 μM 비필수 아미노산, 1 mM 소듐 피루베이트, 50 마이크로몰(mcM) 2-ME, 400 마이크로그램(mcg)/ml G418, 및 10% 내셔컬 컬렉션형 배양물-109 배지에서 TC-1을 성장시켰다. C3은, HPV16의 완전한 게놈으로 무한 증식되고 pEJ-ras로 형질전환된 C57BL/6 마우스로부터의 마우스 배아 세포이다. EL-4/E7은, E7로 레트로바이러스 변환된 티모마 EL-4이다.
L. 모노사이토게네스 균주 및 전파
사용된 리스테리아 균주는, 본원에서 ADXS11-001로도 언급되는 Lm-LLO-E7(에피솜 발현계의 hly-E7 융합 유전자; 도 1a), Lm-E7(리스테리아 게놈에 통합된 단일-카피 E7 유전자 카세트), Lm-LLO-NP(“DP-L2028”; 에피솜 발현계의 hly-NP 융합 유전자), 및 Lm-Gag(“ZY-18”; 염색체에 통합된 단일-카피 HIV-1 Gag 유전자 카세트)이었다. E7는 프라이머 5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3' (서열번호 24; XhoI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (서열번호 25; SpeI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었으며 pCR2.1 (Invitrogen사, San Diego, CA)로 연결되었다. E7을 XhoI/ SpeI 소화에 의해 pCR2.1로부터 잘라내고, pGG-55에 연결하였다. hly-E7 융합 유전자 및 다능성 전사 인자 prfA는 pGG-55를 생성하며, 다중복제 셔틀 플라스미드 (Wirth R 등, J Bacteriol, 165: 831, 1986)인, pAM401로 클로닝되었다. hly 프로모터는 hly 유전자 산물(용혈성 C-말단이 결여됨, “ΔLLO”로서 하기에 언급되고, 서열번호 3으로 제시되는 서열을 가짐)의 처음 441 AA 아미노산의 발현을 구동하며, 이것은 E7 유전자에 Xhol 위치로 결합되어, LLO-E7로서 전사되고 분비되는 hly-E7 융합 유전자를 산출한다. 플라스미드의 생체내 보유를 위해 선택된 PGG-55에 의한 (펜실바니아대 Hao Shen 박사에 의해 제공되는) 리스테리아의 PrfA 음성 균주 XFL-7의 형질전환(도 1a-1b). hly 프로모터 및 유전자 단편은 프라이머 5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (서열번호 26; NheI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3' (서열번호 27; XhoI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 생성되었다. prfA 유전자는 프라이머 5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(서열번호 28; XbaI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (서열번호 29; SalI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR 증폭되었다. E7의 분비와 발현을 구동하는 신호 서열과 hly 촉진제를 함유하는 발현 카세트를 LM 게놈의 orfZ 도메인 내에 도입하여 Lm-E7을 생성하였다. E7는 프라이머 5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3' (서열번호 30; 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3' (서열번호 31; 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 이어서, E7을 pZY-21 셔틀 벡터에 연결하였다. LM 균주 10403S를 형성 플라스미드인 pZY-21-E7로 형질전환하였으며, 이 플라스미드는, LM 게놈의 X, Y, Z 도메인에 대응하는 1.6kb 서열의 중간에 삽입된 발현 카세트를 포함한다. 상동 도메인은, 상동 재조합에 의한 E7 유전자 카세트의 orfZ 도메인 내로의 삽입을 허용한다. E7 유전자 카세트의 orfZ 도메인 내로의 통합을 위해 클론들을 선별하였다. (Lm-LLO-E7 및 Lm-LLO-NP)가 있는 또는 (Lm-E7 및 ZY-18) 클로로암페니콜(20 μg/ml)이 없는 뇌 심장 주입 배지에서 세균을 성장시켰다. 박테리아를 -80℃에서 부분 표본에 동결하였다. 웨스턴 블롯팅에 의해 발현을 검증하였다(도 2).
웨스턴 블롯팅
리스테리아 균주는 37℃에서 루리아-베트로니 배지(Luria-Bertoni medium)에서 성장하였으며 600 nm에서 측정된 동일한 광학 밀도에서 수확되었다. 상등액을TCA 침전시키고, 0.1N NaOH가 보충된 1x 샘플 버퍼에서 재부유시켰다. 각 세포 펠릿 또는 각 TCA-침전된 상등액의 동일한 양을 4-20% Tris-글리신 SDS-PAGE 겔(NOVEX, 캘리포니아주 샌디에고)에 로딩하였다. 겔들을 폴리비닐리덴 디플루오라이드로 형질전환하고, 항-E7 단일클론 항체(mAb)(Zymed Laboratories, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로 프로빙한 후, HRP-접합된 항-마우스 이차 Ab(Amersham Pharmacia Biotech, 영국 리틀 챌폰트)로 배양하고, Amersham ECL 검출 시약으로 현상하고, Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)에 노출시켰다.
종양 성장의 측정
최단 표면 직경과 최장 표면 직경에 걸친 캘리퍼로 하루 걸러 종양을 측정하였다. 이러한 두 개의 측정값의 평균을 다양한 시점에 대하여 밀리미터 단위의 평균 종양 직경으로서 플롯팅하였다. 종양 직경이 20 mm에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 각 시점에 대한 종양 측정값은 생존하고 있는 마우스에 대해서만 도시되어 있다.
확립된 종양 성장에 대한 리스테리아 재조합체의 영향
6주 내지 8주된 C57BL/6 마우스(Charles River)는 좌측 옆구리에 2x105 TC-1 세포를 피하식으로 수용하였다. 종양 접종 후 1주일째, 종양은 직경이 4-5mm인 감지가능한 크기에 도달하였다. 이어서, 8개 마우스 군을 0.1 LD50 복강내 Lm-LLO-E7 (107 CFU), Lm- E7 (106 CFU), Lm-LLO-NP (107 CFU), 또는 Lm-Gag (5 x 105 CFU)로 7일차와 14일차에 처치하였다.
51 Cr 방출 분석
6 내지 8주된 C57BL/6 마우스를, 0.1LD50 Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, 또는 Lm-Gag로 복강내 면역시켰다. 예방 접종후 10일차에 비장을 채취하였다. 지지 세포(feeder cell)로서 방사선 조사 TC-1 세포가 있는 배양물에서 세포를 확립하였고(100:1, 비장 세포:TC-1), 5일 동안 시험관내에서 자극한 후, 표적들을 사용하여 표준 51Cr 방출 분석에 사용하였다: EL-4, EL-4/E7, 또는 E7 H-2b 펩티드(RAHYNIVTF)로 펄스 처리된 EL-4. 3회 수행된 E:T 세포 비는 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 및 2.5:1이었다. 37℃에서의 4시간 배양 후에, 세포를 펠릿 처리하고, 50 μl 상등액을 각 웰로부터 제거하였다. Wallac 1450 섬광 계수기(메릴랜드주 게이더스버그)로 샘플들을 분석하였다. 퍼센트 특이성 용해를, [(분당 실험 카운트(cpm)-순간 cpm)/(총 cpm-순간 cpm)] x 100으로서 결정하였다.
TC-1-특이성 증식
C57BL/6 마우스를 0.1 LD50로 면역시키고, 1 LD50 Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP 또는 Lm-Gag로 20일째 복강내 주입에 의해 추가투여하였다. 추가투여 후 6일째, 면역된 원시 마우스로부터 비장을 채취하였다. E7 Ag의 소스로서 웰 당 2.5 x 104, 1.25 x 104, 6 x 103, 또는 3 x 103 방사선 조사된 TC-1 세포가 있는, 또는 TC-1 세포가 없는, 또는 10 μg/ml Con A가 있는, 바닥이 평평한 96개의 웰 판에서 5 x 105/웰로 배양액에 비장 세포를 확립하였다. 45시간 후에 세포를 0.5 μCi [3H]티미딘/웰로 펄스 처리하였다. Tomtec harvester 96 (코네티컷주 오렌지)을 사용하여18시간 후에 평판들을 거두고, Wallac 1450 섬광 계수기로 증식을 분석하였다. cpm의 변화를 실험적 cpm-no Ag cpm으로서 산출하였다.
유동 세포 분석
C57BL/6 마우스를 0.1 LD50 Lm-LLO-E7 또는 Lm-E7로 정맥 내(i.v.) 면역시키고 30일 후 추가투여하였다. CellQuest®소프트웨어를 구비한 FACSCalibur®유동 세포 분석기(Becton Dickinson, 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 CD8 (53-6.7, PE 접합형), CD62 리간드(CD62L; MEL-14, APC 접합형), 및 E7 H-2Db 4량체에 대한 3색 유동 세포 분석을 수행하였다. 부스트 후 5 일째 채취한 비장세포를, E7 펩티드(RAHYNIVTF) 또는 대조(HIV-Gag) 펩티드가 로딩된 H-2Db 4량체로 실온(rt)에서 염색하였다. 4량체들을 1/200 희석으로 사용하고, Dr. Larry R. Pease (Mayo Clinic, 미네소타주 로체스터) 및 NIAID Tetramer Core Facility 및 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program에 의해 제공되였다. 4량체+, CD8+, CD62Llow 세포를 분석하였다.
B16F0-난자 실험
24 C57BL/6 마우스를 5 x 105 B16F0-난자 세포로 접종하였다. 3일, 10일, 및 17일차에 0.1 LD50 Lm-OVA (106 cfu), Lm-LLO-OVA (108 cfu)로 8개 마우스의 군을 면역시키고, 8마리 동물은 치료하지 않은 상태로 두었다.
통계
종양 직경의 비교를 위해, 각 군에 대한 종양 크기의 평균 및 SD를 측정하고, 스튜던트 t 검정에 의해 통계 유의성을 결정하였다. p ≤ 0.05가 유의성을 갖는 것으로 간주되었다.
실시예 1: LLO-항원 융합은 항종양 면역성을 유도한다
결과
TC-1 성장에 영향을 미치는 능력에 대하여 Lm-E7 및 Lm-LLO-E7을 비교하였다. C57BL/6 마우스의 좌측 옆구리에 피하 종양을 확립하였다. 7일 후, 종양이 검출가능한 크기(4-5 mm)에 도달하였다. 0.1 LD50 Lm-E7, Lm-LLO-E7, 또는 대조군인 Lm-Gag 및 Lm-LLO-NP로 7일차와 14일차에 마우스를 예방접종하였다. Lm-LLO-E7은 확립된 TC-1 종양의 75%의 완전한 퇴행을 유도한 한편, 그룹 내 다른 2 마리 마우스에서 종양 성장을 제어하였다(도 3). 대조적으로, Lm-E7과 Lm-Gag에 의한 면역화는 종양 퇴행을 유도하지 않았다. 이 실험을 여러 번 반복하였으며, 항상 매우 유사한 결과를 얻었다. 또한, 서로 다른 면역화 프로토콜들 하에서 Lm-LLO-E7에 대하여 유사한 결과들을 얻었다. 다른 실험에서, 확립된 5 mm TC-1 종양이 있는 마우스를 단일 면역화로 치료할 수 있었다.
다른 실험들에서, 2개의 다른 E7-발현 종양 세포주로 유사한 결과를 얻었다: C3 및 EL-4/E7. Lm-LLO-E7에 의한 예방접종의 효능을 확인하기 위해, 종양이 제거된 동물들을 상대로 60일차 또는 40일차에 TC-1 또는 EL-4/E7 종양 세포로 각각 재시험하였다. Lm-LLO-E7로 면역된 동물들은, 실험 종료(TC-1의 경우엔 124일 및 EL-4/E7의 경우엔 54일)까지 종양이 없었다.
따라서, ΔLLO를 이용한 융합 단백질로서 항원의 발현은 항원의 면역원성을 향상시킨다.
실시예 2: LM-LLO-E7 처치는 TC-1 특이적 비장세포 증식을 유발한다
Lm-LLO-E7을 이용한 Lm-E7에 의한 T 세포의 유도를 측정하기 위해, 항원-특이적 면역능력의 척도인 TC-1-특이적 증식 반응을 면역화된 마우스에서 측정하였다. Lm-LLO-E7로 면역된 마우스로부터의 비장 세포는, E7의 소스로서 방사선 조사된 TC-1 세포에 노출시 20:1, 40:1, 80:1, 및 160:1의 비장 세포:TC-1 비율로 증식되었다(도 4). 역으로, Lm-E7과 rLm 대조군 면역 마우스로부터의 비장 세포는 백그라운드 수준의 증식만을 나타내었다.
실시예 3: ActA-E7 및 PEST-E7 융합은 항-종양 면역성을 부여한다
재료 및 방법
Lm-ActA-E7의 제조
Lm-ActA-E7는 LM의 재조합 균주이며, actA 단백질의 절단된 버전으로 융합된 E7 단백질을 발현하는 플라스미즈를 포함한다. Lm-actA-E7은 pDP-2028을 변형시켜 제작된 플라스미드 벡터 pDD-1를 리스테리아로 도입하여 생성하였다. pDD-1은 310 bp hly 프로모터 및 hly 신호 서열(ss)의 카피를 발현하는 발현 카세트를 포함하는데, 이는 ActA-E7의 발현 및 분비를 유도한다; 4 개의 PEST 서열을 포함하는 actA 유전자의 1170 bp(서열번호 19)(분자의 처음 390 개 AA로 구성되는 절단된 ActA 폴리펩티드, 서열번호 11); 300 bp HPV E7 유전자; 1019 bp prfA 유전자(병원성 유전자의 대조 발현); 및 형질전환된 박테리아 클론를 선택하기 위한 CAT 유전자(클로람페니콜 저항성 유전자)(Sewell 외, (2004), Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg., 130:92-97).
hly 프로모터(pHly) 및 유전자 단편은 프라이머 5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(Xba I 부위는 밑줄 그어져 있음; 서열번호 32) 및 프라이머 5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3(I 위치는 밑줄 그어지지 않음. 처음 18개의 뉴클레오티드는 ActA 유전자 중첩이다; 서열번호 33)을 이용하여 pGG55(실시예 1)로부터 PCR 증폭되었다. actA 유전자는 프라이머 5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3'(NotI 부위는 밑줄 그어져 있음; 서열번호 34) 및 프라이머 5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3'(XhoI 부위는 밑줄 그어져 있음; 서열번호 35)를 이용하여 LM 10403s 야생형 게놈으로부터 PCR 증폭되었다. E7 유전자는 프라이머 5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(XhoI 위치는 밑줄 그어져 있음; 서열번호 36) 및 프라이머 5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(XmaI 위치는 밑줄 그어져 있음; 서열번호 37)를 이용하여 pGG55(pLLO-E7)로부터 PCR 증폭되었다. prfA 유전자는 프라이머 5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(Xmal 위치는 밑줄 그어져 있음; 서열번호 38) 및 프라이머 5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SalI 부위는 밑줄 그어져 있음; 서열번호 39)를 이용하여 LM 10403s 야생주 게놈으로부터 PCR 증폭되었다. Hly 프로모터-actA 유전자 융합(pHly-actA)은 PCR 생성되었고, 정제된 pHly DNA 및 정제된 actA DNA로부터 업스트림 pHly 프라이머(서열번호 32) 및 다운스트림 actA 프라이머(서열번호 35)를 이용하여 증폭되었다.
prfA 유전자에 융합된 E7 유전자(E7-prfA)는 PCR 생성되었으며, 정제된 E7 DNA 및 정제된 prfA DNA로부터 업스트림 E7 프라이머(서열번호 36) 및 다운스트림 prfA 유전자 프라이머(서열번호 39)을 이용하여 증폭되었다.
E7-prfA 융합 산물에 융합된 pHly-actA 융합 산물은 PCR 생성되었으며, 정제된 융합 pHly-actA DNA 산물 및 정제된 융합 E7-prfA DNA 산물로부터 업스트림 pHly 프라이머(서열번호 32) 및 다운스트림 prfA 유전자 프라이머(서열번호 39)를 이용하여 증폭되었고, pCRII(Invitrogen, 라 졸라, 캘리포니아)로 연결되었다. 컴피턴트 대장균(competent E.coli) (TOP10'F, Invitrogen, 라 졸라, 캘리포니아)은 pCRII-ActAE7로 형질전환되었다. 용해 및 분리 이후, 플라스미드는 BamHI(770 bp 및 6400 bp 단편 크기로 예상됨 (또는 삽입이 벡터로 반전되었을 때: 2500 bp 및 4100 bp)) 및 BstXI(2800 bp 및 3900 bp 단편 크기로 예상됨)을 이용하는 제한 분석으로 스크리닝 하였으며, 업스트림 pHly 프라이머(서열번호 32) 및 다운스트림 prfA 유전자 프라이머(서열번호 39)를 이용하는 PCR 분석으로도 스크리닝 하였다.
pHly-actA-E7-prfA DNA 삽입체는 Xba I 및 Sal I로 이중 분해하여 pCRII로부터 절단하고, 또한 Xba I 및 Sal I로 분해된 pDP-2028에 연결하였다. TOP10’F 컴피턴트 E. coli(Invitrogen, 라 졸라, 캘리포니아주)를 발현 계 pActAE7로 형질전환시킨 후, 클로람페니콜 내성 클론을 업스트림 pHly 프라이머(서열번호 32) 및 다운스트림 PrfA 유전자 프라이머(서열번호 39)를 이용하는 PCR 분석으로 스크리닝하였다. pActAE7을 포함하는 클론을 브레인 하트 인퓨전 배지에서 클로로람페니콜(20 mcg(마이크로그램)/ml(밀리리터), Difco (미시간주 디트로이트)와 함께)에서 성장시키고, pActAE7를 midiprep DNA 정제 시스템 키트(Promega, 매디슨, 위스콘신주)를 이용하여 박테리아 세포로부터 단리시켰다. 페니실린-처치된 리스테리아(균주 XFL-7)의 prfA-음성 균주는 Ikonomidis 등 (1994, J. Exp. Med. 180: 2209-2218)에 기술된 바와 같이, 발현 시스템 pActAE7로 형질전환되었으며 플라스미드의 생체 내 보유를 위해 클론을 선택하였다. 클론은 37℃에서 클로람페니콜 (20 mcg/ml)과 함께 브레인 하트 인퓨젼에서 성장하였다. 박테리아는 -80℃의 분획에서 냉각되었다.
항원 발현의 면역 검증
Lm-ActA-E7가 ActA-E7를 분비하는 지 확인하기 위해 (약 64 kD), 리스테리아 균주가 37℃에서 루리아-베르토니(LB) 배지에서 성장하였다. 단백질은 트리클로로아세트산(TCA)로 배양 상층액으로부터 침전되었으며 0.1 N 수산화나트륨으로 1x 샘플 완충액 중에서 재현탁되었다. 각 TCA 침전된 상층액의 동일한 양이 4% 내지 20% Tris-글리세린 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 젤 (NOVEX, 샌디에고, 캘리포니아주) 상에 로딩되었다. 젤은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 이동되었으며 1:2500 항-E7 단일클론성 항체 (Zymed Laboratories, 사우스 샌프란시스코, 캘리포니아주)로, 그 후 1:5000 홀스래디쉬 퍼록시다아제-공액 항-마우스 IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, 영국)로 프로브되었다. 블롯을 Amersham 인핸스드 화학발광 검출 시약으로 현상하고 방사능 사진 필름(Amersham)에 노출시켰다(도 5a).
Lm-PEST-E7, Lm-ΔPEST-E7, 및 Lm-E7epi의 구축(도 6a)
Lm-PEST-E7는 이것이 hly 유전자의 프로모터 및 PEST 서열, 특히 특히 LLO의 처음 50 아미노산을 함유한다는 것을 제외하고는, Lm-LLO-E7와 동일하다.　 Lm-PEST-E7를 구성하기 위해, hly 프로모터 및 PEST 영역은 SOE (중첩 연장에 의한 유전자 스플라이싱) PCR 기술을 이용하여 전체-길이 E7 유전자에 융합되었다. E7 유전자 및 hly-PEST 유전자 단편은 LLO의 처음 441 아미노산을 함유하는, 플라스미드 pGG-55로부터 증폭되었으며, 이전의 PCR 기술에 의해 서로 스플라이싱되었다. 최종 플라스미드인, pVS16.5를 형성하기 위해, hly-PEST-E7 단편 및 prfA 유전자가 플라스미드 pAM401로 서브클로닝 되었으며, 이것은 시험관내 선택에 대해 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하며, 생성된 플라스미드는 XFL-7을 형질전환 하기 위해 사용되었다.
Lm-ΔPEST-E7는 이것이 PEST 서열이 결여되었다는 것을 제외하고는 Lm- LLO-E7와 동일한 재조합 리스테리아 균주이다. 에피솜 발현 시스템은 에피솜 발현 시스템이 hly-E7 융합 유전자로부터 PEST-함유 영역 (bp 333 내지 387)를 제거하기 위해 설계된 프라이머를 이용하여 제조되었다는 것을 제외하고는, Lm-PEST-E7에 대해 기재된 바와 같이 본질적으로 제조되었다. Lm-E7epi는 PEST 영역 또는 LLO 없이 E7을 분비하는 재조합 균주이다. 이러한 균주를 형질전환 하기 위해 사용되는 플라스미드는 hly 프로모터 및 E7 유전자로 융합된 신호 서열의 유전자 단편을 포함한다. 이러한 구조는 본래의 Lm-E7과는 상이하며, 이것은 염색체로 통합된 E7 유전자의 단일 복제를 발현하였다. Lm-E7epi는 발현된 E7 항원의 형태를 제외하고는 Lm- LLO-E7, Lm-PEST-E7, 및 Lm-ΔPEST-E7와 완벽하게 동종이다.
결과
Lm-ActA-E7 대 Lm-LLO-E7에 의해 유도된 항-종양 면역을 비교하기 위해, 2 x 105 TC-1 종양 세포가 마우스에서 피하로 이식되었으며 감지가 가능한 크기로 성장하였다 (약 5 밀리미터 [mm]). 마우스는 7 일 및 14 일차에 Lm-ActA-E7 (5 x108 CFU), (십자가) Lm-LLO-E7 (108 CFU) (사각형) 또는 Lm-E7 (106 CFU) (원) 중 하나의 LD50으로 복강내 면역화되었다. 26 일째, 모든 미처리 동물(삼각형) 및 Lm-E7로 면역화된 동물이 대형 종양을 성장시킨 반면, Lm-LLO-E7 및 Lm-ActA-E7에서는 모든 동물이 종양이 없었고 그렇게 유지되었다(도 5b). 따라서, ActA-E7 융합과의 백신접종은 종양 퇴행을 야기한다.
또한, Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-ΔPEST-E7, 및 Lm-E7epi에 대하여 E7-발현 종양의 퇴행을 야기하는 그들의 능력을 비교하였다. TC-1 종양은 40마리의 C57BL/6 마우스의 왼쪽 측면에 구축되었다. 종양이 4 내지 5 mm에 도달한 이후, 마우스는 8 마리의 5 그룹으로 나누어졌다. 각각의 그룹은 4 개의 재조합 LM 백신 중 1개로 처리되었으며, 1 그룹은 처리하지 않고 방치되었다. Lm-LLO-E7 및 Lm-PEST-E7는 각각, 5/8 및 3/8 경우에서 확립된 종양의 퇴행을 유도하였다. 어떠한 시점에서도 Lm-PEST-E7 또는 Lm-LLO-E7로 처리된 마우스의 평균 종양 크기 사이에는 유의한 차이점이 없었다. 그러나, PEST 서열, Lm-ΔPEST-E7 및 Lm-E7epi 없이 E7을 발현하는 백신은, 하나를 제외하고는 모든 마우스에서 종양 퇴행을 야기하는데 실패하였다(도 6b, 상부 패널). 이것은 2 실험의 대표적인 것으로, 여기에서는 28 일째에 평균 종양 크기에서 통계적으로 유의미한 차이점이 Lm-LLO-E7 또는 Lm-PEST-E7로 처리된 종양과 Lm-E7epi 또는 Lm-ΔPEST-E7로 처리된 것 사이에서 발견되었다; P < 0.001, 스튜던트 t 검정; 도 6b, 하부 패널). 또한, 4량체-양성 비장세포의 증가된 백분율이 PEST-포함 백신으로 백신접종된 마우스의 비장에서 3 실험에 걸쳐 재현 가능하게 나타났다(도 6c). 따라서, PEST-E7 융합과 백신접종은 종양 퇴행을 야기한다.
실시예 4: LLO, ActA, 또는 PEST-유사 서열에 대한 E7의 융합은 E7-특이적 면역을 향상시키고 종양-침윤성 E7-특이적 CD8 + 세포를 생성한다
재료 및 실험 방법
인산 완충 식염수 (PBS) 중 2 x 105 TC-1 종양 세포 100 mcl를 포함하는 MATRIGEL® 500 mcl (마이크로리터)와 MATRIGEL®(BD Biosciences, 프랭클린 레이크스, 뉴저지) 400 mcl를 12 C57BL/6 마우스 (n=3)의 좌측 옆구리에 피하 내 이식하였다. 7일, 14일, 및 21일차에 마우스를 복강내 면역화시키고, 28일차에 비장과 종양을 채취하였다. 마우스로부터 종양 MATRIGEL을 제거하고, 얼음 상에 2 ml의 RP 10 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 4℃에서 배양하였다. 종양을 겸자로 갈고, 2 mm 블록들로 절단하고, 3 ml의 효소 혼합물(0.2 mg/ml 콜라게나제-P, PBS 내 1 mg/ml DNAse-1)로 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 조직 현탁액을 나일론 메시를 통해 필터링하고, 4량체 및 IFN-감마 염색을 위해 5% 소태아혈청 + PBS 내 0.05%의 NaN3로 세척하였다.
비장 세포와 종양 세포를 107 세포/ml의 브레펠딘 A의 존재 하에 1 마이크로몰(mcm)의 E7 펩티드로 5시간 동안 배양하였다. 세포를 2회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 또는 밤새 50 mcl의 항-마우스 Fc 수용체 상등액(2.4 G2)에서 배양하였다. 세포를 표면 분자 CD8 및 CD62L에 대하여 염색하고, 침투 키트 Golgi-stop® 또는 Golgi-Plug®(Pharmingen, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 침투, 고정하고, IFN-감마에 대해 염색하였다. 이중-레이저 유동 세포 분석기 FACSCalibur 를 사용하여 500,000개 이벤트를 얻고, Cellquest 소프트웨어(Becton Dickinson, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 분석하였다. 활성화된 (CD62Llow) CD8+ T 세포 내의 IFN-감마 분비 세포의 퍼센트를 산출하였다.
4량체 염색의 경우, H-2Db 4량체를 피코에리트린(PE)-접합된 E7 펩티드(RAHYNIVTF, 서열번호 40)와 함께 로딩하고, 1 시간 동안 상온에서 염색하고, 항-알로피코시아닌(APC) 접합된 MEL-14(CD62L) 및 FITC-접합된 CD8+로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 비장 및 종양에서의 4량체+CD8+ CD62Llow 세포를 비교하여 분석하였다.
결과
항원 특이 면역성을 향상시키는 Lm-ActA-E7의 능력을 분석하기 위해, 마우스에 TC-1 종양 세포를 이식하고, Lm-LLO-E7(1 x 107 CFU), Lm-E7 (1 x 106 CFU), 또는 Lm-ActA-E7(2 x 108 CFU)로 면역시켰거나, 또는 치료하지 않았다(미처리). Lm-LLO-E7 및 Lm-ActA-E7 그룹으로부터의 마우스의 종양은 Lm-E7 또는 미처리 마우스에서보다 더 높은 백분율의 IFN-감마-분비 CD8+ T 세포(도 7a) 및 4량체-특이적 CD8+ 세포(도 7b)를 포함하였다.
다른 실험에서는, 종양이 있는 마우스에 Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-ΔPEST-E7, 또는 Lm-E7epi를 투여하고, 종양 내의 E7-특이성 림프구의 레벨을 측정하였다. 7일째와 14일째, 4개 백신의 0.1 LD50으로 마우스를 치료하였다. 21일차에 종양을 채취하여 CD62L, CD8에 대한 항체 및 E7/Db 4량체로 염색하였다. 종양 내 4량체-양성 림프구의 증가된 백분율은 Lm-LLO-E7 및 Lm-PEST-E7로 백신접종된 마우스에서 관찰되었다(도 8a). 이 결과는 세 개 실험에 걸쳐 재현 가능하였다(도 8b).
따라서, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7, 및 Lm-PEST-E7 각각은, 종양-침윤 CD8+ T 세포의 유도 및 종양 퇴행에 효과적이다.
실시예 5: LLO 및 ActA 융합은 E6/E7 트랜스제닉 마우스에서 자생(자발적) 종양을 감소시킨다
E6/E7 트랜스제닉 마우스에서 자생 종양에 대한 Lm-LLO-E7 및 Lm-ActA-E7 백신의 영향을 결정하기 위해, 6 내지 8 주령의 마우스를 1 x 108 Lm-LLO-E7 또는 2.5 x 108 Lm-ActA-E7로 매달 1 회씩 8 개월 동안 면역화하였다. 최종 면역화 20 일 후 마우스를 희생시키고 이들의 갑상선을 제거하여 칭량하였다. 이 실험은 2 회 수행되었다(표 1).
8 개월 시기에서 비백신접종 및 백신접종된 형질전환 마우스의 갑상선 중량(mg)*.
비처리 + S.D. Lm-LLO-NP + S.D. Lm-LLO-E7 + S.D. Lm-ActA-E7 + S.D.
실험 1
408
123
385
130
225
54
305
92
실험 2
588
94
503
86
239
68
275
84
* 스튜던트 t 시험을 사용하여 수행된 통계적 분석에서는 Lm-LLO-NP 처리된 마우스와 비처리 마우스 사이의 갑상선 중량 차이는 유의미하지 않았지만 Lm-LLO-E7와 Lm-ActA-E7 처리된 마우스 사이의 차이는 매우 유의미하였음을 보여주었다(p<0.001).
Lm-LLO-E7 처리된 마우스와 비처리 마우스 사이 및 Lm-LLO-ActA 처리된 마우스와 비처리 마우스 사이의 갑상선 중량의 차이는 두 실험 모두에서 유의미한 반면(각각 p<0.001 및 p<0.05), Lm-LLO-NP 처리된 마우스(비관련 항원 대조)와 비처리 마우스 사이의 차이는 유의미하지 않아서(스튜던트 t 시험), Lm-LLO-E7 및 Lm-ActA-E7이 자발적 종양 성장을 억제된 것을 보여준다. 따라서, 본원에 개시된 백신은 새로운 E7-발현 종양의 형성을 방지한다.
위 실시예에서의 발견을 요약하면, LLO-항원 및 ActA-항원 융합은 (a) 종양-침윤성 항원-특이적 T 세포를 포함하는 종양-특이적 면역 반응을 유도하고; 정상 및 특히 침습성인 종양 둘 다의 종양 성장을 조절하고 종양 퇴행을 유도할 수 있으며; (b) 자기 항원에 대한 내성을 극복하고; 그리고 (c) 자발적 종양 성장을 방해한다. 이들 발견은, 다양한 상이한 항원, PEST-유사 서열, 및 종양 유형에서 이들의 성공적인 성취에 의해 입증되는 바와 같이, 다수의 항원, PEST-유사 서열, 및 종양 유형으로 일반화 가능하다.
실시예 6: LM-LLO-E7 백신은 안전하고 자궁경부암 환자에서 임상적 지표를 개선한다
재료 및 실험 방법
포함 기준. 임상에서 모든 환자는 “후기의 진행성 또는 재발성 자궁경부암”으로 진단받았고 진입 시점에서 평가는 모두 IVB 질환을 갖는 단계로 나타났다. 모든 환자는 칸디딘, 유행성 이하선염, 파상풍, 또는 투베르쿨린 정제 단백질 유도체(Tuberculin Purified Protein Derivative, PPD)로부터 선택되는 3 개 기억 항원을 포함하는 아너지 패널에 대한 양성 면역 반응을 나타내었고; 임신중 또는 HIV 양성이 아니었고, 4 주 이내에 시험용 약물도 복용하지 않았고, 스테로이드를 투여받지 않았다.
프로토콜: 환자에게는 3-주 간격으로 2 회의 백신접종이 입원환자에 대한 250 ml의 정상 식염수로 30-분 정맥내(IV) 주입으로서 투여되었다. 5 일 후, 환자는 단일 코스의 IV 암피실린을 투여받았고 추가로 10 일의 경구 암피실린을 받아 퇴원하였다. 카르노프스키 수행 지수(Karnofsky Performance Index)는 식욕, 일과 수행 능력, 편안한 수면 등과 같은 전반적 활력 및 삶의 질의 척도로서, 전반적인 웰빙(well-being)을 결정하기 위해 사용되었다. 또한, 다음의 안전성 및 일반적 웰빙의 지표가 결정되었다: 알칼리 포스파타제; 직접 빌리루빈 및 총 빌리루빈 둘 다; 감마 글루타밀 트랜스펩티다제(ggt); 콜레스테롤; 수축기, 이완기, 및 심박수; 질환 진행-카르노프스키 유사-삶의 질 지표를 평가하기 위한 이스턴 공동 종양학 그룹의 기준(Eastern Collaborative Oncology Group’s (ECOG)’s criteria); 헤마토크리트; 헤모글로빈; 혈소판 수준; 림프구 수준; AST(아스파테이트 아미노트랜스퍼라제); ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제); 및 LDH(락테이트 데하이드로게나제). 환자들은 두 번째 투약 다음 3 주 및 3 개월에 관찰되었고, 이 시점에서 대상의 고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST) 점수를 결정하고, 종양 크기를 결정하기 위한 스캔을 수행하고, 임상의 종점에서 면역학적 분석을 위한 혈액 샘플을 수집하였는데, 여기에는 IFN-γ, IL-4, CD4+ 및 CD8+ 세포 집단의 평가가 포함된다.
리스테리아 균주: LM-LLO-E7의 생성은 실시예 1에 기술된다.
결과
임상 시험에 앞서, LM-LLO-E7의 정맥내(i.v.) 대 i.p. 투여의 항-종양 효능을 결정하기 위해 전임상 실험이 수행되었다. 1 x 104 TC-1 세포를 포함하는 종양이 피하로 확립되었다. 7 및 14 일째에, 마우스를 108 LM-LLO-E7 i.p. 또는 LM-LLO-E7 i.v.로 108, 107, 106, 또는 105 용량으로 면역화하였다. 35 일째에, 108 LM-LLO-E7를 어느 한 경로로, 또는 107 LM-LLO-E7 i.v를 받은 마우스의 5/8, 및 106 LM-LLO-E7 i.v를 받은 마우스의 4/8이 치유되었다. 대조적으로, 107 미만의 용량 또는 일부 경우 i.p. 투여된 108 LM-LLO-E7에서조차 종양 성장을 제어하는 데 효과가 없었다. 따라서, LM-LLO-E7의 i.v. 투여는 i.p. 투여보다 더 효과적이다.
임상 시험
I/II 상 임상 시험이 후기의 진행성, 또는 재발성 자궁경부암 환자에서 LM-LLO-E7 백신의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 수행되었다. 5 인의 환자를 각각 집단 1-2에 할당하고, 1 x 109 또는 3.3 x 109 CFU를 각각 처치하였다. 추가로 5 인의 환자를 각각 집단 3-4에 할당하고, 1 x 1010 또는 3.31 x 1010 CFU를 각각 처치할 것이다.
안전성 데이터
제1 집단
제1 집단의 모든 환자는 주입 개시 후 1-2 시간 이내에 경도-내지-중등도 발열 및 오한의 개시를 보고하였다. 일부 환자는 오심이 있거나 없는 구토를 보였다. 1 건의 예외와 함께(아래 기술됨), 단일 용량의 파라세타몰과 같은 비-스테로이드성 약제가 이들 증상을 해결하는 데 충분하였다. 보통의 일시적 심장혈관 작용이, 발열과 일치하고 시간 경로를 공유하여, 관찰되었다 다른 유해 작용은 보고되지 않았다.
이러한 자궁경부암의 말기에서, 1 년 생존은 전형적으로 환자의 10-15%이고 어떠한 종양 요법도 효과적이지 않았다. 사실, 환자 2는 매우 침습성인 질환을 가진 젊은 환자로 임상 종료 후 바로 사망하였다.
정량적 혈액 배양물은 투여-후 2, 3, 및 5 일째에 평가하였다. 이 집단에서 5 인의 평가 가능한 환자 중, 4 인은 임의의 시기에 혈청 리스테리아를 나타내지 않았고 1 인은 2 일 째 매우 작은 양(35 cfu) 의 순환하는 리스테리아를 가졌고, 3 또는 5 일째에는 검출 가능한 리스테리아가 없었다.
환자 5는 초기 백신접종에 대하여 투여 후 48 시간에 걸쳐 경도의 발열로 반응하였고 항염증제로 치료되었다. 1 경우에, 발열은 중등도로 심해졌고(38.4 ℃를 넘은 적은 없음), 이후 그녀는 암피실린 치료를 받았으며, 이는 발열을 해결하였다. 항생제 투여 중에 그녀는 경도의 담마진을 경험하였고, 이는 항생제 투여 후 종결되었다. 혈액 배양물은 모두 멸균하고, 심장혈관 데이터는 다른 환자에게서 관찰된 범위 이내였고, 혈청 화학값은 정상으로, 이 환자는 리스테리아 질환이 없었음을 보여준다. 추가로, 아너지 패널은 1/3 기억 항원에 대하여 왕성한 반응을 나타내어, 기능적 면역의 존재를 나타낸다(다른 환자와 유사한). 환자 5는 이어서 부스트를 받은 후 다른 모든 환자와 유사한 반응을 입증하였다.
제2 집단 및 전체 안전성 관찰
두 집단에서, 간 기능 검사에 경미하고 일시적인 변화가 주입 이후 관찰되었다. 이들 변화는 임상을 모니터링하는 담당의에 의해 임상적 의미가 없는 것으로 결정되었고, 전신 순환으로부터 간 및 비장으로 신속하게 제거되는 박테리아의 단-수명 감염으로 예상되었다. 일반적으로, 위의 방법 항목에서 기술된 모든 안전성 지표는 순 변화가 없거나 거의 없음을 나타내어, 우수한 안전성 프로파일을 보여준다. 이 집단에서 부작용 프로파일은 처음의 집단에서 보여지는 것과 사실상 동일하였고 의원성 감염 유도의 결과로 일어나는 사이토카인 및 유사한 물질의 결과와 관련되는 용량 비의존성 일련의 증상으로 보였다. 혈청 리스테리아는 임의의 시기에 관찰되지 않았고 용량 제한 독성은 어느 집단에서도 관찰되지 않았다.
효능-제1 집단
다음 효능의 지표가 임상을 끝낸 제1 집단의 3 인의 환자에게서 관찰되었다: (도 9)
환자 1은 각각 20 mm의 종양 2 개를 갖고 임상에 들어왔는데, 임상 과정에 걸쳐 18 및 14 mm로 줄어들어, 백신의 치료 효과를 나타낸다. 또한, 환자 1은 카르노프스키 수행 지수 70으로 임상에 들어왔는데, 이는 투약 후 90까지 올라갔다. 안전성 검토 패널 미팅에서, Department of Oncology, Institute for Oncology and Radiology, Belgrade, Serbia의 의장인 Sinisa Radulovic은 임상을 수행하는 단체의 대표에 이 결과를 제시하였다; 단체의 컨설턴트로서 일하는 독립 종양학자인 Michael Kurman; Merck의 III 상 Gardasil 임상 및 Glaxo SmithKline의 Cervarix 임상을 수행한 Emory University의 학술 부인과 종양학자인 Kevin Ault; 및 NCI에서의 부인과 종양학 그룹의 설립자이고 University of Mississippi의 부인과 종양학 교수인 Tate Thigpen. Dr. Radulovic의 견해에서, 환자 1은 백신 처치로부터 임상적 혜택을 보여주었다.
사망하기 전, 환자 2는 1/2 종양 축소와 함께 복합 반응을 보여주었다.
환자 3은, 936 x 109/ml까지의 혈소판 수치의 증가를 포함하여, 부신생물 질환에 등록하였다(전반적인 약화 상태의 환자가 암에 버금가는 다른 후유증을 갖는 암의 부수현상). 수치는 첫 번째 투약 이후 대략 정상 수준인 405 x 109/ml까지 저하되었다.
환자 4는 각각 20 mm의 종양 2 개를 갖고 임상에 들어왔는데, 임상 과정에 걸쳐 18 및 14 mm로 줄어들어, 백신의 치료 효과를 나타낸다. 환자 4는 1.6 Kg의 체중 증가 및 첫 번째 및 두 번째 용량 사이에 대략 10%의 헤모글로빈 수치의 증가를 보였다.
효능-제2 집단 및 일반적 관찰
최저 용량 집단에서, 2 인의 환자가 종양의 축소를 보여주었다. 이 효과의 시기는 면역 반응의 발생에 시간순으로 뒤따른다는 점에서 면역학적 반응에서 관찰된 것과 일치하였다. 종양 부담에서 어느 정도까지 평가되었던 제2 집단에서 2 인의 환자 중 1 인이 백신접종-후 시점에서 극적인 종양 부하 감소를 보여주었다. 임상 개시에서, 이 환자는 13, 13, 및 14 mm의 3 개 종양을 가졌다. 2 용량의 백신 이후, 2 개의 종양은 9.4 및 12 mm까지 수축되었고, 세 번째는 더이상 검출 가능하지 않았다.
2 집단에서 종양 부하는 도 13b로 나타낸다. 요약하면, LM-LLO-E7의 비교적 낮은 용량조차, 프라이밍 주사 및 단일 부스트를 포함하는 치료 요법으로 투여시, 데이터를 수집한 6 인의 환자에서 3 개의 객관적 반응을 달성하였다.
논의
이러한 자궁경부암의 말기에서, 1 년 생존은 전형적으로 환자의 10-15%이고 어떠한 종양 요법도 효과적이지 않았다. 어떠한 치료도 단계 IVB 자궁경부암을 역전시키는 데 효과적으로 보이지 않았다. 이 단계의 자궁경부암 치료의 어려움에도 불구하고, 항-종양 효과가 2/6 환자에서 관찰되었다. 또한, 위에 기술된 바와 같이 임상을 끝낸 환자에서 다른 효능의 지표가 관찰되었다.
따라서, LM-LLO-E7은 인간 대상에 안전하고, 비교적 낮은 용량으로 투여시조차 자궁경부암 환자의 임상적 지표를 개선한다. 부스터 백신접종의 용량 및 회수를 증가시킬 때; 및/또는 항생제가 더 적은 용량으로 또는 주입 후 더 늦은 시점에 투여될 때, 추가의 긍정적 결과가 관찰될 것으로 보인다. 전-임상 연구에서는 한 자릿수의 용량 증가가 반응 비율에서 극적인 변화를 야기할 수 있음을 보여준다(예를 들어, 0% 반응 비율로부터 50-100% 완전 차도 비율로 변화. 추가의 부스터 용량은 또한 얻어지는 면역 반응을 추가로 향상시킬 것으로 보인다. 더욱이, 면역 시스템이 암을 계속 공격하므로 관찰된 치료적 면역 반응의 긍정적 효과는 추가 시간의 경과에도 계속될 것으로 보인다.
실시예 7: 약독화 리스테리아 균주-LmddΔ actA 의 제작 및 Lmdd 와 Lmdda 균주에서 프레임 내 인간 klk3 유전자의 hly 유전자로의 삽입.
재료 및 방법
재조합 Lm은 tLLO에 융합된 PSA를 분비하도록 개발되었는데(Lm-LLO-PSA), 이는 종양의 퇴행과 관련된 강력한 PSA-특이적 면역 반응을 전립선암에 대한 마우스 모델에서 유발하고, 여기에서 tLLO-PSA의 발현은 pGG55를 기반으로 하는 플라스미드로부터 유도되어(표 2) 벡터에 항생제 저항성을 부여한다. 본 발명자들은 최근 항생제 저항성 마커가 없는 pADV142 플라스미드 기반의 PSA 백신용 신규 균주를 개발하였으며, LmddA-142로 칭하였다(표 3). 이 신규 균주는 Lm-LLO-PSA보다 10 배 더 약독화되어 있다. 게다가, LmddA-142는 Lm-LLO-PSA보다 약간 더 면역원성이 있고 PSA 발현 종양의 퇴행에 있어 유의미하게 더 효과적이다.
플라스미드 및 균주
플라스미드 특징
pGG55 그람(-) 및 그람(+) cm 저항성, LLO-E7 발현 카세트 및 Lm prfA 유전자 카피를 갖는 pAM401/pGB354 셔틀 플라스미드
pTV3 cm 유전자 결실 및 Lm dal 유전자 삽입에 의해 pGG55로부터 유래됨
pADV119 prfA 유전자 결실에 의해 pTV3으로부터 유래됨
pADV134 Lm dal 유전자를 Bacillus dal 유전자로 교체함으로써 pADV119로부터 유래됨
pADV142 HPV16 e7을 klk3으로 교체함으로써 pADV134로부터 유래됨
pADV168 HPV16 e7을 hmw-maa 2160-2258로 교체함으로써 pADV134로부터 유래됨
균주 유전자형
10403S 야생형 리스테리아 모노사이토게네스:: str
XFL-7 10403S prfA (-)
Lmdd 10403S dal (-) dat (-)
LmddA 10403S dal (-) dat (-) actA (-)
LmddA-134 10403S dal (-) dat (-) actA (-) pADV134
LmddA-142 10403S dal (-) dat (-) actA (-) pADV142
Lmdd-143 염색체에서 hly 유전자에 융합된 klk3를 갖는 10403S dal (-) dat (-)
LmddA-143 염색체에서 hly 유전자에 융합된 klk3를 갖는 10403S dal (-) dat (-) actA (-)
LmddA-168 10403S dal (-) dat (-) actA (-) pADV168
Lmdd-143/134 Lmdd-143 pADV134
LmddA-143/134 LmddA-143 pADV134
Lmdd-143/168 Lmdd-143 pADV168
LmddA-143/168 LmddA-143 pADV168
플라스미드 pAdv142의 서열(6523 bp)은 다음과 같다:
cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgttatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaaccccTAAcccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaa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(서열번호 41). 이 플라스미드는 E. coli 균주로부터 Genewiz 시설에서 2-20-08에 서열결정되었다.
균주 Lm dal dat (Lmdd)는 독성 인자, ActA의 비가역적 결실에 의해 약독화되었다. Lmdal/dat (Lmdd) 백그라운드에서 actA의 프레임내 결실은 하류(downstream) 유전자의 발현에 대한 임의의 극성 효과를 피하기 위해 구성되었다. Lm dal dat ΔactA은 ActA의 591 아미노산의 결실로 N-말단에 처음 19 개 아미노산 및 C-말단에 28 개 아미노산 잔기를 포함한다.
actA 결실 돌연변이체는 actA의 상류 (657 bp-올리고의 Adv 271/272) 및 하류 (625 bp- 올리고의 Adv 273/274) 부분에 해당하는 염색체 영역을 증폭하고 PCR로 결합시켜 생산되었다. 이 증폭에 사용된 프라이머의 서열은 표 3에 표시되어 있다. actA의 상류 및 하류 DNA 영역을 pNEB193 내 EcoRI/PstI 제한 부위에서 클로닝하고, 이 플라스미드로부터 EcoRI/PstI를 온도-감응성 플라스미드 pKSV7에서 추가로 클로닝하여 ΔactA/pKSV7(pAdv120)를 얻었다.
actA 의 상류 및 하류 DNA 서열의 증폭에 사용된 프라이머의 서열
프라이머 서열 서열번호
Adv271-actAF1 cg GAATTCGGATCCgcgccaaatcattggttgattg 42
Adv272-actAR1 gcgaGTCGACgtcggggttaatcgtaatgcaattggc 43
Adv273-actAF2 gcgaGTCGACccatacgacgttaattcttgcaatg 44
Adv274-actAR2 gataCTGCAGGGATCCttcccttctcggtaatcagtcac 45
이의 염색체 위치로부터 유전자의 결실을 도 10a 및 10b에 프라이머 3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc, 서열번호 46) 및 프라이머 4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg; 서열번호 47)로 도시되어 있는, actA 결실 영역에 외부적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 확인하였다. PCR 분석은 Lmdd 및 Lmdd ΔactA로부터 분리된 염색체 DNA에서 수행되었다. Lmdd 염색체 DNA에서 두 개의 상이한 세트의 프라이머 쌍 1/2 및 3/4로 증폭한 이후 DNA 단편의 크기는 3.0 Kb 및 3.4 Kb가 될 것으로 예상되었다. 반면, LmddDactA에 대하여 프라이머 쌍 1/2 및 3/4를 사용한 PCR의 예상된 크기는 1.2 Kb 및 1.6 Kb였다. 따라서, 도 10a 및 10b에서 PCR 분석에 의해 actA의 1.8 kb 영역이 LmddDactA 균주에서 결실되었음이 확인된다. DNA 서열결정은 균주에서 actA 포함 영역, LmddΔactA의 결실을 확인하기 위해 PCR 산물에서 또한 수행되었다.
실시예 8: Lm 벡터에 의한 항원 전달용 항생제-비의존성 에피솜 발현 시스템의 제작.
Lm 벡터(pAdv142)에 의한 항원 전달용 항생제-비의존성 에피솜 발현 시스템은 차세대 무항생제 플라스미드 pTV3이다(Verch 등, Infect Immun, 2004. 72(11):6418-25, 본원에 참조로 인용). 리스테리아 균주 Lmdd는 염색체에 prfA 유전자의 카피를 포함하기 때문에, 독성 유전자 전사 활성인자의 유전자, prfA가 pTV3로부터 결실되었다. 또한, NheI/PacI 제한 부위에서 p60-리스테리아 dal의 카세트를 p60-바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) dal로 교체하여, 플라스미드 pAdv134를 얻었다(도 11a). 리스테리아와 바실러스(Bacillus) dal 유전자의 유사성은 약 30%로, Lmdd 염색체에서 dal 유전자의 잔여 단편과 플라스미드 사이의 재조합 가능성은 사실상 제거된다. 플라스미드 pAdv134는 항원 발현 카세트 tLLO-E7를 포함하였다. LmddA 균주는 pADV134 플라스미드로 형질전환되고 선택된 클론으로부터 LLO-E7 단백질의 발현은 웨스턴 블로팅으로 확인되었다(도 11b). 10403S 야생형 균주 유래의 Lmdd 시스템은 Lmdd 스트렙토마이신 저항성을 제외하고는 항생제 저항성 마커가 결여된다.
또한, pAdv134을 XhoI/XmaI로 제한하여 인간 PSA, klk3을 클로닝하여, 플라스미드 pAdv142를 수득하였다. 새로운 플라스미드 pAdv142(도 11c, 표 2)는 리스테리아 p60 프로모터의 조절 하의 바실러스 dal (B-Dal)을 포함한다. 셔틀 플라스미드 pAdv142는 외인성 D-알라닌의 부재 중 리스테리아 모노사이토게네스 균주 Lmdd뿐 아니라 대장균(E. coli) ala drx MB2159의 성장을 보완하였다. 플라스미드 pAdv142에서 항원 발현 카세트는 hly 프로모터 및 LLO-PSA 융합 단백질로 이루어진다(도 11c).
플라스미드 pAdv142는 리스테리아 백그라운드 균주, LmddactA 균주로 형질전환되어, Lm-ddA-LLO-PSA를 형성하였다. 균주 Lm-ddA-LLO-PSA에 의한 LLO-PSA 융합 단백질의 발현 및 분비는 항-LLO 및 항-PSA 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었다(도 11d). 2 회의 생체내 계대 후, 균주 Lm-ddA-LLO-PSA에 의한 LLO-PSA 융합 단백질은 안정적으로 발현 및 분비되었다.
실시예 9: 균주 LmddA-LLO-PSA의 시험관내 및 생체내 안정성
8 일간 선택 압력(selective pressure)의 존재 또는 부재 중 LmddA-LLO-PSA 리스테리아 균주를 배양하여 플라스미드의 시험관내 안정성을 조사하였다. 균주 LmddA-LLO-PSA의 선택 압력은 D-알라닌이다. 따라서, 균주 LmddA-LLO-PSA는 뇌-심장 침출액(BHI) 및 BHI+ 100 μg/ml D-알라닌에서 계대배양되었다. 선택적(BHI) 및 비-선택적(BHI+D-알라닌) 배지에 접종 후, 매일 CFU을 결정하였다. 비-선택적 배지(BHI+D-알라닌)에 접종 후, 플라스미드의 손실은 더 높은 CFU를 야기할 것으로 예상되었다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 선택적 및 비-선택적 배지에서 CFU 수에는 차이가 없었다. 이는 실험 종료시 플라스미드 pAdv142가 적어도 50 세대 동안 안정적일 것을 제시한다.
생체내 플라스미드 유지 보수는 C57BL/6 마우스에 5 x 107 CFU LmddA-LLO-PSA를 정맥내 주사하여 결정되었다. 24 및 48 시간에 생존 박테리아를 PBS 중에 균질화된 비장으로부터 분리하였다. 각 샘플의 CFU를 BHI 플레이트 및 BHI + 100 mg/ml D-알라닌에서 각 시점에 결정하였다. 선택적 및 비-선택적 배지에 비장세포를 접종한 후 24 시간에 콜로니를 회수하였다. 이 균주는 매우 약독화되어, 박테리아 로드(load)가 24 시간만에 생체내에서 제거된다. 선택적 및 비-선택적 플레이트에서 CFU의 유의미한 차이는 검출되지 않았으며, 이는 모든 분리된 박테리아에서 재조합 플라스미드의 안정된 존재를 나타낸다(도 12b).
실시예 10: 생체내 계대, 균주 LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)의 독성 및 제거율
LmddA-142는 에피솜 형태로 발현된 tLLO-PSA 융합 단백질을 분비하는 재조합 리스테리아 균주이다. 안전한 투여량을 결정하기 위해, 마우스를 다양한 용량의 LmddA-LLO-PSA로 면역화하고 독성 효과를 결정하였다. LmddA-LLO-PSA는 최소 독성 효과를 야기하였다(데이터 미표시). 이 결과는 108 CFU 용량의 LmddA-LLO-PSA가 마우스에 잘 용인되는 것을 제시하였다. 독성 연구는 균주 LmddA-LLO-PSA가 크게 약독화되었음을 나타낸다.
안전한 투여량 108 CFU를 C57BL/6 마우스에 복강내 투여 후, LmddA-LLO-PSA의 생체내 제거율을 결정하였다. 2 일째 이후 LmddA-LLO-PSA로 면역화된 마우스의 간 및 비장 내에서는 검출 가능한 콜로니가 없었다. 이 균주는 크게 약독화되기 때문에, 48 시간에 생체내에서 완전히 제거되었다(도 13a).
LmddA-LLO-PSA의 약독화가 균주 LmddA-LLO-PSA의 매크로파지 감염 및 세포내 성장 능력을 약화시키는지 결정하기 위해, 세포 감염 분석을 실시하였다. J774A.1와 같은 마우스 매크로파지-유사 세포주를 시험관 내 리스테리아 구축물로 감염시켰고 세포내 성장을 정량하였다. 양성 대조 균주인 야생형 리스테리아 균주 10403S는 세포 내에서 성장하고, 음성 대조 XFL7, prfA 돌연변이체는 파고리소좀을 탈출할 수 없어서 J774 세포 내에서 성장하지 못한다. LmddA-LLO-PSA의 세포질내 성장은 이 균주의 세포에서 세포로 확산되는 능력의 손실로 인해 10403S보다 더 느리다(도 13b). 결과는 LmddA-LLO-PSA가 매크로파지 감염 및 세포질내 성장 능력을 갖는 것을 보여준다.
실시예 11: C57BL/6 마우스에서 균주-LmddA-LLO-PSA의 면역원성
C57BL/6 마우스에서 구축물 LmddA-LLO-PSA에 의해 유발된 PSA-특이적 면역 반응을 PSA 4량체 염색을 사용하여 결정하였다. 마우스를 1 주 간격으로 2 회 LmddA-LLO-PSA로 면역화하고 부스트 이후 6 일째에 비장세포를 PSA 4량체로 염색하였다. PSA-특이적 4량체로 비장세포를 염색한 결과 LmddA-LLO-PSA가 23%의 PSA 4량체+CD8+CD62Llow 세포를 유발하였음을 보여주었다(도 14a). 5 시간 동안 PSA 펩티드로 자극 후 IFN-γ를 분비하는 PSA-특이적 T 세포의 기능적 능력을 세포내 사이토카인 염색을 사용하여 검사하였다. 미처리 마우스와 비교하여 LmddA-LLO-PSA 군에서는 PSA 펩티드로 자극된 CD8+CD62LlowIFN-γ 분비 세포의 백분율이 200배 증가하였으며(도 14b), 이는 LmddA-LLO-PSA 균주가 매우 면역원성이며 비장에서 PSA에 대해 높은 수준의 기능적으로 활성화된 PSA CD8+ T 세포 반응을 갖추고 있음을 나타낸다.
마우스를 LmddA-LLO-PSA로 면역화한 후 PSA에 대하여 생성된 세포독성 T 세포의 기능적 활성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 시험관내 분석에서 H-2Db 펩티드로 펄스 자극된 EL4 세포를 용해하는 PSA-특이적 CTL의 능력을 검정하였다. 세포 용해를 측정하기 위해 FACS-기반의 카스파제 분석(도 14c) 및 유로퓸 (Europium) 방출(도 14d)을 사용하였다. LmddA-LLO-PSA로 면역화된 마우스의 비장세포는 표적 항원으로서 PSA 펩티드를 제시하는 세포에 대해 높은 세포 용해 활성을 갖는 CTL을 포함하였다.
항원으로 24 시간 자극 후 IFN-g를 분비하는 효과기 T 세포의 기능적 능력을 결정하기 위해 엘라이스팟(Elispot)을 시행하였다. ELISpot을 사용하여, 미처리 마우스의 비장세포와 비교시 특이적 펩티드로 자극된 LmddA-LLO-PSA로 면역화된 마우스로부터의 비장세포에서 IFN-γ에 대한 스팟의 수에서 20-배 증가가 관찰되었다(도 14e).
실시예 12: LmddA -142 균주로의 면역화는 PSA를 발현하는 종양의 퇴행 및 PSA-특이적 CTL에 의한 종양의 침윤을 유도한다.
구축물 LmddA-142 (LmddA-LLO-PSA)의 치료적 효능은 PSA를 발현하도록 조작된 전립선 선암 세포주를 사용하여 결정하였다(Tramp-C1-PSA (TPSA); Shahabi 등, 2008). 마우스에 2 x 106 TPSA 세포를 피하 이식하였다. 종양이 4-6 mm의 감지할 수 있는 크기가 되었을 때, 종양 접종 후 6 일째에 마우스를 108 CFU LmddA-142 및 107 CFU Lm-LLO-PSA(양성 대조군)로 1 주일 간격으로 3 회 면역화하거나, 미처리하였다. 상기 미처리 마우스에서는 서서히 종양이 발생하였다(도 15a). LmddA-142로 면역화된 마우스는 35 일째까지는 모두 종양이 없었고 8 마리 중 3 마리에서 점차 종양이 발생하였고, 이들은 미처리 마우스에 비해 훨씬 느린 속도로 성장하였다(도 15b). 8 마리 마우스 중 5 마리는 70 일째까지 종양 없이 유지되었다. 예상된 바와 같이, Lm-LLO-PSA-백신접종된 마우스에서는 미처리 대조군보다 종양이 적게 나타나며 대조군보다 종양이 더 느리게 발생하였다(도 15c). 따라서, 구축물 LmddA-LLO-PSA는 TPSA 세포주에 의해 확립된 종양의 60%를 퇴행시키고 다른 마우스에서는 종양의 성장을 지연시킬 수 있었다. 68 일째에 종양이 없는 치유된 마우스를 TPSA 종양으로 재공격하였다.
LmddA-142로의 마우스의 면역화는 성장을 조절하고, 미처리 군에서는 전혀 없는 것과 비교하여(도 15a), 60% 보다 많은 실험 동물에서 PSA를 발현하도록 조작된 7-일 확립된 Tramp-C1 종양의 퇴행을 유도할 수 있다(도 15b). LmddA-142는 고도로 약독화된 벡터(LmddA) 및 플라스미드 pADV142를 사용하여 제작하였다(표 2).
또한, LmddA-LLO-PSA 구축물에 의해 생성된 PSA-특이적 CD8 림프구의 종양 침윤 능력을 조사하였다. 마우스에 종양 및 마트리겔의 혼합물을 피하 이식한 후, 7 일 간격으로 미처리 또는 대조(Lm-LLO-E7) 리스테리아, 또는 LmddA-LLO-PSA로 2 회 면역화하였다. 21 일째에 종양을 절제하고, 종양 내로 침윤하는 CD8+CD62Llow PSA4량체+ 및 CD4+ CD25+FoxP3+ 조절 T 세포의 집단(population)을 대상으로 분석하였다.
미처리 및 Lm-LLO-E7 대조 면역화된 마우스 둘 다에 존재하는, PSA에 특이적인 매우 적은 수의 CD8+CD62Llow PSA4량체+ 종양 침윤 림프구(TIL)가 관찰되었다. 그러나, LmddA-LLO-PSA로 면역화된 마우스에서 PSA-특이적 CD8+CD62Llow PSA4량체+ TIL의 백분율에서 10-30-배 증가가 있었다(도 7a). 흥미롭게도, 비장에서 CD8+CD62Llow PSA4량체+ 세포의 집단은 종양에서보다 7.5 배 더 낮았다(도 16a).
또한, 미처리된 마우스 및 리스테리아 면역화된 마우스의 종양에서 CD4+/CD25+/Foxp3+ T 조절 세포(reg)의 존재를 결정하였다. 흥미롭게도, 리스테리아로의 면역화는 종양에서 CD4+ CD25+FoxP3+ T-reg의 수에 상당한 감소를 야기하지만, 비장에서는 그렇지 않았다(도 16b). 그러나, 구축물 LmddA-LLO-PSA는 미처리 및 Lm-LLO-E7로 면역화된 군과 비교할 때 종양에서 CD4+ CD25+FoxP3+ T-reg 의 빈도 감소에 더 강한 영향을 가졌다(도 16b).
그러므로, LmddA-142 백신은 종양 부위로 침윤할 수 있는 PSA-특이적 CD8+ T 세포를 유도할 수 있다(도 16a). 흥미롭게도, LmddA-142로의 면역화는 종양에서 조절 T 세포수의 감소와 관련되어 있으며(도 16b), 아마도 효과적인 항-종양 CTL 활성을 위해 더욱 유리한 환경을 조성하였다.
실시예 13: Lmdd -143 및 LmddA -143은 PSA 융합에도 불구하고 기능적 LLO를 분비한다.
Lmdd-143 및 LmddA-143은 전장 인간 klk3 유전자를 포함하는데, 이는 염색체에서 hly 유전자와 함께 하류 그리고 프레임 내 상동성 재조합에 의해 삽입되는 PSA 단백질을 인코딩한다. 이들 구축물은 hly-klk3-mpl 재조합 카세트를 전달하는, 온도-감응성 레플리콘(replicon)을 갖는 pKSV7 플라스미드(Smith and Youngman, Biochimie. 1992; 74 (7-8) p705-711)를 사용하여 상동성 재조합으로 만들어졌다. 두 번째 재조합 후 플라스미드 절단 때문에, 통합 선택을 위해 사용된 항생제 저항성 마커가 손실된다. 또한, actA 유전자가 LmddA-143 균주에서 결실된다(도 17a). 염색체로 hly와 함께 프레임 내 klk3의 삽입은 두 구축물에서 PCR(도 17b) 및 서열분석(데이터 미표시)에 의해 확인되었다.
이들 염색체 구축물의 중요한 일 측면은 LLO-PSA 생산이 LLO의 기능을 완전히 파괴하지는 않을 것이라는 점으로, 이는 파고좀으로부터 리스테리아의 탈출, 세포질 침입 및 L. 모노사이토게네스에 의해 생성된 효율적인 면역성을 위해 요구된다. Lmdd-143 및 LmddA-143 배양 상등액에서 분비된 단백질의 웨스턴-블롯 분석으로 LLO-PSA 융합 단백질에 해당하는 -81 kDa 밴드 및 LLO의 예상 크기인 ~60 kDa 밴드를 확인하였으며(도 18a), 이는 염색체 내 융합 유전자에도 불구하고 LLO가 LLO-PSA 융합체로부터 절단되거나 여전히 L. 모노사이토게네스에 의한 단일 단백질로서 생산됨을 나타낸다. Lmdd-143 및 LmddA-143에 의해 분비되는 LLO는 야생형 L. 모노사이토게네스 10403S과 비교해서 50%의 용혈 활성을 유지하였다(도 18b). 이들 결과와 일치하여, Lmdd-143 및 LmddA-143 둘 다 마크로파아지-유사 J774 세포주에서 세포내 복제할 수 있었다(도 18c).
실시예 14: Lmdd -143 및 LmddA -143 둘 다 PSA 항원에 대하여 세포-매개 면역 반응을 유발한다.
Lmdd-143 및 LmddA-143 둘 다 LLO에 융합된 PSA를 분비할 수 있음을 보여준 후, 이들 균주가 생체내 PSA-특이적 면역 반응을 유발할 수 있는지의 의문을 조사하였다. C57Bl/6 마우스는 미처리 상태로 두거나 Lmdd-143, LmddA-143 또는 LmddA-142로 2 회 면역화하였다. PSA-특이적 CD8+ T 세포 반응을 PSA65-74 펩티드에 의한 비장세포 자극 및 IFN-γ에 대한 세포내 염색에 의해 측정하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 염색체 및 플라스미드-기반의 벡터에 의해 유도된 면역 반응은 유사하다.
재료 및 방법(실시예 15-20)
올리고뉴클레오티드는 Invitrogen (칼스배드, 캘리포니아)에 의해 합성되었으며 DNA 서열결정은 Genewiz Inc (사우스 플래인필드, 뉴저지)에 의해 실시되었다. 유동 세포 계측 시약은 Becton Dickinson Biosciences (BD, 샌디에고, 캘리포니아)로부터 구매했다. 세포 배양 배지, 보충제 및 모든 다른 시약들은, 지시되지 않는 한 Sigma (St. Louise, MO)로부터 구했다. Her2/neu HLA-A2 펩티드는 EZbiolabs (Westfield, IN)에 의해 합성되었다. 완전 RPMI 1640 (C-RPMI) 배지는 2mM 글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 및 1mM 피루브산나트륨, 10% 소태아혈청, 페니실린/스트렙토마이신, Hepes (25mM)를 함유한다. 다클론성 항-LLO 항체는 이전에 기재된 바와 같으며 항-Her2/neu 항체는 Sigma로부터 구입되었다.
마우스 및 세포주
모든 동물 실험은 University of Pennsylvania 또는 Rutgers University에서 IACUC에 의한 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. FVB/N 마우스는 Jackson laboratories (바 하버, 메인)로부터 구입했다. 랫 Her2/neu 발암-단백질을 과발현한, FVB/N Her2/neu 형질전환 마우스는 펜실베니아 대학에서 동물 핵심 시설에서 보관 및 사육되었다. NT-2 종양 세포주는 높은 수준의 Her2/neu 단백질을 발현하며, 이러한 마우스에서 자생 유방 종양으로부터 유래되었으며 이전에 기재된 바와 같이 성장하였다. DHFR-G8 (3T3/neu) 세포는 ATCC로부터 수득되었으며 the ATCC 권고에 따라 성장시켰다. EMT6-Luc 세포주는 John Ohlfest 박사(미네소타 대학, 미네아폴리스)로부터의 너그러운 기증품이었으며 완전 C-RPMI 배지에서 배양하였다. 생물발광 작업은 University of Pennsylvania(필라델피아, 펜실베니아)의 Small Animal Imaging Facility (SAIF)에서 지도 하에 실시되었다.
리스테리아 구축물 및 항원 발현
Her2/neu-pGEM7Z는 University of Pennsylvania의 Mark Greene 박사에 의해 자연스럽게 제공되었으며 pGEM7Z 플라스미드 (Promega, 매디슨, 위스콘신)로 클로닝된 전체 길이의 인간 Her2/neu (hHer2) 유전자를 포함하였다. 이 플라스미드는 pfx DNA 중합효소(Invitrogen) 및 표 4에 기재된 올리고를 사용하여 PCR에 의해, hHer-2/neu의 3 개 세그먼트, 즉 EC1, EC2, 및 IC1을 증폭하기 위한 템플릿으로서 사용되었다.
인간 her-2-키메라의 클로닝을 위한 프라이머
DNA 서열 염기쌍 영역 아미노산 영역 또는 연결 지점
Her-2-키메라 (F) TGATCTCGAGACCCACCTGGACATGCTC(서열번호 48) 120-510 40-170
HerEC1-EC2F
(연결 지점)		 CTACCAGGACACGATTTTGTGGAAG-AATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGC (서열번호 49)

510/1077

170/359
HerEC1-EC2R
(연결 지점)		 GCAGCCAGCAAACTCCTGGATATT-CTTCCACAAAATCGTGTCCTGGTAG (서열번호 50)
HerEC2-ICIF
(연결 지점)
 CTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGG-CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGA(서열번호 51)

1554/2034

518/679
HerEC2-ICIR
(연결 지점)
 TCGTGTACTTCCGGATCTTCTGCTGCCCTCGGGC GCACAGCTGGTGGCAG (서열번호 76)
Her-2-키메라 (R) GTGGCCCGGGTCTAGATTAGTCTAAGAGGCAGCCATAGG(서열번호 52) 2034-2424 679-808
Her-2/neu 키메라 제조는 SOEing PCR 법 및 주형으로서 각각 분리된 hHer-2/neu 부분에 의한 직접 융합에 의해 제조되었다. 프라이머는 표 5에 나타나 있다.
DNA 서열
 염기쌍 영역 아미노산 영역
Her-2-EC1(F) CCGCCTCGAGGCCGCGAGCACCCAAGTG
(서열번호 53)		 58-979 20-326
Her-2-EC1(R) CGCGACTAGTTTAATCCTCTGCTGTCACCTC
(서열번호 54)
Her-2-EC2(F) CCGCCTCGAGTACCTTTCTACGGACGTG
(서열번호 55)		 907-1504 303-501
Her- 2- EC2(R) CGCGACTAGTTTACTCTGGCCGGTTGGCAG
(서열번호 56)
Her-2-Her-2-IC1(F) CCGCCTCGAGCAGCAGAAGATCCGGAAGTAC
(서열번호 57)		 2034-3243 679-1081
Her-2-IC1(R) CGCGACTAGTTTAAGCCCCTTCGGAGGGTG
(서열번호 58)
상이한 세그먼트 인간 Her2 영역의 증폭을 위한 프라이머의 서열
ChHer2 유전자는 XhoI 및 SpeI 제한 효소를 이용하여 pAdv138로부터 절단되었으며, 절단된, Lmdd 셔틀 벡터인 pAdv134에서 LLO의 비-용혈성 단편으로 인프렘 클로닝되었다. 삽입의 서열, LLO 및 hly 프로모터는 DNA 서열결정 분석에 의해 확인되었다. 이 플라스미드는 전기-컨피턴트 actA, dal, dat 돌연변이 리스테리아 모노사이토게네스 균주 내로 전기천공되었으며, LmddA 및 양성 클론은 스트렙토마이신(250 μg/ml)을 함유하는 뇌 심장 침출액(BHI) 아가 플레이트 상에서 선별되었다. 일부 실험에서 hHer2/neu (Lm-hHer2) 단편을 발현하는 유사한 리스테리아 균주가 비교 목적을 위해 사용되었다. 모든 연구에서, 무관한 리스테리아 구축물(Lm-대조군)가 면역계에서 리스테리아의 항원 독립적 효과를 설명하기 위해 포함되었다. Lm-대조군은 ADXS31-164(LmddA-ChHer2)와 같은 동일한 리스테리아 플랫폼을 기반으로 하지만, HPV16-E7 또는 NY-ESO-1과 같은 상이한 항원을 발현하였다. 리스테리아로부터의 융합 단백질의 발현 및 분비가 테스트되었다. 각 구축물은 생체내에서 패시지화되었다.
세포독성 분석
3마리 내지 5마리 FVB/N 마우스의 그룹들을 1 x 108 콜로니 형성 유닛(CFU)의 Lm-LLO-ChHer-2, ADXS31-164, Lm-hHer-2 ICI 또는 Lm-대조군(무관한 항원을 발현함)으로 1주 간격으로 3회 면역화시키거나 미처리로 남겨뒀다. NT-2 세포를 생체내에서 성장시켰으며 트립신으로 탈착시키고 37℃에서 45분간 미토신 C (무혈청 C-RPMI 배지 중 250 μg/ml)으로 처리하였다. 5회 세척 후, 이들을 면역화된 동물 또는 처리되지 않은 동물로부터 수확된 비장과 1:5 (자극제: 응답자)의 비율로 37℃ 및 5% CO2에서 5일 동안 공동-인큐베이션 하였다. 표준 세포독성 분석을 이전에 기재된 방법에 따라 표적으로서 유로퓸 표지된 3T3/neu (DHFR-G8) 세포를 사용하여 수행하였다. 사멸된 표적 T 세포로부터의 방출된 유로퓸을 590 nm에서 분광광도계(Perkin Elmer, Victor2)를 사용하여 4시간 인큐베이션 후 측정하였다. 특이 용해 백분율을 (실험 그룹에서의 용해-자발적 용해)/(최대 용해-자발적 용해)로서 규정하였다.
면역화된 마우스로부터의 비장세포에 의한 인터페론-γ 분비
3마리 내지 5마리 FVB/N 또는 HLA-A2 트랜스제닉 마우스의 그룹들을 1 x 108 CFU의 ADXS31-164, 음성 리스테리아 대조군(무관한 항원을 발현함)로 1주 간격으로 3회 면역화시키거나 미처리로 방치하였다. FVB/N 마우스로부터의 비장세포를 마지막 면역화 후 1주일째에 분리하고 C-RPMI 배지 내에서 미토신 C 처리된 NT-2 세포의 존재 하에 5 x 106 세포/웰로 24 웰 플레이트에서 공동-배양하였다. HLA-A2 형질전환 마우스로부터의 비장세포는 1μM의 HLA-A2 특이적 펩티드 또는 1 μg/ml의 재조합 His-태그된 ChHer-2 단백질의 존재 하에 배양되었으며, E. coli에서 생성되었고 친화도 크로마토그래피 시스템에 기반하여 니켈에 의해 정제되었다. 상등액으로부터의 시료를 24시간 또는 72시간 후에 수득하고 제조업자의 권고에 따라 마우스 IFN-γ 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하여 인터페론-γ (IFN-γ)의 존재에 대해 테스트하였다.
Her2 트랜스제닉 동물에서의 종양 연구
6 주령 FVB/N 랫 Her2/neu 형질전환 마우스 (9 내지 14/그룹)가 Lm-LLO-ChHer2, ADXS31-164의 5 x 108 CFU 또는 Lm-대조군으로 6 회 면역화되었다. 이들을 자발적 유방 종양의 출현에 대해 주 2회 관찰하였으며, 이는 52주까지 전자 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 탈출된 종양은 이들이 평균 직경에서 1cm2 크기에 도달할 때 제거되어 -20℃에서 RNAlater 중에 보관되었다. 이러한 종양의 탈출에서 Her2/neu 단백질의 돌연변이의 영향을 확인하기 위해, 유전자 DNA가 유전자 DNA 단리 키트를 이용하여 추출되었고, 서열결정되었다.
비장 및 종양에서 조절 T 세포에서의 ADXS31-164의 효과
마우스에게 1 x 106 NT-2세포가 피하(s.c.) 이식되었다. 7, 14 및 21일에, 이들을 1 x 108 CFU의 ADXS31-164, LmddA-대조군으로 면역화시키거나 미처리로 두었다. 종양 및 비장을 28일째에 추출하고 CD3+/CD4+/FoxP3+ Treg의 존재에 대해 FACS 분석으로 테스트하였다. 간략하게, 비장세포를 C-RPMI 배지 중 2개 유리 슬라이드 사이에서 비장을 균질화하여 분리하였다. 종양을 멸균 면도날로 분쇄하고 PBS 중 DNase (12U/ml), 및 콜라게나아제(2mg/ml)를 함유하는 버퍼로 소화시켰다. 교반하면서 실온에서 60분 인큐베이션한 후, 세포를 온화한 파이펫팅으로 분리했다. 적혈구 세포를 RBC 용해 버퍼로 용해한 후 10% FBS를 함유한 완전 RPMI-1640 배지로 복수 회 세척하였다. 나일론 메쉬를 통해 여과한 후, 종양 세포 및 비장세포를 FACS 완충액(2% FBS/PBS) 중에 재현탁하고 항-CD3-PerCP-Cy5.5, CD4-FITC, CD25-APC 항체로 염색한 후 항-Foxp3-PE로 투과화 및 염색하였다. 유동 세포 계측 분석을 4-색 FACS calibur(BD)를 사용하여 수행하고 데이터를 세포 퀘스트 소프트웨어(BD)를 사용하여 분석하였다.
통계학적 분석
로그-랭크 카이-자승 테스트를 생존 데이터에 사용하였고 CTL 및 ELISA 분석에 스튜던트 t 테스트를 사용하였으며, 삼중으로 실시되었다. 0.05 미만의 p-값(*로 표시됨)은 이들 분석에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 통계학적 분석은 Prism 소프트웨어, V.4.0a (2006) 또는 SPSS 소프트웨어, V.15.0 (2006)로 실시되었다. 모든 FVB/N 랫 Her2/neu 형질전환 연구를 위해 우리는 그룹 당 8 내지14 마리의 마우스를 사용하였으며, 모든 야생형 FVB/N 연구는 명시되지 않는 한 그룹당 적어도 8 마리의 마우스를 사용하였다. 모든 연구는 Her2/neu 형질전환 마우스 모델에서 장기 종양 연구를 제외하고는 적어도 1회 반복되었다.
실시예 15: Her-2 단편에 융합된 LLO 단편을 분비하는 L. 모노사이토게네스 균주의 생성: ADXS31-164의 구축
키메라 Her2/neu 유전자(ChHer2)의 구축은 다음과 같다. 요약하면, ChHer2 유전자는 SOEing PCR 법에 의해 Her2/neu 단백질의 두 개의 세포 외 (아미노산 40 내지 170 및 아미노산 359 내지 433) 및 하나의 세포내 단편(아미노산 678 내지 808)의 직접 융합에 의해 생성되었다. 키메라 단백질은 단백질의 공지된 인간 MHC 클래스 I 에피토프 중 대부분을 보유한다. ChHer2 유전자를 플라스미드, pAdv138(Lm-LLO-ChHer2를 구축하기 위해 사용되었음)로부터 절제하고 LmddA 셔틀 플라스미드 내로 클로닝하여, 플라스미드 pAdv164를 야기하였다(도 20a). 이들 2개의 플라스미드 골격 사이에는 2개의 주요 차이가 있다. 1) pAdv138은 재조합 박테리아의 실험관내 선별을 위해 클로람페니콜 저항 마커(cat)를 사용하는 반면, pAdv164는 바실러스 서브틸리스로부터의 D-알라닌 라세미화 효소 유전자(dal)을 보유하며, dal-dat 유전자가 결여된 LmddA 균주에서 실험관내 선별 및 생체내 플라스미드 보유에 대한 대사 보완 경로를 사용한다. 이 백신 플랫폼은 조작된 리스테리아 백신 균주의 항생제 저항에 대한 FDA 우려를 해결하기 위해 설계되고 발달되었다. 2) pAdv138와 달리, pAdv164는 플라스미드(하기 서열 및 도 20a 참조)에서 prfA 유전자의 카피를 갖고 있지 않은데, 이것은 Lmdd 균주의 생체내 보완을 위해 필요하지 않기 때문이다. LmddA 백신 균주는 또한 actA 유전자(리스테리아의 세포내 이동 및 세포에서 세포로의 확산의 원인임)가 결여되어 있어 이 골격으로부터 유래된 재조합 백신 균주가 이의 모체 균주인 Lmdd로부터 유래된 것보다 100배 적은 독성을 나타낸다. LmddA-기반 백신은 또한 면역화된 마우스의 비장으로부터의 Lmdd-기반 백신보다 더 빨리 지워진다 (48시간 미만). 이 균주로부터의 융합 단백질 tLLO-ChHer2의 발현 및 분비는 8 시간의 시험관내 성장 후 TCA 침전된 세포 배양 상등액에서의 Lm-LLO-ChHer2에서와 비슷하였는데(도 20b), 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 ~104 KD의 밴드가 항-LLO 항체에 의해 검출되었기 때문이다. tLLO만을 발현하는 리스테리아 백본 균주는 음성 대조군으로서 사용되었다.
pAdv164 서열(7075 염기쌍)(도 20a 및 20b 참조):
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(서열번호 77)
실시예 16: ADXS31-164는 LM-LLO-ChHER2만큼 면역원성이다
항-Her2/neu 특이적 세포독성 T 세포를 생성하는 ADXS31-164의 면역원성 특성은 표준 CTL 분석에서 Lm-LLO-ChHer2 백신의 것과 비교되었다. 두 백신은 강력하지만 3T3/neu 타겟 세포에 의해 발현된 Her2/neu 항원에 대해 유사한 세포독성 T 세포 반응을 이끌어냈다. 따라서, LLO에 융합된 Her-2의 세포내 단편만을 발현하는 리스테리아로 면역화된 마우스는 더 많은 MHC 클래스 I 에피토프를 함유하는 키메라보다 더 낮은 용해 활성을 보였다. CTL 활성은 미처리 동물 또는 비관련 리스테리아 백신이 주사된 마우스에서 검출되지 않았다(도 21a). ADXS31-164는 또한 야생형 FVB/N 마우스로부터의 비장세포에 의한 IFN-γ의 분비를 자극할 수 있었다(도 21b). 이것은 미토마이신 C 처리된 NT-2 세포와 공동-배양된 이들 세포의 배양 상등액에서 검출되었으며, 이는 높은 수준의 Her2/neu 항원을 발현한다(도 21c).
ADXS31-164로의 면역화 후 인간 MHC 클래스 I 에피토프의 적절한 처리 및 제시가 HLA-A2 마우스에서 테스트되었다. 면역화된 HLA-A2 형질전환 동물로부터의 비장세포를 Her2/neu 분자의 세포외(HLYQGCQVV 서열번호 59 또는 KIFGSLAFL 서열번호 60) 또는 세포내(RLLQETELV 서열번호 61) 도메인에 위치한 매핑된 HLA-A2 제한 에피토프와 일치하는 펩티드와 함께 72 시간 동안 공-배양하였다(도 21c). 재조합 ChHer-2 단백질이 양성 대조군으로서 사용되었으며 무관한 펩티드 또는 펩티드가 없는 것이 음성 대조군으로서 사용되었다. 이러한 실험으로부터의 데이터는 ADXS31-164가 타겟팅된 항원의 상이한 도메인에서 위치한 인간 항원결정부위에 대해 항-Her2/neu 특이적 면역 반응을 이끌어낼 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 17: ADXS31-164는 자발적 유방 종양의 발생을 예방하는 데 있어서 Lm-LLO-ChHER2보다 더 효과적이었다
ADXS31-164의 항-종양 효과는 20 내지 25 주령에서 자생 유방 종양인, 느리게 성장하는 Her2/neu 형질전환 동물에서 Lm-LLO-ChHer2의 것과 비교되었다. 무관한 리스테리아-대조군 백신으로 면역화된 모든 동물은 21-25주 내에 유방 종양이 발달하였으며 33주 전에 희생되었다. 반대로, 리스테리아-Her2/neu 재조합 백신은 유방 종양의 형성에서 유의한 지연을 야기하였다. 45주에서, ADXS31-164 예방접종된 마우스의 50% 초과(9마리 중 5마리)가 Lm-LLO-ChHer2로 면역화된 마우스의 25%에 비해 여전히 종양이 없었다. 52 주째에, ADXS31-164로 면역화된 8 마리 마우스 중 2 마리가 여전히 무-종양으로 남아있었지만, 다른 실험 그룹으로부터의 모든 마우스는 이미 그들의 질환에 굴복하였다(도 22). 이러한 결과는 더욱 약독화 되었음에도 불구하고, ADXS31-164가 Her2/neu 형질전환 동물에서 자생 유방 종양의 발생을 예방함에 있어 Lm-LLO-ChHer2 보다 더 효율적임을 나타낸다.
실시예 18: ADXS31-164 면역화에 따른 HER2/Neu 유전자에서의 돌연변이
Her2/neu의 MHC 클래스 I 항원결정부위에서 돌연변이는 작은 단편 백신 또는 트라스투주맙(trastuzumab) (허셉틴), Her2/neu의 세포외 도메인에서 항원결정부위를 타겟으로 하는 단일클론성 항체로 면역화에 따른 종양 탈출에 대한 책임으로 간주되고 있다. 이를 평가하기 위해, 게놈 물질이 트랜스제닉 동물 내 탈출 종양으로부터 추출되었으며 키메라 또는 대조군 백신으로 면역화된 종양에서의 neu 유전자의 상응하는 단편이 서열결정되었다. 돌연변이는 대안적인 탈출 메커니즘을 제앙하는 임의의 백신접종된 종양 샘플의 Her-2/neu 유전자에서 관찰되지 않았다 (데이터는 도시하지 않음).
실시예 19: ADXS31-164는 종양내 T 조절 세포에서 유의미한 저하를 야기한다
비장 및 종양에서 조절 T 세포의 빈도에서의 ADXS31-164의 영향을 설명하기 위해, 마우스에 NT-2 종양 세포를 이식하였다. 비장세포 및 종양내 림프구가 3회 면역화 후 분리되고 CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+ 세포로서 규정되는 Treg에 대해 염색하였으나, 개별적으로 분석했을 때 비슷한 결과가 FoxP3 또는 CD25 마커로 수득되었다. 결과는 ADXS31-164로의 면역화가, 비관련 리스테리아 백신 또는 미처리 동물과 비교하여, 비장에서 Treg의 빈도에 대한 영향이 없음을 나타냈다(도 23). 대조적으로, 리스테리아 백신 면역화는 종양에서 Treg의 존재에 상당한 영향을 초래하였다(도 24a). 비처리 종양에서 모든 CD3+ T 세포의 평균 19.0%가 Treg인 반면, 이 빈도는 비관련 백신에서 4.2% 및 ADXS31-164에서 3.4%까지 감소하였으며, 종양내 Treg의 빈도에서 5-배 감소하였다(도 24b). LmddA 백신 중 하나로 처리된 마우스의 종양내 Treg의 빈도에서의 감소는 종양의 크기에서의 차이에 기여하지 않을 것이다. 대표 실험에서, ADXS31-164로 면역화된 마우스로부터의 종양은 비처리된 마우스(8.69 ±0.98, n = 5, p < 0.01) 또는 무관한 백신으로 처리된 마우스(8.41 ±1.47, n = 5, p = 0.04)로부터의 종양보다 상당히 작지만[평균 직경(mm) ±SD, 6.71 ±0.43, n = 5], 이들 마지막 두 그룹의 비교는 종양 크기에서 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다 (p = 0.73). LmddA 백신으로 처리된 종양에서의 Treg의 더 낮은 빈도는 증가된 종양내 CD8/Treg 비율을 야기하며, 이는 더 선호되는 종양 미세환경이 LmddA 백신으로 면역화된 후에 수득될 수 있음을 제안한다. 그러나, 표적 항원 HER2/neu (ADXS31-164) 를 발현하는 백신만이 종양 성장을 감소시킬 수 있었으며, 이는 Treg에서의 감소가 종양에서 항원-특이 반응의 존재시에만 영향이 있음을 나타내는 것이다.
실시예 20: ADXS31-164로의 말초 면역화는 뇌에서 전이성 유방암 세포주의 성장을 지연시킬 수 있다
마우스를 ADXS31-164 또는 비관련 Lm-대조 백신으로 IP 면역화한 다음 루시페라아제 및 낮은 수준의 Her2/neu를 발현하는 5,000 개 EMT6-Luc 종양 세포를 두개내 이식하였다(도 25a). 종양 접종-후 상이한 시간에 마취된 마우스의 생체외 이미징으로 모니터링하였다. 종양 접종-후 8 일째에 모든 대조 동물에서 종양이 검출되었으나, ADXS31-164 그룹에서는 어떠한 마우스도 임의의 검출 가능한 종양을 보이지 않았다(도 25a 및 25b). ADXS31-164는 이들 종양의 발생을 명백히 지연시킬 수 있는데, 종양 접종-후 11 일째에 음성 대조군의 모든 마우스는 종양에 이미 굴복했으나, ADXS31-164 그룹의 모든 마우스는 여전히 생존해 있었고 종양 성장의 작은 징후만을 보였기 때문이다. 이들 결과는 ADXS31-164의 말초 투여로부터 얻어진 면역 반응이 중추 신경계에 도달 가능할 것이고 LmddA-기반 백신이 CNS 종양의 치료를 위한 유망한 용도를 가질 것임을 강력하게 제안한다.
실시예 21: 펩티드 “미니유전자”발현 시스템
재료 및 방법
이 발현 시스템은, 카르복시-말단에 개별 펩티드 모이어티를 함유하는 재조합 단백질로 된 패널의 클로닝을 용이하게 하기 위해 설계되었다. 이는, SS-Ub-펩티드 구축물들 중 하나를 인코딩하는 서열을 주형으로서 이용하는 단순 PCR 반응에 의해 달성된다. Ub 서열의 카르복시-말단 영역까지 연장되는 프라미어를 사용하고 상기 프라이머의 3’말단에서 요망되는 펩티드 서열에 대한 코돈을 도입함으로써, 새로운 SS-Ub-펩티드 서열이 단일 PCR 반응에서 생성될 수 있다. 박테리아 프로모터 및 ActA 신호 서열의 처음 몇 개의 뉴클레오티드를 인코딩하는 5’프라이머는 모든 구축물들에 대해 동일하다. 이러한 전략을 이용하여 생성된 구축물은 도 26a 내지 26c에 개략적으로 나타나 있다. 본 실시예에서, 2개의 구축물이 기재되어 있다. 하나의 구축물은 마우스 MHC 부류 I 상에 제시된 모델 펩티드를 함유하고, 제2 구축물은, 치료학적으로 관련된 펩티드, 예컨대 인간 교아세포종(GBM) TAA로부터 유래된 것과 같은 치환될 위치를 가리킨다. 명료성을 위해, 본 발명자들은 도 26a 내지 26c에 도시된 구축물이 ActA1-100 분비 신호를 포함하는 것으로서 지정하였다. 그러나, LLO-계 분비 신호는 동일한 효과로 대체될 수 있었다.
제안된 시스템의 이점들 중 하나는, 다수의 펩티드들을 단일 리스테리아 벡터 구축물을 사용하여 세포에 로딩 가능할 것이라는 점이다. 다수의 펩티드들은 상기 기재된 단일 펩티드 발현 시스템의 변형을 이용하여 재조합 약독화된 리스테리아(예를 들어, prfA 돌연변이체 리스테리아 또는 dal/dat/actA 돌연변이체 리스테리아) 내로 도입될 것이다. 순차적인 SS-Ub-펩티드 서열 유래의 다수의 개별 펩티드들을 인코딩하는 키메라 단백질은 하나의 삽입물에서 인코딩되었다. 각각의 SS-Ub-펩티드 코딩 서열 앞에 샤인-달가노 리보솜 결합 부위를 도입하여, 각각의 펩티드 구축물을 개별적으로 번역할 수 있다. 도 26c는 하나의 재조합 리스테리아 균주로부터 4개의 개별 펩티드 항원을 발현하도록 설계된 구축물의 도식도를 나타낸다. 이는 엄밀히 일반적인 발현 방법의 대표도이기 때문에, 본 발명자들은 공지된 마우스 또는 인간 종양 연관-항원 또는 감염성 질환 항원으로부터 유래된 4개의 개별 MHC 부류 I 결합 펩티드를 포함시켰다.
재료 및 방법 (실시예 22 내지 24)
플라스미드 pAdv142와 균주 LmddA142는 상기 실시예 7에 기술되었다. 추가적인 상세한 내용은 아래에 제공된다.
플라스미드 pAdv142 및 균주 LmddA142의 구축
이 플라스미드는 Verch 외에 의해 이전에 구축된 무항생제 플라스미드 pTV3의 차세대 플라스미드이다. Lm-ddA는 prfA 유전자의 카피를 염색체에 포함하고 있기 때문에, 독성 유전자 전사 활성인자의 불필요한 카피인, prfA가 pTV3로부터 결실되었다. 따라서, 플라스미드를 포함하는 dal에 prfA 유전자가 필수적으로 존재해야 하는 것은 아니었다. 또한, NheI/PacI 제한 부위에서 p60-리스테리아 dal의 카세트를 p60-바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) dal(dal Bs )로 대체하여, 플라스미드 pAdv134를 수득하였다. 또한, pAdv134을 XhoI/XmaI로 제한하여 인간 PSA, klk3을 클로닝하여, 플라스미드 pAdv142를 수득하였다. 새로운 플라스미드 pAdv 142(도 11c)는 dal Bs 를 포함하며, 그 발현은 Lm p60 프로모터의 제어하에 있다. 셔틀 플라스미드 pAdv142는 외인성 D-알라닌의 첨가가 없는 경우 Lmdd뿐만 아니라 E. coli ala drx MB2159의 성장을 보완할 수 있었다. 플라스미드 pAdv142에서 항원 발현 카세트는 hly 프로모터 및 tLLO-PSA 융합 단백질로 이루어진다(도 27).
플라스미드 pAdv142를 리스테리아 백그라운드 균주 LmddA로 형질전환시켜, LmddA142 또는 ADXS31-142를 수득하였다. 균주 ADXS31-142에 LLO-PSA 융합 단백질의 발현 및 분비는 항-LLO 및 항-PSA 항체를 사용하는 웨스턴 분석에 의해 확인되었고, 이는 도 11d에 도시되어 있다. C57BL/6 마우스에서 2 회의 생체 내 계대 후, 균주 ADXS31-142에 의한 LLO-PSA 융합 단백질은 안정적으로 발현 및 분비되었다.
LmddA211, LmddA223 및 LmddA224 균주의 구축
상이한 ActA/PEST 영역을 플라스미드 pAdv142에서 클로닝하여 ActA 단백질의 상이한 절단된 단편을 포함하는 3 개의 상이한 플라스미드, 즉 pAdv211, pAdv223 및 pAdv224를 생성하였다.
LLO 신호 서열 (LLOss)-ActAPEST2 (pAdv211)/LmddA211
첫 두 개의 단편, 즉 PsiI-LLOss-XbaI (817 bp 크기) 및 LLOss-XbaI-ActA-PEST2 (602 bp 크기)를 증폭하고, 이어서 SOEing PCR 법을 사용해 중복된 25개의 염기로 함께 융합시켰다. 이 PCR 생성물은 이제 762 bp 크기의 단편인 PsiI-LLOss- Xbal- ActAPEST2-XhoI를 포함한다. 새로운 PsiI-LLOss- Xbal- ActAPEST2-XhoI PCR 생성물 및 pAdv142(LmddA-PSA) 플라스미드를 PsiI/XhoI 억제 효소로 소화시키고 정제하였다. 연결을 설정하고 MB2159 전기 수용 세포로 형질전환시키고 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅 하였다. PsiI-LLOss- Xbal- ActAPEST2 / pAdv 142(PSA) 클론을 선택하여 삽입체 특이적인 PCR 반응으로 스크리닝하였다. PsiI-LLOss- Xbal- ActAPEST2 / pAdv 142(PSA) 클론 #9, 10은 양성이며 미니 제제에 의해 정제된 플라스미드였다. PCR 스크리닝에 의한 클로닝 이후, 양성 클론 유래의 삽입체를 시퀀싱하였다. pAdv211.10으로서 언급된 플라스미드 PsiI-LLOss- Xbal- ActAPEST2 / pAdv 142(PSA)를 리스테리아 LmddA 돌연변이 전기 수용체 세포로 형질전환시키고 BHI/strep 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 생성된 LmddA211 균주를 콜로니 PCR로 스크리닝 하였다. 몇 개의 리스테리아 콜로니를 선택하여 내인성 LLO 및 ActAPEST2-PSA(LA229-PSA) 단백질의 발현과 분비에 대해 스크리닝하였다. 마우스에서 두 번의 생체 내 계대 이후 ActAPEST2-PSA 융합 단백질의 발현은 안정적이었다.
LLOss-ActAPEST3 및 PEST4:
ActAPEST3 및 ActAPEST4 단편들을 PCR 법으로 생성하였다. LLOss-XbaI- ActAPEST3-XhoI (839 bp 크기) 및 LLOss-XbaI- ActAPEST4-XhoI 단편들(1146 bp 크기)을 포함하는 PCR 생성물을 pAdv142에서 클로닝하였다. 생성된 플라스미드 pAdv223 (PsiI-LLOss- Xbal- ActAPEST3-XhoI / pAdv 142) 및 pAdv224 (PsiI-LLOss- Xbal- ActAPEST4 / pAdv 142) 클론을 선택하여 삽입체 특이적 PCR 반응으로 스크리닝하였다. 플라스미드 pAdv223 및 pAdv224를 LmddA 백본으로 형질전환시켜 LmddA223 및 LmddA224를 각각 생성하였다. 몇 개의 리스테리아 콜로니를 선택하여 내인성 LLO, ActAPEST3-PSA(LmddA223) 또는 ActAPEST4-PSA(LmddA224) 단백질의 발현과 분비에 대해 스크리닝하였다. 2 회의 생체내 계대 후, 융합 단백질 ActAPEST3-PSA (LmddA223) 또는 ActAPEST4-PSA (LmddA224)의발현과 분비는 안정적이었다.
실험 계획 1
TPSA23(PSA 발현 종양 모델)을 사용하는 ActA-PEST-PSA (PEST3, PEST2 및 PEST4 서열) 과 tLLO-PSA의 치료 효과를 평가하고 비교하였다. 미처리 마우스를 대조군으로서 사용했다. 병행 평가에서 면역 반응에는 또한 인터페론-감마 및 PSA 4량체 염색을 위한 세포 내 사이토카인 염색을 사용하였다.
종양 퇴행 연구에 대하여. 0일 째에, 8 마리의 C57BL/6 마우스(7 주령 수컷)로 이루어진 10 개의 군에 TPSA23 세포의 1 x 106를 피하 이식하였다. 6일 째에는 면역 주사를 맞히고 이후 1 주일 간격으로 2 회 추가 접종하였다. 종양의 평균 직경이 1.2 cm가 될 때까지 매주 종양의 성장을 모니터링하였다.
면역원성 연구.
C57BL/6 마우스(7 주령 수컷)로 이루어진 2 개의 군을 하기 표에 나열된 백신으로 1 주 간격으로 3 회 면역화시켰다. 마지막 용량을 주사하고 6일 후 마우스를 희생시키고, 비장을 채취하여 4량체 염색 및 세포내 사이토카인 염색에 의한 IFN-γ 분비에 대한 면역 반응을 시험하였다.
실험 계획 2
이 실험은 실험 계획 1의 반복이었지만, 미처리 군, tLLO 군, ActA/PEST2-PSA 군 및 tLLO-PSA 군만을 포함하였다. 실험계획 1과 마찬가지로, TPSA23(PSA 발현 종양 모델)을 사용해 치료 효과를 평가하였다. 0일 째에, 매 군당 5 마리의 C57BL/6 마우스에게 TPSA23 세포의 1x106을 피하 이식하였다. 6일 째에는 면역 주사(1x108 CFU/mL)를 맞히고 1 주일 후 추가 접종하였다. 최종 처치 후 6일 째에 종양이 있는 비장을 채취하였다. 비장과 종양 모두에서 PSA 5량체 염색을 사용해 면역 반응을 모니터링 하였다.
재료 및 방법:
TPSA23 세포를 완전한 배지에서 배양했다. 마우스에 종양 세포를 이식하기 2일 전에 TPSA23 세포를 완전한 배지에서 계대 배양하였다. 실험 당일(0일 째)에, 세포를 트립신 처리하고 PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 계수하고, 주사를 위해 PBS/마우스에서 1x106 세포/200ul의 농도로 재현탁하였다. 종양 세포를 각각의 마우스의 측면에 피하주사하였다.
TPSA23 세포에 대한 완전한 배지
DMEM 430ml을 포도당, 태아 송아지 혈청 (FCS) 45ml, 뉴-세럼 IV 25ml, 100X L-글루타민 5ml, 100mM 피루베이트산 나트륨 5ml, 10,000U/mL 페니실린/스트렙토마이신 5ml와 혼합하여 TPSA23 세포의 완전한 배지를 제조하였다. 세포분열 동안에 0.005mg/ml의 보빈 인슐린(Bovine Insulin)과 10nM의 디히드로이소안드로스테론(Dehydroisoandrosterone)을 플라스크에 첨가하였다.
비장 세포(c-RPMI)에 대한 완전한 배지
RPMI 1640 450ml, 태아 송아지 혈청(FCS) 50ml, 1M HEPES 5ml, 100x 비 필수 아미노산(NEAA) 5ml, 100x L-글루타민 5ml, 100mM 피루베이트산 나트륨 5ml, 10,000U/mL 페니실린/스트렙토마이신 5ml 및 14.6M 2-메르캅토에탄올 129ul을 혼합하여 완전한 배지를 제조하였다.
단리된 비장 세포의 준비
작업은 바이오해저드 후드(biohazard hood)에서 수행되었다. 무균 겸자와 가위를 사용해 실험 및 대조 마우스 군으로부터 비장을 채취하였다. 채취한 비장을 PBS 10ml가 들어있는 15 ml 튜브에 담아 실험실로 옮겼다. 각각의 마우스로부터의 비장은 별도로 처리하였다. 비장은 멸균 배양 접시에 담은 후 3 mL 주사기의 플런저 뒷면을 사용하여 으깼다. 비장 세포를 RPMI 1640 10 ml가 담긴 15 ml 튜브로 옮겼다. 세포를 4℃에서 5 분 동안 1,000 RPM으로 원심분리하여 펠렛화하였다 상등액은 10% 표백제에서 제거했다. 세포의 펠릿을 태핑으로 조심스럽게 파괴하였다. 비장 당 RBC 용해 완충제 2ml씩을 세포 펠릿에 첨가하여 RBC를 용해시켰다. RBC는 2 분 동안 용해시키고, 즉시, 10 ml의 c-RPMI 배지를 세포 현탁액에 첨가하여 RBC 용해 완충액을 불활성화시켰다. 세포를 4℃에서 5 분 동안 1,000 RPM으로 원심분리하여 펠렛화하였다 상등액을 제거하고, 세포 펠릿을 c-RPMI 10 ml 중에서 재현탁시킨 뒤 세포 여과기를 통과시켰다. 혈구계산판(hemocytometer)을 사용해 세포를 계수화하고, 10 ul의 세포 현탁액을 90 ul의 트리판(Trypan) 블루 염색을 혼합하여 생존력을 확인하였다. 5량체 염색을 위해 약 2 X 106 개의 세포를 사용하였다. (주: 각 비장의 세포 수는 1-2 x 108 이었다.)
Miltenyi 마우스 종양 해리 키트를 사용하여 종양으로부터 단일 세포 현탁액 준비하기
RPMI 1640 2.35 mL, 효소 D 100 μL, 효소 R 50 μL, 효소 A 12.5 μL를 gentleMACS C 튜브에 첨가하여 효소 혼합물을 제조 하였다. 종양(0.04-1 g)을 2-4 mm의 작은 조각들로 잘라 효소 혼합물이 담긴 gentleMACS C 튜브로 옮겼다. 튜브를 gentle MACS 분해기의 슬리브에 거꾸로 부착하고, m_impTumor_02 프로그램을 실행하였다. 프로그램이 종료된 후, C 튜브를 gentle MACS 분해기로부터 분리하였다. 샘플을 MACSmix 튜브 로테이터를 사용해 연속적으로 회전시키며 37℃에서 40분 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, C 튜브를 gentle MACS 분해기의 슬리브에 거꾸로 다시 부착하고, m_impTumor_03 프로그램을 두 번 실행하였다. 세포 현탁액을 15 mL 튜브 상에 놓인 70 μm 필터를 통해 여과시켰다. 필터를 RPMI 1640 10 mL로 세척하였다. 세포를 300×g에서 7 분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 세포를 RPMI 1640 10 ml 중에서 재현탁시켰다. 이 시점에서, 5량체 염색을 위해 세포를 분할할 수 있다.
비장세포의 5량체 염색
제조자 권장 프로토콜을 사용하여 ProImmune으로부터 구입 가능한 PSA-H-2Db 5량체를 사용해 PSA 특이적 T 세포를 검출하였다. 비장세포를 CD8, CD62L, CD3 및 5량체에 대해 염색하였다. 종양 세포를 CD8, CD62L, CD45 및 5량체에 대해 염색하였다. CD3+CD8+ CD62Llow 세포를 게이팅하여 CD3+CD8+ CD62Llow PSA 5량체+ 세포들의 빈도를 결정하였다. 염색된 세포들을 수득하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 FACS Calibur 세포계산기로 분석하였다.
5량체 염색을 위해 필요한 재료
비장세포(제조 방법은 위에 기술됨), PE에 접합된 Pro5® 재조합 MHC PSA 5량체 (주: 5량체는 단단히 밀봉된 채 어두운 곳에서 4℃로 일관되게 보관되도록 할 것), PerCP Cy5.5에 접합된 항-CD3 항체, FITC에 접합된 항-CD8 항체 및 APC에 접합된 항-CD62L 항체, 세척 완충액(PBS 중 0.1% BSA) 및 고정 용액(1% 열로 불활성화된 태아 송아지 혈청(HI- FCBS), PBS 중 2.5% 포름알데히드)
표준 염색 프로토콜
Pro5® PSA 5량체를 냉각된 미량원심분리기로 14,000×g 로 5-10분 동안 원심분리시켜 용액 중에 존재하는 임의의 단백질 응집체를 제거하였다. 이들 응집체가 시험 양에 포함되는 경우, 비특이적 염색에 기여할 수 있을 것이다. 비장세포 2 × 106을 염색 조건마다 할당하고, 세척 완충액 중 1ml씩을 튜브마다 첨가하였다. 세포를 냉각된 원심분리기로 500xg 로 4℃에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 잔여량(~50 μl)에서 재현탁시켰다. 모든 후속 단계에 있어서, 달리 언급되지 않은 한, 모든 튜브는 얼음 위에서 냉각시켰다. 10 μl의 표지된 5량체를 세포에 첨가하고 피펫팅하여 혼합하였다. 세포를 빛을 차단한 상태에서 10분 동안 실온(22℃) 배양하였다. 세포를 튜브당 2 ml의 세척 완충액으로 세척하고, 잔여액(~50 μl) 중에서 재현탁시켰다. 항-CD3, 항-CD8 및 항-CD62L 항체의 최적량을 첨가하고(1:100 희석) 피펫팅으로 혼합하였다. 단일 균주 대조 샘플 또한 이 시점에서 만들어졌다. 샘플을 빛을 차단한 상태에서 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 샘플을 튜브당 2 ml의 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세포 펠릿을 잔여량(~ 50 μl) 중에서 재현탁시켰다. 고정 용액 200 μl를 각 튜브에 넣고 교반하였다. 튜브를 데이터 획득이 가능할 때까지 어두운 냉장고에 보관하였다. (주: 고정 후 세포의 형태가 바뀌므로, 데이터 획득을 진행하기 전에 3 시간 동안 시료를 그냥 두는 것이 좋다. 샘플은 최대 2 일 동안 보관할 수 있다).
세포내 사이토카인 염색(IFN-γ) 프로토콜:
2x107 세포/ml의 비장세포를 FACS 튜브에 넣고, 100μ의 브레펠딘(Brefeldin) A(BD Golgi Plug)를 튜브에 첨가하였다. 자극을 위해, 2 μM의 펩티드를 튜브에 첨가하고, 세포를 10-15분 동안 실온 배양하였다. 양성 대조 샘플의 경우, PMA(10ng/ml) (2x) 및 이오노마이신(ionomycin) (1μg/ml) (2x)을 해당 튜브에 첨가하였다. 각각의 처치된 100 μl의 배지를 유-바텀(U-bottom) 96 웰 플레이트 중의 해당 웰에 첨가하였다. 100 μl의 세포를 해당 웰에 첨가하였다(배지+세포 최종량은 200μl). 플레이트를 600rpm으로 2분간 원심분리하고, 37℃에서 5%의 CO2에서 5 시간 동안 배양하였다. 플레이트로부터의 내용물을 FACS 튜브로 옮겼다. FACS 완충액 1 ml을 각각의 튜브에 첨가하고 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하였다. 2.4G2 상등액 200 μl 및 토끼 혈청 10 μl을 세포에 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액 1 ml으로 세척하였다. 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포를 형광색소가 접합된 단일클론 항체(CD8 FITC, CD3 PerCP-Cy5.5, CD62L APC)를 포함하는 FACS 완충액 50 μl으로 현탁화시키고 4℃의 어두운 곳에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액 1 ml로 두 번 세척하고, 4% 포르말린 용액 200 μl에서 재현탁화시킨 다음, 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액 1 ml로 두 번 세척하고 BD Perm/Wash(0.25ml/튜브)에서 15분 동안 재현탁화시켰다. 원심분리로 세포를 수집하고, 관심 사이토카인(IFNg-PE)에 대한 형광색소가 접합된 단일클론 항체를 포함하는 BD Perm/Wash 용액 50 μl에서 재현탁화시켰다. 세포를 4℃의 어두운 곳에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 BD Perm/Wash(튜브당 1ml)로 2회 세척하고, 분석에 앞서 FACS 완충액 200 μl에서 재현탁시켰다.
결과
실시예 22: 재조합 리스테리아 구축물로 백신접종하여 종양 퇴행을 야기하다
데이터는 1 주까지 모든 군에서 평균 2-3 mm 크기의 종양이 발생했음을 나타냈다. 3 주(20일 차)차에, PSA에 융합된 tLLO를 발현하는 ActA/PEST2(“LA229”로도 공지된)-PSA, ActA/PEST3-PSA 및 ActA/PEST3-PSA 및 LmddA-142(ADXS31-142)로 면역화된 마우스는 종양의 퇴행 및 종양 성장의 지연을 나타냈다. 6 주까지, 미처리된 마우스 모두 및 ActAPEST4-PSA로 처리된 군의 대부분의 마우스에게 큰 종양이 생겼고 안락사키셔야만 했다(도 28a). 그러나, LmddA-142, ActA-PEST2 및 ActA-PEST3 마우스 군에서는 더 나은 종양 퇴행과 생존율이 나타났다(도 28a 및 28b).
실시예 23: 재조합 리스테리아로 백신 접종하여 높은 수준의 항원특이적 T 세포를 형성하다
LmddA-ActAPEST2-PSA 백신은 LmddA-ActAPEST(3 또는 4)- PSA 또는 LmddA-142와 비교하여 높은 수준의 PSA-특이적 T 세포 반응을 생성하였다(도 29a). PSA-특이적 백신에 있어서의 PSA 4량체 특이적 T 세포의 강도는 미처리 마우스보다 30배 높았다. 유사하게, PSA-특이적 항원에 의한 자극에 반응하여 LmddA-ActAPEST2-PSA 백신에 대해 보다 높은 수준의 IFN-γ 분비가 관찰되었다(도 29b).
실시예 24: ACTA/PEST2(LA229)로 백신접종하여 비장에서 항원-특이적 CD8+ T 세포의 수를 증가시키다
ActA/PEST2 융합된 PSA를 발현하는 Lm은 tLLO 융합된 PSA를 발현하는 Lm 또는 tLLO 처치된 군과 비교해서 비장에서 PSA 특이적 CD8+ T 세포의 수를 증가시킬 수 있었다. 종양을 침윤하는 PSA 특이적 CD8+ T 세포의 수는 Lm-tLLO-PSA 및 Lm-ActA/PEST2-PSA 면역화된 마우스 모두에서 비슷했다(도 30b 및 30c). 또한, ActA/PEST2-PSA를 발현하는 Lm의 종양 퇴행 능력은 tLLO-PSA를 발현하는 LmddA-142에서 관찰된 종양 퇴행 능력과 유사했다(도 30a).
실시예 25: LLO 콜레스테롤-결합 도메인의 위치-특이적 변이
위치-특이적 변이는 다음의 전략을 이용하여, CBD에서 불활성화 포인트 돌연변이를 유도하기 위해 LLO에서 수행되었다. 수득된 단백질은 "mutLLO"로 명명되었다:
pET29b로의 LLO의 서브클로닝
야생주 LLO의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKE C TGLAWE WW RTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(서열번호 80). 굵은 이탤릭체인 CBD 중 3 개의 주요 잔기(C484, W491, 및 W492)와 함께, 신호 펩티드 및 콜레스테롤-결합 도메인(CBD)에는 밑줄이 그어져 있다.
6xHis 태그 (HHHHHH(서열번호 82))는 LLO의 C-말단 영역에 첨가되었다. His-태그된 LLO의 아미노산 서열은 다음과 같다: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKE C TGLAWE WW RTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIEHHHHHH (서열번호 62).
His-태그된 LLO 단백질을 인코딩하는 유전자는 NdeI/BamHI로 분해되었으며, NdeI/BamHI는 NdeI 및 BamHI 위치 사이에 있는, 발현 벡터 pET29b로 서브클로닝 되었다. LLO 단백질을 인코딩하는 유전자의 서열은 다음과 같다:
catatgaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccgtggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttattcaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatcctgaaggtaacgaaattgttcaacataaaaactggagcgaaaacaataaaagcaagctagctcatttcacatcgtccatctatttgcctggtaacgcgagaaatattaatgtttacgctaaagaa tgc actggtttagcttgggaa tggtgg agaacggtaattgatgaccggaacttaccacttgtgaaaaatagaaatatctccatctggggcaccacgctttatccgaaatatagtaataaagtagataatccaatcgaacaccaccaccaccaccactaataaggatcc (서열번호 63). 서열의 시작 부분에서 출발하는, 밑줄이 그어진 서열은 NdeI 위치, NheI 위치, CBG-인코딩 영역, 6x His 태그, 및 BamHI 위치이다. 다음 단계에서 돌연변이되는 CBD 잔기는 굵은 이탤릭체이다.
중복 신장 (SOE) PCR에 의한 스플라이싱
단계 1: PCR 반응 #1 및 #2는 pET29b-LLO 주형에서 수행되었다. 프라이머 #1 및 #2를 이용하는, PCR 반응 #1은 포함된, NheI 위치 및 CBD사이의 단편을 증폭하였으며, CBD로 돌연변이를 도입하였다. 프라이머 #3 및 #4를 이용하는, PCR 반응 #2은 포함된, CBD 및 BamHI 위치 사이의 단편을 증폭하였으며, CBD로 동일한 돌연변이를 도입하였다 (도 31a).
PCR 반응 #1 사이클: A) 94℃ 2 분 30 초, B) 94℃ 30 초, C) 55℃ 30 초, D) 72℃ 1 분, B 내지 D 단계를 29 회 반복 (총 30 사이클), E) 72℃ 10 분.
PCR 반응 #2 사이클: A) 94℃ 2 분 30 초, B) 94℃ 30 초, C) 60℃ 30 초, D) 72℃ 1 분, B 내지 D 단계를 29 회 반복 (총 30 사이클), E) 72℃ 10 분.
단계 2: PCR 반응 #1 및 #2의 산물이 혼합되었고, 돌연변이된 CBD-인코딩 영역에서 어닐링하는 것이 허용되었고, PCR은 25 회 이상의 사이클 동안 프라이머 #1 및 #4로 수행되었다 (도 31b). PCR 반응 사이클: A) 94℃ 2 분 30 초, B) 94℃ 30 초, C) 72℃ 1 분, B 내지 C 단계를 9 회 반복 (총 10 사이클), 프라이머 #1 및 #4 첨가, D) 94℃ 30 초, E) 55℃ 30 초, F) 72℃ 1 분, D 내지 F 단계를 24 회 반복 (총 25 사이클), G) 72℃ 10 분.
프라이머 서열:
프라이머 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (서열번호 64; NheI 서열은 밑줄이 그어져 있음).
프라이머 2: TCT TGCAGC TTCCCAAGCTAAACCAGT CGC TTCTTTAGCGTAAACATTAATATT (서열번호 65; CBD-인코딩 서열은 밑줄이 그어져 있음; 돌연변이된 코돈은 굵은 이탤릭체임).
프라이머 3: GAA GCG ACTGGTTTAGCTTGGGAA GCTGCA AGAACGGTAATTGATGACCGGAAC (서열번호 66; CBD-인코딩 서열은 밑줄이 그어져 있음; 돌연변이된 코돈은 굵은 이탤릭체임).
프라이머 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (서열번호 67; BamHI 서열은 밑줄이 그어져 있음).
야생주 CBD 서열은 ECTGLAWEWWR이다 (서열번호 68).
돌연변이된 CBD 서열은 EATGLAWEAAR이다 (서열번호 69).
돌연변이된 NheI-BamHI의 서열은
GCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCTGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAA GCG ACTGGTTTAGCTTGGGAA GCTGCA AGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAACACCACCACCACCACCACTAATAAGGATCC (서열번호 70).
실시예 26: CTL 에피토프를 갖는 LLO CBD의 부분 치환
위치-특이적 변이는 항원 NY-ESO-1으로부터 CTL 에피토프를 갖는 CBD의 9 개의 아미노산(AA)을 교체하여 LLO 상에서 수행되었다. CBD(서열번호 68)의 서열은 서열 ESLLMWITQCR (서열번호 71; 밑줄이 그어져 있는 돌연변이된 잔기)로 교체되었으며, 이것은 “ctLLO”로 명명되는, NY-ESO-1 유래의 HLA-A2 제한 에피토프 157-165를 포함한다.
사용된 서브클로닝 전략은 이전의 실시예와 유사했다.
사용된 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (서열번호 64; NheI 서열은 밑줄이 그어져 있음).
프라이머 2: TCT GCACTGGGTGATCCACATCAGCAGGCT TTCTTTAGCGTAAACATTAATATT (서열번호 72; CBD-인코딩 서열은 밑줄이 그어져 있음; 돌연변이된 (NY-ESO-1) 코돈은 굵은 이탤릭체임).
프라이머 3: GAA AGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGC AGAACGGTAATTGATGACCGGAAC (서열번호 73; CBD- 인코딩 서열은 밑줄이 그어져 있음; 돌연변이된 (NY-ESO-1) 코돈은 굵은 이탤릭체임).
프라이머 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (서열번호 67; BamHI 서열은 밑줄이 그어져 있음).
수득된 NheI/BamHI 단편의 서열은 다음과 같다: GCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCTGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAA AGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGC AGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAACACCACCACCACCACCACTAATAAGGATCC (서열번호 74).
실시예 27: mutLLO 및 ctLLO는 대장균 발현 시스템에서 발현되고 정제될 수 있다
대장균에서 mutLLO와 ctLLO가 발현될 수 있다는 것을 나타내기 위해, 대장균을 pET29b로 형질전환시키고 0.5 mM의 IPTG로 유도한 다음, 4 시간 후에 세포 용해물을 채취하고, 총 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 분리하고 단일클론 항체 B3-19을 사용해 쿠마시(Coomassie) 염색(도 32a)하고 항-LLO 웨스턴 블롯팅 하였다(도 32b). 따라서, CBD에서 점 돌연변이 또는 치환을 포함하는 LLO 단백질은 대장균 발현 시스템에서 발현되고 정제될 수 있었다.
실시예 28: mutLLO 및 ctLLO는 용혈 활성의 현저한 감소를 나타낸다.
재료 및 실험 방법
용혈 분석
1. 야생주 LLO 및 돌연변이된 LLO를 도 33a 및 33b에 도시된 1x PBS-시스테인(PBS는 0.5M 시스테인 하이드로클로라이드로 pH 5.5로 조정하거나, pH 7.4로 조정함) 900 μl 중의 희석액으로 희석시켰다. 2. LLO를 37℃에서 30분 동안 배양하여 활성화시켰다. 3. 양의 적혈구 세포(200 μl/샘플)를 PBS-시스테인에서 2 회 세척하고, 상등액이 상대적으로 묽어질 때까지 1x PBS에서 3-5회 세척하였다. 4. 양의 적혈구 세포의 최종 펠릿을 PBS-시스테인에서 재현탁하고, 세포 상등액 100 μl을 LLO 용액 900 μl에 첨가하였다(최종 용액의 10%). 5. 양의 적혈구 세포 50 μl을 물과 Tween 20 10% 혼합물 950 μl에 첨가하였다(용해에 있어서의 양성 대조군은 세포의 총량이 다른 튜브에 첨가될 때 용해된 세포량의 50%를 포함할 것이다; "50% 대조군.") 6. 모든 튜브를 조심스럽게 혼합하고 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 7. 적혈구 세포를 미세원심분리기에서 10분 동안 1500 rpm으로 원심분리시켰다. 8. 상등액의 부분 시료인 200 ㎕를 96-웰 ELISA 플레이트에 옮기고 570 nm에서 판독하여 용혈 후 방출된 헤모글로빈의 농도를 측정하고, 샘플을 50 % 대조에 따라 적정하였다.
결과
mutLLO 및 ctLLO의 용혈 활성을 양의 적혈구 세포 분석을 사용해 결정하였다. mutLLO는 pH 5.5에서 용혈 역가가 현저히 감소한 것으로 나타났고(100배 내지 1000배), pH 7.4에서는 용혈 활성을 검출할 수 없었다. ctLLO는 pH 어디에서도 용혈 활성을 검출할 수 없었다(도 33a 및 도 33b).
따라서, C484, W491, 및 W492를 포함하는, LLO CBD 잔기의 점(mutLLO) 또는 치환(ctLLO) 돌연변이는 용혈 활성을 폐지시키거나 심각하게 저하시킨다. 또한, CBD를 이종 항원 펩티드로 대체하는 것은 야생주 LLO에 비해 현저히 감소된 용혈 활성을 갖는 이종 에피토프의 면역원성 담체를 생성하는 효과적인 수단이다.
본 발명의 소정의 특징들이 이에 예시되고 기술되었지만, 해당 분야의 당업자에게는 많은 변형, 치환, 변경 및 등가물이 이제 떠오를 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 내에 있는 바와 같은 모든 변형 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.
실시예 29: 완전 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템
본 혁신적인 시스템은 독창적인 구성으로 배치된 즉시 이용 가능한 바이오프로세싱 구성 요소 및 기술을 활용하여, 조작된 Lm 박테리아를 성장시키고, 발효액을 농축하고, 세포를 세척 및 정제하고, 발효 배지를 제형화 완충액으로 교환하고, 일회용 완전 밀폐된 시스템을 사용하여 환자특이적 투여량을 사용준비된 IV 백으로 분배한다. 이 유형의 시스템은 각 환자의 면역 요법의 완전히 분리하고 제어한다. 이 시스템은 맞춤형 네오-에피토프 표적화 면역 요법의 동정 및 임상적 사용에 대한 전반적인 업무 유동의 통합에 특히 적합하다(도 37a 및 37b).
맞춤 설계형 시스템은 일회용 바이오프로세싱 백, 환자 IV 백, 샘플링 백, 튜빙, 필터, 퀵 커넥터, 및 센서를 사용해 조립된다. 본 시스템의 작은 풋프린트는 개별 환자를 위한 제조를 가능하게 하지만, 동시에 다수의 환자를 위한 제품을 생산하기 위해 복제될 수 있다(도 38). 전체 어셈플리는 4 개의 섹션으로 구성된다: 1) 접종 및 발효, 2) 농축, 3) 정용여과, 및 4) 의약품 채움. 시스템이 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 가지고 사용 전에 멸균되기 때문에, 최종 제형화된 면역 요법이 IV 백에 직접 분배될 수 있고 동결되어 의료 센터로 보내질 수 있다. 따라서, 바이알이나 미리 채워진 주사기에 분배할 때 수반되는 일반적인 채우기나 마감 및 포장을 필요로 하지 않는다. 이는 제품을 신속하게 챙겨 환자에게 전달하기 위한 기대를 충족시킨다.
본 어셈블리의 접종 및 발효 섹션(도 39)는 성장 배지로 채워지고 특정 온도로 가온된다. 이어서, 세포 은행은 일회용/일회성 락커 백 발효기 또는 일회용/일회성 교반된 생물반응 용기에 접종된다. 일단 박테리아가 특정 밀도로 성장하면, 어셈블리의 농축 섹션(도 40)를 사용해 발효 배지를 제거하고 중공 섬유 필터를 사용해 배치(batch)를 농축한다. 세척/제형화 완충액 백은 어셈블리의 정용여과 섹션(도 41)에 연결되어 박테리아 세포를 세척/정제하고, 잔여 배지는 중공 섬유 필터에서 교차 유동 여과를 통해 제형화 완충액과 교환되며, 제품은 최종 농도로 희석된다. 최종적으로, 배치를 어셈블리의 의약품 충진 섹션(도 42)을 사용하여 QC 테스트용 무균 일회용 IV 백과 샘플링 백으로 나눈다. 환자-특이적 면역 요법은 특정 농도의 살아있는 약독화된 조작된 Lm 박테리아의 순수 배양 균주가 들어있는 소량의 비경구 IV 백에 동결 상태로 제공된다. 환자에게 투여하기 전에, IV 백을 해동하고, 세포를 재현탁하고, 필요한 투여량을 주사기로 인출하여 더 큰 주입 IV 백에 첨가한다.
몇몇의 환자 또는 단일 환자를 대상으로 맞춤형 면역 요법 조성물을 제조하기 위해 몇몇의 완전히 밀폐된 어셈블리가 병행으로 사용될 것이다(도 43). 처리량을 증가시키기 위해, 추가 락커 또는 교반된 생물반응기 시스템이 필요에 따라 공정 트레인에 추가될 것이다 (예컨대 도 38 참조).
성장 시스템의 완전 밀폐식 디자인은 제조 과정에서 면역 요법 조성물의 완전한 품질 관리를 가능하게 하여 추가적인 시간 절감을 가능하게 한다. 완전한 분석적 제어 전략은 리스테리아 전달 벡터의 성장과 병행하여 구현된다(표 6). 따라서, 분배된 제품은 추가적인 검사를 필요로 하지 않고 환자에게 즉시 전달될 수 있다.
분석적 제어 전략
파라미터 품질 속성 시험 방법 시험 기간 코멘트
동일성 플라스미드 ID PCR 5일 3일 + 2VCC
안전성 약독화 매크로 파지 또는 THP1 5일 3일 + 2VCC
일반 용액 외관 1일
일반 pH 1일
일반 삼투압몰농도 1일
내용물 채움 중량 공정중 시험 0일
내용물 생존 세포 수 플레이트 2일
내용물 플라스미드 카피 번호 PCR 5일 3일 + 2VCC
효능 시험관 내 효능 J774 감염성 세포 내 발현 5-10일 3-7일 + 2VCC
순도 플라스미드 안정성 5일
순도 미생물 순도 플레이팅 방법 21일 신속한 동정 방법 필요
순도 살아있는 세포와 죽은 세포 백분율 5일
안전성 내독소 5일
실시예 30: 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스 세포 은행의 제조 공정
제조 공정이 도 50에 있으며 다음의 단계에 따라 수행된다:
1. 배지/완충액 제조 .
이 단계에서, 배양 배지(트립톤 대두 브로쓰 (Tryptic Soy Broth) 및 세척 완충액(PBS/수크로오스) 용액은 표 7에 제시된 재료 및 도 44 내지 46의 단계에 따라 제조된다. pH 조정을 위한 염기성 용액이 또한 제조된다(2M NaOH - 도 45).
재료 설명 필요량
백금 경화 실리콘 튜빙 필요에 따라
공급업체가 제조한 트립톤 처리 대두 브로쓰 (TSB) 1000mL
0.2μm 필터가 있는 감마 조사된 5L 백 1
적절한 크기의 플라스틱 상자 필요에 따라
눈금이 있는 시린더 또는 적절한 세롤로지컬 피펫 1
적절한 크기의 루어 락 주사기 필요에 따라
공급업체가 제조한 1M NaOH 75mL
감마 조사된 100mL 백 1
10L 유리병 1
공급업체가 제조한 듈베코 인산염 완충된 식염수 (PBS) 5000mL
수크로오스 100g
0.2μm 필터가 있는 감마 조사된 5L 백 1
또한, 다음의 공정 중(In-Process) 제어가 수행된다: 1) 세척 완충액 전후 생물부담(bioburden), 2) 세척 완충액의 필터 무결성 시험, 3) 발효 배지의 전후 생물부담, 및 4) 발효 배지의 필터 무결성 시험.
2.0 예비 배양 단계 번호 1
예비 배양 1 (PC1)을 제조하기 위해, 단일 리스테리아 모노사이토게네스 콜로니가 단리되고 10 ml의 TSB 튜브에서 확장되고 37℃, 180-220 rpm에서 6-8 시간 동안 배양된다.
3.0 예비 배양 단계 번호 2
예비 배양 2 (PC2)를 제조하기 위해, 190 ml의 TSB가 PC1로 접종되고 37℃, 180-220 rpm에서 16-18 시간 동안 (또는 밤새) 배양된다.
접종물 백 제조
25 ml 분취량이 PC2로부터 수득되고 250 ml 백과 100ml의 충분량 (qs)이 주입되어 접종물 백이 제조된다. 총 4개의 백이 수득된다 (250ml x 4 백으로 100 ml). 1개의 백(“작동 세포 은행”으로 지칭됨)이 후속 발효 공정에서 사용된다. 내부 공정 대조군으로서, 외관, 생존 세포 수 (VCC), actA 유전자의 부재, SIINFEKL 펩티드 태그의 존재, 콜로니 PCR 및 몬셉시스 (순도)에 대해 30분마다 (샘플링 백 매니폴드를 사용하여, 도 53a 참조) 접종물 백을 샘플링하고, 이를 최종 OD 샘플링까지 수행한다. 나머지 백을 TSB 중의 -70℃내지 -80℃에서 동결시킨다. 이 시점부터 공정은 폐쇄된 시스템에서 수행된다.
장비 설정
이 단계에서, 웨이브 생물반응기를 설정하고, 접선 유동 여과(TFF) 시스템(도 51a)을 설정하고, 제품 은행 매니폴드를 설정한다 (도 53).
발효 공정
본 어셈블리의 접종 및 발효 섹션(도 39)는 성장 배지로 채워지고 특정 온도로 가온된다. 이어서, 세포 은행은 일회용/일회성 락커 백 발효기 또는 일회용/일회성 교반된 생물반응 용기에 접종된다. 이 단계는 웨이브 생물반응기 설정의 일부로서 GE 웨이브 백을 사용한다. 이 단계에서, 접종 전에 배지를 조건화하고, 배지가 조건화 되면, 생물반응기를 100 ml의 접종물 백으로 접종하였다. 이어서 발효를 37℃에서 20 rpm의 락킹 속도 및 12°의 락킹 각도에서 2 내지 4시간 동안 수행하였다. 공정 중 제어로서, 발효 공정을 OD600, pH 및 용존 산소 (dO2)에 대해 샘플링하였다. 0.65 +/- 0.05의 OD600이 달성되면 반응/공정을 종결하였다.
접선 유동 여과(농축/정용여과)
박테리아가 특정 밀도로 성장하면, 어셈블리의 농축 및 정용여과 섹션(도 51a, 51c)을 사용하여 발효 배지를 제거하고, 도관(5), 중공 섬유 필터(23), 발효 배지를 포함하여, 유체 혼합물, 및 잔류물 백(2)을 포함하는 루프를 통한 구축물을 통해 재순환시킴으로써 배치를 농축하였다. 2배 농축을 수행하였고, 제품이 이의 최종 2배 농축에 도달할 때까지 순환을 계속할 수 있다.
정용여과 동안, 세척/제형화 완충액 백(예컨대, 세척/제형화 완충액을 담고 있는 백(29))을 접선 유동 여과 어셈블리의 잔류물 백(1)인 커플러(11)에 연결되고 (발효된 배지의 농축/정용여과에 사용하기 위해) (도 51a-c), 박테리아 세포가 세척/정제되는 동안(정용여과: ≥8 Diavolumes ≥ 4L), 펌프(40)는 남아있는 혼합물을 계속해서 순환시키고, 필터(23)는 혼합물로부터 배지를 계속해서 제거한다. 남아있는 배지는 중공 섬유 필터에서 교차 유동 여과를 통해 제형화 완충액으로 대체되고, 제품은 최종 농도로 희석된다. 일부 구현예에서, 제형화 완충액은 필터(23)에 의해 유체가 투과물 백(2)으로 제거되는 것과 동일한 속도로 첨가될 수 있으며, 따라서 후속하여 오래된 배지가 제형화 완충액으로 대체되는 동안 구축물이 실질적으로 일정한 농도로 유지되고 농축이 달성된 후에 정용여과가 시작된다. 잔류물 백(1)은 정용여과 중에 백에서 일정한 부피를 측정하고 유지하기 위한 크기로 유지될 수 있다.
환자에게 분취하기 전에, 의약품을 pH, 외양, 삼투압, 콜로니 PCR, actA 유전자 존재, SIINFEKL 태그 (항원 제시) 모노셉시스, 생존 세포 수, 생존/사멸 % 및 내독소에 대해 샘플링될 수 있다.
충진/동결 및 보관
최종적으로, 배치를 도 52-53에 제시된 어셈블리의 매니폴드(39)를 사용하여 QC 테스트용 무균 일회용 IV 백과 샘플링 백으로 나눈다 (40 X 10 mL 부피). 시스템이 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 가지고 사용 전에 멸균되기 때문에, 최종 제형화된 면역 요법이 IV 백에 직접 분배될 수 있고 동결되어 의료 센터로 보내질 수 있다. 따라서, 바이알이나 미리 채워진 주사기에 분배할 때 수반되는 일반적인 채우기나 마감 및 포장을 필요로 하지 않는다. 이는 제품을 신속하게 챙겨 환자에게 전달하기 위한 기대를 충족시킨다.
환자-특이적 면역 요법은 특정 농도의 생 약독화된 조작된 Lm 박테리아의 순수 배양 균주가 들어있는 소량의 비경구 IV 백에 동결 상태로 제공될 수 있다. 환자에게 투여하기 전에, IV 백을 해동하고, 세포를 재현탁하고, 필요한 투여량을 주사기로 인출하여 더 큰 주입 IV 백에 첨가한다.
몇몇의 환자 또는 단일 환자를 대상으로 맞춤형 면역 요법 조성물을 제조하기 위해 몇몇의 완전히 밀폐된 어셈블리가 병행으로 사용된다(도 43). 처리량을 증가시키기 위해, 추가 락커 또는 교반된 생물반응기 시스템이 필요에 따라 공정 트레인에 추가될 것이다 (예컨대 도 38 참조).
성장 시스템의 완전 밀폐된 디자인은 제조 과정에서 면역 요법 조성물의 완전한 품질 관리를 가능하게 하여 추가적인 시간 절감을 가능하게 한다. 완전한 분석적 제어 전략은 리스테리아 전달 벡터의 성장과 병행하여 구현된다(표 6). 따라서, 분배된 제품은 추가적인 검사를 필요로 하지 않고 환자에게 즉시 전달될 수 있다.
본 발명의 소정의 특징들이 이에 예시되고 기술되었지만, 해당 분야의 당업자에게는 많은 변형, 치환, 변경 및 등가물이 이제 떠오를 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 내에 있는 바와 같은 모든 변형 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.

Claims (72)

  1. 질환 또는 상태를 갖는 대상에 투여하기 위한 맞춤형 면역 요법 조성물의 제조 공정으로서, 여기서 상기 맞춤형 면역 요법 조성물은 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 포함하고, 여기서 상기 리스테리아 균주는 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 서열을 포함하되, 상기 공정은
    a. 질환 또는 상태를 갖는 대상의 질병 샘플에서 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 수득 및 확인하는 단계;
    b. 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 약독화된 리스테리아 균주를 안정적으로 형질감염시키는 단계;
    c. 상기 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 상기 하나 이상의 펩티드를 발현하는 리스테리아 클론을 수득하는 단계;
    d. 상기 리스테리아 클론을 소정의 규모로 확장시키는 단계;
    e. 상기 확장된 리스테리아 클론을 정제하는 단계;
    f. 성장 배지를 제형화 완충액으로 대체하는 단계;
    g. 상기 리스테리아 클론을 수확하는 단계,
    h. 상기 수확된 리스테리아 클론을 소정의 농도를 갖는 용액 중에 희석하는 단계; 및
    i. 후속 저장 또는 대상에게 투여하기 위해, 상기 수확된 리스테리아 클론 용액을 단일 투여량 용기에 분배하는 단계를 포함하고,
    여기서 단계 d 내지 i는 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템에서 수행되는, 공정.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 접종 섹션, 발효 섹션, 농축 및 정용여과 섹션, 및 제품 분배 섹션을 포함하는 공정.
  3. 제2항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 생물처리 백, 환자 IV 백, 샘플링 백, 튜빙, 펌프, 밸브, 필터, 퀵 커넥터 및 센서를 추가로 포함하는 공정.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 모든 구성요소는 일회용인 공정.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 통합된 완전히 밀폐된 유체 유동 경로를 포함하는 공정.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통합된 완전히 밀폐된 유체 유동 경로는 사용 전 멸균되는 공정.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 접종 섹션은 하나 이상의 접종 백을 포함하는 공정.
  8. 제7항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 접종 섹션의 각각의 접종 백은 상기 발효 섹션에 작동가능하게 연결되는 공정.
  9. 제8항에 있어서, 상기 발효 섹션으로의 상기 연결은 멸균 용접기 또는 일회용 무균 커넥터에 의해 고정되는 공정.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 접종 백은 약 25 ml 내지 약 100 ml의 부피를 갖는 공정.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 발효 섹션은 하나 이상의 일회용 교반된 생물반응기를 포함하는 공정.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생물반응기는 일회용 웨이브-혼합된 백 생물반응기인 공정.
  13. 제11항에 있어서, 상기 생물반응기는 일회용 교반된 탱크 생물반응기인 공정.
  14. 제11항에 있어서, 상기 생물반응기는 일회용 기계적으로 진탕되는 생물반응기인 공정.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 발효 섹션은 하나 이상의 배양 백을 추가로 포함하는 공정.
  16. 제15항에 있어서, 각각의 배양 백의 부피는 500 ml을 초과하지 않는 공정.
  17. 제16항에 있어서, 각각의 배양 백은 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 접종 섹션 및 농축 섹션에 작동가능하게 연결되는 공정.
  18. 제17항에 있어서, 상기 연결은 멸균 용접기 또는 일회용 무균 커넥터에 의해 고정되는 공정.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 접종 및 발효 섹션은 특정 온도로 가온된 성장 배지로 충진되는 공정.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 농축 및 섹션은 필터, 펌프, 투과물 용기 또는 백 및 농축된 잔류물 용기 또는 백 중 하나 이상을 포함하는 공정.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 필터는 일회용 중공 섬유 필터인 공정.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 필터는 직렬로 작동가능하게 연결되는 공정.
  23. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 필터는 병렬로 작동가능하게 연결되는 공정.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 농축 섹션의 잔류물 용기는 발효 섹션의 배양 백 및 필터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 상기 잔류물 용기와 필터 사이의 연결은 재순환 루프를 형성하는 공정.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터가 투과물 용기에 추가로 작동가능하게 연결되는 공정.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 섹션 내의 유체의 유동은 상기 하나 이상의 펌프에 의해 작동되는 공정.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 리스테리아 클론의 상기 정제가 상기 확장된 리스테리아 클론을 농축 및 투과-막 압력 정용여과하여 달성되고, 여기서 상기 농축 및 정용여과는 상기 리스테리아 클론을 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 농축 섹션의 상기 일회용 중공 섬유 필터에 통과시킴으로써 달성되는 공정.
  28. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 제품 분배 섹션은 펌프, 벌크 백, 퍼지 백, 샘플링 백, 및 제품 백 중 하나 이상을 포함하는 공정.
  29. 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 제품 백은 단일 투여량 백인 공정.
  30. 제29항에 있어서, 상기 단일 투여량 제품 백은 IV 백인 공정.
  31. 제30항에 있어서, 상기 단일 투여량 제품 IV 백은 약 25 ml 내지 약 100 ml의 부피를 갖는 공정.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템의 상기 제품 분배 섹션의 상기 벌크 백은 상기 정용여과 섹션의 잔류물 백, 및 상기 하나 이상의 샘플링백, 퍼지 백, 및 제품 백에 작동가능하게 연결되는 공정.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 섹션 내의 유체의 유동은 상기 하나 이상의 펌프에 의해 작동되는 공정.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 상기 제품 백이 소정의 농도의 생 약독화된 조작된 리스테리아의 정제된 배양 균주로 충진되는 공정.
  35. 제34항에 있어서, 상기 하나 이상의 상기 제품 백은 충진된 직후 밀봉되고 치료를 위해 환자에 직접 전달되는 공정.
  36. 제34항에 있어서, 상기 제품 백은 충진된 직후 밀봉되고 후속 보관 또는 배송을 위해 동결되는 공정.
  37. 제36항에 있어서, 환자에 투여되기 직전에 상기 동결된 제품 백은 해동되고 상기 리스테리아는 재현탁되는 공정.
  38. 제2항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 중앙화된 구조를 갖고, 여기서 상기 발효 섹션의 상기 발효 백은 상기 농축 및 정용여과 섹션의 잔류물 및 투과물 용기로서, 그리고 제품 분배 섹션의 벌크 백으로서 독립적으로 기능하는 공정.
  39. 제38항의 중앙화된 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템으로, 상기 발효 백은 상기 시스템의 각각의 다른 구획에 작동가능하게 연결되고, 여기서 이러한 연결은 밀봉가능한, 중앙화된 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템은 바이오 후드 기반인 공정.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일회용 세포 성장 시스템은 단일 환자 규모의 세포 성장 시스템인 공정.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템이 다수의 대상을 위한 맞춤형 요법 조성물을 제조하도록 동시에 사용되는 공정.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 상기 완전히 밀폐된 일회용 세포 성장 시스템이 하나의 대상을 위한 다수의 맞춤형 요법 조성물을 제조하도록 동시에 사용되는 공정.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 요법 조성물의 안전성, 순도, 효능, 품질, 및 안정성의 특성분석을 추가로 포함하는 공정.
  45. 제44항에 있어서, 상기 특성분석은 상기 수확된 리스테리아 클론 용액을 단일 투여량 용기에 분배하는 단계 이전의 임의의 시점에 수행되는 공정.
  46. 제44항에 있어서, 상기 특성분석은 상기 수확된 리스테리아 클론 용액을 단일 투여량 용기에 분배하는 단계 후에 수행되는 공정.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 감염성 질환 또는 종양이나 암을 포함하는 공정.
  48. 접선 유동 여과 장치로,
    재순환 배출구;
    재순환 유입구; 및
    정용여과 유입구를 포함하는 잔류물 백;
    투과물 백;
    필터; 및
    순환 펌프를 포함하고;
    여기서, 제1 도관은 재순환 배출구에서 재순환 유입구 까지의 제1 유체 경로를 한정하고, 여기서 상기 제1 도관은 상기 잔류물 백, 순환 펌프, 및 필터를 유동적으로 연결해서, 상기 순환 펌프는 잔류물 백에서 필터까지 및 잔류물 백으로의 역으로 혼합물을 펌핑하도록 구성되고;
    여기서, 제2 도관은 상기 필터에서 상기 투과물 백으로까지의 제2 유체 경로를 한정하고, 여기서 상기 필터는 상기 혼합물의 적어도 일부를 상기 투과물 백 내로 이동하도록 구성되고;
    여기서 상기 재순환 배출구는 잔류물 배출구에 근접하여 한정되어서, 상기 잔류물 배출구는 상기 잔류물 배출구에 근접하는 잔류물 백의 혼합물을 혼합하도록 구성되는 장치.
  49. 제48항에 있어서, 제1 도관 상에 밸브를 추가로 포함하고, 여기서 상기 밸브는 제1 도관 내의 압력을 선택적으로 제어하도록 구성되는 장치.
  50. 제49항에 있어서, 상기 압력은 3 psi인 장치.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재순환 배출구, 재순환 유입구, 또는 정용여과 유입구 중 적어도 하나가 작동 위치에서 잔류물 백의 바닥 지점 또는 그에 근접하여 배치되는 장치.
  52. 제51항에 있어서, 상기 재순환 배출구 및 상기 정용여과 유입구는 상기 잔류물 백의 바닥 지점 또는 그에 근접하여 배치되는 장치.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물의 광학 밀도를 탐지하도록 구성된 적어도 하나의 광학 밀도 센서를 추가로 포함하는 장치.
  54. 제53항에 있어서, 상기 적어도 하나의 광학 밀도 센서가 상기 잔류물 백에 광학적으로 연결된 장치.
  55. 제53항에 있어서, 상기 적어도 하나의 광학 밀도 센서가 상기 투과물 백에 광학적으로 연결된 장치.
  56. 제53항에 있어서, 상기 적어도 하나의 광학 밀도 센서가 상기 제1 도관에 광학적으로 연결된 장치.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도관에 연결된 적어도 하나의 압력 센서를 추가로 포함하는 장치.
  58. 구축물의 제조 방법으로,
    제1 유체 및 구축물의 혼합물을 갖는 잔류물 백을 제공하는 단계;
    혼합물을 필터에 순환시켜서 구축물을 농축하는 단계로서,
    여기서 상기 필터는 투과물 백에 유체 연결되어서, 상기 필터는 제1 유체 통과 중 적어도 일부를 막에 통과시켜 상기 투과물 백에 진입하도록 지시하고 상기 혼합물의 나머지 부분을 잔류물 백에 되돌아 갈 수 있게 하는, 단계;
    제2 유체를 상기 혼합물의 나머지 부분에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고; 및
    제2 혼합물을 필터에 순환시켜서, 정용여과하는 단계로서,
    여기서 적어도 제2 혼합물은 유속으로 순환되고,
    여기서 상기 유속은 제2 혼합물의 적어도 부분적인 난류를 야기하고,
    여기서 상기 유속은 구축물의 전단이 거의 발생하지 않거나 전혀 발생하지 않는 경우 한정되는 것인, 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 구축물이 2배 농축되는 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 유속은 0.450 L/분 내지 0.850 L/분인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 유속은 0.650 L/분인 방법.
  62. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 필터에서 소정의 압력을 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 소정의 압력은 밸브를 제어해서 제1 혼합물 또는 제2 혼합물의 유동을 제한하는 것에 의해 유지되는 방법.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 부분적인 난류는 유체 도관 내의 필터 전후에 배치된 압력 센서에 의해 탐지되는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 압력 센서는 생물막 형성을 표시하는 높은 압력 차를 탐지하도록 구성되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 높은 압력 차에 반응하여 유속을 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전단은 하나 이상의 광학 밀도 센서에 의해 탐지되는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 하나 이상의 광학 밀도 센서는 제1 혼합물 또는 제2 혼합물의 광학 밀도의 변화를 탐지하는 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 하나 이상의 광학 밀도 센서가 투과물 백 내에 배치되는 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변화는 기준선 광학 밀도와 비교하여 탐지되는 방법.
  71. 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순환 펌프에 전기적으로 연결되어 유속을 제어하도록 구성된 유동 제어기를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제58항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 유속 센서를 추가로 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 유속 센서는 상기 필터의 상류에 배치된 제1 압력 센서 및 상기 필터의 하류에 배치된 제2 압력 센서를 포함하고, 여기서 최소 역치는 제1 압력 센서에 의해 탐지되는 제1 압력 및 제2 압력 센서에 의해 탐지되는 제2 압력 사이의 차이가 소정의 역치에 도달할 때 정의되는 방법.
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