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KR20180025969A - N- 및 o-글리코실화 패턴이 변이된 당단백질을 생성하는 세포 및 그의 방법 및 용도 - Google Patents

N- 및 o-글리코실화 패턴이 변이된 당단백질을 생성하는 세포 및 그의 방법 및 용도 Download PDF

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KR20180025969A
KR20180025969A KR1020187003915A KR20187003915A KR20180025969A KR 20180025969 A KR20180025969 A KR 20180025969A KR 1020187003915 A KR1020187003915 A KR 1020187003915A KR 20187003915 A KR20187003915 A KR 20187003915A KR 20180025969 A KR20180025969 A KR 20180025969A
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브이아이비 브이지더블유
우니베르지타이트 겐트
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Abstract

본 출원은 글리코 엔지니어링 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 엔도글루코사미니다제가 존재하면서 또한 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)에 결함이 있도록 제조된 진핵 세포에 관한 것이다. 통상적으로, 당단백질은 또한 세포내에 존재한다. 이들 세포는, 특히 가외의 효소를 첨가할 필요 없이, (외인성) 당단백질을 탈글리코실화하거나, 부분적으로 탈글리코실화하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 생성에서의 이들 세포의 적용을 위한 방법이 또한 제공된다.

Description

N- 및 O-글리코실화 패턴이 변이된 당단백질을 생성하는 세포 및 그의 방법 및 용도
본 출원은 글리코 엔지니어링 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 엔도글루코사미니다제가 존재하면서 또한 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)에 결함이 있도록 제조된 진핵 세포에 관한 것이다. 통상적으로, 당단백질 또한 세포내에 존재한다. 이들 세포는, 특히 가외의 효소를 첨가할 필요없이, (외인성) 당단백질을 탈글리코실화하거나, 부분적으로 탈글리코실화하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 생성에서의 이들 세포의 적용을 위한 방법이 또한 제공된다.
당단백질은 다수의 생물학적 이벤트, 예를 들어 세포 부착, 종양 전이, 병원체 감염 및 면역 반응에서 중요한 역할을 담당하는 주요 생체분자 종류이다. 대부분의 포유류 세포 표면 단백질 및 인간 혈청 단백질은 당단백질이며, 치료적 당단백질이 주요 생물공학 산물의 종류임은 놀라운 일이 아니다. 이들은 특히, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 인터루킨-2, 적혈구생성소(EPO) 및 항체를 포함한다. 천연 당단백질 및 재조합 당단백질 둘 모두는 통상적으로, 부속 올리고당의 구조만이 상이한 글리코형의 혼합물로서 생성된다. 이러한 글리코실화의 이종성은, 당단백질 약물의 개발뿐만 아니라, 당단백질의 구조 연구 및 기능 연구(예를 들어, 결정화 연구)에서의 주요한 문제이다. 부착된 당 사슬은 당단백질의 단백질 접힘, 안정성, 작용, 약동학 및 혈청 반감기에 현저한 영향을 미치며, 일부 당 사슬은 매우 면역원성이다.
글리코실화는 진핵생물에서 단백질의 가장 흔한 번역후 변형 중 하나이다. N-글리코실화는, 진핵생물에서 생존에 필수적인 고도로 보존된 대사 과정이다. 단백질 N-글리코실화는 소포체(ER)에서 유래하며, 여기서, 돌리콜(지질 담체 중간체)에 조립된 N-연결 올리고당(Glc3Man9GlcNAc2)이 신생 단백질의 적절한 아스파라긴 잔기(Asn)에 전달된다. 이는 모든 진핵생물 유기체에서 대체로 공통적인 공동번역 이벤트이다. 3개의 글루코스 잔기 및 하나의 특이적 α-1,2-연결 만노스 잔기는 ER에서 특이적 글루코시다제 및 α-1,2-만노시다제에 의해 제거됨으로써, 코어 올리고당 구조인 Man8GlcNAc2가 생성된다. 이러한 코어 당 구조를 가진 단백질은 골지체로 수송되어, 당 모이어티에 다양한 변형이 이루어지게 된다. 글리코실전달효소 및 만노시다제는 ER 및 골지체의 내부(내강) 표면에 정렬됨으로써, 당단백질이 ER 및 골지망을 통해 진행됨에 따라, 당단백질이 순차적으로 처리될 수 있도록 하는 촉매 표면이 제공된다. 시스, 중간 및 트랜스 골지 및 트랜스 골지망(TGN)의 다수 구획은, 일련의 서열의 글리코실화 반응이 발생할 수 있는 상이한 장소들을 제공한다. 당단백질이 ER에서 합성되어, 후기 골지 또는 TGN에서 완전히 성숙될 때까지, 진행됨에 따라, 당단백질이 상이한 글리코시다제, 만노시다제 및 글리코실전달효소에 순차적으로 노출됨으로써, 특이적 N-글리칸 구조가 합성될 수 있다. 하등 진핵생물과 고등 진핵생물 사이에는 골지체의 당 사슬의 변형에 현저한 차이가 존재한다.
고등 진핵생물에서, N-연결 올리고당은 통상적으로, 효모에서 생성된 것들과 현저히 다른 구조의 복합 혼합(혼성) 유형인 고 만노스(high mannose)이다(문헌[Kornfeld et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664(1985)]). 포유류 세포에서, 당 사슬의 변형은 첨가된 단백질 모이어티에 따라 3개의 상이한 경로를 따를 수 있다. 즉, (1) 코어 당 사슬이 변화되지 않는 경우; (2) 코어 당 사슬에서 만노스의 6-위치에 UDP N-아세틸-글루코사민(UDP-GlcNAc)에서 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 모이어티(GlcNAc-1-P)가 첨가된 후, GlcNAc 모이어티가 제거되어, 당단백질에 산성 당 사슬이 형성됨으로써, 코어 당 사슬이 변화되는 경우; 및 (3) 골지 α-만노시다제 I에 의해 3개의 만노스 잔기가 제거됨으로써, 코어 당 사슬이 우선 Man5GlcNAc2로 전환된 후; GlcNAc가 첨가되고, 추가로 2개의 만노스 잔기가 제거된 후, GlcNAc, 갈락토스(Gal), GalNAc, 푸코스 및 N-아세틸뉴라민산(또한, 시알산(NeuNAc)으로 일컬어짐)이 순차적으로 첨가됨으로써, Man5GlcNAc2가 추가로 변형됨에 의해, 다양한 혼성 또는 복합 당 사슬이 형성되는 경우가 있다(문헌[R. Kornfeld and S. Kornfeld, 1985; Chiba et al., 1998]). 상이한 유기체는, 고등 진핵생물 숙주에 따라 당 측쇄의 최종 조성이 현저히 다를 수 있도록 상이한 글리코실화 효소(글리코실전달효소 및 글리코시다제) 및 상이한 글리코실 기질을 제공한다. 통상적으로, 동물 당단백질의 단백질 N-글리칸은 비-, 트리- 또는 테트라-안테나 구조를 가진다. 이러한 분지쇄 구조는 올리고당 잔기의 영역으로 GlcNAc 전달효소-촉매에 의해 GlcNAc가 첨가됨으로써 합성된다. 이것의 형성 후, 안테나 구조는 Gal, GalNAc, GlcNAc, 푸코스(Fuc) 및 시알산 잔기를 포함한 상이한 당에 의해 종결된다.
효모 및 사상 균류(하등 진핵생물)에서, Man8(9)GlcNAc2 구조의 일부만이 (부분적으로) Man5GlcNAc2로 전지(trimming)된다. 이어서, 이러한 올리고당은 디에스테르 연결에서 만노스 및/또는 만노스포스페이트 잔기의 첨가를 통해 균류 특이적 글리칸으로 추가로 변형될 수 있다. 생성된 글리칸은 "고-만노스" 유형의 글리칸 또는 만난으로 공지되어 있다. 예를 들어, 효모 당펩타이드는 9 내지 13개의 만노스 잔기의 고 만노스 코어 또는 최대 200개의 잔기로 이루어진 연장된 분지형 만난 외부 사슬로 이루어진 올리고당 구조를 포함한다(문헌[Ballou,et al., Dev. Biol. 166: 363-379(1992); Trimble et al., Glycobiology 2: 57-75(1992)]).
치료용 당펩타이드 및 당단백질의 제조를 위한 새로운 전략의 확인 및 최적화에 상당한 노력이 기울여 지고 있다. 많은 유망한 방법들 중에서 가장 많이 보고된 접근법은 예상컨대, 요망되는 글리코실화 패턴을 갖는 당펩타이드를 생성하도록 세포 숙주를 엔지니어링하는 것일 것이다. 이것이 특히 효모에서 어떻게 달성될 수 있는지에 대한 최근의 검토를 위해, 문헌[Wildt et al., Nature reviews 2005, 119-28; 및 Hamilton et al., Curr Opin Biotechnol. 2007; 18(5):387-92]을 참조한다. 다른 예시적인 방법은 화학적 합성, 효소적 합성, 형성된 당펩타이드의 효소적 리모델링 및 물론 이들 기술 중 하나 이상의 혼성 또는 조합인 방법을 포함한다.
세포 숙주계와 관련하여, 원칙적으로, 포유류, 곤충류, 효모, 균류, 식물 또는 원핵 세포 배양계가 대부분의 치료용 및 다른 당펩타이드를 상업적으로 실현 가능한 양으로 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 실제로, 재조합적으로 생성된 단백질에서 요망되는 글리코실화 패턴은 달성되기가 어렵다. 예를 들어, 박테리아는 돌리콜 경로를 통해 N-글리코실화되지 않고, 효모만이, 일반적으로 인간에서 다량으로 발견되지 않으며, 간에 존재하는 대식세포에 의해 능동적으로 제거되는 올리고만노스-유형의 N-글리칸을 생성한다. 유사하게는, 식물 세포는 인간 당펩타이드의 공통 구성성분인 시알릴화된 올리고당을 생성하지 않는다. 추가로, 식물은 단백질 N-글리칸에 자일로스 및/또는 α-1, 3-연결 푸코스를 첨가함으로써, 동물 유래의 것의 구조와 상이하고, 포유류에서 면역원성인 당단백질을 생성한다(문헌[Lerouge et al., Plant Mol Biol. 1998; 38(1-2):31-48; Betenbaugh et al., Curr Opin Struct Biol. 2004; 14(5): 601-6; Altmann, Int Arch Allergy Immunol. 2007;142(2):99-115]). 최근 검토된 바와 같이, 재조합 포유류 당펩타이드의 생성에 현재 이용 가능한 곤충 세포계의 경우, 포유류에서 생성될 때, 통상적으로 발견되는 것과 동일한 글리칸에 의한 당펩타이드가 생성되지 않는다(문헌[Harrison and Jarvis, 2006, 159]). 더하여, 재조합 당펩타이드의 글리코실화 패턴은 상이한 세포 배양 조건하에서 생성된 경우(문헌[Watson et al. Biotechnol. Prog. 10: 39-44(1994); and Gawlitzek et al., Biotechnol. J. 42: 117-131(1995)]), 또는, 심지어 2개의 상이한 생물반응기에서 명목상 동일한 세포 배양 조건하에서 생성된 당펩타이드들 간에도 상이할 수 있다(문헌[Kunkel et al., Biotechnol. Prog. 2000: 462-470(2000)]).
따라서, 당업계의 상당한 진보에도 불구하고, 글리코실화의 이종성이 여전히 문제로 남아 있다. 재조합적으로 생성된 당펩타이드의 글리코실화에서의 이종성은 세포 기전(예를 들어, 글리코실전달효소 및 글리코시다제)이 종마다, 세포마다, 또는 심지어 개체마다 다를 수 있기 때문에 발생한다. 다양한 효소에 의해 인식되는 기질은 글리코실화가 일부 부위에서 발생하지 않거나, 천연 단백질로부터 크게 변형될 수 있을 정도로 충분히 상이할 수 있다. 이종성 진핵 숙주에서 생성된 재조합 단백질의 글리코실화는 종종 천연 단백질과 상이할 수 있다. 치료용 당단백질은 통상적으로, 동일한 펩타이드 백본을 가졌으나, 글리코실화의 성질 및 부위 둘 모두가 상이한 글리코형의 혼합물로서 세포 배양계에서 생성된다. 글리코실화의 이종성은 당단백질의 정제, 효능뿐만 아니라, 치료 안전성에 상당한 난점을 부여한다. 세포 및/또는 글리코 엔지니어링 및 일부 생화학적 변형은, 우세한 글리코형을 가지나, 대부분의 경우, 천연적으로 발현된 당단백질과 같이, 얻어진 구조가 이종성을 유지하는 재조합 당단백질을 생성하는 세포 또는 (예를 들어, 효모) 균주를 생산한다. 주목할 점은, 상이한 글리코실화 형태는 주어진 단백질의 특성에 상당히 상이한 영향을 발휘할 수 있으며, 일부 글리코형은 심지어 알레르기 문제 및 바람직하지 않은 면역 반응을 야기할 수 있다. 예를 들어, 효모에서 정상적으로 생성되는 고 만노스 유형의 당단백질의 경우 특히 그러하다. 이러한 글리코실화 형태의 혼합물로부터 특정 글리코실화 상태를 갖는 당단백질의 단리는 극히 어렵다. 그러나, 소량의 불순물이 관심대상 당단백질의 요망되는 활성을 극적으로 방해할 수 있으므로, 이러한 억제 또한 매우 바람직하다.
이에 대한 해결책이 최근 WO 2010/015722 및 문헌[Meuris et al.(Nat Biotechnol. 2014 32(5):485-9)]에서 제안된 바 있다. 글리코결실이라 일컬어지는 보고된 글리코엔지니어링 전략은 포유류 세포에서 골지 N-글리코실화 경로를 단축시킨다. 이러한 단축은 천연의 포유류 세포 당단백질과 비교하여, 작고, 시알릴화된 3당류 N-글리칸을 가지며, 복합성이 감소된 단백질의 발현을 야기한다. 글리코결실 엔지니어링은 단백질 접힘에서 N-글리칸의 기능을 방해하지 않으며, 글리코결실에 의해 변형된 세포의 생리는 야생형 세포와 유사하다.
그러나, 글리코실화의 이종성은 당단백질에 부착된 N-연결 당뿐만 아니라, O-글리칸에서도 유래한다. 이러한 탄수화물 사슬은 매우 다양하지만, 뮤신 유형의 O-글리코실화가 가장 일반적이다. 엔도글루코사미니다제와는 달리, O-글리칸을 제거하는 효소는 존재하지 않는다.
트리만노실 코어를 모두 공유하는 N-글리칸과는 달리, 뮤신 유형의 O-글리칸은 구조적으로 거의 공통점이 없다. 포유류 세포의 경우, 세린 또는 트레오닌과의 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 연결에서 뮤신 유형의 O-글리코실화가 개시된다. GalNAc은 상이한 뮤신 유형의 O-글리칸의 유일한 공통 잔기이다. 공여체로서 UDP-GalNAc를 사용하는 골지체의 GalNAc 전달효소의 계열에 의해 촉매되는 다양한 단당류에 의한 이들 개시 잔기의 추가 연장이 매우 다양한 올리고당 집합을 야기한다.
따라서, 당단백질 집합에 상동성(동질성(uniform)) 글리코실화를 제공하는 세포계 또는 합성 방법을 가질 필요가 있다. 바람직하게는, 이러한 방법은 N- 및 O-글리코실화가 결여된 당단백질을 야기한다. 이렇게 얻어진 당단백질은 직접적으로 또는 후속 트랜스글리코실화를 위한 개시점으로서 사용될 수 있다.
본 출원의 주요 목적은 비용 및 시간 둘 다의 면에서 경제적인, 요망되는 글리코실화 프로파일의 당단백질을 얻는 시스템 및 방법을 제공하는 것이다. 이러한 방법은, 원치않는 글리코실화 산물을 제거하기 위해, 생성된 당단백질에 효소를 첨가할 필요가 없으므로, 기존의 방법보다 저렴하고, 빠를 수 있다. 이러한 세포 및 방법은 N- 및 O-글리코실화를 모두 다룬다. 이는, 내인성 GalE의 발현 및/또는 활성에 결함이 있는 세포에서 엔도글루코사미니다제 효소를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 당단백질(또는, 당단백질의 중간체 글리코형의 본질적으로 상동성인 글리코실화된 집합)의 올바른 글리코실화는 동일한 세포계에서 당단백질을 생성함으로써 달성된다.
따라서, 제1 양태에 따르면, 하기의 것이 제공된다: 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있는 진핵 세포. 이러한 진핵 세포는 당단백질을 인코딩하는 제2의 외인성 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 이러한 진핵 세포는 내인성 엔도글루코사미니다제 효소를 발현하지 않는다.
특정 구현예에 따르면, 이러한 진핵 세포는 포유류 세포, 특히 Hek293 세포 또는 CHO 세포이다.
특정 구현예에 따르면, 엔도글루코사미니다제는 특히 만노실-당단백질 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제(E.C. 3.2.1.96), 특히 엔도 T(Endo T)이다. 엔도글루코사미니다제는 ER 또는 골지 위치화 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
당단백질은 세포에 의해 분비될 수 있다.
외인성 엔도글루코사미니다제에 의한 세포막 성분의 매우 강력한 탈글리코실화가 세포막을 약화시킴으로써, 궁극적으로 세포 용해를 야기할 것으로 예상되므로, 이러한 전략의 작용은 특히 놀라운 것이다. 효모 세포벽의 만노단백질의 탈글리코실화의 경우, 특히 그러하다. 추가로, 세포에서 또한 O-글리코실화가 결핍되어 있다는 사실은, 세포의 모든 당단백질이 단지 단일 GlcNAc 변형만을 가진다는 것을 의미한다. 세포가 여전히 생존하고, 세포에서 당지질을 함유하는 모든 갈락토스가 결핍됨에 따른 명백한 성장 결함이 나타나지 않으며, 외인적으로 생성된 당단백질의 수율에 불리한 점이 나타나지 않는다는 것은 특히 놀랍다.
본 출원에서는, 본 명세서에 기재된 세포를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 특히, 진핵 세포에서 O-글리코실화가 또한 결핍된 단일 GlcNAc 변형된 단백질을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
- 엔도글루코사미니다제 효소 및 당단백질의 발현에 적합한 조건하에서, 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있고, 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1의 외인성 핵산 서열을 포함하며, 당단백질을 인코딩하는 제2의 외인성 핵산 서열을 포함하는 진핵 세포를 제공하는 단계; 및
- 당단백질을 엔도글루코사미니다제와 세포내 또는 세포외에서 접촉시킨 후, 당단백질을 회수하는 단계.
엔도글루코사미니다제와의 세포내 접촉은 특히 골지 또는 ER에서 발생할 수 있다.
본 방법은, 당단백질이 엔도글루코사미니다제에 의해 세포내 또는 세포외에서 처리된 후, 당단백질을 글리코실전달효소에 의해 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도 1: (A) 293 GalE KO 생성 단백질 및 (B) 293글리코이중결실 생성 단백질에서 발견되는 통상의 N-글리칸
도 2: GalE 유전자의 처음 4개의 엑손의 부호 표시 및 3개의 가이드의 위치(일정한 축척이 아님)
도 3: 3개의 상이한 가이드에 의한 GalE 유전자의 단편의 시험관내 분해. 3개의 가이드는 모두 예상된 분자량에서 밴드를 나타낸다. 낮은 분자량에서의 강한 신호는 시험관내에서 생성된 가이드 RNA이다.
도 4: CRISPR/Cas9 가이드 1(G1), 가이드 2(G2) 및 가이드 3(G3)에 의해 처리된 세포로부터 유래한 DNA에 대한 서베이어 분석. NC는 WT 세포로부터의 음성 대조군이다.
도 5: 상단의 천연 서열에 대한 상이한 생어 서열분석 판독결과의 정렬('상이한 클론'으로 배정됨). 가이드 3의 위치는 도면 상단의 선으로 나타내었다. 돌연변이 서열내의 삽입결실은 박스로 표시된다. 대부분의 판독결과는 상이한 대립유전자에서의 상이한 편집으로 인해, 다수의 트랙으로 구성된다.
도 6: HEK293글리코결실 세포(GD), HEK293 세포 및 상이한 HEK293GalE-/- 클론에서 발현된 hGM-CSF. HEK293은, hGM-CSF가 여전히 전체 크기의 N-글리칸뿐만 아니라, O-글리칸을 보유하는 대조군이다. HEK293GD 세포(GD 레인)에서, N-글리칸은 작고 상동성이며, 잔류 스미어링은 O-글리칸으로 인한 것이다. HEK293GalE-/- 발현에서 관찰되는 3개의 개별 밴드는 높은 분자량에서 낮은 분자량 순으로, 2개의 점유된 N-글리코실화 부위가 장착된 hGMCSF, 1개의 점유된 N-글리코실화 부위가 장착된 hGMCSF 및 점유된 N-글리코실화 부위가 부재하는 hGMCSF에 상응한다. UDP-Gal 및 UDP-GalNAc의 결핍으로 인해, N-글리칸 이종성은 또한 예상컨대, HEK293-생성 hGM-CSF와 비교하여, 감소될 것이다.
도 7: 293글리코결실 세포(GD), HEK293 세포 및 가능한 HEK293글리코이중결실 클론으로부터의 샘플에서 발현된 hGM-CSF(A, B 및 N으로 표시됨). N으로 표시된 레인은, 여전히 기능성 GalE를 발현하는 클론으로부터의 hGM-CSF이다. B로 표시된 레인은, GalE KO가 성공적이나, 엔도T 처리 수준이 더 낮은 클론으로부터의 hGM-CSF이다. A로 표시된 레인은, GalE KO가 성공적이면서 상대적으로 높은 엔도T N-글리칸 처리 수준의 클론으로부터의 hGM-CSF이다. 별표 표시된 클론은 추가의 특성화를 위해 선택된 것이었다.
도 8: 트립신 처리된 hGM-CSF의 MALDI-TOF 분석. 트립신 처리에 의한 펩타이드 SPSPSTQPWEHVNAIQEAR(2134 Da)는 4개의 가능한 O-글리코실화 부위를 함유한다. HEK293(상단 스펙트럼) 및 HEK293글리코결실 세포(제2 스펙트럼)에서, 본 발명자들은 이러한 펩타이드에 부착된 다양한 유형의 O-글리칸을 검출하였다. HEK293GalE-/-(제3 스펙트럼) 및 HEK293글리코이중결실(하단 스펙트럼) 세포주로부터의 hGM-CSF 둘 모두에서, 이들 피크는 부재하며, 단지 네이키드 펩타이드(naked peptide)만이 검출된다.
도 9: HEK293글리코결실 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 발현된 hGM-CSF로부터의 시알리다제 처리된 LLNLSR 펩타이드의 MALDI-TOF 스펙트럼. 비글리코실화된 펩타이드는 715 Da의 분자량을, Asn-GlcNAc 장착 펩타이드는 918 Da의 분자량을, Asn-GlcNAc-Gal 당펩타이드는 1080 Da의 분자량을 갖는다.
도 10: 무손상 hGM-CSF의 상이한 글리코형의 MALDI-TOF 스펙트럼. HEK293 생성 hGM-CSF는, 이종성 N- 및 O-글리코실화로 인해 스펙트럼 전반에 걸쳐 스미어링된다(상단 스펙트럼). HEK293GalE-/- hGM-CSF(제2 스펙트럼)는 O-글리코실화가 결핍되고, 단지 N-글리칸으로 인한 이종성만을 나타내고, HEK293글리코결실 hGM-CSF(제3 스펙트럼)는 감소된 N-글리칸 이종성을 나타내나, 이종성 O-글리칸으로 인해, 여전히 스미어링된다. 마지막 스펙트럼에서, HEK293글리코이중결실 hGM-CSF의 신호는, 2개의 추정 N-글리코실화 부위에서 GlcNAc가 부재하는 hGM-CSF, 1개의 GlcNAc를 보유하는 hGM-CSF 및 2개의 GlcNAc를 보유하는 hGM-CSF에 상응하는 3개의 피크에 집중된다. 16844 Da의 m/z에서, 올리고만노스 N-글리칸이 장착된 hGM-CSF의 분자량에 상응하는 작은 피크가 관찰된다.
도 11: HEK293GalE-/- 세포에서 생성된 무손상 hGM-CSF의 MALDI-TOF 스펙트럼(상단 스펙트럼). 샘플의 PNGaseF 처리는 N-글리칸의 불완전한 제거를 야기한다(하단 스펙트럼).
도 12: HEK293글리코이중결실 세포에서 생성된 무손상 hGM-CSF의 MALDI-TOF 스펙트럼(상단 스펙트럼). PNGaseF에 의한 처리시, 16844의 m/z의 피크는 완전히 분해되었다.
도 13: 본 발명자들이 HEK293로부터 유도한 상이한 세포주, 그의 가능한 N- 및 O-연결 글리칸 및 이러한 상이한 세포주에서 발현된 hGM-CSF의 이종성에 대한 이러한 엔지니어링 결과의 개괄.
도 14: HEK293글리코결실, HEK293GalE 및 HEK293글리코이중결실에서 생성된 무손상 hGM-CSF의 QTOF MS 분석. 스펙트럼은 도 10에서 관찰되는 데이터와 일치한다.
도 15: HEK293(레인 1), HEK293GalE-/-(레인 2), HEK293글리코결실(레인 3), 및 HEK293글리코이중결실(레인 4) 세포에서 안정하게 발현된 hEPO-His6의 SDS-PAGE 및 His-태그-특이적 웨스턴 블롯 분석. 뚜렷한 분자량 변화를 관찰할 수 있다. 이는 HEK293글리코결실 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 N-글리칸의 감소 및 HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 O-글리칸의 부재에 상응한다.
도 16: ESI-LC-MS 질량 분광계에 의해 분석된 트립신 처리된 hEPO-His6의 MS1 스펙트럼. 트립신 처리에 의한 펩타이드 EAISPPDAASAAPLR은 2개의 가능한 O-글리코실화 부위를 함유한다. HEK293 및 HEK293글리코결실 세포에서 생성된 hEPO로부터 유래한 트립신 처리에 의한 펩타이드에서, 두 부위 모두 실제로 O-글리칸에 의해 점유되었다. HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 생성된 hEPO-His6에서는, 단지 네이키드 펩타이드만이 검출된다.
도 17: HEK293(레인 1), HEK293GalE-/-(레인 2), HEK293글리코결실(레인 3), 및 HEK293글리코이중결실(레인 4) 세포에서 안정하게 발현된 에타너셉트(etanercept)의 웨스턴 블롯 분석. 뚜렷한 분자량 변화를 관찰할 수 있다. 이는 HEK293글리코결실 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 N-글리칸의 감소 및 HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 O-글리칸의 부재에 상응한다.
도 18: HEK293, HEK293GalE-/-, HEK293글리코결실, 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 발현된 RSV-G의 SDS-PAGE 및 RSV-G-특이적(토끼-항-RSV-G) 웨스턴 블롯 분석. Non = 비형질감염된 세포; WT = 야생형 RSV-G 단백질을 인코딩하는 벡터에 의해 형질감염된 세포.
정의
본 발명은 특정 구현예의 관점에서, 특정 도면을 참조로 하여 기재될 것이나, 본 발명은 그에 의해 제한되지 않으며, 단지 청구범위에 의해 제한된다. 청구범위의 임의의 참조 부호는 본 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 도시된 도면은 단지 개략적인 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니다. 도면에서, 예시 목적을 위하여 일부 요소의 크기는 과장된 것일 수 있으며, 일정한 축척으로 도시되지 않을 수 있다. 용어 "~를 포함하는"이 본 기재내용 및 청구범위에 사용되는 경우, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 단수 명사의 지칭시, 부정관사 또는 정관사, 예를 들어 단수형 ("a" 또는 "an", "the")이 사용되는 경우, 이는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 상기 명사의 복수형을 포함한다.
추가로, 본 기재내용 및 청구범위의 용어 제1, 제2, 제3 등은 유사한 요소 사이를 구별하기 위해 사용되며, 필연적으로, 순차 또는 발생 순서를 기재하는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적절한 상황하에 상호교환 가능하며, 본 명세서에 기재된 본 발명의 구현예는 본 명세서에 기재되거나 예시된 것 이외의 다른 순서로 작동될 수 있음이 이해되어야 한다.
하기 용어 또는 정의는 단지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 명세서에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 용어는 당업자가 인식하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 당업계의 정의 및 용어에 관하여, 실무자는 특히 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York(2012); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 114), John Wiley & Sons, New York(2016)]을 참조한다. 본 명세서에서 제공되는 정의는 당업자가 이해하는 바보다 더 적은 범위를 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 출원에 사용되는 바와 같은 '글리코 엔지니어링된 효모 세포'는, 야생형 효모에서 발현되지 않는 복합 글리코실화에 필요한 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 발현하고/하거나, 야생형 효모에서 정상적으로 발현되는 고-만노스 유형의 구조의 생성에 관여하는 적어도 하나의 효소를 발현하지 않는 효모 세포이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 '엔도글루코사미니다제'는 당단백질 또는 당지질의 올리고당 및 그의 아글리콘의 비말단 베타-연결 N-아세틸글루코사민 잔기의 아노머 탄소 간의 결합을 가수분해함으로써, 당단백질 또는 당지질 또는 당 중합체로부터 단당류 또는 올리고당을 방출시키는 효소를 지칭한다. 엔도글루코사미니다제는 글리코시다제의 하위세트이며, (예를 들어, 글리코실전달효소 활성과 같은) 다른 효소적 활성을 갖거나, 갖지 않을 수 있다. 생화학 및 분자 생물학 국제 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(IUBMB) 명명법에서 EC 3.2.1.96으로서 지정된 특정 종류의 엔도글루코사미니다제는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 또는 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제에 의해 형성된다. 이러한 특정 종류의 효소는 -[Man(GlcNAc)2]Asn- 구조를 함유하는 고-만노스 당펩타이드 및 당단백질의 N,N'-디아세틸키토비오실 단위의 내부가수분해(endohydrolysis)를 촉매할 수 있다. 하나의 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc) 잔기는 단백질에 부착된 채로 있으며; 나머지 올리고당은 손상되지 않은 채 방출된다. 따라서, 결과물은 단일 GlcNAc-변형된 당단백질이다. 주목할 점은, 잔류 GlcNAc 잔기는 가수분해 결합 이외의 다른 위치의 다른 당 잔기에 의해 여전히 변형되거나, 비변형될 수 있으며, 예를 들어, GlcNAc 잔기는 위치 3 또는 6에서 푸코스를 보유할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 변형된 GlcNAc 잔기를 갖는 당단백질은, GlcNAc 잔기의 위치 4에 제2의 당 잔기가 존재하지 않으므로(즉, 통상적인 당 사슬이 존재하지 않으므로), 단일 GlcNAc-변형된 단백질로 여전히 지칭될 것이다. 엑소글리코시다제와 비교하여, 엔도글루코사미니다제의 특정 이점은, 이들이 N-연결 글리칸과 O-연결 글리칸 사이 및 글리칸 종류들 사이의 구별을 가능하게 한다는 것이다. 엔도글루코사미니다제의 비제한적 목록이 본 출원에서 제공된다.
특히, 글리코 엔지니어링된 효모 세포와 관련하여, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 '복합 글리코실화에 필요한 효소'는, 고등 진핵생물에서 발견되는 것, 특히, 포유류에서 발견되는 것, 특히 인간에서 발견되는 것과 같이, 복합 글리칸의 합성에 관여할 수 있는 숙주 효모 세포에서 천연으로 발생하지 않는 임의의 효소를 지칭한다. 가장 구체적으로, 이러한 효소는, 당 사슬로부터 만노스 잔기를 제거하는 효소(즉, 만노시다제) 또는 글리코실전달효소, 특히, 만노실전달효소(즉, 고-만노스 글리칸에서 발견되지 않는 단당류를 전달하는 글리코실전달효소) 이외의 글리코실전달효소 및/또는 포스포만노실전달효소이다.
본 출원에 사용되는 바와 같은 '글리코실전달효소'는, 생화학 반응에서 글리코실기의 전달, 특히 아스파라긴-연결 당 잔기로의 글리코실 전달을 촉매함으로써, N-연결 당단백질을 제공하는 임의의 그룹의 효소이다. IUBMB 명명법에서 EC 2.4하에 등재된 글리코실전달효소인 특정 종류의 글리코실전달효소는 헥소실전달효소(EC 2.4.1)이다. 당단백질로 펩타이드를 처리하는 이러한 광범위한 번역후 효소 중에는, N-아세틸글루코사미닐 전달효소, N-아세틸갈락토사미닐전달효소, 시알릴전달효소, 푸코실전달효소, 갈락토실전달효소, 및 만노실전달효소와 같은 효소가 있으며, 이에 제한되지 않는다.
외인성 만노실전달효소는 본 출원에 기재된 글리코 엔지니어링된 효모 세포의 특정 구현예에서 배제된다는 것에 유의한다. 본 출원에 사용되는 바와 같은 '만노실전달효소'는, 골지체에서 억셉터 분자, 통상적으로는 또 다른 탄수화물로의 만노실기의 전달을 촉매하는 효소를 지칭한다. 만노실전달효소는 통상적으로 효모의 내인성 효소이며, 고-만노스 유형의 글리칸의 합성에 관여한다.
효소는 엔도글루코사미니다제 및 글리코실전달효소 활성 둘 모두를 보유할 수 있다는 점을 주목한다. 이러한 2개의 활성을 발휘하는 하나의 효소를 사용하는 것이 가능하다 할지라도, 통상적으로는, 사용 효소는 단지 하나의 기능을 충족시킬 것이다. 따라서, 하나의 기능만을 수행할 것을 확실히 하기 위해, 변형되거나, 돌연변이되거나, 특이적 기능을 더욱 효율적으로 실행할 것이 보장되도록 변형되거나, 돌연변이된 효소의 사용이 고려된다. 이러한 변형 효소는 당업계에 공지되어 있다.
본 출원에 사용되는 바와 같은 '당단백질'은, 정상적인 생리적 상황 및/또는 기능적 형태에서, 그의 폴리펩타이드 측쇄에 공유적으로 부착된 올리고당 사슬(글리칸)을 함유하는 단백질을 지칭한다. 이러한 탄수화물은 공동번역 또는 번역후 변형에서 단백질에 부착될 수 있다. 특히, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 당단백질은, 생리적 활성 형태에서 N-글리코실화를 나타내는 단백질이다. 따라서, 당단백질은 통상적으로 적어도 하나의 아스파라긴 잔기에 당 사슬을 함유한다. 당단백질의 비제한적 목록이 본 명세서에서 제공된다. 용어 '당단백질'은 아미노산 사슬의 길이를 지칭하는 것으로 의도되지 않으며, '당펩타이드'는 '당단백질'의 정의 내에 포함된다.
본 출원에 사용되는 바와 같은 용어 '(당)단백질' 및 '효소'(예를 들어, 엔도글루코사미니다제, 글리코실전달효소, 만노시다제, 만노실전달효소)는 또한, 천연 유래의 단백질의 기능적으로 활성인 단편 및 변이체를 포함하는 것으로 의도된다. 실제로, 많은(예를 들어, 치료용) 단백질의 경우, 단백질의 일부분은 (예를 들어, 치료적, 효소적) 효과를 달성하기에 충분한 것일 수 있다. 이는 변이체(즉, 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었으나, 기능을 보유하거나, 심지어 개선된 기능을 나타내는 단백질), 특히 효소적 활성을 위해 최적화된 효소의 변이체에 적용된다.
본 출원의 맥락상, 당단백질은 단백질 자체를 지칭하며; 당단백질은 글리코실화된 형태 또는 비글리코실화된 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있다. '글리코실화된' 단백질은, 적어도 하나의 올리고당 사슬을 보유하는 (당)단백질이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 '당 사슬', '올리고당 사슬' 또는 '탄수화물 사슬'은 2개 이상의 단당류의 사슬이다. 결과적으로, 단일 단당류(예를 들어, 단일 GlcNAc 잔기)만을 보유하는 단백질은 일반적으로, 달리 명시되지 않는 한, 글리코실화된 단백질로 지칭되지 않으나, 단당류를 보유하는 단백질 또는 단당류(예를 들어, GlcNAc)-변형된 단백질로 지칭될 것이다. 당단백질의 올리고당 사슬에 포함될 수 있는 통상적인 단당류는 글루코스(Glu), 갈락토스(Gal), 만노스(Man), 푸코스(Fuc), N-아세틸뉴라민산(NeuAc) 또는 또 다른 시알산, N-아세틸글루코사민(GlcNAc), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 자일로스(Xyl) 및 그의 유도체 (예를 들어, 포스포유도체)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당 사슬은 분지형이거나, 그렇지 않을 수 있으며, 하나 이상의 유형의 올리고당을 포함할 수 있다. 일반적으로, N-연결 글리코실화의 당 사슬은 3가지 유형으로 분류될 수 있다: 고-만노스, 복합 및 혼성 유형의 글리코실화. 이들 용어는 당업자에 잘 인식되어 있으며, 본 문헌에 정의되어 있다. 간략하게 말하면, 고-만노스 유형의 글리코실화는 통상적으로, (가능한 많은) 만노스 및/또는 만노실포스페이트 잔기(그러나, 통상적으로 다른 단당류는 부재함)를 가진 2개의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 올리고당 사슬을 지칭한다.
복합 글리코실화는 통상적으로, 가장 흔하게는 내부 코어 구조 Man3GlcNAc2에 연결되어 있고, 시알릴락토사민 서열을 가지며, 통상적으로 1, 2개 이상(예를 들어, 최대 6개)의 외부 분지쇄를 갖는 구조를 지칭한다. 예를 들어, 복합 N-글리칸은 적어도 하나의 분지쇄 또는 적어도 2개의 분지쇄의 교차하는 GlcNAc 및 갈락토스(Gal) 잔기를 가질 수 있으며, 다양한 올리고당으로 종결될 수 있으나, 통상적으로 만노스 잔기에 의해 종결되지 않는다.
혼성 유형의 글리코실화는 중간체 형태, 즉, 2개의 N-아세틸글루코사민 잔기에 더하여, 말단 만노스 및 말단 비만노스 잔기를 보유하는 글리코실화된 단백질을 포함한다. 복합 글리코실화와 달리, 적어도 하나의 분지쇄의 혼성 유형의 글리코실화 구조는 만노스 잔기에서 종결된다.
단백질의 천연 유래의 글리칸을 기재하기 위해, 이러한 분류가 가장 흔하게 사용되나, 합성 및/또는 비천연 유래의 당은 또한, 그 구조가 보편적인 예와 다른 경우에도, 이러한 방식으로 분류될 수 있음이 명백하다. 예를 들어, 단일 GlcNAc에 연결된 갈락토스 및 시알산 잔기의 단일 분지쇄로 이루어진 당 사슬은, 내부 코어 Man3GlcNAc2가 결핍된 경우에도, 복합 당이다.
'ER 위치화 신호' 또는 '골지 위치화 신호'는, 각각 ER 또는 골지체에 접합된 폴리펩타이드 또는 단백질의 위치화를 유도하는 분자, 통상적으로 펩타이드이다. 따라서, 위치화는 또한 각각 ER 또는 골지체에서의 체류를 의미한다. 통상적으로, 이러한 위치화(또는, 체류) 서열은, 성숙한 단백질로서 기능적으로 활성인 경우, ER 또는 골지에 위치하는 (전구체(pre))단백질로부터 유래한 펩타이드 서열이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "UDP-갈락토스 4-에피머라제", "GalE" 또는 "UDP-글루코스 4-에피머라제"는 효소 종류 EC 5.1.3.2의 효소를 지칭한다. 인간(및 선택된 다른) GalE 이소형은 UDP-GlcNAc와 결합하고, UDP-GalNAc로의 그의 전환을 가역적으로 촉매하며, 또한 UDP-Glu를 UDP-Gal로 전환시킨다. UDP-N-아세틸갈락토사민:폴리펩타이드 N-아세틸갈락토사민 전달효소(ppGaNTase)로 일컬어지는 계열의 글리코실전달효소는 GalNAc를 UDP-GalNAc로부터 당단백질 세린 및 트레오닌 잔기로 전달한다. ppGaNTase-매개 글리코실화는 뮤신 생합성에서 제1의 완료 단계를 나타낸다.
내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제의 발현 및/또는 활성에 결함이 있는 세포를 제조하기 위해, 여러 가지 전략이 사용될 수 있으며, O-글리코실화가 세포에 존재하지 않는 정도로 GalE 활성의 감소를 야기하는 한, 전략의 본질은 본 발명에 필수적이지 않다. (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 Crispr/Cas 기법을 사용하여) GalE를 인코딩하는 (내인성) 유전자를, 예를 들어 결실시키거나, 돌연변이시키거나, 대체하거나, 또는 파괴함으로써, 유전자 수준에서 GalE에 결함이 있도록 세포를 제조할 수 있다. 대안적으로, GalE 유전자로부터의 전사를 방해하거나, 전사된 (핵산, mRNA) 또는 번역된 (아미노산, 단백질) 유전자 산물을 제거하거나, 억제할 수 있다. 이는, 예를 들어 GalE mRNA의 siRNA 억제를 통해 달성될 수 있다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 모폴리노스, miRNA, shRNA, LNA, 소분자 억제 또는 유사한 기법이 또한 사용될 수 있다. GalE 단백질은, 예를 들어 억제 항체, 항체 단편, scFv, Fc 또는 나노바디, 소분자 또는 펩타이드를 사용하여 억제될 수 있다.
당업자에 명백한 바와 같이, GalE 발현 및/또는 활성의 결함은 항시성(예를 들어, 유전자 결실) 또는 유도성(예를 들어, 소분자 억제)의 두 경우 모두일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 '결함'은 통상적으로, GalE의 활성이 관련 대조군(예를 들어, 무손상 GalE 유전자와 동일한 세포)의 75% 미만, 특히 90% 미만인 것을 의미한다. 그러나, 활성 %보다 더 중요한 것은 기능 결함이다. 즉, GalE 억제에 의해, GalNAc가 세린 또는 트레오닌 잔기, 또는 신생 글리칸 사슬(특히, 아미노산에 존재하는 GlcNAc 잔기)에 첨가될 수 없는 상황이 야기되는 경우, 세포는 GalE에 기능적으로 결함이 있다. 따라서, 측정된 효소 활성에 상관 없이, GalE 핵산 또는 단백질의 억제를 통해, 당단백질의 아미노산(노출된(bare) 세린 및 트레오닌 잔기, 또는 GlcNAc 변형된 아미노산)에 GalNAc 잔기를 더이상 첨가할 수 없는 세포는 GalE 발현 및/또는 활성에 결함이 있다고 언급된다.
어구 "뮤신 유형의 O-글리칸의 결여"는, 조성물의 당단백질이 뮤신 유형의 O-글리칸을 본질적으로 함유하지 않으며, 따라서, 당단백질에 본래 존재했던 모든 O-글리칸이 제거된 것을 의미한다. 본 발명의 범위에서, 그의 본래의 뮤신 유형의 O-글리칸의 5, 10, 15, 또는 20%를 여전히 포함하는 당단백질은 뮤신 유형의 O-글리칸을 본질적으로 함유하지 않는 것으로 간주된다.
본 발명은, 추가의 용도, 예를 들어 치료 용도 또는 결정화 연구에서의 용도를 위해 추가로 처리될 수 있도록 하는 변이된 글리코실화 패턴, 특히 상동성이 큰 글리코실화 패턴을 가진 당단백질을 생성하는 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명자들은 이러한 목적이 글리코결실 세포주에서 N-글리코실화에 대해 수행될 수 있음을 종래에 제시하였다(WO 2010/015722 및 문헌[Meuris et al.(Nat Biotechnol. 2014 32(5):485-9)]).
N-글리코실화와 같이, O-글리코실화는 재조합 단백질 생성시 이종성의 주요 원인이다. 이는 결정학에 의해 간편하게 제거될 수 있으며, 이종성 단백질의 결정화는 매우 어려우므로, O-글리코실화는 종종 주요 문제를 형성한다. 또한, 하위단위 백신 분야에서, N-글리칸이 그러한 것과 같이, O-글리칸이 안정한 에피토프를 포함할 수 있는 가능성이 있다. 예를 들어, HIV의 gp120, RSV의 G-단백질 및 에볼라의 GP 단백질상의 뮤신 도메인은 모두 다량으로 O-글리코실화되어 있다.
흥미롭게도, O-글리코실화의 제거를 위한 접근법의 조합은 N-글리코실화의 가변성을 심지어 추가로 감소시킴으로써, 모든 당에서 단일 GlcNAc 잔기만이 잔류토록 한다. 실시예 섹션 및 도 13을 참조한다.
따라서, 제1 양태에 따르면, 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있는 진핵 세포가 제공된다. 이러한 진핵 세포는 통상적으로 당단백질을 인코딩하는 제2의 외인성 핵산 서열을 또한 포함한다.
당단백질의 특성은 본 발명에 주요하지 않으나, 당단백질은 통상적으로 올바른 N-글리코실화가 그 기능에 중요한 약제 및/또는 산업에 적절한 단백질일 것이다. 비제한적인 예는 다수의 호르몬, 성장 인자, 사이토카인 및 그의 상응하는 수용체, 예를 들어 여포-자극 호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH), 갑상선-자극 호르몬(TSH), 표피 성장 인자(EGF), 인간 표피 성장 인자 수용체-2(HER-2), 섬유아세포 성장 인자-알파(FGF-α), 섬유아세포 성장 인자-베타(FGF-β), 형질전환 성장 인자-알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자-2(IGF-2), 신경 성장 인자(NGF), 신경 성장 인자-베타(NGF-β); 전술된 것의 수용체, 성장 호르몬(예를 들어, 인간 성장 호르몬, 소의 성장 호르몬); 인슐린(예를 들어, 인슐린 A 사슬 및 인슐린 B 사슬), 프로인슐린; 적혈구생성소(EPO); 콜로니 자극 인자(예를 들어, 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)); 인터루킨(예를 들어, IL-1 내지 IL-12); 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 그의 수용체(VEGF-R); 인터페론(예를 들어, IFN-α, β, 또는 γ); 종양 괴사 인자(예를 들어, TNF-α 및 TNF-β) 및 그의 수용체, TNFR-1 및 TNFR-2; 트롬보포이에틴(TPO); 트롬빈; 뇌의 나트륨배설 펩타이드(BNP); 응혈 인자(예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자 등); 항응혈 인자; 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA), 예를 들어, 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직 유형 TPA; 칼시토닌; CD 단백질(예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19 등); CTLA 단백질(예를 들어, CTLA4); T-세포 및 B-세포 수용체 단백질; 골 모르포겐 단백질(BMP, 예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3 등); 신경성장촉진인자, 예를 들어, 골 유래 신경성장촉진인자(BDNF); 뉴로트로핀, 예를 들어, 3 내지 6; 레닌; 류머티즘 인자; RANTES; 알부민; 릴락신(relaxin); 대식세포 억제 단백질(예를 들어, MIP-1, MIP-2); 바이러스 단백질 또는 항원; 표면 막 단백질; 이온 채널 단백질; 효소; 알칼리 포스파타제; 렉틴; 조절 단백질; 항체; 면역조절 단백질, (예를 들어, B7 계열인 HLA, MHC); 귀소 수용체(homing receptor); 수송 단백질; 과산화물 디스뮤타제(SOD); G-단백질 커플링 수용체 단백질(GPCR); 신경조절 단백질; 알츠하이머병 관련 단백질 및 펩타이드, (예를 들어, A-베타), 및 전술된 것의 융합 또는 키메라 단백질을 포함하여, 당업계에 공지된 다른 것을 포함한다. 본 명세서에서 제시되는 세포 및 방법에 의해 생성될 수 있는 적절한 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 중에, 전술된 단백질 및 폴리펩타이드 중 임의의 것의 단편 또는 일부분 또는 돌연변이체, 변이체 또는 유사체가 또한 포함된다.
당단백질은 세포에 의해 분비될 수 있다.
엔도글루코사미니다제의 특성은 요망되는 당단백질의 당집합(glycopopulation)에 의존할 것이다. 예를 들어, 엔도글루코사미니다제는 그의 기질 특이성에 대해 선택될 수 있다. 일부 엔도글루코사미니다제, 예를 들어, 엔도 H 및 엔도 T는 고-만노스 유형의 당 사슬 및 혼성 유형의 당을 가수분해하나, 복합 탄수화물 구조는 손상되지 않은 채로 남겨 준다. 이러한 효소는, 예를 들어, 복합 글리코실화가 불가능한 세포로부터 단일 GlcNAc-변형된 당단백질을 얻거나, 다른 글리코형뿐만 아니라, 복합 글리코실화된 단백질을 생성하는 세포(예를 들어, 대부분의 글리코 엔지니어링된 효모 균주)에서 고-만노스 및/또는 혼성 유형의 당의 오염을 제거하는 데에 이상적이다. 특정 구현예에 따르면, 엔도글루코사미니다제는 고 만노스 유형의 당 사슬 및 혼성 유형의 글리칸을 가수분해하나, 복합 유형의 글리칸은 가수분해하지 않는다.
엔도글루코사미니다제는 또한, (당 사슬과만 관련된 것이 아니라) 당단백질과 관련하여, 기질 특이성을 가질 수 있고, 일부 엔도글루코사미니다제는, 예를 들어 다른 엔도글루코사미니다제(예를 들어, 엔도 T)보다, (특히, 촘촘하게 접힌) 단백질로부터 당 사슬을 더욱 성공적으로 가수분해하며, 다른 것들은 (또한) 당펩타이드 또는 촘촘하지 않게 접힌 단백질로부터 당 사슬을 특히 성공적으로 가수분해할 수 있다(예를 들어, 엔도 H, 엔도 T). 중요하게는, 이는 통상적으로 엔도글루코사미니다제의 특이성보다는 기질의 접근성 또는 이용 가능성과 관련이 있기 때문에, 특정 단백질에 대해 특정 효소를 사용하는 것을 배제하지는 않으나, 일부 엔도글루코사미니다제는 모든 N-연결 당 구조의 가수 분해를 완료하기 위해, 더 많은 시간이 필요할 수 있다.
엔도글루코사미니다제의 선택은 또한 생성 산물(들)에 의존할 수 있다. 예를 들어, 상이한 당집합이 분비되는 경우(예를 들어, 복합 유형의 글리코실화된 단백질은 가수분해되지 않고, 다른 유형은 가수분해되는 경우), 생성된 단백질이 용이하게 분리될 수 있는 것이 중요할 수 있다. 또 다른 예로서, 추가의 트랜스글리코실화가 고려되는 경우, 단백질 상의 단일 GlcNAc 잔기가, 당 변형을 부착시키는 글리코실전달효소에 적합한 기질을 제공하므로, 단일 GlcNAc-변형된 단백질을 남겨 두는 엔도글루코사미니다제(예를 들어, 엔도 H, 엔도 T)가 특히 고려된다. 박테리아는 단일 GlcNAc-변형된 당단백질을 생성할 수 없고, 이로 인해, 트랜스글리코실화를 위한 개시점으로서 박테리아에서 생성된 단백질을 사용하는 것이 훨씬 더 어렵게 되므로, 박테리아 발현 시스템과 비교하여, 이는 본 명세서에 기재된 진핵 세포의 상당한 이점이다. 대안적으로, 단일 GlcNAc-변형된 단백질은, 또한 비글리코실화된 단백질의 경우에는 그러하지 않을지라도, 결정화 연구에 사용될 수 있다. 따라서, 결정화를 위해 생성된 당단백질을 사용하는 경우, 단백질 상에 단당류를 남기지 않고, 전체 당 사슬을 제거하는 엔도글루코사미니다제(예를 들어, 펩타이드-N-글리코시다제 F)가 고려될 수 있다. 또 다른 고려사항은 다른 효소적 활성, 예를 들어 글리코실전달효소 활성의 존재 또는 부재일 수 있다. 엔도 A, 엔도 BH 및 엔도 M은, 예를 들어 이러한 글리코실전달효소 활성을 보유하는 것으로 인식되어 있으며, 일부 구현예에서, 이러한 활성을 더이상 보유하지 않는 돌연변이체와 함께 작용하는 것이 요망될 수 있다.
IUBMB 명명법에서 EC 3.2.1.96으로 지정된 특정 종류의 엔도글루코사미니다제는 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제에 의해 형성된다. 이들 효소는 단백질 상에 하나의 GlcNAc 잔기를 남기고, 당 사슬을 제거할 수 있다. 이들의 예는 엔도 A, 엔도 BH, 엔도 CE, 엔도 D, 엔도 F1, 엔도 F2, 엔도 F3, 엔도 H, 엔도 M, 엔도 T(또한 WO2006/050584 참조), AcmA, 및 ENGase를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 당업자에 인식되어 있으며, 예를 들어, 특히, 글리코시드 가수분해효소 계열 85 및 18(Glycoside Hydrolase Family 85 and 18) 하에 www.cazy.org에서 찾아볼 수 있다. 특히, 히포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina)(이전에는 트리코데마 레세이(Trichoderma reesei)로 일컬어짐)로부터 유래한 엔도 T 효소의 사용이 고려되며, 이는 WO2006/050584에 기재되어 있다(예를 들어, 상기 문헌의 SEQ ID 9 내지 12 참조).
특정 구현예에 따르면, 상기 진핵 세포는 내인성 엔도글루코사미니다제 효소, 특히 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 발현하지 않는다. 대안적 특정 구현예에 따르면, 상기 진핵 세포는, 제1 외인성 핵산 서열을 인코딩하는 엔도글루코사미니다제 효소 이외에, 기능성 엔도글루코사미니다제 활성을 갖는 효소를 발현하지 않는다. 즉, 이들은, 예를 들어, 더 이상 가수분해효소 활성을 갖지 않도록 변형된 엔도글루코사미니다제(그러나, 예를 들어, 복합 글리코실화 구조의 합성시 기능할 수 있도록 하는 글리코실전달효소 활성만을 가짐) 이외에, 또 다른 엔도글루코사미니다제를 발현할 수 있다.
추가로, 상기 세포는 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있도록 제조된다. 이는 O-글리코실화 경로의 제1 단계이므로, 이는 O-글리코실화가 세포에 존재하지 않음을 보장한다. 추가로, 이는 또한 심지어, 외인성 엔도글루코사미니다제의 도입에 의해, N-글리코실화가 이미 변형된 경우, 때때로 관찰되는 잔류 이종성을 추가로 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 진핵 세포는, (예를 들어, 결정화 연구를 위해) 사용할 수 있도록 준비가 되었거나, 예를 들어 글리코실전달효소에 의한 추가의 당변형 반응의 개시점으로 사용될 수 있는 단일 GlcNAc-변형된 당단백질을 동질성으로 생성한다.
글리코실전달효소는 당펩타이드의 올리고당 구조를 변형하기 위해 사용되어 왔으며, 적절한 입체화학적 및 위치화학적 제어에 의해, 특이적 산물의 생성에 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 글리코실전달효소는 진핵 세포에서 생성된 당펩타이드에 올리고당을 제조하고, 말단 N- 및 O-연결 탄수화물 구조를 변형하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 말단 올리고당은 완전하게 시알릴화되고/되거나, 푸코실화됨으로써, 당단백질(또는, 당펩타이드) 약력학 및, 예를 들어 면역원성과 같은 다양한 다른 생물학적 특성을 개선하는 당 구조가 생성될 수 있다. 이러한 글리코실전달효소는 천연 또는 합성 경로에 사용될 수 있으며, 예를 들어 푸코실전달효소는 푸코스 단위를 구아노신-5'-디포스포푸코스로부터 당 억셉터의 특이적 히드록실에 전달하는 합성 경로에 사용되었다(문헌[Ichikawa etal., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298(1992)]).
적절한 조건하에, 엑소글리코시다제 및 엔도글리코시다제 둘 모두는 글리코실 전달효소 활성을 보유한 것으로 나타났다. 엔도글리코시다제의 사용을 기반으로 하는 방법은, 단당류가 아닌 올리고당을 전달한다는 이점을 갖는다. 전술된 효소는 (예를 들어, 당단백질에 접합된) 탄수화물뿐만 아니라, 글리코실화된 당단백질 자체의 생성에 사용될 수 있다. 글리코실전달효소가, 예를 들어 단일 GlcNAc 변형된-당단백질의 추가 처리에 사용될 수 있는 방법의 예를 위해, 예를 들어, 문헌[Takegawa JBC 3094, Koeller et al., 835, Nat Biotech 2000]; WO03/046150, 및 WO07/133855를 참조한다.
그러나, 첨가되어야 하는 글리코실전달효소에 의한 추가의 트랜스글리코실화 단계에 사용되는 중간체 당단백질 산물을 전달하는 대신에, 본 명세서에 기재된 세포가 글리코실전달효소(들)를 자체적으로 생성할 수 있을 것으로 또한 예상된다. 실제로, 세포의 글리코실전달효소(들)가 세포내 또는 세포외 환경에서 당단백질의 글리코실화 반응을 수행함으로써, 요망되는 (통상적으로 복합) 글리코실화 프로파일을 갖는 당단백질의 동질성 집합이 생성될 것으로 고려된다.
따라서, 특정 구현예에 따르면, 상기 세포는, 글리코실전달효소를 인코딩하는 제3의 외인성 핵산 서열을 보유한다. 특정의 대안적 구현예에 따르면, 엔도글루코사미니다제 및 글리코실전달효소 활성은 동일한 효소에 의해 수행된다. 이는 단지 하나의 효소만이 존재하고, 두 활성 모두 (또한, 효소 서열은 동일하나, 위치화 또는 분비 서열은 상이한 것이 가능하다 할지라도) 동일한 서열에 의해 인코딩되기 때문일 수 있다. 대안적으로, 세포에서, 하나는 엔도글루코사미니다제 활성을 가지나, (바람직하게는) 글리코실전달효소 활성을 가지지 않으며, 하나는 단지 글리코실전달효소 활성을 가진 동일한 효소의 2개의 버전(예를 들어, 엔도 T, 엔도 M)이 발현될 것으로 고려된다. 여전히 두 활성 모두를 가진 효소가 사용되는 경우, 2개의 효소적 활성의 방해를 피하기 위해, 그의 기질에 대한 접근을 (공간과 시간적으로) 제어하는 것이 중요하다. 예를 들어, 효소 및 당단백질이 분비될 때, 엔도글루코사미니다제 활성을 (예를 들어, pH의 조정에 의해) 우선 활성화할 수 있으며, 그 후, 트랜스글리코실화의 기질을 배지에 첨가할 수 있다. 그러하나, 당단백질이 글리코실전달효소 활성에 의해 당 사슬로 변형된 후에는 엔도글루코사미니다제가 당단백질을 가수분해할 수 없다는 것이 보장되어야 한다.
그러나, 특정 구현예에 따르면, 글리코실전달효소는 엔도글루코사미니다제와 동일한 서열에 의해 인코딩되지 않는다. 추가의 특정 구현예에 따르면, 엔도글루코사미니다제와 상이한 하나 이상의 글리코실전달효소가 사용된다. 예는 시알릴전달효소, 예를 들어 α-시알릴전달효소, 갈락토실전달효소, 예를 들어 β-1, 4-갈락토실전달효소, 및 푸코실전달효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
대안적인, 그러나 반드시 배타적인 것은 아닌 특정 구현예에 따르면, 세포는 글리코 엔지니어링된 효모 세포, 즉, 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소를 인코딩하는 적어도 제3의 외인성 핵산 서열을 또한 보유하고/하거나, 적어도 하나의 내인성 글리코실전달효소의 활성에 결함이 있는 효모 세포이다. 특정 구현예에 따르면, 복합 글리코실화에 필요한 효소는 만노시다제 또는, 만노실전달효소 이외의 글리코실전달효소이다. 추가의 특정 구현예에 따르면, 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소는 N-아세틸글루코사미닐 전달효소 I, N-아세틸글루코사미닐 전달효소 II, 만노시다제 II, 갈락토실전달효소, 및 시알릴전달효소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에 따르면, 글리코 엔지니어링된 효모 세포는, 고 만노스 구조(고 만노스 유형의 글리칸)의 생성에 관여하는 적어도 하나의 효소가 발현되지 않는 것(또는, 세포에서 기능적으로 활성이 아닌 것)을 특징으로 할 수 있다. 추가의 특정 구현예에 따르면, 적어도 하나의 만노실전달효소는 글리코 엔지니어링된 효모 세포에서 발현되지 않는다. 통상적으로, 글리코 엔지니어링된 효모 세포에서 발현되지 않는 만노실전달효소는 야생형 상대 효모 세포에서 발현된다. 추가의 특정 구현예에 따르면, 만노실전달효소는 α-1, 2-만노실전달효소, α-1, 3-만노실전달효소, α-1, 6-만노실전달효소, 또는 β-1, 4-만노실전달효소이다. 이러한 단백질은 효모에서 종종 특이적 명칭(예를 들어, Alg, Och, Mnn)을 가지나, 그의 활성은 당업계에 잘 인식되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 적어도 하나의 만노실포스페이트 전달효소는 글리코 엔지니어링된 효모 세포에서 기능적으로 활성이 아니다.
본 명세서에 기재된 진핵 세포에서, 엔도글루코사미니다제와 같은 글리코실전달효소는 세포에서 분비되거나, 보유될 수 있으며, 특히 ER 또는 골지에 표적화된다. 후자의 경우, 통상적으로, 단백질이 우선 엔도글루코사미니다제에 의해 (부분적으로) 탈글리코실화된 후, 글리코실전달효소에 의해 트랜스글리코실화되는 것을 보장하기 위해, 이는 글리코실화된 단백질의 ER → 골지 조립 경로의 후기 단계로 표적화될 것이다. 이러한 방식으로, 엔도글루코사미니다제(들) 및 글리코실전달효소(들)의 조합에 의존하여, 천연 유래의 글리칸뿐만 아니라, 합성 글리칸이 당단백질에 첨가될 수 있다.
진핵 세포는 임의의 진핵생물 유기체로부터 유래될 수 있으나, 특정 구현예에서, 효모, 식물, 포유류 및 곤충 세포가 고려된다. 사용되는 세포의 특성은 통상적으로, 요망되는 글리코실화 특성 및/또는 당단백질 생성의 용이성 및 비용에 의존적일 것이다. 복합 글리코실화를 달성하고, 면역원성에 의한 문제를 피하기 위해, 예를 들어 포유류 세포가 사용될 수 있으나, 포유류 세포계에서의 단백질의 생성은 비용면에서 비효율적일 수 있다. 식물 및 곤충 세포뿐만 아니라, 효모는 통상적으로 높은 생성 수준을 달성하고, 비용면에서 더 효율적이나, 포유류 단백질의 복합 글리코실화 패턴을 모방하거나, 면역원성에 의한 문제를 감소시키기 위해, 추가의 변형이 필요할 수 있다. 단백질 생성을 위한 진핵 세포주는 변형된 글리코실화 경로를 갖는 세포주를 포함하여, 당업계에 잘 인식되어 있다. 후속 단리 및/또는 정제를 위한 단백질의 보유, 발현 및 생성에 적합한 동물 또는 포유류 숙주 세포의 비제한적 예는 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 예를 들어 CHO-K1(ATCC CCL-61), DG44(문헌[Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; 및 Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909]), CHO-K1 Tet-On 세포주(Clontech), ECACC 85050302로 지정된 CHO(CAMR, 영국 윌트셔 솔즈베리 소재), CHO 클론 13(GEIMG, 이탈리아 제노바 소재), CHO 클론 B(GEIMG, 이탈리아 제노바 소재), ECACC 93061607로 지정된 CHO-K1/SF(CAMR, 영국 윌트셔 솔즈베리 소재), ECACC 92052129로 지정된 RR-CHOK1(CAMR, 영국 윌트셔 솔즈베리 소재), 현탁액-조정 CHO-XL99 세포(Acyte Biotech, 호주 브리즈번 소재), FreeStyle CHO-S 세포(Life Technologies), 디하이드로폴레이트 환원효소 음성 CHO 세포(CHO/-DHFR, 문헌[Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216]), 및 dp12.CHO 세포(미국 특허 제 5,721,121호); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 293 세포, 또는 293T 세포, 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌[Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL-10); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 문헌[Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251]); 인간 자궁 경부암종 세포(HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL-75); 인간 간암 세포(HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포(문헌[Mather, 1982, Annals NYAcad. Sci., 383:44-68]); MCR 5 세포; FS4 세포를 포함한다. 예시적 비-포유류 세포주는 Sf9 세포, 바쿨로바이러스-곤충 세포계(예를 들어, 문헌[Jarvis, Virology Volume 310, Issue 1, 25 May 2003, Pages 1-7] 검토), 식물 세포, 예를 들어 담배 세포, 토마토 세포, 옥수수 세포, 조류(algae) 세포, 또는 효모, 예를 들어 사카로미세스 종(Saccharomyces species), 한세눌라 종(Hansenula species), 야로위아 종(Yarrowia species) 또는 피키아 종(Pichia species)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에 따르면, 진핵 세포는 사카로미세스 종(예를 들어, 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)), 한세눌라 종(예를 들어, 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)), 야로위아 종(예를 들어, 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces species)(예를 들어, 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis)) 또는 피키아 종(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris))로부터의 효모 세포이다. 특정 구현예에 따르면, 진핵 세포는 피키아 세포이고, 가장 특정한 구현예에서는 피키아 파스토리스 세포이다. 피키아 파스토리스는 포유류 세포에서 발견되는 것과 유사한 개별적 골지층판을 갖는 분비 경로를 갖는 것으로 밝혀졌다.
대안적 특정 구현예에 따르면, 세포는 Hek293 세포 또는 CHO 세포로부터 선택되는 포유류 세포이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 진핵 세포는, 단일 GlcNAc-변형된, 동질성으로 글리코실화된 당단백질을 생성할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 제1 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩되는 엔도글루코사미니다제 효소는 만노실-당단백질 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제이고, 즉, 이는 IUBMB 명명법의 E.C. 3.2.1.96의 활성을 가지며, 이는 단백질에 하나의 GlcNAc 잔기를 남기고, 당 사슬을 제거할 수 있음을 의미한다. 대안적 구현예에 따르면, 제1 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩되는 엔도글루코사미니다제는 상이한 유형의 글리코실화 구조에 대해 상이한 친화도를 갖는다. 후자의 경우의 대표적인 예는, 혼성 유형의 당 및/또는 고-만노스 당을 가수분해하나, 복합 유형의 글리칸을 절단할 수 없는 엔도글루코사미니다제이다. 추가의 특정 구현예에 따르면, 엔도글루코사미니다제는, 상이한 유형의 글리코실화 구조에 대해 상이한 친화도를 갖는 만노실-당단백질 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제이다. 추가의 특정 구현예에 따르면, 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제는 혼성 유형의 당 및/또는 고-만노스 당을 절단할 수 있으나, 복합 유형의 글리칸은 절단할 수 없다. 훨씬 더 구체적인 구현예에 따르면, 엔도글루코사미니다제는 엔도H 또는 엔도T이다. 가장 구체적인 구현예에 따르면, 엔도글루코사미니다제는 엔도 T이다.
본 명세서에 기재된 세포에 의해 생성되는 당단백질은 통상적으로 용이하게 횔수되어야 한다. 이는 특히 당단백질의 분비에 의해 달성될 것이다. 이는 (예를 들어, 엔도글루코사미니다제가 세포에 잔류하는 경우) 엔도글루코사미니다제와의 접촉 후 또는 (예를 들어, 둘 모두 분비된 경우) 엔도글루코사미니다제와의 접촉 전에 이루어질 수 있다. 분비 신호는 일반적으로, 엔도글루코사미니다제가 분비된 경우, 당단백질 및 엔도글루코사미니다제(또는, 선택적으로 또한 글리코실전달효소) 둘 모두와 유사할 것이다. 분비 신호의 특성은 실제로 통상적으로, 분비되는 단백질에는 의존적이지 않으나, 사용되는 진핵 세포의 유형에는 의존적일 것이다. 분비 신호가 사용되는 세포 유형에서 기능성인 한(즉, 이에 의해, 융합 단백질 또는 펩타이드의 세포외 환경으로의 분비가 야기되는 한), 이러한 특성은 본 발명에 주요하지 않다. 따라서, 다른 유기체로부터의 분비 신호는, 이들 신호가 사용되는 진핵 세포에서 분비를 유도하는 한, 사용될 수 있다. 분비 신호는 당업계에 잘 인식되어 있으며, 분비되는 단백질(통상적으로 그의 N 말단)로부터 유래될 수 있거나, 합성적으로 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Tan et al., Protein engineering 2002, vol. 15, no4, pp. 337-345]). 대안적으로, 이는 컴퓨터에 의한 방법을 사용하여 게놈 서열로부터 유래될 수 있다(문헌[Klee et al., BMC Bioinformatics 2005, 6:256]). 또한, 박테리아 분비 신호가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 신호 펩타이드의 추가의 예는 WO2002/048187(진핵 세포), 문헌[Schaaf et al.(BMC Biotechnol. 2005; 5: 30])(이끼 세포), EP549062에 기재되어 있다. 효모에서 사용되는 특이적 분비 신호는, 예를 들어, α-인자 분비 펩타이드, PH05 분비 펩타이드, 및 BAR1 분비 신호를 포함한다.
당단백질의 용이한 회수를 위해 분비가 특히 고려된다 할지라도, 대안적 선택지가 존재한다. 생성된 당단백질은 예를 들어 세포의 봉입체 또는 막-결합 세포 소기관 또는 유사한 기능을 갖는 구조에 적재될 수 있다. 세포가 생성을 위해 사용된 유기체(예를 들어, 식물 세포 배양물이 아닌 식물)의 일부인 경우, 당단백질은, 당단백질이 회수될 수 있는 유기체의 특정 기관 또는 조직(예를 들어, 샘 또는 분비모(trichome))에서 생성되거나, 그에 수송될 수 있다. 특히, 단백질이 분비되지 않는 경우, 단백질이 비활성 형태에 적재되는 것이 가능함에 유의해야 한다. 따라서, 당단백질의 생리적으로 적절한 형태를 얻기 위해, 추가의 재접힘 또는 재활성화 단계가 필요할 수 있다.
당단백질에 더하여, (동일하거나, 유사한 분비 신호를 사용하여(즉, 당단백질의 분비 신호에 대해 언급된 것이 엔도글루코사미니다제에도 적용됨)), 엔도글루코사미니다제가 또한 세포에 의해 분비될 수 있다 할지라도, 엔도글루코사미니다제가 세포에 잔류하는 것이 특히 유리할 수 있다. 이는, 두 단백질 모두가 분비되는 경우, 유발되는 엔도글루코사미니다제 및 당단백질을 분리할 필요가 없게 한다. 가장 구체적으로, 엔도글루코사미니다제는 세포에 잔류할뿐만 아니라, 완전하게 활성이다. 요망되는 가수분해가 발생할 것을 보장하기 위해, 그의 활성은 공간과 시간적으로 조절되어야 한다. 이를 위해, 엔도글루코사미니다제는 ER 또는 골지 위치화 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 신호는 엔도글루코사미니다제를, 각각 이것이 유지되는 ER 또는 골지로 유도한다. ER 및 골지체가, 단백질의 글리코실화가 이루어지는 세포내 위치이므로, 이들 세포 소기관의 표적화는, 엔도글루코사미니다제가 당단백질의 글리코실화를 변형시키기 위한 올바른 세포내 위치에 존재하는 것을 보장한다.
복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소가 또한 ER → 골지 분비 경로에서의 기능으로 표적화되고, 엔도글루코사미니다제가, 이들 효소가 당단백질에서 협력적으로 작용하는 방식으로 표적화될 수 있으므로, 이는 또한 본 명세서에 기재된 글리코 엔지니어링된 효모 세포의 경우 특히 그러하다.
실제로, 효모에서(인간에서와 같이) ER 및 골지체의 내강 표면은, 이들이 ER로부터 골지망을 통해 배지로 진행됨에 따라, 당단백질의 순차적 처리를 가능하게 하는 촉매 표면을 제공한다. 당단백질이 ER로부터 분비 경로를 통해 진행됨에 따라, 이는 상이한 만노시다제 및 글리코실전달효소에 순차적으로 노출된다. 일부 N-글리코실화 효소가, 이전의 효소에 의해 생성된 특정 기질에 의존적이므로, 여러 처리 단계는 이전의 반응에 의존된다. 따라서, N-글리코실화 효소, 특히 외인성 효소, 예를 들어 엔도글루코사미니다제 및 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소는, 특정 N-글리칸 구조의 합성을 가능하게 하는 소정의 서열로 정렬되어야 한다.
분비 경로의 순차적 처리 환경의 달성은 N-글리코실화 효소의 적절한 위치화를 요구한다. 각각의 구획이 특정 세트의 상주(예를 들어, N-글리코실화) 효소를 유지하는 동안, 분비된 단백질이 (ER로부터 시스-, 중간- 및 트랜스-골지 구획 및 배지로의) 분비 경로를 통해 수송될 수 있게 하는 메커니즘이, 대규모 연구의 대상이 되고 있다. 단백질을 분비 경로의 다양한 구획에 위치화하는 2개의 잘 수립된 메커니즘은 검색(retrieval) 및 체류이다(문헌[van Vliet et al., PBMB 1 2003; Teasdale et al., 27 1996]).
검색은, 단백질이 다른 단백질과의 상호작용을 통해 특정 세포 소기관으로 위치화되게 하는 과정이다. 여러 개의 ER-상주 단백질은, 공통 서열 KDEL(SEQ ID NO: 1)(또는, 효모에서 HDEL(SEQ ID NO: 2))을 갖는 카복시-말단 테트라펩타이드를 함유하고, 이는 ER로의 효율적인 위치화를 위해 요구되는 것으로 밝혀졌다.
여러 개의 ER- 및 골지-상주 효소는 II 형 막 단백질이다. 이들 단백질은 아미노 말단의 짧은 세포질 꼬리, 소수성 막관통 도메인, 내강 줄기 및 C 말단 촉매 도메인을 포함하는 공통 도메인 구조를 갖는다. 비 골지 상주 단백질과의 융합뿐만 아니라, 결실 연구는, 많은 II 형 막 단백질의 표적화 정보를 함유함에 따라, N 말단, 특히 막관통 영역을 확인시켰다. N 말단 도메인이 표적화에 관여한다는 것이 명백하나, 그의 표적화 능력이 상이한 종 사이에서 이전 가능한 정도는 아직 완전히 명확하지 않다. 그럼에도 불구하고, S. 세레비시아에 또는 P. 파스토리스의 ER 및 골지에 자연적으로 위치화되는 단백질과 관련된 펩타이드를 인코딩하는 공지된 II 형 막 단백질 도메인의 유전자 라이브러리의 설계와 같은 상당한 발전이 이루어져 왔으며(문헌[Choi et al., 5022 2003; Hamilton et al.; Science 1244]), 이는, 예를 들어, S. 세레비시아에 Sec12(ER 위치화), MNN2(골지 위치화), 및 MNN9(골지 위치화)로부터의 리더 서열의 적합성을 확인시켰다. WO02/000879의 표 5에 열거된 서열은 HDEL 및 ER 위치화를 위한 MnsI로부터의 리더 서열 및 Och1 및 Mnt1(골지-시스 위치화), Mnn2(골지 중간 위치화), Mnn1(골지 트랜스 위치화), 알파-2,6-시알릴전달효소(트랜스-골지망) 및 베타-1,4-갈락토실전달효소 I(골지 위치화)로부터의 리더 서열을 포함한다.
따라서, 위치화 신호는 당업계에 잘 인식되어 있으며, 그 기능을 위해 ER 또는 골지에 정상적으로 위치화되는 단백질로부터 유래될 수 있다. 추가로, 하나의 유기체로부터의 위치화 서열은 다른 유기체에서 기능할 수 있다. 예를 들어, 랫트 트랜스 골지에 위치화되는 것으로 인식된 효소인 랫트로부터의 α-2, 6-시알릴전달효소의 막 범위 영역은 또한 리포터 유전자(인버테이스(invertase))를 효모 골지에 위치화시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Schwientek, et al., 1995]). Schwientek과 동료 연구자들은 또한, N 말단 세포질 꼬리, 막관통 영역 및 줄기 영역의 8개의 아미노산을 함유하는 영역인 효모 만노실전달효소(Mntl)의 28개의 아미노산의 인간 GalT의 촉매 도메인으로의 융합이 활성 GalT의 골지 위치화를 위해 적절하다는 것을 밝혀내었다(문헌[Schwientek et al. 1995 J. Biol. Chem. 270(10): 5483-5489]). 다른 잘 보고된 모티프는 ER에서의 체류를 위한 KDEL 및 HDEL 모티프이다. 특정 구현예에 따르면, ER 또는 골지 위치화 신호는, 기능적으로 활성인 경우, 자체적으로 ER 또는 골지에 위치화되는 단백질로부터 유래된다. 이러한 단백질의 예는 S. 세레비시아에 디펩티딜 아미노펩티다제 A(Ste13p), 인간 β-갈락토시드-α-2, 6-시알릴전달효소(ST6GalI) 및 인간 강글리오시드-GM2-합성효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 구현예에 따르면, 위치화 서열은 하기의 단백질 중 하나로부터 유래된다: Ste13p, GL2-합성효소, 강글리오시드-GM2-합성효소, 및 α-2,6-글리코실전달효소, 특히 α-2,6-시알릴전달효소, 가장 특정하게는 β-갈락토시드-α-2,6-시알릴전달효소.
중요하게는, 골지체는 단지 하나의 상동성 영역이 아니라, 5개의 기능성 영역을 갖는다: 시스-골지망, 시스-골지, 중간-골지, 트랜스-골지, 및 트랜스-골지망. (소낭-관형 클러스터를 통한) 소포체로부터의 소낭은 시스-골지망과 융합되고, 후속하여, 골지체를 구성하는 시스테나의 층판을 통해 트랜스-골지망으로 진행되며, 여기서, 이들은 패키징되어, 필요한 목적지로 전송된다. 각각의 영역은, 예를 들어 이들이 상주할 예정지에 따라, 선택적으로 내용물을 변형시키는 상이한 효소를 함유한다. 따라서, 세포내에서의 엔도글루코사미니다제의 올바른 표적화에 의존하여, 글리코실화 경로는 상이한 방식으로 변형될 수 있다.
예를 들어, 엔도글루코사미니다제는, 당 구조가 이미 당단백질에 첨가된 후, 골지 후기로 표적화될 수 있다. 이는, 예를 들어, 일종의 '교정' 또는 '생체내 제거', 즉, 요망되는 복합 글리코실화 패턴이 당단백질뿐만 아니라, 혼성 유형 및/또는 고 만노스 구조에 생성되는 상황(종종, 인간-유형 글리코실화를 위해 변형된 효모에서 관찰되는 상황)에서 특히 고려될 수 있다. 여기서, 혼성 유형 및 고-만노스 글리코실화 구조에 특이적인 엔도글루코사미니다제(예를 들어, 엔도 T, 엔도 H)의 후기-골지 표적화는, 비정상적으로 글리코실화된 당단백질이 (특히 단일 GlcNAc로) 탈글리코실화되고, 복합 글리코실화에 의한 당단백질이 이와 같이 분비되는 것을 보장한다. 따라서, 용이하게 분리 가능한 2개의 당집합이 얻어진다. 대안적 선택지는, 진핵 세포가, (예를 들어 복합 글리코실화에 필요한 효소적 활성의 결함으로 인해, 제한된 글리코다양성(glycodiversity)을 갖는 당단백질을 생성하도록 변형될 수 있거나, 일부 진핵 세포가 단지 제한된 글리코다양성을 가지므로, 특히, 광범위한 특이성을 갖는 엔도글루코사미니다제일 필요가 없는) 세포에서 제조되는 모든 글리코실화 구조를 가수분해하는 엔도글루코사미니다제의 후기 표적화이다. 이러한 방식에 의해, 동질성 글리코실화 패턴은 당단백질의 집합, 예를 들어, 비글리코실화된 당단백질만의 집합 또는 단일 단당류-변형된 당단백질만의 집합으로 얻어질 수 있다. 또 다른 선택지는 엔도글루코사미니다제를 ER → 골지 글리코실화 경로의 초기 단계로 표적화하는 것이며, 이때, 글리코실전달효소(예를 들어, 경로의 후기로 표적화되는 추가의 외인성 글리코실전달효소)는 하류에서 추가적으로 활성이다. 이러한 방식에 의해, (예를 들어, 단일 GlcNAc-변형된 당단백질)의 동질성 당집합은 기질로서 글리코실전달효소에 제공된다. 이는 글리코실화된 당단백질의 동질성 집합을 야기한다. 대표적인 엔도글루코사미니다제가 천연 글리코구조의 대표적인 내부 Man3GlcNAc2 코어 구조를 또한 제거할 것이므로, 이러한 동질성 당집합은 특히, 비천연 유래의 글리코형의 동질성 집합일 수 있음에 유의한다. 그러나, 이러한 구조는 종종, 식물, 효모 또는 곤충 세포에서 생성된 특정 글리칸보다 포유류에서 덜 면역원성이다.
여기서, 엔도글루코사미니다제의 표적화에 대해 이루어진 이러한 언급이, 세포내에서 다른 효소의, 특히 글리코실전달효소 및/또는 특정 구현예에 사용되는 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소로의 표적화에도 물론 적용됨이 명백할 것이다. 실제로, 이들 효소가 ER → 골지 경로에서 활성이고, 순차적으로 작용하므로, 이들 효소는 주의하여 표적화되어야 한다. 특정 구현예에 따르면, 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소는 하나 초과의 효소이다. 더욱 특히, 적어도 하나의 효소는 복합 글리코실화의 경로를 형성하기 위해 필요한 효소의 수이다. 더욱 구체적으로, 복합 글리코실화에 필요한 각각의 이들 효소는, 이들이 순차적으로 올바른 순서로 작용하도록(통상적으로, 하나의 효소가 다음 효소를 위한 기질로 당 사슬을 변형시키도록) 표적화된다. 특정 구현예에 따르면, 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소는 적어도 하나의 N-아세틸글루코사미닐 전달효소(예를 들어, GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), 적어도 하나의 만노시다제(특히 만노시다제 II), 적어도 하나의 푸코실전달효소, 적어도 하나의 갈락토실전달효소, 적어도 하나의 시알릴전달효소, 또는 이들 효소의 임의의 조합이다.
복합 글리코실화 경로가 엔지니어링된 글리코 엔지니어링된 효모의 예는 당업계에 광범위하게 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Choi et al., 5022 2003; Hamilton et al.; Science 1244; Wildt et al., 119 2005; Hamilton et al., 387 2007; EP1211310; WO02/000879; US2006148039]). 복합 글리코실화에 필요한 효소(들)가 모두 분비 ER → 골지 경로의 구획에 표적화되고, 따라서 분비되지 않는다는 점에 유의한다.
추가로, 복합 유형의 글리코실화된 당단백질, 예를 들어 ER 및 골지 특이적 수송인자(예를 들어, UDP-갈락토스 및 다른 전구체의 공동수송 및 역수송 수송인자(sym- and antiport transporter)) 또는 활성화된 올리고당 전구체의 합성에 관여하는 효소, 예를 들어 UDP-갈락토스 및 CMP-N-아세틸뉴라민산의 최적의 생성을 보장하기 위해, 다수의 다른 유전자가 또한, 본 명세서에 기재된 글리코 엔지니어링된 효모 세포에 형질전환될 수 있다. 실제로, 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소와의 접촉은 효율적이고 올바른 글리코실화를 보장하기 위해, 특이적 글리코실 공여체(예를 들어, 당 뉴클레오타이드 공여체)의 존재하에 발생할 수 있다.
생성된 당단백질의 글리코실화 상태는 (예를 들어, 효소가 내부에 존재하는) 사용되는 세포계 및 엔도글루코사미니다제의 특이성 둘 모두에 의존적일 것이다. 추가로, 이들 효소가 작용하는 시간 및 장소가 또한 중요하다(예를 들어, 효소는 우선 ER → 골지 경로에서 작용함). 따라서, 세포가 (예를 들어, 효모 세포 및 고-만노스 및 혼성 유형의 글리칸을 가수분해할 수 있는 엔도글루코사미니다제의 경우) 단지 단일 GlcNAc 잔기를 갖는 단백질 또는 단지 비글리코실화된 단백질을 발현하는 것이 가능하다. 이들 단백질은, 예를 들어 결정화 연구를 위한 기본으로 기능할 수 있다. 또 다른 가능성은, 이러한 단백질을, 예를 들어 글리코실전달효소의 처리에 의해 추가로 변형함으로써, 요망되는 글리칸 모이어티를 갖는 단백질을 야기하는 것이다.
대안적으로, 요망되는 (통상적으로 복합) 글리코실화를 달성할 수 있는 세포(예를 들어, (예를 들어, 트랜스 골지 또는 트랜스-골지망에서 세포내에서 또는 세포외에서) 복합 글리코실화에 필요한 효소 이후에, 엔도글루코사미니다제가 작용하는 글리코 엔지니어링된 효모)가 사용될 수 있다. 이러한 시나리오에서의 전제 조건은, (예컨대, 그의 특이성으로 인한 것이거나, 엔도글루코사미니다제가 글리코실화된 단백질로부터 공간적 및/또는 시간적으로 분리됨으로 인한 것이거나, 엔도글루코사미니다제가 요망되지 않는 글리칸을 제거한 후에는 비활성화됨으로 인해) 엔도글루코사미니다제가 요망되는 당 사슬을 가수분해하지 않는다는 것이다. 통상적으로, 이러한 세포는 2개의 당단백질의 집합을 생성할 것이다: 올바르게 글리코실화된 형태 및 비글리코실화된 형태 또는 단일 GlcNAc 변형된 형태(예를 들어, 혼성 유형 또는 만노스-유형의 글리칸 변형에 의한 당단백질의 탈글리코실화로부터 얻어짐). 동질성으로 글리코실화된 집합을 얻기 이전에는, 이러한 혼합 집합은 여전히 분리 단계가 필요하나, 복합 글리코실화에 의한 단백질과 비글리코실화된 단백질 간의 (예를 들어, 중량, 유체역학 특성) 차이가 상이하게 글리코실화된 단백질 간보다 훨씬 더 크기 때문에, 이러한 분리 단계는 통상의 생성 방법보다 훨씬 더 용이하다.
대안적으로, 세포가 단지 올바르게 글리코실화된 단백질만을 생성하고/하거나, 분비할 것으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 모든 당단백질이 엔도글루코사미니다제에 의해 우선 (적어도 부분적으로) 탈글리코실화되고, 그 후, 이들은 복합 글리코실화를 위한 적어도 하나의 효소에 의해 변형되는 방식으로, 글리코 엔지니어링된 효모에서, 이는 ER → 골지 경로에서 복합 글리코실화를 위한 적어도 하나의 효소 바로 이전의 엔도글루코사미니다제 효소를 표적화함으로써 달성될 수 있다. 후자의 접근법을 사용하는 경우, 엔도글루코사미니다제가 통상적으로 코어 Man5GlcNAc2 구조 또는 그의 적어도 일부분을 제거함으로써, 복합 글리코실화를 위한 효소에 의해 당단백질에 첨가된 당 사슬이 단축된 염기 구조, 예를 들어 단일 GlcNAc 잔기에 첨가될 것이므로, 생성된 당단백질은 비천연 유래의 탄수화물 사슬을 가질 수 있다. 천연 유래의 것이 아닐지라도, 이러한 복합 당 사슬은 또한 종종 비면역원성이며, 예를 들어, 증가된 안정성, 더 긴 반감기 등과 같은 다른 요망되는 특성을 가질 수 있다. 제1 효소(예를 들어, 엔도글루코사미니다제)에 의해 변형된 후의 당단백질이 다음 효소(예를 들어, 복합 글리코실화에 필요한 효소)에 적합한 기질인 것은 항상 중요하나, 특히 이러한 새로운 합성 경로의 생성에 중요하다.
그러나, 예를 들어, 단지 비글리코실화된 단백질만 또는 단일-단당류-변형된 단백질만을 유지하기 위해, 추가의 (복합) 글리코실화가 또한 억제될 수 있음이 이해된다. 따라서, 특정 구현예에 따르면, 본 명세서에 기재된 진핵 세포는 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소, 예를 들어 ER-만노시다제 I, 글루코시다제 I, 글루코시다제 II, 갈락토실전달효소, 시알릴전달효소, 만노시다제 II, N-아세틸글루코사미닐 전달효소 I, 및 N-아세틸글루코사미닐 전달효소 II를 포함하지 않는다. 이러한 세포는 당단백질의 복합 글리코실화가 불가능하다. 그럼에도 불구하고, (완전한) 복합 글리코실화가 이러한 세포에서 정상적으로는 달성되지 않는다 할지라도, 특정 특이성을 갖는 엔도글루코사미니다제를 ER → 골지 글리코실화 경로의 위치로 표적화하는 것이 가능할 수 있으며, 이는 당단백질이 엔도글루코사미니다제와 접촉된 후, 당단백질이 다시 다음의 효소의 표적이 되는 것을 보장한다. 이러한 방식에 의해, 새로운 합성 경로가 생성될 수 있다. 예를 들어, N-아세틸글루코사미닐 전달효소 I이 결핍된 세포에서 갈락토실전달효소 및 시알릴전달효소 바로 이전에 엔도글루코사미니다제를 표적화하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 방식에 의해, 단지 갈락토실전달효소 및 시알릴전달효소가 (부분적으로) 탈글리코실화된 단백질(예를 들어, 단일-GlcNAc-변형된 단백질)에 작용함으로써, 비천연 유래의 복합 글리코실화에 의한 단백질이 생성될 것이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 당단백질의 생성을 위한 세포는 통상적으로 세포 배양물의 형태로 제공되나, 이는 모든 경우에 반드시 그러할 필요는 없다. 실제로, 당단백질을 생성하는 세포는 유기체, 예를 들어 트랜스제닉 동물 또는 식물의 일부일 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 본 출원에 기재된 바와 같은 당단백질 및 엔도글루코사미니다제-함유 세포를 포함하는 식물이 또한 고려된다. 통상적으로, 식물은 특히 또한 상이한 기관 및/또는 조직에 다수의 이들 세포를 가질 것이다.
본 명세서에 기재된 진핵 세포는 당단백질 생성에 특히 잘 적용된다. 특정 구현예에 따르면, 당단백질은 특이적 글리코형, 특히 단일 GlcNAc-변형된 당단백질을 위해 농화된다. 따라서, 진핵 세포에서 단일 GlcNAc 모이어티에 의해 변형된 당단백질을 생성하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
- 엔도글루코사미니다제 효소 및 당단백질의 발현에 적합한 조건하에서, 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있고, 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1의 외인성 핵산 서열을 포함하며, 당단백질을 인코딩하는 제2의 외인성 핵산 서열을 포함하는 진핵 세포를 제공하는 단계; 및
- 당단백질을 엔도글루코사미니다제와 세포내 또는 세포외에서 접촉시킨 후, 당단백질을 회수하는 단계.
단일 GlcNAc 잔기를 가진 당단백질은 단지, 세포에 의해 생성된 당단백질의 유일한 글리코형일 수 있으며(즉, 동질성 당집합이 생성됨), 즉, 당단백질에 다른 N- 또는 O-글리칸이 존재하지 않는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은, (당단백질에서 엔도글루코사미니다제의 최적의 활성을 보장하기 위해) 당단백질과 엔도글루코사미니다제 사이의 접촉이 최적의 환경하에 발생할 것이 보장되도록 추가로 조정될 수 있다. 예를 들어, 이러한 접촉이 세포내에서 발생하는 경우, 엔도글루코사미니다제는, 당단백질에서 그 기능을 발휘하는 골지 또는 ER(의 요망되는 위치)로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 세포의 내부 또는 외부에서 고려되는 추가의 트랜스글리코실화에 따라, 요망되는 위치가 전술된 바와 같이, 변할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 세포내 접촉은 골지 또는 ER에서 발생한다.
엔도글루코사미니다제 및 당단백질 둘 모두가 분비될 수 있으며, 접촉은 세포외에서 일어날 수 있다. 그러나, 사용되는 세포 및 엔도글루코사미니다제에 따라, 세포를 위한 최적의 성장 및 생성 조건(예를 들어, pH, 온도)은 효소 활성을 위한 최적의 조건과 상이할 수 있다. 따라서, 당단백질과 엔도글루코사미니다제 사이의 세포외 접촉이 이루어지는 배지는 엔도글루코사미니다제의 최적의 효소 활성을 위해 조정될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 세포외 접촉이 이루어지는 배지의 조건은 최적의 효소적 엔도글루코사미니다제 활성을 위해 조정된다. 추가의 특정 구현예에 따르면, 세포외 접촉이 이루어지는 배지의 pH는 최적의 효소적 엔도글루코사미니다제 활성을 위해 조정된다. 통상적으로, 이는, 세포가 당단백질 및 엔도글루코사미니다제 둘 모두를 생성하여 분비할 수 있게 된 후, 배지의 pH 변화에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 엔도글루코사미니다제가 보통 산성 환경에서 생리적으로 활성이므로, 이러한 pH 변화는 하향변화될 것이다. 또 다른 특정 구현예에 따르면, 배지의 온도가 최적의 효소 활성을 위해 조정된다. 성장 및 생성 조건의 조정은 엔도글루코사미니다제 활성 직전에 이루어질 수 있다는 점 또는 조건은 세포 성장 동안 이미 조정되었을 수 있다는 점에 유의한다. 예를 들어, 피키아 세포는, 따라서, 특정 엔도글루코사미니다제의 최적의 활성을 위해 이미 조정된 산성이 상당히 강한 배지에서 성장하고, 단백질을 생성할 수 있다. 그러나, 일부 진핵 세포는 그의 완전성을 위해 N-글리코실화에 의존적이므로, 성장 배지의 pH를 엔도글루코사미니다제가 활성이 아닌 pH로 완충하고, 단백질 생성이 종료된 후에만 pH를 하향변화시키는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 또 다른 중요한 양태로서, 단일 GlcNAc N-글리칸을 포함하고, 뮤신 유형의 O-글리칸이 결여된 당단백질이 제공된다. 본 발명에 따르면, 상기 당단백질은 포유류 세포주 또는 유기체에서 상기 당단백질의 발현에 의해 얻어지며, 상기 포유류 세포 또는 유기체는 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 상기 포유류 세포주 또는 유기체는 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있다.
이전에 명시된 본 발명의 모든 특징 및 구현예는, 단일 GlcNAc N-글리칸을 포함하고, 뮤신 유형의 O-글리칸이 결여된 상기 당단백질이 얻어지는 과정을 추가로 명시하기 위해 사용된다는 점을 주목한다.
특정 구현예, 특정 구성뿐만 아니라, 재료 및/또는 분자가 본 발명에 따른 세포 및 방법에 대해 본 명세서에서 논의되었으나, 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화 또는 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 하기 실시예는 특정 구현예를 더 잘 설명하기 위해 제공되며, 이러한 실시에는 본 출원을 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 본 출원은 청구범위에 의해서만 제한된다.
실시예
실시예 1: HEK293 글리코결실 세포주의 생성.
본 실시예는 WO 2010/015722 및 문헌[Meuris et al.(Nat Biotechnol. 2014 32(5):485-9)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
간단히 말하면, 시험관내 탈글리코실화를 피하기 위해, 본 발명자들은 HEK293 세포주에서 생체내 탈-N-글리코실화를 구현하였다. 사상균류 트리코데마 레세이로부터 클로닝되는 이유로 엔도T(문헌[PhD thesis Ingeborg Stals, Ghent University, 2004])로서 지정되는 엔도H-유형의 엔도글리코시다제를 인코딩하는 균류 유전자(Genbank 수탁번호 CS423050)의 확인 및 클로닝은 본 발명자들로 하여금 이를 수행할 수 있도록 하였다. 본 작업을 글루코사미닐전달효소 I 음성 HEK 세포주(문헌[Reeves, Callewaert et al., PNAS. 99(2002): 13419-13424])에서 수행한다. 이 세포주는, 엔도H-유형의 엔도글리코시다제에 의해 키토비오스 결합에서 가수분해되는 Man5GlcNAc2-N-글리칸을 거의 독점적으로 생성한다.
엔도T는 T. 레세이(현재, 히포크레아 제코리나로 지정됨)에 의해 분비되며, 이는, 이것이 진핵생물 분비 경로에서 접힘 과정에 적용된다는 점을 시사한다. 단백질 접힘에서 N-글리칸의 기능을 방해하지 않기 위해, 엔도T는 트랜스- 골지/트랜스-골지망에 표적화된다.
전략
HEK293 세포주의 트랜스-골지/TGN으로의 엔도T 효소의 표적화를 골지-유지 글리코실전달효소의 트랜스-골지-표적화 신호의 융합에 의해 달성한다. 대부분의 골지-상주 글리코실전달효소는 스턱 영역(stalk region)에서 더 적거나 더 큰 정도로 단백분해 스플라이싱(proteolytic splicing)에 적용된다(문헌[Jaskiewicz, J. Biol. Chem. 271(42)(1996), 26395-26403]). 인간 β-갈락토시드-α-2,6-시알릴전달효소(ST6GalI) 또는 인간 강글리오시드-GM2-합성효소(GalNAcT) N-말단을 전장 엔도T 효소의 N 말단에 융합시킨다. β-갈락토시드-α-2,6-시알릴전달효소(ST6GalI)는 더 잘 특성화되어 있으며, 그의 N 말단은 트랜스-골지에 유지되나, 이는 여러 개의 절단 부위를 함유하며, 예상컨대 단백분해 과정에 적용될 것이다(문헌[Kitazume-Kawaguchi et al., Glycobiology 9(12)(1999), 1397-1406]).
GM2-합성효소 N 말단은 더 짧다: 단지 처음 27개의 아미노산이 트랜스-골지 체류를 결정하는 것으로 보이며(문헌[Uliana et al., Traffic 7(2006), 604-612]), 아미노산 22와 23 사이에 단지 하나의 카텝신-D 스플라이싱 부위를 함유한다(GL-LYAST)(문헌[Jaskiewicz, J. Biol. Chem. 271(42)(1996), 26395-26403]). 너무 많이 절단된 엔도T 융합 단백질이 분비되는 경우, 이 서열은 비스플라이싱 서열로 돌연변이된다.
단백분해 절단 및 표적화 및 다른 한편으로 생체내 탈-N-글리코실화의 효율을 평가하기 위해, 포유류 발현 벡터 pCAGGS(문헌[Niwa et al., Gene 108(1991), 193-200])를 사용하여, 일시적 포유류 발현을 위한 발현 작제물을 제조한다. 2개의 융합 단백질에 대한 MYC-태깅된 작제물은 세포 이하 위치화 실험 및 분비의 평가를 가능하게 한다. 세포 이하 위치화 실험을 양성 대조군으로서 트랜스-골지-표적화 pHluorin 작제물(http://www.bristol.ac.uk/synaptic/research/projects/mechanisms/phluorins.htm) 및 항-MYC 항체 면역형광 현미경을 사용하여 수행한다. MYC-태깅된 엔도T 단백질의 분비를 음성 대조군으로서 N 말단 골지-표적화 서열 없이, MYC-태깅된 엔도T를 사용하고, 항-MYC 항체에 의한 웨스턴 블롯에 의해 평가한다.
당단백질 헤마글루티닌 H3의 가용성의 분비 형태를 사용하여, HEK293 세포주를 공동형질감염시키며, 이는 엔도T 융합 단백질의 탈-N-글리코실화 활성의 평가를 가능하게 한다. 이러한 헤마글루티닌 코딩 서열을 또한 pCAGGS 벡터 내로 클로닝한다. 헤마글루티닌이 엔도T에 의해 세포내에서 탈글리코실화됨에 따라, 분자량의 변화를 SDS-PAGE에서 관찰한다.
이어서, 최대 골지-표적화 신호를 사용하여, 선택된 융합 단백질에 의해 최종 작제물을 제조한다. 항시적 발현뿐만 아니라, 테트라사이클린-유도성 발현이 고려된다.
테트라사이클린-유도성 발현의 경우, pcDNA4/TO(invitrogen) 벡터를 사용한다. 따라서, 안정한 세포주를 제오신(zeocin)에 의한 선택에 의해 생성한다. HEK293 GnTI-/- 세포주는 이미, Tet-억제인자 단백질을 인코딩하는 pcDNA6/TR 작제물을 함유한다. 이는 테트라사이클린이 첨가될 때까지, pcDNA4/TO 플라스미드(invitrogen)로부터 항시적으로 안정하게 발현되며, 전사를 억제한다.
항시적 발현을 위해, 항시적 프로모터 및 선택 마커(블라스티시딘(blasticidin)이 아님, 이미 pcDNA6/TR에서 사용됨)를 함유하는 임의의 포유류 발현 벡터를 사용할 수 있다.
실시예 2. 균류 엔도T 효소의 진핵생물 유기체의 분비 경로로의 표적화에 의한 당단백질의 생체내 탈-N-글리코실화.
포유류 세포에서의 엔도T 작제물의 일시적 형질감염
pCAGGS-hST-엔도T, pCAGGS-hST-엔도T-myc, pCAGGS-hGalNAcT-엔도T 및 pCAGGS-hGalNAcT-엔도T-myc를 WO 2010/015722 및 문헌[Meuris et al.(Nat Biotechnol. 2014 32(5):485-9)]에 기재된 바와 같이 생성하였다. 이들 플라스미드 및 또한 빈 pCAGGS 플라스미드를 사용하여, HEK293-Flt3 세포주를 일시적으로 형질감염시켰다. 음성 대조군으로서, 세포를 또한 DNA 없이 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 2일 전에 6 웰 플레이트에 200.000 세포/웰로 시딩하여, 세포가 형질감염 당일에 적어도 85% 내지 90% 컨플루언스(confluence)에 도달되도록 하였다. 형질감염 6시간 전에, 절반의 배지를 혈청 무함유 배지로 교체하고, 형질감염 3시간 전에, 모든 배지(3 mL)를 2 mL의 혈청-무함유 배지로 교체하였다. 500 μL 혈청 무함유 배지에서, 4 μg의 플라스미드 DNA와 10 μL의 리포펙타민 2000을 조합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션함으로써, DNA 리포플렉스(lipoplex)를 제조하였다. 인큐베이션 후, 리포플렉스를 세포에 첨가하고, 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 아침에, 30% 혈청을 함유하는 1 mL의 배지를 각각의 웰에 첨가함으로써, 총 혈청 농도가 10%가 되도록 하였다.
형질감염과 동시에, 2 μg/mL의 테트라사이클린 하이드로클로라이드를 각 웰에 첨가하여, Flt3 세포외 도메인(분비됨)의 생성을 유도하였다. 0,5 ml의 배지(세포 무함유)를 형질감염 48시간 및 72시간 후에 수집하고, 이후 분석시까지 -20℃에 저장하였다.
Flt3 검출을 위한 배지 샘플의 샘플 제조
(소 태아 혈청으로부터의) BSA를 함유하는 배지 샘플을 니켈 이온이 로딩된 킬레이트 세파로스 6B 비드(Chelating sepharose 6B bead)를 사용하여 세척하였다.
비드 제조: 500 μL의 비드에 1 mL의 100 mM 황산니켈을 로딩하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이것을 미세원심분리기에서 500 g에서 1분 동안 회전시키고, 상청액을 버렸다. 그 후, 이것을 1 mL의 PBS로 세척하고, 500 g에서 1분 동안 회전시키고, 상청액을 버렸다. 이 세척 단계를 5회 반복하고, 마지막 세척 후, 500 μL의 PBS를 첨가하였다.
his-태깅된 Flt3의 선택적 농화: 250 μL의 샘플에 동량의 2x PBS를 첨가하였다. 비드 슬러리(전술된 바와 같이 제조됨)로부터의 25 μL를 그에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 회전식 플랫폼에 인큐베이션하였다.
그 후, 비드를 500 g에서 1분 동안 회전시키고, 상청액을 버렸다. 0,5 mL의 PBS를 비드에 첨가하고, 이를 500 g에서 1분 동안 회전시키고, 상청액을 버렸다. 이 세척 단계를 총 3회 수행하였다.
비드를 250 μL의 PBS에 재현탁시켰다. 생성된 샘플 중 20 μL를 취하여 β-머캅토 에탄올이 포함된 3x Laemlli 완충액 10 μL를 첨가하고, 샘플을 5분 동안 가열하였다.
웨스턴 블롯에 의한 분비된 Flt3의 검출
샘플 제조 후, 각 샘플 30 μL를 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 구동시켰다. 겔을 니트로셀룰로스 막에 반건조 상태로 블로팅하고, 1/1000으로 희석된 일차 펜타-his 항체 및 1/5000으로 희석된 이차 항-마우스 IgG1에 의해 his-태깅된 Flt3 단백질의 검출을 수행하였다.
웨스턴 블롯에 의한 분비된 엔도T 작제물의 검출
또한, 동일한 배지 샘플을 사용하여 (단백분해 절단된) 엔도T 융합 단백질의 분비를 평가하였다. β-머캅토 에탄올이 포함된 3x Laemlli 완충액 10 μL를 원래의 샘플 20 μL에 첨가하고, 이를 10% SDS-PAGE 겔에서 구동시켰다. 니트로셀룰로스 막에 블로팅한 후, 1/3000으로 희석된 항-myc 일차 항체 및 1/5000으로 희석된 항-마우스 이차 항체를 사용하여 검출을 수행하였다.
결과
S. Savvides 교수진은, Man5GlcNAc2 N-글리칸을 거의 독점적으로 생성하는 모 세포주 HEK293-RicR로부터 HEK293-Flt3을 생성하였다. 이것은 인간 Flt3 수용체의 his-태깅된 세포외 도메인을 위한 안정한 형질감염 세포주이며, 이 단백질은 분비 경로를 통과한다.
포유류 세포로의 엔도T 작제물의 일시적인 형질감염
사용된 형질감염 프로토콜에 의해 본 발명자들은 약 30 내지 40%의 효율로 세포를 형질감염시킬 수 있었다(FACS에 의해 평가됨, 결과는 도시되지 않음). 매일 현미경으로 관찰한 결과, 엔도T 융합 단백질 또는 빈 pCAGGS 플라스미드 중 임의의 것의 형질감염 후, 음성 대조군 웰(DNA 부재 하의 형질감염)보다 성장이 느리거나 또는 현저한 세포 사멸이 나타나지 않았다.
Flt3 검출을 위한 배지 샘플의 샘플 제조
샘플의 다량의 소 혈청 알부민(BSA)(약 66 kDa에 구동됨)의 존재 및 분비된 비-탈글리코실화된 Flt3 수용체가 약 70 kDa에 구동된 점으로 인해, 70 kDa보다 약간 낮은 분자량에서의 BSA 영역에 구동된 Flt3의 면역검출 및 특히 이 단백질의 탈글리코실화된 형태의 검출은 과량의 BSA에 의한 비특이적 염색 및 실제 Flt3 신호의 차단에 의해 불분명하다. 따라서, 니켈 로딩된 킬레이트 세파로스 비드에 의한 세척 단계를 사용하여, 샘플로부터 Flt3를 일정한 정도로 정제하는 것이 간편하다. 이것이 his-태깅되어 있고, 검출이 가능해짐에 따라, 이 단계는 샘플에서 Flt3 분자를 선택적으로 농화시킨다.
Flt3 웨스턴 블롯 : 엔도T에 의한 처리
분비된 Flt3 세포외 도메인은 9개의 추정 N-글리코실화 부위를 함유한다(문헌[Rosnet et al., 1993]). 현재까지, 이 부위 중 7개가 N-글리칸에 의해 변형된 것으로 확인되었다(개인적으로 접촉함, K. Verstraete). 엔도T 융합 단백질에 의한 글리칸의 적어도 일부의 제거가 웨스턴 블롯에서 밴드 변화를 야기할 것으로 예상되며, 이는 실제로 그러하다(도시되지 않음). 형질감염 및 유도 2일 후, pCAGGS-hST-엔도T 및 pCAGGS-hST-엔도T-myc 형질감염된 세포에 의해 생성된 Flt3의 일부 처리가 관찰될 수 있다. 3일 후, 엔도T 형질감염된 세포에 의해 생성된 임의의 샘플에서 완전히 글리코실화된 Flt3은 더이상 관찰할 수 없다. myc-태깅된 엔도T 융합 단백질에 의해 형질감염된 세포로부터 유래한 Flt3 밴드가 비-myc-태깅된 엔도T 융합 단백질 형질감염된 세포로부터의 하나와 동일한 거동을 나타낸다는 점은 두 경우 모두 c-myc 태그가 융합 단백질의 기능을 심각하게 방해하지 않는다는 것을 시사한다.
웨스턴 블롯에 의한 엔도T 작제물의 검출
또한, 엔도T 융합 단백질 작제물 둘 모두를 c-myc 태그로 C-말단에 태깅시켰다. 이는 단백분해 과정의 평가 및 엔도T 융합 단백질의 골지-내강 도메인의 후속 분비를 가능하게 하며, 이는 그 후 웨스턴 블롯에 의해 상청액에서 검출되어야 한다. 이는 실제로 엔도T가 인간 GM2-합성효소의 표적화 도메인의 N 말단에 융합된 경우(pCAGGS-hGalNAcT-엔도T-myc) 그러하다(도시되지 않음). 아미노산 22와 23 사이의 카텝신 D 유사 스플라이싱 부위(GL-LYAST)에서의 처리에 의해, 약 39,1 kDa의 분비된 단편(비글리코실화된 myc-태깅된 형태)이 생성될 것이다. 분비된 단편은 대략적으로 이 정도의 크기를 갖는다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔은 pCAGGS-hGalNAcT-엔도T 및 pCAGGS-hGalNAcT-엔도T-myc 형질감염된 세포로부터의 상청액 샘플이 로딩된 레인에서 작지만 윤곽이 뚜렷한 밴드를 나타내며, MW의 약간의 차이는 myc-태그(1,2 kDa)의 존재 또는 부재에 기인한다(도시되지 않음).
인간 β-갈락토시드-α-2,6-시알릴전달효소(hST)의 표적화 도메인에 융합된 엔도T는 pCAGGS-hST-엔도T-myc 플라스미드에 의한 형질감염 3일 후, 웨스턴 블롯에 의해 어떠한 단편도 검출할 수 없으므로, 상당한 양으로 분비된 것으로 보이지 않는다. 융합 단백질의 처음 27개의 아미노산은 세포질 및 막관통 도메인을 구성한다. 이는 이론적으로, 아미노산 27과 100 사이(이것은 사용된 hST의 일부분임)의 임의의 부분에서 단백분해 스플라이싱이 발생하여, 38,6 kDa 내지 46,5 kDa의 단편이 생성될 수 있음을 의미한다. N-글리칸이 Man5GlcNAc2-형태로 존재한다는 점을 감안하여, N-글리칸이 존재한다고 해도(엔도T의 경우 4개의 부위에 존재하며, hST 표적화 도메인의 경우 부재함), 이 단백질은 BSA 외부의 약 66 kDa (약 60 내지 70 kDa)의 영역을 차단할 것이며, 따라서 웨스턴 블롯에서 검출될 것이다. 또한 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔은 음성 대조군 레인(빈 pCAGGS에 의한 형질감염)에는 존재하지 않는 가외의 밴드가 없음을 보여준다(도시되지 않음). 이 모든 사실은 엔도T 단백질이 실제로 세포 내부에 잔류함으로써, 효율적으로 표적화된다는 것을 시사한다.
실시예 3. 글리코이중결실 세포주의 생성
전략
본 발명자들의 목적은 뮤신 유형의 O-글리코실화가 완전히 결여된 세포주를 생성하는 것이다. 이어서, 이 세포주를 글리코결실 엔지니어링과 조합함으로써, O- 및 N-글리칸 이종성이 둘 모두 현저히 감소된 '글리코이중결실' 세포주를 생성한다. 이러한 세포주는, 올바른 접힘을 매개하기 위해서는 N-글리칸이 필요하지만, 완전히 성숙된 N- 또는 O-글리칸이 기능할 필요는 없는 당단백질의 생성에 유용할 것이다. 예를 들어, 결정학에서, 글리칸 이종성은 결정 형성을 방해할 수 있다. 이에 더하여, 글리칸은 생물약제의 효능, 활성 및 안정성에 영향을 미치는 것으로 인식되어 있지만, 글리칸 이종성은 배치(batch)마다 다를 수 있으며, 이는 약제학적 단백질의 특성이 동일하게 달라질 수 있음을 의미한다.
글리코결실 세포에 사용된 것과 유사한 효소 전략은 O-글리칸에서는 불가능하다. 글리코결실 세포에서, 엔도T 효소는 합성된 모든 N-글리칸을 인식한다. O-글리칸의 경우, 뮤신 유형의 O-글리칸의 복합체 및 다양한 혼합물의 모든 구성원을 인식하는 이러한 효소는 공지되어 있지 않다. 따라서, 본 발명자들은 O-글리칸 조립의 초기 단계에서 유전자를 넉아웃(knocking out)시킴으로써, O-글리코실화 생합성 경로를 표적화하고자 했다. 트리만노실 코어를 모두 공유하는 N-글리칸과는 달리, 뮤신 유형의 O-글리칸은 구조적으로 거의 공통점이 없다. 세린 또는 트레오닌과의 GalNAc 연결은 O-글리코실화를 개시시킨다. 이는 상이한 뮤신 유형의 O-글리칸의 유일한 공통 잔기이다. 그러나, O-글리코실화 개시 효소인 폴리펩타이드-GalNAc-전달효소(ppGalNAcT) 계열의 표적화는, ppGalNAcT 계열이 20개 초과의 구성원을 가지므로, 장기간이 소요되는 과정이 될 것이다. 본 발명자들이 표적화할 수 있는 하나의 공유 특성은 ppGalNAcT 계열에 의해 사용되는 기질이다: UDP-GalNAc. UDP-GalNAc가 제공되는 2가지 경로가 있다: 외부 또는 내부 대사 분자로부터의 회수 또는 UDP-GlcNAc를 통한 중심 탄소 대사로부터의 새로운 조립. UDP-GlcNAC의 UDP-GAlNAc로의 에피머화는 UDP-갈락토스-4'에피머라제(GalE)에 의해 촉매된다. CHO 세포에서 수용체 매개된 엔도시토시스를 연구하는 실험 동안, GalE은 우연히 넉아웃됨으로써, UDP-GalNAc 및 UDP-Gal의 결핍이 야기되었다(문헌[Krieger et al. J. Mol. Biol. 150, 167-184(1981)]). 이들 세포에서 생성된 단백질에는 임의의 뮤신 유형의 O-글리칸이 결여되어 있다(문헌[Kingsley et al. Cell 44, 749-759(1986)]). 따라서, 본 발명자들은 HEK293 세포에서 GalE 유전자를 표적화하기로 결정하였다.
저자에 따르면, CHO GalE KO를 단리하기 위해 사용된 선택 방법은 단지 하나의 GalE 결함 클론을 생성하였다. 추가로, 실험을 결코 반복할 수 없었다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 절차를 반복하지 않고, 새로운 접근법의 설계를 선택하였다. 본 발명자들의 목적은 게놈 편집 툴을 사용하여, HEK293 세포에서 GalE을 넉아웃 시킴으로써, 그의 단백질에 도 1의 A에 도시된 바와 같은 N-글리칸이 장착되어 있으며, O-글리칸이 부재하는 O-글리코실화 결함 HEK293 세포를 생성하는 것이었다. 글리코결실 세포에 이 접근법을 적용함으로써, 이른바 이러한 글리코이중결실 세포(도 1의 B)에서 N- 및 O-연결 글리칸 둘 모두로부터 유래하는 이종성을 해결하고자 했다.
게놈 편집 툴에 의해 실제로 표적 서열이 편집되는 것을 보장하기 위해, 본 발명자들은, 우선, 시험관내 분석에서 새롭게 설계된 표적화된 뉴클레아제를 완전히 특성화함으로써, 상향식 접근법을 따랐다. 이에 더하여, 본 발명자들은 또한, 생체내 시험을 가능하게 하는 서베이어 분석(재료 및 방법 섹션에 기재됨)을 수행하기 위한 올바른 조건을 발견하였다. 본 발명자들의 성공 가능성을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 닉카제 Cas9 대신에 WT Cas9를 사용한 KO의 생성에 집중하였으며, 이는 후자의 절단 빈도가 훨씬 더 낮기 때문이다.
단시간 대에 상대적으로 용이한 스크리닝을 가능하게 하는 스크리닝 방법이 필요하였다. 여러 가지 표현형 기반의 스크리닝 방법을 사용하였으나, 양성 대조군이 없는 관계로, 스크리닝 방법이 실패했는지 또는 스크리닝된 세포에 넉아웃이 완전히 존재하지 않는지가 항상 불명확하였다. 게놈 수준에서의 스크리닝이 또한 문제가 되는데, 본 발명자들은 게놈 DNA 조제물당 약 백만개의 세포가 필요하였으므로, 세포주의 확장이 필요하였다. 추가로, 본 발명자들은 노동 집약적이며, 시간 소모적인 전략인 서열분석을 위해, PCR 증폭된 단편을 벡터내로 클로닝하여야 했다. 스크리닝에서 나타난 문제점들을 게놈 및 표현형 수준 둘 모두에서 접근하였다. 게놈 수준에서, 본 발명자들은 합리적인 시간대 내에 수십 개의 클론을 스크리닝할 수 있도록 하는 강력한 특이적 중합효소 및 빠른 게놈 DNA 단리 방법의 조합을 최적화하였다. 표현형 수준에서, 본 발명자들은 잠재적인 GalE KO 클론에서 hGM-CSF를 발현시켰다. 본 발명자들은 이전에, O-글리칸 시알산의 제거가 SDS-PAGE 겔에서 검출될 수 있으므로, O-글리칸의 전체 제거가 훨씬 더 큰 분자량 변화를 야기하여야 한다는 것을 밝혀내었다(문헌[Meuris, L. et al. Nat. Biotechnol. 32, 485-489(2014)]).
가이드 조립 및 활성 평가
GalE 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 표적화하는 3개의 가이드를 MIT(CRISPR.MIT.EDU)로부터 이용 가능한 온라인 툴에 의해 설계하였다. 그의 서열은 표 1에서 찾아볼 수 있다. 이들 가이드에 의해 표적화되는 GalE 유전자의 좌위는 도 2에 표시되어 있다. 여기서, 이들 가이드를, 문헌[Ran et al(Ran, F. A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281-2308(2013))]으로부터의 지침에 따라, Feng Zhang의 실험실로부터의 PX458 벡터내로 클로닝하였다. 가이드의 클로닝 부위 외에도, 이 벡터는 또한 Cas9-GFP 발현 카세트를 가지며, 여기서 GFP 유전자의 발현이 Cas9 발현에 커플링된다. GFP를 발현하는 세포는 또한 Cas9 단백질을 발현해야 하는데, 그 이유는 그 발현이 동일한 프로모터로부터 유도되기 때문이다. 2개의 코딩 서열은, 리보솜이 생성된 mRNA에서 특정 스트레치의 CDS의 누락을 야기함으로써, 동일한 mRNA로부터 2개의 개별 폴리펩타이드 사슬을 생성시키는 바이러스 유래의 DNA 요소인 2A 서열에 의해 분리된다.
Figure pct00001
생존 세포에서 게놈 편집 이벤트를 얻기 위해 시도하기 전에, 본 발명자들은 시험관내에서 합성된 가이드 RNA 및 재조합 생성된 Cas9를 사용하여, 표적 영역의 PCR 증폭된 DNA를 분해시킴으로써, 선택된 가이드의 절단 효율을 평가하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 3개의 가이드 모두 GalE 유전자의 1805 bp 길이의 PCR 증폭된 단편을 예상 크기의 단편으로 처리한다(표 2).
Figure pct00002
가이드를 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 HEK293 세포를 사용하여, 백만개의 세포를 3개의 상이한 가이드에 의해 형질감염시켰다. 72시간 후, GFP 양성 세포는 풀에서 FAC 분류하였다. 이 풀로부터의 세포를 수집하고, 그의 게놈 DNA를 단리하였다. 표적화된 영역을 PCR 증폭시켰다. 서베이어 분석(도 4)을 사용함으로써, 본 발명자들은, 가이드 1 및 가이드 3은 생체내에서 표적 단편을 절단할 수 있었으나, 가이드 2는 활성이 없는 것으로 확인되었다고 결론지을 수 있었다. 표 3은 예상 단편 크기를 표시한다.
Figure pct00003
HEK293GalE -/- KO 생성 및 분석
유전자형 스크린의 개발 및 클론 선택에의 적용
가이드 1 및 3 둘 모두가 생체내 게놈 편집을 달성할 수 있다는 것을 성공적으로 입증한 후, 본 발명자들은 HEK293 세포를 가이드 1 및 3에 의해 다시 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후, 세포를 96 웰 플레이트에서 웰 당 하나의 세포로 FACS 분류하였다. 34개의 클론이 안정한 단일 세포주 유래 콜로니로 성장하였으며, 확장되었다. 본 발명자들은, 각각의 클론 중, 게놈 DNA 추출을 위해, 2*105 세포를 수집하여, 100 μl의 QuickExtract 완충액에서 용해시켰다. 이 방법의 경우 DNA 정제 단계가 필요하지 않으므로, 다른 세포 용해물과 혼합된 게놈 DNA의 조 추출물이 생성된다. 다량의 오염물로 인해 샘플의 게놈 DNA 농도를 측정하는 것은 어렵다. 상이한 PCR 반응에 유사한 양의 게놈 DNA를 첨가하기 위해, 본 발명자들은 매번 동량의 완충액 중에 동량의 세포를 용해시키고, 10 μl의 총 PCR 용적당 1 μl의 조 게놈 DNA 혼합물을 사용하였다. 본 발명자들은 또한, 정확도가 높은 본 발명자들의 표준 중합효소가 조 게놈 DNA 추출물에 존재하는 잔류 산물로부터 영향을 받아, 그 후, 표적화된 영역의 불량한 증폭을 야기하거나, 증폭의 부재를 야기함을 발견하였다. 따라서, 중합효소로서 Kapa HiFi를 사용하는 것이 필수적이었으며, 이에 의해 게놈 DNA 품질에서의 매우 광범위한 가변성이 처리될 수 있는 것으로 나타났다. 과거에는 이 PCR 산물을 TOPO 벡터에 클로닝하였으며, 이는 PCR 산물의 직접적 서열분석이 종종, 낮은 DNA 순도로 인해, 나쁜 판독 결과를 야기하기 때문이다. 그러나, 자기 비트(magnetic beat)를 이용한 PCR 앰플리콘의 정제는 고순도의 DNA 샘플을 생성하였으며, 이는 내재된 프라이머를 사용한 직접적 생어 서열분석(Sanger sequencing)을 가능하게 하였다. 이로써 중간 클로닝 단계의 필요성이 제거되므로, 결과적으로 며칠의 분석 시간이 단축되었다. 생어 서열분석에 의해 21개의 클론에서 편집된 것으로 나타났으며, 13개는 여전히 야생형이었다.
HEK293 세포의 배수성으로 인해, 상이한 GalE 대립유전자의 편집 방법을 결정하는 것은 어렵다. 종래에, HEK293 세포의 전체 게놈 서열분석에 의해, HEK293 세포의 경우, GalE 유전자의 위치에서 2,72의 배수성 수준으로 나타났으며, HEK293글리코결실 세포의 경우, 3,48로 나타났다(문헌[Lin, Y.-C. et al. Genome dynamics of the human embryonic kidney 293 lineage in response to cell biology manipulations. Nat. Commun. 5, (2014)]). 생어 서열분석에 의한 PCR 증폭 단편의 서열분석의 경우, 상이한 대립유전자로부터의 판독결과는 도 5의 가이드 3에 예시된 바와 같이, 서로 중첩되어 있으며, 해석하기가 어렵다.
중첩된 서열분석 데이터의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 TIDE라는 온라인 툴을 사용하였다. 이 툴은 삽입결실이 발생하는 빈도를 추정하기 위해, 생어 서열분석 판독결과를 데콘볼루션(deconvolution)하고, 분해한다(문헌[Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M. & van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42, e168-e168 (2014)]). TIDE는 서베이어 분석의 대안으로 세포 풀로부터의 데이터를 분석하도록 설계되었다. 그러나, 본 발명자들은 대립유전자 변이를 찾기 위해 이 툴을 전용하였다. TIDE 분석에 의해, 9개의 클론이 모든 대립유전자에서 기능 돌연변이가 상실된 것으로 나타났음이 밝혀졌다. 본 발명자들은 이들 9개의 클론으로부터 일루미나 서열분석 어댑터(illumina sequencing adapter)를 보유하는 프라이머에 의해 편집된 영역을 PCR 증폭시켰다. 이는 본 발명자들로 하여금, 앰플리콘을 심층적으로 서열분석하고, 상이한 대립유전자에서 상이한 삽입결실의 포괄적인 분석을 생성할 수 있도록 하였다. 각각의 삽입결실의 범위를 계수함으로써, 편집 빈도를 계산하였다. 표 4에서 인식될 수 있는 바와 같이, TIDE 및 일루미나 서열분석으로부터의 결과는 대부분의 클론에서 일치한다.
Figure pct00004
hGM - CSF 처리에 기반한 추가 클론 선택
O-글리코실화된 단백질에 대한 이러한 KO의 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 인간 GM-CSF(hGM-CSF) 발현 플라스미드에 의해 상이한 클론을 형질감염시켰다. 본 발명자들이 인식하고 있는 바로는, hGM-CSF는 구조가 다른 최대 4개의 O-글리칸 및 최대 2개의 N-글리칸을 보유할 수 있는 작은 사이토카인이다. 이종성 O-글리코실화는 SDS-PAGE 겔에서 스미어링을 야기한다. 이는 도 6의 GD 레인 및 HEK293 레인에 도시되어 있다. 본 발명자들의 클론에 생성된 hGM-CSF 샘플에서의 이러한 광범위한 스미어링의 부재는 뮤신 유형의 O-글리코실화의 결핍을 시사한다. 실제로, 웨스턴 블롯에 의한 분석에 의하면, 3개의 N-글리코형을 나타내는 3개의 개별 밴드만이 구별 가능하며, 스미어링은 분명하지 않은 것으로 나타난다. 낮은 분자량에서 높은 분자량 순으로, 밴드는 N-글리칸이 부재하는 hGM-CSF, 1개의 N-글리칸이 장착된 hGM-CSF 및 2개의 N-글리칸이 장착된 hGM-CSF를 나타낸다. 또한, UDP-Gal 및 UDP-GalNAc의 결핍으로 인해, N-글리칸은 추가의 돌연변이가 저지되므로, 도 6에 도시된 바와 같이, 나머지 3개의 글리코형이 SDS-PAGE 겔의 개별 밴드로 분리된다. 결과적으로, 본 발명자들은 선택된 클론 중 여전히 기능적 GalE 효소를 발현하는 것은 없다고 결론지었다.
본 발명자들은 최종적으로, 그의 성장이 빠르고, 단백질 발현의 수율이 높은 하나의 클론(3:1H6)을 선택하였다.
HEK293글리코이중결실
HEK293글리코이중결실 세포주를 생성하기 위해, HEK293GalE-/- 세포의 생성시와 동일한 CRISPR/Cas9 작제물을 사용하여 HEK293글리코결실 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후에 단일 세포를 분류하였다. 18개의 클론이 성장을 개시하여, 24 웰 플레이트로 확장하였다. 본 발명자들은 이것을 hGM-CSF 발현 플라스미드에 의해 혈질감염시키고, 전술된 바와 동일한 방식으로 웨스턴 블롯에서 글리코프로파일을 조사하였다. 도면에서 인식될 수 있는 바와 같이, 대부분의 이러한 클론에서 발현된 hGM-CSF는 분자량이 현저하게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 기능 상실 GalE 돌연변이를 시사한다. 본 발명자들은 엔도T 처리시에 GalE 기능 및 클론 차이점에 따라, 3개의 상이한 유형의 hGM-CSF 처리로 구별할 수 있었다. 제1 유형(도 7에서, N으로 표시됨)에서, O-글리코실화로 인한 스미어링이 여전히 목도되며, 결과적으로 세포는 여전히 적어도 하나의 기능적 GalE 유전자 복제물을 보유하고 있었다. 제2 hGM-CSF 샘플 유형(도 7에서 B로 표시됨)은 GalE이 성공적으로 넉아웃되고, (엔도T가 모 세포에서 활성이었을 지라도) 엔도T 활성이 감소하거나, 결핍된 세포로부터 유래한 것이다. 결과적으로, 이들 세포는 현저히 더 낮은 분자량을 가지나, 1 및 2개의 N-글리코실화 부위가 여전히 검출 가능한 N-글리코형을 가진 hGM-CSF를 생성한다. 마지막으로, 본 발명자들은, 잔류하는 글리칸 이종성이 거의 관찰되지 않는 제3 유형의 hGM-CSF 처리를 관찰하였고, 이는 도 7에서 A로 표시하였다. 본 발명자들은 추가로 이들 세포를 HEK293글리코이중결실로 칭하였다.
HEK293글리코이중결실 세포를 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 성공적인 GalE 넉아웃, hGM-CSF의 N-글리칸의 적절한 엔도T 처리, 빠른 세포 성장 및 높은 재조합 단백질 발현 수준을 기반으로 하여, 클론을 선택하였으며, 이는 도면에서 별표로 표시하였다.
MALDI - TOF 글리칸 특성화
새로운 두 세포주 모두를 추가로 특성화하기 위해, 선택된 HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 클론 세포주에서 생성된 hGM-CSF를 정제하였다. 이들 hGM-CSF 샘플의 트립신 처리에 의한 펩타이드를 MALDI-TOF 질량 분광분석기로 분석하여, GalE KO가 O-글리코실화의 폐기를 야기함을 확인하였다.
hGM-CSF는 4개의 가능한 O-글리코실화 부위를 가지며, 이들 모두는 동일한 트립신 처리에 의한 펩타이드 (SPSPSTQPWEHVNAIQEAR, 표적 Thr 및 Ser 잔기에 밑줄이 그어져 있음) 상에 위치한다(문헌[Kaushansky, K., Lopez, J. A. & Brown, C. B. Role of carbohydrate modification in the production and secretion of human granulocyte macrophage colony-stimulating factor in genetically engineered and normal mesenchymal cells. Biochemistry (Mosc.) 31, 1881-1886 (1992)]). 도 8의 스펙트럼에 나타낸 바와 같이, HEK293 및 HEK293글리코결실 세포 둘 모두는 이러한 펩타이드를 여러 유형의 O-글리칸으로 장착시킨다. 본 발명자들은 O-글리코실화 부위가 부재하는 당펩타이드, 1개의 O-글리코실화 부위가 점유된 당펩타이드 또는 2개의 O-글리코실화 부위가 점유된 당펩타이드만을 검출할 수 있었다. 그러나, 2개 초과의 O-글리칸을 보유하는 펩타이드는 증가된 이종성을 가지며, 이는 가능하게는 검출 한계 이하로 신호가 스미어링되게 하므로, 더 많은 부위의 변형이 배제되는 것은 아니다. 추가로, 이러한 당펩타이드는 잠재적으로 더이상 쉽게 이온화되지 않는다. HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 생성된 hGM-CSF의 스펙트럼에서, 이러한 O-연결 글리코형은 검출되지 않았으며, 이는 GalE-/- 세포에서의 O-글리칸의 부재를 확인시켰다. 본 발명자들은 HEK293GalE-/- 세포주에서 잔류하는 GalE 활성 신호를 관찰할 수 없으며, 따라서 본 발명자들은 완전한 GalE 넉아웃을 성공적으로 생성하였다고 결론지었다. 놀랍게도, 배양 배지로부터 제거된 갈락토스 또는 GalNAc는 종국에는 글리칸에 존재하지 않는다.
HEK293글리코이중결실 세포에서 생성된 hGM-CSF의 경우, 도 9에 도시된 바와 같이, N-연결 글리칸에서 갈락토실화가 검출되지 않았다. 이러한 관찰은 모 HEK293글리코결실 세포주와 비교하여, HEK293글리코이중결실 세포주에서 N-글리칸의 상동성이 추가로 증대된 것을 확인시킨다. 중요하게는, 처리되지 않은 Asn-GlcNAc2-Man5 글리칸을 보유하는 당펩타이드가 검출되지 않았다(데이터가 도시되지 않음). 이는, 초기 클론 중 일부에서 관찰된 바와 같이, 불완전한 엔도T 처리를 시사할 것이다(도 7에서 B로 표시된 레인 참조). 결론적으로, HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포주에서 hGM-CSF 단백질의 발현시, 잔류하는 GalE 활성 신호는 관찰될 수 없다. 추가로, 본 발명자들은 MALDI-TOF 질량 분광분석기에서 무손상 hGM-CSF를 분석하였다. HEK293 및 HEK293글리코결실 hGM-CSF를 HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 생성된 hGM-CSF와 비교하였다(도 10). 제1 레인은 HEK293 hGM-CSF의 스펙트럼을 도시한다. 이종성 N- 및 O-연결 글리코형은 광범위한 이종성 신호로 확산시킨다. 도면의 레인 2는 HEK293GalE-/- 세포에서 생성된 hGM-CSF를 도시한다. 이 스펙트럼에서, 본 발명자들은 더 높은 분자량에서 완전히 글리코실화되지 않은 피크 및 2개의 더 작은 스미어링을 검출할 수 있었다. PNGaseF 처리시, 이러한 2개의 작은 스미어링의 주요 분획이 분해되었다 (도 11). 비록 불완전하지만, 이러한 분해는 HEK293GalE-/- 세포의 잔류 이종성이 N-글리코실화로부터 유래한 것이라는 것을 확인시킨다. 글리코결실을 통해 이러한 N-글리코실화 이종성을 처리하는 경우, 3개의 가능한 글리코결실 N-글리칸의 남은 부분이 검출될 수 있으나, 그 신호는 여전히 O-글리칸 이종성으로 인해 스펙트럼 전반에 걸쳐 스미어링된다(도 10, 레인 3). HEK293글리코결실 세포에서 GalE KO의 조합시, O- 및 N-연결 글리칸 이종성 둘 모두는 상당히 감소되며, 이는 HEK293글리코이중결실 hGM-CSF를 도시하는 도면의 마지막 레인에 예시된 바와 같다. 여기서, GlcNAc 잔기가 부재하는 hGM-CSF, 1개의 GlcNAc 잔기가 장착된 hGM-CSF 또는 2개의 GlcNAc 잔기가 장착된 hGM-CSF만이 검출될 수 있었다. 결과적으로, 스펙트럼에서 검출된 잔류 이종성은 차등적 N-글리칸 부위 점유율로부터 유래한다. 16844 Da의 m/z에서, 올리고만노스 N-글리칸이 장착된 hGM-CSF의 분자량에 상응하는 작은 피크가 검출된다. PNGaseF 분해는 이 피크가 N-글리칸임을 확인시킨다(도 12).
무손상 hGM-CSF를 또한 qtof MS에서 더욱 고분해능으로 분석하였다(도 14). 이는 더욱 상세한 세부사항과 함께 이전 결과를 확인시켰다. 본 발명자들은, 데콘볼루션하기에는 너무 복잡하여, HEK293에 의해 생성된 hGM-CSF의 스펙트럼을 얻을 수 없었다.
본 발명자들은 다시 GalE KO 세포주에서 O-글리칸이 검출되지 않았다고 결론지었다. HEK293글리코이중결실 세포는 매우 상동성의 글리코프로파일을 가지고, 2개의 hGM-CSF N-글리코실화 부위의 상이한 부위-점유율로부터 유래한 3개의 피크를 제외하고, 이종성이 부재하였으며, 단지 단일 GlcNAc가 장착되었다.
논의
HEK293글리코결실 세포는 N-글리코실화의 이종성을 해결한다. 그러나, 단백질 글리코실화는 주로 O-연결 및 N-연결 탄수화물의 두 가지 유형으로 나뉜다. 완전한 상동성의 당단백질을 생성하고자 하는 경우, O-글리코실화는 글리코결실-생성 단백질의 이종성의 가장 중요한 잔류 원인이다. UDP-GlcNAc를 UDP-GalNAc로 에피머화하는 GalE 유전자를 넉아웃함으로써, 본 발명자들은 HEK293 세포로부터 UDP-GalNAc를 제거하고, 결과적으로 단백질 상에서의 임의의 뮤신 유형의 O-글리코실화를 방지하였다. 갈락토스 또는 GalNAc가 장착된 잔기가 검출되지 않으므로, 대안적 회수 경로가 활성화되지 않았거나, 필요한 전구체를 제거하지 못하는 것으로 나타났다. hGM-CSF 발현 동안 사용된 배지(FreeStyle 293 발현 배지)의 갈락토스 및 GalNAc 농도는 개시되어 있지 않으므로, 본 발명자들은 회수된 뉴클레오타이드 당의 결핍을 배지 중에 이것이 부재한다거나, 세포에서 회수 경로가 비활성화되거나, 파괴된 것으로 배당할 수 없다. GalE KO 전략을 HEK293글리코결실 세포와 조합함으로써, 본 발명자들은 HEK293글리코이중결실 세포를 생성하였다. 이 세포들은 필수 및 복합 PTM을 가지나, 이러한 PTM에 의해 야기되는 내재된 이종성이 부재하는 단백질을 발현할 수 있다. HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포 둘 모두에서 예상 글리코형은 질량 분광분석에 의해 확인할 수 있다.
본 발명자들은 이들 2개의 새로운 세포주를 이용하여, 현재 야생형 HEK293 세포, N-글리코실화가 감소된 HEK293 세포, O-글리코실화가 부재하는 HEK293 세포 또는 O-글리코실화가 부재하고, N-글리코실화가 감소된 HEK293 세포에서의 단백질의 생성을 선택적으로 선택할 수 있다. (hGM-CSF) 글리칸 이종성에 영향을 미치는 상이한 가능한 세포주들의 개괄이 도 13에 제공되어 있다.
GalE KO의 생성을 통해, 본 발명자들은 게놈 편집을 위한 클론의 고 처리량의 스크리닝을 가능하게 하는 프로토콜을 최적화하였다. 표현형 hGM-CSF 발현 스크리닝은 매우 유용하나, 글리칸 엔지니어링에 적용이 제한된다. 일반적으로, 게놈 엔지니어링을 통한 새로운 세포주의 생성을 위한 표현형 스크리닝은 모두 동일한 단점이 있다: 이러한 세포주가 처음 생성되는 것이므로, 이들에는 양성 대조군이 없다. 부록 'The road to nowhere'에서 여러 번 예시한 바와 같이, 표현형 스크리닝이 작동하지 않는지 또는 정확하게 올바른 클론이 존재하지 않는지를 평가하는 일은 어려울 수 있다. 따라서, 용이하게 적용할 수 있는 대량 처리량의 게놈 스크리닝이 필수적이다.
표현형 스크리닝과 달리, 게놈 스크리닝에 사용되는 프로토콜은 다른 표적에 용이하게 적용될 수 있다. 초기에 본 발명자들의 게놈 스크리닝 방법은 매우 장기간이 소요되고, 집중적인 작업을 요하였다. 더욱이, 잠재적인 올바른 클론이 중간에 성장함으로써, 세포를 유지하거나, 동결시키기 위한 추가 작업이 요구되었다. 이 작업에 최적화된 프로토콜을 사용하여, 본 발명자들은 현재 하루에 수백개의 클론을 스크리닝할 수 있다. 잠재력의 예시로서, 본 발명자들은 Cas9n 가이드에 의한 상동성 재조합 넉인(knocking in) 이벤트를 목적으로 하여, 더욱 대량의 스크리닝을 수행하였다. 샘플의 스마트 풀링과 유전자형 스크리닝을 조합함으로써, 본 발명자들은 125개의 클론을 스크리닝하여, 2개의 세포주가 넉인 작제물을 보유함을 확인하였다(문헌[Tabak, L. A. The role of mucin-type O-glycans in eukaryotic development. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 616-621 (2010)]). 특히, 이 섹션에서 진행되는 일루미나 샘플 제조와 조합하여, 수일내에 수백개의 클론의 스크리닝이 가능하게 된다. 이로써, 세포가 성장하여, 완전한 컨플루언스를 이루기 전에, 스크리닝이 종결될 수 있으므로, 이들을 유지하기 위한 잠재적 클론의 추가 처리가 또한 회피된다.
중요하게는, 293 GalE KO 세포는 15회 이상의 계대배양 동안 유지되었고, 주요 성장 결함이 검출되지 않았다. 또한, 발현 수준은 급격하게 감소하는 것으로 나타나지 않았다. 글리코결실 GalE KO는 5회 초과의 계대배양 동안 유지되었으며, 또한, 주요 성장 결함이 검출되지 않았다. 또한, 이때 발현 수준은 WT HEK 세포와 비교하여, 대폭 감소하지 않았다.
실시예 4. hEPO - His6의 발현
이전에 제시된 연구결과들을 분명하게 보여주기 위해, His6-태깅된 인간 EPO를 부착된 HEK293, HEK293글리코결실, HEK293Gale-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 안정하게 발현시켰다.
HEK239, HEK239GalE-/-, HEK239글리코결실, 및 HEK239글리코이중결실 세포를 DMEM/F12 배지 + 10% FCS 중에서 6 웰 플레이트에 시딩하였다. 시딩 24시간 후, 배지를 흡인하고, 3 ml의 혈청-무함유 FreeStyle 293 배지로 교체하였으며, hEPO를 인코딩하는 발현 벡터에 의해 세포를 형질감염시키거나, 모의 형질감염시켰다(FuGENE HD; 제조사의 지침에 따름). 형질감염 5일 후, 상청액을 수집하였다.
상청액 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석하였다(도 15). hEPO-His6은 HEK293(레인 1), HEK293GalE-/-(레인 2), HEK293글리코결실(레인 3), 및 HEK293글리코이중결실(레인 4) 세포에서 안정하게 발현되었다. 분자량의 분명한 변화가 관찰될 수 있다. 이는 HEK293글리코결실 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 N-글리칸의 감소 및 HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 O-글리칸의 부재에 상응한다.
정제된 hEPO-His6의 트립신 처리에 의한 펩타이드를 ESI-LC-MS 질량 분광분석기에서 분석하였다.
질량 분광분석 데이터는 뮤신 유형의 O-연결 글리코실화의 표적 부위로서 트립신 처리에 의한 펩타이드 EAISPPDAASAAPLR을 확인시켰다(표적 Ser 잔기에 밑줄 그어짐, 도 16). HEK293 및 HEK293글리코결실 세포는 이러한 펩타이드를 O-글리칸으로 장착시킬 수 있다. 점유된 O-글리코실화 부위가 부재하는 펩타이드, 1개의 점유된 O-글리코실화 부위를 갖는 펩타이드 또는 2개의 점유된 O-글리코실화 부위를 갖는 펩타이드가 검출되었다. HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 생성된 hEPO-His6의 스펙트럼에서, O-연결 글리코형이 검출되지 않았으며, 이는 GalE-/- 세포에서의 뮤신 유형의 O-글리칸의 부재를 확인시키는 것이다.
실시예 5. 에타너셉트의 발현
개념 증명으로, Fc 꼬리와 인간 TNF 수용체 2 사이의 융합으로 이루어지고, 다수의 O- 및 N-글리코실화 부위를 함유하는 에타너셉트(Enbrel)를 HEK293, HEK293글리코결실, HEK293Gale-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 발현시켰다.
모든 세포주를 DMEM/F12 배지 + 10% FCS 중에서 6 웰 플레이트에 시딩하였다. 시딩 24시간 후, 배지를 흡인하고, 3 ml의 혈청-무함유 FreeStyle 293 배지로 교체하였으며, 에타너셉트(Enbrel)를 인코딩하는 발현 벡터에 의해 세포를 형질감염시키거나, 모의 형질감염시켰다(FuGENE HD; 제조사의 지침에 따름). 형질감염 5일 후, 상청액을 수집하였다.
상청액 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석하였으며(도 17), 이는, 에타너셉트가 HEK293(레인 1), HEK293GalE-/-(레인 2), HEK293글리코결실(레인 3), 및 HEK293글리코이중결실(레인 4) 세포에서 안정하게 발현되었음을 보여주었다. HEK293글리코결실 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 N-글리칸의 감소 및 HEK293GalE-/- 및 HEK293글리코이중결실 세포에서의 O-글리칸의 부재에 상응하는 분자량의 분명한 변화가 관찰될 수 있다.
한편으로 HEK293과 HEK293GalE-/- 사이 및 다른 한편으로 HEK293글리코결실과 HEK293글리코이중결실 사이의 분자량의 감소는, Gale KO 세포에서 생성된 에타너셉트가 실제로 O-글리칸이 결여되어 있음을 시사한다. HEK293과 HEK293글리코결실 세포 사이의 분자량 차이는 야생형 N-글리칸과 글리코결실 N-글리칸 사이의 예상 차이와 일치한다.
실시예 6. RSV -G( 호흡기세포 융합 바이러스 - G 단백질)의 발현
또 다른 실시예로서, RSV-G를 상이한 세포주에서 발현시켰다. 상세하게는, HEK239, HEK239GalE-/-, HEK239글리코결실, 및 HEK239글리코이중결실 세포를 DMEM/F12 배지 + 10% FCS 중에서 6 웰 플레이트에 시딩하였다. 시딩 24시간 후, 배지를 흡인하고, 3 ml의 혈청-무함유 FreeStyle 293 배지로 교체하였으며, RSV-G를 인코딩하는 발현 벡터에 의해 형질감염시키거나, 모의 형질감염시켰다(FuGENE HD; 제조사의 지침에 따름). 형질감염 3일 후, 상청액을 수집하였다.
상청액 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석하였으며(도 18), 이는, RSV-G가 HEK293, HEK293GalE-/-, HEK293글리코결실, 및 HEK293글리코이중결실 세포에서 안정하게 발현될 수 있었음을 보여주었다. HEK293글리코이중결실 세포에서, 스미어가 부재하는 하나의 선명한 밴드가 관찰되었다.
재료 및 방법
가이드 조립 및 클로닝
GalE 유전자를 UCSC 인간 게놈 브라우저(nr. GRCh37/hg19 구축)로부터 다운로드 받아, http://CRISPR.MIT.EDU에서 이용 가능한 툴을 사용하여 가이드에 대해 스크리닝하였다. 본 발명자들은 웹사이트의 알고리즘에 따라, 최대의 표적외 점수를 가진 3개의 가이드를 선택했다. 가이드를 코딩하는 올리고체 및 그의 역방향 보체를 연장시켰으며, 이는 본 발명자들의 클로닝 전략에 부합하는 말단인 5' 인산화를 가지며, IDT에서 주문하였다. 최종 가이드 서열의 서열이 표 5에 제시되어 있다. 다음으로, 3개의 가이드를 문헌[Ran et al10]에 기재된 바와 같은 PX458 벡터(Addgene을 통해 입수 가능)에 클로닝하였다. 간략히 말하면, 각각의 올리고체의 100 μM 희석액 1 μl를 8 μl의 이원 완충액(duplexing buffer)(100 mM 아세트산칼륨, 30 mM HEPES, pH 7.5)에 첨가함으로써, 올리고체를 어닐링시켰다. 이 혼합물을 98℃로 가열하고, 5℃/분으로 25℃로 서서히 냉각시켰다. 어닐링된 올리고체의 1/200 희석액의 2 μl를 100 ng의 PC458 벡터, 2 μl의 Tango 완충액(Fermentas, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재), 1 μl의 DTT(10mM), 1μl의 ATP(10mM), 1 μl의 BbSI FastDigest 제한효소(Fermentas), 1 μl의 T7 리가제(Fermentas) 및 milliQ에 총 용적이 20 μl가 되도록 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 5분으로부터 25℃에서 5분으로 6회 순환시킴으로써, 제한 과정 및 결찰 과정을 인큐베이션하였다. 다음으로, 2 μl의 산물을 화학적으로 적격인 MC1061 E. 콜라이 세포로 형질전환시켰다. 세포를 카르베니실린 항생제가 함유된 LB 배지에서 37℃에서 밤새 성장시켜서, PX485 벡터를 함유하는 세포를 선택하였다.
Figure pct00005
본 발명자들은 U6 프로모터(AGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC)상의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서, 가이드의 하단의 올리고체를 사용하여, 콜로니 PCR에서 얻어진 E. 콜라이 클론을 검증하였다. 본 발명자들은 58℃의 어닐링 온도 및 1분의 연장 시간으로, 제조사의 지침에 따라 GoTaq Green(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하였다. PCR 샘플을 MCE-202 MultiNA 마이크로칩 전기영동 시스템(Shimadzu, 일본 교토 소재)에서 분석하였다.
게놈 DNA 조제물
모든 HEK 세포주로부터 게놈 DNA(gDNA) 단리를 위해, 2*105개의 세포를 제조사의 지침에 따라 100 μl의 QuickExtract DNA 추출 용액(Epicentre, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 용해시켰다. QuickExtract 게놈 DNA 추출은 DNA 정제 단계를 포함하지 않는다. 따라서, 추출물은 다량의 잔여 세포 용해 산물을 함유하며, 이는 샘플 중 게놈 DNA 농도의 측정을 어렵게 한다. 따라서, 본 발명자들은 동량의 QuickExtract DNA 추출 용액 중의 게놈 DNA를 제조하기 위해, 항상 동량의 세포로 개시하였으며, 본 발명자들은, 본 섹션에 기재된 gDNA에 대한 모든 PCR에서, 10 μl의 총 PCR 용적당 이 용해물 1 μl를 사용하였다.
Cas9에 의한 시험관내 분해.
관심대상 표적 영역(GalE 유전자)을 55℃의 어닐링 온도 및 2분의 연장 시간으로, GoTaq Green(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), 표 6에 제시된 GalE 정방향 및 역방향 프라이머 및 QuickExtract에 의해 단리된 gDNA 주형을 사용하여 증폭시켰다. 앰플리콘을 제조사의 지침에 따라 자기 비드(PCR Clean Up, CleanNA, 네덜란드 알펀안덴레인 소재)를 사용하여 정제하였다.
가이드 RNA를 시험관내에서 생성하기 위해, 본 발명자들은 T7 프로모터를 도입시켜야 했다. 따라서, 본 발명자들은 가이드의 5'의 T7 프로모터를 코딩하는 프라이머를 사용하였다. 정방향 프라이머에 선행하는 T7 프로모터는 표 6에서 볼드체로 표시하였다. 역방향 프라이머를 가이드의 구조 일부에 결합시키며(가이드 역방향), 이러한 프라이머 설계 전략은 종래에 기재된 바 있다(문헌[Yang, Z. et al. The GalNAc-type O-glycoproteome of CHO cells characterized by the SimpleCell strategy. Mol. Cell. Proteomics mcp.M114.041541 (2014)]). 이러한 프라이머에 의한 증폭에서, 58℃의 어닐링 온도 및 30초의 연장 시간으로, 제조사의 지침에 따라, GoTaq Green 중합효소(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하였다. 다수의 클로닝 부위로 클로닝된 각각의 가이드를 갖는 적절한 PX458 플라스미드 10 ng을 주형으로 사용하였다. 이들 PCR 반응 혼합물로부터 RNA를 전사시키기 위해, 제조사의 지침에 따라, Megascript T7 키트(Ambion, Life technologies, 영국 페이즐리 소재)를 사용하였다: 우선 앰플리콘을 자기 비드(PCR Clean Up, CleanNA, 네덜란드 알펀안덴레인 소재)를 사용하여 정제하고, 2 pmol의 DNA를 전사 반응에 적용하였다.
Figure pct00006
시험관내에서 전사된 RNA를 페놀/클로로포름 추출을 사용하여 정제하였다. 우선 동일한 용적의 산성 페놀/클로로포름(Ambion, Life technologies, 영국 페이즐리 소재)을 첨가함으로써, 상단의 수성상으로부터 유기상을 분리하였다. 상단의 상을 새로운 튜브로 운반하고, 1 용적의 이소프로판올을 첨가함으로써, RNA를 침전시켰다. 혼합물을 -20℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 15,000 rpm의 냉각된 탁상용 원심분리기에서 RNA를 펠레팅하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 뉴클레아제 무함유 물 중에 재현탁시켰다. RNA 용액을 나노드롭(nanodrop)에 의해 정량화하였다.
마지막으로, 2 μg의 가이드 RNA를 20 μl의 뉴클레아제 무함유 물 중의 1 μM의 Cas9(NEB, 미국 매사추세츠주 입스위치 소재) 및 3 μl의 10x Cas9 뉴클레아제 반응 완충액에 첨가하였다. 본 발명자들은 37℃에서 10분 동안 Cas9가 가이드 RNA와 결합하도록 하였다. 마지막으로, 500 ng의 주형 DNA를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 RNA 및 Cas9를 인큐베이션하였다. 1,2% TAE-아가로스 겔상에서 반응 혼합물을 분리시킴으로써, Cas9 및 가이드 RNA 복합체에 의한 주형 DNA의 분해를 분석하였다.
세포주의 배양(Cultivating), 형질감염 및 분류
HEK293 및 HEK293글리코결실 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS)이 보충된 DMEM/F12(Life Technologies, 영국 페이즐리 소재)에서 37℃, 5% CO2에서 습윤한 인큐베이터에 유지시켰다.
소규모 생성 및 게놈 편집 실험을 위해, HEK293 또는 HEK293글리코결실 세포를 형질감염시키기 위해, T25에 500 000개의 세포 또는 6 웰에 웰당 대략 200 000개의 세포의 형질감염 48시간 전에 이것을 시딩하였다. Fugene HD 형질감염 시약(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 제조사의 지침에 따라 사용하여, 웰당 3,3 μg의 플라스미드 DNA를 형질감염시켰다.
형광 단백질의 발현을 검출하기 위해, 배지를 위아래로 피펫팅함으로써, 형질감염 48시간 후 세포를 분리시켰다. 세포를 함유하는 배지를 400 RPM에서 4분 동안 아래로 펠렛팅하고, 1*10^6 세포/ml로 PBS 중에 재현탁시켰다. 100 μm의 세포 스트레이너(Corning, 미국 미시간주 미들랜드 소재)에 현탁액을 적용함으로써, 다수세포 클러스터를 여과하였다. 다음으로, GFP 양성 단일 세포를 선택함으로써, 세포를 BD FACS ARIA III에서 분류하였다. 양성 세포를 96 웰 플레이트로 직접적으로 단일 세포 분류하거나, 웰당 1개의 세포를 시딩하거나, 튜브에 풀링하였다. 웰에 1:1(v/v) 혼합의 새로운 DMEM/F12+10% FCS 및 조절된 배지를 첨가하였다. 10 ml의 DMEM/F12+10% FCS 중에 1*106개의 HEK293글리코결실 세포를 시딩함으로써, 조절된 배지를 제조한 후, 세포를 3일 동안 성장시키고, 마지막으로 0,22 μm 필터(Millipore, 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재)를 통해 여과함으로써, 배지를 수집하였다.
hGM - CSF 생성 정제
전술된 바와 같이1, hGM-CSF를 생성하고, 정제하고, 질량 분광 분석을 위해 제조하였다. 간단히 말해서, 세포를 hGM-CSF 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 1일 후, 배지를 Freestyle 293 발현 배지(Life technologies, 영국 페이즐리 소재)로 교체하고, 형질감염 5일 후 상청액을 수집하였다. Akta Pure(GE healthcare UK Ltd, 영국 버킹엄셔 소재)에서 Ni2 + 이온이 로딩된 His-Trap HP 칼럼(GE healthcare UK Ltd, 영국 버킹엄셔 소재)에 배지를 직접 로딩하고, superdex 75 크기 배제 칼럼(GE healthcare UK Ltd, 영국 버킹엄셔 소재)에서 연마 단계를 수행하고, 완충액을 PBS로 교환하였다. Pierce BCA 단백질 분석 키트(Life technologies, 영국 페이즐리 소재)에 의해 정제 후 단백질 농도를 결정하였다.
hGM - CSF 펩타이드 maldi - tof ms 분석
MALDI-TOF 분석에서, 2,5 ug의 hGM-CSF 샘플을 SDS-PAGE 겔상에서 분리하고, 20 내지 70 kDa의 영역의 겔을 절단하고, 겔 중 트립신 처리에 의한 분해를 수행하였다. 펩타이드 추출 및 세척 단계를 C18 ZipTips(Merck Millipore, 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재)을 사용하여 수행하고, 5 ul의 총 용적으로 샘플을 용출시켰다. 다음으로, 각각의 펩타이드 혼합물 2 ul를 CHCA(α-시아노-4-하이드록시신남산) 매트릭스에서 MALDI 표적 플레이트에 스포팅하였다. 최적의 분해능으로 활성화된 리플렉트론(reflectron)에 의해 양성 이온 방식으로 MALDI-TOF 분석을 수행하였다.
hGM - CSF 무손상 단백질 maldi - tof ms
PBS 중 hGM-CSF 5 μg을 별도의 튜브에 분취하였다. 무효소 500 단위 PNGaseF(자체생산)를 첨가하고, 샘플을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 분해 후, 0,1% TFA를 첨가하고, 제조사의 지침에 따라 C4 ZipTips(Merck Millipore, 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재)를 사용하여 샘플을 탈염시켰다. 최종 용출을 3 μl의 50% 아세토니트릴, 49,5% milliQ 및 0,5% TFA 중에서 수행하고, 이를 MALDI 플레이트 상에 직접 스포팅하였다. 10 mg/ml의 알파-시아노-4-하이드록시신남산 매트릭스 1 μl를 각각의 스폿에 첨가하였다. Applied Biosystems 4800 프로테오믹스 분석기에서 샘플을 선형 방식으로 분석하였다.
서베이어 분석
6 웰 플레이트에서, Fugene HD(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 형질감염 시약을 사용하여, 가이드를 함유하는 PX458 벡터 8,8 μg에 의해 1*106개의 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후, 본 발명자들은 형질감염된 세포 중 GFP 발현 클론을 FAC 분류하였다. 본 발명자들은 분류된 세포를 풀링하고, 이것을 대략 1*10^6 세포로 확장되도록 하였다. 배지를 위아래로 피펫팅함으로써, 세포를 수집하였다. 게놈 DNA를 제조사의 지침에 따라 QuickExtract 키트(Epicentre, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 제조하였다.
CRISPR/Cas9 가이드 RNA에 의해 표적화된 영역을 주형으로서 30 μl의 총 PCR 용적으로 3 μl의 QuickExtract 용액을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 본 발명자들은 Kapa HiFi 중합효소(Kapa Biosystems, 남아프리카 케이프타운 소재) 및 표 7에 제시된 프라이머를 사용하였다. 71℃의 어닐링 온도 및 30초의 연장 시간으로 제조사의 지침에 따라 PCR을 수행하였다.
Figure pct00007
앰플리콘을 자기 비드(CleanNA, 네덜란드 알펀안덴레인 소재)를 사용하여 정제하였다. 다음으로, 400 ng의 정제된 DNA를 milliQ에 의해 9 μl의 총 용적으로 희석하고, 여기에 1 μl의 10x 표준 Taq 완충액(NEB, 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)을 첨가하였다. 표 8에 제시된 온도 구배에 따라 단편을 변성시키고, 복원시켰다.
Figure pct00008
1 μl의 서베이어 뉴클레아제 및 1 μl의 서베이어 인핸서(IDT, 벨기에 루벤 소재)를 혼합물에 첨가하고, 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로 1 μl의 서베이어 정지액을 첨가하고, 1,2% TAE-아가로스 겔에서의 분리에 의해 샘플을 분석하였다.
생어 서열분석
앞서 상세히 기술된 바와 같이, 단일 세포 유래 클론을 24 웰 플레이트에서 확장시키고, 이로부터 게놈 DNA를 QuickExtract를 사용하여 제조하였다. 관심대상 영역을 Kapa HiFi 중합효소 및 표 9에 제시된 프라이머에 의해 PCR 증폭시켰다.
72℃의 어닐링 온도 및 1분 30초의 연장 시간으로, 제조사의 지침에 따라 PCR을 수행하였다.
Figure pct00009
앰플리콘을 자기 비드(CleanNA, 네덜란드 알펀안덴레인 소재)를 사용하여 정제하고, 표 7로부터의 정방향 프라이머를 사용하여 서열분석하였다.
일루미나 서열분석 조제물
일루미나 서열분석은 특이적 어댑터를 사용한다. 그러나, 이러한 어댑터는 매우 길기 때문에, 본 발명자들은 더 작은 중간 어댑터를 사용하여, 관심대상 영역을 우선 증폭시켰으며, 이어서, 일루미나 서열분석 어댑터를 사용하여, 제2 반응으로 연장하였다. 따라서, 우선, CRISPR/Cas9 가이드에 의해 표적화된 영역을 QuickExtract에 의해 단리된 gDNA로부터 증폭시키고, 동시에, 초기 PCR 반응에서 중간 어댑터(표 10의 처음 4개의 프라이머 중 볼드체 부분)에 의해 연장시킨다. 이 반응에서, 가이드3 및 가이드1 프라이머에 대해 각각 70℃ 및 72℃의 어닐링 온도 및 30초의 연장 시간으로 제조사의 지침에 따라 Kapa HiFi 중합효소를 사용하였다. 앰플리콘을 자기 비드(CleanNA, 네덜란드 알펀안덴레인 소재)를 사용하여 정제하였다. 100 ng의 정제된 증폭물을 다시 증폭시켜, 한쪽 면을 P5 어댑터 및 일루미나 서열분석 정방향 어댑터에, 다른 한쪽 면을 P7 어댑터, 일루미나 서열분석 역방향 어댑터 및 Truseq 바코드에 부착시켰다(표 10). 상이한 Truseq 바코드(표 10, 'P7 Truseq13 내지 28'로 일컬어지는 프라이머)를 갖는 모든 클론을 제공함으로써, 본 발명자들은, 서열분석 구동 후 어느 서열이 어느 클론에 속하는지를 추적할 수 있었다. 다시, 70℃의 어닐링 온도 및 30초의 연장 시간으로, 제조사의 지침에 따라 Kapa HiFi 중합효소를 사용하였다. 그러나, 증폭 편향성을 피하기 위해, 단지 15회의 순환만 구동시켰다. 샘플을 자기 비드(CleanNA, 네덜란드 알펀안덴레인 소재)를 사용하여 정제하고, 나노드롭에서 농도를 측정하였다. 본 발명자들은 동몰의 정량으로 샘플을 풀링하고, 혼합물을 10 nM로 희석하였다. 이 샘플을 1%의 총 DNA 농도의 다른 샘플로 풀링하였다. 이어서, 이 혼합물을 단일 말단 서열분석을 사용하여, 일루미나 NextSeq에서 분석하였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
단백질 샘플을 종래에 기재된 바와 같이 제조된 12% Tricin SDS-PAGE 겔에서 분리하였다(문헌[DeAngelis, M. M., Wang, D. G. & Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23, 4742-4743 (1995)]). 제조사의 지침에 따라, TE70X 반건조 전달 단위(Hoefer, 미국 매사추세츠주 홀리스턴 소재)를 사용하여, 샘플을 니트로셀룰로스 막(Schleicher & Schuell, 독일 뮌헨 소재)에 전달하였다. 다음으로, 1시간 동안 0,05%(wt/vol) Tween20 및 3%(wt/vol) 분유를 함유한 PBS를 사용하여 블롯을 차단하였다. hGM-CSF를 시각화하기 위해, DyLight 800 커플링된 6xHis 태그 항체(카탈로그 번호 200-345-382, Rockland, 미국 펜실베니아주 리머릭 소재)를 1/15000 희석액에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS + 0,05% tween20에 의한 3회의 세척 단계 후에, 오딧세이 스캐너(odyssey scanner)(LI-COR biosciences, 미국 네브래스카주 링컨 소재)를 사용하여 블롯을 시각화하였다.
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Claims (12)

  1. 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있는 진핵 세포.
  2. 제1항에 있어서, 당단백질을 인코딩하는 제2의 외인성 핵산 서열을 추가로 포함하는 진핵 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 내인성 엔도글루코사미니다제 효소를 발현하지 않는 진핵 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포, 특히 Hek293 세포 또는 CHO 세포인 진핵 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글루코사미니다제는 만노실-당단백질 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제(E.C. 3.2.1.96), 특히 엔도 T(Endo T)인 진핵 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질은 세포에 의해 분비되는 진핵 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글루코사미니다제는 ER 또는 골지 위치화 신호(Golgi localization signal)에 작동 가능하게 연결된 진핵 세포.
  8. 진핵 세포에서 O-글리코실화가 또한 결핍된 단일 GlcNAc 변형된 단백질을 생성하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:
    - 엔도글루코사미니다제 효소 및 당단백질의 발현에 적합한 조건하에서, 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있고, 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1의 외인성 핵산 서열을 포함하며, 당단백질을 인코딩하는 제2의 외인성 핵산 서열을 포함하는 진핵 세포를 제공하는 단계; 및
    - 당단백질을 엔도글루코사미니다제와 세포내 또는 세포외에서 접촉시킨 후, 당단백질을 회수하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 엔도글루코사미니다제와의 세포내 접촉은 골지 또는 ER에서 발생하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 당단백질을 엔도글루코사미니다제에 의해 세포내 또는 세포외에서 처리한 후, 당단백질을 글리코실전달효소에 의해 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 단일 GlcNAc N-글리칸을 포함하는 당단백질을 포함하는 조성물로서, 상기 당단백질은 뮤신 유형의 O-글리칸이 결여된 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 당단백질은 포유류 세포주 또는 유기체에서 상기 당단백질을 발현시킴으로써 얻어지고, 상기 포유류 세포 또는 유기체는 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하며, 내인성 UDP-갈락토스 4-에피머라제(GalE)의 발현 및/또는 활성에 결함이 있는, 당단백질을 포함하는 조성물.
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