KR20180000252A

KR20180000252A - Spectral analysis on the light reflection for measuring nanostructure of the myelinated axon

Info

Publication number: KR20180000252A
Application number: KR1020160078257A
Authority: KR
Inventors: 최명환; 권준환
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 기초과학연구원
Priority date: 2016-06-22
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2018-01-02

Abstract

본 발명은 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법 및 상기 방법에 이용되는 장치에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 반사분광법을 통해 말이집이 형성된 신경축삭의 광학 구조를 광학적으로 분석하는 방법으로 공초점 광학계를 통해 초점에서의 광반사 신호를 추출하여, 광학소자를 통해 반사된 광신호의 스펙트럼을 분석하는 방법에 관한 것이다. 이에, 본 발명에 따른 분석방법은 신경축삭 세포소구조의 생리학적, 병리학적 상태를 추적 관찰이 가능하다. The present invention relates to a method of analyzing a nerve axon in which a horse is formed by reflection spectroscopy and an apparatus used in the method. More particularly, the present invention relates to a method of optically measuring the optical structure of a nerve axon, And a method for analyzing a spectrum of an optical signal reflected through an optical element by extracting a light reflection signal at a focus through a confocal optical system. Thus, the analysis method according to the present invention can observe the physiological and pathological states of the nerve axonal substructure.

Description

BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a nano-

본 발명은 말이집이 형성된 신경축삭의 반사 분광 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of spectroscopic analysis of a nerve axon in which horses are formed.

축삭(axon)은 뉴런의 세포체에서 뻗어나온 긴 돌기를 의미하는 것으로, 축삭말단은 분지되어 뉴런이나 효과기에 시냅스결합하여 신경세포의 흥분을 전달한다. 실험적으로는 양측성 전도를 나타내지만 생체에서는 대개 축삭의 기부에서 말단의 정방향으로 전도한다. 축삭은 또 측지를 내기도 한다. 축삭 내부에는 뉴로필라멘트와 미소관이 있어 세포체로부터 신경말단으로 또 그 반대의 물질수송(축삭수송)에 관여하고 있다. 이들은 두께 5~10nm의 세포막으로 뒤덮여 있는데 이 막은 막전위, 즉 충격 발생장소로 중요한 기능을 한다.The axon is the long protrusion that extends from the cell body of the neuron. The axon terminal is branched and synapses to the neuron or effector to transmit the excitement of the neuron. Experimentally, bilateral conduction is shown, but in vivo, it usually conducts from the base of the axon to the forward direction of the end. The axon also gives off the geodesy. Within the axon, neurofilaments and microtubules are involved in the transport of substances from the cell body to the nerve endings and vice versa (axon transport). They are covered with a cell membrane with a thickness of 5 to 10 nm.

한편 말이집은 축삭을 둘러싼 중층성 치밀 막구조이다. 상기 말이집의 구성성분은 지질이 매우 많은 것이 특징으로, 생리학적으로는 신경세포의 축삭을 전기적으로 절연하여 도약전도를 가능하게 하고 신경충격의 전도속도를 증가시켜 신경계의 고차기능의 형성에 중요한 역할을 한다.On the other hand, the horse is a dense membrane structure of the middle layer surrounding the axon. The constituents of the horse are characterized by a very high lipid. Physiologically, the axons of the nerve cells are electrically insulated to enable the jump conduction and increase the conduction velocity of the nerve impulses, which is important for the formation of the higher-order functions of the nervous system It plays a role.

중추신경계에서는 희소돌기신경교, 말초신경계에서는 시반세포가 말이집을 형성한다. 말이집은 말이집형성세포의 형질막의 안쪽끼리 접착한 주기선과 바깥쪽끼리 접착한 주기간선의 구성단위가 단기적으로 반복되는 구조이다.In the central nervous system, a rare dendritic ganglion, and in the peripheral nervous system, the sperm cells form horses. The horse family is a structure in which the constituent units of the periodic lines in which horses are adhered to each other on the inner side of the plasma membrane of the collecting cells and the constituent units of the periodic arteries in which the horses are adhered to each other are repeated in the short term.

이와 같이, 신경축삭과 이를 둘러싸고 있는 신경수초는 다발성경화증, 신경손상 등에 중요한 역할을 하기에 의학적 중요성이 높다. 특히 신경수초는 척추동물의 효율적인 신경 전달뿐 아니라 신경가소성, 신경발달 등의 다양한 신경생리 및 병리학적 과정에 중요한 역할을 하기에, 신경축삭과 함께 신경수초의 상태와 변화를 추적 관찰하는 것은 의생물학적 유용성이 높다. As described above, the neurons and the nerve herpes surrounding them play an important role in multiple sclerosis, nerve injury, and the like, and thus are of great medical importance. In particular, the neural aqueduct plays an important role in various neurophysiological and pathological processes such as neuronal plasticity, neural development as well as efficient neurotransmission of vertebrate animals. It is highly useful.

신경축삭은 0.1 - 10 μm 직경의 섬유형태이고 이를 둘러싸는 신경수초는 수 나노미터(4 - 20 nm) 두께의 말이집이 다층으로 감겨있는 구조로 이러한 구조를 관찰하기 위해서는 적어도 수 나노(1 nm = 10^-9 m) 수준의 공간분해능을 가지는 기술이 필요하다. The nerve axon is a fiber of 0.1-10 μm in diameter and the surrounding nerve aqueduct is a multilayer structure of several nanometers (4 - 20 nm) thickness. To observe this structure, at least several nanometers (1 nm = 10 ^-9 m) level of spatial resolution.

이와 관련하여 종래 말이집이 형성된 신경 수초를 포함하는 조직을 관찰하기 위해서는, 주로 조직을 적출한 후, 형광 염색을 처리한 후 관찰하는 것이 대부분이었다. 그러나 임상적용을 고려한다면, 비침습적으로 생화학적, 유전학적 표지 없이 신경축삭의 나노구조를 관찰할 수 있는 방법의 필요성이 있다.In this regard, in order to observe a tissue including a nerve aqueduct with a horseshoe in the past, most of the tissues were removed after the tissue was extracted and then subjected to fluorescence staining. However, considering clinical applications, there is a need for a method that can observe the nerve structure of the neurons without biochemical, genetic markers noninvasively.

한편, 국내 공개특허 제2013-0118845호에서는, 세포 도식을 위한 TEM 이미징 방법을 제공하고 있으나, 비침습적으로 생화학적, 유전학적 표지 없이 신경축삭의 변화 등을 분석하는 방법은 제시하지 못하고 있다.On the other hand, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2013-0118845 provides a TEM imaging method for cell mapping, but does not provide a method for non-invasively analyzing changes in neuronal axons without biochemical and genetic markers.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 백색광 레이저를 광원으로 사용하여, 검체로부터 발생한 반사광의 스펙트럼을 분석하여, 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조를 관찰하는 방법을 발명하였다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been conceived to solve such problems as described above. The present inventors have studied a method of observing the nanostructure of a nerve axon in which a horse is formed by analyzing the spectrum of reflected light generated from a specimen using a white light laser as a light source Invented.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object,

광원으로부터 발생한 빛을 단색화하는 단계(S1);(S1) of monochromating the light emitted from the light source;

상기 S1 단계에서 단색화된 빛을 검체에 입사시키는 단계(S2); 및(S 2) entering the monochromated light into the specimen in the step S 1; And

상기 S2 단계에서 검체로부터 발생한 반사광을 광검출기에서 검출하는 단계(S3)를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공할 수 있다.And a step (S3) of detecting the reflected light generated from the specimen in the step S2 in the photodetector.

또한 본 발명은 백색 광원으로부터 발생한 빛을 검체에 입사시키는 단계(S1'); 및 In addition, the present invention provides a method comprising: (S1 ') causing light emitted from a white light source to enter a specimen; And

상기 검체로부터 발생한 반사광을 분광검출기에서 검출하는 단계(S2')를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공한다.And a step (S2 ') of detecting a reflected light generated from the specimen by a spectroscopic detector.

본 발명의 일 구현에에 있어서, 상기 S1 단계에서 단색화된 빛은 스캐너(40)와 대물렌즈(50)를 통과하여 검체에 입사되는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the monochromatic light in step S1 passes through the scanner 40 and the objective lens 50 and is incident on the specimen.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 S1' 단계에서 광원으로부터 발생한 빛은 스캐너(40)와 대물렌즈(50)를 통과하여 검체에 입사되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the light generated from the light source in the step S1 'is incident on the specimen through the scanner 40 and the objective lens 50.

본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 S3 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 광검출기로 입사되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the reflected light generated in step S3 passes through a scanner and an objective lens, passes through a lens for confocal observation through a beam splitter and a pinhole, and is incident on a photodetector .

본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 S2' 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 분광검출기로 입사되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the reflected light generated in step S2 'passes through a scanner and an objective lens, passes through a lens for confocal observation through a beam splitter and a pinhole, and is incident on a spectroscope .

본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 광원으로부터 발생한 빛의 파장은 400 nm 내지 2 μm 인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the wavelength of light generated from the light source is 400 nm to 2 μm.

본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 스캐너는 갈바노 미러(galvano-mirror) 인 것을 특징으로 한다.In yet another embodiment of the present invention, the scanner is a galvano-mirror.

본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 분광은 광음향변조 단색화 필터((Acousto-optical tunable filter, AOTF)를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the spectroscopy is performed using an acousto-optical tunable filter (AOTF).

또한, 본 발명은 검체로 조사되는 백색 광(11)을 발생시키는 광원(10);The present invention also relates to a light source (10) for generating white light (11) irradiated with a specimen;

상기 광원으로부터 발생한 빛을 단색화하는 단색화 필터(20); A monochromatic filter (20) for monochromating light emitted from the light source;

상기 검체로부터 발생한 반사광을 통과시켜 분광검출기로 입사시키는 빔 분할기(Beam splitter)(30); 및A beam splitter 30 for passing reflected light generated from the specimen and entering the spectroscope; And

상기 빔 분할기(Beam splitter)(30)로부터 입사된 반사광을 측정하는 광검출기(90)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공한다.And a photodetector 90 for measuring the reflected light incident from the beam splitter 30. The apparatus for analyzing the nerve axon of the nerve axon is provided with a horseshoe-shaped nerve axon.

아울러, 본 발명은 검체로 조사되는 백색 광(11)을 발생시키는 광원(10);In addition, the present invention relates to a light source (10) for generating white light (11) irradiated with a specimen;

상기 빔 분할기(Beam splitter)(30)로부터 입사된 반사광을 측정하는 분광검출기(91)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공한다.And a spectroscope 91 for measuring the reflected light incident from the beam splitter 30. The apparatus for analyzing the nerve axon of the nerve axon is provided with a horseshoe-shaped nerve axon.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단색화 필터는 광음향변조 단색화필터(Acousto-optical tunable filter, AOTF)인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the monochromatic filter is an acousto-optical tunable filter (AOTF).

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 장치는 상기 단색화된 빛 또는 반사광을 스캐닝(scanning)하는 스캐너(40);In another embodiment of the present invention, the apparatus includes a scanner 40 for scanning the monochromatic light or reflected light;

검체를 확대하는 대물렌즈(50);An objective lens 50 for magnifying the specimen;

상기 반사광을 통과시키는 공초점 관찰용 렌즈(70); 및A confocal observation lens 70 for passing the reflected light; And

상기 렌즈(70)를 통과한 반사광이 통과하는 핀홀(80);을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.And a pinhole 80 through which the reflected light having passed through the lens 70 passes.

본 발명에 따른 분석 방법은, 별도의 생화학적 표지 없이 신경 축삭의 나노 구조를 관찰함으로써, 살아있는 실험동물 및 인체에 바로 적용할 수 있는 장점이 있다. 즉 신경수초와 관련되어 있는 다양한 유전병과 병리학적 증세를 관찰 할 수 있고, 신경 수초 발달과정을 관찰함으로써 신경 가소성(neuro plasticity)의 지표로 이용할 수 있으며, 살아있는 온전한 개체에서 신경 가소성 관찰을 할 수 있는 장점이 있다.The analysis method according to the present invention has an advantage that it can be directly applied to a live animal or a human body by observing the nerve structure of the nerve axon without a separate biochemical mark. In other words, it is possible to observe various genetic diseases and pathologic symptoms related to the nerve hernia, and to observe the development of the nerve aqueduct, which can be used as an index of neuroplasticity, There are advantages.

본 발명의 방법을 적용하면 실험 동물로부터 신경 축삭의 나노 구조의 변화 등을 용이하게 추적 및 관찰하는 것이 가능하므로 뇌과학 및 신경병리학 분야에서 유용하게 사용될 수 있으며, 배양된 세포(예, neuron-oligodendrocyte coculture), 추출된 신경조직, 혹은 실험동물을 이용한 신경축삭 및 신경수초와 관련된 약물 스크리닝에 활용하는 것이 가능하고, 신경축삭 및 신경수초의 나노구조 변화를 수반하는 질병(e.g. 다발성 경화증, 뇌진탕, 수초용해증, 탈수초증, 수초형성부전증)의 임상적 진단 및 치료효과 추적에 활용 가능할 것으로 기대된다.Since the method of the present invention can easily track and observe the change of the nerve structure of the neurons in an experimental animal, it can be used in the field of brain science and neuropathology, and can be used in cultured cells (for example, neuron-oligodendrocyte coculture, extracted nerve tissue, or animal screening related to neuro-axons and nerve hernias using an experimental animal, and can be used for screening diseases associated with nano-structural changes of the nerve axon and nerve hernia (eg, multiple sclerosis, concussion, Dyslipidemia, mycoplasma hypoglycemia) in the clinical diagnosis and treatment of the effects are expected to be useful.

도 1 및 2는 본 발명의 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 통해 얻은 신경수초의 반사광 측정을 통해 얻은 영상과, 종래 형광 현미경 측정을 통해 얻은 영상을 병합한 영상을 나타낸 도면으로, 붉은색 신호는 형광 염색 후 형광 현미경을 통한 신경 수초 영상을 나타낸 것이고, 하늘색 신호는 반사광 분석을 통한 신경 수초 영상을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 신경수초의 반사 스펙트럼 분석을 통한 신경축삭 직경 분석결과 및 추세선을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 반사 스펙트럼 분석을 통한 신경축삭 직경과 형광 현미경을 통해 측정한 신경축삭의 직경을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 6은 물리적 손상을 받은 실험용 생쥐를 대상으로, 반사광 측정 영상을 통해 신경축삭이 손상 입은 부분을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 물리적 손상을 입은 부위의 신경축삭의 반사광 영상과 형광 현미경 영상을 병합하여 나타낸 도면이다.
도 8은 손상된 부위의 신경 수초 반사 스펙트럼 분석한 결과(좌)와, 반사광 분석을 통한 신경축삭의 직경과 형광 현미경 영상의 신경축삭 직경 비교한 결과(우)를 나타낸 도면이다.1 and 2 are perspective views of the apparatus for analyzing a nerve axon of the present invention.
FIG. 3 is a view showing an image obtained by measuring the reflected light of the nerve hernia obtained through the apparatus for analyzing the nerve axon of the present invention and an image obtained by combining the image obtained by the conventional fluorescence microscope measurement, Post-fluorescence microscope, and the light blue signal is a neuroanalytic image obtained by reflection light analysis.
4 is a graph showing the result of analysis of the nerve axon diameter and the trend line through the reflection spectrum analysis of the nerve herb of the present invention.
FIG. 5 is a graph comparing the diameters of the neural axons measured through the reflection spectrum analysis of the present invention and the diameters of the neural axons measured through the fluorescence microscope.
FIG. 6 is a view showing a result of confirming the damaged part of the nerve axon through the reflected light measurement image of the experimental mouse subjected to physical damage.
FIG. 7 is a view showing a reflection light image of a neuronal axon of a physically damaged area and a fluorescence microscope image in combination. FIG.
FIG. 8 is a graph showing the results of analysis of the neuronal axis reflex spectrum of the damaged region (left) and the diameters of the neural axon through the reflection light analysis and the neuronal axon diameter of the fluorescence microscope image (right).

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, in order that those skilled in the art can easily carry out the present invention. The shapes, sizes, ratios, angles, numbers, and the like disclosed in the drawings for describing the embodiments of the present invention are illustrative, and thus the present invention is not limited thereto. In the following detailed description of the preferred embodiments of the present invention, a detailed description of known functions and configurations incorporated herein will be omitted when it may make the subject matter of the present invention rather unclear. In the drawings, like reference numerals are used throughout the drawings.

덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 '연결' 되어 있다고 할 때, 이는 '직접적으로 연결'되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 '간접적으로 연결'되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.In addition, in the entire specification, when a part is referred to as being 'connected' to another part, it may be referred to as 'indirectly connected' not only with 'directly connected' . Also, to "include" an element means that it may include other elements, rather than excluding other elements, unless specifically stated otherwise.

본 발명은 신경축삭의 특이적인 구조에서 기인하는 광반사를 분광학적으로 분석함으로서 나노구조를 외부 표지 없이 관찰할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 통해 기존의 광학영상법의 회절한계를 넘어 신경축삭의 직경 및 신경수초의 구조적 정보를 제공할 수 있다.It is an object of the present invention to provide a method for spectroscopically analyzing the light reflection caused by the specific structure of the neuronal axon, thereby observing the nanostructure without an external label. This allows us to provide structural information on the diameter of the neurons and the nerves of the nerves beyond the diffraction limit of conventional optical imaging methods.

즉 본 발명은 광원으로부터 발생한 빛을 단색화하는 단계(S1);That is, the present invention includes a step S1 of monochromating light generated from a light source;

상기 S2 단계에서 검체로부터 발생한 반사광을 광검출기에서 검출하는 단계(S3)를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공한다.And a step (S3) of detecting the reflected light generated from the specimen in the step S2 in the photodetector.

상기 단색화는 바람직하게는 광음향변조 단색화필터(Acousto-optical tunable filter, AOTF)를 사용하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 S1 단계에서 단색화된 빛은 스캐너와 대물렌즈를 통과하여 검체에 입사된다. The monochromatization may preferably be performed using an acousto-optical tunable filter (AOTF). In step S1, the monochromatic light passes through the scanner and the objective lens and is incident on the specimen.

상기 S3 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 광검출기로 입사되는 것이다.The reflected light generated in the step S3 passes through a scanner and an objective lens, passes through a lens for confocal observation through a beam splitter and a pinhole, and is incident on a photodetector.

또한, 본 발명은 광원으로부터 발생한 빛을 검체에 입사시키는 단계(S1'); 및 In addition, the present invention provides a method comprising: (S1 ') causing light emitted from a light source to enter a specimen; And

상기 검체로부터 발생한 반사광을 분광검출기에서 검출하는 단계(S2')를 포함하는 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법을 제공할 수 있다.And a step (S2 ') of detecting a reflected light generated from the specimen by a spectroscopic detector.

상기 S1' 단계에서 광원으로부터 발생한 빛은 스캐너(30)와 대물렌즈(40)를 통과하여 검체에 입사되는 것이고, 상기 S2' 단계에서 발생한 반사광은 스캐너와 대물렌즈를 통과한 후, 빔 분할기(Beam splitter)를 통해 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 분광검출기로 입사된다.The light generated from the light source in the step S1 'is incident on the specimen through the scanner 30 and the objective lens 40. The reflected light generated in the step S2' passes through the scanner and the objective lens, splitter through a lens for confocal observation and a pinhole.

즉, 본 발명의 나노 구조 분석 방법은 광원으로부터 발생한 빛을 단색화한 후 검체에 입사 시키고, 반사광을 광검출기에서 검출할 수도 있고, 단색화 단계 없이 반사광 자체를 분광검출기에서 검출하는 방법을 사용할 수 있는 것이다.That is, in the nanostructure analysis method of the present invention, light generated from a light source may be monochromated and then incident on a specimen, and the reflected light may be detected by a photodetector or a method of detecting the reflected light itself by a spectroscope .

상기 스캐너는 갈바노 미러(galvano-mirror) 인 것을 사용한다.The scanner is a galvano-mirror.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치의 사시도를 도시한 것으로, 상기 도 1은 단색화 필터(AOFT) 및 빔 분할기(Beam Splitter)가 구비된 장치에 관한 것이다. 도시된 것과 같이, 발생한 빛을 단색화 필터에서 단색화한 후, 빔 분할기를 지나, 스캐너와 대물렌즈를 통과하여 검체에 입사하게 된다. 검체에 입사된 후 발생하는 반사광은 다시 스캐너를 지나, 빔 분할기에서 공초점관찰용 렌즈와 핀홀을 통과하여 광검출기로 입사되는 것이다.FIG. 1 is a perspective view of an apparatus for analyzing a nerve axon with a nerve axon using reflection spectroscopy according to an embodiment of the present invention. FIG. 1 is a cross-sectional view of a monochromatic filter (AOFT) and a beam splitter And to a device provided with the same. As shown in the figure, the resulting light is monochromated in a monochromatic filter, passes through a beam splitter, passes through a scanner and an objective lens, and enters the specimen. The reflected light generated after entering the specimen passes through the scanner again, passes through the lens for confocal observation and the pinhole in the beam splitter, and is incident on the photodetector.

즉 본 발명은 검체로 조사되는 백색 광(11)을 발생시키는 광원(10);That is, the present invention provides a light source (10) for generating white light (11) irradiated with a specimen;

상기 검체로부터 발생한 반사광을 측정하는 광검출기(90)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공할 수 있다.And a photodetector (90) for measuring the reflected light generated from the specimen.

상기 단색화 필터는 빛을 '단색화'하는 역할을 하는 것으로, 상술한 바와 같이, 광음향변조 단색화필터가 이용되는 것이 바람직하다.The monochromatic filter serves to 'monochromize' light. As described above, it is preferable to use a photoacoustic modulation monochromatic filter.

또한, 빔 분할기는 빛을 원하는 방향으로 분사할 수 있는 역할을 하는 것으로, 상기 빔 분할기로는 광음향변조 빔 분할기(Acousto-optical beam splitter, AOBS)가 이용되는 것이 바람직하다.In addition, the beam splitter serves to inject light in a desired direction, and the beam splitter is preferably an acousto-optical beam splitter (AOBS).

도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치의 사시도를 도시한 것으로, 상기 도 2는 단색화 장비를 따로 구비하지 않는다. 이에 광검출기 대신, 분광검출기를 사용하는 구성을 가짐으로써, 분광 단계 없이 바로 검출이 가능하다.FIG. 2 is a perspective view of an apparatus for analyzing a nerve axon of a nerve axon using reflection spectroscopy according to another embodiment of the present invention. FIG. 2 does not include a monochromatic device. By using a spectroscopic detector instead of a photodetector, it is possible to detect it without a spectroscopic step.

즉 본 발명은, 상기 검체로부터 발생한 반사광을 통과시켜 분광검출기로 입사시키는 빔 분할기(Beam splitter)(30); 및That is, the present invention includes a beam splitter (30) for passing reflected light generated from the specimen and entering the spectral detector; And

상기 빔 분할기(Beam splitter)(30)로부터 입사된 반사광을 측정하는 분광검출기(81)를 포함하는 반사분광법을 이용한 말이집이 형성된 신경 축삭의 나노 구조 분석 장치를 제공할 수 있다.And a spectroscopic detector 81 for measuring the reflected light incident from the beam splitter 30. The apparatus for analyzing the nerve axon of a nerve axon with a horseshoe can be provided.

상기 장치들은 상기 분광된 빛 또는 반사광을 스캐닝(scanning)하는 스캐너(40);The apparatus includes a scanner 40 for scanning the spectral light or reflected light;

상기 장치는 상기 단색화된 빛 또는 반사광을 스캐닝(scanning)하는 스캐너(40);The apparatus includes a scanner 40 for scanning the monochromatic light or reflected light;

상기 렌즈(70)를 통과한 반사광이 통과하는 핀홀(80);을 더 포함할 수 있다.And a pinhole 80 through which the reflected light having passed through the lens 70 passes.

이와 같은 구성을 채택함으로써, 신경축삭의 특이적인 구조에서 기인하는 광반사를 분광학적으로 분석할 수 있고, 이를 통해 신경축삭의 직경 및 신경 수초의 구조적 정보를 제공할 수 있는 것이다.By adopting such a configuration, it is possible to spectroscopically analyze the light reflection caused by the specific structure of the nerve axon, thereby providing the structural information of the diameter and the nerve root of the nerve axon.

이하에서는, 본 발명의 일실시예에 따른 신경 축삭의 나노 구조 분석 방법 및 장치에 대하여 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, a method and an apparatus for analyzing a nerve structure of a nerve axon according to an embodiment of the present invention will be described in detail.

[S1 단계][Step S1]

본 발명에서 S1 단계는 광원(10)으로부터 발생한 빛을 단색화 필터에 통과시켜 단색화시키는 단계이다.In step S1 of the present invention, light generated from the light source 10 is passed through a monochromatic filter to make monochromatic.

상기 광원(10)은 백색광을 조사하는 것으로, 다양한 파장의 빛을 조사할 수 있다. 광원(10)으로부터 발생하는 빛의 파장은 400 nm 내지 2 μm 인 것일 수 있으나, 관찰하려는 목표에 따라서 변경이 가능하다. 단색화 필터에서 단색화 된 빛은 빔 분할기로 입사된다.The light source 10 irradiates white light and can emit light of various wavelengths. The wavelength of light generated from the light source 10 may be 400 nm to 2 占 퐉, but it may be changed depending on the target to be observed. In the monochromatic filter, the monochromatic light is incident on the beam splitter.

상기 단색화 필터는 소망하는 파장의 빛을 원하는 경로로 보낼 수 있는 빔 단색화 필터로 NKT photonics의 nlR1가 사용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.The monochromatic filter may be a beam monochromator filter capable of transmitting light of a desired wavelength to a desired path, but nlR1 of NKT photonics may be used, but is not limited thereto.

[S2 단계][Step S2]

본 발명에서 S2 단계는 상기 S1 단계에서 단색화된 빛을 검체에 입사시키는 단계이다.In the present invention, step S2 is a step of making the monochromatic light incident on the specimen in step S1.

상기 광원으로부터 발생하는 빛을 단색화하여 원하는 파장의 빛만 빔 분할기를 거쳐 검체로 투과시킬 수 있고, 평면 영상화를 위해서, 상기 단색화된 빛을 스캐너(40) 및 대물렌즈(50)를 통해 광원으로부터 발생하는 빛을 입사시킨다. 상기 스캐너(40)는 갈바노 미러를 사용하는 것이 바람직하나, 관찰하고자 하는 대상에 따라 변경이 가능하다.The light generated from the light source may be monochromated so that only the light of a desired wavelength can be transmitted through the beam splitter to the specimen and the monochromatic light is emitted from the light source through the scanner 40 and the objective lens 50 Let the light enter. The scanner 40 preferably uses a galvanometer mirror, but it can be changed depending on an object to be observed.

노이즈를 최소화하기 위한 목적으로, 검체를 고정하기 위해서 샘플 고정장치가 추가로 포함될 수 있으며, 상기 고정 장치 및 대물렌즈는 xyz 방향으로 독립적으로 움직일 수 있도록 한다.For the purpose of minimizing noise, a sample fixing device may be further included to fix the specimen, and the fixing device and the objective lens can move independently in the x, y, and z directions.

[S3 단계][Step S3]

S3 단계는 상기 S2 단계에서 검체로부터 발생한 반사광을 광검출기에서 검출하는 단계이다. 상기 검체에 빛이 입사되면서 발생하는 반사광은 다시 대물렌즈(50) 및 스캐너(40)를 통과한 후, 렌즈(70) 및 핀홀(80)을 통과한 후 광 검출기(90)에 입사될 수 있다.Step S3 is a step of detecting the reflected light generated from the specimen in step S2 in the photodetector. The reflected light generated when light is incident on the specimen may pass through the objective lens 50 and the scanner 40 and then may be incident on the photodetector 90 after passing through the lens 70 and the pinhole 80 .

상기 검출기는 광반사 스펙트럼을 분석하는 기기라면 제한없이 사용이 가능하며, 광반사 스펙트럼으로부터 신경축삭 나노구조를 분석하는 모듈, 실시간으로 나노구조를 디스플레이하는 모듈, 삼차원 나노구조를 분석하는 모듈. 분광영상을 통해 관측할 수 있는 생체 활동 또는 인위적인 조절에 의해 발생하는 변화를 포함하는 생체시료의 나노구조를 분석하는 모듈 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.The detector can be used without any limitation for analyzing the light reflection spectrum. It is a module for analyzing nerve axon nanostructure from light reflection spectrum, a module for displaying nano structure in real time, and a module for analyzing three-dimensional nano structure. A module for analyzing the nanostructure of a biological sample including changes caused by biological activity or anthropogenic regulation that can be observed through a spectroscopic image, but the present invention is not limited thereto.

상기 핀홀(80)의 직경은 다양하게 조절이 가능하며, 이를 통해 다양한 직경의 핀홀이 구비된 회전 디스크(Spinning disk)를 사용할 수 있다.The diameter of the pinhole 80 can be varied, and a spinning disk having pinholes of various diameters can be used.

[S1' 단계][Step S1 ']

본 발명의 S1' 단계는, 상기 S1 단계와 다르게, 광원으로부터 발생한 빛을 단색화하지 않고, 검체에 입사시키는 것이다. 상기 빛은 빔 분할기를 통과하여 스캐너로 입사된다.In the step S1 'of the present invention, unlike the step S1, the light generated from the light source is incident on the specimen without monochromating. The light passes through a beam splitter and is incident on a scanner.

광원에서 발생하는 빛의 파장은 상술한 바와 같고, 상기 광원으로부터 발생한 빛은 스캐너(40) 및 대물렌즈(50)를 통해 검체에 입사된다.The light emitted from the light source is incident on the specimen through the scanner 40 and the objective lens 50.

[S2' 단계][Step S2 ']

본 발명에서 S2' 단계는 상기 S1' 단계에서 입사된 빛이 검체로부터 반사되어 발생한 반사광을 분광검출기에서 검출해내는 단계이다.In the step S2 'of the present invention, the spectroscopic detector detects the reflected light generated when the light incident on the sample is reflected from the sample in the step S1'.

상기 검체에 빛이 입사되면서 발생하는 반사광은 다시 대물렌즈(50) 및 스캐너(40)를 통과한 후, 렌즈(70) 및 핀홀(80)을 통과한 후 분광검출기에 입사될 수 있다.The reflected light generated when light is incident on the specimen may pass through the objective lens 50 and the scanner 40 and then through the lens 70 and the pinhole 80 and may be incident on the spectroscopic detector.

상기 분광검출기는 광학소자 및 검출기를 구비한 장치(Andor, SR-303i-A) 가 사용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.The spectroscopic detector may be an apparatus (Andor, SR-303i-A) having an optical element and a detector, but is not limited thereto.

한편, 본 발명에서, 부품간의 체결은 독립적으로 움직일 수 있도록 한다.On the other hand, in the present invention, the fastening between parts can be moved independently.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[[ 실시예Example ]]

[[ 실시예Example 1] 반사광 분광법을 통해 1] Through reflected light spectroscopy 신경축삭Nerve axon 영상화 및 Imaging and 직경diameter 측정 Measure

척추동물의 신경세포의 신경 전달 통로인 신경축삭은 신경수초에 의한 말이집이 형성되어 있다. 본원의 실시예의 준비 과정으로, 말이집이 형성된 신경축삭을 포함하는 조직을 적출하였다. 상기 조직에 대한 실험을 위해 실험용 생쥐를 이용하였으며, 신경 세포가 밀집되어있는 뇌조직과 척수 조직을 주로 관찰하였다. The nerve axon, the nerve conduction pathway of neurons in vertebrate animals, is harvested by nerves. In the preparation of the examples of the present application, tissues containing the axons in which the horses were formed were excised. Experimental mice were used for the experiments on the tissues, and brain tissue and spinal cord tissues, in which neurons were concentrated, were mainly observed.

본 발명의 반사분광법의 경우 레이저 광원에서 470nm 내지 670nm의 파장을 발생시켜, 단색화 필터에서 단색화시킨 후, 갈바노 미러 및 대물렌즈에 통과시킨 후, 실험용 생쥐의 대뇌 피질 및 척수 부분에 투과시켰다. In the case of the reflection spectroscopy method of the present invention, a wavelength of 470 nm to 670 nm was generated in the laser light source, monochromated in a monochromatic filter, passed through a galvanometer mirror and an objective lens, and then transmitted through the cerebral cortex and spinal cord of a laboratory mouse.

상기 실험용 생쥐의 대뇌 피질 및 척수 부분에서 반사된 반사광은 다시 갈바노 미러 및 스캐너를 통과하여 빔 분할기로 입사되었고, 상기 빔 분할기에서 반사광은 영상검출을 위한 공초점 관찰용 렌즈를 투과하여 조리개를 통과한 후, 광검출기에 입사되었다.The reflected light reflected from the cerebral cortex and the spinal cord of the experimental mouse was again incident on a beam splitter through a galvanometer mirror and a scanner. The reflected light from the beam splitter passed through a confocal observation lens for image detection and passed through a diaphragm And then incident on the photodetector.

도 3에서 나타낸 것과 같이, 적출한 생쥐의 뇌조직(50)을 공초점 현미경으로 관측한 말이집이 형성된 신경수초를 영상화하였다.As shown in Fig. 3, the brain tissue 50 of the extracted mouse was imaged by a confocal microscope.

말이집이 형성된 신경 수초를 포함한 조직(50)을 관찰하기 위한 기존 방법으로는 목표한 조직 및 세포에 형광 염색을 처리 후 관찰이 있다. 본 실시예에서 반사분광법을 검증하기 위한 형광 현미경 관찰의 경우 (Leica, SP8)를 사용하여 수행된 것으로, 형광 염색을 처리한 후 형광 현미경을 사용하여 측정한 결과와, 본 발명의 반사광 측정법을 통해서 분석한 결과를 병합하여 도 3에 나타내었다.As a conventional method for observing a tissue (50) including a nerve aqueduct with horseshoe, there is an observation after treatment with fluorescent staining on a target tissue and cells. In this example, fluorescence microscopy (Leica, SP8) was used for verifying the reflection spectroscopy. The fluorescence intensity was measured using fluorescence microscope after fluorescence staining, The results of the analysis are merged and shown in Fig.

반사광 분석법을 통해 관찰한 결과, 형광 현미경 보다 높은 해상도의 구조적 정보를 얻을 수 있었고, 말이집이 형성된 신경수초의 경우 다층으로 형성된 구조에 의해 반사광이 강하게 발생하며, 별도의 생화학적 표지자 없이 말이집이 형성된 신경수초를 관찰할 수 있었다. As a result of reflection spectroscopy, structural information of resolution higher than that of fluorescence microscope was obtained. In the case of a nerve hernia with a horseshoe, the reflected light is strongly generated by the multilayered structure and the horses are housed without a separate biochemical marker The nerve aqueducts formed were observed.

말이집이 형성된 신경 수초는 다층구조에 의해, 파장에 따라 다양한 반사광 스펙트럼을 갖는다. 검출기(70)에서 획득한 반사 신호들에서 구조적 정보를 얻기 위해 반사광 스펙트럼에 대한 분석을 수행하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이, 신경축삭의 직경을 측정 할 수 있었다. The nerve aqueducts with horses are formed by multilayer structures and have various reflected light spectra depending on their wavelengths. An analysis of the reflected light spectrum is performed to obtain structural information in the reflected signals obtained by the detector 70, and the results are shown in FIG. As can be seen in Fig. 4, the diameter of the nerve axon could be measured.

또한 본 발명에서 제시한 기술의 유의성을 확인하기 위해서, 형광 현미경으로도 관측이 가능하여 비교가 가능한 부분을 선별하여, 구조적 정보를 비교한 결과를 도 5에 나타내었다. In order to confirm the significance of the technique proposed in the present invention, the parts which can be observed even under a fluorescence microscope and which can be compared are selected, and the result of the structural information comparison is shown in FIG.

[[ 실시예Example 2] 반사광 분광법을 통한 외상성 뇌손상 병변 검출 2] Detection of Traumatic Brain Injury Lesions by Reflectance Spectroscopy

본 실시예에서는 본 발명의 방법을 이용하여 외상성 뇌손상을 검출하는 것이 가능한 것인지 확인하기 위해서 수행되었다. 외상성 뇌손상은, 신경축삭 및 신경 수초를 포함하는 신경 세포가 파손되면서 발생하며, 다양한 증상을 보인다. 우선 본 발명의 방법을 통한 외상성 뇌손상 검출의 효용성을 검증하기 위해, 실험용 쥐에 외상성 뇌손상을 인위적으로 발생시켰다(도 6 좌측). 뇌 손상을 발생시킨 후, 상기 실험용 쥐의 뇌를 형광 현미경에서 촬영하여 손상 입은 신경축삭 부위를 확인하였다(도 6 우측).This example was performed to confirm whether it is possible to detect traumatic brain injury using the method of the present invention. Traumatic brain injury is caused by the breakdown of nerve cells, including the nerve axon and the nerve sheaths, and manifests various symptoms. To test the efficacy of traumatic brain injury detection through the method of the present invention, traumatic brain injury was artificially induced in experimental rats (Fig. 6, left). After causing brain damage, the brain of the experimental rat was photographed under a fluorescence microscope to confirm damaged neurons (Fig. 6, right).

상기 손상 부위를 본 발명의 반사분광법으로도 측정하였으며, 상기 반사분광법으로 측정된 반사광 영상과 도 6의 손상 부위 형광 현미경 영상을 병합하여 도 7에 나타내었다(붉은색 신호: 형광 현미경 측정, 하늘색 신호 : 반사광 분석). The damaged region was also measured by the reflection spectroscopy of the present invention, and the reflected light image measured by the reflection spectroscopy and the damaged region fluorescence microscope image of FIG. 6 were merged to be shown in FIG. 7 (red signal: fluorescence microscope measurement, Reflected light analysis).

그 결과 형광 현미경 측정결과와, 본 발명의 반사광 영상 분석을 통한 구조적 정보는 유사한 구조적 양상을 보여, 별도의 생화학적 표지자 없이 손상 부위의 검출이 가능함을 확인하였다.As a result, the fluorescence microscopic measurement result and the structural information through the analysis of the reflection light image of the present invention showed a similar structural pattern, and it was confirmed that the damage site can be detected without a separate biochemical marker.

도 8 좌측에는 손상된 부위의 신경 수초 반사 스펙트럼을 분석한 결과를 나타내었다. 점선은 분석을 위해 형성해낸 추세선으로, 반사 스펙트럼의 결과와 유사하게 나타난다는 것이 확인된다. On the left side of FIG. 8, the results of analyzing the neuronal reflectance spectrum of the damaged region are shown. The dotted line is a trend line formed for the analysis, and it is confirmed that it appears similar to the result of the reflection spectrum.

즉 반사스펙트럼에 의해서도 파장별로 손상된 신경 축삭에서 발생하는 부풀어 오름 현상을 확인할 수 있었다.In other words, by the reflection spectrum, we could confirm the bulging phenomenon occurring in the damaged nerve axon by wavelength.

도 8 우측에는 반사광 분석을 통한 신경축삭의 직경(x축)과 형광 현미경 영상의 신경 축삭 직경(y축)을 비교하여 나타낸 것으로, 본 발명의 반사광 분석에 신뢰성이 있다는 것이 다시 한 번 확인되었다.On the right side of FIG. 8, the diameters of the neurons (x axis) and the diameters of the neurons of the fluorescence microscope (y axis) are shown by reflection light analysis, and it is once again confirmed that the reflection light analysis of the present invention is reliable.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

10 : 광원 20 : 단색화 필터
30 : 빔 분할기 40 : 스캐너
50 : 대물렌즈 60 : 검체
70 : 공초점 관찰용 렌즈
80 : 핀홀 90 : 광검출기
91 : 분광검출기10: light source 20: monochromatic filter
30: beam splitter 40: scanner
50: Objective lens 60: Specimen
70: Confocal observation lens
80: pinhole 90: photodetector
91: Spectroscopic detector

Claims

(S1) of monochromating the light emitted from the light source;
(S 2) entering the monochromated light into the specimen in the step S 1; And
And detecting the reflected light generated from the specimen in the step S2 in the photodetector (S3).

(S1 ') of causing light emitted from the light source to enter the specimen; And
And a step (S2 ') of detecting reflected light generated from the specimen by a spectroscopic detector.

The method according to claim 1,
Wherein the monochromatic light in step S1 is passed through a scanner and an objective lens and is incident on a specimen.

3. The method of claim 2,
Wherein the light generated from the light source in step S1 'passes through the scanner (40) and the objective lens (50) and is incident on the specimen.

The method according to claim 1,
The reflected light generated in the step S3 passes through a scanner and an objective lens and then passes through a lens for confocal observation and a pinhole through a beam splitter and is incident on a photodetector. &Lt; / RTI >

3. The method of claim 2,
The reflected light generated in the step S2 'passes through the scanner and the objective lens, passes through a lens for confocal observation and a pinhole through a beam splitter, and is incident on the spectroscopic detector. Analysis of axon nano structure.

3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the wavelength of the light emitted from the light source is 400 nm to 2 占 퐉.

7. The method according to any one of claims 3 to 6,
Wherein the scanner is a galvano-mirror. &Lt; RTI ID = 0.0 > 8. < / RTI >

The method according to claim 1,
Wherein the monochromatization is performed using an acousto-optical tunable filter (AOTF). &Lt; RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >

A light source (10) generating white light (11) irradiated with a specimen;
A monochromatic filter (20) for monochromating light emitted from the light source;
A beam splitter 30 for passing reflected light generated from the specimen and entering the spectroscope; And
And a photodetector (90) for measuring the reflected light incident from the beam splitter (30).

A light source (10) generating white light (11) irradiated with a specimen;
A beam splitter 30 for passing reflected light generated from the specimen and entering the spectroscope; And
And a spectroscope detector (91) for measuring the reflected light incident from the beam splitter (30).

11. The method of claim 10,
Characterized in that the monochromatic filter is an acousto-optical tunable filter (AOTF).

The method according to claim 10 or 11,
The apparatus includes a scanner 40 for scanning the monochromatic light or reflected light;
An objective lens 50 for magnifying the specimen;
A confocal observation lens 70 for passing the reflected light; And
And a pinhole (80) through which the reflected light having passed through the lens (70) passes through the nerve axon.