KR20170133288A - Induced pluripotent stem cell culture plate using nanotopography and a culture method using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 세포외기질의 영향을 나노지형 (nanotopography)을 이용하여 재현하는 철부 및 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성한 배양 멤브레인 및 상기 배양 멤브레인 표면에 코팅되어 부착능을 향상시키는 개질제를 통해 줄기세포성이 유지되면서, 증식 및 부착 능력이 우수한 유도만능줄기세포를 다량으로 획득할 수 있는, 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 관한 것이다.The present invention relates to an inducible pluripotent stem cell culture plate, and more particularly, to a cultured membrane in which a plurality of convex portions and concavities are arranged in a pattern to reproduce the influence of extracellular matrix using nanotopography, The present invention relates to an inducible pluripotent stem cell culture plate capable of obtaining a large amount of inducible pluripotent stem cells having excellent proliferation and adhesion ability while maintaining stem cell characteristics through a modifier which is coated on the surface of the membrane to improve the adhesion ability.
Description
본 발명은 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 상기 배양 플레이트 표면을 나노 단위로 패턴화하여 세포외기질의 영향을 재현하고, 피브로넥틴으로 코팅시켜 배양 플레이트와 세포의 접촉각을 감소시킴으로서, 줄기세포성이 유지되면서, 증식 및 부착 능력이 우수한 유도만능줄기세포를 다량으로 획득이 가능한 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 관한 것이다.The present invention relates to an induction pluripotent stem cell culture plate, and more particularly, to an inducible pluripotent stem cell culture plate, in which the surface of the culture plate is patterned in nano units to reproduce the effect of the extracellular matrix and coated with fibronectin, And an inducible pluripotent stem cell culture plate capable of obtaining a large amount of inducible pluripotent stem cells excellent in proliferation and adhesion ability while retaining stem cell characteristics.
줄기세포는 증식 능력 및 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 독특한 능력을 가지며, 조직공학 및 재생의약에 있어서 많은 대안과 기회를 제공하고 있다. 줄기세포는 체내에서 용해성 및 비용해성 인자의 복합체 및 조절된 생화학적 화합물과 같이 유용하고 조직 특이적인 환경 하에 존재한다.Stem cells have proliferative potential and unique ability to differentiate into various types of cells and offer many alternatives and opportunities for tissue engineering and regenerative medicine. Stem cells are found in useful, tissue-specific environments, such as complexes of soluble and insoluble factors and controlled biochemical compounds in the body.
최근, 줄기세포를 체외에서 배양한 후, 이를 이용하는 세포 치료가 점차 확대되고 있다. 이에, 세포의 증식과 분화 효율을 향상시킬 수 있는 배양 방법과 배양계(culture system)에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히, 배양계에는 다양한 기기들이 관계하고 있으며, 이에 있어서 중요한 요소 중의 하나가 세포 배양용 용기이다. 일반적으로 많은 수의 세포를 얻기 위하여, 배양 세포의 특성에 따라 인공적으로 만들어진 배양 접시, 배양 플라스크 또는 롤러 병 등의 세포 배양용 용기에서 세포를 배양하게 된다. 이 때, 인공적으로 배양하는 세포들은 주로 세포 배양용 용기의 바닥에 부착되어 성장, 증식 및 분화의 과정을 거치면서 생존하지만, 일부 세포는 여러 층을 형성하면서, 다른 세포 위에 겹쳐 증식하기도 하고, 또 다른 일부 세포는 세포 배양액 내에서 부유 상태를 유지하면서 성장 증식 및 분화하기도 한다. 이로 인해, 인공적으로 만들어진 세포 배양용 용기는 원래 세포가 안주하고 있는 세포외 기질과는 다른 표면 특성을 가지고 있는바, 세포 증식 및 분화 효율이 저하될 수 있다.In recent years, cell therapy using stem cells has been gradually expanded, after culturing the cells in vitro. Accordingly, there is a growing interest in a culture method and a culture system capable of improving cell proliferation and differentiation efficiency. In particular, various devices are involved in the culture system, and one of the important factors is the cell culture container. In general, in order to obtain a large number of cells, the cells are cultured in a cell culture container such as a culture dish, culture flask or roller bottle made artificially according to the characteristics of cultured cells. At this time, artificially cultured cells adhere to the bottom of a cell culture container and survive the process of growth, proliferation and differentiation. However, some cells form multiple layers and overlap and grow on other cells. Some other cells also grow and differentiate while remaining suspended in cell culture fluids. As a result, the artificial cell culture container may have different surface characteristics from the extracellular matrix originally accommodated in the cells, and the cell proliferation and differentiation efficiency may be lowered.
한편, 나노 미터 크기의 정밀성을 가지는 미세 패턴 제작 기술은 최근 반도체 공업의 발전에 크게 힘입은 바 있으며, 이를 이용한 온전자선 기술, 주사탐침 현미경 기술, 나노 임프린트 기술, 마이크로 컨택 프린트 기술 등 다양한 나노 미터 크기의 제어기술 들과 함께 이를 이용한 응용기술의 개발을 가능하게 하고 있다. 이로 인해, 패턴을 주형으로 음각의 복제 패턴을 만들어 내는데도 이용할 수 있으며, 이 기술은 가공성 및 표면의 화학적 개질 등이 용이한 고분자 기판 위에 쉽고 빠르게 패턴을 전사할 수 있다.On the other hand, the technology of producing fine patterns having precision of nanometer size has recently been strongly influenced by the development of the semiconductor industry and has been used for various nanometer sizes such as an electric charger technology, a scanning probe microscope technology, a nanoimprint technology, And it is possible to develop application technologies using them. This makes it possible to use the pattern as a template to reproduce the engraved pattern, and this technique can transfer the pattern easily and quickly onto the polymer substrate, which facilitates processability and chemical modification of the surface.
또한, 세포 거동을 제어하기 위한 연구는 다양하고도 폭 넓은 의학적 응용 가능성 때문에 여러 가지 기술들이 개발되고 있는 가운데, 특히, 줄기세포의 분화를 제어하는 것은 그 임팩트가 매우 클 것으로 판단되어, 최근 주목 받고 있다. 종래 줄기세포의 분화를 비롯한 세포의 여러 가지 거동 제어는 세포에 해당 신호를 전달하는 화학 물질들을 이용하는 것이 일반적이었으나, 상술한 미세 패턴을 이용하여 세포의 거동을 제어하는 연구가 진행되고 있으며, 미세 패턴의 크기 또한 종래의 마이크로 단위에서 나노 패턴으로 발전하고 있다.In addition, studies for controlling cell behavior have been developed for a variety of medical applications because of their wide variety of medical applications. Particularly, controlling the differentiation of stem cells is considered to have a very high impact, have. Conventionally, it has been common to use chemical substances that transmit signals to cells to control various behaviors of cells including differentiation of stem cells. However, studies have been conducted to control the behavior of cells using the above-mentioned fine patterns, Has also been developed into a nanopattern in the conventional micro-scale.
이러한 나노 단위의 패턴을 이용하여 특정 세포의 배양능력을 향상시키거나, 줄기세포성을 유지하면서, 증식 능력 및 분화 능력을 향상시키는 배양용 용기 개발이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국공개특허 10-2010-0039944), 아직은 미비한 실정이다.The development of a culture container which improves the culturing ability of a specific cell using such a nano-unit pattern or improves the proliferation ability and differentiation ability while maintaining stem cell characteristics is a subject of major problems. (Korean Patent Laid-Open No. 10-2010-0039944).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 나노 단위의 철부 및 요부를 구비하는 배양 멤브레인 및 상기 멤브레인 표면에 개질제를 이용한 코팅을 통해서, 줄기세포성을 유지하면서 증식 및 부착 능력이 우수한 유도만능줄기세포를 배양하는 배양 플레이트를 발명하였다.Disclosure of the Invention The present invention has been conceived to solve the problems as described above, and it is an object of the present invention to provide a method for preparing a membrane, which comprises a nano unit of a culture membrane having a convex portion and a concave portion and a coating with a modifier on the membrane surface, A culture plate for culturing induced pluripotent stem cells with excellent ability was invented.
이에, 본 발명의 목적은SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly,
300-400㎚의 직경을 갖는 철부 및 100-300㎚의 직경을 갖는 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인; 및A culture membrane in which a convex portion having a diameter of 300-400 nm and a concave portion having a diameter of 100-300 nm are arranged to form a pattern; And
상기 배양 멤브레인 표면에 코팅된 개질제를 포함하는, 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 제공하는 것이다.And a modifier coated on the surface of the culture membrane.
본 발명의 다른 목적은Another object of the present invention is
하기의 단계를 포함하는 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 이용한 유도만능줄기세포 배양 방법:An inducible pluripotent stem cell culture method using an inducible pluripotent stem cell culture plate comprising the steps of:
(a) 300-400㎚의 직경을 갖는 복수개의 철부 및 100-300㎚의 직경을 갖는 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인을 기판 상면에 배치시키는 단계;(a) disposing a culture membrane on the upper surface of the substrate, the plurality of convexes having a diameter of 300-400 nm and the recesses having a diameter of 100-300 nm arranged in a plurality to form a pattern;
(b) 상기 나노 배양 멤브레인 표면을 친수성으로 개질시키는 단계;(b) hydrophilizing the surface of the nano-culture membrane;
(c) 개질된 상기 배양 멤브레인 표면을 개질제로 코팅시키는 단계; 및(c) coating the modified culture membrane surface with a modifier; And
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 배양 테이블에 유도만능줄기세포를 부착하여 배양하는 단계를 제공하는 것이다.(d) attaching the inducible pluripotent stem cells to the culture table prepared in the step (c) for culturing.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object,
300-400㎚의 직경을 갖는 철부 및 100-300㎚의 직경을 갖는 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인; 및A culture membrane in which a convex portion having a diameter of 300-400 nm and a concave portion having a diameter of 100-300 nm are arranged to form a pattern; And
상기 배양 멤브레인 표면에 코팅된 개질제를 포함하는, 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 제공한다.And a modifier coated on the surface of the culture membrane.
바람직하게는, 상기 배양 멤브레인은, 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어질 수 있다.Preferably, the culture membrane may be composed of polydimethylsiloxane (PDMS).
바람직하게는, 상기 개질제는 피브로넥틴 (Fibronectin)일 수 있다.Preferably, the modifying agent may be fibronectin.
바람직하게는, 상기 철부 및 요부는, 반구형, 만곡진 호형, 파형 또는 기둥형으로 이루어질 수 있다.Preferably, the convex portion and the concave portion may be hemispherical, curved arc-shaped, corrugated or pillar-shaped.
바람직하게는, 상기 배양 플레이트는, 유도만능줄기세포 (Induced pluripotent stem cells)의 부착 및 증식능을 향상시킬 수 있다.Preferably, the culture plate may enhance the adhesion and proliferation of induced pluripotent stem cells.
바람직하게는, 상기 배양 플레이트는, 유도만능줄기세포 (Induced pluripotent stem cells)의 미분화 유지능을 향상시킬 수 있다.Preferably, the culture plate can improve the undifferentiated maintenance ability of inducible pluripotent stem cells.
본 발명은The present invention
하기의 단계를 포함하는 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 이용한 유도만능줄기세포 배양 방법:An inducible pluripotent stem cell culture method using an inducible pluripotent stem cell culture plate comprising the steps of:
(a) 300-400㎚의 직경을 갖는 복수개의 철부 및 100-300㎚의 직경을 갖는 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인을 기판 상면에 배치시키는 단계;(a) disposing a culture membrane on the upper surface of the substrate, the plurality of convexes having a diameter of 300-400 nm and the recesses having a diameter of 100-300 nm arranged in a plurality to form a pattern;
(b) 상기 나노 배양 멤브레인 표면을 친수성으로 개질시키는 단계;(b) hydrophilizing the surface of the nano-culture membrane;
(c) 개질된 상기 배양 멤브레인 표면을 개질제로 코팅시키는 단계; 및(c) coating the modified culture membrane surface with a modifier; And
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 배양 테이블에 유도만능줄기세포를 부착하여 배양하는 단계를 제공한다.(d) attaching the inducible pluripotent stem cells to the culture table prepared in the step (c) and culturing the cells.
본 발명에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트는, 생체내에서의 물리적 미세환경 즉, 세포외기질의 영향을 나노지형 (nanotopography)을 이용하여 재현하는 패턴화된 배양 멤브레인 및 상기 배양 멤브레인 표면에 코팅된 개질제를 포함함으로서, 상기 배양 플레이트에 사람유도만능줄기세포를 부착하여 배양하였을 때, 종래의 줄기세포의 계대배양 과정 중에서 손실되는 줄기세포성 유지의 문제를 해결하였는바, 증식 능력 및 부착 능력이 보다 우수하고, 미분화 유지능이 향상된 사람유도만능줄기세포를 다량 획득할 수 있다. INDUSTRIAL APPLICABILITY The induced pluripotent stem cell culture plate according to the present invention is a plate for culturing a pluripotent stem cell comprising a patterned culture membrane which reproduces the physical microenvironment in vivo, that is, the influence of the extracellular matrix using nanotopography, The present invention solves the problem of loss of stem cell viability during the passage of the stem cells of the conventional stem cells when cultured with human induced pluripotent stem cells attached to the culture plate, , And a large amount of human induced pluripotent stem cells having improved undifferentiated maintenance ability can be obtained.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 분해 사시도이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 나노지형 (nanotopography)에 따른 영향을 비교하기 위한 편평한 형태의 패턴 멤브레인 (Flat pattern Membrane; FPM)의 제작 모식도를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 나노지형에 따른 영향을 확인하기 위한 비교예로 제작된 편평한 형태의 패턴 멤브레인 (Flat pattern Membrane; FPM)의 SEM 및 AFM를 통해 촬영한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 나노지형에 따른 영향을 비교하기 위한 불규칙한 패턴 멤브레인 (Irregular pattern Membrane; IPM)의 제작 모식도이다.
도 3b는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 나노지형에 따른 영향을 확인하기 위한 비교예로 제작된 불규칙한 패턴 멤브레인 (Irregular pattern Membrane; IPM)의 SEM 및 AFM를 통해 촬영한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 나노지형에 따른 영향을 확인하기 위한 비교예로 제작된 불규칙한 패턴 멤브레인 (Irregular pattern Membrane; IPM)의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 반구형, 만곡진 호형 및 파형(Groove) 및 원기둥형(Post) 패턴 멤브레인 (Groove pattern Membrane; GPM 및 Post pattern Membrane; PPM)의 제작 모식도이다.
도 5a는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 Groove master mold의 모식도 및 SEM 이미지이다.
도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 Post master mold의 모식도 및 SEM 이미지이다.
도 5c는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 GPM의 SEM, AFM 이미지 및 크기 모식도이다.
도 5d는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 PPM의 SEM, AFM 이미지 및 크기 모식도이다.
도 6a는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 배양 멤브레인 표면상에 피브로넥틴 코팅 전/후의 접촉각 및 접촉각 수치의 비교를 나타낸 것이다.
도 6b는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 각 배양 멤브레인 표면상에 피브로넥틴 코팅 후의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 각 배양 멤브레인에 유도만능줄기세포를 부착하여 계대 배양에서 Phase 사진 (A), Total PDL 및 PDL (B), 및 Ki67 발현량 및 면역화학염색 (C) 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에서 미분화상태 유지능을 확인하기 위한 Oct3/4 및 Nanog 발현량 (A), 면역화학염색 (B) 및 발현 세포량 % (C)를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 의한 유도만능줄기세포의 세포 부착시 세포의 형태학적 모양을 SEM (A) 및 AFM (B) 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 의한 유도만능줄기세포의 부착 관계 신호전달체계 변화를 real-time PCR (A) 및 western blot (B) 결과를 통해 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 의한 유도만능줄기세포의 세포골격의 변화를 나타낸 것이다.1 is an exploded perspective view of an induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
2A is a schematic diagram showing a flat pattern membrane (FPM) fabricated to compare the influence of nanotopography of an induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2B is a graph showing the effect of the flat pattern membrane (FPM) on SEM and AFM of the flat type membrane fabricated as a comparative example for confirming the influence of the nanotubes of the induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention The results are shown in the photograph.
FIG. 3A is a schematic diagram showing the fabrication of an irregular pattern membrane (IPM) for comparing the influence of nanograins on the induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3B is a photograph showing an irregular patterned membrane (IPM) SEM and AFM prepared as a comparative example for confirming the influence of the nanograins on the induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention The results are shown.
3C is a schematic diagram of an Irregular Pattern Membrane (IPM) fabricated as a comparative example for confirming the influence of the nanograins on the induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the results of a hemispherical shape, a curved arcuate shape, a groove and a post pattern membrane (GPM and Post pattern Membrane; PPM) in an induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention. It is a production diagram.
5A is a schematic and SEM image of a groove master mold in an induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
5B is a schematic and SEM image of a post master mold in an induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5C is a SEM, AFM image, and size diagram of GPM in an induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 5D is a SEM, AFM image, and size diagram of PPM in an induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention. FIG.
6A shows a comparison of contact angle and contact angle values before and after fibronectin coating on a culture membrane surface in an inducible pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
6B is a SEM image after fibronectin coating on each culture membrane surface in an induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the results of Phase Photo (A), Total PDL and PDL (B), and expression of Ki67 in the subculture by induction of pluripotent stem cells in each culture membrane in an inducible pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention And immunochemical staining (C).
FIG. 8 is a graph showing the amounts of Oct3 / 4 and Nanog expression (A), immunochemical staining (B) and expressed cell mass% (C) in the induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention ).
FIG. 9 shows SEM (A) and AFM (B) images of morphologic morphology of cells induced by induction of pluripotent stem cells by an induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
10 shows the results of real-time PCR (A) and western blot (B) of changes in adhesion signaling system of induced pluripotent stem cells induced by the induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
FIG. 11 shows changes in the cytoskeleton of induced pluripotent stem cells by the induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, in order that those skilled in the art can easily carry out the present invention. The shapes, sizes, ratios, angles, numbers, and the like disclosed in the drawings for describing the embodiments of the present invention are illustrative, and thus the present invention is not limited thereto. In the following detailed description of the preferred embodiments of the present invention, a detailed description of known functions and configurations incorporated herein will be omitted when it may make the subject matter of the present invention rather unclear. In the drawings, like reference numerals are used throughout the drawings.
덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 '연결' 되어 있다고 할 때, 이는 '직접적으로 연결' 되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 '간접적으로 연결' 되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 '포함' 한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.In addition, in the entire specification, when a part is referred to as being 'connected' to another part, it may be referred to as 'indirectly connected' not only with 'directly connected' . Also, to "include" an element means that it may include other elements, rather than excluding other elements, unless specifically stated otherwise.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 사시도를 도시한 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트는 배양 멤브레인 및 개질제를 포함하여 구성될 수 있다.1 is a perspective view of an induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 1, an induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention may include a culture membrane and a modifier.
본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트는, 나노 단위의 철부 및 요부를 통하여 형성된 패턴화된 배양 멤브레인 및 상기 배양 멤브레인 표면에 코팅된 개질제를 통해서, 유도만능줄기세포의 배양 증식에 영향을 줄 수 있다. 이와 같은 구성을 채택함으로써, 표면이 개질된 배양 플레이트는 세포외기질의 영향을 나노지형 (nanotopography)을 이용하여 재현하였는바, 줄기세포성이 유지되면서, 증식 및 부착 능력이 우수한 유도만능줄기세포를 다량으로 획득할 수 있을 것으로 기대된다.The induction pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention may be used for culturing induced pluripotent stem cells through a patterned culture membrane formed through nano unit convex and concave portions and a modifier coated on the surface of the culture membrane It can affect. By adopting such a configuration, the surface-modified culture plate reproduced the influence of the extracellular matrix by using nanotopography. As a result, the pluripotent pluripotent pluripotent stem cells, which have superior proliferation and adhesion ability, As well.
이하에서는, 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 구성하는 각각의 구성요소에 대하여 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, each component constituting the induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention will be described in detail.
배양 멤브레인은, 세포의 배양이 이루어지는 공간을 제공하는 구성으로서, 도 1에 도시된 바와 같이, 철부 및 요부가 복수개로 배열되어 세포외기질의 영향을 나노지형 (nanotopography)을 이용하여 패턴화한 물리적 환경을 제공할 수 있다. 이 때, 상기 배양 멤브레인은 바람직하게는, 기판 상에 형성될 수 있다. 또한, 상기 배양 멤브레인은 바람직하게는, 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱이, 상기 철부는 300 ~ 400 ㎚의 직경을 갖는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 300 ㎚일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 요부는 100 ~ 300 ㎚의 직경을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱이, 상기 철부 및 요부는 바람직하게는 반구형, 만곡진 호형, 파형 또는 기둥형의 형태로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.1, a plurality of convex portions and concave portions are arranged in a physical environment in which the influence of the extracellular matrix is patterned by using nanotopography, Can be provided. At this time, the culture membrane is preferably formed on the substrate. In addition, the culture membrane may preferably be made of polydimethylsiloxane (PDMS), but is not limited thereto. Further, the convex portion preferably has a diameter of 300 to 400 nm, more preferably 300 nm, but is not limited thereto. Preferably, the concave portion has a diameter of 100 to 300 nm, It is not. Furthermore, the convex portion and the concave portion may be formed in a hemispherical shape, a curved shape, a wavy shape, or a columnar shape, but are not limited thereto.
한편, 줄기세포를 배양하는데 있어서, 종래의 배양기들은 산소 플라즈마를 패턴화된 배양기 상에 처리하여 줄기세포의 부착능을 강화시켜왔다. 하지만, 산소 플라즈마 처리만으로는 친수화가 충분히 이루어지지 않는바, 상기 줄기세포의 만족스러운 부착능을 얻지 못하는 실정이었다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 본 발명의 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트는 상기 배양 멤브레인 표면을 개질제로 코팅하였는바, 이를 통해 상기 배양 멤브레인의 접촉각을 감소시켜, 친수화가 향상됨에 따라 줄기세포의 부착능을 강화시킬 수 있다.On the other hand, in culturing stem cells, conventional incubators have enhanced the ability of adherent stem cells to treat oxygen plasma on a patterned incubator. However, since the hydrophilic treatment is not sufficiently performed by the oxygen plasma treatment only, the stem cells can not be satisfactorily adhered. In order to solve such a problem, the induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention is coated with the modifying agent on the surface of the culture membrane, thereby reducing the contact angle of the cultured membrane, Can be strengthened.
보다 구체적으로, 개질제는, 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 배양 멤브레인 표면에 코팅될 수 있으며(파란색), 이로 인해 친수화를 증가시킬 수 있다. 이 때, 상기 개질제은 바람직하게는, 피브로넥틴 (Fibronectin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.More specifically, the modifier may be coated on the surface of the culture membrane (blue), as shown in Fig. 1, thereby increasing the hydrophilicity. At this time, the modifier may be, but is not limited to, fibronectin.
본 발명의 일 실시예에서는, 다양한 패턴을 갖는 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 제작하고(실시예 1 및 2 참조), 상기 제작된 배양 플레이트를 이용하여 유도만능줄기세포의 배양 능력을 확인한 결과, 초기 배양에 비하여 계대가 진행됨에 따라 배양 멤브레인 상을 꽉 채우는 유도만능줄기세포의 부착 및 증식능 향상을 확인하였다. 뿐만 아니라, 미분화 배아줄기세포 마커의 발현량 확인을 통해서, 줄기세포의 미분화 유지능도 향상됨을 확인하였다(실시예 3 참조).In one embodiment of the present invention, an inducible pluripotent stem cell culture plate having various patterns was prepared (see Examples 1 and 2), and the culture ability of the induced pluripotent stem cells was confirmed using the prepared culture plate. As a result, As the passage progressed compared to the culture, adhesion and pluripotency of inducible pluripotent stem cells filled the culture membrane were confirmed. In addition, confirmation of the expression level of undifferentiated embryonic stem cell markers showed that the ability to maintain undifferentiated stem cells was also improved (see Example 3).
따라서, 본 발명에 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 통해서 유도만능줄기세포의 줄기세포성을 유지하면서, 세포 부착 및 증식이 우수한 유도만능줄기세포를 배양 및/또는 수득할 수 있을 것으로 기대된다.Thus, it may be possible to cultivate and / or obtain induced pluripotent stem cells having excellent cell adhesion and proliferation, while maintaining the stem cell characteristics of the induced pluripotent stem cells through the induction pluripotent stem cell culture plate according to one embodiment of the present invention It is expected.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 이용한 유도만능줄기세포 배양 방법을 제공한다:Accordingly, in another aspect of the present invention, the present invention provides a method for culturing an inducible pluripotent stem cell using an inducible pluripotent stem cell culture plate comprising the steps of:
(a) 300-400㎚의 직경을 갖는 복수개의 철부 및 100-300㎚의 직경을 갖는 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인을 기판 상면에 배치시키는 단계;(a) disposing a culture membrane on the upper surface of the substrate, the plurality of convexes having a diameter of 300-400 nm and the recesses having a diameter of 100-300 nm arranged in a plurality to form a pattern;
(b) 상기 나노 배양 멤브레인 표면을 친수성으로 개질시키는 단계;(b) hydrophilizing the surface of the nano-culture membrane;
(c) 개질된 상기 배양 멤브레인 표면을 개질제로 코팅시키는 단계; 및(c) coating the modified culture membrane surface with a modifier; And
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 배양 테이블에 유도만능줄기세포를 부착하여 배양하는 단계.(d) attaching the inducible pluripotent stem cells to the culture table prepared in the step (c) and culturing.
단계 (a)에서는, 기판 상면에 철부 및 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인을 배치시킨다. 이 때, 상기 기판은, 실리콘 웨이퍼 또는 글라스 웨이퍼로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In step (a), a plurality of convex portions and concave portions are arranged on the upper surface of the substrate to dispose a culture membrane for forming a pattern. At this time, the substrate may be a silicon wafer or a glass wafer, but is not limited thereto.
또한, 상기 기판 상에 배양 멤브레인을 배치시키기 위해서, E-beam 리소그래피 장비를 사용하여 기판 상에 포토 레지스트 패턴을 형성한 후, Deep RIE 장비를 이용하여 식각 (etching)을 진행 한다. 이 후, 실란 처리를 진행한 뒤, 폴리디메틸실록산 (PDMS)를 도포하여, 3 ~ 5 시간 동안 진공데시게이터에 놓은 후, 상기 기판을 70 ~ 90 ℃, 11 ~ 13 시간 가열을 진행하면, 철부 및 요부가 복수개로 패턴화된 배양 멤브레인을 기판 상에 배치할 수 있다.Further, in order to dispose the culture membrane on the substrate, a photoresist pattern is formed on the substrate using an E-beam lithography equipment, and etching is performed using a Deep RIE equipment. Then, polydimethylsiloxane (PDMS) is applied to the substrate and the substrate is placed in a vacuum desiccator for 3 to 5 hours. After heating the substrate at 70 to 90 ° C for 11 to 13 hours, And a culture membrane in which a plurality of recesses are patterned can be disposed on the substrate.
단계 (b)에서는, 상기 단계 (a)에서 얻은 패턴화된 배양 멤브레인을 친수화 시킨다. 보다 구체적으로, 상기 PDMS를 이용하여 단계 (a)에서 얻은 패턴화된 배양 멤브레인은 PDMS의 특성으로 인해 소수성을 나타내는바, 이를 친수화시키는 과정이 필요하며, 이를 위해 산소 플라즈마 처리를 하는 것이 바람직하다. 이 때, 산소 플라즈마 처리는 산소량 25 SCCM, 전력 40 W 및 40 SEC 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다.In step (b), the patterned culture membrane obtained in step (a) is hydrophilized. More specifically, the patterned culture membrane obtained in step (a) using the PDMS exhibits hydrophobicity due to the characteristics of PDMS, and a process for hydrophilizing the PDMS membrane is required. For this, oxygen plasma treatment is preferably performed. At this time, it is preferable that the oxygen plasma treatment is performed under conditions of an oxygen amount of 25 SCCM, a power of 40 W, and a power of 40 sec.
단계 (c)에서는, 상기 단계 (b)에서 얻은 친수화된 배양 멤브레인을 피브로넥틴 (Fibronectin)으로 코팅하는 단계이다.In step (c), the hydrophilicized culture membrane obtained in step (b) is coated with fibronectin.
이는, 상기 단계 (b) 진행 결과 충분한 친수화가 진행되지 않았는바, 상기 피브로넥틴 코팅을 통해서, 친수화를 증가시킬 수 있다. 이 때, 피브로넥틴은 상기 배양 멤브레인에 바로 코팅되지 않기 때문에 폴리-디-오르니틴 (Poly-DL-ornithine)을 이용하여 4시간 이상 전처리 한 후, 피브로넥틴으로 1시간 이상 코팅한다. 이로 인해 본 발명에 일실시예에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 얻을 수 있다.This is because, as a result of the above step (b), hydrophilization can be increased through the fibronectin coating since sufficient hydrophilization has not proceeded. At this time, since fibronectin is not directly coated on the culture membrane, it is pretreated with Poly-DL-ornithine for 4 hours or longer and then coated with fibronectin for 1 hour or more. Thus, the induced pluripotent stem cell culture plate according to an embodiment of the present invention can be obtained.
단계 (d)에서는, 상기 단계 (c)에서 얻은 유도만능줄기세포 배양 플레이트에 유도만능줄기세포를 부착시키고, 계대 배양을 진행한다. In step (d), the induced pluripotent stem cells are attached to the induced pluripotent stem cell culture plate obtained in step (c), and subculture is performed.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[[ 실시예Example ]]
실시예Example 1. 본 발명에 따른 1. According to the invention 유도만능줄기세포Induced pluripotent stem cells 배양 플레이트 구현 Culture plate implementation
1-1. 편평한 형태의 패턴 멤브레인 (Flat pattern Membrane; FPM) 제작 및 표면 확인 1-1. Flat pattern membrane (FPM) fabrication and surface confirmation
본 발명에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 패턴에 따른 나노지형의 영향을 확인하기 위해서, 도 2a에 도시된 바와 같이, 패턴이 형성되지 않은 배양 멤브레인인 편평한 형태의 패턴 멤브레인을 비교 그룹으로 제작하였다.In order to confirm the effect of the nanoragery pattern according to the pattern of the induced pluripotent stem cell culture plate according to the present invention, as shown in FIG. 2A, a flat pattern membrane, which is a non-patterned culture membrane, .
보다 구체적으로, 순수한 실리콘 웨이퍼상에 폴리디메틸실록산 (PDMS)를 붓고, 이 후, 스핀코터를 이용해서 스핀코팅을 진행한 후, 80℃ 온도로 12시간 가열하였다. 이 후, PDMS의 경화가 진행되어 완료되면, 편평한 형태의 배양 멤브레인 (FPM)을 얻었다.More specifically, polydimethylsiloxane (PDMS) was poured onto a pure silicon wafer, followed by spin coating using a spin coater, followed by heating at 80 占 폚 for 12 hours. Thereafter, when the curing of the PDMS proceeded and was completed, a flat culture membrane (FPM) was obtained.
상기 FPM의 모양모사를 확인하기 위해서, 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy; SEM) 및 원자간력현미경 (Atomic force micoscopy; AFM)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과 도 2b에 도시된 바와 같이, SEM 및 AFM 이미지를 통해 매끄러운 표면을 가진 배양 멤브레인이 형성되는 것을 확인하였다.In order to confirm the shape simulation of the FPM, a scanning electron microscopy (SEM) and an atomic force microscopy (AFM) were used to analyze the result. As a result, as shown in FIG. 2B, AFM images confirmed the formation of a culture membrane with a smooth surface.
1-2. 불규칙한 패턴 멤브레인 (Irregular Pattern Membrane; IPM ) 제작 및 표면 확인 1-2. Irregular pattern membrane (Irregular Pattern Membrane; IPM )
실시예 1-1과 마찬가지로 본 발명에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 패턴에 따른 나노지형의 영향을 확인하기 위해서, 도 3a에 도시된 바와 같이, 불규칙한 형태의 패턴 멤브레인 (IPM)을 제작하였다.As in Example 1-1, in order to confirm the effect of the nanorge patterns according to the pattern of the induction pluripotent stem cell culture plate according to the present invention, an irregular patterned membrane (IPM) was prepared as shown in FIG.
보다 구체적으로, 글라스 웨이퍼 (석영) 상에 플라이머를 뿌린 후, 2 시간 동안 건조시킨다. 이 후, 건조된 글라스 웨이퍼 위에 나노 프린트를 뿌리고, 상온에서 건조시켰으며, 건조시킨 글라스 웨이퍼 위에 PDMS를 도포한 후, 진공데시게이터에서 2시간 동안 넣어 놓았다. 이 후, 글라스 웨이퍼를 80℃ 온도로 12시간 가열하여 불규칙한 배양 멤브레인 (IPM)을 얻었으며, 이를 SEM 및 AFM의 이미지를 통해 확인한 결과, 도 3b에 도시된 바와 같이, 불규칙한 표면을 확인하였다. 또한, 도 3c에 도시된 바와 같이, 나노 표면의 높이가 평균 87.1 ㎚이고, 입자 패턴 사이의 거리는 226.2 내지 447.6 ㎚ 인 불규칙한 패턴 멤브레인이 형성되는 것을 확인하였다.More specifically, after spraying a plier on a glass wafer (quartz), it is dried for 2 hours. Thereafter, a nano-print was sprinkled on a dried glass wafer, dried at room temperature, applied PDMS onto a dried glass wafer, and placed in a vacuum desiccator for 2 hours. Thereafter, the glass wafer was heated at 80 ° C for 12 hours to obtain an irregular culture membrane (IPM). The irregular culture membrane (IPM) was confirmed through the images of SEM and AFM. As a result, an irregular surface was confirmed as shown in FIG. Also, as shown in FIG. 3C, it was confirmed that an irregular patterned membrane having a height of nano surface of 87.1 nm on average and a distance between particle patterns of 226.2 to 447.6 nm was formed.
1-3. 반구형, 만곡진 호형, 파형 (Groove) 및 기둥형 (Post) 패턴 멤브레인 (Groove Pattern Membrane; GPM and Post Pattern Membrane: PPM) 제작 1-3. Hemispherical, curvilinear, grooved and post patterned membranes (Groove Pattern Membrane: GPM and Post Pattern Membrane: PPM)
본 발명에 따른 철부 및 요부가 복수개로 배열되어, Groove 및 Post 패턴을 형성하는 배양 멤브레인을 제작하기 위해서, E-beam 리소그래피 장비를 사용하여 포토 레지스트 패턴을 실리콘 웨이퍼에 형성 시킨 후, 패턴이 형성된 실리콘 웨이퍼를 Deep RIE (reactive ion etcher) 장비를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 식각 (etching) 하였다. 다음으로 패턴화된 실리콘 웨이퍼를 실란 처리를 통하여, 표면을 소수성으로 변환시킨 후, 그 위에 PDMS를 부어 진공데시게이터에 4시간 동안 넣어 놓았다. 이 후, 실리콘 웨이퍼를 80℃ 온도로 12시간 가열한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, Groove 패턴 멤브레인 (GPM) 및 Post 패턴 멤브레인 (PPM)을 얻었다.A plurality of convex portions and concave portions according to the present invention are arranged so that a photoresist pattern is formed on a silicon wafer by using an E-beam lithography equipment to form a culture membrane for forming a groove and a post pattern, The wafer was etched using a Deep RIE (reactive ion etcher) equipment. Next, the patterned silicon wafer was converted into a hydrophobic surface through silane treatment, and then PDMS was poured thereon and placed in a vacuum desiccator for 4 hours. Thereafter, the silicon wafer was heated at a temperature of 80 DEG C for 12 hours to obtain a groove pattern membrane (GPM) and a post pattern membrane (PPM) as shown in Fig.
1-4. Groove 및 Post 패턴 멤브레인 (Groove Pattern Membrane; GPM and Post Pattern Membrane; PPM) 표면 확인 1-4. Groove and Post pattern membrane (Membrane Groove Pattern; GPM and Post Pattern Membrane; PPM) Surface Check
GPM 및 PPM 패턴 멤브레인의 PDMS 개질 전에 master mold의 형태를 각각 SEM을 통하여 확인한 결과, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, GPM의 master mold의 경우, 폭이 239.7 ㎚, 높이가 98.5 ㎚, 사이 간격이 237.9 ㎚ 의 Groove 형태의 master mold를 확인하였으며, PPM의 경우, 폭이 237.2 ㎚, 높이 98.5 ㎚, 사이 간격이 237.2 ㎚ Post 형태의 master mold를 확인하였다.As shown in FIGS. 5A and 5B, in the case of the master mold of GPM, the width of the master mold was 239.7 nm, the height was 98.5 nm, A master mold with a gap of 237.9 ㎚ was identified. In the case of PPM, a master mold with a width of 237.2 ㎚, a height of 98.5 ㎚, and a spacing of 237.2 ㎚ was confirmed.
이 후, PDMS 개질을 진행한 결과, 도 5c 및 도 5d에 도시된 바와 같이, 각각 master mold의 음각과 양각의 방향이 반대로 되어진 GPM 및 PPM을 확인하였다. 보다 구체적으로, GPM의 경우 폭이 377.2 ㎚, 높이가 82.5 ㎚, 사이 간격이 161.1 ㎚ GPM을 확인하였으며, PPM의 경우 폭이 310 ㎚, 높이가 60.1 ㎚, 사이 간격이 100.7 ㎚ PPM을 확인하였다.As a result of the PDMS modification, the GPM and the PPM in which the directions of embossing and embossing of the master mold were reversed, respectively, were confirmed as shown in FIGS. 5C and 5D. More specifically, GPM was 377.2 ㎚ in width, 82.5 ㎚ in height, and 161.1 ㎚ GPM in spacing. In the case of PPM, the width was 310 ㎚, the height was 60.1 ㎚, and the interval was 100.7 ㎚ PPM.
1-5. 배양 1-5. culture 멤브레인의Membrane 표면 거칠기 확인 Check surface roughness
각 배양 멤브레인의 표면 거칠기를 확인하기 위하여, SEM을 통해 거칠기 값을 측정한 결과 하기 표 1과 같이 나타났다.In order to confirm the surface roughness of each culture membrane, the roughness value was measured by SEM and the results are shown in Table 1 below.
[표 1][Table 1]
그 결과, 상기 표 1에 도시된 바와 같이, IPM의 표면 거칠기 값이 가장 크게 측정된 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the surface roughness value of IPM was the largest measured as shown in Table 1 above.
실시예Example 2. 배양 2. Culture 멤브레인의Membrane 표면 개질 Surface modification
2-1. 산소 2-1. Oxygen 플라즈마plasma 처리를 이용한 Processing 친수화Hydrophilization 처리 process
상기 실시예 1에서 제작된 배양 멤브레인은 모두 PDMS로 제작되어 소수성 (hydrophobic)을 띠고 있는바, 산소 플라즈마 처리를 통해서 친수성 표면으로 개질하는 친수화 처리를 진행하였다. 보다 구체적으로, 산소량 25 SCCM, 전력 40 W 및 시간 40 SEC의 조건하에서 산소 플라즈마 처리를 진행하였다.The culture membranes prepared in Example 1 were all made of PDMS and hydrophobic, and the hydrophilization treatment was carried out to modify the hydrophilic surface by oxygen plasma treatment. More specifically, the oxygen plasma treatment was performed under the conditions of an oxygen amount of 25 SCCM, a power of 40 W, and a time of 40 seconds.
2-2. 2-2. 개질제를Modifier 이용한 배양 Used culture 멤브레인Membrane 표면 개질 Surface modification
상기 실시예 2-1의 방법으로 친수화 처리를 진행한 결과 친수화가 충분히 이루어지지 않음을 확인하였으며, 이에, 본 발명의 일실시예에 따른 개질제를 이용하여 배양 멤브레인의 친수화를 증가시키고자 하였다. 보다 구체적으로, 산소 플라즈마 처리가 된 각 배양 멤브레인 표면을 개질제로 코팅을 진행하고, 접촉각을 측정하였다. 이 때, 개질제로는 피브로넥틴 (Fibronectin)을 사용하였다. As a result of the hydrophilization treatment by the method of Example 2-1, it was confirmed that hydrophilization was not sufficiently performed. Accordingly, the hydrophilization of the culture membrane was increased by using the modifier according to one embodiment of the present invention . More specifically, the surface of each culture membrane subjected to the oxygen plasma treatment was coated with a modifying agent, and the contact angle was measured. At this time, fibronectin was used as a modifier.
그 결과, 도 6a에 도시된 바와 같이, 피브로넥틴 코팅전과 비교하여 PPM을 제외한 나머지 배양 멤브레인에서 접촉각이 감소하는 것을 확인하였다. 이로 인해, 피브로넥틴 코팅으로 인해 배양 멤브레인의 친수화를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 6A, it was confirmed that the contact angle was reduced in the remaining culture membranes except PPM as compared with before the fibronectin coating. As a result, it was confirmed that the hydrophilicity of the culture membrane can be increased by the fibronectin coating.
또한, 피브로넥틴 코팅이 패턴의 영향을 미치는지 확인하기 위해 코팅 후 배양 멤브레인을 SEM사진을 통하여 확인하였다. In addition, to confirm that the fibronectin coating affects the pattern, the post-coating culture membrane was confirmed by SEM photograph.
그 결과, 도 6b에 도시된 바와 같이, 배양 멤브레인의 패터닝에 크게 영향을 미치지 않았으나, FPM의 경우 코팅 전과 다르게 불규칙한 패턴이 형성되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 6B, although the patterning of the culture membrane was not greatly affected, it was confirmed that an irregular pattern was formed in FPM different from before coating.
실시예 3. 본 발명에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트의 유도만능줄기 세포 배양능력 확인 Example 3 OK iPS cells cultured ability of the induced pluripotent stem cell culture plate according to the invention
3-1. 3-1. 유도만능줄기세포Induced pluripotent stem cells 부착 및 증식 능력 확인 Identification of adhesion and proliferation ability
각 피브로넥틴이 코팅된 패턴화된 배양 멤브레인이 유도만능줄기세포의 부착 및 증식능력에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 상기 각 배양 멤브레인 상에서 유도만능줄기세포를 5일마다 계대배양을 유지하며 변화를 관찰하였으며, 계대 1 (passage 1; P 1), 계대 5 (P 5) 계대 10 (P 10)에서 유도만능줄기세포의 증식 모양을 확인하였다.To confirm the effect of each fibronectin-coated, patterned culture membrane on the adhesion and proliferation ability of the induced pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells were cultured on each of the above-mentioned culture membranes and the changes were observed every 5 days , Passage 1 (P 1), passage 5 (P 5) and passage 10 (P 10).
그 결과 도 7의 A에 도시된 바와 같이, GPM 및 PPM 상에서 유도만능줄기세포는, P 1에서 콜로니의 형태로 뭉쳐져서 자라며 제대로 증식이 되지 않는 모습을 보였으나, 계대가 진행될수록 콜로니를 이루지 않고, 정상적으로 증식되어 배양 멤브레인을 꽉 채우는 모습을 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 7A, induced pluripotent stem cells on GPM and PPM were clustered in the form of colonies on
또한, 각 배양 멤브레인이 유도만능줄기세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서, Population doubling level (PDL) 및 total PDL을 통하여 확인하였다.In addition, to confirm the effect of each culture membrane on the proliferation of induced pluripotent stem cells, the population doubling level (PDL) and total PDL were examined.
그 결과 도 7의 B에 도시된 바와 같이, total PDL은 각 배양 멤브레인에서 큰 변화가 없었지만, P 1에서의 PDL은 FPM과 비교할 때, GPM 및 PPM에서 다소 낮은 것을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 7B, total PDL did not change much in each culture membrane, but PDL at
더욱이, 각 배양 멤브레인이 유도만능줄기세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 세포 증식의 마커인 Ki67의 mRNA 발현량과 면역형광염색을 통하여 확인하였다. Furthermore, in order to confirm the effect of each culture membrane on the proliferation of induced pluripotent stem cells, mRNA expression of Ki67, a marker of cell proliferation, and immunofluorescence staining were confirmed.
그 결과 도 7의 C 및 D에 도시된 바와 같이, 계대가 계속 진행됨에 따라서, FPM 및 IPM에서 Ki67의 발현량은 점차 감소하고 있으나, GPM 및 PPM에서는 유도만능줄기세포의 Ki67의 발현량이 떨어지지 않았으며, GPM의 경우 오히려 계대가 진행될수록 발현량이 증가되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in C and D of FIG. 7, as the passage continued, the expression level of Ki67 in FPM and IPM gradually decreased, but the expression level of Ki67 in induced pluripotent stem cells did not decrease in GPM and PPM And that the amount of GPM was increased as the passage progressed.
3-2. 줄기세포성 유지 능력 확인3-2. Identification of Stem Cellularity
각 배양 멤브레인의 유도만능줄기세포의 계속된 계대배양시 미분화상태를 유지하는 능력을 확인하기 위해서, 미분화 배아줄기세포 마커인 Oct3/4 및 Nanog의 mRNA 발현량 및 면역화학염색을 진행하였다.In order to confirm the ability of each cultured membrane to maintain undifferentiated state in the continuous passage of induced pluripotent stem cells, mRNA expression and immunochemical staining of Oct3 / 4 and Nanog, the undifferentiated embryonic stem cell markers, were carried out.
그 결과 도 8의 A, B 및 C에 도시된 바와 같이, P 1에서는 큰 차이가 없었으나, 계대가 진행되면서 GPM 및 PPM에서 mRNA 발현량 및 면역화학염색을 통한 발현세포가 크게 증가하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in A, B, and C of FIG. 8, there was no significant difference in
이를 통해, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트를 이용한 계대배양은 유도만능줄기세포 줄기세포성 유지에 효과적이며, 특히, 규칙적인 패턴, 보다 구체적으로 GPM 및 PPM에서 그 효과가 크게 나타나는 것을 확인하였다.As a result, the subculture using the induction pluripotent stem cell culture plate according to the present invention is effective for maintaining pluripotent stem cell stem cells in an inducible pluripotent stem cell, in particular, a regular pattern, more specifically, GPM and PPM Respectively.
3-3. 3-3. 유도만능줄기세포의Induced pluripotent stem cells 형태학적 모양 확인 Check morphological shape
각 배양 멤브레인의 유도만능줄기세포의 세포 부착시 세포의 형태학적 모양에 미치는 영향을 확인하기 위해서, P 5에서 SEM 및 AFM을 이용하여 확인하였다.SEM and AFM were used to confirm the effect of PMS on morphological morphology of cells in inducing pluripotent stem cells of cultured membranes.
그 결과 도 9의 A 및 B에 도시된 바와 같이, FPM 및 IPM에서는 많은 cell fiber들이 뻗어나가면서 부착되어 있는 모습을 확인하였으며, GPM 및 PPM에서는 FPM과 비교하여 상대적으로 cell fiber들이 뻗어나가지 못한 뭉툭한 모양으로 부착되어 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 9A and 9B, in the FPM and the IPM, a lot of cell fibers were observed to be attached while extending. In the GPM and the PPM, the cell fibers were relatively unstable As shown in Fig.
3-4. 3-4. 유도만능줄기세포의Induced pluripotent stem cells 부착 관계 신호전달 인자 확인 Attachment Relevant Signal Transfer Factor
본 발명에 따른 유도만능줄기세포 배양 플레이트 상에서 배양된 유도만능줄기세포를 이용하여 세포 부착과 관련된 인자에 있어서, 인테그린 수용체를 통해서 시작된 외부 신호를 전달하고 증폭시켜 내부로 전달해 주는 인자, 예컨대 Focal adhesion kinase (FAK), a-actinin, Paxillin, Vinculin, Talin 및 Zyxin 등의 단백질의 발현량을 real-time PCR 및 western blot을 통해 확인하였다.In the induction pluripotent stem cells cultured on the induction pluripotent stem cell culture plate according to the present invention, factors relating to cell adhesion include factors that transfer and amplify an external signal initiated through the integrin receptor and transfer it to the inside, such as Focal adhesion kinase (FAK), a-actinin, paxillin, Vinculin, Talin and Zyxin were detected by real-time PCR and western blot.
그 결과 도 10의 A 및 B에 도시된 바와 같이, a-actinin, Vinculin 및 Paxillin은 배양 멤브레인에서의 계대가 진행될수록 전체적인 발현량이 증가하였으며, FAK는 GPM 및 PPM에서만 다른 인자들에 비해 빠르게 P 6에서 증가하는 것을 확인하였으며, Talin 및 Zyxin은 다른 부착 인자들과는 다른 발현 양상을 보였다.As a result, a-actinin, Vinculin, and Paxillin increased as the passage in the culture membrane progressed, as shown in FIG. 10A and FIG. 10B. , And Talin and Zyxin showed different expression patterns from other attachment factors.
또한, p-FAK의 protein 발현량이 P 6와 P 10의 경우에는 다소 높게 나타나는 것으로 확인되었으며, FAK의 인산화 증가와 더불어 FAK와 결합하여 세포의 주요 생리현상을 조절하는 것으로 알려진 Paxillin의 인산화도 배양 멤브레인에서의 초기배양시에는 FPM에서 높았으나, 계대가 진행됨에 따라 GPM 및 PPM에서 높게 나타나는 것을 확인하였다.In addition, the protein expression level of p-FAK was found to be somewhat higher in the case of
3-5. 3-5. 유도만능줄기세포의Induced pluripotent stem cells 세포골격Cytoskeleton 변화 확인 Confirm change
세포외기질을 통한 물리적 자극에 대한 힘의 차이를 인식하고 세포의 행동 방향을 결정짓는 최종 단계에서 세포골격이 매우 중요한 역할을 하는바, 세포골격의 변화를 Phalloidin 염색을 통해 확인하였다.The cytoskeleton plays a very important role in recognizing the difference of force to the physical stimulation through the extracellular matrix and determining the direction of the cell behavior, and the change of the cytoskeleton is confirmed by Phalloidin staining.
그 결과 도 11에 도시된 바와 같이, Phalloidin 및 Vinculin의 면역화학염색 결과, 전체적인 cytoskeleton의 변화는 보이지 않았으나, Vinculin은 GPM 및 PPM에서 더 많이 발현되며, P 1에 비해 P 10의 유도만능줄기세포에서 많이 발현되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 11, immunochemical staining of Phalloidin and Vinculin showed no change in the overall cytoskeleton. However, Vinculin was more expressed in GPM and PPM, and P10 induced pluripotent stem cells .
이를 통해, 규칙적인 패턴의 배양 멤브레인, 보다 구체적으로 GPM 및 PPM에서의 유도만능줄기세포의 계대 배양의 계속된 진행은 세포 부착의 모양에 영향을 미치지 않으면서, Focal adhesion molecules의 발현도 증가시키는 것을 확인하였다.Thus, the continued progression of subculturing of induced pluripotent stem cells in a regular pattern of culture membranes, more specifically GPM and PPM, also increases the expression of Focal adhesion molecules without affecting the shape of cell attachment Respectively.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (7)
300-400㎚의 직경을 갖는 철부 및 100-300㎚의 직경을 갖는 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인; 및
상기 배양 멤브레인 표면에 코팅된 개질제를 포함하는, 유도만능줄기세포 배양 플레이트.
In an induced pluripotent stem cell culture plate,
A culture membrane in which a convex portion having a diameter of 300-400 nm and a concave portion having a diameter of 100-300 nm are arranged to form a pattern; And
And a modifier coated on the surface of said culture membrane.
The induced pluripotent stem cell culture plate according to claim 1, wherein the culture membrane is made of polydimethylsiloxane (PDMS).
The inducible pluripotent stem cell culture plate according to claim 1, wherein the modifier is fibronectin.
The induction pluripotent stem cell culture plate according to claim 1, wherein the convex portion and the concave portion are hemispherical, curved arcuate, corrugated, or columnar.
2. The induction pluripotent stem cell culture plate according to claim 1, wherein the culture plate improves adhesion and proliferation of induced pluripotent stem cells.
The induction pluripotent stem cell culture plate according to claim 1, wherein the culture plate improves the undifferentiated maintenance ability of the induced pluripotent stem cells.
(a) 300-400㎚의 직경을 갖는 복수개의 철부 및 100-300㎚의 직경을 갖는 요부가 복수개로 배열되어 패턴을 형성하는 배양 멤브레인을 기판 상면에 배치시키는 단계;
(b) 상기 나노 배양 멤브레인 표면을 친수성으로 개질시키는 단계;
(c) 개질된 상기 배양 멤브레인 표면을 개질제로 코팅시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 배양 테이블에 유도만능줄기세포를 부착하여 배양하는 단계.An inducible pluripotent stem cell culture method using an inducible pluripotent stem cell culture plate comprising the steps of:
(a) disposing a culture membrane on the upper surface of the substrate, the plurality of convexes having a diameter of 300-400 nm and the recesses having a diameter of 100-300 nm arranged in a plurality to form a pattern;
(b) hydrophilizing the surface of the nano-culture membrane;
(c) coating the modified culture membrane surface with a modifier; And
(d) attaching the inducible pluripotent stem cells to the culture table prepared in the step (c) and culturing.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4079840A4 (en) * | 2019-12-16 | 2024-02-14 | Kangstem Biotech Co., Ltd. | Method for producing stem cells having enhanced efficacy |
-
2017
- 2017-09-21 KR KR1020170121547A patent/KR20170133288A/en not_active Ceased
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| EP4079840A4 (en) * | 2019-12-16 | 2024-02-14 | Kangstem Biotech Co., Ltd. | Method for producing stem cells having enhanced efficacy |
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