KR20170132874A - 발현을 조절하는 신규한 rna-분자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하는 RNA 분자에 관한 것으로, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 15 내지 60nt의 길이를 가지고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 RNA- 중합효소와 50nM 이하의 KD로 결합한다. 또한, 본 출원은 본 발명의 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자, 및 - 본 발명에 따른 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 발현 벡터를 포함하며, - 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하고, - 상기 발현 벡터의 프로모터로부터 전사를 유도하는 조건 하에서, 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, - 선택적으로, 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질 또는 RNA를 회수하는 것을 포함하는, 목적 단백질 또는 RNA를 생산하는 방법을 개시한다. 또한, 본 출원은 RNA-중합효소 결합성 압타머를 적용하는 in vitro 전사 및 발현 방법을 포함한다.
Description
본 발명은 생물학 분야, 구체적으로 생명 공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 RNA-생물학 분야 및 유전자 발현 조절, 예컨데 숙주 세포에서 목적 유전자의 발현을 위한 이의 함유물에 관한 것이다.
전사의 개시부터 신장 및 종결에 이르기까지 박테리아의 모든 전사 단계는, 트렌스-작용 (trans-acting) 단백질 및 작은 RNAs에 의한 조절을 받기 쉽다. 또한, 초기 RNA 자체에는 시스-작용 (cis-acting) 조절 신호를 함유한다. 리보스위치 (Riboswitches)는 작은 대사 산물, 이온, 온도, 또는 pH를 직접적으로 감지하여 전사, 번역 또는 RNA 처리의 조절을 유도하는, 상기 초기 RNA의 5' UTR에 주로 암호화된 시스-작용 RNA 요소이다 (A. Serganov, E. Nudler, Cell. 152, 17-24 (2013); and S. Proshkin, A. Mironov, E. Nudler, Biochim. Biophys. Acta (2014), doi:10.1016/j.bbagrm.2014.04.002). 종결 신호는 하기 두 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있는 조절 RNA 신호의 또 다른 예이다: 내인성 및 인자-의존성 종결자 (E. Nudler, M. E. Gottesman, Genes to Cells. 7, 755-768 (2002); and J. M. Peters, A. D. Vangeloff, R. Landick, J. Mol. Biol. 412, 7930813 (2011)). 우리딘 (uridine)의 확장에 앞선 GC-풍부(rich) RNA 헤어핀은 보조 인자와는 독립적으로 종결을 야기하는 내인성 신호이다. 인자-의존성 신호에서의 종결은 특정 RNA 영역을 인식하는, Rho와 같은 단백질 인자의 존재를 필요로 한다. 초기 RNA는 인자-의존성 또는 비의존성 항종결 신호를 제공하는 RNAP의 진행도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 파지 HK022는 신장을 통해 put RNA가 RNAP에 직접 결합하게 하고, 이는 종결에 대한 저항성을 부여한다 (R. Sen, R. A. King, R. A. Weisberg, Mol. Cell. 7, 993-1001 (2001); and N. Komissarova et al., Mol. Cell. 31, 683-94 (2008)). 인자-의존성 시스-작용 nut RNA (box A + box B)는 박테리아 NusA, NusB, S10과 함께하는 진행성 항종결 과정에서, 파지 λ N 단백질을 돕는다. 오늘날까지 이에 대한 일반적인 특성을 밝혀진 바가 없다. 그러나, 이미 알려진 모든 조절 요소는 뚜렷한 2차 구조를 필요로 하고, 이는 이들의 설계를 어렵게 한다, 그러므로, 뚜렷한 2차 구조를 필요로 하지 않는 RNA의 조절 서열에 대한 필요성이 존재한다.
숙주 세포에서의 이종 (heterogenous) 발현은, 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 때, 종종 조절 효과를 지닌 서열을 영향을 받는 경향이 있다. 이들은 예컨데, 전사 또는 번역의 종결 관점에서 발현을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, 이종 서열은 숙주 세포에서의 발현에 대한 억제 효과를 지닌 서열을 함유할 수 있다. 결국 이는 발현에 대한 원치 않는 제한으로 작용한다. 또한, 숙주 세포에서 표적 서열의 발현에 의한 생산은 숙주 세포 내 조절 효과를 갖는 주변 서열에 의해 영향을 받을 수 있다. 더욱이, 원치 않는 역 상보 가닥의 전사체, 예컨데, 미확인된 프로모터 서열은 반대편 가닥을 전사하는 중합효소의 상호 방해로 인해 전사 효율의 손실을 야기한다. 따라서, 발현되는 서열 내의 저해 요소의 잠재적 존재와 무관하게, 숙주 세포에서 목적 서열의 적절한 발현을 가능하게 하는 도구가 필요하다. 특히, 숙주 세포에서 재조합 단백질의 효율적 생산을 가능하게 하는 도구가 없는 실정이며, 이에 대한 개발이 필요하다.
전사의 개시 및 양은 프로모터, 예를 들어, 유도성 프로모터를 사용하여 종종 조절되거나 향상될 수 있으나, 번역 효율의 조절에 대해서는 아직 충분하게 해결해 주지 못한다.
또한, 이종 숙주 세포에서 특정 서열, 예컨데, 단백질로 발현되는 서열의 발현은, 상기 단백질이 숙주 세포에 유해한 효과를 나타낼 때, 어려움을 초래할 수 있다. 현재, 유도성 프로모터를 이용하는 발현 시스템이 적용되고 있다. 이러한 프로모터는 특정 자극이 존재하는 경우, 예컨데, 특정 화합물에 배양 배지에 첨가되는 경우에만 전사를 효과적으로 개시하게 한다. 그러나, 이러한 프로모터는 종종 비-자극된 환경에서 기저 발현 (basal expression)을 촉진하여 프로모터의 누출을 야기한다. 유해한 효과를 지닌 단백질의 경우, 이들의 발현이 유도되면, 부작용을 일으킬 수 있고, 비효율적인 발현으로 이어질 수 있다.
본 발명자들은, 전술한 문제점을 극복하는데 우수한 특성을 지닌 신규한 종류의 조절 RNA 압타머를 제공한다.
본 발명자들은 흥미롭게도 RNA 중합효소와 높은 친화도로 상호작용하는, 짧은 RNA-중합효소 결합성 압타머 (이하 RAPs로 명명함.)를 발견하였다. 본 발명자들은 자연적으로 발생한 다수의 RAPs를 확인하였다. 또한, 이러한 압타머들은 암호화된 DNA-서열의 발현을 조절할 수 있음을 보여주었다. 따라서, 본 발명은 RNA-중합효소를 조절하는 새로운 도구를 제공하고, 이에 따라, 숙주 세포에서 RNA 및/또는 단백질과 같이 DNA로 암호화된 분자의 발현을 조절할 수 있는 도구를 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하는 RNA 분자에 관한 것으로, 상기 RNA-중합효소와 결합하는 압타머는 15 내지 60개 뉴클레오타이의 길이를 가지고, 상기 RNA-중합효소와 결합하는 압타머는 높은 친화도로, 바람직하게 50 nM 이하의 KD, 바람직하게 10 nM 이하의 KD로 RNA-중합효소와 결합한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA-분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이며, 상기 압타머를 암호화하는 서열은 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
또한, 본 발명은 벡터, 바람직하게 목적 서열의 발현을 위한 벡터에 관한 것으로, 상기 벡터는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서 상기 벡터는 프로모터, 목적 서열의 도입을 위한 다중 클로닝 자리를 포함한다. 또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 발현 카세트는 프로모터의 하류에 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 역 상보 서열을 포함한다. 본 발명의 일 양태로서, 상기 발현 카세트는 프로모터, 발현되는 DNA 서열 또는 발현되는 DNA 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 자리, 및 발현되는 DNA 서열의 하류에 3'UTR을 암호화하는 DNA 서열 또는 상기 다중 클로닝 자리를 포함하며, 상기 3'UTR을 암호화하는 DNA 서열은 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 저해하기 위하기 위하여, DNA 서열의 역 상보 서열을 포함한다.
또한, 본 발명에는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하는 숙주 세포가 포함된다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 목적 서열, 바람직하게 DNA 서열의 발현을 위한 방법에 관한 것으로서, 하기의 단계를 포함한다:
- 본 발명에 따른 벡터를 제공하는 단계로서, 상기 벡터는 본 발명에 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하며,
- 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계, 및
- 발현 벡터의 프로모터로부터 전사를 유도 또는 허용하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계.
또한, 본 발명은, 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위한, 본 발명의 RNA 분자 또는 DNA 분자, 또는 발현 카세트, 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 즉, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 발현되는 서열을 발현시키는 방법, 예컨데, 발현되는 서열이 암호화되어 있는 동일한 DNA 분자 상에 압타머를 암호화하는, 시스로 발현되는 서열을 발현시키는 방법에 적용된다.
본 발명자들은 흥미롭게도 RNA 중합효소와 높은 친화도로 상호작용하는 짧은 RNA-중합효소 결합성 압타머는 암호화된 DNA-서열의 발현을 조절한다는 점을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 RNA-중합효소를 조절하는 새로운 도구를 제공하고, 이에 따라, 숙주 세포에서 RNA 및/또는 단백질과 같이 DNA로 암호화된 분자의 발현을 조절할 수 있는 도구를 제공한다. 따라서, 구체적으로 본 발명은 목적 서열의 발현을 조절하는데 사용하기 위한 본원 명세서에 개시된 RNA-중합효소 결합성 압타머의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 본 발명의 RNA-중합효소 결합성 압타머는 놀랍게도 시스로 작용한다, 즉, 이들이 암호화되고 전사되어 있는 핵산, 예를 들어, 이들이 암호화되어 있는 DNA 가닥의 발현을 조절한다. 따라서, 모든 구현예 및 양태에서 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게 시스로 사용된다. 본 발명에서, 시스로 사용되는 것은, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열이 발현되는 서열과 함께 전사되도록 위치하는 것을 의미하며, 예를 들어, 전사될 때 동일한 RNA의 일부를 형성하는 것이다. 일반적으로, 이는 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열이 본 발명의 구조물의 전사 개시 자리의 하류 및 전사 종결 신호의 상류에 위치하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게 RNA이다. 보다 바람직하게, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 또 다른 핵산, 예를 들어, 바람직하게 DNA에 의해 암호화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.
친화도를 측정하는 방법은 RNA 생화학 분야에 잘 알려져 있고 확립되어 있다. 특히, RNA 또는 DNA와 같은 핵산 분자와 RNA-중합효소와 같은 단백질 또는 폴리펩타이드간 친화도를 결정하는 방법은 널리 알려져 있다. 상호작용의 친화도는 해리 상수로 표현할 수 있다. 해리 상수는 일반적으로 리간드 ("L"; 본 발명에서 RNA-중합효소 결합성 압타머) 및 단백질 ("P"; 본 발명에서 RNA-중합효소)간 친화도를 기술하는데 사용된다. 즉, 해리 상수는 리간드가 특정 단백질에 얼마나 강하게 결합하는지를 나타낸다. 리간드-단백질 친화도는 수소 결합, 정전기적 상호 작용, 소수성 및 반 데르 발스 힘과 같은 두 분자간 비-공유 상호 작용에 의해 영향을 받는다. 리간드-단백질 복합체 ("C")의 형성은 두-상태 과정으로 기술될 수 있다.
각각의 해리 상수 (KD)는 다음과 같이 표시될 수 있다:
[P], [L] 및 [C]는 각각 단백질, 리간드, 및 복합체의 몰 농도를 나타낸다. 해리 상수의 단위는 몰 농도(M)이고, 특정 단백질 상의 결합 자리가 절반 가량 채워지는 리간드의 농도, 즉, 리간드와 결합한 단백질의 농도 [C]와 리간드와 결합하지 않은 단백질의 농도 [P]가 같을 때, 리간드의 농도의 농도에 해당한다. 해리 상수가 작을수록, 리간드가 보다 강하게 결합되거나 리간드와 단백질간 친화도가 높아진다. 예를 들어, 나노 몰 (nM)의 해리 상수를 갖는 리간드는 마이크로 몰 (μM)의 해리 상수를 갖는 리간드보다 특정 단백질에 보다 강하게 결합한다. 본 발명에 따른 RNA-중합효소 압타머에 대한 KD의 측정은 당업자에 의해 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, RNA-중합효소 압타머 (RNA)는 RNA 전기영동 이동성 이동 분석 (RNA EMSA; RNA electrophoretic mobility shift assays)로 분석할 수 있다. 이 경우, EMSA-실험은 in vitro 전사된 RNA 압타머 및 정제된 RNA 중합효소로 수행된다. KD 값을 측정하기 위하여, 고정된 농도의 방사성 표지된 RNA, 및 농도가 증가하는 선택 단백질 (RNAP)로 다양한 결합 반응이 수행되었다. 세부적인 단계별 프로토콜은 본원 명세서에 참조로 인용된, Handbook of RNA Biochemistry” (2014), Edited by R. K. Hartmann, A. Bindereif, A. Schon, E. Westhof. Volume 2, pp. 975-983, Wiley 에서 제공한다. 본 발명자들은 반복적인 SELEX 공정 (약 10nM의 해리 상수를 형성하는 7 사이클의 게놈 SELEX)에 의해, 상기 압타머가 RNA-중합효소와 높은 친화도로 결합함을 확인하였다. 따라서, 당업자는 필요한 경우, 정확한 Kd를 측정하기 위하여, 선택된 RNA 압타머 (예컨데, in vitro에서 전사된 압타머)에 대한 EMSA 실험을 수행할 수 있다. 이러한 공정은 본원 명세서에 참조로서 인용된 N. Windbichler, F. von Pelchrzim, O. Mayer, E. Csaszar, R. Schroeder, RNA Biol. 5, 30?40, and genomic SELEX is described in C. Lorenz, F. von Pelchrzim, R. Schroeder, Nat. Protoc. 1, 2204-12 (2006)에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 50nM 또는 그 이하의 KD, 보다 바람직하게, 10nM 또는 그 이하의 KD로 RNA-중합효소와 결합한다. 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 단일 가닥 RNA로서, 50nM 또는 그 이하의 KD, 보다 바람직하게, 10nM 또는 그 이하의 KD로 RNA-중합효소와 결합한다. 당업자는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 즉, DNA 또는 다른 RNA 가닥과 같은 다른 핵산과의 혼성화 할 필요없이, 단일 가닥 RNA로서 RNA-중합효소와 결합할 수 있다고 이해될 것이다. 따라서, 바람직하게, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 단일 가닥 RNA로서 50nM 또는 그 이하의 KD, 보다 바람직하게, 10nM 또는 그 이하의 KD로 본 발명에 따른 RNA-중합효소와 결합한다. 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 단일 가닥 RNA로서 50nM 또는 그 이하의 KD, 보다 바람직하게, 10nM 또는 그 이하의 KD로 RNA-중합효소와 결합한다.
본 발명자들은 대장균으로부터, RNA 중합효소와 결합하는 RNA-중합효소 결합성 압타머를 발견하였다. 그러나 당업자에게 명백한 바와 같이, 다른 RNA-중합효소, 예를 들어, 다른 원핵성 또는 진핵성 유기체의 RNA-중합효소에 대해서도 마찬가지로 적용 가능하다. 당업자는 특히, 박테리아 RNA-중합효소 및 일반적인 원핵성 유기체의 RNA-중합효소와 높은 구조적 유사성을 공유하는 것과 같이, 진핵성 유기체의 RNA-중합효소에도 적용 가능하다는 점을 인정할 것이다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 실시예에서, 진핵성 유기체의 RNA-중합효소 결합성 압타머, 역시 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위한 도구임을 증명하였다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 원핵성 RNA-중합효소, 및 진핵성 RNA-중합효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA-중합효소와 결합할 수 있고, 보다 바람직하게, 상기 RNA-중합효소는 원핵성 RNA-중합효소, 더욱 바람직하게 대장균 유래 RNA-중합효소이다. 진핵성 RNA 중합효소 Ⅱ 및 Ⅲ은 박테리아 RNA-중합효소와 가장 밀접하게 관련되어 있다 (예컨데, Ebright RH (2000), "RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II". J. Mol. Biol. 304(5): 687-698; 및 Nielsen S, Yuzenkova Y, Zenkin N. (2013), Mechanism of eukaryotic RNA polymerase III transcription termination Science, 340(6140):1577-1580 참조). 따라서, 본 발명에 따른 진핵성 RNA-중합효소는 바람직하게 진핵성 RNA-중합효소 Ⅱ, 및 진핵성 RNA-중합효소 Ⅲ으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게 진핵성 RNA-중합효소 Ⅱ이며, 이들은 효모 또는 포유류 기원으로부터 유래된다.
상기 RNA-중합효소는 바람직하게 RNA 중합효소에 의해 발현이 조절되어야 하는 유기체의 RNA-중합효소이며, 예컨데, 만일 RNA-중합효소 결합성 압타머가 효모 내 발현되는 서열의 발현을 조절하고자 하는 경우, 바람직하게 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 및 BHK21, BHK, VHO, DG44와 같은 햄스터 세포를 포함하는 설치류 세포, 및, 유래물/파생물과 같은 효모 또는 포유류 세포의 RNA-중합효소와 결합한다. 또한, 적합한 세포로는, 마우스 유래의 골수종 세포, 바람직하게 NS0 및 Sp2/0-AG14 세포 및 HEK293 또는 PER.C6와 같은 인간 세포주 뿐만 아니라, 이러한 마우스 및 인간 세포주의 유래물/파생물. 예를 들어, 효모 유래 RNA-중합효소 Ⅱ 또는 RNA-중합효소 Ⅲ, 또는 이러한 포유류 세포주이다. 만일 RNA-중합효소가 박테리아, 예를 들어, 대장균에서 조절되어야 한다면, 압타머가 결합하는 RNA-중합효소는 상기 유기체의 RNA-중합효소, 예컨데, 대장균의 RNA-중합효소이다.
일 구현예로서, 원핵성 RNA-중합효소는 박테리아 RNA-중합효소, 바람직하게 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아로부터 유래된 박테리아 RNA-중합효소, 가장 바람직하게, 그람 음성 박테리아로부터 유래된 RNA-중합효소이다. 특히, 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 대장균으로부터 유래한 것이다. 당업자는 RNA-중합효소 결합성 압타머는 본 발명에 따른 RNA-중합효소의 아단위와 상호작용할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러나 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게 50nM 또는 그 이하의 KD, 보다 바람직하게, 10nM 또는 그 이하의 KD로 RNA-중합효소 전구체와 결합한다. 예를 들어, 박테리아, 예컨데, 대장균의 RNA-중합효소의 RNA-중합효소 전구체는 RNA-중합효소 코어 및 시그마 70을 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 진핵성 RNA-중합효소는 진균 또는 포유류 기원의 RNA-중합효소이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소는 인간 세포, 비-인간 영장류 세포 및 BHK21, BHK, VHO, DG44와 같은 햄스터 세포를 포함하는 설치류 세포, 또는 이들의 유래물/파생물과 같은 효모 또는 포유류 세포의 RNA-중합효소이다. 또한, 적합한 RNA-중합효소로는, 마우스 유래의 골수종 세포, 바람직하게 NS0 및 Sp2/0-AG14 세포 및 HEK293 또는 PER.C6와 같은 인간 세포주 뿐만 아니라, 이러한 마우스 및 인간 세포주의 유래물/파생물이다. 당업자는 RNA-중합효소 결합성 압타머는 본 발명에 따른 RNA-중합효소의 아단위와 상호 작용할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러나 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게 50nM 또는 그 이하의 KD, 보다 바람직하게, 10nM 또는 그 이하의 KD로 진핵성 RNA-중합효소 Ⅱ와 결합한다. 예를 들어, 상기 RNA-중합효소 Ⅱ는 인간 세포 또는 전술한 세포주와 같은 효모 또는 포유류 기원으로부터 유래된다.
본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 짧다. 현재, 박테리오파지 RNA 서열은 DNA 서열의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 서열은 다소 길며, 이들 고유의 명확한 2차 구조를 필요로 한다. HK022와 같은 파지의 예는 파지 RNA 서열이 60nt보다 상당히 긴 길이를 가지며, 2개의 긴 stem 부를 지닌 매우 특수한 2차 구조를 나타낸다. 그러나, 본 발명은 RNA-중합효소와 직접적으로 상호작용할 때, RNA-중합효소 활성을 조절할 수 있는, 짧은, 예를 들어, 23 내지 50nt의 길이를 갖는 압타머의 발견에 기초를 두고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 15 내지 60nt, 바람직하게 20 내지 50nt, 보다 바람직하게 23 내지 50nt의 길이를 가진다.
앞서 기술된 조절 박테리아 RNAs에 대한 구조적 복합성의 필요는 이들이 부착되는 서열에 따라 비접힘을 발생하기 쉽게 한다. 그러나 본 발명자들은 본 발명에 따른 본연의 박테리아 또는 진핵성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 사용은, 전술한 명확한 2차 구조의 필요성을 대체할 수 있음을 확인하였다. 기존의 이론에 제한없이, 이러한 특성은 RNA-중합효소와의 높은 친화도로 이어질 것으로 믿어진다. 따라서, 한 구체예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게 RNfold 소프트웨어에 의해 예측된 바와 같이, 제한된 2차 구조를 지니지 않는다 (Viena RNA Package, RNAfold - http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi (R. Lorenz, S.H. Bernhart, C. Hoener zu Siederdissen, H. Tafer, C. Flamm, P.F. Stadler and I.L. Hofacker (2011), "ViennaRNA Package 2.0", Algorithms for Molecular Biology: 6:26; and I.L. Hofacker, W. Fontana, P.F. Stadler, S. Bonhoeffer, M. Tacker, P. Schuster (1994), "Fast Folding and Comparison of RNA Secondary Structures", Monatshefte f. Chemie: 125, pp 167-188) 및/또는 Mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold (Zuker, M (2003), Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucl Acid Res, 31:3406-3415)).
본 발명자들은 몇몇의 바람직한 압타머를 확인하였다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열 서열에 의해 암호화될 수 있다. 다른 구현예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 의해 암호화될 수 있다. 또 다른 구현예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화될 수 있다. 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 의해 암호화될 수 있다. 또 다른 구현예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 의해 암호화될 수 있다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2 또는 상기 서열과 적어도 80% 서열 상동성, 바람직하게 90%의 서열 상동성, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성, 더욱 바람직하게 97% 서열 상동성, 보다 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 본 발명은 또한, 엄격한 조건 하에서 이러한 서열 중 어느 하나와 혼성화하는, 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA에 관한 것이다.
본 발명자들은 예기치 않게 DNA 분자의 발현은 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 도입에 의해 조절될 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머의 상기 개략적인 특성은 RNA-분자의 특성들이다. 따라서, 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 RNA이다.
본원의 명세서에서 주어진 서열은 상기의 바람직한 압타머를 암호화하는 DNA-서열이다. 따라서, DNA-서열 또는 암호화된 서열이 언급될 때마다, 상기 서열은 바람직하게 각각의 서열번호로 주어진 서열이다. 특정 서열 번호에 암호화되는 것: 이는 RNA 압타머가 우라실 (U)로 대체되는 티아민 (T) 염기, DNA 분자가 아닌 RNA 분자라는 점을 제외하고, 언급된 서열로 나타내는 서열을 가짐을 의미한다.
그러나, 당업자가 쉽게 인식할 수 있는 바와 같이, 특히 이들 압타머는 DNA 분자, 예를 들어, 암호화되는 DNA 분자의 발현을 제어 및/또는 조절하는데 유용하다. 본 발명자들은 특히 압타머는 시스로, DNA로부터 RNA의 발현을 조절하는데 유용하다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하고, 이에 따라, 상기 DNA 분자의 발현 조절을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다.
상기 DNA 분자는 바람직하게 발현되는 서열을 포함한다. 본 발명에 따라 발현되는 이러한 서열은 목적 단백질 또는 RNA 분자를 암호화하는 바람직하게 뉴클레오타이드 서열, 보다 바람직하게 DNA 서열이다. 예를 들어, 암호화된 목적 분자는 조절 RNA 또는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명자들은 RNA-중합효소 결합성 압타머를 통해 전사체 산물 수준 (예를 들어, mRNA) 뿐만 아니라, 뒤이은 번역 산물 수준 (예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드) 모두에 대한 발현이 조절되거나 영향받을 수 있음을 보여주었기 때문에, 당업자는, 발현되는 특정 유형의 서열로 한정되지 않는다는 것을 즉각적으로 인정할 것이다. 그럼에도 불구하고, DNA 서열은 바람직한 특정의 서열이며, 바람직하게 이는 목적 단백질 (폴리펩타이드) 또는 RNA 분자를 암호화한다.
몇몇 유형의 조절 RNA-요소가 알려져 있고, 예를 들어, 일부는 mRNA 또는유전자의 DNA의 어느 한 부분과의 상보적이기 때문에 유전자 발현을 하향 조절할 수 있다. MicroRNAs (miRNA;21-22nt)는 진핵 세포에서, 상보적인 mRNA를 분해할 수 있는 miRNA 및 효소의 효과 복합체 (effector complex)가, mRNA가 번역되는 것을 차단하거나, 이의 분해를 촉진시킴으로써, RNA 간섭 (RNAi)의 작용을 한다. 짧은 간섭 RNA (siRNA; 25-25nt)는 종종 바이러스 RNA의 파괴에 의해 생성되지만, siRNA의 내재적 근원에 의한 경우도 있다. siRNA는 miRNA와 유사한 방식으로 RNA 간섭 작용을 한다. 몇몇 miRNA 및 siRNA는 표적 유전자를 메틸화시켜 이들 유전자의 전사를 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 동물은 세포 생식선에 작용하는, 트랜스포존에 대한 방어 및 생식세포 생성 역할을 하는 Piwi-상호작용 RNAs(piRNA;29-30nt)를 가지고 있다. 많은 원핵 생물은 RNA 간섭과 유사한 CRISPR RNAs, 조절 시스템을 가지고 있다. 안티센스 RNA는 널리 알려져 있고; 대부분은 유전자를 하향 조절하나, 일부는 전사의 활성화 인자이다. 안티센스 RNA가 작용할 수 있는 한가지 방법은 mRNA에 결합하여 효소적으로 분해되는 이중-가닥 RNA를 형성하는 것이다. 진핵 동물에서는 유전자를 조절하는 수많은 긴 비-암호화 RNA가 있고, 이러한 RNA 중 하나가 여성 포유 동물 내 하나의 X 염색체를 덮어 비활성화시키는 Xist이다.
mRNA는 5' 비번역 영역 또는 3' 비번역 영역에 리보스위치와 같은 조절 요소 자체를 추가로 함유할 수 있다; 이러한 시스-조절 요소는 이들의 mRNA 활성을 조절한다. 비번역된 영역은 또한 다른 유전자를 조절하는 요소를 함유한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예로서, DNA-분자는 하나 또는 그 이상의 추가적인 조절 RNA-요소를 암호화하는 서열을 포함한다.
상기 DNA-분자 또는 발현 카세트 또는 벡터, 이하 (infra)는, 발현되는 서열과 작동 가능하게 결합된 발현 제어 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 발현 제어 서열은 대장균과 같은 박테리아, 또는 진균 또는 포유류 세포주와 같은 진핵 생물에서, 번역 가능한 RNA와 같은 RNA의 합성 및 전사를 보장하는데 적합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 발현되는 서열은 목적 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 발현되는 단백질을 암호화한다.
"발현"은 숙주 세포 내 발생하는 전사 및 번역을 나타낸다. 숙주세포에서 DNA 분자의 발현 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 숙주 세포에 의해 생산된 DNA-암호화된 단백질의 양을 기초로 측정될 수 있다. 본원 명세서 내 용어 "발현"에 대한 세부 사항은 본원 명세서에 참조로서 인용된 Sambrook et al. (2012), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 978-1-936113-42-2에서 확인할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 DNA 분자의 발현을 조절하기 위하여, DNA 분자 내 다른 위치에 위치할 수 있음을 확인하였다. 그러나 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 프로모터와 작동 가능하게 되며, 바람직하게 프로모터의 하류에 위치된다. 특히 바람직하게, 제시된 결과는 압타머가 프로모터의 하류에 위치하여 전사되는 경우, 본 발명에 의해 달성하고자 하는 효과를 보여주고 있다.
본 발명에 따른 DNA-분자는 적어도 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함한다. 여기에는 본원 명세서에서 상세하게 기술된 요소들이 추가로 함유될 수 있다. 그러나 이러한 요소들 자체는 프로모터, 전사 개시 자리가 되거나 발현되는 서열이 되는 것과 같이 임의의 기능적 특성을 가지지 않을 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 DNA 분자는 숙주 세포 또는 유기체의 게놈에 통합(integration)하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 경우, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열에 인접한 (측면의) 하나 또는 그 이상의 서열은 숙주 세포의 게놈으로 통합, 바람직하게 자리 특이적 통합을 유발하기에 충분할 수 있다. 상기 통합에 사용되는 기작은 예를 들어, 동종 재조합, 숙주 게놈을 통한 바이러스 DNA의 비-특이적 통합 등일 수 있다 (Youngsuk et. al., "Current Advances in Retroviral Gene Therapy", Curr Gene Ther. 2011 Jun; 11(3): 218-228), adaptation of CRISP/Cas9 system (Harrison et al, "A CRISPR view of development", 10.1101/gad.248252.114 Genes & Dev. 2014. 28: 1859-1872).
본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 벡터 상의 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 상기 프로모터 유래의 발현을 조절한다. 또 다른 구현예로서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 본 발명에 따른 DNA 상에 위치하고, 핵산, 예컨데, 숙주의 게놈 내 DNA 분자 또는 이의 단편의 통합 이후, 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결되어 상기 프로모터 유래의 발현을 조절한다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어, "작동하게 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된"은, 하나 또는 그 이상의 발현 제어 서열 및/또는 발현되는 폴리뉴클레오타이드 내 암호화 영역간 결합이, 발현 제어 서열과 양립 가능한 조건 하에서 발현이 달성되는 것이며, 예컨데, 이에 따라 전사 촉진 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열의 발현을 증가시키거나, 전사 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열의 발현을 저해 또는 감소시키도록 한다.
특히, 바람직한 구현예에서, 발현되는 서열은 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하고, RNA-중합효소 결합성 압타머는 상기 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 서열의 5'UTR 부위 내 위치된다.
본 발명에 따른 DNA 분자는 또한 발현 카세트 (전체)를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 클로닝 및 형질전환에 사용되는 벡터 DNA의 일부일 수 있다. 발현 카세트는 RNA 및 단백질을 생성하도록 세포의 기작을 지시한다. 발현 카세트는 하나 또는 그 이상의 유전자 및 이들 발현을 제어하는 서열로 구성된다. 발현 카세트는 일반적으로 하기를 포함한다: 프로모터 서열, 오픈 리딩 프레임, 및 선택적으로 전핵 생물에서, 일반적으로 폴리아데닐화 자리를 함유하는 3'-비번역 부위. 본원 명세서에서 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명은 DNA 서열, 예컨데, 발현 카세트의 발현을 조절하는 신규한 기작을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 발현 카세트를 포함하는 DNA-분자에 관한 것이며, 상기 발현 카세트는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머, 프로모터, 및 발현되는 서열을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 바람직하게, 상기 압타머, 프로모터, 및 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 서열은 상기 DNA 분자 상의 발현 카세트 내에 작동 가능하게 연결된다. 상기 발현 카세트는 3' 비번역 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명자들은 상기 압타머를 암호화하는 서열의 상기 위치는 전사되는 동안 중요하지 않다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 DNA-분자는 프로모터, 발현되는 서열을 암호화하는 오픈 리딩 프레임, 및 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 오픈 리딩 프레임 및 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 상기 프로모터의 하류에 위치된다. 당업자는 상기 압타머를 암호화하는 서열은 프로모터와 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 5'-비번역 부위) 사이에 위치될 수 있거나, 오픈 리딩 프레임 내에 위치될 수 있음을 인정할 것이다. 따라서, 당업자는 암호화 서열을 재설계할 수 있을 것이다. 그러나 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 DNA-분자의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 프로모터의 하류 및 발현되는 단백질의 오픈 리딩 프레임의 하류, 즉, 5-'비번역 영역에 위치하며, 보다 바람직하게 프로모터의 전사 개시 자리의 하류 및 오픈 리딩 프레임의 번역 개시 자리에 위치한다. 또한, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 하나 또는 그 이상을 암호화하며, 바람직하게 세 개 또는 그 이상의 항시성 압타머, 예를 들어, 직렬 반복 서열로서, 선택적으로 링커 서열을 통해 분리된 압타머를 암호화할 수 있다. 바람직하게, 상기 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 프로모터의 하류에 암호화되며, 발현되는 서열의 상류는 본 발명에 따른 활성화 RNA-중합효소 결합성 압타머이다. 발현을 증가시기 위하여, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게 본 발명에 따른 활성화 RNA-중합효소 결합성 압타머이다. 이러한 활성화 구조물은 발현 카세트의 3' 말단, 바람직하게 3' 비번역 영역 (3'UTR로 지칭함.)에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 역 상보물을 도입함으로써 향상될 수 있다. 이론에 구애받지 않고서도, 이러한 저해성 압타머는 상보적 가닥 유래의 예기치 않은 발현을 억제하여 반대 가닥의 전사에 의한 목적 가닥 유래의 발현을 차단하는 것을 회피하게 함을 알 수 있다.
쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 발현되는 특정 프로모터 또는 유형 또는 서열, 예컨데, 특정 단백질 또는 RNA에 제한되지 않는다. 발현 카세트는 동일한 카세트로 쉽게 다른 단백질을 생산하기 위해 변경될 수 있도록, (단백질을 암호화하는) 서열의 규격화된 복제 (modular cloning)를 설계하였다. 이를 위하여, 발현 카세트는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않고, 발현되는 서열, 예를 들어, 목적 단백질 또는 목적 RNA를 암호화하는 서열을 도입 가능하게 하는 다중 클로닝 자리를 포함하도록 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가적으로 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머, 프로모터, 및 발현되는 서열의 삽입을 위한 다중 클로닝 자리를 암호화하는 서열을 포함하며, 바람직하게, 압타머, 상기 프로모터 및 다중 클로닝 자리를 암호화하는 서열은 작동가능 하게 연결된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA-분자는 프로모터, 발현되는 서열을 도입하기 위한 다중 클로닝 자리, 및 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 다중 클로닝 자리 및 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 상기 프로모터의 하류에 위치한다. 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 DNA-분자의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 프로모터의 하류 및 발현되는 서열을 도입하기 위한 다중 클로닝 자리의 상류에 위치한다.
발현 카세트는 또한 하나 이상의 발현되는 서열을 함유할 수 있고, 예컨데, 다시스톤성 발현 카세트일 수 있다. 이는 전사가 단일의 프로모터로부터 시작되는 것을 의미한다. 박테리아에서 발견되는 mRNA는 주로 다시스톤성이다. 이는 단일 박테리아성 mRNA 가닥은 몇몇의 다른 단백질로 번역될 수 있음을 의미한다. 이는 스페이서가 서로 다른 단백질을 분리하고, 각 스페이서가 시작 코돈 각각의 상류에 위치되는 번역 개시 자리 (리보솜 결합 자리, 샤인-델가노 서열)를 가져야만 발생할 수 있다. 이에, 전사된 mRNA는 발현되는 다수의 서열, 예를 들어, 단백질을 암호화하는 둘 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 당업자는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 이러한 다시스톤성 전사체의 발현 향상에도 적합함을 인정할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 프로모터, 상기 프로모터로부터 전사된 둘 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 상기 발현 카세트는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 둘 또는 그 이상의 서열을 포함하며, 상기 압타머를 암호화하는 서열은 상기 프로모터 및 상기 오픈 리딩 프레임과 작동 가능하게 연결되어 모든 오픈 리딩 프레임의 발현을 가능하게 한다. 바람직한 구현예에서, 각각의 오픈 리딩 프레임은 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 하나 또는 그 이상과 작동 가능하게 연결되며, 특히 바람직하게, 상기 두 개의 서열 또는 오픈 리딩 프레임은 본 발명에 따른 RNA 결합성 압타머를 암호화하는 하나 또는 그 이상을 포함하는 서열에 의해 분리되며, 번역 개시 자리는 바람직하게 상기 압타머를 암호화하는 서열의 리보솜 결합 자리 하류와 작동 가능하게 연결된다. 바람직한 구현예에서, 상기 둘 또는 그 이상의 서열은 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화한다. 각각의 오픈 리딩 프레임은 전사 번역 개시 자리 (예컨데, 리보솜 결합 자리, 샤인 달가노 서열)과 추가로 연결된다. 바람직한 구현예에서, 따라서 상기 발현 카세트는 프로모터, 둘 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 상기 발현 카세트는, 각각의 오픈 프레임 상류에 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머, 바람직하게 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머, 및 번역 개시 자리를 암호화하는 서열을 포함한다. 상기 오픈 리딩 프레임은 모두 동일한 단백질을 암호화하거나 각기 다른 단백질을 암호화할 수 있다.
상이한 발현 카세트는. 정확한 발현 조절 서열이 사용되는 한, 박테리아, 효모, 식물 및 포유동물 세포를 포함하는 각기 다른 유기체를 변형시킬 수 있다. 박테리아, 바람직하게 대장균에 대한 발현 카세트가 특히 바람직하다. 프로모터는 하류 서열의 전사를 개시하는 DNA 부위이다. 프로모터는 유전자의 전사 개시 자리 부근, 상기 DNA의 동일 가닥 및 상류에 위치된다 (센스 가닥의 5' 영역 방향으로). 프로모터는 다양한 크기, 예를 들어, 100-1000nt 길이일 수 있다. 전사가 일어나기 위하여, RNA 중합효소는 프로모터 서열 또는 상기 서열 근처에 결합한다. 프로모터는 RNA 중합 효소와의 안전한 초기 결합 자리를 제공하는 반응 요소와 같은 특정 DNA 서열 및 RNA 중합효소를 유인하는 전사 인자라고 칭하는 단백질 위한 특정 DNA 서열을 함유할 수 있다. 상기 전사 인자는 특정 프로모터에 결합하고 유전자 발현을 조절하는, 상응 뉴클레오타이드의 특정 활성자 또는 억제자 서열을 갖는다. 박테리아에서, 상기 프로모터는 RNA 중합효소 및 관련된 시그마 인자에 의해 인식되고, 시그마 인자는 때때로 활성자 단백질이 그 자체의 DNA 결합 자리 부근에 결합함으로써, 프로모터 DNA를 인식한다. 진핵 세포에서, 전사 개시의 과정은 보다 복잡하며, 프로모터에 RNA 중합 효소 Ⅱ가 결합하는데 적어도 7개의 다른 인자가 필요하다. 박테리아에서, 프로모터는 전사 개시 자리로부터 약 -10 및 -35 뉴클레오타이드 상류의 2개의 짧은 서열 요소를 함유한다. -10에서의 서열 (-10 요소)은 공통서열 TATAAT를 갖는다. -35에서의 서열 (-35 요소)은 공통 서열 TTGACA를 갖는다. 이러한 공통 서열은 평균적으로 보존되며, 대부분의 프로모터 내에서 손상되지 않은 채로 발견되었다. 주어진 프로모터의 각 공통 서열에서, 평균적으로 6개의 염기쌍 중 3-4개만이 발견되었다. 현재까지 발견된 천연 프로모터에서 -10과 -35 모두에서 손상되지 않은 공통 서열을 갖는 경우는 거의 없었다; -10과 -35 요소가 완전하게 보전되어 있는 인위적인 프로모터는 공통 서열 내 일부 미스매치 돌연변이를 지닌 프로모터에 비해 낮은 빈도로 전사되는 것으로 밝혀졌다. -35 및 -10 서열 사이의 최적의 간격은 17bp이다. 상기 전술한 프로모터 서열은 시그마 -70을 함유하는 RNA 중합효소 전구체에 의해서만 인식된다. 다른 시그마 인자를 함유하는 RNA 중합체 전구체는 상이한 코어 프로모터 서열을 인식하고, 본 발명과 마찬가지로 덮여진다. 본 발명자에 의해 밝혀진 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머의 우수한 기술적 효과는 사용되는 프로모터와 무관하게 달성된다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 프로모터는 대상 숙주 세포에 따라 선택되어야 하며, 즉, 숙주 세포가 박테리아인 경우 박테리아 프로모터가 사용되어야 하며, 이와 마찬가지로, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우 진핵성 프로모터가 사용되어야 한다. 바람직한 프로모터는 대장균 내에서 활성화되는 프로모터, 예를 들어, 대장균 프로모터이다. 바람직하게 본 발명에 따른 프로모터는 항시성 및 유도성 프로모터를 포함한다. DNA 분자 및 발현 카세트 각각을 결합하는데 사용하는 프로모터는 이의 기원 및/또는 발현되는 서열 또는 유전자와 관련하여 동종 또는 이종일 수 있다. 적합한 프로모터는 예를 들어, 이들의 항시성 발현에 도움이 되는 프로모터이다. 그러나, 외부 영향에 의해 결정된 특정 시점에서만 활성화되는 프로모터도 사용될 수 있다. 인위적 및/또는 화학적인 유도성 프로모터도 본 발명에서 사용될 수 있다. 유도성 프로모터는 아라비노스-, 글루코스-, IPTG-, 알콜-, 메타-유도성 프로모터를 포함한다.
항시성 프로모터의 일례는 pWM3110이 사용되는 것이다 (실험예 참조). 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 서열번호 66과 적어도 80% 서열 상동성, 바람직하게 서열번호 66과 적어도 90% 서열 상동성, 보다 바람직하게 서열번호 66과 적어도 95% 서열 상동성, 더욱 바람직하게 서열번호 66과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 서열번호 66의 서열을 갖는 프로모터를 포함한다.
유도성 프로모터의 일례는 아라비노스 유도성 프로모터, 예를 들어, 실시예에서 사용되고 서열번호 67의 서열을 갖는 아라비노스-유도성 프로모터이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 서열번호 67과 적어도 80% 서열 상동성, 바람직하게 서열번호 67과 적어도 90% 서열 상동성, 보다 바람직하게 서열번호 67과 적어도 95% 서열 상동성, 더욱 바람직하게 서열번호 67과 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 프로모터를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 서열번호 67의 서열을 갖는 프로모터를 포함한다.
본원의 명세서에서는 RNA-중합효소 결합성 압타머는 압타머를 포함하는 전사체의 전사를 조절할 수 있음을 보여주었다. 본원의 명세서에 개괄된 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 프로모터 서열 및 프로모터의 전사 개시 자리에 작동 가능하게 연결된다. 바람직하게 이는 프로모터 및 본 발명에 따른 DNA-분자 상의 전사 개시 자리의 하류에 위치한다. RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 전사 개시 자리 간의 거리는 중요하지 않다고 여겨진다. 그러나 전사를 조절하는 관점에서, 일정한 거리에서 우수한 효과가 관찰될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 10 내지 1000nt의 거리 내, 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 50 내지 500nt 거리 내, 보다 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 60 내지 250nt 내, 더욱 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 80 내지 103nt 거리 내에 위치된다.
본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 발현되는 서열과도, 예컨데, 오픈 리딩 프레임, 또는 다중 클로닝 자리와 작동 가능하게 연결된다. RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리간 거리는 중요하지 않다고 여겨진다. 그러나 전사 및 번역을 조절하는 관점에서, 일정한 거리에서 우수한 효과가 관찰될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 10 내지 1000nt의 거리 내, 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 50 내지 500nt 거리 내, 보다 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 60 내지 250nt 내, 더욱 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 70 내지 108nt 거리 내에 위치된다.
전술한 바람직한 거리의 임의의 조합이 사용될 수 있고, 예를 들어, 전사 개시 자리의 하류에서 10 내지 1000nt 거리 및 발현되는 서열의 상류에서 10 내지 1000nt, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 50 내지 500nt 거리 및 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 50 내지 500nt, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 60 내지 250nt 거리 및 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 60 내지 250nt, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 80 내지 103nt 거리 및 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 70 내지 108nt, 또는 임의의 다른 조합일 수 있다.
당업자는 본 발명에 따른 DNA 분자는 다양하게 응용되어 적용 가능하다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 본 발명은 DNA로부터의 발현 조절을 위한 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 발현되는 내인성 서열 또는 숙주 세포 또는 유기체에서 발현되는 외인성 서열의 조절을 위한 본 발명에 따른 DNA 분자의 용도에 관한 것이다.
당업자는 본 출원의 개시사항을 고려하여 각각의 용도 및 응용에 대한 특정 실시를 선택할 수 있는 위치에 있다. 예를 들어, 상기 DNA 분자는 발현되는 부분 또는 전체 서열을 포함한다. 이는 숙주 게놈의 적절한 위치에 자리 특이적 통합, 예를 들어, 동종 재조합을 목적으로 할 수 있고, 적절한 발현을 보장하기 위한, 적절하고 바람직한 부위에서의 통합을 가능하게 하기 위하여 발현되는 내인성 서열의 일부만을 포함할 수도 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA-분자는 숙주 게놈에 자리 특이적 통합을 위한 하나 또는 그 이상의 요소 (예: 서열)을 포함한다.
당업자는 본 발명의 개시사항을 고려하여 적절한 통합 부위를 선택하고, 이에 따라 DNA-분자를 설계할 수 있는 위치에 있다. 이러한 설계를 위하여, 본원 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 특정 구현예를 상세하게 고려할 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과, 예를 들어, 프로모터/전사 개시 자리 및/또는 리보솜 결합 자리 및/또는 발현되는 유전자의 개시 코돈간 거리를 고려할 수 있다. 본원 명세서에 개괄적으로 기술된 바와 같이, 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위한 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 프로모터의 전사 개시 자리의 하류에 위치한다. 그러나, 프로모터는 DNA-분자 자체에 존재할 수 있거나, DNA-분자는 숙주 게놈 내로 구조물의 자리 특이적 통합을 위한 서열을 포함함으로써, 프로모터의 내인성 전사 개시 자리의 하류에 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 위치시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA-분자는 숙주 게놈 내로 구조물의 자리 특이적 통합, 바람직하게, 프로모터 및/또는 전사 개시 자리의 하류에 자리 특이적 통합을 위한 서열을 포함한다.
일 구현예에서, DNA-분자는 발현되는 내인성 서열의 상류에 자리 특이적 통합을 위한 서열을 포함한다. 이러한 구현예에서 DNA 분자는 바람직하게 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 상류에 내인성 또는 외인성 프로모터 및/또는 전사 개시 자리를 포함할 수 있다.
RNA-중합효소 결합성 압타머는 필요에 따라 선택될 수 있으며, 예를 들어, 내인성 서열의 발현이 하향조절 되어야 하는 경우, 본 발명에 다른 저해성 RNA 중합효소 결합성 압타머가 적용, 즉, DNA-분자 상에 암호화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머 또는 숙주 세포 내의 내인성 서열의 발현을 저해하기 위한 상기 압타머를 암호화하는 DNA-분자의 용도에 관한 것이다. 숙주 세포는 바람직하게 비-인간 숙주세포, 바람직하게 박테리아 기원이다. 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA 분자는 바람직하게 상기 내인성 서열이 전사되는 프로모터의 하류에 삽입되는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 유전자 치료를 통해 인간을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 DNA-분자에 관한 것이다.
당업자는 본 발명에 따른 DNA 분자가 발현되는 내인성 서열의 발현을 조절하기 위하여 사용되거나, 숙주의 내인성 프로모터를 이용하여 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 통한 외인성 서열의 발현을 조절하기 위하여 사용될 수 있음을 인정할 것이다. 본 발명에 따른 DNA-분자가 발현되는 내인성 서열의 발현 조절에 사용되는 경우, 이는 발현되는 서열의 내인성 프로모터 또는 전사의 개시를 제어하는 외인성 프로모터를 이용하여 수행될 수 있다. 후자의 경우, 당업자는 본 발명에 따른 DNA-분자는 바람직하게 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 상류에 프로모터를 포함하고, 선택적으로 적절한 통합을 위한 부가적인 서열을 포함하는 것으로 이해할 것이다.
또한, 당업자는 본 발명에 따른 압타머의 다양한 각기 다른 용도 및 응용을 인정할 것이다. 본 발명에 따른 압타머 또는 DNA 분자는 숙주 세포 내 또는 in vitro 발현 시스템에서 서열의 발현을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 다양한 압타머의 응용에 의해, 당업자는 종래의 기술로부터 공지된 것에 비해, 보다 미세하게 발현을 조절할 수 있을 것이다. 유전자의 발현을 저해하기 위한 유전자의 침묵 (silencing) 또는 넉아웃 기술, 예컨데 기능적 연구에 사용될 때, 그 결과는 대게 유전자 산물, 즉, RNA 또는 암호화된 단백질의 완전한 손실이다. 그러나, 몇몇의 목적을 위해서는 특정 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 완전히 감소시키지 않는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 유전자 및/또는 유전자 산물이 세포의 생존에 필수적인 경우이다. 당업자는, 본 발명은 암호화된 분자에 대해 세포를 완전히 고갈시키지 않으면서, 유전자의 발현, 예를 들어, 발현되는 내인성 서열의 발현의 하향 조절을 가능하게 하는 우수한 도구를 제공한다는 것을 즉각적으로 인정할 것이다. 그러므로 본 발명에 따른 압타머는 특히 과학적 연구, 예를 들어, 이들을 사용하여 서열, 예를 들어, 목적 분자를 암호화하는 서열의 발현을 하향 또는 상향 조절함에 적용될 수 있다. 당업자는 진핵 세포 뿐만 아니라 원핵 세포에 대해서도 적용될 수 있음을 인정할 것이다. 후자에 대해서, 본 발명은 siRNA 등을 통한 유전자 침묵에 대한 우수한 대안을 제공한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 RNA-중합효소 결합성 압타머를 저해하는 것에 대한 본원 명세서에 개시된 방법 또는 용도는 숙주 세포에서 목적 서열 (예컨데 유전자)을 넉 다운시키기 위한 방법 또는 용도에 관한 것이다. 바람직하게 상기 방법은 하기에서 추가로 설명된다.
본 발명의 일 구현예에서, DNA 분자는 상기 서열의 내인성 프로모터에 의해 발현되는 내인성 서열의 발현을 조절하기 위한 용도에 관한 것이다. 이러한 바람직한 구현예에서, DNA-분자는 바람직하게 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 및 내인성 프로모터의 하류 및 발현되는 서열의 상류에 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 자리 특이적 통합을 위한 하나 또는 그 이상의 서열을 포함한다.
"내인성"은 외부 핵산 서열의 삽입 또는 적용없이, 예를 들어, 본 발명에 따른 DNA-분자의 외부적인 적용 전에도, 숙주 세포 또는 유기체 내 임의의 서열, 프로모터, 전사 개시 자리, 유전자, 오픈 리딩 프레임 등이 존재하는 것을 나타낸다. 내인성 서열은 임의의 외부적 조작 없이, 예를 들어, 핵산의 형질감염 또는 형질전환 전에도, 세포 또는 유기체 내 존재한다.
"외인성"은 숙주 세포 또는 유기체 내 임의의 서열, 프로모터, 전사 개시 자리, 유전자, 등이 존재하지 않거나 외부 핵산 서열의 삽입 또는 적용없이는 특정 로커스 (자리)에 존재하지 않는 것을 나타내며, 여기서, "외인성" 요소는 본 발명에 따른 DNA-분자의 외부적 조작 이후, 숙주 게놈의 특정 자리에에만 존재한다.
본원 명세서에서 사용된, "발현되는 서열"은 목적 분자를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다. 본원 명세서에서 개괄한 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 RNA-중합효소, 예를 들어, 바람직하게 DNA-의존성 RNA-중합효소의 활성을 조절하고, 즉, 이들은 DNA 서열에서 RNA로의 전사에 영향을 미친다. 따라서, 폴리펩타이드로 변역되는 후속 단계의 수율 역시 이에 영향을 받는다. 따라서, 상기 본원 명세서 사용된 "발현되는 서열"은 바람직하게 목적 분자를 암호화하는 DNA 서열을 나타내고, 상기 목적 분자는 바람직하게, 목적 RNA 분자, 또는 폴리펩타이드, 또는 단백질 분자이다.
"숙주 세포" 또는 "숙주 세포들"은 발현되는 서열을 발현하거나 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 본 발명의 숙주 세포는 생명 공학, 분자생물학 및 임상적 설정을 포함하는 임의의 어느 용도를 갖는 폴리펩타이드 또는 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현한다. 본 발명에서 적합한 숙주 세포의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 박테리아, 효모, 곤충, 동물, 및 포유류 세포를 포함한다. 이러한 세포의 구체적인 예로는, 다양한 다른 박테리아 세포 공급원, 예를 들어, 대장균 균주: DH10b 세포, XL1Blue 세포, XL2Blue 세포, Top10 세포, HB101 세포 및 DH12S 세포; 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피키아 (Pichia), 및 클루베로마이세스 (Kluveromyces)를 포함하는 종으로부터 유래한 효모 세포; CHO 세포, HEK293 세포, 및 HeLa 세포와 같은 포유류 및 인간 세포 주뿐만 아니라, 대장균 DH5α, 및 BL21 (DE)도 포함된다. 바람직한 숙주 세포는 DNA 서열의 발현을 위한 박테리아 RNA-중합효소, 또는 진핵성 DNA-의존성 RNA 중합효소 Ⅱ 및/또는 Ⅲ; 바람직하게 RNA-의존성 중합효소 Ⅱ을 사용한 세포이다. 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 바람직하게, 대장균 세포, 보다 바람직하게, DH5α, BL21(DE3), DH10b 세포, XL1Blue 세포, XL2Blue 세포, Top10 세포, HB101 세포 및 DH12S 세포로 이루어진 군으부터 선택되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게 DH5α, 또는 BL21(DE3)이다. 또 다른 구현예에서, 상기 숙주세포는 진균, 보다 구체적으로, 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 아스페르길루스, 클루베로마이세스 또는 피키아일 수 있고, 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 세르비지애, 스키조사카로마이세스 폼베, 아스페르길루스 니게르, 트리코더마 레세이, 클루베로마이세스 마르시아누스, 클루베로마이세스 락티스, 피키아 파스토리스, 피키아 토루라 또는 피카아 유틸리스이다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, 또는 COS 세포, HEK293 세포, 및 HeLA 세포를 포함하는, 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 세르비지애), 진균 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 영장류, 인간 또는 설치류 숙주 세포와 같은 포유류 숙주 세포로 이루어진 군으부로부터 선택되는 진핵성 숙주 세포이다. 당업자는 상기 숙주 세포의 발현 효율을 향상시키기 위하여, 유전자의 추가, 돌연변이, 또는 결실과 같은 추가 변형을 포함할 수 있음을 인정할 것이다.
확인된 압타머가 본질적으로 유전자 발현에 중요한 역할을 할지라도, 본 발명의 구현예는 목적 서열 (발현되는 서열)의 조절된 발현을 위한 DNA-분자, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 대상은 재조합 산물, 예를 들어, 재조합 RNA- 또는 DNA- 분자, 벡터, 및/또는 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 바람직하게 발현되는 서열을 위한, RNA-중합효소 결합성 압타머의 조절 기작이 자연적으로 발현에 적용되는, 자연 발생 숙주세포는 배제된다. 대신에, 본 발명의 숙주 세포 및 본 발명의 방법 또는 용도에서 사용되는 것은, 이들의 게놈이 정상적으로 존재하지 않는 상황에서, 유전적으로 발현되는 서열( 본 발명에 따른 압타머 적용에 의한 조절 기작)의 발현이 변형되었는지 또는 외인성/이종성 효소가 과발현되도록 조작되었는지 여부와 관계없이 (유전자의 과발현 및 감소/저해 포함) 바람직하게 비-자연 발생 숙주 세포가 사용된다.
따라서, 본 발명과 관련하여 사용되는 DNA-분자, 벡터, 및 숙주 세포는 바람직하게 각각 비-자연 발생적 DNA 분자, 벡터, 및 숙주 세포이고, 즉, 이들은 자연 발생 DNA-분자, 벡터 및 숙주 세포와 현저하게 상이하고, 자연에서 발생하지 않은 DNA-분자, 벡터 및 숙주 세포이다.
또한, 본 발명에는 숙주 세포의 변이체도 포함된다. 이러한 변이체는 바람직하게 전술한 바와 같이 유전적 변형으로 인한 자연 발생 유기체와 상이한, 유전적으로 변형된 유기체를 포함한다. 유전적으로 변형된 유기체는 자연적으로 발생하지 않은, 즉, 자연계에서 발견되지 않으며, 외래 (재조합) 핵산 분자의 도입으로 인해 자연 발생 유기체와 실질적으로 상이한 유기체이다. 이러한 유기체는 재조합체라고도 불리워진다.
추가적인 구현예로서, 본 발명은 DNA 분자로부터의 발현을 조절하기 위한 본 발명에 따른 DNA-분자의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 당업자는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열에 추가되는 DNA-분자는 발현되는 서열을 포함할 수 있다고 이해될 것이다.
본 발명은 엄격한 조건 하에서, 본 발명에 따른 RNA 분자 또는 DNA 분자와 혼성화하는 핵산에 관한 것이다. 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y ., 6.3.1-6.3.6, 1991 내의 Current Protocols 에서 확인할 수 있다. 엄격한 조건은 45℃에서 6X 염화 나트륨/시트르산 나트륨 (SSC) 내와 동등한 것으로 정의되어 있고, 뒤이어, 65℃에서 0.2X SSC, 및 0.1% SDS로 세척된다.
본 발명에 따른 DNA 분자는 바람직하게 벡터에 포함된다. 벡터가 발현 카세트를 포함하는 경우, 상기 DNA 분자를 함유하는 벡터는 발현 벡터 또는 발현을 위한 벡터로 나타낼 수 있다.
용어, "벡터"는 세포에 포함된 핵산을 유도하거나 도입할 수 있는, 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드/단백질의 혼합물을 나타낸다. 도입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현 또는 암호화된 서열은 벡터의 도입에 의해 세포 내에서 발현되는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 파지미드, 파지, 코스미드, 인위적인 포유 동물 염색체, 넉-아웃 또는 넉-인 구조물, 바이러스를 포함하고, 바람직하게, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 약독화된 백시니아 바이러서, 카나이라 폭스 바이러스, 레티바이러스 (Chang, L.J. and Gay, E.E. (20001) Curr. Gene Therap. 1:237-251), 헤르페스 바이러스를 포함하며, 보다 구체적으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV-1, Carlezon, W.A. et al. (2000) Crit. Rev. Neurobiol.), 바큘로 바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV, Carter, P.J. and Samulski, R.J. (2000) J. Mol. Med. 6:17-27), 라이노바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 필로바이러스 및 이들의 조작된 바이러스 (예를 들어, Cobinger G. P. et al (2001) Nat. Biotechnol. 19:225-30), 비로좀, "벗겨진" DNA 리포솜, 및 핵산으로 코팅된, 특히, 금으로 이루어진 입자를 포함한다. 특히, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터가 바람직하다 (Lindemann et al. (1997) Mol. Med. 3:466-76 and Springer et al. (1998) Mol. Cell. 2:549-58). 리포솜은 일반적으로, 양이온성, 중성 및/또는 음이온성 지질로 이루어지며, 예를 들어, 리포솜성 현탁액의 초음파 처리에 의한, 작은 단일 또는 다층의 베지클이다. DNA는 예를 들어, 리포솜 표면에 이온 결합되거나 내부적으로 리포솜에 봉입될 수 있다. 적합한 지질 혼합물은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, DOTMA (1, 2-Dioleyloxpropyl-3-trimethylammoniumbromid) 및 DPOE (Dioleoylphosphatidyl-ethanolamin)를 포함하며, 이들 둘 모두는 다양한 세포주에서 사용되어 왔다. 본 발명에 따른 벡터는 본원 명세서 기재한 바와 상이한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 RNA- 중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자를, 존재하는 유전자에 도입시켜, 예를 들어, 유전자의 발현을 촉진/증가 또는 저해/억제/감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 벡터는 적어도 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 벡터는 DNA-분자를 포함하고, 상기 DNA 분자는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함한다.
또한, 본 발명의 벡터의 DNA 분자는 본 발명의 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열이 추가될 수 있고, 추가로 적절한 숙주에서 암호화 부위의 적절한 발현을 가능하게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 제어 요소는 당업자에게 공지되어 있고, 프로모터, 스플라이싱 카세트, 번역 개시 코돈, 벡터에 삽입물을 도입하기 위한 번역 및 삽입 자리 (다중 클로닝 자리라고도 칭함.)를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은, 발현되는 서열을 발현을 가능하게 하고 진핵 또는 원핵 세포에서 상기 다중 클로닝 자리에 삽입되는 발현 제어 서열과 작동 가능하게 연결된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자를 포함하는 벡터에 관한 것이고, 상기 핵산은 진핵 세포 및/또는 원핵 (숙주) 세포가 벡터로 형질감염되었을 때, 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 바람직한 구현예에서, 벡터는 바람직하게 리보솜 결합 자리를 포함하고, 상기 리보솜 결합 자리는 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 하류에 위치한다.
또한, 본 발명의 벡터는 바람직하게 발현 벡터이고, 즉, 이는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 DNA-분자를 포함한다. 본 발명의 DNA 분자 및 벡터는 직접 도입하거나, 리포솜, 바이러스 벡터 (예컨데, 아데노 바이러스, 레트로 바이러스), 전기 천공, 탄도 전달 (예를 들어, 유전자 총) 또는 다른 전달 시스템을 통해 세포에 도입되도록 설계될 수 있다. 또한, 본 발명의 진핵 생물 발현 시스템으로서, 바큘로 바이러스 시스템이 사용될 수 있다. 발현 구조체로도 알려져 있는 발현 벡터는 일반적으로 세포 내 단백질 발현을 위하여 설계된 플라스미드 또는 바이러스이다. 벡터는 표적 세포로 특정 유전자를 도입하는데 사용되며, 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 생산하기 위한 세포의 단백질 합성 기작을 총괄할 수 있다. 플라스미드는 인헨서 및/또는 프로모터 부위로서 작용하고, 발현 백터 상에서 효율적인 유전자의 전사를 유도하는 조절 서열을 함유하도록 조작된다. 발현 벡터의 목적은 상당량의 안정한 메신져 RNA, 및 이에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는데 있다. 발현 벡터는 복제 개시점, 선택적인 마커, 및 다중 클로닝 자리와 같은 삽입을 위한 적합한 부위와 같은 임의의 벡터가 가질 수 있는 특징을 갖는다. 클로닝된 유전자는 특별한 클로닝 벡터로부터 발현 벡터로 전사될 수 있으나, 발현 벡터로 직접 클로닝될 수 있다. 클로닝 과정은 일반적으로 박테리아, 예를 들어, 대장균에서 수행되며, 클로닝을 위해 사용되는 것외의 유기체에서 단백질 발현을 위해 사용되는 벡터, 예를 들어, 대장균은 복제 유기체에서의 전파에 적합한 복제 개시점, 다른 유기체에서 이들의 유지를 가능하게 하는 요소를 추가로 포함할 수 있고, 이들 벡터를 셔틀 벡터라고 칭한다. 발현 벡터는 단백질 발현에 필요한 요소를 가지고 있다. 이들은 프로모터, 항시성 또는 유도성 프로모터, 리보솜 결합 자리 및/또는 개시 코돈, 종결 코돈, 및 전사 종결 서열과 같은 정확한 번역 개시 서열을 포함할 수 있다. 원핵 생물과 진핵 생물간 단백질 합성 기작에 대한 차이가 존재하기 때문에, 발현 벡터는 선택되는 숙주에 적합한 발현을 위한 요소를 가져야 한다. 예를 들면, 원핵 생물의 발현 벡터는 번역 개시 지리에 리보솜과의 결합을 위하여 샤인-달가르노 서열을 가질 수 있는 반면, 진핵 세포의 발현 벡터는 코작 공통 서열을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게 박테리아 대장균에서 목적 서열을 발현시키기 위한 벡터이다.
프로모터는 전사를 개시하고, 이에 따라, 클로닝된 유전자의 발현을 제어하는 지점이다. 발현 벡터에서 사용되는 프로모터는 항시성 또는 유도성 프로모터이다. 후자의 프로모터는 필요한 경우, IPTG 또는 아라비노스와 같은 인듀서의 도입으로 인해 단백질 합성이 단지 개시되거나 완전히 개시된다. 그러나, 단백질 발현은 몇몇의 발현 벡터에서 항시성일 수도 있다 (즉, 전사가 일정하게 진행되고, 단백질이 지속적으로 발현됨.). 항시성 단백질 합성의 낮은 수준은 엄격하게 조절된 프로모터를 지닌 발현 벡터에서도 발생할 수 있다.
유전자 산물의 발현 후, 일반적으로, 발현된 단백질을 정제하는 것이 필요하다. 그러나, 다량의 숙주 세포 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 것은 오랜 시간이 소요되는 과정일 수 있다. 정제 과정을 용이하게 하기 위하여, 정제 태그가 클로닝된 유전자에 부착되거나 발현 카세트 또는 벡터 내 존재할 수 있고, 이는 유전자 및 태그가 프레임 안에 존재하고, 하나의 폴리펩타이드 사슬로서 발현되도록 목적 서열의 클로닝을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 벡터에 존재하는 태그는 선택적으로 히스티딘 (His) 태그, 마커 펩타이드, 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제 또는 말토오스-결합 단백질 또는 GFP 또는 β-갈락토시다제와 같은 융합 파트너를 포함한다. 이들 융합 파트너 중 일부는 몇몇의 발현된 단백질의 용해도를 증가시키는 것을 도울 수 있다. 녹색 형광 단백질과 같은 다른 융합 파트너는 성공적으로 클로닝된 복제 유전자의 확인을 위한 리포터 유전자로서 작용할 수 있다.
발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 DNA-분자는 단백질 합성을 위하여 숙주 세포에 형질전환되거나 형질감염될 수 있다 (도입이라고도 지칭됨.). 본 발명의 벡터는 형질전환 또는 숙주 세포 염색체로의 DNA 삽입을 위한 요소, 예를 들어, 식물체 형질전환을 위한 vir 유전자, 염색체 삽입을 위한 인테그라제 자리를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 박테리아의 주변세포질 공간 (periplasmic space)과 같은 특정 위치에 발현되는 단백질을 표적화하기 위하여, 표적 서열을 포함할 수 있다.
벡터는 발현을 보장 및/또는 조절하는 추가적인 제어 요소을 포함할 수 있다. 진핵 또는 원핵 세포에서 발현을 보장하는 제어 요소는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본원 명세서에서 언급된 바와 같이, 이들은 일반적으로 전사의 개시를 보장하는 조절 서열 및 선택적으로 전사의 종결 및 전사체의 안정성을 보장하는 신호를 포함한다. 추가적인 조절 요소는 전사 및 번역 인헨서 및/또는 자연(천연)-관련 또는 이종 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프로모터는 바람직하게 본원 명세서에서 개괄된 바와 같이, 항시성 또는 유도성이다. 본 발명에 따른 바람직한 프로모터는 박테리아, 진균, 포유류 프로모터와 같이 원핵성 및 진핵성 프로모터를 포함한다. 바람직한 포유류 프로모터는 CMV-HSV 티미딘 카이나제 프로모터, SV40, RSV-프로모터 (Rous Sarcoma Virus), 인간 신장 인자 1a-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터 (Moloney Mouse Tumor Virus), 뉴로필라멘트-프로모터, PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터, thy-1-프로모터, 메탈로티오닌-유도성 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 인헨서는 본 발명에 따른 벡터 또는 DNA-분자 내에 존재할 수 있다. 바람직한 인헨서는 CMV 인헨서, 및 SV40-인헨서로 이루어진 군으로부터 선택된다. 신경 세포에서의 발현을 위하여, 뉴로필라멘트-, PGDF-, NSE-, PrP-, 또는 thy-1-프로모터가 사용될 수 있다고 예상된다. 상기 프로모터는 당업계에 알려져 있고, 이 중에서도 Charron J. Biol. Chem. 270 (1995), 25739-25745에 기재되어 있다. 바람직한 프로모터는 본 발명에 따른 DNA-분자에 대한 본원 명세서의 기재에 기술되어 있고, 벡터 및 플라스미드에도 적용된다.
전사 개시를 담당하는 요소외에, 이러한 조절 요소는 발현되는 서열의 하류에 SV40-poly-A 자리 또는 tk-poly-A 자리와 같은 전사 종절 신호를 포함할 수도 있다. 본원 명세서에서, 적합한 발현 벡터는 Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pX (Pagano, Science 255 (1992), 1144-1147), pEG202 및 dpJG4-5 (Gyuris, Cell 75 (1995), 791-803)와 같은 효소 이종-혼성 벡터, 또는 pET21a (Novagen), pWM1015 (W.G. Miller et al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 5426-5436 (2000)), pBAD24 (L.M. Guzman et al., 177 (1995), Lambda gt11 or pGEX (Amersham-Pharmacia)와 같은 바람직한 원핵성 벡터가 당업계에 알려져 있다. 벡터는 추가적으로 분비 신호를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 사용된 발현 시스템에 따라, 본 발명의 펩타이드가 세포 구획으로 전달하게 할 수 있는 리더 서열은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 서열에 첨가될 수 있고, 당업계에 공지되어 있다. 리더 서열(들)은 번역, 개시 및 종결 서열과 조립되고, 바람직하게, 번역된 단백질 또는 그의 단백질을 주변세포질 공간 또는 세포외 부위로 전달할 수 있는 리더 서열로 적절한 시기에 조립된다. 선택적으로 이종 서열은 발현된 재조합 산물의 안정화 및 단순화된 정제와 같은 바람직한 특성을 부여하는, C- 또는 N-말단의 확인된 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 벡터가 적절한 숙주에 도입되면, 숙주는 벡터가 유지될 수 있는 조건 하에서 유지되고, 발현되는 서열의 발현, 필요에 따라, 발현되는 분자의 수득 (수집) 및 정제가 수행될 수 있다.
본 발명은 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포, 즉, 본 발명의 벡터 또는 DNA-분자, 또는 본 발명의 벡터를 운반하는 비-인간 숙주 유기체를 포함하는 숙주 세포, 즉, 본 발명에 따른 핵산 분자, 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터로 유전적으로 변형된 숙주 세포 또는 숙주에 관한 것이다. 용어, "유전적으로 변형된"은 상기 숙주 세포 또는 숙주가, 자신의 게놈이외 상기 세포 또는 숙주 또는 이들의 이전 세대/부모 중 하나에 도입된 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함함을 의미한다. 상기 핵산 분자 또는 벡터는 유전자 변형된 숙주 세포 또는 세포에 게놈 외부의 독립적인 분자로서, 바람직하게, 복제될 수 있고 숙주 세포 또는 숙주의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있는 분자로 존재한다.
당업자는 본 발명에 따른 DNA-분자가 개체의 유전자 치료에도 적용 가능하다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 본 발명은 개체의 유전자 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 DNA-분자에 관한 것이다. 본 발명의 의미에서의 "개체"는 다르게 명시되지 않는 한, 병리학적 변화를 나타내는지 여부와 관계없이, 모든 인간, 동물, 식물체, 및 미생물인 것으로 이해된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 인간이다. 본 발명의 추가적인 바람직한 구현예에서, 환자는 유전자 치료에 의해 치료되는 질병을 지닌 것으로 의심되는 인간이다.
의학적 용도로서, 상기 DNA 분자 또는 벡터 또는 플라스미드는 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 필요하다고 여겨지는 약학적 부형제, 예를 들어, DNA를 안정화시키기 위한 부형제, 상기 조성물 등의 적용시 피 시험자의 부작용을 감소시키기 위한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 DNA 분자 또는 벡터 또는 플라스미드는 순수한 형태 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 존재할 수 있다. 본원 명세서에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한 염(들)"은 포유류에 대하여 무독성이고 안전하며 의학적 용도로서 효과적이고, 바람직한 생물학적 활성을 지닌 본 발명의 화합물의 염을 의미하고, 이에 제한되는 것은 아니나, 산 부가 염 및/또는 염기 염을 포함한다. 상기 산 부가염은 본 발명의 염기성 화합물로부터 형성되고, 상기 염기 부가 염은 본 발명의 산성 화합물로부터 형성된다. 이들의 모든 형태는 본 발명에 유용한 화합물의 범위 내에 있다. 약학적으로 허용 가능한 염에 대한 검토는, 본원 명세서에 참조로서 인용된 문헌인 Berge et al. (1977), J. Pharm. Sci. 66:1-19에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 단백질 발현의 조절을 위한 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호하는 서열을 포함하는 DNA 분자의 용도에 관한 것으로, 바람직하게 박테리아 및 포유류 세포주를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포주와 같은 미생물에서의 단백질 발현의 조절을 위한 것이다. 발현되는 단백질은 바람직하게 RNA-중합효소 결합성 압타머와 동일한 DNA 분자 상에 암호화되며, 이는 RNA-중합효소 결합성 압타머 서열의 하류 및 바람직하게 상기 RNA 분자 내로 전사되도록 위치된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 상기 단백질의 발현이 개시되는 프로모터의 하류에 위치한다. 이는 RNA-중합효소 결합성 압타머는 발현되는 단백질을 암호화하는 mRNA 중 일부임을 의미한다. 본 발명에 따른 용도는 임의의 목적 단백질의 발현을 조절하기 위한 용도를 포함한다. 목적 단백질은 발현 시스템에서 발현될 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 이러한 발현 시스템은 일반적으로 본 발명에 따른 DNA 분자, 예컨데, 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포를 사용한다. 따라서, 본 발명은 목적 서열의 발현을 위한 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도도 포함한다.
본 발명은 목적 단백질을 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벡터를 제공하고, 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하며, 상기 발현 카세트의 프로모터로부터 전사를 유도하는 조건 하에서, 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 및 선택적으로, 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질 또는 RNA를 회수하는 것을 포함하며, 바람직하게 상기 벡터는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하고, 프로모터 및 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.
당업자는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터의 제공은 본 발명에 따른 발현 카세트 내로 발현되는 서열의 클로닝을 포함할 수 있음으로 이해할 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 벡터를 제공하는 단계는 상기 목적 단백질을 암호화하는 서열을 벡터에 클로닝하는 단계, 즉, 상기 서열을 프로모터 및 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결시켜 최종 발현 벡터를 수득하는 단계를 포함할 수 있고, 바람직하게 발현 카세트의 다중 클로닝 자리로 클로닝하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 목적 단백질을 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벡터를 제공하는 단계, 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하며, 상기 발현 카세트의 프로모터로부터 전사를 유도하는 조건 하에서, 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 선택적으로, 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질 또는 RNA를 회수하는 단계를 포함하며, 바람직하게 상기 벡터는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하며, 상기 목적 단백질을 암호화하는 서열을 벡터, 바람직하게 다중 클로닝 자리에 복제하는 단계, 즉, 상기 서열을 프로모터 및 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결시켜 최종 발현 벡터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머의 서브 그룹은, 암호화하는 DNA 가닥으로부터 전사될 때, RNA 중합효소의 활성을 증가시킨다는 점이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. DNA 절편이 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함할 때, 상기 DNA 절편의 전사 효율은 증가된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 RNA-중합효소의 활성을 증가시킨다. 당업자는 RNA-중합효소의 활성을 측정하는 방법, 분석법 및 시스템을 인지하고 있다. 이러한 방법은 숙주 세포 내 리포터 유전자의 발현을 포함하거나, 실시예에 상세히 기술된 바와 같이, 시험관 내 전사 분석에 적용될 수 있다. 숙주 세포에 기초한 어세이에서, 기본적으로, 전사를 개시하게 하는 프로모터 및 리포터, 예를 들어, 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조물이 사용된다. RNA-중합효소 활성의 증가를 테스트하기 위하여, 프로모터로부터 개시된 구조물의 발현이 측정되고, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 구조물과 상기 압타머를 포함하지 않는 구조물간 이들의 발현을 비교한다. 발현은 당업계에 일반적으로 알려져 잇는 방법을 이용하여 측정된다. 예를 들어, 리포터 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 활성은, 예컨데, 형광 또는 효소 활성으로 테스트할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 직접적인 전사 산물로서 mRNA의 양은 노던 블롯 또는 정량적 역전사 (qRT), 실시간 PCR과 같이 일반적인 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열이 RNA-중합효소 활성 및 이의 전사에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 플라스미드-기반 GFP 리포터 시스템이 이용된다. 가능한 시스템은 제시된 실시예에서 사용된다 (도 2A 참조). 그러나, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명은 특정 리포터에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, RFP, YFP 등 다른 형광 단백질이 사용될 수 있다. 또한, 효소 기반 시스템이 적용 가능하다. 전사에 대한 서열의 영향을 조사하는 추가적인 방법은 본 발명의 실시예에 나타낸 바와 같이, β-갈락토시다제를 리포터 유전자 lacZ를 암호화하는 산물로 사용한다. RNA-중합효소 결합성 압타머의 효과를 측정하기 위한 어세이에서, 상기 압타머를 암호화하는 DNA 서열은 바람직하게 프로모터의 하류, 보다 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에 위치된다. 상기 압타머를 암호화하는 DNA 서열은 리포터의 상류에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 또한 RNA-중합효소의 활성을 증가시키는 RNA-중합효소 결합성 압타머의 일부는 중합효소 자체의 활성을 증가시키고 (본원 명세서에서, 활성화 RNA-중합효소 결합성 압타머로 지칭함.), 동일한 또는 다른 압타머들은 추가적으로 종결자-의존성 방식에서의 발현, 즉, 종결자 서열의 종결 효과에 대한 저해를 증가시키는 것 (본원 명세서에서 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머로 지칭함.)을 발견하였다. 상기 활성화 및 항종결성 모두, 즉, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머의 유형은 "전사 촉진성 압타머"라고 나타낸다.
원핵 생물 내 전사 종결자의 두 종류, Rho-의존성 및 Rho-비의존성 종결자는 원핵 생물 게놈 전체에 걸쳐 확인되었다. 광범위하게 분포된 서열은 유전자 또는 오페론 전사의 정상적인 완료시 전사의 종결을 유발하고, 전사적 감쇠 (transcriptional attenuation)에서 관찰된 바와 같이, 조절의 수단으로서 전사체의 조기 종결을 매개하며, 우연에 의한 이른 종결을 회피할 수 있도록 제어가 되지 않게하는 전사 복합체의 종결을 보장하여, 세포에 대한 불필요한 에너지 소비를 막는다. Rho-의존성 전사 종결자는 mRNA-DNA-RNA 중합효소 전사 복합체를 파괴시키기 위하여, RNA 헬리케이즈 활성을 나타내는 Rho 인자로 지칭되는 단백질이 필요로 한다. Rho-의존성 종결자는 박테리아 또는 파지에서 발견된다. 상기 Rho-의존성 종결자는 변역 정기 코돈의 하류에서 발생하며, 비구조화되었고, Rho 활용 자리 (rut)로 알려져 있는 시토신-풍부 서열, 및 전사 정지 지점 (tsp)의 하류로 이루어진다. 상기 rut는 mRNA 로딩 사이트 및 Rho의 활성화제로의 역할을 한다;. 활성화는 Rho가 효율적으로 ATP를 가수분해시키고, rut 자리와의 접촉을 유지하는 동안 mRNA를 전위시키는 역할을 한다. Rho는 tsp 자리의 하류에 고정되어 있는 RNA-중합효소를 따라 잡을 수 있다 (see e.g. Richardson, J. P. (1996). "Rho-dependent Termination of Transcription Is Governed Primarily by the Upstream Rho Utilization (rut) Sequences of a Terminator". Journal of Biological Chemistry 271 (35): 21597-21603). Rho 및 RNA 중합효소 복합체간 접촉은 Rho의 RNA 중합효소에 대한 다른자리입체성 (allosteric) 효과와 관련된 기작을 통해서 전사 복합체의 해리를 자극한다 (see e.g. Ciampi, MS. (Sep 2006). "Rho-dependent terminators and transcription termination", Microbiology, 152(Pt 9): 2515?2528; and Epshtein, V; Dutta, D; Wade, J; Nudler, E (Jan 14, 2010). "An allosteric mechanism of Rho-dependent transcription termination", Nature, 463 (7278): 245-249).
내인성 전사 종결자 또는 인자/Rho-비의존성 종결자는 mRNA-DNA-RNA 중합효소의 파괴를 초래하는, 신장 전사물에 대한 자가-어닐링 헤어핀 구조의 형성을 필요로 한다. 종결 서열은 두 염기 대칭적인 20개의 염기쌍 GC-풍부 영역과 뒤이어, RNA로 전사되어 각각 종결 헤어핀 및 7-9 뉴클레오타이드 "U-트렉"을 형성하는, 짧은 T-폴리 트렉, 또는 "T-신장을 함유한다. 종결의 기작은 RNA 중합효소와의 결합 반응하는 헤어핀의 다른자리입체성 효과를 통한 해리의 직접적 촉진과, "경쟁적인 역학"의 조합을 통해 발생하는 것으로 가정된다. 헤어핀 형성은 RNA 중합효소의 고정과 불안정화를 유발하여, 어느 한 위치에서 멈춰 있는 시간이 증가되고, 복합체의 안정성이 감소되기 때문에 그 위치에서 복합체의 해리가 일어날 가능성이 높아진다 ((즉. von Hippel, P. H. (1998). "An Integrated Model of the Transcription Complex in Elongation, Termination, and Editing" Science 281 (5377): 660-665; and Gusarov, Ivan; Nudler, Evgeny (1999). "The Mechanism of Intrinsic Transcription Termination" Molecular Cell 3 (4): 495-504 참고).
항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 종결을 억제한다. 이러한 억제는 내인성 종결자 (인자 비독립적) 및 인자-의존성 종결자를 통한 종결의 억제일 수 있다. 두 가지 유형은 예시적으로 본원 명세서에 참조로서 인용된 문헌인 Santangelo and Artsimovitch (2011), Nat. Rev. Microbiol. 9:319-329에 개시되어 있다. 당업자는 본 발명의 개시 사항 및 당해 기술분야의 통상적인 지식을 고려할 때, 전사의 종결 억제를 위한 특정 압타머의 능력을 테스트할 수 있는 위치에 있다. 당업자는 상기 RNA-중합효소의 활성을 측정하는 방법, 어세이 및 시스템을 인식하고 있다. 이러한 방법은 숙주 세포에서 리포터 유전자의 발현을 포함하거나, 본원의 실시예에서 상세히 기술된 바와 같이, in vitro 전사 어세이에 적용될 수 있다. 숙주 세포에 기초한 분석에서, 기본적으로 전사를 개시하게 하는 프로모터 및 리포터, 예컨데, 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조물이 사용된다. RNA-중합효소 활성의 증가를 테스트하기 위하여, 프로모터로부터 개시된 구조물의 발현이 측정되고, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 구조물과 상기 압타머를 포함하지 않는 구조물간 이들의 발현을 비교한다. 종결의 억제를 위한 테스트를 할 때, 상기 구조물은 두 개의 구조물, 즉 대조군 및 압타머를 함유한 구조물 모두는 종결 서열, 예를 들어, rrnB 또는 T7t 종결자 (즉, Santangelo and Artsimovitch (2011), Nat. Rev. Microbiol. 9:319-329 참조)를 추가적으로 포함한다. 종결자는 바람직하게, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 하류에 위치한다. 발현은 일반적으로 당업자에 의해 알려져 있는 방법으로 측정되었다. 예를 들어, 리포터 유전자로 암호화된 단백질의 활성은 예를 들어, 형광 또는 효소 활성에 의해 테스트된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 직접적인 전사 산물로서 mRNA의 양은 노던 블롯 또는 정량적 역전사 (qRT), 실시간 PCR과 같이 일반적인 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, R-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열이 RNA-중합효소 활성 및 이의 전사에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 플라스미드-기반 GFP 리포터 시스템이 이용된다. 가능한 시스템은 제시된 실시예에서 사용된다 (도 5A 참조). 그러나, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명은 특정 리포터에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, RFP, YFP 등 다른 형광 단백질이 사용될 수 있다. 또한, 효소 기반 시스템이 적용 가능하다. 전사에 대한 서열의 영향을 조사하는 추가적인 방법은 본 발명의 실시예에 나타낸 바와 같이, β-갈락토시다제를 리포터 유전자 lacZ을 암호화하는 산물로 사용한다. RNA-중합효소 결합성 압타머의 효과를 측정하기 위한 어세이에서, 상기 압타머를 암호화하는 DNA 서열은 바람직하게 프로모터의 하류, 보다 바람직하게 전사 개시 자리의 하류, 바람직하게 종결자의 상류에 위치된다. 상기 압타머를 암호화하는 DNA 서열은 리포터의 상류에 위치하는 것이 바람직하다.
비록 활성화 및 항종결 기작이 밝혀졌음에도 불구하고, 다수의 확인된 압타머들은 두 가지 활성, 즉, 종결자 의존성 뿐만 아니라 종결자 비의존성 방식에 의한 촉진성 RNA-중합효소 전사 활성을 갖는다. 두 가지 기작을 통해 작용하는 이러한 촉진 압타머의 실시예는 본원 명세서에서 특히 바람직하게 제시하는 서열번호 2 내지 24에 의해 암호화되는 압타머이다.
그러나, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머이고, 종결자-의존적 방식으로 RNA-중합효소의 활성을 향상시킨다. 추가적인 구현예에서, 본 발명에 따른 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 활성화 및 항종결 RNA-중합효소 결합성 압타머이고, 종결자-의존적 및 종결자-비의존적 방식으로 RNA-중합효소의 활성을 향상시킨다.
전사 종결자는 당업자에 의해 잘 알려져 있으며, 인자-의존성 및 내인성 종결자 서열을 포함한다. 원핵성 종결자의 예시는 Santangelo and Artsimovitch (2011), Nat. Rev. Microbiol. 9:319-329에 개시되어 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 용어 "종결자"는 rut (Rho 의존성 종결자), rrnB, T7t, 및 tR2 종결자 (내인성 종결자 서열)로부터 선택되는 종결자를 나타낸다. 바람직한 종결자 서열은 표 3에 나타내었고, 서열번호 42, 서열번호 43, 및 서열번호 44로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 발현되는 서열의 발현을 증가시키고 ("전사 촉진성 압타머" 또는 "전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머"로도 지칭함), 상기 발현의 증가는 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하지 않은 때의 상기 발현되는 서열의 발현에 비해 적어도 10%, 바람직하게 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 100%이다. 바람직하게, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 본원 명세서에서 기재된 바와 같이, 리포터 어세이에서 발현되는 서열의 발현을 증가시킨다.
RNA-중합효소 결합성 압타머의 항종결 활성은 본 출원의 개시사항을 고려하여 당업자에 의해 테스트될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 항종결 RNA-중합효소 결합성 압타머는 종결 서열을 포함하는 발현되는 서열의 발현을 증가시키고, 상기 발현의 증가는 상기 항종결 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하지 않은 때의 상기 발현되는 서열의 발현에 비해 적어도 10%, 바람직하게 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 100%이다. 바람직하게, 상기 항종결 RNA-중합효소 결합성 압타머는 본원 명세서에서 기재된 바와 같이, 리포터 어세이에서 발현되는 서열의 발현을 증가시킨다.
본 발명자들은, 발현되는 서열의 발현을 증가시키는 특성을 갖는, 다수의 RNA-중합효소 결합성 압타머 (서열번호 2 내지 24)를 확인하였으며, 바람직하게 이들은 박테리아 기원이다. 서열의 상세한 분석을 통해 이들 서열에 포함된 공통의 모티브를 밝혀냈다. 상기 RNA 서열은 G[A/G][C/A/T][A/T][A/G/T][C/G]AT[G/T/C][A/C]G[G/A][G/T][C/A][A/G][G/A/C][T/G][T/A/G][C/T/G]AGCA의 DNA 서열에 의해 암호화되고, 확장된 1 문자 표기법 (코드)을 사용하여 서열번호 1로 기재하였다 (표 2 참고). 따라서, RNA-중합효소 결합성 압타머의 일 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 전사 촉진성 압타머이고, 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 다른 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 활성화 RNA-중합효소 결합성 압타머이고, 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 또 다른 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머이고, 서열번호 1의 서열로 암호화된다. 이러한 공통 서열은 박테리아, 예를 들어, 대장균 유래의 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA 내 존재함을 발견하였다. 추가적인 공통 서열은 진핵 기원, 즉, 서열번호 138 유래의 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA에서 확인되었다. 이로써, 암호화된 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 대장균과 같은 박테리아 발현 시스템 (실시예 참고)에서, 전사 촉진 특성을 나타내었다. 또한, 촉진성 서열, 즉 서열번호 1 또는 서열번호 138의 모티프를 공유하는 서열은 모두 서열번호 139의 공토 모티프를 공유한다는 것이 GLAM2를 사용하여 밝혀졌다. 이러한 모티프는 또한 서열번호 2에 의해 암호화되는 압타머에 대하여 테스트된 바와 같이, 확인된 필수적인 nt에 적합하다 (실시예 참고).
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 139에 따른 서열 (CAN0-3[AC][CA]N[GC][AT]N[CA][CA][CAT])에 의해 암호화된다. 서열번호 139에 따른 서열은 바람직하게 서열번호 1 및 서열번호 138로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 특히 바람직한 서열은 서열번호 1에 따른 서열에 의해 암호화된다. 서열번호 1의 공통 범위 내에 속하는 바람직한 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 서열들 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 서열번호 2 또는 상기 서열과 80% 서열 상동성을 갖는 서열이다.
서열번호 138의 공통 범위 내에 속하는 바람직한 서열은 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 서열들 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열이다.
본 발명자들은 이들이 결합하고 있는 RNA-중합효소의 활성을 향상시키는 다수의 RNA-중합효소 결합성 압타머를 발견하였다. 또한, 공통 모티프는 서열번호 1로 확인되었다. 또한, 본 발명자들은, 하나의 예시적인 압타머의 서열 내의 변이가 특성을 간섭하지 않은 채, 특정 위치에서 가능하다는 것을 증명하였다. 따라서, 당업자는 본원 명세서에서 개시된 특정 서열의 압타머가 그 특성을 유지하게 한다는 것을 즉각적으로 인정할 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 추가적인 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 보다 추가적인 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2의 서열, 또는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 상동성, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 상동성, 더욱 바람직하게 적어도 97% 서열 상동성, 보다 더욱 바람직하게 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 본 발명은 엄격한 조건하에서 이들 중 어느 하나와 혼성화되는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 적어도 97% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2의 서열에 의해 암호화된다. 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 바람직한 구현예에서, 서열번호 2와 일정한 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화되고, 상기 압타머를 암호화하는 서열은 서열번호 2의 1, 7, 8, 11 및 20 내지 23의 위치에서 뉴클레오타이드가 변경되지 않는다. 본 발명자들은 상기 압타머를 암호화하는 서열은 이들의 활성을 잃지 않으면서 변이될 수 있음을 발견하였다. 특히, 서열번호 2, 즉, 서열번호 72 내지 75에 의해 암호화되는 RAP ID #5713의 변이체는 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머로서 특성을 보유하고 있음을 보여주었다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 (전사 촉진성) RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 의해 암호화된다. 상기 서열번호 75의 서열은 이의 3' 말단이 6t로 단축되어 서열번호 1의 최소한의 공통서열에 상응하는 서열번호 2의 일 부부만을 포함한다. 이에 의하여, 암호화된 압타머는 이들의 기능성을 보유한다. 따라서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 (전사 촉진성) RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 75와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고, 바람직하게, 서열번호 75와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고, 보다 바람직하게 서열번호 75와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고, 보다 더욱 바람직하게 서열번호 75와 적어도 98% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 75의 서열을 포함하는 서열에 의해 암호화된다. 더욱 특히 바람직한 구현예에서, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 75의 서열을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 구현예에서, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 75와 일정한 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 이루어진 서열로 암호화되고, 상기 압타머를 암호화하는 서열은 서열번호 75의 1, 7, 8, 11, 및 20 내지 23 위치가 변경되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 3과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 3과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 3과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 3과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 3의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 4와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 4와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 4와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 4와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 4의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 5와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 5와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 5와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 5와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 5의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 6과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 6과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 6과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 6과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 6의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 7과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 7과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 7과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 7과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 7의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 8과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 8과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 8과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 8과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 8의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 9와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 9와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 9와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 9와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 9의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 10과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 10과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 10과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 10과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 11과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 11과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 11과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 11과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 11의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 12와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 12와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 12와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 12와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 12의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 13과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 13과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 13과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 13과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 13의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 14와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 14와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 14와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 14와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 14의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 15와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 15와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 15와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 15의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 16과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 16과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 16과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 16과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 16의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 17과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 17과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 17과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 17과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 17의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 18과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 18과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 18과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 18과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 18의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 19와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 19와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 19와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 19와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 19의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 20과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 20과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 20과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 20과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 20의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 21과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 21과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 21과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 21과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 21의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 22와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 22와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 22와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 22와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 22의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 23과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 23과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 23과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 23과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 23의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 24와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게, 서열번호 24와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게, 서열번호 24와 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 더욱 바람직하게, 서열번호 24와 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 24의 서열에 의해 암호화된다.
서열번호 2 내지 14 및 서열번호 72 내지 75의 서열에 의해 암호화되는 압타머에 대한 항종결 활성이 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80% 서열 상동성, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 상동성, 보다 더욱 바람직하게 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다.
두 서열간 상동성 퍼센트의 측정은 Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877의 수학적 알고리즘을 사용하여 진행되었다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 BLASTN 프로그램, 스코어=100, 단어 길이=12로 수행되어 각각의 뉴클레오타이드에 상동인 뉴클레오타이드 서열을 수득하였다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 BLASTN 프로그램, 스코어=50, 단어 길이=3으로 수행되어 각각의 아미노산에 상동인 아미노산 서열을 수득하였다. 비교를 목적으로 하는 갭 정렬을 수득하기 위하여, Grpped BLAST는 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402에 기술된 바와 같이 활용되었다. BLAST 및 Grpped BLAST 프로그램을 활용할 때, 각 프로그램의 기본 매개 변수가 사용된다.
DNA 분자, 발현 카세트 및 벡터에 대한 개략적인 구현예는 본 발명에 전체적으로, 즉, 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머에 적용된다. 그러나, 추가적인 구현예는 특히, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머와 관련된 대상에 적용된다.
매우 상세하게 설명된 바와 같이, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 프로모터 및/또는 발현되는 서열과 작동 가능하게 연결된다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 프로모터, 및 선택적으로 발현되는 서열과 작동 가능하게 연결된다. 본원 명세서에서 나타낸 바와 같이, 전사 촉진성 RNA-결합성 압타머는 압타머를 포함하는 전사체의 전사/발현을 증가시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게, 프로모터 서열 및 전사 개시 자리와 작동 가능하게 연결된다. 이는 바람직하게 본 발명에 따른 DNA 분자 상의 프로모터 및 전사 개시 자리의 하류에 위치한다. 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 전사 개시 자리간 거리는 중요하지 않다. 그러나 전사를 조절하는 관점에서, 일정한 거리에서 우수한 효과가 관찰될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 발현되는 서열 또는 전사 개시 자리의 하류에서 10 내지 1000nt의 거리 내, 전사 개시 자리의 하류에서 50 내지 500nt 거리 내, 보다 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 60 내지 250nt 내, 더욱 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 80 내지 103nt 거리 내에 위치된다. 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 발현되는 서열, 예컨데, 오픈 리딩 프레임과 작동 가능하게 연결된다. 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 발현되는 서열간 거리는 중요하지 않다. 그러나 전사 및 발현을 조절하는 관점에서, 일정한 거리에서 우수한 효과가 관찰될 수 있다. 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 10 내지 1000nt의 거리 내, 바람직하게, 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 50 내지 500nt 거리 내, 보다 바람직하게, 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 60 내지 250nt 내, 더욱 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 70 내지 108nt 거리 내에 위치된다. 전술한 바람직한 거리의 임의의 조합이 사용될 수 있고, 예를 들어, 전사 개시 자리의 하류에서 10 내지 1000nt 거리 및 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 10 내지 1000nt, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 50 내지 500nt 거리 및 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 50 내지 500nt, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 60 내지 250nt 거리 및 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 60 내지 250nt, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 80 내지 103nt 거리 및 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 70 내지 108nt, 또는 임의의 다른 조합일 수 있다. 용어, "전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머"는 "활성화 RNA-중합효소 결합성 압타머" 및 "항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머" 모두를 나타낸다는 점을 주목하여야 한다. 본 발명에 따른 바람직한 전사 촉진성 압타머는 두 가지 특성, 즉, 활성화 및 항종결 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하며, 특히 바람직하게, 적어도 항종결 RNA-중합효소 결합성 압타머이다.
RNA-중합효소 결합성 압타머 또는 역 상보 서열과 같은 전사 후 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA 서열의 영역 내 혼성화 서열을 회피하는 것이 보다 바람직할 수 있다. 이론에 구애받지 않고서도, 특정 환경 하에서 이러한 서열은 DNA 서열 또는 전사된 RNA 중합효소 결합성 압타머와 혼성화되어, 이의 활성화를 방해할 수 있다고 생각된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 함유하는 DNA 분자 또는 벡터는 20nt 또는 그 이상에 걸쳐 100% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 DNA 분자 또는 벡터는 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 가닥과 동일한 가닥에 대한 혼성화 서열, 바람직하게, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열로 전사된 구역의 가닥을 포함하지 않는다. 추가적인 바람직한 구현예에서, DNA 분자 또는 벡터는 동일한 RNA 전사체 상의 RNA-중합효소 결합성 압타머를 혼성화하는 RNA 서열을 암호화하지 않으며, 바람직하게, 적어도 RNA 중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 주변에 30nt 범위 내에 존재하지 않으면, 이들은 암호화된다.
또한, 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게 종결 서열의 상류에 위치할 때, 항-종결 활성을 나타낸다 (항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머). 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 발현 카세트 내 종결 서열의 상류에 위치된다. 상기 종결 서열은 발현되는 서열의 상류, 하류 또는 내부에 위치할 수 있다. 이는 목적 단백질을 암호화하는 서열의 일부일 수 있다. 이러한 경우, 종결자를 포함하는 암호화 서열을 간섭할 필요없이 단백질의 충분한 발현을 가능하게 하기 위하여, 본 발명에 따른 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 바람직하게 본 발명에 따른 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하며, 바람직하게, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열, 보다 바람직하게 서열번호 2, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다. 상기 본원 명세서에서 나타낸 바와 같이, 상기 서열의 구현예는 마찬가지로 각각의 상동성이 적용된다.
항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게, 종결자 서열과 작동 가능하게 연결되고, 보다 바람직하게, 종결자 서열의 상류에 위치한다. 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 종결자간 거리는 중요하지 않다. 그러나 전사 및 발현을 조절하는 관점에서, 일정한 거리에서 우수한 효과가 관찰될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 종결자 서열의 상류에서 10 내지 1000nt의 거리 내, 종결자 서열의 상류에서 15 내지 500nt 거리 내, 보다 바람직하게 종결자 서열의 상류에서 15 내지 250nt 내, 더욱 바람직하게 종결자 서열의 상류에서 20 내지 111nt 거리 내에 위치된다. 전술한 바람직한 거리의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 전사 개시 자리의 하류에서 80 내지 103nt 및 종결자 서열 상류에서 20 내지 111nt에 위치된다. 바람직한 종결자 서열은 본원 명세서에서 추가로 설명된 내인성 종결자 서열, 인자 의존성 종결자 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 프로모터 및 다중 클로닝 자리를 포함하며, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 상기 프로모터의 전사 개시 자리의 하류 및 상기 다중 클로닝 자리의 상류에 위치된다. 상기 발현 카세트는 DNA-분자에 포함될 수 있고, 바람직하게 벡터 내 포함된 DNA 분자에 포함될 수 있다. 특히, 바람직하게, 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 본 발명에 따른 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머이다.
또한, 본 발명은 숙주 세포 내 내인성 서열의 발현을 향상시키기 위한, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머 또는 상기 압타머를 암호화하는 DNA-분자의 용도에 관한 것이다. 숙주 세포는 바람직하게 비-인간 숙주 세포, 보다 구체적으로 박테리아, 특히 바람직하게 대장균이다. 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA-분자는 바람직하게 상기 내인성 내인성 서열이 전사되는 프로모터의 하류에 삽입된다. 본 발명은 숙주 세포에서 내인성 서열의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자를 숙주세포의 게놈에 삽입하여, 본 발명에 따른 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열이 상기 내인성 서열의 프로모터, 바람직하게 삽입된 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된다. 또한, 바람직한 압타머는 상기 프로모터의 하류 및 상기 내인성 서열의 상류에 삽입된다.
또한, 본 발명은 숙주 세포의 내인성 서열에 존재하는 종결자에 대한 저해를 위한, 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머 또는 상기 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자의 용도에 관한 것이다.
당업자는 특히 촉진의 강도와 관련하여, 바람직한 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 선택할 수 있다. 따라서, 당업자는 프로모터의 강도, 즉, 압타머 없이 전사가 발생할 수 있는 정도와 같은, 특정 측면을 고려할 수 있다. 또한, 당업자는 바람직한 발현 양, 예를 들어 전사의 유도를 고려할 것이다. 이를 위하여, 당업자는 이들의 촉진의 정도가 다르기 때문에, 본원 명세서에서 제공되는 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머로부터 선택될 수 있다. 또한, 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 다수가 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 발현 카세트는 둘 또는 그 이상의 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 바람직하게, 셋 또는 그 이상의 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함한다. 상기 서열은 연속적인 서열로서, 상기 둘 또는 그 이상, 또는 셋 또는 그 이상의 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 예를 들어, 직렬 반복을 포함하고, 선택적으로 스페이서 서열로 분리된다. 상기 서열에 의해 암호화된 압타머는 모두 동일한 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머일 수 있거나 상이한 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화할 수 있다.
본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 다양한 용도 및 방법에 적용 가능하다. 따라서, 본 발명은 핵산의 발현을 조절하기 위한, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 용도에 관한 것이며, 바람직하게, 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위한 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA 서열의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 발현되는 서열의 발현을 향상시키기 위한, 본 발명에 따른 DNA-분자의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 목적 서열, 바람직하게 단백질의 발현을 위한 본 발명에 따른 발현 카세트의 용도에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 목적 서열, 바람직하게 단백질의 발현을 위한 본 발명에 따른 벡터의 용도에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 목적 서열, 예를 들어, 목적 단백질을 암호화하는 서열의 발현을 위한, 본 발명에 따른 발현 카세트, 즉, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 카세트의 용도에 관한 것이다. 발현은 숙주 세포 내 또는 in vitro 발현 시스템에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 DNA-분자, 발현 카세트 및/또는 벡터는 숙주 세포 내 또는 in vitro 발현 시스템에 사용될 수 있다.
in vitro 발현 시스템은 당업자에 의해 알려져 있고, 연구실에서의 실험 및 어세이에 널리 사용되고 있다. (Spirin, A.; Baranov, V.; Ryabova, L.; Ovodov, S.; Alakhov, Y. (1988). "A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield". Science 242 (4882): 1162; Jackson, AM et al. (2004). "Cell-free protein synthesis for proteomics". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2 (4): 308-319; Carlson, ED et al. (2011). "Cell-free protein synthesis: Applications come of age". Biotechnol Adv 30 (5): 1185; and Bundy, Bradley C.; Franciszkowicz, Marc J.; Swartz, James R. (2008). "Escherichia coli-based cell-free synthesis of virus-like particles". Biotechnology and Bioengineering 100 (1): 28-37 참조). in vitro 발현 시스템의 일 실시예는 PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB; https://www.neb.com/products/e6800-purexpress-invitro-protein-synthesis-kit)이며, 이는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. in vitro 발현 시스템은 DNA 분자를 RNA로 전사하기 위하여, DNA-의존성 RNA 중합효소를 사용하며, 선택적으로, 필요에 따라 RNA를 폴리펩타이드로 번역하기 위한 리보솜을 사용할 수 있다. 이 시스템은 주로 파지 중합효소 (T7, SP6 등)를 위하여 설계되었지만, 박테리아 RNAP, 바람직하게 대장균 유래 RNAP에 최적화될 수도 있다. 본 발명에 따른 RNA-결합성 압타머는 바람직하게, in vitro 발현 시스템의 중합효소 바람직하게 본원 명세서에 기재된 바와 같은 친화도, 바람직하게 비-파지 중합효소, 보다 바람직하게 in vitro 발현 또는 전사 시스템에서 박테리아 RNA 중합효소에 결합하는 것이 명백할 것이다. 현재, 대부분의 in vitro 시스템은 전사의 높은 수율로 인해 파지 중합효소를 사용한다. 그럼에도 불구하고, 이들은 전사된 RNA 내의 이차 구조 및 RNA의 잘못된 접힘 (misfolding)에 영향을 미치기 쉽다. 현재 박테리아 RNA 중합효소를 사용하는 in vitro 시스템은 사용 가능하지만, RNA 수율이 낮기 때문에 일반적으로 사용되지는 않는다, 이러한 문제점이 본 발명에 의해 개선되었다는 점은 명백하다. 따라서, 본 바람직한 구현예에서의 본 발명은 in vitro 전사 및/또는 발현에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 DNA-분자, 바람직하게 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 in vitro 전사 및/또는 발현에 사용되는 박테리아 RNA 중합효소에 결합한다. 또한, 본 발명은 목적 RNA의 in vitro 전사를 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 DNA-분자를 제공하고, 여기서, 상기 DNA-분자는 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 바람직하게 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 DNA-분자를 포함하고; 상기 목적 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자는 프로모터 및 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결되며, 상기 프로모터로부터 전사를 가능하게 하는 조건 하에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소를 지닌 DNA-분자를 배양하고, 및 선택적으로, 목적 RNA를 회수한다. RNA-중합효소 결합성 압타머는 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머 또는 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머 및 이들의 조합일 수 있다. 압타머의 성질은 필요에 따라, 예를 들어, 전사가 촉진 또는 저해되지 여부에 따라 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머이다.
당업자는 in vitro 전사에 적합한 조건을 인지하고 있다. 이들은 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 및 적합한 완충액을 포함시킬 수 있다. 뉴클레오트리포스페이트에는 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5'-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP)와 같은 천연 뉴클레오사이드 포스페이트를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 마그네슘과 같은 보조 인자가 첨가될 수 있다. 일 구현예에서, 인큐베이션은 세포 추출믈을 이용하여 수행되었다. 또한, 전사 저해제, 예를 들어, 대장균의 Rho 저해제가 첨가될 수 있다. 이는 발현의 세밀한 제어를 가능하게 한다.
본 발명은 목적 단백질의 in vitro 발현을 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 DNA-분자를 제공하고, 여기서, 상기 DNA-분자는 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효서 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 DNA-분자는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하며; 상기 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자는 프로모터 및 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결되고, 상기 프로모터로부터 전사, 및 전사체의 번역을 가능하게 하는 조건 및 성분과 함께, 상기 DNA-분자를 인큐베이팅하고, 선택적으로 목적 단백질을 회수하는 것을 포함한다. in vitro 발현은 무 세포 발현으로도 알려져 있다. 무세포 반응의 일반적인 성분은 세포 추출물, 에너지 원, 아미노산 공급원, 번역의 보조 인자 및/또는 세포 추출물의 번역 기작, 및 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함한다. 이러한 보조 인자는 마그네슘과 같은 2가 양이온일 수 있다. 세포 추출물은 목적 세포를 용해시키고, 세포벽 성분, DNA 게놈, 및 다른 잔여물들을 원심분리하여 수득될 수 있다. 이외 나머지들은 리보솜 아미노아실-tRNA 합성 효소, 번역 개시 및 신장 인자, 뉴클레아제 등을 포함하는 세포 기작에 필요한 물질들이다. 바람직한 세포 추출물은 본 발명에 따른 적절한 숙주 세포로부터 추출될 수 있고, 바람직하게 진핵성 또는 원핵성 세포 추출물, 바람직하게 박테리아 세포 추출물, 보다 바람직하게 대장균의 세포 추출물이다.
본 발명은 또한 in vitro 전사 또는 in vitro 번역 어세이의 수율을 증진시키기 위한, 본 발명에 따른 전사 촉진 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자의 용도에 관한 것이다. 이들은 예를 들어, 본원 명세서에 개괄된 방법에 의해 수행되거나 또는 상기 DNA 분자 또는 적어도 어세이에 이용가능한 서열을 포함하여 수행될 수 있다.
in vitro 발현 또는 전사에 두 가지 유형의 DNA 분자, 즉 플라스미드 및 선형 DNA-분자 (선형 발현 주형)가 사용될 수 있다. 플라스미드는 원형이며, 일반적으로 세포를 이용하여 제조된다. 선형 DNA- 분자는 PCR (중합효소 사슬 반응 참조)를 통하여 보다 효과적으로 제조될 수 있고, 이는 플라스미드를 함유하는 세포를 키우는 것보다 훨씬 빨리 DNA를 복제할 수 있다. 선형 DNA 분자는 제조하기 쉽고, 빠르지만, 플라스미드에서의 수율은 무세포 발현에서 매우 높다. 이 때문에, 오늘날 많은 연구가 선형 DNA-분자를 사용할 때, 플라스미드의 수율에 근접하기 위하여 무세포 발현 수율을 최적화하는데 초점을 맞추고 있다.
"에너지원"은 전사 및/또는 번역에 필요한 에너지원을 나타내며, 이는 반응물에 첨가되고, 예를 들어, 세포 추출물에 첨가된다. 바람직한 에너지원은 포스포에놀 피루베이트, 아세틸 포스페이트, 및 크레아틴 포스페이트이다.
본원 명세서에서 사용된 "아미노산"은 천연 및 비-천연 아미노산을 포함하고, 바람직하게 하기의 단백질성 아미노산들 중 하나 이상이 첨가된다: 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 피로 리신, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 , 셀레 노 시스테인, 발린, 트립토판 및 티로신. 일 구현예에서, 열거된 모든 아미노산이 첨가된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA-분자 또는 벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 사용자가 의도하는 각각의 분석에 사용할 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있고, 예를 들어, 전사 또는 발현 시스템의 성분, 또는 숙주 세포의 형질감염 또는 형질전환을 위한 시약 또는 완충 용액 또는 추가적인 시약, 또는 본원 명세서에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 사용함으로써, 서열, 예컨데, 목적 단백질을 암호화하는 서열의 발현이 향상될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 바람직한 구현예에서, 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벡터를 제공하고, 여기서 상기 벡터는 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 벡터는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하고; 상기 목적 단백질을 암호화하는 서열이 프로모터 및 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머와 작동 가능하게 연결되도록 상기 목적 단백질을 암호화하는 서열을 상기 벡터에 클로닝하여 최종 발현 벡터를 수득하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 및 발현 벡터의 프로모터로부터 전사가 유도되는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 및 선택적으로, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 목적 단백질을 생산하는 방법의 클로닝 단계는 초기 벡터가 상기 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 경우, 생략될 수 있음을 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 이러한 구현예로서, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 벡터를 제공하는 단계, 여기서, 바람직하게 상기 벡터는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하고, 상기 벡터는 프로모터 및 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하고; 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 발현 벡터의 프로모터로부터 전사를 유도하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 및 선택적으로, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 활성화 또는 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머일 수 있고, 바람직하게 본 발명 및 본원 명세서의 구현예에 따른 항종결성 RNA-중합효소 결합성 압타머일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머의 서브 그룹은 상기 압타머를 암호화하는 DNA 가닥으로부터 전사될 때, RNA 중합효소의 활성을 감소시킨다는 것이 본 발명자에 의해 밝혀졌다. DNA 절편이 본 발명에 따른 RNA-합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 경우, DNA 절편의 전사 효율은 감소된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 RNA-중합효소의 활성을 감소 (억제 또는 저해)시킨다. 이러한 구현예에 따른 본 발명의 RNA-중합효소 결합성 압타머는 "저해성" 또는 "전사 저해성" RNA-중합효소 결합성 압타머로 상호 교환적으로 나타낸다. 당업자는 RNA-중합효소의 활성 및 이들 서열의 효과를 측정하는 방법, 어세이 및 시스템을 인식하고 있다. 이러한 방법은 숙주 세포 내 리포터 유전자의 발현을 포함하고, 본원 명세서 및 실시예에서 상세하게 기술된 in vitro 전사 어세이에 적용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 RNA-중합효소의 활성을 저해하고, 바람직하게 본원 명세서에서 개시한 리포터에서 활성을 저해한다. 상기 저해는 Rho-의존성 또는 Rho-비의존성일 수 있고, 바람직하게 Rho-의존성일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 발현되는 서열의 발현은 감소시키고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하지 않은 때의 상기 발현되는 서열의 발현에 비해, 상기 발현의 감소가 적어도 30%, 바람직하게 적어도 20%, 보다 바람직하게 적어도 50%이다.
본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 바람직하게, 전사 정지 모티프, 바람직하게 G-10Y-1G+1의 공통 서열을 갖는 모티프를 포함한다.
또한, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 33.67%의 증가된 C-함량 중간 값을 가지지만, G-함량 중간 값은 15.68%임을 본 발명자에 의해 밝혀졌다 (도 19). 따라서, 일 구현예에서, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 27% 초과, 바람직하게 30% 초과, 보다 바람직하게 31% 초과의 C-함량을 가지고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 23% 미만, 바람직하게 20% 미만, 보다 구체적으로 17% 미만의 G-함량을 가진다.
상이한 RNA-중합효소 결합성 압타머에 대한 공통 서열이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 바람직한 구현예에서, 상기 압타머는 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 및 서열번호 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의하여 암호화되는 서열을 포함한다.
상이한 서열은 이러한 공통 서열에 포함된다 (실시예 2 참조). 따라서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 바람직한 구현예에서, 상기 압타머는 서열번호 84의 서열에 의하여 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 29, 서열번호 35, 서열번호 41, 서열번호 27, 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의하여 암호화된 서열을 포함하며; 바람직하게 서열번호 29, 서열번호 35, 서열번호 41, 서열번호 27, 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의하여 암호화된 서열을 포함하며, 보다 바람직하게 서열번호 29, 서열번호 35, 서열번호 41, 서열번호 27, 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의하여 암호화된 서열을 포함하고; 및 더욱 바람직하게 서열번호 29, 서열번호 35, 서열번호 41, 서열번호 27, 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의하여 암호화된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 84의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 29, 서열번호 35, 서열번호 41, 서열번호 27, 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 보다 바람직한 구현예에서, 상기 압타머는 서열번호 85의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 88, 서열번호 32, 서열번호 26, 및 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 80% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열, 바람직하게 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 88, 서열번호 32, 서열번호 26, 및 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열; 보다 바람직하게 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 88, 서열번호 32, 서열번호 26, 및 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열; 더욱 바람직하게 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 88, 서열번호 32, 서열번호 26, 및 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 85의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 31, 서열번호 91, 서열번호 88, 서열번호 32, 서열번호 26, 및 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 보다 바람직한 구현예에서, 상기 압타머는 서열번호 86의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 89, 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 80% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열, 바람직하게 서열번호 89, 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열; 보다 바람직하게 서열번호 89, 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열; 더욱 바람직하게 서열번호 89, 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 86의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 89, 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 보다 바람직한 구현예에서, 상기 압타머는 서열번호 87의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 33, 서열번호 25, 서열번호 92, 서열번호 30, 서열번호 90, 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 80% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열, 바람직하게 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 33, 서열번호 25, 서열번호 92, 서열번호 30, 서열번호 90, 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열; 보다 바람직하게 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 33, 서열번호 25, 서열번호 92, 서열번호 30, 서열번호 90, 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열; 더욱 바람직하게 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 33, 서열번호 25, 서열번호 92, 서열번호 30, 서열번호 90, 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 87의 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하고, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 33, 서열번호 25, 서열번호 92, 서열번호 30, 서열번호 90, 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
본 발명자들은 이들이 결합하고 있는 RNA-중합효소의 활성을 감소시키는 다수의 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 발견하였다. 따라서, 일 구현예에서 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다. 본 발명은 또한 엄격한 조건 하에서 상기 서열들 중 임의의 서열을 혼성화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정한 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25의 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25의 서열과 일정한 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화되고, 상기 압타머를 암호화하는 서열은 서열번호 25의 10, 11, 18, 20, 21 및 24 내지 27에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드가 변경되지 않은 압타머를 암호화하는 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 26과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 26의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 27과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 27의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 28과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 28의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 29와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 29의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 30과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 30의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 31과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 31의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 32와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 32의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 33과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 33의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 34와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 34의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 35와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 35의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 36과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 36의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 37과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 37의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 38과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 38의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 39와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 39의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 40과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 40의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 41과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 95%의 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 99%의 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 41의 서열에 의해 암호화된다.
본원 명세서에서의 모든 구현예에서, 일반적인 DNA-분자, 발현 카세트, 벡터, 및 숙주 세포는 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머의 바람직한 구현예와 유사하게 적용된다.
또한, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 사용하는 내인성 또는 외인성 서열의 발현 조절은 Rho 저해 인자에 대한 기작의 의존성을 이용하여 수행될 수 있음은 당업자에 의해 인정될 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 사용하는 경우, 발현에 대한 이들의 저해 효과는 Rho 저해제의 저해제, 예를 들어, 바이사이클로마이신을 사용한 발현 시스템 (in vitro 또는 in vivo)에서의 인큐베이션에 의해 제어될 수 있다. 이는 발현의 미세한 조절을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 용도 및 방법의 일 구현예에서는, Rho 전사 저해제의 저해제를 추가하여 추가로 발현을 조절한다. 본 발명에 따른 Rho 전사 저해제의 저해제는 바람직하게 바이사이클로마이신이다.
이는 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머와 관련하여 유용하다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 숙주 세포에서 목적 서열의 발현을 제어하는 방법에 관한 것이다: DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 상기 DNA 분자는 프로모터 및 목적 서열과 작동 가능하게 연결된, 저해성 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하고, 바람직한 수준의 목적 서열의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양 배지에 배양하는 단계: 상기 배양 배지는 바람직한 수준의 발현을 가능하게 하는 농도에서 Rho 전사 저해제의 저해제를 포함한다. 목적 서열은 외인성 서열 또는 숙주 세포의 내인성 서열일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 예를 들어, 숙주 세포의 내인성 서열의 제어된 하향 조절(억제), 예를 들어, 기능성 분석을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 임의의 저해성 RNA-중합효소가 사용될 수 있고, 본 발명에 따른 테스트된 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 모두 Rho 저해제 및 바이사이클로마이신 (BCM)에 대하여 유의성을 나타내므로, 바람직하게 본원 명세서에 정의된 중합효소가 사용될 수 있다. 따라서, 이와 관련된 바람직한 구현예에서, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 본원 명세서에 기술되 서열에 의해 암호화된다. 그러나 바람직한 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 서열번호 25 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열, 보다 바람직하게 서열번호 25 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게 서열번호 25 및 서열번호 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화된다.
본 발명에 따른 Rho 전사 저해제의 저해제는 바람직하게 바이사이클로마이신이고, 바람직하게, 1μg/mL 내지 100μg/mL의 수준, 보다 바람직하게 1μg/mL 내지 50μg/mL, 가장 바람직하게 8μg/mL, 10μg/mL, 15μg/mL, 20μg/mL, 24μg/mL를 포함하는 5μg/mL 내지 25μg/mL일 수 있다.
본원 명세서에서 개괄한 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, RNA-중합효소 결합성 압타머는 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머이고, 바람직하게, 본원 명세서에서 기술한 저해성 RNA-중합효소 압타머들의 군으로부터 선택된다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자는 바람직하게 작동 가능하게 연결된 프로모터로부터의 발현을 저해 또는 억제하기 위하여 사용된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 분자는 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 및 프로모터를 포함하고, 상기 압타머를 암호화하는 서열은 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되고, 바람직하게 상기 프로모터로부터 전사을 저해 또는 억제시키기 위하여 작동 가능하게 연결된다. 몇몇의 접근법은 특정 화합물 또는 온도와 같은 다른 환경적 조건의 존재와 같이, 특정 조건 하에서 전사를 활성화 또는 증가시키는 프로모터를 사용한다. 그러나 이러한 접근법은 유도성 프로모터는 비-유도성 조건 하에서 완전히 "엄격"하지 않다는 점, 즉, 프로모터로부터 전사를 유도하기 위한 자극이 없는 경우에도 프로모터부터 발생하는 기본 전사 및 발현에 의해 어려움을 겪는다. 그러나, 이것은 특히, 목적 단백질이 해로운 특성을 갖는 경우, 숙주 세포에 유해할 수 있다. 이러한 상황에서, 비-유도성 조건 하, "엄격"한 발현 시스템 또는 카세트를 제공하는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명자들은 이와 관련된 예상치 못한 효과를 제공하는 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 제공한다. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이러한 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 코딩하는 서열을 포함함으로써, 프로모터에 대한 엄격한 조건을 마련할 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 DNA-분자에 관한 것으로, 상기 발현 카세트는 본 발명에 따른 유도성 프로모터, 및 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하고, 상기 압타머를 암호화하는 서열은 상기 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 바람직하게 유도성 프로모터의 하류에 위치한다. 당업자는 특히 저해의 강도와 관련하여, 바람직한 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 선택할 수 있다. 당업자는 비유도 상태에서 프로모터의 노출, 즉 자극없이 발생하는 전사의 정도와 같은 특정 관점을 고려할 수 있다. 또한, 당업자는 전사의 유도시에 바람직한 발현 양을 고려할 것이다. 이를 위하여, 당업자는 저해 정도가 다른 본 발명에서 제공하는 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머로부터 선택할 수 있다. 또한, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 다수의 서열이 사용된다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 발현 카세트는 둘 또는 그 이상의 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머, 바람직하게 셋 또는 그 이상의 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 압타머는 모두 동일한 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머이거나 이들은 본 발명에 따른 상이한 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머일 수 있다.
일 구현예에서 본 발명은 단백질의 발현 저해, 바람직하게 박테리아 또는 포유류 세포주를 포함하는 원핵성 또는 진핵성 세포주와 같은 미생물에서의 단백질의 발현 저해를 위한, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 상기 단백질의 발현이 개시되는 프로모터의 하류에 위치된다. 이는 RNA-중합효소 결합성 압타머가 발현되는 단백질을 암호화하는 mRNA의 일부라는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 용도는 임의의 목적 단백질의 발현 조절을 위한 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 숙주 세포 내 내인성 서열의 발현을 저해하기 위한, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머, 또는 상기 압타머를 암호화하는 DNA-분자의 용도, 또는 사용 방법에 관한 것이다. 숙주 세포는 바람직하게 비-인간 숙주 세포이다. 본 발명에 따른 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 DNA 분자는 바람직하게 상기 내인성 서열이 전사되는 프로모터의 하류에 삽입된다. 본 발명은 또한 숙주세포에서 내인성 서열의 발현을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA-분자를 숙주 세포의 게놈에 삽입하고, 여기서, 상기 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 상기 내인성 서열의 프로모터와 작동 가능하게 연결되고, 바람직하게 상기 프로모터의 하류에 삽입된다. 추가로 바람직한 압타머는 상기 프로모터의 하류 및 상기 내인성 서열의 상류에 삽입된다.
저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 프로모터 및/또는 발현되는 서열, 또는 다중 클로닝 자리와 작동 가능하게 연결된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 프로모터, 선택적으로 발현되는 서열, 또는 다중 클로닝 자리와 작동 가능하게 연결된다. 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 상기 압타머를 포함하는 전사체의 전사/발현을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게, 프로모터 서열 및 전사 개시자리와 작동 가능하게 연결된다. 이는 바람직하게 본 발명에 따른 DNA 분자 상의 프로모터 및 전사 개시 자리의 하류에 위치한다. 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머와 전사 개시 자리간 거리는 중요하지 않다. 그러나 전사를 조절하고 저해하는 관점에서, 일정한 거리에서 우수한 효과가 관찰될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 10 내지 1000nt의 거리 내, 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 15 내지 500nt 거리 내, 보다 바람직하게 전사 개시 자리의 하류에서 25 내지 250nt 내에 위치된다. 본 발명에 다른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 발현되는 서열, 예를 들어 오픈 리딩 프레임 또는 다중 클로닝 자리와 작동 가능하게 연결된다. 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 발현되는 서열간 거리는 중요하지 않다. 그러나 전사 및 발현을 조절하고 저해하는 관점에서, 일정한 거리에서 우수한 효과가 관찰될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 적어도 20nt, 예를 들어, 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 20 내지 1000nt 거리 내, 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 30 내지 500nt 거리 내, 보다 바람직하게 발현되는 서열 또는 다중 클로닝 자리의 상류에서 40 내지 250nt 거리 내에 위치된다. 전술한 바람직한 거리의 임의의 조합, 예를 들어, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열은 전사 개시 자리의 하류에서 10 내지 1000nt 거리 및 발현되는 서열의 상류에서 20 내지 1000nt 거리, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 15 내지 500nt 거리 및 발현되는 서열의 상류에서 15 내지 500nt 거리, 또는 전사 개시 자리의 하류에서 25 내지 250nt 거리 및 발현되는 서열의 상류에서 40 내지 250nt 거리, 또는 다른 가능한 임의의 조합이 사용될 수 있다.
본 발명자들은 기능에 대한 하나의 기작이 번역으로부터 전사를 일시적으로분리한다는 것을 발견하였다. RNA 중합효소의 표면에 결합하면, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 리포솜 진행에 대한 물리적 장벽을 만들어 낸다 (도 23); 도 23E 참조. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 발현되는 서열 내에 암호화되고, 바람직하게 발현되는 단백질의 ORF 내에 암호화된다. 일 구현예에서, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 25, 서열번호 25의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열, 바람직하게 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다: - 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공하는 단계로서, 상기 발현 카세트는 본 발명에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하고, - 벡터를 숙주 세포에 도입하고, - 발현 카세트의 프로모터로부터 전사가 유도되는 조건 하에서 숙주세포를 배양 배지에서 배양하고, 및 - 선택적으로 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질을 회수하는 단계. 프로모터는 바람직하게, 본 발명에 따른 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터로부터 선택되고, 바람직하게는 본 발명에 따른 유도성 프로모터이다. 또한, 발현되는 단백질은 바람직하게 숙주 세포에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 상기 방법은 발현 카세트의 유도성 프로모터로부터 전사를 유도하는 조건하에서 숙주 세포를 배양 배지에 배양하는 단계 전에, 발현 카세트의 유도성 프로모터로부터 전사를 유도하지 않는 조건에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본원 명세서에서, 특허 출원 문헌을 포함한 다수의 문헌이 인용되었다. 이러한 문헌의 개시는 본 발명의 특허성에는 관련성이 없는 것으로 간주되고, 그 전체가 본원 명세서에 참조로서 포함된다. 보다 구체적으로, 모든 개별 문서가 참조에 의해 통합되도록, 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것처럼, 모든 참조 문헌은 동일한 범위로 참조에 의해 통합된다.
본 발명자들은 흥미롭게도 RNA 중합효소와 높은 친화도로 상호작용하는, 짧은 RNA-중합효소 결합성 압타머 (RAPs)를 발견하였다. 본 발명자들은 자연적으로 발생한 다수의 RAPs를 확인하였다. 또한, 이러한 압타머들은 암호화된 DNA-서열의 발현을 조절할 수 있음을 보여주었다. 따라서, 본 발명은 RNA-중합효소를 조절하는 새로운 도구를 제공하고, 이에 따라, 숙주 세포에서 RNA 및/또는 단백질과 같이 DNA로 암호화된 분자의 발현을 조절할 수 있는 도구를 제공한다.
도 1은 대장균 게놈 내에서 RNA-중합효소 결합성 압타머 (RAP)의 분포에 관한 것이다. (A) RAP는 대장균 게놈 상의 위치에 따라 분류된다. 표기된 유전자는 회색 화살표로 나타내었다. RAP 위치는 삼각형으로 묘사하였다. (B) 대장균 게놈 내의 다른 카테고리로부터 RAP의 분포이다. (C)-(D) 표기된 유전자 내 센스 (C) 및 안티센스 (D)에 대한 RAP 위치의 분석이다. 밝은 선은 모든 표기된 ORFs (10% 상류/하류)의 각 영역에서 발견된 RAP의 수를 보여준다. 배경 (검은색)은 1000 개의 무작위 조건에 따른 각각의 신호를 보여준다.
도 2는 GFP 리포터 시스템에서 RAP 활성화 효과에 관한 것이다 (박테리아성 RNA-중합효소(RNAP)에 의해 유도됨). (A) GFP 리포터 유전자 (GFP)의 상류에 위치하는 RNA-중합효소 결합성 압타머 (RAP; 직사각형)의 활성화 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 상이한 RAPs를 함유하는 GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). RAP-GFP 구조물로서, 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) 박테리아 RNAP에 의해 전사될 때, 상이한 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준 (이들의 RAP ID로 나타냄.)이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. RAP ID #5713 및 #14908은 RAP를 포함하지 않는 구조물에 비해, 전사체를 현저하게 상향 조절하였다. 대조군 구조물 #7523 및 #3468은 RAP를 포함하지 않는 구조물과 차이가 없었다. 값은 평균±표준 편차, n≥3; **p<0.01; *p<0.05; ns: 유의하지 않음 (T-테스트, 균등 분산 테스트)으로 나타내었다.
도 3은 GFP 리포터 시스템에서 RAP 활성화 효과에 관한 것이다 (파지 T7RNAP에 의해 유도됨). (A) GFP 리포터 유전자 (GFP)의 상류에 위치하는 RNA-중합효소 결합성 압타머 (RAP; 직사각형)의 활성화 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "T7P" (회색 삼각형)는 파지 T7 RNAP에 의해 인식된 파지 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 상이한 RAPs를 함유하는 GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). RAP-GFP 구조물로서, 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) 파지 T7 RNAP에 의해 전사될 때, 상이한 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준 (이들의 RAP ID로 나타냄.)이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. RAP ID #5713 및 #14908은 RAP를 포함하지 않는 구조물과 차이가 없었다. 값은 평균±표준 편차, n≥3; ns: 유의하지 않음 (T-테스트, 균등 분산 테스트)으로 나타내었다.
도 4는 RAPs 프로모터의 활성을 확인한 것이다. (A) RAP 프로모터 활성을 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 기존의 항시성 박테리아 프로모터 (삼각형)은 GFP 리포터 유전자의 상류 RAP (직사각형)으로 대체되었다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 항시성 박테리아 RNAP 프로모터 대신 다른 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 값은 평균±표준 편차, n≥2 으로 나타내었다.
도 5는 프로모터 상류의 RAP ID #5713 활성을 확인한 것이다. (A) 어세이에서 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 테스트된 RAP ID #5713 또는 대조군인 역 상보 서열 (RNA-표시된 직사각형)은 기존의 항시성 박테리아 프로모터의 상류에 위치되었다 (회색 삼각형). TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 어세이에서 리포터 유전자 전사 수준이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 값은 평균±표준 편차, n≥3; **p<0.01; ns: 유의하지 않음(T-테스트, 균등 분산 테스트)으로 나타내었다.
도 6은 RAP ID #5713은 번역초과 (read-through) 내인성 종결자를 촉진시킴을 나타낸 것이다. (A) 내인성 종결자 "Term"의 상류에 위치하는 RAPs (빨간색 직사각형)의 항종결 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다 (헤어핀으로 도식화하여 표기함.). "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) RAP 서열 없이 내인성 종결자를 함유하지 않는 리포터 전사체 (No RAP_No term), RAP 서열 없이 rrnB 내인성 종결자를 지닌 리포터 전사체(No RAP_rrnB), RAP 서열 없이 T7t 내인성 종결자를 지닌 리포터 전사체 (No RAP_T7t)의 수준을 나타낸 것이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다. (C) 전술한 이종 내인성 종결자 (상단에 표시)를 함유하는 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (D) RAP ID #5713에 대한 이차 구조 예측이다- RNA 접힘 소프트웨어 (Vienna RNA Package)에 의해 수득된 내인성 종결자 구조물 (rrnB-상부 패널, T7t-하부 패널). RAP ID #5713의 서열은 내인성 종결자로부터 111nt 떨어져 있으며, 접힘에 영향을 미치지 않는다. (E) RAP ID #5713 존재 또는 부존재 하에서 rrnB 종결자를 지닌 리포터 유전자 전사체의 수준을 나타낸 것이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. RAP ID #5713은 RAP 구조물이 없는 경우에 비해, 번역 초과 rrnB 종결자를 최대 8배까지 활성화시킨다 (항종결자로서 RAP). 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다. (F) RAP ID #5713 존재 또는 부존재 하에 T7t 종결자를 지닌 리포터 유전자 전사체의 수준을 나타낸 것이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다.. RAP ID #5713은 RAP 구조물이 없는 경우에 비해, 번역 초과 T7t 종결자를 최대 14배까지 활성화시킨다 (항종결자로서 RAP). 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다.
도 7은 RAP ID #5713은 Rho-의존성 종결자에 대한 항종결 효과를 촉진시킴을 나타낸 것이다. (A) Rho-의존성 종결 자리 rut(rut-표기된 직사각형)의 상류에 위치하는 RAPs (직사각형)의 항종결 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) rut를 함유하는 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) rut를 함유하는 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 BCM 존재 하 (최종 농도 8μg/ml까지 첨가함.), LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드).
도 8은 RAP ID #5713의 항종결 활성에 대한 저항성 (Challenging)을 나타낸 것이다. (A) 3개의 이종 종결자 T7t-tR2-rrnB (헤어핀으로 도식화하여 표기함. 서열번호 45 참조)의 신장 상류에 위치하는, RAPs (직사각형)의 항종결 효과를 테스트하기 위해 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. (B) 3개의 종결자 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) rrnB 종결자 상류에 위치하는, 직렬로 클로닝된 (직사각형, n=1, 2 또는 3) 다수의 RAP ID #5713 (서열번호 2)의 항종결 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. (D) 전술한 1X, 2X, 3X RAP ID #5713 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드).
도 9는 In vitro 전사 시스템에서 RAP ID #5713의 항종결 효과를 확인한 것이다. (A) in vitro에서 RAPs 항종결 활성을 테스트하기 위하여 사용된 주형을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 강력한 항시성 박테리아 RNAP 프로모터 T7A1의 위치를 나타낸다; TSS: 전사 개시 자리. RAP (직사각형)은 내인성 종결자 rrnB (헤어핀으로 도식화하여 표기함.)의 상류에 위치한다. (B) 대표적인 싱글 라운드 런-오프 전사체 어세이 (6% TBE-UREA 겔)를 나타낸 것이다. RAP ID #5713를 지닌 주형에 대하여 내인성 전사 종결자의 효능을 역 상보 서열 Rev #5713을 지닌 대조군 주형과 비교한 것이다. 내인성 종결의 산물은 화살표로 표기하였다. 상단의 선은 런-오프 산물을 나타낸다. (C) 종결 효능의 정량화는 (B)에서 기술한 라운드 런-오프 전사체 어세이를 사용하여 수행되었다. 종결 효능을 산출하기 위하여 내인성 종결의 강도를 총 강도 (내인성 종결+런-오프)로 나누었다. in vitro 테스트를 실시하였을 때, RAP ID #5713를 지닌 주형에 대한 RNAP의 종결 활성은 대조군 Rev #5713에 비해 적어도 2배 감소되었다. 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다.
도 10은 확인된 전사 촉진성 RAPs의 In silico 분석을 나타낸 것이다. (A) RAP ID #5713 (서열번호 2)의 2차 구조의 In silico 분석을 나타낸 것이다. RNA 접힙 예측 (접힘 알고리즘 및 기본 설정: "최소 자유 에너지 (MFE) 및 분할 함수", 분할 함수를 산출하고, 염기 쌍 형성 매트릭스에 최소 자유 에너지 (MFE) 구조를 추가하는 것을 의미함.). (B) 서열 분석의 서열 로고를 나타낸다 (Schneider TD, Stephens RM (1990). "Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences". Nucleic. Acids. Res. 18 (20): 6097-6100). 예측은 MEME Suite 4.10.0 : Motif 기반 시퀀스 분석 도구로 수행되었다. 보고된 활성화 RAP 서열은 하기의 매개변수와 함께 MEME 프로그램에 제출되었다.-"자리 분포"-서열 당 하나; " 주어진 가닥만 검색". 서열은 폭은 23nt이고, E-값은 8.8e-009이다.
도 11은 전사 종결을 유도하는 RAPs를 나타낸 것이다. (A) RAPs (직사각형)의 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. P" (삼각형)는 상이한 실험적 설정 (유도성/항시성 박테리아 RNAP 프로모터 또는 T7 프로모터)에 사용되는 다수의 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭산물 및 노턴 블롯 프로브의 위치는 하단에 묘사되었다 (렌즈형 막대; 각각 P1 및 P2로 명명된 노턴 블롯). (B)+(C) 상이한 RAPs 상류 (이들의 RAP IDs로 나타냄.)를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준이다. (B) RNAP 프로모터 유래 전사체; (C) 파지 T7 프로모터 유래 전사체. (D) 리포터 구조물을 함유하는 RAP로부터 유래된 전사체의 노턴 블롯 분석 결과이다. 상단의 숫자는 리포터 구조물로 RAP가 클로닝되었음을 나타낸다. 상단 패널 "P2": RAP의 프로브 상류와 혼성화한 결과. 화살표는 안정적인 전사체 ~150nt 길이를 나타낸다. 하단 패널: 로딩한 대조군 (변성 Urea PAGE로 염색된-SYBR).
도 12는 RAP는 Rho-의존성 전사 종결을 야기함을 나타낸 것이다. (A) 다양한 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 발현에 대한 BCM (Rho 저해제)의 효과이다. qRT-PCR 데이터는 최종 농도 24μg/ml로 20'에 대한 BCM 처리 후 (밝은 회색 막대), 및 처리 전 (어두운 회색 막대), 및 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 하단의 숫자는 리포터 구조물로 RAP가 클로닝되었음을 나타낸다. (B) 테스트된 RAPs (직사각형으로 나타냄)의 in vitro 전사를 위해 사용된 주형을 도식화한 것이다. (C)-(D) 대표적인 라운드 런-오프 전사체 어세이이다. 미리 형성된 신장 (enlongation) 복합체는 Rho 부존재 (레인 1, 4, 7, 10, 13), Rho 존재 (레인 2, 5, 8, 11, 14) 또는 Rho 및 NusG 존재 (레인 3, 6, 9, 12, 15) NTPs로 추적되었다. 15mut 서열은 음성 대조군으로 사용되었다. 회색 막대는 런-오프 산물 (상단 분획) 및 예비 전사 종결의 산물 (하단 분획)을 나타낸다.
도 13은 RAP ID #15는 자극에 반응하여 숙주 유전자 내 Rho-의존성 종결을 유도함을 나타낸 것이다. RAP ID #15 도메인의 상류 (밝은 막대) 및 하류 (어두운 맑대)의 내인성 nadD 전사체 수준을 측정하기 위하여 사용된 qRT-PCR 프라이머의 위치를 지닌 nadD 유전자 ORF를 도식한 도이다. (B) 다양한 조건 하에서, RAP ID #15의 상류 및 하류의 qRT-PCR 데이터, nadD mRNA 수준이다. 상류 mRNA 수준은 100%로 설정되었고, 하류 mRNA 수준은 상류 수준으로 정규화되었다.
도 14는 RNA 서열 분석을 나타낸 것이다. (A) 확인된 모든 RAPs 중 10%에 대한 MEME-예측 모티프이다. (B) 게놈 SELEX의 심층 서열분석 결과의 예시적인 스크린 화면이다. 매핑된 리드는 피크를 형성하고, 값은 두 개의 서로 다른 스케일 (주석 참고)를 사용하여 내인성 RAP ID #15에 대한 RAP ID #15 데이터를 나타내었다. 상단: RAP #15를 지닌 전체 nadD 유전자 (붉은 화살표로 도식화함), 하단: RAP #15 테스트된 서열을 지닌 nadD 유전자의 단편을 확대한 것이다.
도 15는 GFP 리포터 시스템에서 RAPs 저해 효과를 나타낸 것이다. (A) GFP 리포터 유전자의 상류에 위치하는 RAPs (직사각형)을 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. RBS는 리보솜 자리이다. (B)-(I) 상이한 RAPs (RAP IP 숫자로 표기됨)를 함유하는 GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). RAP-GFP 융합 단백질을 지닌 박테리아 밀도가 관찰되는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (라이트 모드, 하단 패널). (J) RAP ID #15 (서열번호 25)의 최소 서열에서의 돌연변이는 하향 조절 활성의 상실을 초래하였다. 변화된 뉴클레오타이드 (전이 돌연변이)는 밑줄 및 회색으로 표시되었다 (15 mut). (K) RAP ID #15 서열 (서열번호 25)은 상응하는 단백질 서열로 번역되었다. RAP ID #15는 니코티네이트-모노뉴클레오타이드 아데닐트렌스퍼라제 효소의 보존적 부위를 암호화하는 필수 nadD 부분 내에 위치한다. 흥미롭게, 도입된 돌연변이는 6 개의 보존된 촉매 아미노산 (밑줄) 중 2개를 암호화하는 서열 내에 있었다. (F) 베타-갈락토시다제 분석 결과이다. 상단: 리포터 유전자 lacZ의 상류에 위치하는 RAPs (직사각형)의 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 하단: 다른 RAP-lacZ 리포터를 지닌 대장균에 의해 발현된 베타-갈락토시다제 활성을 나타낸 것이다. 하단의 숫자는 리포터 구조물 내 삽입 (RAP 또는 돌연변이)를 나타낸다.
도 16은 전사체를 함유하는 RAP ID #15 (서열번호 25)의 3'RACE 분석을 나타낸다. (A) 3'RACE 절차를 도식화한 도이다. 5'-인산화된 압타머는 RAP-lacZ 리포터 구조물로 형질전환된 대장균으로부터 분리된 총 RNA의 3'말단에 연결시켰다. 수득득된 산물을 역전사시킨 후, 색상으로 표시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 뒤이은 서열 분석을 위하여, 겔에서 분리되고, 정제되고, 클로닝되었다. (B) 3'RACE에 의해 수득된 서열의 정렬: 예비 RAP-의존성 전사 종결의 산물을 나타내는 RAP-함유 전사체. (C) BCM 처리 전 및 후, RAP ID #15(서열번호 25)-함유 전사체에 대한 3'RACE 분석 결과이다. 2개의 생물학적 복제물로부터 얻은 3'RACE PCR 산물은 6.5% 폴리아크릴 겔에서 분리되었다. RAP ID #15의 짧은 전사체는 ST로 표지화하였다. 비특이적 산물에는 별표(*)가 표기되어 있다. 박테리아 배양에 BCM (Rho 억제자)의 첨가는 ST 전사체 (화살표로 표기)의 수준을 감소시킴과동시에, 보다 긴 RAP-함유 전사체의 현저한 축적을 유도한다.
도 17은 시스에서 RAPs의 저해는 RNAP의 일시적인 정지를 촉진함을 나타낸 것이다. (A) 상단 패널: in vitro 전사 어세이에 사용하기 위한 RAP-함유 주형을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 T7A1 프로모터를 나타낸다. 하단 패널: RAP #15 (레인 1-8) 및 역 상보 대조군 15rev (레인 9-16)을 지닌 주형을 활용한 대표적인 단일-라운드 런-오프 어세이 (용액) 분석 결과이다. 전사 개시 이후, 전사체를 10, 20, 30, 40, 60 및 >110초에 분석하였다. 전사체 내 RAP #15 도메인 및 15 rev 대조군 서열은 각각 어두운 회색 및 밝은 삼각형으로 나타내었다. 전사체의 축적은 RAP#15는 일시적인 정지를 촉진한다는 것을 제시한다 (레인 3-6 vs 레인 11-14). 종결과 대조적으로, 일시 정지는 짧은 전사체의 초기 축척을 초래한 뒤, 사라지므로, RNAP는 일시 정지를 회피하고, 계속적인 신장을 통해 전장 런-오프 전사체를 생산한다. 막대 모양의 사각형은 런-오프 산물을 나타낸다. (B) RAP #15의 위치를 매핑한 것이다. RNA 서열 레더(ladder)는 실시예에서 기술된 방법에 의해 제조되었다. 수득된 전사체는 6% 시퀀싱 겔 상에서 분리되었다. 40초의 추적 이후 중지된 전사 반응이 참조로 사용되었고, "40s"로 표지되었다. (C) (A)에 표시된 단일-라운드 런오프 전사체를 정량화한 것이다. 각각의 반응에 대하여, RNA-함유 전사체 량은 특정 시점 (0 내지 60 초)에 도달한 RAP (직사각형의 하단) 없이, 축적된 짧은 전사체의 전체 신호에 대한 겔에 대한 밴드 강도의 상대적인 값(%)에 기초하여 산출되었다.
도 18은 RAPs 저해에서 G-10Y-1G+1 모티프를 일시 중지하는 공통서열을 검색한 것이다. (A)센스 RAP에서 G-10Y-1G+1 모티프에 대한 농축 분석이다. 5'UTR, 3'UTR 유래 요소 및 유전자 내 카테고리는 센스 RAPs의 그룹을 포함한다. 빨간 선은 모티프를 함유한 센스 RAPs의 수를 나타낸다. 히스토그램은 RAPs의 무작위로 혼합된 10,000개의 집합에 대한 각각의 수를 보여준다. RAPs의 숫자, 길이, 및 가닥은 혼합하는 과정 동안 일정하게 유지되며, 게놈의 위치만 변화된다. 점선은 분포의 95% 분위를 보여주며, G-10Y-1G+1 모티프가 센스 RAP의 세트에 풍부하다는 것을 나타낸다. (B) 안티-센스 RAPs에서 G-10Y-1G+1 모티프에 대한 농축 분석결과를 나타낸다. 안티 센스 RAPs의 경우, G-10Y-1G+1 모티프의 농축물을 관찰할 수 없었다.
도 19는 테스트화된 저해성 RAP의 뉴클레오타이드의 분포를 나타낸다. 값은 일련의 서열 내에서 평균±표준 편차로 나타낸다.
도 20은 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머에 대한 확인된 공통 서열의 서열 로고를 나타낸 것이다. 예측은 MEME Suite 4.10.0: 모티프-기반 서열 분석 도구로 수행되었다. 보고된 활성화 RAP 서열은 하기의 매개 변수와 함께 MEME 프로그램에 제출되었다: "자리 분포"-서열 당 하나; " 주어진 가닥만 검색". E-값은 도면에 기술되어 있으며, 세부적인 사항은 실시예 2를 참조한다.
도 21은 트렌스에서 RAP #5713 과발현의 효과를 평가한 것이다. (A) 활성화 RAP (RAP ID #5713; 서열번호 2)가 트렌스에서의 전사에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험에 대한 설계를 나타낸 것이다. 대장균 세포는 다른 저항성 마커를 갖는 두 개의 양립성 플라스미드로 형질전환되었다 (원형으로 도식화). 첫 번째 플라스미드 (pMW)는 두 개의 잘 특성화된 종결자 중 하나를 갖는 GFP 리포터 유전자를 암호화한다: rho-의존성 rrnB (pWM_rrnB) 또는 rut 내인성 종결자 (pWM_rut). 두 번째 플라스미드는 박테리아 짧은 RNA (sRNA)의 형태로 RAP #5713의 과발현을 위한 아라비노스-유도성 프로모터를 운반한다: (B) 왼쪽 패널: sRNA 설계, RAP가 없는 sRNA (sRNA), RAP가 있는 sRNA (RAP_sRNA). DsrA, RprA, 및 이들의 혼성물의 지지체는 염기쌍 영역을 상응하는 RAP 서열로 대체함으로써, 3가지 상이한 RAP-함유 sRNAs (각각 RAP_sRNA1, RAP_sRNA2, 및 RAP_sRNA3)을 제조하는데 사용되었다. RAP-함유 sRNA를 검출 위한 프로브의 위치는 타원형 막대로 표시된다. 오른쪽 패널: 노던 블롯은 L-아라비노스(1%)로 유도한 RAP_sRNA (pBAD30-기반) 플라스미드로부터 과발현되었을 때, 안정한 전장 전사체를 함유하는 RAP #5713의 축적 (화살 표로 표시된 보다 두꺼운 밴드)을 보여준다. 로딩 대조군을 위하여, 5S RNA를 프로브화하였다. (C)-(D) 리포터 GFP 상류에 두개의 플라스미드: 내인성 rrnB 종결자 (C) 또는 rut 자리 (D)를 지닌 pWM로 공동 형질 전환된 결과이다. 또한 RAP-함유 sRNAdml 과발현을 위한 pBAD30-기반 RAP_sRNA 플라스미드이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다; TSS: 전사 개시 자리, RBS 리포솜 결합 자리. 중간 및 하부 패널: 전술한 GFP 리포터 플라스미드 및 RAP_sRNA 과발현을 위한 다른 플라스미드로 공동-형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (중간 패널-GFP 모드). 다른 균주들의 박테리아 밀도가 관찰되는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (라이트 모드, 하단 패널).
도 22는 대장균에서 전사를 조절하는, 전사 촉진성 RAPs (효모 및 인간 기원)에 대한 모티프의 GLAM2 생산을 나타낸 것이다.
도 23은 저해성 RAP는 Rho를 번역된 부위 내에서 작동시킬 수 있게 함을 나타낸 것이다. (A) 번역된 영역 내에서 RAP15 (서열번호 25)의 저해 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 상단 패널: 내인성 유전자 (nadD 유전자의 첫 168nt) 내 RAP15 (파란색 삼각형)은 GFP 리포터 단백질과 융합되었다. 하단 패널: RAP15-rev#15(녹색 삼각형)의 역 상보 서열의 구조물을 나타낸 것이다. "P" (회색 삼각형)는 프로모터의 위치를 나타낸다; TSS: 전사 개시 자리, RBS 리포솜 결합 자리. (B)-(C) 대장균 GFP 플레이트 어세이로서, 왼쪽 패널: nad (RAP#15) 또는 nad(rev#15)-GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 (B) 바이사이클로마이신이 없는, (C) 바이사이클로마이신 존재 하에서, LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (GFP 모드). 오른쪽 패널: 상응하는 플레이트는 번역 융합물을 지닌 균주들의 박테리아 밀도가 관찰되는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (라이트 모드). (D) 실시간 형광 검출을 통한 대장균 성장 실험 결과이다. nad(RAP 15)-GFP 또는 nad(rev #15)-GFP 리포터 구조물 (파란색 및 녹색으로 표시)로 형질전환된 세포를 LB 배지에서 성장시키면서, 세포 밀도(상단 패널) 및 GFP 세기 (하단패널)에 대한 측정을 실시하였다. 회색 수직 선은 성장기와 정지기를 분리한다. 각 지점에서, 값은 평균±분산, n=3으로 나타낸다. (E) RAP-매개 전사 종결 모델을 나타낸 것이다. (1) 선도 리보솜과 RNAP 사이의 연결은 초기 전사체 상에서, Rho가 로딩될 공간을 남기지 않았다 (S. Proshkin, A. R. Rahmouni, A. Mironov, E. Nudler, Science. 328, 504-8 (2010), B. M. Burmann et al., Science. 328, 501-4 (2010)); (2) RNAP 출구 채널 (RNAP exit channel) 유래 저해성 RAP는 RNAP와 상호작용하여, 리보솜의 일시정지 및 RNA 고리화를 유발한다; (3) 구조화되지 않은 RNA는 Rho가 로딩되고 전사를 종결시키는데 이용된다.
도 2는 GFP 리포터 시스템에서 RAP 활성화 효과에 관한 것이다 (박테리아성 RNA-중합효소(RNAP)에 의해 유도됨). (A) GFP 리포터 유전자 (GFP)의 상류에 위치하는 RNA-중합효소 결합성 압타머 (RAP; 직사각형)의 활성화 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 상이한 RAPs를 함유하는 GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). RAP-GFP 구조물로서, 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) 박테리아 RNAP에 의해 전사될 때, 상이한 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준 (이들의 RAP ID로 나타냄.)이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. RAP ID #5713 및 #14908은 RAP를 포함하지 않는 구조물에 비해, 전사체를 현저하게 상향 조절하였다. 대조군 구조물 #7523 및 #3468은 RAP를 포함하지 않는 구조물과 차이가 없었다. 값은 평균±표준 편차, n≥3; **p<0.01; *p<0.05; ns: 유의하지 않음 (T-테스트, 균등 분산 테스트)으로 나타내었다.
도 3은 GFP 리포터 시스템에서 RAP 활성화 효과에 관한 것이다 (파지 T7RNAP에 의해 유도됨). (A) GFP 리포터 유전자 (GFP)의 상류에 위치하는 RNA-중합효소 결합성 압타머 (RAP; 직사각형)의 활성화 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "T7P" (회색 삼각형)는 파지 T7 RNAP에 의해 인식된 파지 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 상이한 RAPs를 함유하는 GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). RAP-GFP 구조물로서, 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) 파지 T7 RNAP에 의해 전사될 때, 상이한 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준 (이들의 RAP ID로 나타냄.)이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. RAP ID #5713 및 #14908은 RAP를 포함하지 않는 구조물과 차이가 없었다. 값은 평균±표준 편차, n≥3; ns: 유의하지 않음 (T-테스트, 균등 분산 테스트)으로 나타내었다.
도 4는 RAPs 프로모터의 활성을 확인한 것이다. (A) RAP 프로모터 활성을 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 기존의 항시성 박테리아 프로모터 (삼각형)은 GFP 리포터 유전자의 상류 RAP (직사각형)으로 대체되었다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 항시성 박테리아 RNAP 프로모터 대신 다른 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 값은 평균±표준 편차, n≥2 으로 나타내었다.
도 5는 프로모터 상류의 RAP ID #5713 활성을 확인한 것이다. (A) 어세이에서 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 테스트된 RAP ID #5713 또는 대조군인 역 상보 서열 (RNA-표시된 직사각형)은 기존의 항시성 박테리아 프로모터의 상류에 위치되었다 (회색 삼각형). TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) 어세이에서 리포터 유전자 전사 수준이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 값은 평균±표준 편차, n≥3; **p<0.01; ns: 유의하지 않음(T-테스트, 균등 분산 테스트)으로 나타내었다.
도 6은 RAP ID #5713은 번역초과 (read-through) 내인성 종결자를 촉진시킴을 나타낸 것이다. (A) 내인성 종결자 "Term"의 상류에 위치하는 RAPs (빨간색 직사각형)의 항종결 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다 (헤어핀으로 도식화하여 표기함.). "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) RAP 서열 없이 내인성 종결자를 함유하지 않는 리포터 전사체 (No RAP_No term), RAP 서열 없이 rrnB 내인성 종결자를 지닌 리포터 전사체(No RAP_rrnB), RAP 서열 없이 T7t 내인성 종결자를 지닌 리포터 전사체 (No RAP_T7t)의 수준을 나타낸 것이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다. (C) 전술한 이종 내인성 종결자 (상단에 표시)를 함유하는 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (D) RAP ID #5713에 대한 이차 구조 예측이다- RNA 접힘 소프트웨어 (Vienna RNA Package)에 의해 수득된 내인성 종결자 구조물 (rrnB-상부 패널, T7t-하부 패널). RAP ID #5713의 서열은 내인성 종결자로부터 111nt 떨어져 있으며, 접힘에 영향을 미치지 않는다. (E) RAP ID #5713 존재 또는 부존재 하에서 rrnB 종결자를 지닌 리포터 유전자 전사체의 수준을 나타낸 것이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. RAP ID #5713은 RAP 구조물이 없는 경우에 비해, 번역 초과 rrnB 종결자를 최대 8배까지 활성화시킨다 (항종결자로서 RAP). 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다. (F) RAP ID #5713 존재 또는 부존재 하에 T7t 종결자를 지닌 리포터 유전자 전사체의 수준을 나타낸 것이다. qRT-PCR 데이터는 항존 gapA 수준으로 정규화되었다.. RAP ID #5713은 RAP 구조물이 없는 경우에 비해, 번역 초과 T7t 종결자를 최대 14배까지 활성화시킨다 (항종결자로서 RAP). 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다.
도 7은 RAP ID #5713은 Rho-의존성 종결자에 대한 항종결 효과를 촉진시킴을 나타낸 것이다. (A) Rho-의존성 종결 자리 rut(rut-표기된 직사각형)의 상류에 위치하는 RAPs (직사각형)의 항종결 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭의 위치는 아래에 묘사되어 있다 (렌즈형 막대). (B) rut를 함유하는 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) rut를 함유하는 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 BCM 존재 하 (최종 농도 8μg/ml까지 첨가함.), LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드).
도 8은 RAP ID #5713의 항종결 활성에 대한 저항성 (Challenging)을 나타낸 것이다. (A) 3개의 이종 종결자 T7t-tR2-rrnB (헤어핀으로 도식화하여 표기함. 서열번호 45 참조)의 신장 상류에 위치하는, RAPs (직사각형)의 항종결 효과를 테스트하기 위해 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. (B) 3개의 종결자 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드). (C) rrnB 종결자 상류에 위치하는, 직렬로 클로닝된 (직사각형, n=1, 2 또는 3) 다수의 RAP ID #5713 (서열번호 2)의 항종결 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. (D) 전술한 1X, 2X, 3X RAP ID #5713 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). 박테리아 밀도가 동일하게 보이는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (오른쪽 패널-라이트 모드).
도 9는 In vitro 전사 시스템에서 RAP ID #5713의 항종결 효과를 확인한 것이다. (A) in vitro에서 RAPs 항종결 활성을 테스트하기 위하여 사용된 주형을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 강력한 항시성 박테리아 RNAP 프로모터 T7A1의 위치를 나타낸다; TSS: 전사 개시 자리. RAP (직사각형)은 내인성 종결자 rrnB (헤어핀으로 도식화하여 표기함.)의 상류에 위치한다. (B) 대표적인 싱글 라운드 런-오프 전사체 어세이 (6% TBE-UREA 겔)를 나타낸 것이다. RAP ID #5713를 지닌 주형에 대하여 내인성 전사 종결자의 효능을 역 상보 서열 Rev #5713을 지닌 대조군 주형과 비교한 것이다. 내인성 종결의 산물은 화살표로 표기하였다. 상단의 선은 런-오프 산물을 나타낸다. (C) 종결 효능의 정량화는 (B)에서 기술한 라운드 런-오프 전사체 어세이를 사용하여 수행되었다. 종결 효능을 산출하기 위하여 내인성 종결의 강도를 총 강도 (내인성 종결+런-오프)로 나누었다. in vitro 테스트를 실시하였을 때, RAP ID #5713를 지닌 주형에 대한 RNAP의 종결 활성은 대조군 Rev #5713에 비해 적어도 2배 감소되었다. 값은 평균±표준 편차, n=3으로 나타내었다.
도 10은 확인된 전사 촉진성 RAPs의 In silico 분석을 나타낸 것이다. (A) RAP ID #5713 (서열번호 2)의 2차 구조의 In silico 분석을 나타낸 것이다. RNA 접힙 예측 (접힘 알고리즘 및 기본 설정: "최소 자유 에너지 (MFE) 및 분할 함수", 분할 함수를 산출하고, 염기 쌍 형성 매트릭스에 최소 자유 에너지 (MFE) 구조를 추가하는 것을 의미함.). (B) 서열 분석의 서열 로고를 나타낸다 (Schneider TD, Stephens RM (1990). "Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences". Nucleic. Acids. Res. 18 (20): 6097-6100). 예측은 MEME Suite 4.10.0 : Motif 기반 시퀀스 분석 도구로 수행되었다. 보고된 활성화 RAP 서열은 하기의 매개변수와 함께 MEME 프로그램에 제출되었다.-"자리 분포"-서열 당 하나; " 주어진 가닥만 검색". 서열은 폭은 23nt이고, E-값은 8.8e-009이다.
도 11은 전사 종결을 유도하는 RAPs를 나타낸 것이다. (A) RAPs (직사각형)의 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. P" (삼각형)는 상이한 실험적 설정 (유도성/항시성 박테리아 RNAP 프로모터 또는 T7 프로모터)에 사용되는 다수의 프로모터의 위치를 나타낸다. TSS: 전사 개시 자리; RBS: 리보솜 결합 자리. qRT-PCR 증폭산물 및 노턴 블롯 프로브의 위치는 하단에 묘사되었다 (렌즈형 막대; 각각 P1 및 P2로 명명된 노턴 블롯). (B)+(C) 상이한 RAPs 상류 (이들의 RAP IDs로 나타냄.)를 함유하는 리포터 유전자 전사체의 수준이다. (B) RNAP 프로모터 유래 전사체; (C) 파지 T7 프로모터 유래 전사체. (D) 리포터 구조물을 함유하는 RAP로부터 유래된 전사체의 노턴 블롯 분석 결과이다. 상단의 숫자는 리포터 구조물로 RAP가 클로닝되었음을 나타낸다. 상단 패널 "P2": RAP의 프로브 상류와 혼성화한 결과. 화살표는 안정적인 전사체 ~150nt 길이를 나타낸다. 하단 패널: 로딩한 대조군 (변성 Urea PAGE로 염색된-SYBR).
도 12는 RAP는 Rho-의존성 전사 종결을 야기함을 나타낸 것이다. (A) 다양한 RAPs를 함유하는 리포터 유전자 발현에 대한 BCM (Rho 저해제)의 효과이다. qRT-PCR 데이터는 최종 농도 24μg/ml로 20'에 대한 BCM 처리 후 (밝은 회색 막대), 및 처리 전 (어두운 회색 막대), 및 항존 gapA 수준으로 정규화되었다. 하단의 숫자는 리포터 구조물로 RAP가 클로닝되었음을 나타낸다. (B) 테스트된 RAPs (직사각형으로 나타냄)의 in vitro 전사를 위해 사용된 주형을 도식화한 것이다. (C)-(D) 대표적인 라운드 런-오프 전사체 어세이이다. 미리 형성된 신장 (enlongation) 복합체는 Rho 부존재 (레인 1, 4, 7, 10, 13), Rho 존재 (레인 2, 5, 8, 11, 14) 또는 Rho 및 NusG 존재 (레인 3, 6, 9, 12, 15) NTPs로 추적되었다. 15mut 서열은 음성 대조군으로 사용되었다. 회색 막대는 런-오프 산물 (상단 분획) 및 예비 전사 종결의 산물 (하단 분획)을 나타낸다.
도 13은 RAP ID #15는 자극에 반응하여 숙주 유전자 내 Rho-의존성 종결을 유도함을 나타낸 것이다. RAP ID #15 도메인의 상류 (밝은 막대) 및 하류 (어두운 맑대)의 내인성 nadD 전사체 수준을 측정하기 위하여 사용된 qRT-PCR 프라이머의 위치를 지닌 nadD 유전자 ORF를 도식한 도이다. (B) 다양한 조건 하에서, RAP ID #15의 상류 및 하류의 qRT-PCR 데이터, nadD mRNA 수준이다. 상류 mRNA 수준은 100%로 설정되었고, 하류 mRNA 수준은 상류 수준으로 정규화되었다.
도 14는 RNA 서열 분석을 나타낸 것이다. (A) 확인된 모든 RAPs 중 10%에 대한 MEME-예측 모티프이다. (B) 게놈 SELEX의 심층 서열분석 결과의 예시적인 스크린 화면이다. 매핑된 리드는 피크를 형성하고, 값은 두 개의 서로 다른 스케일 (주석 참고)를 사용하여 내인성 RAP ID #15에 대한 RAP ID #15 데이터를 나타내었다. 상단: RAP #15를 지닌 전체 nadD 유전자 (붉은 화살표로 도식화함), 하단: RAP #15 테스트된 서열을 지닌 nadD 유전자의 단편을 확대한 것이다.
도 15는 GFP 리포터 시스템에서 RAPs 저해 효과를 나타낸 것이다. (A) GFP 리포터 유전자의 상류에 위치하는 RAPs (직사각형)을 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다. RBS는 리보솜 자리이다. (B)-(I) 상이한 RAPs (RAP IP 숫자로 표기됨)를 함유하는 GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (왼쪽 패널-GFP 모드). RAP-GFP 융합 단백질을 지닌 박테리아 밀도가 관찰되는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (라이트 모드, 하단 패널). (J) RAP ID #15 (서열번호 25)의 최소 서열에서의 돌연변이는 하향 조절 활성의 상실을 초래하였다. 변화된 뉴클레오타이드 (전이 돌연변이)는 밑줄 및 회색으로 표시되었다 (15 mut). (K) RAP ID #15 서열 (서열번호 25)은 상응하는 단백질 서열로 번역되었다. RAP ID #15는 니코티네이트-모노뉴클레오타이드 아데닐트렌스퍼라제 효소의 보존적 부위를 암호화하는 필수 nadD 부분 내에 위치한다. 흥미롭게, 도입된 돌연변이는 6 개의 보존된 촉매 아미노산 (밑줄) 중 2개를 암호화하는 서열 내에 있었다. (F) 베타-갈락토시다제 분석 결과이다. 상단: 리포터 유전자 lacZ의 상류에 위치하는 RAPs (직사각형)의 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 하단: 다른 RAP-lacZ 리포터를 지닌 대장균에 의해 발현된 베타-갈락토시다제 활성을 나타낸 것이다. 하단의 숫자는 리포터 구조물 내 삽입 (RAP 또는 돌연변이)를 나타낸다.
도 16은 전사체를 함유하는 RAP ID #15 (서열번호 25)의 3'RACE 분석을 나타낸다. (A) 3'RACE 절차를 도식화한 도이다. 5'-인산화된 압타머는 RAP-lacZ 리포터 구조물로 형질전환된 대장균으로부터 분리된 총 RNA의 3'말단에 연결시켰다. 수득득된 산물을 역전사시킨 후, 색상으로 표시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 뒤이은 서열 분석을 위하여, 겔에서 분리되고, 정제되고, 클로닝되었다. (B) 3'RACE에 의해 수득된 서열의 정렬: 예비 RAP-의존성 전사 종결의 산물을 나타내는 RAP-함유 전사체. (C) BCM 처리 전 및 후, RAP ID #15(서열번호 25)-함유 전사체에 대한 3'RACE 분석 결과이다. 2개의 생물학적 복제물로부터 얻은 3'RACE PCR 산물은 6.5% 폴리아크릴 겔에서 분리되었다. RAP ID #15의 짧은 전사체는 ST로 표지화하였다. 비특이적 산물에는 별표(*)가 표기되어 있다. 박테리아 배양에 BCM (Rho 억제자)의 첨가는 ST 전사체 (화살표로 표기)의 수준을 감소시킴과동시에, 보다 긴 RAP-함유 전사체의 현저한 축적을 유도한다.
도 17은 시스에서 RAPs의 저해는 RNAP의 일시적인 정지를 촉진함을 나타낸 것이다. (A) 상단 패널: in vitro 전사 어세이에 사용하기 위한 RAP-함유 주형을 도식화한 도이다. "P" (회색 삼각형)는 T7A1 프로모터를 나타낸다. 하단 패널: RAP #15 (레인 1-8) 및 역 상보 대조군 15rev (레인 9-16)을 지닌 주형을 활용한 대표적인 단일-라운드 런-오프 어세이 (용액) 분석 결과이다. 전사 개시 이후, 전사체를 10, 20, 30, 40, 60 및 >110초에 분석하였다. 전사체 내 RAP #15 도메인 및 15 rev 대조군 서열은 각각 어두운 회색 및 밝은 삼각형으로 나타내었다. 전사체의 축적은 RAP#15는 일시적인 정지를 촉진한다는 것을 제시한다 (레인 3-6 vs 레인 11-14). 종결과 대조적으로, 일시 정지는 짧은 전사체의 초기 축척을 초래한 뒤, 사라지므로, RNAP는 일시 정지를 회피하고, 계속적인 신장을 통해 전장 런-오프 전사체를 생산한다. 막대 모양의 사각형은 런-오프 산물을 나타낸다. (B) RAP #15의 위치를 매핑한 것이다. RNA 서열 레더(ladder)는 실시예에서 기술된 방법에 의해 제조되었다. 수득된 전사체는 6% 시퀀싱 겔 상에서 분리되었다. 40초의 추적 이후 중지된 전사 반응이 참조로 사용되었고, "40s"로 표지되었다. (C) (A)에 표시된 단일-라운드 런오프 전사체를 정량화한 것이다. 각각의 반응에 대하여, RNA-함유 전사체 량은 특정 시점 (0 내지 60 초)에 도달한 RAP (직사각형의 하단) 없이, 축적된 짧은 전사체의 전체 신호에 대한 겔에 대한 밴드 강도의 상대적인 값(%)에 기초하여 산출되었다.
도 18은 RAPs 저해에서 G-10Y-1G+1 모티프를 일시 중지하는 공통서열을 검색한 것이다. (A)센스 RAP에서 G-10Y-1G+1 모티프에 대한 농축 분석이다. 5'UTR, 3'UTR 유래 요소 및 유전자 내 카테고리는 센스 RAPs의 그룹을 포함한다. 빨간 선은 모티프를 함유한 센스 RAPs의 수를 나타낸다. 히스토그램은 RAPs의 무작위로 혼합된 10,000개의 집합에 대한 각각의 수를 보여준다. RAPs의 숫자, 길이, 및 가닥은 혼합하는 과정 동안 일정하게 유지되며, 게놈의 위치만 변화된다. 점선은 분포의 95% 분위를 보여주며, G-10Y-1G+1 모티프가 센스 RAP의 세트에 풍부하다는 것을 나타낸다. (B) 안티-센스 RAPs에서 G-10Y-1G+1 모티프에 대한 농축 분석결과를 나타낸다. 안티 센스 RAPs의 경우, G-10Y-1G+1 모티프의 농축물을 관찰할 수 없었다.
도 19는 테스트화된 저해성 RAP의 뉴클레오타이드의 분포를 나타낸다. 값은 일련의 서열 내에서 평균±표준 편차로 나타낸다.
도 20은 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머에 대한 확인된 공통 서열의 서열 로고를 나타낸 것이다. 예측은 MEME Suite 4.10.0: 모티프-기반 서열 분석 도구로 수행되었다. 보고된 활성화 RAP 서열은 하기의 매개 변수와 함께 MEME 프로그램에 제출되었다: "자리 분포"-서열 당 하나; " 주어진 가닥만 검색". E-값은 도면에 기술되어 있으며, 세부적인 사항은 실시예 2를 참조한다.
도 21은 트렌스에서 RAP #5713 과발현의 효과를 평가한 것이다. (A) 활성화 RAP (RAP ID #5713; 서열번호 2)가 트렌스에서의 전사에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험에 대한 설계를 나타낸 것이다. 대장균 세포는 다른 저항성 마커를 갖는 두 개의 양립성 플라스미드로 형질전환되었다 (원형으로 도식화). 첫 번째 플라스미드 (pMW)는 두 개의 잘 특성화된 종결자 중 하나를 갖는 GFP 리포터 유전자를 암호화한다: rho-의존성 rrnB (pWM_rrnB) 또는 rut 내인성 종결자 (pWM_rut). 두 번째 플라스미드는 박테리아 짧은 RNA (sRNA)의 형태로 RAP #5713의 과발현을 위한 아라비노스-유도성 프로모터를 운반한다: (B) 왼쪽 패널: sRNA 설계, RAP가 없는 sRNA (sRNA), RAP가 있는 sRNA (RAP_sRNA). DsrA, RprA, 및 이들의 혼성물의 지지체는 염기쌍 영역을 상응하는 RAP 서열로 대체함으로써, 3가지 상이한 RAP-함유 sRNAs (각각 RAP_sRNA1, RAP_sRNA2, 및 RAP_sRNA3)을 제조하는데 사용되었다. RAP-함유 sRNA를 검출 위한 프로브의 위치는 타원형 막대로 표시된다. 오른쪽 패널: 노던 블롯은 L-아라비노스(1%)로 유도한 RAP_sRNA (pBAD30-기반) 플라스미드로부터 과발현되었을 때, 안정한 전장 전사체를 함유하는 RAP #5713의 축적 (화살 표로 표시된 보다 두꺼운 밴드)을 보여준다. 로딩 대조군을 위하여, 5S RNA를 프로브화하였다. (C)-(D) 리포터 GFP 상류에 두개의 플라스미드: 내인성 rrnB 종결자 (C) 또는 rut 자리 (D)를 지닌 pWM로 공동 형질 전환된 결과이다. 또한 RAP-함유 sRNAdml 과발현을 위한 pBAD30-기반 RAP_sRNA 플라스미드이다. "P" (회색 삼각형)는 항시성 박테리아 RNAP 프로모터의 위치를 나타낸다; TSS: 전사 개시 자리, RBS 리포솜 결합 자리. 중간 및 하부 패널: 전술한 GFP 리포터 플라스미드 및 RAP_sRNA 과발현을 위한 다른 플라스미드로 공동-형질전환된 대장균 세포를 LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (중간 패널-GFP 모드). 다른 균주들의 박테리아 밀도가 관찰되는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (라이트 모드, 하단 패널).
도 22는 대장균에서 전사를 조절하는, 전사 촉진성 RAPs (효모 및 인간 기원)에 대한 모티프의 GLAM2 생산을 나타낸 것이다.
도 23은 저해성 RAP는 Rho를 번역된 부위 내에서 작동시킬 수 있게 함을 나타낸 것이다. (A) 번역된 영역 내에서 RAP15 (서열번호 25)의 저해 효과를 테스트하기 위하여 사용된 리포터 구조물을 도식화한 도이다. 상단 패널: 내인성 유전자 (nadD 유전자의 첫 168nt) 내 RAP15 (파란색 삼각형)은 GFP 리포터 단백질과 융합되었다. 하단 패널: RAP15-rev#15(녹색 삼각형)의 역 상보 서열의 구조물을 나타낸 것이다. "P" (회색 삼각형)는 프로모터의 위치를 나타낸다; TSS: 전사 개시 자리, RBS 리포솜 결합 자리. (B)-(C) 대장균 GFP 플레이트 어세이로서, 왼쪽 패널: nad (RAP#15) 또는 nad(rev#15)-GFP 리포터 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 (B) 바이사이클로마이신이 없는, (C) 바이사이클로마이신 존재 하에서, LB 한천 플레이트 상에서 성장시킨 후, 형광 세기 측정을 수행하였다 (GFP 모드). 오른쪽 패널: 상응하는 플레이트는 번역 융합물을 지닌 균주들의 박테리아 밀도가 관찰되는 가시광선 하에서 동일한 플레이트를 포획하였다 (라이트 모드). (D) 실시간 형광 검출을 통한 대장균 성장 실험 결과이다. nad(RAP 15)-GFP 또는 nad(rev #15)-GFP 리포터 구조물 (파란색 및 녹색으로 표시)로 형질전환된 세포를 LB 배지에서 성장시키면서, 세포 밀도(상단 패널) 및 GFP 세기 (하단패널)에 대한 측정을 실시하였다. 회색 수직 선은 성장기와 정지기를 분리한다. 각 지점에서, 값은 평균±분산, n=3으로 나타낸다. (E) RAP-매개 전사 종결 모델을 나타낸 것이다. (1) 선도 리보솜과 RNAP 사이의 연결은 초기 전사체 상에서, Rho가 로딩될 공간을 남기지 않았다 (S. Proshkin, A. R. Rahmouni, A. Mironov, E. Nudler, Science. 328, 504-8 (2010), B. M. Burmann et al., Science. 328, 501-4 (2010)); (2) RNAP 출구 채널 (RNAP exit channel) 유래 저해성 RAP는 RNAP와 상호작용하여, 리보솜의 일시정지 및 RNA 고리화를 유발한다; (3) 구조화되지 않은 RNA는 Rho가 로딩되고 전사를 종결시키는데 이용된다.
본 발명의 하기의 실시예를 참조로 하여 설명할 것이며, 이는 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.
[실시예]
RNA-중합효소 상호작용 압타머 (RAP)의 일반적인 재료 및 방법 및 확인
심층 서열 분석
SELEX 사이클 7 유래의 RNA 라이브러리를 먼저 cDNA로 역전사시키고, 이를 고정된 부분을 갖는 프라이머를 사용하여 Phusion 중합효소 (New England Biolabs)로 16 사이클의 PCR에 의해 증폭시켰으며, 및 P. Parameswaran et al., Nucleic Acids Res. 35, e130 (2007) 및 N. Windbichler, F. von Pelchrzim, O. Mayer, E. Csaszar, R. Schroeder, RNA Biol. 5, 30-40 (2008)에 따른 다중화를 위한 바코드가 추가되었다. (fixFW: TATAGGGGAATTCGGAGCGGG (서열번호 45), fixRV_multi: TAGCCCGGGATCCTCGGGGCTG (시그마; 서열번호 46)). 라이브러리 준비 (어뎁터 연결 단계) 및 심층 서열 분석은 CSF NGS unit http://csf.ac.at/에서 수행되었다. SELEX는 쌍방향 76 염기쌍의 리드 (Read)를 대상으로, GAIIx에서 Solexa 기술을 사용하여, 다중화 및 서열 분석을 수행하였다. 리드는 trimmomatic 기기(A. M. Bolger, M. Lohse, B. Usadel, Bioinformatics. 30, 2114-20 (2014))를 사용하여 정돈 (trimmiong)되었고, 대장균 균주 K12 (아균주 MG16655, GenBank ID: U00096.3)의 게놈을 참조로, NextGenMap (F. J. Sedlazeck, P. Rescheneder, A. von Haeseler, Bioinformatics. 29, 2790-1 (2013))을 사용하여 매핑되었다. 리드 매핑은 SELEX 절차에 의해 도입되는 상당량의 서열 변이를 설명하기 위하여 20%까지의 서열 차이를 허용하는 허용적인 설정으로 수행되었다 (B. Zimmermann, I. Bilusic, C. Lorenz, R. Schroeder, Methods. 52, 125?32 (2010); and B. Zimmermann, T. Gesell, D. Chen, C. Lorenz, R. Schroeder, PLoS One, 5, e9169 (2010)). 이후, 매핑된 가닥은 20의 최소 매핑 품질로 필터링하여, 915,594 쌍의 말단 리드를 도출하였다. 상응하는 ORP 주석은 EcoGene 3.0 (J. Zhou, K. E. Rudd, Nucleic Acids Res. 41, D613-24 (2013))으로부터 다운로드되었고, 5' 및 3' UTR 주석 - RegulonDB (J. Zhou, K. E. Rudd, Nucleic Acids Res, 41, D613-24 (2013)) 유래를 사용하였다.
피크의 확인
K12 정렬 (alignments)로부터의 가닥 특이적 출현 신호를 추출하고, 신호- 맞춤 피크 검출방법 (a custom peak-finding method)을 상기 신호에 적용하여, 각각의 SELEX 사이클 내 풍부하게 발견되는 mRNA-단편 유래의 게놈 영역을 확인하였다. 간략하게, 본 발명에서의 피크-콜링 (peak-calling) 방법은 하기의 단계로 이루어진다: 1) 이동 가우시안 커널 (moving Gaussian Kernel)을 사용한 신호 평탄화 (smoothing), 2) 각 신호 위치에서 큐빅 허미트 보간법(cubic Hermite interpolation)에 의한 1차 도함수의 근사치 도출, 2) 파생 신호-변화 및 정의된 최소/최대 피크 면적에 기반한 피크 콜링 (최소 너비 : 10bp, 최대 너비 : 500bp, 최소 (평탄화된) 피크 높이 : T. L. Bailey et al., Nucleic Acids Res. 37, W202-8 (2009)).
간격 주석 및 분류
피크 간격은 주석된 ORFs 또는 UTRs와 중복되는지 여부에 따라 분류되었다. 존재하는 ORF 또는 UTR 주석의 반대편 가닥에 이들이 매핑될 때, 간격은 "안티센스"로서 주석 처리되었다. 게놈 위치에 따라 이들은 여러 카테고리로 분류되었다: 5"UTR (임의의 주석된 5'UTR 내에 상응하는 서열로 정렬), 3'UTR (임의의 주석된 3'UTR 내에 상응하는 서열로 정렬), 유전자 내 (센스) (5'- 및 3' UTR인 경우를 제외하고 주석된 유전자 내 상응하는 서열로 정렬), 안티센스 (주석된 유전의 반대편 가닥 상에 상응하는 서열로 정렬), 및 유전자 내 (센스) (주석된 유전자들 사이에 상응하는 서열).
전사체 내 RAPs의 위치를 특성화하기 위하여, 이들의 상대적인 위치는 주석화된 전사체 내에서 산출되었다 (도 1C-1D). 실험 데이터는 5'/3' UTR 영역에서 RAPs의 고갈 및 번역 개시 자리 주변에서 RAPs의 농축을 나타낸다. 또한, 전사체의 중간 지점 주변 및 안티센스 RAPs를 위한 2차 ORF 중간에서, RAPs에 대한 약간의 농축이 관찰되었다.
RAPs 내 모티프 검색
RAP 서열 내 모티프는 MEME 알고리즘을 사용하여 확인되었다 (T. L. Bailey et al., Nucleic Acids Res. 37, W202-8 (2009)). 기본 설정을 사용하여, (CAN)n 모티프가 확인된 총 15,724 RAPs 중 1010개에서, 29bp의 길이를 갖는 모티프가 확인되었다 (6.4%). 이러한 모티프를 함유하는 RAPs의 대다수 (89%)는 주석된 ORF에 대한 안티센스였다. 또 다른 모티프 발견 도구인, Homer (S. Heinz et al., Mol. Cell. 38, 576-89 (2010))에서는 15,724 RAPs 중 1909개에서 30bp 길이의 모티프로 진행되었을 때, (CAN)n 모티프가 확인되었다 (12.14%).
추가적으로, RAP는 공통의 RNA 중합효소 중지 서열을 위하여 분석되었다 (M. H. Larson et al., Science, 344, 1042-1047 (2014); 및 I. O. Vvedenskaya et al., Science, 344, 1285-1289 (2014)) 참고). 상기 G-10Y-1G+1 모티프는 4656개 (5439개 중)의 센스 및 8329개 (9956개 중)의 안티센스 RAPs에서 확인되었다. 모티프가 농축되었는지 여부를 평가하기 위하여, 몬테 카를로 시뮬레이션을 사용하여, 본 발명자들은 게놈 상에서 검출된 RAPs의 위치를 임의로 섞고 (RAP의 수, 길이, 및 방향을 일정하게 유지), 각 트레일 (trail)을 위한 임의의 세트에서 G-10Y-1G+ 1 모티프의 발생 횟수를 계산하였다. 센스 및 안티-센스 RAP에 대하여 10,000 트레일이 분리되어 수행됨으로써, RAPs가 무작위로 게놈 상에 분포한다고 가정하였을 때, 예상되는 발생 횟수의 분포를 수득하였다. 이러한 분포의 95% 분위는 센스 RAPs의 경우 4483개이고, 안티센스 RAPs의 경우 8532개이다. 이들의 값을 상기 모티프를 함유하는 RAP의 실제 수와 비교하였을 때, 센스 저해성 RAPs에서, G-10Y-1G+1 모티프가 과다하게 표현되었음을 알 수 있다.
박테리아 균주 및 성장 조건
두개의 대장균 균주가 사용되었다: DH5α [F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 γ-thi-1 gyrA96 relA1] 및 BL21(DE3) pLysS [F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cmr]. 세포를 37℃, 및 환기 (200rpm 교반) 조건의 LB 배지에서 지수기 (OD600=0.5-0.6) 또는 정지기 (OD600=1.6-1.8)로 성장시켰다. 필요한 경우, 예를 들어, 플라스미드 선별을 위하여, 배지에 암피실린(100㎍/ml) 또는 카나마이신(30㎍/ml)를 보충하였다. pBAD 리포터를 지닌 세포는 0.2% L-아가로오스 (시그마)로 유도되었다. pET 리포터를 지닌 B21 세포 (파지 T7 RNA-중합효소에 의해 전사됨)은 1mM IPTG로 유도되었다. 액체 배양에 바이사이크로마이신 (BCM)이 처리된 실험에서, 배양물은 우선 초기 정지기 (OD600=0.4)로 성장되었다. 플레이트 상에 바이사이클로마이신 (BCM)이 처리된 실험에서, 세포는 BCM이 보충된 LB-아가 플레이트 상에 성장시켜 최종 농도 8㎍/ml의 농도에 이르도록 하였다 (저농도는 세포 성장을 가능하게 함). 스트레스 유도에 의한 성장 실험에서, 박테리아 세포는 수득 전에 20분 동안 배양되었다 (달리 언급되지 않은 경우).
단백질 리포터 어세이
RAP-lacZ 융합물의 발현을 모니터링하기 위하여, 대장균 배양물은 교반시키면서, 37℃, LB 배지에서 밤새도록 성장시켰고, 이후, 새로운 배양물을 새로운 배지 내 1:1000으로 희석하여 시작하였다. 배양물은 지수기 (OD600=0.5-0.6)로 성장되었다. β-갈락토시다제 활성을 측정하기 위하여, 상응하는 β-갈락토시다제 어세이를 문헌에 개시된 바에 따라 3회 수행하였다 (H. Miller, Experiments in molecular genetics (1972); http://books.google.at/books/about/Experiments_in_molecular_genetics.html&id=PtVpAAAAMAAJ&pgis=1).
RAP-GFP 융합으로 형질전환된 대장균에서 GFP 형광을 모니터링하기 위하여, 세포는 카나마이신(30㎍/ml이 보충된 LB-한천 플레이트 상에 획선도말하고, 37℃, 16-20시간 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 여기 파장 460nm의 GFP 모드로 촬영하였다 (Fusion Fx7 Imager, PEQlab, Germany). 세포 밀도를 비교하기 위하여, 플레이트는 여기 파장 510nm에서 가시 광선 모드로 이미지화되었다 (Fusion Fx7 Imager, PEQlab, Germany).
RNA 분리
총 RNA의 분리는 핫 페놀 방법을 사용하여 수행되었다. 특정 OD600 (지수 기)로 성장한 박테리아 세포를 수집하고, 여기에 정지 용액 (95% 에탄올, 5% 페놀)을 8:1의 비율로 혼합한 후, 4℃, 3000xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 수득된 박테리아 펠릿은 액체 질소에서 동결되었다. 펠렛은 용해 완충액 (10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 0.5mg/ml 리소자임)에 SDS를 첨가하여 재현탁시키고, 최종 농도 0.1%에 이르도록 하였다. 수득된 용해물은 64℃에서 2분 동안 인큐베이션시킨 후, NaOAc (pH 5.2)를 첨가하여 최종 농도 0.1M에 이르도록 하였다. 이후, 동일한 부피의 페놀 (물-포화된, pH 약 4.0, AppliChem GmbH)이 첨가되고, 서서히 혼합한 뒤, 6-8회 뒤집어가며 64℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 샘플을 얼음으로 냉각시키고, 16,100×g (4℃, 10 분)으로 원심분리하였다. 수성 상에 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1, pH 4.0, AppliChem GmbH)이 첨가되고, 상 분리 겔 헤비 튜브(5 prime)에서 16,100×g (4℃)로 5분 동안 원심분리되었다. 이후, 수성 상은 클로로포름/이소아밀 알코올 (24:1)과 혼합된 후, 16,100×g (4℃)로 5분간 원심분리되었다. RNA는 수성 상으로부터 에탄올-침전시켰다 (3 부피 에탄올, 3M 아세트산 나트륨의 1/10 부피, 0.5M EDTA의 1/100 부피). DNA 잔유물을 제거하기 위하여, 전체 RNA는 제조사의 지침에 따라 Turbo DNase I (Roche)로 처리되었다. RNA의 보존 (integrity)은 아가로오스 겔 상에서 확인되었다.
qRT-PCR
전사체의 수준을 측정하기 위하여, 1-2㎍의 총 DNA-free RNA는 무작위 올리고-9-mers(시그마) 및 SuperScript™ II 역전사 효소 (Life Technologies)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사되었다. 표적 서열에 따라, cDNA는 이하 기술된 프라이머로 증폭시켰다 (표 4 참고). 각각의 경우, 실시간 PCR 증폭 효율은 이전에 기술한 바와 같이 한 색상 검출 시스템 내 표준 곡선 방법을 사용하여 측정하였다 (L. Jolla, 87-112 (2004)). qPCR은 제조사에서 제시한 바와 같이, Medibena로부터 Eppendorf Mastercycler® RealPlex2 and 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (no ROX)를 사용하여 수행되었다. gapA 유전자는 내부 표준화에 사용되었다.
노던 블럿 분석
노던 블럿팅 (NB)를 위하여, 10㎍의 총 RNA는 1X TBE에서 변성된 8% 폴리아크릴아마이드-TBE-요소 (8M) 겔을 사용한 겔 전기영동에 의해 분리되었다. RNA는 2X RNA 로드 염료 (Fermentas)에서 70℃ (10분 동안) 변성되고, 뒤이어 아이스 상에 옮겨진 뒤, 겔 상에 로딩되었다. 겔-분리된 RNA는 0.5X TBE에서 1시간 동안 12V의 습식 전자-블롯팅에 의해 HybondXL 맴브레인 (Ambion)으로 옮겨졌다. 멤브레인을 UV(150mJ/cm2)로 가교시키고, 제조사의 지침에 따라 ULTRAhyb®-올리고 혼성화 완충액 (Ambion) 내에서 5'-말단 γ32P-표지된 DNA-올리고뉴클레오타이드 프로브로 탐지되었다. DNA 표지 반응은 제조사의 지침에 따라 TP PNK (New England Biolabs)를 사용하여 수행되었다.
3'RACE
전사체의 3'말단을 정확하게 결정하기 위하여, 제조사의 지침에 따라 16℃에서 밤새 ssRNA (New England Biolabs)에 대하여, 리가아제 1을 사용하여 550 pmol의 5'-인산화된 RNA 압타머 (압타머 서열-5’P -AAUGGACUCGUAUCACACCCGACAA-idT (서열번호 61))를 6㎍의 총 RNA에 연결시켰다. 반응물은 동일한 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1 pH 약 4.0, AppliChem GmbH)과 혼합하고, 이를 상 분리 겔 헤비 튜브 (5prime)에서 5분 동안 16,100 Xg로 원심분리하였다. 이후, 수성 상은 클로로포름/이소아밀 알코올 (24:1)과 혼합되었고, 뒤이서 5분 동안 16,100 Xg로 원심분리하였다 (4℃). 핵산은 수성 상으로부터 에탄올-침전되었고 (에탄올 3부, 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨, 1/100 부피의 0.5M EDTA), SuperScript™ II 역전사효소 (Life Technologies)를 사용하여 RT 처리한 뒤, 제조사의 지침에 따라 RNaseH (Promega)을 처리하였다. cDNA는 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소 (NEX)로, 리포터 구조물 상류 RAP에 대한 정방향 프라이머 (5’-TTGGGCTAGAATTCTGTTGTTA-3’ (서열번호 62)), 연결된 어뎁터에 대한 역방향 프라이머 (5- TTGTCGGGTGTGATACGAGTCCATT-3’(서열번호 63))를 사용하여 증폭하였다. 수득한 PCR-증폭 라이브러리는 분리되었고, 6% PAA/1xTBE 겔에서 겔 전기 영동으로 검사되었다. 수득된 밴드는 겔-정제도었고, pGEM-T Easy Vector System을 사용하여 TA-복제되었으며 (Promega, 제조사의 지침에 따름), 생어 시퀀싱 (Sanger sequencing)을 실시하였다. ClustalW2 은 정렬을 만드는데 사용되었다.
in vitro 전사
in vitro 전사 실험을 위한 강력한 T7A1 프로모터 (서열번호 58)와 융합된 DNA 주형은, Phusion 중합효소 (New England Biolabs)로 각기 다른 RAP 및 적절한 합성 프라이머 (Sigma Aldrich)를 지닌 리포터 프라이머를 사용하여 제조되었다. 전사 반응는 용액에서 수행되었다. 야생형 대장균 His RNAP (Evgeny Nudler Lab) 및 야생형 대장균 RNAP 전구체 (Affymetrix)는 어세이에 사용되었다. 전사 개시 복합체를 평가하기 위하여, 2-6 pmol의 His6 RNAP는 1-2 pmol의 DNA 주형과, 20μl의 전사 완충액 100 (10 mM MgCl2, 40 mM Tris-HCl, pH 7.9, 100 mM NaCl)에서 혼합되었고 (Affymetrix로부터의 RNAP의 경우, 제조사에서 제시한 바와 같이, 복합체는 동일한 양의 효소를 20mM NaCl, 20mM MgCl2, 14mM 2-머캅토에탄올, 및 0.1 mM EDTA을 함유하는 20mM Tris·HCl pH 8.0에서 평가되었다.), 37℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 이후, AUC RNA 프라이머 (Dharmacon)를 GTP (25 μM) 및 ATP (25 μM)와 함께 10μM까지 첨가하였고, 뒤이어 37℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 다음으로, [α-32P]-CTP (800 Ci/mmol, 2μl, Hartmann Analytic)를 추가로 2분 동안 첨가하였다. RNA 분해를 최소화하기 위하여, 10 U의 RNasin® 리보뉴클레아제 저해제(Promega)가 반응물에 첨가되었다. Rho 및 NusG와의 반응을 위하여, 정제된 전사 인자는 지시된 경우, 전사 혼합물에 최대 0.5mM의 농도로 첨가한 다음, 뒤이어 37℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 추적 반응 (Chasing reaction)은 4개의 모든 NTPs로 최종농도 10-50μM의 농도로 첨가하여 수행하였다. 재-개시를 방지하기 위하여, 리팜피신 (Sigma)를 현 단계에서 최종 농도 10μM까지 첨가하였다. 지시된 시점에서, 상기 추적 반응에서의 분취량 (aliquot)을 100 mM EDTA, 8M UREA(요소), 0.025% 자일렌티아놀 및 0.025% 브로모페놀 블루를 포함하는, 3X 정지 용액으로 퀀칭하였다. 산물은 6% 변성된 TBE-PAGE (8M 요소)로 분리되었다. 전사체 내 RAP 서열 매핑은 RAP-함유 주형 및 4개의 3'dNTPs (3′dGTP, 3′dATP, 3′dUTP 또는 3′dCTP) 중 하나와 혼합된 25μM의 NTPs를 3:1의 비율로 혼합된 4 종류의 다른 전사 반응을 10분간 진행하여, 전사시킴으로써 수행되었다.
리포터 구조물 pWM3110의 제작
상기 어세이는 본 발명자들에 의해 제작된 플라스미드 pWM3110에 기초한 리포터 시스템을 사용하여 수행되었다. 이러한 구조물은 잘-특성화된 GFP-함유 플라스미드 pWM1015 (W. G. Miller et al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 5426?36 (2000), 및 C. H. Eggers et al., Mol. Microbiol. 43, 281-95 (2002)에 적용하여 수득되었다. pWM1015는 박테리아 항시성 프로모터 (서열번호 66)의 제어 하에, 카나마이신 저항성 유전자 (KanR) 및 녹색 형광 유전자 (GFP)를 암호화하는 유전자를 함유한다. 5'UTR의 성공적인 복제를 위한 고유한 Xho Ⅰ 및 SacⅠ제한 효소 인식 자리를 도입하기 위하여, pWM1015는 GFP 유전자의 5'UTR에 추가적인 108nt이 연장되도록 조정하였다. 이러한 목적을 위하여, 서열번호 64의 삽입물은 본연의 pWM1015 플라스미드 내 EcoRⅠ사이에 복제되었다. pWM1015는 제조사의 지침에 따라 EcoRI (Thermo Scientific)를 사용하여 소화 (선형화)되었다. 합성적으로 생산된 서열번호 64의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 (Sigma Aldrich)는 제조사의 지침에 따라 EcoR Ⅰ 및 Apo Ⅰ으로 소화되었고, 그 결과, 적절한 구조물의 배향을 가능하게 하는 EcoRⅠ 돌출부(overhangs)와 양립 가능한 돌출부를 제조하였다. 소화된 산물은 T4 DNA 리가아제 (New England Biolabs)로 제조사의 지침에 따라 연결되었다. 정확한 그리고 단일 삽입은 박테리아 콜로니 PCR 및 후속 생어 시퀀싱에 의해 확인되었다. 생성된 pWM3110의 서열은 서열번호 65로 주어진다.
고유한 Xho Ⅰ 및 SacⅠ제한 자리를 사용하여, RNA 중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 상이한 서열을 pWM3110에 클로닝하였다. 합성적으로 제조된 (Sigma Aldrich) 이중 가닥 서열번호 68 (rut Rho 종결 삽입체를 함유), 서열번호 69 (rrnB 내인성 종결 삽입체를 함유), 서열번호 70 (T7t 내인성 종결 삽입체를 함유), 또한, 서열번호 71 (3개의 T7t-tR2-rrnB 내인성 종결자의 조합을 함유)는 제조사의 지침에 따라, SacⅠ(각 구조물의 5' 말단의 자리), 및 BsiHKA Ⅰ (ALw21 Ⅰ) (3' 말단 상의 SacⅠ양립가능성 제한 자리는 최종 구조물 내 고유의 제한 자리로서, SacⅠ의 보존을 가능하게 함.)을 생산하였다. 그 후, 소화된 그리고 정제된 구조물은 SacⅠ-선형화된 pWM3310에 T4 DNA 리가아제의 연결에 의해 클로닝되었다. 정확한 그리고 단일 삽입은 박테리아 콜로니 PCR 및 후속 생어 시퀀싱에 의해 확인되었다. 구조물은 구조물에 포함된 종결자 서열에 따라, 각각 pWM3110_rut, pWM3110_rrnB, pWM3110_T7t, 및 pWM3110_triple 종결자로 명명되었다.
리포터 유전자로서 lacZ를 적용하는 어세이를 위하여, pBAD24 유도물을 제조하였다. pBAD24는 박테리아 아가로오스-유도성 프로모터 (서열번호 67) 및 엠피실린 저항성 유전자 (Amp R )(L. M. Guzman et al., 177 (1995), 참조로서 인용됨)을 포함한다. pBAD24의 본래의 리보솜 결합부위는 NheI /EcoRI에 의한 제한에 의하여 다중 클로닝 자리로부터 제거되었고, DNA 중합효소 I 대 단편 처리 (Klenow), 및 비점착 (blunt) 연결 (재순환)에 의해 pBAD13을 수득하였다. 새로운 +70 RBS (서열번호 80)은 XbaI/PstI 제한 자리 및 lacZ 유전자 (서열번호 79) 사이, pBAD13의 PstI/HindIII 제한 자리 사이에 복제되어 pBAD13_lacZ를 수득하였다.
상이한 RNA-중합효소 결합성 압타머는 pBAD13_lacZ의 EcoRI/NcoI 제한 자리 사이에 복제하여 pB13_RAP_lacZ를 수득하였다. 관찰되는 효과가 초기 RAP 3'말단-측면(flanking) 서열에 의한 영향을 받지 않도록 하기 위하여, 추가 99nt 삽입물 (cobC-유래, 서열번호 80이 함유된 비-RAP)이 NcoI / XbaI 제한 자리에 삽입되었다. 생성된 플라스미드는 pB13_RAP_+99_lacZ이다. 관찰되는 효과가 초기 RAP 5'말단-측면 서열에 의한 영향을 받지 않도록 하기 위하여, 개별적인 RAP 서열은 RAP의 5'말단에서 추가 49nt 및 EcoRI/NcoI 제한 자리를 사용한 RAP-삽입물을 함유하는 구조물 (서열번호 81)로 교환되었고, 그 결과 pB13_+49RAP_+99_lacZ를 생산하였다.
T7 프로모터로부터의 발현에 대한 효과를 확인하기 위하여, 추가적인 구조물을 제작하였다. 이를 위하여, 본래의 RBS는 Xba/NdeI 제한에 의해 pET21a (Novagen)의 MSC로부터 제거되었고, 이후, DNA 중합효소 Ⅰ 대 단편 (Klenow) 처리 및 비점착 말단 연결 (재순환)을 수행하였다. 생성된 구조물은 pET21_minRBS로 명명하였다. RAPs는 주형으로서 pB13_RAP_+99_lacZ 유래 전사 시작 자리로 부터 추가적인 5nt를 함유하는 전장 RAP_+99_lacZ를, 프라이머로서 pET21_Insert_FW_NheI (서열번호 82) 및 pET21_Insert_RV_HindIII (서열번호 83)를 사용한 증폭에 의해, pET21_minRBS로 클로닝 (복제)되었다. 증폭 산물은 NheI / HindIII 제한 자리를 사용하여 pET21_minRBS에 클로닝되었다.
실험예 1: 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머
전사 활성을 촉진시키는 RAP의 확인
확인된 RAPS의 전사에 대한 잠재적인 효과를 모니터링하기 위하여, GFP 리포터 pWM3110 기반 플라스미드를 사용하여 테스트를 실시하였다. 몇몇 대표적인 RAPs는 리포터 구조물의 5'UTR에 복제되었다 (TSS의 하류 거리-72nt, GFP's RBS의 상류 거리-56nt). 수득된 클론은 대장균 GFP 플레이트 어세이에서 실험하여, 각 경우 합성된 형광 단백질의 양을 측정하였다. 이러한 접근법에 의해, 수많은 RAPs가 표 1에 목록화된 바와 같이 확인될 수 있었다 - 예를 들어 RAP ID #5713 (서열번호 2), 및 #14908 (서열번호 4) -새로운 활성 모드: 이들은 생산된 GFP의 양이 현저하게 증가되었다 (도 2B). 본 발명자들은 또한, qRT-PCT를 수행하여 전장 길이의 GFP 전사체의 양을 직접적으로 측정하였고, 단백질 어세이 결과를 확인하였다: 예를 들어, RAPs #5713 및 #14908은 각각 전사 수준을 2배 및 1.5배 이상 증가시켰다. 본 발명자들은 활성 RAPs로서, 적어도 20% 이상 GFP의 전사/번역을 증가시킨 RAP를 분류하였다 (비-RAP 대조군과 비교). 상응하는 서열은 표 1에 제시되어 있다.
특이성을 테스트하기 위하여, 동일한 RAP-함유하는 리포터 구조물은 파지 T7 RNA 중합효소를 사용하여 파지 T7 프로모터로부터 발현되었다 (도 3A). 이 경우, 두 단백질 모두 (도 3B) 또는 RNA 수준에서 상향 조절이 검출되지 않았다. 비-RAP 대조군과 비교하여 발현수준의 차이가 없기 때문에, 본 발명자들은 RAPs의 활성화 활성은 박테리아 RNA 중합효소에 특이적이며, 파지로부터 RNAP에 대해서는 특이적이지 않다고 결론을 내렸다.
관찰된 전사 활성이 RAP-암호화 DNA 서열에 대한 촉진된 프로모터-RNAP 보급에 의해 설명될 수 있는지 확인하기 위하여 대조 실험을 수행하였다. 이를 배제하기 위하여, 활성화 RAPs는 프로모터 활성 어세이에서 확인되었다. RAPs는 리포터 구조에서 개별적으로 클로닝되어 항시적 프로모터를 대체하였다 (도 4A). 이들 구조물로부터의 전사 효율은 qRT-PCR에 의해 평가되었다. 이러한 측정 결과 (도 4B)는 활성화 RAPs가 프로모터 활성을 나타내지 않는다는 것을 시사하였다.
또한, 비-전사 영역에서 프로모터의 상류에 위치할 때, 활성화 RAP#5713이 전사를 활성화하는지 여부를 확인하였다. 전사 수준의 차이는 qRT-PCR에 의해서는 관찰되지 않았다 (도 5B). 종합하면, 실험 데이터는, 본 발명에 따른 RNA-중합효소 결합성 압타머는 프로모터의 상류로부터 전사될 때, 전사를 상향 조절할 수 있음을 보여준다.
전사의 항종결을 촉진하는 RAPs의 동정
추가적인 특성을 규명하기 위하여, 종결을 억제하는 활성화 RAPs의 능력을 조사하였다. 종결 신호의 두가지 유형이 박테리아에서 기술되어 왔다: 인자-비의존성 (내인성) 및 인자 의존성 (Rho-의존성) (Santangelo and Artsimovitch, 2011).
우선, 내인성 종결 신호의 초과 번역(read-through)의 효율에 대한 활성화 RAPs의 효과가 테스트되었다. 두 가지의 상이한 이종 RNAP 내인성 종결자가 RAP 신호 및 GFP 리포터 사이에 클로닝되었다 (도 6A). RAP 부재하에서, 선택된 잘-특성화된 내인성 종결자 rrnB 및 T7t는 GFP 전사체 수준을 내인성 종결자가 없는 경우에 비해 각각 18% 및 13% 감소시켰다 (도 6B). 놀랍게도 테스트화된 활성화 RAPs는 강렬하게 종결자의 초과 번역을 증가시켰다. 도 6C에 나타낸 바와 같이, RAP#5713 부재 하에서, GFP 발현은 종결자 (rrnB 및 T7t 종결자)의 존재로 인해 낮았으나, RAP#5713이 종결 헤어핀의 상류에 존재하는 경우, RNA 중합효소는 더 이상 효율적으로 종결되지 않았다. RAP #5713의 역 상보체 (Rec #5713으로 표기)는 전사에 대한 활성화/종결 방지 효과가 없었고, 이는 대조군 서열로 사용되었다. qRT-PCR에 의한 정확한 정량화는 항종결자로서 작용하는 RAP #5713을 확인하였고, 비 RAP 대조군에 비해 8-14배의 효율로 인자에 의한 종결자의 초과 번역 효율을 증가시켰다 (도 6E-6F). 중요하게도, RAP #5713 서열은 종결 헤어핀의 폴딩을 방해하지 않는다 (도 6D).
Rho-의존성 종결을 억제하는 RAPs
활성화 RAPs는 Rho-의존성 종결 신호의 초과 번역을 활성화시킬 수 있는 신호로서 테스트되었다. Rho-의존성 종결은 Rho와 Rho 활용 (rut) 자리라고 명명되는 특정 신생 RNA 지역과의 결합을 필요로 한다. 잘-특성화된 rut 자리 중 하나 (Krebs et al., “Lewin's GENES X”, 2009)가 RAP #5713과 리포터 유전자 GFP 사이에 삽입되었다 (도 7A). RAP #5713 부재 하에서, 리포터 GFP는 낮은 수준으로 발현되었다. 그러나, rut 자리의 상류에 RAP#5713의 삽입은 GFP 발현을 증가시켰다 (도 7B). 이러한 결과는 qRT-PCR에 의한 전사체 수준 특정을 통해 추가적으로 확인되었다 (미도시). 또한, Rho-의존성을 조절하기 위하여, 바이사이클로마이신(BCM)-Rho를 저해하는 매우 특수한 항생제가 사용되었다 (Zwiefka et al., 1993). BCM의 존재 하에서 GFP는 RAP 없이 리포터로부터 효과적으로 발현되었고; BCM의 존재 하에서 RAP #5713은 더 이상 전사를 활성화하지 않고, 발현수준은 변화하지 않았다 (도 7C). 이는 RAP #5713이 Rho-의존성 종결을 방해함을 명백하게 보여준다.
RAP #5713 (서열번호 2)의 항종결 가능성은 GFP의 상류에 일렬로 3개의 이종 내인성 종결자를 삽입하여 추가로 분석하였다 (도 8A; 서열번호 45 참조). 상기 이전 실험에서와 같이, RAP #5713의 존재는 비-RAP 대조군에 비해 GFP의 높은 발현 수준을 확인하였다. 일렬로 다양한 RAP #5713 서열의 삽입 (도 8C)은 항종결 활성을 비례하여 증가시키고, GFP 발현을 증가시켰다 (도 8D). 이는 특히, 생명 공학 부분에서 흥미를 일으키는 활성화/항종결 RAPs로의 용도로 제조될 수 있다. 이는 RAP의 활성 모드는 특정 종결자에 대하여 독립적이라는 것을 보여준다.
in vitro 전사 어세이를 통한 RAP 항종결 활성의 증명
RAP-매개 전사의 항종결 기작에 대한 이해를 얻고자, 직접적인 RAP #5713-RNAP 상호작용이 각각 효율적인 항종결 및 전사의 향상에 충분한 것인지를 시험하기 위하여, in vitro 전사 연구를 수행하였다. 내인성 종결자 rrnB를 지닌 주형이 본 연구를 위하여 사용되었다. RAP #5713 또는 대조군 Rev #5713 (서열, RAP#5713에 대한 역 상보체)은 종결자의 상류에 위치시켰다 (도 9A). 전사는 정제된 대장균 RNAP만으로 수행되었고, 어떠한 추가적인 전사 인자도 처리되지 않았다. RAP#5713-함유 주형으로부터의 단일 라운드 전사는 대조군 구조물과 비교할 때, 내인성 종결 산물의 양은 적고, 런-오프 산물의 수준은 높았다 (도 9B). 이러한 데이터는 RAP와 RNAP간 직접적인 상호작용에 의해 RAP #5713의 항종결 활성이 향상되는 것을 증명한다.
활성화 RAPs에 대한 대규모 스크리닝
7번째 사이클 SELEX 풀에서, 활성화 RAP의 빈도에 대한 이해를 얻고자, 본 발명자들은 도 2A에 나타낸 바와 같이 리포터 구조물 내로 클로닝되었다. 총 RNA 풀의 심층적인 스크리닝으로부터, 표 1에 요약된 바와 같이, 전사 촉진성 RAPs가 리포터 구조물에 복제될 때 전사를 강화시키는 것이 관찰되었다. 종합하면, 제시된 데이터는 RAPs의 높은 전사 촉진성 잠재력을 보여주고, 모든 유형의 박테리아 RNAP 종결 신호 및 증가된 단백질의 발현을 통해서 매우 효율적인 초과 번역을 가능하게 한다.
확인된 전사 촉진성 RAPs의 구조 및 돌연변이 분석
전사 촉진성 RAPs 서열의 공통적인 특징을 확인하기 위하여, 2차 구조 분석이 수행되었다.
공지된 항종결 파지 서열과 대조적으로, 본 발명에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 (a) 보다 짧고, (b) 특수한 소프트웨어에 의한 예측에 따를 때, 복잡한 2차 구조를 위한 특별한 요구 조건을 갖지 않았다 (Vienna RNA Package, RNAfold ?http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi; or mfold http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold). RAP ID #5713의 2차 구조의 분석은 도 10A에 나타내었다.
공통 모티프를 확인하기 위하여, 서열 분석은 서열번호 2 내지 14의 서열 및 RAP ID #5713의 돌연변이 변이체의 서열 (서열번호 72-75)에 대하여 수행되었다. 모든 서열은 RAP ID #5713 (서열번호 2)와 결합되었다. 예측은 MEME Suite 4.10.0:모티프-기반 서열 분석 도구 (T. Bailey, M. Boden, F. Buske, M. Frith, C. Charles E. Grant, L. Clementi, J. Ren, W. Li, W. Noble, "MEME SUITE: tools for motif discovery and searching", Nucleic Acids Research, 37:W202-W208, 2009)로 수행되었다. 보고된 활성 RAP 서열은 MEME 프로그램에 다음과 같은 매개변수와 함께 제출되었다: "자리 분포"-서열 당 하나; "주어진 가닥만 검색". 상기 분석은 촉진성 RAP를 위한 서열번호 1의 공통서열을 밝혀냈다. 표 7은 p-value 뿐만 아니라, 확인된 상이한 촉진성 RAPs 및 돌연변이 변이체 내 공통 서열의 위치를 가시화한 것이다.
트렌스에서 RAP#5713 활성의 결여
in vivo 내 트렌스에서 명명된 활성화 RAPs의 잠재적인 활성을 테스트하기 위하여, 대장균에서 공동-형질 전환에 적합한 두 개의 양립 가능한 플라스미드로 구성된 리포터 시스템을 설계하였다 (도 21A). 첫 번째 플라스미드는 잘-특성화된 전사 종결자 (GFP-ORF의 상류에서 전사 개시 자리 및 상기 리보솜 결합 자리 사이의 내인성 (rut) 또는 Rho-인자-의존성 (rrnB))가 포함된 GFP 리포터를 포함하였다. 두 번째 플라스미드는 안정한 sRNA의 대표적인 예로서, RAP#5713의 아라비노스-유도성 과발현을 위하여 설계되었다. 3개의 다른 RAP_sRNAs (RAP_sRNA1-RAP_sRNA3)은 각각 DsrA, RprA 및 이들의 혼성화 sRNA를 암호화하는 서열을 사용하여 구축하였고, 염기 쌍 영역을 암호화하는 서열은 RAP#5713을 암호화하는 상응하는 DNA 서열로 대체함으로써, 전체의 접힘은 영향받지 않았다. 안정화 RAP_sRNAs의 과발현 및 축적은 L-아라비노오스-유도된 형질전환 숙주 세포 유래 전체 RNA에 대한 노던 블롯 분석에 의하여 확인되었다. sRNA가 없는 pBAD30 플라스미드는 대조군으로 사용되었다 (도 21B). 흥미롭게도, 비록 RAP #5713이 다양한 종결자의 상류에 바로 위치되었으나, 이러한 경우, 여전히 어느 정도의 RNAP에 의한 초과 번역이 가능하였다 (도 21B 참조, 주요 밴드의 상류의 번짐). 트렌스로 과발현된 3 개의 RAP_sRNA의 잠재적인 항종결 효과는 리포터 GFP 상류의 내인성 (도 21C), 및 Rho-의존성 (도 21D) 종결자 모두를 지닌 시스템에서 테스트되었다. 형질전환된 균주들 사이에서, GFP 강도의 차이는 관찰되지 않았고, RAP #5713은 트렌스에서 활성이 없음을 나타낸다. 과발현된 RAP_sRNA를 지닌 균주의 성장은 모든 단계에서 액체 배지 내 또는 플레이트에서 영향을 받지 않았고 (미도시), 이는 RAP#5713은 트렌스로 작용하는 경우, 전사에 영향을 미치지 않는다는 가설을 뒷받침해 준다.
제시된 결과는 시스에서 원하는 서열을 발현을 활성화시키는 반면, 트렌스에서 다른 숙주 유전자의 발현에는 영향을 미치지 않기 때문에, 활성화 RAPs의 표적화된 사용에 필수적인 이점을 제공한다.
진핵 생물에서 유래된 전사 촉진성 특성을 지닌 RAPs
정의에 따르면, RAPs는 RNAP와 높은 친화도로 결합하는 자연적 RNA 압타머이다. 상기 RAPs는 박테리아 (대장균) 게놈으로부터 유래한다. RNAP Ⅱ와 함께 게놈성 SELEX를 사용하여, 효모 및 인간에 대한 추가 조사가 실시되었다. 진핵성 RNAP와 높은 친화도를 갖는 이러한 효모/인간 RAP 서열은 yh11 내지 yh45로 명명되었다 (서열번호 93 내지 137). 모든 세포 유기체들 사이의 RNAP 기작의 보존을 고려해보면, 수득된 효모/인간 RAPs는 시스에서 원핵성 RNAP에 의해 전사를 활성화 및 항종결시킬 수 있고, 상기 박테리아 유래 RAPs와 상응하는 활성을 갖는다. 이를 증명하기 위하여, 수많은 진핵성 RAPs가 박테라아 내 전사 활성에 미치는 영향을 테스트하였다. GFP 리포터를 지닌 pWM3110_rrnB 구조물 (도 6A로 개략적으로 제시됨)은 박테리아 전사에 대한 인간/효모 RAPs 활성의 신속하고 효율적인 테스트에 사용되었다. 그 결과, 비-박테리아 서열 (비-박테리아 RAPs)는 대장균에서 RAPs와 RNA-박테리아 RNAP간 상호작용을 통해 (박테리아 RAPs에 의한 기작과 유사) 전사물의 생산량이 증가됨을 보여주었다.
제시된 서열은 모티프에 대한 정규식으로 기술될 수 있다:[AC][AC][AG]CAN[AC][AT][CTG]A[CT][AT]CCNA[AC]N[AT]C[AC] (서열번호 138; GLAM2에 의한 예측, 도 3 참조).
또한, 모든 촉진성 압타머, 원핵 및 진핵성 압타머에 대한 공통 모티프는 서열번호 139가 반영된 GLAM2 예측을 사용하여 확인되었다. 당업자에 의해 인식된 바와 같이, 이러한 모티프는 서열번호 2에 의해 암호화되는 RAP에 대하여 확인된 코어 모티프의 필수적 뉴클레오타이드를 매우 잘 반영할 것이다.
실험예
2: 전사
저해성
RNA-중합효소 결합성
압타머
전사를 저해하는
RAPs의
확인
가장 엄격한 선별 조건 (게놈성 SELEX의 7 사이클) 하에서 수득한 농축된 서열은 심층 서열 분석되었고, ~백만 개의 리드들은 대장균 K12 MG16 게놈에 매핑되고 사용자 알고리즘을 사용하여 피크-콜링(peak calling)되었다. 전반적으로, 본 발명자들은 대장균 게놈에서 RNAP와 높은 친화도를 지닌 15,000개 이상의 RAPs-RNA 압타머를 확인하였다 (표 S1). 총 선택된 풀의 kd는 10nM 이하로 나타났다 (N. Windbichler, F. von Pelchrzim, O. Mayer, E. Csaszar, R. Schroeder, RNA Biol. 5, 30-40 참조). RAPs의 대다수 (64.3%)는 안티센스 유전자에 매핑되어 있었고, 약 이들 중 1/3 (31.5%)가 유전자 내(intragenic)의 것이었다 (도 1, A-B). 양성 대조군 6S RNA (K. M. Wassarman, G. Storz, Cell. 101, 613-23 (2000); and A. T. Cavanagh, K. M. Wassarman, Annu. Rev. Microbiol. (2014), doi:10.1146/annurev-micro-092611-150135 참조)은 확인된 RAPs (RAP#10012, 표 S1) 내에서 검출되었고, RNAP-결합성 RNAs의 게놈-전체의 검색을 위한 전략을 검증하였다. 흥미롭게도, RAPs는 번역 개시 자리의 근위부에 과존재하였고, 유전자 영역 내에서는 적게 존재하였다. ORF의 3'- 근위 부분에 반대되는 안티센스 RAPs의 농축이 관찰되었다 (도 1 C-D). 상이한 도구 (MEME 및 Homer)가 RAP 내 공통 서열 모티프를 검색하기 위하여 사용되었고, 피크의 12%에서만 CA-풍부 모티프를 확인할 수 있었다 (도 14A). 이러한 결과로부터 RNAP는 다양한 종류의 RNA 분자와 결합할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
전사에 대한 RAPs의 가능한 효과를 설명하기 위하여, 대표적인 센스 및 안티센스 RAPs의 활성을 플라스미드-기반 LacZ 리포터를 사용하여 테스트하였다 (도 11A). 유전자 발현에 대한 RAPs의 영향은 정량적 RT-PCR에 의해 LacZ 활성 및 RNA 수준의 변화를 모니터링함으로써 평가되었다. 전사량을 크게 감소시키는 몇몇의 RAPs가 확인되었다; 예를 들어, 안티센스 RAP #1086 및 유전자 내 RAP #15는 전사체 수준의 현격한 감소를 야기하였다 (도 11B). 관찰된 저해 효과가 프로모터- 또는 서열 context-의존성이 아님을 확인하기 위하여, 이러한 RAPs는 상이한 플라스미드 유래 추가적인 GFP 리포터 시스템에서 테스트하였다 (또 15, A-I). 표 1의 서열번호 25 내지 41; 하부; 이러한 저해성 RAPs의 유전적 위치, 카테고리, 서열 및 심층 서열분석으로부터 매핑된 염기의 수에 대한 개요을 제공한다. 이러한 저해성 RNA 중 절반 이상은 유전자 내이며, 단백질-암호화 유전자 내 RNA 도메인을 나타낸다. 외삽법을 통하여 수득된 수치는 확인된 RAP의 1/4이 전사 억제 활성을 가질 수 있음을 나타낸다.
박테리아 RNAP에 대한 관찰된 RAP의 효과의 특이성을 테스트하기 위하여, "저해성" RAPs는 파지 T7 프로모터를 갖는 유사한 리포터 시스템에 클로닝되었다. IPTG-유도성 대장균 BL21 균주는 파지 T7 RNAP에 의한 전사를 보장하기 위하여 사용하였다. 이 경우, RAPs와의 반응에 따른 전사 수준의 현저한 감소는 관찰되지 않았다. 따라서, 유전자 발현에 대한 RAPs의 저해 효과는 박테리아 RNAP에 특이적인 것이며, 감소된 RNA 안정성에 기인하는 것은 아니다.
RAP에 의한 전사 억제를 유도하는 기작에 대한 추가적인 이해를 얻고자 RAP-함유 전사체의 노던 블롯 분석이 수행되었다. 지수 성장 세포 유래의 총 RNA가 어닐링 전후의 RNA에 대한 올리고뉴클레오타이드로 탐침되었다 (프로브 위치는 도 11A에 나타냄.). 프로브 P2 하부와의 혼성화 (도 2D)는 RT-qPCR 데이터, 즉 저해성 RAPs (#15 및 #1086)의 경우 사실상 RNA가 검출되지 않음을 확인하였다. 그러나 프로브 P1 상류와의 혼성화는 안정한 절단된 RNA 산물의 축적을 나타내었다 (도 11D). 크기에 따라 판단하면, 이러한 전사체는 삽입된 RAPs의 약 30nt 하류에서 종결되었다. 해당 영역의 퍼지 모양은 정확한 종결점이 없음을 제시하는 것이다. 이들 데이터는 정확한 종결 자리를 매핑하는 3'RACE 실험에 의해 보완되었다 (도 16, A-B): 우수한 전사체는 완전한 RAP 서열이 포함되었고, RAP의 하류에 27 내지 38 뉴클레오타이드로 매핑된 3' 말단을 가지고 있다. RAP 서열에 의한 저해 효과를 확인하기 위하여, 몇몇의 점 돌연변이가 RAP #15에 도입되었고 (도 15, D-E), 이는 전사에 대한 저해 효과를 소멸시켰다 (도 15, F).
RAP-유발된 전사 종결의 기작을 설명하기 위하여, RAP와 리포터 구조물 내 하류 서열 사이에 형성된 종결 헤어핀의 가능성을 조사하였다. 잠재적인 내인성 종결자는 확인되지 않았다. 그러므로 RAP-매개 종결은 Rho-의존성일 수 있다. 이를 테스트하기 위하여, 바이사이클로마이신-Rho를 저해하는 매우 특이적인 항생제가 활용되었다. 상기 기술된 RAP 구조물로 형질전환된 세포에 BCM (25㎍/ml)를 첨가하며, RAPs #1086 및 #15의 전사 저해가 소멸되었다 (도 12A). 저해 효과가 없는 RAPs #2667 및 #7768을 통한 전사는 BCM에 의한 영향이 훨씬 적었다. 이는 전사의 RAP-매개 조기 종결이 Rho-의존성임을 나타낸다. 이러한 데이터는 BCM 존재 하에서 전장 RAP-함유 전사체의 축적을 보여주는 3'RACE 실험에 의해 보완되었다 (도 16C).
RAP 효과의 Rho 의존성을 직접 확인하기 위하여, 선택적인 RAPs 및 강력한 T7A1 프로모터를 갖는 합성적인 DNA 주형을 사용하여, 단일 라운드 in vitro 전사 어세이를 수행하여다. Rho가 없는 경우, 대장균 RNAP를 사용한 in vitro 전사는 전장 런오프 전사체를 생성하였다 (도 12B, 레인 1, 4, 7). Rho의 첨가는 저해성 RAPs의 경우 보다 더 짧은 RAP-함유 전사체의 형성을 초래하였다 (예를 들어, #15 및 #2136- 도 12B, 레인 2, 8 vs 레인 5). 상기 종결 산물은 NusG, Rho-의존성 종결의 효율을 증가시키는 것으로 알려진 보조 인자의 존재 하에서 향상되었다 (도 12B, 레인 3, 9). in vitro 전사 실험은 변이된 RAP #15 (15 mut)와의 반응에 Rho 인자의 첨가는 Rho-의존성 종결을 유발하지 않음을 보여주는 것이다 (도 12C). 이러한 데이터는 RAP #15의 저해 효과는 Rho-의존성 종결에 기인함을 증명한다.
RAP가 대장균 RNAP에 의한 신장에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위하여, 대조군과 동일한 위치에 RAP#15 및 이의 역 상보체 서열을 갖는 DNA 주형을 사용하여 단일-라운드 시간 경로 전사 어세이를 수행하였다. RAP의 위치는 정확하게 매핑되었다 (도 17B). 본 발명자들은 RAP#15 서열 및 몇몇 뉴클레오타이드 하류 내 강력한 RNAP 일시 정지를 검출하였다 (도 17A). 본 발명자들은 관찰된 효과를 매 시간마다 RAP 서열이 통합되지 않은 전사체에 대한 전체 RAP-함유 전사체의 양의 비로 정량화하였다. 전체 RAP 서열을 함유하는 전사체의 축적은 대조군 서열과 비교하여 RAP#15의 경우에 적어도 2배 덜 효율적이었다 (도 17C). 이러한 실험은 RAP#15는 전사의 일시 정지를 유도함을 보여준다. 흥미롭게도, G-10Y-1G+1 모티프는, 최근 NET-서열 접근법으로 확인되었고, 일시 정지를 위한 공통 서열이 보고되었으며 (M. H. Larson et al., Science. 344, 1042-7 (2014); and I. O. Vvedenskaya et al., Science. 344, 1285-9 (2014)), 이는 센스 RAPs의 서브그룹 내에 크게 표기되어 있다.
이러한 현상의 생리학적 역할을 다루기 위하여, 자연 게놈 상태에서 RAP#15의 활성을 연구하였다. 대장균에서, RAP#15는 니코틴에이트-모노뉴클레오타이드 아데닐트렌스퍼라제 (nadD) 유전자의 ORF 내에 암호화된다. NadD는 신생 단백질의 합성 및 산화환원 보조인자 NAD+ 및 NADP+의 회복 기작에 필요한 필수 효소이다 (R. A. Mehl, C. Kinsland, T. P. Begley, J. Bacteriol. 182, 4372-4 (2000); and H. Zhang et al., Structure. 10, 69-79 (2002)). 이것은 RAP#15가 이들의 nadD 유전자 내에서 전사 종결을 유발할 것이라는 가설로 이끌었다. 이 경우, RAP#15 서열 상류의 nadD mRNA의 정상 상태(steady state)의 수준은 RAP#15 하류보다 높을 것이다. 본 발명자들은 nadD mRNA의 각 영역을 증폭시키기 위하여, RAP 측면 프라이머를 설계하고, RAP#15의 상류 및 하류의 mRNA 양을 비교하였다 (도 13A). 총 RNA는 상이한 조건에서 성장된 대장균으로부터 분리되었고, qRT-PCR을 수행하였다 도 13B에 나타낸 바와 같이, 지수 기 동안, RAP#15의 바로 하류에 존재하는 RNA의 양은 상류에 비해 60% 감소되었다. 하류 RNA 수준은 세포가 정지 기에 도달하였을 때, 더욱 감소되었다 (34% vs 100%). 특히, 지수 성장 세포를 BCM에 잠시 노출시킨 후, 조기 종결을 소멸시키면, RAP#15 상류 및 하류의 mRAN은 거의 동일한 수준을 나타냈다. 이러한 실험은 자연 게놈 상태에서 RAP#15는 Rho 의존성 전사 종결을 통한 스트레스에 반응하여 숙주 nadD 유전자의 발현을 억제함을 시사한다.
현저하게, RAP15-매개 Rho 종결은 nadD의 암호화 영역 내에서 발생하였다. 전사 및 번역은 박테리아에서 직접 결합되기 때문에 (S. Proshkin, A. R. Rahmouni, A. Mironov, E. Nudler, Science. 328, 504-8 (2010)), 선도 리보솜은 일반적으로 Rho 의존성 종결을 방지하기 위해, RNAP와 근접하여 뒤따른다. 효율적인 번역이 실제로 RAP#15-매개 종결 과정 동안 일어나는지를 확인하기 위하여, 구축된 nad(RAP15)-GFP 번역 융합체를 구축하고, RAP15를 프레임내 이들의 자연 게놈 구조물에 리포터 유전자와 함께 위치시켰다 (도 23A). 유사한 구조물, RAP15의 역 상보체 서열을 갖는 nad(rev15)-GFP 는 대조군으로 사용되었다. GFP 플레이트의 결과는 RAP15는, 수반되는 번역에도 불구하고 전사 종결을 촉진함을 확인할 수 있었다: RAP15 구조물의 형광 강도는 대조군과 비교하여 현저하게 감소되었다 (도 23B). BCM은 GFP 신호를 회복시켰고, 두 구조물 사이의 차이를 제거하였다 (도 23C). 액체 배양에서 상장의 상이한 단계 동안 두 구조물 사이의 형광 세기를 비교하였다. 성장 속도의 차이는 관찰되지 않은 반면 (도 23D, 상단 패널), RAP15를 지니고 있는 세포에서 GFP 강도의 실질적인 감소가 관찰되었고, 이러한 감소는 초기 지수기로부터 시작하여 안정 단계로의 전환시 더욱 두드러지게 나타났다 (도 23D, 하단 패널). 따라서, RAP15는 번역의 활성과 관계없이 Rho가 암호화 영역에 작용할 수 있게 한다. RAP15가 암호화 영역 내에서 Rho-매개 종결을 가능하게 하는 잠재적인 기작은 리포솜의 일시 정지로 인해 일시적으로 번역으로부터 전사가 분리되는 것이다. 실제로, RNAP의 표면에 결합하면, RAP15 는 리포선 진행에 대한 물리적 장벽을 만들 수 있다 (도 23E).
이러한 데이터로부터, 자연 RNA-중합효소 압타머는 제어 가능한 방식으로 전사에 영향을 미치는 특정 신호라는 결론을 내렸다.
확인된 저해성 압타머의 서브 그룹을 대상으로 공통 서열의 존재를 분석하였다. 핵산 서열에 대한 ClustalW2의 디폴트 매개변수를 사용하여, 관련된 서열의 클러스터 및 서열번호 84([A/T][T/C][G/T/A]A[A/C][G[A/C/T][A/C][G/C][A/C/T][G/T][G/A][A/C][A/T][G/C][G/T/A][A/T][A/C]), SEQ ID NO:85 (G[A/C][G/T/A/C][G/T]AT[T/C][G/C/A][G/C][G/T/A/C]T[G/T], SEQ ID NO:86 (GCCA[G/T]GA[G/T]CG) 및 서열번호 87(([G/T/C][A/C/T][A/C][G/C/A][G/T/A][G/C][G/C/A][G/A][G/C][G/A][A/T])의 대표적인 공통서열이 확이되었다. 서열번호 84의 공통서열은 적어도 RAP ID 5039, 9533, 10822, 10070, 및 1510에 존재하고, 서열번호 85는 적어도 RAP ID 1800, 1760, 4599, 3930, 683, 803, 및 4599에 존재하고, 서열번호 86은 적어도 RAP ID 9505, 10243, 11599, 15, 1086, 2136, 6819, 및 9559에 존재한다. 결과는 도 20에 나타내었다 (서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87).
제시된 in vitro 및 in vivo 연구는 RAP-매개 전사 저해에서 Rho의 역할을 보여준다. Rho는 전사 종결을 촉진하는 신장 복합체에 작용하는 고리 모양의 6 량체의 RNA 헬리카제이다 (E. Nudler, M. E. Gottesman, Genes to Cells. 7, 755?768 (2002); and J. W. Roberts, Nature. 224, 1168-74 (1969)). 저해성 RAPs 에서, C-함량 중간 값은 33.67%인 반면, G-함량 중간 값은 15.69%였다 (도 19). 그러나, 테스트된 RAP 서열의 길이는 45개 뉴클레오타이드를 초과하지 않았으며 (예를 들어, RAP#15는 오직 39nt임.), 이는 rut (적어도 70-80 뉴클레오타이드)에 대하여 요구하는 길이보다 거의 2배 짧은 것이다 (J. P. Richardson, Cell. 114, 157-9 (2003); and A. Q. Zhu, P. H. von Hippel, Biochemistry. 37, 11202-14 (1998)).
최근에, 타일링 마이크로어레이 및 NGS가 대장균에서의 Rho-의존성 종결의 고해상도 맵을 얻기 위하여 적용되었다 (J. M. Peters et al., Genes Dev. 26, 2621-33 (2012)). 저해성 RAPs를 포함하는 20개의 유전자 중에서 오직 하나만이 BCM에 의한 Rho 저해와 관련하여 상향조절된 1264개의 "현저한 전사체"의 보고 목록 내에 있었다. 따라서, RAPs는 신뢰할 수 있는 rut 자리 (bona fide rut site)는 아니지만, Rho에 대한 RNAP 반응성을 직접 조절할 가능성이 높다고 결론을 내릴 수 있다. 전사 일시 정지에 대한 RAPs의 자극 효과는 이러한 가설과 일치하며, RAPs는 Rho와 RNAP 사이의 활동성 결합을 촉진시킴으로써, 적이도 일부분의 전사 종결을 촉진시킨다는 것을 시사한다 (D. J. Jin, R. R. Burgess, J. P. Richardson, C. A. Gross, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1453-7 (1992)).
종합하면, RNA 신호를 조절하는 새로운 종류의 전사물로서, 광범위한 RAP의 확인은, 초기 RNA와 RNAP의 직접적인 상호작용이 대장균 전사체의 구성에 광범위한 영향을 미친다는 것을 밝혀냈다. RAP는 자가-조절 시스템으로서 RNA의 잠재성을 실현시킨다.
[표 1] 본 발명에 따라 상호작용하는 바람직한 RNA-중합효소를 암호화하는 DNA 서열
여기서, 뉴클레오타이드 서열은 확장된 문자 코드로 나타내었다. 확장된 문자 코드는 기존의 GATC 기호외에, 서열을 정의할 때, 탄력적으로 적용될 수 있는 서열 내 위치를 나타낸다. 이하의 표는, 사용된 문자 및 서열의 각 위치에서 포함될 수 있는 구체적인 뉴클레오타이드를 개략적으로 설명한 것이다; 만일 1번 위치에 H가 사용되었다면, 이는 서열 1번 위치는 A,C,또는 T 일 수 있다.
[표 2] 확장된 문자 코드
[표 3] 바람직한 종결자 서열
[표 4] 사용된
올리고뉴클레오타이드
프라이머
,
어뎁터
, 플라스미드
[표 5] 서열번호 2의 활성
변이체
서열번호 2에 대한 변이는 밑줄로 표기하였다. 서열번호 1에서, 서열 번호 1의 공통서열에 대한 대체 서열이 없는 2개의 뉴클레오타이드는 이텔릭체로 표기하였다. 서열번호 75는 서열번호 2와 기교하여, 3'-말단의 6nt가 짧은 서열이다. 따라서, 이는 서열번호 1의 공통서열에 상응하는 서열만을 포함한다.
[표 6] 서열번호 2의 불활성
변이체
[표 7]
본 발명은 상기의 범위를 좁히지 않는 것으로, 특히, 다음 항목에 관한 것이다.
항목 1: RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하는 RNA 분자로서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 15 내지 60nt, 바람직하게 20 내지 50nt, 보다 바람직하게 23 내지 50nt의 길이를 가지고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 50nM 또는 그 이하의 KD, 바람직하게 10nM 또는 그 이하의 KD로 RNA-중합효소와 결합하는 것인, RNA 분자.
항목 2: 상기 항목 1에 따른 RNA 분자로서, 상기 RNA-중합효소는 원핵성 RNA-중합효소, 바람직하게 박테리아 RNA-중합효소, 보다 바람직하게, 그람 음성 박테리아 유래 박테리아 RNA-중합효소, 더욱 바람직하게, 대장균(Escherichia coli)의 RNA-중합효소인, RNA 분자.
항목 3: 항목 1 또는 항목 2에 따른 RNA 분자로서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 RNA-중합효소의 전효소, 바람직하게 RNA-중합효소 코어 및 시그마 70과 상호 작용하는 것인, RNA 분자.
항목 4: 항목 1 내지 항목 3 중 어느 하나에 따른 RNA 분자로서, 상기 압타머는 서열번호 1에 따른 서열을 포함하는 것인, RNA 분자.
항목 5: 항목 4에 따른 RNA 분자로서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, RNA 분자.
항목 6: 항목 5에 따른 RNA 분자로서, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 발현되는 서열의 발현을 증가시키고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하지 않은 때의 상기 발현되는 서열의 발현에 비해, 상기 발현의 증가가 적어도 10%, 바람직하게 적어도 20%, 보다 바람직하게 적어도 100%인 것인, RNA 분자.
항목 7: 항목 3 내지 6 중 어느 하나에 따른 RNA 분자로서, 상기 전사 촉진 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 서열번호 1의서열에 의해 암호화되고; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 것인, RNA 분자.
항목 8: 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 RNA 분자로서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, RNA 분자.
항목 9: 항목 8에 따른 RNA 분자로서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 발현되는 서열의 발현을 감소시키고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하지 않은 때의 상기 발현되는 서열의 발현에 비해, 상기 발현의 감소가 적어도 30%, 바람직하게 적어도 20%, 보다 바람직하게 적어도 50%인 것인, RNA 분자.
항목 10: 항목 8 또는 9에 따른 RNA 분자로서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 27% 초과, 바람직하게 30% 초과, 보다 바람직하게 31% 초과의 C-함량을 가지고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 23% 미만, 바람직하게 20% 미만, 보다 바람직하게 17% 미만의 G-함량을 가지는 것인, RNA 분자.
항목 11: 항목 8 내지 10 중 어느 하나에 따른 RNA 분자로서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 및 서열번호 87로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되고; 바람직하게 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 것인, RNA 분자.
항목 12: 항목 1 내지 11 중 어느 하나에서 정의된 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화화는 서열을 포함하는 DNA 분자.
항목 13: 항목 12에 따른 DNA 분자로서, 상기 DNA-분자는 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 프로모터, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 및 발현되는 서열 또는 상기 발현되는 서열의 도입을 위한 다중 클로닝 자리를 포함하며, 상기 프로모터, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 및 상기 발현되는 서열은 작동 가능하게 연결되고, 바람직하게, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 및 상기 발현되는 서열 또는 상기 다중 클로닝 자리는 상기 프로모터의 하류(downstream)에 위치하는 것인, DNA 분자.
항목 14: 항목 13에 따른 DNA 분자로서, 상기 발현되는 서열은 단백질을 암호화하기 위한 것이고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 상류(upstream)에 위치하는 것인, DNA-분자.
항목 15: 항목 14에 따른 DNA 분자로서, 상기 발현 카세트는, 하나 또는 그 이상의 발현되는 단백질을 암호화하기 위한, 둘 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 상기 각각의 오픈 리딩 프레임에 대하여, 상기 발현 카세트는 상기 오픈 프레임에 작동 가능하게 연결된 항목 1 내지 11 중 어느 하나에서 정의된 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하고, 바람직하게, 상기 둘 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임은 하나 또는 그 이상의 RNA-중합효소 결합성 압타머 및 번역 개시 부위를 암호화하는 서열에 의해 분리되며, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머 및 번역 개시 부위는 상기 오픈 리딩 프레임과 작동 가능하게 연결된 것인, DNA-분자.
항목 16: 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 따른 DNA 분자로서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 항목 5 내지 7 중 어느 하나에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, DNA-분자.
항목 17: 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 따른 DNA 분자로서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 항목 8 내지 12 중 어느 하나에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, DNA-분자.
항목 18: 항목 12 내지 17 중 어느 하나에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현용 벡터.
항목 19: 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 RNA 분자를 포함하는 숙주 세포, 또는 항목 12 내지 17 중 어느 하나에 따른 DNA 분자, 또는 항목 18에 따른 벡터.
항목 20: 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위한, 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 RNA 분자, 또는 항목 12 내지 17 중 어느 하나에 따른 DNA 분자, 또는 항목 18에 따른 벡터, 또는 항목 20에 따른 숙주 세포의 용도.
항목 21: - 항목 12 내지 17 중 어느 하나에 따른 DNA-분자, 또는 항목 18에 따른 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 항목 13 내지 17 중 어느 하나에서 정의된 발현 카세트를 포함하며,
- 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하고,
- 상기 발현 카세트의 프로모터로부터 전사를 유도하는 조건 하에서, 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 및
- 선택적으로, 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질 또는 RNA를 회수하는 것을 포함하는, 목적 단백질 또는 RNA를 생산하는 방법.
항목 22: 항목 21에 있어서, 상기 벡터를 제공하는 단계는, 목적 단백질 또는 RNA를 암호화하는 서열을 상기 벡터 내에 포함된 발현 카세트의 다중 클로닝 자리에 삽입하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
항목 23: 항목 21 또는 22에 있어서, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계는, Rho 전사 저해제의 저해제, 바람직하게 바이사이클로마이신과 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인, 방법.
항목 24: 하기의 단계를 포함하는, 목적 RNA의 in vitro 전사를 위한 방법:
- 항목 12 내지 17 중 어느 한 하나에 따른 DNA-분자, 또는 항목 18에 따른 벡터를 제공하는 단계,
- 상기 프로모터로부터 전사를 가능하게 하는 조건 하에서 상기 DNA-분자를 RNA-중합효소와 함께 인큐베이팅하는 단계, 및
- 선택적으로 목적 RNA를 회수하는 단계이며,
상기 목적 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 상기 DNA-분자는 프로모터 및 본 발명에 따른 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것인, 방법.
항목 25: 하기의 단계를 포함하는, 목적 단백질의 in vitro 발현을 위한 방법:
- 항목 12 내지 17 중 어느 하나에 따른 DNA-분자, 또는 항목 18에 따른 벡터를 제공하는 단계,
- 상기 프로모터로부터 전사, 및 전사체의 번역을 가능하게 하는 조건 및 성분과 함께, 상기 DNA-분자를 인큐베이팅하는 단계, 및
- 선택적으로 목적 단백질을 회수하는 단계이며,
상기 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 상기 DNA-분자는 프로모터 및 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것인, 방법.
항목 26: 항목 25에 있어서, 상기 성분은 대장균으로부터의 세포 추출물, 및 선택적으로 에너지원, 아미노산 공급원, 세포 추출물의 전사 및/또는 번역 기작을 위한 보조 인자를 포함하는 것인, 방법.
항목 27: 항목 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 전사 촉진 RNA-중합효소 결합성 압타머, 바람직하게, 항목 4 내지 7 중 어느 하나에서 정의된 것인, 방법.
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rut Rho termination sequence
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cccttccttc tccccatcgc tacctcatat ccgcacctcc tcaaacgcta cctcgaccag 60
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7t intrinsic terminator
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aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt t 41
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<212> DNA
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<220>
<223> T7t-tR2-rrnB triple terminator insert
<220>
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<221> terminator
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<220>
<221> terminator
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<223> /note="rrnB triple terminator insert"
<400> 45
tctagatcgg tggaaacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt tttttaccgt 60
taataacagg cctgctggta atcgcaggcc tttttatttt gttacacgca cagcggctag 120
cacgacgaca aacgaaaggc tcagtcggaa gactgggcct ttcgttttat ctgttaattt 180
tgtttaactt ttactttatg ta 202
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fixFW (primer)
<400> 46
tataggggaa ttcggagcgg g 21
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fixRV_multi (primer)
<400> 47
tagcccggga tcctcggggc tg 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacZ_qPCR_FW
<400> 48
agcgcgatcc cgtcgtttta ca 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacZ_qPCR_RV
<400> 49
caggctgcgc aactgttggg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gapA_FW
<400> 50
gcaccaccaa ctgcctggct 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gapA_RV
<400> 51
cgccgcgcca gtctttgtga 20
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nadA_before15_FW
<400> 52
acaggctctg tttggcggca c 21
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nadA_before15_RV
<400> 53
cgccagcgtt tccacgggt 19
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nadA_after15_FW
<400> 54
agcgaacagc gtgcagcgta 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nadA_after15_RV
<400> 55
tgcgcagtgt aagagggggc 20
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P1: before RAP
<400> 56
ttaaccagta acaacagaat tctagccc 28
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2: after RAP
<400> 57
ttattatcta gaggatcccc gggtgcatt 29
<210> 58
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7A1
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(67)
<223> /note="T7 promoter"
<400> 58
tccagatccc gaaaatttat caaaaagagt attgacttaa agtctaacct ataggatact 60
tacagccatc gagagggaca cggcgaat 88
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP_FW
<400> 59
tggagagggt gaaggtgat 19
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP_RV
<400> 60
agcattgaac accataagtc aaag 24
<210> 61
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-phosphorylated RNA adapter (for 3 RACE experiments)
<400> 61
aauggacucg uaucacaccc gacaa 25
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer 3 RACE
<400> 62
ttgggctaga attctgttgt ta 22
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer 3 RACE
<400> 63
ttgtcgggtg tgatacgagt ccatt 25
<210> 64
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 108nt insert to introduce additional, unique XhoI and SacI
restriction enzyme recognition sites into plasmid pWM1015
(resulting in pWM3110)
<400> 64
gaattcatcg cgtgtgcgta ttcgatcgaa ttggatcagc tcgcgtccag gtagcgaaag 60
ccatttattg atggaccact cgagatcact agccgagctc taattgctaa attc 114
<210> 65
<211> 2695
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pWM3110
<400> 65
agaataaccc taaaaataaa ccctgatttt gcttatttag tcaatcaact aactactaat 60
tacagctttg agcttgaaga atttatagcc cttagcggta aatatgctaa aacactttac 120
cgccttttaa agcaatttag aaccactggc aaagcttatt ttgagtggga cgagttttgt 180
aaagttatgg atataccaca agattataga caaagcgaag tcgataaatg gattttaaac 240
ctgctatcaa agaactttct aaagaacagc aatctttttg accaaattag agtgcctttt 300
aaaaatcttg cttatgaaaa agaaaaaacc gcaggcgtgg gcgtggcggc aaagtttcag 360
gcattagctt tacttttaaa cctgaaaata tcgaaatgca aaagctagaa aatgaaagtc 420
aaaaaataat gagcgatgag caaaaatatt taaagatttt aaacaatatg aaacttaatc 480
aagctagatt taattataat gacaagcttt ggcagtttaa cgattttgat tttaatgaat 540
ttaaaattat tgcagtagag cttgtaagag atgaatacga gaatttaaac tttggaaatc 600
atatgcactt taatgctaaa aatcaagagc agttttttaa atgattgata ctttaggaat 660
gggattaggt aaaatttgct ataattatat ctttgaagga tacaagctat ccgccacttg 720
tgccaagtgt cgagcttgta aggggtgcaa ccccttaacc ccactaataa aaatcaacta 780
aatcagtgaa tgatttttga attttattaa aacaccaaaa aaggaaaatt taaaaatgca 840
aaaacatatc ccgaagtgca tagcttagaa gaaagccttg cgatacttaa aaaatataaa 900
gatgatttga ctaaagagca atacgaagcc ataagatcaa atataggtaa ttttgcaata 960
gaagatatgt ttttgaatga aaaagatatt attgataatg ttaaaattat aaaaggcgaa 1020
gcaacagcta atgaatgtat tgttgcatta aagaaagaat ggggagtatg aatgcaaaat 1080
gtcaaaagtt gccaccgctc attgcaatcc taaaaaacaa cctgcattaa accacaatga 1140
tagaaccaac gataatgcta agacaatcac taaagaactt acacatttaa atgaatactc 1200
ttgcactagc gatgaagtgc gtaagaacat agaaaggctt tataaaaaag ctttttagac 1260
atctaaatct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta ttttctccca 1320
atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc 1380
ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct 1440
cccaagatca ataaagccac ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag 1500
gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag 1560
ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag 1620
atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat tcgtataggg 1680
acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca gctcgataat 1740
cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact 1800
catgagcaga ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag 1860
ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt 1920
ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt tctcccacca gcttatatac 1980
cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt 2040
caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt tctacagtat 2100
ttaaagatac cccaagaagc taattataac aagacgaact ccaattcact gttccttgca 2160
ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat 2220
aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa ccacaattat gatagaattt acaagctata 2280
aggttattgt cctgggtttc aagcattagt ccatgcaagt ttttatgctt tgcccattct 2340
atagatatat tgataagcgc gctgcctatg ccttgccccc tgaaatcctt acatacggcg 2400
atatcttcta tataagcgta ccggttccaa ttttttcgca gtttaacttt tccgacgcat 2460
ttatcgtctt ggtagtaaag atatattata tattatctta tcagtattgt caatatattc 2520
aaggcaatct gcctcctcat cctcttcatc ctcttcgtct tggtagcttt ttaaatatgg 2580
cgcttcatag agtaattctg taaaggtcca attctcgttt tcatacctcg gtataatctt 2640
acctatcacc tcaaatggtt cgctgggttt atcgatgata agctgtcaaa catga 2695
<210> 66
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> promoter of pWM3110 (constitutive promoter)
<400> 66
tttaagtctt agtttagttt ttttggtata at 32
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> arabinose-inducible promoter
<400> 67
gtttctccat acccgttttt ttgggctagc 30
<210> 68
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insert for integration of rut into pWM3100 (rut sequence in bold)
<400> 68
gagctctgcc gtaccgtcta tcaaactcaa cgaccccttc cttctcccca tcgctacctc 60
atatccgcac ctcctcaaac gctacctcga ccagcctccc tccctcccgt gctc 114
<210> 69
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insert for integration of rrnB intrinsic terminator into pWM3100
(rrnB sequence in bold)
<400> 69
gagctctgcc gtaccgtcta tcaaactcaa cgacaccata gcgtcctgga tcattaacgt 60
gatacgcaga taccgttgca ccactctgtt cacagcggct agcacgtcga caaacgaaag 120
gctcagtcgg aagactgggc ctttcgtttt atctgttaat tttgtttaac tttaggagtg 180
ctc 183
<210> 70
<211> 179
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insert for integration of T7t intrinsic terminator into pWM3100
(T7t sequence in bold)
<400> 70
gagctctgcc gtaccgtcta tcaaactcaa cgacaccata gcgtcctgga tcattaacgt 60
gatacgcaga taccgttgca ccactctgtt cacagcggct agcacgtcga caaccccttg 120
gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tttaattttg tttaacttta ggagtgctc 179
<210> 71
<211> 214
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insert for integration of the three intrinsic terminators T7t,
tR2 and rrnB into pWM 3100
<400> 71
gagctctcta gatcggtgga aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt 60
taccgttaat aacaggcctg ctggtaatcg caggcctttt tattttgtta cacgcacagc 120
ggctagcacg acgacaaacg aaaggctcag tcggaagact gggcctttcg ttttatctgt 180
taattttgtt taacttttac tttatgtagt gctc 214
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 5713_mut_loop2
<400> 72
gacaacatga gggcggttca gcagcacta 29
<210> 73
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 5713_mut_2gg
<400> 73
gacggcatga gggcagttca gcagcacta 29
<210> 74
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 5713_mut_3gg
<400> 74
gacggcatga gggcagggca gcagcacta 29
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 5713_mut_0-6
<400> 75
gacaacatga gaacagttca gca 23
<210> 76
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 5713_mut_stem3
<400> 76
gacaacaaca gaacagttgt gcagcacta 29
<210> 77
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 5713_mut_noStruct
<400> 77
gacaacaccc gaacagtccc gcagcacta 29
<210> 78
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> +70 RBS
<400> 78
taataactat acgtatggta atcgcaggcc ttattccgag ctcaataatt gttaacttta 60
agaaggagga 70
<210> 79
<211> 3150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacZ gene in pBAD13
<400> 79
atgtcgttta ctttgaccaa caagaacgtg attttcgttg ccggtctggg aggcattggt 60
ctggacacca gcaaggagct gctcaagcgc gatcccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 120
gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 180
cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 240
gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg gctggagtgc 300
gatcttcctg aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca cggttacgat 360
gcgcccatct acaccaacgt gacctatccc attacggtca atccgccgtt tgttcccacg 420
gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg gctacaggaa 480
ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtt aactcggcgt ttcatctgtg gtgcaacggg 540
cgctgggtcg gttacggcca ggacagtcgt ttgccgtctg aatttgacct gagcgcattt 600
ttacgcgccg gagaaaaccg cctcgcggtg atggtgctgc gttggagtga cggcagttat 660
ctggaagatc aggatatgtg gcggatgagc ggcattttcc gtgacgtctc gttgctgcat 720
aaaccgacta cacaaatcag cgatttccat gttgccactc gctttaatga tgatttcagc 780
cgcgctgtac tggaggctga agttcagatg tgcggcgagt tgcgtgacta cctacgggta 840
acagtttctt tatggcaggg tgaaacgcag gtcgccagcg gcaccgcgcc tttcggcggt 900
gaaattatcg atgagcgtgg tggttatgcc gatcgcgtca cactacgtct gaacgtcgaa 960
aacccgaaac tgtggagcgc cgaaatcccg aatctctatc gtgcggtggt tgaactgcac 1020
accgccgacg gcacgctgat tgaagcagaa gcctgcgatg tcggtttccg cgaggtgcgg 1080
attgaaaatg gtctgctgct gctgaacggc aagccgttgc tgattcgagg cgttaaccgt 1140
cacgagcatc atcctctgca tggtcaggtc atggatgagc agacgatggt gcaggatatc 1200
ctgctgatga agcagaacaa ctttaacgcc gtgcgctgtt cgcattatcc gaaccatccg 1260
ctgtggtaca cgctgtgcga ccgctacggc ctgtatgtgg tggatgaagc caatattgaa 1320
acccacggca tggtgccaat gaatcgtctg accgatgatc cgcgctggct accggcgatg 1380
agcgaacgcg taacgcgaat ggtgcagcgc gatcgtaatc acccgagtgt gatcatctgg 1440
tcgctgggga atgaatcagg ccacggcgct aatcacgacg cgctgtatcg ctggatcaaa 1500
tctgtcgatc cttcccgccc ggtgcagtat gaaggcggcg gagccgacac cacggccacc 1560
gatattattt gcccgatgta cgcgcgcgtg gatgaagacc agcccttccc ggctgtgccg 1620
aaatggtcca tcaaaaaatg gctttcgcta cctggagaga cgcgcccgct gatcctttgc 1680
gaatacgccc acgcgatggg taacagtctt ggcggtttcg ctaaatactg gcaggcgttt 1740
cgtcagtatc cccgtttaca gggcggcttc gtctgggact gggtggatca gtcgctgatt 1800
aaatatgatg aaaacggcaa cccgtggtcg gcttacggcg gtgattttgg cgatacgccg 1860
aacgatcgcc agttctgtat gaacggtctg gtctttgccg accgcacgcc gcatccagcg 1920
ctgacggaag caaaacacca gcagcagttt ttccagttcc gtttatccgg gcaaaccatc 1980
gaagtgacca gcgaatacct gttccgtcat agcgataacg agctcctgca ctggatggtg 2040
gcgctggatg gtaagccgct ggcaagcggt gaagtgcctc tggatgtcgc tccacaaggt 2100
aaacagttga ttgaactgcc tgaactaccg cagccggaga gcgccgggca actctggctc 2160
acagtacgcg tagtgcaacc gaacgcgacc gcatggtcag aagccgggca catcagcgcc 2220
tggcagcagt ggcgtctggc ggaaaacctc agtgtgacgc tccccgccgc gtcccacgcc 2280
atcccgcatc tgaccaccag cgaaatggat ttttgcatcg agctgggtaa taagcgttgg 2340
caatttaacc gccagtcagg ctttctttca cagatgtgga ttggcgataa aaaacaactg 2400
ctgacgccgc tgcgcgatca gttcacccgt gcaccgctgg ataacgacat tggcgtaagt 2460
gaagcgaccc gcattgaccc taacgcctgg gtcgaacgct ggaaggcggc gggccattac 2520
caggccgaag cagcgttgtt gcagtgcacg gcagatacac ttgctgatgc ggtgctgatt 2580
acgaccgctc acgcgtggca gcatcagggg aaaaccttat ttatcagccg gaaaacctac 2640
cggattgatg gtagtggtca aatggcgatt accgttgatg ttgaagtggc gagcgataca 2700
ccgcatccgg cgcggattgg cctgaactgc cagctggcgc aggtagcaga gcgggtaaac 2760
tggctcggat tagggccgca agaaaactat cccgaccgcc ttactgccgc ctgttttgac 2820
cgctgggatc tgccattgtc agacatgtat accccgtacg tcttcccgag cgaaaacggt 2880
ctgcgctgcg ggacgcgcga attgaattat ggcccacacc agtggcgcgg cgacttccag 2940
ttcaacatca gccgctacag tcaacagcaa ctgatggaaa ccagccatcg ccatctgctg 3000
cacgcggaag aaggcacatg gctgaatatc gacggtttcc atatggggat tggtggcgac 3060
gactcctgga gcccgtcagt atcggcggaa ttacagctga gcgccggtcg ctaccattac 3120
cagttggtct ggtgtcaaaa ataataataa 3150
<210> 80
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cobC-derived +99 nt insert
<400> 80
tgcattctcg accccgatgg cacggctatt gaggacgcgt agcgtcgcga atttttggtt 60
gatatcaatg gcgctccaac acccctggtc aacgcgaaa 99
<210> 81
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> +49 nt insert
<400> 81
tttgttactg gttaacctga aacgccagtc tgcccatacg ccactgcgt 49
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer: pET21_Insert_FW_NheI
<400> 82
atgctagcac ccgttttttt gggctagaat 30
<210> 83
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer: pET21_Insert_RV_HindIII
<400> 83
ataagctttt attattattt ttgacaccag ac 32
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> inhibiting RAP consensus sequence
<400> 84
wydamghmsh krmwsdwm 18
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> inhibiting RAP consensus sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> /note="wherein "N" may be A or T or C or G"
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> /note="wherein "N" may be A or T or C or G"
<400> 85
gmnkatyvsn tk 12
<210> 86
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> inhibiting RAP consensus sequence
<400> 86
gccakgakcg 10
<210> 87
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> inhibiting RAP consensus sequence
<400> 87
bhmvdsvrsr w 11
<210> 88
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 4599
<400> 88
cgggcatatt gcgtgatttg tgccaaccga tgattacttt cccctgc 47
<210> 89
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 1436
<400> 89
cagcgccatg agcgtgatcc acataccaat aaattcgtcc cagacaatgc tgccatgatc 60
g 61
<210> 90
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 6819
<400> 90
ccagtcggca aacattccca tccagacacc aacca 35
<210> 91
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 1760
<400> 91
accatcaacc actgaccgac gattagctta cgcagttgcg ctcgccctg 49
<210> 92
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 1086
<400> 92
gcgtttcaaa tgcgcatcaa cctgccacac tcccccaca 39
<210> 93
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh1
<400> 93
tcatagacaa gacaatccta agcaaaaaga acaaagctgt aggcatcata ctacctgact 60
atc 63
<210> 94
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh2
<400> 94
gagcaaatca ggcagtcctt acccactccc ctccctg 37
<210> 95
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh3
<400> 95
aacttcaaaa aaaattacaa aaagtgcttt ctgaactgaa caaaaaagag taaagttagt 60
cgcgtaaagt acatct 76
<210> 96
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh4
<400> 96
ttcccaacgt gttagaatta taggcatgac ccactgtgcc 40
<210> 97
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh5
<400> 97
gtacgagcgg accccacagt tttaagccta aacttggcct tatgtagaat ttcttgatat 60
cattatcatc tttgtcgtag tcccatc 87
<210> 98
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh6
<400> 98
gcaaaatgag tacttagaca tgctctgtat ttgtgctgta cagtacggta acac 54
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh7
<400> 99
gaggcacaca ctcacacacc cc 22
<210> 100
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh8
<400> 100
gggaattcgg agcgggatcg gttgcattag ctaagcctga gaaggtgatg ttgttgcc 58
<210> 101
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh9
<400> 101
atatcagcca tgtacatccc tgtccccc 28
<210> 102
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh10
<400> 102
gcccacaaga ttccacgata gatatcaagg atttaaagct gattcagtgt atagtacatc 60
60
<210> 103
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh11
<400> 103
ccataccagc atgatggata ccaaaaccaa attgaagaat ctccttcc 48
<210> 104
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh12
<400> 104
attgcttttc cacacggatt ccaaccactg c 31
<210> 105
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh13
<400> 105
attgcttttc cacacggatt ccaaccgata tcatac 36
<210> 106
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# 14
<400> 106
aagcactacc cacctgacaa tgtcttcatc cc 32
<210> 107
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh15
<400> 107
agcatacaaa atataccttt ctcaaacaag aaacatccc 39
<210> 108
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh16
<400> 108
gagccttaaa cactgacttc ccattccctc tcccc 35
<210> 109
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh17
<400> 109
gcagcccaca catcatacac acacacccc 29
<210> 110
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh18
<400> 110
gcagcttaaa ctgcctgacc ggtaagaaac tgaccaacat gcgtgcttcc ggtactgacg 60
aagccttcat cc 72
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh19
<400> 111
gcagcccaca aaccacaccc 20
<210> 112
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh20
<400> 112
gcagcatgaa agtcacagtt ctaaacattc attctgtgcc 40
<210> 113
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh21
<400> 113
gcagcagaca cacgtacaca cacacataca taacctatc 39
<210> 114
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh22
<400> 114
gcagcatatc agccatgtac atccctgtcc ccc 33
<210> 115
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh23
<400> 115
gcagcaacac acacacacac acaccc 26
<210> 116
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh24
<400> 116
gcagctttac ttaacagttg agctaattta cactcccatg gatagtgtat aagtgtttca 60
ttttcgccc 69
<210> 117
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh25
<400> 117
gcagcatgaa ccaaacacct tccactagtc ccatcc 36
<210> 118
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh26
<400> 118
gcagcaacac acagcacaca catacaccca ccgtactaag catcc 45
<210> 119
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh27
<400> 119
gagccaacta catcgaccaa tttaccagag gattcaccat tatgatcacc atcttcc 57
<210> 120
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh28
<400> 120
gcagcagcac tcatcggttc atcatctatg taaaggtgct tctccaccat gtgc 54
<210> 121
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh29
<400> 121
gcagcaacca cacatctata cggccttgaa aaccccatcc 40
<210> 122
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh30
<400> 122
aagcactaaa ggcccattct tgctctatgt atctgtgact taagatctgc cac 53
<210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh31
<400> 123
acggccacca gactcattcc tgcc 24
<210> 124
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh32
<400> 124
attgcttttc cacacggatt ccaaccgcta tccaaacact catccc 46
<210> 125
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh33
<400> 125
gcagcactca cttacacatt cacacacaca acatacaccc c 41
<210> 126
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh34
<400> 126
gcagcgttag tacataccct tcctcaccat tgttccccca tcc 43
<210> 127
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh35
<400> 127
gagctaagac acagataccc agaaagatcc aaacctctac cgcaaagtca aggtagacat 60
ttccc 65
<210> 128
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh36
<400> 128
gagtcccaca cacacaccac accacc 26
<210> 129
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh37
<400> 129
cactttgtac tttattggag ttttcctcc 29
<210> 130
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh38
<400> 130
gagcctacaa attaaatcta gccagaagca ttctatcttc c 41
<210> 131
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh39
<400> 131
gcagcaactt caaaaaaaat tacaaaaagt gctttctgaa ctgaacaaaa aagagtaaag 60
ttagtcgcgt aaagtacatc t 81
<210> 132
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh40
<400> 132
cagatcaggt cagctcagga taattcaaat tcagataatg aggcacagac taatcataac 60
acgaaaattg tcatcc 76
<210> 133
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh41
<400> 133
tcacataaca ttcacacatg cacacatgta ccacagccat gcccacatac cacagccacg 60
catcatcc 68
<210> 134
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh42
<400> 134
gtagtaatcg tcttcattct catggtgttc atcgttctct atgcc 45
<210> 135
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh43
<400> 135
gcagcactta tggtccatat tagtgtctac taccctggtt atggaaggtt atgataccgc 60
actactgaac gcactgtatg cc 82
<210> 136
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh44
<400> 136
gagcatattg gacaggttgt acttgattag aaaacacaat catgcggtaa tattaagcca 60
tactcaacag cgccatcc 78
<210> 137
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAP ID# yh45
<400> 137
gagcatacgt agttgtagtt ttcattttga tggcttaacc ttctttgtca gc 52
<210> 138
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eukaryotic transcription enhancing RAP consesus sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> /note="wherein "N" may be A or T or C or G"
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> /note="wherein "N" may be A or T or C or G"
<400> 138
mmrcanmwba ywccnam 17
<210> 139
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enhancing RAP consensus
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> /note="wherein N may be 0 to 3 nucleotides idependently selected
from the group consisting of A, T, C, and G"
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> /note="wherein "N" may be A or T or C or G"
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> /note="wherein "N" may be A or T or C or G"
<400> 139
canmmnswnm mh 12
Claims (27)
- 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위한, RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하는 RNA-분자의 용도이며, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 15 내지 60개, 바람직하게 20 내지 50개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 50nM 또는 그 이하의 KD로 RNA-중합효소와 결합하는 것인, 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 시스 (cis)로 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위하여 사용되는 것인, 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 RNA-중합효소는, 원핵성 RNA-중합효소 또는 진핵성 RNA-중합효소인 것인, 용도.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 대장균(Escherichia coli)의 RNA-중합효소의 전효소, 또는 인간이나 효모의 RNA-중합효소 Ⅱ와 상호 작용하는 것인, 용도.
- 제4항에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, 용도.
- 제5항에 있어서, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 발현되는 서열의 발현을 증가시키고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하지 않은 때의 상기 발현되는 서열의 발현에 비해, 상기 발현의 증가가 적어도 10%인 것인, 용도.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 서열번호 139의 서열에 의해, 바람직하게 서열번호 1 또는 서열번호 138의 서열에 의해 암호화되거나; 바람직하게, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 및 서열번호 137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 것인, 용도.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, 용도.
- 제8항에 있어서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 발현되는 서열의 발현을 감소시키고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 포함하지 않은 때의 상기 발현되는 서열의 발현에 비해, 상기 발현의 감소가 적어도 30%, 바람직하게 적어도 20%, 보다 바람직하게 적어도 50%인 것인, 용도.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 27% 초과의 C-함량, 및 23% 미만의 G-함량을 가지는 것인, 용도.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 및 서열번호 87로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되고; 바람직하게 상기 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 것인, 용도.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하는, DNA-분자.
- 제12항에 있어서, 상기 DNA-분자는 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 프로모터, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 및 발현되는 서열 또는 상기 발현되는 서열의 도입을 위한 다중 클로닝 자리를 포함하며, 상기 프로모터, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 상기 발현되는 서열은 작동 가능하게 연결되고, 바람직하게, RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열, 및 상기 발현되는 서열 또는 상기 다중 클로닝 자리는 상기 프로모터의 하류(downstream)에 위치하는 것인, DNA-분자.
- 제13항에 있어서, 상기 발현되는 서열은 단백질을 암호화하기 위한 것이고, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 상류(upstream)에 위치하는 것인, DNA-분자.
- 제14항에 있어서, 상기 발현 카세트는, 하나 또는 그 이상의 발현되는 단백질을 암호화하는 둘 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 상기 각각의 오픈 리딩 프레임에 대하여, 상기 발현 카세트는 상기 오픈 프레임에 작동 가능하게 연결된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열을 포함하고, 바람직하게, 상기 둘 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임은 하나 또는 그 이상의 RNA-중합효소 결합성 압타머 및 번역 개시 부위를 암호화하는 서열에 의해 분리되며, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머 및 번역 개시 부위는 상기 오픈 리딩 프레임과 작동 가능하게 연결된 것인, DNA-분자.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 전사 촉진성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, DNA-분자.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 저해성 RNA-중합효소 결합성 압타머인 것인, DNA-분자.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 DNA-분자를 포함하는 발현용 벡터.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 RNA-분자, 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자, 또는 제18항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 발현되는 서열의 발현을 조절하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 RNA-분자 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 DNA-분자, 또는 제18항에 따른 벡터, 또는 제20항에 따른 숙주 세포의 용도.
- - 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 DNA-분자, 또는 제18항에 따른 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 발현 카세트를 포함하며,
- 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하고,
- 상기 발현 카세트의 프로모터로부터 전사를 유도하는 조건 하에서, 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고,
- 선택적으로, 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 목적 단백질 또는 RNA를 회수하는 것을 포함하는, 목적 단백질 또는 RNA를 생산하는 방법. - 제21항에 있어서, 상기 벡터를 제공하는 단계는, 목적 단백질 또는 RNA를 암호화하는 서열을 상기 벡터 내에 포함된 발현 카세트의 다중 클로닝 자리에 삽입하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계는, Rho 전사저해제의 저해제, 바람직하게 바이사이클로마이신과 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 하기의 단계를 포함하는, 목적 RNA의 in vitro 전사를 위한 방법:
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 DNA-분자, 또는 제18항에 따른 벡터를 제공하는 단계,
- 상기 프로모터로부터 전사를 가능하게 하는 조건 하에서 상기 DNA-분자를 RNA-중합효소와 함께 인큐베이팅하는 단계,
- 선택적으로 목적 RNA를 회수하는 단계이며,
상기 목적 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 상기 DNA-분자는 프로모터 및 본 발명에 따른 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것인, 방법. - 하기의 단계를 포함하는, 목적 단백질의 in vitro 발현을 위한 방법:
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 DNA-분자, 또는 제18항에 따른 벡터를 제공하는 단계,
- 상기 프로모터로부터 전사, 및 전사체의 번역을 가능하게 하는 조건 및 성분과 함께, 상기 DNA-분자를 인큐베이팅하는 단계,
- 선택적으로 목적 단백질을 회수하는 단계이며,
상기 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 상기 DNA-분자는 프로모터 및 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것인, 방법. - 제25항에 있어서, 상기 성분은 대장균으로부터의 세포 추출물, 및 선택적으로 에너지원, 아미노산 공급원, 세포 추출물의 전사 및/또는 번역 기작을 위한 보조인자를 포함하는 것인, 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-중합효소 결합성 압타머는, 전사 촉진 RNA-중합효소 결합성 압타머, 바람직하게, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에서 정의된 것인, 방법.
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