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KR20170120090A - 인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물 - Google Patents

인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물 Download PDF

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KR20170120090A
KR20170120090A KR1020177013951A KR20177013951A KR20170120090A KR 20170120090 A KR20170120090 A KR 20170120090A KR 1020177013951 A KR1020177013951 A KR 1020177013951A KR 20177013951 A KR20177013951 A KR 20177013951A KR 20170120090 A KR20170120090 A KR 20170120090A
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South Korea
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mouse
antigen
protein
cell
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KR1020177013951A
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KR102659123B1 (ko
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카라 엘. 올슨
에릭 스미스
카-만 비너스 라이
앤드류 제이. 머피
가빈 서스톤
다용 궈
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

인간화 CD3 단백질을 발현하는 비인간 동물이 제공된다. 또한, 인간화 CD3 단백질을 게놈에 포함하도록 유전자 변형된 비인간 동물, 예를 들어 설치류가 제공된다. 또한, 이러한 비인간 동물을 제조하는 방법 및 조성물뿐만 아니라 상기 비인간 동물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

인간화 CD3 복합체를 발현하는 비인간 동물{NON-HUMAN ANIMALS EXPRESSING HUMANIZED CD3 COMPLEX}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은, 각각 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된, 2014년 11월 24일자로 출원된 미국 가출원 제62/083,653호와 2015년 1월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/106,999호의 정규 출원이다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2015년 11월 23일에 생성된 23,965 바이트의 파일명이 470382_SEQLST.txt인 텍스트 파일의 서열을 포함하며, 이는 참고로 포함된다.
기술분야
인간화 CD3 단백질, 예를 들어 인간화 CD3ε, 인간화 CD3δ, 및/또는 인간화 CD3γ을 인코딩하는 핵산 서열을 게놈에 포함하는, 유전자 변형된 비인간(non-human) 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)이 제공된다. 따라서, 인간화 CD3 복합체를 발현하는, 유전자 변형된 비인간 동물이 제공된다. 또한, 본 명세서에는 CD3 기반 치료제, 예를 들어 CD3 기반 항체, 예컨대 CD3 기반 이중특이적 항체의 전임상 시험을 위한 모델이 제공된다.
T 세포 수용체 서브유닛, 예를 들어 고가변성 TCRα 및 TCRβ 이외에, T 세포 표면 상의 T 세포 수용체 복합체는 불변성 CD3ε 사슬, CD3δ 사슬, 및 CD3γ 사슬을 포함하며, 이들 사슬은 CD3εδ 및 CD3εγ로 이루어지는 이종이량체를 형성한다. 또한, z 사슬은 TCR/CD3 복합체와 관련되어 있으며, 이는 이황화물 결합된 동종이량체로서 존재한다.
CD3 사슬은 T 세포 수용체 조립, 세포 표면으로의 수송, 표면 수용체의 세포내이입, T 세포 발달, 및 T 세포 신호전달에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, CD3 사슬이 이중 음성(CD4-CD8- 또는 DN)과 이중 양성(CD4+CD8+ 또는 DP)과 단일 양성(CD4+ 또는 CD8+ 또는 SP) 상호 간의 T 세포 이행에 중요하다는 것은 다양한 CD3 서브유닛의 결핍 연구를 통해 입증되어 왔다. 또한, CD3ε 사슬, CD3δ 사슬, 및 CD3γ 사슬 각각은 1개의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 반면, z 사슬 이량체는 총 6개의 ITAM을 함유한다. 이들 모티프는 신호전달 모듈로서 기능하며, TCR 관여(engagement) 시 관련 키나제에 의해 인산화된다.
CD3에 대한 항체는 T 세포 상에 CD3를 모아서, 펩티드 로딩된 MHC 분자에 의한 TCR의 관여와 유사한 방식으로 T 세포 활성화를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 항-CD3 항체는 T 세포의 활성화를 목표로 하는 치료제 후보로서 제안되어 왔다. 또한, CD3 및 표적 항원과 결합할 수 있는 이중특이적 항체는, 표적 항원을 발현하는 조직 및 세포에 대한 T 세포 면역 반응을 표적화하는 것을 수반하는 치료 용도를 위해 제안되어 왔다.
단일특이적 및 이중특이적 CD3 기반 치료용 항체의 전임상 시험을 위한 편리한 동물 모델이 특히 요망된다.
본 명세서에는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 또는 이들의 임의의 조합인 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하도록 유전자 변형된 내인성 비인간 CD3 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물이 제공된다. 일 실시 형태에서, 내인성 비인간 CD3 유전자좌는 인간 CD3ε의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하도록 유전자 변형된다. 일 실시 형태에서, 내인성 비인간 CD3 유전자좌는 상응하는 비인간 단백질(들)의 기능적 세포외 도메인(들)을 발현하지 않도록 유전자 변형된다. 일 실시 형태에서, 내인성 비인간 CD3 유전자좌는 상응하는 내인성 비인간 동물 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인을 추가로 인코딩하며, 동물은 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인 및 내인성 비인간 동물 CD3 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 CD3 단백질을 이의 T 세포 표면 상에 발현한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물 내의 인간 CD3의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)은 상응하는 내인성 비인간 동물 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 실시 형태에서, 비인간 동물은 (a) 내인성 CD3ε 유전자좌에, 내인성 비인간 동물 CD3ε의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, (b) 내인성 CD3δ 유전자좌에, 내인성 비인간 동물 CD3δ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, 그리고 (c) 내인성 CD3γ 유전자좌에, 내인성 비인간 동물 CD3γ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 비인간 동물은 이의 T 세포 표면 상에 키메라 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 단백질을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 동물 내의 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인은 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 동물은 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35의 서열을 포함하는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 유전자 변형된 비인간 동물은 CD3 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 비인간 동물은 CD3 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 CD3ε의 세포외 도메인, CD3 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 CD3 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, CD3 프로모터는 비인간 동물 CD3 프로모터이다. 일 실시 형태에서, CD3 프로모터는 인간 CD3 프로모터이다. 일 실시 형태에서, CD3 프로모터는 내인성 비인간 CD3 프로모터이다.
특정 실시 형태에서, 제공되는 비인간 동물은 포유류이다. 일 실시 형태에서, 동물은 설치류이다. 일 실시 형태에서, 동물은 래트 또는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 동물은 마우스이다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 명세서에는 유전자 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 (a) 내인성 마우스 CD3ε 유전자좌에, 내인성 마우스 CD3ε의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, (b) 내인성 마우스 CD3δ 유전자좌에, 내인성 마우스 CD3δ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, 그리고 (c) 내인성 마우스 CD3γ 유전자좌에, 내인성 마우스 CD3γ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 마우스는 이의 T 세포 표면 상에 인간화 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 단백질을 발현한다. 일 실시 형태에서, 상기 마우스의 인간화 CD3ε 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 24에 제시되어 있고, 인간화 CD3δ 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 25에 제시되어 있으며, 인간화 CD3γ 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 26에 제시되어 있다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 마우스는 마우스 CD3 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 CD3의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 프로모터는 내인성 마우스 CD3 프로모터이다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 마우스는 인간 CD3 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 CD3의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 인간화 CD3 단백질을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스와 비교하여 흉선에서 유사한 CD4+ 대 CD8+ 세포 비를 나타낸다. 일 실시 형태에서, 흉선에서의 마우스 CD4+ 대 CD8+ T 세포 비는 인간화 CD3 단백질을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스의 CD4+ 대 CD8+ 세포 비의 30% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 12% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 또는 2% 이내이다. 일 실시 형태에서, 마우스는 비장, 림프절, 및 말초 혈액에서 인간화 CD3 단백질을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스와 유사한 T 세포 및 B 세포 백분율을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 마우스는 인간화 CD3 단백질을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스와 유사한 수의 순환 백혈구, 림프구, 단핵구, 호중구, 호산구, 및 호염기구를 나타낸다.
따라서, 일 태양에서, 본 명세서에는 내인성 마우스 CD3 유전자좌에 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 일 실시 형태에서, 마우스는 인간 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ의 세포외 도메인을 포함한다. 마우스의 일 실시 형태에서, 인간 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 33에 제시되어 있고, 인간 CD3δ의 세포외 도메인은 서열 번호 34에 제시되어 있으며, 인간 CD3γ의 세포외 도메인은 서열 번호 35에 제시되어 있다. 일 실시 형태에서, 마우스는 인간화 CD3ε, 인간화 CD3δ, 및 인간화 CD3γ를 발현한다. 마우스의 일 실시 형태에서, 인간화 CD3ε은 서열 번호 24에 제시되어 있고, 인간화 CD3δ는 서열 번호 25에 제시되어 있으며, 인간화 CD3γ는 서열 번호 26에 제시되어 있다. 일 실시 형태에서, 마우스는 마우스 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 막관통 및 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 내인성 마우스 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 막관통 및 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
다른 태양에서, 본 명세서에는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 비인간 동물의 세포의 게놈에 도입하는 단계; 및 세포로부터 유전자 변형된 비인간 동물을 증식시키는 단계를 포함하는, 인간화 CD3 단백질을 발현하는 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공된다. 방법의 일 실시 형태에서, 동물은 상응하는 비인간 단백질(들)의 기능적 세포외 도메인(들)을 포함하지 않는다. 방법의 일 실시 형태에서, 동물은 내인성 CD3 유전자좌에 인간 CD3ε의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 방법의 일 실시 형태에서, 인간 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 33에 제시되어 있고, 인간 CD3δ의 세포외 도메인은 서열 번호 34에 제시되어 있으며, 인간 CD3γ의 세포외 도메인은 서열 번호 35에 제시되어 있다. 방법의 일 실시 형태에서, 동물은 상응하는 비인간 단백질(들)의 기능적 세포외 도메인(들)을 포함하지 않는다. 하나의 특정 실시 형태에서, 방법은 내인성 CD3 유전자좌에서 비인간 CD3 단백질(들)의 세포외 도메인을 인간 CD3 단백질(들)의 상응하는 세포외 도메인으로 대체하는 단계를 포함한다. 방법의 일 실시 형태에서, 동물은 상응하는 내인성 비인간 동물 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)을 추가로 포함한다. 방법의 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 마우스이며, 대체는 내인성 마우스 CD3 유전자좌에서 이루어진다. 동물이 마우스인 방법의 일 실시 형태에서, 마우스는 서열 번호 24에 제시되어 있는 인간화 CD3ε, 서열 번호 25에 제시되어 있는 인간화 CD3δ, 서열 번호 26에 제시되어 있는 인간화 CD3γ, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간화 CD3 단백질을 발현한다. 방법의 일 실시 형태에서, 대체는 단일 ES 세포에서 이루어지며, 단일 ES 세포가 마우스 배아에 도입되어 마우스를 제조한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서에는 비인간 동물 모델, 예를 들어 CD3와 관심 항원 둘 모두와 결합할 수 있는 CD3 기반 이중특이적 항원 결합 단백질을 시험하기 위한 마우스 모델이 제공되며, 마우스 모델은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 둘 이상의 CD3 단백질)인 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하도록 유전자 변형된 마우스를 포함하고 관심 비마우스 항원을 발현 또는 포함하는 세포를 포함한다. 이러한 모델의 비인간 동물은 전술하거나 본 명세서의 다른 부분에 기술한 비인간 동물 중 어느 것일 수 있다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 인간화 CD3 단백질(들)의 핵산 서열(들)은 내인성 CD3 유전자좌에 위치한다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 항원 결합 단백질이 상기 마우스에 도입되었다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 마우스는 인간 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 세포외 도메인을 발현한다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 마우스는 마우스 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 막관통 및 세포질 도메인을 추가로 발현한다.
마우스 모델의 일 실시 형태에서, 마우스는 관심 항원을 발현하는 종양의 이종이식편(xenograft)을 포함한다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 관심 항원을 발현 또는 포함하는 세포는 종양 세포이다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 선택된 이중특이적 항원 결합 단백질은 인간화 CD3 단백질과 관심 항원 둘 모두에 결합한다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 관심 항원은 인간 항원이다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 항원 결합 단백질은 원숭이 CD3 단백질과 결합할 수 있다. 마우스 모델의 일 실시 형태에서, 관심 항원은 종양 관련 항원이다. 이러한 실시 형태에서, 종양 관련 항원은 ALK, BAGE 단백질, BIRC5(서비빈(survivin)), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20(MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR 변이체 III, ERBB2(HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE 단백질, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV 유래 LMP2, L1CAM, MAGE 단백질, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1(CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA(FOLH1), RAGE 단백질, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6(LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, 톰슨-누벨(Thompson-nouvelle) 항원, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 관심 항원은 감염성 질병 관련 항원이다. 이러한 실시 형태에서, 마우스는 감염체(infectious agent)로 감염될 수 있다. 이러한 일 실시 형태에서, 감염성 질병 관련 항원은 바이러스 항원일 수 있고, 바이러스 항원은 HIV, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕삭키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 전염성 연속종(molluscum) 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 에볼라 바이러스, 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 이러한 실시 형태에서, 감염성 질병 관련 항원은 세균 항원일 수 있고, 세균 항원은 클라미디아, 리케차, 미코박테리아, 포도상구균, 연쇄구균, 폐렴구균, 수막구균, 임질균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저병, 페스트, 렙토스피라, 및 라임병(Lyme disease) 세균 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제공된 마우스 모델의 일 실시 형태에서, CD3 기반 항원 결합 단백질은 항체이다. 일 실시 형태에서, CD3 기반 항원 결합 단백질은 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질이다. 이러한 마우스 모델은 마우스에서 항원 결합 단백질의 효능 및/또는 독성 시험을 가능하게 할 수 있다.
또한, 본 명세서에는, (a) 관심 항원을, 상기 정의되거나 본 명세서의 다른 부분에 정의된 바와 같은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 또는 이들의 임의의 조합인 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하도록 유전자 변형된 내인성 비인간 CD3 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 마우스에 도입하는 단계, (b) 마우스를, 인간 CD3와 관심 항원에 대해 유도된 관심 약물 후보와 접촉시키는 단계, 및 (c) 약물 후보가 관심 항원의 존재 또는 발현을 특징으로 하는 세포를 예방, 감소 또는 제거하는 데 효과적인지를 결정하는 단계를 포함하는, 관심 항원을 표적화하는 약물 후보를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 방법의 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 마우스는 내인성 마우스 CD3 유전자좌에 인간 CD3ε의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 방법의 일 실시 형태에서, 마우스는 상응하는 마우스 단백질(들)의 기능적 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 방법의 일 실시 형태에서, 마우스는 상응하는 내인성 마우스 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)을 포함한다. 방법의 일 실시 형태에서, 인간 CD3의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)은 상응하는 내인성 마우스 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)에 작동가능하게 연결되어 있다. 방법의 일 실시 형태에서, 인간 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 33에 제시되어 있고, 인간 CD3δ의 세포외 도메인은 서열 번호 34에 제시되어 있으며, 인간 CD3γ의 세포외 도메인은 서열 번호 35에 제시되어 있다. 따라서, 방법의 한 가지 특정 실시 형태에서, 마우스는 서열 번호 24에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 CD3ε 단백질, 서열 번호 25에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 CD3δ 단백질, 및 서열 번호 26에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 CD3γ 단백질을 발현한다.
본 명세서에 기술된 약물 후보를 스크리닝하는 방법의 특정 실시 형태에서, 관심 항원을 본 명세서에 기술된 마우스에 도입하는 단계는 마우스에서 관심 항원을 발현시키는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 마우스에서 관심 항원을 발현시키는 단계는 관심 항원을 발현하도록 마우스를 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 관심 항원을 도입하는 단계는 마우스를 관심 항원으로 감염시키는 단계를 포함한다. 방법의 일 실시 형태에서, 도입 단계는 관심 항원을 발현하는 세포를 상기 마우스에 도입하는 단계를 포함한다. 방법의 다양한 실시 형태에서, 세포는 종양 세포, 세균 세포, 또는 바이러스로 감염된 세포일 수 있다. 따라서, 방법의 일부 실시 형태에서, 마우스는 바이러스 또는 세균 감염인 감염을 포함한다. 따라서, 관심 항원은 감염성 질병 관련 항원일 수 있다. 일 실시 형태에서, 관심 항원은 바이러스 항원이며, 바이러스 항원은 HIV, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 엡스타인 바르 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕삭키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 전염성 연속종 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 에볼라 바이러스, 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 관심 항원은 감염성 질병 관련 항원이며, 이는 클라미디아, 리케차, 미코박테리아, 포도상구균, 연쇄구균, 폐렴구균, 수막구균, 임질균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저병, 페스트, 렙토스피라, 및 라임병 세균 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균 항원이다.
약물 후보를 스크리닝하는 방법의 다른 실시 형태에서, 관심 항원은 종양 관련 항원이다. 방법의 일 실시 형태에서, 종양 관련 항원은 ALK, BAGE 단백질, BIRC5(서비빈), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20(MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR 변이체 III, ERBB2(HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE 단백질, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV 유래 LMP2, L1CAM, MAGE 단백질, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1(CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA(FOLH1), RAGE 단백질, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6(LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, 톰슨-누벨 항원, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
약물 후보를 스크리닝하는 방법의 일부 실시 형태에서, 마우스는 면역적격 마우스이다. 본 명세서에 기술된 방법의 일부 실시 형태에서, 관심 항원은 관심 인간 항원이다.
방법의 일부 실시 형태에서, 약물 후보는 항체이다. 일부 실시 형태에서, 약물 후보는 항원 결합 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 약물 후보는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 이중특이적 항원 결합 단백질은 인간 CD3 단백질과 관심 항원 둘 모두와 결합할 수 있다. 일 실시 형태에서, 약물 후보는 원숭이 CD3 단백질을 인식할 수 있다.
약물 후보를 스크리닝하는 방법의 일부 실시 형태에서, 약물 후보는 관심 항원을 표적화하지 않는 작용제(agent)와 비교하여 종양 성장을 감소, 제거, 또는 예방할 수 있다. 이러한 방법의 일부 실시 형태에서, 약물 후보가 관심 항원의 존재 또는 발현을 특징으로 하는 세포를 예방, 감소 또는 제거하는 데 효과적인지를 결정하는 단계는 종양 부피 검정 또는 T 세포 매개 종양 세포 치사 검정을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 약물 후보는 관심 항원을 표적화하지 않는 작용제와 비교하여 세균 또는 바이러스 감염을 감소, 제거, 또는 예방할 수 있다. 일부 이러한 실시 형태에서, 약물 후보가 관심 항원의 존재 또는 발현을 특징으로 하는 세포를 예방, 감소 또는 제거하는 데 효과적인지를 결정하는 단계는 바이러스 또는 세균 역가의 측정을 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 명세서에는 인간 CD3 분자와 결합하는 약물, 예를 들어 항원 결합 단백질을 포함하는 병용 약물 요법의 안전성, 효능, 및 약동학을 시험하기 위한 비인간 동물 모델, 예를 들어 마우스 모델이 제공된다. 이러한 병용 요법은 T 세포의 동원 및/또는 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 본 명세서에 기술된 특정 종양, 감염, 또는 다른 질병을 표적화하는 것을 목표로 한다.
도 1은 T 세포 수용체 복합체의 구조를 도시한다. 복합체는 T 세포 표면 상에 TCRαβ 이종이량체와 복합체를 이루는 2개의 CD3ε 서브유닛, 1개의 CD3δ 서브유닛, 1개의 CD3γ 서브유닛, 및 2개의 CD3z 서브유닛을 포함한다. 별표는 ITAM 모티프의 위치를 표시한다.
도 2a 및 도 2b는 인간화 CD3γδε 대형 표적화 벡터의 개략도(일정한 비율에 따르지 않음)이다. 도 2a는 선택 카세트(Neo) 결실 전의 대형 표적화 벡터를 도시하며, 인간 CD3E, CD3D, 및 CD3G 서열 녹인(knock-in) 위치가 표시되어 있다. A, B, C, D, E, F, 및 G는 표 1에 나타나 있는 접합부 핵산 서열의 위치를 표시한다. 도 2b는 선택 카세트(Neo)의 결실 후의 대형 표적화 벡터를 도시하며; 도 2a와 유사하게 인간 CD3E, CD3D, 및 CD3G의 위치가 표시되어 있다. A-B, C, D, E, F, 및 G는 표 1 및 표 3에 나타나 있는 접합부 핵산 서열의 위치이다.
도 3은 인간화 CD3γδε 마우스의 인간화 CD3 단백질의 아미노산 서열을 도시한다. 인간 기원의 CD3 단백질 서열은 밑줄이 그어져 있다.
도 4는 마우스와 인간 CD3e, CD3d, 및 CD3g 서열 사이의 정렬을 도시한다. 마우스 CD3 유전자좌에 도입된 인간 서열의 5' 및 3' 말단은 각각 * 및 **로 표시되어 있다.
도 5a의 상단 열은 야생형(WT), 이형접합성 인간화 CD3γδε(HET), 또는 동형접합성 인간화 CD3γδε(HO) 마우스에서의 CD4+ 및 CD8+ 흉선세포의 정상 분포를 입증하는 FACs 분석 플롯이다. 도 5b의 상단 열은 표시된 동물의 말초 혈액 내의 B 세포 및 T 세포의 백분율뿐만 아니라 수를 도시하는 데이터이다. 도 5b의 하단 열은 표시된 동물의 비장 내의 T 세포 및 B 세포의 백분율을 도시하는 데이터이다. 도 5c는 인간화 CD3γδε 마우스의 비장으로부터 얻어진 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 Vβ 레퍼토리 다클론성을 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 LCMV 클론 13(도 6a), 또는 선행 LCMV 암스트롱(Armstrong) 클론 감염 후의 LCMV 클론 13(도 6b)으로 감염된 마우스의 경우 야생형 대조군 또는 인간화 CD3γδε 마우스의 비장 내의 바이러스 LCMV 역가를 도시한다.
도 7은 원숭이 CD3와 또한 교차반응하는 2개의 항-인간 CD3 항체(ah/mfCD3-2 및 ah/mfCD3-1), 인간 CD3 특이적인 2개의 항-인간 CD3 항체(ahCD3-1 및 ahCD3-2), 대조 항-마우스 CD3(amCD3-2C11), 무관한 대조 인간 IgG(대조 hIgG) 및 2차 단독 항체 대조군(2nd 단독)으로 분류된 야생형(WT), 이형접합성 인간화 CD3γδε(hCD3γδε Het), 또는 동형접합성 인간화 CD3γδε(hCD3γδεHo) 마우스로부터의 비장세포의 FACS 분석으로부터의 데이터이다. MFI 값은 각 그래프 아래에 있는 표에 열거되어 있다.
도 8은 인간화 CD3γδε 마우스에서의 항-CD3 항체에 대한 반응을 도시한다. 도 8a는 항-CD3 항체로 처리된 마우스의 혈액에서의 일시적인 T 세포 및 B 세포 고갈을 도시하며; 표시된 각 항체에 대한 1일째의 T 세포 고갈(좌측 도면), 또는 시험된 각 항체에 대한 14일에 걸친 T 세포 및 B 세포 고갈 및 회복(중간 도면 및 우측 도면)을 도시한다. 도 8b는 표시된 항체로 처리한지 2시간 후에 방출된 사이토카인(IFNγ, KC, TNFα, IL-6, 및 IL-10)의 농도 증가를 도시한다.
도 9는 야생형(WT) 및 인간화 CD3γδε 동형접합성(hCD3γδε Ho) 마우스에서 표시된 항체의 양을 증가시키면서 처리 시 비장세포 증식(세포수만에 대한 활성화 배수로 측정됨)을 도시한다.
도 10은 인간화 CD3 마우스 모델의 다양한 특성을 요약한 표이다.
도 11a는 처리가 종양 이식과 동시에 개시되는 경우 B16F10.9/CD20 종양의 종양 부피에 대한 항-CD3 항체(Ab-1; CD3와 CD20을 인식하는 이중특이적 항체, 2가지 상이한 농도로 시험됨)의 효과를 도시한다(예방적 모델). 도 11b는 이미 확립된 B16F10.9/CD20 종양의 종양 부피에 대한 항-CD3 항체(Ab-1; CD3와 CD20을 인식하는 이중특이적 항체, 2가지 상이한 농도로 시험됨)의 효과를 도시한다(치료적 모델).
정의
본 발명은 인간화 CD3 단백질, 예를 들어 인간화 CD3ε, CD3δ, CD3γ, 및/또는 CD3z 단백질을 발현하는 유전자 변형된 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간화 CD3 단백질, 예를 들어 키메라 인간/마우스 CD3 단백질을 인코딩하는 유전자 변형된 CD3 유전자좌를 게놈, 예를 들어 생식선(germline)에 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물에 관한 것이다. 또한, 배아, 세포, 및 이를 포함하는 조직, 이를 제조하는 방법뿐만 아니라 이를 사용하는 방법이 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 용어 및 문구는, 반대되는 것이 명확히 표시되거나 그 용어 또는 문구가 사용되는 문맥으로부터 아주 명백한 경우가 아니라면, 그 용어 및 문구가 당업계에서 획득한 의미를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "CD3"는 다중분자 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 일부로서 T 세포 상에 발현되는 항원을 포함하며; 다중분자 TCR 복합체는 CD3-엡실론(ε), CD3-델타(δ), CD3-제타(z), 및 CD3-감마(γ) 중 하나 이상의 수용체 사슬을 포함하는 동종이량체 및/또는 이종이량체의 회합으로부터 형성된다(도 1 참조). 인간 및 마우스 CD3-델타, CD3-제타, 및 CD3-감마의 서열 및 GenBank 수탁 번호는 하기 표 4에 제시되어 있다. 본 출원 전체에 걸쳐, ε 또는 엡실론은 또한 E로 표기될 수 있고 δ 또는 델타는 또한 D로 표기될 수 있고, z 또는 제타는 또한 Z로 표기될 수 있으며, γ 또는 감마는 G로 또한 표기될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "CD3와 결합하는 항체" 또는 "항-CD3 항체"는 단일 CD3 서브유닛(예를 들어, 엡실론, 델타, 감마 또는 제타)을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라 2개의 CD3 서브유닛의 이량체 복합체(예를 들어, 감마/엡실론, 델타/엡실론, 및 제타/제타 CD3 이량체)를 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 가용성 CD3 및/또는 세포 표면 발현된 CD3와 결합할 수 있다. 가용성 CD3는 천연 CD3 단백질뿐만 아니라, 막관통 도메인이 결여되어 있거나 달리 세포막과 회합되어 있지 않은 단량체 및 이량체 CD3 작제물과 같은 재조합 CD3 단백질 변이체를 포함한다.
보존적 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용되는 경우 용어 "보존적"은 아미노산 잔기가 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환됨을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 보존적 치환을 인코딩하는 뉴클레오티드 변화를 도입하도록 뉴클레오티드 서열을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 대체로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심 기능적 특성, 예를 들어 T 세포 수용체 조립 및 신호전달에서 역할을 하는 CD3 단백질의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 화학적 특성이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족 하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드 함유 측쇄; 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황 함유 측쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환 그룹은, 예를 들어 발린/류신/아이소류신, 페닐알라닌/티로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)에 사용된 바와 같은, 단백질 내의 임의의 천연 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45)]에 개시된 PAM250 로그 가능도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 치환은 PAM250 로그 가능도 매트릭스에서 비음성(nonnegative) 값을 갖는 적당히 보존적인 치환이다.
따라서, 본 명세서에 기술된 아미노산 서열에 보존적 아미노산 치환을 포함하는 인간화 CD3 단백질(들)을 발현하는 유전자 변형된 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트가 본 발명에 포함된다.
당업자는 본 명세서에 기술된 인간화 CD3 단백질을 인코딩하는 핵산 잔기 이외에 유전자 코드의 축퇴로 인해 다른 핵산이 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기술된 인간화 CD3 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 게놈에 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물 이외에, 유전자 코드의 축퇴로 인해 본 명세서에 기술된 것들과 상이한 뉴클레오티드 서열을 게놈에 포함하는 비인간 동물이 또한 제공된다.
서열과 관련하여 사용되는 경우 용어 "동일성"은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 상이한 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 동일성을 포함한다. 본 명세서에 기술된 일부 실시 형태에서, 동일성은, 10.0의 오픈 갭 페널티(open gap penalty), 0.1의 익스텐드 갭 페널티(extend gap penalty)를 이용하며 Gonnet 유사성 매트릭스를 사용하는 ClustalW v. 1.83 (slow) 정렬(MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)을 사용하여 결정된다. 서열의 동일성에 관해 비교되는 서열의 길이는 특정 서열에 좌우될 것이다. 다양한 실시 형태에서, 동일성은 성숙 단백질의 서열을 이의 N 말단으로부터 이의 C 말단까지 비교함으로써 결정된다. 다양한 실시 형태에서, 인간화 서열을 인간 서열과 비교하는 경우, 인간화 서열의 인간 부분(그러나 비인간 부분은 아님)은 인간 서열과 인간화 서열 사이의 동일성 수준을 확인할 목적으로 비교하는 데 사용된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기술된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 그들이 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치(juxtaposition)를 포함한다. 이와 같이, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이, 적당한 전사 조절을 보유하도록 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서(silencer) 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또한, 본 발명의 인간화 단백질의 다양한 부분이, 세포에서 단백질의 적절한 접힘, 가공, 표적화, 발현, 및 다른 기능적 특성을 보유하도록 작동가능하게 연결될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 인간화 단백질의 다양한 도메인은 서로 작동가능하게 연결된다. CD3 단백질의 인간 세포외 도메인과 비인간 막관통 및 세포질 도메인의 작동가능한 연결은 이들 성분을 핵산 코딩 서열로부터 인접한 융합 단백질로서 발현시킴으로써 달성될 수 있다.
유전자 대체와 관련하여 용어 "대체"는 외인성 유전 물질을 내인성 유전자좌에 위치시켜, 내인성 유전자의 전부 또는 일부를 오르토로그성(orthologous) 또는 상동성 핵산 서열로 대체하는 것을 포함한다. 일례에서, 내인성 비인간 유전자 또는 이의 단편은 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편으로 대체된다. 예를 들어, 마우스 또는 다른 비인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 DNA는 상응하는 인간 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 DNA로 대체될 수 있다. 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편은, 대체되는 내인성 비인간 유전자 또는 이의 단편의 오르토로그(ortholog) 또는 호모로그(homolog)이거나, 구조 및/또는 기능에 있어서 이와 동일하거나 실질적으로 동일한, 인간 유전자 또는 단편이다. 하기 실시예에 입증된 바와 같이, 내인성 비인간 CD3 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인간 CD3 세포외 도메인에 상응하는 뉴클레오티드 서열에 의해 대체되었다.
예를 들어 기능적 단백질과 관련하여, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "기능적"은 천연 단백질과 정상적으로 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시 형태에서, 내인성 유전자좌에서의 대체(예를 들어, 내인성 비인간 CD3 유전자좌에서의 대체)는 기능적 내인성 단백질을 발현하지 못하는 유전자좌를 초래한다.
CD3 유전자좌에서와 같은 용어 "유전자좌"는 CD3 코딩 영역을 포함하는 게놈 DNA를 포함한다. 상이한 CD3 유전자인 CD3ε, CD3δ, CD3γ는 서로 근접하게 동일한 염색체를 맵핑한다. 따라서, 문맥에 따라, 내인성 CD3 유전자좌에 대한 언급은 이들 코딩 영역의 일부 또는 전부 또는 개별 코딩 영역을 포함하는 유전자좌를 지칭할 수 있다. 예를 들어, CD3ε과 같은 인간 CD3 중 하나만이 비인간 동물에 도입되는 경우, 그러한 CD3를 인코딩하는 핵산은 바람직하게는 상응하는 비인간 CD3의 유전자좌를 변형시킨다. CD3ε, CD3δ, CD3γ와 같은 여러 인간 CD3가 비인간 동물에 도입되는 경우, 변형된 내인성 유전자좌는 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 각각의 코딩 영역을 포함한다. 또한, CD3 유전자좌는 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ와 상이한 염색체를 차지하는 CD3
Figure pct00001
의 유전자좌를 지칭할 수 있다. 인간 CD3
Figure pct00002
가 인간 CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ 중 어느 것과 함께 도입되는 경우, 둘 이상의 CD3 유전자좌가 상이한 염색체들 상에서 변형될 수 있다. 유전자 조작을 위해 도입된 다른 서열, 예를 들어 선택 카세트, 제한 부위 등이 CD3 유전자좌에 포함될 수 있다.
면역글로불린 핵산 서열과 관련하여 용어 "생식선"은 자손으로 전해질 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
문구 "면역글로불린 분자"는 2개의 면역글로불린 중쇄와 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 중쇄는 동일하거나 상이할 수 있으며, 경쇄는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 이황화물 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄인 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인과 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은, 프레임워크 영역(FR)이라 명명되는 더욱 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라 명명되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수 있음).
용어 "고친화성" 항체는 이의 표적 에피토프에 대해 약 10-9 M 이하(예를 들어, 약 1 × 10-9 M, 1 × 10-10 M, 1 × 10-11 M, 또는 약 1 × 10-12 M)의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
문구 "이중특이적 항체"는 2개의 에피토프와 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 대체로 상이한 에피토프 - 2개의 상이한 분자 상의 상이한 에피토프(예를 들어, 2개의 상이한 면역원 상의 상이한 에피토프) 또는 동일한 분자 상의 상이한 에피토프(예를 들어, 동일한 면역원 상의 상이한 에피토프) - 와 각각 결합하는 2개의 아암(arm)(예를 들어, 상이한 특이성을 갖는 2개의 중쇄)을 포함한다. 이중특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)와 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 항체 아암의 친화성은 대체로 제2 에피토프에 대한 제1 항체 아암의 친화성보다 적어도 10배 내지 100배 또는 1000배 또는 10000배 또는 그 이상 낮을 것이고, 그 반대도 마찬가지일 것이다. 이중특이적 항체와 특이적으로 결합하는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에(예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상에) 있을 수 있다. 예시적인 이중특이적 항체는 종양 항원에 특이적인 제1 항체 아암 및 세포독성 마커에 특이적인 제2 항체 아암, 예를 들어 Fc 수용체(예컨대, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 등) 또는 T 세포 마커(예컨대, CD3, CD28 등)를 갖는 것들을 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 이중특이적 항체의 하나의 아암은 CD3에 특이적이다. 또한, 종양 항원에 특이적인 제1 아암 및 독소에 특이적인 제2 아암을 갖는 이중특이적 항체는 독소(예를 들어, 사포린, 빈카 알칼로이드 등)를 종양 세포에 전달하도록 쌍을 이룰 수 있다. 다른 예시적인 이중특이적 항체는 활성화 수용체(예를 들어, B 세포 수용체, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRI, T 세포 수용체 등)에 특이적인 제1 아암 및 억제성 수용체(예를 들어, FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a 등)에 특이적인 제2 아암을 갖는 것들을 포함한다. 이러한 이중특이적 항체는 세포 활성화와 관련된 치료 질환(예를 들어, 알레르기 및 천식)에 대해 작제될 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄들을 조합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 동일하거나 상이한 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이적 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR에 이어 (N 말단에서 C 말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는 2개의 중쇄, 및 면역글로불린 경쇄를 가지며, 이 면역글로불린 경쇄는 에피토프 결합 특이성을 부여하지 않지만 각 중쇄와 회합할 수 있거나, 각 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 에피토프 결합 영역과 결합하는 에피토프들 중 하나 이상과 결합할 수 있거나, 각 중쇄와 회합할 수 있고 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 대한 하나 또는 둘 모두의 중쇄의 결합을 가능하게 한다. 유사하게, 문구 "다중특이적 항체"는 다수의 에피토프(예를 들어, 2개, 3개, 4개의 에피토프)와 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다.
문구 "상보성 결정 영역", 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 2개의 프레임워크 영역 사이에 정상적으로(즉, 야생형 동물의 경우) 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어 생식선 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열에 의해 인코딩될 수 있고, 예를 들어 비감작(naive) 또는 성숙한 B 세포에 의해 인코딩될 수 있다. CDR은 체세포 돌연변이(예를 들어, 동물의 생식선에서 인코딩되는 서열과 달라짐)되고/되거나, 인간화되고/되거나, 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실로 변형될 수 있다. 일부 상황의 경우(예를 들어, CDR3의 경우), CDR은 인접하지 않지만(예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열의 경우), 예를 들어, 서열의 스플라이싱 또는 연결(예를 들어, 중쇄 CDR3를 형성하는 V-D-J 재조합)의 결과로서 B 세포 핵산 서열에서 인접한 둘 이상의 서열(예를 들어, 생식선 서열)에 의해 인코딩될 수 있다.
문구 "기능적 단편"은, 발현되고, 분비되고, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 같은 항원 결합 단백질의 단편을 포함한다. 특이적 인식은 적어도 마이크로몰 범위, 나노몰 범위, 또는 피코몰 범위인 KD를 갖는 것을 포함한다.
문구 "중쇄," 또는 "면역글로불린 중쇄"는, 임의의 유기체로부터의, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 달리 특정되지 않는 한, 중쇄 가변 도메인은 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 (N 말단부터 C 말단으로) 가변 도메인 이후에, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능적 단편은, 에피토프를 특이적으로 인식할(예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인식할) 수 있고, 세포로부터 발현 및 분비할 수 있고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 대체로 생식선에 존재하는 VH, DH, 및 JH 세그먼트의 레퍼토리로부터 유래된 VH, DH, 및 JH 세그먼트를 포함하는 가변 영역 유전자 서열에 의해 인코딩된다. 다양한 유기체에 대한 V, D, 및 J 중쇄 세그먼트의 서열, 위치 및 명명법은 국제 면역유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System)(IMGT 데이터베이스) 웹사이트에서 찾아볼 수 있다.
문구 "경쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 달리 특정되지 않는 한, 인간 카파 및 람다 경쇄 및 VpreB뿐만 아니라 대리(surrogate) 경쇄를 포함한다. 달리 특정되지 않는 한, 경쇄 가변 도메인은 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 대체로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인, 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은, 대체로 생식선에 존재하는 V 및 J 세그먼트의 레퍼토리로부터 유래된 VL 및 JL 세그먼트를 포함하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 인코딩된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 경쇄 세그먼트의 서열, 위치 및 명명법은 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT 데이터베이스) 웹사이트에서 찾아볼 수 있다. 경쇄는, 예를 들어 이것이 나타나는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)에 의해 인식되는 임의의 에피토프와 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한, 이것이 나타나는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)과 선택적으로 결합하는 하나 이상의 에피토프와 결합하고 이를 인식하거나, 중쇄가 이와 결합하고 이를 인식하는 것을 보조하는 것들을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "항원 결합 단백질"은 항체 및 관심 항원과 결합할 수 있는 다양한 천연 생성 분자와 유전자조작 분자를 포함한다. 그러한 것은, 예를 들어 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체(예를 들어, 낙타과 및 어류 등으로부터 유래됨), 도메인 결실 항체, 키메라 항체, CDR 이식 항체, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈 면역약제(small modular immunopharmaceutical)(SMIP), 상어 가변 IgNAR 도메인 등을 포함한다. 항원 결합 단백질은 또한 항원 결합 단편, 예를 들어 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위(예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 포함할 수 있다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포(단세포 또는 다세포), 세균 세포(예를 들어, 대장균(E. coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등의 계통), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), P. 파스토리스(P. pastoris), P. 메타놀리카(P. methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 진핵 세포이며, 하기 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60(예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리(Sertoli) 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 앞서 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 실시 형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함하며, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6™ 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 ES 세포이다.
인간화 CD3 단백질은, 일 실시 형태에서 세포외 도메인이 인간 서열인 CD3 단백질을 의미한다. 막관통 및 세포질 도메인은 또한 인간일 수 있지만, 바람직하게는 비인간 내인성 서열이다. 상이한 종으로부터의 서열, 특히 인간 세포외 도메인, 및 비인간 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 CD3 단백질은 또한 키메라 CD3 단백질로 지칭될 수 있다.
유전자 변형된 인간화 CD3 동물
다양한 실시 형태에서, 본 발명은 인간화 CD3 단백질(예를 들어, 인간화 CD3ε, CD3γ, CD3δ, 또는 이들의 조합)을 인코딩하는 핵산 서열을 게놈에(예를 들어, 생식선 게놈에) 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 인간화 CD3δ, 인간화 CD3γ, 및 인간화 CD3ε 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 게놈에 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)을 제공한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시 형태에서, 마우스는 이의 T 세포 표면 상에 인간화 CD3γδε 복합체를 발현하여, 인간화 CD3γδε가, 동일한 T 세포 상에 발현되는 T 세포 수용체와 복합체를 형성하게 한다.
CD3 분자는 통상적으로 T 세포 면역을 조정하는 것을 목표로 하는 작용제의 표적이며, 이를 위해 여러 항-CD3 항체(예를 들어, muromonab-CD3 또는 OKT3)가 개발되어 왔다. OKT3와 같은 항-CD3 항체는 (예를 들어, 이식 거부반응에서) 면역억제제로서 사용되지만, 자가면역 질병(예를 들어, 크론병(Crohn's disease), I형 당뇨병, 궤양성 대장염 등)에서의 이의 치료 잠재력에 대해서도 연구되고 있다.
또한, CD3 분자는 T 세포를 표적 세포, 예를 들어 특정 관심 항원을 발현하는 세포로 동원하는 항-CD3 이중특이적 항체의 능력 때문에 이중특이적 작용제, 예를 들어 이중특이적 항체에 대한 표적으로서도 연구되고 있다. 예시적인 항-CD3 이중특이적 항체는 미국 특허 출원 공개 제2014/0088295호 및 미국 특허 출원 공개 제2015/0266966호에 기술되어 있으며, 두 출원 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
전임상 약물 개발 단계 동안, 후보 작용제는 전형적으로 이의 효능, 독성, 및 다른 약동학적 및 약력학적 특성에 기반하여 연구된다. 항체와 같은 후보 작용제는 전형적으로 인간 항원을 표적화하며, 이 경우 조사의 최종 목표는 인간 치료법을 개발하는 것이다. 많은 전임상 연구는 영장류와 같은 대형 동물에서 수행되는데, 이는 그것의 생리학 및 약물 대사가 인간과 가장 유사하기 때문이다. CD3에 대해 개발된 여러 항체(예를 들어, OKT3)는 비인간 CD3, 특히 영장류 CD3에 교차 반응하지 않는 것으로 알려져 있다. 약물 후보의 효능, 독성, 및 다른 매개변수에 관한 효과적인 전임상 조사를 수행하기 위해, 우선 약물 후보는 영장류 CD3 분자를 인식하는 것으로 결정되어야 한다.
그러나, 항-CD3 요법의 개발을 복잡하게 하는 별도의 요인은 침팬지와 같은 대형 영장류가 멸종 위기에 처해 있으며, 많은 국가에서 침팬지 연구가 금지되어 있는 한편; 다른 영장류, 예를 들어 사이노몰거스 원숭이(마카카 파스키쿨라리스(Macaca fascicularis)) 연구는 윤리적 우려를 불러일으킬 수 있다. 예를 들어, 위의 모든 이유로 인해, 현재까지 인간 종양의 효과적인 영장류 모델은 없다. 따라서, 설치류, 예를 들어 마우스와 같은 더 소형인 동물 모델에서 얻어질 수 있는 특정 치료제 후보에 대한 임의의 예비 데이터는 대형 영장류에서의 전임상 조사의 추가 진행을 결정하는 데 도움이 될 수 있다.
마우스와 같은 소형 동물 모델에서의 전임상 연구는 전통적으로 약물 대리물을 사용하여 수행되어 왔다. 예를 들어, 특정 인간 항원을 표적화하는 임상 후보가 개발 중인 경우, 일부 전임상 데이터는 관심 항원의 마우스 호모로그를 특이적으로 표적화하는 분자, 예를 들어 항원 결합 단백질 또는 항체를 사용하여 마우스에서 생성된다. 효능, 다양한 투여 계획, 독성 및 부작용, 및 약물 투여의 다른 측면에 관한 정보는 이러한 약물 대리물 연구로부터 수집된다. 그러나, 그러한 결과는 제한적인데, 이는 그것이 개발 중인 실제 약물 또는 연구 중인 이의 인간 표적이 아니기 때문이다.
따라서, 예비적인 전임상 연구를 수행하기 위한 가장 유용한 소형 동물 모델은 인간 또는 인간화 CD3 단백질을 발현하며, 사이노몰거스 원숭이 CD3와 또한 교차 반응하는 항-CD3 약물 후보의 시험을 가능하게 하여 후속 영장류 전임상 연구를 가능하게 하는 비인간 동물, 예를 들어 설치류이다. 본 발명은 이러한 복잡한 동물 모델을 제공한다.
따라서, 본 명세서에는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)을 게놈에 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물이 제공된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, CD3 단백질은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3z, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, CD3 단백질은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, CD3 단백질은 CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 유전자 변형된 비인간 동물은 인간 CD3γ의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)을 이의 게놈에 포함한다. 일부 이러한 실시 형태에서, 인간 CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε의 세포외 도메인은 단일 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인간 CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε의 세포외 도메인은 개별적인 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 비인간 동물은 내인성 비인간 CD3 프로모터(들) 및/또는 조절 요소(예를 들어, 내인성 비인간 CD3γ, CD3δ, 및/또는 CD3ε 프로모터 및/또는 조절 요소)를 보유한다. 다른 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 CD3 프로모터(들) 및 조절 요소를 포함한다.
CD3에 대해 생성된 대부분의 항체가 CD3ε 에피토프를 인식한다고 가정되었지만(문헌[Tunnacliffe et al. (1989) International Immunology, 1(5):546-50] 참조), 다른 CD3 서브유닛(예를 들어, CD3γ 또는 CD3δ)을 인식할 수 있거나 결합을 위해 CD3 복합체의 조립을 필요로 할 수 있는 다수의 작용제가 존재한다. 따라서, 인간 CD3γ의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)을 게놈에 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물은 이점을 제공하는데, 이는 이것이 CD3 서브유닛 또는 CD3 복합체 중 어느 것과도 결합하는 작용제를 수용할 수 있기 때문이다.
예시적인 CD3 단백질은 도 4에 정렬로 제시되어 있다. 마우스 CD3ε 단백질 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_031674 및 서열 번호 27에서 찾아볼 수 있는 한편, 인간 CD3ε 단백질 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_000724 및 서열 번호 28에서 찾아볼 수 있다. 마우스 CD3δ 단백질 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_038515 및 서열 번호 29에서 찾아볼 수 있는 한편, 인간 CDδ 단백질 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_000723 및 서열 번호 30에서 찾아볼 수 있다. 마우스 CD3γ 단백질 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_033980 및 서열 번호 31에서 찾아볼 수 있는 한편, 인간 CD3γ 단백질 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_000064 및 서열 번호 32에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간 CD3의 세포외 도메인, 예를 들어 인간 CD3γ의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)은 내인성 비인간 CD3 유전자좌에 위치한다. 바꾸어 말하면, 이러한 핵산은 인간 CD3 폴리펩티드를 인코딩하도록 내인성 CD3 유전자좌를 변형시킨다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은, 기능적 세포외 도메인이 발현되지 않도록 하는 내인성 유전자좌의 유전자 변형 때문에, 상응하는 비인간 CD3 단백질의 기능적 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간 CD3의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)은 내인성 비인간 CD3를 인코딩하는 상응하는 핵산 서열(들)을 대체한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 비인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 대체하고, 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 비인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 대체하며, 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 비인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 대체한다. 일부 실시 형태에서, 대체는 내인성 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 대체를 포함하지 않는다. 다른 실시 형태에서, 대체는 내인성 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 인간 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열로의 대체를 포함한다.
본 발명의 일부 태양에서, 세포외 도메인은 막관통 또는 세포질 도메인이 아닌 단백질(들)의 영역, 예를 들어 세포 표면 상에 나타나며, 부분적으로, 복합체 내에서 조립되는 경우 TCR 신호전달 복합체의 다른 성분의 세포외 도메인, 예를 들어 TCR 알파 및 베타 세포외 도메인과 상호작용하는 단백질의 영역을 포함한다. 본 명세서에 기술된 다양한 실시 형태에서, 세포외 도메인은 세포 표면 상에 발현되는 단백질의 도메인을 지칭하며, 달리 표시되지 않는 한 세포 표면 발현 전에 전형적으로 단백분해적으로 절단되는 신호 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 24에 제시되어 있는 아미노산 서열의 아미노산 17-130(서열 번호 33으로 별도로 제시되어 있음)을 포함한다. 일부 이러한 실시 형태에서, 동물은 내인성 CD3ε 신호 서열, 예를 들어 서열 번호 24의 아미노산 1-16에 있는 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 동물은 인간 CD3ε 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, CD3δ의 세포외 도메인은 서열 번호 25에 제시되어 있는 아미노산 서열의 아미노산 19-105(서열 번호 34로 별도로 제시되어 있음)을 포함한다. 일부 이러한 실시 형태에서, 동물은 내인성 CD3δ 신호 서열, 예를 들어 서열 번호 25의 아미노산 1-18에 있는 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 동물은 인간 CD3δ 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD3γ의 세포외 도메인은 서열 번호 26에 제시되어 있는 아미노산 서열의 아미노산 20-116(서열 번호 35로 별도로 제시되어 있음)을 포함한다. 일부 이러한 실시 형태에서, 동물은 내인성 CD3γ 신호 서열, 예를 들어 서열 번호 26의 아미노산 1-19에 있는 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 동물은 인간 CD3γ 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 태양에서, 비인간 동물은 내인성 CD3 단백질, 예를 들어 상응하는 내인성 CD3 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 상응하는 내인성 비인간 CD3 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하여, 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인 및 상응하는 내인성 비인간 CD3 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 단백질이 발현되게 한다. 따라서, 일 태양에서, 동물은 내인성 비인간 CD3의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)에 작동가능하게 연결된 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(들)을 내인성 CD3 유전자좌에 포함한다. 일 실시 형태에서, 동물은 내인성 CD3ε 유전자좌에, 내인성 비인간 동물 CD3ε의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, 내인성 CD3δ 유전자좌에, 내인성 비인간 동물 CD3δ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, 그리고 내인성 CD3γ 유전자좌에, 내인성 비인간 동물 CD3γ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 인간 세포외 도메인 및 내인성 막관통 및 세포질 도메인을 갖는 키메라 CD3 단백질의 사용은 인간 CD3에 대해 특이성을 갖는 약물의 상호작용을 가능하게 하지만, 또한 완전 인간 CD3 단백질과 비교하여 내인성 T 세포 수용체 및 이의 신호 전달 성분과의 상호작용의 재현을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 일부 태양에서, 비인간 동물은 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 발현한다. 일부 태양에서, 비인간 동물은 서열 번호 33에 제시되어 있는 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 발현한다. 일부 태양에서, 비인간 동물은 서열 번호 34에 제시되어 있는 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 발현한다. 일부 태양에서, 비인간 동물은 서열 번호 35에 제시되어 있는 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 발현한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 포유류이다. 일 태양에서, 비인간 동물은 소형 포유류, 예를 들어 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 것이다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 설치류는 쥐상과로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스라이크 햄스터(mouse-like hamster)), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(트루(true) 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐(gerbil), 가시쥐(spiny mouse), 돌기 래트(crested rat)), 붉은숲쥐과(Nesomyidae)(클라이밍(climbing) 마우스, 락(rock) 마우스, 흰꼬리쥐(white-tailed rat), 마다카스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐(spiny dormouse)) 및 소경쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 뒤쥐(mole rat), 대나무쥐 및 조커(zokor))로부터 선택되는 과에서 유래된다. 특정 실시 형태에서, 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트(쥐과), 게르빌루스쥐, 가시쥐 및 돌기 래트로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 마우스는 쥐과의 구성원으로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 동물은 설치류이다. 특정 실시 형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 마우스이다.
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택되는 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 129 계통이다(예를 들어, 문헌[Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836]을 참조하고, 또한 문헌[Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines]을 참조함). 특정 실시 형태에서, 유전자 변형된 마우스는 앞서 언급한 129 계통과 앞서 언급한 C57BL/6 계통의 혼합체이다. 다른 특정 실시 형태에서, 마우스는 앞서 언급한 129 계통의 혼합체, 또는 앞서 언급한 BL/6 계통의 혼합체이다. 특정 실시 형태에서, 혼합체의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어 BALB/c 계통이다. 또 다른 실시 형태에서, 마우스는 BALB 계통과 앞서 언급한 다른 계통의 혼합체이다.
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 래트이다. 일 실시 형태에서, 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 계통, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 래트 계통은 위스타, LEA, 스프라그 돌리, 피셔, F344, F6 및 다크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 계통의 혼합체이다.
따라서, 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 비인간 동물은 설치류이다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 비인간 동물은 래트 또는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 동물은 마우스이다. 따라서, 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 동물은 마우스이고, 마우스는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 내인성 마우스 CD3 유전자좌에 포함한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 및 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 33에 제시되어 있는 서열을 포함하고, 인간 CD3δ의 세포외 도메인은 서열 번호 34에 제시되어 있는 서열을 포함하며, 인간 CD3γ의 세포외 도메인은 서열 번호 35에 제시되어 있는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 내인성 마우스 CD3 신호 서열(들)을 인코딩하는 서열(들)을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 인간 CD3 신호 서열(들)을 인코딩하는 서열(들)을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 인간화 CD3 단백질(들)을 발현한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 인간화 CD3ε, 인간화 CD3δ, 및 인간화 CD3γ 단백질을 발현한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 마우스는 인간 CD3ε 세포외 도메인과 내인성 마우스 CD3ε 막관통 및 세포질 도메인, 인간 CD3δ 세포외 도메인과 내인성 마우스 CD3δ 막관통 및 세포질 도메인, 및 인간 CD3γ 세포외 도메인과 내인성 마우스 CD3γ 막관통 및 세포질 도메인을 발현한다. 일부 이러한 실시 형태에서, 마우스는 서열 번호 24에 제시되어 있는 인간화 CD3ε, 서열 번호 25에 제시되어 있는 인간화 CD3δ, 및 서열 번호 26에 제시되어 있는 인간화 CD3γ인 인간화 CD3 단백질을 발현한다.
본 발명의 일부 태양에서, 유전자 조작된 마우스는 면역적격 마우스이다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간화 CD3 단백질(들)의 도입은 마우스의 면역계 기능에 영향을 미치지 않는다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 마우스는 정상 T 세포 및 B 세포 비를 포함한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 마우스는 마우스 감염에 대한 정상 반응을 일으킬 수 있다. 일부 태양에서, 마우스는 야생형 마우스, 예를 들어 인간화 CD3 단백질(들)을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스와 비교하여 흉선에서 유사한 CD4+ 대 CD8+ 세포 비를 나타낸다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 마우스의 흉선에서의 CD4+ 대 CD8+ 세포 비는 인간화 CD3 단백질(들)을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스의 CD4+ 대 CD8+ 세포 비의 30% 이내, 예컨대 20% 이내, 예컨대 15% 이내, 예컨대 12% 이내, 예컨대 10% 이내, 예컨대 5% 이내, 예컨대 2% 이내이다. 일부 태양에서, 마우스는 비장, 림프절, 및 말초 혈액에서 야생형 마우스, 예를 들어 인간화 CD3 단백질(들)을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스와 유사한 T 세포 및 B 세포 백분율을 나타낸다. 일부 태양에서, 마우스는 야생형 마우스, 예를 들어 인간화 CD3 단백질(들)을 발현하도록 유전자 변형되지 않은 마우스와 유사한 수의 순환 백혈구, 림프구, 단핵구, 호중구, 호산구, 및 호염기구를 나타낸다.
또한, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 인간화 CD3 단백질을 발현하는 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법은 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 내인성 비인간 동물 CD3 유전자좌에 도입하는 단계를 포함한다. 다수의 인간 CD3 단백질이 도입되는 경우, 이들은 (본 실시예에서와 같이) 단일 핵산 상에 함께 또는 개별적으로 도입될 수 있다. 후자의 경우, 단일 세포주(예를 들어, ES 세포주)는 요망되는 인간 CD3 각각을 인코딩하는 핵산을 포함하도록 변형될 때까지 연속적인 변형을 겪을 수 있다. 일 실시 형태에서, 동물은 상응하는 비인간 CD3 단백질(들)의 기능적 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일 태양에서, 동물은 인간 CD3ε의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 내인성 비인간 CD3 유전자좌에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 33에 제시되어 있고, 인간 CD3δ의 세포외 도메인은 서열 번호 34에 제시되어 있으며, 인간 CD3γ의 세포외 도메인은 서열 번호 35에 제시되어 있다. 일 실시 형태에서, 동물은 상응하는 비인간 CD3 단백질(들)의 기능적 세포외 도메인을 포함하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법은 내인성 CD3 유전자좌에서 비인간 CD3 단백질(들)의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상응하는 인간 CD3 단백질(들)의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 동물은 비인간 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인을 보유한다. 일부 실시 형태에서, 대체는 인간 CD3 단백질(들)의 세포외 도메인 및 상응하는 내인성 비인간 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 단백질(들)을 생성한다.
인간 CD3 단백질(들)을 인코딩하는 핵산(들)이 전형적으로 세포에 도입되고, 비인간 동물이 세포로부터 증식된다. 일부 실시 형태에서, 대체 방법은 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 제조된 표적화 작제물을 이용하며, 실시예에 기술된 바와 같이, 작제물을 ES 세포에 도입하고, VELOCIMOUSE® 기술을 사용하여 표적화된 ES 세포 클론을 마우스 배아에 도입한다.
방법이 내인성 비인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 인간 CD3ε 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로의 대체를 포함하는 일 실시 형태에서, 방법은 마우스 CD3ε 유전자의 내인성 마우스 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열의 인간 CD3ε 유전자의 인간 코딩 엑손 2 내지 엑손 5의 부분 서열로의 대체를 포함한다. 방법이 내인성 비인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로의 대체를 포함하는 일 실시 형태에서, 방법은 마우스 CD3δ의 내인성 마우스 코딩 엑손 2 내지 엑손 3의 부분 서열의 인간 CD3δ 유전자의 인간 코딩 엑손 2 내지 엑손 3의 부분 서열로의 대체를 포함한다. 방법이 내인성 비인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로의 대체를 포함하는 일 실시 형태에서, 방법은 마우스 CD3γ의 마우스 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열의 인간 CD3γ 유전자의 인간 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열로의 대체를 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 대체는 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ의 서열의 대체를 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 대체는, 예를 들어 실시예 1에 기술된 바와 같이, 모든 3개의 유전자좌에 순차적인 유전자 변형을 포함시키는 대형 표적화 벡터를 생성하고, 이어서 대형 표적화 벡터를 마우스 ES 세포에 도입시켜 마우스를 제조함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 명세서에는 본 발명의 유전자 변형된 동물을 제조하기 위한 대형 표적화 벡터가 제공된다. 일 실시 형태에서, 대형 표적화 벡터는 5' 및 3' 마우스 상동성 아암; 마우스 CD3ε 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열의 인간 CD3ε 코딩 엑손 2 내지 엑손 5의 부분 서열로의 대체를 포함하는 CD3ε 유전자를 포함하는 DNA 단편; 마우스 CD3δ 코딩 엑손 2 내지 엑손 3의 부분 서열의 인간 CD3δ 코딩 엑손 2 내지 엑손 3의 부분 서열로의 대체를 포함하는 CD3δ 유전자를 포함하는 DNA 단편; 마우스 CD3γ 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열의 인간 CD3γ 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열로의 대체를 포함하는 CD3γ 유전자를 포함하는 DNA 단편; 및 선택 카세트를 포함한다.
선택 카세트는 관심 작제물이 통합된 세포(예를 들어, 세균 세포, ES 세포)의 선택을 용이하게 하기 위해 표적화 작제물에 삽입된 뉴클레오티드 서열이다. 다수의 적합한 선택 카세트(Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC 등)가 당업계에 알려져 있다. 또한, 선택 카세트는, 재조합효소로 처리 시 선택 카세트의 결실을 가능하게 하는 재조합 부위에 의해 플랭킹(flanking)될 수 있다. 통상적으로 사용되는 재조합 부위는 각각 Cre 및 Flp 효소에 의해 인식되는 loxP 및 Frt이지만, 다른 것들이 당업계에 공지되어 있다. 선택 카세트는 코딩 영역 외부에 작제물 내의 어느 곳에나 위치할 수 있다. 일 실시 형태에서, 선택 카세트는 인간 CD3ε 삽입 서열의 상류에 삽입된다.
유전자 표적화의 완료 시, ES 세포 또는 유전자 변형된 비인간 동물은, 관심 외인성 뉴클레오티드 서열의 성공적인 포함 또는 외인성 폴리펩티드의 발현을 확인하도록 스크리닝된다. 다수의 기법이 당업자에게 공지되어 있으며, 서던 블롯팅(Southern blotting), 긴 PCR, 정량적 PCR(예를 들어, TAQMAN®을 사용하는 실시간 PCR), 형광 동소 하이브리드화(fluorescence in situ hybridization), 노던 블롯팅(Northern blotting), 유동 세포계측법, 웨스턴 분석, 면역세포화학, 면역조직화학 등을 포함한다(그러나 이에 제한되지 않음). 일례에서, 관심 유전자 변형을 갖는 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은, 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]에 기술된 대립유전자 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및/또는 인간 대립유전자의 이득에 대해 스크리닝함으로써 식별될 수 있다. 유전자 변형된 동물에서 특정 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 식별하는 다른 검정은 당업자에게 공지되어 있다.
상기 방법으로부터 생성된 이형접합체는 동형접합체를 생성하도록 번식될 수 있다.
일 태양에서, 키메라 인간/비인간 CD3 분자를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 단일 세포에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 뉴클레오티드 작제물로부터 키메라 CD3 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 뉴클레오티드 작제물은 바이러스 벡터이고; 특정 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시 형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
일 태양에서, 키메라 인간/비인간 CD3 단백질을 발현하는 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 키메라 CD3 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물에 의해 제조된 키메라 CD3 분자가 제공되며, 일 실시 형태에서, 키메라 CD3 분자는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부의 아미노산 서열, 및 비인간 CD3 단백질, 예를 들어 마우스 CD3 단백질로부터의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
유전자 조작된 비인간 동물 이외에, 또한 비인간 배아(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트 배아)가 제공되며, 배아는 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)로부터 유래되는 도너(donor) ES 세포를 포함한다. 일 태양에서, 배아는 키메라 CD3 유전자를 포함하는 ES 도너 세포, 및 숙주 배아 세포를 포함한다.
또한, 조직이 제공되며, 조직은 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)로부터 유래되며, 키메라 CD3 단백질을 발현한다.
또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 단리된 비인간 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 세포는 ES 세포이다. 일 실시 형태에서, 세포는 T 세포이다. 일 실시 형태에서, 세포는 CD8+ T 세포이다. 다른 실시 형태에서, 세포는 CD4+ T 세포이다.
일부 실시 형태에서, 또한 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 인간화 CD3 단백질(들)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자좌가 제공된다.
인간 치료법을 시험하기 위한 마우스 모델
일부 태양에서, 본 명세서에는 CD3 표적화("항-CD3") 치료제를 시험하기 위한 마우스 모델이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에는 항-CD3 항원 결합 단백질을 시험하기 위한 마우스 모델이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에는 항-CD3 항체를 시험하기 위한 마우스 모델이 제공된다. 일부 이러한 실시 형태에서, 항-CD3 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항-CD3 이중특이적 항체를 시험하기 위한 마우스 모델이 제공된다. 이와 같이, 항-CD3 다중특이적 항원 결합 단백질, 예를 들어 항-CD3 이중특이적 항원 결합 단백질은 상기 인간화 CD3 단백질 및 적어도 하나의 다른 관심 항원을 표적화하거나 이와 특이적으로 결합한다. 다양한 태양에서, CD3와 관심 항원 둘 모두와 결합할 수 있는 항-CD3 이중특이적 항원 결합 단백질을 시험하기 위한 마우스 모델은, CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간화 CD3 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 및 관심 항원을 발현 또는 포함하는 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 상기 인간화 CD3 단백질(들)을 발현하는 T 세포를 포함한다.
일 실시 형태에서, 단일특이적 또는 이중특이적 항원 결합 단백질의 시험은 상기 인간화 CD3 단백질을 발현하는 T 세포에 대한 항원 결합 단백질의 효과의 결정을 가능하게 하는 검정 또는 연구를 수행하는 것을 수반한다. 다른 실시 형태에서, 이중특이적 항원 결합 단백질의 시험은 상기 인간화 CD3 단백질을 발현하는 T 세포와 관심 항원을 발현 또는 포함하는 세포 둘 모두에 대한 항원 결합 단백질의 효과, 또는 상기 CD3 발현 T 세포와 관심 항원을 발현 또는 포함하는 세포 사이의 상호작용의 결정을 가능하게 하는 검정 또는 연구를 수행하는 것을 수반한다. 일 실시 형태에서, 단일특이적 또는 이중특이적 항원 결합 단백질의 시험은 상기 관심 항원을 발현 또는 포함하는 세포에 대한 상기 인간화 CD3 단백질을 발현하는 T 세포의 효과의 결정을 가능하게 하는 검정 또는 연구를 수행하는 것을 수반한다. 일 실시 형태에서, 이러한 검정은, 예를 들어 관심 항원을 발현하는 세포 수, 면역 반응, 세포 상호작용, 세포독성, 사이토카인 방출, 세포 활성화, 세포 증식, 종양 성장 또는 퇴행, 병리의 변화 등을 측정한다. 다양한 검정은 보체 유도 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), PBMC 증식, CD69 활성화, 조직학적 조직 분석, 조직의 분석 및 세포 바이오마커의 측정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 세포 또는 조직은 검정을 위해 마우스로부터 추출되거나 방사선촬영, MRI, PET, SPECT, BLI, 및 형광 기반 이미징 기법에 의해 분석될 수 있음).
본 발명의 일부 실시 형태에서, 이러한 마우스 모델의 경우, 관심 항원이 상기 마우스에 도입되었다. 관심 항원은 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 도입될 수 있다. 일부 비제한적 방법은 유전자이식, 주사, 감염, 조직 또는 세포 이식을 포함한다. 관심 항원 또는 이의 단편(예를 들어, 시험되는 항원 결합 단백질에 의해 인식되는 단편)은 특정 세포 유형에 표적화되거나 이에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 관심 항원은 마우스 게놈에 의해 인코딩되는 관심 인간화 항원이다.
관심 항원은 막 결합 단백질이어서 세포 표면 상에서만 발현될 수 있다. 대안적으로, 관심 항원 또는 이의 단편(예를 들어, 시험되는 항원 결합 단백질에 의해 인식되는 단편)은 다른 단백질 또는 모이어티(moiety)와 복합체를 이루어 세포 표면 상에 나타날 수 있다. 일부 세포-표면 항원은 공-수용체 복합체로서 다른 단백질과 회합하거나, 세포외 분자와 결합하거나 이에 친화력을 가질 수 있다. 따라서, 마우스 모델은 다양한 세포 시스템에서 T 세포와 상호작용하는 이중특이적 항원 결합 분자를 시험하는 데 이용될 수 있다.
일 실시 형태에서, 마우스 모델은 인간 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 세포외 도메인을 발현한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ의 마우스 막관통 및 세포질 도메인을 발현하고; 일 실시 형태에서, 막관통 및 세포질 도메인은 내인성 마우스 도메인이다. 일 실시 형태에서, 마우스 모델은, 각각 인간 세포외 도메인 및 마우스, 예를 들어 내인성 마우스, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는, CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ을 발현한다.
본 발명의 다양한 실시 형태에서, 항원 결합 단백질은 마우스 모델에서 CD3와 관심 항원 둘 모두와 결합한다. 일 실시 형태에서, 관심 항원은 인간 항원이다. 일 실시 형태에서, 관심 항원은 영장류 항원, 예를 들어 사이노몰거스 원숭이 항원이다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 단백질은 인간 기원과 원숭이 기원 둘 모두의 동일한 관심 항원과 결합할 수 있다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 단백질은 인간 CD3와 원숭이 CD3 둘 모두와 결합할 수 있다.
일 실시 형태에서, 마우스 모델은 관심 항원을 발현하는 종양의 이종이식편을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 마우스에서 관심 항원을 발현 또는 포함하는 세포는 종양 세포와 같은 불멸화 세포이다. 따라서, 마우스 모델은 관심 항원을 발현하는 종양 세포를 차단하거나 이에 영향을 미치는 항-CD3 이중특이적 항원 결합 단백질의 활성을 시험하는 데 이용된다.
따라서, 관심 항원을 발현 또는 포함하는 세포가 종양 세포인 본 발명의 실시 형태에서, 관심 항원은 종양 관련 항원(TAA)일 수 있다. 다양한 종양 항원은 T 세포 정의 종양 항원의 데이터베이스에 열거되어 있다(문헌[van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013]). 예시적인 종양 관련 항원은 ALK, BAGE 단백질, BIRC5(서비빈), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20(MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR 변이체 III, ERBB2(HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE 단백질, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV 유래 LMP2, L1CAM, MAGE 단백질, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1(CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA(FOLH1), RAGE 단백질, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6(LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, 톰슨-누벨 항원, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일례에서, 본 명세서의 실시예 3에 기술된 바와 같이, 관심 항원은 CD20, 예를 들어 인간 또는 인간화 CD20일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 마우스 모델은 후보 이중특이적 항원 결합 단백질이 감염성 질병 관련 항원인 관심 항원을 차단하거나 이에 영항을 미칠 수 있는지를 결정하는 데 사용된다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 마우스는 감염체로 감염된다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 감염성 질병 관련 항원은 바이러스 항원이다. 일 태양에서, 바이러스 항원은 HIV, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 엡스타인 바르 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕삭키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 전염성 연속종 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 에볼라 바이러스, 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관심 항원이 감염성 질병 관련 항원인 본 발명의 다른 실시 형태에서, 관심 항원은 세균 항원이다. 본 발명의 일부 태양에서, 세균 항원은 클라미디아, 리케차, 미코박테리아, 포도상구균, 연쇄구균, 폐렴구균, 수막구균, 임질균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저병, 페스트, 렙토스피라, 및 라임병 세균 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 태양에서, CD3 기반 이중특이적 항원 결합 단백질은 인간 CD3 기반 항원 결합 단백질이다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 단백질은 항체, 예를 들어 인간 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 마우스 모델은 면역적격 마우스 모델이다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 마우스 모델은 관심 항원 결합 단백질의 효능 및/또는 독성의 시험을 가능하게 한다. 효능의 척도는 이중특이적 작용제에 의해 표적화되는 관심 항원에 좌우될 것이다. 일부 실시 형태에서, 효능의 척도는 항원을 발현하는 세포의 T 세포 치사이다. 다른 실시 형태에서, 효능의 척도는 바이러스의 중화이다. 다른 실시 형태에서, 효능의 척도는 동물의 생존율일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 효능의 척도는 관심 항원을 발현하는 세포의 제거, T 세포의 증식, 사이토카인(예를 들어, IFNg, TNFa, IL-1, IL-2, IL-10, IL4, IL-6, 그랜자임(granzyme), 퍼포린(perforin) 등)의 생성일 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 동물에서의 독성은 동물에서의 불리한 사건, 예를 들어 체중 변화, 식욕, 소화 변화, 혈구 수 변화, 비장비대, 기관의 조직학적 변화, 간 효소 기능의 변화, 소변검사의 변화, 기관 독성, 출혈, 탈수, 탈모 및 지저분함(scruffiness), 또는 이환의 다른 징후로서 측정될 수 있다. 한 가지 척도는, 일 실시 형태에서 기관 조직학, 구체적으로 관심 항원을 발현하는 것으로 알려져 있지 않은 조직 또는 세포 유형에서의 항원 결합 단백질의 검출에 의해 검출될 수 있는 비관련 항원과의 항원 결합 단백질 교차 반응의 결정일 수 있다.
유전자 변형된 비인간 동물의 사용
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 유전자 변형된 비인간 동물을 사용하는 다양한 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에는, (a) 내인성 마우스 CD3 유전자좌에 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 마우스를 제공 또는 수용하는 단계, (b) 상기 유전자 변형된 마우스에 관심 항원을 도입하는 단계, (c) 상기 마우스를, 인간 CD3와 관심 항원에 대해 유도된 관심 약물 후보와 접촉시키는 단계, 및 (d) 약물 후보가 관심 항원의 존재 또는 발현을 특징으로 하는 세포를 예방, 감소 또는 제거하는 데 효과적인지를 결정하는 단계를 포함하는, 관심 항원을 표적화하는 치료 약물 후보를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 다양한 실시 형태에서, 마우스는 이의 T 세포 표면 상에 기능적 인간화 CD3 단백질을 발현한다. 방법의 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 마우스는 내인성 마우스 CD3 유전자좌에 인간 CD3ε의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법의 일 실시 형태에서, 마우스는 상응하는 마우스 단백질의 기능적 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 방법의 일부 실시 형태에서, 인간 CD3 단백질(들)의 세포외 도메인(들)은 상응하는 내인성 마우스 CD3 단백질(들)의 막관통 및 세포질 도메인(들)에 작동가능하게 연결되어 있다. 방법의 이러한 다양한 실시 형태에서, 인간 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 33에 제시되어 있고, 인간 CD3δ의 세포외 도메인은 서열 번호 34에 제시되어 있으며, 인간 CD3γ의 세포외 도메인은 서열 번호 35에 제시되어 있다. 본 명세서에 기술된 방법의 다양한 실시 형태에서, 마우스는 서열 번호 24에 제시되어 있는 인간화 CD3ε 단백질, 서열 번호 25에 제시되어 있는 인간화 CD3δ 단백질, 및 서열 번호 26에 제시되어 있는 인간화 CD3γ를 발현할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법의 다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 유전자 변형된 마우스에 관심 항원을 도입하는 것은, 제한 없이 유전자이식, 주사, 감염, 조직 또는 세포 이식을 포함할 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 이와 같이, 도입은 마우스에서 관심 항원을 발현시킴으로써 달성될 수 있으며, 이는 관심 항원을 발현하도록 상기 마우스를 유전자 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 도입은, 예를 들어 세포 또는 조직 이식에서와 같이, 관심 항원을 발현하는 세포를 상기 마우스에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 도입은 또한, 예를 들어 세균 또는 바이러스 감염에서와 같이, 상기 마우스를 관심 항원으로 감염시키는 것을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 관심 항원은 관심 인간 항원일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 이는 관심 세균 또는 바이러스 항원일 수 있다.
관심 항원은, 앞서 상세히 기술된 바와 같이 종양 관련 항원일 수 있다. 또한, 항원은 앞서 상세히 기술된 바와 같이 감염성 질병 관련 항원, 예를 들어 세균 또는 바이러스 항원일 수 있다.
치료 약물 후보를 스크리닝하는 방법의 다양한 실시 형태에서, 약물 후보는 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체, 예컨대 이중특이적 항체일 수 있다. 다양한 태양에서, 이러한 약물 후보는 인간 CD3와 관심 항원 둘 모두와 결합할 수 있다. 관심 항원은 인간 항원일 수 있다. 관심 항원은 또한 영장류(예를 들어, 원숭이) 항원일 수 있다. 따라서, 스크리닝에 사용되는 약물 후보는 인간 CD3와 결합하는 것 이외에 인간 항원과 상응하는 영장류 항원 둘 모두와 결합 가능할 수 있다. 약물 후보는 또한 영장류(예를 들어, 원숭이) CD3와 결합 가능할 수 있다. 따라서, 약물 후보는 인간 CD3 및 영장류(예를 들어, 원숭이) CD3 둘 모두와 결합 가능할 수 있고; 또한, 일 실시 형태에서, 관심 인간 항원과 결합 가능할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 관심 항원은 세균 또는 바이러스 항원일 수 있고, 약물 후보는 인간 CD3 및 영장류(예를 들어, 원숭이) CD3 및 관심 세균 또는 바이러스 항원 모두와 결합 가능할 수 있다.
일부 태양에서, 치료제 후보는 인간 항체인 항체이다. 다른 태양에서, 이는 인간화 항체일 수 있다. 예를 들어, 치료제 후보는 VELOCIMMUNE® 마우스에서 생성된 항체일 수 있고(본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,502,018호); 이에 따라, 초기 항체 후보는 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체 후보의 마우스 불변 영역은, VELOCIMMUNE® 마우스에서 선택된 인간 가변 영역을 인간 불변 영역과 작동가능한 연결로 발현시킴으로써 인간 기원을 가진 것으로 재유전자조작될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법의 다양한 실시 형태에서, 치료제 후보는 질병을 감소, 제거, 또는 예방할 수 있다. 일 실시 형태에서, 질병은 종양이고, 치료제 후보는 관심 항원을 표적화하지 않는 작용제와 비교하여 종양 성장을 감소, 제거, 또는 예방할 수 있다. 방법의 이러한 실시 형태에서, 약물 후보가 관심 항원의 존재 또는 발현을 특징으로 하는 세포를 예방, 감소 또는 제거하는 데 효과적인지 여부의 결정은 종양 부피 검정, 종양 세포 치사 검정, 종양에서의 아폽토시스 마커(apoptotic marker)의 유도, 종양에서의 혈관 성장의 감소, 면역 세포의 종양 내로의 침투 등을 사용하여 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 질병은 감염성 질병이고, 치료제 후보는 관심 항원을 표적화하지 않는 작용제와 비교하여 세균 또는 바이러스 감염을 감소, 제거 또는 예방할 수 있다. 방법의 이러한 실시 형태에서, 약물 후보가 관심 항원의 존재 또는 발현을 특징으로 하는 세포를 예방, 감소 또는 제거하는 데 효과적인지 여부의 결정은 세균 또는 바이러스 역가, 감염된 세포에서의 아폽토시스 마커의 유도 등의 척도를 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화 CD3 마우스의 다른 사용 방법이 제공된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 비인간 동물, 예를 들어 인간화 CD3 마우스는 약물 작용의 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 동물의 개발 이전에, 약물 작용의 메커니즘을 연구하는 것은 어려웠는데, 이는 이러한 연구가 인간 및 영장류에서 전형적으로 수행되지 않으며 종종 면역적격 동물 모델을 필요로 하기 때문이다. 약물 작용 메커니즘의 이해는 더 나은 항체의 개발로 이어질 수 있다. 본 발명의 다양한 실시 형태에서, 인간화 CD3 마우스는 면역적격 마우스이다. 예를 들어, 모든 면역 세포 유형의 온전한 발달 및 완전한 보완 그리고 온전한 면역 신호전달 경로를 갖는 건강한 정상 면역계를 포함하는 본 발명의 인간화 CD3 마우스는 특정 세포 유형, 사이토카인, 케모카인 등에 대한 다양한 치료제 후보의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 마우스는 약물 후보 기능에 관한 메커니즘적 질문에 응답하는 데 사용될 수 있다.
또한, 인간화 CD3 마우스는 종양 이식편에 대한 이중특이적 항-CD3 약물 후보의 효과를 시험하는 것을 수반하는 방법에 사용될 수 있다. 이전에 개발된 마우스 모델은 적절한 인간 종양 생착을 가능하게 하는 면역저하 마우스 모델이었다. 인간화 CD3 마우스는 완전 면역적격이며, 관심 항원을 발현하는 종양 세포의 도입 및 성장을 가능하게 하므로, 면역 반응에 대한 완전한 영향을 연구할 수 있고, 이는 메커니즘적 질문, 초기 독성 질문, 초기 효능 질문 등에 대한 응답을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시 형태에서, 인간화 CD3 마우스는 동물 모델에서 병용 약물 요법, 구체적으로는, 예를 들어 하나의 약물이 CD3와 결합하는 항원 결합 단백질이고 다른 약물이 이전에 특정 적응증에 대해 승인된 작용제인 병용 약물 요법의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있다. 약물 투여 및 이의 효과에 관한 특정 질문이 임의의 인간 실험 이전에 동물 모델에서 다루어질 수 있다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지를 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하려고 하는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 확보하기 위한 노력이 이루어졌으나, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 실시예는 당업자에게 잘 알려진 종래의 방법(분자 클로닝 기법 등)의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨로 표시되며, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
실시예 1. 인간화 CD3 유전자좌의 작제
실시예 1.1. 인간화 CD3γδε의 작제
마우스 CD3 유전자좌는 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 인간 및 마우스 세균 인공 염색체(BAC) DNA로부터 독특한 표적화 벡터를 작제함으로써 인간화하였다(예를 들어, 둘 모두 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659] 참조). 마우스 BAC bMQ-425K11로부터의 DNA를 상동 재조합에 의해 변형시켜, 마우스 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 유전자(9번 염색체 상에 서로 매우 근접하게 위치한 마우스 CD3 유전자)의 부분을 인코딩하는 게놈 DNA를 각각 인간 BAC RP11-414G21로부터 유래된 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 유전자(인간 CD3 유전자는 11번 염색체 상에 서로 매우 근접하게 위치해 있음)의 상응하는 부분으로 대체하였다.
구체적으로, 인간화 CD3γδε 마우스를 생성하기 위해, 마우스 상동성 아암을 사용하고 Spec 카세트를 포함하는 표적화 벡터를 사용하는 단일 표적화 사건으로 714 bp의 마우스 Cd3d 서열(Cd3d 유전자의 마우스 코딩 엑손 2 내지 엑손 3의 부분 서열에 상응함)을 939 bp의 인간 CD3D 서열(CD3D 유전자의 인간 코딩 엑손 2 내지 엑손 3의 부분 서열에 상응함)로 대체함으로써 먼저 마우스 BAC을 변형시켰다.
후속하여, 또한 다른 Spec 카세트 함유 벡터 및 마우스 상동성 아암을 사용하는 단일 표적화 사건으로 1,738 bp의 마우스 Cd3g 서열(Cd3g 유전자의 마우스 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열에 상응함)을 1,639 bp의 인간 CD3G 서열(CD3G 유전자의 인간 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열에 상응함)로 대체함으로써, CD3d 유전자의 마우스 코딩 엑손 2 내지 엑손 3의 부분 서열의 상응하는 인간 서열로의 대체를 포함하는 마우스 BAC을 변형시켰다.
마지막으로, 6,213 bp 마우스 CD3e 서열을 6,817 bp의 인간 서열로 대체함으로써(마우스 CD3e 유전자의 마우스 코딩 엑손 2 내지 엑손 4의 부분 서열의 인간 CD3E 유전자의 인간 코딩 엑손 2 내지 엑손 5의 부분 서열로의 대체에 상응함), 마우스 CD3d 및 CD3g 유전자의 상응하는 인간 유전자로의 대체를 포함하는 BAC를 추가로 변형시켰다. 4,996 bp의 플록싱(floxing)된 네오마이신 카세트를 인간 CD3E 서열 녹인의 상류에 삽입하였다.
ES 세포 내로의 삽입을 위한 생성된 대형 인간화 표적화 벡터가 도 2a에 도시되어 있으며, A, B, C, D, E, F, 및 G는 다양한 마우스/인간 또는 마우스/NEO 카세트 또는 인간/NEO 카세트 접합부를 표시한다. 접합부에서의 서열은 하기 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
Figure pct00003
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 CD3 유전자좌에 결실을 포함하는 마우스 ES 세포를 일렉트로포레이팅(electroporating)함으로써 이의 T 세포 표면 상에 인간화 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ를 발현하는 마우스를 생성하는 변형된 ES 세포를 생성시켰다. 인간 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 서열의 삽입을 함유하는 ES 세포를 정량적 TAQMAN™ 검정에 의해 식별하였다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48] 참조). 특정 프라이머 세트 및 프로브를 인간 서열의 삽입(대립유전자의 이득, GOA) 및 마우스 서열의 결실(대립유전자의 손실, LOA)을 검출하기 위해 설계하였다. 표 2는 정량적 PCR 검정에 사용되는 각 프라이머/프로브 세트의 명칭 및 위치를 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00004
전술한 표적화된 ES 세포를 도너 ES 세포로 사용하여, VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8세포기의 마우스 배아에 도입하였다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조). 독립적으로 인간화 CD3 유전자를 갖는 VELOCIMICE®(도너 ES 세포로부터 완전 유래된 F0 마우스)를, 독특한 인간 CD3 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 참조)을 사용하여 유전자형판별에 의해 식별하였다.
선택 카세트는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 인간화 CD3 유전자좌를 갖는 ES 세포는, 플록싱된 카세트를 제거하기 위해 Cre를 발현하는 작제물로 형질감염될 수 있다. 선택 카세트는 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스와 번식시킴으로써 선택적으로 제거될 수 있다. 선택적으로, 선택 카세트는 마우스에 보유된다. 선택 카세트 제거 후의 인간화 CD3ε 대립유전자의 마우스/인간 접합부(도 2b에 A-B로 도시되어 있음)는 하기 표 3에 제시되어 있다. 나머지 접합부 서열은 표적화 벡터에서와 동일하며, 상기 표 1에 제시되어 있다.
[표 3]
Figure pct00005
생성된 인간화 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 단백질의 서열은 도 3에 도시되어 있으며, 서열 목록에 포함되어 있다. 또한, 삽입된 인간 서열의 5' 및 3'에서의 마우스-인간 서열 및 접합부의 정렬은 도 4에 각각 * 및 **로 도시되어 있다. CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 단백질에 대한 GenBank 단백질 수탁 번호는 하기 표 4에 요약되어 있다.
[표 4]
Figure pct00006
실시예 2. 인간화 CD3 마우스의 특성규명
실시예 2.1. 인간화 CD3 마우스에서의 면역 세포 발달
인간 CD3εδγ 마우스의 흉선과 말초에서의 면역 세포 발달은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 및 차별적 세포 계수를 사용하여 평가하였다. 흉선, 비장 및 림프절은 야생형(WT, 인간 CD3γδε 없음), 이형접합성(Het, 하나의 hCD3γδε 대립유전자) 및 동형접합성(Ho, 2개의 hCD3γδε 대립유전자) 마우스의 코호트로부터 수집하였다. 말초 혈액을 심장 천자 또는 안와후방 출혈에 의해 EDTA 코팅된 마이크로테이너 튜브(Microtainer tube)(BD)에 얻었다. 기계적 파쇄를 사용하여 비장, LN 및 흉선으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, AKC 용해 완충액으로의 용해에 의해 비장, 흉선 및 전혈로부터 적혈구를 제거하였다. Fc 수용체를 통한 비특이적 결합을 차단하기 위해 세포를 CD16/CD32에 대한 정제 항체(FcBlock)와 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 T 세포 및 B 세포 마커에 직접 접합된 항체의 칵테일과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS로 2회 세척하고, 완충액에 재현탁하고, FACSCanto II™ 유동 세포계측기(BD Biosciences) 상에서 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 흉선세포는, 먼저 전방 및 측방 산란 게이팅(gating)에 의해, 그리고 이어서 B220- 집단 상에서의 게이팅에 의해 식별하였다. 말초에서, T 세포는 CD45+/TCRb+/B220-로 식별되었고, B 세포는 CD45+/TCRb-/B220+로 식별되었다. 절대 개수는 Hemavet 950FS 혈액학 분석기 상에서 얻었다.
도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, 인간화 CD3γδε 마우스는 흉선, 말초 혈액, 및 비장에서 정상 흉선세포 발달 및 정상 T 세포 및 B 세포 비를 갖는 것으로 나타났다. 또한, T 세포 및 B 세포 백분율은 림프절에서 정상인 것으로 나타났고, 비장 및 림프절의 절대 세포 수(데이터는 도시되지 않음)는 정상 범위 내에 있었다. 혈액 중의 CD4 및 CD8 세포 수는 WT, Het, 및 Ho 마우스 사이에 유사하였다. 순환 백혈구, 림프구, 단핵구, 호중구, 호산구, 및 호염기구는 모두 정상 범위 내로 나타났다(데이터는 도시되지 않음). 따라서, 정상 면역 세포 발달이 인간화 CD3εδγ 마우스에서 관찰된다.
인간화 CD3εδγ 마우스가 다클론성 Vβ CD4+ 및 CD8+ T 세포 레퍼토리를 나타냈는지의 여부를 결정하기 위해, 4 마리의 인간화 마우스 및 5 마리의 계통 매칭된 대조 마우스로부터 비장세포를 단리하고, TCR Vβ 사용빈도(usage)에 대해 조사하였다. 비장을 수집하고, 단일 세포 비장세포를 전술한 바와 같이 준비하였다. Fc 수용체를 통한 비특이적 결합을 차단하기 위해 세포를 CD16/CD32에 대한 정제 항체(FcBlock; Biolegend)와 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 마우스 CD4(Biolegend) 및 마우스 CD8(Biolegend)에 직접 접합된 항체의 칵테일에 재현탁하였다. 이어서, TCR Vβ에 직접 접합된 항체를 개별 웰에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 실온에서 15분 동안 생존율 염료(LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead 세포 염색제, Life Technologies)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 2% FBS를 함유하는 차가운 PBS로 세척하고, 이어서 완충액에 재현탁하고, BD 안정화 완충액으로 고정한 후, LSR Fortessa™ 유동 세포계측기(BD Biosciences) 상에서 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. CD4 및 CD8 T 세포는, 먼저 전방 및 측방 산란 게이팅에 의해, 그리고 이어서 살아있는 집단 상에서의 게이팅에 의해 식별하였다. 이어서, CD4 T 세포(CD4+CD8-) 및 CD8 T 세포(CD4-CD8+)를 TCR Vβ 사용빈도에 대해 조사하였다.
도 5c로부터 알 수 있는 바와 같이, 인간화 CD3εδγ 마우스에서 CD4 및 CD8 T 세포 둘 모두에 의해 사용되는 Vβ 레퍼토리는 다클론성을 나타내며, 사용빈도는 계통 매칭된 대조 마우스와 유의하게 상이하지 않다.
실시예 2.2. 인간화 CD3 마우스에서의 감염에 대한 T 세포 반응
인간화 CD3 마우스(인간화 CD3γδε 마우스)가 감염에 대한 정상 반응을 나타내는지를 결정하기 위해, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)를 제거하는 인간화 마우스의 능력을 시험하였다. LCMV는 마우스 지향성(mouse tropic) 바이러스이며, 감염의 운명은 바이러스 계통에 좌우된다. 암스트롱(Armstrong) 계통으로의 감염은 급성 감염을 초래하며, 마우스는 신속하게 바이러스에 대한 T 세포 반응을 일으킬 수 있고, 약 1주 후에 감염을 제거할 수 있다. 다른 한편, 클론 13 바이러스는 제거될 수 없고, T 세포가 "고갈"되어 만성 감염이 확립된다. 만성 감염과 급성 감염 둘 모두가 T 세포 활성에 좌우되기 때문에, LCMV는 T 세포 기능을 시험하는 이상적인 모델이다.
6 주령 내지 8 주령의 인간화 CD3 또는 계통 매칭된 대조 마우스를, 2×105 ffu의 암스트롱(복강내) 및/또는 클론 13 감염의 경우 2×106 ffu의 클론 13(정맥내)으로 감염시키고, 감염 2주 후 비장을 채취하고, 바이러스 역가를 플라크 검정에 의해 측정하였다. 바이러스 역가는 대조 마우스와 huCD3 마우스 둘 모두에서 유사하였으며(도 6a), 이는 T 세포가 둘 모두의 마우스 계통에서 유사한 수준으로 바이러스를 조절할 수 있기 때문에, CD3 인간화는 T 세포 고갈 표현형에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 암스트롱 계통 감염의 경우, 최초 암스트롱 계통 감염 2 주 후 마우스를 클론 13으로 시험감염(challenge)시키고, 클론 13 시험감염 2주 후 바이러스 역가를 비장에서 측정하였다. 대조 마우스 또는 인간화 CD3 마우스에서 바이러스는 검출되지 않았다(도 6b). 데이터는 급성 암스트롱 감염이 제거되었음을 암시한다. 또한, 이는 암스트롱 감염으로부터 유발된 T 세포 기억이 둘 모두의 마우스 계통에서 후속 클론 13 감염으로부터 마우스를 보호하기에 충분하였음을 입증한다.
실시예 3. 항-CD3 기반 치료제 후보를 시험하기 위한 모델로서의 인간화 CD3 마우스
실시예 3.1. 사이노몰거스 원숭이 교차 반응성 항-인간 CD3 항체를 시험하기 위한 인간화 CD3 마우스
야생형(WT) 또는 인간화 CD3γδε(Ho = 동형접합성, Het = 이형접합성) 마우스로부터의 비장세포와 결합하는 다양한 인간 제한 또는 사이노몰거스 교차 반응성 항-CD3 항체의 능력을 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 사용하여 시험하였다.
새로 단리한 비장세포(웰당 2×105개)를 항-CD3 항체(15 ug/ml)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척하고, 적절한 2차 항체(예를 들어, 형광 태깅된(tagged) PE 항-인간 IgG 및 T 세포 마커에 직접 접합된 항체)를 첨가하고, 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 2회 세척하였다. 하기 항체를 사용하였다: ah/mfCD3-2 및 ah/mfCD3-1은 인간 및 원숭이 CD3 둘 모두를 인식하는 2개의 항체이고; ahCD3-2 및 ahCD3-1은 인간 CD3만을 인식하는 2개의 항체이고, amCD3-2C11은 마우스 CD3만을 인식하는 항체이고, 대조 인간 IgG는 무관한 대조 항체이며, 2nd 단독은 2차 항체 단독 대조군이다. 세포를 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS로 2회 세척하고, 완충액에 재현탁하고, FACSCanto II™ 유동 세포계측기(BD Biosciences) 상에서 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. T 세포는 CD45+/TCRb+/B220-로 식별되었다. hIgG1을 함유하도록 유전자조작된 항-mCD3-2C11을 WT 마우스 비장세포 상의 T 세포를 식별하는 데 사용하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 인간 CD3만을 인식한 항-CD3 항체는 인간화 CD3γδε 마우스로부터의 비장세포 표면 상의 CD3와 결합할 수 있었고; 유사하게, 인간 및 원숭이 CD3를 인식한 항-CD3 항체는 인간화 CD3γδε 마우스 표면 상의 CD3와 결합할 수 있었다. 따라서, CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 3가지 모두에 대해 인간화된 마우스는 CD3 기반 약물 후보의 초기 전임상 연구와 관련이 있으며, 이에 후속하여 사이노몰거스 원숭이에서의 효능 및 독성 연구가 수행될 수 있다.
실시예 3.2. 인간화 CD3 마우스에서의 T 세포 활성화
인간화 CD3 마우스에서 면역 반응을 유발하는 항-인간 CD3 항체의 능력을 시험하였다. CD3γδε에 대해 인간화된 마우스(그룹당 2 마리의 n)에 10 ug의 다양한 인간 제한 또는 사이노몰거스 교차 반응성 항-CD3 항체(모두 hIgG1)를 복강내 주사하였다. 세포 조성 및 혈장 사이토카인 수준을 얻기 위해, 주사 2시간 후부터 시작하여 안와후동으로부터 EDTA 코팅된 마이크로테이너 튜브(BD)로 혈액을 채취하였다. 말초 T 세포와 B 세포의 수를 FACS에 의해 평가하였다. 간략하게 말하면, 50 ul의 전혈을 T 세포와 B 세포 마커에 직접 접합된 항체의 칵테일과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. AKC 용해 완충액으로의 용해에 의해 적혈구를 제거하고, 표지된 세포를, 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS로 1회 세척하였다. 세척 후, 세포를 차가운 완충액에 재현탁하고, FACSCANTO II™ 유동 세포계측기(BD Biosciences) 상에서 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. T 세포는 살아있는 CD45+/TCRb+/B220-로 식별되었고, B 세포는 살아있는 CD45+/TCRb-/B220+로 식별되었다. 절대 세포 수는 공지된 양의 CountBright TM 절대 계수 비드(Absolute Counting Bead)를 첨가함으로써 결정하였다. 혈장 사이토카인 수준은 주사 2시간 후에 얻은 혈액으로부터 Mouse ProInflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive 키트(Meso-Scale Discovery)를 사용하여 평가하였다.
도 8a에 도시된 바와 같이, 10 ug의 항-CD3 항체의 주사는 일시적인 T 세포 및 B 세포 고갈을 유도하였고, 이는 최초 항체 처리 후 4일째까지 크게 회복되었다. 또한, 항-CD3 항체(인간 CD3만을 인식하는 항-CD3 항체(ahCD3-1 및 ahCD3-3) 및 인간 및 원숭이 CD3 둘 모두를 인식하는 항-CD3 항체(ah/mfCD3-1 및 ah/mfCD3-2) 모두)의 주사는 CD3γδε 인간화 마우스에서 사이토카인 생성을 유도하였다(도 8b).
또한, 야생형 또는 인간화 CD3γδε 마우스로부터 얻어진 비장세포의 증식을 유도하는 항-인간 CD3, 항-인간/사이노몰거스 CD3, 또는 항-마우스 항체의 능력을, ATP 촉매 정량(CellTiter Glo®)를 사용하여 평가하였다. 마우스 비장세포의 활성화는 사이토카인의 방출을 가져오며, 이는 세포 증식을 유발한다. 하기 프로토콜을 사용하여 증식 데이터를 획득하였다: 야생형(WT) 또는 인간화 동협접합성 CD3γδε(hCD3γδεHo)로부터 유래된 비장세포(5×105개/웰)를, 감소하는 양의 인간 제한, 사이노몰거스 교차 반응성, 또는 뮤린 특이적 항-CD3 항체로 4℃에서 밤새 코팅한 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 500 ng/ml의 항-마우스 CD28을 배양물에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, CellTiter Glo®를 첨가하고, VICTOR X5 다중 라벨 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 발광을 측정하였다. Prism(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 GraphPad Software)을 사용하여 세포 생존율의 EC50(ATP 촉매 정량)을 결정하였다. 4-매개변수 비선형 회귀 분석을 사용하여 값을 계산하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 인간화 CD3γδε 마우스로부터의 비장세포는 사이노몰거스 원숭이 교차 CD3 항체에 의해 증식하도록 유도되었다.
WT 및 CD3γδε 마우스의 다양한 특성의 요약은 도 10에 제시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, CD3γδε 마우스로부터의 림프구는 항-인간 CD3 항체와 결합하며, 항-인간 CD3 항체, 특히 원숭이 CD3와 교차 반응하는 것으로 알려진 것들에 반응할 수 있는데, 이는 약물 후보에 대한 전임상 연구가 종종 사이노몰거스 원숭이와 같은 대형 동물에서 수행되기 때문에 치료제에 있어서 중요한 측면이다.
실시예 3.3. 인간화 CD3 마우스에서의 종양 고갈 연구
CD3 유전자좌에서 인간화된 마우스를 CD20 유전자좌에서 인간화된 마우스와 교배시킴으로써 CD3(전술한 인간화 CD3γδε 마우스) 및 CD20 둘 모두에 대해 이중 인간화된 마우스를 생성시켰다. 생성된 동물은 인간화 단백질 둘 모두를 발현하였다. 구체적으로, 인간화 CD20 마우스를 생성하기 위해, 9312 bp(Murine Chr. 19)에 걸쳐 있는 두 번째 아미노산(첫 번째는 Met이며, 이는 공통적임)으로부터 3' 비번역 영역의 하류 167 bp까지의 전체 마우스 Ms4a1(Cd20) 코딩 영역을, 8482 bp(Human Chr.11)에 걸쳐 있는 두 번째 아미노산으로부터 3' 비번역 영역의 하류 107 bp까지의 상응하는 CD20 인간 코딩 영역으로 대체하였다. 마우스 및 인간 CD20 둘 모두는 6개의 엑손을 가진다. 하기 기술된 실험에 사용된 동물은 CD3 및 CD20 유전자좌 둘 모두에서의 대체에 대해 동형접합성이었으며, 개별 유전자좌에서 변형된 마우스를 교배시킴으로써 생성되었다.
인간화 CD3/CD20 마우스에, 인간 CD20이 형질도입된 2×105개의 B16F10.9 흑색종 종양 세포를 피하 이식하였다. 0일째(종양 이식일)부터 시작하여, 마우스를 비히클(PBS; n=5), 0.4 mg/㎏의 대조 Ab 2(CD20 항원에 대한 교차 반응성을 나타내지 않는 대조 항체; n=5), 0.4 mg/㎏의 Ab 1(항-CD3/CD20 이중특이적 항체, 2014년 8월 7일에 공개된 WO2014121087A1호 참조, N=5), 또는 0.004 mg/㎏의 Ab 1(n=5)로 주당 2회 복강내 처리하였다. 종양 부피는 도 11a에 표시된 바와 같이 측정되었다. 종양이 약 1500 ㎣ 초과의 부피에 도달하였을 때 마우스를 희생시켰다. 도 11a에 도시된 바와 같이, Ab 1로의 처리는, 처리가 종양 이식과 동시에 개시되는 경우 종양 성장을 지연시켰다.
별도의 실험에서, 또한 이미 확립된 종양에서 종양 성장을 억제하는 Ab 1의 능력을 시험하였다(도 11b). 인간화 CD3/CD20 마우스에, 인간 CD20을 발현하는 2×105개의 B16F10.9 흑색종 종양 세포를 피하 이식하였다. 종양 이식 후 10일째에, 마우스를 종양 크기에 기반하여 무작위 배정하고, 각 그룹에 5 마리씩 하기 처리 그룹으로 구성하였다: 비히클(PBS), 4 mg/㎏의 대조 Ab 2(CD20 항원에 대한 교차 반응성을 나타내지 않는 대조 항체), 4 mg/㎏의 Ab 1, 또는 0.4 mg/㎏의 Ab 1. 모든 마우스를 주당 2회 복강내 처리하였다. 종양이 약 1500 ㎣ 초과의 부피에 도달하였을 때 마우스를 희생시켰다. 도 11b에 도시된 바와 같이, Ab 1로의 처리는 이미 확립된 종양의 종양 성장을 지연시켰는데, 이는 인간화 CD3 마우스가 초기 약물 후보 연구에 유리하다는 것을 입증한다.
균등물
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시 형태의 많은 균등물을 인식하거나 확인 가능할 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 비특허 문헌, 수탁 번호, 웹사이트 등, 특허 출원 및 특허의 전체 내용은 마치 그렇게 개별적으로 나타낸 것처럼 그와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 수탁 번호 또는 다른 인용이 상이한 시기에 상이한 내용과 관련되는 경우, 본 출원의 유효 출원일에 유효한 내용을 의미하며, 유효 출원일은 인용을 언급한 최우선 출원의 출원일이거나 그러한 것이 없는 경우 실제 출원일이다.
문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 임의의 실시 형태, 태양, 요소, 특징, 단계 등은 임의의 다른 것과 조합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Non-Human Animals Expressing Humanized CD3 Complex <130> 7310P1 <150> 62/083,653 <151> 2014-11-24 <150> 62/106,999 <151> 2015-01-23 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 1 cgactttctt gacttctatt tgttaaacac tgtgcattca catcgaatgc tagaagtttc 60 ctcgtcccgc ttcctcctga attgcctggg atcctctgct tgatgccctg taggaaacgt 120 cctttcctgt ggtatagaaa tgactgctcg agataacttc gtataatgta tgctatacga 180 agttatatgc atggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgc 223 <210> 2 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 2 tgtatcttat catgtctgga ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagt 60 aactataacg gtcctaaggt agcgagctag ccttccacag acaccaatgt tcaaaatgga 120 ggcttggggg caaaattctt ttgctatgtc tctagtcgtc caaaaaatgg tcctaacttt 180 ttctgactcc tgcttgtcaa aaattgtggg ctcatagtta atgc 224 <210> 3 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 aggggagaat ggccttcatg 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Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp 65 70 75 80 Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro 85 90 95 Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala 100 105 110 Ala Thr Ile Ser Gly Phe Ile Phe Ala Glu Val Ile Ser Ile Phe Phe 115 120 125 Leu Ala Leu Gly Val Tyr Leu Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Gln Asn Glu Gln Leu Tyr 145 150 155 160 Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Tyr Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly 165 170 175 Asn Gln Leu Arg Lys Lys 180 <210> 27 <211> 189 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Met Arg Trp Asn Thr Phe Trp Gly Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Ala 1 5 10 15 Val Gly Thr Cys Gln Asp Asp Ala Glu Asn Ile Glu Tyr Lys Val Ser 20 25 30 Ile Ser Gly Thr Ser Val Glu Leu Thr Cys Pro Leu Asp Ser Asp Glu 35 40 45 Asn Leu Lys Trp Glu Lys Asn Gly Gln Glu Leu Pro Gln Lys His Asp 50 55 60 Lys His Leu Val Leu Gln Asp Phe Ser Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr 65 70 75 80 Tyr Val Cys Tyr Thr 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Claims (44)

  1. CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 또는 이들의 임의의 조합인 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하도록 유전자 변형된 내인성 비인간(non-human) CD3 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비인간 동물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 내인성 비인간 CD3 유전자좌는 인간 CD3ε의 세포외 도메인, 인간 CD3δ의 세포외 도메인, 및 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하도록 유전자 변형된, 동물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 내인성 비인간 CD3 유전자좌는 상기 인간 CD3 단백질(들)에 상응하는 비인간 CD3 단백질(들)의 기능적 세포외 도메인(들)을 발현하지 않도록 유전자 변형된, 동물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 내인성 유전자좌는 상기 내인성 비인간 동물의 CD3 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 추가로 인코딩하며, 상기 동물은 상기 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인 및 상기 내인성 비인간 동물 CD3 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 CD3 단백질을 이의 T 세포 표면 상에 발현하는, 동물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 동물은,
    내인성 CD3ε 유전자좌에, 상기 내인성 비인간 동물의 CD3ε의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을,
    내인성 CD3δ 유전자좌에, 상기 내인성 비인간 동물의 CD3δ 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, 그리고
    내인성 CD3γ 유전자좌에, 내인성 비인간 동물 CD3γ의 CD3γ 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며,
    상기 비인간 동물은 이의 T 세포 표면 상에 키메라 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 단백질을 발현하는, 동물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35의 서열을 포함하는 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 포함하는, 동물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 포유류인, 동물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 설치류인, 동물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 동물은 마우스인, 동물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 마우스는,
    내인성 마우스 CD3ε 유전자좌에, 내인성 마우스 CD3ε의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을,
    내인성 마우스 CD3δ 유전자좌에, 내인성 마우스 CD3δ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3δ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을, 그리고
    내인성 마우스 CD3γ 유전자좌에, 내인성 마우스 CD3γ의 막관통 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 CD3γ의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며,
    상기 마우스는 이의 T 세포 표면 상에 키메라 CD3ε, CD3δ, 및 CD3γ 단백질을 발현하는, 마우스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 키메라 CD3ε 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 24에 제시되어 있고, 상기 키메라 CD3δ 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 25에 제시되어 있으며, 상기 키메라 CD3γ 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 26에 제시되어 있는, 마우스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 내인성 비인간 CD3 유전자좌에 대해 이형접합성인, 동물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 내인성 비인간 CD3 유전자좌에 대해 동형접합성인, 동물.
  14. 하기 단계를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법:
    CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 또는 이들의 임의의 조합인 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 내인성 CD3 유전자좌에서 비인간 동물의 세포의 게놈에 도입하는 단계; 및
    상기 세포로부터 상기 유전자 변형된 비인간 동물을 증식시키는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포는 단일 ES 세포이고, 상기 단일 ES 세포가 마우스 배아에 도입되어 마우스를 증식시키는, 방법.
  16. CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3z, 또는 이들의 임의의 조합인 인간 CD3 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하도록 유전자 변형된 마우스를 포함하고 관심 비마우스 항원을 발현 또는 포함하는 세포를 포함하는, CD3와 관심 비마우스 항원 둘 모두와 결합할 수 있는 CD3 기반 이중특이적 항원 결합 단백질을 시험하기 위한 마우스 모델.
  17. 제16항에 있어서, 상기 마우스는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 마우스 모델.
  18. 하기 단계를 포함하는, 관심 항원을 표적화하는 약물 후보를 스크리닝하는 방법:
    a. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 마우스에 상기 관심 항원을 도입하는 단계,
    b. 상기 마우스를, 인간 CD3 및 상기 관심 항원에 대해 유도된 관심 약물 후보와 접촉시키는 단계, 및
    c. 상기 약물 후보가 상기 관심 항원의 존재 또는 발현을 특징으로 하는 세포를 예방, 감소 또는 제거하는 데 효과적인지를 결정하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 도입 단계는 상기 마우스에서 상기 관심 항원을 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 도입 단계는 상기 마우스를 상기 관심 항원으로 감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 마우스에서 상기 관심 항원을 발현시키는 단계는 상기 관심 항원을 발현하도록 상기 마우스를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입 단계는 상기 마우스에 상기 관심 항원을 발현하는 세포를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제16항 또는 제22항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포인, 방법 또는 마우스 모델.
  24. 제16항 또는 제22항에 있어서, 상기 세포는 세균 세포인, 방법 또는 마우스 모델.
  25. 제20항에 있어서, 상기 감염 단계는 바이러스 또는 세균 감염을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마우스는 면역적격 마우스인, 방법 또는 마우스 모델.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항원은 종양 관련 항원인, 방법 또는 마우스 모델.
  28. 제27항에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 ALK, BAGE 단백질, BIRC5(서비빈(survivin)), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20(MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR 변이체 III, ERBB2(HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE 단백질, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV 유래 LMP2, L1CAM, MAGE 단백질, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1(CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA(FOLH1), RAGE 단백질, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6(LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, 톰슨-누벨(Thompson-nouvelle) 항원, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, 및 WT1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 마우스 모델.
  29. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항원은 감염성 질병 항원인, 방법 또는 마우스 모델.
  30. 제29항에 있어서, 상기 감염성 질병 항원은 바이러스 항원인, 방법 또는 마우스 모델.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이러스 항원은 HIV; A형 간염 바이러스; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스; 헤르페스 바이러스, 예를 들어 HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 및 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스; 아데노바이러스; 인플루엔자 바이러스; 플라비바이러스; 에코바이러스; 리노바이러스; 콕삭키 바이러스; 코로나바이러스; 호흡기 세포융합 바이러스; 유행성이하선염 바이러스; 로타바이러스; 홍역 바이러스; 풍진 바이러스; 파보바이러스; 백시니아 바이러스; HTLV; 뎅기 바이러스; 유두종 바이러스; 전염성 연속종(molluscum) 바이러스; 소아마비 바이러스; 광견병 바이러스; JC 바이러스; 에볼라 바이러스; 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 마우스 모델.
  32. 제29항에 있어서, 상기 감염성 질병 항원은 세균 항원인, 방법 또는 마우스 모델.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세균 항원은 클라미디아, 리케차, 미코박테리아, 포도상구균, 연쇄구균, 폐렴구균, 수막구균, 임질균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저병, 페스트, 렙토스피라, 및 라임병(Lyme disease) 세균 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 마우스 모델.
  34. 제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 후보는 항체인, 방법.
  35. 제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 후보는 항원 결합 단백질인, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 약물 후보는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단백질인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 상기 이중특이적 항원 결합 단백질은 인간 CD3 단백질과 상기 관심 항원 둘 모두와 결합할 수 있는, 방법.
  38. 제18항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 후보는 원숭이 CD3 단백질을 인식할 수 있는, 방법.
  39. 제23항에 있어서, 상기 약물 후보는 상기 관심 항원을 표적화하지 않는 작용제(agent)와 비교하여 종양 성장을 감소, 제거, 또는 예방할 수 있는, 방법.
  40. 제23항에 있어서, 상기 결정 단계는 종양 부피 검정을 포함하는, 방법.
  41. 제23항에 있어서, 상기 결정 단계는 T 세포 매개 종양 세포 치사 검정을 포함하는, 방법.
  42. 제25항에 있어서, 상기 약물 후보는 상기 관심 항원을 표적화하지 않는 작용제와 비교하여 세균 또는 바이러스 감염을 감소, 제거, 또는 예방할 수 있는, 방법.
  43. 제25항에 있어서, 상기 결정 단계는 바이러스 또는 세균 역가의 측정을 포함하는, 방법.
  44. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항원은 관심 인간 항원인, 방법 또는 마우스 모델.
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