KR20170040748A - 다중 약물의 효율적 세포내 전달을 위한 다중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 약물전달체 및 자가조립 나노구조체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포투과성 폴리펩타이드 블럭(CPP 블럭); 및 상기 세포투과성 폴리펩타이드 블럭의 일 말단에 연결되는 시스테인 블럭(Cys); 및 상기 시스테인 블럭에 연결되는, 전하를 띠고 친수성인 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭(친수성 EBP 블럭); 및 상기 친수성 EBP에 연결되는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭(소수성 EBP 블럭);으로 구성된 다중 블럭 코폴리펩타이드를 포함하는, 약물전달체을 제공한다.
Description
본 발명은 다중 약물의 효율적 세포내 전달을 위한 다중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 약물전달체 및 자가조립 나노구조체에 대한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포투과성 폴리펩타이드 블럭; 시스테인 블럭; 전하를 띤 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭; 및 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭을 포함하는 다중 블럭 폴리펩타이드와, 이를 포함하는 약물 전달체, 그리고 이의 자가조립체에 대한 것이다.
미셀(micelle)들 또는 나노구조체(nanostructure)들과 같은 나노입자들은 약물 운반체로서 중요한 역할을 하여 생체 내에서 약물들을 안정화시키고 오로지 표적들에만 약물들이 전달되도록 한다.
화학요법과 같은 치료를 위해서 사용되는 분자 의약품은 다음과 같은 장애들이 있다: 수성 조건에서 불용성, 표적 세포들로 접근하기 까지 낮은 생체 안정성 및 정상 조직에의 손상.
다양한 운반체들은 약물이 표적에 도달할 때까지 혈액 순환에서 약물의 반감기를 증가시키고, 상기 장애들을 극복하여 정상 세포의 손상을 감소시키며, 표적 환경에 따른 운반체들의 특성을 조절함으로써 약물 방출을 조절한다. 중합체(polymer)는 효과적으로 약물을 전달하는 나노캡슐(nanocapsule), 리포좀(liposome) 또는 미셀과 같은 나노입자(nanoparticle)를 형성하는 고분자 운반체로서 가치가 있다. 중합체의 구조는 양쪽 친매성(amphiphilic) 블럭(block) 공중합체(copolymer)들로 구성되며, 이 때 상기 공중합체는 다이블럭(diblock)으로 이루어져 있고 두 중합체들간의 길이 비율로 조절되는데, 예를 들자면, MePEG-b-폴리(카프로락톤) (MePEG-b-PCL){MePEG-b-poly(caprolactone) (MePEG-b-PCL)} 및 MePEG-b-폴리(락틱-코-글리콜산) (MePEG-b-PLGA) {MePEG-b-poly(lactic-co-glycolic acid) (MePEG-b-PLGA)}는 각 블럭의 길이에 따라 나노캡슐, 리포좀 또는 미셀로 형성될 수 있다. 미셀에 비해서, 나노캡슐 또는 리포좀으로 이루어진 중합체들은 더 큰 중심부(코어)를 가지고 더 많은 양의 약물들을 포함하는 구조체의 표면에 위치한다. 하지만, 나노캡슐 또는 리포좀은 이들의 크기 및 중합체들의 위치로 인해 미셀 보다 덜 안정하며, 한편으로 미셀은 작은 크기로 인해 더 효과적으로 세포 내로 침투한다.
폴리펩타이드는 생체적합성, 생분해성 및 특이적 기능성을 포함하는 장점을 가진다. 하나의 폴리펩타이드에서 정확한 단량체 수와 같은 단량체 단위(monomer scale)로 세밀하게 조절될 수 있다. 또한 각 단량체에서 특이적 작용기들로 세밀하게 조절될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드들은 약물 전달체로 사용될 수 있다. 예를 들어, 겔라틴(gelatin)은 콜로이드성의 약물 전달 시스템에 대해 미소구체(microsphere) 및 나노입자로 사용되었다. 또한 실크피브로인(silk fibroin, SF)은 나노스케일의 약물 전달 부형제로 사용되었다. 폴리펩타이드들은 이차 구조를 가지는 반복적 펩타이드들 간의 상호 작용에 의해 조립되어 나노입자를 형성한다. 폴리펩타이드를 기반으로 하는 양쪽 친매성 블럭 공중합체(copolymer)들은 미셀 구조체를 형성한다. 양쪽 친매성 블럭의 친수성 블럭은 리간드(ligand)와 같은 기능성 펩타이드 또는 표적화 잔기(targeting moiety) 또는 치료 효과를 위한 항원과 같은 기능성 펩타이드와 접합된다.
양쪽 친매성 블럭 코폴리펩타이드(copolypeptide)들의 소수성 블럭은 미셀 형성과 약물 방출을 위한 미셀 붕괴에 대단히 중요하다. 자극-반응성(stimuli-responsiveness)을 가지는 소수성 블럭은 이들의 소수성 및 미셀 형성을 조절한다. 주로 글루타민산(glutamine acid) 또는 라이신(lysine)을 가지는 폴리펩타이드들은 pH 감응성를 가지고, pH에 따른 이들의 양성자첨가작용 및 탈양성자화작용은 폴리펩타이드들의 소수성에 영향을 미친다. 하한 임계 용해 온도(low critical solution temperature, LCST) 또는 상한 임계 용해 온도(upper critical solution temperature, UCST)를 가지는 온도-반응형(thermal-responsive) 폴리펩타이드들은 특정 온도 범위에서 소수성이다. 폴리펩타이드들의 자극-반응성은 피막화된(encapsulated) 약물 및 분자들의 전달 및 방출을 위해 표적 세포 및 기관들의 환경에 맞추어진다.
엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)는 탄성중합체 도메인(domain)으로부터 유래된 열 반응 생체고분자들이다. 엘라스틴은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에서 주요한 단백질 구성요소이다. EBPs는 탄성중합체 도메인을 기반으로 하여 열 감응성(thermal sensitivity)을 가지도록 변형되었고, 5개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드인, 펜타펩타이드(pentapeptide)의 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는다. EBPs는 열-감응성 폴리펩타이드들이고, 이들의 전이 온도는 쉽게 조절되어 약물 전달 나노구조체를 형성한다.
상기 Xaa는 게스트 잔기(guest residue)이고 프롤린(proline)을 제외한 모든 아미노산일 수 있다. 반복 단위의 서열(sequence)에 따라 두 종류의 EBPs로 구분할 수 있는데, 하나는 서열이 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly인 탄성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with elasticity, EBPE)이고, 다른 하나는 서열이 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly인 가소성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity, EBPP)이다.
EBPs는 온도에 따른 가역적 위상 전이를 보이는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST) 거동을 가지는데, 상기 LCST는 역 전이 순환(inverse transition cycling, ITC)과 같은 쉬운 정제 방법을 사용할 수 있는 이점을 제공하고, 열에 촉발되어 입자들, 겔(gel)들, 섬유(fiber)들 및 다른 구조체들로 자가조립되는 이점도 제공한다. 서로 다른 서열을 가지는 EBPs 블럭들로 구성된 블럭 코폴리펩타이드들은 자가조립 구조체를 형성하기 위해 사용된다. EBPs 다이블럭 공중합체들은 두 개의 EBPs로 구성되는데, 상기 두 EBPs는 자가조립 미셀 구조체를 형성하기 위해 서로 다른 서열 및 전이 온도(transition temperature, Tt)를 가진다. EBPs 다이블럭 공중합체 용액의 온도가 하한 Tt 이상으로 온도가 증가될 때, 낮은 Tt를 가지는 EBPs는 불용성이 되고, 한편 높은 Tt를 가지는 EBPs는 가용성이 되며, 양쪽 친매성 다이블럭 EBPs는 미셀 구조체로 자가조립 된다. EBPs 다이블럭 공중합체들은 미셀 구조체들로 기능적 다가성(multivalency)을 가지기 위해, 다른 기능성 펩타이드들과 융합될 수도 있는데, 예를 들면, 세포투과력을 가지는 세포 투과성 펩타이드들과 융합될 수 있다.
세포 투과성 펩타이드들(Cell Penetrating Peptide: CPPs)는 그들의 크기에 비해 매우 큰 물질(cargo)을 나를 수 있다. 이 세포투과성 펩타이드들은, 세포 투과에 대단히 중요한 역할을 하는 서열들이 본래의 단백질로부터 분리되고 짧은 펩타이드들(10-30 아미노산들)로 변형되어 물질(cargo)과 함께 세포막 투과를 위해 사용된다. 비록 세포 섭취의 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않았지만, 상기 메커니즘은 수용체에 비의존적이고, CPPs는 세포막과 적절한 친화력으로 상호작용하여 세포막에 끼이지 않고 투과한다. CPPs는 양전하 및 적절한 소수성을 가지고 있기 때문에 음전하를 가지고 주로 지질들로 구성된 세포막에 접근하여 침투할 수 있다. 소수성이 너무 높으면, 펩타이드들은 세포막 지질들 속에 갇히게 될 것이다. 또한, 이들의 이차 구조는 지질들과 상호작용하기에 적절하다.
본 발명자들은, 세포투과성 펩타이드와 엘라스틴 단백질을 이용한 다중 약물전달체에 대한 연구를 계속하였다. 그 결과, 세포투과성 펩타이드와-엘라스틴 기반 폴리펩타이드가 연결된 새로운 약물전달체를 완성하였다.
Journal of Controlled Release, 2005, 108(2-3), 396-408
본 발명은 새로운 다중 블럭 코폴리펩타이드를 포함하는 약물전달체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다중 블럭 코폴리펩타이드의 자가조립 나노구조체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다중 약물의 순차적 방출이 가능한 약물전달체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 하기를 포함하는 약물전달체를 제공한다:
폴리펩타이드 블럭(CPP 블럭); 및
상기 세포투과성 폴리펩타이드 블럭의 일 말단에 연결되는 시스테인 블럭(Cys); 및
상기 시스테인 블럭에 연결되는, 전하를 띠고 친수성인 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭(친수성 EBP 블럭); 및
상기 친수성 EBP에 연결되는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭(소수성 EBP 블럭);
으로 구성된 다중 블럭 코폴리펩타이드.
상기 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP) 블럭은, Val-Pro-Gly-Xaa-Gly [서열번호 1] 또는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly [서열번호 2]으로 구성된 펜타펩타이드가 6n번 반복되고, 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 약물전달체일 수 있다:
[식 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]6n; 또는
[식 2]
[Val-Pro-Ala-Xaa-Gly]6n,
상기 식 1 또는 식 2에서,
상기 n은 1 이상의 정수이고,
상기 Xaa 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 상기 펜타펩타이드가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되고, 상기 Xaa 중 적어도 하나는 전하를 띤 아미노산이고 친수성 아미노산임.
상기 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP) 블럭은,
Val-Pro-Gly-Xaa-Gly [서열번호 1] 또는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly [서열번호 2]으로 구성된 펜타펩타이드가 6n번 반복되고, 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 약물전달체일 수 있다:
[식 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]6n; 또는
[식 2]
[Val-Pro-Ala-Xaa-Gly]6n,
상기 식 1 또는 식 2에서,
상기 n은 1 이상의 정수이고,
상기 Xaa 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 상기 펜타펩타이드가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되고, 상기 Xaa 중 적어도 하나는 소수성 또는 지방족 아미노산임.
상기 세포투과성 펩타이드(CPP) 블럭은, Penetratin, SynB1, SynB1-NLS, poly-arginine, VP22, MAP, hCT-derived CPP, MPG, Buforin 2, PEP-1, 및 Magainin 2로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 CPP 서열 정보는 이 기술분야에 널리 알려져 있다.
상기 시스테인(Cys) 블럭은, 시스테인이 포함된 펩타이드 서열을 의미한다. 구체적으로, 상기 시스테인 블럭의 아미노산 서열은 (Gly-Ala-Cys)이 1회 이상 반복되어 이루어질 수 있다. 더욱 구체적으로, (Gly-Ala-Cys)n[n은 반복 회수를 나타냄]서열로 이루어진 펩타이드 서열을 시스테인 블럭으로 이용할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 (Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys)[서열번호 43]의 시스테인 블럭을 이용하였다.
상기 친수성 EBP블럭은, 상기 식 1에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 20];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 22];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 24]; 또는
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지진 [서열번호 26]; 것이거나,
또는
상기 식 2에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 21];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 23];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 25]; 또는
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어진 [서열번호 27] 것일 수 있다.
상기 소수성 EBP 블럭은,
상기 식 1에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진[서열번호 28] 것이거나, 또는
상기 식2에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 29];
K(Lys), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 30];
D(Asp), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 31];
K(Lys), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 32];
D(Asp), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 33];
H(His), A(Ala), I(Ile)가 3:2:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 34];
H(His), G(Gly)가 5:1의 비율로 이루어지거나[서열번호 35]; 또는
G(Gly), C(Cys), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진[서열번호 36] 것일 수 있다.
상기 친수성 EBP블럭은,
상기 식 2에서 n은 2이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어진[서열번호 44] 것일 수 있다.
상기 소수성 EBP 블럭은
상기 식 2에서 n는 2 이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나[서열번호 45] 또는
상기 식 2에서 n은 4이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진[서열번호 46] 것일 수 있다.
상기 약물전달체는,
CPP 블럭-시스테인 블럭(Cys)4-친수성 EBP 블럭 EBPP[E1G4I1]12[서열번호 44] -소수성 EBP 블럭 EBPP[G1A3F2]12[서열번호 45]로 구성되거나; 또는
CPP 블럭-시스테인 블럭(Cys)4- 친수성 EBP 블럭 EBPP[E1G4I1]12[서열번호 44] - 소수성 EBP 블럭 EBPP[G1A3F2]24[서열번호 46]로 구성되는 것일 수 있다.
상기 CPP 블럭은 페네트라틴(아미노산 서열번호 38) 또는 SynB1(아미노산 서열번호 40)이고, 상기 약물전달체는, 서열번호 51, 52, 53 및 54로부터 선택되는 하나일 수 있다.
상기 다중 블럭 코폴리펩타이드는,
온도 자극에 의해 소수성 EBP블럭이 코어 구조를 형성하고 CPP 블럭-시스테인 블럭-친수성 EBP 블럭이 쉘 구조를 형성하면서, 코어-쉘 구조의 자가조립 나노구조체를 이룰 수 있다.
상기 시스테인 블럭의 산화반응에 의해 상기 자가조립 나노구조체가 안정화될 수 있다.
상기 쉘 부분의 친수성 EBP블럭의 카르복실기에 아클릴레이트를 도입하고 자외선을 조사하여 상기 친수성 EBP 블럭과 상기 아크릴레이트가 화학적으로 결합함으로써, 상기 자가조립 나노구조체가 안정화될 수 있다.
상기 아크릴레이트는 글리이시딜 메타크릴산염(glycidyl methacrylate: GMA))일 수 있다.
상기 자가조립 나노구조체의 코어 부분에 소수성 약물이 포획되고, 쉘 부분에 전하성 약물이 포획되어 상기 소수성 약물과 상기 전하성 약물의 방출을 제어하여 다중 약물 방출이 가능하다.
상기 소수성 약물은 세포막 염료, 광과민제(photosensitiser), 항암제, 항생제(antibiotics)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항암제는 칼세인(Calcein), 젬시타빈(gemcitabine), 부술판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜파란(Melphalan), 시스플라틴(Cisplatin), 이포스파미드(Ifosfamide), 시타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(Methotrexate; MTX), 다우노루비신(Daunorubicin), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 프로카바진(Procarbazine), 타목시펜(Tamoxifen), 메게스테롤 아세테이트(Megesterol acetate), 플루타미드(Flutamide) 및 고세렐린 아세테이트(Gosereline acetate, Zoladex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린(penicillin)계 항생제, 세팔로스포린(cephalosporine)계 항생제, 마크로라이드(macrolide)계 항생제, 테트라시클린(tetracycline)계 항생제, 퀘놀론(quinolone)계 항생제, 항히스타민제, 항균제, 클린다마이신(clindamycin), 메트로니다졸(metronidazole), 클로람페니콜(chloramphenicol), 악티노마이신-D(Actinomycin-D), 블레오마이신(Bleomycin) 및 미토마이신-C(Mitomycin-C)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 전하성 약물은 음전하성 약물 또는 양전하성 약물일 수 있다. 상기 전하성 약물은 전하(음전하 또는 양전하)를 띤 염료, 전하성 단백질 약물 등이 있다.
상기 전하성 약물은 친수성을 나타낸다.
상기 양전하를 띤 염료는 파라로자닐린(pararosaniline), 메틸렌블루(methylene blue), 아우라민 O(auramine o), 크리소이딘 G(chrysoidine G), 말라카이트 그린(malachite green), 로다민 B(rhodamine B), 및 로다민 6G(rhodamine 6G)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 음전하를 띤 염료는 에오신(Eosin), 메타닐옐로(Metanil yellow), 메틸오렌지(Methyl orange), 크실렌 시아놀(xylene cyanol), 브로모페놀블루(bromophenol blue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 양전하성 약물은 프포파페논(propafenone), 프로카인아마이드(procainamide), 메타포르민(metformin), 펜터민(phentermine), 아테노올(atenolol), 프로프라놀롤 (propranolol), 프라조신(prazosin) 및 라베타롤(labetalol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 음전하성 약물은 나프록센(naproxen), 이부프로펜(Ibuprofen), 덱사메타손 소듐 포스페이트(dexamethasone sodium phosphate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 약물전달체는, 상기 시스테인 블럭의 산화-환원 반응에 의해 상기 소수성 약물과 상기 전하성 약물 또는 친수성 약물의 방출을 제어하여 다중 약물 방출이 가능하다.
상기 자가조립 나노구조체의 코어 부분에 소수성 약물이 포획되고, 상기 쉘 부분의 시스테인 블럭 내 싸이올기(thiol group)에 아크릴레이트가 결합된 전하성 약물이 접합되어, 상기 소수성 약물과 상기 친수성 약물의 방출을 제어하여 다중 약물 방출이 가능하다.
상기 아크릴레이트가 접합되는 전하성 약물로는 앞서 언급한 전하성 약물이 포함될 수 있으며, 친수성을 가지는 약물이 포함될 수 있다.
상기 자가조립 나노구체는 쉘에 포획된 전하성 약물(친수성 약물)을 방출하고, 그 다음에 코어에 포획된 소수성 약물이 방출되거나; 또는 코어에 포획된 소수성 약물이 방출되고, 그 다음에 쉘에 포획된 전하성 약물(친수성 약물)이 방출됨으로써, 순차적 약물 방출이 가능하다.
도 5 및 6은 본 발명의 개념을 모식적으로 나타낸 것이다. 도 5(b)를 보면, 시스테인 블럭의 산화 반응에 의해 자가조립 나노구조체(미셀)를 안정화시킨다. 동시에, 도 5(c) 및 5(d)를 보면, 시스테인 블럭의 산화-환원 반응에 의해 미셀의 다중 약물 방출 속도를 조절할 수 있다. 실시예 12 및 도 12(a)는 시스테인 블럭의 산화반응에 의해 미셀을 안정화시킨 후에 다중 약물을 방출시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 6(a) 및 6(b)를 보면, 전하성(친수성) 약물에 메타크릴레이트(MA)를 도입하였다. 메타크릴레이트는, 시스테인 블럭의 싸이올기(thiol group)와 반응할 수 있는 아크릴레이트이다. 따라서 MA-접합 약물이 시스테인 블럭의 싸이올기와 화학적으로 결합할 수 있기 때문에, 약물이 쉘 부분에 포획될 수 있고, 약물 방출을 제어할 수 있다. 실시예 13 및 도 12(b)는 아크릴레이트가 결합된 친수성 약물이 시스테인 블럭에 결합되어 있다가 방출되는 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 6(c)를 보면, 친수성 EBP 블럭의 카복실기(carboxyl group)와 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate: GMA)를 결합(conjugation)시켜서 아크릴기 (acrylic moiety)를 도입하여, 자외선 조사 (ultraviolet irradiation)에 의해 아크릴기의 화학적 결합을 통해 미셀 구조체를 화학적으로 안정화시켰다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연 아미노산을 의미한다. 예컨대 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다.
상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성(음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 Gly(G), Ala(A) 등의 약어는 아미노산 약어이다. Gly는 글라이신의, Ala는 알라닌의 약어이다. 또한 글라이신은 G, 알라닌은 A라고도 표현한다. 상기 약어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 표현이다.
본 발명에서 "전하를 띤 친수성 아미노산"이란, 친수성 아미노산 중 양전하 또는 음전하를 띤 아미노산을 의미한다. 예를 들면, 양전하성의 친수성 아미노산으로는 리신, 아르기닌 등이 있다.
또한 "소수성 아미노산"이란 소수성 성질을 나타내는 아미노산으로, 글라이신, 류신 등이 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
"코폴리펩타이드란"란, 2 종류 이상의 폴리펩타이드를 연결시켜 만든 공중합체이다. 본 발명에서는 세포투과성 펩타이드, 시스테인, 친수성 EBP 및 소수성 EBP의 4가지 종류의 폴리펩타이드를 연결하여 다중 블럭 코폴리펩타이를 제조하였다(도 5a 및 6a 참고).
용어 "상 전이(phase transition)"이란, 물이 수증기로 변하거나 얼음이 물로 변하는 것과 같이, 물질의 상태가 변하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드는, 기본적으로, 자극 반응성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)이다. 상기 "엘라스틴-기반 폴리펩타이드"는 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ealstin-like polypeptieds: ELP)"라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.
본 명세서에서, 상기 Xaa는 "게스트 잔기"라고 칭한다. 상기 Xaa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다.
상기 EBP는, 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt를 초과하면 불용성으로 된다.
본 발명에서, EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly의 조합에 의해 주로 제어된다. 구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly 는 탄성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다.
한편, 4번째 아미노산인 게스트 잔기 Xaa의 소수성과 펜타펩타이드 반복 단위의 중합화(multimerization)는, 모두, Tt에 영향을 끼친다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 이 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블럭(EBP 블럭)을 형성할 수 있다. 구체적으로 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭을 형성할 수 있다. 본 발명의 EBP 블럭의 친수성 또는 소수성의 성질은 EBP의 전이온도가 깊은 관련성이 있다.
EBP의 전이 온도는 또한 아미노산 서열 및 이의 분자량에 달려 있다. EBP 서열과 Tt의 상관 관계에 대해서는 Urry 등이 많은 연구를 수행하였다(Urry D.W., Luan C.-H., Parker T.M., Gowda D.C., Parasad K.U., Reid M.C., and Safavy A. 1991. Temperature of polypeptide inverse temperature transition depends on mean residue hydrophobicity. J. Am. Chem. Soc. 113: 4346-4348.). Urry 등은 Val-Pro-Gly-Val-Gly의 펜타펩타이드에서, 4번째 아미노산인 "게스트 잔기"를 Val 보다 더 친수성을 나타내는 잔기로 치환하는 경우, 원래 서열과 비교하여 Tt가 올라가고, 반대로 Val보다 소수성인 잔기로 게스트 잔기를 치환하면 원래 서열보다 Tt가 낮아진다는 것을 발견하였다. 즉, 친수성 EBP는 Tt가 높고 소수성 EBP는 상대적으로 Tt가 낮다는 것을 발견하였다. 이러한 발견을 통해, EBP 서열의 게스트 잔기로 어떤 아미노산을 사용할지 결정하고, 게스트 잔기의 조성 비율에 변화를 줌으로써 특정 Tt를 가지는 EBP를 제조할 수 있게 되었다(Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 18. pp. 329-343).
앞서 설명한 바와 같이, Tt가 높으면 친수성을 나타내고 Tt가 낮으면 소수성을 나타낸다. 본 발명에 따른 EBP 블럭들도 게스트 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 분자량에 변화를 줌으로써 Tt를 올리거나 낮출 수 있다. 그리하여 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭의 제조가 가능하다.
참고로, 체온보다 낮은 Tt를 가지는 EBP는 소수성 블럭으로 사용될 수 있고, 체온 보다 높은 Tt를 가지는 EBP 는 친수성 블럭으로 사용될 수 있다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.
본 발명의 EBP 서열을 예로 들면, Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 가소성 펜타펩타이드가 반복되는 가소성 폴리펩타이드 블럭과 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 탄성 펜타펩타이드 반복되는 탄성 폴리펩타이드 블럭을 비교하였을 때, 3번째 아미노산인 Gly이 Ala보다 높은 친수성을 보인다. 따라서 가소성 폴리펩타이드 블럭(Elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)이 탄성 폴리펩타이드 블럭(Elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)보다 Tt가 낮게 나타난다.
본 발명에 따른 EBP들은 앞서 설명한 바와 같이, Tt를 조절하여, 친수성 또는 소수성의 성질을 나타낼 수 있는 것이다. 그리고 전하성 아미노산을 사용하여 전하성을 부여할 수 있다
본 발명에 따른 다중 블럭 코폴리펩타이드는 도 5a 및 6a에 모식적으로 나타내었다. 본 발명은 세포투과성 펩타이드(CPP)를 이용한다. 따라서 본 발명의 다중 블럭 코폴리펩타이드는 세포 내로 쉽게 들어갈 수 있다.
본 발명의 "다중 블럭 코폴리펩타이드"는, CPP 블럭-Cys 블럭-친수성 EBP 블럭-소수성 EBP 블럭으로 구성된 사중 블럭 코폴리펩타이드를 말하며, "다중 블럭 EBP" 또는 "다중 블럭 EBPs" 또는 "다중 블럭 EBPPs"라고도 부른다. 본 명세서에서 두 개의 블럭이 연결된 코폴리펩타이드의 경우, "다이블럭 코폴리펩타이드"라고도 부른다. 세 개의 블럭이 연결된 코폴리펩타이드의 경우, "트라이블럭 코폴리펩타이드"라고도 부른다. 특히, "친수성 EBP 블럭-소수성 EBP 블럭"은 "다이블럭 EBP" 또는 "다이블럭 EBPs" 또는 "다이블럭 EBPPs"라고 부르기도 한다.
본 발명의 실시예에에서는, 두 종류의 CPPs, 즉 페네트라틴(Penetratin) 및 SynB1을 사용했다. 페네트라틴은 안테나페디아(Antennapedia)(초파리 호메오단백질(homeoprotein))의 호메오도메인(homeodomain)으로부터 유래된 펩타이드의 일부이고, RQIKIWFQNRRMKWKK의 아미노산 서열을 가진다. SynB1은 돼지 백혈구에서 항균성 펩타이드 프로테그린-1(protegrin-1, PG-1)으로부터 유래된 벡터들인 SynB 군(family) 중에 하나이고, RGGRLSYSRRRFSTSTGR의 아미노산 서열을 가진다.
페네트라틴은 세포 내로 높은 침투 능력을 가지고 있고, SynB1은 낮은 독성을 가진다. CPPs는 단백질, 중합체 또는 염료 또는 약물과 같은 분자들과 접합되어 사용될 수 있다.
CPPs와 융합된 EBPs는 고체온(hyperthermia)을 표적화하는 치료용 폴리펩타이드로 사용된다. CPP-EBPs 융합 폴리펩타이드들은 Tt 이하에서 가용성 및 긴 EBP 체인(chain)으로 인해 세포막으로 투과하기 힘들다. EBPs는 Tt 이상에서는 응집되고, 상기 융합 폴리펩타이드들은 쉽게 종양에 투과되어 축적된다. 다양한 CPPs는 여러가지의 적용을 위해서 EBPs와 함께 융합될 수 있다.
또한, CPP-EBPs 융합 폴리펩타이드들은 다른 펩타이드들 또는 약물들과 함께 사용된다. CPP 및 모노(mono) 블럭 EBPs를 포함하는 융합 단백질은 고체온을 표적화하는 치료용 폴리펩타이드로 작용할 수 있다. 하지만, 다이블럭(diblock) EBPs는 더 효과적으로 약물을 포함할 수 있고, 표적 세포 및 비표적 세포에 대한 그들의 침투를 조절할 수 있다.
본 발명에서는, 세포로 침투할 수 있는 약물전달체로서의 자가조립 미셀 구조체들을 제작하였다. 상기 미셀은 EBP 다이블럭(친수성 EBP-소수성 EBP), 시스테인(Cysteine 또는 Cys) 블럭 및 CPPs(상기 폴리펩타이드의 N-말단에 위치함)으로 구성되었다. EBPs 다이블럭 공중합체가 도입되어, 열에 의해 자극된 미셀 구조체로 자가조립 되면서 약물을 포획할 수 있었다. 게스트 잔기로 Gly, Ala, 및 Phe(1:3:2의 비율)를 가지는 소수성 EBP의 전이 온도는, 게스트 잔기로 Glu, Gly, 및 Ile(1:4:1의 비율)를 가지는 친수성 EBP의 전이 온도 보다 낮았다. (Gly-Ala-Cys)가 4번 반복되는 서열을 가진 시스테인 블럭은 CPPs와 친수성 EBPPs 사이에 위치하였고, CPPs는 미셀 구조체의 표면 상에서 침투 효율을 증가시키기 위해서 도입되었다.
미셀에 약물을 포함시키고 구조를 안정화하기 위해 두 가지 전략이 자가조립 미셀 구조체에 적용되었다. 첫번째는 각각의 친수성과 소수성의 EBP 블럭에 두 종류의 약물들을 물리적으로 포함시키고, 시스테인 블럭을 사용하여 구조를 안정화시키는 것이다. 미셀이 형성되면서, 양(음)전하로 대전된 약물들은 쉘(shell)에서 음(양)전하로 대전된 친수성 EBP 블럭과 물리적으로 상호작용하였고, 소수성 약물들은 소수성 EBP 블럭이 존재하는 중심부(core)에 포획되었다. 두 개의 다른 약물들과 함께 미셀 구조체가 자가조립된 후에, CPP는 미셀 표면에 위치하였고 시스테인 블럭은 CPP 블럭 아래에 위치했다. 시스테인 블럭에서 티올기(thiol group)들은 이황화 결합을 형성하여 상기 구조를 안정화시켰다. 도 5(b)를 보면, 시스테인 블럭의 산화 반응에 의해 자가조립 나노구조체(미셀)를 안정화시킨다. 도 5(c) 및 5(d)를 보면, 시스테인 블럭의 산화-환원 반응에 의해 미셀의 다중 약물 방출 속도를 조절할 수 있다. 실시예 12 및 도 12(a)는 시스테인 블럭의 산화반응에 의해 미셀을 안정화시킨 후에 다중 약물을 방출시킨 결과를 나타낸 것이다.
또 다른 전략으로는, 시스테인 블럭에 화학적으로 약물을 접합시키고, 광-가교 연결자(photo-crosslinking linker)를 사용함으로써 구조를 안정화하기 위해 친수성 EBP 블럭을 사용하는 것이다. 도 6(a) 및 6(b)를 보면, 전하성(친수성) 약물에 메타크릴레이트(MA)를 도입하였다. 메타크릴레이트는, 시스테인 블럭의 싸이올기(thiol group)와 반응할 수 있는 아크릴레이트이다. 따라서 MA-접합 약물이 시스테인 블럭의 싸이올기와 화학적으로 결합할 수 있기 때문에, 약물이 쉘 부분에 포획될 수 있고, 약물 방출을 제어할 수 있다. 실시예 13 및 도 12(b)는 아크릴레이트가 결합된 친수성 약물이 시스테인 블럭에 결합되어 있다가 방출되는 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 6(c)를 보면, 친수성 EBP 블럭의 카복실기(carboxyl group)와 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate: GMA)를 결합(conjugation)시켜서 아크릴기 (acrylic moiety)를 도입하여, 자외선 조사 (ultraviolet irradiation)에 의해 아크릴기의 화학적 결합을 통해 미셀 구조체를 화학적으로 안정화시켰다.
미셀이 형성 되면서, 시스테인 블럭에서 티올기는 약물들과 접합되었고, 소수성 중심부(core)는 소수성의 다른 약물을 포함했다. 그리고, 미셀 형성 후에, 친수성 EBP 블럭의 카복실기(carboxyl group)를 광-가교 연결자로 연결하여 변형시킨 후, UV로 상기 친수성 EBP 블럭을 가교(crosslink) 시킴으로써 구조를 안정화 시켰다. 약물 모델로서 이중 염료 방출 테스트를 위해 3가지 형광 염료들은 다중블럭 공중합체들과 화학적으로 접합되거나 또는 물리적으로 상호 작용되었다. 본 발명은 진보된 약물 전달 시스템을 위해 높은 침투 능력 및 열 반응성을 가지는 안정화된 나노운반체를 제시한다.
본 발명에 따른 다중 블럭 코폴리펩타이드를 포함하는 약물전달체는, 안정화된 나노운반체로서, 세포 내 침투력이 높고, 열 반응성을 가지며, 또한 다중 약물의 순차적 전달을 제공한다.
도 1은 서로 다른 DNA 크기를 갖는 EBP 유전자 라이브러리를 인코딩하는 플라스미드 및 이들의 블럭 폴리펩티드의 구축의 개략도이다. 개질된 벡터는, XbaI(RE1), AcuI(RE2), 및 BseRI(RE3)를 포함하는 서로 다른 세 개의 제한 효소(RE)의 인식 사이트들을 포함하도록 설계되었다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12 에 대한 유전자는 EBPP[G1A3F2]6을 위한 플라스미드계 유전자 벡터와 인서트 간의 연결 반응에 의해 구축되었다: EBPP[G1A3F2]6 에 대한 플라스미드계 유전자(plasmid-borne gene)의 인서트는 XbaI와 AcuI에 의한 이중 소화(digestion)에 의해 제조되었다. 한편, EBPP[G1A3F2]6에 대한 플라스미드계 유전자 벡터는 XbaI와 BseRI에 의한 이중 소화와 알칼리 포스파타제에 의한 탈인산화에 의해 제조되었다.
도 2는 본 발명에 이용된 EBP 유전자 라이브러리의 아가로스 겔전기영동 이미지이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1], (E) EBPE[D1G4I1], (F) EBPP[D1G4I1], (G) EBPE[E1G4I1], (H) EBPP[E1G4I1], (I) EBPP[G1A3F2], (J) EBPP[K1A3F2], (K) EBPP[D1A3F2], and (L) EBPP[H3A2I1]. EBP 반복 단위의 개수를 각 DNA 대역 아래에 표시하였다. 모든 아가로스 겔 상의 양측 레인은, 서로 다른 DNA 크기 마커 (밑에서 위로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 및 3.0 kbp)를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 이용된 EBP의 구리 염색된 SDS-PAGE 겔 (4-20% 구배)이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1], (E) EBPE[D1G4I1] 및 (F) EBPP[D1G4I1]. SDS-PAGE 겔 상의 양측 레인은 표준 단백질 크기 마커(밑에서 위로 7, 15, 24, 35, 40, 50, 65, 90, 110, 150kDa)를 함유한다.
도 4는 본 발명에 이용된 EBPs의 열적 프로파일이다. (A) EBPE[A1G4I1]n, (B) EBPP[A1G4I1]n, (C) EBPE[K1G4I1]n, (D) EBPP[K1G4I1]n, (E) EBPP[D1G4I1]n 및 (F) EBPP[G1A3F2]n. 열적 프로파일의 350nm에서의 광학 흡광도는, 1℃/분의 가열 속도로 1 내지 3 M NaCl이 보충된 PBS 완충제 내에서 25?M EBP 용액을 가열함으로써 얻었다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다중 블럭 코폴리펩타이드의 분자 구조, 설계, 및 기능에 대한 모식도이다. (a) 융합 단백질들은 소수성 EBP 블럭, 친수성 EBPP 블럭, 시스테인 블럭 및 CPP로 이루어진다. (b) 시스테인 블럭에 있는 티올기들은 이황화 결합을 형성하는데, 상기 결합은 미셀들이 열 자극에 의해 자가조립 되었을 때 그 구조를 화학적으로 안정화 시킨다. (c) 다중 블럭 코폴리펩타이드는 코어(core)에 소수성 약물들을 포획할 수 있고, 쉘(shell)에서는 전하성 약물을 포획할 수 있으며, 시스테인 블럭은 미셀 구조체를 안정화 시키기 위해 이황화 결합을 형성한다. (d) 이황화 결합이 환원 조건하에서 분리된 후에 미셀에 있는 이중 약물들은 방출된다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른, 다중 블럭 코폴리펩타이드의 분자 구조, 설계, 및 기능에 대한 모식도이다. (a) 융합 단백질들은 소수성 EBP 블럭, 친수성 EBP 블럭, 시스테인 블럭 및 CPP로 이루어진다. (B) 시스테인 블럭에 존재하는 티올기들은 메타크릴산염화 된 약물들로 접합될 수 있고, 소수성 코어는 소수성 약물들을 포획할 수 있다. (c) (i) 친수성 EBP 블럭의 카복실기들은 글리시딜 메타크릴산염으로 접합되는데, 이는 친수성 EBP 블럭에서 UV 가교로 미셀들을 안정화 시킬 수 있도록 도와준다. (ii) 일단 미셀들이 열 자극에 의해 자가조립되면, 친수성 EBP 블럭에 있는 메타크릴산염은 UV 노출을 통해서 가교화 된다.
도 7은 (a) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (b) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (c) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24에 대한 (A) 아가로오스 겔(1%) 및 (B) SDS-PAGE 이미지(4-20% 구배 겔). (A) 다중 블럭 코폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 pET21-a(+) 플라스미드는 Xba I 및 BamH I으로 절단되었다. 융합 단백질들을 암호화하는 유전자의 길이는 상기 유전자 단편 상단에 표기되었다. 각 DNA 단편의 크기는 표 4에서의 값과 다른데, 그 이유는 융합 단백질들을 암호화하는 유전자의 바깥에 제한효소 절단 부위들이 있기 때문이다. (B) 융합 단백질들은 대장균에서 발현되어 ITC로 정제되었다. 4-20% 구배 겔은 구리 염색으로 시각화 되었다. 예상된 분자량은 밴드 상단에 표기되었다.
도 8은 본 발명의 다중 블럭 코폴리펩타이드의 혼탁도 프로파일이다. (A) 아래 블럭들(각각 25 uM)에 대한 혼탁도 프로파일; (a) EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (b) (GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (c) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12. (B) 아래 블럭들(각각 25 uM)에 대한 혼탁도 프로파일; (a) EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (b) (GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (c) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]24-EBPP[G1A3F2]24, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24. 1/분의 가열 속도로 시료를 가열하면서 350 nm에서 흡광도를 측정했다. 위상 전이는 두 번 발생했다. 소수성 블럭의 응집으로 인해 일차 위상 전이가 발생되고, 극성 블럭의 영향을 받아 이차 위상 전이가 발생된다.
도 9는 (a) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (b) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (c) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 DLS 기구로 측정되었다. 다중 블럭 코폴리펩타이드의 유체역학적 반경은 10 mM PBS에서 25 uM의 농도에서 측정되었다. 일차 위상 전이 전에 다중 블럭 코폴리펩타이드의 유체역학적 반경은 약 10에서 20 nm 였다.
도 10은 4 및 37℃에서 GMA 접합 및 UV 가교 후에 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)이다. 일단 다중 블럭 코폴리펩타이드가 미셀 구조체를 형성하면 친수성 블럭은 GMA로 접합되고 UV 노출로 가교되었다. 반경은 10 mM PBS에서 25 uM의 농도에서 측정되었다.
도 11은 4℃ 및 37℃에서 TCEP 처리 전(A) 및 처리 후(B), 주사기 여과 후(C), 및 과산화수소 처리 후(D)에 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)이다. SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24는 티올기들을 환원시키기 위해 TCEP로 처리되었고, 시스테인 블럭에서의 이황화 결합을 위해 과산화수소 처리 전에 주사기로 여과되었다. 반경은 10 mM PBS에서 25 uM의 농도에서 측정되었다.
도 12는, (A)시스테인 블럭이 산화되어 이황화결합을 통해 안정화된 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24 미셀로부터 로다민 6G 및 플루오레세인 나트륨 염의 이중 방출 프로파일이고, (B) 시스테인 블럭에 화학적으로 결합된 아크릴화된 로다민 B 및소수성 EBP 블럭에 함입된 플루오레세인 나트륨 염의 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24 미셀로부터 이중 방출 프로파일들이다. 미셀에서 이중 염료들은 PBS(pH 7.4)에서 방출되었다. 방출 시작 후 20 분, 40 분, 1 시간, 1 시간 20 분, 1 시간 40 분, 2 시간, 6 시간, 10 시간, 및 12 시간째 투석 완충액에서 부분 표본들이 채취되었다.
도 2는 본 발명에 이용된 EBP 유전자 라이브러리의 아가로스 겔전기영동 이미지이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1], (E) EBPE[D1G4I1], (F) EBPP[D1G4I1], (G) EBPE[E1G4I1], (H) EBPP[E1G4I1], (I) EBPP[G1A3F2], (J) EBPP[K1A3F2], (K) EBPP[D1A3F2], and (L) EBPP[H3A2I1]. EBP 반복 단위의 개수를 각 DNA 대역 아래에 표시하였다. 모든 아가로스 겔 상의 양측 레인은, 서로 다른 DNA 크기 마커 (밑에서 위로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 및 3.0 kbp)를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 이용된 EBP의 구리 염색된 SDS-PAGE 겔 (4-20% 구배)이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1], (E) EBPE[D1G4I1] 및 (F) EBPP[D1G4I1]. SDS-PAGE 겔 상의 양측 레인은 표준 단백질 크기 마커(밑에서 위로 7, 15, 24, 35, 40, 50, 65, 90, 110, 150kDa)를 함유한다.
도 4는 본 발명에 이용된 EBPs의 열적 프로파일이다. (A) EBPE[A1G4I1]n, (B) EBPP[A1G4I1]n, (C) EBPE[K1G4I1]n, (D) EBPP[K1G4I1]n, (E) EBPP[D1G4I1]n 및 (F) EBPP[G1A3F2]n. 열적 프로파일의 350nm에서의 광학 흡광도는, 1℃/분의 가열 속도로 1 내지 3 M NaCl이 보충된 PBS 완충제 내에서 25?M EBP 용액을 가열함으로써 얻었다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다중 블럭 코폴리펩타이드의 분자 구조, 설계, 및 기능에 대한 모식도이다. (a) 융합 단백질들은 소수성 EBP 블럭, 친수성 EBPP 블럭, 시스테인 블럭 및 CPP로 이루어진다. (b) 시스테인 블럭에 있는 티올기들은 이황화 결합을 형성하는데, 상기 결합은 미셀들이 열 자극에 의해 자가조립 되었을 때 그 구조를 화학적으로 안정화 시킨다. (c) 다중 블럭 코폴리펩타이드는 코어(core)에 소수성 약물들을 포획할 수 있고, 쉘(shell)에서는 전하성 약물을 포획할 수 있으며, 시스테인 블럭은 미셀 구조체를 안정화 시키기 위해 이황화 결합을 형성한다. (d) 이황화 결합이 환원 조건하에서 분리된 후에 미셀에 있는 이중 약물들은 방출된다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른, 다중 블럭 코폴리펩타이드의 분자 구조, 설계, 및 기능에 대한 모식도이다. (a) 융합 단백질들은 소수성 EBP 블럭, 친수성 EBP 블럭, 시스테인 블럭 및 CPP로 이루어진다. (B) 시스테인 블럭에 존재하는 티올기들은 메타크릴산염화 된 약물들로 접합될 수 있고, 소수성 코어는 소수성 약물들을 포획할 수 있다. (c) (i) 친수성 EBP 블럭의 카복실기들은 글리시딜 메타크릴산염으로 접합되는데, 이는 친수성 EBP 블럭에서 UV 가교로 미셀들을 안정화 시킬 수 있도록 도와준다. (ii) 일단 미셀들이 열 자극에 의해 자가조립되면, 친수성 EBP 블럭에 있는 메타크릴산염은 UV 노출을 통해서 가교화 된다.
도 7은 (a) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (b) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (c) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24에 대한 (A) 아가로오스 겔(1%) 및 (B) SDS-PAGE 이미지(4-20% 구배 겔). (A) 다중 블럭 코폴리펩타이드를 암호화하는 변형된 pET21-a(+) 플라스미드는 Xba I 및 BamH I으로 절단되었다. 융합 단백질들을 암호화하는 유전자의 길이는 상기 유전자 단편 상단에 표기되었다. 각 DNA 단편의 크기는 표 4에서의 값과 다른데, 그 이유는 융합 단백질들을 암호화하는 유전자의 바깥에 제한효소 절단 부위들이 있기 때문이다. (B) 융합 단백질들은 대장균에서 발현되어 ITC로 정제되었다. 4-20% 구배 겔은 구리 염색으로 시각화 되었다. 예상된 분자량은 밴드 상단에 표기되었다.
도 8은 본 발명의 다중 블럭 코폴리펩타이드의 혼탁도 프로파일이다. (A) 아래 블럭들(각각 25 uM)에 대한 혼탁도 프로파일; (a) EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (b) (GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (c) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12. (B) 아래 블럭들(각각 25 uM)에 대한 혼탁도 프로파일; (a) EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (b) (GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (c) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]24-EBPP[G1A3F2]24, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24. 1/분의 가열 속도로 시료를 가열하면서 350 nm에서 흡광도를 측정했다. 위상 전이는 두 번 발생했다. 소수성 블럭의 응집으로 인해 일차 위상 전이가 발생되고, 극성 블럭의 영향을 받아 이차 위상 전이가 발생된다.
도 9는 (a) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, (b) 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, (c) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 (d) SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 DLS 기구로 측정되었다. 다중 블럭 코폴리펩타이드의 유체역학적 반경은 10 mM PBS에서 25 uM의 농도에서 측정되었다. 일차 위상 전이 전에 다중 블럭 코폴리펩타이드의 유체역학적 반경은 약 10에서 20 nm 였다.
도 10은 4 및 37℃에서 GMA 접합 및 UV 가교 후에 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)이다. 일단 다중 블럭 코폴리펩타이드가 미셀 구조체를 형성하면 친수성 블럭은 GMA로 접합되고 UV 노출로 가교되었다. 반경은 10 mM PBS에서 25 uM의 농도에서 측정되었다.
도 11은 4℃ 및 37℃에서 TCEP 처리 전(A) 및 처리 후(B), 주사기 여과 후(C), 및 과산화수소 처리 후(D)에 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)이다. SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24는 티올기들을 환원시키기 위해 TCEP로 처리되었고, 시스테인 블럭에서의 이황화 결합을 위해 과산화수소 처리 전에 주사기로 여과되었다. 반경은 10 mM PBS에서 25 uM의 농도에서 측정되었다.
도 12는, (A)시스테인 블럭이 산화되어 이황화결합을 통해 안정화된 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24 미셀로부터 로다민 6G 및 플루오레세인 나트륨 염의 이중 방출 프로파일이고, (B) 시스테인 블럭에 화학적으로 결합된 아크릴화된 로다민 B 및소수성 EBP 블럭에 함입된 플루오레세인 나트륨 염의 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24 미셀로부터 이중 방출 프로파일들이다. 미셀에서 이중 염료들은 PBS(pH 7.4)에서 방출되었다. 방출 시작 후 20 분, 40 분, 1 시간, 1 시간 20 분, 1 시간 40 분, 2 시간, 6 시간, 10 시간, 및 12 시간째 투석 완충액에서 부분 표본들이 채취되었다.
실시예
1: 재료
pET-21a(+) 벡터 및 BL21(DE3) 대장균 세포는 Novagen Inc.(미국, 위스콘신, 매디슨)로부터 얻었고, Top10 세포는 Invitrogen(미국, 캘리포니아, 칼즈배드)로부터 구입했다. 주문 제작된 모든 올리고뉴클레오타이드들(oligonucleotides)은 Cosmo Gene Tech(대한민국, 서울)에서 합성되었다. 송아지 창자 알칼리인산분해효소(calf intestinal alkaline phosphatase, CIP), BamHI 및 XbaI은 Fermentas(캐나다, 온타리오)로부터 얻었다. AcuI 및 BseRI는 New England Biolabs(미국, 매사추세츠, 입스위치)로부터 구입했다. T4 DNA연결효소는 Elpis Bio-tech(대한민국, 대전)로부터 얻었다. DNA 분리 키트(DNA miniprep), 겔 추출(gel extraction), 및 PCR 정제 키트는 Geneall Biotechnology(대한민국, 서울)로부터 얻었다. 'Dyne Agarose High'는 DYNE BIO, Inc.(한국, 성남)로부터 얻었다. 모든 Top10 세포 배양은 MO BIO Laboratories, Inc.(미국, 캘리포니아, 칼즈배드)로부터 얻은 'TB DRY' 배양배지에서 이루어졌다. 모든 BL21(DE3) 세포 배양은 MP Biomedicals(미국, 오하이오, 솔론)에서 얻은 'Circle Grow' 배양배지에서 이루어졌다. 'Ready Gels, Tris - HCl 2 - 20% precast gels'은 Bio-Rad(미국, 캘리포니아, 에르쿨레스)로부터 구입했다. 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4), 암피실린, 폴리에틸렌아민(polyethyleneamine, PEI), 로다민 6G(rhodamin 6G), 로다민 B(rhodamin B), 플루오레세인 나트륨 염(fluorescein sodium salt), 요오드화나트륨(sodium iodide), 글리시딜 메타크릴산염(glycidyl methacrylate, GMA), 및 과산화수소(hydrogen peroxide)는 Sigma-Aldrich(미국, 미주리, 세인트루이스)로부터 얻었다.
실시예
2: 서로 다른
EBP
블럭들과
이들의
블럭
폴리펩타이드에
대한 표기
펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는 서로 다른 EBP들은 다음과 같이 명명한다. 상기 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 첫째, 가소성이 있는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복은 가소성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)라고 정의한다. 한편 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복은 탄성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(the elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)라 칭한다. 둘째, [XiYjZk]n에서, 괄호 내의 대문자들은 게스트 잔기의 단글자 아미노산 코드, 즉, EBP 펜타펩타이드의 4번째 위치(Xaa)에서의 아미노산이고, 이들의 해당하는 아래 첨자는 반복 단위로서 EBP 모노머 유전자의 게스트 잔기의 비율(ratio)을 나타낸다. [XiYjZk]n의 아래 첨자 수 n은 EBP의 반복 횟수의 총 수를 나타낸다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly 펜타펩타이드 단위가 12번 반복되어 이루어진 EBPP 블럭이며, 여기서 4번째 게스트 잔기 위치(Xaa)에서의 Gly, Ala, 및 Phe의 비는 1:3:2이다. 마지막으로, CPP 블럭-시스테인 블럭-친수성 EBP 블럭-소수성 EBP 블럭과 같은다중 블럭 폴리펩타이드들은, 꺾쇠 괄호의 각 블럭의 조성에 의해 명명되며, 블럭들 사이에는 하이픈이 있다.
실시예
3: 이음매가 없는 (seamless) 유전자
클로닝을
위한 변형된
pET
-21a 벡터의 제조
37℃에서 20분 동안 FastDigest 완충제에서 50U의 XbaI, 50U의 BamHI, 10U의 감열(thermosensitive) 알칼리 인산 포스파타제와 함께 4μg의 pET-21a 벡터를 소화(digestion) 및 탈인산화하였다. 제한된 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. XbaI와 BamHI 호환가능한 접착 말단을 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드, 즉, 서열번호 41(5'-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggaggagtacatatgggctactgataatgatcttcag-3') 및 서열번호 42(5'-gatcctgaagatcattatcagtagcccatatgtactcctccttcttaaagttaaacaaaattattt-3')를 설계하였다. 2분 동안 95℃에서 T4 DNA 리가아제 완충제에서 2μM 올리고뉴클레오티드 농도의 50μL를 가열함으로써 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 후 그 용액을 3 시간에 걸쳐 실온까지 천천히 냉각하였다. 30분 동안 37℃에서 20pmol의 어닐링된 dsDNA와 0.1pmol의 선형화된 벡터를 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에 배양함으로써, pET-21a 벡터 내의 다수의 복제 사이트로의 DNA 인서트의 연결 반응(ligation)을 실시하였다. 이음매가 없는 (seamless) 유전자 클로닝과 발현을 위한 변형된 pET-21a(mpET-21a) 벡터를 Top10의 수용세포들로 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC(super optimal broth with catabolite repression) 플레이트 상에 도포하였다. 이어서, mpET-21a 벡터의 DNA 서열을 형광 색소 종료자 DNA 시퀀싱(Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer ABI 3730)에 의해 검증하였다.
실시예
4:
EBP
유전자 단위체 합성 및 이의
올리고머화
4번째 잔기들이 서로 다른 몰비로 가변되는 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는 EBP 서열을 DNA 레벨에서 설계하여 생리적 온도 미만으로 Tt를 최적화하였다. 17개의 EBP 라이브러리에 대하여, 다양한 펜타펩타이드 반복 단위들을 갖는 EBP들의 DNA와 아미노산 서열이 표 1과 표 2에 각각 나타나 있다.
[표 1]
EBP 라이브러리의 유전자 서열. Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩티드 반복을 갖는 가소성이 있는 EBP(EBPP); 및 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 펜타펩티드 반복을 갖는 탄성이 있는 EBP(EBPE)은 모두 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 가지도록 복제되었음
[표 2]
EBP 라이브러리의 아미노산 서열
상기 표 1에서 서열번호 3-10은 친수성 EBP 블럭을 위한 유전자 서열로 분류될 수 있고, 서열번호 11-19번은, Phe, His이 들어간 EBP 블럭을 위한 유전자 서열로 분류될 수 있다. 상기 표 2에서 아미노산 서열번호 20-27은 친수성으로 분류될 수 있고, Phe, His이 들어간 아미노산 서열번호 28-36은 소수성 EBP 블럭으로 분류될 수 있다. 특히 상기 표 2에서 서열번호 22, 23은 양전하를 띤 친수성 EBP 블럭으로 분류되고, 서열번호 24-27은 음전하를 띤 친수성 EBP 블럭으로 분류된다. 즉, 앞에서 서술한 바와 같이, EBP의 LCST가 체온보다 낮은 경우 소수성을 띠고, EBP의 LCST가 체온보다 높은 경우 친수성을 띤다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.
온도와 pH를 포함한 고유한 자극 반응성을 갖도록 펜타펩티드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly [여기서 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음]를 갖는 서로 다른 EBP들을 DNA 레벨에서 설계하였다. Val-Pro-Ala-Xaa-Gly인 펜타펩티드 반복을 갖는 가소성이 있는 EBPP(EBP with plasticity: EBPP)와, Val-Pro-Gly-Xaa-Gly인 펜타펩티드 반복을 갖는 탄성이 있는 EBPE(EBP with elasticity: EBPE), 모두를, 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 갖도록 복제하였다. 상기 표 1과 표 2는, 각각 펜타펩티드 반복 단위를 갖는 서로 다른 EBP들의 유전자 및 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들어, EBPE[G1A3F2]12와 EBPP[G1A3F2]12는 거의 동일한 몰 질량(molar mass)뿐만 아니라, EBP 펜타펩티드 반복 단위의 4번째 잔기가 동일한 조합을 나타낸다. 그리고 펜타펩티드 반복 단위의 서로 다른 3번째 아미노산 잔기(Ala 또는 Gly)로 인해 서로 다른 기계적 특성들을 갖는다. 양전하 및 음전하를 가지는 EBPs는 Lys, Asp, Glu, 및 His과 같은 전하를 띤 아미노산을 게스트 잔기로 도입함으로써 제작되었다.
다양한 EBPs를 인코딩(encoding)하는 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 쌍의 경우 두 올리고뉴클레오타이드들(각각 2 μM 농도로 맞춘)의 각각 50 μL를 T4 DNA 리가아제 완충제에서, 95℃, 2분 동안 가열하고, 그런 다음 상기 반응 용액을 상온에서 3시간에 걸쳐 천천히 식힘으로써 어닐링하였다. 37℃에서 30분 동안 15U의 BseRI와 10U의 FastAP 감열 알칼리 포스파타제로 총 4μg의 변형된 mpET-21a 복제 벡터를 소화 및 탈인산화하였다. 제한 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 30분 동안 16℃에서 90pmol의 어닐링된 dsDNA와 30pmol의 선형화된 mpET-21a 복제 벡터를 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에서 배양함으로써, pET-21a 벡터 내의 다수의 복제 사이트로의 DNA 인서트의 연결 반응을 실시하였다. 연결 반응한 플라스미드를 Top10의 화학적 수용 세포들로 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 판 상에 도포하였다. 이어서, DNA 시퀀싱에 의해 DNA서열을 확인하였다. 모든 EBP 단위체 유전자를 구축한 후에, 다음과 같이, 36개의 반복 유전자를 함유하는 대응하는 벡터 내로의 동일한 36개의 반복 인서트를 연결 반응화함으로써 각 EBP 유전자를 합성하였다. EBP 라이브러리를 위한 복제 절차 및 이들의 융합이 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 단위체 EBP의 유전자의 카피를 함유하는 벡터를, 30분 동안 37℃에서 Cutsmart 완충제에서 10U의 XbaI, 15U의 BseRI, 및 10U의 FastAP 감열 알칼리 포스파타제로 소화 및 탈인산화하였다. 제한된 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 인서트 파트를 제조하도록, 30분 동안 37℃에서 총 4μg의 EBP 모노머 유전자들을 Cutsmart 완충제에서 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 소화하였다. 소화 후에, 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 의해 반응 산물들을 분리하였고, 겔 추출 키트를 사용하여 인서트를 정제하였다. T4 DNA 리가아제 완충제에서 30분 동안 16℃에서 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30pmol의 선형화된 벡터와 함께 90pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 산물을 Top10의 화학적 수용 세포들로 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도말되었다. 형질전환체는 아가로스 겔에서 진단 제한 다이제스트에 의해 초기에 선별되었으며, 전술한 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다.
앞에서 기술한 바와 같이, 설계된 플라스미드 벡터와 함께 세 개의 서로 다른 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 서로 다른 DNA 크기의 EBP 유전자 라이브러리들을 합성하였다. 도 1은, RDL(recursive directional ligation) 방법을 나타내는데, 이 방법을 이용하여 EBP 모노머 유전자들이 연결되어서 올리고머화된 EBP 유전자들을 형성한다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12 에 대한 유전자는 EBPP[G1A3F2]6을 위한 플라스미드계 유전자 벡터와 인서트 간의 연결 반응에 의해 구축되었다: EBPP[G1A3F2]6 에 대한 플라스미드계 유전자(plasmid-borne gene)의 인서트는 XbaI와 AcuI에 의한 이중 소화(digestion)에 의해 제조되었다. 한편, EBPP[G1A3F2]6에 대한 플라스미드계 유전자 벡터는 XbaI와 BseRI에 의한 이중 소화와 알칼리 포스파타제에 의한 탈인산화에 의해 제조되었다. 두 개의 서로 다른 이중 제한효소를 이용하는 이 RDL 방법은 여러 장점들을 갖는다. 첫째, 인서트와 벡터 모두의 돌출부의 서로 다른 형상들로 인해, 제한 벡터의 자기 연결 반응이 발생하지 않았으며, 이들은 머리-꼬리 배향으로 효율적으로 연결되었다. 둘째, 이는, 유형 III 제한 엔도뉴클레아제의 메커니즘 때문에 각 블럭 사이의 링커를 인코딩하는 데 추가 DNA 서열을 갖지 않는다. 각 EBP 유전자를 올리고머화하여 36, 72, 108, 144, 180, 및 216 EBP 펜타펩티드 반복을 생성하였다. 두 개의 제한 엔도뉴클레아제인 Xba I와 BamH I를 사용하여, 540, 1080, 1620, 2160, 2700, 및 3240 염기 쌍(bps)을 갖는 올리고머화된 유전자 크기를 확인하였다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 특징화되는 바와 같이, 도 2는 양측 말단 레인 상의 DNA 크기 마커와 함께 EBP 라이브러리들의 제한된 DNA 대역을 나타낸다. 예를 들어, 도 2(A)의 EBPE[A1G4I1]는, Ala, Gly, Ile를 게스트 잔기로 해서 1:4:1 비로 함유하는 올리고머화된 펜타펩티드 서열을 인코딩하는 제한 DNA 대역을 명확하게 나타낸다. 제한 DNA 대역들 모두는, 분자 크기 마커와 비교하여, 해당하는 길이로 도시되어 있다.
EBP 유전자들과 이들의 블럭 코폴리펩티드들을 T7 프로모터를 갖는 E. coli 에서 과발현하였고, ITC(inverse transition cycling)의 다수 사이클에 의해 정제하였다. 도 3은 정제된 EBP의 구리 염색된 SDS-PAGE 겔화상을 나타낸다. EBP들은, 이론적으로 산출된 분자량보다 적어도 20% 크게 이동하였다. SDS-PAGE 겔 상의 양측 레인들은 표준 단백질 크기 마커(바닥부터 상부로 7, 15, 24, 35, 40, 50, 65, 90, 110, 150kDa)를 함유한다. 도 3(A)와 3(B)의 EBPE[A1G4I1]와 EBPP[A1G4I1]는, 이론적 분자량보다 큰 분자량을 가지는 일련의 대응 단백질들을 나타낸다(EBPE[A1G4I1]는 좌에서 우로 14.0, 27.7, 41.3, 55.0, 68.6kDa). 일반적으로, 도 3(C)와 3(D)의 EBPE[K1G4I1]와 EBPP[K1G4I1]를 포함하는 양으로 대전된 EBP 라이브러리들은, EBPE[A1G4I1]와 EBPP[A1G4I1]의 비극성 EBP 라이브러리들보다 큰 분자량으로 이동하였다. 게다가, 도 3(E)와 3(F)의 EBPE[D1G4I1]와 EBPP[D1G4I1]의 음으로 대전된 EBP 라이브러리들은, 서로 다르게 대전된 특징 때문에 양으로 대전된 EBP 라이브러리들보다 큰 분자량을 나타낸다.
EBP 라이브러리의 특징을 분석하였다. 도 4는, 1℃/분의 가열 속도로 350nm에서의 광학 흡광도(Absorbance350)를 측정함으로써 EBP들의 열적 전이 거동을 나타낸다. 역 전이 온도(Tt)는, 온도에 대한 함수인 혼탁도(turbidity)의 제1 미분값(d(OD350)/dT)이 최대이었던 온도로서 정의된다. 염 농도와 pH 등의 환경적 조건들과 EBP 펜타펩티드 반복 단위의 서로 다른 3번째 및 4번째 아미노산에 따라, EBP의 Tt를 PBS에서 미세 제어하였고, PBS에는 1 내지 3M의 NaCl을 보충하였다. 예를 들어, EBP 펜타펩티드 반복의 3번째 아미노산에서의 Gly를 갖는 EBPE[A1G4I1]12(도 4(A))는, EBP 펜타펩티드 반복의 3번째 아미노산에서의 Gly가 Ala보다 높은 친수성을 갖기 때문에, 1M NaCl을 갖는 PBS에서 EBP 펜타펩티드 반복의 3번째 아미노산에서 Ala를 갖는 EBPP[A1G4I1]12(도 4(B))보다 높은 약 15℃를 나타낸다. 일반적으로, 대전된 EBP 라이브러리들은, 대전된 잔기들을 EBP 펜타펩티드 반복의 4번째 아미노산에 도입하기 때문에, 비극성 EBP 라이브러리들보다 높은 Tt를 갖는 것으로 나타난다. EBPP[D1G4I1](도 4(E))의 음으로 대전된 EBP 라이브러리들은, EBP 펜타펩티드 반복의 4번째 아미노산에서의 Asp와 Lys의 서로 다른 pKa 값들 때문에, EBPE[K1G4I1](도 4(C))와 EBPP[K1G4I1](도 4(D))의 양으로 대전된 EBP 라이브러리들보다 높은 Tt를 갖는다. 참고로, 도 4의 (A), (B), (C), (D) 및 (E)는 친수성을 나타내고 (F) EBPP[G1A3F2]12 및 EBPP[G1A3F2]24 는 소수성을 나타낸다.
실시예
5: 세포투과성
펩타이드
(
CPP
) 유전자 제작 및 시스테인(
Cys
) 포함
블럭
제작
페네트라틴의 아미노산 서열들은 안테나페디아(Antennapedia)(초파리 호메오단백질(homeoprotein))의 호메오도메인(homeodomain)으로부터 유래되었고, SynB1는 돼지 백혈구에서 항균성 펩타이드 프로테그린-1(protegrin-1, PG-1)으로부터 유래된 SynB 군(family) 중 하나였다.
시스테인(Cys) 블럭의 아미노산 서열은 반복되는 시스테인(cysteine, Cys)들 사이에 알라닌(alanine, Ala) 및 글라이신(glycine, Gly)을 넣었고, 상기 아미노산들은 4번 반복되었다, 즉 (Gly-Ala-Cys)4. 알라닌 및 글라이신은 약물 접합을 위한 공간 및 시스테인에서 티올기의 가역적인 분자간 가교를 만들기 위해서 도입되었다. 시스테인-포함 블럭, 페네트라틴, 및 SynB1의 아미노산 서열들을 암호화하는 유전자들은 이음매 없는(seamless) 연결(ligation)을 위해 유전자들의 각 끝에 두 가지 제한효소 인식 부위들(AcuI 및 BseRI)을 포함하는 코돈(codon) 최적화에 의해 파생되었다. 페네트라틴, SynB1, 및 시스테인-포함 블럭의 올리고뉴클레오타이드들의 쌍은 Cosmo Genetech(대한민국, 서울)에서 화학적으로 합성되어, AcuI 및 BseRI로 절단되는 이중가닥 DNA(dsDNA) 단편으로 결합되었다.
실시예
6:
CPP
블럭
및
Cys
블럭을
포함하는 다중
블럭
코폴리펩타이드
설계
시스테인(Cys) 블럭 및 CPP 블럭과 함께 미셀로 자가조립되는 다이블럭 EBPs(친수성 EBP-소수성 EBP) 기반의 다중 블럭 폴리펩타이드들을 설계하였다. 이때 CPP는 세포막을 투과하기 위해서 도입되었다. 하기 표 3은 CPP 블럭으로 이용된 페네트라틴과 SynB1의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
[표 3] CPPs의 유전자 및 아미노산 서열
표 4는 다중 블럭 EBPs의 순서 및 아미노산 서열을 나타낸다. 친수성 EBP 블럭 및 시스테인 블럭을 포함한 미셀 구조체는 이중 약물을 전달할 수 있고 안정화될 수 있다. 미셀 표면 상에 위치한 다가의(multivalent) CPP는 상기 구조체가 세포로 내재화 되는 것을 증가시킬 수 있다. 상기 자가조립 미셀 구조체는 쉘(shell) 및 시스테인 블럭 상에 있는 친수성 EBP 블럭이 약물 전달 및 구조 안정화를 제공한다.
[표 4] 다중 블럭 EBPs의 서열, 유전자 길이 및 분자량
세포투과성 펩타이드(CPP) 블럭-시스테인(Cys) 블럭-전하를 띤 친수성 EBP 블럭-소수성 EBP 블럭으로 구성되는 다중 블럭 코폴리펩타이드들을 설계하였다. 이때 CPP는 세포막을 투과하기 위해서 도입되었다. 표 4는 4 종류의 다중 블럭 코폴리펩타이드의 순서 및 아미노산 서열을 나타낸다. 친수성 EBP 블럭 및 시스테인 블럭을 포함한 미셀 구조체는 이중 약물을 전달할 수 있고 안정화될 수 있으며, 미셀 표면 상에 위치한 다가의(multivalent) CPP는 상기 구조체가 세포 내로 잘 침투하도록 한다. 상기 자가조립 미셀 구조체는 쉘(shell) 및 시스테인 블럭 상에 있는 친수성 EBP 블럭을 통해 약물 전달 및 구조 안정화가 이루어진다.
도 5는 이중 약물 전달 및 구조 안정화를 위한, 미셀 구조체의 첫번째 전략을 도시한다. 카복실기들을 가지고 음전하로 대전된 친수성 EBP는 양전하로 대전된 약물들과 물리적으로 결합된다. 다중 블럭 코폴리펩타이드가 자가조립 미셀 구조체를 형성하면서, 다른 소수성 약물들은 미셀 코어로 포획된다. 두 가지 약물들이 미셀로 포함된 후에, 시스테인 블럭에 티올기들은 이황화 결합을 형성하여 미셀 안정화를 도모한다. 이 때 두 가지 약물들은 다른 물리적 상호작용(정전기적 상호작용 및 소수성 상호작용) 을 통해 미셀에서 각각의 블럭에 결합된다. 쉘 부분에 포획된 전하성 약물과 코어 부분에 포획된 소수성 약물이 다른 속도로 방출될 수 있다. 즉, 두 약물들의 방출 패턴은 다를 수 있다.
도 6은 미셀 구조체의 다른 전략을 도시한다. 미셀은 친수성EBP의 카복실기들에 접합되는 광가교제(photocrosslinker)를 사용함으로써 안정화 된다. 시스테인 블럭 내의 티올기들은 약물들과 화학적으로 접합된다. 상기 도 5의 첫번째 전략과 유사하게, 다중 블럭 코폴리펩타이드가 자가조립 미셀 구조체를 형성하면서, 다른 소수성 약물들은 미셀 코어로 포획된다. 두 약물들이 미셀로 포획된 후에, 미셀 구조체는 광가교의 형성에 의해 안정화 된다. 두 약물들은 화학적 접합 및 물리적 상호작용을 통해 미셀 내 각각의 블럭에 결합된다. 쉘 부분에 접합된 전하성 약물과코어 부분에 포획된 소수성 약물이 다른 속도로 방출될 수 있다. 즉, 두 약물들의 방출 패턴은 다를 수 있다.
실시예
7:
CPP
-
Cys
-친수성
EBP
-소수성
EBP의
다중
블럭
코폴리펩타이드의
유전자 구축
CPP 이중가닥 DNA 단편들, Cys 블럭 이중가닥 DNA 단편들 및 친수성 EBP 및 소수성 EBP를 포함하는 각 플라스미드는 CPP-Cys-EBPP[E1A4I1]12-EBPP[G1A3F2]n의 융합 폴리펩타이드 라이브러리에 대한 유전자들을 창출하기 위해 사용되었다. EBPP[G1A3F2]n를 암호화(encoding)하는 플라스미드 벡터는 CutSmart 완충액에서 10 U의 XbaI, 15 U의 BseRI 및 10 U의 FastAP(온도 감응성 알칼리인산분해효소의 일종)로 37℃에서 30분 동안 절단 및 탈인산화 되었다. 절단된 플라스미드 DNA는 PCR 정제 키트로 정제되었고, 그 다음 40 μL의 증류 및 탈이온화 물로 추출되었다. EBPP[E1A4I1]12 유전자를 삽입 부분(insert)으로 준비하기 위해서, EBPP[E1A4I1]12 유전자 4 μg 전체가 CutSmart 완충액에서 10 U의 XbaI 및 15 U의 AcuI으로 37℃에서 30분 동안 절단되었다. 절단된 후, 반응 산물은 아가로오스겔(agarose gel) 전기영동(electrophoresis)으로 분리되었고, 겔 추출 키트가 사용되어 상기 삽입 부분은 정제되었다. 연결(ligation)은 90 pmol의 상기 정제된 삽입부분과 30 pmol의 상기 선형화된 벡터를 T4 DNA연결효소 완충액에서 1 U의 T4 DNA 연결효소로 16℃에서 30분 동안 항온 처리함으로써 이루어졌다. 그 결과 얻어진 산물은 (화학적 방법으로 제작된) Top10 수용세포로 도입된 후, SOC 평판배지(50 μg/ml의 암피실린으로 보충된) 위에 상기 세포는 도말 되었다. 형질전환체(transformants)는 아가로오스겔 상에서 제한효소에 의해 잘린 단편들을 확인하는 과정을 통해 우선적으로 검증되었고, 그 다음 상기 언급한 바와 같이 DNA 시퀀싱으로 더 검증되었다.
친수성 EBP-소수성 EBP의 다이블럭 "EBPP[E1A4I1]12-EBPP[G1A3F2]n"를 암호화하는 플라스미드 벡터는 CutSmart 완충액에서 15 U의 BseRI 및 10 U의 FastAP(온도 감응성 알칼리인산분해효소의 일종)로 37℃에서 30분 동안 절단 및 탈인산화 되었다. 상기 절단된 플라스미드 DNA는 PCR 정제 키트로 정제되었고, 그 다음 40 μL의 증류 및 탈이온화 물로 추출되었다. 그리고, 연결(ligation)은 시스테인 블럭 이중가닥 DNA 단편들과 상기 선형화된 벡터를 항온 처리함으로써 이루어졌다. 클로닝은 상기 언급한 바와 같이 DNA 시퀀싱으로 확인되었다. 그리고, 트라이 블럭(triblock)인 "시스테인 블럭-EBPP[E1A4I1]12-EBPP[G1A3F2]n"을 암호화하는 플라스미드 벡터는 선형화된 벡터로 준비되었고, CPP 이중가닥 DNA 단편들과 결찰 되었다. 또한, 상기 클로닝은 상기 언급한 바와 같이 DNA 시퀀싱으로 확인되었다.
실시예
8: 다중
블럭
코폴리펩타이드의
유전자 발현 및 정제
표 4의 다중 블럭 EBPs는 IPTG 유도에 의해 대장균에서 과발현되었고 역 전이 순환(inverse transition cycling, ITC)으로 정제되었다. 다중 블럭 EBP 유전자들을 포함하는 모든 플라스미드들은 클로닝 동안 Top 10 대장균에서 다루어졌다. 발현을 위해, 화학적 방법으로 제작된 BL21(DE3) 대장균 수용세포에 열충격을 가해 플라스미드를 도입시켰고, SOC 평판배지에 대장균을 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 항온 처리했다. 형질전환체들 중 하나의 콜로니(colony)는 CircleGrow 배양배지(50 ug/ml 암피실린으로 보충된)에서 하룻밤 동안 37℃에서 100 rpm으로 진탕(shaking) 배양되었다. 일차 배양배지 4 ml은 2 L 플라스크에 담겨있는 500 ml의 CircleGrow 배양배지(50 ug/ml 암피실린으로 보충된)에 첨가되었고, OD600의 값이 0.8에 이를 때까지 37℃에서 180 rpm으로 진탕 배양 되었다. 단백질 발현은 IPTG(isopropyl β-thiogalactopyranoside) 유도(1 mM의 최종 농도)에 의해 유발되었다. IPTG 유도 후 배양은 37℃에서 하룻밤 동안 180 rpm으로 진탕 되었고, 배양된 세포는 원심분리(3000 
g, 4℃, 10 분)로 모아진 후, 20 ml의 10 mM PBS로 재부유 되었고, 그 다음으로 초음파 처리(얼음에서, 20초 간격으로 10 초간 초음파를 부가하는 조건으로 하여, 전체 5 분간 초음파 처리함)를 통해서 용해되었다. 상기 세포 용해물에서 불용성 세포 잔해를 제거하기 위해 원심분리(16,000 rpm, 4℃, 15 분)를 실시했다. 핵산은 폴리에틸렌아민(polyethylenimine)(0.5% w/v) 침전 및 원심분리(16,000 rpm, 4℃, 15 분)로 제거되었다. 그 다음 EBP로 이루어진 다중 블럭 폴리펩타이드들는 ITC로 정제되었다. EBP는 염화나트륨(3-5 M)을 첨가하고 40℃로 가열함으로써 응집되었다. 상기 응집된 단백질은 원심분리(16,000 rpm, 4℃, 15 분)를 통해서 침전물로 가라앉혀졌다. 가용성 불순물을 포함한 상층액은 버렸고, 상기 단백질 침전물은 4℃에서 10 mM PBS로 완전히 재부유 되었다. 낮은 온도에서의 불용성 불순물은 저온 조건에서 원심분리(16,000 rpm, 4℃, 15 분)함으로써 제거되었다. EBPP를 기반으로 한 단백질은 아래의 과정을 반복함으로써 정제되었다; 37℃에서 염화나트륨과 함께 원심분리 후 새로운 PBS로 재부유 그리고 4℃ 원심분리. 37℃ 원심분리 후 매 PBS 첨가 단계에서, 단백질 농도를 증가시키기 위해서 더해진 새로운 PBS의 양을 줄였다.
실시예
9: 다중
블럭
코폴리펩타이드의
특성화
다중 블럭 코폴리펩타이드의 발현 및 불순도는 폴리아크릴아마이드겔전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)로 확인되었고, 이들의 LCST는 온도에 따른 혼탁도를 측정함으로써 확인하였다. 추가적으로, 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)을 측정하여 다중 블럭 코폴리펩타이드가 온도에 의존해 미셀 구조체로 자가조립되는 것을 확인하였다. 폴리펩타이드 용액의 농도는 원액을 희석함으로써 조절되었는데, 여기서 농도는 280 nm에서 변형된 pET-21a(+)의 Tyr(1280 M- 1 cm-1) 및 280 nm에서 페네트레이틴 시퀀스 내의 두 개의 Trp(5690 M-1 cm- 1)와 SynB1의 Tyr(1280 M-1 cm-1)의 몰 흡광 계수을 사용하여 분광광도법으로 측정되었다. SDS-PAGE 겔(gel)은 4-20% 구배(gradient) 겔이고 구리 염색으로 시각화 되었다. LCST 및 DLS는 10 mM PBS에서 1℃/분의 가열 속도를 가지는 온도 함수로서 측정되었다. 다중 블럭 코폴리펩타이드 및 DLS의 OD350는 측정되었다. 전이 온도는 OD350 그래프상에서 변곡점에 해당되는 온도이다.
다중 블럭 코폴리펩타이드의 유전자들은 분자적 클로닝으로 제작되어, Xba I 및 BamH I으로 절단된 후 아가로오스겔 전기영동으로 확인되었다. 도 7(A)는 다중 블럭 코폴리펩타이드의 유전자 단편들을 도시하며, 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24를 암호화하는 유전자들의 길이(2247, 3327, 2253, 및 3333 bp)는 상기 유전자 단편 위에 표기된다. 아가로오스겔 상에 표기된 수치들은 표 4에서의 수치들 보다 66 bp 더 큰데, 그 이유는 다중 블럭 코폴리펩타이드를 암호화하는 유전자들의 양 옆으로 제한효소의 제한 부위들이 위치하기 때문이다. 도 7(B)는 대장균에서 발현되고, ITC에 의해 정제되어, 그리고 SDS-PAGE로 특징지어지는 다중 블럭 코폴리펩타이드를 도시한다. 도 7(B)에서 구리 염색된 SDS-PAGE(4-20% 구배)는 다중 블럭 코폴리펩타이드가 ITC에 의해서 완전히 정제되었음을 보여준다. 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 예상 분자량(62.7, 107.0, 62.6, 및 106.85 kDa)은 밴드 위에 표시되었다. 다중 블럭 코폴리펩타이드밴드들은 예상 분자량과 비교했을 때 더 높은 위치에서 나타났는데, 그 이유는 폴리펩타이드 기반 EBP가 이론적 분자량 보다 약 20% 더 이동했기 때문이며, 이는 이전 연구와 잘 일치된다.
다중 블럭 코폴리펩타이드의 열적(thermal) 거동은 혼탁도(turbidity) 프로파일(profile)에 의해 특징지어졌다. 혼탁도 프로파일들은10 mM의 PBS에 들어있는 25 ?M의 단백질 용액을 1℃/분의 가열 속도로 가열하면서 350 nm에서 흡광도를 측정함으로써 얻어졌다. 도 8은 다이블럭 EBPs, 시스테인 블럭을 가지는 다이블럭 EBPs, 및 다중 블럭 코폴리펩타이드의 LCST 그래프들을 나타내고, 표 5는 전 이온도를 나타낸다.
[표 5] 전이 온도
표 5에서 전이 온도(Tt)는 LCST 그래프들의 변곡점이고, 도 8의 LCST 그래프들로부터 계산되어 얻어졌다. 상기 변곡점은 350 nm에서 흡광도 및 DLS의 그래프로부터 계산되었다. UV 및 DLS 간에 일차 Tt는 다른데, 그 이유는 EBP 응집의 낮은 정도는 용액에서 난류(turblance)를 보이지 않지만 DLS은 응집을 측정하기 때문이다. 그래서, DLS로부터의 전이 온도는 흡광도로 부터의 전이온도 보다 낮다. 위상 전이(phase transition)는 두 번 발생된다. 첫번째 전이는 소수성 EBP 블럭, EBPP[G1A3F2]12 및 EBPP[G1A3F2]24의 응집으로부터 발생된다. 긴 소수성 EBPP 블럭을 가지는 다중 블럭 코폴리펩타이드(페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24 및 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24)(31.02 및 31.37℃)는 짧은 소수성 EBPP 블럭을 가지는 다중 블럭 코폴리펩타이드(페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 및 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12)(38.57 및 40.61) 보다 낮은 Tt를 가진다. 친수성 EBPP 블럭, EBPP[E1G4I1]12,의 응집으로 인해 이차 전이가 발생되기 때문에, 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24(83.55, 82.97, 52.57, 및 84.37 kDa)는 유사한 이차 전이 온도를 가진다. 일차 전이 온도를 보면, 시스테인 블럭은 친수성으로, 친수성 시스테인 블럭을 가지는 다중 블럭 EBPPs인, (GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 및 (GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 일차 전이 온도를 다이 블럭 EBPPs(EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24 및 EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24)보다 증가시킨다(ΔTt는 2.25 및 3.25). 페네트라틴을 가지는 다중 블럭 코폴리펩타이드 (페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 및 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24)의 일차 전이 온도는 시스테인 블럭을 가지는 다중 블럭 EBPPs 보다 2.7 및 1.35 더 낮았다. 또한, SynB1은 다중 블럭 EBPPs의 일차 전이 온도를 감소시켜, SynB1을 가지는 다중 블럭 코폴리펩타이드 (SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 및 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24)의 전이 온도는 시스테인 블럭을 가지는 다중 블럭 EBPPs 보다 낮았다(ΔTt는 0.66 및 1.00). 비록 페네트라틴 및 SynB1은 양전하로 대전된 아미노산을 가지지만, 세포막과의 상호작용에 대한 소수성이 더 큰 효과를 가진다. 이러한 소수성으로 인해, CPP를 가지는 다중 블럭 코폴리펩타이드의 이차 전이 온도가 시스테인 블럭을 가진 삼중 블럭 코폴리펩타이드보다 더 낮게 측정되었다.
자가조립 미셀의 형성 및 크기는 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해 확인되었는데, 이 때 20℃부터 60℃까지의 범위에서 1℃/분의 가열 속도로 시료들을 가열하면서 각 온도에서 11 회 측정되었다(도 9). 10 mM PBS에 포함된 25 μM의 단백질 용액에서 다중블럭 EBPPs의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)이 측정되었다. 상기 표 5는 350 nm에서의 흡광도 그래프 및 DLS로부터 계산된 다중 블럭 EBPP의 전이 온도들을 나타낸다. DLS 데이터에 따르면, 일차 전이 전에 융합 단백질의 반경은 약 10 nm인데, 이것은 상기 단백질이 가용성 단일체(unimer)라는 것을 지시한다. 온도가 증가되면서, 다중 블럭 EBPPs(페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24, SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12, 및 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24)의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 Tt 온도 부근에서 270에서 600 nm의 범위에서 증가하였고, 이 후에는 안정된 단계에 도달하여 일정한 수치(49.17, 46.77, 44.15, 및 47.21 nm)를 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 다중 블럭 코폴리펩타이드가 안정된 미셀을 형성하기 전에 준안정 나노구조체를 형성했다는 것을 의미한다.
실시예
10: 다중
블럭
코폴리펩타이드에
글리시딜
메타크릴산염
(
glycidyl
methacrylate)의 접합, 및 이의
광가교
(
photocrosslinking
) 및 특성화
UV 가교(crosslinking)로 미셀을 안정화 시키는데 사용되는 이중 결합을 도입하기 위해, 다중 블럭 코폴리펩타이드에 글리시딜 메타크릴산염(glycidyl methacrylate, GMA)이 접합되었다. pH 3.5 탈이온수에 1 w/v %로 존재하는 다중 블럭 코폴리펩타이드에 70 umol의 GMA가 첨가된 후 교반되면서 24 시간 동안 4℃에서 항온 처리되었다. 반응 후에, GMA로 변형된 폴리펩타이드들은 미반응 GMA를 제거하기 위해 ITC로 정제되고 PBS에 재부유 되었다. GMA로 변형된 6.25 uM의 폴리펩타이드들은 0.1%의 개시제(initiator)와 함께 미셀로 형성되기 위해 37℃에서 항온 처리되었고, 그 다음 형성된 미셀 구조체를 가교결합(crosslink) 시키기 위해 10 분간 UV에 노출시켰다. 미셀의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 4에서 DLS에 의해 측정되었고, 37℃에서 구조 유지가 확인되었다.
페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 친수성 EBPPs 블럭에 있는 카복실기들에 메타크릴산염 잔기(methacrylate moiety)를 도입시키기 위해, 다중 블럭 EBPPs는 글리시딜 메타크릴산염(glycidyl methacrylate, GMA)으로 접합되었고, 그 다음 UV 노출을 통해 다중 블럭 EBPPs가 미셀 구조체로 형성될 때 상기 접합은 가교화 되어 미셀의 안정화가 이루어졌다. UV 노출 이후에, 10 mM PBS에 25 uM로 존재하는 페네트라틴-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 4℃ 및 37℃에서 측정되었다(도 10). 상기 미셀 의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 4℃에서 123.3 nm였는데, 이는 37℃에서는 소수성을 띄는 코어(core)의 소수성 블럭이 4℃에서 친수성으로 되고 미셀은 가교를 유지한 채 코어에 물을 머금으며 가교되지 않은 미셀(46.77 nm)보다 커진다. 37℃에서, 46.57 nm에서 좁은 피크(pick) 및 401 nm에서 넓은 피크가 관찰되었다. 4℃에서 123.3 nm의 미셀은 이전 미셀 구조체로 완전하게 복원되지 않았고, 무작위적인 구조체(넓은 401 nm의 구조)로 모였다.
실시예
11:
이황화
결합(disulfide bond) 형성 및 특성화
일단 미셀이 형성되면, 시스테인 블럭에서 4 개의 티올기(thiol group)들은 산화제 존재 하에서 이황화 결합을 형성하는데, 이를 통해 쉘(shell)의 가교가 이루어진다. 이황화 결합을 분리하기 위해서 4℃에서 100 uM의 다중블럭 EBPPs에 500 uM의 TCEP(환원제)가 처리되었고, TCEP이 자가산화(self-oxidization)에 의해 환원 능력을 잃어버릴 때까지, 즉 72 시간 동안, 항온 처리되었다. 상기 폴리펩타이드 용액에서 잔해를 제거하기 위해 폴리펩타이드 용액은 0.2 nm 주사기 필터로 여과되었다. 여과된 25 uM의 폴리펩타이드 용액은 촉매제로 작용하는 요오드화나트륨(0.25 uM)의 존재 하에 미셀을 형성시키기 위해서 37℃에서 항온 처리되었고, 이황화 결합을 형성시키기 위해 250 uM의 과산화수소가 첨가되었다. 각 단계 후 용액 내에 있는 구조체의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 37℃에서 DLS로 측정되었고, 4℃에서 미셀 구조체의 유지가 확인되었다.
SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 시스테인 블럭에 있는 티올기들은 이황화 결합을 형성하여 미셀을 안정화 시켰고, 상기 결합 형성은 DLS로 특징지어졌다. 이황화 결합을 형성시키기 전에, SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24의 티올기들을 환원시키기 위해 TCEP(환원제)를 처리하였고, 주사기 필터를 사용하여 잔해를 제거했다. 그 다음 이황화 결합 형성을 위해 과산화수소가 처리되었다. 각 단계 후에 용액 속에 있는 구조체의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 10 mM PBS에서 4℃ 및 37℃에서 측정되었다(도 11). TCEP 처리 이전에, 4℃에서 SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24 용액이 단일체 형태 폴리펩타이드들(11.36 nm) 및 나노구조체(174.8 nm)를 포함한다는 것을 도 11(A)에서 보여준다. TCEP 처리 후에, 무작위적인 이황화 결합은 감소되었다. 도 11(B)에 보여지듯이, 4℃에서 단일체 형태(4.32 nm) 및 나노구조체(75.43 nm)에서의 폴리펩타이드들의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, Rh)은 작아졌고, 단일체 형태(4.32 nm)에서의 폴리펩타이드들의 강도는 증가했고, 나노구조체의 강도는 감소했다. 이러한 결과는 본 발명의 다중 블럭 코폴리펩타이드가 이황화 결합에 의해 연결된 다합체(multimer) 형태로 된 폴리펩타이드를 포함하고 있다는 것을 의미한다. 도 11 (C)는 4℃에서 불순물 없는 단 하나의 단일체(7.05 nm)를 도시한다. 과산화수소 처리 후, 미셀 내에 있는 셀(shell)은 이황화 결합으로 가교화 되었고, 미셀 구조체는 일차 전이 온도 이하에서 유지되었다. 도 11 (D)는 4℃에서 안정된 미셀 구조체를 도시한다.
실시예
12: 물리적으로 포획된 로다민 6G 및 플루오레세인
나트륨 염의
생체 외 방출
양전하로 대전된 로다민 6G는 25 uM의 최종 농도로 25 uM 다중 블럭 코폴리펩타이드(SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24)에 첨가되었고, 양전하로 대전된 로다민 6G가 다중 블럭 코폴리펩타이드에 있는 음전하의 카복실기들(carboxyl groups)과 상호작용하도록 4℃에서 30 분간 상기 용액은 항온 처리되었다. 플루오레세인 나트륨염은 25 uM의 최종 농도로 로다민 6G 및 다중 블럭 코폴리펩타이드의 혼합물에 첨가되었다. 미셀 코어(소수성 EBP 부분)에 플루오레세인 나트륨염을 포획하기 위해서 상기 용액은 37℃로 가열되었다. 로다민 6G 및 플루오레세인 나트륨염을 포함하는 다중 블럭 코폴리펩타이드는, 촉매제로서 0.25 uM의 요오드화나트륨과 250 uM의 과산화수소로 37℃에서 항온 처리되어 이황화 결합이 형성되었다. 상기 혼합물은 투석막 내로 옮겨져서 37℃에서 50 ml의 PBS에서 170 rpm으로 교반되면서 투석되었다. 12 시간까지 측정 시, 1 ml의 부분 표본을 빼내고 1 ml의 PBS로 대체했다. 각 시간 마다 부분 표본의 형광강도는, 로다민 6G에 대해서 524 nm에서 여기(excitation) 파장 및 555 nm에서 방출(emission) 파장이 측정되었고, 플루오레세인 나트륨 염에 대해서는 460 nm에서 여기(excitation) 파장 및 513 nm에서 방출(emission) 파장이 측정되었다. 상기 측정에는 "Synergy Mx monochromator-based multi-mode microplate reader" 기기가 이용되었다.
이중 방출 테스트를 위해, 앞서 기재한 것과 같이, 두 가지 형광 염료들(로다민 6G 및 플루오레세인 나트륨 염)이 모델 약물로서 사용되었다. 다중 블럭 코폴리펩타이드에서 음전하로 대전된 블럭은 먼저 4℃에서 양전하로 대전된 로다민 6G와 전하-전하 상호작용(charge-charge interaction)을 하였고, 그 다음 플루오레세인 나트륨 염이 다중 블럭 코폴리펩타이드에 첨가되었다. 이로써 만들어진 용액은 37℃까지 가열되었다. 이 때 소수성 상호작용으로 플루오레세인 나트륨염이 포획되었다.
로다민 6G 및 플루오레세인 나트륨염을 포함하는 다중 블럭 코폴리펩타이드는, 촉매제로서 요오드화나트륨과 과산화수소로 37℃에서 처리되어 이황화 결합이 형성되었고, 이를 이용해서 다중 약물 방출 실험을 수행하였다.로다민 6G 및 플루오레세인 나트륨 염을 포함한 다중 블럭 코폴리펩타이드는 pH 7.4의 PBS에서 투석 되었다. 방출 시작 후 20 분, 40 분, 1 시간, 1 시간 20 분, 1 시간 40 분, 2 시간, 6 시간, 10 시간, 및 12 시간째 투석 완충액에서 부분 표본들이 채취되었다(도 12 (A)). 로다민 6G는 20 분 동안 방출되지 않았고, 2 시간 이후에는 71.18%의 로다민 6G가 계속적으로 방출되었다. 51.23%의 플루오레세인 나트륨 염은 처음 20 분 이후에 방출되었고, 또한 80.51%의 플루오레세인 나트륨 염은 2 시간 이후에도 방출되었다. 플루오레세인 나트륨염은 로다민 6G 보다 더 빠르고, 더 많이 방출되었다.
실시예
13: 화학적으로
접합된
로다민 B 및 물리적으로 포획된 플루오레세인 나트륨염의 생체 외 방출
로다민 B의 화학적 접합은 다음과 같이 수행하였다: 시스테인 블럭에서 티올기들은 글리시딜 메타크릴산염(glycidyl methacrylate, GMA)에 의해 변형되어 메타크릴산염(methacrylate) 잔기들이 도입된 로다민 B와 접합되었다. 0.2 g의 로다민 B는 pH 3.5의 탈이온수 20 ml에 준비되었고, 70 ul의 GMA가 상기 염료 용액(로다민 B 포함)에 첨가되어 50℃에서 24 시간 동안 반응되었다. 반응이 종결된 후, 상기 용액은 동결 건조되었고, 미반응 GMA을 제거하기 위해 상기 건조된 염료들은 다이에틸 에터(diethyl ether)에서 재침전 되었다. 메타크릴산염으로 변형된 로다민 B는 티올기들과 접합되기 위해 동결 건조 되었다.
0.04 g의 다중 블럭 코폴리펩타이드(SynB1-(GAC)4-EBPP[E1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]24)는 질소 대기(nitrogen atmosphere)하에서 3 ml의 인산완충액(pH 10)에서 0.005 g의 TCET로 4℃에서 24 시간 동안 항온 처리되었다. 그런 다음 1 ml의 인산완충액(pH 10)에 포함된 0.8 mg의 헥실아민(hexylamine)과 1 ml의 인산완충액(pH 10)에 포함된 0.09 g의 메타크릴산염으로 변형된 로다민 B는 상기 용액으로 첨가되었다. 상기 반응은 상온에서 4 시간 동안 행해졌다. 로다민 B가 접합된 다중블럭 폴리펩타이드들은 ITC로 정제되고, 미반응 로다민 B는 투석으로 제거되었다.
플루오레세인 나트륨 염의 물리적 포획은 다음과 같이 수행하였다: 25 uM의 로다민 B-접합 다중 블럭 코폴리펩타이드들은 PBS에 준비되었고 플루오레세인 나트륨 염은 25 uM의 최종 농도로 첨가되었다. 미셀 코어(core)로 플루오레세인 나트륨 염을 포획하기 위해서 상기 혼합 용액은 37℃로 가열되었다. 상기 혼합물은 투석막 내로 옮겨져서 37℃에서 50 ml의 PBS에서 170 rpm으로 교반되면서 투석되었다. 12 시간까지 측정 시, 1 ml의 부분 표본(aliquot)을 빼내고 1 ml의 PBS로 대체했다. 각 시간 마다 부분 표본의 형광강도는, 로다민 B에 대해서 530 nm에서 여기(excitation) 파장 및 578 nm에서 방출(emission) 파장이 측정되었고, 플루오레세인 나트륨염에 대해서는 460 nm에서 여기(excitation) 파장 및 513 nm에서 방출(emission) 파장이 측정되었다. 상기 측정에는 "Synergy Mx monochromator-based multi-mode microplate reader" 기기가 이용되었다.
이중 방출 테스트를 위해, 두 가지 형광 염료들(로다민 B 및 플루오레세인 나트륨 염)이 모델 약물로서 사용되었다. 상기 언급합 바와 같이, 로다민 B는 다중 블럭 코폴리펩타이드의 친수성 EBP 블럭과 화학적으로 접합되었다. 플루오레세인 나트륨 염은 로다민 B-접된 다중 블럭 코폴리펩타이드에 첨가되었고, 이로써 만들어진 용액은 37℃까지 가열되었는데, 이 때 소수성 상호작용으로 플루오레세인 나트륨염이 소수성 EBP 부분에 포획되었다. 로다민 B가 접합되고 물리적으로 포획된 플루오레세인 나트륨 염을 가지는 다중 블럭 코폴리펩타이드는 PBS (pH 7.4)에서 투석되었다. 방출 시작 후 20 분, 40 분, 1 시간, 1 시간 20 분, 1 시간 40 분, 2 시간, 6 시간, 10 시간, 및 12 시간째 투석 완충액에서 부분 표본들이 채취되었다(도 12 (B)). 24.69%의 로다민 B는 처음 20 분 후에 방출되었고, 83.83%의 플루오레세인 나트륨염은 6 시간 동안 상대적으로 천천히 방출되었고, 47.68%의 플루오레세인 나트륨염은 20 분 동안 방출되었으며, 82.42%의 플루오레세인 나트륨 염은 2 시간 동안 방출되었다. 플루오레세인 나트륨염은 로다민 B 보다 더 빠르고, 더 많이 방출되었다. PBS에서 화학적으로 접합된 염료는 물리적으로 갇힌 염료 보다 느리게 방출되었다.
안정화된 미셀(micelle)을 이용하여 세포 내로 이중 약물을 전달하는 것은 진보된 약물 전달 시스템에 있어 중요하다. 진보된 약물 전달 운반체로서 자가조립(self-assembled) 미셀 구조체들을 특별히 제작했다. 상기 미셀 구조체들은 세포막 침투에 필요한 세포 투과성 펩타이드들(cell penetrating peptides, CPPs)을 포함하는 열 반응형(thermally responsive) 엘라스틴-기반 폴리펩타이드들(elastin-based polypeptides, EBPs)을 기반으로 만들어졌다. 약물을 포함하는 열-촉발식(thermal-triggered) 미셀 구조체로 자가조립 되는 EBPs 다이블럭(diblock) 공중합체(copolymer)가 도입되었다. 또한, 시스테인(cysteine) 아미노산들을 포함한 시스테인(Cys) 블럭은 미셀 안정화 또는 약물 접합을 위해서 CPPs 와 EBPs 사이에 도입되었고, 상기 CPPs는 미셀들이 약물들과 함께 더 효과적으로 세포막으로 침투하도록 했다. CPPs는 미셀 구조체의 표면에 위치되었고, EBPs 다이블럭 공중합체가 두 가지 다른 약물을 물리적으로 포획(entrapment)하면서 자가조립 미셀 구조체를 형성할 때 시스테인 블럭은 이황화 결합을 형성했다. 또한, 다중 블럭 코폴리펩타이드가 자가조립 미셀 구조체를 형성하는 동안 시스테인 블럭은 약물 접합 자리로 사용되었고, 열-촉발식 미셀들이 소수성 코어(core)에 약물들을 포함하며 형성될 때 상기 시스테인 블럭은 쉘(shell)의 가교(crosslinking)에 의해 화학적으로 안정화 되었다. 약물 모델로서 방출 테스트를 위해 3가지 형광 염료(로다민 6G, 로다민 B 및 플루오레세인 나트륨 염)들은 다중 블럭 코폴리펩타이드와 화학적으로 접합되거나 또는 물리적으로 상호 작용되었다. 본 발명은 진보된 약물 전달 시스템을 위해 열 반응형(thermally responsive) 융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide)들에 기초하여 높은 침투 능력을 가지는 안정화된 나노운반체를 제시한다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus
<120> Multi-block Polypeptides and Their Self-assembled Nanostructures
for Enhanced Intracellular Delivery of Multiple Drugs
<130> P16U22D1659
<150> KR 15/139,205
<151> 2015-10-02
<160> 54
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or
non-natural
<400> 1
Val Pro Gly Xaa Gly
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or
non-natural
<400> 2
Val Pro Ala Xaa Gly
1 5
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 3
gtcccaggtg gaggtgtacc cggcgcgggt gtcccaggtg gaggtgtacc tgggggtggg 60
gtccctggta ttggcgtacc tggaggcggc 90
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 4
gttccagctg gcggtgtacc tgctgctgct gttccggccg gtggtgttcc ggcgggcggc 60
gtgcctgcaa taggagttcc cgctggtggc 90
<210> 5
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 5
gttccgggtg gtggtgttcc gggtaaaggt gttccgggtg gtggtgttcc gggtggtggt 60
ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 6
gttccggcgg gtggtgttcc ggcgaaaggt gttccggcgg gtggtgttcc ggcgggtggt 60
gttccggcga tcggtgttcc ggcgggtggc 90
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<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 7
gttccgggtg gtggtgttcc gggtgatggt gttccgggtg gtggtgttcc gggtggtggt 60
ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 8
gttccggcgg gtggtgttcc ggcggatggt gttccggcgg gtggtgttcc ggcgggtggt 60
gttccggcga tcggtgttcc ggcgggtggc 90
<210> 9
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 9
gttccgggtg gtggtgttcc gggtgaaggt gttccgggtg gtggtgttcc gggtggtggt 60
ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90
<210> 10
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 10
gttccggcgg gtggtgttcc ggcggaaggt gttccggcgg gtggtgttcc ggcgggtggt 60
gttccggcga tcggtgttcc ggcgggtggc 90
<210> 11
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 11
gtcccgggtg cgggcgtgcc gggatttgga gttccgggtg cgggtgttcc aggcggtggt 60
gttccgggcg cgggcgtgcc gggctttggc 90
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<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 12
gtgccggcgg cgggcgttcc agcctttggt gtgccagcgg cgggagttcc ggccggtggc 60
gtgccggcag cgggcgtgcc ggcttttggc 90
<210> 13
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 13
gtgccggcgg cgggcgttcc agcctttggt gtgccagcgg cgggagttcc ggccaaaggc 60
gtgccggcag cgggcgtgcc ggcttttggc 90
<210> 14
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 14
gtgccggcgg cgggcgttcc agcctttggt gtgccagcgg cgggagttcc ggccgatggc 60
gtgccggcag cgggcgtgcc ggcttttggc 90
<210> 15
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 15
gttccagcgt ttggcgtgcc agcgaaaggt gttccggcgt ttggggttcc cgcgaaaggt 60
gtgccggcct ttggtgtgcc ggccaaaggc 90
<210> 16
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 16
gttccagcgt ttggcgtgcc agcggatggt gttccggcgt ttggggttcc cgcggatggt 60
gtgccggcct ttggtgtgcc ggccgatggc 90
<210> 17
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 17
gtgccggcgc atggagttcc tgccgccggt gttcctgcgc atggtgtacc ggcaattggc 60
gttccggcac atggtgtgcc ggccgccggc 90
<210> 18
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 18
gttccggccg gaggtgtacc ggcgcatggt gttccggcac atggtgtgcc ggctcacggt 60
gtgcctgcgc atggcgttcc tgcgcatggc 90
<210> 19
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 19
gtgccggcgt gcggcgttcc agcctttggt gtgccagcgt gcggagttcc ggccggtggc 60
gtgccggcat gcggcgtgcc ggcttttggc 90
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 20
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 21
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 22
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 23
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 24
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 25
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 26
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 27
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 27
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 28
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly
20 25 30
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 29
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 30
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 31
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 32
Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 33
Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 34
Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala His Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly
20 25 30
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 35
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly
20 25 30
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 36
Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Cys Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 37
<211> 48
<212> DNA
<213> Penetratin of cell penetrating pepatide
<400> 37
cgccagatta agatctggtt ccagaatcgc cgcatgaaat ggaagaaa 48
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> Penetratin of cell penetrating pepatide
<400> 38
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> SynB1 of cell penetrating pepatide
<400> 39
cgggggggcc gtctgtcata tagccgtcgt cgttttagca ccagcaccgg tcgt 54
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> SynB1 of cell penetrating pepatide
<400> 40
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 41
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 41
ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gaggagtaca tatgggctac tgataatgat 60
cttcag 66
<210> 42
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 42
gatcctgaag atcattatca gtagcccata tgtactcctc cttcttaaag ttaaacaaaa 60
ttattt 66
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Cys block
<400> 43
Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys
1 5 10
<210> 44
<211> 60
<212> PRT
<213> hydrophilic EBP
<400> 44
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
20 25 30
Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
50 55 60
<210> 45
<211> 60
<212> PRT
<213> hydrophobic EBP
<400> 45
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
50 55 60
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> hydrophobic EBP
<400> 46
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
85 90 95
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
100 105 110
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
115 120
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 47
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
20 25 30
Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
85 90 95
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
100 105 110
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
115 120
<210> 48
<211> 180
<212> PRT
<213> hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 48
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
20 25 30
Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
85 90 95
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
100 105 110
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
115 120 125
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
130 135 140
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
145 150 155 160
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
165 170 175
Pro Ala Phe Gly
180
<210> 49
<211> 132
<212> PRT
<213> Cys-hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 49
Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Val Pro Ala Gly
1 5 10 15
Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly
20 25 30
Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
35 40 45
Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
65 70 75 80
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
85 90 95
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
100 105 110
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
115 120 125
Pro Ala Phe Gly
130
<210> 50
<211> 192
<212> PRT
<213> Cys-hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 50
Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Val Pro Ala Gly
1 5 10 15
Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly
20 25 30
Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
35 40 45
Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
65 70 75 80
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
85 90 95
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
100 105 110
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
115 120 125
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
130 135 140
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
145 150 155 160
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
165 170 175
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
180 185 190
<210> 51
<211> 148
<212> PRT
<213> Penetratin-Cys-hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 51
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Val Pro Ala Gly
20 25 30
Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly
35 40 45
Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
50 55 60
Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
85 90 95
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
100 105 110
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
115 120 125
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
130 135 140
Pro Ala Phe Gly
145
<210> 52
<211> 208
<212> PRT
<213> Penetratin-Cys-hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 52
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Val Pro Ala Gly
20 25 30
Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly
35 40 45
Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
50 55 60
Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
85 90 95
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
100 105 110
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
115 120 125
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
130 135 140
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
145 150 155 160
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
165 170 175
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
180 185 190
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
195 200 205
<210> 53
<211> 150
<212> PRT
<213> SynB1-Cys-hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 53
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Val Pro
20 25 30
Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly
50 55 60
Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
85 90 95
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
100 105 110
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
115 120 125
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
130 135 140
Gly Val Pro Ala Phe Gly
145 150
<210> 54
<211> 210
<212> PRT
<213> SynB1-Cys-hydrophilic EBP-hydrophobic EBP
<400> 54
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Val Pro
20 25 30
Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly
50 55 60
Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
85 90 95
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
100 105 110
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
115 120 125
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
130 135 140
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
145 150 155 160
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
165 170 175
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
180 185 190
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
195 200 205
Phe Gly
210
Claims (19)
- 세포투과성 폴리펩타이드 블럭(CPP 블럭); 및
상기 세포투과성 폴리펩타이드 블럭의 일 말단에 연결되는 시스테인 블럭(Cys); 및
상기 시스테인 블럭에 연결되는, 전하를 띠고 친수성인 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭(친수성 EBP 블럭); 및
상기 친수성 EBP에 연결되는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭(소수성 EBP 블럭);
으로 구성된 다중 블럭 코폴리펩타이드를 포함하는, 약물전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 친수성 EBP블럭은, Val-Pro-Gly-Xaa-Gly [서열번호 1] 또는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly [서열번호 2]으로 구성된 펜타펩타이드가 6n번 반복되고, 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 약물전달체:
[식 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]6n; 또는
[식 2]
[Val-Pro-Ala-Xaa-Gly]6n,
상기 식 1 또는 식 2에서,
상기 n은 1 이상의 정수이고,
상기 Xaa 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 상기 펜타펩타이드가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되고, 상기 Xaa 중 적어도 하나는 전하를 띤 아미노산이고 친수성 아미노산임.
- 제1항에 있어서,
상기 소수성 EBP 블럭은,
Val-Pro-Gly-Xaa-Gly [서열번호 1] 또는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly [서열번호 2]으로 구성된 펜타펩타이드가 6n번 반복되고, 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 약물전달체:
[식 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]6n; 또는
[식 2]
[Val-Pro-Ala-Xaa-Gly]6n,
상기 식 1 또는 식 2에서,
상기 n은 1 이상의 정수이고,
상기 Xaa 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 상기 펜타펩타이드가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되고, 상기 Xaa 중 적어도 하나는 소수성 또는 지방족 아미노산임.
- 제1항에 있어서,
상기 CPP 블럭은, Penetratin, SynB1, SynB1-NLS, poly-arginine, VP22, MAP, hCT-derived CPP, MPG, Buforin 2, PEP-1, 및 Magainin 2로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약물전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 시스테인 블럭의 아미노산 상기 (Gly-Ala-Cys)이 1회 이상 반복되어 구성되는 것인 약물 전달체.
- 제5항에 있어서,
상기 시스테인 블럭의 아미노산 서열은 (Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys)[서열번호 43]로 표시되는 것인, 약물 전달체.
- 제2항에 있어서,
상기 친수성 EBP블럭은,
상기 식 1에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 20];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 22];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 24]; 또는
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지진 [서열번호 26]; 것이거나,
또는
상기 식 2에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 21];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 23];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 25]; 또는
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어진 [서열번호 27];
것인. 약물전달체.
- 제3항에 있어서,
상기 소수성 EBP 블럭은,
상기 식 1에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진[서열번호 28] 것이거나, 또는
상기 식2에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 29];
K(Lys), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 30];
D(Asp), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 31];
K(Lys), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 32];
D(Asp), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 33];
H(His), A(Ala), I(Ile)가 3:2:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 34];
H(His), G(Gly)가 5:1의 비율로 이루어지거나[서열번호 35]; 또는
G(Gly), C(Cys), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진[서열번호 36]것인, 약물 전달체.
- 제2항에 있어서,
상기 친수성 EBP블럭은,
상기 식 2에서 n은 2이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어진[서열번호 44] 것인, 약물 전달체.
- 제3항에 있어서,
상기 소수성 EBP 블럭은
상기 식 2에서 n는 2 이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나[서열번호 45] 또는
상기 식 2에서 n은 4이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 Xaa는,
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진[서열번호46]것인, 약물전달체.
- 제1항에 있어서, 상기 약물전달체는,
CPP 블럭-시스테인 블럭(Cys)4-친수성 EBP 블럭 EBPP[E1G4I1]12[서열번호 44] -소수성 EBP 블럭 EBPP[G1A3F2]12[서열번호 45]로 구성되거나; 또는
CPP 블럭-시스테인 블럭(Cys)4- 친수성 EBP 블럭 EBPP[E1G4I1]12[서열번호 44] - 소수성 EBP 블럭 EBPP[G1A3F2]24[서열번호 46]로 구성되는것인, 약물 전달체.
- 제11항에 있어서,
상기 CPP 블럭은 페네트라틴(아미노산 서열번호 38) 또는 SynB1(아미노산 서열번호 40)이고,
상기 약물전달체는, 서열번호 51, 52, 53 및 54로부터 선택되는 하나인 것인, 약물전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 다중 블럭 코폴리펩타이드는,
온도 자극에 의해 소수성 EBP블럭이 코어 구조를 형성하고, CPP 블럭-시스테인 블럭-친수성 EBP 블럭이 쉘 구조를 형성하면서, 코어-쉘 구조의 자가조립 나노구조체를 이루는 것인, 약물전달체.
- 제13항에 있어서,
상기 시스테인 블럭의 산화반응에 의해 상기 자가조립 나노구조체가 안정화되는 것인, 약물전달체.
- 제13항에 있어서,
상기 쉘 부분의 친수성 EBP블럭의 카르복실기에 아클릴레이트를 도입하고 자외선을 조사하여 상기 친수성 EBP 블럭과 상기 아크릴레이트가 화학적으로 결합함으로써, 상기 자가조립 나노구조체가 안정화되는 것인, 약물전달체.
- 제13항에 있어서,
상기 약물전달체는,
상기 자가조립 나노구조체의 코어 부분에 소수성 약물이 포획되고, 쉘 부분에 전하성 약물이 포획되어 상기 소수성 약물과 상기 전하성 약물의 방출을 제어하여 다중 약물 방출이 가능한 것인, 약물전달체.
- 제13항에 있어서,
상기 약물전달체는,
상기 시스테인 블럭의 산화-환원 반응에 의해 상기 소수성 약물과 상기 전하성 약물의 방출을 제어하여 다중 약물 방출이 가능한 것인, 약물전달체.
- 제13항에 있어서,
상기 약물전달체는,
상기 자가조립 나노구조체의 코어 부분에 소수성 약물이 포획되고, 상기 쉘 부분의 시스테인 블럭 내 싸이올기(thiol group)에 아크릴레이트가 결합된 전하성 약물이 접합되어, 상기 소수성 약물과 상기 전하성 약물의 방출을 제어하여 다중 약물 방출이 가능한 것인, 약물전달체.
- 제16항 에 있어서,
상기 자가조립 나노구체는 쉘에 포획된 전하성 약물을 방출하고, 그 다음에 코어에 포획된 소수성 약물이 방출되거나; 또는
코어에 포획된 소수성 약물이 방출되고, 그 다음에 쉘에 포획된 전하성 약물이 방출됨으로써, 순차적 약물 방출이 가능한 것인, 약물전달체.
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