KR20170020091A

KR20170020091A - shRNA 발현 카세트의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리

Info

Publication number: KR20170020091A
Application number: KR1020150114815A
Authority: KR
Inventors: 황병준; 김성훈; 박성균; 권남훈; 유해용; 기윤
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2017-02-22

Abstract

본 발명은 shRNA 발현 카세트의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서로 다른 길이(염기 갯수)를 가지는 센스 및 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 염기서열을 동시에 포함하는 올리고뉴클레오티드로부터 비대칭형 헤어핀 구조를 유도하고 상기 비대칭형 헤어핀 구조에서 오버행(overhang)되어있는 서열에 대한 상보서열 가닥을 신장(elongation)하는 과정을 통해 제작된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명의 shRNA 발현 카세트 제조방법은, 기존에 Agilent Sure Print technology를 이용한 150 - 200 base oligonucleotide의 합성 및 이를 이용한 RNAi library 제작 정확도가 50% 정도 수준에 불과한 문제점을 해결하여 높은 수준의 RNAi library 제작 정확도를 구현할 뿐만 아니라, RNAi 라이브러리 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절감하여 산업상 이용가능성이 크다.

Description

shRNA 발현 카세트의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리{Method to prepare shRNA expression cassette, shRNA expression cassette and library produced thereby}

본 발명은 shRNA 발현 카세트의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ⅰ) 제1차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 5' 프라이머 서열을 포함하는 DNA 서열; ii) 3개 내지 9개의 염기로 이루어진 표적 유전자에 대한 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열; iii) 10개 내지 33개의 염기로 이루어진 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열; iv) 19 내지 24개의 염기로 이루어지며 상기 ii) 에서와 동일한 표적 유전자에 대한 센스 RNA를 코딩하는 DNA서열; 및 v) 제2차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 3’ 프라이머 결합 부위를 포함하는 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 이용한 shRNA 발현 카세트의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리에 관한 것이다.

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 하나의 생물학적인 현상으로서 특정 mRNA의 상보적인 염기서열을 갖는 작은 크기의 RNA에 의하여 번역(translation)을 저해하는 현상을 말한다. 1998년 Andrew Fire와 Craig C. Mello가 C. elegans(예쁜꼬마선충)에서 이러한 현상을 처음 발견하여 보고하였고 그 공로를 인정받아 2006년에 노벨 물리의학상을 수상하였다.

유전자의 전사(transcription)를 통하여 만들어진 mRNA에 상보적인 염기서열을 갖는 21~24 nt(nucleotide)의 small RNA가 결합하여 mRNA를 절단하거나 번역(translation)이 진행될 수 없도록 차단함으로써 결과적으로는 단백질이 만들어지지 않아 결과적으로는 유전자의 발현 수준이 낮아진 것으로 나타난다(유전자 침묵, gene silencing 유도). 또한 RNAi는 외부로부터 침입한 바이러스(virus)에 의하여 세포 내로 도입된 외래 RNA 또는 트랜스포존(transposon) 등을 방어하는 기능을 하는 것으로도 알려져 있다.

RNAi는 연구자가 원하는 유전자의 발현 수준을 인위적으로 낮게 유지함을 통하여 유전자의 기능 연구 및 질병과의 관계를 밝히는 데 사용 될 수 있으며 따라서 생명현상을 연구하는 데 있어 매우 가치 있는 도구이다. 한편, 인간 및 생쥐를 포함한 여러 고등 생명체의 유전체를 대상으로 하는 RNAi 라이브러리가 사용되고 있으나, 라이브러리의 제작, 유지 및 사용에 많은 비용이 요구되는 이유로 국내에서 널리 사용되고 있지 못하며, 그에 따른 질병 기전에 대한 이해와 신약 타겟 도출 연구 역시 저해를 받고 있는 실정이다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 인간, 생쥐 등의 유전체는 물론 유전체 내 유전자들에 대한 정보가 잘 알려지지 않은 여러 동식물들의 유전자들에 대한 RNAi 라이브러리를 제공하면서도 RNAi 라이브러리 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있는 새로운 기술에 대한 요구가 존재한다.

현재 RNAi library 제작에 쓰이는 약 150~200 base 크기의 oligonucleotide는 Agilent Sure Print technology로 대표되는 microarray chip을 이용해서 대부분 제작되는데, 이러한 microarray chip을 이용한 150~200 base oligonucleotide의 합성 및 이를 이용한 RNAi library 제작 정확도는 50% 이하이다. 따라서 저비용, 간편성, 높은 정확도, 고효율을 갖는 유전체 RNAi 라이브러리 제작 기술 개발의 필요성이 대두되고 있다.

이에 본 발명자들은 저비용, 간편성, 높은 정확도, 고효율을 갖는 유전체 RNAi 라이브러리 제작 기술을 개발하고자 연구하던 중, 서로 다른 길이(염기 갯수)의 센스 및 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열과 PCR adaptor를 동시에 포함하는 올리고뉴클레오티드로부터 헤어핀 구조를 생성한 후 여러 분자생물학 연구에 널리 쓰이는 효소들을 이용해 상보서열 가닥을 신장(elongation)하는 과정을 통해서 정확도가 높은 shRNA 발현 카세트 제작 기술을 개발하고, 상기 본 발명의 기술을 이용하면 shRNA 라이브러리를 간편하고 저비용으로 제작할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

ⅰ) 제1차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 5' 프라이머 서열을 포함하는 DNA 서열;

ii) 3개 내지 9개의 염기로 이루어진 표적 유전자에 대한 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열;

iii) 10개 내지 33개의 염기로 이루어진 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열;

iv) 19 내지 24개의 염기로 이루어지며 상기 ii) 에서와 동일한 표적 유전자에 대한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열; 및

v) 제2차 3’-제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 3’ 프라이머 결합 부위를 포함하는 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

(a) 상기 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 서열로 이루어지는 이중가닥 DNA 사슬(double strand DNA chain)에 제1차 5’-제한효소 타입 Ⅱ를 처리하고 단일가닥 DNA 사슬(single-strand DNA chain)을 제작 및 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA 사슬에 포함되어 있는 센스 RNA를 코딩하는 DNA서열 및 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 간의 자가혼성화(self-hybridization)를 유도하여, 스템-루프 구조 중 스템을 이루는 한쪽 팔(arm)이 짧은 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에서 스템을 이루는 짧은 쪽 팔(arm)의 말단을, 혼성화되지 않고 오버행(overhang) 되어있는 DNA 서열 부분에 상보적으로 신장(elongation)하여 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계 ;

(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에 제2차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리하는 단계; 및

(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 DNA 사슬 양 말단에 각각 제1 및 제2어댑터(adaptor)를 부착하고, PCR하여 증폭시키는 단계;

를 포함하는 shRNA 발현 카세트 (small hairpin RNA expression cassette) 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 복수의 벡터로 구성된 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

서로 상이한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 삽입된 상기 shRNA 발현 카세트를 하나 이상 제작하는 단계;

상기 제작된 shRNA 발현 카세트들을 발현벡터(RNA vector system)에 클로닝(cloning)하는 단계; 및

상기 클로닝된 벡터를 풀링(pooling)하는 단계를 포함하는 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library) 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library)가 패키징(packaging)된 위바이러스성 입자(pseudoviral particle)를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

iv) 19 내지 24개의 염기로 이루어지며 상기 ii)에서와 동일한 표적 유전자에 대한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열; 및

v) 제2차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 3’ 프라이머 결합 부위를 포함하는 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 상기 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 서열로 이루어지는 이중가닥 DNA 사슬(double strand DNA chain)에 제1차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리하고 단일가닥 DNA 사슬(single-strand DNA chain)을 제작 및 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA 사슬에 포함되어 있는 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 및 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 간의 자가혼성화(self-hybridization)를 유도하여, 스템-루프 구조 중 스템을 이루는 한쪽 팔(arm)이 짧은 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬 에서 스템을 이루는 짧은 쪽 팔(arm)의 말단을, 혼성화되지 않고 오버행(overhang) 되어있는 DNA 서열 부분에 상보적으로 신장(elongation)하여 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계 ;

를 포함하는 shRNA 발현 카세트(small hairpin RNA expression cassette) 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 복수의 벡터로 구성된 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

상기 클로닝된 벡터를 풀링(pooling)하는 단계를 포함하는 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library) 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library)가 패키징(packaging)된 위바이러스성 입자(pseudoviral particle)를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 별다른 언급이 없는 한, 염기서열은 5’에서 3’방향으로 기재된다.

본 발명에서 용어‘사슬(strand)’은 ‘가닥’, ‘쇄’또는 ‘스트랜드’와 호환성 있게 사용되며, 복수의 뉴클레오타이드 중합체(즉, 폴리뉴클레오타이드)를 의미한다.

본 발명에서 용어‘센스 가닥(sensestrand)’이란 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA (messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.

본 발명에서 용어‘안티센스 가닥(antisense strand)’이란 관심있는 목적 핵산(target nucleic acid)에 실질적으로 또는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA (messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 상보적인 폴리뉴클레오티드를 말한다.

본 발명에서 용어 '프라이머(primer, 시발체)'란 상보적인 주형(template, 템플레이트) 가닥과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서 용어 “5’프라이머(5’primer)”는 용어‘정방향 프라이머(forward primer)’와 호환성있게 사용되며, 증폭하고자 하는 목적 핵산 서열에 대한 짧은 센스 가닥으로서, 일반적으로 18-25개의 염기로 이루어진다. 상기 5’프라이머는 목적 핵산 서열에 대한 상보 가닥(안티센스 가닥)의 3’-말단에 상보적으로 결합(binding)하며, 상기 결합 부위를 “5’프라이머 결합 부위(5’ primer binding site)”로 지칭한다.

본 발명에서 용어 “3’프라이머(3’primer)”는 용어 ‘역방향 프라이머(reverse primer)’와 호환성있게 사용되며, 증폭하고자 하는 목적 핵산 서열에 대한 짧은 안티센스 가닥으로서, 일반적으로 18-25개의 염기로 이루어진다. 상기 3’프라이머는 목적 핵산 서열의 3’-말단에 상보적으로 결합(binding)하며, 상기 결합 부위를 “3’프라이머 결합 부위(3’ primer binding site)”로 지칭한다.

본 발명은

ⅰ) 제1차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 5' 프라이머 서열을 포함하는 DNA 서열;

ii ) 3개 내지 9개의 염기로 이루어진 표적 유전자에 대한 안티센스 RNA 를 코딩하는 DNA 서열;

iii ) 10개 내지 33개의 염기로 이루어진 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열;

iv ) 19 내지 24개의 염기로 이루어지며 상기 ii ) 에서와 동일한 표적 유전자에 대한 센스 RNA 를 코딩하는 DNA 서열; 및

v) 제2차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 3’ 프라이머 결합 부위를 포함하는 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 상기 i)의 5’프라이머 서열 및 v)의 3’프라이머 결합 부위의 서열은 사용하고자하는 프라이머 서열에 따라 당업자가 용이하게 결정할 수 있는 것으로서 염기의 갯수 및 조합이 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게 본 발명의 상기 i)의 5’프라이머 서열 및 v)의 3’프라이머 결합 부위의 서열은 합성의 정확도를 위하여 염기서열의 갯수가 10 내지 30개일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15 내지 25개일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 i)의 5’프라이머 서열 및 v)의 3’프라이머 결합 부위의 서열은 제한효소 인식부위(서열)을 포함한다.

본 발명의 용어‘제한효소(restriction endonuclease)’란 선택적으로 이중사슬 DNA에서 각 핵산 사이의 포스포디에스터 결합을 절단하여 절편(fragment)을 만들어 내는 효소이다. 모든 제한효소는 DNA의 특정 염기서열을 인식하며, 이 염기서열은 해당 제한효소의 선택적 작용부위를 나타내주는 것이다. 이중사슬 DNA를 절단함에 따라 몇몇 제한효소는 특이적인 소위 ‘점착 말단(sticky end)’을 생성한다. 이 말단은 특정한 복원 조건에서 다시 스스로 혹은 다른 과정에서 얻어진 DNA 절편 중 해당하는 보족(complementary) 말단기와 봉합(ligation)될 수 있다(재조합, recombination). 이외의 다른 제한효소로 절단 시에는 평활 말단(blunt end)를 지닌 이중사슬 DNA가 생긴다. 평활 말단(blunt end)을 지닌 이중사슬 DNA는 다른 평활 말단(blunt end)을 지닌 이중사슬 DNA와 재조합될 수 있다.

상기 제한효소는 인식 자리(recognition site)에서 특정한 염기서열을 인식하고 제한 자리(restriction site, 절단 부위)에서 핵산을 절단한다. 따라서 본 발명의 용어‘제한효소 인식 부위’는 제한효소 처리에 의하여 직접 절단되는 부위(제한 자리)를 포함할 수도 있고, 또는 절단 부위(제한 자리)와는 별개로 존재할 수도 있다. 즉, 후자에 있어서‘제한효소 인식부위’는 제한효소가 상기 인식 부위의 인지를 통해 그 부위(서열)로부터 특정 염기 이상 떨어진 부위를 절단할 수 있도록 하는 염기의 배열을 의미한다.

본 발명의 제한효소는 당업자가 의도하는 작업 효율 및 편리성에 따라 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 제한효소 타입 I, II, III 및 Ⅳ의 제한효소를 모두 포함할 수 있다.

바람직하게 상기 ⅰ) 및 v)에서의 제한효소는 타입 II 제한효소일 수 있다. 상기 타입 II(2) 제한효소(type II restriction endonuclease)는 호모다이머 또는 테트라머로 알려져 있으며, 특이한 인지 부위 내에 또는 이에 가까운 DNA를 절단한다. 타입 II 제한효소들은 대부분 제한효소 인식 부위(recognition site)와 절단 부위(restriction site)가 같다. 촉매로는 Mg² ⁺ 와 같은 2가 이온(divalention)을 요구한다. 상기 타입 II 제한효소의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 EcoRI, BamHI, HindⅢ, KpnⅠ, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, XhoⅠ 등의 orthodox Ⅱ형; FokⅠ, Alw26Ⅰ, BbvⅠ, BsrⅠ, EarⅠ, HphⅠ, MboⅠ, SfaNⅠ, Tth111Ⅰ 등의 ⅡS형, NaeⅠ등의 ⅡE형; NgoM Ⅳ 등의 ⅡF형; ⅡT형; Eco57Ⅰ 등의 ⅡG형; ⅡM형;BcgⅠ, BpⅠ, Bsp24Ⅰ, BaeⅠ, CjeⅠ등의 ⅡB형 등 일 수 있다.

본 발명의 제한효소는 바람직하게 ⅡS형 제한효소일 수 있고 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 FokⅠ, Alw26Ⅰ, BbvⅠ, BsrⅠ, EarⅠ, HphⅠ, MboⅠ, SfaNⅠ, Tth111 Ⅰ, BsrDI 등을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게 BsrDI 또는 EarI일 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘제1차 제한효소’ 및 ‘제2차 제한효소’에서 각각 제1차, 제2차는 제한효소 처리의 순서를 의미하는 것으로 각각 첫 번째 및 두 번째로 처리됨을 의미한다. 본 발명에서 각각 첫 번째 및 두 번째로 처리되는 ‘제1차 제한효소’ 및 ‘제2차 제한효소’ 는 서로 다른 종류의 제한효소인 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어 '제1차 제한효소(타입 Ⅱ) 인식 서열'이란, 후술하는 shRNA 발현 카세트 제조방법에서 첫 번째로 처리되는 제한효소(타입 Ⅱ)의 인식 부위를 의미하고, '제2차 제한효소(타입 Ⅱ) 인식 서열'이란, 두 번째로 처리되는 제한효소(타입 Ⅱ)의 인식 부위를 의미한다.

본 발명에서 상기 i)의 5’프라이머 및 상기 v)의 3’프라이머 결합 부위에 결합하는 3’프라이머는 하나의 프라이머 세트로서 제공될 수 있다.

바람직한 일례로서 본 발명의 상기 i)의 DNA 서열 및 v)의 DNA 서열은 바람직하게, 상기 i)의 DNA 서열은 BsrDI 인식 부위를 포함하는 5’프라이머 서열인 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 상기 v)의 DNA 서열은 EarI 인식 부위를 포함하는 3’ 프라이머 결합 부위 서열인 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 이때, 상기 v)의 DNA 서열에 부착되는 3' 프라이머는 서열번호 6으로 표시되는 DNA 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어‘표적 유전자’란 이의 발현 또는 기능을 억제하고자 하는 목적 유전자를 의미하며, 본 발명에서 목적 유전자에 특이적인 shRNA를 발현시켜 이로부터 생성된 siRNA에 의해 발현이 선택적으로 억제되거나 불활성화되는 유전자이다. 이러한 불활성화는, siRNA가 표적 유전자의 mRNA에 결합하고 궁극적으로 상기 mRNA를 제거함에 의해 달성된다. 본 발명에서 표적 유전자는 shRNA를 통해 그 기능을 억제할 수 있는 모든 유전자를 포함한다.

본 발명에서 용어‘센스 RNA(sense RNA)’란 표적하는 유전자에서 전사된 mRNA에 대한 센스 가닥(sense strand)을 의미한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드 중, 상기 iv)에서 센스 RNA를 코딩하는 DNA서열의 염기 갯수 및 조합은 원하는 표적 유전자의 종류에 따라, 당업자가 적절하게 설정할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 상기 iv)에서 센스 RNA를 코딩하는 DNA서열의 염기 갯수는 19 내지 24개일 수 있으며, 가장 바람직하게 19 내지 22개일 수 있다.

본 발명에서 용어‘안티센스 RNA(anti-sense RNA)’란 표적하는 유전자에서 전사된 mRNA에 대한 안티센스 가닥(sense strand)을 의미한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드 중, 상기 ii) 에서 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA서열의 염기 갯수는 상기 iv)의 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열보다 적은 것이 특징으로서, 이에 따라 본 발명의 상기 i) 내지 v)로 이루어지는 단일가닥 올리고뉴클레오티드(및 이의 상보서열)에서 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열과 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열을 자가혼성화(self-hybridization)하였을 시에 비대칭적 헤어핀 구조를 띠게 된다.

상기 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA서열의 염기 개수와 그 조합은 원하는 표적 유전자의 종류에 따라, iv)의 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열에 따라, 당업자가 적절하게 설정할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 상기 ii)에서 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열의 염기 개수는 바람직하게 3 내지 9개일 수 있으며, 가장 바람직하게 5 내지 7개일 수 있다.

본 발명에서 상기 ii) 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열은 상기 iv) 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열과 상보적으로 결합하므로, 올리고뉴클레오티드 단일가닥 상에 포함되어 있는 상기 ii)의 DNA와 iv)의 DNA의 서열은 상호 역상보적(reverse complementary)으로 배열되어 있다. 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 자기-상보성(self-complementary) 안티센스 가닥을 포함하는 단일쇄 구조로서, 본 발명에서의 용어 '자기 상보성(self-complementary) 안티센스 가닥' 이라함은 센스 가닥에 역상보적인(reverse complementary) 서열의 안티센스 가닥을 말한다.

따라서 상기 ii) 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열의 염기 순서(조합)는 상기 iv) 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열에 따라 당업자가 적절하게 설정할 수 있는 것으로, 바람직하게 상기 ii) 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열은 상기 iv)센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열의 3’말단에 위치한 염기에서부터 5’방향으로 순차적으로 연결된 염기들에 대하여 상보적인 염기로 구성된다.

본 발명에서 용어‘상보적’이란 핵산과 관련하여 사용될 때, 아데닌(A)은 티민(T) 또는 우라실(U)과 결합하고 구아닌(G)은 시토신(C)과 결합하는 각각의 서열특이적 결합관계를 의미한다. 예를 들면, 5'에서 3' 방향으로 서열 GCAU를 갖는 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서열 CGTA를 갖는 핵산과 상보적이다. 본 명세서에서, 상보적이라는 용어는 실질적으로 상보적인 핵산 및 100% 상보적인 핵산(즉, mismatch를 허용하지 않음)의 의미를 모두 포함하는 것으로 사용되며, 가장 바람직하게는 100% 상보적인 핵산의 관계를 의미하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어‘헤어핀’이란 단일 사슬 내의 상보적인 두 영역이 비상보적인 영역에 의하여 분리된 채 이중구조를 형성할 때, 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 취하는 자가혼성화된 구조를 의미한다. 상기 상보적인 두 영역은 상보성의 정도와 상보성 부위의 방위가 충분하면 충분한 염기쌍의 결합이 일어나 스템(stem, 줄기)으로 칭하는 이중구조를 형성하며, 비상보적인 영역은 루프(loop) 구조를 형성하고 상기 상보적인 두 영역을 연결한다. 루프 부위는 루프 부위의 핵산(또는 핵산 유사체)간의 염기쌍의 부재에 의해 이루어지며, 상기 헤어핀 구조의 루프 부위는 센스 및 안티센스 가닥의 사이의 단일가닥 부위로서 ‘개입한 단일가닥’으로 지칭될 수 있다.

본 명세서에서 상기 상보적인 두 영역은 두 개의 팔(arm)로서 지칭되며, 따라서 본 명세서에서 스템(stem)은 두 개의 팔(3’arm 및 5’arm)로 이루어지는 것으로 정의한다. 그러므로 상기 헤어핀 구조는 단일 사슬 내에서 서로 상보적인 관계에 있는 3’팔(3’arm, 즉 단일 사슬 중 3’말단 측)과 5' 팔(5’arm, 즉 단일 사슬 중 5’말단 측) 서열이 비상보적인 루프 코딩 서열에 의해 분리된 채 이중구조를 형성한 것을 의미한다.

본 발명의 상기 iii)의 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 공지의 mir-30에서 유래된 서열(특히 루프(loop) 부위에서 유래되는 서열)일 수 있다. 상기 iii)의 DNA 서열의 염기 갯수(또는 서열 길이)는 당업자가 목적하는 작업 효율 및 합성 정확도에 따라 임의로 설정할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 10개 내지 33개의 염기로 이루어질 수 있다. 상기 iii)의 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열은 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 DNA 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 '혼성화(hybridization)'는 상보적인 염기 서열 구조를 구비하는 사이의 상보쇄(이중쇄) 형성 반응(즉, 페어링 pairing)을 의미한다.

본 발명에서 용어‘자가혼성화(self-hybridization)’는 분자 내 혼성화(intramolecular hybridization)를 의미하는 것으로, 단일가닥(single strand) 핵산 분자 내에 포함된 서로 상보적인 영역(염기)들이 상보쇄를 형성하는 반응을 뜻한다.

본 발명의 상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열을 중심으로 양쪽에 비대칭적 길이의 센스 RNA 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 서열을 코딩하는 DNA 서열이 각각 위치하는 것이 그 특징으로서, 상기 본 발명의 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 일련의 과정을 통해 제조되는 shRNA 발현 카세트는 그 염기서열 합성 정확도가 매우 높다. 또한 40% 이하의 GC palindrome 서열을 갖는 경우에도 bias가 없이 합성이 잘 이루어진다.

상기 본 발명의 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드는 전술한 i) 내지 v)의 DNA 서열에 관한 설명에 비추어 당업자가 다양한 형태의 조합을 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 상기한 전체적인 특징과 구조를 방해하지 않으면서 i) 내지 v)에 기재된 구성 요소들을 적절히 연결하기 위하여 구성 요소들 사이에 수 개의 염기서열을 추가할 수 있다. 또한 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있다. 상기 서열번호 4로 표시되는 염기서열은 88mer로서, 도 1에 그 구조에 대한 대략적 개념이 도시된다. 상기 서열번호 4의 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열을 중심으로 5’ 말단 쪽에 표적 유전자에 대한 6mer의 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 위치(6개의 N으로 표기)하고, 3’ 말단 쪽에 역시 동일한 표적 유전자에 대한 20mer의 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열(20개의 N으로 표기)이 위치하는 것이 그 특징이다(도 1 참조). 그리고 5’ 말단은 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열을, 3’말단은 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열로 구성된다.

본 발명은

(a) 상기 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 서열로 이루어지는 이중가닥 DNA 사슬( double strand DNA chain )에 제1차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리하고 단일가닥 DNA 사슬( single - strand DNA chain)을 제작 및 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA 사슬에 포함되어 있는 센스 RNA 를 코딩하는 DNA 서열 및 안티센스 RNA 를 코딩하는 DNA 서열 간의 자가혼성화(self-hybridization)를 유도하여, 스템 -루프 구조 중 스템을 이루는 한쪽 팔( arm )이 짧은 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에서 스템을 이루는 짧은 쪽 팔( arm )의 말단을, 혼성화되지 않고 오버행( overhang ) 되어있는 DNA 서열 부분에 상보적으로 신장( elongation )하여 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에 제2차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리하는 단계; 및

(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 DNA 사슬 양 말단에 각각 제1 및 제2어댑터( adaptor )를 부착하고, PCR하여 증폭시키는 단계;

를 포함하는 shRNA 발현 카세트( small hairpin RNA expression cassette ) 제조방법을 제공한다.

본 발명의 용어 'shRNA(small-hairpin RNA)' 는 서로 상보적인 첫 번째 및 두 번째 영역, 즉 센스 및 안티센스 가닥을 포함하여 스템-루프 구조(줄기-루프 구조)를 가지는 siRNA(small interfering RNA)를 지칭한다. 본 명세서에서 용어 ‘스템-루프 구조’는 용어‘헤어핀 구조’와 호환성있게 사용될 수 있으며, 이들 구조에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 ‘발현 카세트’는 '발현 구조체'와 호환적으로 사용되며, 목적하는 뉴클레오티드 단편(본 발명에서는 상기 ⅰ) 내지 v)로 이루어진 올리고뉴클레오타이드)을 발현할 수 있는 핵산 구조체를 말하는 것으로, 숙주 세포에 따라 적절한 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 하나 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있고, 전사조절요소(예, 인핸서 등) 등을 추가로 포함할 수 있다. 아울러, 발현 카세트는 바람직하게는 복제원점, 선별 마커 및 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등와 더불어 벡터를 구성하여, 재조합 발현벡터를 이룰 수도 있다. 본 발명에서 용어‘shRNA 발현 카세트’란, 적어도 프로모터와 마이크로 RNA의 리더 염기서열(leader sequence)에 표적 유전자의 센스 가닥(sense strand)과 안티센스 가닥 (anti-sense strand)을 포함하고 그 사이에 루프를 형성할 수 있는 서열을 포함하고 있어서, shRNA를 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다.

(a) 단계에서는 상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 서열로 이루어지는 이중가닥 DNA 사슬(double strand DNA chain)에 제1차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리하고 단일가닥 DNA 사슬(single-strand DNA chain)을 제작 및 수득한다.

먼저, 본 발명의‘상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 서열로 이루어지는 이중가닥 DNA 사슬’은 당업계에 통상적으로 알려져 있는 합성과정을 통하여 제작될 수 있는 것으로서, 그 방법이 특별히 제한되지 않으나 예를 들어 ' i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드'를 주형으로 하는 PCR 증폭 과정에 의하여 생성되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 예시한 바와 같이 서열번호 4로 표시되는 88mer의 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 경우, 서열번호 1(5’ 프라이머) 및 서열번호 6(3’ 프라이머)의 프라이머 세트를 사용하여 통상의 과정에 의해 PCR 증폭함으로서, ‘상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호 4) 및 이에 상보적인 서열(예를 들어, 서열번호 5)로 이루어지는 이중가닥 DNA 사슬’을 수득할 수 있다.

또한 상기 (a) 단계에서는 본 발명의 상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 중 i) 제1차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 인지하는 제한효소를 처리한다. 상기 제한효소에 관해서는 전술한 바와 같다.

상기 (a) 단계에서 수득하는‘단일가닥 DNA 사슬’은 상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 주형 가닥으로부터 유래된 것 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게 상기 (a) 단계에서 수득하는 ‘단일가닥 DNA 사슬’은 상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열로부터 유래된 것 일 수 있다.

상기 (a) 단계에서 단일가닥 DNA 사슬을 얻기 위하여, 이중가닥 DNA 사슬(double strand DNA chain, dsDNA)을 단일가닥 DNA 사슬(single strand DNA chain, ssDNA)로 제조하는 방법은 당업계에 공지되어있다. 예를 들어 가열에 의한 방법, 엑소뉴클레아제 처리에 의한 방법 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 ‘이중가닥 DNA 사슬(double strand DNA chain, dsDNA)을 단일가닥 DNA 사슬(single strand DNA chain, ssDNA)로 제조하는 방법’은 바람직하게 엑소뉴클레아제 처리에 의한 방법일 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘엑소뉴클레아제(exonuclease)’는 핵산(폴리뉴클레오티드)의 말단으로부터 포스포디에스테르 결합을 순차적으로 분해하여 모노뉴클레오티드를 생성하는 효소를 의미하는 것으로, 엑소뉴클레아제는 5'→3' 방향으로, 또는 3'→5' 방향으로 핵산을 분해할 수 있다. 상기 엑소뉴클레아제는 당업계에 공지된 엑소뉴클레아제라면 그 종류가 제한되지 않으나 예를 들어, E. coli로부터의 엑소뉴클레아제 I, E. coli로부터의 엑소뉴클레아제 III, T. thermophilus로부터의 RecJ 및 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제 등을 포함한다.

본 발명의 엑소뉴클레아제는 바람직하게 이중가닥 핵산에 작용하며 5'→3' 방향으로 핵산을 분해하여 단일가닥 핵산을 생산하는 엑소뉴클라아제라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 T7 엑소뉴클라아제(T7 Exonuclease), 람다엑소뉴클레아제 등을 포함한다.

가장 바람직하게 람다 엑소뉴클레아제를 사용할 수 있다. 상기 효소는 5‘-말단에 인산기를 가지는 이중가닥 DNA를 인지하여 그 가닥(strand)만을 분해하여 최종적으로 단일가닥 DNA를 만든다.

엑소뉴클레아제가 결합하는 핵산의 말단은 전형적으로는, 사용되는 효소의 선택 및/또는 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 결정된다. 전형적으로 엑소뉴클레아제가 핵산 서열의 특정 말단에 결합하는 것을 방해하거나 또는 촉진시키기 위해, 핵산 서열의 한쪽 말단에 히드록실기 등의 화학적 표지, 캡 구조 또는 단백질 표지가 사용될 수 있다.

구체적으로 상기 (a) 단계에서는, 상기 i) 내지 v)의 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열로부터 유래된 단일가닥 DNA 사슬을 수득하기 위하여, 하기와 같은 일련의 단계들을 수행할 수 있다;

(a1) 제1항의 올리고뉴클레오티드를 5’ 프라이머 및 5’-말단이 표지된 3’ 프라이머로 증폭시켜 이중가닥 DNA 사슬(double-strand DNA chain)을 수득하는 단계; 및

(a2) 상기 (a1) 단계에서 수득된 이중가닥 DNA 사슬에 제1차 제한효소 타입 Ⅱ 및 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 처리하고, 5’-말단이 표지된 단일가닥 DNA사슬만을 선택적으로 수득하는 단계.

상기‘증폭’은 공지의 핵산 증폭 반응에 의한 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 의한 것일 수 있다. 상기 PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수 있다.

상기 3’프라이머는 5’-말단이 표지화된 상태로 제공됨으로써, 새로 신장되는 상보서열이 후에 엑소뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 막고 원하는 표적 서열을 수득할 수 있도록 한다. 상기 표지화 수단은 사용되는 엑소뉴클레아제의 종류에 따라 당업자가 용이하게 표지화 수단의 종류를 설정할 수 있는 것으로서, 바람직하게 상기 표지는 비인산화(non-phosphated) 화합물에 의한 표지일 수 있다. 상기 표지는 비오틴(biotin), biotin-TEG, desthiobiotin-TEG, dual biotin, digoxigenin NHS Ester, AMCA, 6-FAM, Int 6-FAM dT, TET, HEX, TAMRA NHS Ester, ROX NHS Ester, JOE NHS Ester, Cy3, Cy5, Texas Red, Alexa 488일 수 있으며, 바람직하게는 biotin-TEG일 수 있다.

상기 (a1) 및 (a2) 단계에서 제한효소 및 엑소뉴클레아제에 관해서는 전술한 바와 같다.

(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA 사슬에 포함되어 있는 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 및 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 간의 자가혼성화(self-hybridization)를 유도하여, 스템-루프 구조 중 스템을 이루는 한쪽 팔(arm)이 짧은 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득한다.

상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA 사슬은 사슬 내에 포함된 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 및 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열의 길이가 동일하지 않고 어느 한쪽이 현저하게 짧은 것이 특징으로서, 바람직하게 양 서열간의 염기갯수 차이는 10 내지 30개의 범위일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA 사슬은, 단일가닥 내에 포함된 상기 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열과 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열을 자가혼성화(self-hybridization)하였을 시에 비대칭적 헤어핀 구조형을 띠게 된다(도 6 참조).

상기 용어‘비대칭적’이란, 헤어핀을 이루는 스템-루프 구조에서, 단일 사슬 내 상보적 서열 간의 결합으로 인한 스템 구조의 양 팔(또는 각 가닥) 길이가 서로 다른 것을 의미한다. 즉, 스템을 이루는 두 개의 팔(arm) 중 어느 한쪽이 다른 한쪽에 비하여 서열 길이가 짧은 것을 의미한다. 따라서 스템 구조 중 한쪽에 비하여 상대적으로 길이가 긴 쪽은 염기 중 일부가 오버행(overhang)된 상태로 노출된다. 구체적으로 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA가 상기 올리고뉴클레오티드 주형가닥으로부터 유래된 경우, 스템을 이루는 짧은 쪽 팔(arm)은 상대적으로 염기의 갯수가 적은 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열에 의한 것이고, 센스 RNA를 코딩하는 DNA의 염기 중 일부는 오버행(overhang)된 상태로 노출된다. 또한 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA가 상기 올리고뉴클레오티드의 상보가닥으로부터 유래된 경우, 스템을 이루는 짧은 쪽 팔(arm)은 상대적으로 염기의 갯수가 적은 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열(즉, 상기 올리고뉴클레오티드 주형가닥의 안티센스 RNA 코딩 DNA에 대한 상보서열)에 의한 것이고, 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA의 염기 중 일부는 오버행(overhang)된 상태로 노출된다.

본 발명에서 용어‘오버행(overhang)’이란 5' 말단(5' 팔) 또는 3' 말단(3' 팔)에서 염기쌍을 형성하지 않고 자유 말단의 상태로 존재하는 뉴클레오티드들을 의미한다. 본 발명의 한 실시양태에서 상기 오버행은 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 가닥 또는 센스 RNA를 코딩하는 DNA 가닥 상의 3' 말단 또는 5' 말단 오버행이다.

구체적으로 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA가 상기 올리고뉴클레오티드 주형가닥으로부터 유래된 경우, 상기 오버행은 센스 RNA를 코딩하는 DNA 가닥상의 3' 말단 오버행일 수 있고, (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA가 상기 올리고뉴클레오티드의 상보가닥으로부터 유래된 경우, 상기 오버행은 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 가닥 상의 5’말단 오버행일 수 있다.

상기 (b) 단계의 자가혼성화는 당업계에 공지된 핵산 서열의 혼성화 기법을 기초로 하여 수행되는 것으로서, 핵산 서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건하에서 실시될 수 있다. 핵산의 서열 구성, GC 함량 및 길이, 혼성화 온도, 혼성화 시약 또는 용액의 조성(용액의 이온강도), 세척온도 및 목적하는 혼성화 특이성의 정도와 같은 여러 인자(factor)에 따라 상기 혼성화 조건이 조절 또는 변형될 수 있다. 본 발명의 상기 (b) 단계에서는 다양한 정도의 혼성화 엄격성(stringency, 예를 들어, 고, 중 및 저)이 적용될 수 있다. 조건이 엄격할수록(ex. 혼성화 수행 온도가 높을수록) 이중가닥을 형성하기 위하여 더 큰 상보성이 요구된다. 바람직하게 본 발명의 상기 (b) 단계의 혼성화는 당업계에서 공지된 기술에 의해 적당한 내지 고엄격성(high stringency) 조건하에서 수행되는 것으로, 이로서 미스매치(mismatch)를 포함하지 않는 상태로 상보적 서열 간에 100% 혼성화가 이루어지는 것일 수 있다. 상기 용어 ‘적당한 내지 고엄격성(moderate to high stringency)’의 혼성화 조건은 본 발명의 실시예에서 사용된 조건과 동일하거나 또는 거의 동일한 정도의 혼성화 특이성을 달성할 수 있는 조건을 의미한다.

상기 혼성화 엄격성은 단일가닥 DNA 사슬 상에 존재하는 상보적 영역 간의 특이적 혼성화를 위한 것으로서, 상기 용어 ‘특이적 혼성화(specific hybridization)’는 결합시키고자 목적하는 핵산들이 이와 유사한 서열을 가지는 다른 핵산에는 혼성화하지 않고 목적하는 핵산 서열에만 혼성화하는 능력을 의미한다.

(c) 단계에서는 상기 (b) 단계에서 수득된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA에서 스템을 이루는 짧은 쪽 팔(arm)의 말단을 혼성화되지 않고 오버행(overhang) 되어 있는 DNA 서열 부분에 상보적으로 신장(elongation)하여 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득한다.

본 발명에서 용어‘신장(elongation)’은 주형 핵산에 상보적인 올리고디옥시뉴클레오티드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오티드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

상기 (c) 단계의‘신장(elongation)’과정은 공지의 분자생물학적인 DNA 합성방법에 의한 것일 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 DNA 중합효소 및 dNTP(디옥시뉴클레오디드 삼인산)를 이용하여 주형 핵산 서열에 대한 상보적인 서열을 중합하는 방법일 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 DNA 중합효소가 본 발명에 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편(klenow fragment), 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.

상기 신장 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 필요한 성분들의 과량은, 신장 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 의도하는 신장 효율이 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공될 수 있다. 상기 DNA 염기서열의 신장 반응은 중합 효소의 신장 반응에 적합한 온도에서 수행될 수 있다.

상기 (c) 단계에서는 스템을 이루는 짧은 쪽 팔의 말단이 반대편 팔(스템을 이루는 긴 쪽 팔)에 오버행 되어있는 서열에 상보적으로 신장되는 것이 특징이며, 이에 따라 헤어핀 구조를 이루는 스템(stem)이 대칭 구조가 된다(도 7 참조).

본 단계의 효소적 서열 합성방법을 통해 shRNA 발현 카세트 및 이를 이용한 shRNA 라이브러리의 합성 정확도가 매우 높아진다.

이는 기존에 Agilent Sure Print technology를 이용한 약 200base oligonucleotide의 합성 및 이를 이용한 RNAi library 제작 정확도가 50% 정도 수준에 불과한 것과 비교하였을 때, 본 발명은 상기 (c) 단계를 포함하는 방법으로 인해 매우 획기적으로 RNAi library 제작 정확도를 높혔다.

(d) 단계에서는 상기 (c) 단계에서 수득한 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에 제2차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리한다.

제한효소에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 제한효소를 처리하고 목적하는 핵산의 절편(fragment)를 수득한다(도 8 참조).

상기 핵산 절편을 고효율로 수득하기 위해 임의의 정제 과정 등을 추가로 시행할 수 있으며, 예를 들어 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 이용한 전기영동 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

(e) 단계에서는 상기 (d) 단계에서 수득된 DNA 사슬 양 말단에 각각 제1 및 제2어댑터(adaptor)를 부착하고, PCR 하여 증폭시킨다.

본 발명에서 용어‘어댑터(adaptor)’란 핵산과 핵산 사이를 연결하는 임의의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 연결성 분자를 의미한다. 본 발명에서는 상기 어댑터 분자와의 연결을 통해, 최종적으로 제조된 shRNA 발현 카세트 construct의 추후 벡터 내 삽입 등의 조작이 용이하다.

본 발명에서 어댑터는 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor)를 사용할 수 있으며, 이의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 어댑터는 당업자가 목적하는 바에 따라 다양한 조합의 서열구성을 가질 수 있으며, 예를 들어 증폭 조작에 사용되는 프라이머에 상보적인 서열 또는/및 프라이머와 동일한 서열을 포함할 수도 있고, 제한효소 인식 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 어댑터는 한 쌍(제1 및 제2어댑터)으로 제공되는 것으로서, 제1어댑터(다른 경우에 있어, 제2어댑터)는 증폭 조작에 사용되는 5’프라이머와 동일한 서열 및 제한효소 인식 서열을 포함하고, 제2어댑터(다른 경우에 있어, 제1어댑터)는 증폭 조작에 사용되는 3’프라이머에 대하여 상보적인 서열 및 제한효소 인식 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 (e) 단계의 제1 및 제2어댑터(adaptor)는 서로 다른 제한효소에 대하 인식 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 제한효소에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 (e) 단계의 제1 및 제2어댑터(adaptor)에 포함되는 제한효소 인식 서열에 있어서 제한 효소의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 AcuⅠ 또는 EcoRⅠ의 인식서열이 포함되는 것일 수 있다.

예를 들어 상기 (e) 단계의 제1어댑터는 제한효소 AcuⅠ의 인식서열을 포함하고 서열번호 7로 표시되는 DNA 서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 제2어댑터는 제한효소 EcoRⅠ의 인식서열을 포함하고 서열번호 8로 표시되는 DNA 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

핵산 서열간의 연결 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 리가아제(ligase) 처리를 통한 효소적 연결반응 등에 의한 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 리가아제의 종류는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 E. coliligase, T4 DNA ligase, mammalian ligases(DNA ligase I, DNA ligase III, DNA ligase IV), thermostable ligase 등이 포함되며, 바람직하게 T4 DNA ligase가 사용될 수 있다.

PCR 증폭에 관련한 내용은 전술한 바와 같으며, 일례로 상기 서열번호 7로 표시되는 제1어댑터 및 서열번호 8로 표시되는 제2어댑터를 부착하여 생성된 단일 사슬에 대한 PCR 증폭은, 서열번호 9(서열번호 7의 센스가닥 단편) 및 서열번호 10(서열번호 8의 상보가닥 단편)의 프라이머 세트를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트를 제공한다.

상기 shRNA 발현 카세트는 상기 (a) 내지 (e) 단계를 포함하는 shRNA 발현카세트 제조방법에서 전술한 바 있는, 하기 DNA 염기서열의 전체 또는 일부를 포함한다;

제1어댑터 DNA 서열;

센스 RNA 를 코딩하는 DNA 서열;

헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열;

상기 센스 RNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열; 및 제2어댑터 DNA 서열;

을 포함하는 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트.

상기 shRNA 발현 카세트에 포함된 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 및 상기 센스 RNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열은 염기의 갯수즉, 서열의 길이가 동일한 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어‘재조합 발현벡터’란 숙주세포에서 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.

본 발명에서 용어‘작동가능하게 연결된(operably linked)’는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동가능하게 연결하는 것은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소, 예를 들면, 제한효소 또는 연결효소(ligase) 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 당업계에 알려진 바이러스 벡터에 의한 것일 수 있고, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 아데노연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터 등 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발병의 상기 발현벡터는 벡터 속에 포함된 상기 shRNA 발현 카세트의 효과적인(세포 내) 발현을 위하여, shRNA의 siRNA로의 효과적인 프로세싱(processing)을 위한 임의의 모티프 서열(sequence motif)를 추가할 수 있다. 상기 모티프 서열은 shRNA의 siRNA로의 프로세싱에 관여하는 것으로 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 CNNC 모티프(CNNC motif, C는 시토신 잔기를 의미, N은 임의의 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, C, G, T, A로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 잔기(residue)를 의미)일 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로의 도입방법은 바람직하게는 염화칼슘법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등 공지의 방법를 이용할 수 있다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 인간 세포일 수 있다.

본 발명은 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 복수의 벡터로 구성된 shRNA 코딩 라이브러리( shRNA encoding library )를 제공한다.

상기 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library)를 구성하는 복수의 벡터는 서로 상이한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 삽입된 shRNA 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 각 벡터에 서로 상이한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 삽입되어있으므로, 상기 각 벡터에는 또한 서로 상이한(그리고 상기 센스 RNA에 상보적인) 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 마찬가지로 삽입되어 있음은 당업자에게 자명하게 이해된다.

본 발명은

서로 상이한 센스 RNA 를 코딩하는 DNA 서열이 삽입된 상기 shRNA 발현 카세트를 하나 이상 제작하는 단계;

상기 제작된 shRNA 발현 카세트들을 발현벡터( RNA vector system )에 클로닝( cloning)하는 단계;

상기 클로닝된 벡터를 풀링(pooling)하는 단계를 포함하는 shRNA 코딩 라이브러리( shRNA encoding library ) 제조방법을 제공한다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J.,Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명은 상기 shRNA 코딩 라이브러리( shRNA encoding library )가 패키징(packaging)된 위바이러스성 입자( pseudoviral particle )를 제공한다.

본 발명의 상기 shRNA 코딩 라이브러리는 위바이러스성 입자(pseudoviral particle)에 패키징된 형태로 제공될 수 있다. 상기 위바이러스성 입자의 제조 방법 및 제조에 기반이 되는 바이러스의 종류는 당업계에 공지되어 있다.

상기 위바이러스성 입자를 통해 진핵세포 안으로 본 발명의 shRNA 코딩 라이브러리의 외부 유전자가 효과적으로 전이될 수 있다.

본 발명의 shRNA 발현 카세트 제조방법은, 기존에 Agilent Sure Print technology를 이용한 150-200 base oligonucleotide의 합성 및 이를 이용한 RNAi library 제작 정확도가 50% 정도 수준에 불과한 문제점을 해결하여 높은 수준의 RNAi library 제작 정확도를 구현할 뿐만 아니라, RNAi 라이브러리 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절감하여 산업상 이용가능성이 크다.

도 1은 실시예 1에서 디자인된 88mer 올리고뉴클레오티드(88mer oligo DNA)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 shRNA 발현 카세트 및 shRNA 발현 라이브러리 제작과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 실시예 <2-1>의 1^st PCR 증폭 반응을 나타내는 것으로, 상기 반응에 사용된 프라이머 쌍(세트) 및 증폭 산물을 도시한다.
도 4는 실시예 <2-2>의 BsrDI 제한효소 처리 반응을 나타내는 것으로, 상기 제한효소의 처리로 인한 절단 부위 및 생성된 DNA 이중 사슬 절편을 도시한다.
도 5는 실시예 <2-2>의 lambda exonuclease 처리 반응을 나타내는 것으로, 상기 lambda exonuclease 처리에 의해 제거 또는 수득된 DNA 단일 사슬을 도시한다.
도 6은 실시예 <2-3>의 자가혼성화 유도 반응을 나타내는 것으로, 상기 혼성화 반응에 의해 생성된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 도시한다.
도 7은 실시예 <2-4>의 DNA 서열 신장 반응을 나타내는 것으로, T4 DNA polymerase 반응에 의해 수득된 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 도시한다.
도 8은 실시예 <2-5>의 EarI 제한효소 처리 반응을 나타내는 것으로, 상기 제한효소의 처리로 인한 절단 부위 및 생성된 헤어핀 구조형 핵산 절편을 도시한다.
도 9는 실시예 <2-6>의 branched adaptor 연결 반응을 나타내는 것으로, 상기 연결 반응에 의해 생성된 헤어핀 구조형 핵산을 도시한다.
도 10은 실시예 <2-7>의 2^nd PCR 증폭반응을 나타내는 것으로, 상기 반응에 사용된 프라이머 쌍(세트) 및 증폭 산물을 도시한다.
도 11은 실시예 <2-8>의 NGS 분석으로 확인한 shRNA의 정확도를 나타낸 그래프이다. x축은 % perfect match(각각의 shRNA에 대하여 총 read에 대한 perfect match의 비율을 백분율로 환산한 것)이고 y축은 shRNA의 수(shRNA numbers)이다. x축의 구간은 십 단위로 [이상~미만]을 나타내며(예를 들어 맨 처음 구간은 % perfect match가 0 이상 10 미만인 구간), 맨 마지막 구간은 100을 포함한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

88mer oligo DNA 디자인

<1-1> 표적 유전자에 대한 sense RNA 를 코딩하는 DNA 염기서열 수집

본 발명에 사용되는 88mer 주형 oligo DNA를 합성하기에 앞서 특정 유전자의 발현 수준을 저해할 수 있을 것으로 기대되는 2만 개의 20mer의 sense RNA를 코딩하는 DNA 염기서열 정보를 수집하여 준비한다. 본 실시예에서 표적 유전자는 모두 인간 유전자를 대상으로 하였으며, sense RNA는 TRC(The RNAi Consortium)의 library를 참고로 선정하였다. 하나의 표적 유전자 당 3 내지 5개의 다른 sense RNA 서열이 포함되도록 하였다.

<1-2> 88 mer oligo DNA 디자인 및 합성

도 1에서 도시하는 바와 같이 5’→ 3' 방향의 순서대로, BsrDI 제한효소 인식 서열을 포함하는 5’프라이머 DNA 서열(서열번호 1), 상기 실시예 <1-1>에서 수집한 20mer DNA 서열에 역상보적인 6개의 염기로 이루어지는 DNA 서열(즉, anti-sense RNA를 코딩하는 6mer DNA 염기서열), 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열(서열번호 2), 상기 실시예 <1-1>에서 수집한 20mer의 DNA 염기서열 및 EarI 제한효소 인식 서열을 포함하는 3’프라이머 결합 부위(3‘ primer binding site)의 DNA 서열(서열번호 3)이 연결된 단일가닥 88mer 올리고뉴클레오타이드(single-strand 88mer oligo DNA, 서열번호 4)를 디자인하였다.

상기에서 디자인한 88mer oligo DNA 염기서열 정보를 바탕으로 CustomArray B3™ Synthesizer(Custom array사)를 사용하여, single-strand 88mer oligo DNA를 합성하였다.

<실시예 2>

shRNA 발현 카세트( short hairpin RNA expression cassette )의 제조

<2-1> 1 ^st PCR 증폭

상기 실시예 <1-2>에서 제작한 single-strand 88mer oligo DNA(서열번호 4) 시료를 주형으로 하고 하기의 표 1에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭한다(도 3 참조). 이때 3’프라이머(즉, reverse primer)의 5’- 말단에는 비오틴의 변형체인 비오틴 텍(biotin TEG)으로 표지한다.

PCR 조건 : 95℃/30초 - [95℃/15초 74℃/30초]_x20 72℃/60초 4℃/∞

(본 명세서에서 기호‘∞’는 0 내지 무한대를 의미하는 것으로, 시간(초)이 특별히 제한되지 않는 것을 의미함.)

상기 PCR을 통해 수득된 증폭 산물은 double-strand 88mer oligo DNA 가 된다. 이때 새로 합성된 상보가닥(서열번호 5)은 3’프라이머에 의해 biotin TEG으로 표지된 상태로 합성된다(도 3 참조).

<2-2> BsrDI 제한효소 및 lambda exonuclease 처리

상기 실시예 <2-1>의 PCR을 통하여 얻은 산물에 BsrDI(NEB) 제한효소를 처리한 후(65℃에서 3시간 이상 처리, 도 4 참조), lambda exonuclease(NEB)로 37℃에서 30분 동안 처리하여 최종적으로 5’-말단에 biotin TEG이 표지된 단일가닥 DNA를 얻는다(도 5 참조).

<2-3> 자가혼성화 ( self - hybridization ) 유도

상기 실시예 <2-2>에서 수득된 5’-말단에 biotin TEG이 표지된 단일가닥 DNA에 2X hybridization buffer(표 2 참조)를 첨가하여 준비하고, 이를 water bath를 사용하여 85℃에서 5분간 방치 후 상온이 될 때까지 천천히 식히고 상온이 되면 시료를 4℃로 옮겨 20분 방치 후 20℃에서 O/N(overnight) 방치 후 사용한다.

상기 과정을 통해 6mer의 DNA 서열(표적 유전자에 대한 anti-sense RNA를 코딩하는 DNA서열)과 20mer의 DNA 서열이 상보적으로 결합하여, 스템-루프(stem-loop) 구조를 가지는 단일가닥 DNA 사슬이 만들어진다. 상기 혼성화 과정에서 20mer 중의 일부 염기(15개의 염기)는 오버행(overhang)되어 남아있게 되며, 따라서 스템 구조를 이루는 한쪽 팔(arm, 특히 3’팔)이 짧은 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬이 제작된다(도 6 참조).

<2-4> DNA 서열 신장

하기 표 3에 제시된 반응 요소들을 상기 실시예 <2-3>에서 수득된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에 처리하고, 12℃에서 30분간 반응을 진행하였다.

이러한 과정을 통해 상기 실시예 <2-3>에서 수득된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에서 스템 구조를 이루는 짧은 쪽 팔의 말단(즉, 6mer DNA 염기서열의 3’-말단)을, 그 반대편 팔(특히 5’팔)에서 혼성화되지 못하고 오버행(overhang)되어 남아있는 부분을 주형으로 하여 상보적으로 신장(elongation)시킨다. 상기 과정을 통해 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬이 수득된다(도 7 참조).

<2-5> EarI 제한효소 처리 및 절편의 정제

상기 실시예 <2-4>의 과정을 통하여 얻은 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에 EarI 제한효소를 처리한 후, 원하는 절편 시료(30bp band의 핵산)를 polyacrylamide gel로 분리하여 준비한다.

상기 과정을 통하여 DNA 사슬에 표지되어 있던 biotin TEG은 잘려나가게 되고, 후술하는 어댑터(adaptor) 서열이 결합할 수 있는 sticky end가 생성된다(도 8 참조).

<2-6> Branched adaptor의 준비 및 연결

Branched adaptor를 준비하기 위하여 Branch oligo A 와 Branch oligo B를 각 각 100pmole씩 섞은 후 2X hybridization buffer를 첨가하여 최종적으로 10 pmole/ul의 농도가 되도록 하여 준비하고, water bath를 사용하여 85℃에서 5분간 방치 후 상온이 될 때 까지 천천히 식힌 후 상온이 되면 4℃에서 30분 방치 후 20℃에서 O/N 보관 후에 사용하였다. Branch oligo A와 branch oligo B는 각각 AcuI과 EcoRI 제한 자리(restriction site)를 포함한다.

상기 실시예 <2-5>에서 준비한 시료와 branched adaptor를 1:10의 비율(예를 들어 시료가 1pomle이라면 branched adaptor는 10pmole을 사용한다)이 되도록 섞은 후 T4 DNA ligase(NEB)를 처리하여 4℃에서 O/N 방치한다. 상기 과정을 통해 제작된 ligation mixture 시료에서는, 상기 실시예 <2-5>에서 제작된 단일가닥 DNA 사슬의 양 말단에 각각 Branch oligo A 와 Branch oligo B가 결합한다(도 9 참조).

<2-7> 2 ^nd PCR 증폭

상기 실시예<2-6>을 통하여 얻은 시료(ligation mixture)를 주형으로 하고, 하기 표 5의 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 최종 산물인 shRNA 카세트를 얻는다(도 10 참조).

PCR 조건 : 95℃/30초 - [95℃/15초 74℃/30초]_x15 74℃/60초 4℃/∞

<2-8> NGS를 통한 shRNA 카세트 염기서열의 정확도 측정

상기 실시예 <2-7>에서 수득한 PCR 산물, 즉 20,000개의 서로 다른 20mer sense RNA를 코딩하는 shRNA 카세트의 염기서열을 분석하여 본 발명의 방법에 따라 제작한 shRNA 발현 카세트의 정확도를 측정하였다.

NGS 분석은 (주)셀레믹스에 의뢰하여 Illumina HiSeq 2000을 이용하여 실시하였다. 실시예 <2-7>에서 PCR 산물로 수득한 shRNA 카세트들은 그 각각이 NGS에서 하나의 주형(template)로 작용하며, NGS으로 증폭하고 분석한 개개의 염기서열을 read라고 부른다. 염기서열의 정확성의 기준으로서, ‘perfect match’는 각 shRNA 카세트에서 branch adaptor A의 AcuI과 branch adaptor B의 EcoRI의 제한 자리(restriction site) 사이의 염기 서열, 즉 발현 벡터에 삽입되게 되는 부분의 염기서열이 예상되는 서열과 정확히 100% 일치하는 것으로 정하였다.

NGS 분석 결과는 하기 표 6에 요약하였다. 총 read 수는 11,811,812였으며, 상기 read에 포함된 template, 즉 shRNA는 전체 20,000가지 중 99.78%에 해당하는 19,956가지로 나타났다. 또한 한 개의 template 당 평균 591개의 read가 분석된 것으로 나타났다.

한편 상기 총 read 중 perfect match의 수는 8,143,805였으며, 상기 perfect read에 포함된 template, 즉 perfect read가 생성된 template는 전체 20,000가지 중 97.66%에 해당하는 19,531개로 나타났다. 하나의 template 당 평균 407개의 perfect read가 생성된 것으로 나타났다.

또한 각각의 template에 대하여 본 발명의 방법으로 제조한 shRNA 카세트의 염기서열의 정확도를 분석한 결과, shRNA의 총 read에 대한 perfect match 비율(% perfect match)은 60% 이상 80% 미만의 구간에 가장 많이 분포하였으며(도 11 참조), 전체적으로 평균 % perfect match는 63.25%인 것으로 나타났다(도 11 참조). 즉, 본 발명의 방법에 따르면, 약 63%의 확률로 표적 유전자의 특정 센스 그리고 안티센스 서열, 제한 효소의 제한 자리와 헤어핀 구조 서열 등의 염기 서열에 오류(error)가 전혀 없는 정확한 서열의 shRNA 카세트를 제작할 수 있다. 이는 기존의 shRNA 라이브러리 제작의 정확도가 50% 이하인 것을 감안하면 정확도가 크게 향상된 것임을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 shRNA 발현 카세트의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ⅰ) 제1차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 5' 프라이머 서열을 포함하는 DNA 서열; ii) 3개 내지 9개의 염기로 이루어진 표적 유전자에 대한 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열; iii) 10개 내지 33개의 염기로 이루어진 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열; iv) 19 내지 24개의 염기로 이루어지며 상기 ii) 에서와 동일한 표적 유전자에 대한 센스 RNA를 코딩하는 DNA서열; 및 v) 제2차 제한효소 타입 2S의 인식 서열을 포함하는 3’ 프라이머 결합 부위를 포함하는 DNA 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 이용한 shRNA 발현 카세트의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트 및 이를 포함하는 라이브러리에 관한 것이다.

본 발명의 shRNA 발현 카세트 제조방법은, 기존의 Agilent Sure Print technology를 이용한 150-200 base oligonucleotide의 합성 및 이를 이용한 RNAi library 제작 정확도가 50% 정도 수준에 불과한 문제점을 해결하여 높은 수준의 RNAi library 제작 정확도를 구현할 뿐만 아니라, RNAi 라이브러리 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절감하여 산업상 이용가능성이 크다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Method to prepare shRNA expression cassette, shRNA expression cassette and library produced thereby <130> NP14-0022 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 88mer 5' primer with BsrD1 site <400> 1 cgatggacgt ccgtgcaatg 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 88mer hairpin loop sequence <400> 2 tacatctgtg gcttcacta 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 88mer 3' primer binding sequence with EarI site <400> 3 agaagagaac ccgcccgcc 19 <210> 4 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 88mer oligo DNA <400> 4 cgatggacgt ccgtgcaatg nnnnnntaca tctgtggctt cactannnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnggtga gaagagaacc cgcccgcc 88 <210> 5 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary DNA of 88mer oligo DNA <400> 5 ggcgggcggg ttctcttctc accnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntagtgaa gccacagatg 60 tannnnnnca ttgcacggac gtccatcg 88 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 88mer 3' reverse primer <400> 6 ggcgggcggg ttctcttct 19 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> branch oligo A adaptor <400> 7 atagagagta cgtgctcctg ctgaaggagg gtacgtagg 39 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> branch oligo B adaptor <400> 8 gtgcctactg cctcggaatt ctgccctcac gagtcgaagg cacag 45 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR forward primer <400> 9 atagagagta cgtgctcctg ctgaaggagg 30 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR reverse primer <400> 10 ctgtgccttc gactcgtgag ggcag 25

Claims

ⅰ) 제1차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 5' 프라이머 서열을 포함하는 DNA 서열;
ii) 3개 내지 9개의 염기로 이루어진 표적 유전자에 대한 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열;
iii) 10개 내지 33개의 염기로 이루어진 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열;
iv) 19 내지 24개의 염기로 이루어지며 상기 ii)에서와 동일한 표적 유전자에 대한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열; 및
v) 제2차 제한효소 타입 Ⅱ의 인식 서열을 포함하는 3’프라이머 결합 부위를 포함하는 DNA 서열
로 이루어지는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 i)의 DNA 서열은 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 iii)의 헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 v)의 DNA 서열은 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 염기서열 인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
(a) 제1항의 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 서열로 이루어지는 이중가닥 DNA 사슬(double strand DNA chain)에 제1차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리하고 단일가닥 DNA 사슬(single-strand DNA chain)을 제작 및 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 단일가닥 DNA 사슬에 포함되어 있는 센스 RNA를 코딩하는 DNA서열 및 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열 간의 자가혼성화(self-hybridization)를 유도하여, 스템-루프 구조 중 스템을 이루는 한쪽 팔(arm)이 짧은 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 비대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에서 스템을 이루는 짧은 쪽 팔(arm)의 말단을, 혼성화되지 않고 오버행(overhang) 되어있는 DNA 서열 부분에 상보적으로 신장(elongation)하여 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬을 수득하는 단계 ;
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 대칭적 헤어핀 구조형 단일가닥 DNA 사슬에 제2차 제한효소 타입 Ⅱ를 처리하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 DNA 사슬 양 말단에 각각 제1 및 제2어댑터(adaptor)를 부착하고, PCR 하여 증폭시키는 단계;
를 포함하는 shRNA 발현 카세트(small hairpin RNA expression cassette) 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (a) 단계는
(a1) 제1항의 올리고뉴클레오티드를 5’ 프라이머 및 5’-말단이 표지된 3’프라이머로 증폭시켜 이중가닥 DNA 사슬(double-strand DNA chain)을 수득하는 단계; 및
(a2) 상기 (a1) 단계에서 수득된 이중가닥 DNA 사슬에 제1차 제한효소 타입 Ⅱ 및 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 처리하고, 5’-말단이 표지된 단일가닥 DNA사슬만을 선택적으로 수득하는 단계;
로 이루어지는 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트(small hairpin RNA expression cassette) 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (e) 단계의 제1 및 제2어댑터(adaptor)는 서로 다른 제한효소 절단 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트(small hairpin RNA expression cassette) 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (e) 단계의 제1 및 제2어댑터(adaptor)는 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트(small hairpin RNA expression cassette) 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제는 T7 엑소뉴클라아제(T7 Exonuclease) 또는 엑소뉴클레아제 람다(exonuclease lambda)인 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트(small hairpin RNA expression cassette) 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 표지는 비인산화 화합물에 의한 표지인 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트(small hairpin RNA expression cassette) 제조방법.
제6항의 방법에 의해 제조된 shRNA 발현 카세트.
제12항에 있어서, 상기 shRNA 발현 카세트는
제1어댑터 DNA 서열;
센스 RNA 를 코딩하는 DNA 서열;
헤어핀 루프를 코딩하는 DNA 서열;
상기 센스 RNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열; 및
제2어댑터 DNA 서열;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트.
제12항의 shRNA 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제14항에 있어서, 상기 발현 벡터는 CNNC motif를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제14항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제16항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노연관바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 shRNA 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
제12항의 shRNA 발현 카세트를 포함하는 복수의 벡터로 구성된 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library).
제18항에 있어서, 상기 복수의 벡터는 서로 상이한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 삽입된 shRNA 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library).
서로 상이한 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 삽입된 제12항의 shRNA 발현 카세트를 하나 이상 제작하는 단계;
상기 제작된 shRNA 발현 카세트들을 발현벡터(RNA vector system)에 클로닝(cloning)하는 단계;
상기 클로닝된 벡터를 풀링(pooling)하는 단계를 포함하는 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library) 제조방법.
제18항의 shRNA 코딩 라이브러리(shRNA encoding library)가 패키징(packaging)된 위바이러스성 입자(pseudoviral particle).