KR20170005204A - Synthesis of hyaluronic acid tethered semiconductor nanoparticles in amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer composites and application for cell-specific targeting - Google Patents
Synthesis of hyaluronic acid tethered semiconductor nanoparticles in amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer composites and application for cell-specific targeting Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 히알루론산을 포함하는 특이적 나노 복합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산에 특이적인 생체 조직에 특이적 전달이 가능한 히알루론산을 포함하는 특이적 나노 복합체 및 이를 이용한 특이적 전달에 관한 것이다.The present invention relates to a specific nanocomposite containing hyaluronic acid, and more particularly to a specific nanocomposite containing hyaluronic acid capable of specifically transferring to a biological tissue specific to hyaluronic acid, will be.
Description
본 발명은 히알루론산을 포함하는 특이적 나노 복합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산에 특이적인 생체 조직에 특이적 전달이 가능한 히알루론산을 포함하는 특이적 나노 복합체 및 이를 이용한 특이적 전달에 관한 것이다. The present invention relates to a specific nanocomposite containing hyaluronic acid, and more particularly to a specific nanocomposite containing hyaluronic acid capable of specifically transferring to a biological tissue specific to hyaluronic acid, will be.
특이적 전달 (targeted delivery)은 원하는 물질 (예를 들어, 약물 혹은 표지자)을 특정 세포 혹은 세포 조직으로 전달하여 특이적인 대상에 대한 제한적 진단 및 치료를 통해 부작용을 최소화하는 동시에 체내 순환시간을 증대하여 전달 효율을 극대화하기 위해 필수적인 현대 의학의 요소 중 하나이다.Targeted delivery delivers the desired substance (eg, a drug or marker) to a specific cell or tissue to minimize the side effects by limited diagnosis and treatment of a specific target, while increasing circulation time It is one of the essential elements of modern medicine to maximize delivery efficiency.
일반적인 특이적 전달 방법을 위해 널리 사용되는 방법은 리포좀, 덴드리머, 생분해성 고분자, 인공적인 핵산 나노구조체 등을 전달체로 이용하고 세포 표면의 특정 단백질을 대상으로 특이적 결합 능력을 가진 단분자, 항체, 생체 고분자 등을 전달하고자 하는 약물에 결합시켜 전달하는 방식이 사용된다. A widely used method for general specific delivery methods is to use liposomes, dendrimers, biodegradable polymers, artificial nucleic acid nanostructures, and the like as a carrier, A biomolecule or the like is bound to a drug to be delivered and then delivered.
가장 흔히 사용되는 전달체의 전달 방식인 리포좀은 최소 구성단위체인 리피드가 친수성 및 소수성 작용기를 동시에 가져 일정한 크기의 구형의 입자를 형성하게 되고, 물과 같은 용매에서 내부가 소수성, 외부가 친수성 작용기를 가지는 리포좀을 형성하게 된다. 하지만, 전달 능력을 결정하는데 매우 중요한 요소 중 하나인 크기와 표면전하를 세밀하게 조절하기 힘들다는 단점이 있다. 또한 특이적인 전달을 위해 표면에 특정 대상에 결합하는 작용기를 추가 도입해야 하는 단점이 존재한다. The liposome, which is the most commonly used delivery system of the carrier, is a lipid which is a minimum constituent unit, which forms hydrophilic and hydrophobic functional groups at the same time and forms spherical particles of a certain size. In a solvent such as water, liposomes are hydrophobic, To form liposomes. However, there is a disadvantage that it is difficult to finely control the size and surface charge, which is one of the most important factors for determining the transfer capability. In addition, there is a disadvantage that additional functional groups that bind to a specific object on the surface must be introduced for specific delivery.
덴드리머는 세대를 정밀하게 조절하면서 크기를 세밀하게 조절할 수 있는 장점이 있지만, 표면 전하를 조절하기 위해서는 다른 작용기를 도입하는 새로운 합성단계를 필수적으로 요구받게 된다. 이 경우, 덴드리머 자체가 가진 3차원 구조가 바뀌게 되어 덴드리머들끼리 응집하여 초분자체를 이루거나 하여 새로운 구조를 가진 전달체로 바뀔 수 있어서, 최종적으로는 크기를 세밀하게 조절하는 것 또한 쉽지 않게 된다. 결국, 세포내 전달 효율을 최적화하기에 한계점이 존재한다.Dendrimers have the advantage of fine-tuning the size while fine-tuning the generation, but in order to control the surface charge, a new synthesis step of introducing another functional group is required. In this case, since the three-dimensional structure of the dendrimer itself is changed, the dendrimers may be aggregated to form a supramolecular body, which can be converted into a carrier having a new structure, and finally, it is also difficult to finely control the size. Consequently, there is a limit to optimizing the intracellular delivery efficiency.
인공적인 핵산 나노구조체 등을 전달체로 이용하는 경우, 알고 있는 염기서열을 가진 핵산 가닥들을 혼성하여 원하는 3차원 구조로 형성 (DNA origami) 되도록 디자인하여 상대적으로 표면 전하 및 크기를 동시에 세밀하게 조절할 수 있는 장점이 있다. 하지만 이 또한 전체 표면전하가 주로 음전하를 띄어 생체내 조건에서 전반적으로 음전하 표면을 띄는 세포막과의 상호 작용이 약해 효율적인 약물 전달을 저해하게 되고, 특이적 전달을 위해 표면에 특이적 결합 능력을 가진 다른 작용기를 치환해주어야 하는 단점이 있다. When an artificial nucleic acid nanostructure or the like is used as a carrier, nucleic acid strands having known nucleotide sequences are hybridized to form a desired three-dimensional structure (DNA origami), and the surface charge and size can be controlled at the same time . However, since the surface charge is mainly negatively charged, the interaction with the cell membrane having a negative charge surface is weak in the in vivo condition, which inhibits efficient drug delivery. In addition, It is necessary to substitute functional groups.
생체 고분자를 이용한 특이적 전달은 일반적으로 구성하는 전달하고자 하는 대상에 대한 특이적 결합 능력을 가진 작용기를 가지는 동시에 일정한 크기와 표면 전하를 가지도록 디자인할 수 있어 전달체이자 동시에 특이적 전달의 특이적 결합 능력을 가진 전달체 중 하나이며 생체내 조건에서 천천히 분해되어 전달체 자체의 세포 독성 또한 낮은 전달체 중 하나이다. 하지만, 여전히 표면 전하와 크기를 세밀하게 조절하는 것은 매우 복잡한 합성 방법을 요구하고, 특정 생체 고분자는 음전하를 띄어 세포내 전달에 불리하며 특히 약물 혹은 표지자를 담지하는 능력을 극대화하기 위해서는 소수성 부분을 덧붙여 합성하거나 추가적인 합성 단계를 도입해야할 필요가 있다. The specific transfer using a biopolymer can be designed to have a specific size and surface charge while having a functional group having a specific binding ability to a general object to be transferred, and it is possible to provide a specific binding Is one of the carriers with the ability to be degraded slowly in vivo conditions and the carrier itself is one of the lower cytotoxicity. However, fine control of the surface charge and size still requires a very complicated synthesis method. Certain biopolymers are negatively charged and adversely affect intracellular delivery. In order to maximize the ability to carry drugs or markers, a hydrophobic moiety is added It is necessary to synthesize or introduce additional synthesis steps.
이에 따라, 인체의 특정 조직 내에 특이적으로 결합 및 전달할 수 있는 새로운 특이적 전달체에 대한 요구가 여전히 계속되고 있다. Accordingly, there is a continuing need for new specific carriers capable of specifically binding and transferring into specific tissues of the human body.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 특이적 전달용 나노 입자 복합체를 제공하는 것이다. A problem to be solved by the present invention is to provide a specific transfer nanoparticle complex.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 특이적 전달용 나노 입자 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다. Another problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing a specific transfer nanoparticle complex.
본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 특이적 전달용 나노 입자 복합체를 이용하여 전달하는 방법을 제공하는 것이다. Another problem to be solved by the present invention is to provide a method for delivery using a specific delivery nanoparticle complex.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에 따른 특이적 전달용 나노 입자 복합체는 양전하를 띠는 양친매성 고분자 입자 내부에 소수성을 가지는 다수의 형광성 반도체 나노입자들이 캡슐화되어 있으며, 고분자의 입자 표면에 히알루온산이 결합된 것을 특징으로 한다. In order to solve the above problems, the specific transfer nanoparticle complex according to the present invention is characterized in that a plurality of fluorescent semiconductor nanoparticles having hydrophobicity are encapsulated in the positively charged amphipathic polymer particle, Characterized in that hyaluronic acid is bound.
이론적으로 한정된 것은 아니지만, 상기 특이적 전달용 나노 입자 복합체는 외부가 친수성을 띠며 내부가 소수성을 띠는 양친성 고분자로 이루어진 하나의 큰 나노 입자의 내부에, 소수성 리간드를 가지는 수십 개 또는 수백 개의 작은 반도체 나노입자들이 다량 내포되고, 상기 양친성 고분자는 생체 내에서 양전하를 띠고 있어 음전하 표면을 가지는 세포막과 정전기적 인력으로 결합하여 세포 내부로 도입성을 높여주며, 내포된 반도체 나노 입자들은 리간드 비치환과 응집에 의해 세포 표지에 필요한 충분한 형광성을 가지는 형광제로 작용하며, 또한 복합체가 세포내로 이동하는 과정에서 고분자 입자의 구조를 지지하는 구조 지지체로 작용한다. 또한, 표면에 결합된 히알루온산에 의해서 히알루온산에 특이적인 생체 조직에 특이적으로 결합하게 된다. Although it is not theoretically limited, the specific transfer nanoparticle composite may contain dozens or hundreds of small particles having a hydrophobic ligand inside of one large nanoparticle composed of an amphiphilic polymer having hydrophilicity outside and hydrophobic inside The semiconductor nanoparticles are encapsulated in a large amount and the amphipathic polymer is positively charged in the living body and binds to the cell membrane having the negative charge surface by electrostatic attraction to increase the introduction property into the cell, It functions as a fluorescent agent having sufficient fluorescence for cell labeling by aggregation and also acts as a structural support for supporting the structure of the polymer particles in the process of moving the complex into cells. In addition, it binds specifically to biotissue specific to hyaluronic acid by hyaluronic acid bound to the surface.
본 발명에 있어서, 상기 "양전하를 띤다"는 입자의 전체적인 전하가 양전하를 이룬다는 것을 의미하며, 바람직하게는 제타 포텐셜이 1 mV 이상, 보다 바람직하게는 10 mV이상, 보다 더 바람직하게는 20 mV이상을 가지는 것으로 이해된다. In the present invention, the term "positively charged" means that the entire charge of the particle is positive, and preferably the zeta potential is at least 1 mV, more preferably at least 10 mV, even more preferably at least 20 mV Or more.
본 발명에 있어서, 상기 "양친매성" 또는 "양친성"이라 함은 친수성과 소수성을 동시에 가지고 있어, 물 또는 극성 용매와 비극성 용매 양자에 녹거나 분산될 수 있는 성질을 의미하는 것으로 이해된다. In the present invention, the term " amphipathic "or" amphipathic "means hydrophilic and hydrophobic, and is understood to mean a property capable of being dissolved or dispersed in water or both a polar solvent and a nonpolar solvent.
본 발명에 있어서, 상기 형광성이 좋다는 것은 toluene 기반 용매에서 비슷한 발광파장을 가진 형광 유기염료, 예를 들어 rhodamine101 의 양자 수율을 100% 로 가정하였을 때와 비교하여 상대적 양자 수율을 측정하였을시 60% 이상이 되는 것을 의미한다. In the present invention, when the relative quantum yield of the fluorescent organic dye having a similar emission wavelength in the toluene-based solvent, for example, rhodamine101 is assumed to be 100%, it is 60% or more .
본 발명에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 바람직하게는 친수성 부분과 소수성 부분으로 이루어져, 물과 비극성 유기 용매 양자에 녹거나 분산될 수 있는 고분자를 의미하는 것으로서 이해된다. In the present invention, the amphipathic polymer is preferably understood as meaning a polymer consisting of a hydrophilic part and a hydrophobic part, which can be dissolved or dispersed in both water and a non-polar organic solvent.
본 발명에 있어서, 상기 양전하를 띠는 양친매성 고분자는 본태성으로 양전하를 띠는 경우와, 사용되는 특정 조건에서 양전하를 띠는 경우를 다 포함할 수 있으며, 바람직하게는 수계, 보다 바람직하게는 생체 내 표지제로서 생체 내에서 양전하를 띠는 것으로 이해된다. In the present invention, the positively charged amphipathic polymer may include both a case where the positively charged amphipathic polymer is positively charged and a case where the positively charged polymer is positively charged under specific conditions to be used. Preferably, It is understood that as an in vivo labeling agent, a positive charge is generated in vivo.
본 발명에 있어서, 상기 양전하를 띠는 양친매성 고분자는 가지형 폴리에틸렌이민의 가지 말단들에 소수성기가 결합되어 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자일 수 있다. 여기서 상기 소수성기는 탄소수 5-20의 알킬기, 알켄기, 알카인기, 고리형 알킬기, 페닐기가 치환된 알킬, 페닐기가 치환된 알켄, 또는 페닐기가 치환된 알카인기일 수 있다. In the present invention, the positively charged amphipathic polymer may be a polyethyleneimine derivative polymer having an amphipathic bond by bonding a hydrophobic group to the terminal ends of the branched polyethyleneimine. The hydrophobic group may be an alkyl group having 5 to 20 carbon atoms, an alkenyl group, an alkaline group, a cyclic alkyl group, an alkyl substituted with a phenyl group, an alkene substituted with a phenyl group, or an alkane substituted with a phenyl group.
본 발명에 따른 상기 유도체 고분자에 있어서, 가지형 폴리에틸렌이민은 하기 화학식(2)로 표현될 수 있으며, 여기서 n은 반복단위이다. In the above-mentioned derivative polymer according to the present invention, the branched polyethyleneimine can be represented by the following formula (2), wherein n is a repeating unit.
상기 폴리에틸렌이민 유도체 고분자의 주쇄를 이루는 폴리에틸렌 이민의 분자량은 복합체 입자의 수화 크기, 입자당 포집되는 반도체 나노 입자의 수와, 세포 독성, 세포 내부로의 이동성 등에 영향을 미치게 된다. 상기 폴리에틸렌이민 유도체에 사용되는 폴리에틸렌이민의 중량 평균 분자량은 50,000~100,000, 바람직하게는 60,000~80,000, 보다 더 바람직하게는 65,000~75,000의 분자량을 가지며, 가장 바람직하게는 실질적으로 70,000의 분자량을 가진다. 상기 폴리에틸렌이민은 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다. 분자량이 커지게 되면, 반도체 나노입자를 둘러싸는 막의 두께가 두꺼워지면서 세포 내부로의 이동이 어려워질 수 있으며, 분자량이 적어지게 되면 단위 입자당 형광력이 낮아지게 되며, 독성이 강해지는 문제가 발생할 수 있다.The molecular weight of the polyethyleneimine constituting the main chain of the polyethyleneimine derivative polymer affects the hydration size of the composite particle, the number of semiconductor nanoparticles captured per particle, cytotoxicity, mobility into the cell, and the like. The polyethyleneimine used in the polyethyleneimine derivative has a weight average molecular weight of 50,000 to 100,000, preferably 60,000 to 80,000, more preferably 65,000 to 75,000, most preferably substantially 70,000. The above polyethyleneimine can be commercially purchased and used. When the molecular weight is increased, the thickness of the film surrounding the semiconductor nanoparticles may become thicker and the migration into the cell may become difficult. If the molecular weight is reduced, the fluorescence per unit particle is lowered and the toxicity is increased. .
본 발명에 따른 상기 유도체 고분자에 있어서, 가지형 폴리에틸렌이민 고분자의 가지 말단들은 적어도 일부가 하기 화학식(1)로 표현되는 소수성 그룹이며, In the derivative polymer according to the present invention, the branch terminals of the branched polyethyleneimine polymer are hydrophobic groups represented at least in part by the following chemical formula (1)
-NHCONH-R (1)-NHCONH-R (1)
여기서 상기 -R은 탄소수 5-20의 알킬기, 알켄기, 알카인기, 고리형 알킬기, 페닐기가 치환된 알킬, 페닐기가 치환된 알켄, 또는 페닐기가 치환된 알카인기인 고분자를 사용할 수 있다. Here, -R may be an alkane-substituted polymer in which the alkyl group having 5 to 20 carbon atoms, the alkenyl group, the alkaline group, the cyclic alkyl group, the alkyl substituted with the phenyl group, the alkenyl substituted with the phenyl group, or the phenyl group substituted.
상기 화학식(1)에서 -R은 탄소수는 반도체 나노입자와 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 사이의 분자간 인력이 높임으로서, 포획되는 반도체 나노입자의 포획 비율을 높이는 동시에 반도체 나노입자 표면을 효과적으로 보호하기 위해서, 탄소수 16-20으로 이루지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 탄소수 15-20의 직쇄 알킬기이며, 가장 바람직하게는 hexadecyl 그룹이 폴리에틸렌이민 고분자의 아민 그룹 중 약 50% 의 아민에 공유 결합된 형태이다. In the above formula (1), the number of carbon atoms in -R increases the intermolecular attractive force between the semiconductor nanoparticles and the amphipathic polyethyleneimine derivative polymeric transporter, thereby increasing the capture ratio of the captured semiconductor nanoparticles and effectively protecting the surfaces of the semiconductor nanoparticles More preferably a straight chain alkyl group having from 15 to 20 carbon atoms, and most preferably a hexadecyl group is covalently bonded to about 50% of the amine groups of the polyethyleneimine polymer .
본 발명의 실시에 있어서, 상기 화학식(1)의 말단은 가지형 폴리에틸렌이민의 가지말단기 -NH2를 하기 화학식(3)으로 반응시켜 제조될 수 있다 In the practice of the present invention, the terminal of the above-mentioned formula (1) can be produced by reacting the terminal terminal group -
R-NCO (3)R-NCO (3)
여기서, R은 탄소수 5-20의 알킬기, 알켄기, 알카인기, 고리형 알킬기, 페닐기가 치환된 알킬, 페닐기가 치환된 알켄, 또는 페닐기가 치환된 알카인기이며, 클로로포름과 같은 용매에서 반응이 이루어질 수 있다. Here, R is an alkyl group having 5 to 20 carbon atoms, an alkenyl group, an alkaline group, a cyclic alkyl group, an alkyl substituted with a phenyl group, an alkenyl substituted with a phenyl group, or an alkane substituted with a phenyl group and a reaction is performed in a solvent such as chloroform .
본 발명에 있어서, 상기 반도체 나노 입자는 반도체 나노입자의 크기가 전자-정공 짝의 보어 반경 (Bohr radius, 특정 원소 혹은 분자의 바닥 상태에서 전자-정공이 가장 높은 확률로 존재하는 거리) 과 비슷하거나 작아지면 양자구속효과(quantum confinement effect)의 범위에 드는 반도체 나노입자, 즉 양자점인 것으로 이해된다.In the present invention, the semiconductor nanoparticles may have a size such that the size of the semiconductor nanoparticles is similar to a Bohr radius of the electron-hole pairs (a distance at which the electron-holes are present at the highest probability in the bottom state of a specific element or molecule) It is understood that it is a semiconductor nanoparticle, that is, a quantum dot, which falls within the range of the quantum confinement effect.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 반도체 나노 입자들은 CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, InP, InAs, InSb, AlP, AlS, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, PbS, PbSe, Si, Ge, MgS, MgSe, MgTe에서 선택될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the semiconductor nanoparticles may be selected from the group consisting of CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, InP, InAs, InSb, AlP, AlS, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, PbS, PbSe, Si, Ge, MgS, MgSe, MgTe.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 반도체 나노 입자들은 뜨거운 배위용매 속에서 유기 금속을 열분해시켜 균일한 핵생성을 유도하고, 후에 Ostwald ripening과 어닐링 (annealing) 과정을 통해 평균 입자의 크기가 균일하고 규칙적인 내부구조를 갖는 양자점을 합성하는 비가수분해 합성법에 의해서 합성될 수 있다. In the practice of the present invention, the semiconductor nanoparticles thermally decompose the organometallic compound in a hot coordinating solvent to induce uniform nucleation, and then, through Ostwald ripening and annealing, the average particle size is uniform and regular Can be synthesized by a non-water-soluble synthesis method of synthesizing quantum dots having an internal structure.
본 발명에 있어서, 상기 반도체 나노 입자들은 리간드 치환에 의해서 형광 특성들이 저하되는 것을 방지하기 위해서, 합성과정의 소수성 리간드를 유지하는 비치환형 반도체 나노입자를 사용하는 것이 특히 바람직하다. In the present invention, it is particularly preferable to use unsupported semiconductor nanoparticles that maintain the hydrophobic ligand in the synthesis process in order to prevent the semiconductor nanoparticles from degrading their fluorescence properties by ligand substitution.
본 발명에 있어서, 소수성 리간드로는 이소시아네이트 화합물을 사용할 수 있으며, 예컨대 탄소수 5의 펜틸이소시아네이트에서부터 탄소수 16의 헥사데실이소시아네이트를 이소시아네이트, 바람직하게는 헥사데실이소시아네이트를 사용할 수 있다. In the present invention, as the hydrophobic ligand, an isocyanate compound may be used. For example, hexadecyl isocyanate of hexyl group having from 5 carbon atoms to hexyl group isocyanate, preferably hexadecyl isocyanate, may be used.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 특이적 나노 복합체는 다수의 나노입자가 포획되어 충분한 형광성을 발현할 수 있도록, 고분자 대 반도체 나노입자의 몰 당량비가 2:1~20:1, 바람직하게는 15:1~5:1, 가장 바람직하게는 10:1의 비를 이루는 것이 좋다.In the practice of the present invention, the specific nanocomposite has a molar equivalent ratio of polymer to semiconductor nanoparticles of 2: 1 to 20: 1, preferably 15: 1, in order that a plurality of nanoparticles can be captured and exhibit sufficient fluorescence. 1 to 5: 1, and most preferably 10: 1.
본 발명에 있어서, 히알루온산은 생체 조건에서 음전하를 띠고 있어 양전하를 띠는 양친성 고분자의 표면에 결합된다. 상기 히알루온산의 함량은 양친성 고분자와 결합하는 과정에서 특이적 전달용 나노 복합체의 전하가 음전하로 변환되거나, 이로 인해 입자 응집이 일어나는 것을 방지할 수 있도록, 양전하를 유지하는 범위에서 사용되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 히알루온산의 특이성을 나타내면서 입자의 안정성, 양전하 특성과 200 nm 미만의 입자크기를 유지할 수 있도록, 양친성 고분자-반도체 나노입자:히알루온산의 몰당량 비를 10:1 미만, 예컨대 10,000:1~50:1의 범위, 바람직하게는 1000:1~100:1의 범위로 유지하는 것이 바람직하다. 상기 히알루온산은 중량 평균 분자량이 100,000~5,000,000 의 범위이며, 바람직하게는 2,000,000 의 중량 평균 분자량을 가지는 히알루온산이다.In the present invention, hyaluronic acid binds to the surface of a positively charged amphiphilic polymer because it is negatively charged in vivo. The content of the hyaluronic acid is preferably within a range of maintaining a positive charge so as to prevent the charge of the specific transfer nanocomposite from being converted into a negative charge in the course of binding with the amphiphilic polymer and thereby preventing particle agglomeration. Do. More preferably, the mole ratio of the amphiphilic polymer-semiconductor nanoparticles: hyaluronic acid to the molar equivalent ratio of the hyaluronic acid is less than 10: 1, for example, 10,000 to maintain the stability of the particle, the positive charge property and the particle size of less than 200 nm while exhibiting specificity of hyaluronic acid. : 1 to 50: 1, preferably 1000: 1 to 100: 1. The hyaluronic acid is hyaluronic acid having a weight average molecular weight in the range of 100,000 to 5,000,000, preferably 2,000,000.
본 발명은 일 측면에서, 본 발명에 따른 특이적 전달용 나노 입자 복합체가 양전하를 띠는 양친매성 고분자 입자 내부에 소수성을 가지는 다수의 형광성 반도체 나노입자들이 캡슐화되어 있으며, 고분자의 입자 표면에 정전기적으로 결합되는 생체 조직에 특이적 물질이 결합된 것을 특징으로 한다. In one aspect, the present invention provides a specific transfer nanoparticle composite according to the present invention, wherein a plurality of fluorescent semiconductor nanoparticles having hydrophobicity are encapsulated in the positively charged amphipathic polymer particles, and electrostatic And a specific substance is bound to the living tissue.
본 발명은 일 측면에서, 본 발명에 따른 특이적 전달용 나노 복합체는 양전하를 띠는 양친매성 고분자 내부에 소수성 나노 입자들이 캡슐화되어 있으며, 표면에 히알루온산이 결합된 나노입자인 것을 특징으로 한다. In one aspect of the present invention, the specific delivery nanocomposite according to the present invention is characterized in that hydrophobic nanoparticles are encapsulated in a positively charged amphipathic polymer and hyaluronic acid is bound to the surface.
본 발명은 다른 일 측면에서, 본 발명에 따른 특이적 전달용 나노 복합체는 양전하를 띠는 양친매성 고분자 내부에 소수성 나노 입자들이 캡슐화되어 있으며, 표면에 히알루온산이 결합되고, 전달 물질을 포함하는 특이적 전달용 나노 복합체인 것을 특징으로 한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a specific transfer nanocomposite according to the present invention, wherein hydrophobic nanoparticles are encapsulated in a positively charged amphipathic polymer, hyaluronic acid is bonded to the surface thereof, And is a nanocomposite for transfer.
상기 전달 물질은 나노 복합체의 내부에 내포될 수 있는 소수성 물질, 예컨대 소수성 약물 또는 염료일 수 있다. 또한, 상기 전달물질은 나노 복합체의 외부에 정전기적으로 결합할 수 있는 이온성 물질, 예컨대 유전적 표지체나 DNA의 상보적 서열 등일 수 있다.The transmissive material may be a hydrophobic material, such as a hydrophobic drug or dye, which may be contained within the nanocomposite. In addition, the transfer material may be an ionic material capable of electrostatically bonding to the outside of the nanocomposite, such as a complementary sequence of a genetic marker or DNA.
본 발명은 일 측면에서, 양전하를 띠는 양친매성 고분자 내부에 소수성 나노 입자들이 캡슐화되어 있으며, 표면에 히알루온산이 결합된 특이적 전달용 나노 복합체에 소수성 물질 또는 음이온성 물질을 결합하여 히알루온산에 특이적인 생체 조직에 전달하는 것을 특징으로 한다. In one aspect of the present invention, hydrophobic nanoparticles are encapsulated within a positively charged amphipathic polymer, and a hydrophobic or anionic material is bound to a specific transferring nanocomposite having hyaluronic acid bound to its surface, And transmits it to a specific biotissue.
본 발명에 따라 히알루온산 특이성을 가지는 생체 조직에 특이적으로 전달될 수 있는 새로운 나노 입자 복합체가 제공되었다. The present invention provides new nanoparticle complexes that can be specifically delivered to living tissue having hyaluronic acid specificity.
본 발명에 따른 특이적 전달용 나노 입자 복합체는 입자 외부에 히알루온산이 결합되고 입자 내부에 소수성 부분이 있어, 생체 내 환경에 민감한 소수성의 피전달 물질을, 히알루온산에 특이적인 생체 조직으로 안전하게 전달할 수 있다. 또한, 생체 조직으로 전달된 후에도 복합체 내부의 나노입자 집단이 높은 형광 특성을 나타낸다. The specific transfer nanoparticle complex according to the present invention has hyaluronic acid bound to the outside of the particle and a hydrophobic part in the inside of the particle to safely transfer the hydrophobic substance to be transferred sensitive to the environment in the living body to hyaluronic acid- . Also, even after delivery to living tissue, the population of nanoparticles within the complex exhibit high fluorescence properties.
도 1은 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자의 합성 모식도이다.
도 2는 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 복합체의 합성 모식도이다.
도 3은 폴리에틸렌이민 고분자로 표면치환된 반도체 나노입자 합성 모식도이다.
도 4는 양전하 표면 안정화 분자체(Hexadecyltrimethylammonium bromide)로 포획된 반도체 나노입자 합성 모식도이다.
도 5는 양전하 표면 안정화 분자체로 표면치환된 반도체 나노입자 합성 모식도이다.
도 6은 양전하 리피드(Lipofectamine)로 포획된 반도체 나노입자 합성 모식도이다.
도 7은 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 투과전자 현미경 사진이다. (a-scale bar: 100 nm, b-scale bar: 50 nm)
도 8은 친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 포획되기 전(검은색) 과 후(적색)의 반도체 나노입자 형광 스펙트럼 그래프이다.
도 9는 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 (a) 수화 크기 및 (b) 표면 전하를 나타낸 그래프이다.
도 10은 서로 다른 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 복합체 (적색: 서로 다른 알킬기 길이에 따라 C5: pentyl-, C8: octyl-, C16: hexdecyisocyanate 로 치환된 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 사용, 파란색: 서로 다른 분자량 (25K: 25000, 70K: 70000, 750K: 750000)을 가진 고분자 전달체), 폴리에틸렌으로 표면 치환된 반도체 나노입자 (초록색, 서로 다른 분자량의 폴리에틸렌이민 (25K: 25000, 70K: 70000, 750K: 750000)으로 표면 치환), 양전하 표면 안정화 분자체로 포획된 반도체 나노입자 (CTAB-QDs, 분홍색), 양전하 리피드로 포획된 반도체 나노입자 (Lipo-QDs, 분홍색), 양전하 표면 안정화 분자체로 표면치환된 반도체 나노입자 ((+)-QDs, 주황색) 의 (a) 형광 수율, (b) 형광 표지된 세포 비율 (c) 세포당 평균 형광 신호 세기이다.
도 11은 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 (서로 다른 분자량을 가진 (25K, 70K, 750K)) 복합체 및 대조군 반도체 나노입자 샘플 (양전하 표면 안정화 분자체로 포획된 반도체 나노입자(CTAB-QDs), 양전하 리피드로 포획된 반도체 나노입자(Lipo-QDs), 양전하 표면 안정화 분자체로 표면치환된 반도체 나노입자 ((+)-QDs) 의 처리 시간별 세포 독성을 도시한 그래프이다.
도 12는 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 복합체로 표지된 HeLa 세포의 공초점 현미경 사진. 초록색으로 반도체 나노입자의 형광을 나타내었고 z축을 따라 광학적 섹션을 하였음.(Scale bar: 20 m)
도 13은 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체-반도체 나노입자가 내입된 암세포의 단면 투과 전자 현미경 사진이다.(왼쪽 그림 scale bar: 200 nm , 오른쪽 그림 scale bar: 100 nm)
도 14는 반도체 나노입자, 히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체의 합성 모식도이다.
도 15는 반도체 나노입자와 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체 대비 히알루론산의 비율에 따른 히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체의 (a) 수화 크기 및 (b) 표면 전하를 나타낸 그래프이다.
도 16은 (a) 히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체 혹은 (b) 반도체 나노입자와 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체를 이용한 HeLa 혹은 Hdf (HeLa: CD44 양성그룹, Hdf: CD44 음성그룹 세포) 세포의 세포 특이적 표지 능력을 검증한 형광 현미경 사진 (scale bar: 50 m).BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing the synthesis of an amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer. FIG.
Fig. 2 is a schematic diagram showing the synthesis of a semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative complex.
FIG. 3 is a schematic diagram of synthesis of semiconductor nanoparticles surface-substituted with a polyethyleneimine polymer.
4 is a schematic diagram of synthesis of semiconductor nanoparticles entrapped with a positive charge surface stabilizing molecular sieve (Hexadecyltrimethylammonium bromide).
Fig. 5 is a schematic diagram of synthesis of semiconductor nanoparticles surface-substituted with positively charged surface stabilizing molecular sieve.
6 is a schematic diagram of synthesis of semiconductor nanoparticles entrapped with a positive charge lipid (Lipofectamine).
7 is a transmission electron micrograph of a semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer composite. (a-scale bar: 100 nm, b-scale bar: 50 nm)
FIG. 8 is a fluorescence spectral graph of semiconductor nanoparticles before (black) and after (red) before being captured with a hydrophilic polyethylenimine derivative polymer.
9 is a graph showing (a) the hydration size and (b) surface charge of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer composite.
FIG. 10 is a graph showing the results of a comparison between different semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymeric carrier complexes (red: amphiphilic polyethyleneimine derivatives substituted with C 5 : pentyl-, C 8 : octyl-, and C 16 : hexdecyisocyanate depending on the length of different alkyl groups Polymeric carrier with different molecular weight (25K: 25000, 70K: 70000, 750K: 750000), semiconductor nanoparticles substituted with polyethylene (green, polyethyleneimine of different molecular weight (25K: 25000, (CTAB-QDs, pink), semiconductor nanoparticles (Lipo-QDs, pink) captured with positive charge lipid, positive charge surface (A) fluorescence yield, (b) fluorescence labeled cell ratio (c) average fluorescence signal intensity per cell, and (c) the fluorescence yield of the semiconductor nanoparticles surface-substituted with stabilized molecular sieve ((+) - QDs, orange).
11 is a graph showing the results of a comparison between a semiconductor nanoparticle-amphiphilic polyethylenimine derivative polymeric carrier (25K, 70K, 750K) with different molecular weights and a control semiconductor nanoparticle sample (CTAB- QDs), semiconductor nanoparticles (Lipo-QDs) captured with a positive charge lipid, and semiconductor nanoparticles (+) -QDs surface-substituted with a positive charge surface stabilization molecular sieve.
12 is a confocal microscope photograph of HeLa cells labeled with a semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymeric carrier complex. Green showed fluorescence of semiconductor nanoparticles and optical section along the z axis (Scale bar: 20 m).
FIG. 13 is a cross-sectional transmission electron micrograph of cancer cells into which amphiphilic polyethyleneimine derivative polymeric transporter-semiconductor nanoparticles have been introgressed (left scale bar: 200 nm, right scale bar: 100 nm)
FIG. 14 is a synthesis schematic diagram of a composite comprising a semiconductor nanoparticle, hyaluronic acid, and a polyethylenimine derivative polymer having amphipathic nature.
FIG. 15 is a graph showing the relationship between (a) the hydration size and (b) the surface area of a complex composed of hyaluronic acid and amphipathic polyethyleneimine derivative polymer according to the ratio of hyaluronic acid to the composite of semiconductor nanoparticles and amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer. Fig.
Fig. 16 is a graph showing the results of the measurement of the activity of the HeLa or Hdf (HeLa: CD44 positive group) using a complex composed of (a) hyaluronic acid, a complex composed of a polyethyleneimine derivative polymer having amphipathic nature, or (b) a mixture of semiconductor nanoparticles and amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer , And Hdf: CD44 negative group cells). The fluorescence microscope photograph (scale bar: 50 m) was used to verify the cell-specific labeling ability of the cells.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 발명을 예시하기 위한 것이며, 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 유의하여야 한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. It should be noted that the following examples are intended to illustrate the invention and not to limit the invention.
실시예 1 Example 1
양친매성Amphipathic 폴리에틸렌이민 유도체 고분자의 합성 Synthesis of Polyethyleneimine Derivative Polymers
0.1 mM polyethyleneimine (평균 분자량: 70,000) 용액의 물을 70 ℃로 가열 및 진공상태에 두어 제거하고 1 mL 무수 클로로포름(anhydrous chloroform)에 녹인 후 816 당량의 헥사데실이소시아네이트(hexadecylisocyanate)를 첨가하여 1 시간 동안 격렬하게 교반하여 제조하였다(도 1). 아래 실시 예들에서 보인 대표적인 실험군 샘플(반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 복합체)은 모두 실시예 1에서 합성한 양친매성 고분자 전달체를 이용하여 합성하였다.Water in 0.1 mM polyethyleneimine (average molecular weight: 70,000) solution was heated to 70 ° C and removed under vacuum to dissolve in 1 mL of anhydrous chloroform. 816 equivalents of hexadecylisocyanate was added to the solution for 1 hour And stirred vigorously (FIG. 1). Representative experimental group samples (semiconductor nanoparticle-amphiphilic polyethyleneimine derivative polymeric carrier complex) shown in the following examples were all synthesized using the amphiphilic polymeric carrier synthesized in Example 1.
반도체 나노 입자의 합성Synthesis of semiconductor nanoparticles
본 명세서에서 밝히는 나노 입자의 합성방법은 다양한 합성 방법 중 하나의 대표적인 예시를 드는 것일 뿐 이에 제한되지는 않는다. 나노 입자 중 하나인 양자점을 합성하기 위해 다음과 같이 준비한다. Octadecene, oleylamine을 둥근 바닥 플라스크에 넣고 100 ℃로 가열하면서 진공 상태, 질소 주입상태를 번갈아 바꾸어 주어 결국 주변 환경을 질소 기체로만 가득 채운 환경으로 바꾸어 준다. 이후 둥근 바닥 플라스크의 온도를 300℃까지 올리고, 각각 카드뮴(Cd)과 황(S)을 따로 녹인 Octadecene 용액을 Cd:S = 1:5 의 비율로 동시에 고온의 플라스크에 넣어 준다. 이 때, Cd 대 S 의 비율은 원하는 나노 입자의 크기에 따라 조절될 수 있다. 이후 반응 용기인 플라스크를 천천히 식혀 유기 용매에 분산된 나노 입자를 얻는다.The method of synthesizing the nanoparticles disclosed in the present specification is not limited to the typical example of one of various synthetic methods. To synthesize the quantum dot, one of the nanoparticles, prepare as follows. Octadecene and oleylamine are placed in a round bottom flask and heated at 100 ° C to alternate between vacuum and nitrogen injection, eventually turning the environment into an environment full of nitrogen gas. Thereafter, the temperature of the round bottom flask is raised to 300 ° C., and the Octadecene solution, in which cadmium (Cd) and sulfur (S) are separately dissolved, is simultaneously introduced into the high temperature flask at a ratio of Cd: S = 1: 5. At this time, the ratio of Cd to S can be adjusted according to the size of the desired nanoparticles. Then, the flask, which is a reaction container, is slowly cooled to obtain nanoparticles dispersed in an organic solvent.
반도체 나노입자와 Semiconductor nanoparticles 양친매성을Amphibious 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체의 합성 Synthesis of Polyethyleneimine Derivative Polymer Complex
유기 용매에서 합성한 1 nmol 반도체 나노입자를 헥산(hexane)에 분산시킨 후 메탄올을 추가하여 과량의 소수성 리간드 및 합성 전구체를 제거하였다. 위의 과정으로 정제된 반도체 나노입자를 1 mL 클로로포름에 재분산시킨 후, 이 용액에 합성된 양친매성 고분자 전달체를 나노입자의 10 몰당량만큼 넣어 분산시켰다. 이후, 0.1M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer (pH 6.3) 10 mL를 나노입자와 양친매성 고분자 전달체가 같이 분산된 클로로포름 용액에 넣어 주었다. 상분리 되어 존재하는 물/클로로포름 혼합 용액을 1분 동안 소니케이션 및 1시간 동안 격렬히 교반하여 충분히 섞이도록 하였다. 잉여의 클로로포름을 제거하기 위해, 진공 상태에서 50℃로 맞추어 약 30분간 격렬히 교반하였다. 4℃, 14,000 rpm 조건에서 원심분리 하여 위층 용액을 따라 내고, 아래 침출된 부분을 증류수를 넣어 재분산 시켜서 실험에 사용하였다. 도 2에서와 같이 1개의 고분자 전달체 내부에 수십개의 소수성 표면을 가진 반도체 나노입자가 포획된 복합체가 형성되었다. 1 nmol semiconductor nanoparticles synthesized in organic solvent were dispersed in hexane and methanol was added to remove excess hydrophobic ligand and synthesis precursor. The purified semiconductor nanoparticles were redispersed in 1 mL of chloroform, and the amphipathic polymeric carrier synthesized in this solution was dispersed by adding 10 molar equivalents of the nanoparticles. Then, 10 mL of 0.1 M 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer (pH 6.3) was added to the chloroform solution in which the nanoparticles and the amphiphilic polymer carrier were dispersed. The water / chloroform mixture solution, which had been phase separated, was thoroughly stirred by sonication for 1 minute and vigorous stirring for 1 hour. To remove excess chloroform, the mixture was vigorously stirred for about 30 minutes at 50 캜 in a vacuum state. The solution was centrifuged at 4 ° C and 14,000 rpm to remove the upper layer solution, and the lower leached portion was re-dispersed by adding distilled water. As shown in FIG. 2, a composite in which semiconductor nanoparticles having dozens of hydrophobic surfaces are trapped within one polymer carrier was formed.
반도체 나노입자-Semiconductor nanoparticles - 양친매성Amphipathic 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 구조적 및 광학적 특성확인 Identification of Structural and Optical Properties of Polyethyleneimine Derivative Polymer Complex
내입된 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체는 도 7의 전자 투과 현미경에서 확인할 수 있듯이 직경이 100 nm 정도의 전달체 내부에 나노입자가 수십개 이상 내입되어 존재하였다. 복합체 내부에 내입된 반도체 나노입자의 표면을 그대로 유지하면서 복합체 내부로 전달되므로 반도체 나노입자가 본래 가진 소수성의 표면 안정화 분자체를 제거하거나 치환하지 않고 고분자 복합체 내부에 나노입자가 도입되었다. 이는 반도체 나노입자의 표면 성질에 의해 가장 민감하게 반응하는 형광 특성을 그대로 유지하기에 매우 유리하며, 도 8에서 도시된 바와 같이, 실제로 내입된 후의 양자 효율은 내입전과 비교해 90% 이상의 양자 효율을 유지하며 파장에 따른 형광 특성차이도 관측되지 않았다. 동시에 도 9에서 도시된 바와 같이, 표면 전하는 60 mV 정도로 양전하를 띄고 수화크기는 이보다 약간 큰 105 nm 정도를 가졌다.As shown in the electron-transmission microscope of FIG. 7, the intercalated semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer composite was present in the carrier having a diameter of about 100 nm with several tens of nanoparticles intercalated therein. Since the surface of the semiconductor nanoparticles intruded into the complex is transferred to the interior of the composite, nanoparticles are introduced into the polymer composite without removing or replacing the hydrophobic surface stabilized molecular sieve originally possessed by the semiconductor nanoparticles. As shown in FIG. 8, the quantum efficiency after the intrinsic inactivation is maintained at 90% or more of the quantum efficiency as compared with that before the intrathoracic injection, as shown in FIG. 8, which is very advantageous to maintain the fluorescence characteristic most sensitive to the surface properties of the semiconductor nanoparticles. And no difference in fluorescence characteristics with respect to wavelength was observed. At the same time, as shown in FIG. 9, the surface charge was positively charged at about 60 mV, and the hydration size was about 105 nm which was slightly larger than this.
반도체 나노입자, 히알루론산, Semiconductor nanoparticles, hyaluronic acid, 양친매성을Amphibious 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체의 합성 Synthesis of Polyethyleneimine Derivative Polymer Complex
양친매성 고분자 전달체로 포획된 반도체 나노입자 10 pmol 을 MES buffer (0.1M, pH 6.5) 1mL에 분산시켰다. 이후, 위 용액에 0.1 pmol 의 소듐 히알루로네이트 수용액을 섞어주어 5분간 상온에 두어 정전기적 인력을 통해 양친매성 고분자 전달체 표면에 히알루론산을 도입하고, 도 14에서와 같이, 히알루론산이 표면 개질된 양친매성 고분자 전달체로 포획된 반도체 나노입자 복합체를 형성하였다. 이후 히알루론산에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 CD44 세포 단백질이 과발현된 세포 (HeLa cell, human cervical cancer cell line) 대조군 세포 (Hdf, human dermal fibroblast cell line) 에 앞서 형성된 복합체 용액을 4시간 동안 처리한 후, 과량의 복합체를 충분한 양의 PBS buffer (0.1M, pH 7.4) 로 씻어내 주었다. 앞서 세척한 세포를 고정한 후 슬라이드 글라스에 부착 및 고정하여 세포 특이적인 형광신호 및 세포 모양을 형광 현미경을 통해 확인하였다. 10 pmol of the semiconductor nanoparticles trapped with the amphipathic polymer transporter was dispersed in 1 mL of MES buffer (0.1 M, pH 6.5). Thereafter, 0.1 pmol of sodium hyaluronate aqueous solution was added to the above solution, and the mixture was placed at room temperature for 5 minutes to introduce hyaluronic acid into the surface of the amphipathic polymer transporter through electrostatic attraction. As shown in FIG. 14, hyaluronic acid was surface- To form a semiconductor nanoparticle complex entrapped with an amphipathic polymeric carrier. Then, the complex solution formed before the CD44 cell protein (HeLa cell, human cervical cancer cell line) control cells (Hdf, human dermal fibroblast cell line) known to specifically bind to hyaluronic acid was treated for 4 hours Afterwards, the excess complex was washed with a sufficient amount of PBS buffer (0.1M, pH 7.4). After washing the previously washed cells, they were attached and fixed on a slide glass, and cell specific fluorescence signals and cell shapes were confirmed by fluorescence microscopy.
반도체 나노입자, 히알루론산, Semiconductor nanoparticles, hyaluronic acid, 양친매성을Amphibious 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체의 수화 크기 및 표면 전하 최적화 Size and Surface Charge Optimization of Polyethyleneimine Derivative Polymer Complexes
응집체 형성을 억제하는 동시에 히알루론산 작용기와 전체적인 고분자 전달체의 표면은 양전하 표면을 가지도록 하여 세포 내입이 최대화 될 수 있는 조건을 찾기 위해, 양친매성 고분자 전달체의 표면에 음전하를 띈 히알루론산을 도입, 정전기적 인력을 통해 결합시킴으로써 반도체 나노입자, 히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체의 수화 크기 및 표면 전하의 변화를 관측하였다. 양친매성 고분자 전달체 대비 히알루론산의 비율을 증가함에 따라 수화크기 및 표면 전하를 측정하여 도 15에서와 같이 비교하였다. 수화크기는 110 nm 근처에서 크게 변화하지 않다가 반도체 나노입자-양친매성 고분자 전달체 복합체:히알루론산의 비율이 몰당량 비가 10:1 이 되는 지점부터 그 크기가 매우 크게 증가하였으며, 히알루온산은 중량평균 분자량이 2,000,000 이었으며, 동시에 표면 전하가 0에 가깝게 감소하고 표면전하의 역전이 일어남을 확인하였다. 이는 양친매성 고분자 전달체 표면의 양전하가 음전하인 히알루론산이 도입됨에 따라 표면 전위의 역전이 일어나기 때문이며, 표면 전하가 0에 가까워짐에 따라 물에서의 분산 특성이 낮아져 응집체를 형성하게 되기 때문이다. The hyaluronic acid functional group and the entire surface of the polymeric carrier have a positively charged surface to introduce hyaluronic acid having a negative charge on the surface of the amphipathic polymer transporter in order to find a condition for maximizing intracellular penetration, The changes in the hydration size and surface charge of the complex composed of semiconductor nanoparticles, hyaluronic acid, and amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer were observed by bonding through a miraculous attraction force. The hydration size and surface charge were measured by increasing the ratio of hyaluronic acid to amphipathic polymeric transporter and compared as shown in FIG. The hydration size did not change much in the vicinity of 110 nm, but the size of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polymer conjugate complex: hyaluronic acid increased from the point where the molar equivalent ratio became 10: 1. The hyaluronic acid had a weight average It was confirmed that the molecular weight was 2,000,000, the surface charge decreased to nearly 0, and the surface charge reversed. This is because the reversal of the surface potential occurs due to the introduction of hyaluronic acid in which the positive charge on the surface of the amphipathic polymer transporter is negatively charged, and the dispersion characteristic in water is lowered as the surface charge approaches zero, thereby forming an aggregate.
반도체 나노입자, 히알루론산, Semiconductor nanoparticles, hyaluronic acid, 양친매성을Amphibious 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체를 이용한 히알루론산 특이적 결합 표면 단백질 (CD44) 과발현 세포의 특이적 표지 능력 비교 분석 Comparison of specific labeling ability of hyaluronic acid-specific binding surface protein (CD44) -expressing cells using a complex of polyethyleneimine derivative polymers
도 16에서 도시된 바와 같이, CD44 라는 히알루론산 특이적 결합 능력을 가진 세포막 단백질이 과발현된 HeLa (human cervical cancer cell line) 세포, 과발현되지 않는 세포주 중 하나인 Hdf (human dermal fibroblast cell line) 세포를 각각 실험군 및 대조군으로 삼아 히알루론산 표면 개질된 반도체 나노입자-양친매성 고분자 세포 특이적인 결합능력을 확인하였다. As shown in FIG. 16, human laryngeal cancer cell line (HeLa) cells overexpressing a cell membrane protein having hyaluronic acid-specific binding ability called CD44 and human dermal fibroblast cell line (Hdf) cells, which are not over- Each of the experimental group and the control group was confirmed to have hyaluronic acid surface modified semiconductor nanoparticle-amphipathic polymer cell-specific binding ability.
실제 세포에 특이적 결합능력을 확인하기 위해, 나노 복합체는 응집체를 형성하지 않는 동시에 약하게 양전하 표면을 가진, 반도체 나노입자-양친매성 고분자 전달체 복합체 대비 히알루론산의 몰당량 비율이 100:1인 반도체 나노입자, 히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체를 사용하였다. 히알루온산은 중량평균 분자량이 2,000,000 이었다.In order to confirm the specific binding ability to actual cells, the nanocomposite is a semiconductor nanomaterial having a molar equivalent ratio of hyaluronic acid to a semiconductor nanoparticle-amphipathic polymeric carrier complex having a weakly positively charged surface while not forming aggregates, Particles, hyaluronic acid, and a polyethyleneimine derivative polymer having amphiphilic properties. The hyaluronic acid had a weight average molecular weight of 2,000,000.
히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체 샘플의 대조군으로 히알루론산이 표면 개질 되지 않는 반도체 나노입자와 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체의 세포 표지 능력또한 동시에 확인하였다. The cell labeling ability of the complex consisting of the semiconductor nanoparticles not surface-modified with hyaluronic acid and the polyethyleneimine derivative polymer having amphipathic nature was also confirmed as a control sample of a composite sample composed of hyaluronic acid and amphipathic polyethyleneimine derivative polymer.
10 nM 의 히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체, 혹은 반도체 나노입자와 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체를 각각 실험군 및 대조군 세포 (양성 그룹: HeLa, 음성 그룹: Hdf) 에 처리하여 전달된 반도체 나노입자로부터 발광되는 형광 신호를 비교 분석하였다. 히알루론산, 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체 샘플을 처리한 HeLa 및 Hdf 세포의 경우, 히알루론산에 의한 특이적 표지를 통해 CD44 가 과발현된 HeLa cell 에 특이적으로 높은 형광 신호가 보임을 확인할 수 있었다. 특이적 신호 대비 잡음 비율은 약 100 이상이 됨을 전달된 반도체 나노입자의 형광신호를 정량하여 알 수 있다. The complex consisting of 10 nM of hyaluronic acid, the amphipathic polyethyleneimine derivative polymer, or the composite of semiconductor nanoparticles and amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer was used as test and control cells (positive group: HeLa, negative group: Hdf ), And compared the fluorescence signals emitted from the semiconductor nanoparticles. In the case of HeLa and Hdf cells treated with a complex sample composed of hyaluronic acid and amphipathic polyethyleneimine derivative polymer, specifically high fluorescence signals were seen in HeLa cells overexpressing CD44 through specific labeling with hyaluronic acid I could confirm. The specific signal-to-noise ratio is about 100 or more, which is determined by quantifying the fluorescence signal of the transferred semiconductor nanoparticles.
반면, 반도체 나노입자와 양친매성을 가지는 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 이루어진 복합체 샘플을 두 가지 서로 다른 세포군에 처리한 경우 거의 비슷한 세포 표지 능력을 보임을 확인하였다. On the other hand, it was confirmed that when the complex sample composed of the semiconductor nanoparticles and the amphipathic polyethylene imine derivative polymer was treated in two different cell groups, the cells showed almost similar cell labeling ability.
이들 결과를 종합해 보면, 양전하를 띄는 반도체 나노입자-양친매성 고분자 복합체 표면에 음전하를 가진 히알루론산 고분자 분자를 도입하는 경우, 반도체 나노입자-양친매성 고분자 복합체 전체의 구조를 깨트리지 않는 동시에 기존 복합체가 가지고 있지 않던 세포 특이적 표지 능력을 가짐을 확인하였다. These results indicate that when a hyaluronic acid polymer molecule having a negative charge is introduced onto the positively charged semiconductor nanoparticle-amphipathic polymer composite surface, the structure of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polymer composite is not broken, Specific labeling ability that was not possessed by the cells.
다시 말해, 양친매성 고분자 전달체가 세포 내부로 전달시, 소수성 부분에 포획된 반도체 나노입자 뿐만아니라 친수성 부분에 결합된 히알루론산의 특이적 표적능력을 잃지 않아 특이적 표지 신호 대비 잡음 비율을 극대화할 수 있음을 확인하였다.In other words, when the amphipathic polymer transporter is transferred into the cell, the specific targeting ability of the hyaluronic acid bound to the hydrophilic part as well as the semiconductor nanoparticles captured in the hydrophobic part is not lost, thereby maximizing the noise ratio relative to the specific label signal Respectively.
형광 수율의 상대적 세기 비교, Comparison of relative intensity of fluorescence yield, 유세포Flow cell 분석법을 통한 반도체 나노입자- Semiconductor nanoparticles through analytical methods - 양친Parent 매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 세포 Cells of macromolecular polyethyleneimine derivative polymer complex 내입효과Internal effect 및 세포독성 분석 And cytotoxicity analysis
도 10 및 도 11에서 서로 다른 조건으로 합성된 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체와 반도체 나노입자의 복합체의 형광 수율, 세포 내입 효과, 세포 독성을 분석하였다. 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체를 합성할 당시 사용한 탄화수소 (알킬기)의 길이를 조절한 경우 (탄화수소의 탄소개수 5, 8, 16개) 탄화수소의 길이가 길어져 반도체 나노입자가 본래 가진 소수성 리간드의 길이와 비슷해질수록 더 높은 형광 신호를 보임을 확인할 수 있었다.(도 10a). 이는 탄화수소 길이가 길어짐에 따라, 반도체 나노입자가 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 사이의 분자간 인력이 극대화되어 고분자 전달체의 소수성 부분에 포획되는 반도체 나노입자의 포획 비율을 높이는 동시에 반도체 나노입자 표면을 효과적으로 보호해주기 때문인 것으로 추정된다. The fluorescence yield, intracellular effect, and cytotoxicity of the complex of amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer carrier and semiconductor nanoparticles synthesized under different conditions in FIGS. 10 and 11 were analyzed. Amphiphilic polyethylene imine derivative When the length of the hydrocarbon (alkyl group) used at the time of synthesizing the polymer carrier was adjusted (the number of carbon atoms of the hydrocarbon was 5, 8, 16), the length of the hydrocarbon became longer, and the length of the hydrophobic ligand It was confirmed that the higher the fluorescence signal is, the more similar it is (Fig. 10A). As the hydrocarbon length becomes longer, the intermolecular attraction between the semiconductor nanoparticles and the amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer carrier is maximized, thereby increasing the capture ratio of the semiconductor nanoparticles captured in the hydrophobic portion of the polymer carrier and effectively protecting the surface of the semiconductor nanoparticle .
이와 비슷하게, 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자를 구성하는 폴리에틸렌이민 고분자의 분자량을 크게함에 따라 (25K, 70K, 혹은 750K), 전달체 내부에 도입된 반도체 나노입자의 형광 신호는 증가하는 양상을 보였다. 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자의 분자량이 증가되면 하나의 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체를 구성하는 고분자 전달체의 수가 줄어들게 될 것이므로 결과적으로 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 껍질이 더욱 단단하게 유지되게 된다. 이에 따라, 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 표면은 분자량이 증가할수록 더욱 높은 표면 안정성을 가지게 될 것이므로 형광 신호의 상대적인 세기가 증가할 것으로 생각할 수 있다. Similarly, the fluorescence signals of semiconductor nanoparticles introduced into the carrier increased with increasing molecular weight of the polyethyleneimine polymer (25K, 70K, or 750K) constituting the amphipathic polyethyleneimine derivative polymer. As the molecular weight of the amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer increases, the number of polymer carriers constituting one semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer complex will be reduced. As a result, the shell of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer composite So that it is maintained more firmly. Accordingly, the surface of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer composite will have a higher surface stability as the molecular weight increases, so that the relative intensity of the fluorescence signal may be increased.
또한, 알킬기를 추가 도입하지 않은 폴리에틸렌이민으로 표면 치환된 반도체 나노입자(비교실시예 1), 양친매성 분자체인 CTAB 으로 포획된 반도체 나노입자(비교 실시예 2), Lipofectamine으로 포획된 반도체 나노입자(비교 실시예 3), 양전하 표면을 띄도록 아민그룹을 가진 친수성 리간드로 치환된 반도체 나노입자(비교 실시예 4)와 비교하였다. 폴리에틸렌이민으로 표면 치환되거나 친수성 리간드로 치환된 반도체 나노입자 등은 표면을 외부 표면 안정화 물질로 치환시 필연적으로 무기층 표면이 추가로 산화되거나 식각될 수 있으므로 낮은 형광 특성을 가질 것으로 예상되며, 또한 치환 과정이 없이 CTAB, Lipofectamine 과 같은 단분자로 반도체 나노입자를 포획하는 경우 반도체 나노입자 표면이 충분히 보호되지 않아 물층으로 옮긴 경우 이들 나노입자의 표면이 외부의 산소나 이온등에 의해 형광 특성이 낮아질 가능성이 높다. 이들은 모두 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체에 비해 25% 미만의 낮은 형광 신호를 가짐을 확인하였다. 비교 실시예 입자의 제조 방법은 아래 후술하였다.In addition, semiconductor nanoparticles (Comparative Example 1) surface-substituted with polyethyleneimine without addition of an alkyl group (Comparative Example 1), semiconductor nanoparticles captured with an amphipathic molecule chain CTAB (Comparative Example 2), semiconductor nanoparticles captured with Lipofectamine Comparative Example 3), and semiconductor nanoparticles substituted with a hydrophilic ligand having an amine group so as to have a positively charged surface (Comparative Example 4). Semiconductor nanoparticles surface-substituted with polyethyleneimine or substituted with a hydrophilic ligand are expected to have low fluorescence properties because the surface of the inorganic layer can inevitably be oxidized or etched when the surface is replaced with an external surface stabilizing material, In the case of capturing semiconductor nanoparticles with single molecules such as CTAB and Lipofectamine without process, the surface of semiconductor nanoparticles is not sufficiently protected. If they are transferred to a water layer, there is a possibility that the surface of these nanoparticles may be lowered in fluorescence due to external oxygen or ions high. All of these have a fluorescence signal of less than 25% lower than that of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer complex. COMPARATIVE EXAMPLES The preparation method of the particles was described below.
세포 내입효과를 분석하기위해 유세포분석법 (flow cytometry) 와 공초점현미경 (confocal microscope)을 이용하여 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체로 포획된 반도체 나노입자의 세포 내입정도를 분석하였다.(도 10b 및 10c). portion of labeled cell은 전체 세포 중 반도체 나노입자로 표지되어 형광 특성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 것으로, CTAB으로 포획된 반도체 나노입자의 경우를 제외하고 대부분의 경우 100%에 가까운 효율적인 세포 표지 능력을 보여주고 있다. 또한, 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 분자체를 구성하는 알킬기의 길이가 늘어남에 따라 세포 표지의 효율성이 높아지는데, 이로써 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체의 소수성이 높아질수록 더 높은 세포 표지 능력을 가지게 됨을 알 수 있다. 또한 세포당 형광 신호의 세기를 확인한 mean PL intensity의 경우, 분자량 70,000의 폴리에틸렌이민으로 구성된 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 경우 가장 높은 형광 신호 값을 보임을 확인하였다. 분자량이 이보다 낮은 경우에는 고분자 전달체 내에 도입된 반도체 나노입자의 수가 상대적으로 적은 반면, 분자량이 이보다 높은 경우에는 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체의 표면이 너무 단단하게 구성되어 효과적인 세포내로의 반도체 나노입자 전달이 어려워지는 것으로 생각된다. 폴리에틸렌이민의 알킬기 길이를 더 짧게 조절한 경우, 세포당 형광신호의 세기가 최적화된 고분자-반도체 나노입자의 경우에 비해 10배 이상 낮은 결과를 보이게 된다. 이는 알킬기를 더 짧게한 대조군 반도체 나노입자-고분자 복합체의 형광신호가 낮은 동시에 세포 표지 능력이 낮아져 있기 때문으로 생각된다. 알킬기를 추가 도입하지 않은 폴리에틸렌이민으로 표면 치환된 반도체 나노입자, 양친매성 분자체인 CTAB 으로 포획된 반도체 나노입자, Lipofectamine으로 포획된 반도체 나노입자, 양전하 표면을 띄도록 아민그룹을 가진 친수성 리간드로 치환된 반도체 나노입자의 경우 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자- 반도체 나노입자에 비해 최대 10배 이상의 낮은 세포 내입 효율을 확인하였다. 이들은 모두 단일 반도체 나노입자 각각을 세포내부로 도입하게 되는 동시에, 샘플 자체의 형광 효율이 낮음으로 위와 같은 세포 내입 효과 차이를 보이는 것으로 생각된다. In order to analyze the intracellular effect, intracellular penetration of the semiconductor nanoparticles captured by the amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer carrier using flow cytometry and a confocal microscope was analyzed (FIGS. 10B and 10C ). The portion of labeled cells represents the percentage of cells that are labeled with semiconductor nanoparticles in the whole cell and exhibit fluorescence characteristics. In most cases, the efficiency of cell labeling is close to 100% except for the case of semiconducting nanoparticles captured by CTAB Giving. In addition, the amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer molecule has higher cell labeling efficiency as the length of the alkyl molecule constituting the polymer molecule molecule is increased. As a result, the higher the hydrophobicity of the amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer carrier, the higher the cell labeling ability . In addition, it was confirmed that the mean PL intensity of the fluorescence signal per cell was the highest in the case of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer composite composed of polyethyleneimine having a molecular weight of 70,000. When the molecular weight is lower than the above range, the number of semiconductor nanoparticles introduced into the polymer carrier is relatively small. On the other hand, when the molecular weight is higher than this range, the surface of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer composite is too hard, It is believed that semiconductor nanoparticle transfer becomes difficult. When the alkylation length of the polyethyleneimine is adjusted to be shorter, the fluorescence intensity per cell is 10 times lower than that of the polymer-semiconductor nanoparticles having optimized intensity. This is thought to be due to the fact that the fluorescent signal of the control semiconductor nanoparticle-polymer complex having a shorter alkyl group is low and the cell labeling ability is low. Semiconductor nanoparticles surface-substituted with polyethyleneimine without additionally introducing an alkyl group, semiconductor nanoparticles captured with an amphipathic molecule chain CTAB, semiconductor nanoparticles captured with a lipofectamine, hydrophilic ligands having an amine group with a positively charged surface In the case of semiconductor nanoparticles, the intracellular efficiency was 10 times or more lower than that of the amphiphilic polyethylenimine derivative polymer - semiconductor nanoparticles. All of them introduce the single semiconductor nanoparticles into the cells, and the fluorescence efficiency of the sample itself is low.
대표적으로 사용한 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 복합체 (분자량 70,000, 탄소 체인 길이 16) 의 세포 독성은 거의 확인되지 않으며, CTAB 혹은 폴리에틸렌이민의 분자량 750,000 로 매우 큰 경우 높은 세포 독성을 보임을 확인하였다(도 11). The cytotoxicity of a representative semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymeric carrier complex (molecular weight of 70,000 and carbon chain length of 16) is hardly confirmed, and when the molecular weight of CTAB or polyethyleneimine is as high as 750,000, high cytotoxicity is observed (Fig. 11).
투과 전자 현미경을 이용한 세포 Transmission electron microscopy 내입Inside 분석 analysis
공초점 현미경으로 광학적 섹션 영상을 확인함으로써, 세포 내로 전달된 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 복합체의 형광이 세포내에 존재함을 확인하였다(도 12). 세포 내입된 양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 복합체는 세포내로 도입되는 양상을 살펴보기 위하여 아래와 같이 세포내에 내입된 복합체의 투과 전자 현미경 사진을 확인하였다(도 13). 이와 같은 결과를 바탕으로, 반도체 나노입자-양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자 전달체 복합체는 세포 내입 후에도 유동적인 구조를 유지한 채 세포 내부로 잘 전달될 수 있음을 확인하였다. 고분자 전달체-반도체 나노입자 복합체의 유동성을 높이는 동시에 이들 복합체의 높은 형광 효율을 유지하여 세포 표지를 진행함으로써 세포내로의 반도체 나노입자와 같은 표지자 전달을 극대화 할 수 있음을 확인하였다.By confirming the optical section image with a confocal microscope, it was confirmed that the fluorescence of the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer transporter complex transferred into the cell is present in the cell (FIG. 12). The intracellular amphipathic polyethyleneimine derivative semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymer complex was examined for transmission electron microscopic photographs of intracellular intracellular complexes (FIG. 13). Based on these results, it was confirmed that the semiconductor nanoparticle-amphipathic polyethyleneimine derivative polymeric carrier complex can be transferred well into the cell while maintaining a fluid structure even after intracellular entry. It was confirmed that the conjugation of the semiconductor nanoparticles into the cell can be maximized by increasing the fluidity of the polymer carrier-semiconductor nanoparticle complex while maintaining the high fluorescence efficiency of the complex and progressing the cell labeling.
비교 실시예 1. 폴리에틸렌이민 고분자로 표면 치환된 나노입자의 합성Comparative Example 1. Synthesis of Nanoparticles Surface-Substituted with Polyethyleneimine Polymer
양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 포획된 반도체 나노입자의 대조군으로서, 폴리에틸렌이민 고분자 (25, 70, 혹은 750 kDa)를 양친매성을 띄도록 알킬기로 치환하지 않고 그대로 반도체 나노입자 표면에 표면 치환하였다.As a control group of semiconductor nanoparticles captured by amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer, the polyethyleneimine polymer (25, 70, or 750 kDa) was surface-substituted on the surface of semiconductor nanoparticles as it was without replacing the amphipathic polymer with an alkyl group.
1 mL 클로로포름에 반도체 나노입자 대비 10배의 폴리에틸렌이민 고분자를 섞어주고, 이 혼합 용액에 0.1M MES buffer (pH 6.5)를 10 mL 추가하여 상전이를 유도하였다. 이후, 남아있는 클로로포름은 상온에서 진공상태로 두어 제거하였다.이 경우, 도 3에서 도시된 바와 같이, 폴리에틸렌이민 고분자가 가진 아민기 중 일부가 반도체 나노입자의 표면에 결합하고, 나머지 일부는 수용액쪽으로 분포하여 양전하를 띄어 수용액상에서 분산력을 제공하게 된다.To the mixed solution was added 10 mL of 0.1 M MES buffer (pH 6.5) to induce the phase transition, and 1 mL of chloroform was mixed with
비교실시예 2. 양전하를 띄는 세포 내입 가능 분자체로 표면 치환된 나노입자의 합성Comparative Example 2. Synthesis of surface-substituted nanoparticles with positively charged intracellular molecules
양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 포획된 반도체 나노입자의 대조군으로서, 도 4에 도시된 바와 같이, 양전하를 띄는 동시에 알킬기를 가진 단분자인 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium bromide(CTAB)) 분자체를 표면에 가진 반도체 나노입자를 합성하였다. CTAB 분자체를 소수성 표면을 가진 반도체 나노입자와 같이 1 mL 클로로포름에 분산시켰다(반도체 나노입자 당 섞어준 CTAB의 비율은 1:1000). 이후 0.1M MES buffer (pH 6.5) 10 mL를 넣고 상전이를 유도하였다. 이후, 남아있는 클로로포름은 상온에서 진공상태로 두어 제거함 As a control group of semiconductor nanoparticles entrapped with the amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) molecular sieve having a positive charge and having an alkyl group, as shown in FIG. 4, Were synthesized. CTAB molecular sieves were dispersed in 1 mL of chloroform as semiconductor nanoparticles with hydrophobic surfaces. The ratio of CTAB mixed per semiconductor nanoparticles was 1: 1000. Then, 10 mL of 0.1 M MES buffer (pH 6.5) was added to induce the phase transition. The remaining chloroform was then removed by vacuuming at room temperature
비교실시예 3 양전하를 띄는 세포 내입 가능 분자체로 표면 치환된 나노입자의 합성Comparative Example 3 Synthesis of surface-substituted nanoparticles with positively charged intracellular molecules
양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 포획된 반도체 나노입자의 대조군으로, 도 5에 도시된 바와 같이, 양전하를 띄는 동시에 반대편 작용기에 2개의 싸이올(-SH) 작용기를 반도체 나노입자 표면에 직접 결합하는 표면 결합 작용기로 가진 단분자인 디하이드로리픽엑시드(diihydrolipoic acid)에 tertiary amine 이 치환된 분자체((+)-ligand)를 표면에 가진 반도체 나노입자를 합성하였다. 소수성 표면을 가진 반도체 나노입자를 1 mL 클로로포름에 분산시킨 후, 반도체 나노입자 당 100000 당량의 (+)-ligand를 섞어주고 (+)-ligand 대비 2배의 sodium borohydride를 넣고 1 mL 증류수를 섞어주어 격렬하게 교반하였다. 이후 상전이를 유도된 반도체 나노입자 샘플에 남아있는 chloroform 은 상온에서 진공상태로 두어 제거하였다.As a control group of semiconductor nanoparticles entrapped with an amphiphilic polyethyleneimine derivative polymer, as shown in Fig. 5, a surface which positively binds and simultaneously binds two thiol (-SH) functional groups to the opposite functional group to the surface of semiconductor nanoparticles We have synthesized semiconductor nanoparticles with molecular sieves ((+) - ligand) substituted with a tertiary amine in dihydrolipoic acid, a monomolecular complex with a functional group. After dispersing the semiconductor nanoparticles with hydrophobic surface in 1 mL of chloroform, 100,000 equivalents of the (+) - ligand per semiconductor nanoparticle were mixed, and 2 times of sodium borohydride was added to the (+) - ligand. 1 mL of distilled water was added And vigorously stirred. The chloroform remaining in the phase - induced semiconductor nanoparticle sample was then removed under vacuum at room temperature.
비교실시예 4. 양전하 작용기를 가진 리피드로 표면 개질된 반도체 나노입자의 합성 Comparative Example 4. Synthesis of surface-modified semiconductor nanoparticles with lipid with positively charged functional groups
양친매성 폴리에틸렌이민 유도체 고분자로 포획된 반도체 나노입자의 대조군으로서, 도 6에서 도시된 바와 같이, 양전하를 띄는 리피드 (Lipofectamine)로 표면 개질 된 반도체 나노입자를 합성하였다. 양전하 작용기를 가진 리피드를 0.1M MES buffer (pH 6.5) 10 mL 에 분산시키고 1 mL chloroform 에 소수성 표면을 가진 반도체 나노입자를 분산시켰다 (반도체 나노입자 당 섞어준 Lipofectamine의 비율은 1:1000). 이후 상온에서 격렬하게 교반하여 상전이를 유도하였다. 이후, 남아있는 클로로포름은 상온에서 진공상태로 두어 제거하였다. 리포펙타아민(Lipofectamine)의 소수성 부분이 소수성 표면을 가진 반도체 나노입자 표면의 소수성 리간드와 분자간 인력을 통해 나노입자 표면에 도입되어 양전하를 띈 리피드로 표면 개질된 반도체 나노입자를 합성하였다.As a control group of semiconductor nanoparticles entrapped with an amphipathic polyethyleneimine derivative polymer, semiconductor nanoparticles surface-modified with a positively charged lipofectamine were synthesized as shown in FIG. The lipid with positively charged functional groups was dispersed in 10 mL of 0.1M MES buffer (pH 6.5), and the semiconductor nanoparticles with a hydrophobic surface were dispersed in 1 mL of chloroform (the ratio of Lipofectamine mixed per semiconductor nanoparticles was 1: 1000). The reaction was then stirred vigorously at room temperature to induce phase transitions. The remaining chloroform was then removed by vacuum at room temperature. The hydrophobic part of Lipofectamine was introduced on the surface of nanoparticles through hydrophobic ligand and intermolecular attraction on the surface of semiconductor nanoparticle with hydrophobic surface to synthesize semiconductor nanoparticles surface - modified with lipid with positive charge.
Claims (19)
-NHCONH-R (1)
로 이루어진 고분자이며, 여기서 상기 -R은 탄소수 5-20의 알킬인 것을 특징으로 하는 특이적 전달용 복합 나노 입자.The amphiphilic polymer according to any one of claims 1 to 4, wherein the amphipathic polymer has at least one branch terminal of the branched polyethyleneimine represented by the following formula (1)
-NHCONH-R (1)
, Wherein the -R is an alkyl having 5 to 20 carbon atoms.
R-NCO (3)
이 반응하여 형성되며, 여기서 상기 R은 탄소수 5-20의 알킬기, 알켄기, 알카인기, 고리형 알킬기, 페닐기가 치화된 알킬, 페닐기가 치화된 알켄, 페닐기가 치화된 알카인기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 특이적 전달용 복합 나노 입자.7. The compound according to claim 6, wherein said terminal group has the formula (3) at the -NH2 end,
R-NCO (3)
Wherein R is selected from the group consisting of an alkyl group having 5 to 20 carbon atoms, an alkenyl group, an alkoxy group, a cyclic alkyl group, an alkyl group having a phenyl group, an alkenyl group having a phenyl group, Specific nanoparticles for transfer.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114813689A (en) * | 2022-05-12 | 2022-07-29 | 梅晔生物医药股份有限公司 | Method for analyzing absorption capacity of hyaluronic acid penetrating cell membrane |
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20201214 Patent event code: PE09021S01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20150701 Patent event code: PA02011R01I |
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Patent event date: 20210304 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20201214 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |