KR20160095715A

KR20160095715A - 퀴놀린산 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20160095715A
Application number: KR1020150016971A
Authority: KR
Inventors: 이재민; 김주은; 이재희; 장진숙; 김소영; 신용욱
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2016-08-12
Anticipated expiration: 2035-02-03
Also published as: JP6502515B2; KR101758446B1; WO2016126006A1; BR112017016626A2; CN107278225A; EP3255150A1; EP3255150A4; WO2016126006A8; MY173051A; US20180163186A1; JP2018504914A

Abstract

본 발명은 퀴놀린산 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퀴놀린산 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법{A microorganism having an ability to produce quinolinic acid and a method for producing a quinolinic acid using the same}

퀴놀린산(quinolinic acid)은 2,3-피리딘-디카복실산(2,3-Pyridinedicarboxilic acid)으로 불리우며 의학용, 농업용 화학 물질, 염색 물질 등 매우 다양한 분야에서 사용되는 화학합성물의 전구체로 이용된다.

상기 퀴놀린산은 화학적 또는 생물학적 합성 방법을 통하여 제조될 수 있다. 화학적 합성 방법은 석유 유래의 재생 불가능한(non-renewable) 재료를 원료로 사용하기 때문에 환경적인 문제나 유가 또는 석유 추출 단가에 많은 영향을 받는 문제점을 가지고 있다.

생물학적 합성 방법의 대표적인 예로서, L-아스파르트산 산화효소(NadB), 퀴놀린산 신타아제(NadA)를 암호화하는 유전자를 각각 다른 카피 수를 가지는 플라스미드에 클로닝하고, 퀴놀린산 포스포리보실트란스퍼라제의 활성이 제거된 대장균에 상기 두 가지 효소의 발현을 강화시킨 다음, 상기 균주로부터 퀴놀린산을 생산하는 방법이 있다 (Eur. J. Biochem. 175,221 -228 (1988), DE3826041). 그러나, 이때 퀴놀린산의 농도는 500 mg/L 이하로 매우 낮은 수준이었다.

이렇게 낮은 농도로 퀴놀린산이 생성되는 첫 번째 원인은 L-아스파르트산 산화효소를 코딩하는 nadB와 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 nadA 유전자의 NAD 관련 전사단계 저해인자인 NadR에 의한 전사단계 발현 조절이 저해되는 것이며, 두 번째 원인은 L-아스파르트산 산화효소인 NadB 단백질이 NAD에 의해 피드백 저해되는 것이며, 세 번째 원인은 사용된 대장균 자체가 탄소원으로부터 L-아스파르트산까지의 생합성 경로가 약한 것에 기인하는 것으로 파악된다.

이에 본 발명자들은 이 중 첫 번째 원인을 해결하고자 하는 방법으로 고활성의 외래 퀴놀린산 신타아제를 발굴하고, 이를 이용하여 퀴놀린산을 증가시키고자 예의 노력한 결과, 퀴놀린산 생산능을 가지는 미생물에 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제의 활성을 도입한 경우, 대장균 유래의 퀴놀린산 신타아제를 사용한 경우에 비하여 퀴놀린산의 생산능이 보다 우수함을 확인하였고, 이에 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래의 퀴놀린산 신타아제(quinolinate synthase) 활성을 가지도록 형질전환된, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 구체적인 하나의 양태는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래의 퀴놀린산 신타아제(quinolinate synthase) 활성을 가지도록 형질전환된, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물이다.

본 발명에서 사용된 용어, "퀴놀린산 신타아제(quinolinate synthase)"는 이미노숙신산으로부터 퀴놀린산을 합성하는 활성을 가지는 효소를 말한다. 상기 퀴놀린산 신타아제의 EC 번호는 EC 2.5.1.72로서, NadA로도 명명된다. 상기 퀴놀린산 신타아제가 가지는 활성은 하기와 같다.

[퀴놀린산 신타아제의 활성]

α-이미노숙시네이트 + 디히드록시아세톤 포스페이트 <=> 퀴놀린산 + 포스페이트 + 2H₂O

본 발명에서 사용되는 상기 퀴놀린산 신타아제는 크렙시엘라 속 유래의 퀴놀린산 신타아제이며, 구체적으로 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제일 수 있다. 본 발명에서 상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제는 NadA(KP)로도 명명된다.

상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제의 서열은 미국 생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 당업계에 공지된 데이터 베이스로부터 용이하게 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI GenBank의 등록번호가 339761016인 유전자의 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 뿐만 아니라, 서열번호 1과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질로서, 실질적으로 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

또한, 상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 사용된 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩타이드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

구체적으로, 상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제 활성을 가지도록 형질전환된 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "내재적 활성"은 본래 단백질이 천연의 상태, 즉 비변이 상태에서 나타내는 해당 단백질의 활성 상태를 의미한다. "내재적 활성에 비하여 강화"는 본래 단백질이 천연의 상태에서 나타내는 해당 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 증가된 것을 말하며, 해당 단백질의 활성을 가지지 않는 미생물에 해당 활성을 도입하는 것 역시 포함하는 개념이다.

이러한 활성의 강화는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있는데, 예를 들어 해당 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 해당 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, 해당 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 발현능이 강화된 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 단백질을 도입하는 방법, 해당 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이체를 도입하는 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 미생물이 해당 단백질의 활성을 가지는 경우, 해당 단백질을 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 변형하는 방법, 또는 상기 단백질의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법 등에 의하여 수행될 수 있다. 그러나, 상기 예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 활성을 강화시키는 방법은 본 명세서 내의 다른 단백질의 활성 강화 시에도 동일하게 참고될 수 있다.

상기 발현능이 강화된 프로모터는 공지된 프로모터가 사용될 수 있으며, 예를 들어, cj1 프로모터(대한민국 등록특허 제 0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "벡터"란, 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 생산물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어 "형질전환"이란, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 일련의 작업을 의미한다. 상기 숙주세포에 도입되는 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 한, 어떠한 형태라도 무방하다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소(상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위, 번역 종결신호 등)를 포함하는 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있는데, 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

이와 같은 단백질 활성의 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 추가적으로 L-아스파르트산 산화효소의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "L-아스파르트산 산화효소"는 L-아스파르트산을 이미노숙시네이트로 산화시키는 활성을 가지는 효소를 말한다. 상기 L-아스파르트산 산화효소는 EC 번호가 1.4.3.16이며, NadB로 명명될 수 있다. L-아스파르트산 산화효소가 가지는 활성은 하기와 같다.

[L-아스파르트산 산화효소의 활성]

L-아스파르트산 + 푸마레이트 <=> α-이미노숙시네이트 + 숙시네이트 + H⁺,또는

L-아스파르트산 + 산소 <=> 과산화수소 + α-이미노숙시네이트 + H⁺

또한, 상기 L-아스파르트산 산화효소의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21)에 공개된 대장균(Escherichia coli)의 게놈 서열 (GI:89109380)이나 NCBI 및 DDBJ와 같은 당업계에 공지된 데이터 베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다.

그 예로, 상기 L-아스파르트산 산화효소는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질뿐만 아니라, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다, 실질적으로 상기 L-아스파르트산 산화효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

또한, 상기 L-아스파르트산 산화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

또한, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제(quinolinate phosphoribosyltransferase)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것일 수 있다.

상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제는 퀴놀린산을 니코틴산 모노뉴클레오티드로 전환시키는 활성을 가지는 효소를 말한다. 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 EC 번호는 2.4.2.19로서, NadC로도 명명된다. 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제가 가지는 활성을 나타내면 하기와 같다.

[퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성]

5-포스포-α-D-리보오스 1-디포스페이트 + 퀴놀린산 + 2H⁺<=> CO₂ + 다이포스페이트 + 니코틴네이트 모노뉴클레오티드

또한, 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21)에 공개된 대장균(Escherichia coli)의 게놈 서열 (GI: 89106990)이나 NCBI 및 DDBJ와 같은 당업계에 공지된 데이터 베이스로부터 용이하게 얻을 수 있으며, 그 예로 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열뿐만 아니라, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

상기 NadC의 활성을 내재적 활성에 비해 약화시킴으로써 세포 내에 퀴놀린산의 축적을 증가시킬 수 있다.

상기 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것은 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다.

이러한 단백질 활성의 약화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법(예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법); 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하고, 당업자가 적절히 결정할 수 있으나, 구체적으로는 1 내지 300개, 보다 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 발현 조절서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 포스포에놀파이루베이트 카복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase, PPC) 또는 L-아스파르트산 트랜스아미나아제(aspartate transaminase)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것일 수 있다.

상기 포스포에놀파이루베이트 카복실라제는 포스포에놀파이루베이트와 CO₂로부터 옥살로아세트산을 생성하는 반응을 매개하는 효소이다. 상기 포스포에놀파이루베이트 카복실라제의 EC 번호는 4.1.1.31로서, PPC로도 명명된다.

[포스포에놀파이루베이트 카복실라제 활성]

포스포에놀파이루베이트 + CO₂ → 옥살로아세트산 + 포스페이트

또한, L-아스파르트산 트랜스아미나아제는 포스포에놀파이루베이트로부터 L-아스파르트산을 합성하는 활성을 가진다. 상기 L-아스파르트산 트랜스아미나아제의 EC 번호는 2.6.1.1로서, AspC로 또는 L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라아제로도 명명될 수 있다.

[L-아스파르트산 트랜스아미나아제 활성]

옥살로아세트산 + 글루타민산 <=> L-아스파르트산 + 2-케토글루타민산

상기 효소를 코딩하는 유전자 ppc, aspC의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균의 게놈 서열(gi:89110074, GI:89107778)이나 NCBI, DDBJ와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.

상기 PPC 및 AspC는 포스포에놀파이루베이트로부터 퀴놀린산의 전구체인 L-아스파르트산의 합성을 매개하므로, 이의 활성을 강화할 경우, 세포 내에 퀴놀린산의 전구체인 L-아스파르트산의 생산을 증가시킬 수 있으며, 이에 의하여 퀴놀린산의 생산을 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 "퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 퀴놀린산을 생산할 수 있는 미생물을 말한다. 또한, 상기 퀴놀린산을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 퀴놀린산을 생산하는 미생물은 퀴놀린산을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있으며, 구체적으로는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물, 보다 구체적으로는 대장균일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 또 하나의 양태는 상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제 활성을 가지는 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법이다.

구체적으로, 상기 방법은 (a) 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 미생물, 배지 또는 둘 다에서 퀴놀린산을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　배양 방법은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 미생물의 다양한 배양 방법이 예를 들어 "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시킨 배지일 수 있다.　다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　

미생물 배양용 배지에 이용 가능한 탄소원은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.　

미생물 배양용 배지에 이용 가능한 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.

미생물 배양용 배지는 인의 공급원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염을 포함할 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.　이 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있으나,.　이에 제한 되는 것은 아니다. 미생물 배양용 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다.　또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있다.　배양기간은 원하는 퀴놀린산의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 160 시간일 수 있다.

상기 (b) 단계에서 퀴놀린산을 수득하는 단계는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 발명의 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 퀴놀린산의 효과적 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 퀴놀린산을 생산하는 균주 제작

1-1. 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제 제거 균주 제작.

퀴놀린산의 분해경로에 관여하는 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 nadC를 결손시키고자 다음의 실험을 진행하였다.

대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 분해경로의 nadC 유전자를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)으로부터 nadC 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 "GI: 89106990", 서열번호 4)를 수득하였고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 3과 같다. 상기 서열번호 4 에 근거하여 nadC 유전자의 하류(downstream) 부분을 증폭하는 서열번호 5 및 6의 프라이머, nadC의 상류 및 하류 부분과 loxpCm을 증폭하는 서열번호 7 및 8의 프라이머, 상류 부분을 증폭하는 서열번호 9 및 10의 프라이머를 합성하였다.

대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5와 6 및 9와 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 각각 0.5 kb 및 0.3 kb의 nadC 유전자의 상류 부분 및 하류 부분을 증폭하였다. 또한, loxpCm을 함유하고 있는 플라스미드 벡터 pLoxpCat2 벡터(Genbank Accession No. AJ401047)를 주형으로 하여 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 1.0kb의 양 말단에 nadC 유전자와 상동 서열을 갖는 loxpCm 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사. 미국)를 사용하고, PCR은 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다.

이후 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 nadC-상류 절편, nadC-하류 절편, loxpCm 절편을 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 60초의 변성, 50℃에서의 60초의 변성, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복 및 서열번호 5 및 10의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복이었다. 그 결과 1.8kb의 nadC 유전자 상류-loxpCm-하류를 함유한 nadC 결손 카세트를 획득하였다.

제작된 nadC 결손 카세트를 람다 레드 재조합효소(lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 K12 W3110 상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L, 및 아가 1.5%) 상에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후, 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 6 및 9의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생주의 경우 1.6kb, nadC 제거 균주의 경우 1.3kb인 것을 확인함으로써 nadC 유전자의 결실을 확인하였다. 이를 W3110-△nadC라 명명하였다.

1-2. 퀴놀린산 신타아제 제거 균주 제작

본 발명의 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 퀴놀린산 신타아제의 활성을 확인하기 위하여, 미생물 자체의 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 nadA를 결손하고자 다음과 같이 실험하였다.

대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 신타제의 nadA 유전자를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)으로부터 nadA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI: 89107601", 서열번호 12)를 수득하고, 이의 아미노산 서열은 11과 같다. 서열번호 12에 근거하여 nadA 유전자의 하류(downstream) 부분을 증폭하는 서열번호 13 및 14의 프라이머, nadA의 상류 및 하류 부분과 loxpCm을 증폭하는 서열번호 15 및 16의 프라이머, 상류 부분을 증폭하는 서열번호 17 및 18의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13과 14 및 17과 18의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 각각 0.5 kb 및 0.5 kb의 nadA 유전자의 상류 부분 및 하류 부분을 증폭하였다. 또한, loxpCm을 함유하고 있는 플라스미드 벡터 pLoxpCat2 벡터(Genbank Accession No. AJ401047)를 주형으로 하여 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 1.0kb의 양 말단에 nadA 유전자와 상동 서열을 갖는 loxpCm 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltra^TMDNA 폴리머라제(Stratagene사. 미국)를 사용하고, PCR은 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다.

이후 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 nadA-상류 절편, nadA-하류 절편, loxpCm 절편을 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 60초의 변성, 50℃에서의 60초의 변성, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복 및 서열번호 13 및 18의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복이었다. 그 결과 2.0kb의 nadA 유전자 상류-loxpCm-하류를 함유한 nadA 결손 카세트를 획득하였다.

제작된 nadA 결손 카세트를 람다 레드 재조합효소(lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 W3110-△nadC 상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L, 및 아가 1.5%) 상에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후, 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 14 및 17의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생주의 경우 1.1kb, nadA 제거 균주의 경우 1.3kb인 것을 확인함으로써 nadA 유전자의 결실을 확인하였다. 이를 W3110-△nadC△nadA 라 명명하였다.

1-3. 대장균 L-아스파르트산 산화효소 발현 벡터 제작

L-아스파르트산 산화효소를 코딩하는 유전자 nadB를 강화하기 위하여, 다음과 같은 실험을 진행하였다.

대장균 유래의 야생형 nadB 유전자를 발현 벡터에 클로닝하였다. 이를 위한 주형으로는 대장균 K12 W3110 균주(ATCC No 23257)의 염색체를 사용하였다. 유전자 서열은 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)의 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI: 89109380", 서열번호 20)을 활용하였고 아미노산 서열은 서열번호 19과 같다. nadB 유전자의 ORF 부분을 증폭하고, 제한효소 인식부위 NdeI과 BamHI를 갖는 서열번호 21 및 22의 프라이머를 합성하였다.

상기 대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 21 과 22의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. PCR을 통하여, nadB ORF 유전자와 제한효소 NdeI 및 BamHI의 인식부위를 함유한 약 1.9 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.

상기 PCR을 통하여 수득된 nadB 유전자는, 아가로즈 젤 용출(agarose gel elution)을 통하여 회수한 후, 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 처리하였다. 이후 제한효소 NdeI 및 BamHI로 처리한 pProLar(CloneTech사, 미국) 벡터에 접합(ligation)하여, pPro 프로모터에 연결된 nadB 유전자로부터 L-아스파르트산 산화효소가 발현되도록 하였다. 상기의 방법으로 제작된 벡터를 pPro-nadB 벡터라 명명하였다.

1-4. 퀴놀린산 신타아제 발현 벡터 제작

(1) pNadA-nadA 벡터 제작

대장균 유래의 야생형 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 nadA 유전자를 발현 벡터에 클로닝하였다. 이를 위한 주형으로는 대장균 K12 W3110 균주(ATCC No. 23257)의 염색체를 사용하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)으로부터 서열번호 12의 nadA 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 "GI: 89107601")를 수득하였다. 또한, 이에 근거하여 nadA 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF 부분을 증폭하는데 사용할 수 있고 제한효소 XbaI 인식부위 및 BamHI 인식부위를 갖는, 서열번호 25 및 26의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96℃에서의 30초의 변성, 55℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadA 유전자와 제한효소 XbaI 인식부위 및 BamHI 인식부위를 함유한 약 1 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

또한 Mendoza-Vargas et al., PLoS ONE, 4: e7526를 근거로 pNadA 프로모터를 포함한 대장균 W3110 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, pNadA 프로모터를 수득하였다. pNadA 프로모터와 상기에 증폭된 nadA 유전자를 접합시키기 위해 제한효소 PstI과 XbaI의 인식부위를 갖는 서열번호 23 및 24의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, pNadA 프로모터와 제한효소 PstI와 XbaI 인식부위를 함유한 약 0.3 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 nadA 유전자를 제한효소 XbaI 및 BamHI으로 처리하고, 증폭된 pNadA 프로모터 절편을 PstI 및 XbaI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 nadA 및 pNadA 프로모터 절편을 pCL1920 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하여 pNadA-nadA 재조합 벡터를 제작하였다. 이는 서열번호 27에 나타낸 바와 같다.

(2) pNadA-nadA(KP) 벡터 제작

크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래 퀴놀린산 신타아제를 제작하기 위하여, 크렙시엘라 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 nadA(KP) 유전자를 발현 벡터에 클로닝하였다. 이를 위하여 주형으로는 크렙시엘라 균주의 염색체 DNA를 이용하였다. 균주는 ATCC No. 25955번을 구매하여 사용하였다. 유전자 서열은 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)의 유전자의 염기서열(NCBI 등록번호 "GI:339761016")의 서열번호 2를 활용하였으며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 1과 같다. 유전자 클로닝을 위하여 nadA(KP) 유전자 부분을 증폭할 수 있는 제한효소 XbaI 인식부위 및 BamHI 인식부위를 갖는 서열번호 28 및 29의 프라이머를 합성하였다.

크렙시엘라의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 28 및 29의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96℃에서의 30초의 변성, 55℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadA(KP) 유전자와 제한효소 XbaI과 BamHI의 인식부위를 함유한 약 1 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 nadA(KP) 유전자를 제한효소 XbaI 및 BamHI으로 처리하고, 제한효소로 처리한 nadA(KP) 절편을 pNadA 프로모터를 포함한 pCL1920 벡터에 ligation(접합)함을 통하여 pNadA-nadA(KP) 재조합 벡터를 제작하였다. 이 염기서열은 서열번호 30에 나타낸 바와 같다.

1-5. 아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제 발현용 플라스미드 제작

(1) pPro-nadB-pCJ1-nadA 벡터 제작

퀴놀린산을 생산하기 위해서는 아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제, 두 효소의 강화가 필요하다. 따라서 이 두 효소를 코딩하는 nadB와 nadA의 유전자가 함께 발현될 수 있는 플라스미드를 만들었다. 먼저 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자 nadA를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)으로부터 nadA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89107601")를 활용하였으며, 서열번호 12와 같다. 이에 근거하여 nadA 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF 부분을 증폭하는데 사용할 수 있고, 제한효소 ApaI 및 NotI의 인식부위를 갖는 서열번호 31 및 32의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadA 유전자와 제한효소 ApaI과 NotI의 인식부위를 함유한 약 1.0kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

대한민국 등록특허 제0620092호를 근거로 pCJ1 프로모터를 포함한 플라스미드를 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, pCJ1 프로모터를 수득하였다. pCJ1 프로모터와 상기에 증폭된 nadA 유전자를 접합시키기 위해 제한효소 BamHI과 ApaI의 인식부위를 갖는 서열번호 33 및 34의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, pCJ1 프로모터와 제한효소 BamHI 인식부위와 ApaI 인식부위를 함유한 약 0.3kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 nadA 유전자를 제한효소 ApaI 및 NotI으로 처리하고, 증폭된 pCJ1 프로모터 절편을 ApaI 및 BamHI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 nadA 및 pCJ1 프로모터 절편을 제한효소 NotI 및 BamHI으로 처리한 상기 1-3 에서 수득된 pPro-nadB 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고 최종적으로 구성적 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자와 pCJ1 유전자 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadA 유전자가 클로닝된 5.9Kb의 pPro-nadB_pCJ1-nadA 재조합 벡터를 제작하였다.

(2) pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP) 벡터 제작

퀴놀린산을 생산하기 위해서는 아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제의 두 효소의 강화가 필요하다. 이 두 효소를 코딩하는 nadB와 nadA(KP)의 유전자가 함께 발현될 수 있는 플라스미드 제작을 위하여 크렙시엘라 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자 nadA(KP)를 수득하였다. 유전자 서열은 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)의 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI:339761016")의 서열을 활용하였으며, 서열번호 2와 같다. 이에 근거하여 nadA(KP) 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF 부분을 증폭하는데 사용할 수 있고, 제한효소 ApaI 및 NotI의 인식부위를 갖는 서열번호 35 및 36의 프라이머를 합성하였다.

크렙시엘라 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadA 유전자와 제한효소 ApaI과 NotI의 인식부위를 함유한 약 1.0kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 nadA(KP) 유전자를 제한효소 ApaI 및 NotI으로 처리하고, ApaI 및 NotI 처리한 상기 1-5(1)에서 수득된 pPro-nadB-pCJ1-nadA 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고 최종적으로 구성적 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자와 pCJ1 유전자 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadA(KP) 유전자가 클로닝된 5.9Kb의 pPro-nadB_pCJ1-nadA(KP) 재조합 벡터를 제작하였다.

1-6. 포스포에놀파이루베이트 카복실라제 및 L-아스파르트산 트랜스아미나아제 발현용 플라스미드 제작

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 포스포에놀파이루베이트 카복실라제를 코딩하는 유전자 ppc를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)으로부터 서열번호 37의 ppc 유전자의 염기서열(NCBI 등록번호 "GI:89110074")을 수득하고, 이에 근거하여 ppc 유전자의 프로모터로부터 터미네이터까지 함유하는 부분을 증폭할 수 있고, 제한효소 HindIII와 BamHI 인식부위를 갖는 서열번호 38 및 39의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 38 과 39의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 4분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이에 의하여, ppc 유전자와 제한효소 HindIII 및 BamHI의 인식부위를 함유한 약 3.1 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다. 상기 PCR을 통하여 수득된 ppc 유전자를 제한효소 HindIII 및 BamHI으로 처리하고, 제한효소 HindIII 및 BamHI으로 처리한 pCL1920(AB236930) 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고, 최종적으로 ppc 유전자가 클로닝된 pCP 재조합 벡터를 제작하였다.

ppc 유전자가 클로닝되어 있는 pCP 재조합 벡터상에 aspC 유전자를 클로닝하기 위하여, 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 L-아스파르트산 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자 aspC를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)으로부터 서열번호 40의 aspC 유전자의 염기서열(NCBI 등록번호 "GI:89107778")을 수득하고, 이에 근거하여 aspC 유전자의 프로모터로부터 터미네이터까지 함유하는 부분을 증폭할 수 있고, 제한효소 BamHI와 KpnI 인식부위를 갖는 서열번호 41 및 42의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 41 과 42의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이에 의하여, aspC 유전자와 제한효소 BamHI 및 KpnI의 인식부위를 함유한 약 1.5 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.

상기 PCR을 통하여 수득된 aspC 유전자를 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 처리하고, 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 처리한 pCP 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고, 최종적으로 aspC 유전자와 ppc 유전자가 동시에 클로닝된 pCPA 재조합 벡터를 제작하였다. 제작된 pCPA 벡터는 서열번호 43의 서열을 갖는다.

실시예 2. 퀴놀린산 생산 균주의 생산능 평가

nadA(KP) 유전자 강화 균주의 퀴놀린산 생산 능력을 평가하기 위해 W3110-△nadC 균주에 pNadA-nadA와 pNadA-nadA(KP) 벡터를 도입하였고 W3110△nadC/pNadA-nadA와 W3110△nadC/pNadA-nadA(KP) 균주는 각각 CV01-0812, CV01-0813로 명명하였다. 이에 추가로 nadB 강화를 위하여 CV01-0812, CV01-0813에 pPro-nadB 벡터를 도입하였고, 각각 CV01-0814, CV01-0815로 명명하였다.

벡터의 도입방법은 CaCl₂방법을 이용하여 형질전환하였고, 37℃의 배양기에서 CV01-0812, CV01-0813의 경우 LB-Sp(효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트리톤 10g/L, 아가 1.5%, 스펙티노마이신 50μg/L), CV01-0814, CV01-0815의 경우 LB-Sp, Km(효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트리톤 10g/L, 아가 1.5%, 카나마이신 50μg/L, 스펙티노마이신 50μg/L) 평판배지에 도말하여 밤새 배양하였다. 그 후 항생제 내성을 갖는 수득한 단일 콜로니를 25mL의 퀴놀린산 역가배지에 1 백금이씩 접종하여 33℃에서 250rpm으로 24 내지 72시간 동안 배양하였다. 하기 표 1은 퀴놀린산 생산용 배지의 조성을 나타낸다.

퀴놀린산 역가 배지 조성

조성	농도(리터당)
포도당	70g
황산암모늄	17g
KH₂PO₄	1.0g
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.5g
FeSO₄ㆍ7H2O	5mg
MnSO₄ㆍ8H2O	5mg
ZnSO₄	5mg
탄산칼슘	30g
효모 추출물	2g
메티오닌	0.15g

배양액 중의 퀴놀린산을 HPLC로 분석하여, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 퀴놀린산 생산시 nadB와 nadA의 동시 강화의 필요성을 확인하였고 크렙시엘라 기반의 nadA(KP)를 강화한 균주가 야생형 nadA를 강화한 균주보다 퀴놀린산의 생산량이 약 10% 증가하는 것을 확인하였다.

균주	퀴놀린산(g/L)
CV01-0812	0.1
CV01-0813	0.1
CV01-0814	5.6
CV01-0815	6.1

단일종 퀴놀린산 신타아제의 활성을 평가하기 위하여 pPro-nadB 벡터가 포함된 W3110 -△ nadC △ nadA 균주에 pNadA-nadA와 pNadA-nadA(KP) 벡터를 각각 CaCl₂방법을 이용하여 형질전환하고, W3110 △ nadC △ nadA / pNadA-nadA, pPro-nadB와 W3110 △nadC△ nadA / pNadA-nadA(KP), pPro-nadB 균주를 각각 CV01-0816, CV01-0817로 명명하였다. 이 중 CV01-0817 균주는 부다페스트 조약하에 2014년 11월 27일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11612P를 부여받았다.

상기 두 균주를 이용하여 다음과 같이 퀴놀리산 역가배지 평가를 진행하였다.

형질전환된 상기 CV01-0816, CV01-0817 균주를 37℃의 배양기에서 LB-Km, Sp (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트리톤 10g/L, 아가 1.5%, 카나마이신 50μg/L, 스펙티노마이신 50μg/L) 평판배지에 도말하여 밤새 배양하였다. 그 후 카나마이신 및 스펙티노마이신 내성을 갖는 수득한 단일 콜로니를 25mL의 퀴놀린산 역가배지에 1백금이씩 접종하여 33℃에서 250rpm으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다.

배양액 중의 퀴놀린산을 HPLC로 분석하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 크렙시엘라 기반의 nadA(KP)를 강화한 경우 퀴놀린산의 생산이 nadA를 강화하였을 때보다 9% 이상 수준으로 증가하는 것을 확인하였다.

균주	퀴놀린산(g/L)
CV01-0816	6.1
CV01-0817	6.5

추가적으로 생합성 경로 강화시 퀴놀린산 생산능력을 평가하기 위해 W3110 -△n a dC와 W3110 -△ nadC △ nadA 균주에 pCPA 벡터를 도입하고, 또한 nadB, nadA가 동시에 강화된 pPro-nadB-pCJ1-nadA, pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP) 벡터를 각각 도입하였다. W3110 -△ nadC/pCPA, pPro-nadB-pCJ1-nadA, W3110 -△ nadC/pCPA, pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP), W3110 -△ nadC △ nadA/pCPA, pPro-nadB-pCJ1-nadA, W3110 -△ nadC △nadA/pCPA, pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP) 균주를 각각 CV01-0818, CV01-0819, CV01-0820, CV01-0821로 명명하였다.

도입방법은 CaCl₂ 방법을 이용하여 형질전환 하였고, 37℃의 배양기에서 LB-Km, Sp (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 카나마이신 50μg/L, 스펙티노마이신 50μg/L) 평판배지에 도말하여 밤새 배양하였다. 그 후 카나마이신 및 스펙티노마이신 내성을 갖는 수득한 단일 콜로니를 25mL의 퀴놀린산 역가배지에 1 백금이씩 접종하여 33℃에서 250 rpm으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다.

배양액 중의 퀴놀린산을 HPLC에 의하여 분석하여 결과를 하기 표 4에 나타내었으며, 이는 균주의 퀴놀린산을 생산하는 생산능을 나타낸다. 하기 표 4에서 보듯이 크렙시엘라 기반의 nadA(KP)를 강화 시 퀴놀린산의 생산이, nadA를 강화하였을 때보다 10% 이상 수준으로 증가하는 것을 확인하였다.

균주	퀴놀린산(g/L)
CV01-0818	7.1
CV01-0819	7.8
CV01-0820	7.3
CV01-0821	8.1

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11612P

20141127

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism having an ability to produce quinolinic acid and a method for producing a quinolinic acid using the same <130> KPA141199-KR <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 347 <212> PRT <213> Klebsiella pneumonia <400> 1 Met Ser Val Met Phe Asp Pro Glu Thr Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Ala 1 5 10 15 Lys Pro Gln Pro Leu Thr Val Asp Glu Lys Gln Phe Tyr Arg Glu Lys 20 25 30 Ile Lys Arg Leu Leu Arg Glu Arg Asp Ala Val Met Val Ala His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Pro Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Glu Thr Gly Gly Cys 50 55 60 Ile Ala Asp Ser Leu Glu Met Ala Arg Phe Gly Ala Arg His Ser Ala 65 70 75 80 Ser Thr Leu Leu Val Ala Gly Val Arg Phe Met Gly Glu Thr Ala Lys 85 90 95 Ile Leu Ser Pro Glu Lys Thr Ile Leu Met Pro Thr Leu Asn Ala Glu 100 105 110 Cys Ser Leu Asp Leu Gly Cys Pro Ile Glu Glu Phe Asn Ala Phe Cys 115 120 125 Asp Ala His Pro Asp Arg Thr Val Val Val Tyr Ala Asn Thr Ser Ala 130 135 140 Ala Val Lys Ala Arg Ala Asp Trp Val Val Thr Ser Ser Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Leu Ile Asp His Leu Asp Ser Leu Gly Gln Lys Ile Leu Trp Ala 165 170 175 Pro Asp Arg His Leu Gly Arg Tyr Val Gln Arg Gln Thr Gly Ala Asp 180 185 190 Val Leu Cys Trp Gln Gly Ala Cys Ile Val His Asp Glu Phe Lys Thr 195 200 205 Gln Ala Leu Met Arg Met Lys Ala Leu His Pro Glu Ala Ala Val Leu 210 215 220 Val His Pro Glu Ser Pro Gln Ala Ile Val Glu Met Ala Asp Ala Val 225 230 235 240 Gly Ser Thr Ser Gln Leu Ile Ala Ala Ala Lys Ser Leu Pro Gln Arg 245 250 255 Gln Leu Ile Val Ala Thr Asp Arg Gly Ile Phe Tyr Lys Met Gln Gln 260 265 270 Ala Val Pro Glu Lys Thr Leu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Gly Glu Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Arg Ser Cys Ala His Cys Pro Trp Met Ala Met Asn Gly 290 295 300 Leu Lys Ala Ile Ala Glu Gly Leu Glu Gln Gly Gly Ala Glu His Glu 305 310 315 320 Ile His Val Asp Glu Ala Leu Arg Thr Gly Ala Leu Ile Pro Leu Asn 325 330 335 Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly 340 345 <210> 2 <211> 1044 <212> DNA <213> Klebsiella pneumonia <400> 2 atgagcgtaa 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Arg 145 150 155 160 Ser Ala Leu Lys Tyr Ala Val Leu Cys Gly Gly Gly Ala Asn His Arg 165 170 175 Leu Gly Leu Ser Asp Ala Phe Leu Ile Lys Glu Asn His Ile Ile Ala 180 185 190 Ser Gly Ser Val Arg Gln Ala Val Glu Lys Ala Ser Trp Leu His Pro 195 200 205 Asp Ala Pro Val Glu Val Glu Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Asp Glu 210 215 220 Ala Leu Lys Ala Gly Ala Asp Ile Ile Met Leu Asp Asn Phe Glu Thr 225 230 235 240 Glu Gln Met Arg Glu Ala Val Lys Arg Thr Asn Gly Lys Ala Leu Leu 245 250 255 Glu Val Ser Gly Asn Val Thr Asp Lys Thr Leu Arg Glu Phe Ala Glu 260 265 270 Thr Gly Val Asp Phe Ile Ser Val Gly Ala Leu Thr Lys His Val Gln 275 280 285 Ala Leu Asp Leu Ser Met Arg Phe Arg 290 295 <210> 4 <211> 894 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 atgccgcctc gccgctataa ccctgacacc cgacgtgacg agctgctgga acgcattaat 60 ctcgatatcc ccggcgcggt ggcccaggcg ctgcgggaag atttaggcgg aacagtcgat 120 gccaacaatg atattacggc aaaactttta ccggaaaatt ctcgctctca tgccacggtg 180 atcacccgcg agaatggcgt cttttgcggc aaacgctggg ttgaagaggt gtttattcaa 240 ctggcaggcg acgatgtcac cataatctgg catgtggatg acggcgatgt catcaatgcc 300 aatcaatcct tgttcgaact tgaaggccca tcccgcgtgc tgttaacggg cgaacgcact 360 gcgcttaatt ttgtgcaaac cctttcagga gttgccagta aggtacgcca ctatgtcgaa 420 ttgctggaag gcaccaacac gcagttgttg gatacgcgca aaaccttacc cggcctgcgt 480 tcagctctga aatacgcggt actttgcggc ggcggagcga atcaccgtct ggggctttct 540 gatgccttcc tgatcaaaga aaaccatatt attgcctccg gctcagtgcg ccaggcggtc 600 gaaaaagcgt cctggctgca cccggatgcg ccagtagaag tcgaagtaga gaatctggaa 660 gaacttgatg aagccctgaa agcaggagcc gatatcatca tgctggataa cttcgaaaca 720 gaacagatgc gcgaagccgt caaacgcacc aacggcaagg cgctactgga agtgtctggc 780 aacgtcactg acaaaacact gcgtgaattt gccgaaacgg gcgtggactt tatctccgtc 840 ggtgcgctaa ctaaacacgt acaagcactc gacctttcaa tgcgttttcg ctaa 894 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cattatacga acggtacccc cagttgaata aacacctctt ca 42 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tggcggcagg 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295 300 Leu Gln Ala Ile Ala Glu Ala Leu Glu Gln Glu Gly Ser Asn His Glu 305 310 315 320 Val His Val Asp Glu Arg Leu Arg Glu Arg Ala Leu Val Pro Leu Asn 325 330 335 Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly 340 345 <210> 12 <211> 1044 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 atgagcgtaa tgtttgatcc agacacggcg atttatcctt tccccccgaa gccgacgccg 60 ttaagcattg atgaaaaagc gtattaccgc gagaagataa aacgtctgct aaaagaacgt 120 aatgcggtga tggttgccca ctactatacc gatcccgaaa ttcaacaact ggcagaagaa 180 accggtggct gtatttctga ttctctggaa atggcgcgct tcggtgcaaa gcatcccgct 240 tctactttgt tagtcgctgg ggtgagattt atgggagaaa ccgccaaaat tctcagtccg 300 gaaaaaacaa ttctgatgcc gacacttcag gctgaatgtt cactggatct cggctgccct 360 gttgaagaat ttaacgcatt ttgcgatgcc catcccgatc gtactgtcgt cgtctacgcc 420 aacacttctg ctgcggtaaa agcgcgcgca gattgggtgg taacttcaag cattgccgtc 480 gaacttattg atcatcttga tagtttgggt gaaaaaatca tctgggcacc cgacaaacat 540 ctggggcgtt acgtgcaaaa acagacgggt ggagacattc tatgctggca gggtgcctgt 600 attgtgcatg atgaatttaa gactcaggcg ttaacccgct tgcaagaaga atacccggat 660 gctgccatac tggtgcatcc agaatcacca caagctattg tcgatatggc ggatgcggtc 720 ggttccacca gtcaactgat cgctgctgcg aaaacattgc cacatcagag gcttattgtg 780 gcaaccgatc ggggtatttt ctacaaaatg cagcaggcgg tgccagataa agagttactg 840 gaagcaccaa ccgcaggtga gggtgcaacc tgccgcagct gcgcgcattg tccgtggatg 900 gccatgaatg gccttcaggc catcgcagag gcattagaac aggaaggaag caatcacgag 960 gttcatgttg atgaaaggct gcgagagagg gcgctggtgc cgctcaatcg tatgctggat 1020 tttgcggcta cactacgtgg ataa 1044 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 cattatacga acggtacccc cccggatgct gccatactg 39 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ccatgagaga tcataaccgc 20 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tgacttttcc ccaccattcg ttcgagctcg gtacctaccg 40 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 cagtatggca gcatccgggg gggtaccgtt cgtataatg 39 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gggtcgttag ctcagttggt 20 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 cggtaggtac cgagctcgaa cgaatggtgg ggaaaagtca 40 <210> 19 <211> 540 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 19 Met Asn Thr Leu Pro Glu His Ser Cys Asp Val Leu Ile Ile Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ala Leu Arg Leu Ala Asp Gln His Gln 20 25 30 Val Ile Val Leu Ser Lys Gly Pro Val Thr Glu Gly Ser Thr Phe Tyr 35 40 45 Ala Gln Gly Gly Ile Ala Ala Val Phe Asp Glu Thr Asp Ser Ile Asp 50 55 60 Ser His Val Glu Asp Thr Leu Ile Ala Gly Ala Gly Ile Cys Asp Arg 65 70 75 80 His Ala Val Glu Phe Val Ala Ser Asn Ala Arg Ser Cys Val Gln Trp 85 90 95 Leu Ile Asp Gln Gly Val Leu Phe Asp Thr His Ile Gln Pro Asn Gly 100 105 110 Glu Glu Ser Tyr His Leu Thr Arg Glu Gly Gly His Ser His Arg Arg 115 120 125 Ile Leu His Ala Ala Asp Ala Thr Gly Arg Glu Val Glu Thr Thr Leu 130 135 140 Val Ser Lys Ala Leu Asn His Pro Asn Ile Arg Val Leu Glu Arg Ser 145 150 155 160 Asn Ala Val Asp Leu Ile Val Ser Asp Lys Ile Gly Leu Pro Gly Thr 165 170 175 Arg Arg Val Val Gly Ala Trp Val Trp Asn Arg Asn Lys Glu Thr Val 180 185 190 Glu Thr Cys His Ala Lys Ala Val Val Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser 195 200 205 Lys Val Tyr Gln Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Ile Ser Ser Gly Asp Gly 210 215 220 Ile Ala Met Ala Trp Arg Ala Gly Cys Arg Val Ala Asn Leu Glu Phe 225 230 235 240 Asn Gln Phe His Pro Thr Ala Leu Tyr His Pro Gln Ala Arg Asn Phe 245 250 255 Leu Leu Thr Glu Ala Leu Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Leu Lys Arg Pro 260 265 270 Asp Gly Thr Arg Phe Met Pro Asp Phe Asp Glu Arg Gly Glu Leu Ala 275 280 285 Pro Arg Asp Ile Val Ala Arg Ala Ile Asp His Glu Met Lys Arg Leu 290 295 300 Gly Ala Asp Cys Met Phe Leu Asp Ile Ser His Lys Pro Ala Asp Phe 305 310 315 320 Ile Arg Gln His Phe Pro Met Ile Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Leu Gly 325 330 335 Ile Asp Leu Thr Gln Glu Pro Val Pro Ile Val Pro Ala Ala His Tyr 340 345 350 Thr Cys Gly Gly Val Met Val Asp Asp His Gly Arg Thr Asp Val Glu 355 360 365 Gly Leu Tyr Ala Ile Gly Glu Val Ser Tyr Thr Gly Leu His Gly Ala 370 375 380 Asn Arg Met Ala Ser Asn Ser Leu Leu Glu Cys Leu Val Tyr Gly Trp 385 390 395 400 Ser Ala Ala Glu Asp Ile Thr Arg Arg Met Pro Tyr Ala His Asp Ile 405 410 415 Ser Thr Leu Pro Pro Trp Asp Glu Ser Arg Val Glu Asn Pro Asp Glu 420 425 430 Arg Val Val Ile Gln His Asn Trp His Glu Leu Arg Leu Phe Met Trp 435 440 445 Asp Tyr Val Gly Ile Val Arg Thr Thr Lys Arg Leu Glu Arg Ala Leu 450 455 460 Arg Arg Ile Thr Met Leu Gln Gln Glu Ile Asp Glu Tyr Tyr Ala His 465 470 475 480 Phe Arg Val Ser Asn Asn Leu Leu Glu Leu Arg Asn Leu Val Gln Val 485 490 495 Ala Glu Leu Ile Val Arg Cys Ala Met Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly 500 505 510 Leu His Phe Thr Leu Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Thr His Ser Gly Pro 515 520 525 Ser Ile Leu Ser Pro Gly Asn His Tyr Ile Asn Arg 530 535 540 <210> 20 <211> 1623 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 20 atgaatactc tccctgaaca ttcatgtgac gtgttgatta tcggtagcgg cgcagccgga 60 ctttcactgg cgctacgcct ggctgaccag catcaggtca tcgttctaag taaaggcccg 120 gtaacggaag gttcaacatt ttatgcccag ggcggtattg ccgccgtgtt tgatgaaact 180 gacagcattg actcgcatgt ggaagacaca ttgattgccg gggctggtat ttgcgatcgc 240 catgcagttg aatttgtcgc cagcaatgca cgatcctgtg tgcaatggct aatcgaccag 300 ggggtgttgt ttgataccca cattcaaccg aatggcgaag aaagttacca tctgacccgt 360 gaaggtggac atagtcaccg tcgtattctt catgccgccg acgccaccgg tagagaagta 420 gaaaccacgc tggtgagcaa ggcgctgaac catccgaata ttcgcgtgct ggagcgcagc 480 aacgcggttg atctgattgt ttctgacaaa attggcctgc cgggcacgcg acgggttgtt 540 ggcgcgtggg tatggaaccg taataaagaa acggtggaaa cctgccacgc aaaagcggtg 600 gtgctggcaa ccggcggtgc gtcgaaggtt tatcagtaca ccaccaatcc ggatatttct 660 tctggcgatg gcattgctat ggcgtggcgc gcaggctgcc gggttgccaa tctcgaattt 720 aatcagttcc accctaccgc gctatatcac ccacaggcac gcaatttcct gttaacagaa 780 gcactgcgcg gcgaaggcgc ttatctcaag cgcccggatg gtacgcgttt tatgcccgat 840 tttgatgagc gcggcgaact ggccccgcgc gatattgtcg cccgcgccat tgaccatgaa 900 atgaaacgcc tcggcgcaga ttgtatgttc cttgatatca gccataagcc cgccgatttt 960 attcgccagc atttcccgat gatttatgaa aagctgctcg ggctggggat tgatctcaca 1020 caagaaccgg taccgattgt gcctgctgca cattatacct gcggtggtgt aatggttgat 1080 gatcatgggc gtacggacgt cgagggcttg tatgccattg gcgaggtgag ttataccggc 1140 ttacacggcg ctaaccgcat ggcctcgaat tcattgctgg agtgtctggt ctatggctgg 1200 tcggcggcgg aagatatcac cagacgtatg ccttatgccc acgacatcag tacgttaccg 1260 ccgtgggatg aaagccgcgt tgagaaccct gacgaacggg tagtaattca gcataactgg 1320 cacgagctac gtctgtttat gtgggattac gttggcattg tgcgcacaac gaagcgcctg 1380 gaacgcgccc tgcggcggat aaccatgctc caacaagaaa tagacgaata ttacgcccat 1440 ttccgcgtct caaataattt gctggagctg cgtaatctgg tacaggttgc cgagttgatt 1500 gttcgctgtg caatgatgcg taaagagagt cgggggttgc atttcacgct ggattatccg 1560 gaactgctca cccattccgg tccgtcgatc ctttcccccg gcaatcatta cataaacaga 1620 taa 1623 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 aattcatatg aatactctcc ctgaacatt 29 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 aattggatcc ctataccact acgcttgatc ac 32 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ctgcagatcc tgcacgaccc acc 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 tctagactta ccatctcgtt tta 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 tctagaatga gcgtaatgtt tga 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ggatccttat ccacgtagtg tag 23 <210> 27 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNadA-nadA <400> 27 ctgcagatcc tgcacgaccc accaatgtaa aaaagcgccc taaaggcgct tttttgctat 60 tcaggcatcc tcaatttcac tttgtaaacc tgatgacatc gtcagagctt actgtgcaag 120 caactctatg tcggtggaat taggcgtaaa atgacgcatc ctgcacatta ggcgtaattc 180 gagtgacttt tccccaccat tcgactatct tgtttagcat ataaaacaaa ttacaccgat 240 aacagcgaat attacgctaa tgtcggtttt aacgttaagc ctgtaaaacg agatggtaag 300 tctagaatga gcgtaatgtt tgatccagac acggcgattt atcctttccc cccgaagccg 360 acgccgttaa gcattgatga aaaagcgtat taccgcgaga agataaaacg tctgctaaaa 420 gaacgtaatg cggtgatggt tgcccactac tataccgatc ccgaaattca acaactggca 480 gaagaaaccg gtggctgtat ttctgattct ctggaaatgg cgcgcttcgg tgcaaagcat 540 cccgcttcta ctttgttagt cgctggggtg agatttatgg gagaaaccgc caaaattctc 600 agtccggaaa aaacaattct gatgccgaca cttcaggctg aatgttcact ggatctcggc 660 tgccctgttg aagaatttaa cgcattttgc gatgcccatc ccgatcgtac tgtcgtcgtc 720 tacgccaaca cttctgctgc ggtaaaagcg cgcgcagatt gggtggtaac ttcaagcatt 780 gccgtcgaac ttattgatca tcttgatagt ttgggtgaaa aaatcatctg ggcacccgac 840 aaacatctgg ggcgttacgt gcaaaaacag acgggtggag acattctatg ctggcagggt 900 gcctgtattg tgcatgatga atttaagact caggcgttaa cccgcttgca agaagaatac 960 ccggatgctg ccatactggt gcatccagaa tcaccacaag ctattgtcga tatggcggat 1020 gcggtcggtt ccaccagtca actgatcgct gctgcgaaaa cattgccaca tcagaggctt 1080 attgtggcaa ccgatcgggg tattttctac aaaatgcagc aggcggtgcc agataaagag 1140 ttactggaag caccaaccgc aggtgagggt gcaacctgcc 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cggcgctgaa 1260 catgaaatcc atgtcgacga agcgctgcga accggcgcat taattcccct taaccggatg 1320 ctggattttg cggctacact acggggataa ggatcc 1356 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aattgggccc atgagcgtaa tgtttgatcc a 31 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aattgcggcc gctcgtgcct accgcttcg 29 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ccgcggatcc caccgcgggc ttattccatt ac 32 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gatgggccca tcttaatctc ctagattggg tttc 34 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aattgggccc atgagcgtaa tgtttgatcc t 31 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 aattgcggcc gctcgtcccc acggcctct 29 <210> 37 <211> 3096 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 37 ataaggcgct cgcgccgcat ccggcactgt tgccaaactc cagtgccgca ataatgtcgg 60 atgcgatact 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gcgtccaagc ccggtagatg aagccaaatg gggctttgcc 960 gtagtggaaa acagcctgtg gcaaggcgta ccaaattacc tgcgcgaact gaacgaacaa 1020 ctggaagaga acctcggcta caaactgccc gtcgaatttg ttccggtccg ttttacttcg 1080 tggatgggcg gcgaccgcga cggcaacccg aacgtcactg ccgatatcac ccgccacgtc 1140 ctgctactca gccgctggaa agccaccgat ttgttcctga aagatattca ggtgctggtt 1200 tctgaactgt cgatggttga agcgacccct gaactgctgg cgctggttgg cgaagaaggt 1260 gccgcagaac cgtatcgcta tctgatgaaa aacctgcgtt ctcgcctgat ggcgacacag 1320 gcatggctgg aagcgcgcct gaaaggcgaa gaactgccaa aaccagaagg cctgctgaca 1380 caaaacgaag aactgtggga accgctctac gcttgctacc agtcacttca ggcgtgtggc 1440 atgggtatta tcgccaacgg cgatctgctc gacaccctgc gccgcgtgaa atgtttcggc 1500 gtaccgctgg tccgtattga tatccgtcag gagagcacgc gtcataccga agcgctgggc 1560 gagctgaccc gctacctcgg tatcggcgac tacgaaagct ggtcagaggc cgacaaacag 1620 gcgttcctga tccgcgaact gaactccaaa cgtccgcttc tgccgcgcaa ctggcaacca 1680 agcgccgaaa cgcgcgaagt gctcgatacc tgccaggtga ttgccgaagc accgcaaggc 1740 tccattgccg cctacgtgat ctcgatggcg aaaacgccgt ccgacgtact ggctgtccac 1800 ctgctgctga aagaagcggg tatcgggttt gcgatgccgg ttgctccgct gtttgaaacc 1860 ctcgatgatc tgaacaacgc caacgatgtc atgacccagc tgctcaatat tgactggtat 1920 cgtggcctga ttcagggcaa acagatggtg atgattggct attccgactc agcaaaagat 1980 gcgggagtga tggcagcttc ctgggcgcaa tatcaggcac aggatgcatt aatcaaaacc 2040 tgcgaaaaag cgggtattga gctgacgttg ttccacggtc gcggcggttc cattggtcgc 2100 ggcggcgcac ctgctcatgc ggcgctgctg tcacaaccgc caggaagcct gaaaggcggc 2160 ctgcgcgtaa ccgaacaggg cgagatgatc cgctttaaat atggtctgcc agaaatcacc 2220 gtcagcagcc tgtcgcttta taccggggcg attctggaag ccaacctgct gccaccgccg 2280 gagccgaaag agagctggcg tcgcattatg gatgaactgt cagtcatctc ctgcgatgtc 2340 taccgcggct acgtacgtga aaacaaagat tttgtgcctt acttccgctc cgctacgccg 2400 gaacaagaac tgggcaaact gccgttgggt tcacgtccgg cgaaacgtcg cccaaccggc 2460 ggcgtcgagt cactacgcgc cattccgtgg atcttcgcct ggacgcaaaa ccgtctgatg 2520 ctccccgcct ggctgggtgc aggtacggcg ctgcaaaaag tggtcgaaga cggcaaacag 2580 agcgagctgg aggctatgtg ccgcgattgg ccattcttct cgacgcgtct cggcatgctg 2640 gagatggtct tcgccaaagc agacctgtgg ctggcggaat actatgacca acgcctggta 2700 gacaaagcac tgtggccgtt aggtaaagag ttacgcaacc tgcaagaaga agacatcaaa 2760 gtggtgctgg cgattgccaa cgattcccat ctgatggccg atctgccgtg gattgcagag 2820 tctattcagc tacggaatat ttacaccgac ccgctgaacg tattgcaggc cgagttgctg 2880 caccgctccc gccaggcaga aaaagaaggc caggaaccgg atcctcgcgt cgaacaagcg 2940 ttaatggtca ctattgccgg gattgcggca ggtatgcgta ataccggcta atcttcctct 3000 tctgcaaacc ctcgtgcttt tgcgcgaggg ttttctgaaa tacttctgtt ctaacaccct 3060 cgttttcaat atatttctgt ctgcatttta ttcaaa 3096 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 aagcttctgt aggccggata aggcgctcgc gccgcat 37 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cggatccttt gaataaaatg cagacag 27 <210> 40 <211> 1556 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 40 gtccacctat gttgactaca tcatcaacca gatcgattct gacaacaaac tgggcgtagg 60 ttcagacgac accgttgctg tgggtatcgt 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<213> Artificial Sequence <220> <223> pCPA <400> 43 cccgtcttac tgtcgggaat tcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 60 ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 120 aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 180 gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctt ctgtaggccg 240 gataaggcgc tcgcgccgca tccggcactg ttgccaaact ccagtgccgc aataatgtcg 300 gatgcgatac ttgcgcatct tatccgacct acacctttgg tgttacttgg ggcgattttt 360 taacatttcc ataagttacg cttatttaaa gcgtcgtgaa tttaatgacg taaattcctg 420 ctatttattc gtttgctgaa gcgatttcgc agcatttgac gtcaccgctt ttacgtggct 480 ttataaaaga cgacgaaaag caaagcccga gcatattcgc gccaatgcga cgtgaaggat 540 acagggctat caaacgataa gatggggtgt ctggggtaat atgaacgaac aatattccgc 600 attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga gaaaccatca aggatgcgtt 660 gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag ttgtcgaaat cttcacgcgc 720 tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta caaaatttgt cgaacgacga 780 gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca 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gattctggaa gccaacctgc tgccaccgcc 2520 ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg tcagtcatct cctgcgatgt 2580 ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct tacttccgct ccgctacgcc 2640 ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg gcgaaacgtc gcccaaccgg 2700 cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc tggacgcaaa accgtctgat 2760 gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa gtggtcgaag acggcaaaca 2820 gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc tcgacgcgtc tcggcatgct 2880 ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa tactatgacc aacgcctggt 2940 agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac ctgcaagaag aagacatcaa 3000 agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc gatctgccgt ggattgcaga 3060 gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac gtattgcagg ccgagttgct 3120 gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg gaccctcgcg tcgaacaagc 3180 gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt aataccggct aatcttcctc 3240 ttctgcaaac cctcgtgctt ttgcgcgagg gttttctgaa atacttctgt tctaacaccc 3300 tcgttttcaa tatatttctg tctgcatttt attcaaagga tccgtccacc tatgttgact 3360 acatcatcaa ccagatcgat tctgacaaca aactgggcgt aggttcagac gacaccgttg 3420 ctgtgggtat cgtttaccag ttctaatagc acacctcttt gttaaatgcc gaaaaaacag 3480 gactttggtc ctgttttttt tataccttcc agagcaatct cacgtcttgc aaaaacagcc 3540 tgcgttttca tcagtaatag ttggaatttt gtaaatctcc cgttaccctg atagcggact 3600 tcccttctgt aaccataatg gaacctcgtc atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc 3660 gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac 3720 ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa 3780 aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa accaccaaaa attacctcgg cattgacggc 3840 atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc 3900 aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct 3960 gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg 4020 ccgaaccata agagcgtctt taactctgca ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat 4080 gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag 4140 gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 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Claims

크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래의 퀴놀린산 신타아제(quinolinate synthase) 활성을 가지도록 형질전환된, 퀴놀린산 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는, 퀴놀린산 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 가지는, 퀴놀린산 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 L-아스파르트산 산화효소의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 퀴놀린산 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제(quinolinate phosphoribosyltransferase)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된, 퀴놀린산 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균인 것인, 퀴놀린산 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물.
(a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 미생물, 배지 또는 둘 다에서 퀴놀린산을 수득하는 단계를 포함하는, 퀴놀린산을 생산하는 방법.