KR20160093648A - 케톤을 생산하기 위한 방법 및 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2차 알코올 탈수소효소가 결여되거나 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 포함하는, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아를 제공한다. 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 아세톤을 아이소프로판올로 전환시키고 메틸 에틸 케톤을 2-부탄올로 전환시키는 박테리아의 능력을 감소시키는 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 2차 알코올 탈수소효소가 결여되거나 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 포함하는 박테리아가 카보닐-함유 화합물을 축적시키므로, 본 발명은 카보닐-함유 화합물, 예컨대 아세톤 및 메틸 에틸 케톤을 생산하는 방법을 또한 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 12월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/911,449호(이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)의 이익을 주장한다.
서열 목록
본원은 본 명세서와 동시에 제출되고 하기한 바대로 확인된 뉴클레오타이드/아미노산 서열 목록을 포함한다: 2014년 12월 1일자로 생성된 7,617 바이트의 ASCII(text) 파일명 "LT101PCT_ST25.txt"(이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨).
발명의 기술분야
본 발명은 산업적 발효에 관한 것이다. 특히, 이것은 산업적으로 유용한 용매, 예컨대, 케톤을 생산하기 위한 미생물의 용도에 관한 것이다.
초산생성(acetogenic), 일산화탄소영양(carboxydotrophic) 박테리아, 예컨대 클로스트리듐 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리융달리(Clostridium ljungdahlii) 및 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei)는 아세톤을 아이소프로판올로 전환시키고, 메틸 에틸 케톤(MEK)을 2-부탄올로 전환시킨다. 따라서, 이들 박테리아는 아세톤 및 MEK와 같은 케톤을 소비하여 아이소프로판올 및 2-부탄올과 같은 알코올을 생성한다.
그러나, 케톤 그 자체가 중요한 상업용 제품이다. 아세톤은 메틸 메타크릴레이트(MMA) 및 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)에 대한 산업적 용매 및 전구체이고, 이들은 합쳐서 1년간 약 ＄100억 USD의 시장 가지치를 가진다. 아세톤은 또한 아이소뷰틸렌에 대한 전구체이다(van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012). 아이소뷰틸렌의 시장 가치는 1년간 약 ＄240억 USD로 또한 상당하다. MEK는 페인트 및 잉크의 중요한 성분이고, 이들은 1년간 약 ＄20억 USD의 전세계 시장 가치를 가지고 매년 약 1.9%로 성장한다. MEK는 또한 1,3-뷰타다이엔에 대한 전구체이고, 이것은 1년간 ＄190억 USD를 초과하는 시장 가치를 가지고 매년 약 2.7%로 성장한다. 게다가, 아세톤은 제트 연료의 제조를 위한 전구체이다(Anbarasan, Nature, 491: 235-239, 2012).
따라서, 산업적으로 유용한 용매 및 합성 전구체, 예컨대 아세톤 및 메틸 에틸 케톤(MEK)을 생산하기 위한 개선된 방법에 대한 수요가 여전하다.
본 발명은 2차 알코올 탈수소효소가 결여되거나 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 포함하는, 재조합 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아를 제공한다. 바람직하게는, 박테리아는 클로스트리듐 속의 구성원, 예컨대 클로스트리듐 아우토에타노게눔, 클로스트리듐 리융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이로부터 유래된 박테리아이다. 특정한 실시형태에서, 박테리아는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 아우토에타노게눔으로부터 유래된다.
불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 2차 알코올 탈수소효소 또는 1차-2차 알코올 탈수소효소 활성을 가지는 효소로부터 유래될 수 있다. 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에 의해 코팅될 수 있다. 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자는 2차 알코올 탈수소효소 또는 1차-2차 알코올 탈수소효소 활성을 가지는 효소를 암호화하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 서열 번호 1의 아미노산 서열로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에서, 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 핵산 서열로부터 유래된다. 특히, 불활화 돌연변이는 삽입일 수 있다.
박테리아는 하나 이상의 효소, 예컨대 티올라제, coA-전환효소 또는 아세토아세테이트 탈탄산효소를 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 게다가, 박테리아는 메소-2,3-부탄다이올을 MEK로 전환시키는 프로판다이올 탈수효소, 예컨대 클레브시엘라 옥스토카(Klebsiella oxtoca) 프로판다이올 탈수효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 수 있다.
불활화된 2차 알코올 탈수소효소의 존재는 케톤을 축적시킨다. 따라서, 박테리아는 아세톤 또는 MEK와 같은 케톤을 축적시키거나 생성할 수 있다.
본 발명은 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에 의해 암호화된 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 포함하는 박테리아를 배양하고, 이로써 박테리아가 아세톤 및 MEK 중 하나 이상을 생산함으로써, 아세톤 또는 MEK와 같은 케톤을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 배양물로부터 아세톤 또는 MEK를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 다양한 기질에서의 씨. 아우토에타노게눔 알코올 탈수소효소의 동역학을 보여주는 표이다.
도 2는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에서 인트론 표적 부위(211s, 287a, 388a, 400s, 433s 및 552a) 및 프라이머 결합 부위(156F 및 939R)를 보여주는 유전자 지도이다.
도 3a 내지 도 3c는 II군 인트론 삽입을 확인시켜주는 겔 이미지이다.
도 4는 LZ1561 및 불활화된 2차 알코올 탈수소효소(287a)를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔에 의한 아이소프로판올로의 아세톤의 전환(또는 이의 결여)을 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소(433s, 388a)를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔의 배양물과 비교하여 LZ1561의 배양물의 성장의 4일에 걸쳐 광학 밀도에 의해 측정된 성장(도 5a), 아세톤의 변화(도 5b) 및 아이소프로판올의 변화(도 5c)를 보여주는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는, 기질로서 CO 함유 제강 공장 가스(steel mill gas)에 의해 LZ1561의 안정한 연속 배양물로 공급될 때, 높은 농도 및 속도에서의 아이소프로판올로의 아세톤의 완전한 전환을 보여주는 그래프이다. 공급물 농도는 각각의 그래프 아래에 표시되어 있다.
도 7은 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔의 발효의 11-14일에 아세테이트(삼각형), 에탄올(다이아몬드) 및 바이오매스(정사각형) 농도를 보여주는 그래프이다. 아세톤을 발효기로 11일에 공급하고, MEK를 12일에 공급하였다.
도 8은 HPLC에 의해 검출된 아세톤(삼각형) 및 아이소프로판올(다이아몬드) 농도, 및 1.6의 희석률에서 아세톤에 대한 이론적 세척제거(washout) 곡선(점선)을 보여주는 그래프이다. 불일치는 아세톤의 가스 스트리핑으로 인한 것이다.
도 9는 LZ1561 및 불활화된 2차 알코올 탈수소효소(287a)를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔에 의한 2-부탄올로의 MEK의 전환(또는 이의 결여)을 보여주는 그래프이다.
도 10은 HPLC에 의해 검출된 MEK(삼각형) 및 2-부탄올(다이아몬드), 및 1.6의 희석률에서 MEK에 대한 이론적 세척제거 곡선(점선)을 보여주는 그래프이다. 불일치는 MEK의 가스 스트리핑으로 인한 것이다.
도 11은 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔에서 연속 발효에서 CO로부터의 아세톤의 생성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에서 인트론 표적 부위(211s, 287a, 388a, 400s, 433s 및 552a) 및 프라이머 결합 부위(156F 및 939R)를 보여주는 유전자 지도이다.
도 3a 내지 도 3c는 II군 인트론 삽입을 확인시켜주는 겔 이미지이다.
도 4는 LZ1561 및 불활화된 2차 알코올 탈수소효소(287a)를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔에 의한 아이소프로판올로의 아세톤의 전환(또는 이의 결여)을 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소(433s, 388a)를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔의 배양물과 비교하여 LZ1561의 배양물의 성장의 4일에 걸쳐 광학 밀도에 의해 측정된 성장(도 5a), 아세톤의 변화(도 5b) 및 아이소프로판올의 변화(도 5c)를 보여주는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는, 기질로서 CO 함유 제강 공장 가스(steel mill gas)에 의해 LZ1561의 안정한 연속 배양물로 공급될 때, 높은 농도 및 속도에서의 아이소프로판올로의 아세톤의 완전한 전환을 보여주는 그래프이다. 공급물 농도는 각각의 그래프 아래에 표시되어 있다.
도 7은 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔의 발효의 11-14일에 아세테이트(삼각형), 에탄올(다이아몬드) 및 바이오매스(정사각형) 농도를 보여주는 그래프이다. 아세톤을 발효기로 11일에 공급하고, MEK를 12일에 공급하였다.
도 8은 HPLC에 의해 검출된 아세톤(삼각형) 및 아이소프로판올(다이아몬드) 농도, 및 1.6의 희석률에서 아세톤에 대한 이론적 세척제거(washout) 곡선(점선)을 보여주는 그래프이다. 불일치는 아세톤의 가스 스트리핑으로 인한 것이다.
도 9는 LZ1561 및 불활화된 2차 알코올 탈수소효소(287a)를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔에 의한 2-부탄올로의 MEK의 전환(또는 이의 결여)을 보여주는 그래프이다.
도 10은 HPLC에 의해 검출된 MEK(삼각형) 및 2-부탄올(다이아몬드), 및 1.6의 희석률에서 MEK에 대한 이론적 세척제거 곡선(점선)을 보여주는 그래프이다. 불일치는 MEK의 가스 스트리핑으로 인한 것이다.
도 11은 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔에서 연속 발효에서 CO로부터의 아세톤의 생성을 보여주는 그래프이다.
2차 알코올 탈수소효소는 카보닐-함유 화합물을 알코올로 전환시킨다. 따라서, 2차 알코올 탈수소효소를 함유하는 박테리아는 각각 아세톤 및 MEK와 같은 카보닐-함유 화합물을 아이소프로판올 및 2-부탄올과 같은 알코올로 전환시킬 수 있다. 본 발명은 2차 알코올 탈수소효소가 결여되거나 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 포함하는, 재조합 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아를 제공한다. 특히, 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 불활화 돌연변이는 아세톤을 아이소프로판올로 전환시키고 MEK를 2-부탄올로 전환시키는 박테리아의 능력을 감소시킨다. 이 불활화 돌연변이가 카보닐-함유 화합물을 축적시키므로, 본 발명은 카보닐-함유 화합물, 예컨대 아세톤 및 MEK를 생성하는 방법을 또한 제공한다.
카보닐은 산소 원자에 이중 결합된 탄소 원자로 이루어진 작용기, 예컨대 알데하이드 또는 케톤이다. 카보닐-함유 화합물은 예를 들어 아세토인, 아세톤, 메틸 에틸 케톤(MEK)(즉, 2-부탄온) 및 아세트알데하이드를 포함한다.
알코올은 하이드폭실 작용기가 포화 탄소 원자에 결합된 유기 화합물이다. 알코올은 예를 들어 아이소프로판올 및 2-부탄올을 포함한다.
알코올 탈수소효소(ADH)는 알데하이드 또는 케톤(예컨대, 아세톤)과 알코올(예컨대, 아이소프로판올) 사이의 상호전환을 촉매화하는 효소의 그룹이다. 1차 알코올 탈수소효소는 알데하이드를 1차 알코올로 전환시키거나, 그 반대일 수 있고, 2차 알코올 탈수소효소는 케톤을 2차 알코올로 전환시키거나, 그 반대일 수 있다. 부가적으로, 다수의 알코올 탈수소효소는 알데하이드를 1차 알코올로 전환시키거나, 그 반대일 수 있고, 케톤을 2차 알코올로 전환시키거나, 그 반대일 수 있다. 이 알코올 탈수소효소는 1차-2차 알코올 탈수소효소라 칭해질 수 있는데, 왜냐하면 이것이 1차 알코올 탈수소효소 및 2차 알코올 탈수소효소 둘 다의 활성을 나타내기 때문이다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "알코올 탈수소효소" 및 "2차 알코올 탈수소효소"는 2차 알코올 탈수소효소 및 1차-2차 알코올 탈수소효소 둘 다를 포함한다.
박테리아는 2차 알코올 탈수소효소가 결여될 수 있거나, 2차 알코올 탈수소효소를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 특히, 박테리아는 2차 알코올 탈수소효소가 결여된 씨. 아우토에타노게눔, 씨. 리융달리 또는 씨. 라그스달레이(2차 알코올 탈수소효소를 가지는 것으로 공지된 초산생성 박테리아의 유일한 종임)로부터 유래된 박테리아일 수 있다.
불활화 돌연변이는 2차 알코올 탈수소효소 또는 1차-2차 알코올 탈수소효소와 같은 효소의 활성을 감소시키거나 실질적으로 제거하거나 완전히 제거하는 임의의 돌연변이이다. 불활화 돌연변이는 삽입, 결실, 치환 또는 넌센스 돌연변이, 또는 효소의 활성을 감소시키거나 제거하는 임의의 다른 유형의 돌연변이일 수 있다. 불활화 돌연변이는 박테리아의 효소 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 감소시킬 수 있다. 효소 활성은 효소의 기능을 감소시킴으로써 또는 효소의 양을 감소시킴으로써 감소하거나 제거될 수 있다. 불활화 돌연변이를 도입하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 불활화 돌연변이는 화학 돌연변이유발, 전이인자 돌연변이유발, 바이러스 돌연변이유발 또는 실험실내 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다.
핵산 서열 및 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "유도된"은 모 또는 야생형 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 변형을 의미한다. 예를 들어, 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, 불활화 돌연변이를 포함하지 않는, 각각 모 또는 야생형 핵산 서열 또는 아미노산 서열로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 2차 알코올 탈수소효소로부터 유래된다. 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3을 포함하는 핵산 서열로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 서열이 본 명세서에 구체적으로 예시된 서열과 다른 핵산을 사용하여 실행될 수 있고, 단 핵산은 실질적으로 동일한 기능을 수행한다. 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 경우, 이것은 암호화된 단백질 또는 펩타이드가 실질적으로 동일한 기능을 수행한다는 것을 의미한다. 프로모터의 핵산 서열의 경우, 변이체 서열은 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 능력을 가질 것이다. 이러한 핵산은 "기능적으로 동등한 변이체"라 칭해질 수 있다. 예로서, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자의 단편, 다형 등을 포함한다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자는 본 명세서에 구체적으로 예시된 서열의 기능적으로 동등한 변이체의 예이다. 이것은 씨. 아우토에타노게눔, 씨. 리융달리, 씨. 라그스달레이 또는 씨. 노비이(C. novyi)와 같은 종(이에 대한 서열 정보는 GenBank 또는 NCBI와 같은 웹사이트로부터 공개적으로 입수 가능)에서의 상동성 유전자를 포함한다. 구절 "기능적으로 동등한 변이체"는 또한 특정한 유기체에 대한 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변하는 핵산을 포함한다. 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 확인된 핵산과 적어도 대략 70%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 이것 초과의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
부가적으로, 본 발명은 서열이 본 명세서에 구체적으로 예시된 서열과 다른 효소 또는 단백질을 사용하여 실행될 수 있고, 단 효소 또는 단백질은 실질적으로 동일한 기능을 수행한다. 이 변이체는 "기능적으로 동등한 변이체"라 칭해질 수 있다. 단백질 또는 펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체는 확인된 단백질 또는 펩타이드와 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 이것 초과의 아미노산 동일성을 공유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 변이체는 단백질 또는 펩타이드의 단편을 포함하고, 단편은 폴리펩타이드의 절두된 형태를 포함하고, 결실은 1개 내지 5개, 10개, 15개, 20개, 25개의 아미노산일 수 있다. 결실은 폴리펩타이드의 양 말단에서 1번 내지 25번의 잔기로부터 연장될 수 있거나, 구역 내의 임의의 길이일 수 있거나, 단백질의 내부 위치 또는 특정한 도메인에 있어서, 기질 또는 보인자의 활성 또는 결합 및 특정한 촉매 기능을 부여할 수 있다. 특정한 효소 또는 단백질의 기능적으로 동등한 변이체는, 예를 들어 이전 문단에 예시된 바대로, 박테리아의 다른 종에서 상동성 유전자에 의해 발현된 폴리펩타이드를 또한 포함한다.
본 발명의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 외인성 또는 내인성일 수 있다. 일 실시형태에서, 외인성 핵산은 미생물에 의해 천연으로 생성되지 않은 유전자를 발현하거나 미생물에 의해 천연으로 생성된 유전자를 과발현하도록 도입된다. 부가적으로, 외인성 핵산은 유전자의 카피수를 증가시키거나, 강한 또는 구성적 프로모터를 도입하거나, 조절 요소를 도입할 수 있다. 외인성 핵산은 미생물의 게놈으로 통합될 수 있거나, 염색체외 상태로 남을 수 있다.
재조합 핵산, 단백질 또는 미생물은, 함께 연결된, 상이한 개체, 상이한 종 또는 상이한 속의 일부를 함유한다. 통상적으로, 이것은 재조합 DNA의 기법을 이용하여 수행되어서, 복합 핵산이 형성된다. 복합 핵산은 예를 들어 복합 단백질을 만들기 위해 사용될 수 있다. 이것은 융합 단백질을 만들기 위해 사용될 수 있다. 복합 핵산을 유지하고 복제하고, 단백질, 선택적으로 복합 단백질을 발현하는 미생물을 형질전환시키도록 이것이 사용될 수 있다. 본 발명의 박테리아는 재조합, 즉 비야생형이다.
입체특이적 효소는 거울상이성질체를 다르게 인식하고 거울상이성질체와의 상이한 반응을 촉매화한다. 따라서, 오직 하나의 거울상이성질체가 반응할 수 있거나, 각각의 거울상이성질체는 구별되는 생성물을 생성할 수 있다.
"약독화된 발현"은 모 미생물에서의 발현에 대해 감소한 핵산 또는 단백질의 발현을 의미한다. 약독화된 발현은 또한, 전혀 발현되지 않는 핵산 또는 단백질을 의미하는, "0"의 발현을 포함한다. "0"의 발현은 RNA 침묵, 발현 과정의 변형(예를 들어, 프로모터 기능의 파괴), 또는 게놈으로부터의 효소를 암호화하는 핵산의 완전 또는 부분 제거(넉아웃)를 포함하는, 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
용어 핵산 "작제물" 또는 "벡터" 및 유사한 용어는 유전 물질을 세포로 전달하도록 비히클로서 사용하기에 적합한 임의의 핵산(DNA 및 RNA 포함)을 포함하도록 광범위하게 취해져야 한다. 상기 용어는 플라스미드, 바이러스(박테리오파지 포함), 코스미드(cosmid) 및 인공 염색체를 포함하도록 취해져야 한다. 작제물 또는 벡터는 하나 이상의 조절 요소, 복제 기원, 다중클로닝 부위 및/또는 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 작제물 또는 벡터는 작제물 또는 벡터에 의해 암호화된 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하도록 채택될 수 있다. 핵산 작제물 또는 벡터는 네이키드 핵산, 및 세포로의 전달을 수월하게 하는 하나 이상의 물질과 제제화된 핵산(예를 들어, 리포솜 접합 핵산)을 포함한다.
외인성 핵산은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 박테리아로 도입될 수 있다. 예를 들어, 형질전환(형질도입 또는 형질감염 포함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글라이콜 매개 형질전환, 화학 또는 천연 능력, 프로토플라스트 형질전환, 프로파지 유도 또는 접합(예를 들어 문헌[Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989] 참조)에 의해 달성될 수 있다.
전기천공의 사용은 씨. 리융달리(Kopke, PNAS, 107:13087-13092, 2010; WO/2012/053905), 씨. 아우토에타노게눔(WO/2012/053905), 씨. 아세티쿰(C. aceticum)(Schiel-Bengelsdorf, Synthetic Biol, 15: 2191-2198, 2012) 및 에이. 우디(A. woodii)(
, Appl Environ Microbiol, 60: 1033-1037, 1994)를 포함하는 몇몇 일산화탄소영양 아세토젠에 대해 보고되어 있다. 전기천공의 사용은 씨. 아세토뷰틸리쿰(C. acetobutylicum)(Mermelstein, Biotechnol, 10: 190-195, 1992) 및 씨. 셀룰롤리티쿰(C. cellulolyticum)(Jennert, Microbiol, 146: 3071-3080, 2000)을 포함하는 클로스트리디아에서 또한 보고되어 있다. 부가적으로, 프로파지 유도는 씨. 스카톨로게네스(C. scatologenes)를 포함하는 일산화탄소영양 아세토젠에 대해 입증되었고(Parthasarathy, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project, Western Kentucky University, 2010), 접합은 씨. 디피실(C. difficile)(Herbert, FEMS Microbiol Lett, 229: 103-110, 2003) 및 씨. 아세토뷰틸리쿰(Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826, 1990)을 포함하는 많은 클로스트리디아에 대해 기재되어 있다. 일산화탄소영양 아세토젠에서 유사한 방법을 사용할 수 있다.
숙주 미생물에서 소정의 제한 시스템이 활성인 경우 외인성 핵산의 메틸화가 필요할 수 있다.
셔틀 미생물은 메틸전환효소 효소가 발현되고 목적 미생물과 구별되는 미생물일 수 있다. 셔틀 미생물은 유전적으로 조작된 핵산에 합성 후 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있고, 이것은 최종 숙주 유기체에서 유전적으로 조작된 핵산을 보호할 것이다. 목적 미생물은 반대로 발현 작제물/벡터에 포함된 유전자가 발현되고 셔틀 미생물과 구별되는 미생물이다.
박테리아는 임의의 재조합, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아일 수 있다. "재조합"은 야생형 또는 모 미생물로부터 유전적으로 변형된 미생물을 의미한다. "일산화탄소영양(carboxydotroph)"은 높은 농도의 일산화탄소를 견딜 수 있는 미생물, 바람직하게는 박테리아를 의미한다. "아세토젠(acetogen)"은 혐기성 발효의 생성물로서 아세테이트/아세트산을 천연으로 생성하는 미생물, 바람직하게는 박테리아를 의미한다.
특히, 박테리아는 클로스트리듐 속에 속할 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 아세토뷰틸리쿰, 클로스트리듐 아우토에타노게눔, 클로스트리듐 베이예린키(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 뷰틸리쿰, 클로스트리듐 카복시도비란스(Clostridium carboxidovirans), 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰, 클로스트리듐 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans), 클로스트리듐 디피실, 클로스트리듐 디올리스(Clostridium diolis), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 리융달리, 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리듐 노비이, 클로스트리듐 파스테리아늄(Clostridium pasterianium), 클로스트리듐 피토페르멘탄스(Clostridium phytofermentans), 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 사카르뷰틸리쿰(Clostridium saccharbutyricum), 클로스트리듐 사카로퍼뷰틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum), 또는 이로부터 유래된 박테리아일 수 있다. 박테리아는 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아는 클로스트리듐 아우토에타노게눔, 클로스트리듐 리융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이로부터 유래될 수 있다. 박테리아는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 DSM10061, 클로스트리듐 아우토에타노게눔 DSM23693(LZ1561, 클로스트리듐 아우토에타노게눔 DSM10061의 유도체) 또는 클로스트리듐 리융달리 DSM13528로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아는 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 DSM23693이다.
다른 박테리아를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 아세토박테륨(Acetobacterium), 알칼리게네스(Alkaligenes), 바실러스(Bacillus), 브레비박테륨(Brevibacterium), 칸디다(Candida), 코리네박테륨(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 에스체리치아(Escherichia), 한세눌라(Hansenula), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 파에니바실러스(Paenibacillus), 피치아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 살모넬라(Salmonella), 트리초데르마(Trichoderma) 또는 지모모나스(Zymomonas)의 속에 속할 수 있다. 특히, 박테리아는 아세토박테륨 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바치(Alkalibaculum bacchii), 바실러스 리헤니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 뷰티리박테륨 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 유박테륨 리모숨(Eubacterium limosum), 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 모렐라 써르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 모렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 프페니기(Oxobacter pfennigii), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 써모아나에로박터 키우브(Thermoanaerobacter kiuv), 트리초데르마 레세이(Trichoderma reesei), 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 또는 이로부터 유래된 박테리아일 수 있다.
미생물(예를 들어, 박테리아)과 관련하여, 용어 "유래된"은 모 또는 야생형 미생물의 변형을 의미한다. 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 박테리아는 불활화 돌연변이를 포함하지 않는 2차 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 모 또는 야생형 박테리아, 또는 2차 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 모 또는 야생형 박테리아로부터 유래될 수 있다. 박테리아는 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 인공 또는 천연 선택, 돌연변이, 또는 유전적 재조합을 이용하여 모 또는 야생형 박테리아로부터 유래될 수 있다. 모 미생물은 이전에 변형되었지만, 본 발명의 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하지 않는 유기체(예를 들어, LZ1561)일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아는 클로스트리듐 아우토에타노게눔, 클로스트리듐 리융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이로부터 유래된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 박테리아는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 박테리아(즉, LZ1561)로부터 유래된다.
박테리아는 단리될 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 이의 천연 환경, 2개 이상의 미생물을 포함하는 배양물 또는 단일 미생물의 불균일한 (유전적으로 비동일한) 집단을 포함하는 배양물로부터 물리적으로 단리될 수 있다. 단일 박테리아로부터 성장한 콜로니 또는 배양물은 또한 단리되는 것으로 생각된다.
박테리아는 카보닐-함유 화합물, 예컨대 알데하이드 또는 케톤을 만들기 위해 생합성 경로에서 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 생합성 경로는 박테리아에 내인성, 부분적으로 내인성 또는 전체적으로 외인성일 수 있다. 생합성 경로는 예를 들어 외인성 효소 또는 다른 종 또는 속으로부터 유래된 효소를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 외인성 효소는 그 박테리아에 천연으로 존재하지 않는 생합성 경로를 형성하기 위해 내인성 효소와 협력하여 작용할 수 있다. 예를 들어, 아세톤의 생산은 아세톤을 천연으로 생성하지 않는 미생물에서 입증되었다(WO/2012/115527). 티올라제, coA-전환효소 및 아세토아세테이트 탈탄산효소와 같은 효소를 암호화하는 유전자를 박테리아에 첨가하여, 박테리아가 아세톤을 만들게 할 수 있다. 부가적으로, 또는 대안적으로, 외인성 프로판다이올 탈수효소를 박테리아에 첨가하여, 박테리아가 메소-2,3-부탄다이올을 2-부탄온(MEK)으로 전환하게 할 수 있다. 외인성 프로판다이올 탈수효소는 클레브시엘라 옥스토카로부터 유래될 수 있다.
가스 발효는 에탄올 또는 다른 생성물 또는 화학물질의 제조를 위해 가스 기질이 탄소원 및/또는 에너지원으로서 사용되는 대사 과정이다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "발효"는 이 과정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 다를 포함한다. 가스 발효는 미생물, 통상적으로 박테리아에 의해 수행된다.
박테리아 배양물은 배양물에 충분한 자원을 제공하는 임의의 액체 영양소 배지에서 성장할 수 있다. 액체 영양소 배지는 예를 들어 비타민, 미네랄 및 물을 함유할 수 있다. 에탄올 또는 다른 생성물의 발효에 적합한 혐기성 배지를 포함하는, 적합한 액체 영양소 배지의 예가 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 5,173,429, 미국 특허 5,593,886 및 WO 2002/08438 참조).
박테리아 배양물은 반응기(생물반응기)에 함유될 수 있다. 반응기는 박테리아 배양물의 성장을 위한 하나 이상의 용기 및/또는 탑 또는 배관 배열을 가지는 임의의 발효 장치일 수 있다. 반응기는 예를 들어 고정 셀 반응기, 가스-리프트 반응기, 버블 칼럼 반응기(bubble column reactor: BCR), 순환 루프 반응기, 막 반응기, 예컨대 중공 섬유 막 생물반응기(hollow fibre membrane bioreactor: HFM BR), 연속 흐름 교반 탱크 반응기(continuous flow stirred-tank reactor: CSTR) 또는 삼상층 반응기(trickle bed reactor: TBR)일 수 있다. 반응기는 CO, CO2 및/또는 H2를 포함하는 가스 기질을 수용하도록 바람직하게 적합화된다. 반응기는 병렬 또는 직렬의 다수의 반응기(단)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응기는 박테리아가 배양되는 제1 성장 반응기 및 성장 반응기로부터의 발효 브로쓰가 공급될 수 있고, 발효 생성물의 대부분이 생성될 수 있는 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다.
발효는 바람직하게는 카보닐-함유 화합물이 생성되는 적절한 발효 하에 수행되어야 한다. 고려되어야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, (연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우) 교반 속도, 접종원 수준, 액상 중의 CO가 제한이 되지 않게 보장하는 최대 가스 기질 농도, 및 생성물 저해를 피하기 위한 최대 생성물 농도를 포함한다.
용어 "효율을 증가시킨다", "효율의 증가" 및 기타 등등은, 발효 과정과 관련하여 사용될 때, 발효의 다른 부산물과 비교하여, 상승한 생성물 농도에서 발효, 성장 및/또는 생성물 생산 속도를 촉매하는 미생물의 성장 속도, 소모된 기질의 용적당 생성된 원하는 생성물의 용적, 원하는 생성물의 생산 속도 또는 생산 수준, 및 생산된 원하는 생성물의 상대 비율 중 하나 이상을 증가시키는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
가스 기질("가스" 또는 "공급 가스" 또는 "발효 가스" 또는 "기질")은 발효에서 탄소원 및/또는 에너지원으로서 미생물에 의해 사용되는 화합물 또는 요소를 함유하는 임의의 가스일 수 있다. 가스 기질은 통상적으로 상당한 비율의 H2, CO2 및/또는 CO를 함유할 것이고, N2 또는 다른 가스를 부가적으로 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 가스 기질은 CO를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 가스 기질은 H2, CO2 및 CO를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 가스 기질은 O2가 없거나 실질적으로 없다.
가스 기질의 정확한 조성은 변할 수 있다. 가스 기질은 예를 들어 약 20용적% 내지 약 100용적%의 CO, 약 20용적% 내지 70용적%의 CO, 약 30용적% 내지 60용적%의 CO, 또는 약 40용적% 내지 55용적%의 CO를 함유할 수 있다. 특히, 가스 기질은 약 25용적%, 약 30용적%, 약 35용적%, 약 40용적%, 약 45용적%, 약 50용적%의 CO, 약 55용적%의 CO, 또는 약 60용적%의 CO를 함유할 수 있다. 가스 기질은 예를 들어 약 1용적% 내지 80용적%의 CO2 또는 약 1용적% 내지 30용적%의 CO2를 함유할 수 있다. 가스 기질은 예를 들어 약 20% 미만의 CO2, 약 15% 미만의 CO2, 약 10% 미만의 CO2, 약 5% 미만의 CO2, 또는 약 0%(실질적으로 무)의 CO2를 함유할 수 있다. 가스 기질이 H2를 함유하는 것이 필요하지 않지만, H2의 존재는 원하는 생성물 생산의 전체 효율을 개선할 수 있다. 가스 기질은 예를 들어 2:1, 1:1 또는 1:2 비율의 H2:CO를 포함할 수 있다. 가스 기질은 예를 들어 약 30용적% 미만의 H2, 약 20용적% 미만의 H2, 약 15용적% 미만의 H2, 또는 약 10용적% 미만의 H2를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 가스 기질은 낮은 농도의 H2, 예를 들어 약 5용적% 미만의 H2, 약 4용적% 미만의 H2, 약 3용적% 미만의 H2, 약 2용적% 미만의 H2, 약 1용적% 미만의 H2, 또는 약 0용적%(실질적으로 무)의 H2를 포함할 수 있다.
또한, CO가 기질일 때 발효 반응의 효율을 증가시키기 위해 기질 스트림의 CO 농도(또는 가스 기질 중의 CO 분압)를 증가시키는 것이 대개 바람직하다. 증가한 압력에서의 조작은 기상으로부터 액상(여기서, 이것은 미생물에 의해 흡수될 수 있음)으로의 CO 전달의 속도가 상당히 증가하게 한다. 이는 결국, 생물반응기 내의 액체 용적을 유입 가스 유속으로 나눈 것으로 정의되는, 보유 시간을 감소시킨다. 최적 반응 조건은 사용된 특정한 미생물에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로, 상압보다 높은 압력에서 발효를 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 소정의 CO 전환율이 부분적으로 기질 보유 시간의 함수이고 원하는 보유 시간을 달성하는 것이 생물반응기의 필요한 용적을 좌우하므로, 가압 시스템의 사용은 필요한 생물반응기의 용적 및 결과적으로 발효 설비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. US 5,593,886에 제공된 예에 따라, 반응기 용적은 반응기 조작 압력의 증가에 선형 비례로 감소할 수 있다. 예를 들어, 10atm 압력에서 조작되는 생물반응기는 단지 1atm 압력에서 조작되는 것의 용적의 1/10일 필요가 있다.
발효 반응에 공급하기 위해 사용된 가스 스트림의 조성은 발효 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, O2의 존재는 혐기성 발효 과정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전에 또는 후에 발효 과정의 단계에서 원치 않거나 필요하지 않은 가스의 프로세싱은 단계의 에너지 부담을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 가스 스트림이 생물반응기에 진입하기 전에 압축되는 경우, 발효에서 필요하지 않은 가스를 압축하기 위해 에너지를 사용할 수 있다.
가스 기질은 산업 과정으로부터 공급될 수 있다. 특히, 가스 기질은 산업 과정, 예컨대 철 금속 제품 제조(예를 들어, 강 제조), 비철 제품 제조, 석유 정제, 석탄 기화, 전력 생성, 카본 블랙 제조, 암모니아 제조, 메탄올 제조, 또는 코크스 제조에 의해 생성된 폐가스일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 가스 기질은 강 제조 가스로부터 유래된다.
가스 기질은 유기물, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 석탄, 천연 가스, 원유, 정유 공장으로부터의 저가치 잔유(석유 코크스 또는 페트코크(petcoke) 포함), 고체 도시 폐기물 또는 바이오매스의 기화로부터 공급될 수 있다. 바이오매스는 식품의 추출 및 처리 동안 얻은 부산물, 예컨대 사탕수수로부터의 당, 또는 옥수수 또는 곡물로부터의 전분, 또는 임업에 의해 생성된 비식품 바이오매스 폐기물을 포함한다. 임의의 이 탄소질 재료는 기화되어, 즉 부분적으로 산소에 의해 연소하여, 합성 가스(합성가스)를 생성할 수 있다. 합성가스는 통상적으로 주로 CO, H2 및/또는 CO2를 포함하고, 메탄, 에틸렌, 에탄, 또는 다른 가스의 양을 부가적으로 함유할 수 있다. 기화기의 조작 조건은 조정되어서, 발효 공정에서 증가한 알코올 생산성 및/또는 전체 탄소 포획을 위해 최적화되거나 원하는 조성을 제공하기 위해, 하나 이상의 다른 스트림과의 블렌딩 또는 발효에 대해 원하는 조성을 가지는 기질 스트림을 제공할 수 있다.
가스 기질을 화학적 또는 물리적 불순물 또는 오염물질을 제거하기 위해 발효에서 사용하기 전에, 이것을 여과시키거나, 스크럽하거나, 그렇지 않으면 전처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 공급원 가스를 물을 통해 통과시키거나, 그렇지 않으면 여과시켜서 미립자 물질, 장쇄 탄화수소 또는 타르를 제거할 수 있다. 그러나, 이러한 여과 또는 전처리가 항상 필요한 것은 아니다. 여과되지 않은 전처리되지 않은 가스 기질을 발효 배양물로 직접적으로 제공하는 것이 때때로 가능하다.
가스 기질이 통상적으로 가스의 형태로 제공되지만, 용어 "가스 기질"은 교대하는 형태로 제공되는 CO, CO2 및/또는 H2를 포함하는 기질을 또한 포함한다. 예를 들어, CO를 함유하는 가스 기질은 액체 중에 용해된 채 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 CO 함유 가스에 의해 포화되고, 이후 생물반응기에 첨가될 수 있다. 예시적인 방법은 마이크로버블 분산액 생성기(Hensirisak, Appl Biochem Biotechnol , 101: 211-227, 2002) 및 고체 지지체로의 가스 기질의 흡착의 사용을 포함한다.
본 발명은 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에 의해 암호화된 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 포함하는 박테리아를 배양하고, 이로써 박테리아가 아세톤 및 MEK 중 하나 이상을 생산함으로써, 아세톤 또는 MEK와 같은 케톤을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 배양물로부터 아세톤 또는 MEK를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 임의의 방식으로 이의 범위를 제한하도록 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
이 실시예는 일반 재료 및 방법을 기재한다.
미생물 및 성장 조건
씨. 아우토에타노게눔 DSM10061 및 DSM23693(DSM10061의 유도체) 및 씨. 리융달리 DSM13528은 DSMZ(독일 미생물 및 세포 배양물 수집(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(독일 브라운슈바이크 38124 인호펜슈트라쎄 7 B))로부터 공급된다. 씨. 라그스달레이 ATCC BAA-622는 ATCC(미국 배양물 유형 수집(American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 20108 매너서스))로부터 공급되고, 이. 콜라이 DH5α는 인비트로겐(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 92008 칼스바드)으로부터 공급된다.
1.0ℓ의 배지당 10g의 트립톤, 5g의 효모 추출물 및 10g의 NaCl을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 배지 중에 37℃에서 호기성 조건 하에 이. 콜라이를 성장시켰다. 고체 배지는 1.5%의 한천을 함유하였다.
클로스트리듐 균주를 표준 혐기성 기법(Hungate, In: Methods in Microbiology, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microb Physiol, 6: 107-146, 1971)을 이용하여 pH 5.6에서 PETC 매질 중에 37℃에서 성장시켰다. 헤드스페이스 중의 30psi의 CO 함유 제강 공장 가스(뉴질랜드 스틸(New Zealand Steel) 부지(뉴질랜드 글렌브룩)로부터 수집, NZ; 조성: 44%의 CO, 32%의 N2, 22%의 CO2, 2%의 H2)(독립영양 성장) 또는 프럭토스(종속영양 성장)를 기질로서 사용하였다. 고체 배지의 경우, 1.2%의 박토 한천(BD, 미국 뉴저지주 07417 플랭클린 레이크스)을 첨가하였다.
단독 에너지원 및 탄소원으로서 CO 함유 제강 공장 가스를 사용하여 1.5ℓ의 생물반응기 내에서 37℃에서 씨. 아우토에타노게눔 DSM23693에 의한 발효를 수행하였다. MgCl, CaCl2(0.5mM), KCl(2mM), H3PO4(5mM), Fe(100μM), Ni, Zn(5μM), Mn, B, W, Mo, Se(2μM)를 함유하는 한정 배지를 준비하였다. 배지를 생물반응기로 옮기고, 121℃에서 45분 동안 오토클레이빙하였다. 오토클레이빙 후, 배지를 티아민, 판토테네이트(0.05㎎/ℓ), 바이오틴(0.02㎎/ℓ)을 보충하고, 3mM 시스테인-HCl에 의해 환원시켰다. 반응기 용기를 0.2㎛ 필터를 통해 질소에 의해 스파징하여 혐기성 조건을 달성하였다. 접종 전에, 가스를 CO 함유 제강 공장 가스로 전환하고, 반응기로 연속하여 공급하였다. 가스 흐름을 초기에 80㎖/분으로 설정하고, 교반을 200rpm으로부터 350rpm으로 증가시키면서, 중간 지수기 동안 200㎖/분으로 증가시켰다. Na2S를 0.25㎖/시간으로 생물반응기로 투입하였다. OD600이 0.5에 도달하면, 생물반응기를 1.0㎖/분의 속도(0.96 d-1의 희석률)로 연속 모드로 전환시켰다. 샘플을 바이오매스 및 대사물질을 측정하기 위해 취하고, 유입 및 유출 가스를 분석하였다.
대사물질 분석
2개의 채널이 설치된 배리언(Varian) CP-4900 마이크로 GC에서 헤드스페이스의 가스 조성을 측정하였다. 채널 1은 70℃, 200kPa의 아르곤 및 4.2초의 역수세 시간에서 실행되는 10m Mol-체 칼럼인 반면, 채널 2는 90℃, 150kPa의 헬륨 및 비역수세에서 실행되는 10m PPQ 칼럼이다. 채널 둘 다에 대한 주입기 온도는 70℃였다. 실행시간을 120초로 설정하였지만, 관심 있는 모든 피크는 보통 100초 전에 용리할 것이다.
35℃에서 조작되는 RID(굴절률 검출기) 및 60℃에서 유지되는 알테크(Alltech) IOA-2000 유기산 칼럼(150 x 6.5㎜, 입자 크기 5㎛)이 구비된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 대사물질 최종 생성물의 HPLC 분석을 수행하였다. 0.7㎖/분의 유속으로 이동상으로서 약간 산성인 물을 사용하였다(0.005M H2SO4). 단백질 및 다른 세포 잔류물을 제거하기 위해, 400㎕의 샘플을 100㎕의 2 %(w/v) 5-설포살리실산과 혼합하고, 14,000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 침전된 잔류물을 분리하였다. 이후, 분석을 위해 10㎕의 상청액을 HPLC로 주입하였다.
수펠코(Supelco) PDMS 100 1㎝ 섬유, 알테크 EC-1000(30m x 0.25㎜ x 0.25㎛) 칼럼 및 화염 이온화 검출기(FID)가 구비된 애질런트 6890N 헤드스페이스 GC를 사용하여 대사물질 최종 생성물의 GC 분석을 수행하였다. 5㎖의 샘플을 Hungate 관으로 옮기고, 수욕 내에서 40℃로 가열하고, 정확히 5분 동안 섬유에 노출시켰다. 주입기를 250℃에서 유지시켰다. 헬륨을 운반 가스로서 사용하고, 1㎖/분의 일정한 유속에서 유지시켰다. 오븐을 40℃에서 5분 동안 실행하고, 이어서 200℃까지 10℃/분으로 증가시켰다. 이후, 온도를 50℃/분의 속도로 220℃로 더 증가시키고, 이어서 이 온도에서 5분 동안 유지시켰다. 이후, 온도를 50℃/분의 속도로 40℃로 감소시키고, 이어서 이 온도에서 1분 동안 유지시켰다. FID를 구성 가스로서 40㎖/분의 수소, 450㎖/분의 공기 및 15㎖/분의 질소에 의해 250℃에서 유지시켰다.
실시예 2
이 실시예는 씨. 아우토에타노게눔, 씨. 리융달리 및 씨. 라그스달레이에서 아세톤의 아이소프로판올로의 환원 및 MEK의 2-부탄올로의 환원을 담당하는 2차 알코올 탈수소효소의 확인을 입증한다.
아이소프로판올로의 아세톤의 전환은 일산화탄소영양 박테리아, 예컨대 씨. 아우토에타노게눔(WO 2012/115527), 씨. 리융달리(WO 2012/115527) 및 씨. 라그스달레이(WO 2012/115527)(Ramachandriya, Biotechnol Bioeng, 108: 2330-2338, 2011)에 기재되어 있다. 씨. 베이예린키(Ismaiel, J Bacteriol, 175: 5097-5105, 1993)로부터의 효소와 유사성을 가지는 2차 알코올 탈수소효소(ADH; EC 1.1.1.2)가 또한 확인되었다(WO 2012/115527).
씨. 아우토에타노게눔은 서열 번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화된 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2차 알코올 탈수소효소를 포함한다. 씨. 리융달리는 씨. 리융달리 게놈(NCBI NC_014328.1:2755565..2756620, 유전자 번호 9446102, 좌위 태그 CLJU-c24860) 내에 2차 알코올 탈수소효소 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 서열 번호 1(NCBI YP_003780646.1)의 아미노산 서열을 가지는 2차 알코올 탈수소효소를 포함한다. 씨. 라그스달레이는 서열 번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2차 알코올 탈수소효소를 포함한다.
이 2차 알코올 탈수소효소 효소가 아이소프로판올로의 아세톤의 전환을 담당한다는 것을 입증하기 위해, 씨. 아우토에타노게눔의 2차 알코올 탈수소효소를 이. 콜라이에서 과생성하고, 이의 활성을 측정하였다. 서열 번호 2는 WO 2012/115527에 기재된 바대로 단리된 씨. 아우토에타노게눔의 게놈으로부터 증폭되고, KpnI 및 HindIII을 통해 pBAD 벡터(인비트로겐)로 클로닝되고, Sambrook에 기재된 바대로 표준 방법을 이용하여 전기천공에 의해 이. 콜라이로 형질전환되었다. ADH 유전자의 서열은 DNA 서열분석에 의해 검증되었다. 0.8의 OD600이 도달될 때까지 형질전환된 세포를 37℃에서 암피실린을 가지는 100㎖의 LB 중에 성장시켰다. 이 시점에, 1㎖의 20% 아라비노스를 첨가하고, 발현의 나머지를 위해 배양물을 28℃에서 항온처리하였다. 세포를 펠렛화하고, 상청액을 경사여과시켰다. 이후, 펠렛을 HEPES 완충제(50mM Na-HEPES 및 0.2mM DTT, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, 0.2㎕의 각각의 벤조나제(BENZONASE)(상표명)(머크(Merck), 25단위/㎕) 및 라이소자임(머크, 30kU/㎕)을 첨가하였다. 이후, 부동화된 금속 친화도 크로마토그래피를 사용하여 융합된 N 말단 His6tag를 통해 2차 알코올 탈수소효소를 정제하였다. 얼음에서 30분 항온처리 후, 세포를 음파처리에 의해 용해시키고, 불용성 조각을 펠렛화하고, 상청액을 0.2 마이크론 필터를 사용하여 깨끗하게 하였다. 깨끗해진 상청액을 용해 완충제에 의해 완전히 세척된 타론(TALON)(상표명) 수지(클론테크(Clontech))에 첨가하였다. 500㎕의 베드 용적을 정제에 사용하고, 단백질을 4℃에서 1시간 동안 타론(상표명) 수지에 결합하게 하고, 이후 용해 완충제에 의해 수회 세척하였다. 단백질을 150mM 이미다졸이 보충된 용해 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 용리시키고, 용리물을 500㎕의 분획으로 수집하였다. 정제 과정을 통해 취한 분취량, 및 모든 용리 분획을 SDS PAGE 겔에서 실행하여서, 단백질의 존재를 확인하고, 정제의 성공을 결정하였다. 단백질을 아미콘(AMICON)(상표명) 울트라-4 원심분리 필터 유닛츠(밀리포어(Millipore))를 사용하여 저장 완충제(50mM 인산칼륨, 150mM NaCl, 10% v/v 글라이세롤, pH 7.0)로 교환하였다. 단백질은 이. 콜라이에서 발현될 때 매우 가용성이고, 용이하게 정제될 수 있었다. 기질로서 0.2mM 및 3mM MEK의 농도에서 보인자로서 NADPH를 사용하여 석영 큐벳을 가지는 UV/vis 분광광도계에서 활성 검정을 수행하였다. 검정 혼합물은 1mM DTT와 함께 50mM 트리스-HCl 완충제(pH 7.5)를 함유하였다. 씨. 아우토에타노게눔의 2차 알코올 탈수소효소는 아이소프로판올로의 아세톤의 환원에 대한 활성을 나타냈다. 또한, 2-부탄올로의 MEK의 환원, 2,3-부탄다이올로의 아세토인의 환원, 및 에탄올로의 아세트알데하이드의 환원에 대한 활성이 확인되었다. 최고 활성은 아세톤, 이어서 MEK에 의해 확인되었다(도 1).
2차 알코올 탈수소효소 이외에, 아이소프로판올에 대한 활성을 가지는 2개의 부탄올 탈수소효소(BDH) 효소가 기재되어 있다(Tan, J Basic Microbiol, 54: 996-1004, 2013). 이 부탄올 탈수소효소는 씨. 아우토에타노게눔 및 씨. 라그스달레이에 또한 존재한다.
실시예 3
이 실시예는 씨. 아우토에타노게눔에서 2차 알코올 탈수소효소의 불활성화를 입증한다.
씨. 아우토에타노게눔(서열 번호 2)의 확인된 2차 알코올 탈수소효소를 클로스트론(ClosTron) 시스템을 사용하여 불활화하였다(Heap, J Microbiol Meth, 70: 452-464, 2007). 클로스트론 웹사이트에 호스팅된 인트론 설계 도구를 사용하여 344bp 표적화 구역(서열 번호 4)을 설계할 뿐만 아니라, 센스 및 안티센스 가닥에서 6개의 표적 부위(도 2)를 확인하였다. 표적화 구역을 레트로-트랜스플랜트 활성화 ermB 마커(RAM)를 함유하는 벡터 pMTL007C-E2로 화학적으로 합성하였다.
벡터를 WO 2012/053905에 기재된 바대로 씨. 아우토에타노게눔으로 도입하였다. 15㎍/㎖의 티암페니콜을 가지는 PETC MES에서 성장한 단일 콜로니를 5㎍/㎖의 클라로쓰로마이신을 가지는 PETC MES에서 스트리킹(streaking)하였다. 각각의 표적으로부터의 콜로니를 무작위로 선별하고, 플랭킹 프라이머 155F(서열 번호 5) 및 939R(서열 번호 6)을 사용하여 삽입에 대해 스크리닝하였다. 인트론 맥시머(iNtron Maxime) PCR 프리믹스를 사용하여 증폭을 수행하였다. 783bp의 PCR 생성물은 LZ1561 유전자형을 나타내지만, 대략 2.6kb의 생성물 크기는 표적 부위에서 II군 인트론의 삽입을 제시하였다(도 3). 내성 마커(catP) 및 그람 양성 복제 기원(pCB102)의 증폭을 위해 프라이머 CatR(TTCGTTTACAAAACGGCAAATGTGA, 서열 번호 7) 및 RepHF(AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT, 서열 번호 8)를 가지는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 플라스미드의 소실을 검증하였다.
동일한 전략 및 플라스미드를 씨. 리융달리 또는 씨. 라그스달레이에 또한 적용할 수 있었다. 형질전환 프로토콜은 이전에 기재되어 있다(WO 2012/053905)(Leang, Appl Environ Microbiol, 79: 1102-1109, 2013).
실시예 4
이 실시예는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 씨. 아우토에타노게눔에서 아이소프로판올로의 아세톤의 제거를 입증한다.
아세톤(0, 1, 5 및 20g/ℓ)을 (1) LZ1561 및 (2) 287a 및 211s 위치에서 돌연변이를 가지는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 클로스트론 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔의 혈청 병 배양물에 공급하였다. LZ1561 균주는 1g/ℓ의 아세톤을 아이소프로판올로 전부 전환시켜서, HPLC에 의해 0.65g/ℓ의 아이소프로판올이 검출되었고, 아세톤이 검출되지 않았다. 20g/ℓ의 아세톤이 공급된 혈청 병 중의 아이소프로판올의 최종 농도는 8.1g/ℓ의 아이소프로판올이고, 9.25g/ℓ의 아세톤이 남았다. 아이소프로판올로의 아세톤의 검출 가능한 전환이 임의의 클로스트론 2차 알코올 탈수소효소 돌연변이체에서 관찰되지 않았다(도 4). 공급된 양과 측정된 양 사이의 불일치는 가압 혈청 병에 아세톤을 정확하게 첨가하는 것의 어려움으로 인한다.
부가적인 실험에서, 16g/ℓ의 아세톤을 PETC MES 중의 LZ1561 SecADH::erm 433s, LZ1561 SecADH::erm 388a 및 LZ1561의 혈청 병 배양물에 공급하였다. 배양물을 37℃에서 공장 가스 헤드스페이스 하에 성장시켰다. 성장 4일 후, LZ1561은 아세톤의 대략 절반을 아이소프로판올로 전환시켰다. secADH 클로스트론 돌연변이체에서 아이소프로판올이 검출되지 않았다(도 5).
따라서, LZ1561 균주가 아세톤을 아이소프로판올로 매우 효과적으로 환원시켰지만, 돌연변이체 균주는 아세톤을 아이소프로판올로 환원시킬 수 없었다. 이 결과는 2개의 부탄올 탈수소효소의 존재에도 불구하고 관찰되었지만, 아이소프로판올로의 아세톤의 환원에서 명확히 역할을 하지 않는다.
생물반응기 내의 연속 배양물을 함유하는 실험을 또한 수행하였다. LZ1561을 상기 기재된 바대로 생물반응기 내에서 성장시켰다. 일단 안정한 바이오매스 및 대사물질 생성에 의한 연속 모드에서, 아세톤을 생물반응기 및 반응 배지 둘 다에 첨가하였다. 아세톤을 반응기에 소정의 수준으로 스파이킹하고, 이것을 이후 연속 공급에 의해 얻었다. 초기에, 1g/ℓ의 아세톤을 첨가하였다. 일단 대사물질 농도가 안정화되면, 농도를 5g/ℓ, 15g/ℓ로 증가시키고, - 제2 실험에서 - 20g/ℓ로 증가시켰다. 심지어 15-20g/ℓ의 높은 농도에서도, 배양물은 모든 아세톤을 아이소프로판올로 높은 속도로 전환시켜서, 확인된 2차 알코올 탈수소효소가 매우 효과적이라는 것을 입증한다(도 6)(WO 2012/0252083).
211s 위치에서 돌연변이를 가지는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 클로스트론 돌연변이체에 의해 유사한 생물반응기 내에서 실험을 수행하였다. 5g/ℓ의 아세톤을 생물반응기로 스파이킹하였다. 거의 즉각적인 아이소프로판올로의 아세톤의 전환이 관찰되는 LZ1561과 달리(도 6), 클로스트론 돌연변이체에서 아세톤의 전환이 관찰되지 않았다(도 7 및 도 8). 따라서, 아이소프로판올로의 아세톤의 전환은 클로스트론 돌연변이체에서 완전히 제거되었다.
실시예
5
이 실시예는 아세톤 환원 없이 1,2-프로판다이올로부터의 아세톤 생산을 입증한다.
씨. 아우토에타노게눔이 프로판-1,2-다이올이 배지에 첨가될 때 프로판-1,2-다이올을 프로판알 및 아세톤으로 입체특이적으로 탈수시키는 능력을 부여하는 유전자를 함유한다는 것이 이전에 입증되었다. LZ156에서, 프로판알 및 아세톤은 프로판-1-올 및 프로판-2-올로 환원되었다. 아세톤은 2차 알코올 탈수소효소에 의해 환원되었다. 프로판-1,2-다이올을 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 클로스트론 돌연변이체에 의해 접종된 배지에 첨가할 때, 생산된 아세톤은 프로판-2-올로 환원되지 않았다.
프로판-1,2-다이올을 혈청 병에서 PETC-MES 배지에 66mM으로 첨가하였다. 병을 클로스트론-불활화된 2차 알코올 탈수소효소(SecADH::ermB 287a)를 가지는 씨. 아우토에타노게눔 또는 LZ1561에 의해 접종하였다. 성장 96시간 후, LZ1561은 16.0±1.6mM의 프로판-2-올 및 8.1±1.8mM의 프로판-1-올을 생산하지만, 불활화 sADH 균주는 5.7±1.5mM의 아세톤 및 6.0±1.8mM의 프로판-1-올을 생산하였고, 프로판-2-올이 검출될 수 없었다.
실시예 6
이 실시예는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소 유전자를 가지는 씨. 아우토에타노게눔에서 CO로부터의 아세톤의 생산을 입증한다
티올라제, CoA-전환효소 및 아세토아세테이트 탈탄산효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 아세톤의 합성을 위한 유전자를 가지는 플라스미드를 설계하고, 씨. 아우토에타노게눔에서 도입하여서, 아주 적은 아세톤을 가지거나 아세톤이 없는 아이소프로판올을 생산하였다(WO 2012/0252083). 이러한 플라스미드를 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 씨. 아우토에타노게눔의 클로스트론 돌연변이체에 도입할 때, 아이소프로판올이 없이 아세톤이 생산되었다. 배양물을 25psi에서 CO/H2 가스에서 혐기성 병 내에서 웰마다 6㎖의 용적으로 6웰 플레이트에서 성장시켰다. 4일 성장 후, 배양물은 평균 0.95±0.01g/ℓ의 아세톤, 5.64±0.11g/ℓ의 에탄올 및 3.58±1.3g/ℓ의 아세테이트를 생산하였다. 37℃에서의 아세톤의 휘발성으로 인해, 배지를 가지지만, 아세톤 생성 박테리아가 없는 2개의 부가적인 6웰 플레이트에 의해 실험을 반복하였다. 아세톤 생성 배양물은 4일에 평균 0.92±0.04g/ℓ의 아세톤을 생산하였다. 또한, 배경 플레이트는 평균 0.5±0.02g/ℓ의 아세톤을 생산하였지만, 이것은 기상 아세톤을 통해 옮겨졌다. 최종 조정된 생성은 아세톤의 이동을 고려하면 1.9g/ℓ의 아세톤이었다.
아세톤 생성은 상기 기재된 바대로 동일한 균주 및 방법을 사용하여 생물반응기 내에서 연속 배양물 중에 또한 입증되었다. 20일 기간에 걸쳐, 대략 0.2g/ℓ의 아세톤이 끊임없이 브로쓰에서 관찰되었다(도 11, 여기서 "아세톤 전체"는 (HPLC에 의해 관찰된) 배지 중의 아세톤과 발효기를 통과한 가스에 의해 배지로부터 제거하고자 하는 계산된 아세톤을 의미한다). 생물반응기를 1.5의 희석률에서 실행하여서, 브로쓰 중의 대략 0.4g/ℓ/일의 생산성을 제공하였다. 브로쓰 중의 농도 이외에, (브로쓰 중의 농도의 30%에 걸쳐) 상당한 양의 아세톤을, 유출 가스의 냉각된 넉아웃 포트에서 결정되는 것처럼, 외부유입 가스에 의해 스트리핑하였다. 아세톤의 휘발성 및 시스템에 걸친 가스 흐름을 고려하여, 아세톤의 스트리핑은 이상적인 저비용 생성물 분리를 제공하여서, 휘발성이 아닌 아이소프로판올에 비해 이점을 제공하고, 대부분은 예를 들어 증류를 통해 브로쓰로부터 추출될 필요가 있다. 아세톤의 스트리핑은 또한 생성물 합성에 대한 추진력을 제공하여서, 최종 생성물 저해를 회피한다.
실시예 7
이 실시예는 2-부탄올 환원으로의 MEK의 제거를 입증한다.
MEK(0, 1, 5 및 20g/ℓ)를 (1) LZ1561 및 (2) 287a 및 211s 위치에서 돌연변이를 가지는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 클로스트론 돌연변이체 씨. 아우토에타노게눔의 혈청 병 배양물에 공급하였다. LZ1561은 각각 1 및 5g/ℓ의 MEK를 0.94 및 4.34g/ℓ의 2-부탄올로 전부 전환시켜서, 남은 MEK가 검출 가능하지 않았다. 20g/ℓ의 MEK가 공급된 혈청 병 중의 2-부탄올의 최종 농도는 6.3g/ℓ 2-부탄올이고, 17.3g/ℓ의 MEK가 남았다. 임의의 클로스트론 2차 알코올 탈수소효소 돌연변이체에서 2-부탄올로의 MEK의 전환이 관찰되지 않았다(도 9).
211s 위치에서 2차 알코올 탈수소효소 유전자 불활화를 불활화하는 것이 MEK를 2-부탄올로 전환시키는 씨. 아우토에타노게눔의 능력을 완전히 제거하는지를 추가로 검증하기 위해, 10g/ℓ의 MEK를 성장하는 2차 알코올 탈수소효소 불활화된 균주를 가지는 생물반응기로 스파이킹하였다. MEK의 전환이 관찰되지 않았다(도 7, 도 10).
실시예 8
이 실시예는 불활화된 2차 알코올 탈수소효소 유전자를 가지는 씨. 아우토에타노게눔에서 2-3-부탄다이올로부터의 MEK의 생산을 기술한다.
씨. 아우토에타노게눔에서의 케이. 옥시토카로부터의 프로판다이올 탈수효소 유전자의 발현이 2-부탄온으로의 외인성 메소-2,3-부탄다이올의 전환을 허용한다는 것이 입증되었다. 생산된 2-부탄온은 씨. 아우토에타노게눔에 존재하는 2차 알코올 탈수소효소에 의해 2-부탄올로 환원되었다.
불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 가지는 씨. 아우토에타노게눔의 클로스트론 돌연변이체를 확립된 방법을 이용하여 케이. 옥시토카로부터의 다이올 탈수효소를 발현하는 pMTL83155-pddABC에 의해 형질전환시킬 수 있다. 생성된 균주는 외인성 메소-2,3-부탄다이올의 존재 하에 혈청 병에서 독립영양으로 성장하였다. 2-부탄온으로 전환된 부탄다이올은 2-부탄올로 환원되지 않았다.
본 명세서에 인용된 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌은, 각각의 참조문헌이 참조문헌으로 포함된 것으로 개별적으로 및 구체적으로 표시되고 그 전문이 본 명세서에 기재된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다. 본 명세서에서 임의의 선행 기술의 언급은, 선행 기술이 어떤 나라에서 노력의 분야에서 일반 상식의 일부를 형성한다는 인정으로서 취해지지 않고 취해져서도 안 된다.
(특히 하기 청구항의 맥락에서) 본 발명을 기술하는 맥락에서 용어 "일" 및 "하나" 및 "이것" 및 유사한 언급의 사용은, 본 명세서에서 달리 기재되어 있지 않거나 문맥에 의해 명확히 달리 반대되지 않는 한, 단일 및 복수 둘 다를 포함하도록 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "가지는", "수반하는" 및 "함유하는"은, 달리 표시되지 않은 한, 개방 말단 용어(즉, "포함하지만, 이들로 제한되지는 않음"을 의미함)로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위의 언급은, 본 명세서에서 달리 기재되어 있지 않은 한, 단지 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 간단한 방법으로 작용하도록 의도되고, 각각의 별개의 값은 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은, 본 명세서에서 달리 기재되어 있지 않거나 문맥에 의해 명확히 달리 반대되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 밝히도록 의도되고, 달리 청구되지 않은 한, 본 발명의 범위에 제한을 부여하지 않는다. 본 명세서에서 언어는 본 발명의 실행에 대한 필수로서 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최고의 방식을 포함하여, 본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 기재되어 있다. 이 바람직한 실시형태의 변형이 상기 설명을 읽을 때 당해 분야의 당업자에게 명확해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련자가 이러한 변형을 적절한 바대로 이용할 것을 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과 달리 실행되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는 바대로 첨부된 청구항에서 언급된 대상의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 더구나, 이의 모든 가능한 변형의 상기 기재된 부재의 임의의 조합은, 본 명세서에서 달리 기재되어 있지 않거나 문맥에 의해 명확히 달리 반대되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> LanzaTech New Zealand Limited
<120> MICROORGANISMS AND METHODS FOR THE PRODUCTION OF KETONES
<130> WO 2015/085015
<140> PCT/US2014/068463
<141> 2014-12-03
<150> US 61/911,449
<151> 2013-12-03
<160> 8
<170> PatentIn version 2.0
<210> 1
<211> 351
<212> PRT
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 1
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly Ile Asn Lys Leu Gly Trp Ile Glu
1 5 10 15
Lys Lys Asn Pro Val Pro Gly Pro Tyr Asp Ala Ile Val His Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ser Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Leu Gly Asn Arg Glu Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu
50 55 60
Ile Ala Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Val Gly Asp Arg
65 70 75 80
Val Ile Val Pro Cys Thr Thr Pro Asp Trp Arg Ser Leu Glu Val Gln
85 90 95
Ala Gly Phe Gln Gln His Ser Asn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe
100 105 110
Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Ala Asp Tyr Phe His Val Asn Asp
115 120 125
Ala Asp Met Asn Leu Ala Ile Leu Pro Asp Glu Ile Pro Leu Glu Ser
130 135 140
Ala Val Met Met Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ile Lys Met Gly Ser Ser Val Val Val Ile Gly Ile Gly
165 170 175
Ala Val Gly Leu Met Gly Ile Ala Gly Ser Lys Leu Arg Gly Ala Gly
180 185 190
Arg Ile Ile Gly Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Glu Thr Ala Lys
195 200 205
Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asn Gly Asp Ile Val
210 215 220
Glu Gln Ile Met Asp Leu Thr His Gly Lys Gly Val Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Met Ala Gly Gly Gly Ala Glu Thr Leu Ala Gln Ala Val Thr Met Val
245 250 255
Lys Pro Gly Gly Val Ile Ser Asn Ile Asn Tyr His Gly Ser Gly Asp
260 265 270
Thr Leu Pro Ile Pro Arg Val Gln Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys
275 280 285
Thr Ile Arg Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Met
290 295 300
Leu Arg Asp Leu Val Leu Tyr Lys Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu Val
305 310 315 320
Thr His Val Phe Asp Gly Ala Glu Asn Ile Glu Lys Ala Leu Leu Leu
325 330 335
Met Lys Asn Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ser Val Val Thr Phe
340 345 350
<210> 2
<211> 1056
<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 2
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aaattaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60
gtgccaggtc cttatgatgc gattgtacat cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120
atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggccatgaa 180
gctgtaggtg aaatagccga agttggcagc gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240
gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatctttag aagtccaagc tggttttcag 300
cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga cggtgtattt 360
gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg ccatactccc agatgaaata 420
cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggagcagaa 480
cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600
cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660
ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720
atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780
gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840
tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900
agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960
actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020
ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056
<210> 3
<211> 1056
<212> DNA
<213> Clostridium ragsdalei
<400> 3
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aagttaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60
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atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggtcacgaa 180
gctgtaggtg aaatagctga agttggcagt gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240
gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatccttag aagtccaagc tggttttcaa 300
cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga cggtgtattt 360
gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg caatacttcc agatgaaata 420
cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggggcagaa 480
cttgctgaca taaaaatggg ttccagtgtt gtcgtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggtagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600
cccgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660
ggtgatatag ttgaacaaat aatggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720
atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780
gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt tgccaatacc tcgtgttcaa 840
tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggagggt tatgtcccgg cggacgtctt 900
agaatggaaa tgctaagaga ccttgttcta tataaacgtg ttgatttgag caaacttgtt 960
actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020
ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056
<210> 4
<211> 344
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Intron targeting region
<400> 4
aagcttataa ttatccttag atatcaatct tgtgcgccca gatagggtgt taagtcaagt 60
agtttaaggt actactctgt aagataacac agaaaacagc caacctaacc gaaaagcgaa 120
agctgatacg ggaacagagc acggttggaa agcgatgagt tacctaaaga caatcgggta 180
cgactgagtc gcaatgttaa tcagatataa ggtataagtt gtgtttactg aacgcaagtt 240
tctaatttcg attatatctc gatagaggaa agtgtctgaa acctctagta caaagaaagg 300
taagttagca agattgactt atctgttatc accacatttg taca 344
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 156F primer
<400> 5
gccaggtcct tatgatgcga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 939R primer
<400> 6
gccccattga acacgaggta 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CatR primer
<400> 7
ttcgtttaca aaacggcaaa tgtga 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> RepHF primer
<400> 8
gccccattga acacgaggta 20
Claims (17)
- 2차 알코올 탈수소효소(secondary alcohol dehydrogenase)가 결여되거나 불활화된 2차 알코올 탈수소효소를 포함하는, 재조합, 초산생성(acetogenic), 일산화탄소영양(carboxydotrophic) 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 클로스트리듐(Clostridium) 속의 구성원인, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 클로스트리듐 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리융달리(Clostridium ljungdahlii) 및 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아로부터 유래된, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제3항에 있어서, 상기 클로스트리듐 아우토에타노게눔은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 아우토에타노게눔인, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 불활화된 1차-2차 알코올 탈수소효소인, 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 2차 알코올 탈수소효소로부터 유래된, 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 불활화된 2차 알코올 탈수소효소는 불활화 돌연변이를 포함하는 2차 알코올 탈수소효소 유전자에 의해 암호화된, 박테리아.
- 제7항에 있어서, 상기 불활화 돌연변이를 포함하는 상기 2차 알코올 탈수소효소 유전자는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 핵산 서열로부터 유래된, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제7항에 있어서, 상기 불활화 돌연변이는 삽입인, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 티올라제, coA-전환효소 및 아세토아세테이트 탈탄산효소 중 하나 이상을 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함하는, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 메소-2,3-부탄다이올을 MEK로 전환시키는 프로판다이올 탈수효소를 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함하는, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제11항에 있어서, 상기 프로판다이올 탈수효소는 클레브시엘라 옥스토카(Klebsiella oxtoca) 프로판다이올 탈수효소인, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 아세톤 및 MEK 중 하나 이상을 생산하는, 재조합, 초산생성, 일산화탄소영양 박테리아.
- 제1항의 박테리아를 배양하는 단계를 포함하고, 이로써 상기 박테리아가 아세톤을 생산하는, 아세톤을 생산하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 배양물로부터 상기 아세톤을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 아세톤을 생산하는 방법.
- 제1항의 박테리아를 배양하는 단계를 포함하고, 이로써 상기 박테리아가 MEK를 생산하는, MEK를 생산하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 배양물로부터 상기 MEK를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, MEK를 생산하는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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