KR20160083758A

KR20160083758A - Ｐｃｒ―ｌｄｒ을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출

Info

Publication number: KR20160083758A
Application number: KR1020150000286A
Authority: KR
Inventors: 신인경; 김건희; 조대연
Original assignee: 주식회사 랩 지노믹스
Priority date: 2015-01-02
Filing date: 2015-01-02
Publication date: 2016-07-12
Anticipated expiration: 2035-01-02
Also published as: KR101728023B1

Abstract

본 발명은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reactioin, PCR)과 리가아제 검출 반응(Ligase Detection Reaction, LDR)을 이용한 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이 검출 방법, 이를 이용하여 윌슨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 및 ATP7B 유전자의 돌연변이의 증폭을 위한 PCR 프라이머 세트 및 그의 검출을 위한 LDR 프로브 세트를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

ＰＣＲ―ＬＤＲ을 이용한 ＡＴＰ７Ｂ 유전자의 돌연변이 검출{Detection of mutations in ATP7B gene using PCR-LDR}

본 발명은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reactioin, PCR)과 리가아제 검출 반응(Ligase Detection Reaction, LDR)을 이용한 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이 검출 방법, 이를 이용하여 윌슨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 및 윌슨병 진단용 조성물에 관한 것이다.

윌슨(Wilson)병은 구리 대사 이상으로 인하여 간, 뇌, 각막, 신장 및 적혈구에 구리가 침착되는 보통염색체 열성 유전질환으로, 13번 염색체에 위치하는 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자 돌연변이에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 이 유전자의 돌연변이로 인하여 간 및 뇌에 구리가 축적되어 간 증상 혹은 신경학적 증상이 나타난다.

구리의 흡수에 관여하는 효소인 ATP7B를 코딩하는 유전자에 돌연변이가 발생하면 구리운반 P-형 ATPase 단백질에 이상이 생겨 간세포 내에서 미세담도로 구리가 배출되지 못하고, 구리가 셀룰로플라스민과 결합하지 못하므로 혈액 내로 배출되지 못하여, 간세포, 적혈구, 뇌 등의 장기에 구리가 침착되어 중독증상이 나타나고, 구리이온에 의한 자유라디칼(free readical)의 발생으로 장기에 산화적 손상을 유발한다.

윌슨병은 보통염색체 열성으로 유전된다. 부모 양쪽 모두가 보인자인 경우에 25%의 확률로 환자인 자녀가 생길 수 있다. 윌슨병은 희귀병이나 국내에서 지난 10년간 발생한 유전질환 중 가장 많이 발생한 질환이며 다른 나라와 비교해 발생률이 높은 편에 속한다. 따라서 윌슨병 환자에 대한 조기 진단과 치료의 중요성이 강조되고 있다. 특히, 신생아 대사 검사와 같이, 저비용으로 편리하고 효율적으로 시행할 수 있는 검사법의 개발이 요구된다.

윌슨병은 임상적, 생화학적 및 분자유전학적 소견으로 진단할 수 있다. 임상적, 생화학적 진단은 특징적인 각막환(K-F 고리), 특징적인 신경학적 이상소견, 혈중 내 낮은 셀룰로플라스민 수치, 24시간 동안 소변 중 구리 배설량 증가, 간내 증가된 구리의 양을 고려하고, 이들 중 2가지 이상이 양성이면 윌슨병의 확진 가능성이 매우 높다. 최근 혈중 셀룰로플라스민의 농도를 측정하여 윌슨병을 진단하는 기술이 개발되고 있으나, 셀룰로플라스민의 농도 측정은 생화학적 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 초기 윌슨병 환자들은 정확한 진단이 어렵고 보인자를 판별할 수 없다는 문제가 있다.

현재, 윌슨병의 확진을 위해서 ATP7B 유전자의 돌연변이를 확인하는 분자유전학적 진단 방법이 이용되고 있다. 약 80%의 윌슨병 환자에서 유전자 이상을 규명할 수 있으며 임상적, 생화학적 진단법에 의한 윌슨병 확진시 도움을 줄 수 있다. 또한 증상이 없는 환자인지 이형접합 보인자인지 여부를 확진하는 데는 분자유전학적 진단 방법이 표준 방법이다. 특히 분자유전학적 진단 방법을 이용하면 생화학적 또는 임상적 양상이 비전형적이거나 생화학적 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 윌슨병 초기 환자 및 현재 무증상이나 보인자인 환자 등 임상적으로 감별이 어려운 환자를 확진할 수 있다. 또한 관련 돌연변이가 밝혀지면 해당 가계 내에서도 예측적 검사가 가능하다.

ATP7B 유전자에 대한 돌연변이는 전세계적으로 다양한 종류들이 보고되었고 인종이나 민족 간에 차이가 있는 것으로 나타났다. 중부/동부/북서부 유럽 국가에서는 H1069Q 돌연변이 빈도가 가장 높게 발견되며(17-72%), 지중해 연안 국가에서는 이탈리아, 그리스, 터키에서는 H1069Q 돌연변이(9.4-35%), 스페인에서는 M645R 돌연변이(27%), 카나리 제도에서는 L708P 돌연변이(64%)의 빈도가 가장 높다. 한국에서는 R778L 돌연변이가 37.5%로 가장 높은 빈도를 차지하고 있고, 중국의 경우도 비슷한 양상을 보인다(49.2%) (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298). 특히 한국인에서는 R778L(c.2333G>T), A874V(c.2621C>T), N1270S(c.3809A>G)의 3가지가 전체 돌연변이 대립유전자의 50% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 외에도 c.2513delA, T1029I (c.3086C>T), G1035V (c.3104G>T), L1083F (c.3247C>T), G1186S (c.3556G>T)의 돌연변이가 1 내지 8% 빈도로 확인되었다 (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298; Human Mutation 2007, 28, 1108-1113; Liver International, 2011, 31, 831-839). 따라서, 이들 돌연변이의 분석에 의해 60% 이상의 윌슨병 진단이 가능하다.

윌슨병의 분자유전학적 진단 방법으로 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 검출방법과 실시간 중합효소연쇄반응의 용융 곡선 분석을 이용한 진단법, 직접염기서열분석법이 이용되고 있다.

제한효소 절편 질량다형성법은 정확도가 우수하고, 정량분석이 가능하지만 고가의 MALDI-TOF MS가 필요하며, 여러 개의 표적 돌연변이 존재 여부를 검출하기 위해 여러 개의 제한효소들이 사용됨에 따라 제한효소에 의한 절단, 절단된 단편의 정제 등이 요구되어 검사법이 복잡해진다는 단점이 있다.

Taqman이나 분자 비콘(molecular beacon) 등 유전형에 특이적인 형광 표지된 프로브를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응법은 정확도가 우수하지만 다중 돌연변이 검출이 어려운 단점이 있다. 다중 분석을 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응 후 증폭된 산물들의 용융 곡선 분석을 이용한 진단법이 제시되었으나 용융 곡선의 분석이 복잡하고 비특이적 증폭 등에 의하여 정확도 및 특이도가 떨어질 수 있으므로 실제 진단 검사에서 적용하기에는 한계가 있다.

직접염기서열분석법은 정확도가 우수하지만, 시간 및 비용이 비교적 많이 들고 근본적으로 다중 돌연변이 검출이 불가능하다.

이에 본 발명자들은 기존의 분자유전학적 분석법에 비해 저렴한 비용으로 윌슨병을 유발하는 주요한 다중 돌연변이를 정확하고 신속하게 검출하여 효율적으로 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR) 및 리가아제 검출반응(LDR)에 의해 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태는 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,

검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이를 포함하는 단편을 증폭시키는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계, 및

수득된 PCR 산물을 대상으로 리가아제 검출 반응(LDR)을 수행하여, ATP7B 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하고,

상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,

상기 LDR은 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어진 프로브 세트를 이용하여 수행되는 것인 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 ATP7B 유전자 돌연변이는 하기와 같이 정의된다:

ATP7B 유전자의 돌연변이는 서열번호 1을 기준으로 표시된다. 서열번호 1은 ATP7B 유전자(GenBank Accession No. NM_000053)의 코딩 서열(CDS)을 나타내며, 번역 개시 코돈인 ATG의 A를 뉴클레오티드 +1로 표시한다.

치환(substitution) 돌연변이는 기호'>'를 표시하여 기재하며, '>'앞의 문자는 정상인 ATP7B 유전자의 뉴클레오티드이며, '>' 뒤의 문자는 돌연변이 ATP7B 유전자의 뉴클레오티드를 의미한다. 결실(deletion) 돌연변이는 "del"로 표시하며, "del" 다음의 문자는 결실된 뉴클레오티드를 나타낸다.

돌연변이 "c.2333G>T"은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2333번째 염기의 G에서 T로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.2621C>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2621번째 염기의 C에서 T로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.3809A>G"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3809번째 염기의 A에서 G로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.2513delA"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2513번째 염기 A의 결실을 의미한다.

돌연변이 "c.3086C>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3086번째 염기의 C에서 T로의 치환을 의미한다.

한국인 윌슨병 환자에 대한 연구 결과들에 의하면, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>T가 전체 돌연변이 대립유전자의 50%를 차지하며 그 외에 c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, c.3247C>T, c.3556G>T의 돌연변이도 각각 1 내지 8% 빈도를 차지하는 것으로 확인되었다 (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298; Human Mutation 2007, 28, 1108-1113; Liver International, 2011, 31, 831-839). 따라서, 이들 돌연변이의 분석에 의해 60% 이상의 윌슨병 보인자 진단이 가능하다.

본 명세서에서 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)"은 증폭시키고자 하는 표적 부위 특이적 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 이용한, 연쇄 반응에 의해 표적 부위를 증폭시키는 반응을 의미한다. 중합효소 연쇄반응의 반응액의 조성 및 반응 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "리가아제 검출반응(ligase detection reaction, LDR)"은 서로 인접한 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 표적 유전자 서열과 완전히 상보적으로 결합한 경우에만 리가아제에 의해 라이게이션되는 것에 기반하여 표적 서열의 변이를 검출하는 반응을 의미한다. 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 서로 인접한 부분에서 완전히 상보적인 경우에만 리가아제에 의해 하나로 연결된 산물이 생성되고, 두 개의 프로브가 서로 인접한 부분에서 상보적이지 않을 경우에는 하나로 연결된 산물이 생성되지 않는다. 따라서, LDR은 반응의 특이성이 매우 높아서 돌연변이를 정확하게 검출할 수 있다. LDR에서는 각 사이클마다 리가아제에 의한 염기서열 특이적 라이게이션 반응이 일어나서 매우 정확하게 유전형을 확인할 수 있다. 특히, 열에 강한 리가아제를 사용하여 고온, 예를 들면, 45 내지 70℃에서 LDR을 수행할 경우, 프로브의 염기 서열 특이성이 더 높아지고, 프로브간 상호작용을 줄일 수 있으므로 다중 분석에 유리하다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열, 즉 표적 부위 특이적 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "LDR 프로브"는 리가아제 검출 반응에서 이용되는 서로 인접한 표적 서열에 결합하는 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브를 의미한다. 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 모두 표적 서열에 완전한 상보성으로 결합한 경우에만 라이게이션이 일어나 하나의 LDR 산물을 생성하고, 그에 의해 표적 서열의 변이를 확인할 수 있게 한다. 특정 염기 서열의 돌연변이를 확인하기 위해 이용되는 LDR 프로브는 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이 검출용 왼쪽 프로브 및 공통된 오른쪽 프로브가 한 세트로 구성될 수 있다. 왼쪽 프로브의 5' 말단에 형광물질을 포함하나, 그에 한정되지 않는 표지 물질이 결합될 수 있고, 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션을 위한 인산기로 수식될 수 있다.

본 명세서에서, "야생형 검출용 (LDR) 왼쪽 프로브"는 표적 부위의 야생형 서열과 완전히 상보적인 염기서열을 가져서 높은 특이성으로 표적 부위의 야생형 서열에 특이적으로 결합하는 프로브를 의미한다.

본 명세서에서, "돌연변이형 검출용 (LDR) 왼쪽 프로브"는 표적 부위의 돌연변이형 서열과 완전히 상보적인 염기서열을 가져서 높은 특이성으로 표적 부위의 돌연변이형 서열에 특이적으로 결합하는 프로브를 의미한다.

LDR 반응 후, 해당 검체에서 ATP7B 돌연변이 부위의 유전형은 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 신호 검출에 의해 판단될 수 있다. 프로브가 형광 물질로 표지되고, 야생형 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 해당 검체는 그 돌연변이 부위에 돌연변이를 갖지 않는 야생형, 즉, 정상이라는 것을 의미하고, 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 이는 그 돌연변이의 동형접합형의 존재, 즉, 윌슨병 환자라는 것을 의미하며, 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호가 모두 검출되는 경우, 이는 야생형과 돌연변이 모두가 존재하는 이형접합형을 갖는 보인자라는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 증폭되는 표적 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이고, 적합한 온도에서 중합효소 연쇄 반응액 중 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 반응 온도와 프라이머의 용도 등의 인자에 따라 정해지나, 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다.

본 발명의 일 구체예에서, 검체는 윌슨병의 진단 대상으로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 혈흔지, 체액, 뇨, 세포, 모발, 조직, 융모막, 양수, 태반, 또는 제대혈 등의 시료일 수 있고, 그로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법에 의해 DNA를 분리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 중합효소연쇄반응은 단일 또는 다중 중합효소 연쇄반응으로 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 PCR은 서열번호 2 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머 쌍을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 왼쪽 프로브의 5' 말단은 형광 물질로 표지되고, 상기 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위한 인산기로 수식될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지될 수 있다. 이에 의해, 야생형 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호와 돌연변이 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호가 구별되므로, 야생형 검출용 프로브의 신호가 양성이면 야생형, 돌연변이 검출용 프로브의 신호가 양성이면 돌연변이, 양자 모두의 신호가 양성이면 야생형과 돌연변이의 이형접합형인 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR에서

상기 c.2333G>T은 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,

상기 c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며, 및

상기 c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, LDR 프로브는 표적 돌연변이에 따라 LDR 산물의 크기가 구별될 수 있도록 최종 LDR 산물의 크기를 조절하기 위해 충전 서열(stuffer sequence)를 더 포함할 수 있다. 충전 서열의 크기 및 조성은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자가 필요에 따라 선택할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 왼쪽 LDR 프로브에 서열번호 27의 충전 서열을 포함시키고, 오른쪽 프로브에 서열번호 28의 충전 서열을 포함시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR에서,

상기 c.2333G>T은 서열번호 29 내지 31의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 c.2621C>T는 서열번호 32 내지 34의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 c.3809A>G는 서열번호 35 내지 37의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 c.2513delA는 서열번호 38 내지 40의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,

상기 c.3086C>T는 서열번호 31 내지 43의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 리가아제 검출 반응(LDR)은 모세관 전기영동에 의해 LDR 산물을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

모세관 전기영동 분석은 염기서열의 길이에서 1개의 뉴클레오티드 차이까지 구별할 수 있기 때문에, LDR 산물의 길이를 조절하여 여러 개의 돌연변이를 동시에 분석할 수 있다. 또한, LDR 산물의 길이를 다르게 하는 것 외에, 분석 대상 돌연변이별로 상이한 형광물질로 표지된 프로브를 사용하는 것에 의해 LDR 산물을 검출할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 리가아제 검출 반응은 대장균 리가아제, Taq 리가아제, T4 리가아제, 9°N 리가아제, 앰플리가아제(ampligase), 및 pfu DNA 리가아제로 구성된 군으로부터 선택된 리가아제를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 윌슨병의 진단을 위해 필요한 정보를 제공하기 위해, 검체에 대해 ATP7B 유전자 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T 중 하나 이상, 또는 5종 모두의 유전형을 분석할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, 및 c.3809A>G로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 내지 11의 PCR 프라이머 및 서열번호 12 내지 26의 서열을 포함하는 LDR 프로브를 포함하는, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 조성물로서,

상기 c.2333G>T은 서열번호 2 및 3의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 c.2621C>T는 서열번호 4 및 5의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며,

상기 c.3809A>G는 서열번호 6 및 7의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 c.2513delA는 서열번호 8 및 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며, 및

상기 c.3086C>T는 서열번호 10 및 11의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,

상기 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지는 것인 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR 프로브 중 야생형 검출용 왼쪽 LDR 프로브와 돌연변이형 검출용 왼쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 상이한 형광 물질로 표지되고, 오른쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 라이게이션을 위한 인산기로 수식될 수 있다. 야생형 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 물질에 의한 신호가 구별되므로, 야생형 검출용 프로브의 신호가 양성이면 야생형, 돌연변이 검출용 프로브의 신호가 양성이면 돌연변이, 양자 모두의 신호가 양성이면 야생형과 돌연변이의 이형접합형인 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광 물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 윌슨병의 진단을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 중합효소 연쇄반응의 수행을 위해 필요한 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소, 및 완충 용액을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 내지 11의 서열로 이루어진, ATP7B 유전자의 돌연변이 증폭용 프라이머 세트로서,

서열번호 2과 3으로 이루어진 프라이머 쌍은 c.2333G>T의 증폭을 위해 이용되고,

서열번호 4와 5 이루어진 프라이머 쌍은 c.2621C>T의 증폭을 위해 이용되며,

서열번호 6과 7로 이루어진 프라이머 쌍은 c.3809A>G의 증폭을 위해 이용되고,

서열번호 8과 9로 이루어진 프라이머 쌍은 c.2513delA의 증폭을 위해 이용되며,

서열번호 10과 11로 이루어진 프라이머 쌍은 c.3086C>T의 증폭을 위해 이용되는 것인 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 ATP7B 돌연변이 검출을 위한 반응 전에 검체의 ATP7B 돌연변이 부위의 증폭을 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 12 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 LDR 프로브 세트로서,

각 LDR 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지고,

c.2333G>T는 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,

c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며,

c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,

c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고, 및

c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 LDR 프로브 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR 프로브 세트는 ATP7B 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 리가아제 검출 반응에서 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 각 돌연변이 부위에 대한 LDR 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지고, 상기 왼쪽 프로브의 5' 말단은 형광 물질로 표지되고, 상기 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위한 인산기로 수식될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 야생형 검출용 왼쪽 프로브와 상기 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브는 상이한 형광 물질로 표지될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, LDR 프로브는 표적 돌연변이에 따라 LDR 산물의 크기가 구별될 수 있도록 LDR 산물의 크기를 조절하기 위해 충전 서열을 더 포함할 수 있다. 충전 서열은 왼쪽 프로브의 5' 영역, 또는 오른쪽 프로브의 3' 영역, 또는 왼쪽 프로브의 5' 영역 및 오른쪽 프로브의 3' 영역에 추가될 수 있다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 ATP7B 돌연변이에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용한 중합효소 연쇄반응 및 리가아제 검출 반응에 의해 한국인 호발 ATP7B 돌연변이의 존재 여부를 신속하고 정확하게 판별하고, 이에 의해 이에 의해 윌슨병의 조기 진단, 보인자 판별, 및 효율적 질환 관리에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, 2513delA, 및 c.3086C>T의 이형접합형 및 야생형에 대해 수득된 LDR 분석 결과를 보여준다.

실시예 1. ATP7B 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 제작

서열번호 1의 ATP7B 유전자(GenBank Accession No., NM_000053)의 돌연변이는 구리 대사 이상 질환인 윌슨병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 한국인에서 높은 빈도로 발생하는 것으로 확인된 ATP7B 유전자의 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T를 검출하기 위해 이용할 수 있는 PCR 프라이머 및 LDR 프로브를 제작하였다.

ATP7B 유전자의 염기 서열을 바탕으로 각 표적 돌연변이를 포함하는 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였다. 하기의 표 1은 각 표적 돌연변이를 포함하는 부위를 증폭하기 위해 중합효소 연쇄반응에서 사용하는 프라이머를 나타낸다.

표적	프라이머 서열 (5' 말단→3' 말단 방향)
c.2333G>T	F: TCT GGT CAT CCT GGT GGT TG (서열번호 2)
c.2333G>T	R: AA CAT GGT GTT CAG AGG AAG TGA (서열번호 3)
c.2621C>T	F: AGC TGG CCT AGA ACC TGA CC (서열번호 4)
c.2621C>T	R: CAT CTG AGC CTC TTC CAC CA (서열번호 5)
c.3809A>G	F: GGT CCA GGA GCT CCA GAA TAA (서열번호 6)
c.3809A>G	R: ACA GTG AGG AAG GGG TCT GC (서열번호 7)
c.2513delA	F: AGC TGG CCT AGA ACC TGA CC (서열번호 8)
c.2513delA	R: CAT CTG AGC CTC TTC CAC CA (서열번호 9)
c.3086C>T	F: TCT TTG CAG TGG GAG TTG TTG (서열번호 10)
c.3086C>T	R: AAT AAA AGA GCA TTG GCG GG (서열번호 11)

또한, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T 에 대하여 서열 특이적인 라이게이션 반응을 위한 프로브를 제작하였다. 프로브는 해당 부위별로 왼쪽 프로브 2개 (야생형 및 돌연변이형 각 1개)와 오른쪽 프로브 1개 (공통)의 세트로 구성된다. 야생형 왼쪽 프로브는 3' 말단이 야생형 서열과 완벽하게 일치하며 돌연변이형 왼쪽 프로브는 3' 말단이 돌연변이형 서열과 완벽하게 일치하여 야생형과 돌연변이형의 염기서열에 따라 특이성을 가질 수 있도록 디자인하였다. 왼쪽 프로브의 5' 말단에는 형광 물질을 표지하였고, 변이가 없는 야생형 유전자 단편과 결합하는 프로브, 즉 야생형 검출용 프로브와 변이가 있는 유전자 단편과 결합하는 프로브, 즉 돌여변이 검출형 프로브는 각각 서로 다른 형광물질로 표지하였다. 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위하여 인산기로 수식하였다.

하기의 표 2는 각 표적 돌연변이 부위의 야생형 및 돌연변이형을 검출하는 프로브를 나타낸다.

표적 돌연변이	프로브	프로브 서열 (5' 말단→3' 말단 방향)
c.2333G>T	야생형 왼쪽	TACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACC (서열번호 12)
	돌연변이형 왼쪽	TACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACA (서열번호 13)
	오른쪽	GGCCCAGGGCAATGAACACAAAGA (서열번호 14)
c.2621C>T	야생형 왼쪽	CTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGC (서열번호 15)
	돌연변이형 왼쪽	CTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGT (서열번호 16)
	오른쪽	GGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTG (서열번호 17)
c.3809A>G	야생형 왼쪽	GGGCCAAGGCCGGGGAGTCAT (서열번호 18)
	돌연변이형 왼쪽	GGGCCAAGGCCGGGGAGTCAC (서열번호 19)
	오른쪽	TGACCCCATCCCCCACCATGG (서열번호 20)
c.2513delA	야생형 왼쪽	GTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAAA (서열번호 21)
	돌연변이형 왼쪽	GTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAA- (서열번호 22)
	오른쪽	GTTTCCAGTGGATGGGAAAGTCCTGGA (서열번호 23)
c.3086C>T	야생형 왼쪽	ACGCCATGGGTAATGGTGCCAG (서열번호 24)
	돌연변이형 왼쪽	ACGCCATGGGTAATGGTGCCAA (서열번호 25)
	오른쪽	TCTTGTCAAACATCACAGTCTTTATCTGCCAAAAAC (서열번호 26)

결과분석 시 모세관 전기영동 상에서 표적 돌연변이 별 라이게이션 산물을 구별하기 위하여 표적 돌연변이를 포함하는 부위에 특이적인 서열에 크기 조절을 위한 충전 서열(stuffer sequence)을 프로브에 추가하여 최종 LDR 산물의 크기를 다르게 할 수 있다. 하기 표 3은 충전 서열의 예시이며, 필요에 따라 길이를 조절하여 사용할 수 있다.

	서열 (5' 말단→3' 말단 방향)
왼쪽 프로브용	GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTA (서열번호 27)
오른쪽 프로브용	TAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 28)

결과분석 시 모세관 전기영동 상에서 표적 돌연변이별 라이게이션 산물을 구별하기 위하여 길이 조절을 위한 충전 서열을 추가하는 방법 외에도 돌연변이별 서로 다른 형광물질을 수식하여 구분할 수 있다.

하기 표 4는 각 돌연변이에 대하여 표적 부위 특이적인 서열 및 충전 서열을 포함하는 LDR 프로브 서열을 보여준다. 야생형 왼쪽 프로브와 돌연변이형 왼쪽 프로브는 각각 HEX 및 FAM으로 표지되었다.

표적 돌연변이	프로브	프로브 서열 (5' 말단→3' 말단 방향)
c.2333G>T	야생형 왼쪽	HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGATACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACC (서열번호 29)
	돌연변이형 왼쪽	FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGATACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACA (서열번호 30)
	오른쪽	P-GGCCCAGGGCAATGAACACAAAGATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 31)
c.2621C>T	야생형 왼쪽	HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTCTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGC (서열번호 32)
	돌연변이형 왼쪽	FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTCTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGT (서열번호 33)
	오른쪽	P-GGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTGAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 34)
c.3809A>G	야생형 왼쪽	HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGGCCAAGGCCGGGGAGTCAT (서열번호 35)
	돌연변이형 왼쪽	FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGGCCAAGGCCGGGGAGTCAC (서열번호 36)
	오른쪽	P-TGACCCCATCCCCCACCATGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 37)
c.2513delA	야생형 왼쪽	HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTAGTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAAA (서열번호 38)
	돌연변이형 왼쪽	FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTAGTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAA- (서열번호 39)
	오른쪽	P-GTTTCCAGTGGATGGGAAAGTCCTGGATAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 40)
c.3086C>T	야생형 왼쪽	HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACACGCCATGGGTAATGGTGCCAG (서열번호 41)
	돌연변이형 왼쪽	FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACACGCCATGGGTAATGGTGCCAA (서열번호 42)
	오른쪽	P-TCTTGTCAAACATCACAGTCTTTATCTGCCAAAAACAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 43)

실시예 2. 중합효소 연쇄반응 및 리가아제 검출 반응에 의한 ATP7B 유전자형 판별

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득된 PCR용 프라이머 및 LDR용 프로브를 이용하여, 검체의 ATP7B 유전자형을 분석하였다.

2-1. 중합효소 연쇄반응

검체의 혈액 등의 샘플로부터 지노믹 DNA를 분리하였다. DNA 분리 및 정제는 G-dex Kit(인트론)를 이용하였다. 중합효소 연쇄반응에는 실시예 1에서 제작된 표적 돌연변이 부위를 포함하는 단편의 증폭용 프라이머(서열번호 2 내지 11)를 사용하였다. 중합효소 연쇄반응 반응물은 각 15 ㎕ 반응을 기준으로 지노믹 DNA 주형 1㎕, 각 프라이머 0.133 uM을 포함하였다. 다중 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 5분간 반응시키고, 94℃에서 1, 57℃에서의 1분, 72℃에서의 1분 30초로 이루어진 사이클을 35회 수행하고, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 중합효소연쇄반응 후에는 Exo-SAP(GE Healthcare)을 처리하여 남아있는 dNTP와 잔류 프라이머를 제거하였다.

2-2. LDR(Ligation Detection Reaction)에 의한 ATP7B 유전자 돌연변이의 검출

리가아제 검출 반응을 위한 반응액은 실시예 2-1에서 수득된 Exo-SAP 처리가 끝난 중합효소 연쇄반응물 1 ㎕와 각 표적 돌연변이와 야생형을 탐침할 수 있는 형광 표지된 프로브(서열번호 29 내지 43) 각각 250 fmole을 첨가한 반응물에 5 Unit의 Taq 리가아제 및 1X 반응버퍼를 포함했다. 반응은 94℃에서 1분, 65℃에서 2분 30초로 이루어진 사이클을 25회 수행하였다. 수행된 결과는 모세관 전기영동을 통해 확인하였다.

도 1은 모세관 전기영동결과를 나타낸다. 모세관 전기영동결과 모두 야생형 프로브에 결합된 형광색의 피크(peak)를 나타내는 샘플은 표적 돌연변이를 포함하는 유전자 부위에서 야생형이고, 5개의 피크 중 야생형에 결합된 형광색의 피크와 돌연변이형 프로브에 결합된 형광색의 피크가 함께 검출되는 샘플은 야생형과 돌연변이형 유전자를 모두 갖는 이형접합 돌연변이(hetero)로 진단할 수 있다.

실시예 3. 임상검체 유전자형 진단

실시예 1에서 제작된 한국인 윌슨병의 원인이 되는 주요한 ATP7B 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T를 검출하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 실제 임상검체를 대상으로 유전자 검사를 실시하였다.

랩지노믹스 진단검사의학과에서 수집된 600개의 샘플로부터 추출한 지노믹 DNA를 주형으로 각 유전형에 대한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 및 LDR을 수행하여 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T 돌연변이 5종에 대한 유전형을 분석하였다. 실험결과 600명 중 c.2333G>T 2명, c.2621C>T 3명, c.3809A>G 1명, c.2513delA 1명, c.3086C>T 1명의 이형접합 변이가 검출되었다. 야생형과 이형접합 돌연변이 검체들에 대한 염기서열분석 결과 100% 결과가 일치함을 확인하였다.

이와 같은 결과는 본 발명의 일 구체예에 따른 ATP7B 돌연변이 검출 방법이 한국인에서 윌슨병을 유발하는 주요한 ATP7B 돌연변이를 효과적으로 검출하여, 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다는 것을 보여준다.

<110> Lab Genomics <120> Detection of ATP7B mutations using PCR-LDR <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4398 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcctgagc aggagagaca gatcacagcc agagaagggg ccagtcggaa aatcttatct 60 aagctttctt tgcctacccg tgcctgggaa ccagcaatga agaagagttt tgcttttgac 120 aatgttggct atgaaggtgg tctggatggc ctgggccctt cttctcaggt ggccaccagc 180 acagtcagga tcttgggcat gacttgccag tcatgtgtga agtccattga ggacaggatt 240 tccaatttga aaggcatcat cagcatgaag gtttccctgg aacaaggcag tgccactgtg 300 aaatatgtgc catcggttgt gtgcctgcaa caggtttgcc atcaaattgg ggacatgggc 360 ttcgaggcca gcattgcaga aggaaaggca gcctcctggc cctcaaggtc cttgcctgcc 420 caggaggctg tggtcaagct ccgggtggag ggcatgacct gccagtcctg tgtcagctcc 480 attgaaggca aggtccggaa actgcaagga gtagtgagag tcaaagtctc actcagcaac 540 caagaggccg tcatcactta tcagccttat ctcattcagc ccgaagacct cagggaccat 600 gtaaatgaca tgggatttga agctgccatc aagagcaaag tggctccctt aagcctggga 660 ccaattgata ttgagcggtt acaaagcact aacccaaaga gacctttatc ttctgctaac 720 cagaatttta ataattctga gaccttgggg caccaaggaa gccatgtggt caccctccaa 780 ctgagaatag atggaatgca ttgtaagtct tgcgtcttga atattgaaga aaatattggc 840 cagctcctag gggttcaaag tattcaagtg tccttggaga acaaaactgc ccaagtaaag 900 tatgaccctt cttgtaccag cccagtggct ctgcagaggg ctatcgaggc acttccacct 960 gggaatttta aagtttctct tcctgatgga gccgaaggga gtgggacaga tcacaggtct 1020 tccagttctc attcccctgg ctccccaccg agaaaccagg tccagggcac atgcagtacc 1080 actctgattg ccattgccgg catgacctgt gcatcctgtg tccattccat tgaaggcatg 1140 atctcccaac tggaaggggt gcagcaaata tcggtgtctt tggccgaagg gactgcaaca 1200 gttctttata atccctctgt aattagccca gaagaactca gagctgctat agaagacatg 1260 ggatttgagg cttcagtcgt ttctgaaagc tgttctacta accctcttgg aaaccacagt 1320 gctgggaatt ccatggtgca aactacagat ggtacaccta catctgtgca ggaagtggct 1380 ccccacactg ggaggctccc tgcaaaccat gccccggaca tcttggcaaa gtccccacaa 1440 tcaaccagag cagtggcacc gcagaagtgc ttcttacaga tcaaaggcat gacctgtgca 1500 tcctgtgtgt ctaacataga aaggaatctg cagaaagaag ctggtgttct ctccgtgttg 1560 gttgccttga tggcaggaaa ggcagagatc aagtatgacc cagaggtcat ccagcccctc 1620 gagatagctc agttcatcca ggacctgggt tttgaggcag cagtcatgga ggactacgca 1680 ggctccgatg gcaacattga gctgacaatc acagggatga cctgcgcgtc ctgtgtccac 1740 aacatagagt ccaaactcac gaggacaaat ggcatcactt atgcctccgt tgcccttgcc 1800 accagcaaag cccttgttaa gtttgacccg gaaattatcg gtccacggga tattatcaaa 1860 attattgagg aaattggctt tcatgcttcc ctggcccaga gaaaccccaa cgctcatcac 1920 ttggaccaca agatggaaat aaagcagtgg aagaagtctt tcctgtgcag cctggtgttt 1980 ggcatccctg tcatggcctt aatgatctat atgctgatac ccagcaacga gccccaccag 2040 tccatggtcc tggaccacaa catcattcca ggactgtcca ttctaaatct catcttcttt 2100 atcttgtgta cctttgtcca gctcctcggt gggtggtact tctacgttca ggcctacaaa 2160 tctctgagac acaggtcagc caacatggac gtgctcatcg tcctggccac aagcattgct 2220 tatgtttatt ctctggtcat cctggtggtt gctgtggctg agaaggcgga gaggagccct 2280 gtgacattct tcgacacgcc ccccatgctc tttgtgttca ttgccctggg ccggtggctg 2340 gaacacttgg caaagagcaa aacctcagaa gccctggcta aactcatgtc tctccaagcc 2400 acagaagcca ccgttgtgac ccttggtgag gacaatttaa tcatcaggga ggagcaagtc 2460 cccatggagc tggtgcagcg gggcgatatc gtcaaggtgg tccctggggg aaagtttcca 2520 gtggatggga aagtcctgga aggcaatacc atggctgatg agtccctcat cacaggagaa 2580 gccatgccag tcactaagaa acccggaagc actgtaattg cggggtctat aaatgcacat 2640 ggctctgtgc tcattaaagc tacccacgtg ggcaatgaca ccactttggc tcagattgtg 2700 aaactggtgg aagaggctca gatgtcaaag gcacccattc agcagctggc tgaccggttt 2760 agtggatatt ttgtcccatt tatcatcatc atgtcaactt tgacgttggt ggtatggatt 2820 gtaatcggtt ttatcgattt tggtgttgtt cagagatact ttcctaaccc caacaagcac 2880 atctcccaga cagaggtgat catccggttt gctttccaga cgtccatcac ggtgctgtgc 2940 attgcctgcc cctgctccct ggggctggcc acgcccacgg ctgtcatggt gggcaccggg 3000 gtggccgcgc agaacggcat cctcatcaag ggaggcaagc ccctggagat ggcgcacaag 3060 ataaagactg tgatgtttga caagactggc accattaccc atggcgtccc cagggtcatg 3120 cgggtgctcc tgctggggga tgtggccaca ctgcccctca ggaaggttct ggctgtggtg 3180 gggactgcgg aggccagcag tgaacacccc ttgggcgtgg cagtcaccaa atactgtaaa 3240 gaggaacttg gaacagagac cttgggatac tgcacggact tccaggcagt gccaggctgt 3300 ggaattgggt gcaaagtcag caacgtggaa ggcatcctgg cccacagtga gcgccctttg 3360 agtgcaccgg ccagtcacct gaatgaggct ggcagccttc ccgcagaaaa agatgcagtc 3420 ccccagacct tctctgtgct gattggaaac cgtgagtggc tgaggcgcaa cggtttaacc 3480 atttctagcg atgtcagtga cgctatgaca gaccacgaga tgaaaggaca gacagccatc 3540 ctggtggcta ttgacggtgt gctctgtggg atgatcgcaa tcgcagacgc tgtcaagcag 3600 gaggctgccc tggctgtgca cacgctgcag agcatgggtg tggacgtggt tctgatcacg 3660 ggggacaacc ggaagacagc cagagctatt gccacccagg ttggcatcaa caaagtcttt 3720 gcagaggtgc tgccttcgca caaggtggcc aaggtccagg agctccagaa taaagggaag 3780 aaagtcgcca tggtggggga tggggtcaat gactccccgg ccttggccca ggcagacatg 3840 ggtgtggcca ttggcaccgg cacggatgtg gccatcgagg cagccgacgt cgtccttatc 3900 agaaatgatt tgctggatgt ggtggctagc attcaccttt ccaagaggac tgtccgaagg 3960 atacgcatca acctggtcct ggcactgatt tataacctgg ttgggatacc cattgcagca 4020 ggtgtcttca tgcccatcgg cattgtgctg cagccctgga tgggctcagc ggccatggca 4080 gcctcctctg tgtctgtggt gctctcatcc ctgcagctca agtgctataa gaagcctgac 4140 ctggagaggt atgaggcaca ggcgcatggc cacatgaagc ccctgacggc atcccaggtc 4200 agtgtgcaca taggcatgga tgacaggtgg cgggactccc ccagggccac accatgggac 4260 caggtcagct atgtcagcca ggtgtcgctg tcctccctga cgtccgacaa gccatctcgg 4320 cacagcgctg cagcagacga tgatggggac aagtggtctc tgctcctgaa tggcagggat 4380 gaggagcagt acatctga 4398 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2333G>T <400> 2 tctggtcatc ctggtggttg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2333G>T <400> 3 aacatggtgt tcagaggaag tga 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2621C>T <400> 4 agctggccta gaacctgacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2621C>T <400> 5 catctgagcc tcttccacca 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3809A>G <400> 6 ggtccaggag ctccagaata a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3809A>G <400> 7 acagtgagga aggggtctgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2513delA <400> 8 agctggccta gaacctgacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2513delA <400> 9 catctgagcc tcttccacca 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forwrad primer for c.3806C>T <400> 10 tctttgcagt gggagttgtt g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3806C>T <400> 11 aataaaagag cattggcggg 20 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2333G>T <400> 12 tacctttgcc aagtgttcca gccacc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2333G>T <400> 13 tacctttgcc aagtgttcca gccaca 26 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2333G>T <400> 14 ggcccagggc aatgaacaca aaga 24 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2621C>T <400> 15 ctaagaaacc cggaagcact gtaattgc 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2621C>T <400> 16 ctaagaaacc cggaagcact gtaattgt 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2621C>T <400> 17 ggggtctata aatgcacatg gctctgtg 28 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3809A>G <400> 18 gggccaaggc cggggagtca t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3809A>G <400> 19 gggccaaggc cggggagtca c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3809A>G <400> 20 tgaccccatc ccccaccatg g 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2513delA <400> 21 gtcaaggtgg tccctggggg aaa 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2513delA <400> 22 gtcaaggtgg tccctggggg aa 22 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2513delA <400> 23 gtttccagtg gatgggaaag tcctgga 27 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3086C>T <400> 24 acgccatggg taatggtgcc ag 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3086C>T <400> 25 acgccatggg taatggtgcc aa 22 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3086C>T <400> 26 tcttgtcaaa catcacagtc tttatctgcc aaaaac 36 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stuffer sequence for left probe <400> 27 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagta 36 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stuffer sequence for right probe <400> 28 taaatctact ctagattgga tcttgctggc ac 32 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2333G>T <400> 29 gggttcccta agggttggat acctttgcca agtgttccag ccacc 45 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2333G>T <400> 30 gggttcccta agggttggat acctttgcca agtgttccag ccaca 45 <210> 31 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2333G>T <400> 31 ggcccagggc aatgaacaca aagatctaga ttggatcttg ctggcac 47 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2621C>T <400> 32 gggttcccta agggttggac gctctaagaa acccggaagc actgtaattg c 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2621C>T <400> 33 gggttcccta agggttggac gctctaagaa acccggaagc actgtaattg t 51 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2621C>T <400> 34 ggggtctata aatgcacatg gctctgtgaa tctactctag attggatctt gctggcac 58 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3809A>G <400> 35 gggttcccta agggttggag ggccaaggcc ggggagtcat 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3809A>G <400> 36 gggttcccta agggttggag ggccaaggcc ggggagtcac 40 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3809A>G <400> 37 tgaccccatc ccccaccatg gtctagattg gatcttgctg gcac 44 <210> 38 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2513delA <400> 38 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagtagtca aggtggtccc tgggggaaa 59 <210> 39 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2513delA <400> 39 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagtagtca aggtggtccc tgggggaa 58 <210> 40 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2513delA <400> 40 gtttccagtg gatgggaaag tcctggataa atctactcta gattggatct tgctggcac 59 <210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3086C>T <400> 41 gggttcccta agggttggac gctactacac gccatgggta atggtgccag 50 <210> 42 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3086C>T <400> 42 gggttcccta agggttggac gctactacac gccatgggta atggtgccaa 50 <210> 43 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3086C>T <400> 43 tcttgtcaaa catcacagtc tttatctgcc aaaaacaaat ctactctaga ttggatcttg 60 ctggcac 67

Claims

윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이를 포함하는 단편을 증폭시키는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계, 및
수득된 PCR 산물을 대상으로 리가아제 검출 반응(LDR)을 수행하여, ATP7B 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하고,
상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,
상기 LDR은 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어진 프로브 세트를 이용하여 수행되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 왼쪽 프로브의 5' 말단은 형광 물질로 표지되고, 상기 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위한 인산기로 수식되는 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 야생형 검출용 왼쪽 프로브와 상기 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브는 상이한 형광 물질로 표지되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 LDR에서
상기 c.2333G>T은 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며, 및
상기 c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 LDR에서
상기 c.2333G>T은 서열번호 29 내지 31의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 32 내지 34의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 35 내지 37의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2513delA는 서열번호 38 내지 40의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며, 및
상기 c.3086C>T는 서열번호 41 내지 43의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 형광 물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 PCR은 서열번호 2 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머 쌍을 이용하여 수행되는 것인 방법.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리가아제 검출 반응(LDR)은 모세관 전기영동에 의해 LDR 산물을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
서열번호 2 내지 11의 PCR 프라이머 및 서열번호 12 내지 26의 서열을 포함하는 LDR 프로브를 포함하는, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 조성물로서,
상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,
상기 c.2333G>T은 서열번호 2 및 3의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 4 및 5의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 6 및 7의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2513delA는 서열번호 8 및 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며, 및
상기 c.3086C>T는 서열번호 10 및 11의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지는 것인 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성되는 것인 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 LDR 프로브 중 야생형 검출용 왼쪽 LDR 프로브와 돌연변이형 검출용 왼쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 상이한 형광 물질로 표지되고, 오른쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 라이게이션을 위한 인산기로 수식되는 것인 조성물.
청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 윌슨병의 진단용인 것인 조성물.
서열번호 12 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을을 포함하는 프로브로 이루어진, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 LDR 프로브 세트로서,
상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,
각 LDR 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지고,
c.2333G>T는 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며,
c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고, 및
c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 LDR 프로브 세트.