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KR20160067901A - ＲＮＡ 간섭에 사용하기 위한 ＲＮＡｉ 작용제를 위한 3'' 말단 캡 - Google Patents

ＲＮＡ 간섭에 사용하기 위한 ＲＮＡｉ 작용제를 위한 3'' 말단 캡 Download PDF

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KR20160067901A
KR20160067901A KR1020167011437A KR20167011437A KR20160067901A KR 20160067901 A KR20160067901 A KR 20160067901A KR 1020167011437 A KR1020167011437 A KR 1020167011437A KR 20167011437 A KR20167011437 A KR 20167011437A KR 20160067901 A KR20160067901 A KR 20160067901A
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제레미 리 바리자
마르셀 블로머스
세자르 페르난데츠
에린 제노
알바르 고저트
폴레트 그리니지
디터 휘스켄
위르크 훈지커
프랑수아 장-샤를 나트
아누프 파트나이크
앤드류 패터슨
장-미셀 렌 롱도
얀 바일러
메이쳉 주
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Abstract

본 발명은 3' 말단 캡으로서 신규한 화합물을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물 및 신규한 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 조성물의 제조 방법 및 예를 들어, RNA 간섭을 매개하기 위한 그러한 조성물의 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

ＲＮＡ 간섭에 사용하기 위한 ＲＮＡｉ 작용제를 위한 3' 말단 캡{3' END CAPS FOR RNAi AGENTS FOR USE IN RNA INTERFERENCE}
본 발명은 3' 말단 캡으로서 신규한 화합물을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물 및 신규한 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 조성물의 제조 방법, 및 예를 들어, RNA 간섭을 매개하기 위한 그러한 조성물의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNAi)은 서열-특이적 유전자 침묵화 메커니즘이다. 이러한 과정은 특정 서열을 표적으로 하는 RNAi 작용제를 세포 내로 도입함으로써 인공적으로 유도될 수 있다. 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 구조가 RNAi 작용제에 적합하다. RNAi 작용제는 변형될 수 있는 이중-가닥 RNA를 포함하는 임의의 다양한 구조를 가질 수 있다.
RNAi 작용제는 치료 용도에 바람직하다. 그러나 이러한 용도는 때때로 혈청에서의 이들 분자의 분해에 의해 매개되는 짧은 활성 기간에 의해 제한된다. 네이키드(naked) RNAi 작용제는 종종 수 분의 반감기를 갖는다. 문헌[Layzer et al. 2004 RNA 10: 766-771]; 문헌[Choung et al. 2006 Biochem. Biophys. Res. Comm. 342: 919-927]; 문헌[Sato et al. 2007 J. Control. Rel. 122: 209-216].
따라서, RNA 간섭 활성을 방해하지 않고, 혈청에서의 활성, 생물학적 반감기 및/또는 활성 기간을 증가시키는 RNAi 작용제를 위한 신규한 변형이 필요하다.
이들 변형을 갖는 RNAi 작용제는 RNA 간섭 메커니즘을 통한 표적-특이적 침묵화 방법에 유용할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물을 포함한다:
[화학식 Ia]
Figure pct00001
상기 식에서,
X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 여기서, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
Y는 CH 또는 N이며;
m은 0 또는 1이고;
p는 1, 2 또는 3이며;
R3은 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질, 석시네이트 또는 고체 지지체(예를 들어, 비드 또는 수지)이고;
(CH2)m-O-R3 모이어티는 위치 3 또는 4에서 페닐 고리에 부착되며;
R4는 수소이고;
R5는 수소이거나; R4 및 R5는 R4 및 R5가 부착되는 페닐 고리와 함께, 6H-벤조[c]크로멘을 형성한다.
ODMT는 산소 원자를 통해 연결된 DMT(4,4'-디메톡시트리틸)이다.
본원에 기재된 다양한 구현예에서, 고체 지지체는 제한 없이, 비드, 수지 또는 운반체를 포함한다. 화합물의 고정화를 위하여 수많은 적합한 고체 지지체가 사용될 수 있다. 적합한 고체 지지체의 예는 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란(예를 들어, 세파덱스(Sephadex), 세파로스(Sepharose)로 구매가능) 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 여과지, 니트로셀룰로스, 이온 교환 수지, 플라스틱 필름, 폴리아민메틸비닐에테르 말레산 코폴리머, 유리 비드, 아미노산 코폴리머, 에틸렌-말레산 코폴리머, 나일론, 실크 등을 포함한다.
다양한 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물은 표 1A로부터 선택된다:
[표 1A]
Figure pct00002
Figure pct00003
일 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ib의 화합물을 포함한다:
[화학식 1b]
Figure pct00004
상기 식에서,
X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 여기서, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
q는 0, 1 또는 2이며;
R6은 비치환되거나, 벤족시 및 3,4-디하이드록시부틸로부터 선택되는 기로 치환된 페닐이고;
R7은 수소 또는 하이드록시-에틸이며, R7이 하이드록시-에틸이면, 하이드록실은 석시네이트로서 임의로 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고;
R8은 수소 또는 메톡시이며;
Y1은 CH 또는 N이고;
Y2는 N 또는 CR9이며; R9는 수소 및 메틸로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, Ib의 화합물은 표 1B로부터 선택된다:
[표 1B]
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
다양한 구현예에서, 본 발명은 표 1C로부터 선택되는 화합물에 관한 것이다:
[표 1C]
Figure pct00009
Figure pct00010
상기 식에서,
X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 여기서, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
q는 1 및 2로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명은 RNAi 작용제를 표 1D로부터 선택되는 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단의 캡핑 방법을 포함한다:
[표 1D]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
상기 식에서,
X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 여기서, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고,
q는 1 및 2로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 DMT-리간드, 석시네이트-리간드 및/또는 카르복실레이트 리간드, 예를 들어, 표 4에 열거된 것들에 관한 것이다. 이들은 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물, 본원의 임의의 표로부터의 화합물을 포함하는 3' 말단 캡 또는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제를 생성하는데 유용하다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물에 관한 것이고, 여기서, X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 및 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단으로부터 선택되며, 여기서, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고; R3은 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질 및 석시네이트로부터 선택되거나, 고체 지지체(예를 들어, 비드 또는 수지)에 부착된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물에 관한 것이고, 여기서, X는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 여기서, 적어도 가닥의 3'-말단은 3' 말단 캡을 포함하고, 3' 말단 캡은 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물(여기서, X는 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단임), 본원의 임의의 표로부터의 화합물 또는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡으로부터 선택된다.
일 구현예에서, RNAi 작용제의 제1 및/또는 제2 가닥은 약 49개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제의 제1 및/또는 제2 가닥은 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
일 구현예에서, 제1 및/또는 제2 가닥은 19개의 뉴클레오티드 길이이다.
일 구현예에서, 제1 가닥은 안티-센스 가닥이며, 19개의 뉴클레오티드 길이이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 1 또는 2개의 블런트(blunt)-말단을 갖는다.
다른 구현예에서, RNAi 작용제는 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 오버행(overhang)을 포함한다.
다른 구현예에서, RNAi 작용제는 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 1 내지 6개의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 스페이서를 포함한다.
일 구현예에서, 스페이서는 리비톨 또는 다른 유형의 무염기(abasic) 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, 스페이서는 리비톨 또는 다른 유형의 무염기 뉴클레오티드, 2'-데옥시-리비톨, 디리비톨, 2'-메톡시에톡시-리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), C3, C4, C5, C6 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된다.
일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택된다. 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택된다. 다양한 양태에서, 뉴클레오티드 서브유닛은 당의 2' 위치에서 화학적으로 변형된다. 일 양태에서, 2' 화학 변형은 할로, C1-10 알킬, C1-10 알콕시, 할로 등으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 2' 화학 변형은 -OCH3(즉, "OMe"), -OCH2CH3(즉, "OEt") 또는 -CH2OCH2CH3(즉, 메톡시에틸 또는 "MOE")로부터 선택되는 C1-10 알콕시이거나; 또는 F로부터 선택되는 할로이다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금(locked) 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 안하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나; 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며(예를 들어, 뉴클레오티드의 적어도 하나의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체됨), 변형된 뉴클레오시드간 링커는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음)로부터 선택된다.
일 구현예에서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형된다.
일 구현예에서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드는 2'-MOE이다.
일 구현예에서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체된다.
다른 구현예에서, 제1 또는 제2 가닥은 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥이다.
다양한 구현예에서, 센스 가닥은 하기에서 선택되는 5' 말단 캡을 포함한다: 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT.
다양한 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 적어도 가닥의 3'-말단은 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡은 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물, 본원의 임의의 표로부터의 화합물 또는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡으로부터 선택되고; 임의로, 각 가닥은 49-mer 이하이며, 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥은 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이고/거나 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이며; 임의로, RNAi 작용제는 1 또는 2개의 블런트-말단을 갖거나, RNAi 작용제는 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 오버행, 임의로, 1 내지 6개 뉴클레오티드 오버행을 포함하고; RNAi 작용제는 임의로 스페이서를 포함하며, 임의로, 스페이서는 리비톨 또는 다른 유형의 무염기 뉴클레오티드, 2'-데옥시-리비톨, 디리비톨, 2'-메톡시에톡시-리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), C3, C4, C5, C6 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올이고; 임의로, 하나의 또는 둘 모두의 가닥은 RNA이거나, 임의로, RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형되며, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택되고, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택되며; 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 언하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나(비-뉴클레오티드, C2'-C3' 결합이 존재하지 않는 비환식 유사체); 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며, 변형된 뉴클레오시드간 링커는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물로부터 선택되고; 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드는 2'-MOE이며; 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되고; 임의로, 제1 또는 제2 가닥은 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥이며, 임의로, 5' 말단 캡은 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT로부터 선택된다.
상호 배타적이 아닌 본원에 개시된 다양한 구현예의 다양한 요소[예를 들어, 조성물 및 방법; 및 3' 말단 캡, 뉴클레오티드 변형 또는 (예를 들어, DNA로의) 대체, 변형 패턴, 가닥 길이, 오버행의 존재 또는 부재, 및/또는 5' 말단 캡 및 전달 비히클의 선택]가 조합될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 특성 중 임의의 하나 이상을 갖는 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한 상기 특성 중 임의의 하나 이상을 갖는 RNAi 작용제를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 임의의 RNAi 작용제 중 하나 이상을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 세포에서의 표적 유전자의 수준 및/또는 활성의 억제 방법, 또는 그의 억제 또는 감소 방법에 관한 것이다.
다수의 RNAi 작용제(동일하거나 상이한 유형의 RNAi 작용제, 및/또는 3' 말단 캡, 서열, 길이, 오버행, 5' 말단 캡, 뉴클레오티드 대체 및/또는 변형 및/또는 변형의 패턴 등의 조합을 포함할 수 있음)는 개별적으로 투여되거나 동시-투여될 수 있다. 다수의 RNAi 작용제는 동일한 전달 비히클, 동일한 유형의 전달 비히클 또는 상이한 전달 비히클에서 투여될 수 있다.
다양한 추가의 구현예가 하기에 기재되어 있다.
본 발명의 하나 이상의 양태의 상세사항은 첨부된 도면 및 하기의 설명에 기재되어 있다. 상호 배타적이지 않은 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 다양한 양태의 요소(예를 들어, 서열, 변형, 치환, 스페이서, 변형된 뉴클레오시드간 링커, 말단캡, RNAi 작용제의 조합, 전달 비히클, RNAi 작용제 및 다른 작용제를 포함하는 병용 요법 등)는 서로 조합될 수 있되, 단, 작용제 또는 작용제들은 여전히 RNA 간섭을 매개할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 RNAi 작용제 서열은 임의의 세트의 본원에 개시된 변형 또는 말단캡과 조합될 수 있다. 유사하게, 변형, 5' 말단 캡 및/또는 3' 말단 캡의 임의의 조합은 본원에 개시된 임의의 RNAi 작용제 서열과 함께 사용될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 RNAi 작용제(변형 또는 말단캡의 임의의 조합이 존재하거나, 변형 또는 말단캡 중 어느 하나가 부재임)는 임의의 다른 RNAi 작용제 또는 다른 치료 조성물 또는 본원에 개시된 방법과 조합될 수 있다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이러한 설명, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 실시예 1에 사용된 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 구조 및 서열을 예시한 것이다. 도 1에서 SEQ ID NO: 1 및 2(포괄적 서열); 및 3 및 4(안티센스 및 센스 F7)에 의해 상측에서 하측으로 서열이 나타나 있다. 3' 말단 캡("X")의 구조가 본원 및/또는 미국 특허 제8,084,600호에 제공되어 있다.
도 2는 RNAi 작용제가 RNA 간섭을 매개하게 함에 있어서, 실시예 1에 기재된 바와 같은 3' 말단 캡(C3, C6, C12, 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, 비페닐, 리토콜, C7 아미노 또는 C3 아미노)을 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여준다. 3' 말단 캡("X")의 구조는 본원 및/또는 미국 특허 제8,084,600호에 제공되어 있다.
도 3은 혈청 중 뉴클레아제 분해의 감소 및/또는 방지에서의 실시예 1에 기재된 3' 말단 캡의 효능을 보여준다.
도 4는 실시예 1에서 사용되는 다양한 RNAi 작용제의 품질 조절을 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 잔류 발현 수준을 보여주며, 실시예 3A에 기재된 바와 같이 가이드 가닥 상에 3' 말단 캡: BP(비페닐), C6, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068 및 X069를 포함하는 다양한 RNAi 작용제에 의해 매개되는 시험관내 RNA 간섭 또는 KD(녹다운)를 나타낸다. 이들 RNAi 작용제는 2'-MOE 클램프(clamp) 부재(-) 또는 2'-MOE 클램프 존재(MOE); 또는 리비톨 스페이서 부재(-) 또는 리비톨 스페이서 존재(rib)이다. 도 5a에 대한 설명은 도 5b의 하측에 제공되어 있으며, 이러한 데이터는 실시예 3A에 관한 것이다. 이들은 헵시딘(Hepcidin)에 대한 RNAi 작용제이다.
도 6a 및 도 6b는 도 5a 및 도 5b, 및 실시예 3A 등에 나타낸 데이터에 사용되는 RNAi 작용제의 일부를 상세히 나타낸 것이다. 도 6a에서 상측에서 하측으로, SEQ ID NO: 5 내지 10(400), 11 내지 16(402) 및 17(400 21-mer)로 서열이 표현된다. 도 6b에서 상측에서 하측으로, SEQ ID NO: 18 내지 23(400); 24 내지 29(402) 및 30(400 21-mer)로 서열이 표현된다. 이들은 헵시딘에 대한 RNAi 작용제이다.
도 7은 1.57 nM 내지 15 nM 범위의, 3' 말단 캡(C6, BP, X027, X058, X067, X038, X069 또는 X052)을 포함하는 RNAi 작용제의 잔류 유전자 활성[잔류 유전자 활성 = 100% - 낙 다운(KD)]을 보여준다. 실시예 3A에 기재된 바와 같이 가닥의 형식이 나타나 있다. 이들은 마우스 헵시딘에 대한 RNAi 작용제이다.
도 8a 및 도 8b는 ABI Hamp1 Taqman 검정(도 8a) 및 Hamp1 특이적 Taqman 검정(도 8b) 둘 모두에서, 3' 말단 캡이 있는 RNAi 작용제의 전부가 1×3 ㎎/㎏ 용량을 사용하여 투여후 48시간에, 생체내에서 낙다운을 매개할 수 있었음을 보여준다. 사용된 3' 말단 캡은 실시예 3B에 기재된 바와 같이 X052, X058, X067, X038, X069 및 X027, 대조군으로서 C6이었다. 이들은 생체내에서 시험된 마우스 헵시딘에 대한 RNAi 작용제이다.
도 9a는 X058 3' 말단 캡을 포함하는 듀플렉스가 실시예 3B에 기재된 바와 같이 1×3 ㎎/㎏ 용량을 사용하여 생체내에서 투여후 168시간(제7일)에 여전히 RNA 간섭(헵시딘 낙다운에 의해 측정)을 매개할 수 있었음을 보여준다. 도 9b는 C6 3' 말단 캡을 포함하는 듀플렉스의 회합에 비한, X058 3' 말단 캡을 포함하는 듀플렉스의 Ago2와의 회합의 증가를 보여준다. 이들은 생체내에서 시험된 마우스 헵시딘에 대한 RNAi 작용제이다.
도 10은 실시예 3B에 기재된 바와 같이, A160 및 A161 형식, 및 다양한 3' 말단 캡(C6 또는 BP) 또는 리비톨 스페이서 및 3' 말단 캡(ribC6)의 RNAi 작용제의 생체내 비교를 보여준다. 이들은 인간 헵시딘 RNAi 작용제이다.
도 11(상측)은 18-mer RNAi 작용제 형식의 비제한적인 예를 보여준다. "L"은 비-뉴클레오티드 "리간드", 예를 들어, 사용될 수 있는 다양한 3' 말단 캡 중 임의의 것을 나타낸다(예를 들어, PAZ 리간드). 이러한 포괄적 서열은 SEQ ID NO: 31 및 32로 나타나 있다. 또한, 도 11(중간)은 다양한 가닥의 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 리비톨 스페이서(rib), 포스페이트(p) 및 3' 말단 캡(X058 또는 C6)을 포함하고, 3' 말단 포스페이트에 결합된 18-mer RNAi 작용제의 특정 예를 보여준다. 이들 서열은 SEQ ID NO: 33 및 34(400), 및 35 및 36(402)으로 나타나 있다. 또한, 다양한 변형이 나타나 있다(하측).
도 12는 석시네이트 형태를 사용하여 3' 말단 캡(X058)을 포함하는 RNAi 작용제의 합성의 비제한적인 예를 보여준다.
도 13은 X058, X109, X110, X111, X112 및 X113 3' 말단 캡의 구조를 보여준다. TF-26-BC53은 RNAi 작용제를 나타내며, 이들 3' 말단 캡은 임의의 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제의 어느 하나의 또는 둘 모두의 가닥에서 사용될 수 있다.
도 14는 3' 말단 캡(C6); 또는 5'에서 3' 순서로, 스페이서(C3), 포스페이트(p) 및 3' 말단 캡(C6) 또는 C3pC6을 포함하는 다양한 RNAi 작용제의 시험관내 효능을 보여준다. 이들 서열은 상측에서 하측으로, SEQ ID NO: 37 내지 44로 나타나 있다. 시험된 RNAi 작용제는 마우스 인자 VII에 대한 것이다.
도 15a 및 도 15b는 RNAi 작용제에 대한 몇몇의 상이한 변형 체계를 보여준다. 이들 RNAi 작용제는 3' 말단 캡(C3)을 포함한다. 도 15b는 "wt"(야생형) 및 변형된 RNAi 작용제의 맥락에서 변형 체계를 보여주며, RNAi 작용제는 뉴클레오티드 dTdT 또는 dTsdT 오버행을 포함하고, 이는 3' 말단 캡으로 대체될 수 있다. 또한, 도 15c는 3' 디뉴클레오티드 오버행 또는 3' 말단 캡(L 또는 비-뉴클레오티드 리간드)을 추가로 포함할 수 있는 19 bp 또는 18 bp 스템(이중-가닥 영역)의 맥락에서 예시적인 변형 체계를 보여준다. 나타낸 다양한 변형 체계는 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 RNAi 작용제와 함께 사용될 수 있다. 도 15a에서, 포괄적 서열이 상측에서 하측으로, SEQ ID NO: 45 내지 48로 나타나 있다. 도 15b에서, 이들 서열이 상측에서 하측으로 SEQ ID NO: 49 내지 52로 나타나 있다. 도 15c에서, 포괄적 서열이 상측에서 하측으로 SEQ ID NO: 53 내지 56으로 나타나 있다. 도 15c에서, 예시적인 19-mer를 일 예에서, 안티센스 가닥 상의 말단 3' 뉴클레오티드 및 센스 가닥 상의 5' 말단 뉴클레오티드를 결실시켜 이중-가닥 분자를 유지함으로써 18-mer로 전환시킬 수 있다.
도 16a는 다양한 3' 말단 캡 중 임의의 것을 포함하는 RNAi 작용제의 시험관내 효능을 보여준다: X058, X109, X110, X111, X112, X113 또는 C6(양성 대조군). 도 16b는 이러한 실험 등에 사용되는 분자의 구조를 보여준다. X109, X110, X111, X112 또는 X113을 포함하는 RNAi 작용제는 안티-센스 가닥의 5' 말단에 DNA 변형을 포함한다. 듀플렉스는 20 내지 28로 넘버링된다. 도 16b의 서열은 SEQ ID NO: 57(제1 서열) 및 58(제2 서열)로 나타나 있다. 이들은 HuR에 대한 RNAi 작용제(ELAVL1)이다. 서열은 hs(인간) 1186으로 표기되어 있으나, 인간, 마우스 및 랫트 간에 교차-반응성이다.
도 17a 내지 도 17i는 RNAi 작용제의 5' 말단 캡핑과 관련된 데이터를 보여준다. 도 17a는 2개의 5' 말단을 보여준다. 도 17b는 HAMP RNAi 작용제에 대한 5' 말단 캡핑의 영향을 보여준다. 도 17c는 다양한 5' 말단 캡을 도해한 것이다. 도 17d는 다양한 5' 말단 캡 및 서열을 예시한 것이다. 도 17a에서 서열은 상측에서 하측으로 그리고 좌측에서 우측으로 SEQ ID NO: 59 내지 66으로 나타나 있다. 도 17c에서 서열은 상측에서 하측으로 SEQ ID NO: 67 내지 72로 나타나 있다. 도 17d 및 도 17f에서 듀플렉스는 10 내지 15로 넘버링된다.
도 18a, 도 18b 및 도 18c는 실시예 5에 기재된 바와 같이 C6, C8 또는 C10 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 SSB RNAi 작용제의 구조 및 효능을 보여준다. 도 18c는 RNAi 작용제 가닥의 3' 말단의 예시적인 구조를 보여준다. 가닥은 뉴클레오티드(BASE 존재), 및 디뉴클레오티드(wt 또는 야생형); 또는 3' 말단 캡(C6, C8 또는 C10)에 결합된 3' 포스페이트로 종결된다. 이들 구조는 예를 들어, LNP-제형화된 SSB siRNA에서 사용되었으나, 임의의 길이, 임의의 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제에 대하여 사용될 수 있다. RNAi 작용제는 SSB(쇼그렌 증후군 항원 B)에 대한 것이며, 3' 말단 캡(C6, C8 또는 C10)을 갖는 19-mer를 포함한다. SSB-309 A22S26으로 표기된 화합물은 21-mer 대조군이다. 실험을 마우스에서 생체내에서 행하였다. 도 18b는 도 18a에 나타낸 막대 그래프를 생성하기 위해 사용되는 데이터점을 보여준다. 또한, 도 18c는 3' 말단 포스페이트가 도시된 화합물로 대체될 수 있음을 보여준다. RNAi 작용제의 어느 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 포스페이트 중 임의의 것은 도시된 화합물로 대체될 수 있다.
도 19는 디뉴클레오티드(예를 들어, CU 오버행) 또는 디리비톨, 리비톨 및 X027인 3' 말단 캡에 결합된 RNAi 작용제의 3' 말단 뉴클레오티드의 구조를 도해한 것이다. 또한, 5'에서 3'순서로 스페이서(리비톨), 제2 포스페이트 및 3' 말단 캡(C6 또는 X058)에 결합된 3' 말단 뉴클레오티드(2'-MOE) 및 포스페이트의 구조가 도시되어 있다.
도 20a 및 도 20b는 다양한 변형을 포함하는 3' 말단 캡 및 2'-MOE 클램프의 효능을 보여준다. 다양한 RNAi 작용제에서, 둘 모두의 가닥의 3' 말단 포스페이트(P 또는 PO)는 포스포로티오에이트(P 또는 PS)로 대체되며, 3' 말단 캡은 C3이다. 대조군 RNAi 작용제는 3' 말단 캡이 결여되며, 3' 말단 디뉴클레오티드(dTpdT, 여기서 "p"는 포스페이트 또는 포스포로티오에이트임)를 포함한다. 도 20a 및 도 20b는 포스포로티오에이트-C3(PS-C3)의 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여준다. 도 20c, 도 20d 및 도 20e는 2'-MOE 클램프를 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여주며, 5'에서 3'으로 계수하여 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드는 RNA, DNA, 2'-MOE, 2'-F 또는 LNA이다. 따라서, 다양한 RNAi 작용제에서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 LNA로 대체된다. 도 20d 및 도 20e에서 RNAi 작용제에 대하여, 모든 시험된 RNAi 작용제는 효율적이었다. 백분율이 낙다운을 나타내지 않고, 다른 RNAi 작용제에 비한 낙다운을 나타내는 것이 주목된다. 예를 들어, 100%는 이들 효율적인 RNAi 작용제의 모든 안티센스 가닥의 평균 낙다운을 나타낸다. 도 20a에서 서열은 상측에서 하측으로 SEQ ID NO: 73 내지 84로 나타나 있다. 도 20c에서 서열은 상측에서 하측으로 SEQ ID NO: 85 및 86으로 나타나 있다.
도 21은 스페이서[리비톨(rib), C3 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올(A5300)임]; 포스페이트; 및 X058인 3' 말단 캡을 포함하는 예시적인 RNAi 작용제의 구조를 보여준다. 도면은 18-mer RNAi 작용제 및 특정 3' 말단 캡의 맥락에서 스페이서를 도시한 것이나, 스페이서는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제 가닥과 함께 그리고 임의의 3' 말단 캡과 함께 사용될 수 있다.
도 22는 소정의 가닥을 포함하는 예시적인 RNAi 작용제의 RNAi 작용제 활성의 효능 및 기간을 보여주며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트으로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 리비톨(rib), C3 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올(A5300)인 스페이서; 포스페이트; 및 X058 또는 C6인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 듀플렉스는 1 내지 6으로 넘버링된다. 이들은 HuR(ELAVL1)에 대한 RNAi 작용제이다. UNT: 미처리(음성 대조군). NTC: 비-표적 대조군(상이한 표적을 표적으로 하는 비관련 RNAi를 사용하는 음성 대조군).
도 23a 내지 도 23c는 X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1024 또는 X1025(도 23a); X1011, X1012, X1013, X058, X1015, X1016, X1017, X1026, X1027(도 23b): 또는 X1018; X1019, X1020, X1021, X1022 또는 X1028(도 23c)인 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여준다. 용어 C3 링커, C4 링커 및 C5 링커는 3' 말단 캡의 부분을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 X110, X1012, X1018, X111, X1013, X112, X058, X1019, X1025, X1027 또는 X1028인 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능 및 기간을 보여준다.
본 발명은 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물, 본원의 임의의 표로부터의 화합물 또는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡을 포함하는 신규한 화합물에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물(예를 들어, 여기서, X는 H 또는 OH임), 본원의 임의의 표로부터의 화합물을 포함하는 3' 말단 캡 또는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제를 생성하는데 유용한 DMT-리간드, 석시네이트-리간드 및/또는 카르복실레이트 리간드, 예를 들어, 표 4에 열거된 것들에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물에 관한 것이며, 여기서, X는 H, OH, ODMT, 카르복실산 및 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단으로부터 선택되고; R3은 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질 및 석시네이트로부터 선택되거나, 고체 지지체(예를 들어, 비드 또는 수지)에 부착된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 본원에 X058로 표기된 화합물에 관한 것이며, 여기서, X는 H, OH, ODMT, 카르복실산 및 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단으로부터 선택되고; R3은 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질 및 석시네이트로부터 선택되거나, 고체 지지체(예를 들어, 비드 또는 수지)에 부착된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제에 관한 것이며, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 이러한 경우에, X는 제1 또는 제2 가닥을 나타낸다.
일 구현예에서, 화학식 Ia 및 Ib의 화합물 및 표 1A, 1B 또는 1C의 것들은 RNAi 작용제 상의 3' 말단 캡으로 사용될 수 있으며; 이들 구현예에서, X는 RNAi 작용제 가닥의 3' 말단이다.
일 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 여기서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단은 3' 말단 캡(예를 들어, 3' 말단에서 변형)을 포함하며, 3' 말단 캡은 표 1 또는 표 2에 열거된 3' 말단 캡 또는 다르게 본원에 개시된 것들로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 여기서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 안티센스 가닥의 3'-말단은 3' 말단 캡(예를 들어, 3' 말단에서 변형)을 포함하며, 3' 말단 캡은 표 1 또는 표 2에 열거된 3' 말단 캡 또는 다르게 본원에 개시된 것들로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, RNAi 작용제는 이중-가닥 RNA일 수 있다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 또는 상이한 백본의 뉴클레오티드, 또는 PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA로의 RNA의 대체 또는 치환은 "변형"으로 여겨질 수 있다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 포스페이트는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 또는 화학식 I의 화합물(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음)로 대체될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제에 관한 것이며, 여기서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단은 포스페이트(본원에 "p" 또는 "PO"로 표기) 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서는 리비톨, 2'-데옥시-리비톨, 디리비톨, 2'-메톡시에톡시-리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨) 또는 C3, C4, C5 또는 C6 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올이며; 3' 말단 캡은 표 1 또는 표 2에 열거되거나 또는 다르게 본원에 개시된 3' 말단 캡으로부터 선택되고; 임의로 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되며; 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 링커(예를 들어, 뉴클레오티드의 적어도 하나의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체됨)를 포함한다.
본원에 개시된 3' 말단 캡 및 스페이서는 길이, 서열 또는 표적과 상관없이, 임의의 RNAi 작용제의 하나의 또는 둘 모두의 가닥과 함께 사용될 수 있다.
네이키드 siRNA(예를 들어, 개시된 바와 같이 3' 말단 캡이 결여된 것들)는 장액에서 혈청에서 종종 오직 수 분의 매우 짧은 생물학적 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 짧은 반감기는 예를 들어, 뉴클레아제에 의한 분해 때문일 수 있다. 많은 3' 말단 캡을 RNAi 작용제에서 사용하기 위하여 시험하였지만, 대부분은 (1) RNA 간섭 활성을 가능하게 하는 것 및 (2) 활성 기간을 증가(예를 들어, 분해를 감소)시키는 것 둘 모두를 행하지 않았다. 대조적으로, 본 발명의 3' 말단 캡은 RNA 간섭을 가능하게 하는 것 및 RNAi 작용제의 기간을 증가(예를 들어, 분해를 감소)시키는 것 둘 모두를 가능하게 한다. 바람직한 3' 말단 캡은 개선된 낙다운(RNA 간섭 활성) 및/또는 추가의 개선된 활성 기간을 갖는다. 임의의 특정 과학적 이론에 제한하지 않고, 본 발명은 이들 영향 중 하나 또는 둘 모두가 다이서(Dicer)의 PAZ 도메인과의 특이적인 상호작용으로부터 및/또는 감소된 엑소뉴클레아제 활성을 통한 안정성의 개선을 통해 야기될 수 있음을 뒷받침한다.
또한, RNAi 작용제가 이중-가닥이기 때문에, 어느 가닥은 RISC(RNA 유도 침묵화 복합체)에 로딩될 수 있다. 이에 따라, 센스 가닥이 로딩될 수 있으나, 오직 안티센스 가닥만이 올바른 서열을 표적으로 한다는 문제가 있다. "PAZ 리간드"로 표기된 것들을 포함하는 본원에 개시된 신규한 3' 말단 캡은 안티센스 가닥이 로딩되는 것을 돕고, 이는 효율, 안정성 및 작용 기간을 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단은 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡을 포함한다.
또한, 본 발명은 시험관내에서 또는 유기체, 예를 들어, 포유류, 예를 들어, 인간에서의 표적 유전자의 발현의 감소 방법 또는 그의 유전자 산물의 수준 및/또는 활성의 억제 또는 감소 방법, 또는 표적 유전자의 과발현과 관련된 질병의 치료 방법을 포함하며, 상기 방법은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 생리학적 활성량의 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하며, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3'-말단은 3' 말단 캡(예를 들어, 3' 탄소에서 변형)을 포함하며, 3' 말단 캡은 표 1 또는 표 2에 열거되거나 다르게 본원에 개시된 3' 말단 캡으로부터 선택된다.
다양한 3' 말단 캡("PAZ 리간드"로 표기된 것들을 포함)의 구조는 하기 표 1에 하기에 나타나 있다. 일부 3' 말단 캡이 "PAZ 리간드"로 표기되어 있지만, 본 발명은 임의의 특정 이론에 제한되지 않음을 주목한다.
[표 1]
Figure pct00019
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Figure pct00031
표 1의 구조는 RNAi 작용제의 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 3' 말단(X로 표시)에 존재할 수 있는 3' 말단 캡을 나타낸다. 일부 구현예에서, 3' 말단 캡은 안티센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다.
표 1의 구조의 특정 구현예는 표 2에 도시되어 있다.
표 1 및 표 2의 구조에서:
일부 구현예에서, 하이드록실기가 존재하며, X는 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단을 나타낸다. 예를 들어, RNAi의 가닥의 3' 말단은 3' 말단 캡이 결합되는 포스페이트기로 종결될 수 있다. 그러한 구조의 비제한적인 예는 예를 들어, 도 15a(C3), 도 18c(C6, C8 및 C10); 및 도 19(X027, C6 및 X058)에 나타나 있다. 특히, X027 및 X058은 시험관내에서 19-mer에서 활성이다. 표 2는 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단에서 포스페이트에 결합되는 다양한 3' 말단 캡의 구조를 보여준다. 비제한적인 예로서, X058이 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 상이한 길이, 서열 및 표적의 다양한 상이한 RNAi 작용제 상의 작용성 3' 말단 캡인 것으로 나타났다(본원에 도시된 데이터 및 미도시된 데이터). X058은 예를 들어, 21-mer 블런트-말단 HuR RNAi 작용제 상의 효율적인 3' 말단 캡이었으며, 각 가닥은 21-mer이고, 2개의 가닥은 함께 블런트-말단 듀플렉스를 형성하고, 각 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, X058이었던 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 또한, X058은 18-mer 형식에서 몇몇의 상이한 표적 및 서열에 효율적이었다. 예를 들어, 제1 및 제2 가닥을 포함하는 몇몇의 효율적인 RNAi 작용제를 작제하였으며, 제1 및 제2 가닥 둘 모두는 18-mer였고, 2개의 가닥은 함께 블런트-말단 듀플렉스를 형성하였으며, 가이드 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 제1 및 제2 가닥을 포함하는 몇몇의 효율적인 RNAi 작용제를 작제하였으며, 제1 및 제2 가닥 둘 모두는 18-mer였고, 2개의 가닥은 함께 블런트-말단 듀플렉스를 형성하였으며, 가이드 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 제1 및 제2 가닥을 포함하는 몇몇의 효율적인 RNAi 작용제를 작제하였으며, 제1 및 제2 가닥 둘 모두는 18-mer였고, 2개의 가닥은 함께 블런트-말단 듀플렉스를 형성하였으며, 가이드 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 또한, X058은 다른 RNAi 작용제 상에서도 효율적이었다. 따라서, X058은 생체내 및 시험관내 둘 모두에서, 상이한 길이, 표적 및 서열의 다양한 RNAi 작용제 상의 효율적인 3' 말단 캡이다.
일부 구현예에서, 하이드록실기가 존재하는 경우, 하이드록실은 보호된 형태로 존재할 수 있다. OH에 적합한 보호기는 해당 분야에 알려져 있다. OH의 보호된 형태는 에테르, 포스페이트 에스테르, 메틸 테트라아세틸 글루쿠로네이트, 퍼아세틸 글리코시드 및 아미노산 폴리펩티드 에스테르를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
스페이서 , 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 구현예
일부 구현예에서, RNAi 작용제의 하나의 또는 둘 모두의 가닥은 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡)을 추가로 포함한다.
따라서:
일 구현예에서, X는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서는 리비톨, 2'-데옥시리비톨 또는 2'-메톡시에톡시 리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), C3, C4, C5 또는 C6, 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올이다. 다양한 구현예는 하기에 더욱 상세히 기재되어 있다.
스페이서 : 리비톨 , 디리비톨 , 2'- 데옥시리비톨 , 2'- 메톡시에톡시 리비톨 , C3, C4, C5, C6, 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올(5300)
일부 구현예에서, RNAi 작용제의 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡)을 추가로 포함한다. 스페이서는 2개의 다른 화학 모이어티 사이에; 예를 들어, 2개의 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 사이에 공간(예를 들어, 적절한 또는 기능적 간격)을 생성하거나 유지하는 것으로 의도되거나 그를 위해 사용되는 화학 모이어티이다. 스페이서는 하기 기재된 바와 같이, 예를 들어, 리비톨, 디리비톨, 2'-데옥시리비톨 또는 2'-메톡시에톡시 리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), 또는 당업자에게 알려져 있는 등가의 무염기 뉴클레오티드 또는 저급 알킬 또는 알콕시기, 예를 들어, C3, C4, C5 또는 C6, 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올로부터 선택될 수 있다.
리비톨 스페이서 .
일부 구현예에서, 스페이서는 리비톨 또는 다른 유형의 무염기 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단(예를 들어, 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡)을 추가로 포함한다. 다시 말하면: 일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 리비톨인 스페이서; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 가닥을 포함한다. 따라서: 일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트; 리비톨인 스페이서; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 및 3' 말단 캡을 포함하는 가닥을 포함한다.
3' 말단 포스페이트 및 리비톨 스페이서의 구조가 여기에 나타나 있다:
Figure pct00032
.
일부 문헌에서, 리비톨 스페이서는 N027(C027 등)로 표기된다.
일 구현예는 도 18에 나타나 있으며, 여기서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 18-mer 가닥을 포함하며, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 이러한 구조는 임의의 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 가닥 상에 존재할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡은 X058 대신에 사용될 수 있다.
관련 구조는 도 19("X058이 있는 리비톨")에 나타나 있으며, 여기서, 18-mer 가닥의 마지막 뉴클레오티드(2'-MOE임)가 나타나 있으며, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
다른 구현예는 도 19("C6 캡이 있는 리비톨")에 나타나 있으며, 여기서, 18-mer 가닥의 마지막 뉴클레오티드(2'-MOE임)가 나타나 있으며, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 C6인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 18-mer 가닥, 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C6 3' 말단 캡을 포함한다. 이것은 표 2에 ribpC6(또는 ribC6)으로 도시되어 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 18-mer 가닥, 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 BP 3' 말단 캡을 포함한다. 이것은 표 2에 ribpBP(또는 ribBP)로 도시되어 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 18-mer 가닥, 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C6 3' 말단 캡을 포함한다. 이것은 표 2에 ribpC10(또는 ribC10)으로 도시되어 있다.
일 구현예는 도 21에 나타나 있으며, 여기서, RNAi 작용제는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 도 21에 나타낸 구조가 18-mer RNAi 작용제이지만, 이러한 구조는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 가닥 상에 존재할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡은 X058 대신에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 말단 캡은 리비톨이다. 따라서, RNAi 작용제는 18-mer 가닥을 포함하며, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 제2 리비톨인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 및 제2 리비톨인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 그러한 구조는 도 19에 나타나 있으며(3' 말단 뉴클레오티드 및 포스페이트 포함), "디리비톨"로 표기된다.
다양한 구현예에서, 3' 말단 캡은 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064 또는 리비톨 또는 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡이다. 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 리비톨 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 이전 문장에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 구조가 이중-가닥 RNA를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제 상에서 사용될 수 있으며, 임의로 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되고, 임의로 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되며, 임의로 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드가 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
디리비톨 스페이서 .
일부 구현예에서, 스페이서는 디리비톨이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서(스페이서는 5'에서 3' 순서로, 제1 리비톨; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 제2 리비톨; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함함); 및 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트를 포함하는 가닥; 제1 리비톨 스페이서; 포스페이트; 제2 리비톨 스페이서; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 및 3' 말단 캡을 포함한다. 3' 말단 포스페이트, 제1 리비톨, 포스페이트 및 제2 리비톨의 구조가 여기에 나타나 있다:
Figure pct00033
.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 제1 리비톨 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커, 제2 리비톨 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 리비톨인 3' 말단 캡을 포함하며; 이러한 구조는 트리리비톨로 표기된다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C6 3' 말단 캡을 포함한다. 이것은 표 2에 ribpC6(또는 ribC6)으로 도시되어 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 BP 3' 말단 캡을 포함한다. 이것은 표 2에 ribpBP(또는 ribBP)로 도시되어 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C10 3' 말단 캡을 포함한다. 이것은 표 2에 ribpC10(또는 ribC10)으로 도시되어 있다. 다양한 구현예에서, 3' 말단 캡은 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064, 또는 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡이다.
5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 제1 리비톨 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커, 제2 리비톨 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 구조는 이중-가닥 RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제 상에 사용될 수 있으며, 임의로 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
2'- 메톡시에톡시 리비톨 스페이서 .
일부 구현예에서, 스페이서는 2'-메톡시에톡시 리비톨 또는 다른 유형의 무염기 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단(예를 들어, 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡)을 추가로 포함한다. 다시 말하면: 일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하는 가닥; 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡)을 포함한다. 따라서: 일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트를 포함하는 가닥; 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 및 3' 말단 캡을 포함한다.
3' 말단 포스페이트 및 2'-메톡시에톡시 리비톨 스페이서의 구조가 여기에 나타나 있다:
Figure pct00034
.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 18-mer 가닥을 포함하며, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 이러한 구조는 임의의 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 가닥 상에 존재할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡은 X058 대신에 사용될 수 있다.
관련 구조는 X058이 있는 2'-메톡시에톡시 리비톨이며, 여기서, 18-mer 가닥의 마지막 뉴클레오티드는 2'-MOE이고, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
다른 구현예는 C6 캡이 있는 2'-메톡시에톡시 리비톨이며, 여기서, 18-mer 가닥의 마지막 뉴클레오티드는 2'-MOE이고, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 C6인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 18-mer 가닥, 2'-메톡시에톡시 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C6 3' 말단 캡을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 18-mer 가닥, 2'-메톡시에톡시 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 BP 3' 말단 캡을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 18-mer 가닥, 2'-메톡시에톡시 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C10 3' 말단 캡을 포함한다.
다른 구현예에서, RNAi 작용제는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 3' 말단 캡은 2'-메톡시에톡시 리비톨이다. 따라서, RNAi 작용제는 18-mer 가닥을 포함하며, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 제2 2'-메톡시에톡시 리비톨인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 일 구현예예서, 18-mer 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 2'-메톡시에톡시 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 및 제2 2'-메톡시에톡시 리비톨인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 3' 말단 캡은 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064, 또는 2'-메톡시에톡시 리비톨, 또는 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡이다. 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 2'-메톡시에톡시 리비톨 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 이전 문장에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 구조는 이중-가닥 RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제 상에서 사용될 수 있으며, 임의로 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
2'- 데옥시리비톨 스페이서 .
일부 구현예에서, 스페이서는 2'-데옥시리비톨이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 2'-데옥시리비톨(2'-deoxyrib)인 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, 2'-데옥시리비톨(2'-deoxyrib)인 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함한다. 3' 말단 포스페이트 및 2'-데옥시리비톨의 구조가 여기에 나타나 있다:
Figure pct00035
.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트를 포함하는 가닥; 제1 리비톨 스페이서; 포스페이트; 제2 리비톨 스페이서; 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커; 및 3' 말단 캡을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, 2'-데옥시리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C12 3' 말단 캡을 포함한다. 이것은 표 2에 ribpC12(또는 ribC12)로 도시되어 있다. 이러한 구현예는 "2'DeoxyribC12"로 표기되어 있으며, 표 2에 예시되어 있다.
다양한 구현예에서, 3' 말단 캡은, 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064, 또는 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡이다.
5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 2'-데옥시리비톨 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 구조는 이중-가닥 RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제 상에서 사용될 수 있으며, 임의로 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
C3 스페이서 .
일부 구현예에서, 스페이서는 C3이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, C3인 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, C3인 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함한다.
C3 스페이서는 화학식 -(CH2)3-을 갖는다. 3' 말단 포스페이트 및 C3 스페이서의 구조가 여기에 나타나 있다:
Figure pct00036
일 구현예는 도 21에 나타나 있으며, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, C3 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 포함한다. 도 21에 나타낸 구조가 18-emr RNAi 작용제이지만, 이러한 구조는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 가닥 상에 존재할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡은 X058 대신에 사용될 수 있다.
다른 구현예는 도 14에 나타나 있으며, 이는 소정의 가닥을 포함하는 인자 VII에 대한 RNAi 작용제의 부분을 예시한 것이며, 상기 가닥은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, C3 스페이서, 포스페이트 및 C6인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 이것은 "C3pC6 오버행"으로 표기된다. 이러한 구조는 임의의 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 가닥 상에 존재할 수 있다. 또한, 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡은 C6 대신에 사용될 수 있으며, 임의의 변형된 뉴클레오시드간 링커는 포스페이트 대신에 사용될 수 있다.
C3 스페이서를 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 22에 나타나 있다. 소정의 가닥을 포함하는 2개의 상이한 HuR 작제물을 제조하였으며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, C3 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡(C6 또는 X058임)을 추가로 포함한다. 이들 둘 모두는 RNA 간섭을 매개할 수 있었다.
다양한 구현예에서, 3' 말단 캡은 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064, 또는 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡이다.
5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, C3 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 구조는 이중-가닥 RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제에 사용될 수 있으며, 임의로 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되고, 임의로, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
C4 스페이서 , C5 스페이서 및 C6 스페이서 .
다양한 구현예에서, 스페이서는 C4 또는 C5 또는 C6이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 3' 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, C4 또는 C5 또는 C6인 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 2개의 가닥을 포함하며, 각 가닥의 3' 말단은 3' 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 하나의 또는 둘 모두의 가닥에서 스페이서는 C4 또는 C5 또는 C6이다.
C3 내지 C6 스페이서는 하기와 같이 정의될 수 있다:
C3 = 1,3-프로판-디올
C4 = 1,4-부탄-디올
C5 = 1,5-펜탄-디올
C6 = 1,6-헥산-디올.
일부 맥락에서:
C4 스페이서는 화학식 -(CH2)4-를 갖는다.
C5 스페이서는 화학식 -(CH2)5-를 갖는다.
C6 스페이서는 화학식 -(CH2)6-을 갖는다.
다양한 구현예에서, 3' 말단 캡은 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064, 또는 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡이다.
5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는가닥, C4 또는 C5 또는 C6 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 구조는 이중-가닥 RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제 상에서 사용될 수 있으며, 임의로 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA 및/또는 UNA로 대체된다.
설명으로서, 본 발명은 용어 "C3"[-(CH2)3-], "C4"[-(CH2)4-] 및 "C5"[-(CH2)5-]가 일반적으로 스페이서를 표기하기 위하여 본원에 사용되며, 유사 용어(C3, C4, C5 "링커")도 또한 3' 말단 캡의 부분을 표기하기 위하여 사용되는 것을 언급한다. 이들 도면에서, 상이한 링커는 다양한 3' 말단 캡의 부분을 구별하기 위해 사용된다. 또한, 용어 "C3"이 C3 3' 말단 캡(예를 들어, 도 15a), C3 스페이서(도 21) 및 C3 링커(도 13)를 표기하기 위해 사용되는 것을 주목한다. 또한, C6 스페이서는 C6 말단 캡으로부터 구별되어야 한다.
4- 메톡시부탄 -1,3- 디올 (5300) 스페이서 .
다양한 구현예에서, 스페이서는 4-메톡시부탄-1,3-디올이다. 4-메톡시부탄-1,3-디올도 또한 5300, A5300, C5300, G5300 및 UG5300으로 표기된다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트(3' 말단 포스페이트) 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 4-메톡시부탄-1,3-디올인 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함한다.
3' 말단 포스페이트 및 4-메톡시부탄-1,3-디올 스페이서의 구조는 여기에 나타나 있다:
Figure pct00037
4-메톡시부탄-1,3-디올은 또한 5300, A5300, C5300, G5300 및 UG5300으로 표기된다. 일 구현예에서, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, 4-메톡시부탄-1,3-디올인 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함한다.
일 구현예는 도 21에 나타나 있으며, RNAi 작용제는 5'에서 3' 순서로, 3' 포스페이트로 종결되는 가닥, 4-메톡시부탄-1,3-디올 스페이서, 포스페이트 및 X058인 3' 말단 캡을 포함한다. 도 21에 나타낸 구조가 18-mer RNAi 작용제이지만, 이러한 구조는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 가닥 상에 존재할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡은 X058 대신에 사용될 수 있다.
C5300 스페이서를 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 22에 나타나 있다. 18-mer를 포함하는 2개의 상이한 HuR 작제물을 제조하였으며, 18-mer의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, C5300 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡(C6 또는 X058임)을 추가로 포함한다. 이들 둘 모두는 RNA 간섭을 매개할 수 있었다.
다양한 구현예에서, 3' 말단 캡은 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064, 또는 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 3' 말단 캡이다.
5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 4-메톡시부탄-1,3-디올 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 구조는 이중-가닥 RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 임의의 RNAi 작용제 상에서 사용될 수 있으며, 임의로 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는가 변형되고, 임의로, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커
다양한 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드간 링커는 하기에 상세화된 바와 같은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 또는 화학식 I의 화합물이다.
일부 구현예에서, RNAi 작용제의 하나의 또는 둘 모두의 가닥은 3' 말단에 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡)을 포함한다.
다양한 구현예에서, RNAi 작용제의 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 포스페이트 중 하나 이상이 대체된다. 따라서: 다양한 구현예에서, 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 갖는다. 일부 구현예에서, 3' 말단 포스페이트가 대체된다. 일부 구현예에서, 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 갖고/거나, 변형된 뉴클레오시드간 링커는 스페이서와 3' 말단 캡 사이에 개재된다.
일 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3'-말단은 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡은 표 1 또는 표 2에 열거되거나 다르게 본원에 개시된 3' 말단 캡으로부터 선택되며, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 가지며(예를 들어, 뉴클레오티드의 적어도 하나의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체됨), 변형된 뉴클레오시드간 링커는
Figure pct00038
포스포로티오에이트(PS),
Figure pct00039
포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 또는 화학식 I의 화합물이다:
[화학식 I]
Figure pct00040
상기 식에서,
R3은 O-, S-, NH2, BH3, CH3, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C1-6 알콕시 및 C6-10 아릴-옥시로부터 선택되며, C1-6 알킬 및 C6-10 아릴은 비치환되거나 임의로 할로, 하이드록실 및 NH2로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 기로 독립적으로 치환되고; R4는 O, S, NH 또는 CH2로부터 선택된다.
도 20d 및 도 20e는 다양한 RNAi 작용제의 효능을 보여주며, 센스(S) 또는 안티센스(AS) 가닥의 2개의 3' 말단 NT(뉴클레오티드)는 2' MOE 포스페이트(MOE_PO), 2'OMe 포스페이트(OMe-PO), RNA(RNA_PO), DNA(DNA_PO), 2'F PS(F_PS), RNA PS(RNA_PS), LNA 포스페이트(LNA_PO), 2'F 포스페이트(F_PO), 2'OMe PS(OMe_PS), 2'MOE PS(MOE_PS), DNA PS(DNA_PS) 또는 LNA PS(LNA_PS)이다. 도 20d 및 도 20e에서 RNAi 작용제에 있어서, 모든 시험된 RNAi 작용제는 효과적이었다. 백분율이 낙다운을 나타내지 않고, 다른 RNAi 작용제에 비한 낙다운을 나타내는 것이 주목된다. 예를 들어, 100%는 이들 효율적인 RNAi 작용제의 모든 안티센스 가닥의 평균 낙다운을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3'-말단은 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡은 표 1 또는 표 2에 열거되거나 다르게 본원에 개시된 3' 말단 캡으로부터 선택되고, 하나의 또는 둘 모두의 가닥 상의 적어도 3'말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 가지며(예를 들어, 하나의 또는 둘 모두의 가닥 상의 3' 뉴클레오티드의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체됨), 변형된 뉴클레오시드간 링커는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 또는 화학식 I의 화합물이다.
일 구현예에서, 표 1의 화합물은 말단 포스페이트기를 통해 연결되며, 이는 적어도 하나의 RNAi 작용제 가닥의 3' 말단에서 3' 탄소에 결합된다. 그러한 화합물은 예를 들어, 표 2에 나타나 있다.
일 구현예에서, 표 2의 화합물은 적어도 하나의 RNAi 작용제 가닥의 3' 말단에서 3' 탄소에 결합된 말단 포스포로티오에이트기를 갖는다. 따라서, 다양한 구현예에서, 표 2에 열거된 3' 말단 캡에서, 포스페이트기는 포스포로티오에이트로 대체된다. 추가의 구현예에서, 본원에 C3, C6, C12, 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, 비페닐, 아다만탄, 리토콜산으로 열거된 다양한 3' 말단 캡의 포스페이트기는 포스포로티오에이트로 대체될 수 있다. 특정 일 구현예에서, C3 3' 말단 캡에서 포스페이트기는 포스포로티오에이트로 대체된다(표 2에 예시되고 실시예 6 및 도 20a 내지 도 20e에 기재된 바와 같이 "PS-C3"으로 표기됨). 특정 일 구현예에서, C6 3' 말단 캡에서 포스페이트기는 포스포로티오에이트로 대체된다(표 2에 나타낸 바와 같이 "PS-C6"로 표기됨). 특정 일 구현예에서, C10 3' 말단 캡에서 포스페이트기는 포스포로티오에이트로 대체된다(표 2에 나타낸 바와 같이 "PS-C10"으로 표기됨). 특정 일 구현예에서, 비페닐(BP) 3' 말단 캡에서 포스페이트기는 포스포로티오에이트로 대체된다(표 2에 나타낸 바와 같이 "PS-BP"로 표기됨).
다양한 구현예에서, R1은 OH이고; R2는 화학식 I의 화합물이다. 또한, 이러한 구조는 도 18c에 나타나 있다.
3' 말단 캡
일부 구현예에서, RNAi 작용제의 하나의 또는 둘 모두의 가닥은 3' 말단에 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡)을 포함한다.
3' 말단 캡은 RNAi 작용제를 포함하는 분자의 3' 말단, 예를 들어, (a) 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥을 포함하는 분자; 또는 (b) 5'에서 3' 순서로, 가닥(상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결됨), 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하는 분자의 3' 종단(또는 3' 말단)에 결합된 비-뉴클레오티드 화학적 모이어티이다. 3' 말단 캡은 하기의 기능 중 적어도 하나를 수행한다: 분자에 의해 매개되는 RNA 간섭의 허용, (예를 들어, 뉴클레아제에 의한) 분해로부터 분자의 보호 또는 분자의 분해량 또는 속도의 감소, 센스 가닥의 표적외 효과의 감소, 또는 분자에 의해 매개되는 RNA 간섭의 활성, 기간 또는 효능의 증가. 3' 말단 캡을 "비-뉴클레오티드"로 설명한 것은 뉴클레오티드가 3가지 성분, 즉 포스페이트, 펜토스(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스) 및 핵염기를 포함하며, 3' 말단 캡은 3가지 성분 모두를 포함하지 않는 것을 의미한다.
하기 표 2에는 표 1에 나타낸 것들 중 일부를 포함하는 다양한 3' 말단 캡의 일부 구조가 제시되어 있다. 구조의 일부에서, RNAi 작용제 가닥의 말단 3' 포스페이트도 또한 맥락을 위해 나타나 있지만, 이러한 포스페이트는 3' 말단 캡의 부분이 아니다.
추가의 정보는 그들 전문이 모두 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제61/886,753호; 제61/930,681호; 제61/886,748호; 제61/886,739호; 및 제61/886,760호에서 찾을 수 있다.
[표 2]
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
추가의 구조는 특히 ribp트리에틸렌 글리콜, ribp사이클로헥실, ribp페닐, ribpBP(비페닐), ribp리토콜(리토콜산), ribp아다만탄, ribpC3 아미노, ribpC7 아미노, ribpC3, ribpC6, ribpC8, ribpC10, ribpC12, ribpX027, ribpX027, ribpX038, ribpX050, ribpX051, ribpX052, ribpX059, ribpX060, ribpX061, ribpX062, ribpX063, ribpX064, ribpX065, ribpX066, ribpX067, ribpX068, ribpX069, ribpX097, ribpX098, ribpX109, ribpX110, ribpX111, ribpX112, ribpX113, ribpX1009, ribpX1011, ribpX1012, ribpX1013, ribpX1015, ribpX1016, ribpX1017, ribpX1018, ribpX1019, ribpX1020, ribpX1021, ribpX1022, ribpX1024, ribpX1025, ribpX1026, ribpX1027, ribpX1028, ribpX1047, ribpX1048, ribpX1049, ribpX1062, ribpX1063, ribpX1064, ribp리비톨 등을 포함한다. 이들은 리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050 등인 3' 말단 캡을 나타낸다.
추가의 구조는 특히 diribp트리에틸렌 글리콜, diribp사이클로헥실, diribp페닐, diribpBP(비페닐), diribp리토콜(리토콜산), diribp아다만탄, diribpC3 아미노, diribpC7 아미노, diribpC3, diribpC6, diribpC8, diribpC10, diribpC12, diribpX027, diribpX027, diribpX038, diribpX050, diribpX051, diribpX052, diribpX059, diribpX060, diribpX061, diribpX062, diribpX063, diribpX064, diribpX065, diribpX066, diribpX067, diribpX068, diribpX069, diribpX097, diribpX098, diribpX109, diribpX110, diribpX111, diribpX112, diribpX113, diribpX1009, diribpX1011, diribpX1012, diribpX1013, diribpX1015, diribpX1016, diribpX1017, diribpX1018, diribpX1019, diribpX1020, diribpX1021, diribpX1022, diribpX1024, diribpX1025, diribpX1026, diribpX1027, diribpX1028, diribpX1047, diribpX1048, diribpX1049, diribp1062, diribp1063, diribp1064, diribp리비톨 등을 포함한다. 이들은 디리비톨인 스페이서, 포스페이트 및 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050 등인 3' 말단 캡을 나타낸다.
추가의 구조는 특히 2'-deoxyribp트리에틸렌 글리콜, 2'-deoxyribp사이클로헥실, 2'-deoxyribp페닐, 2'-deoxyribpBP(비페닐), 2'-deoxyribp리토콜(리토콜산), 2'-deoxyribp아다만탄, 2'-deoxyribpC3 아미노, 2'-deoxyribpC7 아미노, 2'-deoxyribpC3, 2'-deoxyribpC6, 2'-deoxyribpC8, 2'-deoxyribpC10, 2'-deoxyribpC12, 2'-deoxyribpX027, 2'-deoxyribpX027, 2'-deoxyribpX038, 2'-deoxyribpX050, 2'-deoxyribpX051, 2'-deoxyribpX052, 2'-deoxyribpX059, 2'-deoxyribpX060, 2'-deoxyribpX061, 2'-deoxyribpX062, 2'-deoxyribpX063, 2'-deoxyribpX064, 2'-deoxyribpX065, 2'-deoxyribpX066, 2'-deoxyribpX067, 2'-deoxyribpX068, 2'-deoxyribpX069, 2'-deoxyribpX097, 2'-deoxyribpX098, 2'-deoxyribpX109, 2'-deoxyribpX110, 2'-deoxyribpX111, 2'-deoxyribpX112, 2'-deoxyribpX113, 2'-deoxyribpX1009, 2'-deoxyribpX1011, 2'-deoxyribpX1012, 2'-deoxyribpX1013, 2'-deoxyribpX1015, 2'-deoxyribpX1016, 2'-deoxyribpX1017, 2'-deoxyribpX1018, 2'-deoxyribpX1019, 2'-deoxyribpX1020, 2'-deoxyribpX1021, 2'-deoxyribpX1022, 2'-deoxyribpX1024, 2'-deoxyribpX1025, 2'-deoxyribpX1026, 2'-deoxyribpX1027, 2'-deoxyribpX1028, 2'-deoxyribpX1047, 2'-deoxyribpX1048, 2'-deoxyribpX1049, 2'-deoxyribp 1062, 2'-deoxyribp 1063, 2'-deoxyribp 1064, 2'-deoxyribp리비톨 등을 포함한다. 이들은 2'-데옥시리비톨인 스페이서, 포스페이트, 및 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050 등인 3' 말단 캡을 나타낸다.
추가의 구조는 특히 C3p트리에틸렌 글리콜, C3p사이클로헥실, C3p페닐, C3pBP(비페닐), C3p리토콜(리토콜산), C3p아다만탄, C3pC3 아미노, C3pC7 아미노, C3pC3, C3pC6, C3pC8, C3pC10, C3pC12, C3pX027, C3pX027, C3pX038, C3pX050, C3pX051, C3pX052, C3pX059, C3pX060, C3pX061, C3pX062, C3pX063, C3pX064, C3pX065, C3pX066, C3pX067, C3pX068, C3pX069, C3pX097, C3pX098, C3pX109, C3pX110, C3pX111, C3pX112, C3pX113, C3pX1009, C3pX1011, C3pX1012, C3pX1013, C3pX1015, C3pX1016, C3pX1017, C3pX1018, C3pX1019, C3pX1020, C3pX1021, C3pX1022, C3pX1024, C3pX1025, C3pX1026, C3pX1027, C3pX1028, C3pX1047, C3pX1048, C3pX1049, C3pX1062, C3pX1063, C3pX1064, C3p리비톨 등을 포함한다. 이들은 C3인 스페이서, 포스페이트, 및 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050 등인 3' 말단 캡을 나타낸다.
추가의 구조는 특히 C4p트리에틸렌 글리콜, C4p사이클로헥실, C4p페닐, C4pBP(비페닐), C4p리토콜(리토콜산), C4p아다만탄, C4pC4 아미노, C4pC7 아미노, C4pC4, C4pC6, C4pC8, C4pC10, C4pC12, C4pX027, C4pX027, C4pX038, C4pX050, C4pX051, C4pX052, C4pX059, C4pX060, C4pX061, C4pX062, C4pX063, C4pX064, C4pX065, C4pX066, C4pX067, C4pX068, C4pX069, C4pX097, C4pX098, C4pX109, C4pX110, C4pX111, C4pX112, C4pX113, C4pX1009, C4pX1011, C4pX1012, C4pX1013, C4pX1015, C4pX1016, C4pX1017, C4pX1018, C4pX1019, C4pX1020, C4pX1021, C4pX1022, C4pX1024, C4pX1025, C4pX1026, C4pX1027, C4pX1028, C4pX1047, C4pX1048, C4pX1049, C4pX1062, C4p1063, C4p1064, C4p리비톨 등을 포함한다. 이들은 C4인 스페이서, 포스페이트, 및 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C4 아미노, C7 아미노, C4, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050 등인 3' 말단 캡을 나타낸다.
추가의 구조는 특히 C5p트리에틸렌 글리콜, C5p사이클로헥실, C5p페닐, C5pBP(비페닐), C5p리토콜(리토콜산), C5p아다만탄, C5pC5 아미노, C5pC7 아미노, C5pC5, C5pC6, C5pC8, C5pC10, C5pC12, C5pX027, C5pX027, C5pX038, C5pX050, C5pX051, C5pX052, C5pX059, C5pX060, C5pX061, C5pX062, C5pX063, C5pX064, C5pX065, C5pX066, C5pX067, C5pX068, C5pX069, C5pX097, C5pX098, C5pX109, C5pX110, C5pX111, C5pX112, C5pX113, C5pX1009, C5pX1011, C5pX1012, C5pX1013, C5pX1015, C5pX1016, C5pX1017, C5pX1018, C5pX1019, C5pX1020, C5pX1021, C5pX1022, C5pX1024, C5pX1025, C5pX1026, C5pX1027, C5pX1028, C5pX1047, C5pX1048, C5pX1049, C5pX1062, C5pX1063, C5pX1064, C5p리비톨 등을 포함한다. 이들은 C5인 스페이서, 포스페이트, 및 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C5 아미노, C7 아미노, C5, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050 등인 3' 말단 캡을 나타낸다.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
추가의 구조는 특히 PS-트리에틸렌 글리콜, PS-사이클로헥실, PS-페닐, PS-BP(비페닐), PS-리토콜(리토콜산), PS-아다만탄, PS-C3 아미노, PS-C7 아미노, PS-C3, PS-C6, PS-C8, PS-C10, PS-C12, PS-X027, PS-X027, PS-X038, PS-X050, PS-X051, PS-X052, PS-X059, PS-X060, PS-X061, PS-X062, PS-X063, PS-X064, PS-X065, PS-X066, PS-X067, PS-X068, PS-X069, PS-X097, PS-X098, PS-X109, PS-X110, PS-X111, PS-X112, PS-X113, PS-X1009, PS-X1011, PS-X1012, PS-X1013, PS-X1015, PS-X1016, PS-X1017, PS-X1018, PS-X1019, PS-X1020, PS-X1021, PS-X1022, PS-X1024, PS-X1025, PS-X1026, PS-X1027, PS-X1028, PS-X1047, PS-X1048, PS-X1049, PS-X1062, PS-X1063, PS-X1064, PS-리비톨 등을 포함한다. 이들은 포스포로티오에이트(PS) 및 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050 등인 3' 말단 캡을 나타낸다.
표 2(2.A, 2.B 및 2.C 포함)에 관하여:
C7 아미노 및 C3 아미노(각각 아미노 C7 또는 아미노 C3으로도 표기)에 대한 합성 반응식은 이들 분자가 글렌 리서치(Glen Research)(Sterling, VA)로부터 구매가능하고 합성 반응식이 글렌 리서치에 의해 이전에 공개되었기 때문에, 제공되지 않는다.
C7 아미노: 카탈로그 번호: 20-2957-xx; 설명: 3'-아미노-개질제(Modifier) C7 CPG 500; 2-디메톡시트리틸옥시메틸-6-플루오레닐메톡시카보닐아미노-헥산-1-석시노일-장쇄 알킬아미노-CPG; 기술 회보: [Pre-Synthesis Labeling of Aminomodifier C3 or C7 CPG, Glen Research (Sterling, VA)].
C3 아미노: 카탈로그 번호: 20-2913-xx; 설명: 3'-스페이서 C3 CPG; (1-디메톡시트리틸옥시-프로판디올-3-석시노일)-장쇄 알킬아미노-CPG, 글렌 리서치(Sterling, VA). 또한, 글렌 리서치는 프로필 CPG가 올리고를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하고, 중합효소 연장을 가능하게 하지 않는다는 주장을 뒷받침하기 위한 프로필 CPG에 대한 결정적인 데이터를 글렌 리서치에서 갖지 않는 것을 언급한다. 글렌 리서치의 결론은 프로필아미노-개질제 CPG와의 유사성을 기반으로 한다(문헌[Zendegui et al. Nucleic Acids Research, 1992, 20, 307-314])(카탈로그 번호 20-2950-41). 이러한 변형은 올리고를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하지만, 중합효소 연장을 적은 정도로 가능하게 하는데, 이는 개질제가 3' 말단으로부터 약 10%의 수준으로 제거되어 3'-하이드록실기가 이용 가능하게 남기 때문이다. HPLC 실험에 의해, 스페이서 C3-CPG로부터 제조된 올리고로부터의 프로필기의 검출가능한 제거가 존재하지 않음이 나타났다.
또한, RNAi 작용제 가닥의 맥락에서, 예시적인 3' 말단 캡 C8 및 C10도 또한 도 18c에 나타나 있으며, 리비톨 및 디리비톨은 도 19에 나타나 있다.
표 2에 스페이서(예를 들어, C3p, 리비톨 또는 2'-데옥시리비톨) 및 3' 말단 캡 둘 모두를 포함하는 다양한 3' 말단 캡이 열거되어 있음이 주목된다. 따라서, 예를 들어, "C3pC6"은 문맥에 따라, "3' 말단캡" 또는 "스페이서 및 포스페이트 및 3' 말단 캡"(C3 + p + C6) 또는 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡으로 여겨질 수 있다. 스페이서 및 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 예를 들어, 5a, 5b, 10 및 14에 나타나 있다.
본 발명은 표 1 또는 표 2에 나타나 있거나 다르게 본원에 개시된 3' 말단 캡을 포함하는 임의의 RNAi 작용제를 포함한다.
상이한 서열 및 표적을 위한 3' 말단 캡의 용도
본원에 개시된 3' 말단 캡을 보여주는 다양한 실험은 헵시딘, HuR(ELAVL1), PLK1, SSB 및 FVII(F7 또는 인자 7)를 포함하는 다양한 상이한 mRNA 표적에 대하여 RNA 간섭을 매개할 수 있는 효율적인 RNAi 작용제의 다양한 가닥의 3' 말단에서 사용될 수 있다. 또한, 상이한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제가 마우스 및 인간 세포 둘 모두에서 효율적이었기 때문에, 3' 말단 캡은 다양한 포유류 종을 포함하는 다양한 종을 위한 RNAi 작용제 상에서 사용될 수 있다. 또한, (본원에 기재되지 않은) 몇몇의 추가의 유전자 표적에 대하여 본원에 개시된 다양한 3' 말단 캡을 포함하는 성공적인 RNAi 작용제를 작제하였다. 본원에 기재된 3' 말단 캡은 생체내 및 시험관내에서 RNAi 작용제에 유용한 것으로 밝혀졌다. 또한, 다양한 성공적인 RNAi 작용제를 작제하고 시험하였으며, 하나의 또는 둘 모두의 가닥은 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 본원에 개시된 바와 같은 스페이서, 본원에 개시된 바와 같은 포스페이트 또는 뉴클레오시드간 링커 및 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡을 포함한다.
명백하게, 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있을 바와 같이, 분명히 임의의 3' 말단 캡이나 임의의 스페이서, 포스페이트 또는 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡과 조합하지 않고, 모든 시험된 서열이 성공적인 RNAi 작용제를 제공하지 않을 것이다. 그러나 본원에 기재된 3' 말단 캡을 사용하여 다양한 RNAi 작용제를 고안하고 시험할 수 있으며, 그 중 일부는 다른 형식(예를 들어, 표준 구조)의 것과 대략 동일한 활성을 가질 수 있고; 일부는 개선된 품질(예를 들어, 증가된 활성, 활성의 기간, 감소된 표적-외 효과 등)을 생성할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 신규한 3' 말단 캡은 다양한 상이한 서열 및 유전자 표적과 함께 사용될 수 있다.
3' 말단 캡을 포함하는 헵시딘 RNAi 작용제
본원, 예를 들어, 도 5a 내지 도 9에 상세히 설명된 바와 같이, 헵시딘을 표적으로 하는 본원에 개시된 다양한 3' 말단 캡을 포함하는 효율적인 RNAi 작용제를 작제하였다.
이들 작제물은 도면 및 도면 범례에 상세히 설명되어 있다. 이들 작제물은 성공적으로 마우스 및 인간 헵시딘 둘 모두를 표적화하였다.
이들 RNAi 작용제에 사용되는 성공적인 3' 말단 캡은 BP, C6, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069 등을 포함한다. 이들 RNAi 작용제의 일부는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 다른 RNAi 작용제는 소정의 가닥을 포함하며, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서(예를 들어, 리비톨), 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
3' 말단 캡을 포함하는 HuR ( ELAV1 ) RNAi 작용제
다양한 3' 말단 캡을 포함하는 HuR에 대한 효율적인 RNAi 작용제를 작제하였다. 도 16a 및 도 16b, 및 도 22 내지 도 24, 도면 범례 등을 참조한다.
예를 들어: 다른 표적, HuR에 대한 효율적인 18-mer RNAi 작용제가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00060
상기 5'에서 3'으로 나타낸 AS(안티-센스) 가닥의 서열은 SEQ ID NO: 87이고; 상기 3'에서 5'으로 나타낸 S(센스) 가닥의 서열은 SEQ ID NO: 88이다. 이러한 RNAi 작용제는 각각 5'에서 3' 순서로, RNAi 작용제 가닥, 스페이서(리비톨 또는 rib), 포스페이트(미도시) 및 3' 말단 캡(C6)을 포함하는 2개의 가닥을 포함한다. 다른 스페이서 및 3' 말단 캡이 사용될 수 있으며, 이러한 포스페이트 및 다른 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체될 수 있다.
다른 효율적인 HuR RNAi 작용제를 생성하였으며, 사용된 서열은 하기와 같았다:
U002pUpApApU004pU004pApU004pCpU004pApU004pU004pCpCpGpU005pA005pC027pXnnnn (SEQ ID NO: 89)
여기서, C027은 리비톨(또는 필요에 따라 다른 스페이서, 예를 들어, C3 또는 C5300)이고,
002는 DNA이며,
004는 2'Ome이고,
005는 2'MOE이며,
모든 다른 위치는 RNA이고,
027은 리비톨이며,
p는 포스페이트이고,
Xnnn은 3' 말단 캡(X058, X109 등)이다.
본원에 개시된 이러한 서열 및 다양한 다른 서열에서, U004는 2'Ome 변형이 있는 U 염기가 있는 뉴클레오티드를 나타내며; U002는 DNA인 U 염기가 있는 뉴클레오티드를 나타내고; U005는 2'MOE 변형이 있는 U 염기가 있는 뉴클레오티드를 나타낸다. 유사하게, 다른 뉴클레오티드가 변형되며, 예를 들어, U004는 U 염기 및 2'Ome 변형이 있는 뉴클레오티드를 나타낸다.
이러한 HuR 서열을 사용하여, RNAi 작용제 가닥을 포함하며, 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 스페이서(리비톨), 포스페이트 및 3' 말단 캡(X058, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027 또는 X1028)을 추가로 포함하는 효율적인 RNAi 작용제를 생성하였다. 이들을 Huh-7 세포에서 시험관내에서 시험하였으며, 모두 30 pM에서 적어도 약 60% 내지 80% 유전자 낙다운이 입증되었다.
RNAi 작용제 가닥을 포함하며, 3' 말단에서 5'에서 3' 순서로, 스페이서(리비톨), 포스페이트 및 3' 말단 캡(X058, X110, X111, X112, X1012, X1013, X1018, X1019, X1025, X1027, X1028)을 추가로 포함하는 것들을 포함하는 이들 HuR 작제물 중 몇몇을 추가로 시험하였다. 이들을 Huh-7 세포에서 시험관내에서 시험하였으며, 모두 1 nM에서 제3일에 적어도 약 80% 내지 90% 유전자 낙다운이 입증되었다.
3' 말단 캡을 포함하는 추가의 HuR 작제물을 작제하였으며, 이는 상기 18-mer 서열을 가지며, 3' 말단에서 5'에서 3' 순서로, (a) 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 X058 3' 말단 캡; (b) 리비톨 스페이서, 포스페이트 및 C6 3' 말단 캡; (c) C3 스페이서, 포스페이트 및 X058 3' 말단 캡; (d) C3 스페이서, 포스페이트 및 C6 3' 말단 캡; (e) C5300 스페이서, 포스페이트 및 X058 3' 말단 캡; 및 (f) C5300 스페이서, 포스페이트 및 C6 3' 말단 캡을 추가로 포함하는 가닥을 포함하였다. 이들 작제물의 각각을 Huh-7 세포에서 시험관내에서 시험하였으며, 모두 1 nM에서 제3일에 약 90% 유전자 낙다운이 입증되었다.
각각 18-mer인 2개의 가닥을 포함하는 HuR에 대한 추가의 RNAi 작용제를 작제하였으며, 2개의 가닥은 함께 블런트-말단 듀플렉스를 형성하고, 적어도 가닥은 3' 포스포로티오에이트(PS)에서 종결되고, 가닥은 3' 말단에서 5'에서 3' 순서로, 스페이서(리비톨), 변형된 뉴클레오시드간 링커(다른 포스포로티오에이트) 및 3' 말단 캡(C6)을 추가로 포함한다.
3' 말단 캡을 포함하는 SSB RNAi 작용제
또한, SSB를 표적으로 하고, 본원에 개시된 바와 같이 3' 말단 캡 또는 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 효율적인 RNAi 작용제를 작제하였다. 예를 들어, 이들 표적에 대한 일부 RNAi 작용제에서, 하나의 또는 둘 모두의 가닥은 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 스페이서(예를 들어, C3), 포스페이트 및 3' 말단 캡(C6)을 추가로 포함한다.
예를 들어, hs_SSB_309_AS_18mer-C3-C6으로 표기된 인간 SSB RNAi 작용제는 시험관내에서 RNA 간섭을 매개하는데 효율적이었으며, 하기에 나타나 있다:
Figure pct00061
상기 5'에서 3'으로 나타낸 AS(안티-센스) 가닥의 서열은 SEQ ID NO: 90이다. 상기 5'에서 3'으로 나타낸 S(센스) 가닥의 서열은 SEQ ID NO: 91이다. 8, 7, 5 및 5는 상기 정의된 바와 같이 2'-MOE 뉴클레오시드이다.
SSB를 표적으로 하고, 본원에 개시된 바와 같이 3' 말단 캡 또는 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 RNAi 작용제를 작제하였다. 이들은 다양한 표적 서열을 갖는다. 예를 들어, 작제한 다양한 SSB RNAi 작용제에서, 하나의 또는 둘 모두의 18-mer 가닥은 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 스페이서(C3 또는 리비톨), 포스페이트 및 3' 말단 캡(C6, BP, 제2 리비톨 또는 디리비톨)을 추가로 포함한다. SSB를 표적으로 하는 다른 RNAi 작용제를 작제할 수 있다.
3' 말단 캡을 포함하는 인자 VII RNAi 작용제.
인자 VII(F7)을 표적으로 하고, 3' 말단 캡(C3, C6, C12, 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, 비페닐, 리토콜, C7 아미노 및 C3 아미노)을 포함하는 다양한 RNAi 작용제를 작제하였으며; 이들 작제물의 효능은 도 1 내지 도 3에 나타나 있다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은, 인자 VII(F7)을 표적으로 하고, 3' 말단 캡 또는 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 RNAi 작용제를 작제하였다. 이들은 비제한적인 예로서 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 스페이서(C3), 포스페이트 및 3' 말단 캡(C6)을 추가로 포함하는 가닥을 포함하는 RNAi를 포함한다. F7을 표적으로 하는 다른 RNAi 작용제를 작제할 수 있다.
3' 말단 캡을 포함하는 PLK1 RNAi 작용제
3' 말단 캡을 포함하는 다양한 PLK1 RNAi 작용제를 작제하고 시험하였다.
본원에 개시된 바와 같이 3' 말단 캡 또는 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는, 예를 들어, 3' 말단에서, 5'에서 3' 순서로, 스페이서(C3), 포스페이트 및 3' 말단 캡(C6)을 추가로 포함하는 가닥을 포함하는, 표적 PLK1에 대한 RNAi 작용제를 작제하였다.
3' 말단 캡의 개선된 활성
상기 언급된 바와 같이, 몇몇 경우에, 본원에 개시된 바와 같이 3' 말단 캡 또는 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제는 그러한 3' 말단 캡이 결여된 상응하는 siRNA에 비하여 증가된 활성을 갖는 것으로 나타났다. 본원에 개시된 바와 같이 3' 말단 캡 또는 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 siRNA는 상이한 실험에서, 시험관내 및 생체내에서 증가된 RNA 간섭 활성, 증가된 활성 기간, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성 및/또는 증가된 특이성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, 도 1 내지 도 3을 참조한다.
예를 들어, C3pC6을 포함하는 (2개의 디뉴클레오티드 오버행이 있는 표준 구조의) 21-mer 및 블런트-말단 18-mer를 포함하는 표적 F7에 대한 몇몇 시험 siRNA를 작제하였다. C3pC6 분자에서, 안티-센스 가닥의 3' 말단은 5'에서 3' 순서로, C3인 스페이서, 포스페이트 및 C6인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 21-mer 및 18-mer는 둘 모두 동일한 서열을 표적으로 하며: 둘 모두는 동일한 5' 출발을 갖는다. 그러나 C3pC6을 포함하는 RNAi 작용제는 21-mer(0.61(±0.017) ㎎/㎏)보다 더 낮은 ED50(0.44(±0.022) ㎎/㎏)을 보였다.
또한, (X058 3' 말단 캡이 있는) 헵시딘 RNAi 작용제가 생체내에서 시험되는 경우, 2일 후에 (디뉴클레오티드 오버행을 갖는) 상응하는 21-mer RNAi 작용제보다 더욱 강력한 것으로 관찰되었다. 헵시딘에 있어서, (디뉴클레오티드 오버행이 있는) 상응하는 21-mer보다 더욱 강력한 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡이 있는 몇몇 RNAi 작용제를 개발하였다.
또한, 헵시딘 21-mer siRNA는 스페이서, 포스페이트 또는 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 3' 말단이 있는 상응하는 18-mer보다, 센스 가닥이 RISC 내로 혼입되기 더 쉬운 것이 관찰되었다. 따라서, 이러한 경우에, 21-mer는 덜 특이적이다.
따라서, 다양한 실험에서, 스페이서, 포스페이트 또는 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 3' 말단을 포함하는 RNAi 작용제는 상응하는 21-mer siRNA에 비하여 개선된 활성이 입증되었다.
또한, 본 발명은 시험관내에서 또는 유기체, 예를 들어, 포유류, 예를 들어, 인간에서의 표적 유전자의 발현의 감소 방법 또는 그의 유전자 산물의 수준 및/또는 활성의 억제 또는 감소 방법, 또는 표적 유전자의 과발현과 관련된 질병의 치료 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같이 스페이서, 포스페이트 또는 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 3' 말단이 있는 RNAi 작용제를 포함하는 생리학적 활성량의 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제
다양한 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함한다:
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 C7 아미노인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 C3 아미노인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 18개 뉴클레오티드이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 C6인 RNAi 작용제. C6은 18-mer 형식에서 시험관내 및 생체내에서 활성인 것으로 입증되었다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 C8인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 C10인 RNAi 작용제. C10은 18-mer 및 19-mer 형식에서 유리한 siRNA의 기간이 입증되었다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 C12인 RNAi 작용제. C12는 시험관내에서 siRNA 상에서 활성인 것으로 나타났다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X027인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X038인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X050인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X051인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X052인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X058인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X059인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X060인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X061인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X062인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X063인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X064인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X065인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X066인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X067인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X068인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X069인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X097인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X098인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X109인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X110인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X111인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X112인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X113인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1009인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1010인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1011인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1012인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1013인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1015인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1016인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1017인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1018인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1019인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1020인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1021인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1022인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1024인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1025인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1026인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1027인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1028인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1047인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1048인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1049인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1062인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1063인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 X1064인 RNAi 작용제.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥이 49-mer 이하이고, 적어도 가닥의 3' 말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 리비톨인 RNAi 작용제.
이러한 섹션에 열거된 각각의 및 모든 RNAi 작용제에 대하여 RNAi 작용제는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 것일 수 있으며, 비제한적인 예로서, 이중-가닥 RNA일 수 있고, 임의로, 하나 이상의 포스페이트가 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되고, 임의로, 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드가 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하는 RNAi 작용제.
다양한 구현예에서, 본 발명은 5'에서 3' 순서로, 3' 말단 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되는 가닥, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 열거되거나, 또는 다르게 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 하기의 것을 포함한다:
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하는 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 리비톨인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 2'-데옥시-리비톨인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 디리비톨인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 2'-메톡시에톡시-리비톨인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 C3인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 C4인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 C5인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 C6인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하고, 스페이서가 4-메톡시부탄-1,3-디올인 RNAi 작용제.
이러한 제2 가닥의 각각의 및 모든 RNAi 작용제에서, 3' 말단 캡은 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064 또는 리비톨로부터 선택된다. 또한, 이러한 섹션에 열거된 각각의 및 모든 RNAi 작용제에 있어서, RNAi 작용제는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 것일 수 있으며, 비제한적인 예로서, 이중-가닥 RNA일 수 있고, 임의로, 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
스페이서 , 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 추가의 구현예
본 발명은 특히 하기의 것을 포함한다:
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 C3이고, 3' 말단 캡이 C6인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 C3pC6으로 표기된다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 C3인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribC3 또는 ribpC3으로 표기된다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 C6인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribpC6으로 표기된다. ribpC6을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 효율적인 RNAi 작용제는 도 11에 나타나 있다. 또한, ribpC6은 18-mer 형식에서 생체내에서 활성이다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 C6인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribC6 또는 ribpC6으로 표기된다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 C8인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribC8 또는 ribpC8로 표기된다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 C10인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribC10 또는 ribpC10으로 표기된다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 C12인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribC12 또는 ribpC12로 표기된다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 BP인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribpBP로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다. 이러한 3' 말단 캡은 18-mer 형식에서 시험관내에서 활성이다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X027인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX027로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X038인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX038로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X050인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX050으로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X051인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX051로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X052인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX052로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X058인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX058로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 효율적인 RNAi 작용제는 도 11에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X059인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX059로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X060인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX060으로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5a에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X061인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX061로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X062인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX062로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X063인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX063으로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X064인 RNAi 작용제. ribX064. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X065인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX065로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X066인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX066으로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X067인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX067로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X068인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX068로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X069인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 ribX069로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X097인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X098인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X109인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X110인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X111인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X112인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X113인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1009인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1010인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1011인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1012인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1013인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1015인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1016인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1017인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1018인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1019인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1020인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1021인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1022인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1024인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1025인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1026인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1027인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1028인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1047인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1048인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1049인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1062인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1063인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 X1064인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥이 3' 말단 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 스페이서가 리비톨이고, 3' 말단 캡이 리비톨인 RNAi 작용제.
이러한 섹션에 열거된 각각의 및 모든 구조에 대하여, RNAi 작용제는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 것일 수 있으며, 비제한적인 예로서 이중-가닥 RNA일 수 있고, 임의로, 하나 이상의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
스페이서 , 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 포함하는 추가의 구현예
본 발명은 특히 하기의 것을 포함한다:
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C3인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C6인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C8인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C10인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C12인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 BP인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X027인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X038인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X050인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X051인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X052인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X058인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X059인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X060인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X061인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X062인 RNAi 작용제. 이것은 ribX062로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X063인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X064인 RNAi 작용제. ribX064. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능은 도 5b에 나타나 있다.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X065인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X066인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X067인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X068인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X069인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X097인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X098인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X109인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X110인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X111인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X112인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X113인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1009인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1010인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1011인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1012인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1013인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1015인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1016인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1017인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1018인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1019인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1020인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1021인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1022인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1024인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1025인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1026인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1027인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1028인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1047인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1048인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1049인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1062인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1063인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X1064인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 리비톨인 RNAi 작용제.
제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, BP(비페닐), 리토콜(리토콜산), 아다만탄, C3 아미노, C7 아미노, C3, C6, C8, C10, C12, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068, X069, X097, X098, X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1011, X1012, X1013, X1015, X1016, X1017, X1018, X1019, X1020, X1021, X1022, X1024, X1025, X1026, X1027, X1028, X1047, X1048, X1049, X1062, X1063, X1064 또는 리비톨인 RNAi 작용제.
이러한 섹션에 열거된 각각의 및 모든 구조에 있어서, RNAi 작용제는 임의의 길이, 서열 또는 표적의 것일 수 있으며, 비제한적인 예로서, 이중-가닥 RNA일 수 있고, 임의로, 하나 이상의 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되며, 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되고, 임의로 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA, PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체된다.
또한, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS(포스포로티오에이트)로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 또한, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS(포스포로티오에이트)로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명은 하기의 것을 포함한다:
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C3인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 PS-C3으로 표기된다. 이러한 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 이러한 효능은 실시예 6 및 도 20a 내지 도 20e에 기재되어 있다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C6인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 PS-C6으로 표기된다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C8인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 PS-C8으로 표기된다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C10인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 PS-C10으로 표기된다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 C12인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 PS-C12로 표기된다.
제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제로서, 각 가닥은 49-mer 이하이고, 제1 및/또는 제2 가닥은 PS로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 BP인 RNAi 작용제. 이러한 구조는 PS-BP로 표기된다.
3' 말단 캡의 대안적인 명칭, 및 DMT , 석시네이트 및 카르복실 레이트 변이체
다양한 구현예에서, 본 발명은 다양한 3' 말단 캡의 DMT, 석시네이트 및 카르복실레이트 형태를 포함하며, 이를 사용하여 3' 말단 캡(또는 스페이서 또는 3' 말단 캡)을 포함하는 RNAi 작용제를 작제할 수 있다. 표 1에 나타낸 화합물에서, 예를 들어, 독립적으로, R1은 OH, 석시네이트 또는 OH의 보호된 형태이고; R2는 ODMT(여기서, ODMT는 산소 원자를 통해 연결된 DMT(4,4'-디메톡시트리틸)임) 또는 카르복실레이트이다. OH의 보호된 형태는 에테르, 포스페이트 에스테르, 메틸 테트라아세틸 글루쿠로네이트, 퍼아세틸 글리코시드 및 아미노산 폴리펩티드 에스테르를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
다양한 3' 말단 캡("리간드"로도 지칭)의 다양한 DMT, 석시네이트 및 카르복실레이트 형태에 대하여 대안적인 명칭이 고안되었다.
석시네이트 형태는 임의로 RNAi 작용제 합성을 위해 이들 분자를 고체 지지체에 로딩하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 한 합성은 도 12에 나타나 있지만, 다른 경로도 또한 가능하다.
고상 CPG 로딩 및 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 석시닐(CO2H-(CH2)n-CO2H; n=2) 링커에 더하여, 다양한 길이의 다른 이산[CO2H-(CH2)n-CO2H] 및 하이드로퀴논-O,O'-디아실(문헌[Pon et al. Nucl . Acids Res. 1997, 18, 3629-3635]), N-메틸-석신이미도[3,4-b]-7-옥사비사이클로[2.2.1]헵탄-6-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-5-석시노일(문헌[Guzaev et al. J. Am. Chem . Soc . 2003, 125, 2380-2381]; 문헌[Kumar et al. Tetrahedron 2006, 62, 4528-4534]), (2S,3S,4R,5R)-4-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)-2,5-디메톡시테트라하이드로푸란-3-석시노일(문헌[Scott et al. "Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis, 3rd International Symposium," 1994, Ed. Roger Epton, Mayflower Worldwide, 115-124]) 및 1-디메톡시트리틸옥시-2-O-디클로로아세틸-프로필-3-N-석시닐(문헌[Azhayev. Tetrahedron, 1999, 55, 787-800]; 문헌[Azhayev et al. Tetrahedron 2001, 57, 4977-4986])을 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 다른 "광범위 지원" 전략(예컨대, Glen Research, Sterling, VA의 Glen UnySupportTM)이 사용될 수 있다.
석시네이트는 그것이 오직 siRNA의 최종 형태에 존재하지 않는 합성 핸들이기 때문에, 흔적이 없다.
그렇지만, 카르복실레이트 변이체를 사용하는 PAZ 결합 검정이 효능을 예측하는 것이 아닌데, 이는 하기에 개시된 PAZ 리간드 중 몇몇이 이러한 검정에서 PAZ 리간드에 결합하지 않았고, 이후에 siRNA에 컨쥬게이트되는 경우 3' 캡으로 효율적인 것으로 관찰되었기 때문이다.
3' 말단 캡의 DMT-리간드, 석시네이트-리간드 및 카르복실레이트 형태의 구조는 하기 표 4에 나타나 있다.
[표 4]
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제
따라서, 본 발명은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 이중-가닥 RNAi 작용제(siRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 이중-가닥 분자)를 제공하며, 제1 및/또는 제2 가닥은 표적 유전자의 적어도 15 내지 적어도 19개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, RNAi 작용제는 하나의 또는 둘 모두의 가닥 상에 3' 말단 캡을 포함한다. 제1 및 제2 가닥은 맥락에 따라, 안티센스 및 센스 가닥 또는 센스 및 안티센스 가닥일 수 있다. 센스 및 안티-센스 가닥은 비-연속, 연속이거나, 예를 들어, 루프 또는 링커를 통해 공유 결합될 수 있다. 특히, 3' 말단 캡은 표 1 또는 표 2에 열거되거나 다르게 본원에 개시된 것들로부터 선택된다. 둘 모두의 가닥이 3' 말단 캡을 포함하면, 각 가닥 상의 3' 말단 캡은 동일하거나 상이할 수 있다. RNAi 작용제는 특히 일 구현예에서, 가닥 마다 30개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어, 17 내지 23개 뉴클레오티드, 15 내지 19개 뉴클레오티드, 18 내지 22개 뉴클레오티드 및/또는 19 내지 21개 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 뉴클레오티드에서 (예를 들어, 2' 탄소에서) 변형되거나 비변형될 수 있다.
이중-가닥 RNAi 작용제는 하나의 또는 둘 모두의 3' 및/또는 5' 말단으로부터 0, 1 또는 2개의 블런트 말단 및/또는 [예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드(즉, 1 내지 4개의 뉴클레오티드)의] 오버행을 가질 수 있다.
RNAi 작용제는 그들이 리보뉴클레오티드 서브유닛을 포함하든, 데옥시리보뉴클레오티드 서브유닛을 포함하든, 아니면 다른 관련 변형된 변이체를 포함하든, 천연-발생 뉴클레오티드 서브유닛(예를 들어, 리보뉴클레오티드)만을 함유하거나 대체 뉴클레오티드 서브유닛의 하나 이상의 당, 포스페이트 또는 염기에 대한 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 따라서, RNAi 작용제는 대체 백본 뉴클레오티드(예를 들어, PNA, 모르폴리노, LNA, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA 등) 및/또는 변형된 뉴클레오티드에 의한 천연-발생 뉴클레오티드의 치환을 함유하는 것들을 포함한다.
일 구현예에서, 개시된 RNAi 작용제의 변형된 변이체는 유리딘을 대체하는 티미딘(RNA 또는 바람직하게는 DNA로서)을 갖거나 이노신 염기를 갖는다. 일부 구현예에서, 개시된 RNAi 작용제의 변형된 변이체는 "패신저(passenger)"("센스"로도 알려져 있음) 가닥에 닉(nick), 가이드와 패신저 가닥 사이의 미스매치, 가이드 및 패신저 가닥(예를 들어, 씨드 영역) 둘 모두의 일부분의 RNA를 대체하는 DNA 및/또는 단축된 패신저 가닥(예를 들어, 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드)을 가질 수 있다. 가이드 가닥에서 사용하기에 적합한 기능적 3' 말단 캡이 확인되면, RNAi 작용제의 변형 및 변이체가 용이하게 이루어질 수 있다. 개시된 3' 말단 캡은 상호 배타적이지 않은 구현예 또는 특징의 임의의 조합(예를 들어, 염기 변형과 단축된 패신저 가닥; 또는 닉이 있는 패신저 가닥과 염기 변형; 또는 씨드 영역의 부분 또는 전부를 대체하는 DNA와 잔여 RNA에서의 염기 변형; 또는 변형과 임의의 전달 비히클의 조합; 등)을 포함하는 임의의 RNAi 작용제에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 변형은 RNAi 작용제의 효능, (예를 들어, 혈청 또는 장액 중 뉴클레아제에 대한) 안정성을 개선시키고/거나 면역원성을 감소시킨다. 본 발명의 일 구현예는 적어도 하나의 비-천연 핵염기를 포함하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 비-천연 핵염기는 디플루오로톨릴, 니트로인돌릴, 니트로피롤릴 또는 니트로이미다졸릴이다. 특정 구현예에서, 비-천연 핵염기는 디플루오로톨릴이다. 특정 구현예에서, 2개의 올리고뉴클레오티드 가닥 중 오직 한 가닥만이 비-천연 핵염기를 함유한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 가닥의 둘 모두는 비-천연 핵염기를 함유한다.
RNAi 작용제(들)는 임의로 작용제, 예를 들어, 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 하나 이상의 특징, 예를 들어, 안정성, 분포 및/또는 세포 흡수를 개선시키도록 선택되는 리간드에 부착될 수 있다. RNAi 작용제(들)는 분리되거나, 본원에 기재된 방법을 위해 사용되는 약제학적 조성물의 부분일 수 있다. 특히, 약제학적 조성물은 특정 조직(예를 들어, 표적 유전자-관련 질병을 앓고 있는 것들)으로의 전달을 위해 제형화되거나 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 임의로 2개 이상의 유형 또는 서열의 RNAi 작용제를 포함할 수 있으며, 각각의 것은 동일하거나 상이한 표적 유전자 mRNA의 세그먼트에 지향된다. 임의로, 약제학적 조성물은 임의의 표적 유전자-관련 질병을 위한 임의의 알려져 있는 치료를 추가로 포함하거나 그와 함께 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제 및 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 적합한 전달 비히클을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 특히 표적 유전자의 과발현 또는 과활성을 특징으로 하는 질병의 경우에, 세포에서의 표적 유전자 mRNA의 수준 및/또는 활성의 억제 또는 감소 방법을 제공한다. 표적 유전자의 돌연변이, 과발현 및/또는 과활성과 같은 변경을 포함하는 세포는 "표적 유전자-결함" 세포로 명명된다. 그러한 방법은 하기에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 RNAi 작용제 중 하나 이상을 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 세포에서 표적 RNA를 선택적으로 분해하는 RNA 간섭에 수반되는 세포 메커니즘을 사용하며, 세포를 본 발명의 RNAi 작용제 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 표적 유전자를 표적으로 하는 치료적 유효량의 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 적어도 부분적으로 표적 유전자 발현에 의해 매개되는 병적 상태를 갖는 인간 대상체의 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물, 예를 들어, 방법 및 표적 유전자 RNAi 작용제 조성물은 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 적절한 용량 및/또는 제형으로, 그리고 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 적합한 투여 경로와 함께 사용될 수 있다.
또한, 상기 방법은 임의로 제2 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 제2 작용제는 표적 유전자에 대한 다른 RNAi 작용제이다. 다른 구현예에서, 제2 작용제는 다른 치료, 예를 들어, 병적 상태에서 과활성이고/거나 돌연변이되고/거나 과발현되는 다른 표적에 지향된 치료이다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 상세한 설명은 하기의 첨부된 도면 및 설명에 기재되어 있다. 서로 배타적이지 않은 다양한 구현예의 요소(예를 들어, 3' 말단 캡, 서열, 변형, 변형의 패턴, 5' 말단 캡, RNAi 작용제의 병용, 표적 유전자 RNAi 작용제 및 다른 작용제를 수반하는 병용 요법 등)는 본원에 기재되고 해당 분야에 알려져 있거나 개발된 바와 같이 서로 병용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡은 본원에 개시된 변형 또는 서열의 임의의 세트와 병용될 수 있다. 변형, 5' 말단 캡 및/또는 서열의 임의의 병용은 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡과 함께 사용될 수 있다. (변형 또는 말단캡의 임의의 병용이 있거나, 변형 또는 말단캡 중 어느 하나가 없는) 본원에 개시된 임의의 RNAi 작용제는 본원에 개시된 임의의 다른 RNAi 작용제 또는 다른 치료 조성물 또는 방법과 병용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 RNAi 작용제 또는 본원에 개시된 임의의 RNAi 작용제를 수반하는 임의의 방법을 포함하며, RNAi 작용제는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 3' 말단 캡을 포함한다.
정의
편의상, 발명의 설명, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어 및 어구의 의미가 하기에 제공된다. 발명의 설명의 다른 부분에서의 용어의 용법과 이러한 섹션에 제공된 그의 정의 사이에 명백한 모순이 존재하는 경우, 이러한 섹션에서의 정의가 우선할 것이다.
"알킬"은 특정 개수의 탄소 원자를 갖는 1가 포화 탄화수소 쇄이다. 예를 들어, C1-6 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 말한다. 알킬기는 직선형 또는 분지형일 수 있다. 대표적인 분지형 알킬기는 1, 2 또는 3개의 분지를 갖는다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필(n-프로필 및 이소프로필), 부틸(n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 t-부틸), 펜틸(n-펜틸, 이소펜틸 및 네오펜틸) 및 헥실을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
"아릴"은 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리계이다. 아릴기는 단환식 고리계 또는 이환식 고리계이다. 단환식 아릴 고리는 페닐을 말한다. 이환식 아릴 고리는 나프틸, 및 페닐이 본원에 정의된 바와 같은 C5-7 사이클로알킬 또는 C5-7 사이클로알케닐 고리에 융합되어 있는 고리를 말한다.
RNA 간섭
본원에 사용된 "RNA 간섭"(RNAi)은 RNAi 작용제를 사용하여, RNAi 작용제와 동일하거나 그와 매우 유사한 서열을 함유하는 메신저 RNA(mRNA)를 분해하는 전사후, 표적화된 유전자-침묵화 기술이다. 문헌[Zamore and Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524]; 문헌[Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33]; 문헌[Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498]; 및 Kreutzer 등의 PCT 공개 WO 00/44895호; Fire의 PCT 공개 WO 99/32619호; Mello 및 Fire의 PCT 공개 WO 01/29058호 등을 참조한다. RNAi 과정은 긴 dsRNA가 세포 내로 도입되고 리보뉴클레아제 III(다이서)에 의해 siRNA로 지칭되는 더 짧은 단편으로 절단되는 경우 천연적으로 발생한다. 천연적으로 생성된 siRNA는 전형적으로 약 21개 뉴클레오티드 길이이며, 2개의 2-nt 오버행을 갖는 약 19개 염기쌍 듀플렉스("표준" 구조)를 포함한다. siRNA의 가닥은 RNA-유도 침묵화 복합체(RISC) 내로 혼입된다. 이러한 가닥(안티-센스 또는 가이드 가닥으로 알려져 있음)은 RISC를 상보성 mRNA로 안내한다. 그 다음, RISC 내의 하나 이상의 뉴클레아제는 표적 mRNA의 절단을 매개하여, 침묵화를 유도한다. 표적 RNA의 절단은 안티-센스 가닥에 상보적인 영역의 중간에서 일어난다. 문헌[Nykanen, et al. 2001 Cell 107:309]; 문헌[Sharp et al. 2001 Genes Dev. 15:485]; 문헌[Bernstein, et al. 2001 Nature 409:363]; 문헌[Elbashir, et al. 2001 Genes Dev. 15:188]을 참조한다.
본원에 사용되는 용어 "RNAi 작용제"는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 다양한 천연 및 인공 구조에 더하여, siRNA("표준" 구조의 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않음)를 포함한다. 하기 상세히 설명된 바와 같이, 이들 구조는 표준보다 더 길거나 짧을 수 있고/거나 블런트-말단일 수 있고/거나 하나 이상의 변형, 미스매치, 갭 및/또는 뉴클레오티드 대체를 포함할 수 있다. 본 발명의 3' 말단 캡은 임의의 RNAi 작용제와 함께 사용될 수 있으며, 2가지 기능을 가능하게 할 수 있다: (1) RNA 간섭을 가능하게 하는 기능; 및 (2) 예를 들어, 다이서의 PAZ 도메인으로의 증가된 결합 및/또는 (예를 들어, 뉴클레아제, 예를 들어, 혈청 또는 장액 중의 뉴클레아제에 의한) RNAi 작용제의 분해의 감소 또는 방지에 의해 달성될 수 있는 활성 기간 및/또는 생물학적 반감기를 증가시키는 기능.
본 발명의 RNAi 작용제(들)는 표적 mRNA를 표적으로 한다(예를 들어, 그에 결합하거나, 그에 어닐링되거나 하는 등이다). 표적에 대한 RNAi 작용제의 이용은 표적 활성, 수준 및/또는 발현의 감소, 예를 들어, 표적 유전자 또는 표적 서열의 "낙-다운" 또는 "낙-아웃"을 야기한다. 특히, 일 구현예에서, 표적 유전자의 과발현 또는 과활성을 특징으로 하는 병태의 경우에, 표적 유전자에 대한 RNAi 작용제를 투여하면, 표적 유전자 활성의 정상 수준을 복구시키기에 충분하게 표적 유전자 표적이 낙 다운된다.
적합한 RNAi 작용제는 해당 분야에 알려져 있거나 당업계의 숙련자에 의해 가능한 임의의 과정에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 선택 기준은 하기의 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 표적 유전자 서열의 초기 분석 및 RNAi 작용제의 설계로서, 이러한 설계가 종들(인간, 시노몰구스(cynomolgus), 마우스 등) 간의 서열 유사성 및 다른 유전자(비-표적 유전자)와의 차이점을 고려할 수 있는 설계; 시험관내에서의(예를 들어, 세포에서 10 nM에서의) RNAi 작용제의 스크리닝; 세포에서의 EC50의 결정; 생존을 위해 표적 유전자를 필요로 하지 않는 비감수성 세포 또는 생존을 위해 표적 유전자를 필요로 하는 감수성 세포를 포함하는 RNAi 작용제로 처리된 세포의 생존가능성의 결정; 예를 들어, TNF-알파의 수준을 시험하여 면역원성을 추정하기 위한 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)를 사용한 시험으로서, 면역자극 서열이 덜 바람직한 시험; 신선한 인간 혈액을 RNAi 작용제로 처리하고 사이토카인/케모카인[예를 들어, TNF-알파(종양 괴사 인자-알파) 및/또는 MCP1(단핵구 화학주성 단백질 1)] 수준을 결정하는 인간 전혈 검정에서의 시험으로서, 면역자극 서열은 덜 바람직한 시험; 시험 동물에서 피하 종양을 이용한 생체내 유전자 녹다운의 결정; 예를 들어, 약역학적(PD) 마커, 예를 들어 발현이 표적 유전자에 의해 영향을 받는 다른 인자를 이용한 표적 유전자 조정 분석으로서, 표적 유전자 낙다운이 그들 성분의 풍부도의 용량-의존적 감소를 유발하는 분석; 및 RNAi 작용제의 특정 변형의 최적화.
따라서, 본원에 기재된 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제는 표적 유전자의 RNA 간섭에 유용하다.
네이키드 siRNA(적합한 3' 말단 캡, 예를 들어, 본원에 개시된 것들이 결여)가 생체내에서 짧은 활성 기간을 갖는 것이 해당 분야에 알려져 있으며; 그것은 혈청 중 뉴클레아제에 의해 신속하게 분해되며, 종종 수 분의 반감기를 갖는다. 문헌[Layzer et al. 2004 RNA 10: 766-771]; 문헌[Choung et al. 2006 Biochem. Biophys. Res. Comm. 342: 919-927]; 및 문헌[Sato et al. 2007 J. Control. Rel. 122: 209-216]. 이전에 기재된 많은 3' 말단 캡은 RNA 간섭을 가능하게 하는 것 및 분자를 뉴클레아제로부터 보호하거나 기간을 연장시키는 것 둘 모두를 행하지 않는다.
본원에 개시된 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제는 이들 활성을 매개한다.
개시된 3' 말단 캡과 함께 사용하기에 적합한 RNAi 작용제 구조의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.
RNAi 작용제의 구조: 다양한 길이, (임의의) 오버행, (임의의) 5' 말단 캡, (임의의) 변형; (임의의) 변형 패턴의 안티센스 가닥 및 센스 가닥
RNAi 작용제는 RNA 간섭을 매개하며, 제1 가닥 및 제2 가닥, 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥(또는 안티센스 및 센스 가닥)을 포함하고, 가닥은 임의로 1개의 또는 2개의 오버행, 및 (임의로) 1개의 또는 2개의 5' 말단 캡을 (임의로) 추가로 포함하는 주로 RNA(임의로 하나 이상의 뉴클레오티드가 대체되고/거나 변형됨)이며, 임의의 변형은 임의로 다양한 변형 패턴으로 존재할 수 있으며, 가닥은 임의로 다양한 길이의 것일 수 있다. 본 발명의 RNAi 작용제는 어느 하나의 센스 및/또는 안티-센스 가닥 상에 3' 말단 캡을 포함한다.
안티 -센스 및 센스 가닥
본원에 사용되는 용어 "안티센스 가닥"(AS)은 표적 서열에 완전히 또는 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 작용제의 가닥을 말한다. "안티센스 가닥"은 때때로 "가이드" 가닥으로 지칭된다. 본원에 사용되는 용어 "상보성 영역"은 표적 mRNA 서열에 완전히 또는 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 말한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 분자의 내부 또는 말단 영역에 미스매치가 존재할 수 있다. 일반적으로 가장 잘 용인되는 미스매치는 말단 영역, 예컨대 5' 및/또는 3' 말단의 5, 4, 3, 또는 2개 뉴클레오티드 내에 존재한다. 미스매치에 가장 민감한 안티센스 가닥의 부분은 "씨드 영역"으로 지칭된다. 정확히 19개 뉴클레오티드의 가닥을 포함하는 RNAi 작용제에서, 19번째 위치(5'에서 3'으로 계수하여)는 일부 미스매치를 용인할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "센스 가닥"(S)은 용어가 본원에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 작용제의 가닥을 말한다. "센스" 가닥은 때때로 "패신저" 또는 "안티-가이드" 가닥으로 지칭된다. 안티센스 가닥은 그들의 서열에 의해, 요망되는 mRNA를 표적으로 하는 한편, 센스 가닥은 상이한 표적을 표적으로 한다. 따라서, 안티센스 가닥이 RISC 내로 혼입되면, 올바른 표적이 표적화된다. 센스 가닥의 혼입은 표적외 효과를 야기할 수 있다. 이들 표적외 효과는 하기에 기재된 바와 같이, 센스 가닥 상의 변형의 이용 또는 5' 말단 캡의 이용에 의해 제한될 수 있다.
유전자의 서열은 개체 간에, 특히 코딩 세그먼트 내의 워블(wobble) 위치에서, 또는 비번역 영역에서 달라질 수 있고; 개체는 또한 코딩 서열이 서로 상이하여 mRNA에서 추가의 차이를 야기할 수 있다. 따라서, RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥의 서열은 필요한 경우에, 개별 환자의 서열에 상응하도록 맞춤화될 수 있다. RNAi 작용제는 또한 면역원성, 요망되지 않는 mRNA로의 결합(예를 들어, "표적외 효과")을 감소시키거나 또는 혈중 안정성을 증가시키도록 서열이 변형될 수 있다. 이들 서열 변이체는 RNAi 작용제의 염기 또는 5' 또는 3' 또는 다른 말단-캡의 화학적 변형과 독립적이다.
안티센스 및 센스 가닥의 길이
RNAi 작용제의 안티센스 및 센스 가닥은 본원에 기재되고 해당 분야에 알려져 있는 바와 같이 다양한 길이의 것일 수 있다.
일 구현예에서, 각 가닥은 49-mer 이하이다.
더 짧은 길이의 siRNA는 효율적인 siRNA를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 2개의 RNA 가닥의 각각은 14 내지 24개 염기쌍(bp)의 이중-가닥 영역 및 1 내지 5개 뉴클레오티드의 적어도 하나의 3' 말단 오버행을 갖는 19 내지 25개 뉴클레오티드(nt)일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,056,704호 및 제7,078,196호; 일본 특허 2002/546670호; 및 유럽 특허 제1407044호를 참조한다. 대안적으로, 가닥은 각각 21개 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, 2개의 2개 뉴클레오티드 오버행을 갖는 19 bp 영역을 형성한다. 그러한 구조는 본원에 "표준" 구조로 정의된다.
대안적으로, 가닥은 각각 19-mer일 수 있고, 2개의 가닥은 함께 블런트-말단 듀플렉스를 형성할 수 있다.
대안적으로, 가닥은 각각 18-mer일 수 있고, 2개의 가닥은 함께 블런트-말단 듀플렉스를 형성할 수 있다.
대안적으로, 센스 가닥은 안티센스 가닥보다 유의미하게 더 짧을 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이나 센스 가닥은 오직 15 또는 16개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 가닥의 단축은 RISC 내로 혼입되는 센스 가닥에 의해 매개되는 표적-외 효과를 감소시킨다. 문헌[Sun et al. 2008 Nature Biotech. 26: 1379-1382]; 문헌[Chu and Rana. 2008 RNA 14: 1714-1719]. 센스 가닥은 다양한 조합으로, 단축 및/또는 변형 및/또는 5' 말단 캡핑되어, 그의 RNAi 활성을 감소시킬 수 있다.
안티센스 또는 센스 가닥 중 어느 하나의 임의의 길이는 그러한 조합이 상호 배타적이지 않는 한(예를 들어, 오버행의 존재 또는 부재는 안티센스 및 센스 가닥의 특정 길이에 의해 좌우될 수 있음), 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 작용제의 임의의 다른 구현예(예를 들어, 임의의 3' 말단 캡, 변형, 뉴클레오티드 대체, 5' 말단 캡, 오버행, 전달 비히클 등)와 조합될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 3' 말단 캡은 임의의 길이의 가닥(들)을 갖는 임의의 작용성 RNAi 작용제에서 사용될 수 있다.
(임의의) 오버행(들)
또한, RNAi 작용제는 0, 1 또는 2개의 오버행의 오버행을 가질 수 있으며; 0개 뉴클레오티드 오버행의 경우에, 그들은 블런트-말단이다. 따라서, RNAi 작용제는 0, 1 또는 2개의 블런트 말단을 가질 수 있다. "블런트-말단 RNAi 작용제"에서, 둘 모두의 가닥은 염기-쌍으로 종결되며; 따라서, 블런트-말단 분자는 3' 또는 5' 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행이 결여된다.
본 발명의 3' 말단 캡은 오버행의 작용성을 대체할 수 있거나, 하나의 또는 둘 모두의 가닥 상의 오버행에 더하여 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "오버행" 또는 "뉴클레오티드 오버행"은 RNAi 작용제의 듀플렉스 구조의 2개의 가닥 중 적어도 하나의 말단으로부터 돌출하는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 말한다. 오버행(들)은 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3' 말단 상에 존재할 수 있다.
(뉴클레오티드 중 하나 이상이 대체되고/거나 변형될 수 있지만) siRNA의 둘 모두의 가닥이 일반적으로 RNA인 한편, 오버행은 RNA 또는 그의 변이체일 수 있다. 적합한 오버행은 임의의 서열 또는 길이(예를 들어, 1 내지 5개 뉴클레오티드)의 RNA, TT(디티미딘 디뉴클레오티드) 또는 UU 또는 그의 변이체, 예를 들어, dTdT, sdT, dTsdT, sdTsdT 또는 sdTdT 등을 포함하며, 이들은 듀플렉스 내의 표적 유전자 특이적 서열과 동일한 5'에서 3' 배향 또는 역전/역위 배향으로 존재할 수 있다.
뉴클레오티드 오버행, 예를 들어, TT 또는 UU는 표적 mRNA를 인식하지 않으며, 표적 서열의 부분으로 여겨지지 않는다. 그럼에도 불구하고, 많은 표준 siRNA가 오버행 없이 잘 기능하지 않기 때문에, 오버행은 작용성일 수 있다. 또한, 오버행은 뉴클레아제, 예를 들어, 혈청 또는 장액 중 뉴클레아제에 의한 분해로부터의 RNAi 작용제의 일부 보호를 제공한다. 문헌[Elbashir et al. 2001 EMBO J. 23: 6877-6888], 특히 도 1F; 문헌[Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498]; 및 문헌[Kraynack et al. 2006 RNA 12:163-176]을 참조한다.
본원에 나타나 있고, 해당 분야에 알려져 있는 바와 같이, 오버행을 3' 말단 캡으로 대체하여, 뛰어난 RNAi 작용제를 제공하기 위한 많은 시도가 이루어졌다. 그러나 하기 상세히 설명된 바와 같이, 이들 시도는 종종 (1) RNA 간섭을 매개하고, (2) 뉴클레아제에 대한 저항성을 증가시키고/거나 혈청 중 기간을 연장시키는 것 둘 모두를 가능하게 할 수 없는 RNAi 작용제를 제공하였다. 대조적으로, 본원에 개시된 3' 말단 캡은 RNA 간섭 및 혈청 중 RNA 간섭 활성의 기간 증가를 가능하게 한다.
3' 말단 캡(특히 PAZ 리간드)은 그들이 때때로 디뉴클레오티드 오버행을 대체하기 때문에, 일부 문헌에서 "디뉴클레오티드 대용물"로 지칭된다. 그러나 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡이 또한 오버행에 더하여 사용될 수 있는 것이 주목된다.
따라서, 이러한 문헌은 RNAi 작용제에 사용하기 위한, 예를 들어, 표 1 및 표 2에 나타내고/거나 다르게는 본원에 기재된 바와 같은 3' 말단 캡을 포함한다.
(임의의) 5' 말단 캡(들)
"5' 캡"은 임의로 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 부착될 수 있다. 안티센스 및 센스 가닥의 기능은 이들 가닥의 5' 말단의 구조적 요건이 그러한 것과 같이 상이하다. 안티센스 가닥 상의 5' 말단 캡은 이러한 가닥에 의해 매개되는 RNAi 활성을 간섭하지 않아야 하지만; 일부 구현예에서, 센스 가닥 상의 5' 말단 캡은 센스 가닥에 의해 매개되는 RNAi 활성을 간섭할 수 있다. 어느 가닥이 RISC 내로 로딩될 수 있지만, 안티센스 가닥만이 요망되는 표적을 표적으로 한다. 센스 가닥의 로딩은 표적외 효과, 예를 들어, 요망되지 않는 표적의 RNA 간섭을 야기할 수 있다. 문헌[Jackson et al. 2003 Nat. Biotech. 21: 635-637].
안티센스 가닥의 경우에: 5' 말단 캡은 이러한 가닥의 RNAi 활성을 간섭하지 않아야 하고, (예를 들어, 뉴클레아제, 예를 들어, 혈청 또는 장액 중 뉴클레아제로부터) 적어도 일부 보호를 제공할 수 있다. 가이드 가닥 상의 5'-포스페이트는 일반적으로 최적의 RNAi 활성에 필요하다. 5' dT 변형은 안티센스 가닥 안정성을 제공하고, 효력을 증가시킨다. 인산화를 차단하면 활성이 감소된다. 대조적으로, 5' 말단에 부가되는 1 내지 3개의 리보뉴클레오티드는 억제를 개선시킨다. 문헌[Morrissey et al. 2005 Nat. Biotech. 23: 1002-1007]. 안티센스 가닥 5' 말단과 RISC의 아고너트-2(Ago2) 성분의 분자 상호작용의 일부가 설명되어 있다. 문헌[Parker et al. 2005. Nature 434: 663-666]; 및 문헌[Frank et al. 2010 Nature 465: 818-822].
대조적으로, 센스 가닥의 경우에: RNA 간섭을 억제하는 5' 말단 캡은 이러한 가닥에 유용할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이 5'-포스페이트는 일반적으로 최적의 RNAi 활성에 필요하다. 5'-OH 기의 제거는 센스 가닥의 인산화를 방지하는 가장 간단한 방법이다.
5' 말단 캡에 더하여, 다른 변형 또는 변형의 세트를 사용하여, 센스 가닥의 활성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 3' 말단 캡은 센스 가닥 상의 5' 말단 캡 및/또는 센스 가닥의 활성을 감소시키는 임의의 변형 또는 일련의 변형을 포함하는 임의의 RNAi 작용제와 함께 사용될 수 있다.
(임의의) 추가의 뉴클레오티드 대체 및/또는 변형
siRNA의 가닥은 일반적으로 천연에서 발현되거나 관찰되는 바와 같은(즉, 천연적으로 발생하는) RNA 분자뿐 아니라, 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 바와 같은 하나 이상의 리보뉴클레오티드/리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 뉴클레오티드의 비-천연 발생 유사체 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 위치에서, RNA 뉴클레오티드는 DNA 또는 상이한 백본의 뉴클레오티드 또는 PNA, LNA, 모르폴리노, TNA, GNA, ANA, HNA, CeNA, FANA 및/또는 UNA로 대체되고/거나; 변형될 수 있다(2'-MOE, 2'-OMe, 2'-F 및 2'-H를 포함하나 이들에 한정되지 않음). 다양한 구현예에서, RNAi 작용제는 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단(예를 들어, 19-mer에서 위치 18 및 19 또는 18-mer에서 위치 17 및 18) 및/또는 중간에 존재하는 하나 이상의 LNA를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 대체는 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(5'에서 3'으로 계수) 내에 존재하여 클램프를 형성한다. 클램프는 제한 없이, 2'-MOE 클램프[여기서, 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(5'에서 3'으로 계수)는 각각 2'-MOE 변형을 가짐]를 포함한다. 클램프의 다른 변이체가 가능하며, 여기서, 예를 들어, 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(5'에서 3'으로 계수)는 도 20c 내지 도 20e에 나타낸 바와 같이 각각 DNA, 2'-OMe, 2'-F 또는 LNA이다. 마지막 2개의 뉴클레오티드(5'에서 3'으로 계수)도 또한 각 가닥의 3' 말단에서 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(3'에서 5'으로 계수)인 것으로 여겨질 수 있는 것이 주목된다. 본원 및 미국 특허 제8,084,600호에 나타낸 바와 같이, 클램프는 안티센스 및/또는 센스 가닥 상에 존재할 수 있다.
따라서, 각 가닥에서 뉴클레오티드는 일반적으로 RNA인 한편(뉴클레오티드의 대부분이 RNA임을 의미함), 일부는 DNA 또는 대안적인 백본의 뉴클레오티드, 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노, 트레오스 핵산(TNA) 및/또는 글리콜 핵산(GNA)으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 또는 둘 모두의 가닥에서 오직 1 또는 2 또는 3개의 뉴클레오티드만이 대체된다. 일부 구현예에서, 하나의 또는 둘 모두의 가닥에서 오직 약 1 내지 3개의 뉴클레오티드만이 DNA로 대체된다. 이의 비제한적인 예는 도 15b 및 도 17a에 나타나 있다.
따라서, 어느 가닥에서 RNA 뉴클레오티드는 대체 및/또는 변형될 수 있다.
RNA는 핵염기 구조 또는 리보스-포스페이트 백본 구조에서 변형될 수 있다. 그러나 대부분의 구현예에서, 리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 분자는 듀플렉스를 형성하는 능력을 유지한다. 비제한적 예로서, RNA 분자는 또한 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5' 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오시드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오시드, 잠금 뉴클레오시드, 무염기 뉴클레오시드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오시드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오시드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오시드, 모르폴리노 뉴클레오시드, 비잠금 리보뉴클레오티드(예를 들어, WO 2008/147824호에 기재된 바와 같은 비환식 뉴클레오티드 단량체), 포스포르아미데이트, 또는 뉴클레오시드를 포함하는 비-천연 염기, 또는 그들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 적어도 하나의 변형된 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 대안적으로, RNA 분자는 적어도 2개의 변형된 리보뉴클레오시드, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 이상, dsRNA 분자의 전장 이하를 포함할 수 있다. 변형은 RNA 분자에서 이러한 복수의 변형된 리보뉴클레오시드 각각에 대해 동일할 필요는 없다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려되는 변형된 RNA는, 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡을 포함하며, 요구되는 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 가지며, 그것은 RISC 경로를 통한 표적 RNA의 특이적 분해를 허용 또는 매개한다.
RNAi 작용제를 생성하는데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노푸린을 포함한다.
본원에 개시된 서열의 "변형된 변이체"는 동일한 서열을 포함하지만 염기, 당, 포스페이트 또는 백본에서 변형을 갖는 (그러나 예를 들어 A의 G로의, 또는 C의 U로의 염기 치환이 아닌) 임의의 변이체를 포함한다. 따라서, 변형된 변이체는 상기 기재된 임의의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)우라실 등)를 포함할 수 있다. 염기가 상응하는 변형된 염기로 대체된 경우에(예를 들어, A가 변형된 A로), 이들 변형된 뉴클레오티드는 미스매치 또는 염기 차이를 구성하지는 않는다. 따라서, 특정한 위치에서 U를 갖는 주어진 서열, 및 동일한 서열에서 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 또는 5-아이오도우라실을 포함하는 변형된 변이체는 0개의 뉴클레오티드 만큼 상이할 것이나(또는 미스매치를 갖지 않을 것이나); 특정한 위치에서 C를 갖는 주어진 서열, 및 5-플루오로우라실을 갖는 상이한 서열은(여기서 2개의 서열은 그 외에는 동일함) 1개의 뉴클레오티드 만큼 상이할 것이다(1개의 미스매치).
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNAi 작용제는 3' 말단 캡 및 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 적어도 가닥에 포함함으로써 높은 생체내 안정성을 부여한다. 따라서, 본 발명에 따른 RNAi 작용제는 바람직하게는 적어도 하나의 변형된 또는 비-천연 리보뉴클레오티드를 함유한다. 많은 알려져 있는 화학적 변형의 긴 설명은 공개된 PCT 특허 출원 WO 200370918호에 기재되어 있으며, 본원에 반복하지 않을 것이다. 경구 전달에 적합한 변형은 더욱 구체적으로 본원의 실시예 및 설명에 기재되어 있다. 적합한 변형은 당 모이어티(즉, 당 모이어티의 2' 위치, 예를 들어, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE(문헌[Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]), 즉, 알콕시알콕시기) 또는 염기 모이어티(즉 교호하는 뉴클레오티드 쇄에서 다른 특정 염기와 쌍을 형성하는 능력을 유지하는 비천연 또는 변형된 염기)에 대한 변형을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
기타 변형에는 포스포에스테르기를 대체하는 것(예를 들면 인접 리보뉴클레오티드를 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트와 연결하는 것)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 소위 '백본' 변형이 포함된다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 포스페이트기는
Figure pct00072
로 대체된다. 다양한 추가의 구현예에서, 하나 이상의 포스페이트기는
Figure pct00073
로 대체되며, 여기서, R3은 O-, S-, NH2, BH3, CH3, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C1-6 알콕시 및 C6-10 아릴-옥시로부터 선택되고, C1-6 알킬 및 C6-10 아릴은 비치환되거나 임의로 할로, 하이드록실 및 NH2로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 기로 독립적으로 치환되며; R4는 O, S, NH 또는 CH2로부터 선택된다. 이들 대체 포스페이트기 중 일부는 또한 도 18c에 나타나 있다.
다양한 구현예에서, 포스페이트기의 포스페이트는 비소(As), 셀레늄(Se) 또는 안티몬(Sb)으로 대체된다. 일 구현예에서, 스페이서는 리비톨이고 포스페이트기는 대체되지 않는다. 다양한 구현예에서, 포스페이트기는 술폰아미드기 또는 시아노기 또는 카르복사미드로 대체된다. 다양한 구현예에서, 3' 말단 캡의 포스페이트기는 비소, 셀레늄, 안티몬 또는 술폰아미드기 또는 시아노기 또는 카르복사미드로 대체된다. 다양한 구현예에서, 링커(예를 들어, C3, C4 또는 C6 또는 리비톨, 디리비톨, 2'-데옥시리비톨 또는 2'-메톡시에톡시리비톨)의 포스페이트기는 비소, 셀레늄, 안티몬 또는 술폰아미드기 또는 시아노기 또는 카르복사미드로 대체된다.
Figure pct00074
W = O, S, NH, CH2, ...
X1, X2 = O-, S-, NH2, BH3 -, CH3, 알킬, 아릴, O-알킬, O-아릴, ...
Y = O, S, NH, CH2, ...
Z = C, Si, P, S, As, Se, Sb, Te, ...
R1 = H, OH, F, NH2, O-알킬, O-아릴, O-알킬-아릴, O-아릴-알킬, NH-알킬, N-디알킬, ...
R2 = 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬, ... (PAZ 리간드)
BASE = H, 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 티민, ...
따라서, 본원에 개시된 3' 말단 캡에 유용한 RNAi 작용제의 어느 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 뉴클레오티드는 대체 및/또는 변형될 수 있다.
(임의의) 변형의 패턴
RNAi 작용제의 뉴클레오티드의 변형의 일부 경우에, 변형은 무작위가 아니고 패턴으로 정렬된다. 이들 패턴(또는 체계)은 RNAi 작용제의 효능(RNAi 활성)을 증가시키고/거나, 센스 가닥의 활성을 감소시키거나 다르게는 표적외 효과를 감소시키고/거나, 분해 또는 면역원성을 감소시키고/거나 생물학적 반감기(예를 들어, 활성 기간)를 증가시킨다.
한 패턴의 변형에서, 센스 가닥의 다수의 위치는 2'-MOE이다. 비제한적인 예로서, 대부분의 또는 모든 피리미딘은 센스 가닥 내의 2'MOE이다. 센스 가닥에서 절반이 넘는 위치를 2'-MOE로 변형시키면, 활성을 감소시킬 수 있다. 센스 가닥의 모든 위치가 2'-MOE인 경우, 종종 활성이 없어진다.
다양한 패턴의 변형은 도 7, 11, 14, 15a, 15b 및 17a에 나타나 있다.
도 15a(상측)는 19-mer 블런트-말단 RNAi 작용제에서의 2'-OMe 및 2'-MOE 변형의 패턴의 정렬의 비제한적인 예를 보여준다. 예로서, 나타낸 3' 말단 캡은 C3이지만, 다른 3' 말단 캡이 이러한 변형 패턴(예를 들어, 본원에 개시된 것들)과 함께 사용될 수 있다. 이러한 변형 패턴은 또한 MOE 클램프(여기서, 5'에서 3'으로 계수하여 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드는 2'-MOE 변형을 가짐)를 포함한다. 5'에서 3'으로 계수하여 마지막 2개의 뉴클레오티드는 또한 각 가닥의 3' 말단에서 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(3'에서 5'으로 계수하여)인 것으로 여겨질 수 있다.
도 15a(하측)는 2'F 변형을 사용한 변형 패턴의 비제한적인 예를 보여준다. 다시 이러한 예에서, 나타낸 3' 말단 캡은 C3이지만, 다른 3' 말단 캡이 이러한 변형 체계(예를 들어, 본원에 개시된 것들)와 함께 사용될 수 있다.
도 15b(상측)는 "wt"("야생형") siRNA 및 이러한 siRNA의 상응하는 비제한적인 예시적인 변형 체계를 보여준다. 예시적인 변형된 siRNA는 2'-OMe 및 포스포로티오에이트(들)를 갖는다.
도 15b(하측)는 표준 21-mer siRNA에 대한 및 18- 또는 19-mer 형식에 대한 변형 체계의 비제한적인 예를 보여준다. 이들 체계에서, "L"은 3' 말단 캡(예를 들어, PAZ 리간드)을 나타낸다.
다양한 다른 변형 패턴에서, RNAi 작용제는 우리딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 적어도 하나의 5'-우리딘-아데닌-3'(5'-ua-3') 디뉴클레오티드; 5'-우리딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 적어도 하나의 5'-우리딘-구아닌-3'(5'-ug-3') 디뉴클레오티드; 5'-시티딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 적어도 하나의 5'-시티딘-아데닌-3'(5'-ca-3') 디뉴클레오티드; 및/또는 5'-우리딘이 2'-변형된 뉴클레오티드인 적어도 하나의 5'-우리딘-우리딘-3'(5'-uu-3') 디뉴클레오티드를 포함한다.
다른 패턴의 변형은 본원에 개시된 바와 같은 3' 말단 캡을 포함하는 임의의 RNAi 작용제와 함께 사용될 수 있다.
특히 바람직한 변형 패턴은 다음을 포함하나 이들에 한정되지 않는다:
2'-OMe-U 2'-OMe-U로서의 모든 3' 오버행
A85: 위치 1, 2 및 14를 제외하고, 2'-OMe-U로서의 모든 U
S26: 2'-OMe-U로서의 모든 U 및 2'-OMe-C로서의 모든 C
A51: 위치 1, 2 및 14를 제외하고, 2'-OMe-U로서의 모든 U 및 2'-OMe-C로서의 모든 C
S26: 2'-OMe-U로서의 모든 U 및 2'-OMe-C로서의 모든 C
A48: 2'-OMe-U A로서의 UA 및 2'-OMe-C A로서의 모든 CA, 처음 5'-N는 DNA임
S26: 2'-OMe-U로서의 모든 U 및 2'-OMe-C로서의 모든 C
따라서, 본원에 개시된 3' 말단 캡은 임의의 RNAi 작용제와 함께 사용될 수 있으며, 여기서, RNAi 작용제의 적어도 가닥의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 대체 및/또는 변형되고, 뉴클레오티드(들)의 변형(들)은 소정의 변형의 패턴(들)으로 정렬될 수 있다.
다양한 패턴의 변형에서, 패턴은 2'-MOE 클램프[여기서, 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(5'에서 3'으로 계수)는 각각 2'-MOE 변형을 가짐]를 포함한다. 클램프의 다른 변이체가 가능하며, 여기서, 예를 들어, 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(5'에서 3'으로 계수)는 도 20c 내지 도 20e에 나타낸 바와 같이 각각 DNA, 2'-OMe, 2'-F 또는 LNA이다. 마지막 2개의 뉴클레오티드(5'에서 3'으로 계수)도 또한 각 가닥의 3' 말단에서 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드(3'에서 5'으로 계수)인 것으로 여겨질 수 있는 것이 주목된다. 본원 및 미국 특허 제8,084,600호에 나타낸 바와 같이, 클램프는 안티센스 및/또는 센스 가닥 상에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 RNAi 작용제의 임의의 구현예는 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있되, 단, 구현예들은 상호 배타적이지 않다(예를 들어, 단일의 RNAi 작용제는 동시에 정확히 0개 및 정확히 2개의 오버행을 가질 수 없다).
따라서, 본원에 개시된 3' 말단 캡은 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 RNAi 작용제와 함께 사용될 수 있으며, RNAi 작용제의 가닥은 임의의 길이의 것이고, RNAi 작용제는 0, 1 또는 2개의 오버행 또는 0, 1 또는 2개의 블런트 말단을 포함할 수 있으며, 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 대체되거나 변형될 수 있고, 변형(들)은 소정의 패턴(들) 또는 체계(들)의 변형으로 정렬될 수 있으며, 안티센스 및/또는 센스 가닥은 5' 말단 캡을 포함할 수 있고, 센스 가닥(존재한다면)의 5' 말단 캡은 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭 활성을 감소시킨다.
또한, 본원에 개시된 3' 말단 캡은 본원에 개시되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 추가의 RNAi 작용제 형식 또는 구조와 함께 사용될 수 있다.
추가의 RNAi 작용제
상기 열거된 구조에 더하여, RNA 간섭을 매개할 수 있는 추가의 유형의 분자도 고안된다. 이들 구조에서, 상기 가닥은 반드시 RNA인 것은 아니며, 상기 가닥은 표준보다 더 길거나 더 짧을 수 있고/거나 블런트-말단일 수 있고/거나 하나 이상의 변형, 미스매치, 갭 및/또는 뉴클레오티드 대체를 포함할 수 있다.
용어 "RNAi 작용제"는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 본원에 기재되거나 해당 분야에 알려져 있는 임의의 분자를 포함하려는 의도이며, 비제한적으로 siRNA(표준 구조이든지 다른 구조이든지) 또는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 임의의 다른 분자를 포함한다. 본원에 기재된 3' 말단 캡은 임의의 RNAi 작용제와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 3' 말단 캡은 임의의 RNAi 작용제(siRNA 포함)에서 또는 특히 제한 없이, 다음을 포함하는 임의의 다른 RNAi 작용제에서 사용될 수 있다:
빽빽한 헤어핀 턴을 만들고, siRNA와 같이 RISC를 통해 표적을 침묵화시키는 RNA의 서열을 포함하는 shRNA(작은 헤어핀 RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA). 따라서, 안티센스 및 센스 가닥은 헤어핀에 의해 연결된다. shRNA는 예를 들어, 플라스미드의 전달을 통해 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 발현될 수 있다. 다양한 shRNA의 종류가 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Xiang et al. 2006. Nature Biotech. 24: 697-702]; 문헌[Macrae et al. 2006 Science 311: 195-8]. 문헌[Lombardo et al. 2007. Nature Biotech. 25: 1298-1306]; 문헌[Wang et al. 2011. Pharm. Res. 28: 2983-2995]; 문헌[Senzer et al. 2011. Mol. Ther. 20: 679-686]을 참조한다.
또한, siRNA와 같이 RISC를 통해 표적을 침묵화시키는 작은 RNA 분자(약 22개 뉴클레오티드)인 miRNA(마이크로RNA). 천연-발생 miRNA는 진핵생물의 핵 DNA에 의해 인코딩되며; miRNA는 전사후 RNA 처리에 의해 생성되고, mRNA 분자 내의 상보적 서열과의 염기-쌍형성을 통해 기능하여, 통상 번역 억제 또는 표적 분해 및 유전자 침묵화를 야기한다. 인간 게놈은 포유류 유전자의 약 60%를 표적으로 할 수 있으며, 많은 인간 세포 유형에서 풍부한 1000개 초과의 miRNA를 인코딩할 수 있다. miRNA의 천연 발생 및 인공 유도체의 다양한 종류는 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Lewis et al. 2003. Cell 115: 787-798]; 문헌[Lim et al. 2003. Genes Dev. 17: 991-1008]; 문헌[He et al. 2004. Nat. Rev. Genet. 5: 522-31]; 문헌[Bentwich et al. 2005. Nat. Genet. 37: 766-70]; 문헌[Lewis et al. 2005. Cell 120: 15-20]; 문헌[Kusenda et al. 2006. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 150: 205-15]; 문헌[Zhang et al. 2006. J. Gen. Gen. 36: 1-6]; 문헌[Brodersen et al. 2008. Science 320: 1185-90]; 문헌[Friedman et al. 2009. Genome Res. 19 (1): 92-105]; 문헌[Bartel 2009. Cell 136 (2): 215-33]을 참조한다.
센스 가닥이 적어도 하나의 단일-가닥 닉을 포함하는 sisiRNA(작은 내부 분절화 간섭 RNA). 이러한 닉은 RISC 복합체로의 센스 가닥의 혼입을 감소시키고, 이에 따라, 표적-외 효과를 감소시킨다. WO 2007/107162호를 참조한다.
각 가닥의 씨드 부분이 DNA인 한편, 각 가닥의 나머지가 RNA인 DNA-RNA 키메라. 문헌[Yamato et al. 2011. Cancer Gene Ther. 18: 587-597]을 참조한다.
분자가 3개의 짧은 이중-가닥 영역을 포함하는 2개의 미스매치를 포함하는 siRNA. 이러한 RNAi 작용제의 일 구현예에서, 가이드(안티센스) 가닥은 22-mer인 한편, 센스 가닥은 20-mer이며(안티-센스 가닥의 3' 말단 상에 단일의 2-뉴클레오티드 오버행만을 생성함); 2개의 미스매치는 6, 8 및 4 bp의 이중-가닥 영역을 생성한다. 미국 특허 출원 2009/0209626호를 참조한다.
센스 가닥이 19-nt 길이보다 더 짧아서, 안티-센스 가닥이 우선적으로 RISC로 로딩되며, 이에 따라 표적-외 효과가 감소되는 aiRNA(비대칭 간섭 RNA). 이러한 RNAi 작용제의 다양한 구현예에서, 안티-센스 가닥은 21-nt 길이이나, 센스 가닥은 오직 15 또는 16개 뉴클레오티드 길이이다. 문헌[Sun et al. 2008 Nature Biotech. 26: 1379-1382]; 및 문헌[Chu and Rana. 2008 RNA 14: 1714-1719]을 참조한다.
따라서, 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡은 siRNA(표준 구조의 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않음), shRNA, miRNA, sisiRNA, DNA-RNA 키메라, 2개의 미스매치(또는 그 이상의 미스매치)를 포함하는 siRNA 또는 aiRNA를 포함하는 상기 기재되거나 다르게 해당 분야에 알려져 있는 다양한 형식의 RNAi 작용제 중 임의의 것과 함께 사용될 수 있다.
3' 말단 캡
본 발명의 RNAi 작용제는 3' 말단 캡을 포함한다. 용어 "3' 말단 캡", "3' 말단 캡 변형", "말단 캡", "캡", "3' 말단 변형" 등은 이중-가닥 뉴클레오티드 듀플렉스의 말단에 부착된 화학 모이어티를 포함하나, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드인 화학 모이어티를 배제하는 것으로 본원에 사용된다. "3' 말단 캡"은 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착되고(예를 들어, 적어도 가닥의 3' 말단에서 3' 뉴클레오티드의 3' 탄소에서의 변형임), 분자를 분해로부터, 예를 들어, 뉴클레아제, 예를 들어, 혈청 또는 장액 중 뉴클레아제로부터 보호한다. "3' 말단 캡"은 "PAZ 리간드"를 포함하나 이에 한정되지 않으며, PAZ 리간드라는 용어는 효소 다이서의 PAZ 도메인과 상호작용하는 3' 말단 캡을 포함한다. 3' 말단 캡은 때때로 "비-뉴클레오티드 오버행 모방체" 또는 "디뉴클레오티드 오버행의 LMW 모방체" 등으로 지칭된다.
본 발명은 일부 문헌이 본원에 기재된 3' 말단 캡(예를 들어, X109 또는 X110 또는 X111 등)을 "오버행" 또는 "3' 오버행"으로 지칭하나; 본 문서에서는 3' 말단 캡을 "오버행"과 구별하며, 뉴클레오티드 오버행(예를 들어, 오직 뉴클레오티드, 예를 들어, A, C, G, U 또는 T, 예를 들어, UU 또는 TT만을 포함하는 것)을 지칭하기 위해서만 용어 "오버행"을 사용하는 것을 언급한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같이 "3' 말단 캡"은 오버행이 아니다.
본원에 정의된 바와 같이, 3' 말단 캡은 오버행(즉, 뉴클레오티드 오버행) 대신에 또는 그에 더하여 사용될 수 있다. 표준 siRNA 구조를 사용한 이전의 연구는, 2-nt 오버행이 RNA 간섭 활성에 유용한 반면, 블런트-말단 dsRNA(오버행 결여)가 일반적으로 유효하지 않았음을 제시하였다. 예를 들어, 문헌[Elbashir et al. 2001 EMBO J. 23: 6877-6888], 특히 도 1F를 참조한다. 그러나 심지어 오버행이 있는 dsRNA도 효소 분해를 겪었다. 상기 출원인에 의해 다른 곳에 언급된 바와 같이, "비변형 siRNA는 주로 뉴클레아제에 의한 효소 분해를 겪는다."(WO 2007/128477호, 페이지 1). 따라서, (1) 분자가 RNA 간섭 활성을 매개하게 하는 기능 및 (2) 분자를 분해로부터 보호하는 기능을 포함하는 몇몇의 기능을 수행하기 위하여 3' 말단 캡을 설계하였다.
본원에 개시된 3' 말단 캡이 3' 오버행에 더하여, 그리고 그 대신에 사용될 수 있는 것이 주목된다.
3' 말단 캡이 오버행, 예를 들어, UU 또는 TT 대신에 사용될 수 있기 때문에, 본원에 기재된 3' 말단 캡은 때때로 "3'-디뉴클레오티드 대용물"로 지칭된다.
siRNA와 함께 이용하기 위한 소수의 3' 말단 캡이 개시되어 있다. 화학적으로 설명된 3' 말단 캡 중에, 이들 중 다수가 작용성인 것으로 나타나지 않았음이 주목된다. 작용성 3' 말단 캡은 이들 기능을 수행할 수 있다: (1) 이중-가닥 RNA가 RNA 간섭에서 작용하도록 하는 기능; 및 (2) 예를 들어, 분자를 뉴클레아제, 예를 들어, 혈청 또는 장액 중에 관찰되는 뉴클레아제로부터 보호함으로써 분자의 안정성을 증가시키는 기능.
비-작용성 3' 말단 캡
문헌에 기재된 많은 3' 말단 캡은 이들 기능 둘 모두를 수행할 수 없다. 일부 경우에, 말단 캡의 배치가 중요하며; 일부 말단 캡은 오직 가닥 상에 배치되는 경우 작용성일 수 있으나, 둘 모두의 가닥 및/또는 둘 모두의 가닥의 5' 및 3' 말단 둘 모두 상에 배치된다면 작용성이 아닐 수 있다.
실험 없이 어떤 3' 말단 캡이 둘 모두의 기능을 수행할 것인지 예측하는 것은 불가능하다. 사실상, 많은 말단캡은 RNA 간섭에 적합한 것으로 예측되었으나(예를 들어, US 2003/0143732호에서), 이후에 다수가 둘 모두의 기능을 수행하지 않는 것으로 발견되었다.
다른 과학자들은 예측에도 불구하고, 일부 말단캡 또는 오버행이 (1) siRNA를 안정화시켰으나 (2) RNAi 활성을 가능하게 하지 않았음을 실험적으로 관찰하였다. 예를 들어, 모든 위치에서 2'-OMe 변형과 조합된 TT(디티미딘)이 있다(문헌[Czauderna et al. 2003 Nucl. Acids Res. 31:2705-2716, Figure 4B]). Hadwiger 등은 또한, 완전한 2'-O-메틸화는 siRNA가 혈청 뉴클레아제-저항성이 되게 하지만, 유전자 침묵화 활성이 거의 완전히 폐지되었음을 언급한다. 문헌[Hadwiger et al. 2005, pages 194-206, in RNA Interference Technology, ed. K. Appasani, Cambridge University Press, Cambridge, UK].
다른 말단캡 또는 오버행은 (1) siRNA를 안정화시키지 않았지만, (2) RNAi 활성을 가능하게 하였다. 예를 들어, siRNA의 둘 모두의 3' 말단 또는 둘 모두의 5' 말단에서의 TT. 문헌[Czauderna et al. 2003, Figure 4B].
또 다른 말단캡은 (1) siRNA를 안정화시키지 않았고, (2) RNAi 활성을 가능하게 하지 않았으며, 그러한 예는 아미노-C6 링커 또는 역전된 무염기 뉴클레오티드를 포함한다. 문헌[Czauderna et al. 2003, Figure 4B].
적어도 일부 조건하에서 비작용성인 3' 말단 캡의 추가의 예는 다음을 포함한다:
둘 모두의 5' 및 둘 모두의 3' 말단 상에 존재하는 경우 siRNA를 안정화시키거나 siRNA 활성을 가능하게 하지 않는 역전된 (데옥시) 무염기물질(abasics). 문헌[Czauderna et al. 2003 Nucl. Acids Res. 31:2705-2716, Figure 4B] 참조.
siRNA를 안정화시키는 것 및 RNAi 활성을 가능하게 하는 것 둘 모두를 행하지 않는 변형된 염기 뉴클레오티드, 예를 들어, 5-프로피닐-U. 문헌[Deleavey et al. 2009 Curr. Prot. Nucl. Acid Chem. 16.3.1 - 16.3.22]; 문헌[Terrazas et al. 2009 Nucleic Acids Res. 37: 346-353].
siRNA를 안정화시킬 수 없는 아미노헥실 포스페이트를 포함하는 적어도 일부의 아미노-치환된 저급 알킬. 둘 모두의 5' 말단 및 둘 모두의 3' 말단 상에 존재하는 경우, 그것은 RNAi 활성을 방지하였다. 문헌[Czauderna et al. 2003, Figure 4B]을 참조한다.
안티센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되는 경우, RNA 간섭 활성을 억제하는 것으로 밝혀진 플루오레세인(예를 들어, 형광 발색단). 센스 가닥은 예를 들어, 3'-말단에서 플루오레세인의 컨쥬게이션을 용인할 수 있지만, 안티센스 가닥은 그럴 수 없다. 문헌[Harboth et al. 2003 Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 13: 83-105]. 문헌[Harboth et al. 2003 Antisense Nucl. Acid Drug Dev 13: 83-105]을 참조한다.
비-작용성인 시아닌(예를 들어, Cy5). 문헌[Song et al. 2003 Nature Med. 9: 347-351] 참조. 페이지 347, 두번째 칼럼 참조.
미국 특허 제5,998,203호(단락 [017])에 의해 제안되었으나 이후에 siRNA의 3' 말단을 안정화시키는 것 및 RNAi 활성을 가능하게 하는 것 둘 모두를 행하지 않는 것으로 밝혀진 3' 말단 캡으로서의 3' 포스페이트(문헌[Schwarz et al. 2002 Mol. Cell 10: 537-548]; 및 문헌[Lipardi et al. 2001 Cell 107: 299-307]).
RNA 간섭 활성을 감소시키는 3'-아미노프로필포스포에스테르. 문헌[Schwarz et al. 2002 Mol. Cell 10: 537-548, Fig. 2] 참조.
따라서, 3' 말단 캡으로 시험된 모든 모이어티가 RNA 간섭을 가능하게 하는 것 및 분자를 분해로부터 보호하는 것 둘 모두를 가능하게 하는 것은 아니다.
작용성 3' 말단 캡
상기 기재된 비-작용성 3' 말단 캡 및 오버행과 대조적으로, 작용성 3' 말단 캡이 예를 들어, 미국 특허 제8,097,716호; 제8,084,600호; 제8,344,128호; 제8,404,831호; 및 제8,404,832호에 기재되어 있다. 이들은 C3, C6, C12, 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실(또는 Cyclohex), 페닐, 비페닐, 아다만탄 및 리토콜산(또는 리토콜)으로 명명된, 포스페이트를 포함하는 작용성 3' 말단 캡을 개시한다.
이들 작용성 3' 말단 캡은 하기 도시되어 있으며, 여기서, 그들은 포스페이트에 결합되어 나타나 있다:
Figure pct00075
Figure pct00076
본 발명에 사용되는 용어가 미국 특허 제8,097,716호; 8,084,600호; 8,344,128호; 8,404,831호; 및 8,404,832호에 사용되는 것과 약간 상이한 것이 주목된다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제에 관한 것이며, 여기서, 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단은 포스페이트(또는 변형된 뉴클레오시드간 링커)로 종결되고 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. 바로 위의 도해에서, 포스페이트 및 3' 말단 캡이 나타나 있다.
미국 특허 제8,097,716호; 8,084,600호; 8,344,128호; 8,404,831호; 및 8,404,832호에 개시된 3' 말단 캡은 그들 전에 고안된 것들보다 뛰어났다. 예를 들어, 다른 가능한 말단캡과 달리, 이들은 (예를 들어, 혈액 또는 장액 중 뉴클레아제로부터의) 분해로부터 siRNA를 보호하는 것 및 또한, RNA 간섭을 가능하게 하는 것 둘 모두를 가능하게 하였다.
그러나, 본 발명의 신규한 3' 말단 캡(예를 들어, 표 1 및 표 2에 열거된 것들)의 다수는 훨씬 더 개선된다. 예를 들어, X058이 있는 siRNA(본원에 개시된 바와 같음)는 C6이 있는 siRNA보다 더 긴 활성 기간을 보여준다(도 22). X058이 있는 HuR siRNA는 Huh-7 세포에서 제7일 및 제10일에 더 큰 효능을 보였다.
본원에 개시된 다양한 신규 3' 말단 캡은 PAZ 리간드로 표기된 것들이 다이서의 PAZ 도메인과 상호작용하기 때문에, PAZ 리간드로 표기된 것들을 포함한다.
PAZ 리간드
상기 언급된 바와 같이, 긴 dsRNA 분자가 세포 내로 도입되는 경우, 다이서는 dsRNA를 자르고, siRNA로 지칭되는 더 짧은 세그먼트가 된다. 다이서의 상동체는 dsRNA-매개의 유전자 침묵화가 관찰되는 모든 유기체에 통상적이다. 문헌[Myers et al. 2005. In RNA Interference Technology, ed. Appasani, Cambridge University Press, Cambridge UK, p. 29-54]; 문헌[Bernstein et al. 2001 Nature 409: 363-366]; 및 문헌[Schauer et al. 2002 Trends Plant Sci. 7: 487-491]. 다이서는 RNase III 효소이며, 6개의 인식 가능한 도메인으로 이루어진다. N-말단에 또는 그 근처에 대략 550개 아미노산 DExH-box RNA 헬리카제 도메인이 존재하며, 바로 그 다음에 DUF283으로 지칭되는 보존된 대략 100개 아미노산 도메인이 존재한다. DUF283 도메인에 대한 인접 C-말단은 PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille에 대한) 도메인이다. 도메인은 단일 가닥 디뉴클레오티드 오버행을 인식한다. 문헌[Lingel et al. 2003 Nature 426: 465-469]; 문헌[Song et al. 2003 Nature Struct. Biol. 10: 1026-1032]; 문헌[Yan et al. 2003 Nature 426: 468-474]; 문헌[Lingel et al. 2004 Nature Struct. Mol. Biol. 11: 576-577]; 문헌[Ma et al. 2004 Nature 429: 318-322]. 아마도, 다이서 내의 PAZ 도메인은 또한 RNA에 결합하여, 절단을 위해 촉매 도메인을 배치시킬 수 있다. 문헌[Zhang et al. 2004 Cell 118: 57-68]. 다이서 단백질의 C-말단은 2개의 RNAse III 촉매 도메인 및 추정의 dsRNA-결합 도메인으로 이루어진다.
표 2에는 많은 PAZ 리간드를 포함하는 다양한 3' 말단 캡이 열거된다.
3' 말단 캡의 배열 및 비-동일 성질
안티-센스 및 센스 가닥은 생화학적으로 구별된다. 상기 언급된 바와 같이, 안티센스 가닥은 이러한 가닥이 요망되는 표적을 표적으로 함에 따라 바람직하게는 RISC 내로 로딩된다. 센스 가닥의 혼입은 표적-외 효과를 야기할 수 있다.
일부 3' 말단 캡이 다른 가닥에서보다 어느 한 가닥에서 더욱 유용할 수 있는 것이 알려져 있다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이, 센스 가닥은 예를 들어, 3'-말단에서 플루오레세인의 컨쥬게이션을 허용할 수 있으나, 안티센스 가닥은 그럴 수 없다. 문헌[Harboth et al. 2003 Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 13: 83-105].
본원에 기재된 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제
구체적인 특정 일 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서, 제1 또는 제2 가닥은 표 2에 열거된 3' 말단 캡으로부터 선택되는 3' 말단 캡을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 제1 및 제2 가닥은 표 2에 열거된 3' 말단 캡으로부터 선택되는 3' 말단 캡을 포함한다. 따라서, 약술하면: 일 구현예에서, 조성물은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하며, 제1 및/또는 제2 가닥은 표 2에 열거된 3' 말단 캡으로부터 선택되는 3' 말단 캡을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 가닥은 각각 안티-센스 및 센스 가닥이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 가닥은 각각 센스 및 안티-센스 가닥이다.
RNAi 작용제는 siRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 이중-가닥 분자이다.
이러한 구현예의 다양한 구체적 구현예가 하기 기재된다.
일 구현예에서, 조성물은 제2 RNAi 작용제를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 제2 RNAi 작용제는 제1 RNAi 작용제와 물리적으로 분리되어 있거나; 또는 2개의 RNAi 작용제는 물리적으로 연결되어 있거나(예를 들어, 공유적으로 결합되거나 다르게는 컨쥬게이트됨) 동일한 약제학적 조성물에서 조합되거나, 둘 모두 동일한 치료 계획에서의 요소이다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
일 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 형성한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 약 18 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이를 포함하고, 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드 길이 및 약 19 내지 약 23개 뉴클레오티드 길이를 추가로 포함하여, 약 15 내지 약 36개 뉴클레오티드 길이이다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥은 적어도 약 15개 뉴클레오티드, 약 16개 뉴클레오티드, 약 17개 뉴클레오티드, 약 18개 뉴클레오티드, 약 19개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 21개 뉴클레오티드, 약 22개 뉴클레오티드, 약 23개 뉴클레오티드, 약 24개 뉴클레오티드, 약 25개 뉴클레오티드, 약 26개 뉴클레오티드, 약 27개 뉴클레오티드, 약 28개 뉴클레오티드, 약 29개 뉴클레오티드 및 약 30개 뉴클레오티드로부터 선택되는 길이를 갖는다.
일 구현예에서, 3' 말단 캡은 RNAi 작용제가 생물학적 샘플 또는 환경, 예를 들어 세포질, 간질액, 혈청, 폐 또는 장 세척액에서 증가된 안정성을 갖게 한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 추가로 적어도 하나의 당 백본 변형(예를 들어, 포스포로티오에이트 링커) 및/또는 적어도 하나의 2'-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일 구현예에서, 모든 피리미딘은 2' O-메틸-변형된 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 적어도 하나의 5'-우리딘-아데닌-3'(5'-ua-3') 디뉴클레오티드(여기서, 우리딘은 2'-변형된 뉴클레오티드임); 및/또는 적어도 하나의 5'-우리딘-구아닌-3'(5'-ug-3') 디뉴클레오티드(여기서, 5'-우리딘은 2'-변형된 뉴클레오티드임); 및/또는 적어도 하나의 5'-시티딘-아데닌-3'(5'-ca-3') 디뉴클레오티드(여기서, 5'-시티딘은 2'-변형된 뉴클레오티드임); 및/또는 적어도 하나의 5'-우리딘-우리딘-3'(5'-uu-3') 디뉴클레오티드(여기서, 5'-우리딘은 2'-변형된 뉴클레오티드임)를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 및 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2'-변형을 포함한다. 일 구현예에서, 모든 피리미딘은 2' O-메틸-변형된 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 블런트 말단을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 1 내지 4개의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 갖는 오버행을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 3'-말단에 오버행을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 하나 이상의 진단 화합물, 리포터 기, 가교제, 뉴클레아제-저항성 부여 모이어티, 천연 또는 비통상적 핵염기, 친지성 분자, 콜레스테롤, 지질, 렉틴, 스테로이드, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌, 테르펜, 트리테르펜, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리델라놀-유도체화 리토콜산, 비타민, 탄수화물, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 합성 탄수화물, 올리고 락테이트 15-mer, 천연 중합체, 저- 또는 중-분자량 중합체, 이눌린, 사이클로덱스트린, 히알루론산, 단백질, 단백질-결합제, 인테그린-표적화 분자, 다가양이온, 펩티드, 폴리아민, 펩티드 모방체 및/또는 트랜스페린에 라이게이션된다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 시험관내 세포에서 10 nM의 농도에서 표적 유전자의 발현을 적어도 약 60% 억제할 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 시험관내 세포에서 10 nM의 농도에서 표적 유전자의 발현을 적어도 약 70% 억제할 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 시험관내 세포에서 10 nM의 농도에서, 표적 유전자의 발현을 적어도 약 80% 억제할 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 시험관내 세포에서 10 nM의 농도에서, 표적 유전자의 발현을 적어도 약 90% 억제할 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 시험관내 세포에서 약 0.1 nM 이하의 EC50을 갖는다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 시험관내 세포에서 약 0.01 nM 이하의 EC50을 갖는다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 시험관내 세포에서 약 0.001 nM 이하의 EC50을 갖는다.
표적 유전자에 대한 RNAi 작용제의 약제학적 조성물
구체적인 특정 일 구현예에서, 본 발명은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 제1 및/또는 제2 가닥은 표 2에 열거된 3' 말단 캡으로부터 선택되는 3' 말단 캡을 포함하며, 조성물은 약제학적으로 유효한 제형 내에 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 유전자-관련 질병의 치료용 약제의 제조에서의 RNAi 작용제의 용도에 관한 것이며, RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 본원에 제공되고, 예를 들어, 표 2에 열거된 특정 듀플렉스로부터 선택되는 표적 유전자에 대한 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 만큼 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전달 비히클, 및 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제를 포함한다.
해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 다른 변형은 본 발명 내에 포함되는 것으로 여겨진다. 예시적인 변형은 센스 및 안티센스 가닥 내의 염기쌍 사이의 갭 또는 미스매치의 존재, 센스 가닥 내의 뉴클레오시드간 연결에서의 닉 또는 파단부(break)의 존재 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
약제학적 조성물
경구 사용을 위해 의도되는 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 대한 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있고, 그러한 조성물은 약제학적으로 편안하고 맛좋은 제제를 제공하기 위해 하나 이상의 그러한 감미제, 풍미제, 착색제 또는 보존제를 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적절한 비-독성의 약제학적으로 허용되는 부형제와의 혼합물로 활성 성분을 함유한다. 이들 부형제는, 예를 들어 비활성 희석제; 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나, 또는 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 경구 사용을 위한 제형은 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐로 또한 제시될 수 있다. 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적절한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다.
본 발명의 조성물의 경구 투여는, 가장 중요하게는 투여형의 환자-조절 연하에 의해, 뿐만 아니라 그러한 전달의 다른 기계적 및 보조 수단에 의해, 위 또는 장에 직접적으로 물질을 투여하기 위한 모든 표준 기술을 포함한다.
체중 1 ㎏ 당 약 0.1 ㎎/일 내지 약 140 ㎎/일의 투여량 수준이 상기에서 지시된 질환의 치료에 유용하다(약 0.5 ㎎ 내지 약 7 g/대상체/일). 단일 투여형이 생성되도록 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 변한다. 단위 투여형은 일반적으로 약 1 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 임의의 특정 대상체에 대한 구체적인 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 속도, 약물 병용 및 치료법이 진행 중인 특정 질병의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 좌우되는 것으로 이해된다.
본 발명의 치료제의 치료 효과는 다른 작용제와의 병용에 의해 증진될 수 있다. 전형적으로, 그러한 기타 작용제에는 유사 질병, 예컨대 혈관형성 장애를 치료하는 데에서의 사용에 대해 공지된 작용제가 포함될 것이다.
본 발명의 RNAi 작용제 및 그의 제형은 통상적인 약제학적으로 허용되는 비독성 담체, 애쥬번트(adjuvant) 및/또는 비히클을 함유하는 단위 투여 제형으로 경구적으로, 국소적으로, 비경구적으로, 흡입 또는 스프레이에 의해, 또는 직장으로 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 비경구는 경피, 피하, 혈관내(예를 들어, 정맥내), 근육내, 복강내 또는 척추강내 주사 또는 주입 기술 등을 포함한다. 2가지 이상의 상이한 RNAi 작용제가 투여되는 경우 각각은 개별적으로 투여되거나 동시-투여될 수 있다. 각각이 개별적으로 투여되는 경우, 투여 방법 및/또는 부위는 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, 둘 모두의 RNAi 작용제가 정맥내 또는 피하 투여될 수 있거나, 제1 RNAi 작용제가 정맥내로 투여될 수 있으며, 제2 Rai 작용제가 피하 투여될 수 있는 등이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 RNAi 작용제를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물을 포함하며, 하나의 또는 둘 모두의 가닥은 3' 말단 캡을 포함하고, 조성물은 헬퍼 지질(helper lipid), 중성 지질 및/또는 스텔스 지질(stealth lipid)을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 조성물은 헬퍼 지질을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 조성물은 중성 지질을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 조성물은 스텔스 지질을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 헬퍼 지질, 중성 지질 및 스텔스 지질은 공개된 특허 출원 US 2011-0200582호에 개시된 것들로부터 선택된다. 다양한 RNAi 작용제의 전달을 위해 사용될 수 있는 추가의 조성물은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 출원 제61/774759호; 12/19/13에 출원된 61/918,175호; 61/918,927호; 61/918,182호; 61/918941호; 62/025224호; 62/046487호; 및 국제 출원 PCT/US04/042911호; PCT/EP2010/070412호; PCT/IB2014/059503호에 제공되어 있다.
다양한 구현예에서, 상기 조성물은 추가의 생물학적 활성제를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 생물학적 활성제는 siRNA이다.
다양한 구현예에서, 조성물은 지질 나노입자의 형태로 존재한다.
본원에 기재된 RNAi 작용제를 사용한 치료 방법
구체적인 특정 일 구현예에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서의 표적 유전자-관련 질병의 치료 방법에 관한 것이며, 여기서, 제1 및/또는 제2 가닥은 표 2에 열거된 3' 말단 캡으로부터 선택되는 3' 말단 캡을 포함한다. 구체적인 특정 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 RNAi 작용제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서의 표적 유전자의 발현의 억제 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 일 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 유효한 제형을 추가로 포함한다.
이들 구현예의 다양한 구체적인 특정 구현예는 하기 기재된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 추가의 치료의 시행을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 추가의 치료는 치료적 유효량의 조성물이다.
일 구현예에서, 추가의 치료는 방법(또는 절차)이다.
일 구현예에서, 추가의 치료 및 RNAi 작용제는 임의의 순서로 시행되거나, 동시에 시행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 질병에 대한 추가의 치료를 시행하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 표적 유전자-관련 질병에 대한 추가의 길항제의 목록으로부터 선택되는 추가의 치료 또는 치료법을 시행하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 표적 유전자에 대한 제2 RNAi 작용제를 포함한다. 다양한 구현예에서, 제2 RNAi 작용제는 제1 RNAi 작용제와 물리적으로 분리되어 있거나, 2개는 물리적으로 연결되어 있다(예를 들어, 공유 결합되거나 다르게 컨쥬게이트되어 있다).
다른 구현예
본 발명의 다양한 구체적인 특정 구현예가 하기 기재된다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체에서의 표적 유전자-관련 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 구현예 중 임의의 것에 따른 조성물에 관한 것이며, 상기 방법은 청구항 중 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예는 표적 유전자-관련 질병의 치료용 약제의 제조에서의 이들 구현예 중 임의의 것에 따른 조성물의 용도이다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 유전자-관련 질병의 치료에 사용하기 위한 상기 구현예 중 임의의 것의 조성물에 관한 것이다.
추가의 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 분야에 친숙한 전문가가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 상세하게 구체적으로 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은, 당업자에게 명백할 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되어 왔다. 참조는, 예를 들어 표준 핸드북 및 본원에 언급된 일반적인 배경 기술에 대해, 및 그에 인용된 추가의 참고문헌에 대해 다시 이루어진다.
본 발명에 대한 청구범위는 비제한적이며, 하기 제공된다.
특정한 구현예 및 청구범위가 본원에 상세히 개시되어 있을지라도, 이는 단지 예시의 목적으로 예로서 행해진 것이며, 첨부된 청구범위의 범위, 또는 임의의 상응하는 추후 출원의 청구범위의 대상의 범위와 관련하여 제한하려는 의도가 아니다. 특히, 본 발명자들은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않으면서, 본 발명에 다양한 치환, 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 고려한다. 핵산 출발 물질, 관심 클론, 또는 라이브러리 유형의 선택은 본원에 기재된 구현예의 지식을 가진 해당 분야의 숙련자에게는 일상적인 문제인 것으로 여겨진다. 다른 양태, 이점 및 변형이 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 다양한 국가의 특허법에 의한 제한으로 인해 이후 출원되는 상응하는 출원의 청구범위가 고쳐질 수 있으며, 이것을 청구범위의 대상을 포기하는 것으로 해석해서는 안 된다.
기재된 3' 말단 캡의 다양한 추가의 제형 및 명백한 변이체가 해당 분야의 숙련자에 의해 고안될 수 있다. 하나의 또는 둘 모두의 가닥이 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 비제한적 예가 하기 실시예에 기재되며, 이는 청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1. 3' 말단 캡이 있는 siRNA의 혈청 안정성
다양한 상이한 3' 말단 캡(3'-말단 오버행)의 효능을 시험하였다.
동일한 서열(mF7-III 표적 유전자, 19-mer 블런트-말단, A12S17 변형 체계)을 갖는 10개의 siRNA를 제조하였다.
10개의 상이한 비-뉴클레오티드 3'-말단 캡을 사용하였다.
이들을 4가지 시점에서 마우스 및 인간 혈청에서 시험하였다.
A6S11 형식의 모체 mF7-III 및 wt(야생형) luc(루시퍼라제) siRNA를 대조군으로 사용하였다.
사용된 분자는 도 1에 도시되어 있다.
하기의 표 5는 이들 분자에 대한 서열을 제공한다.
[표 5]
Figure pct00077
센스 서열은 상측에서 하측으로 SEQ ID NO: 92 내지 114에 의해 나타나 있으며; 가이드(안티-센스) 서열은 상측에서 하측으로 SEQ ID NO: 115 내지 137에 의해 나타나 있다. 이러한 실시예에 사용되는 3' 말단 캡은 RNAi 작용제 가닥의 상황에서 하기에 도시되어 있다:
Figure pct00078
재료 및 방법:
RNA 시료를 100% 마우스 혈청 및 인간 혈청에서 37℃에서 인큐베이션시키고, 0, 5분, 6시간 및 24시간 시점에 빼내고, 동결-건조시켰다. 올리고를 프리캐스트(precast) 하이드로겔(엘크롬 사이언티픽(Elchrom Scientific))에 의해 분리하고, SYBR 골드(gold)(바이오라드(Biorad), 케미독(Chemidoc) XRS)로 가시화시켰다.
도 2는 RNAi 작용제가 RNA 간섭을 매개하도록 함에서의 실시예 1에 기재된 다양한 3' 말단 캡의 효능을 보여준다. 3' 말단 캡 - C3, C6, C12, 트리에틸렌 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, 비페닐, 아다만탄 및 리토콜산 모두는 RNAi 작용제가 RNA 간섭을 수행하게 한다.
도 3은 혈청에서의 뉴클레아제 분해의 감소 및/또는 방지에서의 실시예 1에 기재된 다양한 3' 말단 캡의 효능을 보여준다.
마우스 혈청에서, 모든 3'-캡핑된 A12S17 siRNA는 최대 24시간 동안 높은 저항성을 나타낸다.
인간 혈청에서, C3, C12 및 리토콜은 다른 유도체에 비하여 덜 안정적인 것으로 보인다. 그러나, 둘 모두의 실험에서, C3, 비페닐 및 리토콜은 다른 유도체에 비하여 유의미하게 더 약한 밴드를 나타낸다. 그러나 이것이 더 낮은 합성/dsRNA 품질(겔-기반의 QC에 의해 나타낸 바와 같음)에 기인한 것인지, 또는 기술적 겔-기반의 인위 결과(리토콜산은 인간 혈청에 점착되어, 이에 따라 SYBR 골드 인터칼레이션(intercalation)으로부터 보호될 수 있음)에 기인한 것인지를 명확히 하는 것이 필요하다.
단일-가닥 안티센스 A12는 인간 혈청에서 신속하게 분해되는 한편, (더 많은 화학적 변형이 있는) 모체 센스 S17 가닥은 약간 더 길게, 그렇지만 dsRNA만큼 길지 않게 저항한다. 효소 안정성은 dsRNA 열 안정성과 관련이 있다.
따라서, 이러한 실시예는 이들 다양한 3' 말단 캡이 있는 siRNA가 FVII(인자 VII)에 대하여 RNA 간섭을 매개할 수 있었음을 보여준다. C3, C6, C12, 글리콜, 사이클로헥실, 페닐, 비페닐, 리토콜, C7 아미노 및 C3 아미노로 표기된 3' 말단 캡 변형은 1분, 30분, 6시간 및 24시간에, 루시퍼라제 및 dTsdT 대조군에 비하여 마우스 혈청에서 증가된 안정성을 보였다. 또한, C3, C6, 글리콜, 사이클로헥실, 페닐 및 비페닐, C7 아미노 및 C3 아미노로 표기된 3'-말단 변형은 대조군에 비하여 인간 혈청에서 증가된 안정성을 보였다.
실시예 2. 다양한 3' 말단 캡 석시네이트 에스테르 및 알코올의 합성이 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00079
Figure pct00080
실시예 2. 다양한 3' 말단 캡 석시네이트 에스테르 및 알코올의 합성이 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00081
Figure pct00082
2.A . X027 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00083
반응식 1: 석시네이트 9의 합성의 개요.
Figure pct00084
DMF(200 ㎖) 중 화합물 1(10.0 g, 70.0 mmol)의 용액에, DMT-Cl 2(28.4 g, 84.0 mmol) 및 2,6-루티딘(15.0 g, 140 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고, EtOAc로 추출하였다(3 × 500 ㎖). 유기 추출물을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시켜, 미정제 생성물을 제공하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트/ NEt3)에 의해 정제하여, 요망되는 생성물을 백색 고체(16 g, 36%)로 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): 3.73 (s, 6H), 4.17 (s, 2H), 6.91 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.35-7.22 (m, 7H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.83-7.80 (m, 1H), 8.33 (d, J = 1.6 Hz, 1H).
Figure pct00085
디옥산(160 ㎖)/H2O(40 ㎖) 중 화합물 2(8.0 g, 18 mmol)의 용액에, 3-하이드록시페닐보론산 4(3.5 g, 25 mmol), Pd(PPh3)4(1.1 g, 1.0 mmol) 및 Na2CO3(4.0 g, 38 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 기체로 버블링시키고, 90℃에서 하룻밤 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 추출하였다(3 × 800 ㎖). 유기 추출물을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트/NEt3)에 의해 정제하여, 4를 불순한 연황색 오일(6 g)로 제공하였다.
Figure pct00086
아세톤(600 ㎖) 중 화합물 4(10 g 미정제, 20 mmol)의 용액에, 화합물 5(4.0 g, 17.6 mmol), K2CO3(4.0 g, 28 mmol) 및 KI(316 ㎎, 1.9 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 환류 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 후에, 용매를 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 물로 희석하고, EtOAc로 추출하였다(3 × 800 ㎖). 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시켜, 미정제 생성물을 제공하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트/NEt3)에 의해 정제하여, 6을 연황색 오일(9 g, 69%)로 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): 3.74 (s, 6H), 3.84 (s, 3H), 4.19 (s, 2H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.11-7.08 (m, 1H), 7.27-7.23 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.46-7.31 (m, 9H), 7.59-7.55 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79-7.75 (m, 2H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.97-7.92 (m, 2H), 8.10 (s, 1H), 8.61 (d, J = 1.6 Hz, 1H).
Figure pct00087
수소화리튬알루미늄(THF 중 1.0 M 현탁액 30.7 ㎖, 30.7 mmol)을 0℃에서 THF(150 ㎖) 중 화합물 6(8.0 g, 12 mmol)의 용액에 첨가하였다. 0℃에서 2시간 후에, 반응 혼합물을 물(200 ㎖)로 켄칭시킨 다음, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고(3 × 200 ㎖), 합한 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켜, 요망되는 생성물 7을 백색 고체(6.1 g, 80%)로 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): 3.74 (s, 6H), 4.19 (s, 2H), 5.54 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.27-5.24 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.10-7.07 (m, 1H), 7.47-7.23 (m, 14H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.83-7.81 (m, 1H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.61 (d, J = 1.2 Hz, 1H).
Figure pct00088
10 ㎖의 무수 피리딘 중 2.00 g(3.21 mmol)의 7 및 390 ㎎(3.21 mmol)의 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에, 640 ㎎(6.41 mmol)의 석신산 무수물(8)을 아르곤하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반한 다음, 0.5 ㎖의 물을 첨가하였다. 교반을 30분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 100 ㎖의 디클로로메탄으로 희석하고, 50 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액 및 물(2 × 50 ㎖)로 세척하였다. 수층을 50 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류 오일을 톨루엔으로 2회 동시증발시키고, 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 97:2:1)에 의해 정제하여, 1.35 g(1.64 mmol, 51%)의 9를 회백색 폼(foam)으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.12 (t, J=7.3 Hz, 9 H), 2.51 - 2.55 (m, 2 H), 2.59 - 2.62 (m, 2 H), 2.89 (q, J=7.3 Hz, 6 H), 3.72 (s, 6 H), 4.17 (s, 2 H), 5.08 (s, 4 H), 5.68 (s br., 1 H), 6.76 - 6.80 (m, 4 H), 6.93 (dd, J = 8.1, 2.5 Hz, 1H), 7.14 - 7.18 (m, 1 H), 7.21 - 7.34 (m, 10 H), 7.41 - 7.46 (m, 4 H), 7.62 (dd, J = 5.1, 2.5 Hz, 2 H), 7.71 (dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 1 H), 8.59 (d, J = 1.5 Hz, 1H).
2.B X038 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00089
반응식 1: 석시네이트 13의 합성의 개요.
Figure pct00090
반응식 2: 7의 합성의 개요.
Figure pct00091
반응식 3: 9의 합성의 개요.
Figure pct00092
2000-㎖ 3-구 둥근 바닥 플라스크 내로 메탄올(1000 ㎖) 중 6-브로모-1H-인돌-2-카르복실산 1(100 g, 417 mmol)의 용액을 넣었다. 이에 이어서 교반하면서 염화티오닐(100 g, 840 mmol)을 적가하였다. 생성된 용액을 2시간 동안 환류하에 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 침전물을 형성하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 메탄올로 세척하고, 감압하에 오븐에서 건조시켜, 2(95 g, 90%)를 백색 고체로 제공하였다.
Figure pct00093
질소 불활성 분위기로 퍼지시키고, 유지한 2000-㎖ 3-구 둥근-바닥 플라스크 내로, 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르(500 ㎖), 물(500 ㎖), (피리딘-3-일)보론산 3(43.6 g, 355 mmol), NEt3(107 g, 1.06 mol) 및 Pd(PPh3)4(9 g, 7.79 mmol) 중 2(90 g, 354 mmol)의 용액을 넣었다. 생성된 용액을 하룻밤 환류 하에 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 800 ㎖의 물의 첨가에 의해 켄칭시켜, 침전물을 형성하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 감압하에 오븐에서 건조시켜, 4(78 g, 87%)를 갈색 고체로 제공하였다.
Figure pct00094
2000-㎖ 둥근-바닥 플라스크 내로 DMF(500 ㎖) 중 4(75 g, 297 mmol)의 용액을 넣었다. 이에 이어서, NBS(53.5 g, 301 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응물을 1000 ㎖의 물의 첨가에 의해 켄칭시켜, 침전물을 형성하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고 감압하에 오븐에서 건조시켜, 5(70 g, 71%)를 갈색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 3.94 (s, 3 H), 7.51-7.58 (m, 2 H), 7.67-7.76 (m, 2 H), 8.11 (d, J=7.6 Hz, 1 H), 8.60 (d, J=4.4 Hz, 1 H), 8.91 (s, 1 H), 12.48 (s, 1 H).
Figure pct00095
2000-㎖ 둥근-바닥 플라스크 내로 메탄올(500 ㎖), 물(100 ㎖) 및 수산화나트륨(25 g, 625 mmol) 중 5(68 g, 205)의 용액을 넣었다. 생성된 용액을 2시간 동안 환류하에 가열하였다. 생성된 용액을 실온으로 냉각시키고, 500 ㎖의 물로 희석하였다. 용액의 pH 값을 2N HCl(aq)을 사용하여 5 내지 6으로 조정하여, 침전물을 형성하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 감압하에 오븐에서 건조시켜, 6(50 g, 77%)을 연황색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.50-7.53 (m, 2H), 7.65-7.71 (m, 2H), 8.09 (d, J=7.6Hz, 1H), 8.59 (d, J= 4Hz, 1H), 8.91 (s, 1H), 12.30 (s, 1H), 13.55 (s, 1H).
Figure pct00096
2000-㎖ 둥근-바닥 플라스크 내로, THF(600 ㎖), Fmoc-OSu(166 g, 491 mmol) 및 NEt3(199 g, 1.97 mol) 중 2-아미노에탄-1-올 7a(30 g, 491 mmol)의 용액을 넣었다. 생성된 용액을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/석유 에테르)에 의해 정제하여 7b(130 g, 93%)를 백색 고체로 제공하였다.
Figure pct00097
2000-㎖ 둥근-바닥 플라스크 내로, 피리딘(500 ㎖), 1-[클로로(4-메톡시페닐)벤질]-4-메톡시벤젠(DMT-Cl)(233 g, 688 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(2.8 g, 22.9 mmol) 중 7b(130 g, 459 mmol)의 용액을 넣었다. 생성된 용액을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 그 다음, 반응물을 물의 첨가에 의해 켄칭시키고, 생성된 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 500 ㎖). 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/석유 에테르)에 의해 정제하여, 7c(210 g, 78%)를 갈색 고체로 제공하였다.
Figure pct00098
2000-㎖ 둥근-바닥 플라스크 내로, 디클로로메탄(500 ㎖) 및 NEt3(500 ㎖) 중 7c(210 g, 359 mmol)의 용액을 넣었다. 생성된 용액을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/석유 에테르)에 의해 정제하여, 7(95 g, 73%)을 갈색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 2.42 (br. s, 2 H), 3.70 - 3.82 (m, 2 H), 3.80 (s, 6 H), 6.79 - 6.87 (m, 4 H), 7.19 - 7.25 (m, 2 H), 7.29 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.33 - 7.40 (m, 3 H), 7.49 (d, J = 7.6 Hz, 2 H).
Figure pct00099
2000-㎖ 둥근 바닥 플라스크 내로, DMF(800 ㎖) 중 6(40 g, 126 mmol), 7(69 g, 190 mmol), HATU(96 g, 252 mmol) 및 i-Pr2EtN(65 g, 503 mmol)의 용액을 넣었다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, 1000 ㎖의 물의 첨가에 의해 켄칭시켰다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 800 ㎖). 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/석유 에테르)에 의해 정제하여, 8(30 g, 36%)을 연황색 고체로 제공하였다.
Figure pct00100
2000-㎖ 둥근-바닥 플라스크 내로, THF(200 ㎖) 중 4-(클로로메틸)벤조산 9a(50 g, 293 mmol)의 용액을 넣었다. 이에 이어서, 교반하면서 0℃에서 1시간에 걸쳐 1 M BH3/THF(586 ㎖, 586 mmol)를 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응물을 600 ㎖의 1 N HCl의 첨가에 의해 켄칭시켰다. 용액을 500 ㎖의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 300 ㎖의 탄산나트륨(aq.) 및 300 ㎖의 염수로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시켜, 9b(35 g, 76%)를 백색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.50 (d, J=4.8 Hz, 2 H), 4.75 (s, 2 H), 5.21 (t, J=4.8 Hz, 1 H), 7.32 (d, J=7.6 Hz, 2 H), 7.39 (d, J=7.6 Hz, 2 H).
Figure pct00101
1000-㎖ 3-구 둥근-바닥 플라스크 내로, THF(300 ㎖) 중 9b(35 g, 223 mmol)의 용액 및 TEA(68 g, 672 mmol)를 넣었다. 이에 이어서, 교반하면서 TMS-Cl(36.4 g, 335 mmol)을 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 그 다음, 반응물을 500 ㎖의 물의 첨가에 의해 켄칭시키고, 500 ㎖의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 500 ㎖의 NaHCO3(aq.), 500 ㎖의 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 잔류물을 진공하에 농축시켜, 9(35 g, 68%)를 무색의 오일로 제공하였다.
Figure pct00102
1000-㎖ 3-구 둥근-바닥 플라스크 내로, DMF(300 ㎖) 중 8(30 g, 45.3 mmol)의 용액 및 수소화나트륨(1.1 g, 45.8 mmol)을 넣었다. 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 그 다음, THF(100 ㎖) 중 9(15.5 g, 67.8 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 용액을 60℃에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 500 ㎖의 물의 첨가에 의해 켄칭시켰다. 생성된 용액을 디클로로메탄(3 × 500 ㎖)으로 추출하고, 합한 유기층을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/석유 에테르)에 의해 정제하여, 10(15 g, 39%)을 백색 고체로 제공하였다.
Figure pct00103
500-㎖ 둥근-바닥 플라스크 내로, THF(150 ㎖) 중 10(15 g, 17.6 mmol)의 용액 및 TBAF(7 g, 26.8 mmol)를 넣었다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 생성된 용액을 300 ㎖의 물로 희석하고, 500 ㎖의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물(2 × 300 ㎖) 및 300 ㎖의 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 생성된 혼합물을 진공하에 농축시키고, 미정제 생성물을 헥산으로부터 재결정화시켜, 11(5.5 g, 40%)을 황색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 3.30 (m, 2 H), 3.66 - 3.65 (m, 2 H), 3.78 (s, 6 H), 4.51 (s, 2 H), 5.68 (s, 2 H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 4 H), 7.09 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.19 - 7.35 (m, 9 H), 7.47 - 7.54 (m, 4 H), 7.70 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 8.10 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.51 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 8.79 (s, 1 H).
Figure pct00104
8 ㎖의 무수 피리딘 중 1.57 g(2.00 mmol)의 11 및 244 ㎎(2.00 mmol)의 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에, 400 ㎎(4.00 mmol)의 석신산 무수물(12)을 아르곤하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 22시간 동안 교반한 다음, 0.5 ㎖의 물을 첨가하였다. 교반을 30분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 100 ㎖의 디클로로메탄 중에 취하고, 50 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액 및 물(2 × 50 ㎖)로 세척하였다. 수층을 50 ㎖의 디클로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류 오일을 톨루엔을 사용하여 2회 동시증발시키고, 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 94:5:1)에 의해 정제하여, 2.05 g(2.00 mmol, 정량적)의 13을 회백색 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.05 (t, J = 7.2 Hz, 9 H), 2.45 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 2.54 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 2.66 (q, J = 7.2 Hz, 6 H), 3.29 (t, J = 4.9 Hz, 2 H), 3.60 (q, J = 5.1 Hz, 2 H), 3.70 (s, 6 H), 4.97 (s, 2 H), 5.75 (s, 2 H), 6.72 - 6.76 (m, 4 H), 7.01 (d, J = 8.1 Hz, 2 H), 7.12 - 7.23 (m, 6 H), 7.26 - 7.31 (m, 5 H), 7.35 - 7.41 (m, 4 H), 7.63 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.79 (dt, J = 8.1, 1.9 Hz, 1 H), 8.49 (dd, J = 4.8, 1.5 Hz, 1 H), 8.73 (d, J = 2.0 Hz, 1 H).
2.C . X052 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00105
반응식 1: 석시네이트 6의 합성의 개요.
Figure pct00106
건조된 2-구 둥근 바닥 플라스크에서, 3.33 g(17.8 mmol)의 4-브로모벤질 알코올, 2.35 g(17.8 mmol)의 4-에티닐벤질 알코올, 750 ㎎(1.07 mmol)의 비스-(트리페닐포스핀)-팔라듐디클로라이드 및 340 ㎎(1.78 mmol)의 요오드화구리(I)를 아르곤하에서 45 ㎖의 무수 THF 중에 용해시켰다. 그 다음, 12.4 ㎖(9.21 g, 71.3 mmol)의 후니그 염기를 첨가하고, 혼합물을 환류하에 4시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 하이플로(Hyflo)의 패드를 통과시키고, 필터케익을 THF로 세척하고, 여액을 건조될 때까지 증발시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올 99:1 내지 49:1)에 의해 정제하여, 3(1.03 g, 24%)을 황색을 띠는 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 4.54 (d, J=5.6 Hz, 4 H), 5.29 (t, J=5.8 Hz, 2 H), 7.37 (d, J=8.3 Hz, 4 H), 7.51 (d, J=8.1 Hz, 4 H).
Figure pct00107
디올 3(960 ㎎, 4.03 mmol)을 아르곤하에 17 ㎖의 피리딘 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 그 다음, 4,4'-디메톡시트리페닐클로로메탄(DMT-Cl, 1.37 ㎎, 4.03 mmol)을 15분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 용액을 주위 온도에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 100 ㎖의 디클로로메탄 중에 용해시키고, 각각 50 ㎖의 NaHCO3 포화 수용액으로 2회 추출하였다. 수층을 100 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켰다. 미정제 생성물을 톨루엔으로 2회 동시증발시키고, 실리카 겔 크로마토그래피(0.1% Et3N과 함께, 헵탄/에틸 아세테이트 3:1 내지 2:1)에 의해 정제하여, 4를 61% 수율로 폼으로서 제공하였다(1.32 g, 2.44 mmol). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.67 (t br., 1 H), 3.72 (s, 6 H), 4.11 (s, 2 H), 4.64 (s br., 2 H) 6.76 - 6.79 (m, 4 H), 7.13 - 7.17 (m, 1 H), 7.21 - 7.34 (m, 10 H), 7.41 - 7.47 (m, 6 H).
Figure pct00108
12 ㎖의 무수 피리딘 중 1.30 g(2.40 mmol)의 4 및 290 ㎎(2.40 mmol)의 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에, 480 ㎎(4.81 mmol)의 석신산 무수물(5)을 아르곤하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 19시간 동안 교반한 다음, 1.5 ㎖의 물의 첨가에 의해 켄칭시켰다. 교반을 60분 동안 계속한 후에, 반응 혼합물을 150 ㎖의 디클로로메탄으로 희석하고, 75 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액 및 물(2 × 75 ㎖)로 세척하였다. 수층을 150 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류 오일을 톨루엔으로 2회 동시증발키고, 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 97:2:1)에 의해 정제하여, 1.36 g(1.83 mmol, 76%)의 6을 회백색 점착성 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.16 (t, J=7.3 Hz, 9 H), 2.50 (t, J=6.5 Hz, 2 H), 2.60 (t, J= 6.7 Hz, 2 H), 2.87 (q, J=7.3 Hz, 6 H), 3.72 (s, 6 H), 4.11 (s, 2 H), 5.05 (s, 2 H), 5.65 (s br., 1 H), 6.75 - 6.79 (m, 4 H), 7.13 - 7.16 (m, 1 H), 7.21 - 7.34 (m, 10 H), 7.41 - 7.44 (m, 6 H).
2.D . X058 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00109
반응식 1: 석시네이트 13의 합성의 개요
Figure pct00110
반응식 2: 아민 10의 합성
Figure pct00111
톨루엔(4.94 ℓ, 4.94 mol) 중 삼염화붕소의 1 M 용액을 아르곤하에서 5 ℓ의 톨루엔으로 희석한 다음, 400 ㎖의 톨루엔 중 850 g(4.94 mol)의 2-브로모아닐린(1)의 용액을 40분의 기간에 걸쳐 첨가하여, 약간 발열성인 반응에서, 투명한 담갈색 용액을 야기하였다. 온도를 냉각하면서 24℃ 미만으로 유지하였다. 그 다음, 1.53 ℓ의 톨루엔 중 1529 g(14.8 mol)의 벤조니트릴(2)의 용액에 이어서, 725 g(5.44 mol)의 AlCl3을 첨가하여, 담록색으로 바뀌는 미세 현탁액을 생성하였다. 이러한 혼합물을 20℃ 내지 24℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 6시간 동안 환류하에 가열하였다. 환류하에서 1시간 후에, 투명한 담갈색 용액을 생성하였으며, 이는 4시간 후에 담황색으로 변하였으며, 결국에는 탁해졌다. 총 7시간 후에, 반응 혼합물이 하룻밤 20℃로 냉각되게 하여, 에멀젼을 생성한 다음, 15 ℓ의 빙냉 1 M HCl의 첨가에 의해 켄칭시켰다(주의: 첨가의 시작시에 강력한 기체 발생이 있는 발열 반응). 냉각에 의해 온도를 22℃ 내지 35℃로 유지하였다. 이러한 2상 혼합물을 60분 동안 80℃로 가온하였다. 수상을 분리하고, 5 ℓ의 톨루엔으로 재추출하였다. 둘 모두의 유기상을 5 ℓ의 1 M HCl, 10 ℓ의 2 M NaOH 용액 및 5 ℓ의 염수로 세척하였다. 합한 톨루엔 층을 MgSO4로 건조시키고, 갈색 오일로 증발시키고(55℃, 5 mbar), 이를 80℃ 및 0.5 mbar에서 추가로 건조시켰다. 미정제 생성물을 실온에서 1시간 후에 고화시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여, 812 g(2.94 mol, 58%)의 3을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3): 6.52 - 6.68 (m, 3 H), 7.42 (dd, J = 7.8, 1.3 Hz, 1 H), 7.47 - 7.54 (m, 2 H), 7.57 - 7.64 (m, 3 H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.3 Hz, 1 H).
Figure pct00112
아르곤하에서 그리고 격렬한 교반과 함께, 120 g(1033 mmol)의 메틸-4-옥소부타노에이트(4)를 3.5 ℓ의 빙초산 중 벤조페논 3(233 g, 808 mmol)의 용액에 한꺼번에 첨가하여, 투명한 황색 용액을 생성하였다. 2.5 ㎖(4.60 g, 46.9 mmol)의 진한 황산의 첨가 후에, 색상이 담적색으로 변하였다. 용액을 환류하에 하룻밤 가열하였다. 그 다음, 황색 용액을 실온으로 냉각시키고, 10 ℓ의 수 중 3 ㎏의 염화암모늄 빙냉 용액에 천천히 부었다. 혼합물을 각각 5 ℓ의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합한 유기층을 6 ℓ의 NaHCO3 포화 수용액으로 2회 추출하였다(주의: 기체 발생). 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켜, 338 g의 미정제 생성물을 담황색 고체로서 제공하였다. 이러한 물질을 6 ℓ의 헵탄/에틸 아세테이트 4:1로부터 결정화시켜, 136 g(382 mmol, 47%)의 5를 무색의 결정으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3): 3.58 (s, 3 H), 3.65 (s, 2 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H), 7.32 - 7.38 (m, 1 H), 7.40 - 7.45 (m, 1 H), 7.53 - 7.61 (m, 3 H), 8.07 (dd, J = 7.6, 1.5 Hz, 1 H), 8.97 (s, 1 H).
Figure pct00113
페닐퀴놀린 5(338 g, 949 mmol), 비닐 보로네이트 6(175 g, 1139 mmol) 및 탄산칼륨(266 g, 1926 mmol)을 아르곤하에서 4.6 ℓ의 1,4-디옥산/물 1:1 중에 용해시켰다. 혼합물을 5분 동안 교반한 후에, 31.9 g(78 mmol)의 S-PHOS 및 10.0 g(44.6 mmol)의 팔라듐(II)아세테이트를 첨가하였다. 혼합물을 70℃로 가온시키고, 아르곤하에서 5시간 동안 교반하였다. 그 다음, 황색 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 3 ℓ의 tert-부틸메틸에테르로 희석하고, 2.5 ℓ의 물에 이어서 2 ℓ의 염수로 2회 추출하였다. 수상을 2 ℓ의 tert-부틸메틸에테르로 재추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켜, 348 g의 황색 오일을 생성하였다. 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 4:1)에 의해 정제하여, 196 g(645 mmol, 68%)의 7을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3): 3.58 (s, 3 H), 3.63 (s, 2 H), 5.50 (dd, J = 11.1, 1.5 Hz, 1 H), 6.04 (dd, J = 17.9, 1.8 Hz, 1 H), 7.24 - 7.30 (m, 2 H), 7.35 (dd, J = 8.3, 1.3 Hz, 1 H), 7.43 - 7.50 (m, 1 H), 7.51 - 7.59 (m, 3 H), 7.97 (dd, J = 7.1, 1.0 Hz, 1 H), 8.06 (dd, J = 17.9, 11.4 Hz, 1 H), 8.91 (s, 1 H)
Figure pct00114
비닐-퀴놀린 7(194 g, 640 mmol)을 아르곤하에 3 ℓ의 THF 중에 용해시켰다. 황색 용액을 15℃로 냉각시키고, 10분 동안 교반하였다. 그 다음, THF(900 mmol) 중 9-보라비사이클로[3.3.1]노난의 0.5 M 용액 1.8 ℓ를 15 내지 18℃에서 30분의 기간 동안 적가하였다. 교반을 실온에서 하룻밤 계속하였다. -50℃로 냉각시킨 후에(드라이 아이스/아세톤), 수 중 30% 과산화수소 용액(2937 mmol) 300 ㎖를 5분에 걸쳐 적가한 다음(발열 반응), 520 ㎖의 3 M NaOH 수용액(1560 mmol)을 첨가하였으며, 이는 황색 현탁액을 생성하였다. 반응 혼합물이 0 내지 2℃로 가온되게 한 다음, 이러한 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 황색 현탁액을 3 ℓ의 물로 희석한 다음, 3 ℓ의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 둘 모두의 유기층을 2 ℓ의 물에 이어서 2 ℓ의 염수로 세척하였다. 합한 유기상을 MgSO4로 건조시키고, 증발시켜, 담갈색 오일을 제공하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중 2 내지 3% 메탄올)에 의해 정제하여, 163 g(507 mmol, 79%)의 8을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 3.42 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.53 (s, 3 H), 3.65 (s, 2 H), 3.76 - 3.84 (m, 2 H), 4.54 (t, J = 5.3 Hz, 1 H), 7.19 (dd, J = 8.6, 1.5 Hz, 1 H), 7.21 - 7.25 (m, 2 H), 7.40 (dd, J = 8.1, 7.1 Hz, 1 H), 7.49 - 7.59 (m, 3 H), 7.62 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 8.91 (s, 1 H).
Figure pct00115
메틸 에스테르 8(64.5 g, 201 mmol)을 600 ㎖의 메탄올 중에 용해시켰다. 이러한 용액에, 450 ㎖의 0.5 M NaOH 수용액(225 mmol)을 첨가하였다. 탁한 용액을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 약 600 ㎖로 증발시키고, 잔류물을 각각 800 ㎖의 tert-부틸메틸에테르로 2회 추출하였다. 에테르 층을 300 ㎖의 물로 세척하였다. 합한 수상을 건조될 때까지 증발시키고, 잔류물을 톨루엔으로 2회 동시증발시켜, 67 g의 베이지색 고체를 제공하였다. 이러한 물질을 1 ℓ의 물에 용해시킨 다음, 250 ㎖의 1 M 시트르산 수용액을 조심히 첨가하였다. 생성된 현탁액을 15분 동안 교반한 다음, 각각 1 ℓ의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켜, 54.1 g(176 mmol, 88%)의 산 9를 베이지색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, D2O): 3.80 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.82 (s, 2 H), 4.32 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 7.58 - 7.64 (m, 2 H), 7.67 - 7.73 (m, 1 H), 7.73 - 7.79 (m, 1 H), 7.87 - 7.95 (m, 3 H), 7.97 (dd, J = 7.1, 1.5 Hz, 1 H), 9.14 (s, 1 H).
Figure pct00116
프탈산 무수물(10B, 140 g, 945 mmol)을 4-아미노-1-부탄올(10A)과 혼합하고, 3시간 동안 140℃로 가열하였다. 반응의 과정에 걸쳐, 무색의 현탁액은 투명한 연황색 액체로 바뀌었다. 혼합물이 80℃로 냉각되게 하고, 3 ㎏의 쇄빙에 부었다. 얼음 혼합물을 각각 2 ℓ의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 2 ℓ의 NaHCO3 포화 수용액, 2 ℓ의 물로 2회, 2 ℓ의 염수로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 농축시켜, 195 g의 10C(889 mmol, 95%)를 베이지색 고체로 제공하였다. 이러한 물질을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3): 1.48 - 1.58 (m, 2 H), 1.67 - 1.78 (m, 2 H), 2.37 (t, J = 5.3 Hz, 1 H), 3.50 - 3.57 (m, 2 H), 3.66 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.75 - 7.85 (m, 4 H).
Figure pct00117
프탈이미드 10C(193 g, 880 mmol)를 2.5 ℓ의 피리딘 중에 아르곤하에 용해시켰다. 그 다음, 4,4'-디메톡시트리페닐클로로메탄(DMT-Cl, 328 g, 968 mmol)을 10분에 걸쳐 4부분으로 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물의 온도를 23℃에서 26℃로 올렸으며, 황색 용액이 적색으로 바뀐 다음, 다시 황색으로 바뀌었다. 용액을 주위 온도에서 하룻밤 교반하였다. 반응물을 켄칭시키기 위하여, 200 ㎖의 메탄올을 첨가하고 이후에 반응 혼합물을 증발시켰다. 잔류물을 5 ℓ의 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 5 ℓ의 5% 시트르산 수용액으로 2회, 5% NaHCO3 수용액으로 1회, 마지막으로 5 ℓ의 염수로 추출하였다. 수층을 2 ℓ의 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켰다. 미정제 생성물, 495 g의 갈색 오일을 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 4:1 내지 3:1)에 의해 정제하였다. DMT-보호된 링커 10D를 81% 수율(381 g, 730 mmol)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 1.48 - 1.60 (m, 2 H), 1.62 - 1.74 (m, 2 H), 3.01 (t, J = 6.1 Hz, 2 H), 3.56 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 3.73 (s, 6 H), 6.82 - 6.88 (m, 4 H), 7.16 - 7.25 (m, 5 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H), 7.32 - 7.37 (m, 2 H), 7.78 - 7.87 (m, 4 H).
Figure pct00118
프탈이미드 10D(302 g, 579 mmol)를 50℃에서 7 ℓ의 에탄올 중에 용해시키고, 320 ㎖(327 g, 3.57 mol)의 하이드라진 수화물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 50℃로 가열하였다. 무색의 현탁액을 실온으로 냉각시키고, 15 ℓ의 물로 희석하였다. 생성된 에멀젼을 각각 6 ℓ의 tert-부틸메틸에테르로 2회 추출하였다. 유기상을 4 ℓ의 5% NaHCO3 수용액 후에 4 ℓ의 염수로 2회 세척하였다. 합한 에테르 층을 MgSO4로 건조시키고, 증발시켜, 226 g(578 mmol)의 10을 담황색 오일로 제공하였으며, 이를 다음 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3): 1.42 - 1.54 (m, 2 H), 1.56 - 1.66 (m, 2 H), 2.61 (t, J=7.1 Hz, 2 H), 3.06 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 3.78 (s, 6 H), 6.84 - 6.90 (m, 4 H), 7.19 - 7.26 (m, 1 H), 7.28 - 7.35 (m, 6 H), 7.41 - 7.47 (m, 2 H).
Figure pct00119
퀴놀린 아세트산 9(92 g, 279 mmol)를 아르곤하에 1.5 ℓ의 DMF 중에 용해시키고, 1 ℓ의 DMF 중 128 g(327 mmol)의 DMT-보호된 아미노부탄올 10의 용액 후에 146 ㎖(108 g, 838 mmol)의 에틸디이소프로필아민을 첨가하였다. 마지막으로, 138 g(363 mmol)의 HATU를 탁한 담황색 용액에 첨가하여, 발열 반응을 야기하였다. 빙조(ice-bath) 냉각을 사용하여 온도를 25℃ 미만으로 유지하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반한 다음, 3 ℓ의 NaHCO3 수용액으로 희석하였다. 이러한 혼합물을 각각 3 ℓ의 tert-부틸메틸에테르로 2회 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, 합하고, 건조시키고, 증발시켰다. 미정제 생성물(180 g의 담갈색 오일)을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 98:2:0.25)에 의해 정제하여, 134 g(197 mmol, 70%)의 11을 무색의 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 1.35 - 1.57 (m, 4 H), 2.97 (t, J = 6.3 Hz, 4 H), 3.34 - 3.48 (m, 4 H), 3.73 (s, 6 H), 3.76 - 3.83 (m, 2 H), 4.54 (t, J = 5.3 Hz, 1 H), 6.84 - 6.90 (m, 4 H), 7.15 - 7.32 (m, 10 H), 7.34 - 7.41 (m, 3 H), 7.42 - 7.53 (m, 3 H), 7.58 (dd, J = 6.8, 1.3 Hz, 1 H), 7.62 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 8.83 (s, 1 H).
Figure pct00120
알코올 11(43.8 g, 64.4 mmol) 및 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP, 7.87 g, 64.4 mmol)을 아르곤하에 600 ㎖의 피리딘 중에 용해시켰다. 그 다음, 12.9 g(128 mmol)의 석신산 무수물(12)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 10 ㎖의 물의 첨가에 의해 반응물을 켄칭시키고, 교반을 30분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 1200 ㎖의 디클로로메탄으로 희석하고, 600 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액으로 세척하고, 600 ㎖의 물로 2회 세척하였다. 수층을 600 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 100 ㎖의 톨루엔으로 2회 동시증발시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 97:2:1 내지 94:5:1)에 의해 정제하여, 57.5 g(정량적)의 13을 회백색 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 9 H), 1.46 - 1.60 (m, 4 H), 2.52 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.61 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 2.82 (q, J = 7.3 Hz, 6 H), 3.06 (t, J = 5.8 Hz, 2 H), 3.16 (q, J = 6.3 Hz, 2 H), 3.49 (s, 2 H), 3.64 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.80 (s, 6 H), 4.53 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 5.38 (t br., 1 H), 6.08 (s br., 1 H), 6.80 - 6.84 (m, 4 H), 7.20 (t, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.26 - 7.38 (m, 10 H), 7.41 - 7.52 (m, 5 H), 7.59 (d, J = 6.3 Hz, 1 H), 8.92 (s, 1 H).
2.E . X067 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00121
반응식 1: 6의 합성의 개요
Figure pct00122
250 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에, 2-(4-브로모페닐)에탄올 1(1.00 g, 4.97 mmol), 피리딘(25 ㎖) 및 4,4'-(클로로(페닐)메틸렌)비스(메톡시벤젠)(DMT-Cl)(1.69 g, 4.97 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 1 ㎖의 MeOH를 첨가하고, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음, 용액을 진공하에 농축시키고, 250 ㎖의 EtOAc 중에 용해시키고, 100 ㎖의 NaHCO3 포화 수용액, 100 ㎖의 물 및 100 ㎖의 염수로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트/NEt3)에 의해 정제하여, 2(2.35 g, 94%)를 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 2.80 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 3.12 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 3.72 (s, 6 H), 6.81 - 6.87 (m, 4 H), 7.12 - 7.22 (m, 7 H), 7.26 (d, J = 4.0 Hz, 4 H), 7.44 - 7.50 (m, 2 H).
Figure pct00123
고무 격벽이 있는 40 ㎖ 유리 바이얼에, 2(0.70 g, 1.39 mmol), 4-(하이드록시메틸)페닐보론산 3(0.25 g, 1.67 mmol), Pd(PPh3)4(80 ㎎, 0.070 mmol), 2 M(aq) Na2CO3(2.1 ㎖, 4.17 mmol) 및 1,4-디옥산(7 ㎖)을 첨가하였다. 내용물을 진공 하에 잠시 둔 다음, 질소 분위기하에 두었다. 바이얼을 밀봉하고, 90℃에서 16시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, EtOAc를 첨가하고, 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액 및 염수로 세척하였다. 유기부를 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트/NEt3)에 의해 정제하여, 3(0.64 g, 87%)을 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 2.86 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 3.16 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 3.72 (s, 6 H), 4.52 (d, J = 6.1 Hz, 2 H), 5.19 (t, J = 5.8 Hz, 1 H), 6.81 - 6.87 (m, 4 H), 7.18 (d, J = 9.1 Hz, 4 H), 7.20 - 7.22 (m, 1 H), 7.24 - 7.33 (m, 6 H), 7.38 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.57 (d, J = 8.1 Hz, 2 H), 7.60 (d, J = 8.1 Hz, 2 H).
Figure pct00124
35 ㎖의 무수 피리딘 중 3.68 g(6.93 mmol)의 4 및 847 ㎎(6.93 mmol)의 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에 1.39 g(13.9 mmol)의 석신산 무수물(5)을 아르곤하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 2.5 ㎖의 물을 첨가하였다. 교반을 30분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 300 ㎖의 디클로로메탄 중에 취하고, 150 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액 및 물(2 × 150 ㎖)로 세척하였다. 수층을 150 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 증발시켰다. 남아있는 오일을 톨루엔으로 2회 동시증발시키고, 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 97:2:1)에 의해 정제하여, 4.68 g(6.39 mmol, 92%)의 6을 회백색 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.14 (t, J = 7.4 Hz, 9 H), 2.51 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.60 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 2.82 - 2.90 (m, 8 H), 3.24 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.70 (s, 6 H), 5.08 (s, 2 H), 6.69 - 6.73 (m, 4 H), 7.08 - 7.21 (m, 9 H), 7.28 - 7.35 (m, 4 H), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 2 H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 8.04 (s br., 1 H).
2. F. X069 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00125
반응식 1: 석시네이트 7의 합성의 개요
Figure pct00126
화합물 2를 문헌[Eur . J. Org . Chem, 2002, 19, 3326-3335]에 따라 제조하였다. 250 ㎖의 둥근 바닥에, 3-브로모벤즈알데히드 1(10.0 g, 54.0 mmol) 및 EtOH(25 ㎖)를 첨가하였다. 용액을 빙수조에서 0℃로 냉각시키고, 수소화붕소나트륨(1.11 g, 29.5 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 황산나트륨 10수화물을 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하여, 붕소수소화물을 켄칭시켰다. 디에틸 에테르를 첨가하고, 혼합물을 물로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시켜, 2(9.50 g, 94%)를 투명한 오일로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 2.34 (br. s, 1 H), 4.61 (br. s, 2 H), 7.13 - 7.33 (m, 2 H), 7.40 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.49 (s, 1 H).
Figure pct00127
500 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에, 2(9.50 g, 50.8 mmol), 4,4'-(클로로(페닐)메틸렌)비스(메톡시벤젠)(DMT-Cl)(17.2 g, 50.8 mmol), DMAP(0.310 g, 0.050 mmol) 및 피리딘(200 ㎖)을 첨가하였다. 용액을 질소 분위기하에 두고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. EtOAc를 첨가하고, 용액을 NaHCO3 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 진공하에 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트/NEt3)에 의해 정제하여, 3(23.3 g, 94%)을 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 3.74 (s, 6 H), 4.12 (s, 2 H), 6.92 (dd, J = 8.0 Hz, 4 H), 7.21 - 7.48 (m, 13 H).
Figure pct00128
고무 격벽이 있는 40 ㎖ 유리 바이얼에, 3(1.00 g, 2.04 mmol), 4-에티닐벤질 알코올 4(0.405 g, 3.06 mmol), PdCl2(PPh3)2(86 ㎎, 0.123 mmol), CuI(39 ㎎, 0.204 mmol), iPr2EtN(1.06 g, 8.17 mmol) 및 THF(7 ㎖)를 첨가하였다. 내용물을 진공하에 잠시 둔 다음, 질소 분위기하에 두었다. 바이얼을 밀봉하고, 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, EtOAc로 세척하고, 여액을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트/NEt3)에 의해 정제하여, 5(0.680 g, 62%)를 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 3.74 (s, 6 H), 4.12 (s, 2 H), 4.53 (d, J = 4.0 Hz, 2 H), 5.29 (t, J = 4.0 Hz, 1 H), 6.93 (dd, J = 8.0 Hz, 4 H), 7.19 - 7.58 (m, 17 H).
Figure pct00129
42 ㎖의 무수 피리딘 중 4.55 g(8.42 mmol)의 5 및 1.03 g(8.42 mmol)의 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에, 1.68 g(16.8 mmol)의 석신산 무수물(6)을 아르곤하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 2.5 ㎖의 물을 첨가하였다. 교반을 30분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 300 ㎖의 디클로로메탄 중에 취하고, 150 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액 및 물(2 × 150 ㎖)로 세척하였다. 수층을 150 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 남아있는 오일을 톨루엔을 사용하여 2회 동시증발시키고, 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 97:2:1)에 의해 정제하여, 5.81 g(7.83 mmol, 93%)의 7을 회백색 점착성 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.14 (t, J = 7.4 Hz, 9 H), 2.50 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 2.60 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 2.86 (q, J = 7.3 Hz, 6 H), 3.72 (s, 6 H), 4.09 (s, 2 H), 5.05 (s, 2 H), 5.95 (s br., 1 H), 6.75 - 6.79 (m, 4 H), 7.15 (tt, J = 7.3, 1.5 Hz, 1 H), 7.21 - 7.36 (m, 11 H), 7.42 - 7.45 (m, 5 H).
2.G . PAZ 리간드 석시네이트로의 , 조절 공극 유리 지지체의 고밀도 로딩을 위한 일반 절차
Figure pct00130
삼각 플라스크에서, 1.00 mmol의 PAZ 리간드 석시네이트 염 1을 아르곤하에 50 ㎖의 무수 아세토니트릴 중에 용해시켰다. 이러한 용액에, 353 ㎎(1.10 mmol)의 O-(1H-벤조-1,2,3-트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU)를 첨가하고, 용액을 10분 동안 진탕시켰다. 그 다음, 10 g의 장쇄 알킬아민 조절 공극 유리(LCAA/CNA-600-CPG, PrimeSynthesis, 2)를 첨가하고, 반응 혼합물을 5분 동안 온건하게 교반하였다. 마지막으로, 0.685 ㎖(517 ㎎, 4.00 mmol)의 후니그 염기를 첨가하고, 플라스크를 오비탈 진탕기(orbital shaker)에서 24시간 동안 온건하게 진탕시켰다. CPG의 분취물을 데트리틸화(detritylating)시킴으로써 로딩 밀도를 평가하였다(3 내지 5 ㎎의 CPG를 아세토니트릴로 세척하고, 진공하에 건조시키고, 디클로로메탄 중 3%(v/v) 디클로로아세트산 25 ㎖에 첨가하고, 504 ㎚에서 흡광도를 결정함). 로딩 밀도가 요망되는 범위(60 내지 90 마이크로몰/g)에 있으면, CPG를 여과해내고, 아세토니트릴로 광범위하게 세척하였다. CPG를 각각의 아세트산 무수물/2,6-루티딘/THF 1:1:8(v/v/v)의 혼합물 및 1-메틸이미다졸/THF 16:84(v/v) 용액 x ㎖로 처리함으로써 비유도체화된 아미노기를 캡핑하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 온건하게 진탕시켰다. 그 다음, CPG를 여과해내고, 아세토니트릴로 세척하고, 진공하에 하룻밤 건조시켰다. 로딩 밀도를 상기와 같이 다시 결정하였다. 실시예 1 내지 6에서 석시네이트에 대한 로딩 수율은 64 내지 75 마이크로몰/g의 범위였다.
2.H . X050, X059, X061, X062, X065, X068 알코올 및 석시네이트 에스테르의 합성
X027과 유사한 방식으로 제조
Figure pct00131
X050 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.73 (s, 6 H) 4.19 (s, 2 H) 4.51 (d, J=5.56 Hz, 2 H) 5.17 (s, 2 H) 5.21 (t, J=5.81 Hz, 1 H) 6.89 - 6.95 (m, 4 H) 7.01 (dd, J=8.08, 2.02 Hz, 1 H) 7.19 - 7.30 (m, 4 H) 7.30 - 7.40 (m, 9 H) 7.40 - 7.49 (m, 5 H) 7.53 (s, 1 H) 7.57 (d, J=7.58 Hz, 1 H). MS (ESI-) m/z: C42H38O5에 대한 계산치: 622.3; 실측치: 667.9 [MH- + 포름산].
X059 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 4.10 (s, 2 H) 4.52 (s, 2 H) 5.15 (s, 2 H) 5.22 (br. s., 1 H) 6.90 - 6.96 (m, 4 H) 7.07 - 7.13 (m, 2 H) 7.22 - 7.30 (m, 2 H) 7.30 - 7.38 (m, 8 H) 7.39 - 7.48 (m, 5 H) 7.60 (d, J=8.08 Hz, 4 H). MS (ESI-) m/z: C42H38O5에 대한 계산치: 622.3; 실측치: 621.1 [MH-].
X061 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 4.17 (s, 2 H) 4.63 (d, J=5.05 Hz, 2 H) 5.17 - 5.22 (m,3 H) 6.93 (d, J=8.59 Hz, 4 H) 7.11 (d, J=8.59 Hz, 2 H) 7.22 - 7.37 (m, 10 H) 7.40 - 7.52 (m, 7 H) 7.58 (d, J=8.59 Hz, 2 H). MS (ESI-) m/z: C42H38O5에 대한 계산치: 622.3; 실측치: 667.6 [MH- + 포름산].
X062 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 4.16 (s, 2 H) 4.52 (d, J=6.06 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.19 - 5.23 (m, 1 H) 6.90 - 6.95 (m, 4 H) 7.07 - 7.12 (m, 2 H) 7.21 - 7.29 (m, 2 H) 7.30 - 7.38 (m, 9 H) 7.39 - 7.48 (m, 5 H) 7.49 - 7.53 (m, 1 H) 7.55 - 7.60 (m, 2 H). MS (ESI-) m/z: C42H38O5에 대한 계산치: 622.3; 실측치: 667.7 [MH- + 포름산].
X065 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.75 (s, 6 H) 4.16 (s, 2 H) 4.52 (d, J=6.06 Hz, 2 H) 5.17 (s, 2 H) 5.21 (t, J=5.81 Hz, 1 H) 6.93 (d, J=8.59 Hz, 4 H) 7.12 (d, J=9.09 Hz, 2 H) 7.22 - 7.39 (m, 10 H) 7.41 - 7.47 (m, 3 H) 7.78 (dd, J=8.34, 2.27 Hz, 1 H) 7.85 - 7.90 (m, 1 H) 8.03 (d, J=9.09 Hz, 2 H) 8.55 (d, J=1.52 Hz, 1 H). MS (ESI+) m/z: C41H37NO5에 대한 계산치: 623.3; 실측치: 624.7 [MH+].
X068 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 2.87 (t, J=6.57 Hz, 2 H) 3.16 (t, J=6.57 Hz, 2 H) 3.72 (s, 6 H) 4.51 (d, J=5.56 Hz, 2 H) 5.17 (s, 2 H) 5.21 (t, J=5.81 Hz, 1 H) 6.85 (d, J=8.59 Hz, 4 H) 6.99 (dd, J=8.08, 1.52 Hz, 1 H) 7.18 (d, J=9.09 Hz, 4 H) 7.20 - 7.38 (m, 13 H) 7.43 (s, 1 H) 7.59 (d, J=8.59 Hz, 2 H). MS (ESI+) m/z: C43H40O5에 대한 계산치: 636.3; 실측치: 659.7 [M + Na].
2.I . X060 및 X064 알코올 및 석시네이트 에스테르의 합성
X067과 유사한 방식으로 제조
Figure pct00132
X060 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.75 (s, 6 H) 4.12 (s, 2 H) 4.57 (d, J=5.56 Hz, 2 H) 5.20 - 5.26 (m, 1 H) 6.90 - 6.96 (m, 4 H) 7.22 - 7.28 (m, 1 H) 7.29 - 7.38 (m, 7 H) 7.39 - 7.48 (m, 5 H) 7.53 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.60 (s, 1 H) 7.64 (d, J=8.08 Hz, 2 H). MS (ESI+) m/z: C35H32O4에 대한 계산치: 516.2; 실측치: 303.4 [DMT+].
X064 알코올: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.75 (s, 6 H) 4.18 (s, 2 H) 4.56 (d, J=5.56 Hz, 2 H) 5.24 (t, J=5.81 Hz, 1 H) 6.93 (d, J=9.09 Hz, 4 H) 7.25 (t, J=7.33 Hz, 1 H) 7.32 (d, J=9.09 Hz, 4 H) 7.34 - 7.39 (m, 2 H) 7.44 (t, J=8.08 Hz, 4 H) 7.82 (dd, J=8.34, 2.27 Hz, 1 H) 7.93 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.04 (d, J=8.08 Hz, 2 H) 8.59 (d, J=2.02 Hz, 1 H). MS (ESI+) m/z: C34H31NO4에 대한 계산치: 517.2; 실측치: 518.8 [MH+].
2.J . X063 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00133
3-(하이드록시메틸)페놀(1, 6.21 g, 50.0 mmol)을 피리딘(100 ㎖) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. DMT-Cl(16.9 g, 50 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 500 ㎖의 EtOAc를 첨가하고, 용액을 400 ㎖의 NaHCO3 포화 수용액, 물 및 염수로 각각 1회 세척하였다. 유기부를 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 혼합물을 아세톤/톨루엔 중에 재용해시키고, 농축시키고, 이 과정을 4회 반복하였다. 그 다음, 잔류물을 진공하에 하룻밤 농축시켜, 2(20.9 g, 98%)를 거품상 고체로 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 3.97 (s, 2 H) 6.66 (dd, J=8.08, 1.52 Hz, 1 H) 6.72 (d, J=7.58 Hz, 1 H) 6.83 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 6.89 - 6.95 (m, 4 H) 7.12 (t, J=7.83 Hz, 1 H) 7.17 (d, J=7.58 Hz, 1 H) 7.27 - 7.32 (m, 4 H) 7.34 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 7.40 - 7.46 (m, 2 H) 9.37 (s, 1 H).
Figure pct00134
아세톤(145 ㎖) 중 화합물 2(17.2 g, 36.3 mmol)에, 메틸 4-브로모-3-(브로모메틸)벤조에이트(3, 11.7 g, 38.1 mmol) 및 K2CO3(30.1 g, 218 mmol)를 첨가하였다. 플라스크를 2회 배기/N2 충전하고, N2의 분위기하에 환류하에 하룻밤 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 혼합물을 여과하고, CH2Cl2로 세척하고, 농축시켰다. 그 다음, 잔류물을 CH2Cl2 중에 재용해시키고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 4(24.8 g, 99%)를 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 3.84 (s, 3 H) 4.07 (s, 2 H) 5.20 (s, 2 H) 6.88 - 6.92 (m, 4 H) 6.94 - 6.98 (m, 2 H) 6.99 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.21 - 7.26 (m, 1 H) 7.26 - 7.30 (m, 5 H) 7.30 - 7.35 (m, 2 H) 7.38 - 7.43 (m, 2 H) 7.85 (s, 2 H) 8.11 (s, 1 H)
Figure pct00135
디메톡시에탄(350 ㎖) 중 화합물 4(24.8 g, 35.8 mmol)에 Bu4NBr(17.3 g, 53.7 mmol), Cs2CO3(17.5 g, 53.7 mmol) 및 Pd(OAc)2(2.01 g, 8.96 mmol)를 첨가하였다. 플라스크를 2 사이클의 진공/N2 충전으로 탈기시키고, N2의 분위기하에, 환류하에 하룻밤 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여, THF로 용리시키고, 농축시켰다. 잔류물을 500 ㎖의 EtOAc 중에 용해시키고, 400 ㎖의 NaHCO3 포화 수용액, 2× 400 ㎖의 물 및 400 ㎖의 염수로 세척하였다. 유기 분획을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(CH2Cl2/트리에틸아민)에 의해 정제하여, 5(15.1 g, 68%)를 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 3.87 (s, 3 H) 4.11 (s, 2 H) 5.23 (s, 2 H) 6.89 - 6.96 (m, 4 H) 7.01 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.08 (dd, J=8.08, 1.52 Hz, 1 H) 7.22 - 7.27 (m, 1 H) 7.29 - 7.33 (m, 4 H) 7.33 - 7.38 (m, 2 H) 7.41 - 7.46 (m, 2 H) 7.88 - 7.93 (m, 2 H) 7.93 - 7.99 (m, 2 H)
Figure pct00136
수소화리튬알루미늄(THF 중 1.0 M 현탁액 43.4 ㎖, 43.4 mmol)을 0℃에서 THF(150 ㎖) 중 화합물 5(12.0 g, 19.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 0℃에서 2시간 후에, 0℃에서 10분 동안 교반하면서 20 ㎖의 EtOAc를 적가함으로써 반응 혼합물을 켄칭시켰다. 1.65 ㎖의 H2O, 1.65 ㎖의 20% NaOH 수용액 및 4.95 ㎖의 H2O를 순차적으로 첨가하였다. 그 다음, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, Na2SO4로 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄/트리에틸아민)에 의해 정제하여, 6(8.47 g, 81%)을 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.75 (s, 6 H) 4.07 (s, 2 H) 4.52 (d, J=5.56 Hz, 2 H) 5.13 (s, 2 H) 5.21 - 5.25 (m, 1 H) 6.89 - 6.95 (m, 4 H) 6.96 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.03 (dd, J=8.08, 1.52 Hz, 1 H) 7.22 (s, 1 H) 7.23 - 7.28 (m, 1 H) 7.29 - 7.33 (m, 4 H) 7.33 - 7.38 (m, 3 H) 7.41 - 7.46 (m, 2 H) 7.76 (d, J=7.58 Hz, 1 H) 7.81 (d, J=8.08 Hz, 1 H). MS (ESI+) m/z: C36H32O5에 대한 계산치: 544.2; 실측치: 545.2 [MH+].
Figure pct00137
디메틸아미노피리딘(0.124 g, 1.02 mmol)을 실온에서 아르곤하에 피리딘(5 ㎖) 중 화합물 6(0.554 g, 1.02 mmol)의 용액에 첨가하였다. 석신산 무수물 7(0.204 g, 2.03 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 0.5 ㎖의 H2O를 첨가하고, 용액을 30분 동안 교반하였다. 100 ㎖의 CH2Cl2를 첨가하고, 용액을 50 ㎖의 차가운 10% 시트르산 수용액으로 1회, 그리고 각각 50 ㎖의 물로 2회 세척하였다. 수성 분획을 50 ㎖의 CH2Cl2로 1회 재추출하였다. 합한 유기 분획을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시킨 다음, 톨루엔으로 2회 희석/농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민)(49:1/1%)에 의해 정제하여, 8(0.78 g, 103%)을 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.45 (t, J=7.20 Hz, 2.5 H) 2.52 - 2.60 (m, 2 H) 2.65 - 2.71 (m, 2 H) 3.60 (q, J=7.33 Hz, 1.7 H) 3.79 (s, 6 H) 4.16 (s, 2 H) 5.12 (s, 2 H) 5.13 (s, 2 H) 6.82 - 6.87 (m, 4 H) 7.03 (dd, J=8.08, 1.26 Hz, 1 H) 7.08 (s, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.19 - 7.25 (m, 1 H) 7.28 - 7.33 (m, 2 H) 7.33 - 7.37 (m, 1 H) 7.38 - 7.44 (m, 4 H) 7.49 - 7.54 (m, 2 H) 7.66 (t, J=7.83 Hz, 2 H)
2.K . X066 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00138
격벽이 있는 40 ㎖ 바이얼에, 4-브로모-3-(브로모메틸)페놀(1, 0.360 g, 1.25 mmol), 메틸 3-(브로모메틸)벤조에이트(2, 0.856 g, 3.74 mmol), K2CO3(0.516 g, 3.74 mmol) 및 아세톤(6 ㎖)을 첨가하였다. 바이얼을 2회 배기/N2 충전시키고, 20시간 동안 50℃에서 가열하고, 실온으로 냉각시킨 후에, 혼합물을 여과하여, CH2Cl2로 세척하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄)에 의해 정제하여, 3(0.391 g, 62%)을 백색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.88 (s, 3 H) 4.67 (s, 2 H) 5.21 (s, 2 H) 6.98 (dd, J=8.59, 3.03 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=3.03 Hz, 1 H) 7.52 - 7.58 (m, 2 H) 7.72 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.91 - 7.95 (m, 1 H) 8.05 (s, 1 H)
Figure pct00139
화합물 4의 합성은 X063의 합성에 기재되어 있다. 격벽이 있는 40 ㎖ 바이얼에, 화합물 3(0.390 g, 0.763 mmol), 4(0.390 g, 0.915 mmol), K2CO3(0.316 g, 2.29 mmol) 및 아세톤(4 ㎖)을 첨가하였다. 바이얼을 밀봉하고, 내용물을 2회 배기/N2 충전하였다. 그 다음, 바이얼을 17시간 동안 60℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 혼합물을 여과하여, CH2Cl2로 세척하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄/트리에틸아민)에 의해 정제하여, 5(0.448 g, 77%)를 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 3.85 (s, 3 H) 4.10 (s, 2 H) 5.08 (s, 2 H) 5.20 (s, 2 H) 6.87 - 6.92 (m, 4 H) 6.92 - 7.02 (m, 4 H) 7.19 - 7.26 (m, 3 H) 7.26 - 7.35 (m, 7 H) 7.39 - 7.45 (m, 2 H) 7.50 (t, J=7.83 Hz, 1 H) 7.56 (d, J=8.59 Hz, 1 H) 7.68 (d, J=7.58 Hz, 1 H) 7.90 (d, J=7.58 Hz, 2 H) 8.02 (s, 1 H)
Figure pct00140
격벽이 있는 바이얼에서 화합물 5(0.540 g, 0.569 mmol)에, 디메톡시에탄(5.7 ㎖), Bu4NBr(0.275 g, 0.853 mmol), Cs2CO3(0.278 g, 0.853 mmol) 및 Pd(OAc)2(0.026 g, 0.11 mmol)를 첨가하였다. 바이얼을 밀봉하고, 2 사이클의 진공/N2 충전으로 탈기시키고, 90℃에서 하룻밤 가열하였다. LCMS에 의해 17시간 후에 약 33% 전환이 관찰되었다. 추가의 0.100 g의 Pd(OAc)2(0.44 mmol)를 첨가하고, 반응을 추가 24시간 동안 계속하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 EtOAc로 용리시켰다. 그 다음, 용액을 NaHCO3 포화 수용액, 물 및 염수로 각각 1회 세척하였다. 유기부를 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄/트리에틸아민)에 의해 정제하여, 6(0.105 g, 27%)을 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.75 (s, 6 H) 3.87 (s, 3 H) 4.08 (s, 2 H) 5.09 (s, 2 H) 5.24 (s, 2 H) 6.88- 6.95 (m, 5 H) 6.95 - 7.00 (m, 2 H) 7.05 (dd, J=8.34, 2.78 Hz, 2 H) 7.21 - 7.26 (m, 2 H) 7.29 - 7.36 (m, 6 H)7.39 - 7.46 (m, 2 H) 7.55 (t, J=7.83 Hz, 1 H) 7.69 - 7.77 (m, 3 H) 7.92 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.05 (s, 1 H)
Figure pct00141
THF(2 ㎖) 중 화합물 6(0.135 g, 0.199 mmol)을 N2의 분위기하에 0℃로 냉각시켰다. THF 중 1 M LAH의 현탁액(0.477 ㎖, 0.477 mmol)을 적가하고, 용액을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 1 ㎖의 EtOAc를 적가하고, 용액을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 0.018 ㎖의 H2O, 0.018 ㎖의 20% NaOH 수용액 및 0.054 ㎖의 H2O를 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 Na2SO4로 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하여 EtOAc로 세척하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄/트리에틸아민)에 의해 정제하여, 7(0.110 g, 85%)을 거품상 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.75 (s, 6 H) 4.08 (s, 2 H) 4.52 (d, J=5.56 Hz, 2 H) 5.04 (t, J=5.81 Hz, 1 H) 5.08 (s, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 6.89 - 6.94 (m, 5 H) 6.95 (d, J=2.53 Hz, 1 H) 6.98 (dd, J=8.08, 1.52 Hz, 1 H) 7.03 (dd, J=8.59, 2.53 Hz, 1 H) 7.24 (t, J=7.33 Hz, 1 H) 7.26 - 7.37 (m, 9 H) 7.40 - 7.46 (m, 3 H) 7.72 (d, J=8.08 Hz, 2 H). MS (ESI+) m/z: C43H38O6에 대한 계산치: 650.3; 실측치: 303.4 [DMT+].
Figure pct00142
디메틸아미노피리딘(0.019 g, 0.157 mmol)을 실온에서 아르곤하에 피리딘(3 ㎖) 중 화합물 7(0.102 g, 0.157 mmol)의 용액에 첨가하였다. 석신산 무수물 8(0.031 g, 0.313 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 0.5 ㎖의 H2O를 첨가하고, 용액을 30분 동안 교반하였다. 50 ㎖의 CH2Cl2를 첨가하고, 용액을 25 ㎖의 차가운 10% 시트르산 수용액으로 1회, 그리고 각각 25 ㎖의 물로 2회 세척하였다. 수성 분획을 25 ㎖의 CH2Cl2로 1회 재추출하였다. 유기 분획을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시키고, 톨루엔을 사용하여 2회 희석/농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민)(49:1/1%)에 의해 정제하여, 9(0.10 g, 76%)를 오일로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.46 (t, J=7.33 Hz, 2.1 H) 2.57 (t, J=6.82 Hz, 2 H) 2.68 (t, J=6.82 Hz, 2 H) 3.61 (q, J=7.16 Hz,1.4 H) 3.80 (s, 6 H) 4.15 (s, 2 H) 5.09 (s, 2 H) 5.09 (s, 2 H) 5.15 (s, 2 H) 6.78 (d, J=2.53 Hz, 1 H) 6.82 - 6.88 (m, 4 H) 6.95 - 7.04 (m, 2 H) 7.06 (s, 1 H) 7.18 - 7.25 (m, 1 H) 7.28 - 7.36 (m, 3 H) 7.36 - 7.46 (m, 7 H) 7.50 - 7.55 (m, 2 H) 7.61 (dd, J=8.34, 2.27 Hz, 2 H)
2.L . X051 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00143
Figure pct00144
화합물 1의 합성은 X063의 합성에 기재되어 있다. 화합물 1(6.70 g, 12.3 mmol)을 THF(123 ㎖) 중에 용해시키고, 2회 배기/N2 퍼지시키고, 0℃로 냉각시켰다. 광유 중 NaH의 60% 분산액을 첨가하고(0.886 g, 36.9 mmol), 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 그 다음, 메틸 3-(브로모메틸)벤조에이트(2, 3.38 g, 14.8 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 400 ㎖의 EtOAc로 희석하고, 400 ㎖의 NaHCO3 포화 수용액으로 1회 세척하였다. 수층을 200 ㎖의 EtOAc로 재추출하고, 합한 유기층을 각각 400 ㎖의 물 및 염수로 1회 세척하였다. 유기부를 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄/트리에틸아민)에 의해 정제하여, 3(6.55 g, 77%)을 거품상 고체로 제공하였다. 생성물은 약 13%의 상응하는 에틸 에스테르를 함유하였으며, 이를 동등한 전구체로서 다음 단계로 전달하였다. 메틸 에스테르: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.32 (t, J=7.07 Hz, 0.38 H) 3.74 (s, 6 H) 3.86 (s, 2.52 H) 4.08 (s, 2 H) 4.32 (q, J=7.07 Hz, 0.25 H) 4.58 (s, 2 H) 4.64 (s, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 6.93 (d, J=8.59 Hz, 4 H) 6.97 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.04 (dd, J=8.08, 1.52 Hz, 1 H) 7.25 (t, J=7.33 Hz, 1 H) 7.28 (s, 1 H) 7.31 (d, J=9.09 Hz, 4 H) 7.33 - 7.41 (m, 3 H) 7.44 (d, J=7.58 Hz, 2 H) 7.53 (t, J=7.83 Hz, 1 H) 7.66 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.80 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.83 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.90 (d, J=7.58 Hz, 1 H) 7.97 (s, 1 H)
Figure pct00145
THF 중 화합물 3을 0℃로 냉각시키고, N2의 분위기하에 두었다. THF 중 1M LAH의 현탁액(22.5 ㎖, 22.5 mmol)을 적가하고, 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 1 ㎖의 EtOAc를 적가하고, 용액을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 그 다음, 0.86 ㎖의 H2O, 0.86 ㎖의 20% NaOH 수용액 및 2.58 ㎖의 H2O를 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, Na2SO4로 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하여, EtOAc로 세척하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄/트리에틸아민)에 의해 정제하여, 4(5.98 g, 96%)를 거품상 고체로 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.74 (s, 6 H) 4.08 (s, 2 H) 4.50 (d, J=6.06 Hz, 2 H) 4.55 (s, 2 H) 4.55 (s, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.18 (t, J=5.81 Hz, 1 H) 6.93 (d, J=8.59 Hz, 4 H) 6.97 (d, J=1.01 Hz, 1 H) 7.01 - 7.06 (m, 1 H) 7.21 - 7.28 (m, 4 H) 7.28 - 7.33 (m, 5 H) 7.33 - 7.40 (m, 4 H) 7.41 - 7.46 (m, 2 H) 7.80 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.83 (d, J=8.08 Hz, 1 H). MS (ESI+) m/z: C44H40O6에 대한 계산치: 664.3; 실측치: 665.3 [MH+].
Figure pct00146
디메틸아미노피리딘(0.37 g, 3.01 mmol)을 실온에서 아르곤하에 피리딘(15 ㎖) 중 화합물 4(2.00 g, 3.01 mmol)의 용액에 첨가하였다. 석신산 무수물 7(0.60 g, 6.02 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 1 ㎖의 H2O를 첨가하고, 용액을 1시간 동안 교반하였다. 100 ㎖의 CH2Cl2를 첨가하고, 용액을 50 ㎖의 차가운 10% 시트르산 수용액으로 1회 세척하고, 각각 50 ㎖의 물로 2회 세척하였다. 수성 분획을 50 ㎖의 CH2Cl2로 1회 재추출하였다. 합한 유기 분획을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시키고, 톨루엔을 사용하여 2회 희석/농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민)(39:1/1%)에 의해 정제하여, 6(2.48 g, 95%)을 오일로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.17 (t, J=7.33 Hz, 14.2 H) 2.56 (t, J=6.69 Hz, 2 H) 2.68 (t, J=7.45 Hz, 2 H) 2.84 (q, J=7.33 Hz, 9.5 H) 3.80 (s, 6 H) 4.16 (s, 2 H) 4.57 (s, 2 H) 4.58 (s, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 6.82 - 6.88 (m, 4 H) 7.01 - 7.05 (m, 1 H) 7.09 (s, 1 H) 7.18 (s, 1 H) 7.19 - 7.25 (m, 1 H) 7.28 - 7.34 (m, 5 H) 7.34 - 7.38 (m, 2 H) 7.39 - 7.44 (m, 4 H) 7.49 - 7.55 (m, 2 H) 7.68 (dd, J=7.96, 4.42 Hz, 2 H)
2.M . X097 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00147
반응식 1: 6의 합성의 개요.
Figure pct00148
(3-(( 비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시 ) 메틸 )-5- 브로모페닐 )메탄올(2):
피리딘(60 ㎖) 중 5-브로모-1,3-디하이드록시메틸 벤젠 1(3.00 g, 13.8 mmol), 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(4.68 g, 13.8 mmol)의 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. EtOAc 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여, 5 내지 30% EtOAc/헵탄 중 1% Et3N로 용리시켜, 2.57 g(36%)의 2를 제공하였다. MS (ESI+) m/z: C29H27BrO4에 대한 계산치: 518.1; 실측치: 303.5 [DMT]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 - 7.48 (m, 2H), 7.47 - 7.37 (m, 6H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 7.27 - 7.21 (m, 2H), 6.87 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 4.67 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.82 (s, 6H), 1.67 (t, J = 6.0 Hz, 1H).
Figure pct00149
(3'-( 벤질옥시 )-5-(( 비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시 ) 메틸 )-[1,1'-비페닐]-3-일)메탄올(4):
질소 분위기하에서 1,4-디옥산(6 ㎖) 중 브로마이드 2(0.50 g, 0.963 mmol), 3-벤질옥시벤젠 보론산 3(0.263 g, 1.155 mmol) 및 Pd(PPh3)4(0.111 g, 0.096 mmol)의 혼합물에, 2M Na2CO3 수용액(1.44 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 환류하에 하룻밤 가열하였다. 그 다음, 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc와 NaHCO3 포화 수용액 사이에 분배하였다. 유기층을 증발시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여, 5 내지 30% EtOAc/헵탄 중 1% Et3N으로 용리시켜, 0.454 g(70%)의 4를 제공하였다. MS (ESI+) m/z: C42H38O5에 대한 계산치: 622.3; 실측치: 303.5 [DMT]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.52 - 7.43 (m, 5H), 7.41 - 7.29 (m, 12H), 7.27 - 7.16 (m, 3H), 7.01 (m, 1H), 6.95 - 6.86 (m, 4H), 5.18 (s, 2H), 5.07 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 4.18 (s, 2H), 3.74 (s, 6H).
Figure pct00150
5 ㎖의 무수 피리딘 중 452 ㎎(0.726 mmol)의 4 및 89 ㎎(0.726 mmol)의 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에, 아르곤하에서 145 ㎎(1.45 mmol)의 석신산 무수물(5)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 0.5 ㎖의 물을 첨가하였다. 교반을 30분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 100 ㎖의 디클로로메탄으로 희석하고, 50 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액 및 물(2 × 50 ㎖)로 세척하였다. 수층을 50 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류 오일을 톨루엔을 사용하여 2회 동시증발시키고, 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 94:5:1)에 의해 정제하여, 510 ㎎(0.619 mmol, 85%)의 6을 무색의 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.22 (t, J=7.3 Hz, 9 H), 2.57 - 2.59 (m, 2 H), 2.67 - 2.69 (m, 2 H), 2.97 (q, J=7.3 Hz, 6 H), 3.79 (s, 6 H), 4.24 (s, 2 H), 5.14 (s, 2 H), 5.18 (s, 2 H), 5.72 (s br., 1 H), 6.84 - 6.88 (m, 4 H), 6.98 (ddd, J = 0.7, 2.2, 8.2 Hz, 1 H), 7.19 - 7.54 (m, 20 H).
2.N . X098 석시네이트 에스테르의 합성
Figure pct00151
반응식 1: 6의 합성의 개요
Figure pct00152
(3-(( 비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시 ) 메틸 )-5- 브로모페닐 )메탄올(2):
상기와 동일
피리딘(60 ㎖) 중 5-브로모-1,3-디하이드록시메틸 벤젠 1(3.00 g, 13.8 mmol), 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(4.68 g, 13.8 mmol)의 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. EtOAc 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여, 5 내지 30% EtOAc/헵탄 중 1% Et3N으로 용리시켜, 2.57 g(36%)의 2를 제공하였다. MS (ESI+) m/z: C29H27BrO4에 대한 계산치: 518.1; 실측치: 303.5 [DMT]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 - 7.48 (m, 2H), 7.47 - 7.37 (m, 6H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 7.27 - 7.21 (m, 2H), 6.87 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 4.67 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.82 (s, 6H), 1.67 (t, J = 6.0 Hz, 1H).
Figure pct00153
(5-(( 비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시 ) 메틸 )-[1,1'-비페닐]-3-일)메탄올(4):
1,4-디옥산(6 ㎖) 중 브로마이드 2(0.500 g, 0.960 mmol), 벤젠 보론산 3(0.141 g, 1.16 mmol) 및 Pd(PPh3)4(0.111 g, 0.096 mmol)의 혼합물에, 질소 분위기하에 2M Na2CO3 수용액(1.44 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 환류하에 하룻밤 가열하였다. 그 다음, 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc와 NaHCO3 포화 수용액 사이에 분배하였다. 유기층을 증발시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여, 5 내지 30% EtOAc/헵탄 중 1% Et3N으로 용리시켜, 0.380 g(76%)의 4를 제공하였다. MS (ESI+) m/z: C35H32O4에 대한 계산치: 516.2; 실측치: 303.5 [DMT]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.61 (dd, J = 8.3, 1.3 Hz, 2H), 7.51 - 7.42 (m, 5H), 7.39 - 7.28 (m, 9H), 7.27 - 7.20 (m, 1H), 6.95 - 6.86 (m, 4H), 5.08 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 4.19 (s, 2H), 3.74 (s, 6H).
Figure pct00154
5 ㎖의 무수 피리딘 중 380 ㎎(0.736 mmol)의 4 및 90 ㎎(0.736 mmol)의 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에, 아르곤하에 147 ㎎(1.47 mmol)의 석신산 무수물(5)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 0.5 ㎖의 물을 첨가하였다. 교반을 30분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 100 ㎖의 디클로로메탄으로 희석하고, 50 ㎖의 빙냉 10% 시트르산 수용액 및 물(2 × 50 ㎖)로 세척하였다. 수층을 50 ㎖의 디클로로메탄으로 재추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류 오일을 톨루엔을 사용하여 2회 동시증발시키고, 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올/트리에틸아민 94:5:1)에 의해 정제하여, 460 ㎎(0.641 mmol, 87%)의 6을 회백색 폼으로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.22 (t, J=7.2 Hz, 9 H), 2.59 (t, J=7.1 Hz, 2 H), 2.71 (t, J=7.1 Hz, 2 H), 2.94 (q, J=7.2 Hz, 6 H), 3.81 (s, 6 H), 4.26 (s, 2 H), 5.20 (s, 2 H), 6.04 (s br., 1 H), 6.85 - 6.89 (m, 4 H), 7.22 - 7.55 (m, 15 H), 7.62 (d, J = 7.9 Hz, 2 H).
2.O . X109와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
ss-siRNA = 컨쥬게이션에 사용된 안티센스 단일 가닥 서열 = U002pUpApApU004pU004pApU004pCpU004pApU004pU004pCpCpGpU005pA005pC027
여기서, C027은 리비톨이다.
Figure pct00155
반응식 1: 3의 합성의 개요
Figure pct00156
DCE(4 ㎖) 중 1(100 ㎎, 0.361 mmol), N-하이드록시석신이미드(83 ㎎, 0.721 mmol) 및 DCC(149 ㎎, 0.721 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액(4 ㎖)으로 켄칭시켰다. 유기층을 수층으로부터 분리하고, 물(1 ㎖) 및 염수(1 ㎖)로 세척하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 메탄올로부터의 재결정화에 의해 정제하여, 2(27.7 ㎎, 0.074 mmol)를 21% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 375.4; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 2.85 (d, J=5.52 Hz, 4 H) 2.89 (s, 3 H) 3.94 (s, 2 H) 7.31 - 7.48 (m, 4 H) 7.49 - 7.64 (m, 3 H) 7.71 (t, J=6.78 Hz, 1 H) 8.12 (br. s., 1 H).
Figure pct00157
DMSO(73.2 ㎕) 중 2(2.23 ㎎, 5.96 μmol)에, 신선하게 제조된 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(3.66 ㎎, 73.2 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.596 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에 30분 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 5 내지 60% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 3(1.09 ㎎, 0.164 μmol)을 27.5% 수율로 제공하였다. TOF MS (ES-): 6403.
2.P . X110과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00158
반응식 2: 4의 합성의 개요.
Figure pct00159
메탄올(15 ㎖) 중 1(500 ㎎, 1.40 mmol), Pd(탄소상 30%, 24.9 ㎎, 0.070 mmol) 및 아세트산(80 ㎕, 1.40 mmol)의 혼합물을 H2(1 atm)하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여, Pd/C를 제거하였다. 용액에 1M NaOH 수용액(3 ㎖)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 1M HCl 수용액을 사용하여 중화시켜, 침전물을 형성하였다. 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, 오븐에서 건조시켜 2(166 ㎎, 0.63 mmol)를 45% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 264.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.58 (s, 2 H) 7.18 - 7.39 (m, 3 H) 7.44 - 7.65 (m, 4 H) 7.75 (ddd, J=8.28, 6.78, 1.51 Hz, 1 H) 8.01 - 8.20 (m, 1 H) 8.91 (s, 1 H) 12.47 (s, 1 H).
Figure pct00160
DCM(4 ㎖) 중 2(87.6 ㎎, 0.333 mmol), N-하이드록시석신이미드(77.0 ㎎, 0.665 mmol) 및 DCC(137 ㎎, 0.665 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액(4 ㎖)으로 켄칭하였다. 유기층을 수층으로부터 분리하고, 물(1 ㎖) 및 염수(1 ㎖)로 세척하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 메탄올로부터의 재결정화에 의해 정제하여, 3(27.7 ㎎, 0.074 mmol)을 49% 수율로 제공하였다. ESI MS(m/z, MH+): 361.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 2.79 (br. s., 4 H) 4.05 (s, 2 H) 7.29 - 7.37 (m, 2 H) 7.40 (s, 1 H) 7.50 - 7.64 (m, 4 H) 7.80 (s, 1 H) 8.10 (s, 1 H) 9.02 (s, 1 H).
Figure pct00161
DMSO(240 ㎕) 중 3(1.76 ㎎, 4.88 μmol)에, 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2 ㎎, 40 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 30분 동안 정치시켰다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 5 내지 60% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 4(0.526 ㎎, 0.082 μmol)를 25% 수율로 제공하였다. TOF MS (ES-): 6388.
2. Q. X111과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
1은 상용이지만, 합성은 문헌에 알려져 있지 않다.
Figure pct00162
반응식 3: 3의 합성의 개요
Figure pct00163
DCM(4 ㎖) 중 1(81 ㎎, 0.308 mmol), N-하이드록시석신이미드(70.8 ㎎, 0.615 mmol) 및 DCC(127 ㎎, 0.615 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액(4 ㎖)으로 켄칭시켰다. 유기층을 수층으로부터 분리하고, 물(1 ㎖) 및 염수(1 ㎖)로 세척하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 메탄올로부터의 재결정화에 의해 정제하여, 2(43.7 ㎎, 0.121 mmol)를 39% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 361.4. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ ppm 2.82 (s, 4 H) 4.07 (s, 2 H) 7.36 - 7.42 (m, 2 H) 7.46 - 7.51 (m, 1 H) 7.55 - 7.64 (m, 3 H) 7.70 - 7.77 (m, 2 H) 8.20 (dt, J=4.52, 2.26 Hz, 1 H) 9.29 (s, 1 H).
DMSO(240 ㎕) 중 2(2.35 ㎎, 6.51 μmol)에, 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고 실온에서 30분 동안 정치시켰다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 5 내지 60% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 3(0.68 ㎎, 0.082 μmol)을 33% 수율로 제공하였다. TOF MS (ES-): 6390.
2.R . X112와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00165
반응식 4: 3의 합성의 개요.
Figure pct00166
DMF(4 ㎖) 중 1(100 ㎎, 0.325 mmol), tert-부틸클로로디메틸실란(108 ㎎, 0.716 mmol) 및 이미다졸(91 ㎎, 1.33 mmol)의 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(4 ㎖)로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 5 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 50% 에틸 아세테이트/헵탄을 사용한 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하여, 2(55 ㎎, 0.13 mmol)를 40% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 422.2. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.04 (m, 6 H) 0.88 - 0.93 (m, 9 H) 3.59 (t, J=6.78 Hz, 2 H) 3.71 (s, 2 H) 4.09 (t, J=6.78 Hz, 2 H) 7.28 - 7.45 (m, 4 H) 7.51 - 7.61 (m, 3 H) 7.63 - 7.68 (m, 1 H) 9.00 (s, 1 H).
Figure pct00167
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.73 ㎎, 0.024 mmol), 2(5.0 ㎎, 0.012 mmol) 및 DIC(2 ㎎, 0.325 μmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에, 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2.19 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.356 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 3(0.79 ㎎, 0.123 μmol)을 35% 수율로 제공하였다. TOF MS (ES-): 6435.
2.S . X113과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
1은 상용이며, 합성은 문헌에 알려져 있다. Zhang, Yan et al.의 PCT 국제 특허 출원 제2010083384호, 2010년 7월 22일로부터의 문헌.
Figure pct00168
반응식 5: 2의 합성의 개요.
Figure pct00169
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(6.18 ㎎, 0.054 mmol), 1(5.0 ㎎, 0.027 mmol) 및 DIC(6.77 ㎎, 0.054 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에, 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2.46 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.401 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2(0.24 ㎎, 0.038 μmol)를 10% 수율로 제공하였다. TOF MS (ES-): 6315.
2. S. 1. PAZ 리간드 석시네이트로의 , 조절 공극 유리 지지체의 고밀도 로딩을 위한 일반 절차
Figure pct00170
삼각 플라스크에서, 1.00 mmol의 PAZ 리간드 석시네이트 염 1을 아르곤하에 50 ㎖의 무수 아세토니트릴 중에 용해시켰다. 이러한 용액에, 353 ㎎(1.10 mmol)의 O-(1H-벤조-1,2,3-트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU)를 첨가하고, 용액을 10분 동안 진탕시켰다. 그 다음, 10 g의 장쇄 알킬아민 조절 공극 유리(LCAA/CNA-600-CPG, PrimeSynthesis, 2)를 첨가하고, 반응 혼합물을 5분 동안 온건하게 교반하였다. 마지막으로, 0.685 ㎖(517 ㎎, 4.00 mmol)의 후니그 염기를 첨가하고, 플라스크를 오비탈 진탕기에서 24시간 동안 온건하게 진탕시켰다. CPG의 분취물을 데트리틸화시킴으로써 로딩 밀도를 평가하였다(3 내지 5 ㎎의 CPG를 아세토니트릴로 세척하고, 진공하에 건조시키고, 디클로로메탄 중 3%(v/v) 디클로로아세트산 25 ㎖에 첨가하고, 504 ㎚에서 흡광도를 결정함). 로딩 밀도가 요망되는 범위(60 내지 90 마이크로몰/g)에 있으면, CPG를 여과해내고, 아세토니트릴로 광범위하게 세척하였다. CPG를 각각의 아세트산 무수물/2,6-루티딘/THF 1:1:8(v/v/v)의 혼합물 및 1-메틸이미다졸/THF 16:84(v/v) 용액 x ㎖로 처리함으로써 비유도체화된 아미노기를 캡핑하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 온건하게 진탕시켰다. 그 다음, CPG를 여과해내고, 아세토니트릴로 세척하고, 진공하에 하룻밤 건조시켰다. 로딩 밀도를 상기와 같이 다시 결정하였다. 실시예 1 내지 6에서 석시네이트에 대한 로딩 수율은 64 내지 75 마이크로몰/g의 범위 내였다.
2. T. X1011과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00171
반응식 1: 2의 합성의 개요.
Figure pct00172
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.489 ㎎, 0.022 mmol), 1(3.0 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2.00 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6418.
2. U. X1012 및 X1018과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00173
반응식 2: 3의 합성의 개요.
Figure pct00174
메탄올(15 ㎖) 중 1(500 ㎎, 1.40 mmol), Pd(탄소상 30%, 24.9 ㎎, 0.070 mmol) 및 아세트산(80 ㎕, 1.40 mmol)의 혼합물을 실온에서 H2(1 atm) 하에 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여, Pd/C를 제거하였다. 용액에 1M NaOH 수용액(3 ㎖)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 1M HCl 수용액으로 중화시켜, 침전물을 형성하였다. 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, 오븐에서 건조시켜, 2(166 ㎎, 0.63 mmol)를 45% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 264.4. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 3.58 (s, 2 H) 7.18 - 7.39 (m, 3 H) 7.44 - 7.65 (m, 4 H) 7.75 (ddd, J=8.28, 6.78, 1.51 Hz, 1 H) 8.01 - 8.20 (m, 1 H) 8.91 (s, 1 H) 12.47 (s, 1 H).
Figure pct00175
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.489 ㎎, 0.022 mmol), 2(2.85 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2.00 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 3을 제공하였다. ESI MS (ES+): 6405.
2. U. X1018과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00176
반응식 3: 4의 합성의 개요
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.483 ㎎, 0.022 mmol), 2(2.84 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.72 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)5-NH2 용액(2.00 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 4를 제공하였다.
2. V. X1013과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00177
반응식 4: 2의 합성의 개요.
Figure pct00178
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.489 ㎎, 0.022 mmol), 2(2.85 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2.00 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6404.
2.W . X1019와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00179
반응식 5: 3의 합성의 개요.
Figure pct00180
DMF(4 ㎖) 중 1(100 ㎎, 0.325 mmol), tert-부틸클로로디메틸실란(108 ㎎, 0.716 mmol) 및 이미다졸(91 ㎎, 1.33 mmol)의 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(4 ㎖)로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 5 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 50% 에틸 아세테이트/헵탄을 사용한 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하여, 2(55 ㎎, 0.13 mmol)를 40% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 422.2. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.04 (m, 6 H) 0.88 - 0.93 (m, 9 H) 3.59 (t, J=6.78 Hz, 2 H) 3.71 (s, 2 H) 4.09 (t, J=6.78 Hz, 2 H) 7.28 - 7.45 (m, 4 H) 7.51 - 7.61 (m, 3 H) 7.63 - 7.68 (m, 1 H) 9.00 (s, 1 H).
Figure pct00181
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.48 ㎎, 0.022 mmol), 2(4.55 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.72 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.324 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 3을 제공하였다. TOF MS (ES-): 6462.
2. X. X1015와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00182
반응식 6: 2의 합성의 개요.
Figure pct00183
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 1(2.02 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6327.
2.Y . X1020과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00184
반응식 7: 2의 합성의 개요.
Figure pct00185
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.48 ㎎, 0.022 mmol), 1(2.02 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.72 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)5-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.324 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6341.
2. Z. X1009와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00186
반응식 7: 8의 합성의 개요.
Figure pct00187
AlCl3(1.19 g, 8.93 mmol, 40 ㎖ 톨루엔 용액)에 N2하에, 4-메톡시아닐린(1 g, 8.12 mmol, 10 ㎖ 톨루엔 용액)을 적가하였다. BCl3(8.12 ㎖, 8.12 mmol, CH2Cl2 중 1 M 용액) 및 벤조니트릴(2.51 g, 24.36 mmol)을 이후에 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 110℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여기에 HCl 수용액(1 M, 13 ㎖)을 첨가하였다. 그 다음, 용액을 80℃에서 1시간 동안 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 50 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 40% 에틸 아세테이트/헵탄을 사용한 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하여, 1(273 ㎎, 1.2 mmol)을 15% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 227.3. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 3.66 (s, 3 H) 6.80 (d, J=8.84 Hz, 1 H) 6.93 - 7.05 (m, 2 H) 7.40 - 7.49 (m, 2 H) 7.49 - 7.58 (m, 1 H) 7.63 - 7.72 (m, 2 H).
Figure pct00188
DCM(10 ㎖) 중 1(269 ㎎, 1.18 mmol) 및 에틸 4-클로로-4-옥소부타노에이트(214 ㎎, 1.3 mmol)의 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 1 M NaOH 수용액(5 ㎖)으로 켄칭하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(3 × 5 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 60% 에틸 아세테이트/헵탄을 사용한 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하여, 2(305 ㎎, 0.86 mmol)를 73% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 355.5. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.26 (t, J=7.28 Hz, 3 H) 2.74 (s, 4 H) 3.77 (s, 3 H) 4.16 (q, J=7.03 Hz, 2 H) 7.06 (d, J=3.01 Hz, 1 H) 7.14 (dd, J=9.03, 3.01 Hz, 1 H) 7.48 - 7.55 (m, 2 H) 7.60 - 7.66 (m, 1 H) 7.73 - 7.79 (m, 2 H) 8.50 (d, J=9.03 Hz, 1 H) 10.45 (br. s., 1 H).
Figure pct00189
에탄올(10 ㎖) 중 2(305 ㎎, 0.86 mmol) 및 수소화나트륨(343 ㎎, 8.58 mmol)의 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(5 ㎖)로 켄칭한 다음, 1 M HCl 수용액(2 ㎖)으로 중화하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트(3 × 10 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하여, 3(250 ㎎, 0.81 mmol)을 94% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 309.3. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ ppm 3.38 (s, 2 H) 3.63 (s, 3 H) 6.51 (d, J=2.51 Hz, 1 H) 7.20 (dd, J=9.03, 3.01 Hz, 1 H) 7.28 - 7.47 (m, 3 H) 7.52 - 7.63 (m, 3 H).
Figure pct00190
POCl3(10 ㎖) 중 3(250 ㎎, 0.81 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. POCl3를 진공하에 제거하고, 생성된 잔류물을 에탄올(20 ㎖)로 켄칭하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 에탄올을 진공하에 제거하였다. 잔류물에 디클로로메탄(30 ㎖) 및 1 M NaOH 수용액(20 ㎖)을 첨가하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(2 × 20 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 4(270 ㎎, 0.8 mmol)를 99% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 338.2. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.23 - 1.27 (m, 3 H) 3.48 (s, 2 H) 3.66 (s, 3 H) 4.04 - 4.22 (m, 2 H) 6.55 (d, J=2.51 Hz, 1 H) 7.09 - 7.15 (m, 1 H) 7.24 (d, J=9.03 Hz, 1 H) 7.29 - 7.34 (m, 2 H) 7.44 - 7.64 (m, 3 H) 10.49 (br. s., 1 H).
Figure pct00191
POCl3(10 ㎖) 중 4(270 ㎎, 0.8 mmol)의 용액을 110℃에서 12시간 동안 가열하였다. POCl3를 진공하에 제거하였다. 잔류물에 디클로로메탄(20 ㎖) 및 1 M NaOH 수용액(20 ㎖)을 첨가하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(2 × 20 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 5(265 ㎎, 0.75 mmol)를 92% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 356.1. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.22 - 1.27 (m, 3 H) 3.70 (s, 5 H) 4.17 (q, J=7.03 Hz, 2 H) 6.62 (d, J=3.01 Hz, 1 H) 7.20 - 7.34 (m, 2 H) 7.38 (dd, J=9.03, 2.51 Hz, 1 H) 7.46 - 7.63 (m, 3 H) 8.01 (d, J=9.03 Hz, 1 H).
Figure pct00192
에탄올(20 ㎖) 중 5(265 ㎎, 0.745 mmol), 트리에틸아민(1.28 g, 12.66 mmol) 및 Pd/C(10%, 79 ㎎, 0.745 mmol)의 혼합물을 실온에서 H2(1 atm)하에 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 Pd/C를 제거하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 6(182 ㎎, 0.57 mmol)을 76% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 322.1. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.12 (t, J=7.15 Hz, 3 H) 3.51 (s, 2 H) 3.62 (s, 3 H) 4.01 (q, J=7.19 Hz, 2 H) 6.61 (d, J=2.76 Hz, 1 H) 7.18 - 7.31 (m, 3 H) 7.39 - 7.50 (m, 3 H) 7.97 (d, J=9.29 Hz, 1 H) 8.68 (s, 1 H).
Figure pct00193
디옥산(1 ㎖) 중 6(50 ㎎, 0.16 mmol), 1 M LiOH 수용액(0.17 ㎖, 0.17 mmol)의 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물로부터의 침전물을 여과하고 건조시켜, 7(32 ㎎, 0.107 mmol)을 리튬 염으로서 69% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 294.2. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ ppm 3.48 (s, 2 H) 3.63 - 3.73 (m, 3 H) 6.75 (d, J=2.51 Hz, 1 H) 7.28 - 7.43 (m, 3 H) 7.48 - 7.64 (m, 3 H) 7.94 (d, J=9.03 Hz, 1 H) 8.73 (s, 1 H).
Figure pct00194
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 7(3.18 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.74 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 8을 제공하였다. TOF MS (ES-): 6422.
2. AA. X1016과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00195
반응식 8: 9의 합성의 개요.
Figure pct00196
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 7(3.18 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.74 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 9를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6434.
2. BB. X1021과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00197
반응식 9: 10의 합성의 개요.
Figure pct00198
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.48 ㎎, 0.022 mmol), 7(3.16 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.72 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)5-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 10을 제공하였다. TOF MS (ES-): 6448.
2. CC. X1010과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00199
반응식 10: 10의 합성의 개요.
Figure pct00200
BCl3(10.74 ㎖, 10.74 mmol, CH2Cl2 중 1 M 용액)에 N2하에 아닐린(1 g, 10.74 mmol, 10 ㎖ 톨루엔 용액)를 적가하였다. 3-메톡시벤조니트릴(4.29 g, 32.2 mmol) 및 AlCl3(1.575 g, 11.81 mmol, 40 ㎖ 톨루엔 용액)를 이후에 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 110℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여기에 HCl 수용액(1 M, 13 ㎖)을 첨가하였다. 그 다음, 용액을 80℃에서 1시간 동안 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트(3 × 50 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 40% 에틸 아세테이트/헵탄을 사용한 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하여, 1(875 ㎎, 3.85 mmol)을 36% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 227.9. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 3.74 (s, 3 H) 6.00 (br. s., 2 H) 6.44 - 6.56 (m, 1 H) 6.63 (dd, J=8.53, 1.00 Hz, 1 H) 6.93 - 7.00 (m, 1 H) 7.04 - 7.11 (m, 2 H) 7.14 - 7.31 (m, 2 H) 7.37 (dd, J=8.03, 1.51 Hz, 1 H).
Figure pct00201
DCM(20 ㎖) 중 1(570 ㎎, 2.51 mmol) 및 에틸 4-클로로-4-옥소부타노에이트(454 ㎎, 2.76 mmol)의 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 1 M NaOH 수용액(5 ㎖)으로 켄칭시켰다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(3 × 15 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하여, 2(824 ㎎, 2.32 mmol)를 92% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 355.4. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.25 - 1.48 (m, 3 H) 2.73 - 3.01 (m, 4 H) 3.88 (s, 3 H) 4.18 (q, J=7.07 Hz, 2 H) 7.05 - 7.20 (m, 2 H) 7.22 - 7.30 (m, 2 H) 7.37 - 7.45 (m, 1 H) 7.53 - 7.64 (m, 2 H) 8.64 (d, J=8.59 Hz, 1 H) 10.90 (br. s., 1 H).
Figure pct00202
에탄올(20 ㎖) 중 2(824 ㎎, 2.32 mmol) 및 수소화나트륨(927 ㎎, 23.19 mmol)의 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(5 ㎖)로 켄칭한 다음, 1 M HCl 수용액(2 ㎖)으로 중화시켰다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트(3 × 10 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하여, 3(583 ㎎, 0.81 mmol)을 81% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 310.1. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 3.49 - 3.64 (m, 2 H) 3.83 - 3.89 (m, 3 H) 6.83 - 6.96 (m, 2 H) 7.00 - 7.28 (m, 4 H) 7.37 - 7.56 (m, 4 H) 12.02 - 12.32 (m, 2 H).
Figure pct00203
POCl3(10 ㎖) 중 3(583 ㎎, 1.89 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. POCl3를 진공하에 제거하고, 생성된 잔류물을 에탄올(20 ㎖)로 켄칭하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 에탄올을 진공하에 제거하였다. 잔류물에 디클로로메탄(30 ㎖) 및 1 M NaOH 수용액(20 ㎖)을 첨가하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(2 × 20 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 4(760 ㎎, 2.25 mmol)를 120% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 338.1. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.26 (t, J=7.07 Hz, 3 H) 3.44 - 3.64 (m, 2 H) 3.85 (s, 3 H) 4.17 (q, J=7.16 Hz, 2 H) 6.85 - 6.93 (m, 2 H) 7.03 (ddd, J=8.46, 2.65, 1.01 Hz, 1 H) 7.11 (ddd, J=8.21, 6.95, 1.01 Hz, 1 H) 7.17 (dd, J=8.21, 1.39 Hz, 1 H) 7.32 - 7.39 (m, 1 H) 7.40 - 7.52 (m, 2 H) 11.43 (br. s., 1 H)
Figure pct00204
POCl3(10 ㎖) 중 4(760 ㎎, 2.25 mmol)의 용액을 110℃에서 12시간 동안 가열하였다. POCl3를 진공하에 제거하였다. 잔류물에 디클로로메탄(20 ㎖) 및 1 M NaOH 수용액(20 ㎖)을 첨가하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(2 × 20 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 5(650 ㎎, 1.83 mmol)를 97% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 355.4. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.25 (t, J=7.28 Hz, 3 H) 3.75 (d, J=1.00 Hz, 2 H) 3.85 (s, 3 H) 4.18 (q, J=7.03 Hz, 2 H) 6.78 - 6.92 (m, 2 H) 6.97 - 7.13 (m, 1 H) 7.39 - 7.60 (m, 3 H) 7.76 (d, J=2.01 Hz, 1 H) 8.15 (d, J=8.53 Hz, 1 H).
Figure pct00205
에탄올(20 ㎖) 중 5(650 ㎎, 1.83 mmol), 트리에틸아민(3.14 g, 31.1 mmol) 및 Pd/C(10%, 194 ㎎, 1.827 mmol)의 혼합물을 실온에서 H2(1 atm)하에 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여, Pd/C를 제거하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 6(460 ㎎, 1.43 mmol)을 78% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 321.5. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.20 - 1.26 (m, 3 H) 1.44 (t, J=7.53 Hz, 9 H) 3.12 (qd, J=7.28, 4.77 Hz, 6 H) 3.65 (s, 2 H) 3.79 - 3.93 (m, 3 H) 4.12 (q, J=7.19 Hz, 2 H) 6.82 - 6.92 (m, 2 H) 7.06 (ddd, J=8.53, 2.51, 1.00 Hz, 1 H) 7.39 - 7.58 (m, 3 H) 7.72 (ddd, J=8.41, 6.65, 1.51 Hz, 1 H) 8.19 (d, J=8.53 Hz, 1 H) 8.93 (s, 1 H) 12.20 (br. s., 3 H).
Figure pct00206
-78℃에서 DCM(15 ㎖) 중 6(400 ㎎, 1.245 mmol)의 용액에 BBr3(DCM 중 1 M, 3.73 ㎖, 3.73 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 내에 실온으로 가온하였다. 혼합물을 -78℃로 냉각시키고, 에탄올로 켄칭하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물에 에틸 아세테이트(15 ㎖) 및 물(15 ㎖)을 첨가하였다. 유기 및 수층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 15 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제물을 디클로로메탄으로부터의 재결정화에 의해 정제하여, 7(282 ㎎, 0.92 mmol)을 74% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 308.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.11 (t, J=7.03 Hz, 3 H) 3.68 (s, 2 H) 3.91 - 4.11 (m, 2 H) 6.50 - 6.70 (m, 2 H) 6.81 - 6.97 (m, 1 H) 7.30 - 7.48 (m, 2 H) 7.51 - 7.63 (m, 1 H) 7.78 (ddd, J=8.53, 7.03, 1.51 Hz, 1 H) 8.08 (d, J=8.03 Hz, 1 H) 8.93 (s, 1 H) 9.75 (br. s., 1 H).
Figure pct00207
DMF(500 ㎕) 중 7(20 ㎎, 0.065 mmol), 브롬화벤질(16.69 ㎎, 0.098 mmol) 및 탄산세슘(42.4 ㎎, 0.13 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 미정제 생성물을 5 내지 95% 아세토니트릴/수 중 5% NH4OH를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 8(6.9 ㎎, 0.017 mmol)을 26.7% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 398.3. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.22 (t, J=7.03 Hz, 3 H) 3.64 (s, 2 H) 4.12 (q, J=7.03 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 6.76 - 7.02 (m, 2 H) 7.13 (ddd, J=8.53, 2.51, 1.00 Hz, 1 H) 7.31 - 7.56 (m, 8 H) 7.71 (ddd, J=8.28, 6.78, 2.01 Hz, 1 H) 8.17 (d, J=8.53 Hz, 1 H) 8.92 (s, 1 H).
Figure pct00208
디옥산(0.5 ㎖) 중 8(6.9 ㎎, 0.017 mmol), 1 M LiOH 수용액(0.019 ㎖, 0.019 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 9(6 ㎎, 0.016 mmol)를 리튬 염으로서 92% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 370.2. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ ppm 3.42 - 3.60 (m, 2 H) 5.07 - 5.19 (m, 2 H) 6.94 (dt, J=7.53, 1.25 Hz, 1 H) 7.06 (dd, J=2.51, 1.51 Hz, 1 H) 7.14 (ddd, J=8.53, 2.51, 1.00 Hz, 1 H) 7.25 - 7.42 (m, 3 H) 7.42 - 7.53 (m, 2 H) 7.70 (ddd, J=8.41, 4.64, 3.51 Hz, 2 H) 8.04 (d, J=8.03 Hz, 1 H) 8.56 (s, 2 H) 8.88 (s, 1 H).
Figure pct00209
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 9(4.08 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.74 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 10을 제공하였다. TOF MS (ES-): 6495.
2. DD . X1017과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00210
반응식 11: 11의 합성의 개요.
Figure pct00211
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 9(4.07 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 11을 제공하였다. TOF MS (ES-): 6510.
2. EE . X1022와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00212
반응식 12: 12의 합성의 개요.
Figure pct00213
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.48 ㎎, 0.022 mmol), 9(4.06 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.72 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)5-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 12를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6524.
2. FF. X1024와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00214
반응식 13: 2의 합성의 개요.
Figure pct00215
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.5 ㎎, 0.0522 mmol), 1(2.5 ㎎, 0.013 mmol) 및 DIC(2.74 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2.0 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6315.
2. GG . X1026과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00216
반응식 14: 2의 합성의 개요.
Figure pct00217
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 1(2.02 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6327.
2. HH . X1025와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00218
반응식 15: 2의 합성의 개요.
Figure pct00219
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 1(2.84 ㎎, 0.01 mmol) 및 DIC(2.74 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2.0 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6390.
2. II. X1027과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00220
반응식 16: 2의 합성의 개요.
Figure pct00221
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 1(2.84 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6404.
2. JJ . X1028과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00222
반응식 17: 2의 합성의 개요.
Figure pct00223
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.48 ㎎, 0.022 mmol), 1(2.90 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.72 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)5-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.324 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 2를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6417.
2.KK . X1062와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00224
반응식 1: 10의 합성의 개요.
Figure pct00225
톨루엔(200 ㎖) 중 AlCl3(7.88 g, 59.1 mmol)에 N2하에 아닐린(5g, 53.7 mmol, 4.59 ㎖, 50 ㎖ 톨루엔 중)을 적가하였다. 이후에 3-브로모벤조니트릴(29.3 g, 161 mmol)을 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 110℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여기에 HCl 수용액(1 M, 3 ㎖)을 첨가하였다. 그 다음, 용액을 80℃에서 1시간 동안 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각하고, 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 100 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 40% 에틸 아세테이트/헵탄을 사용한 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하여, 1(4.31 g, 15.6 mmol)을 29% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 278.1 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 6.16 (br. s., 2 H) 6.64 (t, J=7.53 Hz, 1 H) 6.76 (d, J=8.53 Hz, 1 H) 7.29 - 7.49 (m, 3 H) 7.56 (d, J=7.53 Hz, 1 H) 7.67 (d, J=8.03 Hz, 1 H) 7.74 - 7.84 (m, 1 H)
Figure pct00226
DCM(60 ㎖) 중 1(1.02 g, 3.69 mmol) 및 에틸 4-클로로-4-옥소부타노에이트(0.669 g, 4.06 mmol)의 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 1 M NaOH 수용액(15 ㎖)으로 켄칭하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(3 × 50 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하여, 2(1.44 g, 3.56 mmol)를 96% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 406.2. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 10.88 (s, 1H), 8.65 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.65 - 7.51 (m, 3H), 7.39 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 4.17 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.77 (dt, J = 10.3, 5.2 Hz, 4H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 4H).
Figure pct00227
에탄올(20 ㎖) 중 2(1.44 g, 3.56 mmol) 및 수소화나트륨(1.425 g, 35.6 mmol)의 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 물(5 ㎖)로 켄칭한 다음, 1 M HCl 수용액(2 ㎖)으로 중화시켰다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 50 ㎖). 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 그 다음, 유기 용매를 진공하에 제거하여 3(1.2 g, 3.63 mmol)을 94% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 360.2. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 11.71 - 11.63 (m, 1H), 11.55 - 11.42 (m, 3H), 11.37 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 11.30 - 11.22 (m, 1H), 11.12 (td, J = 7.6, 7.0, 1.2 Hz, 1H), 11.00 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 4.87 - 4.82 (m, 2H).
Figure pct00228
POCl3(15 ㎖) 중 3(1.2 g, 1.89 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. POCl3를 진공하에 제거하고, 생성된 잔류물을 에탄올(50 ㎖)로 켄칭하였다. 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 에탄올을 진공하에 제거하였다. 잔류물에 디클로로메탄(50 ㎖) 및 1 M NaOH 수용액(20 ㎖)을 첨가하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(2 × 50 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 4(1.76 ㎎, 4.56 mmol)를 136% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 388.2. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.65 (dt, J = 8.2, 1.4 Hz, 1H), 7.54 - 7.46 (m, 2H), 7.45 - 7.37 (m, 2H), 7.27 (dt, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.17 - 7.04 (m, 2H), 4.18 - 4.16 (m, 2H), 3.50 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 1.27 (h, J = 3.7 Hz, 3H).
Figure pct00229
POCl3(10 ㎖) 중 4(1.76 g, 4.56 mmol)의 용액을 110℃에서 12시간 동안 가열하였다. POCl3를 진공하에 제거하였다. 잔류물에 디클로로메탄(50 ㎖) 및 1 M NaOH 수용액(20 ㎖)을 첨가하였다. 유기층 및 수층을 분리하였다. 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다(2 × 50 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하여, 5(440 ㎎, 1.09 mmol)를 32.5% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 406.0. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.14 - 8.05 (m, 1H), 7.76 (ddd, J = 8.4, 6.9, 1.4 Hz, 1H), 7.69 (ddd, J = 8.0, 1.9, 1.0 Hz, 1H), 7.53 - 7.41 (m, 3H), 7.36 (dd, J = 8.3, 1.3 Hz, 1H), 7.26 (dt, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 4.19 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.72 (s, 2H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
Figure pct00230
TFA(1 ㎖) 중 5(50 ㎎, 0.124 mmol), 아연 분말(40.4 ㎎, 0.618 mmol)의 혼합물을 40℃에서 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 NaOH(1 M, 1 ㎖)로 켄칭하였다. 유기층을 디클로로메탄으로 추출하였다(2 × 10 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 50% EtOAc/헵탄으로 용리시키는 실리카 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 6(39 ㎎, 0.105 mmol)을 85% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 372.1. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.24 (t, J=7.15 Hz, 3 H) 3.63 (s, 2 H) 4.02 - 4.27 (m, 2 H) 7.12 - 7.33 (m, 1 H) 7.37 - 7.61 (m, 4 H) 7.61 - 7.71 (m, 1 H) 7.75 (t, J=1.51 Hz, 1 H) 8.21 (d, J=8.53 Hz, 1 H) 8.94 (s, 1 H).
Figure pct00231
2-Me THF(500 ㎕) 및 DMF(500 ㎕) 중 4-(2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)에틸)-1,3-디옥솔란-2-온)(255 ㎎, 1.05 mmol), 6(39 ㎎, 0.105 mmol), (브렛포스)팔라듐(II) 페네틸아민 클로라이드(4.21 ㎎, 5.27 μmol) 및 1 M K3PO4 수용액(421 ㎕, 0.421 mmol)의 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제물을 5 내지 95% 아세토니트릴/수 중 5% TFA를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 7(15 ㎎, 0.04 mmol)을 37.5% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 380.4. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) ppm 1.22 (td, J=7.15, 2.26 Hz, 3 H) 1.73 - 1.92 (m, 2 H) 2.72 - 2.98 (m, 2 H) 3.49 (dd, J=11.04, 7.53 Hz, 1 H) 3.56 - 3.84 (m, 4 H) 4.04 - 4.20 (m, 2 H) 7.15 (d, J=7.53 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.37 (d, J=7.53 Hz, 1 H) 7.43 - 7.56 (m, 3 H) 7.74 (br. s., 1 H) 8.22 (br. s., 1 H) 8.94 (br. s., 1 H).
Figure pct00232
디옥산(200 ㎕) 중 7(15 ㎎, 0.04 mmol) 및 1 M LiOH 수용액(87 ㎕/㎖, 0.087 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하여 8(14.17 ㎎, 0.04 mmol)을 리튬 염으로서 100% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 352.4. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ ppm 1.62 - 1.80 (m, 1 H) 1.80 - 1.98 (m, 1 H) 2.78 (ddd, J=13.33, 6.76, 3.16 Hz, 1 H) 2.84 - 2.99 (m, 1 H) 3.46 - 3.55 (m, 3 H) 3.55 - 3.68 (m, 3 H) 6.98 - 7.25 (m, 2 H) 7.31 - 7.59 (m, 4 H) 7.74 (ddd, J=8.40, 6.38, 1.89 Hz, 1 H) 8.06 (d, J=8.34 Hz, 1 H) 8.86 (s, 1 H).
Figure pct00233
DMF(4 ㎖) 중 8(14 ㎎, 0.039 mmol), TBDMSCl 및 이미다졸(43.6 ㎎, 0.641 mmol)의 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(1 ㎖)로 켄칭하였다. 유기층을 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 × 5 ㎖). 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 생성물을 0 내지 50% EtOAc/헵탄으로 용리하는 실리카 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여, 9(15.9 ㎎, 0.025 mmol)를 63.2% 수율로 제공하였다. ESI MS (m/z, MH+): 580.6. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ ppm -0.12 - 0.13 (m, 8 H) 0.69 - 0.98 (m, 12 H) 1.17 - 1.36 (m, 5 H) 2.60 - 2.90 (m, 2 H) 3.38 - 3.62 (m, 6 H) 3.73 (d, J=4.55 Hz, 1 H) 7.02 - 7.15 (m, 2 H) 7.24 - 7.38 (m, 1 H) 7.39 - 7.47 (m, 3 H) 7.64 - 7.74 (m, 1 H) 7.98 - 8.06 (m, 1 H) 8.68 - 8.89 (m, 1 H).
Figure pct00234
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 9(6.26 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.74 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)3-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 10을 제공하였다. TOF MS (ES-): 6478.
2.LL. X1063과 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00235
반응식 2: 11의 합성의 개요.
Figure pct00236
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.49 ㎎, 0.022 mmol), 9(6.26 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.73 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)4-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여, 11을 제공하였다. TOF MS (ES-): 6492.
2.MM. X1064와 컨쥬게이트된 siRNA의 합성
Figure pct00237
반응식 3: 12의 합성의 개요.
Figure pct00238
DMSO(200 ㎕) 중 N-하이드록시석신이미드(2.48 ㎎, 0.022 mmol), 9(6.26 ㎎, 0.011 mmol) 및 DIC(2.72 ㎎, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 10 ㎕의 반응 혼합물을 190 ㎕의 DMSO로 희석하였다. 생성된 용액에 신선한 ss-siRNA-(CH2)5-NH2 용액(2 ㎎, 80 ㎕의 PBS 8.5 완충제 중 0.325 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 와류시키고, 실온에서 2시간 동안 정치하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/수 중 10 내지 40% 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용한 HPLC에 의해 정제하여 12를 제공하였다. TOF MS (ES-): 6506.
실시예 3. 시험관내 및 생체내 에서의 PAZ 리간드 컨쥬게이트 3' 말단 캡 활성 및 구조
PAZ 리간드 컨쥬게이트를 X-선 결정 및 NMR 구조 연구(데이터 미도시)에서 7-mer RNA 컨쥬게이트 구조의 일부로서 연구하였다.
또한, 다양한 3' 말단 캡을 포함하는 듀플렉스의 RNA 간섭 활성을 분석하고; 실시예 3A(시험관내 데이터) 및 실시예 3B(생체내 데이터)에 나타낸 바와 같이 시험관내 및 생체내 효력을 연구하였다.
실시예 3A. 3' 말단 캡(PAZ 리간드)을 포함하는 RNAi 작용제의 시험관내 효력
HAMP siRNA - PAZ 리간드 컨쥬게이트의 효력을 연구한다.
HuH-7 세포에서의 헵시딘 mRNA 하향 조절을 3가지 용량에서 연구한다.
2가지 시험 서열: hs_HAMP_400 및 402
모체 스템 형식: A106S42(2'-OMe 화학물질)
가이드(안티센스) 가닥 상의 19가지 PAZ 리간드 +/- 리비톨 스페이서, +/- MOE 클램프(여기서, MOE 클램프는 5'에서 3'으로 계수하여 각 가닥 상의 2개의 마지막 염기-쌍형성 뉴클레오티드 각각에서의 2'-MOE 변형임).
Huh-7 세포에서의 시험관내 용량-반응을 결정한다.
결과는 하기 도 5a 및 도 5b 및 도 7, 및 표 5에 나타나 있다.
도 5a 및 도 5b는 가이드(안티센스) 가닥 상에 하기의 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 RNAi 작용제에 의해 매개되는 시험관내 RNA 간섭 또는 KD(낙다운)를 보여준다: BP(비페닐), C6, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068 및 X069. 2개의 서열을 시험하였으며(hs_HAMP_400 및 _402), 여기서, 400은 인간 HAMP(헵시딘) 유전자의 위치 400에서 시작하는 서열이며, 402는 위치 402에서 시작하는 중첩 서열이다.
이들을 (Rib)와 함께 그리고 리비톨 스페이서 없이(-); (MOE)와 함께, 그리고 2'-MOE 클램프 없이(-) 시험하였다(도 6a 및 도 6b에 도시되어 있는 바와 같음). 다양한 hs_HAMP 400 및 402는 도 6a(가이드 또는 안티센스 가닥) 및 도 6b(상응하는 센스 가닥)에 도시되어 있다.
데이터는 도 5a 및 도 5b에 제공되어 있다. 도 4a 및 도 4b에서 원이 그려져 있는 데이터 점은 hs_HAMP_400에 대한 가장 강력한 형식 및 hs_HAMP_402에 대한 가장 강력한 형식을 나타낸다.
추가의 데이터가 하기 표 5에 제공되어 있다. 이러한 표는 3' 말단 캡, 그의 DMT, 석시네이트 및 카르복실레이트 변이체에 대한 명칭("올리고 식별자"); 카르복실레이트 Kd; 시험관내의 5 nM에서 3' 말단 캡(형식: S402 + 리비톨 + MOE 클램프)을 포함하는 헵시딘 RNAi 작용제에 의해 매개되는 KD(낙다운); 및 근사치(approx.) IC50을 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00239
Figure pct00240
도 7은 1.57 nM 내지 15 nM의 범위에서, 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 다양한 투여량 이후 COS1 세포에서의 제72시간의 헵시딘 mm-리포터 수준의 잔류 유전자 활성(여기서, 잔류 유전자 활성은 100% - KD임)을 보여준다. 가닥의 형식이 나타나 있다. 센스 가닥의 3' 말단은 2' MOE-클램프 - ribp(리비톨 스페이서) - C6으로 종결된다. 안티센스 가닥의 3' 말단은 2' MOE-클램프 - ribp(리비톨 스페이서) - 리간드로 종결되며, 여기서, 사용되는 리간드는 3' 말단 캡(X027, X058, X067 등)이었다.
이들 데이터는 BP(비페닐), C6, X027, X038, X050, X051, X052, X058, X059, X060, X061, X062, X063, X064, X065, X066, X067, X068 또는 X069인 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여준다.
실시예 3B. 3' 말단 캡(PAZ 리간드)을 포함하는 RNAi 작용제의 생체내 효력
실시예 3A는 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 RNAi 작용제의 시험관내 효력을 보여주었다. 실시예 3B는 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 RNAi 작용제의 생체내 효력을 보여주었다.
이들 생체내 실험은 이들 파라미터를 사용하였다:
정맥내 볼루스(꼬리 정맥)를 통해 마우스(n=5/그룹)에 주사하였다: LNP569
· PBS
· LNP569 - Hamp254 - X052(SL52-49CE) - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 - X058(IL54-43-XE) - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 - X067(YL55-48RE) - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 - X038(CL51-55IE) - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 - X069(GA35-24OF) - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 - X027(ML59-39NE) - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 - C6 대조군 - 3 ㎎/㎏
LNP569는 RNAi 작용제의 지질 나노입자 제제이다.
2가지 시점 - 주사후 48 및 168시간(둘 모두 3 ㎎/㎏).
간에서의 헵시딘 낙다운을 평가한다(mRNA - qPCR)
주요 질문을 질의한다:
PAZ 도메인 리간드가 생체내에서 활성인가(48시간 시점)?
PAZ 도메인 리간드가 낙다운 기간 동안 이익을 제공하는가(168시간 시점)?
결과는 도 8a 및 도 8b에 나타나 있다.
도 8a 및 도 8b는 ABI Hamp1 Taqman 검정(도 8a) 및 Hamp1 특이적 Taqman 검정(도 8b) 둘 모두에서, RNAi 작용제 모두가 1×3 ㎎/㎏ 용량을 사용하여 투여 후 48시간에 생체내에서 헵시딘 낙다운을 매개할 수 있었음을 보여준다. 사용된 3' 말단 캡은 다음과 같았다: X052, X058, X067, X038, X069 및 X027, 대조군으로서 C6 사용.
X052, X058, X067, X038, X069, X027 또는 C6의 3' 말단 캡이 있는 RNAi 작용제가 제48시간에 여전히 RNA 간섭을 매개할 수 있었다는 관찰은 3' 말단 캡이 (예를 들어, 혈청 중 뉴클레아제에 의한) 분해 또는 소화에 대하여 RNAi 작용제를 보호하는 것을 나타낸다.
도 9a는 Hamp1 특이적 Taqman 검정에서, X058 3' 말단 캡을 포함하는 듀플렉스가 생체내에서 투여 후 168시간에 여전히 RNA 간섭(헵시딘 낙다운에 의해 측정)을 매개할 수 있었음을 보여준다. 따라서, 50% 초과의 낙다운이 단일의 투여를 사용하여 7일 후에 마우스에서 관찰되었다.
임의의 특정 이론에 제한하지 않고, 본 발명은 X058 3' 말단 캡이 있는 RNAi 작용제에 의해 매개되는 증가된 낙다운의 효력 및 기간이 X058과 Ago2의 회합의 증가로 인한 것일 수 있음을 주목한다. 도 9b는 헵시딘 18-mer 올리고뉴클레오티드를 사용한 X058 및 C6 Ago2 풀다운(pulldown) 실험을 보여준다.
약술하면, X058 또는 C6 3' 말단 캡 중 어느 하나를 포함하는 RNAi 작용제, 또는 비-표적화(NT) 대조군 RNAi 작용제를 사용한 투여 후 72시간에, Ago2에 대한 항체를 사용하여, 세포로부터 Ago2를 풀다운시켰다. 그 다음, 분석을 수행하여, 나타낸 바와 같이 RNAi 작용제의 수준을 결정하였다. 도 9b는 72시간 후에, X058이 있는 RNAi 작용제가 C6이 있는 RNAi 작용제보다 훨씬 더 많이 Ago2와 회합되었음을 보여준다.
따라서, 이들 데이터는:
가이드 가닥 상에 X038, X052, X058, X067 또는 X069 PAZ 리간드가 있는 HAMP 18-mer(254) siRNA가 생체내에서 활성임을 보여준다.
X058은 확실한 증가된 낙다운의 효력 및 기간을 보여준다.
추가의 생체내 시험.
상이한 화학 형식을 사용하여 추가의 생체내 시험을 행하였다: (A160_S38,S42,S45 및 A161_S38,S42,S45).
안티센스 가닥에서:
A160_ → 위치 2에서 F 및 ribC6 오버행
A161_ → 위치 2, 5, 6, 7에서 F 및 ribC6 오버행
센스 가닥에서:
_S38 → C6 오버행
_S42 → ribC6 오버행
_S45 → BP 오버행
이러한 실험에 사용되는 파라미터는 하기와 같았다:
정맥내 볼루스(꼬리 정맥)를 통해 마우스(n=5/그룹)에 주사하였다: LNP569
· PBS
· LNP569 - Hamp254 A160_S38 - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 A160_S42 - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 A160_S45 - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 A161_S38 - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 A161_S42 - 3 ㎎/㎏
· LNP569 - Hamp254 A161_S45 - 3 ㎎/㎏
48시간 시점.
간에서의 헵시딘 낙다운을 평가한다(mRNA - qPCR)
결과는 도 10에 나타나 있다. 도 10은 A160 및 A161 형식[다양한 패신저(센스) 가닥 오버행]의 생체내 비교를 보여준다. 이러한 실험을 1×3 ㎎/㎏ 용량을 사용한 투여 후 48시간에 행하였다.
이들 데이터는 몇몇의 3' 말단 캡 중 임의의 것을 포함하는 RNAi 작용제의 생체내 효능을 보여준다: BP, C6, X052, X058, X067, X038, X069, X027.
실시예 4. 3' 말단 캡의 효능을 보여주는 추가의 연구
3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제를 사용하여 추가의 연구를 수행하였다.
도 16a는 3' 말단 캡이 X109, X110, X111, X112, X113, X058 또는 C6인 RNAi 작용제의 효능을 보여준다. HuR은 표적이다. 사용되는 용량은 1 nM, 0.25 nM, 0.62 nM 및 0.16 nM이다. 3' 말단 캡 중 임의의 것을 포함하는 RNAi 작용제는 특히 사용된 가장 높은 용량에서 RNA 간섭을 매개할 수 있었다.
특히, HuR-PAZ 리간드 X110, X111 및 X112는 X058과 효력이 유사한 것으로 보인다.
하기의 표 6은 다양한 3' 말단 캡이 있는 18-mer 형식 RNAi 작용제의 효능을 보여주는 추가의 데이터를 제공한다: X059, X050, X061, X051, X027, X062, X060, C6(X003), X068, X065, X069, X097, X066, X098, X052, X063, BP(X014), X038, X067, X058, X064 및 ribprib(X025).
[표 7]
Figure pct00241
Figure pct00242
실시예 5. C8 또는 C10 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능
C8 또는 C10 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제를 시험한다.
C8 또는 C10 오버행이 있는 19-mer SSB siRNA를 시험한다.
도 18a 및 도 18b는 결과를 보여주는 한편, 도 17c는 사용된 다양한 3' 말단 캡을 도해한 것이다.
C8 또는 C10 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제는 RNA 간섭을 매개할 수 있었다.
C10 오버행이 있는 19-mer SSB siRNA는 제3일에, 21-mer 양성 대조군보다 덜 강력한 mRNA 하향조절을 제공하지만, 작용 기간은 더 나았다.
따라서, C10 변형된 19mer siRNA는 조기의 시점(제3일)에 동일한 최대 표적 낙-다운을 제공하지 않지만, 더 길게 유지된다(제10일에 더욱 강력한 낙다운). 따라서, C10 3' 말단 캡은 뛰어난 작용 기간을 제공한다.
실험 데이터는 C6, C8 또는 C10인 3' 말단 캡을 포함하는 효율적인 RNAi 작용제가 작제될 수 있음을 보여준다. 또한, C10 3' 말단 캡은 생체 내에서 증가된 활성 기간의 이점을 갖는다.
실시예 6. 포스포로티오에이트 및/또는 RNA, DNA, 2'- MOE , 2'-F 또는 LNA 클램프를 포함하는 RNAi 작용제
F7(인자 VII)에 대한 변이형 RNAi 작용제를 제조한다.
이들 변이형은 예로서 포스포로티오에이트-C3(PS-C3)인 3' 말단 캡 및/또는 클램프를 포함한다. 클램프에서, 5'에서 3'으로 계수하여 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형된다.
결과는 도 20a 내지 도 20e에 나타나 있다.
도 20은 다양한 변형을 포함하는 3' 말단 캡 및 클램프의 효능을 보여준다. 도 20a 및 도 20b는 포스포로티오에이트-C3(PS-C3)의 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여준다. 도 20c, 도 20d 및 도 20e는 2' 클램프를 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여주며, 여기서, 5'에서 3'으로 계수하여 마지막 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드는 RNA, DNA, 2'-MOE, 2'-F 또는 LNA이다.
도 20d 및 도 20e에서 RNAi 작용제에 대하여, 모든 시험된 RNAi 작용제가 효율적이었다. 백분율이 낙다운을 나타내지 않고, 다른 RNAi 작용제에 비한 낙다운을 나타내는 것이 주목된다. 예를 들어, 100%는 이들 효율적인 RNAi 작용제의 모든 안티센스 가닥의 평균 낙다운을 나타낸다.
따라서, 이들 데이터는 RNA, DNA, 2'-MOE, 2'-F 또는 LNA를 포함하며, 변형된 뉴클레오시드간 링커가 포스포로티오에이트인 효율적인 RNAi 작용제가 작제될 수 있음을 보여준다.
실시예 7. 3' 말단 캡에 C3, C4 또는 C5 링커를 포함하는 RNAi 작용제
이러한 실시예는 하기와 같은 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제의 효능을 보여준다:
X109, X110, X111, X112, X113, X1009, X1010, X1024 또는 X1025(도 23a);
X1011, X1012, X1013, X058, X1015, X1016, X1017, X1026, X1027(도 23b); 또는
X1018; X1019, X1020, X1021, X1022 또는 X1028(도 23c).
도 20a에 나타낸 3' 말단 캡은 C3을 포함하고; 도 20b에 나타낸 3' 말단 캡은 C4를 포함하며; 도 20c에서 3' 말단 캡은 C5를 포함한다. 이들 데이터는 이들 3' 말단 캡 중 임의의 것을 포함하는 RNAi 작용제가 효율적임을 보여준다.
HuR RNAi 작용제를 사용한다.
이들 실험에서, Huh-7 세포를 96-웰 플레이트 형식에서 RNAiMax를 사용하여 트랜스펙션시킨다. RNA를 트랜스펙션 48시간 후에 분리한다. HuR mRNA를 PPIA 내인성 대조군에 정규화시킨다. 3, 10 및 30 pM의 RNAi 작용제 농도를 이전에 분석된 PAZ 리간드(3' 말단 캡)의 IC50 데이터에 기초하여 선택한다. X109 내지 X113 데이터에 대하여, 2가지의 이전의 데이터 세트의 평균이 제공된다.
일반적으로, 3' 말단 캡 내의 링커의 길이는 3' 말단 캡 중 임의의 것의 효력에 유의미하게 영향을 미치지 않는다.
개별적이지만 관련이 있는 실험에서, Huh-7 세포에서 HuR RNAi 작용제를 사용하여 몇몇의 3' 말단 캡에 대하여 IC50 데이터를 결정하였다. 2가지 개별 연구에 대한 데이터점이 하기에 나타나 있다:
Figure pct00243
이들 데이터는 X058, X109, X110, X111, X112 또는 X113인 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제가 각각 효율적임을 보여준다.
실시예 8. 3' 말단 캡에 C3, C4 또는 C5 링커를 포함하는 추가의 RNAi 작용제
이러한 실시예는 다음과 같은 3' 말단 캡을 포함하는 다양한 RNAi 작용제의 효능을 보여준다:
X110, X1012, X1018, X111, X1013, X112, X058, X1019, X1025, X1027 또는 X1028.
이러한 다양한 3' 말단 캡(표 1에 예시)은 R2 및 헤드기 사이의 링커(C3, C4 또는 C5)의 길이가 상이하다.
설명으로서, 본 발명은 용어 "C3"[-(CH2)3-], "C4"[-(CH2)4-] 및 "C5"[-(CH2)5-]가 일반적으로 스페이서를 나타내기 위하여 본원에 사용되며, 유사 용어(C3, C4, C5 "링커")도 또한 3' 말단 캡의 일부를 나타내기 위하여 사용되는 것을 언급한다. 도 13에서, 상이한 링커를 사용하여 다양한 3' 말단 캡의 부분을 차별화시킨다. 또한, C3 3' 말단 캡(예를 들어, 도 15a), C3 스페이서(도 21) 및 C3 링커(도 13)를 나타내기 위해 용어 "C3"이 사용되는 것을 주목한다.
이러한 실시예에 대한 표적 유전자는 HuR이다. Huh-7 세포를 RNAiMax 트랜스펙션 시약을 사용하여 트랜스펙션시킨다. 24 웰 플레이트에 웰마다 40,000개 세포를 씨딩한다. 1 nM RNAi 작용제/웰을 사용한 "역 트랜스펙션"을 행한 다음, 대략 18시간 동안 인큐베이션시킨다. 2벌 플레이트를 준비하여 RNA 추출을 위하여 하나를 사용하고, 지속을 위하여 다른 하나를 사용한다. 트랜스펙션 배지를 신선한 성장 배지(RNAi 작용제 부재)로 대체하고, RNA 분리 또는 지속 실험을 위한 분할 전에 세포를 추가 2일 동안 인큐베이션시킨다.
세포를 트랜스펙션 후 3일 및 7일에 분할한다. HuR mRNA 분석을 위하여 트랜스펙션 후 3일, 7일 및 10일에 RNA를 분리한다.
결과는 도 24a 및 도 24b에 나타나 있다. 대조군(NTC)은 mFVII 21-mer RNAi 작용제이다.
도 24a에서, 리간드 LME844(X110, X1012 및 X1018)에서, 링커 길이는 활성 기간을 변경시키는 것으로 보이지 않는다. 리간드 PKF027-895(X111 및 X1013)에 대하여, 더 짧은 링커(C3) 및 C4 링커는 유의미하게 상이하지 않다.
도 24b에서, 리간드 LPI230(X1025, X1027 및 X1028)에 대하여, C3 링커의 작용 기간은 더 긴 링커보다 더 나았다. 트랜스펙션 후 7일만큼 조기에 이의 증거가 존재한다.
리간드 LKS871(X112, X058 및 X1019)에 대하여, 더 긴 링커가 이후의 시점에 약간 더 나은 활성을 갖는 것으로 보이며, 제7일에 "경향"이 있지만, 오차 막대가 중첩되고, 그것은 아마도 유의미하지 않을 것이다. 제10일에 X058 활성은 이전의 작용 기간 연구에서 입증된 것보다 약 15% 더 낮지만, 이들 유형의 분석에 대한 가변성을 연구하기 위한 연구가 있을 것이다.
이들 데이터는 X112, X058, X1019, X1025, X1027 또는 X1028인 3' 말단 캡을 포함하는 RNAi 작용제가 각각 효율적임을 보여준다.
실시예 9. 추가의 3' 말단 캡의 효능
3' 말단 캡 X1062, X1063 및 X1064는 RNAi 작용제에 사용되는 경우 각각 효율적인 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 이들은 HuR siRNA에 효율적이었으며, 여기서, HuR siRNA는 본원에 기재된 바와 같은 18-mer였고, 각 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'에서 3' 방향으로 리비톨인 스페이서, 제2 포스페이트 및 X1062, X1063 또는 X1064인 3' 말단 캡을 추가로 포함한다. Huh7 세포를 RNAi Max 트랜스펙션 시약을 사용하여 siRNA로 트랜스펙션시키고; 24-웰 플레이트에 웰마다 40,000개 세포를 씨딩하고; 웰마다 1 nM siRNA를 사용하여 역 트랜스펙션을 수행하고 세포를 약 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 트랜스펙션 배지를 교체하고(siRNA 부재), RNA 분리 또는 씨딩을 위한 분할 이전에 추가 2일 동안 세포를 인큐베이션시켰다. 세포를 지속 시점을 위하여 트랜스펙션 후 3일 및 7일에 분할하였다. HuR mRNA 분석을 위하여 트랜스펙션 후 3일, 7일 및 10일에 RNA를 분리하였다. X1062였던 3' 말단 캡이 있는 HuR siRNA는 3일, 7일 또는 10일 후에 89.0, 77.9 및 32.7%의 효능(낙다운)을 보여주었다. X1063 및 X1064인 3' 말단 캡이 있는 HuR siRNA는 3일, 7일 및 10일 후에 각각 89.6, 81.5 및 43.7%; 및 67.0, 30.9 및 0.0%를 보였다.
구현예
1. 화학식 Ia의 화합물:
[화학식 Ia]
Figure pct00244
상기 식에서,
X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 여기서, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
Y는 CH 또는 N이며;
m은 0 또는 1이고;
p는 1, 2 또는 3이며;
R3은 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질, 석시네이트 또는 고체 지지체이고;
(CH2)m-O-R3 모이어티는 위치 3 또는 4에서 페닐 고리에 부착되며;
R4는 수소이고;
R5는 수소이거나;
R4 및 R5는 R4 및 R5가 부착되는 페닐 고리와 함께, 6H-벤조[c]크로멘을 형성한다.
2. 구현예 1에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:
Figure pct00245
Figure pct00246
3. 화학식 Ib의 화합물:
[화학식 Ib]
Figure pct00247
상기 식에서,
X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
q는 0, 1 또는 2이며;
R6은 비치환되거나, 벤족시 및 3,4-디하이드록시부틸로부터 선택되는 기로 치환된 페닐이고;
R7은 수소 또는 하이드록시-에틸이며, R7이 하이드록시-에틸이면, 하이드록실은 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고;
R8은 수소 또는 메톡시이며;
Y1은 CH 또는 N이고;
Y2는 N 또는 CR9이며; R9는 수소 및 메틸로부터 선택된다.
4. 구현예 3에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:
Figure pct00248
Figure pct00249
Figure pct00250
Figure pct00251
5. 하기로부터 선택되는 화합물:
Figure pct00252
Figure pct00253
상기 식에서,
X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
q는 1 및 2로부터 선택된다.
6. 하기의 단계의 방법을 포함하는 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단의 캡핑 방법:
RNAi 작용제를 하기로부터 선택되는 화합물과 반응시키는 단계로서:
Figure pct00254
Figure pct00255
Figure pct00256
Figure pct00257
Figure pct00259
X가 H, OH, ODMT 및 카르복실레이트로부터 선택되고, 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 단계;
고체상 합성 방법을 사용하여 X를 RNAi 작용제의 가닥으로 대체하는 단계; 또는
고체 지지체 상에서 RNAi 작용제 가닥을 작제하는 단계;
상기 가닥을 상기 화합물과 반응시키는 단계, 및
고체 지지체로부터 RNAi 작용제 가닥을 절단하는 단계.
7. 화학식 Ia의 화합물로서, X가 H, OH, ODMT 또는 카르복실레이트이고, 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있으며; R3이 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질, 석시네이트 또는 고체 지지체인 화학식 Ia의 화합물.
8. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물로서, 적어도 가닥의 3'-말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 3' 말단 캡이 구현예 1 내지 구현예 6 중 임의의 것의 화합물이고, X가 제1 또는 제2 가닥인 조성물.
9. 구현예 8에 있어서, RNAi 작용제의 제1 및/또는 제2 가닥이 약 49개 이하의 뉴클레오티드 길이인 조성물.
10. 구현예 8에 있어서, RNAi 작용제의 제1 및/또는 제2 가닥이 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이인 조성물.
11. 구현예 8에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥이 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이인 조성물.
12. 구현예 8에 있어서, 제1 가닥이 안티-센스 가닥이고, 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이인 조성물.
13. 구현예 8에 있어서, RNAi 작용제가 1 또는 2개의 블런트-말단을 갖는 조성물.
14. 구현예 8에 있어서, RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 오버행을 포함하는 조성물.
15. 구현예 8에 있어서, RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 1 내지 6개 뉴클레오티드 오버행을 포함하는 조성물.
16. 구현예 8에 있어서, RNAi 작용제가 스페이서를 포함하는 조성물.
17. 구현예 16에 있어서, 스페이서가 리비톨인 조성물.
18. 구현예 16에 있어서, 스페이서가 리비톨, 2'-데옥시-리비톨, 디리비톨, 2'-메톡시에톡시-리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), C3, C4, C5, C6 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올인 조성물.
19. 구현예 8에 있어서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 조성물.
20. 구현예 19에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택되는 조성물.
21. 구현예 19에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택되는 조성물.
22. 구현예 8에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 언하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나; 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며(예를 들어, 뉴클레오티드의 적어도 하나의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체됨), 변형된 뉴클레오시드간 링커가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물로부터 선택되는 조성물:
[화학식 I]
Figure pct00260
상기 식에서,
R3은 O-, S-, NH2, BH3, CH3, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C1-6 알콕시 및 C6-10 아릴-옥시로부터 선택되며, C1-6 알킬 및 C6-10 아릴은 비치환되거나 임의로 할로, 하이드록실 및 NH2로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 기로 독립적으로 치환되고; R4는 O, S, NH 또는 CH2로부터 선택된다.
23. 구현예 8에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형되는 조성물.
24. 구현예 8에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 2'-MOE인 조성물.
25. 구현예 8에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트가 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되는 조성물.
26. 구현예 8에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥은 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥인 조성물.
27. 다양한 구현예에 있어서, 센스 가닥은 하기로부터 선택되는 5' 말단 캡을 포함한다: 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT.
28. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물로서, 적어도 가닥의 3'-말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 X가 제1 또는 제2 가닥인 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물, 또는 본원의 임의의 표로부터의 화합물, 또는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡으로부터 선택되고; (a) 제1 및/또는 제2 가닥이 49-mer 이하이거나, 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이거나, 19개의 뉴클레오티드 길이이거나, 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이이고/거나; (b) 임의로, RNAi 작용제가 1 또는 2개의 블런트-말단을 갖거나 RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단 상에 오버행, 임의로, 1 내지 6개의 뉴클레오티드 오버행을 포함하고/거나; (c) 임의로, 하나의 또는 둘 모두의 가닥이 RNA이거나, 임의로, RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형되며, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택되고, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택되며; 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형되고, 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 2'-MOE이며; 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 언하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나; (d) 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며, 변형된 뉴클레오시드간 링커가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물로부터 선택되고; 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트가 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되고/거나; (e) 임의로, 제1 또는 제2 가닥이 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥이고, 임의로, 5' 말단 캡이 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT로부터 선택되는 조성물.
29. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물로서, 적어도 가닥의 3'-말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 3' 말단 캡이 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡이거나, 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물, 또는 본원의 임의의 표로부터의 화합물로부터 선택되고, X가 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하는 제1 또는 제2 가닥이고; (a) 제1 및/또는 제2 가닥이 49-mer 이하이거나, 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이거나, 19개 뉴클레오티드 길이이거나, 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이이고/거나; (b) 임의로, RNAi 작용제가 1 또는 2개의 블런트-말단을 갖거나 RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단 상에 오버행, 임의로, 1 내지 6개의 뉴클레오티드 오버행을 포함하고/거나; (c) 임의로, 하나의 또는 둘 모두의 가닥이 RNA이거나, 임의로, RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형되며, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택되고, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택되며; 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형되고, 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 2'-MOE이며; 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 언하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나; (d) 스페이서가 리비톨, 2'-데옥시-리비톨, 디리비톨, 2'-메톡시에톡시-리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), C3, C4, C5, C6 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올이고/거나; (e) 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며, 변형된 뉴클레오시드간 링커가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물로부터 선택되고; 임의로, 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트가 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되고/거나; (f) 임의로, 제1 또는 제2 가닥이 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥이고, 임의로, 5' 말단 캡이 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT로부터 선택되는 조성물.
30. 구현예 25의 RNAi 작용제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
31. 약제로 사용하기 위한, 구현예 25의 RNAi 작용제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
32. 구현예 25의 하나 이상의 RNAi 작용제를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 세포에서의 표적 유전자의 수준 및/또는 활성의 억제 또는 감소 방법.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에 친숙한 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 구체적으로 상세히 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은, 당업자에게 명백할 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되어 왔다. 예를 들어 표준 핸드북 및 본원에 언급된 일반적인 배경기술, 및 그에 인용된 추가의 참고문헌을 또한 참조한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 인용된 참고문헌은 각각 그 전문이 참조로 포함된다.
청구범위는 비제한적이며, 하기 제공된다.
특정 구현예 및 청구범위가 본원에 상세히 개시되어 있을지라도, 이는 단지 예시의 목적으로 예로서 행해진 것이며, 첨부된 청구범위의 범위, 또는 임의의 상응하는 추후 출원의 청구범위의 대상의 범위와 관련하여 제한하려는 의도가 아니다. 특히, 본 발명자들은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서, 본 발명에 다양한 치환, 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 고려한다. 핵산 출발 물질, 관심 클론, 또는 라이브러리 유형의 선택은 본원에 기재된 구현예의 지식을 가진 당업자에게는 일상적인 문제인 것으로 여겨진다. 다른 구현예, 이점 및 변형이 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 당업자는 일상적인 실험 범위를 넘지 않고 이를 사용하여 본원에 기재된 발명의 구체적 구현예의 다수의 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 다양한 국가의 특허법에 의한 제한으로 인하여 이후 출원되는 상응하는 출원의 청구범위가 고쳐질 수 있으며, 이것을 청구범위의 대상을 포기하는 것으로 해석해서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> 3' END CAPS FOR RNAI AGENTS FOR USE IN RNA INTERFERENCE <130> PAT055438-WO-PCT <140> PCT/US2014/058705 <141> 2014-10-01 <150> 61/886,739 <151> 2013-10-04 <160> 139 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1 nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2 nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 uuuaauugaa accaagaca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source 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oligonucleotide" <400> 25 cataggtctt ggaataaa 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 26 cataggtctt ggaataaa 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 27 cataggtctt ggaataaa 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 28 cataggtctt ggaataaa 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 29 cataggtctt ggaataaa 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 30 gaacataggt cttggaatau u 21 <210> 31 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(17) <223> a, c, t, u, g, unknown or other <400> 31 nnnnnnnnnn nnnnnnn 17 <210> 32 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> a, c, t, u, g, unknown or other <400> 48 nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 49 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 50 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> 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Synthetic oligonucleotide" <400> 79 uucuacaaca gguauucac 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 80 gugaauaccu guuguagaa 19 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 81 uuuauuugaa accaagacat t 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 82 ugucuugguu ucaaauaaat t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> 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Claims (32)

  1. 화학식 Ia의 화합물:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00261

    상기 식에서,
    X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 여기서, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
    Y는 CH 또는 N이며;
    m은 0 또는 1이고;
    p는 1, 2 또는 3이며;
    R3은 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질, 석시네이트 또는 고체 지지체이고;
    (CH2)m-O-R3 모이어티는 위치 3 또는 4에서 페닐 고리에 부착되며;
    R4는 수소이고;
    R5는 수소이거나;
    R4 및 R5는 R4 및 R5가 부착되는 페닐 고리와 함께, 6H-벤조[c]크로멘을 형성한다.
  2. 제1항에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00262

    Figure pct00263
  3. 화학식 Ib의 화합물:
    Figure pct00264

    상기 식에서,
    X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
    q는 0, 1 또는 2이며;
    R6은 비치환되거나, 벤족시 및 3,4-디하이드록시부틸로부터 선택되는 기로 치환된 페닐이고;
    R7은 수소 또는 하이드록시-에틸이며, R7이 하이드록시-에틸이면, 하이드록실은 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고;
    R8은 수소 또는 메톡시이며;
    Y1은 CH 또는 N이고;
    Y2는 N 또는 CR9이며; R9는 수소 및 메틸로부터 선택된다.
  4. 제3항에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00265

    Figure pct00266

    Figure pct00267

    Figure pct00268
  5. 하기로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00269

    Figure pct00270

    상기 식에서,
    X는 H; 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 OH; ODMT; 카르복실산; RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단; 또는 RNAi 작용제의 가닥을 포함하는 분자의 3' 말단이고, 상기 가닥의 3' 말단은 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서 및 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하고;
    q는 1 및 2로부터 선택된다.
  6. 하기의 단계의 방법을 포함하는 RNAi 작용제의 가닥의 3' 말단의 캡핑 방법:
    RNAi 작용제를 하기로부터 선택되는 화합물과 반응시키는 단계로서:
    Figure pct00271

    Figure pct00272

    Figure pct00273

    Figure pct00274

    Figure pct00275

    Figure pct00276

    X가 H, OH, ODMT 및 카르복실레이트로부터 선택되고, 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있는 단계;
    고체상 합성 방법을 사용하여, X를 RNAi 작용제의 가닥으로 대체하는 단계; 또는
    고체 지지체 상에서 RNAi 작용제 가닥을 작제하는 단계;
    상기 가닥을 상기 화합물과 반응시키는 단계, 및
    상기 고체 지지체로부터 상기 RNAi 작용제 가닥을 절단하는 단계.
  7. 화학식 Ia의 화합물로서, X가 H, OH, ODMT 또는 카르복실레이트이고, 하이드록실기가 임의로 석시네이트로서 작용화되거나 고체 지지체에 부착될 수 있으며; R3이 수소, 2-(하이드록시-메틸)-벤질, 3-(하이드록시-메틸)-벤질, 석시네이트 또는 고체 지지체인 화학식 Ia의 화합물.
  8. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물로서, 적어도 가닥의 3'-말단이 3' 말단 캡을 포함하며, 상기 3' 말단 캡이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물이고, X가 제1 또는 제2 가닥인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 제1 및/또는 제2 가닥이 약 49개 이하의 뉴클레오티드 길이인 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 제1 및/또는 제2 가닥이 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥이 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이인 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 제1 가닥이 안티-센스 가닥이고, 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이인 조성물.
  13. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 작용제가 1 또는 2개의 블런트-말단을 갖는 조성물.
  14. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 오버행을 포함하는 조성물.
  15. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 1 내지 6개 뉴클레오티드 오버행을 포함하는 조성물.
  16. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 작용제가 스페이서를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 스페이서가 리비톨인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 스페이서가 리비톨, 2'-데옥시-리비톨, 디리비톨, 2'-메톡시에톡시-리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), C3, C4, C5, C6 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올인 조성물.
  19. 제8항에 있어서, 상기 RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택되는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택되는 조성물.
  22. 제8항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 언하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나; 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며(예를 들어, 뉴클레오티드의 적어도 하나의 포스페이트는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체됨), 상기 변형된 뉴클레오시드간 링커가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물로부터 선택되는 조성물:
    [화학식 I]
    Figure pct00277

    상기 식에서,
    R3은 O-, S-, NH2, BH3, CH3, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C1-6 알콕시 및 C6-10 아릴-옥시로부터 선택되며, C1-6 알킬 및 C6-10 아릴은 비치환되거나 임의로 할로, 하이드록실 및 NH2로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 기로 독립적으로 치환되고; R4는 O, S, NH 또는 CH2로부터 선택된다.
  23. 제8항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형되는 조성물.
  24. 제8항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 2'-MOE인 조성물.
  25. 제8항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트가 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되는 조성물.
  26. 제8항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 가닥은 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥인 조성물.
  27. 전술한 항들에 있어서, 센스 가닥이 하기로부터 선택되는 5' 말단 캡을 포함하는 화합물, 방법 또는 조성물: 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT.
  28. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물로서, 적어도 가닥의 3'-말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 상기 3' 말단 캡이 X가 제1 또는 제2 가닥인 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물, 또는 본원의 임의의 표로부터의 화합물, 또는 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡으로부터 선택되고; (a) 상기 제1 및/또는 제2 가닥이 49-mer 이하이거나, 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이거나, 19개의 뉴클레오티드 길이이거나, 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이이고/거나; (b) 임의로, 상기 RNAi 작용제가 1 또는 2개의 블런트-말단을 갖거나 상기 RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단 상에 오버행, 임의로, 1 내지 6개의 뉴클레오티드 오버행을 포함하고/거나; (c) 임의로, 하나의 또는 둘 모두의 가닥이 RNA이거나, 임의로, 상기 RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형되며, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택되고, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택되며; 임의로, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형되고, 임의로, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 2'-MOE이며; 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 언하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나; (d) 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며, 상기 변형된 뉴클레오시드간 링커가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물로부터 선택되고; 임의로, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트가 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되고/거나; (e) 임의로, 상기 제1 또는 제2 가닥이 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥이고, 임의로, 상기 5' 말단 캡이 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT로부터 선택되는 조성물.
  29. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물로서, 적어도 가닥의 3'-말단이 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되고, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커 및 3' 말단 캡을 추가로 포함하며, 상기 3' 말단 캡이 본원에 개시된 임의의 3' 말단 캡이거나, 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물, 또는 본원의 임의의 표로부터의 화합물로부터 선택되고, X가 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커로 종결되며, 5'에서 3' 순서로, 스페이서, 제2 포스페이트 또는 변형된 뉴클레오시드간 링커를 추가로 포함하는 제1 또는 제2 가닥이고; (a) 상기 제1 및/또는 제2 가닥이 49-mer 이하이거나, 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이거나, 19개 뉴클레오티드 길이이거나, 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이이고/거나; (b) 임의로, 상기 RNAi 작용제가 1 또는 2개의 블런트-말단을 갖거나 상기 RNAi 작용제가 적어도 하나의 5' 말단 또는 3' 말단 상에 오버행, 임의로, 1 내지 6개의 뉴클레오티드 오버행을 포함하고/거나; (c) 임의로, 하나의 또는 둘 모두의 가닥이 RNA이거나, 임의로, 상기 RNAi 작용제의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형되며, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2' 알콕시리보뉴클레오티드, 2' 알콕시알콕시 리보뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드 중에서 선택되고, 임의로, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 2'-OMe, 2'-MOE 및 2'-H로부터 선택되며; 임의로, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 변형되고, 임의로, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드가 2'-MOE이며; 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되거나, DNA이거나, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 언하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 비잠금 핵산(UNA)으로 대체되고/거나; (d) 상기 스페이서가 리비톨, 2'-데옥시-리비톨, 디리비톨, 2'-메톡시에톡시-리비톨(2'-MOE가 있는 리비톨), C3, C4, C5, C6 또는 4-메톡시부탄-1,3-디올이고/거나; (e) 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드간 링커를 포함하며, 상기 변형된 뉴클레오시드간 링커가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드 링커 및 화학식 I의 화합물로부터 선택되고; 임의로, 상기 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 포스페이트가 변형된 뉴클레오시드간 링커로 대체되고/거나; (f) 임의로, 제1 또는 제2 가닥이 센스 가닥에 의해 매개되는 RNA 간섭의 양을 감소시키는 5' 말단 캡을 포함하는 센스 가닥이고, 임의로, 상기 5' 말단 캡이 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여된 뉴클레오티드; 5' 포스페이트 또는 5'-OH가 결여되고, 또한 2-OMe 또는 2'-MOE 변형을 포함하는 뉴클레오티드; 5'-데옥시-2'-O-메틸 변형; 5'-OME-dT; ddT; 및 5'-OTr-dT로부터 선택되는 조성물.
  30. 제25항의 RNAi 작용제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  31. 약제로 사용하기 위한, 제25항의 RNAi 작용제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  32. 제25항의 하나 이상의 RNAi 작용제를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 세포에서의 표적 유전자의 수준 및/또는 활성의 억제 또는 감소 방법.
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