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KR20160065930A - 글루코스-반응성 인슐린 접합체 - Google Patents

글루코스-반응성 인슐린 접합체 Download PDF

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KR20160065930A
KR20160065930A KR1020167011439A KR20167011439A KR20160065930A KR 20160065930 A KR20160065930 A KR 20160065930A KR 1020167011439 A KR1020167011439 A KR 1020167011439A KR 20167011439 A KR20167011439 A KR 20167011439A KR 20160065930 A KR20160065930 A KR 20160065930A
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KR
South Korea
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ioc
insulin
saccharide
conjugate
group
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020167011439A
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English (en)
Inventor
송니안 린
린 연
아흐메트 케켁
위핑 주
데이비드 엔. 헌터
페이 후오
단칭 펑
라비 피. 나르군드
크리스토퍼 알. 모예스
지치앙 자오
브렌다 피픽
드미트리 피사르니츠키
조셉 엘. 더피
에린 엔. 기드리
Original Assignee
머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 filed Critical 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
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Abstract

2개의 아암을 갖는 적어도 1개의 두자리 링커에 공유 부착된 인슐린 분자를 포함하는 인슐린 접합체가 개시되며, 여기서 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드에 부착되고, 링커의 적어도 1개의 리간드는 푸코스이다. 이러한 인슐린 접합체는 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 다가 사카라이드-결합 분자, 예컨대 Con A의 부재 하에 투여되었을 때에도 사카라이드, 예컨대 글루코스 또는 알파-메틸만노스의 전신 농도에 반응성인 약동학적 (PK) 및/또는 약역학적 (PD) 프로파일을 나타낸다.

Description

글루코스-반응성 인슐린 접합체{GLUCOSE-RESPONSIVE INSULIN CONJUGATES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 10월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 61/886,717의 이익을 우선권 주장하며, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
(1) 발명의 분야
본 발명은 푸코스를 포함하는 인슐린 접합체에 관한 것이며, 이는 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 다가 사카라이드-결합 분자, 예컨대 Con A의 부재 하에 투여되었을 때에도 사카라이드, 예컨대 글루코스 또는 알파-메틸만노스의 전신 농도에 반응성인 약동학적 (PK) 및/또는 약역학적 (PD) 프로파일을 나타낸다. 특히, 본 발명은 적어도 1개의 두자리 링커에 공유 부착된 인슐린 분자를 포함하는 인슐린 접합체에 관한 것이며, 여기서 링커의 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드에 부착되고, 적어도 1개의 리간드에 대한 사카라이드는 푸코스이다.
(2) 관련 기술의 설명
선행 기술에 공지되어 있는 대다수의 "제어-방출" 약물 전달 시스템 (예를 들어, 효소적으로 불안정한 캡슐로부터의 약물 방출을 기재하고 있는 미국 특허 번호 4,145,410 (Sears))은 인간 신체 내에 존재하는 분자 인디케이터 (예를 들어, 대사물)의 양에 정비례하는 농도 및 간격으로 환자에게 약물을 제공할 수 없다. 따라서, 이들 선행 기술 시스템의 약물은 문자 그대로 "제어"되지 않는 것이지만, 외부 또는 내부 인자와는 독립적으로 단순히 느린 방출 포맷으로 제공되는 것이다. 주사가능한 인슐린을 사용하는 당뇨병의 치료는 널리 공지되어 있으며, 비제어된 느린 방출 인슐린이 바람직하지 않은 경우의 예가 연구되었다. 사실상, 호르몬의 단순한 대체는 이러한 질환과 연관된 병리학적 후유증을 방지하는데 충분하지 않다는 것이 명백하다. 이들 후유증의 발생은, 환자가 경험하는 가변적인 혈액 글루코스 농도에 비례하는 외인성 인슐린을 제공할 수 없다는 것을 반영하는 것으로 여겨진다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 보다 생리학적인 인슐린 전달 시스템을 개발하기 위한 여러 생물학적 및 생체공학적 접근법이 제안되어 왔다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,348,387 (Brownlee et al.); 미국 특허 번호 5,830,506, 5,902,603, 및 6,410,053 (Taylor et al.) 및 미국 특허 출원 공개 번호 2004-0202719 (Zion et al.) 참조).
각각의 이들 시스템은 다가 글루코스 결합 분자 (예를 들어, 렉틴 Con A), 및 다가 글루코스 결합 분자에 의해 가역적으로 결합되는 당 기재 성분의 조합에 의존한다. 불행하게도, Con A 및 수많은 다른 용이하게 이용가능한 렉틴은 림프구 증식을 자극하는 잠재력을 갖는다. 특정한 유형의 림프구의 표면 상의 탄수화물 수용체에 결합함으로써, 이러한 소위 "유사분열촉진" 렉틴은 잠재적으로 림프구의 유사분열을 유도하여, 이들의 증식을 유발할 수 있다. Con A를 비롯한 대부분의 유사분열촉진 렉틴은 선택적 T-세포 미토겐이다. 몇몇 렉틴은 덜 선택적이며, T-세포 및 B-세포를 둘 다 자극한다. 유사분열촉진 렉틴에 대한 생체내 국부 또는 전신 노출은 염증, 세포독성, 대식세포 소화 및 알레르기 반응 (아나필락시스 포함)을 일으킬 수 있다. 또한, 식물 렉틴은 특히 면역원성이어서, 높은 역가의 항-렉틴 특이적 항체의 생산을 일으키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 고도로 주의하여 유사분열촉진 렉틴의 방출을 막지 않는 한, 유사분열촉진 렉틴은 생체내 방법 및 장치에서 그의 천연 형태로 사용될 수 없는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,830,506 (Taylor)에서는 Con A의 사용과 관련된 독성 위험을 강조하고, 약물 전달 장치 (글루코스 및 인슐린 분자가 장치 내외로 자유롭게 확산되도록 하는 것을 또한 필요로 함) 내에 Con A를 함유하는 것의 중요성 및 어려움을 강조한다. 렉틴을 필요로 하지 않는 대안적인 제어된 약물 전달 시스템을 제공할 수 있다면 렉틴의 이러한 및 다른 생체내 사용과 관련된 위험 및 어려움은 유의하게 감소될 수 있다.
본 발명은 푸코스를 포함하는 인슐린 접합체를 제공하며, 이는 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 다가 사카라이드-결합 분자, 예컨대 Con A의 부재 하에 투여되었을 때 사카라이드, 예컨대 글루코스 또는 알파-메틸만노스의 전신 농도에 반응성인 약동학적 (PK) 및/또는 약역학적 (PD) 프로파일을 나타낸다. 일반적으로, 접합체는 2개의 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커 (두자리 링커)에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하며, 여기서 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드에 부착되고, 링커의 적어도 1개의 리간드는 푸코스이다. 특정한 실시양태에서, 링커는 비-중합체이다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 1의 다분산 지수 및 약 20,000 Da 미만의 MW를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 장기 작용성이다 (즉, 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)보다 더 지속적인 PK 프로파일을 나타냄).
본원에 개시된 접합체는 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 사카라이드 결합 분자의 부재 하에 투여되었을 때 혈청 사카라이드의 혈청 농도에 감수성인 약역학적 (PD) 또는 약동학적 (PK) 프로파일을 나타낸다. 특정한 측면에서, 혈청 사카라이드는 글루코스 또는 알파-메틸만노스이다. 추가 측면에서, 접합체는 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되었을 때 내인성 사카라이드 결합 분자에 60 또는 70 mg/dL 이하의 혈청 글루코스 농도에서 결합한다. 내인성 사카라이드 결합 분자에 대한 접합체의 결합은 혈청 사카라이드의 혈청 농도에 감수성이다. 추가 측면에서, 접합체는 인슐린 수용체에 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/dL 초과의 혈청 사카라이드 농도에서 결합할 수 있다. 60 또는 70 mg/dL의 혈청 사카라이드 농도에서, 접합체는 인슐린 수용체보다 내인성 사카라이드 결합 분자에 우선적으로 결합하고, 혈청 사카라이드의 혈청 농도가 60 또는 70 mg/dL로부터 증가함에 따라, 내인성 사카라이드 결합 분자에 대한 접합체의 결합이 감소하고, 인슐린 수용체에 대한 접합체의 결합이 증가한다.
따라서, 본 발명은 제1 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하며, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제2 리간드에 연결되고, 적어도 1개의 분지형 링커에 대한 제1 사카라이드는 푸코스인 접합체를 제공한다. 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 특정한 측면에서, 제2 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, 제2 리간드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드를 포함한다. 추가 측면에서, 제2 리간드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스를 포함한다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 둘 다 푸코스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 글루코스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 비만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 테트라만노스이다.
특정한 측면에서, 적어도 1개의 분지형 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있는 아미노산에 공유 연결된다.
접합체의 추가 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드를 포함하는 선형 또는 분지형 링커에 추가로 공유 연결된다. 특정한 측면에서, 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, 리간드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드를 포함한다. 추가 측면에서, 리간드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스를 포함한다.
접합체의 추가 측면에서, 접합체는 하기 화학식 I을 갖는다:
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서
(i) 각 경우의
Figure pct00002
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
(ii) 각 경우의
Figure pct00003
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
(iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
(iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
(v) -B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이고, 각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vi) n은 1, 2, 또는 3이며,
단 인슐린 또는 인슐린 유사체는 리간드 X 중 1개가 푸코스인 사카라이드를 포함하는 적어도 1개의 링커에 접합된다.
접합체의 특정한 측면에서, 적어도 1개의 링커에 대한 적어도 1개의 사카라이드는 푸코스이고, 다른 사카라이드 또는 사카라이드들은 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, 적어도 1개의 링커에 대한 적어도 1개의 사카라이드는 푸코스이고, 다른 사카라이드 또는 사카라이드들은 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드이다. 추가 측면에서, 적어도 1개의 링커에 대한 적어도 1개의 사카라이드는 푸코스이고, 다른 사카라이드 또는 사카라이드들은 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 특정한 측면에서, n은 1이고, X의 제1 경우에 대한 사카라이드는 푸코스이고, X의 제2 경우에 대한 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, X의 제1 경우에 대한 사카라이드는 푸코스이고, X의 제2 경우에 대한 사카라이드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드이다. 추가 측면에서, X의 제1 경우에 대한 사카라이드는 푸코스이고, X의 제2 경우에 대한 사카라이드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 특정한 측면에서, n은 2이고, X의 제1 경우에 대한 사카라이드는 푸코스이고, X의 제2, 제3, 및 제4 경우에 대한 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 특정한 측면에서, n은 3이고, X의 제1 경우에 대한 사카라이드는 푸코스이고, X의 제2, 제3, 제4, 제5, 및 제6 경우에 대한 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 추가 측면에서, 접합체는 하기 화학식 II를 포함한다:
<화학식 II>
Figure pct00004
상기 식에서
(i) 각 경우의
Figure pct00005
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
(ii) 각 경우의
Figure pct00006
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
(iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
(iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
(v) -B1은 -T-
Figure pct00007
-X1이고, 여기서 X1은 푸코스를 포함하는 리간드이고,
Figure pct00008
은 공유 결합 또는 T의 X1과의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vi) -B2는 -T-
Figure pct00009
-X2이고, 여기서 X2는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하는 리간드이고;
Figure pct00010
는 공유 결합 또는 T의 X2와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vii) n은 1, 2, 또는 3이다.
접합체의 특정한 측면에서, X2는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 추가 측면에서, 두자리 링커는 하기 화학식을 갖고:
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
여기서 각 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 푸코스를 포함하는 리간드 X를 포함한다. 상기 두자리 링커를 갖는 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 추가 측면에서, 각 X는 독립적으로 하기 화학식을 가질 수 있고:
Figure pct00018
여기서 파상선은 결합이 두자리 링커를 구성하는 원자에 연결된다는 것을 나타내며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 EDF를 포함한다. 상기 접합체 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 추가 측면에서, 접합체는 각각 제1 및 제2 아암을 갖는 적어도 2개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이다. 접합체의 특정한 측면에서, 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, 제2 사카라이드는 독립적으로 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드이다. 추가 측면에서, 제2 사카라이드는 독립적으로 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 둘 다 푸코스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 글루코스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 비만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 테트라만노스이다.
상기 접합체의 추가 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 A1, B1, B29, B28, 및 B3으로부터 선택된 2개의 아미노산 위치가 2개의 링커에 공유 연결된다.
접합체의 추가 측면에서, 접합체는 각각 제1 및 제2 아암을 갖는 적어도 3개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이다. 접합체의 특정한 측면에서, 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, 제2 사카라이드는 독립적으로 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드이다. 추가 측면에서, 제2 사카라이드는 독립적으로 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 둘 다 푸코스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 글루코스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 비만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 테트라만노스이다.
상기 접합체의 추가 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 A1, B1, B29, B28, 및 B3으로부터 선택된 3개의 아미노산 위치가 3개의 링커에 공유 연결된다.
접합체의 추가 측면에서, 접합체는 각각 제1 및 제2 아암을 갖는 적어도 2개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 2개의 링커 중 1개의 제1 사카라이드는 푸코스이다.
접합체의 특정한 측면에서, 나머지 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, 나머지 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드이다. 추가 측면에서, 나머지 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 둘 다 푸코스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 글루코스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 비만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 각각에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 테트라만노스이다.
특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 둘 다 푸코스이고, 제2 링커에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 분지형 트리만노스이고, 제2 링커에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이고, 제2 링커에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 글루코스이고, 제2 링커에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 2개의 링커 중 각각에 대한 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 만노스이고, 제2 링커에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 비만노스이고, 제2 링커에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 사카라이드는 트리만노스이고, 제2 링커에 대해 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다. 특정한 측면에서, 2개의 링커 중 1개에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 제2 링커에 대해 제2 사카라이드는 테트라만노스이고, 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
상기 접합체의 추가 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 A1, B1, B29, B28, 및 B3으로부터 선택된 2개의 아미노산 위치가 2개의 링커에 공유 연결된다.
접합체의 추가 측면에서, 접합체는 각각 제1 및 제2 아암을 갖는 적어도 3개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 3개의 링커 중 적어도 1개의 제1 사카라이드는 푸코스이고, 나머지 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스이다. 다른 측면에서, 나머지 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 독립적으로 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드이다. 추가 측면에서, 나머지 제1 사카라이드 및 제2 사카라이드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
상기 접합체의 추가 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 A1, B1, B29, B28, 및 B3으로부터 선택된 3개의 아미노산 위치가 3개의 링커에 공유 연결된다.
IOC-1, 1OC-2, IOC-3, IOC-4, IOC-5, IOC-6, IOC-7, IOC-8, IOC-9, IOC-10, IOC-11, IOC-12, IOC-13, IOC-14, IOC-15, IOC-16, IOC-17, IOC-18, IOC-19, IOC-20, IOC-21, IOC-22, IOC-23, IOC-24, IOC-25, IOC-26, IOC-27, IOC-28, IOC-29, IOC-30, IOC-31, IOC-32, IOC-33, IOC-34, IOC-35, IOC-36, IOC-37, IOC-38, IOC-39, IOC-41, IOC-42, IOC-43, IOC-44, IOC-45, IOC-46, IOC-47, IOC-49, IOC-50, IOC-51, IOC-52, IOC-53, IOC-54, IOC-55, IOC-56, IOC-57, IOC-58, IOC-59, IOC-60, IOC-61, IOC-62, IOC-63, IOC-64, IOC-65, IOC-66, IOC-67, IOC-68, IOC-69, IOC-70, IOC-71, IOC-72, IOC-73, IOC-74, IOC-75, IOC-76, IOC-77, IOC-78, IOC-79, IOC-80, IOC-81, IOC-82, IOC-83, IOC-84, IOC-85, IOC-86, IOC-87, IOC-88, IOC-89, IOC-90, IOC-91, IOC-92, IOC-93, IOC-94, IOC-95, IOC-96, IOC-97, IOC-98, IOC-99, 또는 IOC-100에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체 또는 이러한 접합체를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
IOC-101, 1OC-102, IOC-103, IOC-104, IOC-105, IOC-106, IOC-107, IOC-108, IOC-109, IOC-110, IOC-111, IOC-112, IOC-113, IOC-114, IOC-115, IOC-116, IOC-117, IOC-118, IOC-119, IOC-120, IOC-121, IOC-122, IOC-123, IOC-124, IOC-125, IOC-126, IOC-127, IOC-128, IOC-129, IOC-130, IOC-131, IOC-132, IOC-133, IOC-134, IOC-135, IOC-136, IOC-137, IOC-138, IOC-139, IOC-140, IOC-141, IOC-142, IOC-143, IOC-144, IOC-145, IOC-146, IOC-147, IOC-149, IOC-150, IOC-151, IOC-152, IOC-153, IOC-154, IOC-155, IOC-156, IOC-157, IOC-158, IOC-159, IOC-160, IOC-161, IOC-162, IOC-163, IOC-164, IOC-165, IOC-166, IOC-167, IOC-168, IOC-169, IOC-170, IOC-171, IOC-172, IOC-173, IOC-174, IOC-175, IOC-176, IOC-177, IOC-178, IOC-179, IOC-180, IOC-181, IOC-182, IOC-183, IOC-184, IOC-185, IOC-186, IOC-187, IOC-188, IOC-189, IOC-190, IOC-191, 또는 IOC-192에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체 또는 이러한 접합체를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
IOC-193, 1OC-194, IOC-195, IOC-196, IOC-197, IOC-198, IOC-199, IOC-200, IOC-201, IOC-202, IOC-203, IOC-204, IOC-205, IOC-206, IOC-207, IOC-208, IOC-210, IOC-211, IOC-212, IOC-213, IOC-214, IOC-215, IOC-216, IOC-217, IOC-218, IOC-219, IOC-220, IOC-221, IOC-222, IOC-223, IOC-224, IOC-225, IOC-226, IOC-227, IOC-228, IOC-229, IOC-230, IOC-231, IOC-232, IOC-233, IOC-234, IOC-235, IOC-236, IOC-237, IOC-238, IOC-239, IOC-240, IOC-241, IOC-242, IOC-243, IOC-244, IOC-245, IOC-246, IOC-247, IOC-248, IOC-249, IOC-250, IOC-251, IOC-252, IOC-253, IOC-254, IOC-255, IOC-256, IOC-257, IOC-258, IOC-259, IOC-260, IOC-261, IOC-262, IOC-263, IOC-264, IOC-265, IOC-266, IOC-267, IOC-268, IOC-269, IOC-270, IOC-271, 또는 IOC-272에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체 또는 이러한 접합체를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
상기 접합체는 제약상 허용되는 담체 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 및/또는 계면활성제를 포함하는 제약 제제로 추가로 제공될 수 있다. 추가 측면에서, 접합체는 아연 및/또는 프로타민을 추가로 포함할 수 있다. 접합체는 결정질 형태로서 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에 일반적으로 또는 구체적으로 개시된 바와 같은 접합체 중 1종 이상 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 결정질 형태의 본원에 일반적으로 또는 구체적으로 개시된 바와 같은 접합체 중 1종 이상 및 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 보존제, 아연 염, 프로타민, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
접합체의 추가 측면에서, 인슐린 분자는 포유동물 인슐린이고, 특정한 실시양태에서, 인간 인슐린, 소 인슐린, 개 인슐린, 고양이 인슐린, 염소 인슐린, 말 인슐린, 돼지 인슐린 또는 그의 유사체일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 유사체는 인슐린 리스프로 또는 인슐린 글루리신이다. 추가 실시양태에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 인슐린 또는 인슐린 유사체의 아미노산에 공유 연결된 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방산을 포함하도록 변형된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 유사체는 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데테미르, 또는 인슐린 글루리신이다.
본 발명은 본원에 개시된 접합체 또는 본원에 개시된 접합체를 포함하는 제약 제제를 당뇨병성인 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 개시된 접합체의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 추가로 제공하며, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이며, 이에 따라 접합체가 제공된다.
일반적으로, 제2 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
특정한 측면에서, 분지형 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있는 아미노산에 공유 연결된다.
추가 실시양태에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제2 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제3 사카라이드를 포함하는 제3 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제4 사카라이드를 포함하는 제4 리간드에 연결된다. 특정한 측면에서, 제2 분지형 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된다.
추가 실시양태에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제3 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제5 사카라이드를 포함하는 제5 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제6 사카라이드를 포함하는 제6 리간드에 연결된다. 특정한 측면에서, 제3 분지형 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커 및 제2 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된다.
상기 접합체의 임의의 실시양태에서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 사카라이드는 각각 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
추가 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자는 사카라이드를 포함하는 리간드를 포함하는 선형 링커에 추가로 공유 연결되고, 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스일 수 있다.
특정한 측면에서, 인슐린 유사체 분자는 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데테미르, 또는 인슐린 글루리신이다.
상기 측면 또는 실시양태 중 어느 하나에서, 접합체는 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 사카라이드 결합 분자의 부재 하에 투여되었을 때 혈청 사카라이드의 혈청 농도에 감수성인 약역학적 (PD) 또는 약동학적 (PK) 프로파일을 나타낸다. 특정한 측면에서, 혈청 사카라이드는 글루코스 또는 알파-메틸만노스이다. 특정한 측면에서, 접합체는 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되었을 때 내인성 사카라이드 결합 분자에 60 mg/dL 이하의 혈청 글루코스 농도에서 결합한다. 내인성 사카라이드 결합 분자는 인간 만노스 수용체 1일 수 있다.
조성물의 특정한 측면에서, 접합체는 하기 화학식 I을 갖고:
<화학식 I>
Figure pct00019
상기 식에서
(i) 각 경우의
Figure pct00020
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
(ii) 각 경우의
Figure pct00021
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
(iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
(iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
(v) -B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이고, 각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vi) n은 1, 2, 또는 3이며,
단 적어도 1개의 X는 푸코스이다.
조성물의 특정한 측면에서, 접합체는 하기 화학식 II를 포함하고:
<화학식 II>
Figure pct00022
상기 식에서
(i) 각 경우의
Figure pct00023
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
(ii) 각 경우의
Figure pct00024
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭이고;
(iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
(iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
(v) -B1은 -T-
Figure pct00025
-푸코스이고, 여기서
Figure pct00026
은 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vi) -B2는 -T-
Figure pct00027
-X이고, 여기서 X는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하는 리간드이고;
Figure pct00028
는 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vii) n은 1, 2, 또는 3이다.
조성물의 특정한 측면에서, 두자리 링커는 상기 제시된 바와 같은 화학식 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, AB, AC, AD, AE, AF, AG, AH, AI, AJ, 또는 AK를 갖고, 여기서 각 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 푸코스를 포함한다. 특정한 측면에서, 각 X는 독립적으로 상기 제시된 바와 같은 화학식 EG, EM, EBM, EGA, EF, EFβ, EBM, ETM, EDG, EDF, 또는 EDM을 가질 수 있다.
IOC-1, 1OC-2, IOC-3, IOC-4, IOC-5, IOC-6, IOC-7, IOC-8, IOC-9, IOC-10, IOC-11, IOC-12, IOC-13, IOC-14, IOC-15, IOC-16, IOC-17, IOC-18, IOC-19, IOC-20, IOC-21, IOC-22, IOC-23, IOC-24, IOC-25, IOC-26, IOC-27, IOC-28, IOC-29, IOC-30, IOC-31, IOC-32, IOC-33, IOC-34, IOC-35, IOC-36, IOC-37, IOC-38, IOC-39, IOC-41, IOC-42, IOC-43, IOC-44, IOC-45, IOC-46, IOC-47, IOC-49, IOC-50, IOC-51, IOC-52, IOC-53, IOC-54, IOC-55, IOC-56, IOC-57, IOC-58, IOC-59, IOC-60, IOC-61, IOC-62, IOC-63, IOC-64, IOC-65, IOC-66, IOC-67, IOC-68, IOC-69, IOC-70, IOC-71, IOC-72, IOC-73, IOC-74, IOC-75, IOC-76, IOC-77, IOC-78, IOC-79, IOC-80, IOC-81, IOC-82, IOC-83, IOC-84, IOC-85, IOC-86, IOC-87, IOC-88, IOC-89, IOC-90, IOC-91, IOC-92, IOC-93, IOC-94, IOC-95, IOC-96, IOC-97, IOC-98, IOC-99, 또는 IOC-100에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물; IOC-101, 1OC-102, IOC-103, IOC-104, IOC-105, IOC-106, IOC-107, IOC-108, IOC-109, IOC-110, IOC-111, IOC-112, IOC-113, IOC-114, IOC-115, IOC-116, IOC-117, IOC-118, IOC-119, IOC-120, IOC-121, IOC-122, IOC-123, IOC-124, IOC-125, IOC-126, IOC-127, IOC-128, IOC-129, IOC-130, IOC-131, IOC-132, IOC-133, IOC-134, IOC-135, IOC-136, IOC-137, IOC-138, IOC-139, IOC-140, IOC-141, IOC-142, IOC-143, IOC-144, IOC-145, IOC-146, IOC-147, IOC-149, IOC-150, IOC-151, IOC-152, IOC-153, IOC-154, IOC-155, IOC-156, IOC-157, IOC-158, IOC-159, IOC-160, IOC-161, IOC-162, IOC-163, IOC-164, IOC-165, IOC-166, IOC-167, IOC-168, IOC-169, IOC-170, IOC-171, IOC-172, IOC-173, IOC-174, IOC-175, IOC-176, IOC-177, IOC-178, IOC-179, IOC-180, IOC-181, IOC-182, IOC-183, IOC-184, IOC-185, IOC-186, IOC-187, IOC-188, IOC-189, IOC-190, IOC-191, 또는 IOC-192에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물; 및 IOC-193, 1OC-194, IOC-195, IOC-196, IOC-197, IOC-198, IOC-199, IOC-200, IOC-201, IOC-202, IOC-203, IOC-204, IOC-205, IOC-206, IOC-207, IOC-208, IOC-210, IOC-211, IOC-212, IOC-213, IOC-214, IOC-215, IOC-216, IOC-217, IOC-218, IOC-219, IOC-220, IOC-221, IOC-222, IOC-223, IOC-224, IOC-225, IOC-226, IOC-227, IOC-228, IOC-229, IOC-230, IOC-231, IOC-232, IOC-233, IOC-234, IOC-235, IOC-236, IOC-237, IOC-238, IOC-239, IOC-240, IOC-241, IOC-242, IOC-243, IOC-244, IOC-245, IOC-246, IOC-247, IOC-248, IOC-249, IOC-250, IOC-251, IOC-252, IOC-253, IOC-254, IOC-255, IOC-256, IOC-257, IOC-258, IOC-259, IOC-260, IOC-261, IOC-262, IOC-263, IOC-264, IOC-265, IOC-266, IOC-267, IOC-268, IOC-269, IOC-270, IOC-271, 또는 IOC-272에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
본 발명은 당뇨병의 치료를 위한 본원에 개시된 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 특정한 측면에서, 당뇨병은 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병이다.
본 발명은 당뇨병을 가진 대상체에게 당뇨병의 치료를 위해 소정량의 조성물을 투여하여 당뇨병을 치료하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이며, 이에 따라 접합체가 제공되고, 상기 투여는 당뇨병을 치료하는 것인, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 특정한 측면에서, 투여되는 조성물의 양은 유효량 또는 치료 유효량이다.
일반적으로, 제2 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
특정한 측면에서, 분지형 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있는 아미노산에 공유 연결된다.
추가 실시양태에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제2 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제3 사카라이드를 포함하는 제3 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제4 사카라이드를 포함하는 제4 리간드에 연결된다. 특정한 측면에서, 제2 분지형 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된다.
추가 실시양태에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제3 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제5 사카라이드를 포함하는 제5 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제6 사카라이드를 포함하는 제6 리간드에 연결된다. 특정한 측면에서, 제3 분지형 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커 및 제2 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된다.
상기 접합체의 임의의 실시양태에서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 사카라이드는 각각 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
추가 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자는 사카라이드를 포함하는 리간드를 포함하는 선형 링커에 추가로 공유 연결되고, 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스일 수 있다.
특정한 측면에서, 인슐린 유사체 분자는 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데테미르, 또는 인슐린 글루리신이다.
상기 측면 또는 실시양태 중 어느 하나에서, 접합체는 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 사카라이드 결합 분자의 부재 하에 투여되었을 때 혈청 사카라이드의 혈청 농도에 감수성인 약역학적 (PD) 또는 약동학적 (PK) 프로파일을 나타낸다. 특정한 측면에서, 혈청 사카라이드는 글루코스 또는 알파-메틸만노스이다. 특정한 측면에서, 접합체는 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되었을 때 내인성 사카라이드 결합 분자에 60 mg/dL 이하의 혈청 글루코스 농도에서 결합한다. 내인성 사카라이드 결합 분자는 인간 만노스 수용체 1일 수 있다.
조성물의 특정한 측면에서, 접합체는 하기 화학식 I을 갖고:
<화학식 I>
Figure pct00029
상기 식에서
(i) 각 경우의
Figure pct00030
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
(ii) 각 경우의
Figure pct00031
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
(iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
(iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
(v) -B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이고, 각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vi) n은 1, 2, 또는 3이며,
단 적어도 1개의 X는 푸코스이다.
조성물의 특정한 측면에서, 접합체는 하기 화학식 II를 포함하고:
<화학식 II>
Figure pct00032
상기 식에서
(i) 각 경우의
Figure pct00033
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
(ii) 각 경우의
Figure pct00034
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
(iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
(iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
(v) -B1은 -T-
Figure pct00035
-푸코스이고, 여기서
Figure pct00036
은 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vi) -B2는 -T-
Figure pct00037
-X이고, 여기서 X는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하는 리간드이고;
Figure pct00038
는 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
(vii) n은 1, 2, 또는 3이다.
조성물의 특정한 측면에서, 두자리 링커는 상기 제시된 바와 같은 화학식 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, AB, AC, AD, AE, AF, AG, AH, AI, AJ, 또는 AK를 갖고, 여기서 각 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 푸코스를 포함한다. 특정한 측면에서, 각 X는 독립적으로 상기 제시된 바와 같은 화학식 EG, EM, EBM, EGA, EF, EFβ, EBM, ETM, EDG, EDF, 또는 EDM을 가질 수 있다.
본 발명은 IOC-1, 1OC-2, IOC-3, IOC-4, IOC-5, IOC-6, IOC-7, IOC-8, IOC-9, IOC-10, IOC-11, IOC-12, IOC-13, IOC-14, IOC-15, IOC-16, IOC-17, IOC-18, IOC-19, IOC-20, IOC-21, IOC-22, IOC-23, IOC-24, IOC-25, IOC-26, IOC-27, IOC-28, IOC-29, IOC-30, IOC-31, IOC-32, IOC-33, IOC-34, IOC-35, IOC-36, IOC-37, IOC-38, IOC-39, IOC-41, IOC-42, IOC-43, IOC-44, IOC-45, IOC-46, IOC-47, IOC-49, IOC-50, IOC-51, IOC-52, IOC-53, IOC-54, IOC-55, IOC-56, IOC-57, IOC-58, IOC-59, IOC-60, IOC-61, IOC-62, IOC-63, IOC-64, IOC-65, IOC-66, IOC-67, IOC-68, IOC-69, IOC-70, IOC-71, IOC-72, IOC-73, IOC-74, IOC-75, IOC-76, IOC-77, IOC-78, IOC-79, IOC-80, IOC-81, IOC-82, IOC-83, IOC-84, IOC-85, IOC-86, IOC-87, IOC-88, IOC-89, IOC-90, IOC-91, IOC-92, IOC-93, IOC-94, IOC-95, IOC-96, IOC-97, IOC-98, IOC-99, 또는 IOC-100에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하여 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법; IOC-101, 1OC-102, IOC-103, IOC-104, IOC-105, IOC-106, IOC-107, IOC-108, IOC-109, IOC-110, IOC-111, IOC-112, IOC-113, IOC-114, IOC-115, IOC-116, IOC-117, IOC-118, IOC-119, IOC-120, IOC-121, IOC-122, IOC-123, IOC-124, IOC-125, IOC-126, IOC-127, IOC-128, IOC-129, IOC-130, IOC-131, IOC-132, IOC-133, IOC-134, IOC-135, IOC-136, IOC-137, IOC-138, IOC-139, IOC-140, IOC-141, IOC-142, IOC-143, IOC-144, IOC-145, IOC-146, IOC-147, IOC-149, IOC-150, IOC-151, IOC-152, IOC-153, IOC-154, IOC-155, IOC-156, IOC-157, IOC-158, IOC-159, IOC-160, IOC-161, IOC-162, IOC-163, IOC-164, IOC-165, IOC-166, IOC-167, IOC-168, IOC-169, IOC-170, IOC-171, IOC-172, IOC-173, IOC-174, IOC-175, IOC-176, IOC-177, IOC-178, IOC-179, IOC-180, IOC-181, IOC-182, IOC-183, IOC-184, IOC-185, IOC-186, IOC-187, IOC-188, IOC-189, IOC-190, IOC-191, 또는 IOC-192에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하여 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법; 및 IOC-193, 1OC-194, IOC-195, IOC-196, IOC-197, IOC-198, IOC-199, IOC-200, IOC-201, IOC-202, IOC-203, IOC-204, IOC-205, IOC-206, IOC-207, IOC-208, IOC-210, IOC-211, IOC-212, IOC-213, IOC-214, IOC-215, IOC-216, IOC-217, IOC-218, IOC-219, IOC-220, IOC-221, IOC-222, IOC-223, IOC-224, IOC-225, IOC-226, IOC-227, IOC-228, IOC-229, IOC-230, IOC-231, IOC-232, IOC-233, IOC-234, IOC-235, IOC-236, IOC-237, IOC-238, IOC-239, IOC-240, IOC-241, IOC-242, IOC-243, IOC-244, IOC-245, IOC-246, IOC-247, IOC-248, IOC-249, IOC-250, IOC-251, IOC-252, IOC-253, IOC-254, IOC-255, IOC-256, IOC-257, IOC-258, IOC-259, IOC-260, IOC-261, IOC-262, IOC-263, IOC-264, IOC-265, IOC-266, IOC-267, IOC-268, IOC-269, IOC-270, IOC-271, 또는 IOC-272에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하여 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
방법의 상기 언급된 측면 또는 실시양태 중 어느 하나에서, 당뇨병은 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병이다.
본 발명은 적어도 1개의 푸코스 분자를 포함하며, 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 하는 인슐린 및 인슐린 유사체 접합체; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
특정한 측면에서, 접합체는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이다. 추가 측면에서, 제2 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 본원에 개시된 바와 같은 접합체일 수 있다.
본 발명은 푸코스를 포함하며, 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 하는 접합체; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하여 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이다. 추가 측면에서, 제2 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 본원에 개시된 바와 같은 접합체일 수 있다.
특정한 측면에서, 당뇨병은 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병이다.
정의
명세서 전반에 걸쳐 사용된 구체적 관능기, 화학적 용어 및 일반적 용어의 정의가 하기에 보다 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 화학 원소는 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.]의 표지 안쪽의 원소 주기율표 (CAS 버전)에 따라 확인되며, 구체적 관능기는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가로, 유기 화학의 일반적 원리, 뿐만 아니라 구체적 관능 모이어티 및 반응성은 문헌 [Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있다.
아실 - 본원에 사용된 용어 "아실"은 화학식 -C(=O)RX1, -C(=O)ORX1, -C(=O)-O-C(=O)RX1, -C(=O)SRX1, -C(=O)N(RX1)2, -C(=S)RX1, -C(=S)N(RX1)2, 및 -C(=S)S(RX1), -C(=NRX1)RX1, -C(=NRX1)ORX1, -C(=NRX1)SRX1, 및 -C(=NRX1)N(RX1)2를 갖는 기를 지칭하며, 여기서 RX1은 수소; 할로겐; 치환 또는 비치환된 히드록실; 치환 또는 비치환된 티올; 치환 또는 비치환된 아미노; 치환 또는 비치환된 아실, 시클릭 또는 비-시클릭 치환 또는 비치환된 분지형 또는 비분지형 지방족; 시클릭 또는 비-시클릭 치환 또는 비치환된 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 시클릭 또는 비-시클릭 치환 또는 비치환된 분지형 또는 비분지형 알킬; 시클릭 또는 비-시클릭 치환 또는 비치환된 분지형 또는 비분지형 알케닐; 치환 또는 비치환된 알키닐; 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 모노- 또는 디-지방족아미노, 모노- 또는 디-헤테로지방족아미노, 모노- 또는 디-알킬아미노, 모노- 또는 디-헤테로알킬아미노, 모노- 또는 디-아릴아미노, 또는 모노- 또는 디-헤테로아릴아미노이거나; 또는 2개의 RX1 기는 함께 5- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 예시적인 아실 기는 알데히드 (-CHO), 카르복실산 (-CO2H), 케톤, 아실 할라이드, 에스테르, 아미드, 이민, 카르보네이트, 카르바메이트 및 우레아를 포함한다. 아실 치환기는 안정한 모이어티를 형성하는 본원에 기재된 임의의 치환기 (예를 들어, 그의 각각이 추가로 치환될 수 있거나 또는 치환되지 않을 수 있는 지방족, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로지방족, 헤테로시클릭, 아릴, 헤테로아릴, 아실, 옥소, 이미노, 티오옥소, 시아노, 이소시아노, 아미노, 아지도, 니트로, 히드록실, 티올, 할로, 지방족아미노, 헤테로지방족아미노, 알킬아미노, 헤테로알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 알킬아릴, 아릴알킬, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 아실옥시 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
지방족 - 본원에 사용된 용어 "지방족" 또는 "지방족 기"는 직쇄형 (즉, 비분지형), 분지형 또는 시클릭 ("카르보시클릭")일 수 있고, 완전히 포화될 수 있거나, 불포화의 1개 이상의 단위를 함유할 수 있으나 방향족은 아닌, 임의로 치환된 탄화수소 모이어티를 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 지방족 기는 1-12개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방족 기는 1-6개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방족 기는 1-4개의 탄소 원자를 포함하고, 또 다른 실시양태에서, 지방족 기는 1-3개의 탄소 원자를 함유한다. 적합한 지방족 기는 선형 또는 분지형, 알킬, 알케닐 및 알키닐 기, 및 그의 하이브리드, 예컨대 (시클로알킬)알킬, (시클로알케닐)알킬 또는 (시클로알킬)알케닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
알케닐 - 본원에 사용된 용어 "알케닐"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 지방족 모이어티로부터 유래된 임의로 치환된 1가 기를 나타낸다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알케닐 기는 2-6개의 탄소 원자를 함유한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알케닐 기는 2-5개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알케닐 기는 2-4개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 사용된 알케닐 기는 2-3개의 탄소 원자를 함유한다. 알케닐 기는 예를 들어 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일 등을 포함한다.
알킬 - 본원에 사용된 용어 "알킬"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 1-6개 탄소 원자를 함유하는 지방족 모이어티로부터 유래된 임의로 치환된 포화, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알킬 기는 1-5개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 사용된 알킬 기는 1-4개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 알킬 기는 1-3개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 알킬 기는 1-2개의 탄소를 함유한다. 알킬 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, sec-펜틸, 이소-펜틸, tert-부틸, n-펜틸, 네오펜틸, n-헥실, sec-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-데실, n-운데실, 도데실 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
알키닐 - 본원에 사용된 용어 "알키닐"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 지방족 모이어티로부터 유래된 임의로 치환된 1가 기를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알키닐 기는 2-6개의 탄소 원자를 함유한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알키닐 기는 2-5개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알키닐 기는 2-4개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 사용된 알키닐 기는 2-3개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 알키닐 기는 에티닐, 2-프로피닐 (프로파르길), 1-프로피닐 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
아릴 - 본원에 사용된 바와 같이, 단독으로 또는 더 큰 모이어티의 일부로서 ("아르알킬", "아르알콕시" 또는 "아릴옥시알킬"에서와 같이) 사용된 용어 "아릴"은 총 5 내지 10개의 고리원을 갖는 임의로 치환된 모노시클릭 및 비시클릭 고리계를 지칭하며, 여기서 계 내의 적어도 1개의 고리는 방향족이고, 계 내의 각각의 고리는 3 내지 7개의 고리원을 함유한다. 용어 "아릴"은 용어 "아릴 고리"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, "아릴"은 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라실 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방향족 고리계를 지칭하며, 이것은 1개 이상의 치환기를 보유할 수 있다.
아릴알킬 - 본원에 사용된 용어 "아릴알킬"은 아릴 기 (예를 들어, 방향족 또는 헤테로방향족 기)로 치환된 알킬 기를 지칭한다.
두자리 - 단일 단위분자로서 함께 공유 결합된 2개 이상의 분자로부터 형성된 분자.
2가 탄화수소 쇄 - 본원에 사용된 용어 "2가 탄화수소 쇄" (또한 "2가 알킬렌 기"로 지칭됨)는, 폴리메틸렌 기, 즉 -(CH2)z-이고, 여기서 z는 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 12, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4, 또는 2 내지 3의 양의 정수이다. 치환된 2가 탄화수소 쇄는 1개 이상의 메틸렌 수소 원자가 치환기로 대체된 폴리메틸렌 기이다. 적합한 치환기는 치환된 지방족 기에 대해 하기 기재되는 것을 포함한다.
카르보닐 - 본원에 사용된 용어 "카르보닐"은 탄소-산소 이중 결합을 함유하는 1가 또는 2가 모이어티를 지칭한다. 카르보닐 기의 비제한적 예는 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 에논, 아실 할라이드, 무수물, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 티오에스테르, 락톤, 락탐, 히드록사메이트, 이소시아네이트 및 클로로포르메이트를 포함한다.
시클로지방족 - 본원에 사용된 바와 같이, 단독으로 또는 더 큰 모이어티의 일부로서 사용된 용어 "시클로지방족", "카르보사이클" 또는 "카르보시클릭"은 3 내지 10개의 구성원을 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 임의로 치환된 포화 또는 부분 불포화 시클릭 지방족 모노시클릭 또는 비시클릭 고리계를 지칭한다. 시클로지방족 기는 비제한적으로 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로헵테닐, 시클로옥틸, 시클로옥테닐 및 시클로옥타디에닐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클로알킬은 3-6개의 탄소를 갖는다.
푸코스 - 푸코스의 D 또는 L 형태를 지칭하고, 산소 또는 탄소 연결된 글리코시드를 지칭할 수 있다.
할로겐 - 본원에 사용된 용어 "할로" 및 "할로겐"은 플루오린 (플루오로, -F), 염소 (클로로, -Cl), 브로민 (브로모, -Br) 및 아이오딘 (아이오도, -I)으로부터 선택된 원자를 지칭한다.
헤테로지방족 - 본원에 사용된 용어 "헤테로지방족" 또는 "헤테로지방족 기"는 탄소 원자 뿐만 아니라 1 내지 5개의 헤테로원자를 갖는, 직쇄 (즉, 비분지형), 분지형 또는 시클릭 ("헤테로시클릭")일 수 있고, 완전히 포화될 수 있거나, 또는 불포화의 1개 이상의 단위를 함유할 수 있으나 방향족은 아닌, 임의로 치환된 탄화수소 모이어티를 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 헤테로지방족 기는 1-6개의 탄소 원자를 함유하며, 여기서 1-3개의 탄소 원자가 임의로 및 독립적으로 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된다. 일부 실시양태에서, 헤테로지방족 기는 1-4개의 탄소 원자를 함유하며, 여기서 1-2개의 탄소 원자가 임의로 및 독립적으로 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 헤테로지방족 기는 1-3개의 탄소 원자를 함유하며, 여기서 1개의 탄소 원자가 임의로 및 독립적으로 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된다. 적합한 헤테로지방족 기는 선형 또는 분지형, 헤테로알킬, 헤테로알케닐 및 헤테로알키닐 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
헤테로아르알킬 - 본원에 사용된 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로아릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
헤테로아릴 - 본원에 사용된 바와 같이, 단독으로 또는 더 큰 모이어티의 일부로서 (예를 들어, "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아르알콕시") 사용된 용어 "헤테로아릴"은 5 내지 10개의 고리 원자, 바람직하게는 5, 6 또는 9개의 고리 원자를 갖고, 고리 배열 내에 공유하는 6, 10 또는 14개의 π 전자를 가지며, 탄소 원자 뿐만 아니라 1 내지 5개의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 기를 지칭한다. 헤테로아릴 기는 비제한적으로 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐 및 프테리디닐을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 또한 헤테로방향족 고리가 1개 이상의 아릴, 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리에 융합되고, 여기서 라디칼 또는 부착 지점이 헤테로방향족 고리 상에 있는 기를 포함한다. 비제한적인 예는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 디벤조푸라닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 4H-퀴놀리지닐, 카르바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 테트라히드로퀴놀리닐 및 테트라히드로이소퀴놀리닐을 포함한다. 헤테로아릴 기는 모노- 또는 비시클릭일 수 있다. 용어 "헤테로아릴"은 용어 "헤테로아릴 고리", "헤테로아릴 기" 또는 "헤테로방향족"과 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 이들 중 임의의 용어는 임의로 치환된 고리를 포함한다.
헤테로원자 - 본원에 사용된 용어 "헤테로원자"는 질소, 산소 또는 황을 지칭하며, 질소 또는 황의 임의의 산화된 형태, 및 염기성 질소의 임의의 4급화된 형태를 포함한다. 용어 "질소"는 또한 치환된 질소를 포함한다.
헤테로시클릭 - 본원에 사용된 용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릭 라디칼" 및 "헤테로시클릭 고리"는 상호교환가능하게 사용되고, 상기 정의된 바와 같이 포화 또는 부분 불포화되며, 탄소 원자 뿐만 아니라 1개 이상의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환된 안정한 5- 내지 7-원 모노시클릭 또는 7- 내지 10-원 비시클릭 헤테로시클릭 모이어티를 지칭한다. 헤테로시클릭 고리는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 그의 펜던트 기에 부착되어 안정한 구조를 생성할 수 있고, 임의의 고리 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로시클릭 라디칼의 예는 비제한적으로 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐, 및 퀴누클리디닐을 포함된다. 용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릴 고리", "헤테로시클릭 기", "헤테로시클릭 모이어티" 및 "헤테로시클릭 라디칼"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 또한 헤테로시클릴 고리가 1개 이상의 아릴, 헤테로아릴 또는 카르보시클릭 고리에 융합된 기, 예컨대 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐 또는 테트라히드로퀴놀리닐 (여기서, 라디칼 또는 부착 지점은 헤테로시클릴 고리 상에 있음)을 포함한다. 헤테로시클릴 기는 모노- 또는 비시클릭일 수 있다. 용어 "헤테로시클릴알킬"은 헤테로시클릴에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로시클릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
불포화 - 본원에 사용된 용어 "불포화"는 모이어티가 1개 이상의 이중 또는 삼중 결합을 갖는다는 것을 의미한다.
부분 불포화 - 본원에 사용된 용어 "부분 불포화"는 적어도 1개의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 고리 모이어티를 지칭한다. 본원에 정의된 바와 같이, 용어 "부분 불포화"는 다중 불포화 부위를 갖는 고리를 포괄하도록 의도되지만, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하는 것으로 의도되지는 않는다.
임의로 치환된 - 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 "임의로 치환된" 모이어티를 함유할 수 있다. 일반적으로, 용어 "치환된"은, 용어 "임의로"가 앞에 있든 없든, 지정된 모이어티의 1개 이상의 수소가 적합한 치환기로 대체된다는 것을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, "임의로 치환된" 기는 기의 각각의 치환가능한 위치에 적합한 치환기를 가질 수 있고, 임의의 주어진 구조 내의 1개 초과의 위치가 명시된 군으로부터 선택된 1개의 초과의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 의해 고려된 치환기의 조합은 바람직하게는 안정한 또는 화학적으로 실현가능한 화합물을 형성하는 것이다. 본원에 사용된 용어 "안정한"은 화합물의 생성, 검출, 및 특정 실시양태에서는 화합물의 회수, 정제가 허용되는 조건 및 본원에 개시된 목적 중 하나 이상을 위해 사용되는 조건에 적용되었을 때 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 지칭한다.
"임의로 치환된" 기의 치환가능한 탄소 원자 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐; -(CH2)0-4R○; -(CH2)0- 4OR○; -O-(CH2)0- 4C(O)OR○; -(CH2)0- 4CH(OR○)2; -(CH2)0- 4SR○; -(CH2)0- 4Ph (R○로 치환될 수 있음); -(CH2)0- 4O(CH2)0 - 1Ph (R○로 치환될 수 있음); -CH=CHPh (R○로 치환될 수 있음); -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0- 4N(R○)2; -(CH2)0-4N(R○)C(O)R○; -N(R○)C(S)R○; -(CH2)0- 4N(R○)C(O)NR○ 2; -N(R○)C(S)NR○ 2; -(CH2)0-4N(R○)C(O)OR○; -N(R○)N(R○)C(O)R○; -N(R○)N(R○)C(O)NR○ 2; -N(R○)N(R○)C(O)OR○; -(CH2)0- 4C(O)R○; -C(S)R○; -(CH2)0- 4C(O)OR○; -(CH2)0- 4C(O)SR○; -(CH2)0-4C(O)OSiR○ 3; -(CH2)0- 4OC(O)R○; -OC(O)(CH2)0- 4SR-, SC(S)SR○; -(CH2)0- 4SC(O)R○; -(CH2)0-4C(O)NR○ 2; -C(S)NR○ 2; -C(S)SR○; -SC(S)SR○, -(CH2)0- 4OC(O)NR○ 2; -C(O)N(OR○)R○; -C(O)C(O)R○; -C(O)CH2C(O)R○; -C(NOR○)R○; -(CH2)0- 4SSR○; -(CH2)0- 4S(O)2R○; -(CH2)0-4S(O)2OR○; -(CH2)0- 4OS(O)2R○; -S(O)2NR○ 2; -(CH2)0- 4S(O)R○; -N(R○)S(O)2NR○ 2; -N(R○)S(O)2R○; -N(OR○)R○; -C(NH)NR○ 2; -P(O)2R○; -P(O)R○ 2; -OP(O)R○ 2; -OP(O)(OR○)2; SiR○ 3; -(C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)O-N(R○)2; 또는 -(C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)C(O)O-N(R○)2이고, 여기서 각 R○은 하기 정의되는 바와 같이 치환될 수 있고, 독립적으로 수소, C1-6　지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0- 1Ph, 또는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이거나, 또는 상기 정의에도 불구하고, 2가지 독립적 경우의 R○은 그에 개재된 원자(들)와 함께, 하기 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는, 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 3-12-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 모노- 또는 비시클릭 고리를 형성한다.
R○ (또는 2가지 독립적 경우의 R○이 그에 개재된 원자와 함께 형성한 고리) 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2R●, -(할로R●), -(CH2)0- 2OH, -(CH2)0-2OR●, -(CH2)0- 2CH(OR●)2; -O(할로R●), -CN, -N3, -(CH2)0- 2C(O)R●, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0- 2C(O)OR●, -(CH2)0- 2SR●, -(CH2)0- 2SH, -(CH2)0- 2NH2, -(CH2)0- 2NHR●, -(CH2)0-2NR● 2, -NO2, -SiR● 3, -OSiR● 3, -C(O)SR●, -(C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)C(O)OR●, 또는 -SSR●이고, 여기서 각 R●은 비치환되거나 또는 앞에 "할로"가 있는 경우에 오직 1개 이상의 할로겐으로 치환되고, 독립적으로 C1-4　지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리로부터 선택된다. R○의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 =O 및 =S를 포함한다.
"임의로 치환된" 기의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 하기: =O, =S, =NNR* 2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R* 2))2-3O-, 또는 -S(C(R* 2))2-3S-를 포함하고, 여기서 각 독립적 경우의 R*는 수소, 하기 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6　지방족, 또는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리로부터 선택된다. "임의로 치환된" 기의 이웃자리 치환가능한 탄소에 결합되는 적합한 2가 치환기는 -O(CR* 2)2 -3O-를 포함하고, 여기서 각 독립적 경우의 R*는 수소, 하기 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6　지방족, 또는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리로부터 선택된다.
R*의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2를 포함하고, 여기서 각 R●은 비치환되거나 또는 앞에 "할로"가 있는 경우에 오직 1개 이상의 할로겐으로 치환되고, 독립적으로 C1-4　지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0- 1Ph, 또는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
"임의로 치환된" 기의 치환가능한 질소 상의 적합한 치환기는 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2, 또는 -N(R†)S(O)2R†를 포함하고; 여기서 각 R†는 독립적으로 수소, 하기 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 비치환된 -OPh, 또는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이거나, 또는 상기 정의에도 불구하고, 2가지 독립적 경우의 R†는 그에 기재된 원자(들)와 함께 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 3-12-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 모노- 또는 비시클릭 고리를 형성한다.
R†의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2이고, 여기서 각 R●은 비치환되거나 또는 앞에 "할로"가 있는 경우에 오직 1개 이상의 할로겐으로 치환되고, 독립적으로 C1-4　지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0- 1Ph, 또는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
적합한 보호기 - 본원에 사용된 용어 "적합한 보호기"는 화합물 내의 그의 위치에 따라 아미노 보호기 또는 히드록실 보호기를 지칭하고, 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 상세히 기재된 것을 포함한다.
적합한 아미노 보호기는 메틸 카르바메이트, 에틸 카르바메이트, 9-플루오레닐메틸 카르바메이트 (Fmoc), 9-(2-술포)플루오레닐메틸 카르바메이트, 9-(2,7-디브로모)플루오로에닐메틸 카르바메이트, 2,7-디-t-부틸-[9-(10,10-디옥소-10,10,10,10-테트라히드로티오크산틸)]메틸 카르바메이트 (DBD-Tmoc), 4-메톡시페나실 카르바메이트 (Phenoc), 2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (Troc), 2-트리메틸실릴에틸 카르바메이트 (Teoc), 2-페닐에틸 카르바메이트 (hZ), 1-(1-아다만틸)-1-메틸에틸 카르바메이트 (Adpoc), 1,1-디메틸-2-할로에틸 카르바메이트, 1,1-디메틸-2,2-디브로모에틸 카르바메이트 (DB-t-BOC), 1,1-디메틸-2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (TCBOC), 1-메틸-1-(4-비페닐릴)에틸 카르바메이트 (Bpoc), 1-(3,5-디-t-부틸페닐)-1-메틸에틸 카르바메이트 (t-Bumeoc), 2-(2'- 및 4'-피리딜)에틸 카르바메이트 (Pyoc), 2-(N,N-디시클로헥실카르복스아미도)에틸 카르바메이트, t-부틸 카르바메이트 (BOC), 1-아다만틸 카르바메이트 (Adoc), 비닐 카르바메이트 (Voc), 알릴 카르바메이트 (Alloc), 1-이소프로필알릴 카르바메이트 (Ipaoc), 신나밀 카르바메이트 (Coc), 4-니트로신나밀 카르바메이트 (Noc), 8-퀴놀릴 카르바메이트, N-히드록시피페리디닐 카르바메이트, 알킬디티오 카르바메이트, 벤질 카르바메이트 (Cbz), p-메톡시벤질 카르바메이트 (Moz), p-니트로벤질 카르바메이트, p-브로모벤질 카르바메이트, p-클로로벤질 카르바메이트, 2,4-디클로로벤질 카르바메이트, 4-메틸술피닐벤질 카르바메이트 (Msz), 9-안트릴메틸 카르바메이트, 디페닐메틸 카르바메이트, 2-메틸티오에틸 카르바메이트, 2-메틸술포닐에틸 카르바메이트, 2-(p-톨루엔술포닐)에틸 카르바메이트, [2-(1,3-디티아닐)]메틸 카르바메이트 (Dmoc), 4-메틸티오페닐 카르바메이트 (Mtpc), 2,4-디메틸티오페닐 카르바메이트 (Bmpc), 2-포스포니오에틸 카르바메이트 (Peoc), 2-트리페닐포스포니오이소프로필 카르바메이트 (Ppoc), 1,1-디메틸-2-시아노에틸 카르바메이트, m-클로로-p-아실옥시벤질 카르바메이트, p-(디히드록시보릴)벤질 카르바메이트, 5-벤즈이속사졸릴메틸 카르바메이트, 2-(트리플루오로메틸)-6-크로모닐메틸 카르바메이트 (Tcroc), m-니트로페닐 카르바메이트, 3,5-디메톡시벤질 카르바메이트, o-니트로벤질 카르바메이트, 3,4-디메톡시-6-니트로벤질 카르바메이트, 페닐(o-니트로페닐)메틸 카르바메이트, 페노티아지닐-(10)-카르보닐 유도체, N'-p-톨루엔술포닐아미노카르보닐 유도체, N'-페닐아미노티오카르보닐 유도체, t-아밀 카르바메이트, S-벤질 티오카르바메이트, p-시아노벤질 카르바메이트, 시클로부틸 카르바메이트, 시클로헥실 카르바메이트, 시클로펜틸 카르바메이트, 시클로프로필메틸 카르바메이트, p-데실옥시벤질 카르바메이트, 2,2-디메톡시카르보닐비닐 카르바메이트, o-(N,N-디메틸카르복스아미도)벤질 카르바메이트, 1,1-디메틸-3-(N,N-디메틸카르복스아미도)프로필 카르바메이트, 1,1-디메틸프로피닐 카르바메이트, 디(2-피리딜)메틸 카르바메이트, 2-푸라닐메틸 카르바메이트, 2-아이오도에틸 카르바메이트, 이소보르닐 카르바메이트, 이소부틸 카르바메이트, 이소니코티닐 카르바메이트, p-(p'-메톡시페닐아조)벤질 카르바메이트, 1-메틸시클로부틸 카르바메이트, 1-메틸시클로헥실 카르바메이트, 1-메틸-1-시클로프로필메틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(3,5-디메톡시페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(p-페닐아조페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-페닐에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(4-피리딜)에틸 카르바메이트, 페닐 카르바메이트, p-(페닐아조)벤질 카르바메이트, 2,4,6-트리-t-부틸페닐 카르바메이트, 4-(트리메틸암모늄)벤질 카르바메이트, 2,4,6-트리메틸벤질 카르바메이트, 포름아미드, 아세트아미드, 클로로아세트아미드, 트리클로로아세트아미드, 트리플루오로아세트아미드, 페닐아세트아미드, 3-페닐프로판아미드, 피콜린아미드, 3-피리딜카르복스아미드, N-벤조일페닐알라닐 유도체, 벤즈아미드, p-페닐벤즈아미드, o-니트로페닐아세트아미드, o-니트로페녹시아세트아미드, 아세토아세트아미드, (N'-디티오벤질옥시카르보닐아미노)아세트아미드, 3-(p-히드록시페닐)프로판아미드, 3-(o-니트로페닐)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-니트로페녹시)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-페닐아조페녹시)프로판아미드, 4-클로로부탄아미드, 3-메틸-3-니트로부탄아미드, o-니트로신나미드, N-아세틸메티오닌 유도체, o-니트로벤즈아미드, o-(벤조일옥시메틸)벤즈아미드, 4,5-디페닐-3-옥사졸린-2-온, N-프탈이미드, N-디티아숙신이미드 (Dts), N-2,3-디페닐말레이미드, N-2,5-디메틸피롤, N-1,1,4,4-테트라메틸디실릴아자시클로펜탄 부가물 (STABASE), 5-치환된 1,3-디메틸-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 5-치환된 1,3-디벤질-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 1-치환된 3,5-디니트로-4-피리돈, N-메틸아민, N-알릴아민, N-[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸아민 (SEM), N-3-아세톡시프로필아민, N-(1-이소프로필-4-니트로-2-옥소-3-프롤린-3-일)아민, 4급 암모늄 염, N-벤질아민, N-디(4-메톡시페닐)메틸아민, N-5-디벤조수베릴아민, N-트리페닐메틸아민 (Tr), N-[(4-메톡시페닐)디페닐메틸]아민 (MMTr), N-9-페닐플루오레닐아민 (PhF), N-2,7-디클로로-9-플루오레닐메틸렌아민, N-페로세닐메틸아미노 (Fcm), N-2-피콜릴아미노 N'-옥시드, N-1,1-디메틸티오메틸렌아민, N-벤질리덴아민, N-p-메톡시벤질리덴아민, N-디페닐메틸렌아민, N-[(2-피리딜)메시틸]메틸렌아민, N-(N',N'-디메틸아미노메틸렌)아민, N,N'-이소프로필리덴디아민, N-p-니트로벤질리덴아민, N-살리실리덴아민, N-5-클로로살리실리덴아민, N-(5-클로로-2-히드록시페닐)페닐메틸렌아민, N-시클로헥실리덴아민, N-(5,5-디메틸-3-옥소-1-시클로헥세닐)아민, N-보란 유도체, N-디페닐보린산 유도체, N-[페닐(펜타카르보닐크로뮴- 또는 텅스텐)카르보닐]아민, N-구리 킬레이트, N-아연 킬레이트, N-니트로아민, N-니트로소아민, 아민 N-옥시드, 디페닐포스핀아미드 (Dpp), 디메틸티오포스핀아미드 (Mpt), 디페닐티오포스핀아미드 (Ppt), 디알킬 포스포르아미데이트, 디벤질 포스포르아미데이트, 디페닐 포스포르아미데이트, 벤젠술펜아미드, o-니트로벤젠술펜아미드 (Nps), 2,4-디니트로벤젠술펜아미드, 펜타클로로벤젠술펜아미드, 2-니트로-4-메톡시벤젠술펜아미드, 트리페닐메틸술펜아미드, 3-니트로피리딘술펜아미드 (Npys), p-톨루엔술폰아미드 (Ts), 벤젠술폰아미드, 2,3,6-트리메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mtr), 2,4,6-트리메톡시벤젠술폰아미드 (Mtb), 2,6-디메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Pme), 2,3,5,6-테트라메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mte), 4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mbs), 2,4,6-트리메틸벤젠술폰아미드 (Mts), 2,6-디메톡시-4-메틸벤젠술폰아미드 (iMds), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술폰아미드 (Pmc), 메탄술폰아미드 (Ms), β-트리메틸실릴에탄술폰아미드 (SES), 9-안트라센술폰아미드, 4-(4',8'-디메톡시나프틸메틸)벤젠술폰아미드 (DNMBS), 벤질술폰아미드, 트리플루오로메틸술폰아미드, 및 페나실술폰아미드를 포함한다.
적합한 히드록실 보호기는 메틸, 메톡실메틸 (MOM), 메틸티오메틸 (MTM), t-부틸티오메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸 (SMOM), 벤질옥시메틸 (BOM), p-메톡시벤질옥시메틸 (PMBM), (4-메톡시페녹시)메틸 (p-AOM), 구아이아콜메틸 (GUM), t-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸 (POM), 실록시메틸, 2-메톡시에톡시메틸 (MEM), 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 비스(2-클로로에톡시)메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 (SEMOR), 테트라히드로피라닐 (THP), 3-브로모테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 1-메톡시시클로헥실, 4-메톡시테트라히드로피라닐 (MTHP), 4-메톡시테트라히드로티오피라닐, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 S,S-디옥시드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일 (CTMP), 1,4-디옥산-2-일, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오푸라닐, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로-7,8,8-트리메틸-4,7-메타노벤조푸란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, t-부틸, 알릴, p-클로로페닐, p-메톡시페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, p-페닐벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥시도, 디페닐메틸, p,p'-디니트로벤즈히드릴, 5-디벤조수베릴, 트리페닐메틸, α-나프틸디페닐메틸, p-메톡시페닐디페닐메틸, 디(p-메톡시페닐)페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모페나실옥시페닐)디페닐메틸, 4,4',4''-트리스(4,5-디클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4''-트리스(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4''-트리스(벤조일옥시페닐)메틸, 3-(이미다졸-1-일)비스(4',4''-디메톡시페닐)메틸, 1,1-비스(4-메톡시페닐)-1'-피레닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)크산테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조디티올란-2-일, 벤즈이소티아졸릴 S,S-디옥시도, 트리메틸실릴 (TMS), 트리에틸실릴 (TES), 트리이소프로필실릴 (TIPS), 디메틸이소프로필실릴 (IPDMS), 디에틸이소프로필실릴 (DEIPS), 디메틸텍실실릴, t-부틸디메틸실릴 (TBDMS), t-부틸디페닐실릴 (TBDPS), 트리벤질실릴, 트리-p-크실릴실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴 (DPMS), t-부틸메톡시페닐실릴 (TBMPS), 포르메이트, 벤조일포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 디클로로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, 페녹시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트 (레불리네이트), 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트 (레불리노일디티오아세탈), 피발로에이트, 아다만토에이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, p-페닐벤조에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트 (메시토에이트), 알킬 메틸 카르보네이트, 9-플루오레닐메틸 카르보네이트 (Fmoc), 알킬 에틸 카르보네이트, 알킬 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트 (Troc), 2-(트리메틸실릴)에틸 카르보네이트 (TMSEC), 2-(페닐술포닐) 에틸 카르보네이트 (Psec), 2-(트리페닐포스포니오) 에틸 카르보네이트 (Peoc), 알킬 이소부틸 카르보네이트, 알킬 비닐 카르보네이트 알킬 알릴 카르보네이트, 알킬 p-니트로페닐 카르보네이트, 알킬 벤질 카르보네이트, 알킬 p-메톡시벤질 카르보네이트, 알킬 3,4-디메톡시벤질 카르보네이트, 알킬 o-니트로벤질 카르보네이트, 알킬 p-니트로벤질 카르보네이트, 알킬 S-벤질 티오카르보네이트, 4-에톡시-1-나프틸 카르보네이트, 메틸 디티오카르보네이트, 2-아이오도벤조에이트, 4-아지도부티레이트, 4-니트로-4-메틸펜타노에이트, o-(디브로모메틸)벤조에이트, 2-포르밀벤젠술포네이트, 2-(메틸티오메톡시)에틸, 4-(메틸티오메톡시)부티레이트, 2-(메틸티오메톡시메틸)벤조에이트, 2,6-디클로로-4-메틸페녹시아세테이트, 2,6-디클로로-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페녹시아세테이트, 2,4-비스(1,1-디메틸프로필)페녹시아세테이트, 클로로디페닐아세테이트, 이소부티레이트, 모노숙시노에이트, (E)-2-메틸-2-부테노에이트, o-(메톡시카르보닐)벤조에이트, α-나프토에이트, 니트레이트, 알킬 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미데이트, 알킬 N-페닐카르바메이트, 보레이트, 디메틸포스피노티오일, 알킬 2,4-디니트로페닐술페네이트, 술페이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 벤질술포네이트, 및 토실레이트 (Ts)를 포함한다. 1,2- 또는 1,3-디올 보호를 위한 보호기는 메틸렌 아세탈, 에틸리덴 아세탈, 1-t-부틸에틸리덴 케탈, 1-페닐에틸리덴 케탈, (4-메톡시페닐)에틸리덴 아세탈, 2,2,2-트리클로로에틸리덴 아세탈, 아세토니드, 시클로펜틸리덴 케탈, 시클로헥실리덴 케탈, 시클로헵틸리덴 케탈, 벤질리덴 아세탈, p-메톡시벤질리덴 아세탈, 2,4-디메톡시벤질리덴 케탈, 3,4-디메톡시벤질리덴 아세탈, 2-니트로벤질리덴 아세탈, 메톡시메틸렌 아세탈, 에톡시메틸렌 아세탈, 디메톡시메틸렌 오르토 에스테르, 1-메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, 1-에톡시에틸리덴 오르토 에스테르, 1,2-디메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, α-메톡시벤질리덴 오르토 에스테르, 1-(N,N-디메틸아미노)에틸리덴 유도체, α-(N,N'-디메틸아미노)벤질리덴 유도체, 2-옥시시클로펜틸리덴 오르토 에스테르, 디-t-부틸실릴렌 기 (DTBS), 1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴) 유도체 (TIPDS), 테트라-t-부톡시디실록산-1,3-디일리덴 유도체 (TBDS), 시클릭 카르보네이트, 시클릭 보로네이트, 에틸 보로네이트, 및 페닐 보로네이트를 포함한다.
화학적 가변기 (예를 들어, R 기)가 고리의 결합에 걸쳐있는 결합에 부착된 것으로 나타난 임의의 경우에, 이는 1개 이상의 이러한 가변기가 교차된 결합을 갖는 고리에 임의로 부착된다는 것을 의미한다. 이러한 고리 상의 각 R 기는 고리 상의 임의의 적합한 위치에 부착될 수 있고, 이는 일반적으로 기가 모 고리 상의 수소 원자 대신에 부착된다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 이는 2개의 R 기가 동일한 고리 원자에 부착될 수 있다는 가능성을 포함한다. 또한, 1개 초과의 R 기가 고리 상에 존재하는 경우, 각각은 그에 부착된 다른 R 기와 동일하거나 상이할 수 있고, 각 기는 이들이 동일한 식별자로 표시될 수 있더라도 동일한 분자 상의 어디에든 부착될 수 있는 다른 기와 독립적으로 정의된다.
생분해성 - 본원에 사용된 용어 "생분해성"은 생리학적 또는 엔도솜 상태 하에 분해되는 (즉, 그의 공유 구조 중 적어도 일부가 상실됨) 분자를 지칭한다. 생분해성 분자는 반드시 가수분해에 의해서만 분해가능하지는 않으며, 효소에 의한 분해 작용을 필요로 할 수 있다.
생체분자 - 본원에 사용된 용어 "생체분자"는 자연적으로 발생한 것이든 인위적으로 생성된 것이든 (예를 들어, 합성 또는 재조합 방법에 의함) 간에 세포 및 조직에서 일반적으로 발견되는 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리사카라이드, 당, 지질, 핵단백질, 당단백질, 지단백질, 스테로이드, 대사물 등)를 지칭한다. 생체분자의 특정 부류는 효소, 수용체, 신경전달물질, 호르몬, 시토카인, 세포 반응 조절자, 예컨대 성장 인자 및 화학주성 인자, 항체, 백신, 합텐, 독소, 인터페론, 리보자임, 안티센스 작용제, 플라스미드, DNA 및 RNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
약물 - 본원에 사용된 용어 "약물"은 생물학적 사건을 변경하고, 억제하고, 활성화시키거나, 다르게는 그에 영향을 미치는 소분자 또는 생체분자를 지칭한다. 예를 들어, 약물은 항-AIDS 물질, 항암 물질, 항생제, 항당뇨병 물질, 면역억제제, 항-바이러스 물질, 효소 억제제, 신경독소, 오피오이드, 수면제, 항-히스타민, 윤활제, 신경안정제, 항-경련제, 근육 이완제 및 항-파킨슨 물질, 항-연축제 및 근육 수축제, 예를 들어 채널 차단제, 축동제 및 항-콜린제, 항-녹내장 화합물, 항-기생충 및/또는 항-원충 화합물, 세포-세포외 매트릭스 상호작용의 조절제, 예를 들어 세포 성장 억제제 및 항-부착 분자, 혈관확장제, DNA, RNA 또는 단백질 합성의 억제제, 항-고혈압제, 진통제, 해열제, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제, 항혈관신생 인자, 항-분비 인자, 항응고제 및/또는 항-혈전 작용제, 국부 마취제, 안약, 프로스타글란딘, 항우울제, 항-정신병 물질, 항-구토제 및 영상화제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 약물의 보다 완전한 목록은 문헌 ["Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" by Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; the "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", edited by Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, 및 the United States Pharmacopeia-25/National Formulary-20, published by the United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville MD, 2001]에서 찾아볼 수 있다.
외인성 - 본원에 사용된 "외인성" 분자는 환자에게 투여되지 않는 한, 환자 내에서 유의한 수준으로 존재하지 않는 것이다. 특정한 실시양태에서, 환자는 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 래트, 미니돼지 등이다. 본원에 사용된 바와 같이, 분자는 환자에 대한 정상 혈청이 0.1 mM 미만의 분자를 포함하는 경우에 상기 유형의 환자에서 유의한 수준으로 존재하지 않는다. 특정한 실시양태에서, 환자에 대한 정상 혈청은 0.08 mM 미만, 0.06 mM 미만 또는 0.04 mM 미만의 분자를 포함할 수 있다.
과분지형 - 본원에 사용된 "과분지형" 구조는 적어도 1개의 분지형 분지를 포함하는 공유 구조 (예를 들어, 덴드리머 구조)이다. 과분지형 구조는 중합체 및/또는 비-중합체 하위구조를 포함할 수 있다.
정상 혈청 - 본원에 사용된 "정상 혈청"은 5명 이상의 비-당뇨병성 환자로부터의 응고된 전혈의 액체 부분의 대략 동등량을 수집하여 얻은 혈청이다. 비-당뇨병성 인간 환자는 혈액 채취 시점에 어떠한 당뇨병 증상도 나타내지 않은 무작위로 선택된 18 내지 30세 연령이다.
중합체 - 본원에 사용된 "중합체" 또는 "중합체 구조"는 일련의 공유 결합 단량체를 포함하는 구조이다. 중합체는 1종의 유형의 단량체 또는 1종 초과의 유형의 단량체로부터 만들어질 수 있다. 따라서, 용어 "중합체"는 상이한 유형의 단량체가 전체 중합체 내에서 개별적으로 그룹화되는 블록-공중합체를 비롯한 공중합체를 포괄한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 - 본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체이다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 중합체는 천연 뉴클레오시드 (즉, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘), 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 디히드로우리딘, 메틸슈도우리딘, 1-메틸 아데노신, 1-메틸 구아노신, N6-메틸 아데노신, 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기), 삽입된 염기, 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2'-O-메틸시티딘, 아라비노스, 및 헥소스), 또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 - 본원에 사용된 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체이다. 용어 "폴리펩티드", "단백질", "올리고펩티드" 및 "펩티드"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 (즉, 자연에서 발생하지 않지만 폴리펩티드 쇄로 도입될 수 있는 화합물) 및/또는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 아미노산 유사체를 함유할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 중 1개 이상은, 예를 들어 화학 물질, 예컨대 탄수화물 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합, 관능화 또는 다른 변형을 위한 링커 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 펩티드의 고리화, D-아미노산의 혼입 등을 포함할 수 있다.
폴리사카라이드 - 본원에 사용된 "폴리사카라이드"는 사카라이드의 중합체이다. 용어 "폴리사카라이드", "탄수화물" 및 "올리고사카라이드"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 중합체는 천연 사카라이드 (예를 들어, 아라비노스, 릭소스, 리보스, 크실로스, 리불로스, 크실룰로스, 알로스, 알트로스, 갈락토스, 글루코스, 굴로스, 이도스, 만노스, 탈로스, 프룩토스, 프시코스, 소르보스, 타가토스, 만노헵툴로스, 세도헵툴로스, 옥톨로스, 및 시알로스)및/또는 변형된 사카라이드 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 2'-데옥시리보스, 및 헥소스)를 포함할 수 있다. 예시적인 디사카라이드는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 겐티오비오스, 이소말토스, 코지비오스, 라미나리비오스, 만노비오스, 멜리비오스, 니게로스, 루티노스 및 크실로비오스를 포함한다.
소분자 - 본원에 사용된 용어 "소분자"는 자연적으로 발생한 것이든 또는 인위적으로 생성된 것이든 (예를 들어, 화학적 합성을 통함), 비교적 적은 분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 소분자는 단량체이고, 약 1500 Da 미만의 분자량을 갖는다. 바람직한 소분자는 이들이 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 국부 또는 전신 효과를 생성한다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 특정한 바람직한 실시양태에서, 소분자는 약물이다. 바람직하게는, 반드시 그러한 것은 아니지만, 약물은 적절한 정부 기관 또는 단체가 이미 그의 사용이 안정하고 효과적임을 인정한 것이다. 예를 들어, 21 C.F.R. §§ 330.5, 331 내지 361, 및 440 내지 460 하에 FDA가 열거한 인간 사용을 위한 약물; 21 C.F.R. §§ 500 내지 589 하에 FDA가 열거한 수의학적 사용을 위한 약물은 모두 본 발명에 따라 사용하는데 허용되는 것으로 간주된다.
치료하다 - 본원에 사용된 용어 "치료하다" (또는 "치료하는", "치료된", "치료" 등)는 본 개시내용의 접합체를 그를 필요로 하는 대상체에게, 상태 (예를 들어, 당뇨병), 상태의 증상 또는 증상들 (예를 들어, 고혈당), 또는 상태에 대한 질병소질을 완화, 경감, 변경, 개선, 증진시키거나, 또는 그에 영향을 미치기 위한 목적으로 투여하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 용어 "당뇨병 치료"는 일반적으로 글루코스 혈액 수준을 정상 수준 근처에서 유지하는 것을 지칭할 것이고, 주어진 상황에 따라 혈액 글루코스 수준을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
제약상 허용되는 담체 - 본원에 사용된 이 용어는 임의의 표준 제약 담체, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어 유/수 또는 수/유 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 또한, 이 용어는 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 인간을 포함하는 동물에 사용하기 위해 미국 약전에 열거된 임의의 물질을 포괄한다.
제약상 허용되는 염 - 본원에 사용된 이 용어는 모 화합물의 생물학적 활성을 유지하며, 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 화합물의 염을 지칭한다. 다수의 본원에 개시된 화합물은 아미노 및/또는 카르복실 기 또는 그와 유사한 기의 존재에 의해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다.
제약상 허용되는 염기 부가염은 무기 및 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래된 염은 단지 예로서 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염을 포함한다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1급, 2급 및 3급 아민의 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
제약상 허용되는 산 부가염은 무기 및 유기 산으로부터 제조될 수 있다. 무기 산으로부터 유래된 염은 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기 산으로부터 유래된 염은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등을 포함한다.
유효량 또는 치료 유효량 - 본원에 사용된 바와 같이 비독성이지만, 바람직한 효과를 제공하기에 충분한 인슐린 유사체의 양을 지칭한다. 예를 들어 한 바람직한 효과는 고혈당증의 예방 또는 치료일 것이다. "유효한" 양은 개체의 연령 및 일반적 상태, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 달라질 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 그러나, 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효"량은 상용 실험을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
비경구 - 본원에 사용된 이 용어는 소화관을 통하지 않고, 일부 다른 경로, 예컨대 비강내, 흡입, 피하, 근육내, 척수내 또는 정맥내를 통하는 것을 의미한다.
인슐린 - 본원에 사용된 이 용어는 동물 신체에서의 탄수화물의 대사에 영향을 미치며 당뇨병 치료에 유용한 췌장의 활성 성분을 의미한다. 이 용어는 자연 발생 인슐린과 구조, 용도, 및 의도되는 효과가 동일하거나 또는 유사하며 당뇨병 치료에 유용한 합성 및 생체공학적으로 유래된 산물을 포함한다.
인슐린 또는 인슐린 분자 - 이 용어는 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 A-쇄 펩티드 및 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B-쇄 펩티드를 포함하는 51개 아미노산 이종이량체를 지칭하는 일반적 용어이며, 여기서 A 쇄의 위치 6 및 11에 있는 시스테인 잔기는 디술피드 결합으로 연결되고, A 쇄의 위치 7 및 B 쇄의 위치 7에 있는 시스테인 잔기는 디술피드 결합으로 연결되고, A 쇄의 위치 20 및 B 쇄의 위치 19에 있는 시스테인 잔기는 디술피드 결합으로 연결된다.
인슐린 유사체 또는 유사체들 - 본원에 사용된 이 용어는 천연 A-쇄 펩티드 및/또는 B-쇄 펩티드의 하나 이상의 변형(들)을 포함하는 임의의 이종이량체 유사체 또는 단일-쇄 유사체를 포함한다. 변형은 A4, A5, A8, A9, A10, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29, 및 B30으로부터 선택된 위치에 있는 천연 아미노산에 대한 아미노산 치환; 임의의 또는 모든 위치 B1-4 및 B26-30의 결실; 또는 직접적인 또는 중합체성 또는 비-중합체성 링커에 의한 하나 이상의 아실, 폴리에틸글리신 (PEG), 또는 사카라이드 모이어티 (모이어티들)의 접합; 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 N-연결된 글리코실화 인슐린 유사체에 의해 예시되는 바와 같이, 이 용어는 추가로 적어도 1개의 N-연결된 글리코실화 부위를 갖도록 변형된 임의의 인슐린 이종이량체 및 단일-쇄 유사체를 포함하고, 특히 N-연결된 글리코실화 부위가 N-글리칸에 연결되거나 또는 이에 의해 점유된 실시양태를 포함한다. 인슐린 유사체의 예는 공개된 국제 출원 WO20100080606, WO2009/099763, 및 WO2010080609 (그의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 이종이량체 및 단일-쇄 유사체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단일-쇄 인슐린 유사체의 예는 또한 공개된 국제 출원 WO9634882, WO95516708, WO2005054291, WO2006097521, WO2007104734, WO2007104736, WO2007104737, WO2007104738, WO2007096332, WO2009132129; 미국 특허 번호 5,304,473 및 6,630,348; 및 문헌 [Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995)] (그의 개시내용은 각각 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이 용어는 인슐린 수용체에서 검출가능한 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않으나, 천연 인슐린에 비해 인슐린 수용체에서 활성의 적어도 1%, 10%, 50%, 75%, 또는 90%를 갖는 인슐린 수용체에서의 활성을 갖도록 하기 위한 1개 이상의 아미노산 변형 또는 치환을 포함하도록 변형되었으며 적어도 1개의 N-연결된 글리코실화 부위를 추가로 포함하는 단일-쇄 및 이종이량체 폴리펩티드 분자를 추가로 포함한다. 특정한 측면에서, 인슐린 유사체는 천연 인슐린에 비해 인슐린 수용체에서 2x 내지 100x 적은 활성을 갖는 부분 효능제이다. 다른 측면에서, 인슐린 유사체는 인슐린 수용체, 예를 들어 공개된 국제 출원 WO2010080607 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 IGFB16B17 유도체 펩티드에서 증진된 활성을 갖는다. 인슐린 성장 호르몬 수용체에서 감소된 활성을 갖고 인슐린 수용체에서 증진된 활성을 갖는 이들 인슐린 유사체는 이종이량체 및 단일-쇄 유사체를 둘 다 포함한다.
단일-쇄 인슐린 또는 단일-쇄 인슐린 유사체 - 본원에 사용된 이 용어는 A-쇄 펩티드 또는 기능적 유사체 및 B-쇄 펩티드 또는 기능적 유사체가 2 내지 35개 아미노산의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 비-펩티드 중합체성 또는 비-중합체성 링커에 의해 공유 연결되고, 천연 인슐린에 비해 인슐린 수용체에서 인슐린의 활성의 적어도 1%, 10%, 50%, 75%, 또는 90%를 갖는 구조적으로-관련된 단백질의 군을 포괄한다. 단일-쇄 인슐린 또는 인슐린 유사체는 3개의 디술피드 결합을 추가로 포함한다: 첫번째 디술피드 결합은 A-쇄 또는 그의 기능적 유사체의 위치 6 및 11에 있는 시스테인 잔기 사이에 있고, 두번째 디술피드 결합은 A-쇄 또는 그의 기능적 유사체의 위치 7 및 B-쇄 또는 그의 기능적 유사체의 위치 7에 있는 시스테인 잔기 사이에 있고, 세번째 디술피드 결합은 A-쇄 또는 그의 기능적 유사체의 위치 20 및 B-쇄 또는 그의 기능적 유사체의 위치 19에 있는 시스테인 잔기 사이에 있다.
펩티드 또는 C-펩티드 연결 - 본원에 사용된 이 용어는 단일 쇄 프리프로인슐린-유사 분자의 B-C-A 폴리펩티드 서열의 모이어티 "C"의 연결을 지칭한다. 구체적으로, 천연 인슐린 쇄에서, C-펩티드는 B-쇄의 위치 30에 있는 아미노산과 A-쇄의 위치 1에 있는 아미노산을 연결한다. 이 용어는 두 천연 인슐린 C-펩티드 (서열 30), 원숭이 C-펩티드, 및 B-쇄를 A-쇄에 연결하는 3 내지 35개 아미노산의 임의의 다른 펩티드 (이에 따라, 단일-쇄 인슐린 유사체 (예를 들어, 미국 공개 출원 번호 20090170750 및 20080057004 및 WO9634882 참조) 및 인슐린 전구체 분자 (WO9516708 및 미국 특허 번호 7,105,314에 개시된 바와 같음)에서 A-쇄 펩티드에 대한 B-쇄 펩티드의 임의의 펩티드 연결을 포괄하도록 의도됨)를 지칭할 수 있다.
아미노산 변형 - 본원에 사용된 이 용어는 아미노산의 치환, 또는 아미노산에의/으로부터의 화학적 기의 부가 및/또는 제거에 의한 아미노산의 유도체화를 지칭하고, 인간 단백질에서 통상적으로 발견되는 20개의 아미노산, 뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연 발생 아미노산 중 임의의 것으로의 치환을 포함한다. 비정형 아미노산의 상업적 공급원은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (위스콘신주 밀워키), 켐펩 인크.(ChemPep Inc.) (플로리다주 마이애미) 및 겐자임 파마슈티칼스(Genzyme Pharmaceuticals) (매사추세츠주 캠브리지)를 포함한다. 비정형 아미노산은 상업적 공급업체로부터 구입하거나, 신생 합성하거나, 또는 자연 발생 아미노산으로부터 화학적으로 변형시키거나 또는 유도체화시킬 수 있다.
아미노산 치환 - 본원에 사용된 바와 같이, 하나의 아미노산 잔기의 상이한 아미노산 잔기에 의한 대체를 지칭한다.
보존적 아미노산 치환 - 본원에 사용된 이 용어는 하기 5개의 군 중 하나 내의 교환으로서 본원에 규정된다:
I. 작은 지방족, 비극성 또는 다소 극성의 잔기:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드:
Asp, Asn, Glu, Gln, 시스테산 및 호모시스테산;
III. 극성, 양으로 하전된 잔기:
His, Arg, Lys; 오르니틴 (Orn)
IV. 큰, 지방족, 비극성 잔기:
Met, Leu, Ile, Val, Cys, 노르류신 (Nle), 호모시스테인
V. 큰, 방향족 잔기:
Phe, Tyr, Trp, 아세틸 페닐알라닌
도 1: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.69 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-2의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 2: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-3의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 3: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-8의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 4: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-9의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 5: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-16의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 6: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-22의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 7: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-23의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 8: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-46의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 9: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-48의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 10: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-52의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 11: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.69 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-56의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 12: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-60의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 13: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.69 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-75의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 14: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-76의 혈청 농도의 플롯. 각 실험에서, 동물에게 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 (●) PBS를 주입하였다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유래된 곡선을 사용하여 피팅된 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 15: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.69 nmol/kg에서의 접합체 IOC-2의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
도 16: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.17 nmol/kg에서의 접합체 IOC-3의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
도 17: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-16의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
도 18: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-22의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
도 19: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-23의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
도 20: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-52의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
도 21: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.69 nmol/kg에서의 접합체 IOC-56의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
도 22: (●) PBS 주입 또는 (□) i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM) 주입 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입)의 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-60의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선.
본 발명은 사카라이드, 예컨대 글루코스의 전신 농도에 반응성인 방식으로 인슐린의 약동학적 (PK) 및/또는 약역학적 (PD) 프로파일을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 부분적으로 특정한 인슐린 접합체가 고친화도 사카라이드 리간드, 예컨대 분지형 트리만노스를 포함하도록 변형된 경우에 이들이 외인성 다가 사카라이드-결합 분자, 예컨대 렉틴 콘카나발린 A (Con A)의 부재 하에서도 사카라이드 농도 변화에 반응하는 PK/PD 프로파일을 나타내도록 만들어질 수 있다는, 미국 공개 출원 번호 2011/0301083에 개시된 발견에 기초한다.
일반적으로, 본 발명의 인슐린 접합체는 2개의 아암을 갖거나 또는 이로 이루어진 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드에 공유 부착되고, 링커의 적어도 1개의 리간드는 사카라이드 푸코스를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 리간드는 내인성 사카라이드-결합 분자에의 결합에 대해 사카라이드 (예를 들어, 글루코스 또는 알파-메틸만노스)와 경쟁할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 리간드는 Con A에의 결합에 대해 글루코스 또는 알파-메틸만노스와 경쟁할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 링커는 비-중합체이다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 1의 다분산 지수 및 약 20,000 Da 미만의 MW를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 본원에 정의되고 기재된 바와 같은 화학식 I 또는 II를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 장기 작용성이다 (즉, 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)보다 더 지속적인 PK 프로파일을 나타낸다).
본원에 사용된 용어 "인슐린 접합체"는 (i) 인슐린의 천연 또는 야생형 아미노산 서열을 갖는 인슐린 분자를 포함하는 인슐린 접합체 및 (ii) 인슐린 유사체 분자를 포함하는 인슐린 접합체를 포함하고, 여기서 인슐린 유사체는 천연 또는 야생형 인슐린 아미노산 서열과 적어도 1개의 아미노산 치환, 결실, 재배열, 또는 부가에 의해 차이가 나는 아미노산 서열을 포함한다. 이 용어는 추가로 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방산 분자에 접합된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함한다. 인슐린 분자는 인간 인슐린, 돼지 인슐린, 소 인슐린, 토끼 인슐린, 양 인슐린 등 또는 그의 유사체일 수 있다. 다수의 이들 인슐린 분자는 상업적으로, 예를 들어 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스)로부터 입수가능하다. 인슐린의 다양한 변형된 형태는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crotty and Reynolds, Pediatr. Emerg. Care. 23:903-905, 2007 및 Gerich, Am. J. Med. 113:308-16, 2002] 및 그에 인용된 참고문헌 참조). 인슐린의 변형된 형태는 화학적으로 변형되고/거나 (예를 들어, 하기 기재되는 바와 같은 화학적 모이어티, 예컨대 PEG 기 또는 지방 아실 쇄의 부가에 의함), 돌연변이될 수 있다 (즉, 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의함).
인슐린 접합체
한 측면에서, 본 발명은 2개의 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커 (두자리 링커)에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하는 인슐린 접합체를 제공하고, 여기서 두자리 링커의 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드에 공유 연결되고, 두자리 링커의 제1 리간드는 푸코스인 제1 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 두자리 링커의 제2 리간드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스일 수 있는 제2 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 제2 리간드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 제2 리간드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스를 포함한다.
특정한 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자는 1, 2, 3, 또는 4개의 두자리 링커에 접합되고, 여기서 각 두자리 링커의 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드에 공유 연결되고, 두자리 링커의 제1 리간드는 푸코스인 제1 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 두자리 링커의 제2 리간드는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 제2 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 제2 리간드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 제2 리간드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
특정한 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자는 1, 2, 3, 또는 4개의 두자리 링커에 접합되고, 여기서 각 두자리 링커의 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드에 공유 연결되고, 두자리 링커의 적어도 1개에 대해 두자리 링커의 제1 리간드는 푸코스인 제1 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 두자리 링커의 제2 리간드는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 제2 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 제2 리간드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 제2 리간드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 제2, 제3, 및 제4 두자리 링커에 대해, 제1 및 제2 사카라이드는 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스일 수 있다.
특정한 측면에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자는 (i) 1개의 두자리 링커에 접합되고, 여기서 각 두자리 링커의 각 아암은 독립적으로 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드에 공유 연결되고, 두자리 링커의 제1 리간드는 푸코스인 제1 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 두자리 링커의 제2 리간드는 푸코스, 만노스, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스일 수 있는 제2 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
특정한 측면에서, 본원에 개시된 인슐린 접합체의 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 1개의 리간드를 갖는 적어도 1개의 선형 링커에 추가로 공유 부착된다. 특정한 측면에서, 리간드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 리간드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
특정한 측면에서, 본원에 개시된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자 접합체는 적어도 1개의 세자리 링커에 추가로 공유 부착되고, 여기서 세자리 링커의 각 아암은 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드에 공유 연결된다. 특정한 측면에서, 리간드는 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 또는 분지형 트리사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 측면에서, 리간드는 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
인슐린 접합체가 포유동물에게 투여되는 경우에, 접합체의 적어도 하나의 약동학적 또는 약역학적 특성은 사카라이드의 혈청 농도에 감수성이다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 PK 및/또는 PD 특성은 내인성 사카라이드, 예컨대 글루코스의 혈청 농도에 감수성이다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 PK 및/또는 PD 특성은 외인성 사카라이드, 예를 들어 비제한적으로 만노스, L-푸코스, N-아세틸 글루코사민 및/또는 알파-메틸 만노스의 혈청 농도에 감수성이다.
PK 및 PD 특성
다양한 실시양태에서, 인슐린 접합체의 약동학적 및/또는 약역학적 거동은 사카라이드의 혈청 농도의 변화에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 약동학적 (PK) 관점에서, 혈청 농도 곡선은 사카라이드 (예를 들어, 글루코스)의 혈청 농도가 증가하는 경우 또는 사카라이드의 혈청 농도가 역치를 넘어서는 경우 (예를 들어, 정상 글루코스 수준보다 높음)에 위로 이동할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 공복 및 고혈당 상태 하의 포유동물에게 투여된 경우에 실질적으로 상이하다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상이한"은 2개의 곡선이 스튜던트 t-검정 (p < 0.05)에 의해 결정시에 통계적으로 상이하다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "공복 상태"는 혈청 농도 곡선이 5명 이상의 공복 비-당뇨병성 개체로부터의 데이터를 합하여 수득되었다는 것을 의미한다. 특정한 실시양태에서, 공복 비-당뇨병성 개체는 혈액 채취 시점에서 당뇨병성 증상을 나타내지 않고, 혈액 채취 시점의 12시간 내에 금식한 무작위적으로 선택된 18-30세 인간이다. 본원에 사용된 용어 "고혈당 상태"는 혈청 농도 곡선이 고혈당 상태 (공복 상태 하에 관찰된 평균 글루코스 농도보다 적어도 100 mg/dL 높은 글루코스 Cmax)가 접합체 및 글루코스의 공동 투여에 의해 유도된 5명 이상의 공복 비-당뇨병성 개체로부터의 데이터를 합하여 수득되었다는 것을 의미한다. 접합체 및 글루코스의 공동 투여는 단순히 글루코스 Cmax가 접합체가 혈청에 검출가능한 수준으로 존재하는 기간 동안 유발될 것을 요구한다. 예를 들어, 글루코스 주사 (또는 섭취)는 접합체의 투여 조금 전에, 그와 동시에, 또는 그의 조금 후에 수행되도록 시간을 정할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 접합체 및 글루코스는 상이한 경로에 의해 또는 상이한 위치에 투여된다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 접합체는 피하로 투여되면서 글루코스는 경구로 또는 정맥내로 투여된다.
특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 Cmax는 공복 상태에 비해 고혈당 상태 하에서 더 높다. 추가적으로 또는 대안적으로, 특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 곡선하 면적 (AUC)은 공복 상태에 비해 고혈당 상태 하에서 더 높다. 다양한 실시양태에서, 접합체의 혈청 제거 속도는 공복 상태에 비해 고혈당 상태 하에서 더 느리다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 하나는 짧은 반감기 및 하나는 긴 반감기를 갖는 2-구획 이중-지수 모델을 사용하여 피팅될 수 있다. 긴 반감기는 글루코스 농도에 특히 감수성인 것으로 보인다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 긴 반감기는 공복 상태에 비해 고혈당 상태 하에 더 길다. 특정한 실시양태에서, 공복 상태는 100 mg/dL 미만 (예를 들어, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 수반한다. 특정한 실시양태에서, 고혈당 상태는 200 mg/dL 초과 (예를 들어, 300 mg/dL, 400 mg/dL, 500 mg/dL, 600 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 수반한다. 다른 PK 파라미터, 예컨대 평균 혈청 체류 시간 (MRT), 평균 혈청 흡수 시간 (MAT) 등이 임의의 상기 언급된 파라미터 대신에 또는 이와 함께 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
인간, 개, 고양이, 및 래트에서의 글루코스 농도의 정상 범위는 60 내지 200 mg/dL이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 정상 범위를 갖는 종에 대한 하기 값을 추론할 수 있을 것이다 (예를 들어, 소형 돼지에서의 글루코스 농도의 정상 범위는 40 내지 150 mg/dl임). 60 mg/dL 미만의 글루코스 농도는 저혈당으로 간주된다. 200 mg/dL 초과의 글루코스 농도는 고혈당으로 간주된다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 PK 특성은 글루코스 클램프 방법 (실시예 참조)을 사용하여 시험될 수 있고, 접합체의 혈청 농도 곡선은 50 및 200 mg/dL, 50 및 300 mg/dL, 50 및 400 mg/dL, 50 및 500 mg/dL, 50 및 600 mg/dL, 100 및 200 mg/dL, 100 및 300 mg/dL, 100 및 400 mg/dL, 100 및 500 mg/dL, 100 및 600 mg/dL, 200 및 300 mg/dL, 200 및 400 mg/dL, 200 및 500 mg/dL, 200 및 600 mg/dL 등의 글루코스 농도에서 투여되었을 때 실질적으로 상이할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 혈청 Tmax, 혈청 Cmax, 평균 혈청 체류 시간 (MRT), 평균 혈청 흡수 시간 (MAT) 및/또는 혈청 반감기는 2가지 글루코스 농도에서 실질적으로 상이할 수 있다. 하기 논의되는 바와 같이, 특정한 실시양태에서, 100 mg/dL 및 300 mg/dL은 비교용 글루코스 농도로서 사용될 수 있다. 그러나 본 개시내용은 하기 쌍: 50 및 200 mg/dL, 50 및 300 mg/dL, 50 및 400 mg/dL, 50 및 500 mg/dL, 50 및 600 mg/dL, 100 및 200 mg/dL, 100 및 400 mg/dL, 100 및 500 mg/dL, 100 및 600 mg/dL, 200 및 300 mg/dL, 200 및 400 mg/dL, 200 및 500 mg/dL, 200 및 600 mg/dL 등 중 어느 하나를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 비교용 글루코스 농도의 대안적 쌍을 사용하는 각각의 이들 실시양태를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 접합체의 Cmax는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 더 높다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 Cmax는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 적어도 50% (예를 들어, 적어도 100%, 적어도 200% 또는 적어도 400%) 더 높다.
특정한 실시양태에서, 접합체의 AUC는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 더 높다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 AUC는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 적어도 50% (예를 들어, 적어도 100%, 적어도 200% 또는 적어도 400%) 더 높다.
특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 제거 속도는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 더 느리다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 제거 속도는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 100 대 300 mg/dL 글루코스) 중 낮은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 적어도 25% (예를 들어, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 또는 적어도 400%) 더 빠르다.
특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 하나는 짧은 반감기 및 하나는 긴 반감기를 갖는 2-구획 이중-지수 모델을 사용하여 피팅될 수 있다. 긴 반감기는 글루코스 농도에 특히 감수성인 것으로 보인다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 긴 반감기는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 더 길다. 특정한 실시양태에서, 긴 반감기는 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 적어도 50% (예를 들어, 적어도 100%, 적어도 200% 또는 적어도 400%) 더 길다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 접합체의 혈청 농도 곡선을 2가지 상이한 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스)에서 수득하고; 2개의 곡선을 하나는 짧은 반감기 및 하나는 긴 반감기를 갖는 2-구획 이중-지수 모델을 사용하여 피팅하고; 2가지 글루코스 농도 하에 수득한 긴 반감기를 비교하는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 방법은 1종 이상의 접합체의 글루코스 감수성의 시험 또는 비교를 위한 검정으로 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 접합된 약물 (예를 들어, 본 개시내용의 인슐린 접합체) 및 비접합 버전의 약물 (예를 들어, RHI)의 혈청 농도 곡선을 동일한 상태 (예를 들어, 공복 상태) 하에 수득하고; 2개의 곡선을 하나는 짧은 반감기 및 하나는 긴 반감기를 갖는 2-구획 이중-지수 모델을 사용하여 피팅하고; 접합 및 비접합 약물에 대해 수득한 긴 반감기를 비교하는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 방법은 비접합 약물보다 더 빠르게 제거되는 접합체를 확인하기 위한 검정으로 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 고혈당 상태 하의 포유동물에게 투여되었을 때 비접합 버전의 약물의 혈청 농도 곡선과 실질적으로 동일하다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 스튜던트 t-검정 (p > 0.05)에 의해 결정시에 2개의 곡선 사이에 통계적 차이가 없다는 것을 의미한다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 공복 상태 하에 투여되었을 때 비접합 버전의 약물의 혈청 농도 곡선과 실질적으로 상이하다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 고혈당 상태 하에 투여되었을 때 비접합 버전의 약물의 혈청 농도 곡선과 실질적으로 동일하고, 공복 상태 하에 투여되었을 때에는 실질적으로 상이하다.
특정한 실시양태에서, 고혈당 상태는 200 mg/dL초과 (예를 들어, 300 mg/dL, 400 mg/dL, 500 mg/dL, 600 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 수반한다. 특정한 실시양태에서, 공복 상태는 100 mg/dL 미만 (예를 들어, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 수반한다. 임의의 상기 언급된 PK 파라미터, 예컨대 혈청 Tmax, 혈청 Cmax, AUC, 평균 혈청 체류 시간 (MRT), 평균 혈청 흡수 시간 (MAT) 및/또는 혈청 반감기는 비교될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
약역학적 (PD) 관점에서, 접합체의 생물활성은 글루코스 농도가 증가하는 경우 또는 글루코스 농도가 역치를 넘어서는 경우, 예를 들어 정상 글루코스 수준보다 높은 경우에 증가할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 생물활성은 고혈당 상태에 비해 공복 상태 하에 투여되었을 때 더 낮다. 특정한 실시양태에서, 공복 상태는 100 mg/dL 미만 (예를 들어, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 수반한다. 특정한 실시양태에서, 고혈당 상태는 200 mg/dL 초과 (예를 들어, 300 mg/dL, 400 mg/dL, 500 mg/dL, 600 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 수반한다.
특정한 실시양태에서, 접합체의 PD 특성은 정상 글루코스 농도를 유지하기 위해 요구되는 글루코스 주입 속도 (GIR)를 측정하여 시험할 수 있다. 이러한 실시양태에 따르면, 접합체의 생물활성은 50 및 200 mg/dL, 50 및 300 mg/dL, 50 및 400 mg/dL, 50 및 500 mg/dL, 50 및 600 mg/dL, 100 및 200 mg/dL, 100 및 300 mg/dL, 100 및 400 mg/dL, 100 및 500 mg/dL, 100 및 600 mg/dL, 200 및 300 mg/dL, 200 및 400 mg/dL, 200 및 500 mg/dL, 200 및 600 mg/dL 등의 글루코스 농도에서 투여되었을 때 실질적으로 상이할 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 접합체의 생물활성은 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 더 높다. 특정한 실시양태에서, 접합체의 생물활성은 2가지 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도에서 포유동물에게 투여되었을 때 적어도 25% (예를 들어, 적어도 50% 또는 적어도 100%) 더 높다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 약물로서 인슐린 분자를 포함한다. 이러한 실시양태에 따르면, 인슐린에 대한 PD 거동은 최소 혈액 글루코스 농도에 도달하는데 소요되는 시간 (Tnadir), 혈액 글루코스 수준이 초기 값의 특정한 백분율 (예를 들어, 초기 값의 70% 또는 T70% BGL) 미만으로 유지되는 기간 등을 비교하여 관찰할 수 있다.
일반적으로, 이 섹션에서 논의된 임의의 PK 및 PD 특징은 임의의 다양한 공개된 약동학적 및 약역학적 방법에 따라 결정될 수 있는 것으로 인지될 것이다 (예를 들어, 피하 전달에 적합한 방법에 대해 문헌 [Baudys et al., Bioconjugate Chem. 9:176-183, 1998] 참조). 또한, PK 및/또는 PD 특성은 임의의 포유동물 (예를 들어, 인간, 래트, 고양이, 미니돼지, 개 등)에서 측정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 특정한 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 인간에서 측정된다. 특정한 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 래트에서 측정된다. 특정한 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 미니돼지에서 측정된다. 특정한 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 개에서 측정된다.
또한, 상기 내용은 글루코스-반응성 접합체의 측면에서 기재되었으나, 동일한 특성 및 검정이 외인성 사카라이드, 예를 들어 만노스, L-푸코스, N-아세틸 글루코사민, 알파-메틸 만노스 등을 포함하는 다른 사카라이드에 반응성이 접합체에도 적용되는 것으로 인지될 것이다. 하기 및 실시예에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 공복 및 고혈당 상태 하의 PK 및/또는 PD 특성을 비교하는 대신에, 공복 상태 하에 외인성 사카라이드를 투여한 경우와 투여하지 않은 경우의 PK 및/또는 PD 특성을 비교할 수 있다. 주어진 외인성 사카라이드의 상이한 Cmax 값에 반응하는 접합체가 설계될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
리간드(들)
일반적으로, 인슐린 접합체는 2개의 리간드를 갖는 적어도 1개의 두자리 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 리간드 중 적어도 하나 (제1 리간드)는 푸코스인 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 다른 리간드 (제2 리간드)는 1종 이상의 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 각각 1종 이상의 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 단일 리간드를 포함하는 하나 이상의 선형 링커를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 각각 적어도 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 리간드를 포함하는 하나 이상의 분지형 링커를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 각 리간드는 독립적으로 1종 이상의 사카라이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 1개 초과의 리간드가 존재하는 경우에 리간드는 동일한 또는 상이한 화학 구조를 가질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 리간드는 내인성 사카라이드-결합 분자 (예를 들어, 비제한적으로 계면활성제 단백질 A 및 D 또는 셀렉틴 패밀리의 구성원)에의 결합에 대해 사카라이드 (예를 들어, 글루코스, 알파-메틸만노스, 또는 만노스)와 경쟁할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 리간드는 세포-표면 당 수용체 (예를 들어, 비제한적으로 대식세포 만노스 수용체, 글루코스 수송체 리간드, 내피 세포 당 수용체, 또는 간세포 당 수용체)에의 결합에 대해 사카라이드 (예를 들어, 글루코스, 알파-메틸만노스, 또는 만노스)와 경쟁할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 리간드는 내인성 글루코스-결합 분자 (예를 들어, 비제한적으로 계면활성제 단백질 A 및 D 또는 셀렉틴 패밀리의 구성원)에의 결합에 대해 글루코스와 경쟁할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 리간드는 인간 대식세포 만노스 수용체 1 (MRC1)에의 결합에 대해 글루코스 또는 알파-메틸만노스와 경쟁할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 리간드는 비-인간 렉틴 (예를 들어, Con A)에의 결합에 대해 사카라이드와 경쟁할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 리간드는 비-인간 렉틴 (예를 들어, Con A)에의 결합에 대해 글루코스, 알파-메틸만노스, 또는 만노스와 경쟁할 수 있다. 예시적인 글루코스-결합 렉틴은 칼넥신, 칼레티쿨린, N-아세틸글루코사민 수용체, 셀렉틴, 아시알로당단백질 수용체, 콜렉틴 (만노스-결합 렉틴), 만노스 수용체, 아그레칸, 베르시칸, 피숨 사티붐 응집소 (PSA), 비시아 파바 렉틴, 렌즈 쿨리나리스 렉틴, 대두 렉틴, 땅콩 렉틴, 라티루스 오크루스 렉틴, 잠두 렉틴, 소포라 자포니카 렉틴, 보우린기아 밀브라에디이 렉틴, 콘카나발린 A (Con A), 및 미국자리공 미토겐을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 리간드 이외의 리간드(들)는 글루코스와 동일한 화학 구조를 가질 수 있거나 또는 글루코스의 화학적으로 관련된 종, 예를 들어 글루코사민일 수 있는 사카라이드 푸코스를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 다양한 실시양태에서, 리간드(들)는, 예를 들어 접합체의 글루코스 반응을 정밀하게 조정하기 위해, 글루코스와 상이한 화학 구조를 갖는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 글루코스, 만노스, L-푸코스 또는 그의 유도체 (예를 들어, 알파-L-푸코피라노시드, 만노사민, 베타-연결된 N-아세틸 만노사민, 메틸글루코스, 메틸만노스, 에틸글루코스, 에틸만노스, 프로필글루코스, 프로필만노스 등) 및/또는 그의 보다 높은 차수의 조합 (예를 들어, 비만노스, 선형 및/또는 분지형 트리만노스 등)을 포함하는 리간드를 사용할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 리간드(들)는 모노사카라이드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 리간드(들)는 디사카라이드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 리간드(들)는 트리사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드(들)는 사카라이드 및 하나 이상의 아민 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드(들)는 사카라이드 및 에틸 기를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 사카라이드 및 아민 기는 C1-C6 알킬 기, 예를 들어 C1-C3 알킬 기에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸글루코스 (AEG)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸만노스 (AEM)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸비만노스 (AEBM)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸트리만노스 (AETM)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸푸코스 (AEF)이다. 특정한 실시양태에서, 사카라이드는 "D" 배위이고, 다른 실시양태에서, 사카라이드는 "L" 배위이다. 하기는 C2 에틸 기에 의해 사카라이드로부터 분리된 아민 기를 갖는 예시적인 사카라이드의 구조이고, 여기서 R은 수소 또는 링커의 카르보닐 기일 수 있다. 다른 예시적인 리간드는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 알 것이다.
Figure pct00039
인슐린
본원에 사용된 용어 "인슐린" 또는 "인슐린 분자"는 인슐린 분자의 모든 염 및 비-염 형태를 포괄한다. 염 형태는 인슐린 분자에 따라 음이온성 또는 양이온성일 수 있는 것으로 인지될 것이다. 본 발명자들은 "인슐린" 또는 "인슐린 분자"가 야생형 인슐린 및 생물활성 (즉, 생체내 투여시에 글루코스에서 검출가능한 환원을 유발할 수 있음)을 나타내는 한 인슐린의 변형된 형태 둘 다를 포괄하도록 의도한다. 야생형 인슐린은 정제된 형태이든, 합성 형태이든 또는 재조합 형태이든 임의의 종으로부터의 인슐린 (예를 들어, 인간 인슐린, 돼지 인슐린, 소 인슐린, 토끼 인슐린, 양 인슐린 등)을 포함한다. 이들 중 다수는 상업적으로, 예를 들어 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스)로부터 입수가능하다. 인슐린의 다양한 변형된 형태는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Crotty and Reynolds, Pediatr. Emerg. Care. 23:903-905, 2007 및 Gerich, Am. J. Med. 113:308-16, 2002] 및 그에 인용된 참고문헌 참조). 인슐린의 변형된 형태 (인슐린 유사체)는 화학적으로 변형되고/거나 (예를 들어, 하기 기재되는 바와 같은 화학적 모이어티, 예컨대 PEG 기 또는 지방 아실 쇄의 부가에 의함), 돌연변이될 수 있다 (즉, 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의함).
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 야생형 인슐린과 1-10개 (예를 들어, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-9, 6-8, 6-7, 7-9, 7-8, 8-9, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 차이가 날 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 야생형 인슐린과 오직 아미노산 치환에 의해 차이가 날 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 야생형 인슐린과 오직 아미노산 부가에 의해 차이가 날 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 야생형 인슐린과 아미노산 치환 및 부가 둘 다에 의해 차이가 날 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 야생형 인슐린과 아미노산 치환 및 결실 둘 다에 의해 차이가 날 것이다.
특정한 실시양태에서, 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 특성에 있어서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환은 보존적일 수 있는데, 즉 1개의 아미노산이 유사한 형태 및 전하의 것으로 대체된다. 보존적 치환은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 전형적으로 하기 기 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 티로신, 페닐알라닌. 특정한 실시양태에서, 아미노산의 소수성 지수는 적합한 돌연변이의 선택에서 고려될 수 있다. 폴리펩티드 상에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 관련 기술분야에서 이해되는 것이다. 대안적으로, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있다. 폴리펩티드의 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어 친수성의 중요성은 일반적으로 관련 기술분야에서 이해되는 것이다. 폴리펩티드 설계시의 소수성 지수 또는 친수성의 사용은 미국 특허 번호 5,691,198에서 추가로 논의된다.
인간 인슐린 (A-쇄 및 B-쇄)의 야생형 서열은 하기 제시된다.
A-쇄 (서열 1): GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
B-쇄 (서열 2): FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 B-펩티드 서열의 B28 및/또는 B29 위치에서 돌연변이된다. 예를 들어, 인슐린 리스프로 (휴마로그(HUMALOG)®)는 B-펩티드의 C-말단 단부 상의 끝에서 2개의 리신 및 프롤린 잔기가 역전된 신속 작용 인슐린 돌연변이체이다 (LysB28ProB29-인간 인슐린) (서열 3). 이러한 변형은 인슐린 다량체의 형성을 차단한다. 인슐린 아스파르트 (노보로그(NOVOLOG)®)는 위치 B28의 프롤린이 아스파르트산으로 치환된 또 다른 신속 작용 인슐린 돌연변이체이다 (AspB28-인간 인슐린) (서열 4). 이러한 돌연변이체는 또한 다량체의 형성을 방지한다. 일부 실시양태에서, 위치 B28 및/또는 B29에서의 돌연변이는 인슐린 폴리펩티드 내 어디에서든지 하나 이상의 돌연변이를 수반한다. 예를 들어, 인슐린 글루리신 (아피드라(APIDRA)®)은 위치 B3의 아스파르트산이 리신 잔기에 의해 대체되고, 위치 B29의 리신이 글루탐산 잔기로 대체된 또 다른 신속 작용 인슐린 돌연변이체이다 (LysB3GluB29-인간 인슐린) (서열 5).
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 인간 인슐린에 비해 이동된 등전점을 갖는다. 일부 실시양태에서, 등전점의 이동은 하나 이상의 아르기닌 잔기를 인슐린 A-펩티드의 N-말단 및/또는 인슐린 B-펩티드의 C-말단에 부가하여 달성된다. 이러한 인슐린 폴리펩티드의 예는 ArgA0-인간 인슐린, ArgB31ArgB32-인간 인슐린, GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, ArgA0ArgB31ArgB32-인간 인슐린, 및 ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린을 포함한다. 추가의 예로서, 인슐린 글라진 (란투스(LANTUS)®)은 AspA21이 글리신에 의해 대체되고 (서열 6), 2개의 아르기닌 잔기가 B-펩티드의 C-말단에 부가된 (서열 7) 예시적인 장기 작용 인슐린 돌연변이체이다. 이러한 변화의 효과는 등전점을 이동시켜, pH 4에서 완전 가용성인 용액을 생산하는 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 A21이 Gly인 A-펩티드 서열 및 B31 및 B32가 Arg-Arg인 B-펩티드 서열을 포함한다. 본 개시내용이 이들 돌연변이 및 본원에 기재된 임의의 다른 돌연변이의 모든 단일 및 다중 조합을 포괄하는 것을 이해되어야 한다 (예를 들어, GlyA21-인간 인슐린, GlyA21ArgB31-인간 인슐린, ArgB31ArgB32-인간 인슐린, ArgB31-인간 인슐린).
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 말단절단된다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 폴리펩티드의 B-펩티드 서열에서 B1, B2, B3, B26, B27, B28, B29 및/또는 B30이 결실된다. 특정한 실시양태에서, 잔기의 조합이 본 개시내용의 인슐린 폴리펩티드의 B-펩티드 서열로부터 결실된다. 예를 들어, B-펩티드 서열에서 잔기 B(1-2), B(1-3), B(29-30), B(28-30), B(27-30) 및/또는 B(26-30)이 결실될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 결실 및/또는 말단절단은 임의의 상기 언급된 인슐린 분자에 적용된다 (예를 들어, 비제한적으로 데스(B30)-인슐린 리스프로, 데스(B30)-인슐린 아스파르트, 데스(B30)-인슐린 글루리신, 데스(B30)-인슐린 글라진 등을 생산함).
일부 실시양태에서, 인슐린 분자는 A 또는 B-펩티드 서열의 N- 또는 C-말단 상에 추가의 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기는 위치 A0, A21, B0 및/또는 B31에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 A0에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 A21에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 B0에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 B31에 위치한다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A0, A21, B0 또는 B31에 임의의 추가의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 1개 이상의 아미드화 아미노산이 산성 형태로 대체되도록 돌연변이된다. 예를 들어, 아스파라긴이 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 글루타민이 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체될 수 있다. 특히, AsnA18, AsnA21, 또는 AsnB3, 또는 이들 잔기의 임의의 조합이 아스파르트산 또는 글루탐산에 의해 대체될 수 있다. GlnA15 또는 GlnB4, 또는 둘 다가 아스파르트산 또는 글루탐산에 의해 대체될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A21에 아스파르트산 또는 위치 B3에 아스파르트산, 또는 둘 다를 갖는다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 생물학적 활성을 유지시키면서 인슐린 분자 내의 또 다른 아미노산을 돌연변이시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 비제한적으로 하기 변형이 또한 관련 기술분야에서 널리 허용된다: 위치 B10의 히스티딘 잔기의 아스파르트산으로의 대체 (HisB10→AspB10); 위치 B1의 페닐알라닌 잔기의 아스파르트산으로의 대체 (PheB1→AspB1); 위치 B30의 트레오닌 잔기의 알라닌으로의 대체 (ThrB30→AlaB30); 위치 B26의 티로신 잔기의 알라닌으로의 대체 (TyrB26→AlaB26); 및 위치 B9의 세린 잔기의 아스파르트산으로의 대체 (SerB9→AspB9).
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 연장된 작용 프로파일을 갖는다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 지방산으로 아실화될 수 있다. 즉, 아미드 결합이 인슐린 분자 상의 아미노 기와 지방산의 카르복실산 기 사이에 형성된다. 아미노 기는 인슐린 분자의 N-말단 아미노산의 알파-아미노 기일 수 있거나, 또는 인슐린 분자의 리신 잔기의 엡실론-아미노 기일 수 있다. 본 개시내용의 인슐린 분자는 야생형 인간 인슐린에 존재하는 3개의 아미노 기 중 1개 이상에서 아실화될 수 있거나, 또는 야생형 인간 인슐린 서열에 도입된 리신 잔기 상에서 아실화될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 B1에서 아실화될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 B29에서 아실화될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 지방산은 미리스트산 (C14), 펜타데실산 (C15), 팔미트산 (C16), 헵타데실산 (C17) 및 스테아르산 (C18)으로부터 선택된다. 예를 들어, 인슐린 데테미르 (레베미르(LEVEMIR)®)는 ThrB30이 결실되고, C14 지방산 쇄 (미리스트산)가 LysB29에 부착된 장기 작용 인슐린 돌연변이체이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자 내의 A-펩티드의 N-말단, B-펩티드의 N-말단, 위치 B29의 Lys의 엡실론-아미노 기 또는 임의의 다른 이용가능한 아미노 기가 하기 화학식의 지방산 모이어티에 공유 연결된다:
Figure pct00040
상기 식에서, RF는 수소 또는 C1-30 알킬 기이다. 일부 실시양태에서, RF는 C1-20 알킬 기, C3-19 알킬 기, C5-18 알킬 기, C6-17 알킬 기, C8-16 알킬 기, C10-15 알킬 기, 또는 C12-14 알킬 기이다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 A1 위치에서 모이어티에 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 B1 위치에서 모이어티에 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 위치 B29의 Lys의 엡실론-아미노 기에서 모이어티에 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자의 위치 B28은 Lys이고, LysB28의 엡실론-아미노 기는 지방산 모이어티에 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자의 위치 B3은 Lys이고, LysB3의 엡실론-아미노 기는 지방산 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 지방산 쇄는 8-20개 탄소 길이이다. 일부 실시양태에서, 지방산은 옥탄산 (C8), 노난산 (C9), 데칸산 (C10), 운데칸산 (C11), 도데칸산 (C12), 또는 트리데칸산 (C13)이다. 특정한 실시양태에서, 지방산은 미리스트산 (C14), 펜타데칸산 (C15), 팔미트산 (C16), 헵타데칸산 (C17), 스테아르산 (C18), 비아데칸산 (C19), 또는 아라키드산 (C20)이다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 3개의 야생형 디술피드 가교를 포함한다 (즉, 1개는 A-쇄의 위치 7과 B-쇄의 위치 7 사이에 있고, 두번째는 A-쇄의 위치 20과 B-쇄의 위치 19 사이에 있고, 세번째는 A-쇄의 위치 6과 11 사이에 있음). 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 돌연변이의 부위가 접합 지점으로 사용되고, 돌연변이된 부위에서의 접합이 인슐린 수용체에의 결합을 감소시키도록 돌연변이된다 (예를 들어, LysA3). 특정한 다른 실시양태에서, 기존의 야생형 아미노산 또는 말단에서의 접합은 인슐린 수용체에의 결합을 감소시킨다 (예를 들어, GlyA1). 일부 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A4, A5, A8, A9, 또는 B30에서 접합된다. 특정한 실시양태에서, 위치 A4, A5, A8, A9, 또는 B30에서의 접합은 야생형 아미노산 측쇄를 통해 일어난다 (예를 들어, GluA4). 특정한 다른 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A4, A5, A8, A9, 또는 B30에서 돌연변이되어 접합을 위한 부위를 제공한다 (예를 들어, LysA4, LysA5, LysA8, LysA9, 또는 LysB30).
인슐린 분자의 접합 방법이 하기에 기재된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 링커에 접합된다. 특정한 실시양태에서, A1 아미노산 잔기는 글리신이다. 그러나, 본 개시내용은 N-말단 접합에 제한되지 않으며, 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 비-말단 A-쇄 아미노산 잔기를 통해 접합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 특히, 본 개시내용은 A-쇄 내의 임의의 위치에 존재하는 리신 잔기 (야생형 또는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 도입됨)의 엡실론-아민 기를 통한 접합을 포괄한다. A-쇄 상의 상이한 접합 위치는 인슐린 활성의 상이한 감소로 이어질 수 있을 것으로 인지될 것이다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 링커에 접합된다. 특정한 실시양태에서, B1 아미노산 잔기는 페닐알라닌이다. 그러나, 본 개시내용은 N-말단 접합에 제한되지 않으며, 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 비-말단 B-쇄 아미노산 잔기를 통해 접합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 특히, 본 개시내용은 B-쇄 내의 임의의 위치에 존재하는 리신 잔기 (야생형 또는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 도입됨)의 엡실론-아민 기를 통한 접합을 포괄한다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B29 리신 잔기를 통해 접합될 수 있다. 인슐린 글루리신의 경우에, B3 리신 잔기를 통한 적어도 1개의 리간드에의 접합이 사용될 수 있다. B-쇄 상의 상이한 접합 위치는 인슐린 활성의 상이한 감소로 이어질 수 있는 것으로 인지될 것이다.
특정한 실시양태에서, 리간드는 인슐린 분자 상의 1개 초과의 접합 지접에 접합된다. 예를 들어, 인슐린 분자는 A1 N-말단 및 B29 리신 둘 다에서 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미드 접합은 카르보네이트 완충제 중에서 B29 및 A1 위치에서 접합되도록, 그러나 B1 위치에서는 접합되지 않도록 일어난다. 다른 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 N-말단, B1 N-말단, 및 B29 리신에서 접합될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 접합이 B1 및 B29 또는 B1 및 A1 위치에서 일어나도록 하는 보호기가 사용된다. 인슐린 분자 상의 접합 지점의 임의의 조합이 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 일부 실시양태에서, 접합 지점 중 적어도 1개는 돌연변이된 리신 잔기, 예를 들어 LysA3이다.
예시적인 인슐린 접합체
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 접합체는 적어도 1개의 두자리 링커에 접합된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 두자리 링커의 적어도 1개의 아암은 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF)에 부착된다. 두자리 링커의 다른 아암은 리간드 AEF 및/또는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 리간드에 접합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 B28에 리신 (LysB28)을 포함하는 유사체이고, 인슐린 분자는 LysB28의 엡실론-아미노 기를 통해 접합되고, 예를 들어 인슐린 리스프로는 LysB28의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 B3에 리신 (LysB3)을 포함하는 유사체이고, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합되고, 예를 들어 인슐린 글루리신은 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다.
특정한 실시양태에서, 상기 인슐린 접합체의 인슐린 또는 인슐린 분자는 1개 이상의 리간드에 부착된 1개 이상의 추가의 링커에 접합될 수 있고, 여기서 각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM) 리간드, 아미노에틸트리만노스 (AETM) 리간드, β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된다. 추가의 링커는 선형, 두자리, 세자리, 네자리 등일 수 있고, 여기서 링커의 각 아암은 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM) 리간드, 아미노에틸트리만노스 (AETM) 리간드, β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택될 수 있는 리간드를 포함한다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 두자리 링커의 적어도 1개의 아암은 인슐린 또는 인슐린 유사체의 위치 A1에 있는 아미노 기; 또는 인슐린 또는 인슐린 유사체의 위치 B1에 있는 아미노 기; 또는 인슐린 유사체의 위치 B3에 있는 아미노 기; 또는 인슐린 유사체의 위치 B28에 있는 아미노 기; 또는 인슐린 또는 인슐린 유사체의 위치 B29에 있는 아미노 기에 접합된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF)에 부착된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 2개의 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 제1 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐)는 위치 A1에 있는 아미노 기에 접합되고, 1개 이상의 리간드에 부착된 제2 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B1, B3, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 2개의 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 제1 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐)는 위치 B1에 있는 아미노 기에 부착되고, 1개 이상의 리간드에 부착된 제2 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 A1, B3, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 부착된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 2개의 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 제1 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐)는 위치 B3에 있는 아미노 기에 접합되고, 1개 이상의 리간드에 부착된 제2 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B1, A1, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 2개의 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 제1 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐)는 위치 B28에 있는 아미노 기에 접합되고, 1개 이상의 리간드에 접합된 제2 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B1, B3, A1, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 2개의 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 제1 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐)는 위치 B29에 있는 아미노 기에 접합되고, 1개 이상의 리간드에 부착된 제2 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B1, B3, B28, 또는 A1에 있는 아미노 기에 접합된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 3개의 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 제1 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐)는 위치 A1에 있는 아미노 기에 접합되고; 1개 이상의 리간드에 부착된 제2 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B1에 있는 아미노 기에 접합되고; 1개 이상의 리간드에 부착된 제3 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B3, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 4개의 두자리 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 제1 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐)는 위치 A1에 있는 아미노 기에 접합되고; 1개 이상의 리간드에 부착된 제2 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B1에 있는 아미노 기에 접합되고; 1개 이상의 리간드에 부착된 제3 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B3에 있는 아미노 기에 접합되고; 1개 이상의 리간드에 부착된 제4 두자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)는 위치 B28 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 (a) 두자리 링커 (여기서, 두자리 링커의 적어도 1개의 아암은 위치 A1에 있는 아미노 기; 또는 위치 B1에 있는 아미노 기; 또는 위치 B3에 있는 아미노 기; 또는 위치 B28에 있는 아미노 기; 또는 위치 B29에 있는 아미노 기에 접합된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF)에 부착됨) 및 (b) 1개 이상의 리간드에 부착된 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 위치 A1에 있는 아미노 기; 또는 위치 B1에 있는 아미노 기; 또는 위치 B3에 있는 아미노 기; 또는 위치 B28에 있는 아미노 기; 또는 위치 B29에 있는 아미노 기 (어떠한 위치도 두자리 링커가 점유하지 않음)에 접합된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 (a) 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 위치 A1에 있는 아미노 기에 접합된, 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐) 및 (b) 1개 이상의 리간드에 부착된 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 위치 B1, B3, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 (a) 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 위치 B1에 있는 아미노 기에 접합된, 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐) 및 (b) 1개 이상의 리간드에 부착된 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 위치 A1, B3, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 (a) 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 위치 B3에 있는 아미노 기에 접합된, 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐) 및 (b) 1개 이상의 리간드에 부착된 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 위치 B1, A1, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 (a) 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 위치 B28에 있는 아미노 기에 접합된, 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐) 및 (b) 1개 이상의 리간드에 부착된 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 위치 B1, B3, A1, 또는 B29에 있는 아미노 기에 접합된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 (a) 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 위치 B29에 있는 아미노 기에 접합된, 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐) 및 (b) 1개 이상의 리간드에 부착된 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 위치 B1, B3, B28, 또는 A1에 있는 아미노 기에 접합된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체는 (a) 두자리 링커 (제1 두자리 링커의 1개의 아암에 부착된 리간드 아미노에틸푸코스 (AEF) 및 두자리 링커의 다른 아암에 부착된 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택된 리간드를 가짐); (b) 1개 이상의 리간드에 부착된 제1 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨); 및 (c) 1개 이상의 리간드에 부착된 제2 선형 또는 세자리 링커 (각 리간드는 독립적으로 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA), 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로부터 선택됨) (여기서 각 링커는 위치 A1,B1, B3, B28, 또는 B29에 있는 아미노 기에 각각 접합되며, 단 각각은 총 3개의 부위가 점유되도록 개별 위치를 점유함)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
인슐린 접합체
이 섹션은 일부 예시적인 인슐린 또는 인슐린 유사체 접합체를 기재한다.
특정한 실시양태에서, 적어도 1개의 푸코스를 포함하는 인슐린 및 인슐린 유사체 접합체가 제공되고, 여기서 접합체는 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 한다. 추가 측면에서, 상기 접합체는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 한다. 특정한 측면에서, 제2 사카라이드는 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스이다.
용어 "IP"는 만곡부 또는 오목부에서 부호가 플러스에서 마이너스로 또는 마이너스에서 플러스로 변하는 곡선 상의 지점인 변곡점을 지칭한다. 일반적으로, IP는 통상적으로 EC50 또는 IC50에 등가이다.
특정한 측면에서, 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP는 약 100 nM 미만 및 약 0.5 nM 초과일 수 있다. 특정한 측면에서, IC50 또는 IP는 약 50 nM 미만 및 약 1 nM 초과; 약 25 nM 미만 및 약 1 nM 초과; 또는 약 20 nM 미만 및 약 1 nM 초과일 수 있다. 특정한 측면에서, 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP는 약 100 nM 미만 및 약 0.5 nM 초과일 수 있다. 특정한 측면에서, IC50 또는 IP는 약 50 nM 미만 및 약 1 nM 초과; 약 25 nM 미만 및 약 1 nM 초과; 또는 약 20 nM 미만 및 약 1 nM 초과이다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 하기 화학식 I을 가질 수 있고:
<화학식 I>
Figure pct00041
상기 식에서
각 경우의
Figure pct00042
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
각 경우의
Figure pct00043
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
-B는 -T-LB-X이고;
각 경우의 X는 독립적으로 리간드이고;
각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
n은 1, 2, 또는 3이며, 단 인슐린은 리간드 중 1개가 푸코스인 적어도 1개의 링커에 접합된다.
특정한 측면에서, 상기 언급된 접합체는 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체 접합체는 하기 화학식 II를 가질 수 있고:
<화학식 II>
Figure pct00044
상기 식에서
각 경우의
Figure pct00045
는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
각 경우의
Figure pct00046
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
-B1은 -T-
Figure pct00047
-푸코스이고, 여기서
Figure pct00048
은 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
-B2는 -T-
Figure pct00049
-X이고, 여기서 X는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하는 리간드이고;
Figure pct00050
는 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
n은 1, 2, 또는 3이다.
특정한 측면에서, 상기 언급된 접합체는 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 할 수 있다.
예시적인 기의 설명
Figure pct00051
(결절)
특정한 실시양태에서, 각 경우의
Figure pct00052
는 독립적으로 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이다. 일부 실시양태에서, 각 경우의
Figure pct00053
는 동일하다. 일부 실시양태에서, 중앙
Figure pct00054
는
Figure pct00055
의 모든 다른 경우와 상이하다. 특정한 실시양태에서,
Figure pct00056
의 모든 경우는 중앙
Figure pct00057
를 제외하고 동일하다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00058
는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기이다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00059
는 2-, 3, 4, 6, 또는 8-원 아릴 또는 헤테로아릴 기이다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00060
는 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 기이다. 특정한 실시양태에서,
Figure pct00061
는 N, O, 또는 S로부터 선택된 헤테로원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00062
는 질소 원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00063
는 산소 원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00064
는 황 원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00065
는 탄소 원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00066
는 구조
Figure pct00067
이다.
T ( 스페이서 )
특정한 실시양태에서, 각 경우의 T는 독립적으로 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-20 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체된다. 특정한 실시양태에서, T의 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 대체된다. 특정한 실시양태에서, T는 C1-10, C1-8, C1-6, C1-4, C2-12, C4-12, C6-12, C8-12, 또는 C10-12 탄화수소 쇄로부터 구축되고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체된다. 일부 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 헤테로시클릭 기에 의해 대체된다. 일부 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 트리아졸 모이어티에 의해 대체된다. 특정한 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -C(O)-에 의해 대체된다. 특정한 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -C(O)N(R)-에 의해 대체된다. 특정한 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -O-에 의해 대체된다.
특정한 실시양태에서, T는 하기 구조일 수 있다:
Figure pct00068
.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 각각 독립적으로
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 두자리 링커를 포함하는 인슐린 또는 인슐린 유사체 접합체를 제공하고, 여기서 각 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 푸코스를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각 X는 독립적으로
Figure pct00076
Figure pct00077
일 수 있고, 여기서 파상선은 결합이 두자리 링커를 구성하는 원자에 연결된다는 것을 나타낸다. EG는 에틸글루코스이고, EM은 에틸만노스이고, EF는 에틸푸코스이고, ETM은 에틸트리만노스이고, EBM은 에틸디만노스이고, EGA는 에틸글루코스아민이고, EDG는 에틸데옥시글루코스이고, EDF는 에틸데옥시푸코스이고, EDM은 에틸데옥시만노스이다.
통상의 기술자는 다양한 접합 화학을 이용하여 X를 T와 및/또는 W를 T와 (일반적으로 "성분들"을) 공유 접합시킬 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예시적인 기술은 하기에서 논의된다. 성분은 직접 결합되거나 (즉, 어떠한 화학적 기도 개입하지 않음) 또는 스페이서 (예를 들어, 접합된 요소와 링커의 나머지 부분 사이에 일부 물리적 분리를 제공하는 커플링제 또는 공유 쇄)을 통해 간접적으로 결합될 수 있다. 성분은 아미드, 아민, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이소우레아, 이민 등의 결합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 다수의 화학 결합을 통해 링커에 공유 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
다양한 실시양태에서, 성분은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 "클릭 화학" 반응을 이용하여 링커에 공유 결합될 수 있다. 이것은 예를 들어 고리화첨가 반응, 친핵성 개환 반응, 및 탄소-탄소 다중 결합에의 부가를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kolb and Sharpless, Drug Discovery Today 8:1128-1137, 2003] 및 그에 인용된 참고문헌 뿐만 아니라 문헌 [Dondoni, Chem. Asian J. 2:700-708, 2007] 및 그에 인용된 참고문헌 참조). 상기 논의된 바와 같이, 다양한 실시양태에서, 성분은 천연 또는 화학적으로 부가된 펜던트 기를 통해 링커에 결합될 수 있다. 일반적으로, 한 쌍의 반응성 기 (예를 들어, 반응하여 아미드 결합을 생성하는 카르복실 기와 아민 기)의 제1 및 제2 구성원은 성분 및 링커 중 어느 하나 상에 존재할 수 있는 것으로 인지될 것이다 (즉 2가지 구성원의 상대적 위치는 이들이 반응하여 접합체를 생산하는 한 무관함). 예시적인 연결부는 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
특정한 성분은 1개 초과의 동일한 화학적 반응성 모이어티를 본래 가지고 있을 수 있다. 일부 예에서, 성분을 해당 부위 중 오직 1개에서만 선택적으로 반응시키기 위한 화학적 반응 유형 및 조건을 선택하는 것이 가능하다. 예를 들어, 인슐린이 반응성 아민을 통해 접합되는 경우에, 특정한 실시양태에서, N-말단 α-Phe-B1은 인슐린 생물활성을 보존하기 위해 N-말단 α-Gly-A1 및 ε-Lys-B29에 걸친 부착 부위로서 더 바람직할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Mei et al., Pharm. Res. 16: 1680-1686, 1999] 및 그에 인용된 참고문헌 뿐만 아니라 [Tsai et al., J. Pharm. Sci. 86: 1264-1268, 1997] 참조). 헥사데세날 (알데히드-종결된 분자)과 인슐린 사이의 예시적인 반응에서, 연구원은 두 성분을 소듐 시아노보로히드라이드의 존재 하에 1:6 (인슐린:알데히드 mol/mol)의 비로 54% 이소프로판올을 함유하는 1.5M pH 6.8 살리실산나트륨 수용액 중에서 밤새 혼합하면 단일-치환된 Phe-B1 2급 아민-접합된 생성물로 80% 넘게 전환된다는 것을 발견하였다 (Mei et al., Pharm. Res. 16:1680-1686, 1999). 그의 연구는 용매, pH, 및 인슐린:알데히드 비의 선택이 모두 반응의 선택성 및 수율에 영향을 미쳤음을 보여주었다. 그러나, 대부분의 경우, 화학적 반응 조건을 선택하여 선택성을 달성하는 것은 어려운 일이다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 반응에 바람직한 것 이외의 모든 부위에서 성분 (예를 들어, 인슐린)을 선택적으로 보호하고, 이어서 물질을 반응시키고 정제한 후에 탈보호 단계를 거치는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 산성 (BOC), 약간 산성 (시트라콘산 무수물) 및 염기성 (MSC) 조건 하에 탈보호될 수 있는 것을 포함하여, 문헌에 이용가능한 인슐린 아민 기의 선택적 보호에 대한 다수의 예가 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Tsai et al., J. Pharm. Sci. 86: 1264-1268, 1997; Dixon et al., Biochem. J. 109: 312-314, 1968; 및 Schuettler et al., D. Brandenburg Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 360: 1721, 1979] 참조). 한 예에서, Gly-A1 및 Lys-B29 아민을 tert-부톡시카르보닐 (BOC) 기로 선택적으로 보호하고, 이어서 90% 트리플루오로아세트산 (TFA)/10% 아니솔 용액 중에서 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하여 접합시킨 후에 BOC 기를 제거한다. 한 실시양태에서, 인슐린의 건조 분말을 무수 DMSO 중에 용해시킨 후에 과량의 트리에틸아민을 첨가한다. 이 용액에, THF 중 디-tert-부틸 디카르보네이트 용액의 대략 2 당량을 천천히 첨가하고, 용액을 30 내지 60분 동안 혼합되도록 허용한다. 반응 후에, 조 용액을 과량의 아세톤에 부은 후에 묽은 HCl을 적가하여 반응된 인슐린을 침전시킨다. 침전된 물질을 원심분리하여 아세톤으로 세척하고 진공하에 완전히 건조시킨다.
목적하는 디-BOC 보호된 생성물은 미반응 인슐린, 목적하지 않은 디-BOC 이성질체 및 모노-BOC 및 트리-BOC 부산물로부터 정제용 역상 HPLC 또는 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tsai et al., J. Pharm. Sci. 86: 1264-1268, 1997] 참조). 역상 HPLC의 경우에, 0.1％ TFA를 함유하는 70％ 물/30％ 아세토니트릴 중 조 생성물의 용액을 C8 칼럼에 로딩하고, 증가하는 아세토니트릴 구배로 용리한다. 목적하는 디-BOC 피크를 수집하고, 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜 생성물을 수득한다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 올리고사카라이드 접합체는 인슐린 또는 인슐린 유사체 및 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 두자리 링커를 포함할 수 있고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 적어도 1개의 두자리 링커에 대해 제1 사카라이드는 푸코스이고, 적어도 1개의 두자리 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체의 A-쇄 또는 B-쇄의 N-말단 아미노산의 알파 아미노 기 또는 인슐린 또는 인슐린 유사체의 A-쇄 또는 B-쇄의 리신 잔기의 엡실론 아미노 기에 접합된다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 적어도 2개의 링커를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 1개의 링커는 푸코스를 포함하는 두자리 링커이다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 적어도 3개의 링커를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 1개의 링커는 푸코스를 포함하는 두자리 링커이다.
특정한 실시양태에서, 적어도 1개의 두자리 링커는 상기 제시된 바와 같은 화학식 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, AB, AC, AD, AE, AF, AG, AH, AI, AJ, 또는 AK를 가질 수 있고, 여기서 X는 사카라이드이고; 단 적어도 1개의 두자리 링커에 대해 적어도 1개의 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상의 X는 푸코스이다. 특정한 실시양태에서, X는 상기 제시된 바와 같은 화학식 EG, EM, EBM, EGA, EF, EFβ, EBM, ETM, EDG, EDF, 또는 EDM을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 인슐린 유사체는 GIVEQCCX1SICSLYQLENYCX2 (서열 8)의 서열을 포함하는 A 쇄 서열; 및 X3LCGX4X5LVEALYLVCG ERGFF (서열 9) 또는 X8VNQX3LCGX4X5LVEALYLVCGERGFFYTX6 X7 (서열 10)의 서열을 포함하는 B 쇄 서열을 포함할 수 있고, 여기서
X1은 트레오닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X2는 아스파라긴 또는 글리신이고;
X3은 히스티딘 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X4는 알라닌, 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X5는 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 호모시스테산 및 시스테산으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X6은 아스파르테이트-리신 디펩티드, 리신-프롤린 디펩티드, 또는 프롤린-리신 디펩티드이고;
X7은 트레오닌, 알라닌, 또는 트레오닌-아르기닌-아르기닌 트리펩티드이고;
X8은 페닐알라닌 및 데스아미노-페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, A-쇄는 서열 1 또는 서열 6에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있고, B-쇄는 서열 2, 서열 3, 서열 4, 또는 서열 5에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인슐린 유사체는 데스B30 인슐린 유사체, 데스 B29-B30 인슐린 유사체, 데스 B28-B30 인슐린 유사체, 데스 B27-B30 인슐린 유사체 또는 데스 B26-B30 인슐린 유사체이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 인슐린 올리고사카라이드 접합체는 하기 화학식을 가질 수 있고:
Figure pct00078
Figure pct00079
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여기서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 H (수소) 또는 그 위에 사카라이드를 포함하는 리간드를 갖는 선형 링커 또는 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 두자리 링커이고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되며, 단 R1, R2, 또는 R3 중 적어도 1개는 두자리 링커이고, 여기서 제1 사카라이드는 푸코스이다. 특정한 실시양태에서, R1, R2, 또는 R3은 각각 독립적으로 H (수소) 또는 상기에 제시된 바와 같은 화학식 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, AB, AC, AD, AE, AF, AG, AH, AI, AJ, 또는 AK를 갖는 두자리 링커이고, 여기서 X는 사카라이드이며; 단 R1, R2, 또는 R3 중 적어도 1개는 두자리 링커이고, 적어도 1개의 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상의 X는 푸코스이다. 특정한 실시양태에서, X는 상기 제시된 바와 같은 화학식 EG, EM, EBM, EGA, EF, EFβ, EBM, ETM, EDG, EDF, 또는 EDM을 갖는다.
본 발명의 예시적인 인간 인슐린 올리고사카라이드 접합체 (IOC)는 하기 구조를 갖는 IOC를 포함한다.
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지속 방출 제제
특정 실시양태에서, 인슐린 접합체를 지속적인 방식으로 (즉, 가용성 재조합 인간 인슐린보다 더 지속적인 흡수 프로파일을 나타내는 형태로) 투여하는 것이 이로울 수 있다. 이것은 전형적인 글루코스 변동 기간 (즉, 분이 아닌 시간)에 보다 밀접한 관련이 있는 시간 척도 상에서 글루코스 변동에 반응할 수 있는 지속적인 수준의 접합체를 제공할 것이다. 특정한 실시양태에서, 지속 방출 제제는 비-고혈당 상태 (즉, 공복 상태) 하에 포유동물에 투여되었을 때 접합체의 0차 방출을 나타낼 수 있다.
지속적인 흡수 프로파일을 제공하는 임의의 제제가 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 특정한 실시양태에서, 이는 체순환으로의 그의 방출 특성을 늦추는 다른 성분과 접합체를 합하여 달성될 수 있다. 예를 들어, PZI (프로타민 아연 인슐린) 제제가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용은 무정형 및 결정질 형태의 이들 PZI 제제를 포괄한다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 약 0.05 내지 약 10 mg 프로타민/mg 접합체를 포함한다. 예를 들어, 약 0.2 내지 약 10 mg 프로타민/mg 접합체, 예를 들어 약 1 내지 약 5 mg 프로타민/mg 접합체를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 약 0.006 내지 약 0.5 mg 아연/mg 접합체를 포함한다. 예를 들어, 약 0.05 내지 약 0.5 mg 아연/mg 접합체, 예를 들어 약 0.1 내지 약 0.25 mg 아연/mg 접합체를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 프로타민 및 아연을 약 100:1 내지 약 5:1, 예를 들어 약 50:1 내지 약 5:1, 예를 들어 약 40:1 내지 약 10:1 범위의 비 (w/w)로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 PZI 제제는 프로타민 및 아연을 약 20:1 내지 약 5:1, 예를 들어 약 20:1 내지 약 10:1, 약 20:1 내지 약 15:1, 약 15:1 내지 약 5:1, 약 10:1 내지 약 5:1, 약 10:1 내지 약 15:1 범위의 비 (w/w)로 포함한다.
하기 성분 중 하나 이상이 PZI 제제에 포함될 수 있다: 항미생물 보존제, 등장화제 및/또는 비접합 인슐린 분자.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 항미생물 보존제 (예를 들어, m-크레졸, 페놀, 메틸파라벤, 또는 프로필파라벤)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 항미생물 보존제는 m-크레졸이다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제제는 약 0.1 내지 약 1.0% v/v m-크레졸을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 0.1 내지 약 0.5% v/v m-크레졸, 예를 들어 약 0.15 내지 약 0.35% v/v m-크레졸을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 등장화제로서 폴리올 (예를 들어, 만니톨, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 등장화제는 글리세롤이다. 특정한 실시양태에서, 등장화제는 염, 예를 들어 NaCl이다. 예를 들어, 제제는 약 0.05 내지 약 0.5 M NaCl, 예를 들어 약 0.05 내지 약 0.25 M NaCl 또는 약 0.1 내지 약 0.2 M NaCl을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 소정량의 비접합 인슐린 분자를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제제는 약 100:1 내지 1:1, 예를 들어 약 50:1 내지 2:1 또는 약 25:1 내지 2:1 범위의 비접합 인슐린 분자에 대한 접합 인슐린 분자의 몰비를 포함한다.
본 개시내용은 또한 소분자 제제의 관련 기술분야에 널리 공지된 제제의 표준 지속 방출 제제 (또한, 연장 방출 제제라 불리기도 함)의 용도를 포괄한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995] 참조). 본 개시내용은 또한 접합체를 점진적으로 전달하기 위해서 펌프 또는 제한적 확산에 의존하는 장치를 사용하는 것을 포괄한다. 특정한 실시양태에서, 장기 작용 제제는 (추가로 또는 대안적으로) 변형된 인슐린 분자를 사용하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 접합체 제조시에 야생형 인간 인슐린 대신 인슐린 글라진 (란투스®) 또는 인슐린 데테미르 (레베미르®)를 사용할 수 있다. 인슐린 글라진은 A-쇄의 위치 A21에 있는 Asn이 글리신에 의해 대체되고 2개의 아르기닌 잔기가 B-쇄의 C-말단에 있는 예시적인 장기 작용 인슐린 유사체이다. 이러한 변화의 효과는 등전점을 이동시켜, pH 4에서는 가용성이지만 생리학적 pH에서는 불용성인 인슐린을 생성한다. 인슐린 데테미르는 B-쇄의 위치 B30에 있는 Thr이 결실되고 C14 지방산 쇄가 위치 B29에 있는 Lys에 부착된 또 다른 장기 작용 인슐린 유사체이다.
접합체의 용도
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인슐린 접합체를 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 인슐린 접합체를 사용하여, 그를 필요한 개체에게 사카라이드 (예를 들어, 글루코스 또는 외인성 사카라이드, 예컨대 만노스, 알파-메틸 만노스, L-푸코스 등)에 반응하여 인슐린을 제어가능하게 제공할 수 있다. 본 개시내용은 본 개시내용의 인슐린 접합체를 투여하여 당뇨병을 치료하는 것을 포괄한다. 인슐린 접합체는 임의의 환자 (예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 마우스 등)의 치료에 사용될 수 있지만, 가장 바람직하게는 인간의 치료에 사용된다. 인슐린 접합체는 임의의 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피하, 뇌실내, 경피, 직장, 질내, 복강내, 국소 (분말, 연고 또는 점적제에 의함), 협측 투여되거나 또는 경구 또는 비강 스프레이 또는 에어로졸로서 투여되는 것을 포함한다. 이러한 다양한 경로를 위한 제약 조성물의 제제화 및 제조에 있어서의 일반적인 고려사항은 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에서 찾아볼 수 있다. 다양한 실시양태에서, 접합체를 예를 들어 주사에 의해 피하 투여할 수 있다. 인슐린 접합체는 전달이 용이하도록 담체에 용해될 수 있다. 예를 들어, 담체는 멸균수, 염수 또는 완충 염수를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수용액일 수 있다.
일반적으로, 인슐린 접합체의 치료 유효량이 투여될 것이다. 용어 "치료 유효량"은 인슐린 접합체의 효능 및 독성이 균형을 이루는 것을 포함하는 합리적인 이익/위험 비로 당뇨병을 치료하는데 충분한 인슐린 접합체의 양을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 인슐린의 평균 1일 용량은 10 내지 200U, 예를 들어 25 내지 100U의 범위이다 (여기서, 인슐린 1 유닛은 ~ 0.04 mg임). 특정한 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량을 갖는 접합체의 양은 일일 기준으로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량의 5 내지 10배를 갖는 접합체의 양은 매주 기준으로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량의 10 내지 20배를 갖는 접합체의 양은 격주 기준으로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량의 20 내지 40배를 갖는 접합체의 양은 월별 기준으로 투여된다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 환자 (예를 들어, 포유동물 또는 인간 환자)에서 고혈당증을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 환자는 당뇨병성이다. 그러나, 본 발명의 방법은 당뇨병 환자의 치료로 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 접합체는 혈당 조절 장애와 연관된 감염을 가진 환자에서 고혈당증을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 접합체 또는 제제가 환자 (예를 들어, 포유동물 환자)에게 투여되었을 때 이는 비접합 버전의 인슐린 분자보다 더 적은 저혈당증을 유발한다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 환자 (예를 들어, 포유동물 또는 인간 환자)에서 비접합 버전의 인슐린 분자를 포함하는 제제보다 더 낮은 HbA1c 값을 유발한다. 특정한 실시양태에서, 제제는 비접합 버전의 인슐린 분자를 포함하는 제제보다 적어도 10% 더 낮은 (예를 들어, 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 30% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 50% 더 낮은) HbA1c 값을 유도한다. 특정한 실시양태에서, 제제는 7% 미만, 예를 들어 약 4 내지 약 6% 범위의 HbA1c 값을 유도한다. 특정한 실시양태에서, 비접합 버전의 인슐린 분자를 포함하는 제제는 7% 초과, 예를 들어 약 8 내지 약 12%의 HbA1c 값을 유도한다.
외인성 트리거
이전에 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 방법, 접합체 및 조성물은 글루코스 반응성-접합체로 제한되지 않는다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 여러 예시적인 인슐린 접합체는 또한 외인성 사카라이드, 예컨대 알파-메틸 만노스에도 반응성이었다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 인슐린 접합체가 글루코스 이외의 사카라이드, 예컨대 알파-메틸 만노스, 또는 접합체의 PK 또는 PD 특성을 변경시킬 수 있는 임의의 다른 사카라이드의 외인성 투여에 의해 촉발될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
상기 기재된 바와 같이 접합체가 일단 투여되면 (예를 들어, 지속 방출 제제로서 투여되면), 이것은 적합한 외인성 사카라이드의 투여에 의해 촉발될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 외인성 사카라이드의 촉발량이 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 외인성 사카라이드의 "촉발량"은 접합체의 적어도 하나의 PK 및/또는 PD 특성 (예를 들어, 이전에 논의된 바와 같은 Cmax, AUC, 반감기 등)에 변화를 야기하기에 충분한 양이다. 접합체에 관한 임의의 상기 언급된 투여 방법이 외인성 사카라이드에도 동등하게 적용된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 접합체 및 외인성 사카라이드의 투여 방법은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 다양한 실시양태에서, 투여 방법은 상이하다 (예를 들어, 예시의 목적으로 언급하자면, 접합체는 매주 기준으로 피하 주사로 투여될 수 있고, 외인성 사카라이드는 일일 기준으로 경구로 투여됨). 외인성 사카라이드의 경구 투여는 이것이 환자 순응도를 용이하게 하기 때문에 특히 유용하다. 일반적으로, 접합체의 PK 및 PD 특성이 외인성 사카라이드의 PK 프로파일과 관련이 있을 것임을 알 것이다. 따라서, 접합체의 PK 및 PD 특성은 외인성 사카라이드의 PK 프로파일을 제어함으로써 조절될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 외인성 사카라이드의 PK 프로파일은 사용되는 용량, 경로, 빈도 및 제제에 기초하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 접합체의 단기간의 강력한 활성화를 원하는 경우에는 경구 즉시 방출 제제가 사용될 수 있다. 반대로, 접합체의 보다 장기간의 덜 강력한 활성화를 원하는 경우에는 대신에 경구 연장 방출 제제가 사용될 수 있다. 즉시 및 연장 방출 제제의 제제화 및 제조시의 일반적인 고려사항은 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에서 찾아볼 수 있다.
또한 본 개시내용의 접합체 및 외인성 사카라이드의 투여의 상대적 빈도는 동일하거나 또는 상이할 수 있을 것으로 인지될 것이다. 특정한 실시양태에서, 외인성 사카라이드는 접합체보다 빈번하게 투여된다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 외인성 사카라이드가 1일 1회 초과로 투여되는 동안 접합체는 매일 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 외인성 사카라이드가 매일 투여되는 동안 접합체는 매주 2회, 매주, 격주 또는 매월 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 접합체는 매월 투여되고, 외인성 사카라이드는 매주 2회, 매주, 또는 격주로 투여된다. 이들 방식의 다른 변화가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 것이고, 사용되는 접합체 및 제제의 특성에 따라 달라질 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 추가적인 이해를 촉진하도록 의도된다.
실시예
일반적 절차
모든 화학물질은 달리 나타내지 않는 한 상업적 공급원으로부터 구입하였다. 습기 또는 공기에 민감한 반응은 질소 또는 아르곤 하에 무수 용매 및 시약을 사용하여 수행하였다. 반응의 진행은 분석용 박층 크로마토그래피 (TLC), 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (HPLC-MS), 또는 초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (UPLC-MS)에 의해 모니터링하였다. TLC는 실리카 겔 60F-254, 층 두께 0.25 mm로 사전코팅된 이. 머크(E. Merck) TLC 플레이트 상에서 수행하였다. 플레이트를 254 nm UV의 사용 및/또는 세륨 몰리브데넘산암모늄 (CAM) 또는 p-아니스알데히드 염색 용액에의 노출에 이어 탄화에 의해 시각화하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC (슈펠코 아센티스 익스프레스(Supelco Ascentis Express) C18 2.7 μm 3.0x100 mm 칼럼 사용 - 4.0 min에 걸쳐 구배 10:90-99:1 v/v CH3CN/H2O + v 0.05% TFA, 이어서 98:2 v/v CH3CN/H2O + v 0.05% TFA에서 0.75 min 동안 유지; 유량 1.0 mL/min, UV 범위 200-400 nm) (LC-MS 방법 A) 상에서 수행하였다. 질량 분석은 워터스 마이크로매스(Waters Micromass)® ZQ™ (전기분무 이온화를 양성 이온 검출 모드로 사용, 질량-대-전하 비의 스캔 범위는 170-900 또는 500-1500임) 상에서 수행하였다. 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)는 워터스 액퀴티(Waters Acquity)™ UPLC® 시스템 (워터스 액퀴티™ UPLC® BEH300 C4 1.7 μm 2.1x100 mm 칼럼 사용 - 4.0 min에 걸쳐 구배 10:90-90:10 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA 및 0.5 min에 걸쳐 90:10-95:5 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA; 유량 0.3 mL/min, UV 파장 200-300 nm) (UPLC 방법 A) 상에서 수행하였다. 대안적 UPLC 조건을 UPLC 방법 B (워터스 액퀴티™ UPLC® BEH C18 1.7 μm 2.1x100 mm 칼럼 - 4.0 min에 걸쳐 구배 10:90-70:30 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA 및 40 sec에 걸쳐 70:30-95:5 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA; 유량 0.3 mL/min, UV 파장 200-300 nm), UPLC 방법 C (워터스 액퀴티™ UPLC® BEH C18 1.7 μm 2.1x100 mm 칼럼 - 4.0 min에 걸쳐 구배 60:40-100:0 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA 및 40 sec에 걸쳐 100:0-95:5 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA; 유량 0.3 mL/min, UV 파장 200-300 nm), UPLC 방법 D (워터스 액퀴티™ UPLC® BEH300 C4 1.7 μm 2.1x100 mm 칼럼 - 4.3 min에 걸쳐 구배 10:90-50:50 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA 및 0.5 min에 걸쳐 50:50-70:30 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA; 유량 0.3 mL/min, UV 파장 200-300 nm), UPLC 방법 E (워터스 액퀴티™ UPLC® BEH C18 1.7 μm 2.1x100 mm 칼럼 - 4.3 min에 걸쳐 구배 10:90-60:40 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA 및 0.5 min에 걸쳐 60:40-90:10 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA; 유량 0.3 mL/min, UV 파장 200-300 nm), UPLC 방법 F (워터스 액퀴티™ UPLC® BEH C18 1.7 μm 2.1x100 mm 칼럼 - 4.0 min에 걸쳐 구배 60:40-100: 0 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA 및 0.4 min에 걸쳐 100: 0-95:5 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA; 유량 0.3 mL/min, UV 파장 200-300 nm), 및 UPLC 방법 G (워터스 액퀴티™ UPLC® BEH C8 1.7 μm 2.1x100 mm 칼럼 - 4.2 min에 걸쳐 구배 10:90-55:45 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA 및 0.4 min에 걸쳐 100: 0-95:5 v/v CH3CN/H2O + v 0.1% TFA; 유량 0.3 mL/min, UV 파장 200-300 nm)로서 기록하였다. 질량 분석을 워터스 마이크로매스® LCT 프리미어™ XE (전기분무 이온화를 양성 이온 검출 모드로 사용, 질량-대-전하 비의 스캔 범위는 300-2000임) 상에서 수행하였다. 생산된 인슐린 접합체의 확인은 이론적 분자량과 UPLC-MS를 사용하여 측정된 실험값을 비교하여 확인하였다. 당 변형(들)의 위치를 결정하기 위해, 특히 인슐린 접합체를 DTT 처리 (a/b 쇄의 경우) 또는 Glu-C 소화 (환원 및 알킬화 사용)에 적용하고, 이어서 생성된 펩티드를 LC-MS에 의해 분석하였다. 측정된 질량에 기초하여, 당 위치를 추론하였다.
플래쉬 크로마토그래피는 바이오타지 플래쉬(Biotage Flash) 크로마토그래피 장치 (다이액스 코포레이션(Dyax Corp.)) 또는 콤비플래쉬(CombiFlash)®Rf 기기 (텔레다인 이스코(Teledyne Isco))를 사용하여 수행하였다. 정상-상 크로마토그래피는 공지된 크기의 사전-패킹된 카트리지에서 실리카 겔 (20-70 μm, 60 Å 포어 크기) 상에서 수행하였다. 역상 크로마토그래피는 공지된 크기의 사전-패킹된 카트리지에서 C18-결합된 실리카 겔 (20-60 μm, 60-100 Å 포어 크기) 상에서 수행하였다. 정제 규모 HPLC는 길슨 333-334 이원 시스템 상에서 워터스 델타(Waters Delta) Pak C4 15 μm, 300 Å, 50x250 mm 칼럼 또는 크로마실(Kromasil)® C8 10 μm, 100 Å, 50x250 mm 칼럼 (유량 85 mL/min, 공지된 구배 이용)을 사용하여 수행하였다. 용액의 농축을 감압 하에 회전 증발기 상에서 수행하거나 또는 VirTis 프리즈모바일(Freezemobile) 동결 건조기 (SP 사이언티픽(SP Scientific)) 상에서 동결-건조시켰다.
1H NMR 스펙트럼을 공지된 중수소화 용매 중에서 500 MHz (또는 달리 명시됨) 분광계에서 획득하였다. 화학적 이동을 백만분율 (ppm)로 보고하였다. 테트라메틸실란 (TMS) 또는 중수소화 용매의 잔류 양성자 피크를 내부 참조물로 사용하였다. 커플링 상수 (J)를 헤르츠 (Hz)로 보고하였다.
약어: 아세트산 (AcOH), 아세토니트릴 (AcCN), 수성 (aq), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) (HATU), 에틸 아세테이트 (EtOAc), 디에틸 에테르 (에테르 또는 Et2O), N,N-디이소프로필에틸아민 또는 휘니그(Huenig) 염기 (DIPEA), (4-디메틸아미노)피리딘 (DMAP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 에틸 아세테이트 (EtOAc), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), 그램 (g), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt), 시간 (h 또는 hr), 질량 스펙트럼 (ms 또는 MS), 마이크로리터 (μL), 밀리그램 (mg), 밀리리터 (mL), 밀리몰 (mmol), 분 (min), 펜타플루오르페놀-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (PFTU), 석유 에테르 (PE), 체류 시간 (Rt), 실온 (rt), 포화 (sat. 또는 sat'd), 포화 염화나트륨 수용액 (염수), 트리에틸아민 (TEA), 트리플루오로아세트산 (TFA), 테트라히드로푸란 (THF), 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트 (TSTU).
실시예 1
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-6-옥소헥산아미드 (ML-1)의 합성이 기재된다.
Figure pct00260
단계 A: 벤질 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노에이트
DMF (50 mL) 중 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산 (3.3 g, 13.97 mmol)의 용액에 0℃에서 TSTU (4.3 g, 14.28 mmol) 및 DIPEA (2.5 mL, 14.31 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 1시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 Et2O 및 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에테르 (2x150 mL)로 더 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C17H19NO6에 대한 계산치 333.12, 관찰치 m/e: 334.10 [M+1]; Rt = 3.75 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.40-7.30 (5H, m), 5.10 (2H, s), 2.80 (4H, s), 2.62-2.58 (2H, m), 2.41- 2.37 (2H, m), 1.80-1.72 (4H, m).
단계 B: 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트
DMF (20 mL) 중 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드 (1.23 g, 2.247 mmol, WO 2010/088294 A1)의 용액에 0℃에서 벤질 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노에이트 (1.02 g, 3.06 mmol) 및 TEA (0.5 mL, 3.59 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 1시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-40% AcCN/H2O로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 칼럼 (275 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C33H51NO19에 대한 계산치 765.31, 관찰치 m/e = 766.26 [M+1]; Rt = 4.04 min. 1H NMR (D2O) δ 7.43-7.37 (5H, m), 5.14 (2H, s), 5.07-5.06 (1H, m), 4.82-4.81 (1H, m), 4.77-4.76 (1H, m), 4.06-4.01 (2H, m), 3.96-3.92 (2H, m), 3.87-3.81 (5H, m), 3.79-3.77 (1H, m), 3.74-3.67 (5H, m), 3.65-3.60 (4H, m), 3.53-3.49 (1H, m), 3.37-3.35 (2H, m), 2.43-2.40 (2H, m), 2.22-2.19 (2H, m), 1.62-1.52 (4H, m).
단계 C: 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥산산
물 (10 mL) 중 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트 (1.15 g, 1.502 mmol) 및 Pd/C (80 mg, 0.075 mmol)의 혼합물을 H2의 풍선 하에 실온에서 16 hr 동안 교반하였다. 촉매를 여과-제거하고, H2O (3x10 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C26H45NO19에 대한 계산치 675.26, 관찰치 m/e: 676.21 [M+1]; Rt = 3.50 min.
단계 D: 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-6-옥소헥산아미드
DMF (22 mL) 중 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥산산 (1.55 g, 2.294 mmol)의 용액에 0℃에서 TSTU (760 mg, 2.52 mmol) 및 DIPEA (0.52 mL, 2.98 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 1 hr 동안 교반한 후에, 반응물을 TFA (371 μL, 4.82 mmol)의 첨가에 의해 켄칭하고, 생성된 혼합물을 약 3 mL까지 농축시켰다. 잔류물을 무수 아세토니트릴 (45mL)을 함유하는 튜브에 자동피펫을 통해 적가하여 전달하였다. 백색 침전물을 원심분리 (3000 rpm, 15 min, 4℃에서)를 통해 수집하고, 무수 AcCN (1 mL)으로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C30H48N2O21에 대한 계산치 772.27, 관찰치 m/e: 773.23 [M+1]; Rt = 3.65 min. 1H NMR (D2O) δ 5.07-5.06 (1H, m), 4.84-4.83 (1H, m), 4.79-4.78 (1H, m), 4.06-4.01 (2H, m), 3.96-3.93 (2H, m), 3.87-3.83 (5H, m), 3.80-3.78 (1H, m), 3.75-3.69 (5H, m), 3.67-3.61 (4H, m), 3.57-3.52 (1H, m), 3.41-3.38 (2H, m), 2.91 (4H, s), 2.75-2.71 (2H, m), 2.29-2.25 (2H, m), 1.75-1.58 (4H, m).
실시예 2
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[3-O-(α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-6-옥소헥산아미드 (ML-2)의 합성이 기재된다.
Figure pct00261
단계 A: 2-아지도에틸 2,4-디-O-벤조일-6-O-트리틸-β-D-만노피라노시드
250 ml 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노시드 (1.0 g, 2.186 mmol; WO 2010/088294 A1 참조, 본원에 참조로 포함됨)를 피리딘 (50 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 DMAP (13 mg, 0.109 mmol)에 이어 트리틸 클로라이드 (762 mg, 2.73 mmol)를 첨가하였다. 80℃에서 18 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 0-50% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (40 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 C: m/e=722.2955, [M+Na]; Rt=4.50. 1H NMR (CDCl3) δ 7.0-8.3 (m, 25H), 5.8 (t, 1H), 5.5(m, 1H), 5.2 (s, 1H), 4.3 (m, 1H), 4.1 (m, 2H), 4.0 (m, 1H), 3.5 (m, 1H), 3.4 (m, 2H), 3.2 (dd, 1H), 2.7 (d, 1H).
단계 B: 2-아지도에틸 2,4-디-O-벤조일-3-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-6-O-트리틸-α-D-만노피라노시드
100 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 2,4-비스-O-벤조일-6-O-트리틸-α-D-만노피라노시드 (400 mg, 0.572 mmol), 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-1-O-(2,2,2-트리클로로에탄이미도일)-α-D-만노피라노스 (508 mg, 0.686 mmol) 및 4 Å 분자체 (300 mg)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 CH2Cl2 (5 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃로 냉각시키고, 여기에 TMSOTf (10.33 μL, 0.057 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 단계적으로 가온시키고, 30 min 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 sat'd NaHCO3으로 켄칭하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 CH2Cl2 (20 mL)로 희석하고, 염수 및 물로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (80 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 생성물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 1278.80 [M+1]; Rt = 3.14 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.1-8.3 (m, 30H), 6.0 (t, 1H), 5.8 (t, 1H), 5.7 (m, 2H), 5.4 (s, 1H), 5.38 (m, 1H), 5.2 (s, 1H), 4.7 (dd, 1H), 4.6 (dd, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.35 (dd, 1H), 3.9-4.0 (m, 2H), 3.8 (m, 2H), 3,7 (m, 1H), 3.4 (m, 2H).
단계 C: 2-아지도에틸 2,4-디-O-벤조일-3-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노시드
50 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 2,4-디-O-벤조일-3-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-6-O-트리틸-α-D-만노피라노시드 (450 mg, 0.352 mmol) 및 CH2Cl2 (3 mL)를 첨가하였다. 상기 용액에 TFA (3 mL, 38.9 mmol)를 첨가하였다. 25℃에서 1 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 CH2Cl2 (10 mL)로 희석하고, 물 (3x15 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (40 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 생성물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 1053.57 [M+18]; Rt = 2.73 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.0-8.5 (m, 45H), 6.1 (t, 1H), 6.0 (t, 1H), 5.7 (m, 2H), 5.4 (s, 1H), 5.3 (s, 1H), 5.25 (s, 1H), 4.6 (m, 2H), 4.5 (m, 1H), 4.3 (m, 1H), 4.0-4.2 (m, 3h), 3.8 (m, 1H), 3.3-3.5 (m, 3H).
단계 D: 2-아지도에틸 3-O-α-D-만노피라노실-α-D-만노피라노시드
50 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 2,4-디-O-벤조일-3-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노시드 (350 mg, 0.338 mmol) 및 CH3OH (5 mL)를 첨가하였다. 상기 용액에 NaOCH3 (conc)을 pH >10까지 적가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 6 hr 동안 교반하였다. 상기 용액에 다우엑스(Dowex) H+ (50W x 8-200) 수지를 pH ~ 7까지 첨가하였다. 고체 수지를 여과-제거하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 434.00 [M+1]; Rt = 0.44 min.
단계 E: 2-아미노에틸 3-O-α-D-만노피라노실-α-D-만노피라노시드
50 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 3-O-α-D-만노피라노실-α-D-만노피라노시드 (139 mg, 0.338 mmol)를 물/CH3OH (v/v 1:1, 5 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 Pd/C (10%, 36 mg, 0.034 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 H2 풍선 하에 18 hr 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 386.08 [M+1]; Rt = 0.24 min.
단계 F: 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[3-O-(α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-6-옥소헥산아미드
단계 B에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 3-O-α-D-만노피라노실-α-D-만노피라노시드로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 611.201 [M+1]: Rt = 1.82 min.
실시예 3
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[6-O-(α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-6-옥소헥산아미드 (ML-3)의 합성이 기재된다.
Figure pct00262
단계 A: 2-아지도에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-6-트리틸-α-D-만노피라노시드
250 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노시드 (1.0 g, 1.429 mmol)를 피리딘 (20 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 0℃에서 벤조일 클로라이드 (166 μL, 1.429 mmol)를 첨가하였다. rt에서 18 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (20 mL)에 용해시키고, 물 (10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-50% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (40 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 804.44 [M+1]; Rt = 2.88 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.0-8.2 (m, 30H), 6.1 (t, 1H), 5.8(dd, 1H), 5.2 (d, 1H), 4.2-4.3 (m, 1H), 4.0-4.1 (m, 1H), 3.8 (m, 1H), 3.6 (m, 1H), 3.5 (m, 1H), 3.4 (dd, H), 3.3 (dd, 1H).
단계 B: 2-아지도에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-α-D-만노피라노시드
100 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-6-트리틸-α-D-만노피라노시드 (1.1 g, 1.368 mmol)를 CH2Cl2 (10 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 TFA (10 mL, 130 mmol)를 첨가하였다. 25℃에서 18 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 CH2Cl2 (20 mL)로 희석하고, 염수 (10mL) 및 포화 NaHCO3으로 pH ~ 7까지 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (40 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 579.12 [M+18] 및 584.10 [M+Na]; Rt = 2.22 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.2-8.2 (m, 15H), 6.0 (dd, 1H), 5.9(t, 1H), 5.7 (m, 1H), 5.2 (br-s, 1H), 4.1-4.2 (m, 2H), 3.85 (m, 1H), 3.7-3.8 (m, 2H), 3.6 (m, 1H, 3,5 (m, 1H).
단계 C: 2-아지도에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-6-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노시드
100 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 2-아지도에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-α-D-만노피라노시드 (720 mg, 1.282 mmol), 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-1-O-(2,2,2-트리클로로에탄이미도일)-α-D-만노피라노스 (1.14 g, 1.539 mmol) 및 4 Å 분자체 (300 mg)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 CH2Cl2 (10 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 TMSOTf (23.2 μL, 0.128 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 단계적으로 가온시키고, 30 min 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 sat. NaHCO3으로 켄칭하고, 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 CH2Cl2 (20 mL)로 희석하고, 염수 및 물로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (80 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 생성물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 1157.64 [M+18] 및 1163.52 [M+Na]; Rt = 3.01 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.2-8.3 (m, 25H), 6.0 (t, 1H), 5.8 (t, 1H), 5.7 (m, 2H), 5.4 (s, 1H), 5.38 (m, 1H), 5.2 (s, 1H), 4.7 (dd, 1H), 4.6 (dd, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.35 (dd, 1H), 3.9-4.0 (m, 2H), 3.8 (m, 2H), 3,7 (m, 1H), 3.4 (m, 2H).
단계 D: 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[6-O-(α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-6-옥소헥산아미드
단계 D에서의 2-아지도에틸 2,4-비스-O-벤조일-3-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노시드를 2-아지도에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-6-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노시드로 대체한 ML-2에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 611.202 [M+1]; Rt = 1.88 min.
실시예 4
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-6-옥소헥산아미드 (ML-4)의 합성이 기재된다.
Figure pct00263
단계 B에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 (Bilstein J. Org. Chem. 2010, 6, 699-703)로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 433.14 [M+1]; Rt = 2.14 min.
실시예 5
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-[2-(α-D-만노피라노실옥시)에틸]-6-옥소헥산아미드 (ML-5)의 합성이 기재된다.
Figure pct00264
단계 B에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노시드 (Eur. J. Org. Chem. 2002, 79-86)로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 449.14 [M+1], Rt = 1.90 min.
실시예 6
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N,N-비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥산아미드 (ML-6)의 합성이 기재된다.
Figure pct00265
단계 A: 벤질 6-[비스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)아미노]-6-옥소헥사노에이트
DMF (50 mL) 중 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산 (1.5 g, 6.35 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 DIPEA (2.218 mL, 12.70 mmol), HOBt (1.945 g, 12.7 mmol), EDC (2.434 g, 12.7 mmol) 및 디-tert-부틸 2,2'-이미노디아세테이트 (2.34 g, 9.52 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 H2O (30 mL)로 희석하고, CH2Cl2 (2x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 0-40% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (80 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 464.04 [M+1]; Rt = 2.47 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.32 (m, 5H), 5.07 (s, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.96 (s, 2H), 2.35 (s, 2H), 2.26 (s, 2H), 1.66 (s, 4H), 1.42-1.44 (bs, 18H).
단계 B: 2,2'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디아세트산
CH2Cl2 (30 mL) 중 벤질 6-[비스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)아미노]-6-옥소헥사노에이트 (5.9 g, 12.73 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 TFA (30 mL, 12.73 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 C18 역상 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 486 [M+1]; Rt = 2.53 min. 1H NMR (CD3OD) δ 7.30 (m, 5H), 5.06 (s, 2H), 4.81 (s, 4H), 4.19 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.34 (q, 4H, J = 7.03).
단계 C: 벤질 6-{비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥사노에이트
DMF (12 mL) 중 2,2'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디아세트산 (800 mg, 2.277 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 (1.132 g, 5.46 mmol), DMAP (834 mg, 6.83 mmol) 및 EDC (1.528 g, 7.97 mmol)를 첨가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (120 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 730.26 [M+1]; Rt = 1.42 min.
단계 D: 6-{비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥산산
H2O (5 mL) 중 벤질 6-{비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥사노에이트 (900 mg, 1.233 mmol)의 교반된 용액에 rt에서 디히드록시팔라듐 (866 mg, 1.233 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 탈기시키고, 이어서 H2의 풍선 하에 교반하였다. rt에서 H2 하에 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, CH3OH (3x10 mL)으로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 640.17 [M+1]; Rt = 0.98 min.
단계 E: N,N-비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥산아미드
DMF (3.0 mL) 중 6-{비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥산산 (160 mg, 0.250 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 DMF (2 mL) 중 TSTU (94 mg, 0.313 mmol)의 용액을 첨가하고, 5 min 후에, DIPEA (53 μL, 0.300 mmol)를 첨가하였다. 1.5 h 동안 0℃에서 교반한 후에, 혼합물을 원심분리 튜브 내의 Et2O (30 mL)에 적가하였다. 30 min 동안 3500 rpm에서 원심분리한 후에, 상청액을 따라내고, 고체 잔류물을 H2O에 용해시키고, 이를 동결-건조시켜 표제 생성물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 737 [M+1]; Rt = 2.19 min.
실시예 7
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,2'-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]이미노}비스(N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아세트아미드) (ML-7)의 합성이 기재된다.
Figure pct00266
단계 A: 2,2'-[(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산
DMF (10 mL) 중 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산-1-아미늄 4-메틸벤젠술포네이트 (2.0 g, 5.08 mmol)의 용액에 0℃에서 K2CO3 (738 mg, 5.34 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 2 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물의 상청액을 DMF (10 mL) 중 3-(2,6-디옥소모르폴린-4-일)프로판산 (1.10 g, 6.35 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 0℃에서 30 min 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 rt에서 1 hr 동안 교반하고, 이어서 0℃로 냉각시킨 후에 물 (10 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물 (10 mL)에 현탁시켰다. 0℃에서 16 hr 동안 교반한 후에, 고체를 여과를 통해 수집하고, 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 7.36-7.30 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 3.56 (s, 4H), 3.43 (s, 2H), 3.23 (t, J = 6.7, 2H), 2.39 (t, J = 7.3, 2H), 1.68-1.62 (m, 2H), 1.57-1.51 (m, 2H), 1.40-1.35 (m, 2H).
단계 B: 벤질 6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트
DMF (10 mL) 중 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 (7.88 g, 38.04 mmol) 및 2,2'-[(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산 (2.5 g, 19.02 mmol)의 용액에 HOBt (2.43 g, 15.85 mmol) 및 EDC (3.04 g, 15.85 mmol)를 첨가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-50% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (120 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 773.292 [M+1]; Rt = 3.74 min.
단계 C: 2,2'-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]이미노}비스(N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아세트아미드)
단계 D에서의 벤질 6-{비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥사노에이트를 벤질 6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트로 대체한 ML-6에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 780.265 [M+1]; Rt = 2.39 min.
실시예 8
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N,N-비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]글리실-β-알라니네이트 (ML-8)의 합성이 기재된다.
Figure pct00267
단계 A: 2,2'-[(2-{[3-(벤질옥시)-3-옥소프로필]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산
DMF (30 mL) 중 벤질 3-아미노프로파노에이트 히드로클로라이드 (4.49 g, 20.8 mmol)의 빙조 냉각된 용액에 K2CO3 (3.02 g, 21.84 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 0℃에서 2 hr 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고, 여과물을 DMF (30 mL) 중 2-(2,6-디옥소모르폴리노)아세트산 (4.47 g, 25.8 mmol)의 빙조 냉각된 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 30 min 동안 교반하고, 이어서 rt에서 2 hr 동안 교반하였다. 반응물을 물 (30 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, 생성된 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 물 (40 mL)과 교반하고, 생성된 침전물을 여과를 통해 수집하고, 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ 2.53 (t, J = 6.8, 2H), 3.27 (s, 2H), 3.36 (q, J = 6.2, 2H), 3.42 (m,m 2H), 3.49 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 7.28 (m, 4H), 8.16 (m, 1H), 12.45 (br s, 2H).
단계 B: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N,N-비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]글리실-β-알라니네이트
단계 B에서의 2,2'-[(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산을 2,2'-[(2-{[3-(벤질옥시)-3-옥소프로필]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산으로 대체한 ML-7에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 E: m/e = 738.2149 [M+1; Rt = 1.77 min.
실시예 9
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N,N-비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]글리실글리시네이트 (ML-9)의 합성이 기재된다.
Figure pct00268
단계 A에서의 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산-1-아미늄 4-메틸벤젠술포네이트를 벤질 글리시네이트로 대체한 ML-7에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 724.23 [M+1]; Rt = 1.10 min.
실시예 10
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 15-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-3-[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-5,15-디옥소-9,12-디옥사-3,6-디아자펜타데칸-1-아미드 (ML-10)의 합성이 기재된다.
Figure pct00269
단계 A에서의 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산-1-아미늄 4-메틸벤젠술포네이트를 벤질 3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노에이트로 대체한 ML-7에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 825.812 [M+1]; Rt = 2.17 min.
실시예 11
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[비스({3-옥소-3-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-2-옥소에틸}아미노)프로필]아미노}-6-옥소헥사노에이트 (ML-11)의 합성이 기재된다.
Figure pct00270
단계 A: 3,3'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디프로판산
DMF (20 mL) 중 3,3'-이미노디프로피온산 (2.59 g, 7.76 mmol)의 용액에 0℃에서 DMF (3 mL) 중 벤질 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노에이트 (2.59 g, 7.76 mmol)를 15min의 기간에 걸쳐 나누어 첨가하고, 이어서 TEA (951 μL, 6.83 mmol)를 10 min의 기간에 걸쳐 적가하였다. 생성된 현탁액을 rt에서 16 hr 동안 교반하였다. 불용성 물질을 여과에 의해 제거하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 5-50% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (150 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 380.177 [M+1]; Rt = 3.46 min.
단계 B: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[비스({3-옥소-3-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-2-옥소에틸}아미노)프로필]아미노}-6-옥소헥사노에이트
단계 C에서의 2,2'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디아세트산을 3,3'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디프로판산으로 대체한 ML-6에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 765.36 [M+1]; Rt = 2.15 min.
실시예 12
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 1-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-1-옥소헥산-2-일]-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N'-[(2S)-6-{[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]아미노}헥산디아미드 (ML-12)의 합성이 기재된다.
Figure pct00271
단계 A: N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신
250 mL 둥근 바닥 플라스크에서, N2-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 (194 mg, 0.694 mmol) 및 DMF (10 mL)를 첨가하였다. 상기 용액에 DMF (5 mL) 중 ML-4 (300 mg, 0.694 mmol)를 적가한 후에 DIPEA (121 μL, 0.694 mmol)를 첨가하였다. rt에서 18 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 0-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 생성물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 598.2997 [M+1]; Rt = 2.99 min.
단계 B: N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신
100 mL 플라스크에서, N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신 (200 mg, 0.335 mmol)을 물 (5 mL)에 용해시켰다. 플라스크를 탈기시키고, N2로 채웠다. 상기 혼합물에 PdOH2 (48.7 mg, 0.069 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 H2 풍선 하에 2 hr 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 464.2697 [M+1]; Rt = 2.61 min.
단계 C: 벤질 6-({N2,N6-비스[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리실}아미노)헥사노에이트
40 mL 바이알에서, N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신 (150 mg, 0.324 mmol) 및 DMF (5 mL)를 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각시켰다. 상기 용액에 DMF (2 mL) 중 ML-4 (140 mg, 0.324 mmol)를 적가한 후에 TEA (45 μL, 0.324 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt로 가온시키고, 1h 동안 교반하였다. 생성된 혼합물에 TSTU (97 mg, 0.324 mmol)를 첨가한 후에 TEA (45 μL, 0.324 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 20 min 동안 교반하였다. 생성된 혼합물에 DMF (1.0 mL) 중 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산-1-아미늄 4-메틸벤젠술포네이트 (127 mg, 0.324 mmol)의 용액을 첨가하였다. rt에서 18 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 984.5469 [M+1]; Rt = 3.37 min.
단계 D: 1-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-1-옥소헥산-2-일]-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N'-[(2S)-6-{[6-({2-[(α-L-갈락토피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]아미노}헥산디아미드
단계 C에서의 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트를 벤질 6-({N2,N6-비스[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리실}아미노)헥사노에이트로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 991.5182 [M+1]; Rt = 2.41 min.
실시예 13
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2 N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N'-[(5S)-6-{[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥실]아미노}-5-({8-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-8-옥소옥타노일}아미노)-6-옥소헥실]헥산디아미드 (ML-13)의 합성이 기재된다.
Figure pct00272
단계 A: N2-{8-(벤질옥시)-8-옥소옥타노일}-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신
DMF (20 mL) 중 N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신 (310 mg, 0.669 mmol)의 용액에 0℃에서 벤질 8-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-8-옥소옥타노에이트 (242 mg, 0.669 mmol)를 첨가한 후에 DIPEA (0.117 ml, 0.669 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 25℃로 가온시키고, 이 온도에서 18 hr 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-30% CAN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 710.423 [M+1]; Rt = 4.59 min.
단계 B: 벤질 8-({(12S)-1,26-비스[(α-L-푸코피라노실)옥시]-4,11,18,23-테트라옥소-3,10,17,24-테트라아자헥사코산-12-일}아미노)-8-옥소옥타노에이트
40 mL 바이알에서, N2-{8-(벤질옥시)-8-옥소옥타노일}-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신 (100 mg, 0.141 mmol) 및 DMF (5 mL)를 첨가하였다. 상기 용액에 0℃에서 EDC (40.5 mg, 0.211 mmol) 및 HOBt (23.7 mg, 0.155 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 rt로 가온시키고, rt에서 20 min 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 6-아미노-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산아미드 (45.1 mg, 0.141 mmol)를 첨가하였다. rt에서 18 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 0-40% AcCN/물로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1012.6348 [M+1]; Rt = 3.28 min.
단계 C: N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N'-[(5S)-6-{[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥실]아미노}-5-({8-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-8-옥소옥타노일}아미노)-6-옥소헥실]헥산디아미드.
단계 C에서의 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트를 벤질 8-({(12S)-1,26-비스[(α-L-푸코피라노실)옥시]-4,11,18,23-테트라옥소-3,10,17,24-테트라아자헥사코산-12-일}아미노)-8-옥소옥타노에이트로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1019.588 [M+1]; Rt = 2.38 min.
실시예 14
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N-{(5S)-5-({8-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-8-옥소옥타노일}아미노)-6-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}-N'-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸} 헥산디아미드 (ML-14)의 합성이 기재된다.
Figure pct00273
단계 A: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리시네이트
6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노에이트를 N2-{8-(벤질옥시)-8-옥소옥타노일}-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신으로 대체한 ML-1 단계 A에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 695.213 [M+1]; Rt = 3.98 min.
단계 B: N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-L-리신아미드
40 mL 바이알에서, 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드 (883 mg, 1.612 mmol)를 DMF (10 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 0℃에서 DMF (10 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리시네이트 (700 mg, 1.008 mmol)의 용액을 적가하였다. rt에서 18 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 HPLC (워터스 델타 Pak C4 300 A, 15 um, 50 x 250 mm 칼럼, 유량 85 ml/min, 25 min 이내의 8-30% ACN/물 구배)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1127.335 [M+1]; Rt = 2.83 min.
단계 C: N-{(5S)-5-아미노-6-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}-N'-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산디아미드
100 mL 플라스크에서, N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-L-리신아미드 (950 mg, 0.843 mmol)를 물 (10 mL)에 용해시켰다. 플라스크를 탈기시키고, N2로 채웠다. 생성된 혼합물에 Pd/C (10%, 179 mg, 0.169 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 H2 풍선 하에 18 hr 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 993.326 [M+1]; Rt = 1.37 min.
단계 D: N-{(5S)-5-({8-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-8-옥소옥타노일}아미노)-6-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}-N'-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산디아미드
단계 C에서의 N6-[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]-L-리신을 N-{(5S)-5-아미노-6-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}-N'-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산디아미드로 대체한 ML-12에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다: UPLC 방법 B: m/e = 1218.418 [M+1]; Rt = 2.25 min.
실시예 15
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,2'-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]이미노}비스[N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아세트아미드] (ML-15)의 합성이 기재된다.
Figure pct00274
단계 B에서의 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드로 대체한 ML-7에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1460.58 [M+1]; Rt = 1.53 min.
실시예 16
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}피롤리딘-시스-3,4-디카르복스아미드 (ML-16)의 합성이 기재된다.
Figure pct00275
단계 C에서의 2,2'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디아세트산을 피롤리딘-시스-3,4-디카르복실산으로 대체한 ML-6에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 763.38 [M+1]; Rt = 2.12 min.
실시예 17
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}피페리딘-시스-3,5-디카르복스아미드 (ML-17)의 합성이 기재된다.
Figure pct00276
단계 A: N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}피리딘-3,5-디카르복스아미드
DMF (30 mL) 중 3,5-피리딘디카르복실산 (311 mg, 1.861 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 (2.077 g, 9.30 mmol), DMAP (568 mg, 4.65 mmol), 및 EDC (1784 mg, 9.30 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (300 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 578.31 [M+1]; Rt = 0.25 min.
단계 B: N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}피페리딘-시스-3,5-디카르복스아미드
H2O (12 mL) 중 N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}피리딘-3,5-디카르복스아미드 (550 mg, 0.952 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 PtO2 (64.9 mg, 0.286 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 탈기시키고, 이어서 H2의 풍선 하에 rt에서 4 hr 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 농축시키고, CH3OH에 재용해시키고, 원심분리하여 고체 촉매를 침전시켰다. 상청액을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 584.27 [M+1]; Rt = 1.14 min.
단계 C: 벤질 6-[시스-3,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}카르바모일)피페리딘-1-일]-6-옥소헥사노에이트
DMF (3 mL) 중 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산 (125 mg, 0.529 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 DMAP (64.6 mg, 0.529 mmol), EDC (203 mg, 1.058 mmol), 및 DMF (2 mL) 중 N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}피페리딘-시스-3,5-디카르복스아미드 (438 mg, 0.794 mmol)의 용액을 첨가하였다. rt에서 밤새 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-50% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 F: m/e = 770.48 [M+1]; Rt = 1.38 min.
단계 D: 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}피페리딘-시스-3,5-디카르복스아미드
단계 D에서의 벤질 6-{비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥사노에이트를 벤질 6-[시스-3,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}카르바모일)피페리딘-1-일]-6-옥소헥사노에이트로 대체한 ML-6에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 F: m/e = 777.35 [M+1]; Rt = 2.23 min.
실시예 18
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N1,N5-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N2-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-L-글루탐아미드 (ML-18)의 합성이 기재된다.
Figure pct00277
단계 A: 벤질 [(2S)-1,5-디옥소-1,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄-2-일]카르바메이트
DMF (10 mL) 중 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-글루탐산 (1.1 g, 3.91 mmol) 및 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 (2.026 g, 9.78 mmol)의 용액에 EDC (3.00 g, 15.64 mmol) 및 DMAP (0.048 g, 0.391 mmol)를 첨가하였다. rt에서 24 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 5 칼럼 부피에 대해 100% EtOAc, 이어서 등용매 EtOAc:AcCN:MeOH 6:1:1로 용리하는 실리카 겔 (80 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 7.38-7.29 (m, 5H), 5.13-5.05 (m, 2H), 4.76 (s, 2H), 4.09 (dd, J = 5.3, 8.6, 1H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.74-3.65 (m, 6H), 3.53-3.25 (m, 8H), 2.30 (t, J = 7.5, 2H), 2.06-2.04 (m, 1H), 1.92-1.89 (m, 1H), 1.19 (d, J = 6.5, 6H).
단계 B: 2-[(N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-L-α-글루타미닐)아미노]에틸 α-L-푸코피라노시드
CH3OH (20 mL) 중 벤질 [(2S)-1,5-디옥소-1,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄-2-일]카르바메이트 (940 mg, 1.425 mmol) 및 펄만 촉매 (20 mg, 0.028 mmol)의 현탁액을 30 Psi의 H2 하에 실온에서 진탕시켰다. 16시간 후에, 촉매를 여과-제거하고, 여과물을 표제 화합물로 농축시켰다.
단계 C: 벤질 {[(2S)-1,5-디옥소-1,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄-2-일]아미노}-6-옥소헥사노에이트
DMF (10 mL) 중 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산 (260 mg, 1.1 mmol)의 용액에 0℃에서 TSTU (348 mg, 1.155 mmol)에 이어 DIPEA (202 μL, 1.155 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 1 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 Et2O (100 mL) 및 염수 (100 mL) 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 염수 (2x100 mL)로 더 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 DMF (5 mL)에 재용해시키고, DMF (10 mL) 중 2-[(N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-L-α-글루타미닐)아미노]에틸 α-L-푸코피라노시드 (368 mg, 1.103 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가한 후에 Et3N (154 μL, 1.103 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 30 min 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 rt까지 단계적으로 가온시키고, 2 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH3OH (10 mL)로 희석하고, HPLC (34 min에 걸쳐 6-30% 0.1%TFA/물 구배, 50x250 mm C4 15 um, 300A, 100 mL/min 유량)에 의해 정제하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 8.18 (m, 1H), 7.35-7.30 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 4.76 (d, J = 3.6, 2H), 4.30 (dd, J = 5.5, 8.6, 1H), 3.93 (dd, J = 6.5, 13.1, 2H), 3.74-3.71 (m, 4H), 3.65 (s, 2H), 3.54-3.25 (m, 6H), 2.40 (t, J = 6.7, 2H), 2.29-2.26 (m, 4H), 2.07-2.03 (m, 2H), 1.93-1.88 (m, 2H), 1.65-1.64 (m, 4H), 1.19 (d, J = 6.5, 6H).
단계 D: {[(2S)-1,5-디옥소-1,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄-2-일]아미노}-6-옥소헥산산
메탄올 (30 mL) 중 벤질 {[(2S)-1,5-디옥소-1,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄-2-일]아미노}-6-옥소헥사노에이트 (380 mg, 0.511 mmol) 및 펄만 촉매 (50 mg, 0.071 mmol)의 현탁액을 Parr 진탕기 상에서 50 Psi의 H2 하에 실온에서 교반하였다. 16시간 후에, 촉매를 여과-제거하고 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 4.76-4.75 (m, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 3.96-3.91 (m, 2H), 3.76-3.66 (m, 5H), 3.55-3.27 (m, 9H), 2.34-2.27 (m, 6H), 2.09-2.04 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 1H), 1.67-1.61 (m, 4H), 1.20 (d, J = 6.7, 6H).
단계 E: N1,N5-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N2-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-L-글루탐아미드
DMF (5.0 mL) 중 {[(2S)-1,5-디옥소-1,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄-2-일]아미노}-6-옥소헥산산 (289 mg, 0.422 mmol)의 현탁액에 0℃에서 TSTU (140 mg, 0.464 mmol)에 이어 휘니그 염기 (810 μL, 0.464 mmol)를 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시켜 표제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제하지 않고 사용하였다. UPLC 방법 B: m/e = [M+1]; Rt= 1.82 min.
실시예 19
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N1,N4-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N2-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-L-아스파르트아미드 (ML-19)의 합성이 기재된다.
Figure pct00278
단계 A에서의 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-글루탐산을 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-아스파르트산으로 대체한 ML-18에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 737.3126 [M+1]; Rt = 2.04 min.
실시예 20
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N2-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-N5-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N1-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루탐아미드 (ML-20)의 합성이 기재된다.
Figure pct00279
단계 A: 벤질 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루타미네이트
DMF (10 mL) 중 Z-Glu-γ-Bn (1.0 g, 2.69 mmol) 및 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드 (2.21 g, 4.04 mmol)의 용액에 EDC (1.29 g, 6.73 mmol), HOBt (41 mg, 0.269 mmol), 및 Et3N (38 μL, 0.269 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 HPLC (50x250 mm, C4, 유량 85 mL/분, 30 min에 걸쳐 25-35% AcCN/H2O + 0.1% TFA 구배)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 8.12-8.10 (m, 1H), 7.38-7.26 (m, 10H), 5.50-5.04 (m, 5H), 4.81 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.16-4.13 (m, 1H), 4.06 (s, 1H), 3.99-3.3.97 (m, 1H), 3.93-3.37 (m, 20H), 2.48 (t, J = 7.6, 2H), 2.15-2.10 (m, 1H), 1.97-1.90 (m, 1H).
단계 B: N-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루타민
H2O (30 mL) 중 벤질 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루타미네이트 (1.41 g, 1.57 mmol) 및 펄만 촉매 (110 mg, 0.157 mmol)의 혼합물을 Parr 진탕기 상에서 50 Psi H2 하에 실온에서 교반하였다. 16시간 후에, 촉매를 여과-제거하고 여과물을 동결-건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (D2O) δ 5.07 (s, 1H), 4.87 (s, 1H), 4.81 (s, 1H), 4.08-3.55 (m, 22H), 3.41-3.36 (m, 1H), 2.32 (t, J = 7.5, 2H), 2.10-2.06 (m, 2H).
단계 C: N2-[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]-N-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루타민
단계 C에서의 2-[(N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-L-α-글루타미닐)아미노]에틸 α-L-푸코피라노시드를 N-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루타민으로 대체한 ML-18에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 8.09-8.06 (m, 1H), 7.35-7.30 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.79 (m, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.34-4.31 (m, 1H), 4.06-3.37 (m, 22H), 2.42-2.36 (m, 4H), 2.29-2.26 (m, 2H), 2.09-2.05 (m, 1H), 1.93-1.88 (m, 1H), 1.65-1.62 (m, 4H).
단계 D: N2-[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]-N5-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N1-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루탐아미드
DMF (10 mL) 중 N2-[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]-N-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루타민 (500 mg, 0.559 mmol) 및 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 (116 mg, 0.559 mmol)의 용액에 EDC (161 mg, 0.838 mmol) 및 HOBt (8.56 mg, 0.056 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 HPLC (50x250 mm, C4, 유량 85 mL/분, 30 min에 걸쳐 25-35% AcCN/H2O + 0.1% TFA 구배)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 8.12-8.08 (m, 1H), 7.35-7.29 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.12-3.26 (m, 30H), 2.42-2.39 (m, 2H), 2.30-2.26 (m, 4H), 2.09-2.04 (m, 1H), 1.93-1.88 (m, 1H), 1.65-1.64 (m, 4H), 1.19 (d, J = 6.7, 3H).
단계 E: N2-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-N5-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N1-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루탐아미드
단계 D에서의 벤질 {[(2S)-1,5-디옥소-1,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄-2-일]아미노}-6-옥소헥사노에이트를 N2-[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]-N5-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-N1-{2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}-L-글루탐아미드로 대체한 ML-18에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 5.08 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.33-4.30 (m, 1H), 4.06-3.33 (m, 30H), 2.84-2.82 (m, 4H), 2.69-2.66 (m, 2H), 2.34-2.27 (m, 4H), 2.10-2.02 (m, 1H), 1.94-1.89 (m, 1H), 1.76-1.74 (m, 4H), 1.20 (d, J = 6.5, 3H).
실시예 21
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N2-[5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-5-옥소펜타노일]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-L-글루타미닐글리시네이트 (ML-21)의 합성이 기재된다.
Figure pct00280
단계 A: (S)-벤질 2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-5-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-5-옥소펜타노에이트
DMF (36 mL) 중 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드 (2.6 g, 4.75 mmol), 및 (S)-5-(벤질옥시)-4-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-5-옥소펜탄산 (2.0 g, 5.39mmol)의 용액에 0℃에서 DMAP (580 mg, 4.75 mmol) 및 EDC (3.64 g, 19.00 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt까지 단계적으로 가온시켰다. 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 10-55% AcCN/H2O로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (275g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C40H56N2O21에 대한 계산치 900.34, 관찰치 m/e: 901.26 [M+1]; Rt = 2.46 min.
단계 B: (S)-2-아미노-5-((2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시)에틸)아미노)-5-옥소펜탄산
물 (10 mL) 중 (S)-벤질 2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-5-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-5-옥소펜타노에이트 (1.0 g, 1.11 mmol) 및 Pd/C (118 mg, 0.111 mmol)의 혼합물을 H2의 풍선 하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과-제거하고, H2O (3x10 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C25H44N2O19에 대한 계산치 676.25, 관찰치 m/e: 677.21 [M+1]; Rt = 0.86 min.
단계 C: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 5-옥소-5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜타노에이트
벤질 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노에이트를 벤질 5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노에이트로 대체한 ML-4에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C17H26N2O10에 대한 계산치 418.16, 관찰치 m/e: 419.11 [M+1]; Rt = 2.00 min.
단계 D: (S)-5-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-5-옥소-2-[5-옥소-5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄아미도]펜탄산
DMF (5 mL) 중 (S)-2-아미노-5-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-5-옥소펜탄산 (350 mg, 4.75 mmol)의 용액에 0℃에서 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 5-옥소-5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜타노에이트 (216 mg, 0.517 mmol, 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산을 5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄산으로 대체한 실시예 4, ML-4, 단계 A에 따라 제조됨) 및 TEA (0.2 mL, 1.435 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 2 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 5-40% AcCN/H2O로 용리하는 C18 실리카 겔 (150g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C38H65N3O26에 대한 계산치 979.39, 관찰치 m/e: 980.31 [M+1]; Rt = 0.92 min.
단계 E: (S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 5-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-5-옥소-2-[5-옥소-5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄아미도]펜타노에이트
DMF (2 mL) 중 (S)-5-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-5-옥소-2-[5-옥소-5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄아미도]펜탄산 (366 mg, 0.373 mmol)의 용액에 0℃에서 TSTU (115 mg, 0.381 mmol) 및 DIPEA (0.1 mL, 0.573 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 1시간 동안 교반한 후에, 반응물을 TFA (60 μL, 0.784 mmol)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 AcCN (45 mL)을 함유하는 튜브에 자동피펫을 통해 적가하여 전달하였다. 생성된 백색 현탁액을 원심분리 (3000 rpm, 15분, 4℃에서)하여 맑은 상청액 및 백색 펠릿이 생성되었다. 상청액을 따라내고, 백색 펠릿을 AcCN (1 mL)으로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다: UPLC 방법 B: C42H68N4O28에 대한 계산치 1076.40, 관찰치 m/e: 1077.28 [M+1]; Rt = 0.90 min.
단계 F: 벤질 N2-[5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-5-옥소펜타노일]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-L-글루타미닐글리시네이트
DMF (4 mL) 중 (S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 5-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-5-옥소-2-[5-옥소-5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)펜탄아미도]펜타노에이트 (0.35 g, 0.325 mmol)의 용액에 0℃에서 2-(벤질옥시)-2-옥소에탄아미늄 클로라이드 (77 mg, 0.382 mmol) 및 TEA (0.15 mL, 1.076 mmol)를 첨가하였다. rt에서 24 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 5-40% AcCN/H2O로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (150 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C47H74N4O27에 대한 계산치 1126.45, 관찰치 m/e: 1127.39 [M+1]; Rt = 2.84 min.
단계 G: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N2-[5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-5-옥소펜타노일]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-L-글루타미닐글리시네이트
단계 C에서의 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트를 벤질 N2-[5-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-5-옥소펜타노일]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-L-글루타미닐글리시네이트로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C44H71N5O29에 대한 계산치 1133.42, 관찰치 m/e: 1134.34 [M+1]; Rt = 2.17 min.
실시예 22
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{(2S)-8-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-1-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-1,8-디옥소옥탄-2-일}-N'-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산디아미드 (ML-22)의 합성이 기재된다.
Figure pct00281
단계 A: (2S)-8-(벤질옥시)-2-{[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]아미노}-8-옥소옥탄산
DMF 중 ML-4 (300 mg, 0.694 mmol)의 용액에 0℃에서 (S)-2-아미노-8-(벤질옥시)-8-옥소옥탄산 (194 mg, 0.694 mmol)에 이어 DIPEA (121 μL, 0.694 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 2 hr 동안 교반하고, 이어서 농축시켰다. 잔류물을 5-28% AcCN/H2O로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 597.226 [M+1]; Rt = 3.45 min.
단계 B: N-{(2S)-8-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-1-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-1,8-디옥소옥탄-2-일}-N'-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산디아미드
단계 A에서의 벤질 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산을 (2S)-8-(벤질옥시)-2-{[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노일]아미노}-8-옥소옥탄산으로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e: 1133.312 [M+1]; Rt = 2.23 min.
실시예 23
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-13-{2-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-2-옥소에틸}-4,11,15-트리옥소-3,10,13,16-테트라아자도코산-22-오에이트 (ML-23)의 합성이 기재된다.
Figure pct00282
단계 A: 벤질 (6-{2-[(α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}-6-옥소헥실)카르바메이트
DMF (80 mL) 중 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 (3.0 g, 14.48 mmol)의 용액에 rt에서 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}헥사노에이트 (6.3 g, 17.37 mmol)를 첨가하고, 1 hr 후에, TEA (4.44 mL, 31.8 mmol)를 첨가하였다. 16 h 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 5-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (230g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 455.2568 [M+1]; Rt = 2.86 min.
단계 B: 6-아미노-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산아미드
H2O (20 mL) 중 벤질 (6-{2-[(α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}-6-옥소헥실)카르바메이트 (1.72 g, 3.79 mmol)의 용액에 Pd/C (23 mg, 0.217 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 탈기시키고, H2의 풍선 하에 교반하였다. 2 h 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 동결-건조시켜 표제 화합물을 생성하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.21 (d, 3 H), 1.40-1.38 (m, 2 H), 1.62-1.60 (m, 4 H), 2.23 (t, 2 H), 2.76 (t, 2 H), 3.28-3.27 (m, 1 H), 3.44-3.43 (m, 1 H), 3.54-3.52 (m, 1 H), 3.66 (s, 1 H), 3.75-3.74 (m, 2 H), 3.94-3.93 (m, 1 H), 4.76 (d, 1 H). UPLC 방법 B: m/e = 321.2323 [M+1]; Rt =3.02 min.
단계 C: [(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)(2-{[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)아미노]아세트산
CH2Cl2 (30 mL) 중 2,2'-[(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)아잔디일]디아세트산 (1.0 g, 2.54 mmol)의 현탁액에 0℃에서 트리플루오로아세트산 무수물 (448 μL, 3.17 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 3 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 -30℃로 냉각시키고, 여기에 DMF (20 mL) 중 Et3N (848 μL, 6.08 mmol)의 용액을 30 min에 걸쳐 적가하였다. -30℃에서 30 min 동안 교반한 후에, DMF (30 mL) 중 6-아미노-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산아미드 (812 mg, 2.54 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 생성된 혼합물을 rt에서 교반하였다. 16 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (42g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 생성하였다. UPLC 방법 B: m/e = 697.3876 [M+1]; Rt = 3.398 min. 1H NMR (CD3OD) δ 1.23 (3 H, d, J = 6.59), 1.39-1.36 (4 H, m), 1.56 (6 H, s), 1.67 (6 H, d, J = 10.32), 2.23 (2 H, t, J = 7.50), 2.41 (2 H, t, J = 7.37), 3.24 (6 H, m), 3.42 (4 H, s), 3.49 (2 H, s), 3.57-3.52 (3 H, m), 3.68 (1 H, s), 3.77 (3 H, t, J = 1.65), 3.98-3.94 (1 H, m), 4.77 (1 H, s), 5.14 (2 H, s), 7.38 (5 H, d, J = 4.43).
단계 D: 벤질 1-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-13-{2-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-2-옥소에틸}-4,11,15-트리옥소-3,10,13,16-테트라아자도코산-22-오에이트
DMF (15 mL) 중 [(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)(2-{[6-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)아미노]아세트산 (800 mg, 1.148 mmol)의 용액에 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)]-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드 (1.89 g, 3.44 mmol), HOBt (17.6 mg, 0.115 mmol), 및 EDC (770 mg, 4.02 mmol)를 첨가하였다. 16 h 동안 rt에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 10-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (50 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1226.5990 [M+1]; Rt = 2.96 min. 1H NMR (CD3OD) δ 1.23 (3 H, d, J = 6.58), 1.38 (6 H, s), 1.56 (6 H, s), 1.69-1.65 (6 H, m), 2.23 (2 H, t, J = 7.44), 2.41 (2 H, t, J = 7.35), 3.27-3.23 (6 H, m), 3.37 (1 H, s), 3.37 (1 H, s), 3.38 (1 H, s), 3.45 (1 H, s), 3.47 (1 H, s), 3.47 (1 H, s), 3.54 (3 H, s), 3.60 (1 H, s), 3.62 (2 H, s), 3.64 (1 H, s), 3.65 (1 H, s), 3.67 (2 H, s), 3.68 (3 H, s), 3.88-3.72 (20 H, m), 4.07 (1 H, s), 4.76 (1 H, s), 4.78 (1 H, s), 4.84 (1 H, d, J = 1.69), 5.10 (1 H, s), 5.14 (2 H, s), 7.38 (5 H, d, J = 4.37).
단계 E: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 13-(2-((2-(((([α-D-만노피라노실-(1→3)]-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실-옥시-(1-O→2))-에틸아미노)-2-옥소에틸)-4,11,15-트리옥소-1-(((2-(α-L-푸코피라노실-옥시)-(1-O→2)))옥시)-3,10,13,16-테트라아자도코산-22-오에이트
단계 D에서의 벤질 6-{비스[2α-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥사노에이트를 벤질 1-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-13-{2-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-2-옥소에틸}-4,11,15-트리옥소-3,10,13,16-테트라아자도코산-22-오에이트로 대체한 ML-6에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1233.6006 [M+1]; Rt = 2.223 min.
실시예 21
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-(2-{[6-({2-[(6-데옥시-α-L-갈락토피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)-N-[2-({6-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]글리실-β-알라니네이트 (ML-21)의 합성이 기재된다.
Figure pct00283
단계 A: 벤질 {6-[(2-{[α-D-만노피라노일-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}카르바메이트
DMF (50 mL) 중 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드 (1.8 g, 3.29 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 벤질 {6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-헥실}카르바메이트 (1.787 g, 4.93 mmol)를 첨가하고, 30분 후에 Et3N (1.146 mL, 8.22 mmol)을 첨가하였다. 16 h 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 생성된 잔류물을 5-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (240 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.35 (br s, 2 H), 1.52 (br s, 2 H), 1.63 (br s, 2 H), 2.21 (s, 2 H), 3.12 (s, 2 H), 3.37 (s, 1 H), 3.51-3.37 (br m, 5 H), 3.81-3.69 (br m, 14 H), 3.98 (s, 1 H), 4.06 (s, 1 H), 4.72 (s, 1 H), 4.81 (s, 2 H), 5.07 (s, 2 H), 7.35 (s, 5 H). UPLC 방법 B: m/e = 795.303 [M+1]; Rt = 2.49 min.
단계 B: 6-아미노-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)헥산아미드
단계 B에서의 벤질 (6-{2-[(α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}-6-옥소헥실)카르바메이트를 벤질 {6-[(2-{[α-D-만노피라노일-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}카르바메이트로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.40 (2 H, d, J = 7.97), 1.63 (4 H, d, J = 12.78), 2.23 (2 H, t, J = 7.37), 2.82 (2 H, q, J = 8.46), 3.44-3.37 (2 H, m), 3.53-3.46 (1 H, m), 3.63-3.61 (4 H, m), 3.72-3.70 (6 H, m), 3.80 (5 H, dd, J = 9.96, 4.52), 3.83 (2 H, s), 3.90 (1 H, dd, J = 11.05, 5.87), 3.97 (1 H, s), 4.03 (1 H, s), 4.72 (1 H, s), 4.81 (1 H, s), 5.06 (1 H, s). UPLC 방법 B: m/e 661.3543 [M+1]; Rt = 3.89 min.
단계 C: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-(2-{[6-({2-[(6-데옥시-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)-N-[2-({6-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]글리실-β-알라니네이트
각각 단계 C에서의 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드 및 2,2'-[(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산을 6-아미노-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)헥산아미드 및 벤질 N,N-비스(카르복시메틸)글리실-β-알라니네이트로 대체하고, 단계 D에서의 6-아미노-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)헥산아미드를 6-아미노-N-{2-[(6-데옥시-α-L-갈락토피라노실)옥시]에틸}헥산아미드로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 E: m/e = 1304.444 [M+1]; Rt = 1.76 min.
실시예 25
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-13-[2-({6-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]-4,11,15-트리옥소-3,10,13,16-테트라아자도코산-22-오에이트 (ML-25)의 합성이 기재된다.
Figure pct00284
벤질 N,N-비스(카르복시메틸)글리실-β-알라니네이트를 2,2'-[(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산으로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 E: m/e = 1346.5950 [M+1]; Rt = 2.29 min.
실시예 26
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-11-[2-({4-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-4-옥소부틸}아미노)-2-옥소에틸]-4,9,13-트리옥소-3,8,11,14-테트라아자이코산-20-오에이트 (ML-26)의 합성이 기재된다.
Figure pct00285
단계 A: 벤질 {4-[(2-{[α-D-만노피라노일-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-4-옥소부틸}카르바메이트
DMF (5 mL) 중 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)]-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드 (790 mg, 1.44 mmol) 및 4-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}부탄산 (342 mg, 1.443 mmol)의 혼합물에 EDC (553 mg, 2.89 mmol) 및 DMAP (176 mg)를 첨가하였다. rt에서 밤새 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 5-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (43g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 767.2084 [M+1]; Rt = 2.56 min.
단계 B: 4-아미노-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)부탄아미드
물 (6 mL) 중 벤질 {4-[(2-{[α-D-만노피라노일-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-4-옥소부틸}카르바메이트 (955 mg, 1.25 mmol)의 질소 플러싱된 용액에 10% 탄소 상 팔라듐 (133 mg)을 첨가하고, 생성된 혼합물 H2의 풍선 하에 4 hr 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 동결-건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 633.2224 [M+1]; Rt = 0.78 min.
단계 C: 4-아미노-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}부탄아미드
단계 A에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)]-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드로 대체한 ML-26에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 E: m/e= 1248.365 [M+1]; Rt = 1.37 min.
단계 D: 11-[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-1-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)-4,9,13-트리옥소-3,8,11,14-테트라아자옥타데칸-18-아미드
각각 단계 C에서의 6-아미노-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산아미드를 4-아미노-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}부탄아미드로 대체하고, 단계 D에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)]-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 4-아미노-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)부탄아미드로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 E: m/e = 1290.4012 [M+1]; Rt = 2.03 min.
실시예 27
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-(2-{[4-({2-[(6-데옥시-α-L-갈락토피라노실)옥시]에틸}아미노)-4-옥소부틸]아미노}-2-옥소에틸)-N-[2-({4-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-4-옥소부틸}아미노)-2-옥소에틸]글리실-β-알라니네이트 (ML-27)의 합성이 기재된다.
Figure pct00286
단계 B에서의 벤질 {6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}카르바메이트를 벤질 {4-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-4-옥소부틸}카르바메이트로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 E: m/e = 1248.365 [M+1]; Rt = 1.37 min.
실시예 28
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-11-[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]-1-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}-4,9,13-트리옥소-3,8,11,14-테트라아자이코산-20-아미드 (ML-28)의 합성이 기재된다.
Figure pct00287
단계 D에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)]-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 4-아미노-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)부탄아미드로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 E: m/e = 1318.4270 [M+1]; Rt = 2.19 min.
실시예 29
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-({[(2-옥소-2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]-2-옥시에틸}아미노)({2-옥소-2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-2-옥소에틸}아미노)에틸]아미노}아세트아미도)-6-옥소헥사노에이트 (ML-29)의 합성이 기재된다.
Figure pct00288
단계 C에서의 6-아미노-N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}헥산아미드를 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 A: m/e = 1120.30 [M+1]; Rt = 1.90 min.
실시예 30
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-({[(2-옥소-2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]-2-옥시에틸}아미노)({2-옥소-2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]-2-옥소에틸}아미노)에틸]아미노}아세트아미도)아세테이트 (ML-30)의 합성이 기재된다.
Figure pct00289
각각 단계 C에서의 2,2'-((2-((6-(벤질옥시)-6-옥소헥실)아미노)-2-옥소에틸)이미노)디아세트산을 벤질 N,N-비스(카르복시메틸)글리실글리시네이트로 대체하고, 6-아미노-N-(2-α-L-푸코피라노실)에틸)헥산아미드를 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1064.25 [M+1]; Rt = 2.65 min.
실시예 31
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)아세트아미드 (ML-31)의 합성이 기재된다.
Figure pct00290
단계 A: 벤질 {2-[(4,6-O-벤질리덴-β-D-글루코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트
AcCN (150 mL) 중 벤질 [2-(β-D-글루코피라노실옥시)에틸]카르바메이트 (10 g, 28.0 mmol, Beilstein J. Org. Chem. 2010, 6, 699)의 용액에 벤즈알데히드 디메틸 아세탈 (5 mL, 31.6 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 1수화물 (60 mg, 0.315 mmol)을 첨가하였다. 24 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 0-20% CH3OH/CH2Cl2로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C23H27NO8에 대한 계산치 445.17, 관찰치 m/e: 446.06 [M+1]; Rt = 3.21 min. 1H NMR (CDCl3) δ 7.50-7.45 (2H, m), 7.35-7.25 (8H, m), 5.50 (1H, s), 5.10 (2H, s), 4.40-4.36 (1H, m), 4.31-4.26 (1H, m), 3.95-3.85 (1H, m), 3.80-3.70 (2H, m), 3.55-3.40 (4 H, m), 3.40-3.30 (2H, m).
단계 B: 벤질 {2-[(2-O-벤조일-4,6-O-벤질리덴-β-D-글루코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트
톨루엔 (50 mL) 중 벤질 {2-[(4,6-O-벤질리덴-β-D-글루코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트 (4.5 g, 10.10 mmol) 및 디부틸스탄나논 (3 g, 12.05 mmol)의 교반 혼합물을 5hr 동안 환류시켰다. 생성된 혼합물을 rt로 냉각시키고, 벤조일 클로라이드 (1.3 mL, 11.19 mmol)로 처리하였다. rt에서 1hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 (330 g, 0-10% 아세톤/CH2Cl2로 용리함) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C30H31NO9에 대한 계산치 549.20, 관찰치 m/e: 572.09 [M+Na]; Rt = 3.94 min. 1H NMR (CDCl3) δ 8.05-8.00 (2H, m), 7.55-7.45 (3H, m), 7.40-7.25 (10H, m), 5.55 (1H, s), 5.18-5.12 (1H, m), 5.04-5.00 (1H, m), 4.93-4.89 (1H, m), 4.66-4.63 (1H, m), 4.38-4.32 (1H, m), 4.05-4.00 (1H, m), 3.90-3.85 (1H, m), 3.82-3.77 (1H, m), 3.70-3.60 (2H, m), 3.55-3.45 (1H, m), 3.40-3.25 (2H, m). 위치화학은 1H-1H 2D COSY 실험에 의해 확인하였다.
단계 C: 벤질 {2-[(2-O-벤조일-4-O-벤질-β-D-글루코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트
벤질 {2-[(2-O-벤조일-4,6-O-벤질리덴-β-D-글루코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트 (2.58 g, 4.69 mmol) 및 보란 테트라히드로푸란 착물 (40 mL, 40.0 mmol, THF 중 1.0 M)의 용액에 0℃에서 디부틸(((트리플루오로메틸)술포닐)옥시)보란 (6 mL, 6.00 mmol, CH2Cl2 중 1.0 M)의 용액을 적가하였다. 0℃에서 2hr 동안 교반한 후에, TEA (0.5 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 H2의 발생이 멈출 때까지 CH3OH를 조심스럽게 첨가하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc: 35/65, Rf = 0.5. 1H NMR (CDCl3) δ 8.05-8.00 (2H, m), 7.55-7.25 (13H, m), 5.05-4.98 (3H, m), 4.86-4.82 (1H, m), 4.78-4.74 (1H, m), 4.60-4.58 (1H, m), 3.95-3.90 (2H, m), 3.85-3.80 (1H, m), 3.75-3.65 (2H, m), 3.61-3.58 (1H, m), 3.45-3.40 (1H, m), 3.35-3.30 (2H, m). 위치화학은 1H-1H COSY 및 1H-13C 1-결합 상관관계 (HSQC) 2D NMR 실험에 의해 확인하였다.
단계 D: 벤질 (2-{[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2-O-벤조일-4-O-벤질-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)카르바메이트
CH2Cl2 (40 mL) 중 벤질 {2-[(2-O-벤조일-4-O-벤질-β-D-글루코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트 (1.47 g, 2.67 mmol), 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-D-만노피라노실 트리클로로아세트이미데이트 (4.15 g, 5.60 mmol, Organic Letters, 2003, 5, 4041) 및 4Å 분자체의 혼합물에 -30℃에서 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (0.25 mL, 1.384 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 rt까지 단계적으로 가온시켰다. 6hr 동안 교반한 후에, 반응물을 TEA (0.4 mL, 2.87 mmol)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 0-75% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc 3/2, Rf = 0.5. 1H NMR (CDCl3) δ 8.20-7.95 (8H, m), 7.85-7.75 (8H, m), 7.65-7.60 (3H, m), 7.55-7.40 (8H, m), 7.38-7.18 (24H, m), 7.15-7.05 (4H, m), 6.00-5.95 (1H, m), 5.88-5.85 (1H, m), 5.75-5.65 (3H, m), 5.48-5.46 (1H, m), 5.35-5.25 (2H, m), 5.22-5.20 (1H, m), 5.07-5.05 (1H, m), 4.95-4.85 (2H, m), 4.78-4.75 (1H, m), 4.70-4.60 (1H, m), 4.60-4.55 (2H, m), 4.40-4.30 (2H, m), 4.27-4.23 (1H, m), 4.20-4.10 (2H, m), 3.95-3.90 (1H, m), 3.80-3.75 (1H, m), 3.75-3.70 (3H, m), 3.60-3.55 (1H, m), 3.51-3.48 (1H, m), 3.40-3.25 (2H, m).
단계 E: 벤질 (2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)카르바메이트
CH3OH (30 mL) 중 벤질 (2-{[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2-O-벤조일-4-O-벤질-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)카르바메이트 (3.39 g, 1.984 mmol)의 용액에 NaOCH3 (0.4 mL, 0.2 mmol, CH3OH 중 0.5 M)을 첨가하였다. rt에서 24 hr 동안 교반한 후에, 앰버라이트 IR 120 (H) 이온 교환 수지 (CH3OH 3x30 mL로 사전-세척)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 추가의 15 min 동안 교반하였다. 수지를 여과-제거하고, CH3OH (3x5 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C35H49NO18에 대한 계산치 771.29, 관찰치 m/e: 772.42 [M+1]; Rt = 2.51 min.
단계 F: 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드
물 (20 mL) 중 벤질 (2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)카르바메이트 (0.96 g, 1.244 mmol) 및 Pd/C (124 mmol)의 혼합물을 H2의 풍선 하에 rt에서 16 h 동안 교반하였다. 촉매를 여과-제거하고, H2O (3x10 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C20H37NO16에 대한 계산치 547.21, 관찰치 m/e: 548.29 [M+1]; Rt = 0.87 min. 1H NMR (D2O) δ 5.20-5.19 (1H, m), 4.88-4.87 (1H, m), 4.51-4.49 (1H, m), 4.05 (1H, m), 4.00-3.90 (4H, m), 3.85-3.70 (9H, m), 3.70-3.60 (5H, m), 3.40-3.30 (1H, m), 3.05-3.00 (2H, m).
단계 G: 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)아세트아미드
2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드로 대체한 ML-29에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C44H71N5O29에 대한 계산치 1133.42, 관찰치 m/e: 1134.34 [M+1]; Rt = 2.17 min.
실시예 32
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)아세트아미드 (ML-32)의 합성이 기재된다.
Figure pct00291
단계 A: 2-클로로에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-D-글루코피라노시드
CH2Cl2 (50 mL) 중 2-클로로에탄올 (1.0 mL, 14.92 mmol), 3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-D-글루코피라노실 트리클로로아세트이미데이트 (1.4 g, 3.09 mmol, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 8724) 및 4Å 분자체의 용액에 -30℃에서 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (0.25 mL, 1.384 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 rt까지 단계적으로 가온시켰다. 2hr 동안 교반한 후에, 반응물을 TEA (0.13 mL, 0.933 mmol)로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 0-60% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (80 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 이 아노머 혼합물을 다음 단계에 추가 정제하지 않고 직접 사용하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc: 3/1, Rf = 0.35.
단계 B: 2-클로로에틸 2-데옥시-2-플루오로-D-글루코피라노시드
CH3OH (10 mL) 중 2-클로로에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-D-글루코피라노시드 (0.85 g, 2.293mmol)의 용액에 NaOCH3 (0.46 mL, 0.230mmol, CH3OH 중 0.5 M)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 rt에서 2hr 동안 교반하였다. 다우엑스 50wx2-200 (H) 이온 교환 수지 (CH3OH 3x 10 mL로 사전-세척)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 15 min 동안 교반한 후에, 수지를 여과-제거하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 이 아노머 혼합물을 다음 단계에 추가 정제하지 않고 직접 사용하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc: 1/1, Rf = 0.2.
단계 C: 2-클로로에틸 4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드
AcCN (10 mL) 중 2-클로로에틸 2-데옥시-2-플루오로-D-글루코피라노시드 (0.55 g, 2.248 mmol)의 용액에 벤즈알데히드 디메틸 아세탈 (540 μL, 3.6 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 1수화물 (6 mg, 0.032 mmol)을 첨가하였다. 3 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 0-60% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (80 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 7.50-7.47 (2 H, m), 7.35-7.32 (3 H, m), 5.58 (1 H, s), 4.76-4.72 (1 H, m), 4.32-4.28 (1 H, m), 4.16-4.02 (2 H, m), 3.95-3.85 (2 H, m), 3.80-3.74 (1 H, m), 3.70-3.66 (2 H, m), 3.52-3.48 (2 H, m). β 아노머 입체화학은 1H-13C 1-결합 상관관계 (HSQC) 및 1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR 실험에 의해 확인하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc: 7/3, Rf = 0.5.
단계 D: 2-클로로에틸 4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드
보란 테트라히드로푸란 착물 (9 mL, 9.0 mmol, THF 중 1.0 M) 중 2-클로로에틸 4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드 (422 mg, 1.268 mmol)의 용액에 0℃에서 디부틸 {[(트리플루오로메틸)술포닐]옥시}보란 (1.27 mL, 1.270 mmol, CH2Cl2 중 1.0 M)의 용액을 적가하였다. 0℃에서 2h 동안 교반한 후에, TEA (0.5 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고 이어서 H2의 발생이 멈출 때까지 CH3OH을 조심스럽게 첨가하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-60% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (40 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc: 1/1, Rf = 0.6. 1H NMR (CDCl3) δ 7.38-7.28 (5 H, m), 4.84-4.71 (2H, m), 4.56-4.53 (1H, m), 4.22-4.04 (2H, m), 3.93-3.83 (3 H, m), 3.77-3.71 (1 H, m), 3.67-3.63 (2H, m), 3.55-3.50 (1H, m), 3.40-3.37 (1 H, m). 위치화학은 1H-13C 1-결합 상관관계 (HSQC); 1H-13C 다중-결합 상관관계 (HMQC); 및 1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR 실험에 의해 확인하였다.
단계 E: 2-아지도에틸 4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드
DMF (45 mL) 중 2-클로로에틸 4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드 (1.53 g, 4.57 mmol)의 용액에 rt에서 아지드화나트륨 (360 mg, 5.54 mmol)을 첨가하였다. 70℃에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 rt로 냉각시키고, 빙수 (200 mL) 상에 붓고, CH2Cl2 (3x100 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수 (2x100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (120 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc: 1/1, Rf = 0.55. 1H NMR (CDCl3) δ 7.37-7.28 (5 H, m), 4.84-4.71 (2H, m), 4.55-4.52 (1 H, m), 4.22-4.07 (1H, m), 4.03-3.98 (1H, m), 3.94-3.86 (2H, m), 3.79-3.71 (2H, m), 3.56-3.51 (1H, m), 3.48-3.36 (3H, m).
단계 F: 2-아지도에틸 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드
CH2Cl2 (60 mL) 중 2-아지도에틸 4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드 (1.23 g, 3.6 mmol), 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-D-만노피라노실 트리클로로아세트이미데이트 (5.35 g, 7.22 mmol, Organic Letters, 2003, 5, 4041), 및 4Å 분자체의 용액에 -30℃에서 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (0.25 mL, 1.384 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 rt까지 단계적으로 가온시켰다. 6h 동안 교반한 후에, 반응물을 TEA (0.4 mL, 2.87 mmol)로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 0-75% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.20-7.70 (16 H, m), 7.60-7.05 (29H, m), 6.14-5.98 (2H, m), 5.90-5.80 (2H, m), 5.79-5.77 (1H, m), 5.66-5.64 (1H, m), 5.42-5.41 (1H, m), 5.23-5.22 (1H, m), 5.03-5.02 (1H, m), 4.91-4.89 (1 H, m), 4.70-4.60 (3H, m), 4.57-4.55 (1H, m), 4.50-4.48 (1H, m), 4.40-4.22 (3H, m), 4.10-4.00 (2H, m), 3.80-3.70 (3H, m), 3.55-3.45 (2H, m), 3.44-3.38 (1H, m), 3.36-3.30 (1H, m).
단계 G: 2-아지도에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드
CH3OH (40 mL) 중 2-아지도에틸 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드 (5.0 g, 3.34 mmol)의 용액에 NaOCH3 (1.0 mL, 0.5 mmol, CH3OH 중 0.5 M)을 첨가하였다. rt에서 24 hr 동안 교반한 후에, 앰버라이트 IR 120 (H) 이온 교환 수지 (CH3OH 3x30 mL로 사전-세척)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 15 min 후에, 수지를 여과-제거하고, CH3OH (3x5 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (50 mL)에 녹이고, 2 hr 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, EtOAc (3x15 mL)로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C27H40FN3O15에 대한 계산치 665.24, 관찰치 m/e: 666.35 [M+1]; Rt = 2.03 min.
단계 H: 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드
물 (30 mL) 중 2-아지도에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드 (1.77 g, 2.66 mmol) 및 Pd/C (0.133 mmol)의 혼합물을 H2의 풍선 하에 rt에서 16 h 동안 교반하였다. 촉매를 여과-제거하고, H2O (3x10 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C20H36FNO15에 대한 계산치 549.21, 관찰치 m/e: 550.29 [M+1]; Rt = 0.86 min. 1H NMR (D2O) δ 5.16-5.14 (1H, m), 4.88-4.86 (1H, m), 4.80-4.76 (1H, m), 4.30-4.16 (1H, m), 4.06-4.03 (1H, m), 3.98-3.88 (4H, m), 3.86-3.72 (9H, m), 3.70-3.62 (5H, m), 2.94-2.88 (2H, m).
단계 I: 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)아세트아미드
2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-4-O-벤질-2-데옥시-2-플루오로-β-D-글루코피라노시드로 대체한 ML-29에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C44H71N5O29에 대한 계산치 1133.42, 관찰치 m/e: 1134.34 [M+1]; Rt = 2.17 min.
실시예 33
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸][2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-[2-(β-D-글루코피라노실옥시)에틸]아세트아미드 (ML-33)의 합성이 기재된다.
Figure pct00292
각각 단계 C에서의 6-아미노-N-(2-α-L-푸코피라노실)에틸)헥산아미드를 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드로 대체하고, 단계 D에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-글루코피라노시드로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 796.38 [M+1]; Rt = 1.87 min.
실시예 34
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N,N-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥산아미드 (ML-34)의 합성이 기재된다.
Figure pct00293
단계 A: 프로프-2-엔-1-일 2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노시드
CH2Cl2 (300 mL) 중 1,2,3,4-테트라-O-벤조일-L-푸코피라노시드 (70.34 g, 121 mmol, Organic Letters 2007, 9, 1227-30)의 교반된 용액에 0℃에서 알릴 알콜 (12.36 mL, 182 mmol)을 첨가한 후에 삼플루오린화붕소 디에틸 에테르에이트 (44.9 mL, 363 mmol)를 1 hr에 걸쳐 내부 온도를 20℃ 미만으로 유지하면서 적가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 여기에 sat. NaHCO3 (600 mL, 121 mmol)을 천천히 첨가하였다. 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 CH2Cl2 (2x400 mL)로 추출하였다. 유기 상을 물 (200 mL), sat. NaHCO3 (3x100 mL), 및 염수 (200 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 잔류물을 5개의 동등한 부분으로 나누고, 이들을 개별적으로 0-60% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. (α 이성질체 Rf = 0.63 30:70 EtOAc:헥산). 1H NMR (CDCl3) δ 1.32 (3H, t, J = 6.77), 2.09 (1H, s), 4.15-4.14 (1H, m), 4.33-4.31 (1H, m), 4.51-4.49 (1H, m), 5.22 (1H, d, J = 10.52), 5.39-5.38 (2H, m), 5.73 (1H, dd, J = 10.74, 3.67), 5.82 (1H, d, J = 3.30), 5.92-5.91 (1H, m), 6.04 (1H, dd, J = 10.75, 3.43), 7.44 (3H, dt, J = 22.64, 7.61), 7.48-7.57 (5H, m), 7.65 (1H, d, J = 7.49), 7.84 (2H, d, J = 7.84), 8.04 (2H, d, J = 7.84), 8.15 (2H, d, J = 7.79).
단계 B: 2-옥소에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노시드
아세톤 (94 mL) 및 물 (23.5 mL) 중 프로프-2-엔-1-일 2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노시드 (6.06 g, 11.73 mmol)의 용액에 4-메틸모르폴린 4-옥시드 (2.75 g, 23.46 mmol)를 첨가하고, 이어서 물 중 2.5% OsO4 (5.97 g, 0.587mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 16 hr 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 혼합물에 물 (100 mL) 중 NaIO4 (5.40 g, 23.46 mmol)의 용액을 첨가하였다. 추가의 6 hr 동안 교반한 후에, 침전물을 여과하고, 아세톤 (200 mL)으로 세척하였다. 여과물의 부피를 처음 부피의 대략 1/3로 감소시킨 후에, EtOAc (200 mL)로 추출하였다. 유기 상을 분리하고, sat. NaHCO3 (200 mL)으로 세척하였다. 수성 상을 EtOAc (3x100 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (220 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.33-1.29 (3H, m), 3.27 (1H, s), 3.41 (1H, s), 4.35-4.31 (1H, m), 5.51-5.45 (1H, m), 5.75-5.69 (1H, m), 5.81 (1H, dd, J = 13.91, 3.57), 6.05-5.98 (1H, m), 7.42 (2H, d, J = 7.76), 7.53 (5H, d, J = 8.61), 7.67-7.63 (2H, m), 7.84-7.81 (2H, m), 8.01 (2H, t, J = 8.82), 8.14-8.12 (2H, m), 9.77-9.77 (1H, m).
단계 C: 벤질 {2-[(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트
AcCN (100 mL) 중 1,2,3,4-테트라-O-아세틸-L-푸코피라노스 (200 g, 601.86 mmol), 및 벤질 (2-히드록시에틸)카르바메이트 (140.96 g, 722.08 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 BF3ㆍEt2O (427.7 g, 3.01 mol)를 2 hr에 걸쳐 적가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 이어서 Et3N (130 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 CH2Cl2 (2.0 L)에 용해시키고, 이후에 sat. NaHCO3 (2x500 mL), 물 (2x500 mL) 및 염수 (500 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc/석유 에테르 (1:3)로 용리하는 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.33-7.37(5H,m), 5.12-5.32(5H,m), 4.99-5.04(1H,m), 4.42-4.45 (1H, d), 3.87-3.94 (1H, m), 3.78-3.84 (1H, m), 3.66-3.70(1H, m), 3.42-3.44 (2H, m), 2.19 (3H, s), 2.05-2.12(6H, m), 1.25-1.30 (3H, d).
단계 D: 2-아미노에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드
물 (10 mL) 중 벤질 {2-[(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트 (1.0 g, 2.139 mmol)의 용액에 Pd/C (68 mg, 0.642 mmol)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 탈기시키고, H2의 풍선 하에 rt에서 교반하였다. 1 hr 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 동결건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 334.1563 [M+1]; Rt = 1.43 min.
단계 E: 2-(벤질아미노)에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드
CH2Cl2 (100 mL) 중 2-아미노에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드 (8.56 g, 25.7 mmol)의 용액에 벤즈알데히드 (2.197 ml, 21.67 mmol), 아세트산 (372 μL, 6.50 mmol) 및 NaCNBH3 (3.40 g, 54.2 mmol)을 첨가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (50 mL) 및 sat. NaHCO3 (50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, sat'd NaHCO3 (2x100 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (130 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 424.2089 [M+1]; Rt =3.42 min.
단계 F: 2-(벤질{2-[(2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드
CH2Cl2 (50 mL) 중 2-(벤질아미노)에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드 (1.021 g, 2.411 mmol)의 용액에 2-옥소에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노시드 (1.25 g, 2.411 mmol), 아세트산 (41 μL, 0.723 mmol) 및 NaCNBH3 (227 mg, 3.62 mmol)을 첨가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (50 mL) 및 sat'd NaHCO3 (50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 포화 NaHCO3 (2 x 100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 (120g, 0-100 EtOAc/헥산으로 용리) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 합하여 농축시켰다. 잔류물을 추가로 0-100% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (130 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: me/e = 926.3234 [M+1]; Rt = 1.947min. 1H NMR (CDCl3) δ 1.12 (3H, d, J = 6.54), 1.27 (3H, d, J = 6.57), 2.00 (6H, d, J = 5.40), 2.20 (3H, s), 2.78 (2H, q, J = 5.85), 2.85 (2H, t, J = 5.72), 3.48-3.46 (1H, m), 3.77-3.59 (4H, m), 3.87-3.85 (1H, m), 4.09 (1H, d, J = 6.63), 4.39 (1H, d, J = 6.71), 5.02 (1H, d, J = 3.71), 5.14 (1H, dd, J = 10.82, 3.68), 5.30 (1H, d, J = 3.36), 5.37-5.34 (2H, m), 5.65 (1H, dd, J = 10.72, 3.66), 5.77 (1H, d, J = 3.49), 5.98 (1H, dd, J = 10.70, 3.47), 7.29 (6H, s), 7.36 (3H, t, J = 7.74), 7.45 (1H, t, J = 7.59), 7.52 (3H, t, J = 7.73), 7.64 (1H, t, J = 7.46), 7.81 (2H, dd, J = 8.00, 1.41), 7.97 (2H, dd, J = 8.07, 1.40), 8.14-8.12 (2H, m).
단계 G: 2-(벤질{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸 6-α-L-푸코피라노시드
CH3OH (10 mL) 중 2-(벤질{2-[(2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드 (432.9 mg, 0.468 mmol)의 용액에 NaOCH3 (0.087 μL, 0.468 mmol, 1.0 M)을 첨가하였다. 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 488.2324 [M+1]; Rt = 2.106 min.
단계 H: 2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드
물 (10 mL) 중 2-(벤질{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸 6-α-L-푸코피라노시드 (220 mg, 0.451 mmol)의 용액에 Pd/C (14.41 mg, 0.135 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 탈기시키고, H2의 풍선 하에 교반하였다. 1hr 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 동결건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법: m/e = 398.2161 [M+1]; Rt = 1.119 min. 1H NMR (CD3OD) δ 1.24 (6H, d, J = 6.58), 2.91-2.89 (4H, m), 3.56 (2H, ddd, J = 10.66, 6.64, 4.66), 3.70-3.69 (2H, m), 3.80-3.75 (4H, m), 3.86 (2H, dt, J = 10.61, 4.53), 3.98 (2H, q, J = 6.63), 4.80 (2H, d, J = 3.45).
단계 I: 벤질 6-(비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트
DMF (5 mL) 중 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산 (40 mg, 0.169 mmol), EDC (114 mg, 0.593 mmol) 및 HOBt (2.59 mg, 0.017 mmol)의 용액에 rt에서 2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드 (190 mg, 0.478 mmol)를 첨가하였다. 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 5-40% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (50 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 616.2923 [M+1]; Rt = 3.114 min. 1H NMR (CD3OD) δ 1.24 (6H, d, J = 6.58), 1.72-1.64 (4H, m), 2.45 (2H, t, J = 7.11), 2.53 (2H, t, J = 7.32), 3.91-3.55 (17H, m), 4.78-4.75 (2H, m), 5.14 (2H, s), 7.38-7.37 (5H, m).
단계 J: N,N-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥산아미드
단계 C에서의 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트를 벤질 6-(비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 623.2853 [M+1]; Rt = 2.155 min.
실시예 35
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드 (ML-35)의 합성이 기재된다.
Figure pct00294
단계 A: 벤질 6-(비스{2-[(2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)헥사노에이트
CH2Cl2 (50 mL) 중 2-옥소에틸 2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노시드 (1.25 g, 2.411 mmol)의 용액에 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산-1-아미늄 4-메틸벤젠술포네이트, 아세트산 (17 μL, 0.300 mmol) 및 NaCNBH3 (189 mg, 3.00 mmol)을 첨가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (50 mL) 및 sat'd NaHCO3 (50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, sat'd NaHCO3 (2x100 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (120g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 합하여 농축시켰다. 잔류물을 추가로 0-100% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (50 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1226.4591 [M+1]; Rt = 3.310 min. 1H NMR (CDCl3) δ 1.29 (5H, d, J = 6.62), 2.36-2.31 (2H, m), 2.75 (3H, d, J = 23.31), 3.53 (2H, d, J = 9.26), 3.78-3.76 (1H, m), 4.45 (1H, d, J = 6.66), 5.13 (2H, s), 5.35 (1H, d, J = 3.64), 5.64 (2H, dd, J = 10.69, 3.63), 5.79 (2H, d, J = 3.48), 5.98 (1H, dd, J = 10.71, 3.44), 7.26 (4H, t, J = 7.64), 7.56-7.40 (14H, m), 7.64 (2H, t, J = 7.72), 7.82-7.80 (5H, m), 7.99-7.97 (5H, m), 8.19-8.12 (5H, m).
단계 B: 메틸 6-(비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)헥사노에이트
단계 G에서 2-(벤질{2-[(2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드를 벤질 6-(비스{2-[(2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)헥사노에이트로 대체한 ML-34에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 526.2852 [M+1]; Rt = 2.112 min.
단계 C: 6-(비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)헥산산
물 (10 mL) 중 메틸 6-(비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)헥사노에이트 (45 mg, 0.086 mmol)의 용액에 NaOH (0.086 μL, 0.086 mmol, 1.0 M)를 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 0.01 M HCl로 중화시키고, 생성된 용액을 동결건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 512.2866 [M+1]; Rt = 1.709 min.
단계 D: 2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드
6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥산산을 6-(비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)헥산산으로 대체한 ML-1, 단계 D에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 609.2808 [M+1]; Rt = 2.088 min.
실시예 36
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-L-푸코피라노실)프로필]아미노)에틸 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (ML-36)의 합성이 기재된다.
Figure pct00295
단계 A: 3-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)-1-프로펜
AcCN (60 mL) 중 1,2,3,4-테트라-O-아세틸-α-L-푸코피라노스 (12 g, 36.1 mmol) 및 알릴트리메틸 실란 (11.48 mL, 72.2 mmol)의 용액에 0℃에서 TMS-OTf (3.52 mL, 19.50 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 18 hr 동안 교반한 후에, rt에서 6 hr 동안 교반하였다. 생성된 적색 용액을 CH2Cl2 (250 mL)로 희석하고, sat'd NaHCO3 (150 mL)을 조심스럽게 첨가하였다. 수성 층을 분리하고, CH2Cl2 (2x50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 15 % EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (220 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.16 (d, J = 6.4, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 2.34 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 4.29 (dt, J = 10.4, 7.3, 1H), 5.13 (m, 2H), 5.23 (dd, J = 10.0, 3.4, 1H), 5.30 (dd, J = 3.4, 1.9, 1H), 5.35 (dd, J = 10.0, 5.6, 1H), 5.77 (m, 1H).
단계 B: 3-(α-L-푸코피라노실)-1-프로펜
CH3OH (50 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)-1-프로펜 (10.65 g, 33.9 mmol)의 교반된 용액에 NaOCH3 (183 mg, 3.4 mmol)을 첨가하였다. rt에서 2 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 앰버라이트 IR120 (메탄올 3x25 mL로 사전-세척)으로 중화시켰다. 수지를 여과-제거하고, 여과물을 농축시켜 백색 고체를 수득하였으며, 이를 EtOAc (~200 mL)로부터 재결정화시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.22 (d, J = 6.5, 3H), 2.41 (m, 1H), 2.47 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.85 (qd, J = 6.5, 2.0, 1H), 3.90 (dd, J = 8.9, 5.5, 1H), 3.99 (m, 1H), 5.07 (m, 1H), 5.15 (dq, J = 17.2, 1.7, 1H), 5.85 (m, 1H).
단계 C: 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)-1-프로펜
DMF (120 mL) 중 NaH (3.91 g, 오일 중 60% 분산액, 98 mmol)의 교반된 현탁액에 rt에서 3-(α-L-푸코피라노실)-1-프로펜 (4.6 g, 24.44 mmol)을 나누어 첨가하였다. 2 hr 후에, 생성된 혼합물에 테트라부틸 아이오딘화암모늄 (451 mg, 1.22 mmol)을 첨가하고, 이어서 벤질 브로마이드 (13.1 mL, 110 mml)를 천천히 첨가하였다. rt에서 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물 (300 mL) 및 Et2O (150 mL) 사이에 분배하였다. 수성 층을 Et2O (3x150 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-40% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (220 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.34 (d, J = 6.6, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.42 (m, 1H), 3.82 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 4.58 (d, J = 11.8, 1H), 4.64 (d, J = 11.8, 2H), 4.69 (d, J = 12.0, 1H), 4.76 (dd, J = 12.0, 8.9, 2H), 5.05, 5.07 및 5.11 (m, 2H), 5.80 (m, 1H), 7.30-7.40 (m, 15H).
단계 D: 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로판올
THF (100 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)-1-프로펜 (10.4 g, 22.68 mmol)의 용액에 0℃에서 9-BBN (58.5 mL, 29.3 mmol, THF 중 0.5 M)을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 rt까지 가온시키고, 이어서 3hr 동안 환류시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 rt로 냉각시키고, 에탄올 (4.4 mL, 75 mmol)에 이어 NaOH (11.51 ml, 46 mmol, 물 중 4.0 M)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 35% 과산화수소 (10 mL, 115 mmol)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 rt에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 염수 (125 mL) 및 에테르 (200 mL)로 희석하였다. 유기 층을 염수 (2x125 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-100% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.33 (d, J = 6.6, 3H), 1.67 (m, 3H), 1.70 (m, 1H), 3.65 (m, 2H), 3.80 (m, 3H), 3.98 (m, 1H), 4.02 (m, 1H), 4.56 (d, J = 11.8, 1H), 4.63 (t, J = 12.2, 2H), 4.69 (d, J = 12.0, 1H), 4.78 (dd, J = 12.1, 2.1, 2H), 7.27-7.40 (m, 15H).
단계 E: 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로판알
CH2Cl2 (100 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로판올 (8.4 g, 17.62 mmol)의 용액에 0℃에서 데스-마르틴 퍼아이오디난 (11.21 g, 26.4 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 1 hr 동안 교반한 후에 rt에서 2 hr 동안 교반하였다. TLC가 일부 출발 알콜이 여전히 존재함을 나타내어, 추가의 데스-마르틴 퍼아이오디난 (5 g, 11.8 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 rt에서 추가의 2 hr 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 sat'd NaHCO3 (3x150 mL), 염수 (50 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 0-80% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (220 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.26 (d, J = 6.6, 3H), 1.82 (m, 1H), 2.06 (m, 1H), 2.40-2.58 (m, 2H), 3.80 (m, 2H), 3.84 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.99 (dt, J = 10.9, 3.8, 1H), 4.55 (d, J = 11.8, 1H), 4.65 (d, J = 11.8, 1H), 4.70 (t, J = 12.0, 2H), 4.79 (dd, J = 12.0, 9.2, 2H), 7.28-7.40 (m, 15H).
단계 F: 2-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필]아미노}에틸 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드
CH2Cl2 (15 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로판알 (800 mg, 1.69 mmol) 및 2-아미노에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (987 mg, 2.53 mmol)의 혼합물에 아세트산 (29 μL, 0.506 mmol) 및 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (893 mg, 4.21 mmol)를 첨가하였다. rt에서 밤새 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (70 mL)에 녹이고, sat'd NaHCO3 (2x100 mL), 염수 (30 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 CH3OH (8 mL)에 녹이고, 여기에 NaOCH3 (27 mg, 0.506 mmol)을 첨가하였다. rt에서 2 hr 동안 교반한 후에, 생성된 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 5-100% AcCN/물로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (120 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.30 (d, J = 6.6, 3H), 1.50 (m, 1H), 1.60 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 2.02 (s, 3H), 2.64 (m, 2H), 2.81 (m, 2H), 3.39 (m, 1H), 3.57 (m, 2H), 3.69 (m, 1H), 3.78-3.85 (m, 4H), 3.92 (m, 2H), 4.00 (m, 2H), 4.45 (d, J = 7.7, 1H), 4.52 (d, J = 11.9, 1H), 4.62 (d, J = 11.8, 1H), 4.68 (d, J = 12.1, 1H), 4.79 (d, J = 12.0, 2H), 7.28-7.38 (m, 15H), 7.65 (s, 1H); [M+H/e]+=723.3925.
단계 G: 벤질 6-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필](2-{[2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)아미노}헥사노에이트
CH2Cl2 (8 mL) 중 벤질 6-옥소헥사노에이트 (170 mg, 0.77 mmol) 및 2-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질옥시-α-L-푸코피라노실)프로필]아미노}에틸 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (558 mg, 0.77 mmol)의 혼합물에 아세트산 (13 μL, 0.232 mmol) 및 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (327 mg, 1.54 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 추가의 벤질 6-옥소헥사노에이트 (170 mg, 0.77 mmol)를 첨가하고, 밤새 계속 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 EtOAc (40 mL) 및 sat'd NaHCO3 (60 mL) 사이에 분배하고; 유기 층을 염수 (30 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 5-20% MeOH/CH2Cl2로 용리하는 실리카 겔 (40g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 1.27-1.38 (m, 5H), 1.48 (m, 1H), 1.62-1.75 (m, 4H), 1.80 (m, 1H), 2.09 (s, 3H); 2.37 (t, J = 7.3, 2H), 2.90-3.02 (m, 4H), 3.04 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.59 (t, J = 8.9, 1H), 3.65-3.75 (m, 3H), 3.78 (d, J = 4.9, 2H), 3.86 (m, 1H), 3.87-4.05 (m, 4H), 4.15 (d, J = 11.2, 1H), 4.49 (d, J = 11.9, 1H), 4.62 (d, J = 11.8, 1H), 4.66 (d, J = 11.7, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.74 (d, J = 11.8, 1H), 4.78 (d, J = 12.0, 1H), 5.12 (s, 2H), 7.25-7.38 (m, 15H), 8.36 (s, 1H); UPLC-MS [M+H/e]+=927.5049.
단계 H: 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-L-푸코피라노실)프로필]아미노)에틸 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드
단계 C에서의 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노-6-옥소헥사노에이트"를 벤질 6-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필](2-{[2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)아미노}헥사노에이트로 대체한 실시예 1, ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 664.3474 [M+1]; Rt = 1.08 min
실시예 37
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-L-푸코피라노실)프로필]아미노)에틸 β-D-글루코피라노시드 (ML-37)의 합성이 기재된다.
Figure pct00296
단계 F에서의 2-아미노에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드를 2-아미노에틸 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노시드로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 623.3277 [M+1]; Rt = 1.11 min.
실시예 38
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-L-푸코피라노실)프로필]아미노)에틸 α-D-글루코피라노시드 (ML-38)의 합성이 기재된다.
Figure pct00297
단계 F에서의 2-아미노에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드를 2-아미노에틸 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-글루코피라노시드로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 623.3336 [M+1]; Rt = 1.11 min.
실시예 39
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[3-(α-L-푸코피라노실)프로필][2-(α-D-글루코피라노실)프로필]아미노}헥사노에이트 (ML-39)의 합성이 기재된다.
Figure pct00298
단계 A: 메틸 2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노시드
DMF (150 mL) 중 NaH (오일 중 60% 분산액 5.19 g, 130 mmol)의 현탁액에 메틸-α-D-글루코피라노시드 (4.2 g, 21.6 mmol)를 나누어 첨가하였다. 생성된 혼합물을 rt에서 2 hr 동안 교반하고, 여기서 테트라부틸 브로민화암모늄 (800 mg, 2.16 mmol)에 이어 벤질 브로마이드 (11.58 mL, 97 mmol)를 적가하였다. rt에서 밤새 교반한 후에, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물에 현탁시키고, 에테르 (3x150 mL)로 추출하였다. 합한 에테르 층을 염수 (200 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 0-30% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.44 (s, 3H), 3.62 (dd, J = 9.6, 3.5, 1H), 3.66-3.72 (m, 2H), 3.75-3.82 (m, 2H), 4.04 (t, J = 9.3, 1H), 4.51-4.55 (m, 2H), 4.66 (d, J = 12.1, 1H), 4.69 (d, J = 3.5, 1H), 4.72 (d, J = 12.1, 1H), 4.83-4.90 (m, 3H), 5.04 (d, J = 11.0, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.30-7.43 (m, 18H).
단계 B: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)-1-프로펜
단계 A에서의 1,2,3,4-테트라-O-아세틸-α-L-푸코피라노스를 메틸 2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노시드로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 2.48-2.60 (m, 2H), 3.64-3.70 (m, 3H), 3.76 (dd, J = 10.5, 3.2, 1H), 3.80-3.88 (m, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.52 (d, J = 10.5, 2H), 4.68 (d, J = 13.7, 2H), 4.74 (d, J = 11.6, 1H), 4.86 (dd, J = 10.6, 3.3, 2H), 4.98 (d, J = 11.0, 1H), 5.11-5.18 (m, 2H), 5.84-5.90 (m, 1H), 7.18 (m, 2H), 7.29-7.41 (m, 18H).
단계 C: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로판올
단계 D에서의 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)-1-프로펜을 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)-1-프로펜으로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.70 (m, 2H), 1.85 (m, 2H), 3.61 (m, 1H), 3.65 -3.76 (m, 2H), 3.76-3.86 (m, 2H), 4.91 (m, 1H), 4.52 (d, J = 10.8, 1H), 4.55 (d, J = 12.3, 1H), 4.65 (d, J = 12.1, 1H), 4.67 (d, J = 11.8, 1H), 4.75 (d, J = 11.7, 1H), 4.86 (d, J = 11.3, 2H), 4.98 (d, J = 11.0, 1H), 7.18 (m, 2H), 7.29-7.40 (m, 18H).
단계 D: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로필 메탄술포네이트
CH2Cl2 (30 mL) 중 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로판올 (3.35 g, 5.75 mmol)의 용액에 0℃에서 DIPEA (1.25 mL, 7.19 mmol)를 첨가한 후에, 메탄술포닐 클로라이드 (538 μL, 6.9 mmol)를 적가하였다. 0℃에서 1 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 물 (50 mL)에 부었다. 유기 층을 분리하고, sat'd NaHCO3 (50 mL), 염수 (30 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.76-1.90 (m, 3H), 1.90-1.99 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 3.58-3.66 (m, 2H), 3.68 -3.74 (m, 2H), 3.77-3.85 (m, 2H), 4.06 (m, 1H), 4.52 (d, J = 10.7, 1H), 4.54 (d, J = 12.1, 1H), 4.65 (d, J = 12.1, 1H), 4.66 (d, J = 11.6, 1H), 4.76 (d, J = 11.6, 1H), 4.85 (d, J = 10.9, 1H), 4.98 (d, J = 10.9, 1H), 7.18 (m, 2H), 7.30-7.40 (m, 18H).
단계 E: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로필 아지드
AcCN (50 mL) 중 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로필 메탄술포네이트 (3.78 g, 5.72 mmol)의 용액에 테트라부틸암모늄 아지드 (1.66 g, 5.83 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 환류시켰다. rt로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 에테르 (50 mL)에 용해시키고, 이를 물 (2x50 mL), 염수 (25 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 (120 g, 0-30% EtOAc/헥산으로 용리) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.58-1.68 (m, 2H), 1.74-1.86 (m, 2H), 3.32-3.41 (m, 2H), 3.58 -3.76 (m, 4H), 3.76-3.85 (m, 2H), 4.40 (m, 1H), 4.52 (t, J = 10.4, 2H), 4.65 (dd, J = 11.7, 2.5, 2H), 4.75 (d, J = 11.7, 1H), 4.86 (m, 2H), 4.97 (d, J = 10.8, 1H), 7.16 (m, 2H), 7.28-7.40 (m, 18H).
단계 F: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로필아민
CH3OH (100 mL) 중 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로필 아지드 (3 g, 4.94 mmol)의 질소 플러싱된 용액에 10% Pd/C (525 mg)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 H2의 풍선 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.48 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 2.23 (m, 1H), 2.30 (m, 2H), 3.66-3.76 (m, 5H), 4.00 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.38 (d, J = 10.0, 1H), 4.50 (d, J = 12.1, 1H), 4.61 (d, J = 11.7, 1H), 4.68 (d, J = 11.8, 1H), 4.70 (d, J = 12.0, 1H), 4.79 (d, J = 10.0, 1H), 4.86 (d, J = 11.2, 1H), 5.02 (d, J = 11.2, 1H), 7.00 (m, 2H), 7.25-7.40 (m, 18H), 8.06 (s, 2H).
단계 G: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[3-(α-L-푸코피라노실)프로필][2-(α-D-글루코피라노실)프로필]아미노}헥사노에이트
단계 F에서의 2-아미노에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드를 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로필아민으로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 621.3424 [M+1]; Rt = 1.08 min.
실시예 40
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[3-(α-L-푸코피라노실)프로필][2-(β-D-글루코피라노실)프로필]아미노}헥사노에이트 (ML-40)의 합성이 기재된다.
Figure pct00299
단계 A: 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-글루코피라노실 브로마이드
β-D-글루코스 펜타아세테이트 (5 g, 12.81 mmol)에 아세트산 중 33% HBr (30 mL, 192 mmol)을 rt에서 첨가하였다. 40 min 동안 교반한 후에, 혼합물을 CH2Cl2 (150 mL)로 희석하고, 세척물이 중성 pH가 될 때까지 빙냉수로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 2.06 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 4.15 (d, J = 11.1, 1H), 4.31-4.37 (m, 2H), 4.86 (dd, J = 9.9, 4.0, 1H), 5.19 (t, J = 9.8, 1H), 5.58 (t, J = 9.8, 1H), 6.63 (d, J = 4.0, 1H).
단계 B: 3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실)-1-프로펜
알릴 브로민화마그네슘의 용액 (100 mL, 100 mmol, 에테르 중 1.0 M)에 0℃에서 에테르 (60 mL) 중 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-글루코피라노실 브로마이드 (4.45 g, 10.82 mmol)를 1hr의 기간에 걸쳐 적가하였다. 첨가 완료 후에, 혼합물을 가온시키고, rt에서 밤새 교반하였다. 생성된 혼합물에 물 (200 mL)을 조심스럽게 첨가하고, 이어서 아세트산을 첨가하여 마그네슘 염을 용해시켰다. 유기 층을 분리하고, 농축시켰다. 잔류물을 아세트산 무수물 (70 mL, 740 mmol) 및 피리딘 (100 mL)으로 처리하였다. rt에서 밤새 교반한 후에, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (200 mL)에 녹이고, sat'd NaHCO3 (5x300 mL)으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 (120 g, 0-100% EtOAc/헥산으로 용리) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 2.00 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.26-2.37 (m, 2H), 3.51 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 4.10 (dd, J = 12.2, 2.2, 1H), 4.24 (dd, J = 12.2, 5.0, 1H), 4.93 (t, J = 9.4, 1H), 5.07 (m, 2H), 5.09 (s, 1H), 5.17 (t, J = 9.4, 1H), 5.83 (m, 1H).
단계 C: 3-(β-D-글루코피라노실)-1-프로펜
CH3OH (50 mL) 중 3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실)-1-프로펜 (4.15 g, 11.14 mmol)의 용액에 NaOCH3 (0.56 mL, 2.2 mmol, CH3OH 중 4.0 M)을 첨가하였다. rt에서 2 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 다우엑스 50W (산성 형태)를 사용하여 중화시켰다. 수지를 여과-제거하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ 2.09 (m, 1H), 2.49 (m, 1H), 2.88 (t, J = 8.9, 1H), 2.98-3.07 (m, 3H), 3.11 (m, 1H), 3.39 (dd, J = 11.4, 4.7, 1H), 3.60 (d, J = 11.6, 1H), 4.99 (dd, J = 10.3, 0.9, 1H), 5.06 (d, J = 17.2, 1H), 5.90 (m, 1H).
단계 D: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-β-D-글루코피라노실)-1-프로펜
단계 C에서 3-(α-L-푸코피라노실)-1-프로펜을 3-(β-D-글루코피라노실)-1-프로펜으로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 2.39 (m, 1H), 2.65 (m, 1H), 3.41 (m, 2H), 3.49 (m, 1H), 3.68 (t, J = 9.5, 1H), 3.72-3.82 (m, 3H), 4.72 (dd, J = 10.8, 2.1, 1H), 4.89 (d, J = 10.7, 1H), 4.94-500 (m, 3H), 5.16 (m, 2H), 6.03 (m, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.32-7.44 (m, 18H).
단계 E: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-β-D-글루코피라노실)-1-프로판올
단계 D에서 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)-1-프로펜을 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-β-D-글루코피라노실)-1-프로펜으로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.60 (m, 1H), 1.76 (m, 2H), 2.04 (m, 1H), 2.36 (t, J = 5.7, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.49 (m, 1H), 3.62-3.72 (m, 4H), 3.72-3.77 (m, 2H), 4.58 (d, J = 12.2, 1H), 4.60 (d, J = 10.7, 1H), 4.65 (d, J = 12.2, 1H), 4.70 (d, J = 10.8, 1H), 4.86 (d, J = 10.8, 1H), 4.95 (m, 3H), 7.21 (m, 2H), 7.31-7.41 (m, 18H).
단계 F: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[3-(α-L-푸코피라노실)프로필][2-(β-D-글루코피라노실)프로필]아미노}헥사노에이트
단계 D에서의 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로판올을 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-β-D-글루코피라노실)-1-프로판올로 대체한 ML-39에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 621.3412 [M+1]; Rt = 1.08 min.
실시예 41
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-D-만노피라노실)프로필]아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드 (ML-41)의 합성이 기재된다.
Figure pct00300
단계 A: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-만노피라노실)-1-프로펜
단계 B에서 메틸 2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노시드를 메틸 2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-만노피라노시드로 대체한 ML-39에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 α 및 β 아노머의 혼합물로서 제조하였다. 이들 아노머를 키랄 SFC 크로마토그래피 (칼럼: AD-H (50X250 cm), 30% IPA (0.1%DEA)/CO2로 용리, 100 bar, 200 mL/min, 220 nm; 주입 부피: 162mg/mL 4:1 v/v IPA/CH2Cl2의 농도에서 1.0 mL)에 의해 분리하여 주요 생성물을 α 아노머로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 2.38 (m, 2H), 3.68 (dd, J = 4.6, 3.2, 1H), 3.76 (dd, J = 10.4, 3.7, 1H), 3.83 (m, 2H), 3.90 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 4.55-4.62 (m, 4H), 4.62-4.65 (m, 3H), 4.75 (d, J = 11.3, 1H), 5.06 (d, J = 4.6, 1H), 5.08 (s, 1H), 5.80 (m, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.30-7.42 (m, 18H).
단계 B: 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-만노피라노실)-1-프로판올
단계 C에서 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)-1-프로펜을 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-만노피라노실)-1-프로펜으로 대체한 ML-39에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.85-2.00 (m, 2H), 2.53 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 3.62 (dd, J = 6.0, 2.4, 1H), 3.73 (dd, J = 10.2, 4.2, 1H), 3.78-3.87 (m, 3H), 3.90 (m, 1H), 3.98 (m, 1H), 4.54-4.62 (m, 7H), 4.67 (d, J = 11.5, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.28-7.40 (m, 18H), 9.79 (s, 1H).
단계 C: 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-D-만노피라노실)프로필]아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드
단계 E에서의 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로판올을 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-만노피라노실)-1-프로판올로 대체하고, 단계 F에서의 2-아미노에틸 (3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드)를 2-아미노에틸 (2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드)로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 623.3235 [M+1]; Rt = 1.13 min.
실시예 42
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-{[3-(α-L-푸코피라노실)프로필][2-(α-D-만노피라노실)프로필]아미노}헥사노에이트 (ML-42)의 합성이 기재된다.
Figure pct00301
단계 D에서의 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-글루코피라노실)프로판올을 3-(2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-만노피라노실)-1-프로판올로 대체한 ML-39에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 621.3358 [M+1]; Rt = 1.11 min.
실시예 43
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-({6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥실}아미노)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-알라니네이트 (ML-43)의 합성이 기재된다.
Figure pct00302
단계 A: 펜타플루오로페닐 6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트
DMF (7.7 mL) 중 6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥산산 (1.0 g, 1.465 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 PFTU (627 mg, 1.465 mmol)를 첨가하고, 5 min 후에 DIPEA (256 μL, 1.465 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 단계적으로 실온으로 가온시켰다. 16 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 300 mL의 EtOAc로 용리하여 비극성 혼합물을 세척해내고, 이어서 혼합 용매 (v/v EtOAc/H2O/MeOH/AcCN: 6/1/1/1), = 6:1:1:1)로 용리하는 실리카 겔 (40 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 생성물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 849.50 [M+1]; Rt = 1.94 min.
단계 B: 3-아미노-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닌 히드로클로라이드
CH2Cl2 (11.72 mL) 중 3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-알라닌 (1.0 g, 2.35 mmol)의 교반된 용액에 HCl (디옥산 중 4.0 M, 11.72 mL, 46.9 mmol)을 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시켜 표제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제하지 않고 사용하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 327.19 [M+1]; Rt = 1.73 min.
단계 C: 3-({6-[({비스[2-옥소-2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노일}아미노)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닌
DMF 중 펜타플루오로페닐 6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트 (270 mg, 0.318 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 3-아미노-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닌 히드로클로라이드 (303 mg, 0.306 mmol)를 첨가하고, 5 min 후에 DIPEA (111 μL, 0.636 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 2 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 우선 100 mL의 EtOAc로 용리한 후에 0-20% 용매 B/용매 A (용매 A: v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 6/1/1/1; 용매 B v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 2/1/1/1)로 용리하는 실리카 겔 (22 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 991.66 [M+1]; Rt = 1.84 min.
단계 D: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-({6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥실}아미노)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-알라니네이트
단계 D에서의 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥산산을 3-({6-[({비스[2-옥소-2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노일}아미노)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닌으로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 1088.9 [M+1]; Rt = 1.96 min.
실시예 44
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-({6-[({비스[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}아세틸)아미노]헥실}아미노)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라니네이트 (ML-44)의 합성이 기재된다.
Figure pct00303
단계 B에서의 3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-알라닌을 3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닌으로 대체한 ML-43에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 1088.9 [M+1]; Rt = 1.96 min.
실시예 45
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,2'-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]이미노}비스(N-{[1-(α-D-만노피라노실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸}아세트아미드) (ML-45)의 합성이 기재된다.
Figure pct00304
단계 A: 벤질 6-[({비스[2-옥소-2-(프로프-2-인-1-일아미노)에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트
2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 프로파르길아민으로 대체한 ML-1 단계 B에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.32 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.014 (s, 4H), 3.298 (m, 4H), 3.23 (m, 2H), 3.21 (m, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.22 (s, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.51 (m, 2H), 1.33 (m, 2H).
단계 B: 벤질 6-[({비스[2-옥소-2-({[1-(α-D-만노피라노실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸}아미노)에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트
DMF (5.8 mL) 중 벤질 6-[({비스[2-옥소-2-(프로프-2-인-1-일아미노)에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트 (546 mg, 1.165 mmol) 및 α-D-만노피라노실 아지드 (598 mg, 2.91 mmol)의 교반된 용액에 DIPEA (1.0 mL, 5.83 mmol) 및 Cu(I) 아이오다이드 (222 mg, 1.165 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 30 min 동안 모든 CuI가 용해될 때까지 교반하고, 이어서 rt에서 1 hr 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 10x 부피의 CH3OH로 희석하였다. 침전된 무기물을 여과해내었다. 여과물을 농축시키고, 잔류물을 0-60% 용매 B/용매 A (용매 A: v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 6/1/1/1; 용매 B v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 2/1/1/1)로 용리하는 실리카 겔 (40 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 879.31 [M+1]; Rt = 0.98 min.
단계 C: 2,2'-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]이미노}비스(N-{[1-(α-D-만노피라노실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸}아세트아미드)
단계 C에서의 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트를 벤질 6-[({비스[2-옥소-2-({[1-(α-D-만노피라노실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸}아미노)에틸]아미노}아세틸)아미노]헥사노에이트로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 A: m/e = 886.2 [M+1]; Rt = 2.02 min.
실시예 46
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,2'-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]이미노}비스(N-{2-[(β-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아세트아미드) (ML-46)의 합성이 기재된다.
Figure pct00305
단계 B에서의 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드를 2-아미노에틸 β-L-푸코피라노시드로 대체한 ML-7에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 780.361 [M+1]; Rt = 2.09 min.
실시예 47
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-N-{2-[(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시}에틸)아미노]-2-옥소에틸}-6-옥소헥산아미드 (ML-47)의 합성이 기재된다.
Figure pct00306
2,2'-[(2-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]아미노}-2-옥소에틸)이미노]디아세트산을 2,2'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디아세트산으로 대체한 ML-29에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1070.33 [M+1]; Rt = 3.08 min.
실시예 48
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸][2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-[2-(α-D-만노피라노실옥시)에틸]아세트아미드 (ML-48)의 합성이 기재된다.
Figure pct00307
각각 단계 C에서의 6-아미노-N-(2-α-L-푸코피라노실)에틸)헥산아미드를 2-아미노에틸 α-L-푸코피라노시드로 대체하고, 단계 D에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노시드로 대체한 ML-23에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B m/e = 796.37 [M+1]; Rt = 1.87 min.
실시예 49
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸][2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-[2-(β-D-만노피라노실옥시)에틸]아세트아미드 (ML-49)의 합성이 기재된다.
Figure pct00308
단계 A: 벤질 {2-[(3,6-디-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)옥시]에틸}카르바메이트
톨루엔 (150 mL) 중 벤질 2-({2-[(β-D-갈락토피라노실)옥시]에틸}아미노)카르바메이트 (15.5 g, 43.4 mmol, Beilstein J. Org. Chem. 2010, 6, 699) 및 4Å 분자체의 용액에 디부틸스탄나논 (23.4 g, 94 mmol)을 첨가하였다. 5hr 동안 환류시킨 후에, 반응 혼합물을 0℃로 천천히 냉각시키고, 여기에 벤조일 클로라이드 (11 mL, 95 mmol)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 rt까지 단계적으로 가온시켰다. rt에서 24 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 0 -75% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/EtOAc: 1/1, Rf = 0.35. UPLC 방법 B: C30H31NO10에 대한 계산치 565.19 관찰치 m/e = 566.21 [M+1]; Rt = 1.87 min. 1H NMR (CDCl3) δ 8.05-7.95 (4 H, m), 7.60-7.25 (11H, m), 5.10-5.05 (1H, m), 5.02 (2H, s), 4.60-4.55 (1H, m), 4.50-4.45 (1H, m), 4.40-4.35 (1H, m), 4.20-4.15 (1H, m), 4.05-4.00 (1H, m), 3.90-3.80 (2H, m), 3.75-3.70 (1H, m), 3.45-3.30 (1H, m), 3.35-3.25 (1H, m). 위치화학은 1H-13C 1-결합 상관관계 (HSQC); 1H-13C 다중-결합 상관관계 (HMBC); 및 1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR 실험에 의해 확인하였다.
단계 B: 벤질 {2-[(3,6-디-O-벤조일-β-D-만노피라노실)옥시]에틸}카르바메이트
CH2Cl2 (26 mL) 중 벤질 {2-[(3,6-디-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)옥시]에틸}카르바메이트 (1.17 g, 2.069 mmol)의 교반된 용액에 -20℃에서 피리딘 (2.4 mL, 29.7 mmol)을 첨가하고, 5 min 후에 트리플산 무수물 (1.1 mL, 6.51 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 -20℃에서 0℃로 2 hr에 걸쳐 천천히 가온시켰다. 생성된 혼합물을 CH2Cl2 (75 mL)로 희석하고, 이를 냉각된 1.0 M HCl (100 mL), 냉각된 sat'd NaHCO3 (100 mL), 냉수 (100 mL), 및 냉각된 염수 (100 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 저온에서 농축시켰다. 잔류물을 AcCN (20 mL)에 용해시키고, 여기에 AcCN (6mL) 중 테트라부틸암모늄 니트라이트 (3.0 g, 10.40 mmol)의 용액을 첨가하였다. 50℃에서 6 hr 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 0-75% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 (330 g) 상 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. TLC: 실리카 겔, 헥산/에틸아세테이트: 1/1, Rf = 0.33. UPLC 방법 B: C30H31NO10에 대한 계산치 565.19 관찰치 m/e = 566.22 [M+1]; Rt = 1.84 min. 1H NMR (CDCl3) δ 8.10-8.00 (4 H, m), 7.55-7.25 (11H, m), 5.05-5.00 (3H, m), 4.72-4.68 (1H, m), 4.64-4.58 (2H, m), 4.24-4.20 (1H, m), 4.17- 4.12 (1H, m), 3.93-3.87 (1H, m), 3.77-3.72 (1H, m), 3.65-3.60 (1H, m), 3.46-3.34 (2H, m). 입체화학은 1H-13C 1-결합 상관관계 (HSQC); 1H-13C 다중-결합 상관관계 (HMBC); 및 1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR 실험에 의해 확인하였다.
단계 C: 벤질 [2-(β-D-만노피라노실옥시)에틸]카르바메이트
CH3OH (5 mL) 중 벤질 {2-[(3,6-디-O-벤조일-β-D-푸코피라노실)옥시]에틸}카르바메이트 (287 mg, 0.507 mmol)의 교반된 용액에 NaOCH (0.1 mL, 0.05 mmol, CH3OH 중 0.5 M)를 첨가하였다. 4 hr 후에, 앰버라이트 IR 120 (H) 이온 교환 수지 (CH3OH 3x5mL로 사전-세척)를 교반된 반응 혼합물에 첨가하였다. 15 min 후에, 수지를 여과-제거하고, CH3OH (3x5 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시키고, 잔류물을 5-60% AcCN/H2O로 용리하는 C18 역상 실리카 겔 (50 g) 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 B: C16H23NO8에 대한 계산치 357.14 관찰치 m/e = 358.16 [M+1]; Rt = 1.40 min. 1H NMR (CD3OD) δ 7.35-7.24 (5H, m), 5.04 (2H, s), 4.50-4.48 (1H, m), 3.90-3.82 (3H, m), 3.74-3.60 (2H, m), 3.55-3.50 (1H, m), 3.42-3.37 (1H, m), 3.36-3.30 (2H, m), 3.18-3.12 (1H, m).
단계 D: 2-아미노에틸 β-D-만노피라노시드
물 (5 mL) 중 벤질 [2-(β-D-만노피라노실옥시)에틸]카르바메이트 (133 mg, 0.372 mmol), 및 Pd/C (20 mg, 0.019 mmol)의 혼합물을 H2의 풍선 하에 rt에서 4 hr 동안 교반하였다. 촉매를 여과-제거하고, H2O (3x5 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 4.53-4.52 (1H, m), 3.93-3.85 (3H, m), 3.72-3.64 (2H, m), 3.53-3.49 (1H, m), 3.44-3.42 (1H, m), 3.22-3.18 (1H, m), 2.92-2.85 (2H, m).
단계 E: 2-{[2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸][2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-[2-(β-D-만노피라노실옥시)에틸]아세트아미드
2-아미노에틸 α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 β-D-만노피라노시드로 대체한 ML-48에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 796.37 [M+1]; Rt = 2.19 min.
실시예 50
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{1[α-D-만노피라노실],4[α-D-만노피라노실]-옥시}부틸)아세트아미드 (ML-50)의 합성이 기재된다.
Figure pct00309
단계 A: 벤질 (1[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실],4[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실]-디히드록시부탄-2-일)카르바메이트
4 Å분자체를 함유하는 500 mL rb 플라스크에 무수 디클로로메탄 (200 mL) 중 (S)-벤질 (1,4-디히드록시부탄-2-일)카르바메이트 (2.7 g, 11.28 mmol), 및 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-D-만노피라노실 트리클로로아세트이미데이트 (17.35 g, 23.42 mmol, 문헌 [Organic Letters, 2003, vol.5, No.22, 4041]에 따라 제조됨)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 -30℃로 냉각시키고, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (0.4 mL, 2.214 mmol)를 첨가하였다. -30 내지 주위 온도에서 4h 동안 질소 하에 교반한 후에, 반응 혼합물을 TEA (3.15 mL, 22.57 mmol)로 켄칭하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 크로마토그래피 (0- 60% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. (TLC: 실리카 겔, 헥산/에틸아세테이트:3/2, 생성물 Rf=0.4). 1H NMR (클로로포름-d, 500 MHz): δ 8.15-8.10 (4H, m), 8.10-8.05 (4H, m), 8.00-7.95 (4H, m), 7.80-7.75 (4H, m), 7.65-7.55 (4H, m), 7.45-7.20 (15H, m), 6.15-6.10 (2H, m), 5.95-5.85 (2H, m), 5.80-5.75 (2H, m), 5.15-5.10 (4H, m), 4.75-4.65 (2H, m), 4.55-4.40 (4H, m), 4.25-4.20 (1H, m), 4.10-4.00 (2H, m), 3.75-3.65 (2H, m), 2.15-2.05 (2H, m).
단계 B: 벤질 (1[α-D-만노피라노실],4[α-D-만노피라노실]-디히드록시부탄-2-일)카르바메이트
메탄올 (30mL) 중 벤질 (1[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실],4[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실]-디히드록시부탄-2-일)카르바메이트 (9.72 g, 6.96 mmol)의 용액에 메탄올 중 0.5M 소듐 메톡시드 (1.5 mL, 0.750 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 48시간 동안 교반한 후에, 앰버라이트 IR 120 (H) 이온 교환 수지 (메탄올 3x30ml로 사전-세척)를 반응 혼합물에 첨가하고, 추가의 15분 동안 교반하였다. 이온 교환 수지를 여과-제거하고, 메탄올 (2x5 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시키고, 잔류물을 5% CH3CN/물 (3 cv)에 이어서 5%-50% CH3CN/물 (20 cv)로 용리하는 86 g C18 칼럼 역상 상에서 정제하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다. UPLC-MS: C24H37NO14에 대한 계산치 563.22 관찰치 m/e: 564.24 (M+H)+ (Rt: 2.31/5.00 min).
단계 C: 1(α-D-만노피라노실),4(α-D-만노피라노실)-디히드록시부탄-2-아민
물 (60 mL) 중 벤질 (1[α-D-만노피라노실],4[α-D-만노피라노실]-디히드록시부탄-2-일)카르바메이트 (3.73 g, 6.62 mmol), 및 Pd/C (0.300 g, 0.282 mmol)의 혼합물을 H2의 풍선 하에 rt에서 2 h 동안 교반하였다. 촉매를 여과-제거하고, H2O (3x10 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC-MS: C16H31NO12에 대한 계산치 429.18 관찰치 m/e: 430.21 (M+H)+ (Rt: 1.37/5.00 min).
단계 D: 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{1[α-D-만노피라노실],4[α-D-만노피라노실]-옥시}부틸)아세트아미드
2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 1(α-D-만노피라노실),4(α-D-만노피라노실)-디히드록시부탄-2-아민으로 대체한 ML-29에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C40H67N5O24에 대한 계산치 1001.42, 관찰치 m/e: 1002.48 [M+1]; Rt = 2.05min.
실시예 51
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-만노피라노실]옥시}에틸)아세트아미드 (ML-51)의 합성이 기재된다.
Figure pct00310
단계 A: (2-((3,6-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)옥시)클로로에틸)
4Å 분자체를 함유하는 500 mL Rb 플라스크에, 2-클로로에틸-β-D-갈락토피라노시드 (6.58 g, 27.1 mmol, 문헌 [Carbohydr. Res. 1992, 223, 303]에 따라 제조됨), 디부틸스탄나논 (14.5 g, 58.2 mmol) 및 무수 톨루엔 (150 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 환류 온도에서 3h 동안 교반하였다. 3h 후에, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이어서 0℃로 냉각시켰다. 반응 조 물질의 냉각된 용액에 0℃에서 벤조일 클로라이드 (6.7 ml, 57.7 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 0℃ 내지 주위 온도에서 교반하였다. 24시간 후에, 반응 혼합물을 여과-제거하고 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 크로마토그래피 (0-75% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC-MS: C22H23ClO8에 대한 계산치 450.11 관찰치 m/e: 473.11 (M+Na)+ (Rt: 1.82/5.00 min). 1H NMR (클로로포름-d, 500 MHz): δ 8.10-8.05 (2H, m), 8.05-8.00 (2H, m), 7.60-7.55 (2H, m), 7.50-7.40 (4H, m), 5.20-5.10 (1H, m), 4.70-4.60 (1H, m), 4.55-4.50 (1H, m), 4.50-4.45 (1H, m), 4.25-4.20 (1H, m), 4.20-4.15 (1H, m), 4.12-4.08 (1H, m), 4.00-3.95 (1H, m), 3.90-3.85 (1H, m), 3.72-3.68 (2H, m). 위치화학은 1H-13C 1-결합 상관관계 (HSQC); 1H-13C 다중-결합 상관관계 (HMBC); 및 1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR 실험에 의해 확인하였다.
단계 B: (2-((3,6-O-벤조일-β-D-만노피라노실)옥시)클로로에틸)
DCM (28 mL) 중 (2-((3,6-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)옥시)클로로에틸) (1 g, 2.218 mmol)의 용액에 -20℃에서 피리딘 (2.5 mL, 30.9 mmol)을 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후에, 트리플산무수물 (1.2 mL, 7.10 mmol)을 적가하고, 혼합물을 -20℃에서 0℃로 2 시간에 걸쳐 가온시키면서 교반하였다. 생성된 혼합물을 75 ml DCM으로 희석하고, (1x100 mL)의 냉각된 1 M HCl; (1x100 mL)의 냉각된 수성 NaHCO3; (1x100 mL)의 냉수 및 100ml의 냉각된 염수로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 저온에서 진공 농축시켰다. 잔류물을 다음 단계에 추가 정제하지 않고 직접 사용하였다. 5 ml의 무수 아세토니트릴 중 테트라부틸암모늄 니트라이트 (3.3 g, 11.44 mmol)의 용액을 건조 아세토니트릴 (22mL) 중 트리플레이트화 중간체의 용액에 첨가하고, 이어서 50℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 생성된 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 실리카 크로마토그래피 (0-75% EtOAc/헥산)에 의해 직접 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC-MS: C22H23ClO8에 대한 계산치 450.11 관찰치 m/e: 451.13 (M+H)+ (Rt: 1.80/5.00 min).1H NMR (클로로포름-d, 500 MHz): δ 8.15-8.05 (4 H, m), 7.65-7.60 (2H, m), 7.50-7.40 (4H, m), 5.12-5.08 (1H, m), 4.77-4.72 (2H, m), 4.68-4.65 (1H, m), 4.34-4.32 (1H, m), 4.24- 4.14 (2H, m), 3.90-3.84 (1H, m), 3.71-3.66 (3H, m), 2.98-2.96 (1H, b), 2.41-2.39 (1H, b). 입체화학은 1H-13C 1-결합 상관관계 (HSQC); 1H-13C 다중-결합 상관관계 (HMBC); 및 1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR 실험에 의해 확인하였다.
단계 C: (2-((2,4-O-벤질,3,6-O-벤조일-β-D-만노피라노실)옥시)클로로에틸)
250 mL rb 플라스크에서, 2-(벤질옥시)-1-메틸피리딘-1-윰 트리플루오로메탄술포네이트 (5 g, 14.31 mmol), 산화마그네슘 (0.085 g, 2.118 mmol), 트리플루오로톨루엔 (40 mL), 및 (2-((3,6-O-벤조일-β-D-만노피라노실)옥시)클로로에틸) (1.91 g, 4.24 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 불균질 반응 혼합물을 82℃에서 48h 동안 교반하였다. 반응 완료시에, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 크로마토그래피 (0-75 % EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC-MS: C36H35ClO8에 대한 계산치 630.20 관찰치 m/e: 631.21 (M+H)+ (Rt: 3.97/5.00 min).
단계 D: (2-((2,4-O-벤질-β-D-만노피라노실)옥시)클로로에틸)
메탄올 (25 mL) 및 DCM (5 mL) 중 (2-((2,4-O-벤질,3,6-O-벤조일-β-D-만노피라노실)옥시)클로로에틸) (1.6 g, 2.54 mmol)의 용액에 메탄올 중 0.5M 소듐 메톡시드 (0.5 mL, 0.25 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후에, 앰버라이트 IR 120 (H) 이온 교환 수지 (메탄올 3x5 mL로 사전-세척)를 반응 혼합물에 첨가하고, 추가의 15분 동안 교반하였다. 이온 교환 수지를 여과-제거하고, 메탄올 (3x5 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 크로마토그래피 (0-75% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC-MS: C22H27ClO6에 대한 계산치 422.15 관찰치 m/e: 423.14 (M+H)+ (Rt: 1.90/5.00 min).
단계 E: (2-((2,4-O-벤질-β-D-만노피라노실)옥시)아지도에틸)
무수 DMF (25 mL) 중 (2-((2,4-O-벤질-β-D-만노피라노실)옥시)클로로에틸) (800 mg, 1.892 mmol)의 용액에 아지드화나트륨 (140 mg, 2.154 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 70℃로 가열하고, 16h 동안 질소 하에 교반하였다. 반응 완료시에, 조 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 빙수 (200 mL) 상에 붓고, 에테르 (3x100 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수 (2x100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 크로마토그래피 (0-100%EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. UPLC-MS: C22H27N3O6에 대한 계산치 429.19 관찰치 m/e: 430.19 (M+H)+ (Rt: 1.87/5.00 min).
단계 F: (2-((2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-(2,4-O-벤질-β-D-만노피라노실)옥시)아지도에틸)
4Å 분자체를 함유하는 250 mL Rb 플라스크에 무수 디클로로메탄 (30 mL) 중 (2-((2,4-O-벤질-β-D-만노피라노실)옥시)아지도에틸) (710 mg, 1.653 mmol) 및 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-D-만노피라노실 트리클로로아세트이미데이트 (2.6 g, 3.51 mmol, 문헌 [Organic Letters, 2003, vol.5, No.22, 4041]에 따라 제조됨)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 -30℃로 냉각시키고, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (0.03 mL, 0.166 mmol)를 첨가하였다. -30 내지 주위 온도에서 4 h 동안 질소 하에 교반한 후에, 반응 혼합물을 TEA (0.1 mL, 0.717 mmol)로 켄칭하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 크로마토그래피 (0-75% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. (TLC: 실리카 겔, 헥산/에틸아세테이트:3/2, 생성물 Rf=0.6). 1H NMR (클로로포름-d, 500 MHz): δ 8.15-7.80 (16H, m), 7.62-7.49 (8H, m), 7.47-7.32 (20H, m), 7.30-7.15 (6H, m), 6.13-6.05 (2H, m), 6.01-5.91 (2H, m), 5.87-5.85 (1H, m), 5.71-5.69 (1H, m), 5.43-5.42 (1H, m), 5.26-5.23 (1H, m), 5.13-5.12 (1H, m), 5.03-5.00 (1H, m), 4.84-4.81 (1H, m), 4.68-4.63 (2H, m), 4.60-4.55 (2H, m), 4.54-4.48 (2H, m), 4.31-4.25 (2H, m), 4.20-4.15 (1H, m), 4.08-4.07 (1H, m), 3.98-3.88 (3H, m), 3.84-3.80 (1H, m), 3.78-3.73 (1H, m), 3.62-3.54 (2H, m), 3.38-3.33 (1H, m).
단계 G: (2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]- (2,4-O-벤질, β-D-만노피라노실)옥시)아지도에틸)
메탄올 (20 mL) 및 DCM (4 mL) 중 2-((2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-(2,4-O-벤질-β-D-만노피라노실)옥시)아지도에틸 (2.52 g, 1.588 mmol)의 용액에 메탄올 중 0.5M 소듐 메톡시드 (0.32 mL, 0.16 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후에, 앰버라이트 IR 120 (H) 이온 교환 수지 (메탄올 3x30mL로 사전-세척)를 반응 혼합물에 첨가하고, 추가의 15분 동안 교반하였다. 이온 교환 수지를 여과-제거하고, 메탄올 (3x5mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (C18 칼럼) (ACN/H2O - 변형제 무함유)에 의해 정제하여 표제 생성물을 수득하였다. UPLC-MS: C34H47N3O16에 대한 계산치 753.30 관찰치 m/e: 754.29 (M+H)+ (Rt: 2.93/5.00 min).
단계 H: 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-만노피라노시드
물 (25 mL) 중 2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]- (2,4-O-벤질, β-D-만노피라노실)옥시)아지도에틸 (1.05 g, 1.393 mmol), 및 Pd/C (0.148g, 0.139 mmol)의 혼합물을 H2의 풍선 하에 rt에서 16 h 동안 교반하였다. 촉매를 여과-제거하고, H2O (3x5 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC-MS: C20H37NO16에 대한 계산치 547.21 관찰치 m/e: 548.23 (M+H)+ (Rt: 1.07/5.00 min). 1H NMR (D2O, 500 MHz): δ 5.06-5.05 (1H, m), 4.86-4.85 (1H, m), 4.655-4.65 (1H, m), 4.13-4.12 (1H, m), 4.02-4.01 (1H, m), 3.95-3.82 (6H, m), 3.80-3.67 (8H, m), 3.66-3.57 (3H, m), 3.53-3.49 (1H, m), 2.90-2.85(2H, m).
단계 I: 2-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸][2-({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-만노피라노실]옥시}에틸)아세트아미드
2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-만노피라노시드로 대체한 ML-29에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C44H73N5O28에 대한 계산치 1119.44, 관찰치 m/e: 1120.46 [M+1]; Rt = 2.09 min.
실시예 52
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-{2-[(β-D-만노피라노실)옥시]에틸}-6-옥소헥산아미드 (ML-52)의 합성이 기재된다.
Figure pct00311
단계 B에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 β-D-만노피라노시드로 대체한 ML-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC-MS: C18H28N2O11에 대한 계산치 448.17 관찰치 m/e: 449.19 (M+H)+ (Rt: 1.96/5.00 min).
실시예 53
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 4-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]- N-{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}4-옥소부탄아미드 (ML-53)의 합성이 기재된다.
Figure pct00312
단계 A에서의 6-(벤질옥시)-6-옥소헥산산을 4-(벤질옥시)-4-옥소부탄산으로 대체한 ML-4에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC-MS: C16H24N2O10에 대한 계산치 404.14 관찰치 m/e: 405.14 (M+H)+ (Rt: 1.87/5.00 min).
실시예 54
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,2'-{[2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)-2-옥소에틸]이미노}비스[N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노실]옥시}에틸)아세트아미드] (ML-54)의 합성이 기재된다.
Figure pct00313
단계 B에서의 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드로 대체한 ML-15에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C56H93N5O39에 대한 계산치 1459.54, 관찰치 m/e: m/e = 1460.62 [M+1]; Rt = 0.92 min.
실시예 55
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-(2-{([α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시)에틸}{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드 (ML-55)의 합성이 기재된다.
Figure pct00314
단계 A: 2-아미노에틸 2,3,4,6-펜타-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디벤조일-α-D-만노피라노시드.
EtOAc (300 mL) 중 2-아지도에틸 2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-O-펜타-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노시드 (25 g, 15.5 mmol WO 2010/088294 A1)의 질소 플러싱된 용액에 10% 탄소 상 팔라듐 (1.65 g)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 수소의 풍선 하에 밤새 교반하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과물을 증발시키고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 330g) (용리액: 8CV에 걸쳐 구배 2-5% MeOH/DCM)에 의해 정제하여 표제 화합물 (18 g, 73%)을 회백색 발포체로서 수득하였다. UPLC 방법 C: C90H77NO26에 대한 계산치 1587.47, 관찰치 m/e: 1588.6636 [M+1]; Rt = 4.17 min.
단계 B: 벤질 6-(2-{2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노실]-2-옥시에틸}아미노) 헥사노에이트.
DCM (150 mL) 중 2-아미노에틸 2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노시드 (18 g, 11.35 mmol) 및 벤질 6-옥소헥사노에이트 (1 g, 4.54 mmol)의 용액에 아세트산 (0.26 mL, 4.54 mmol) 및 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (2.41 g, 11.35 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 EtOAc (300 mL)에 용해시키고, sat. NaHCO3 (2 x 300 mL), sat. NaCl (200 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 2 x 330g) (용리액: 8CV에 걸쳐 구배 2-5% MeOH/DCM)에 의해 정제하여 표제 화합물 (4.8 g, 59%)을 백색 발포체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.33 (2H, m), 8.18 (2H, m), 8.13 (2H, dd, J = 8.0 및 1.4 Hz), 8.10 (2H, dd, J = 8.0 및 1.4 Hz), 8.06 (2H, m), 8.05 (2H, dd, J 4.8 및 1.6 Hz), 7.84 (4H, m), 7.78 (2H, dd, J = 8.0 및 1.4 Hz), 7.74 (2H, dd, J = 8.0 및 1.4 Hz), 7.67-7.48 (8H, m), 7.47-7.30 (23H, m), 7.25 (2H, t, J = 7.8Hz), 6.14 (1H, t, J = 10.1 Hz), 6.10 (1H, t, J = 10.0 Hz), 6.03 (1H, dd, J = 10.1 및 3.3 Hz), 5.93 (1H, t, J = 10.0 Hz), 5.80 (2H, m), 5.75 (1H, dd, J = 10.1 및 3.3 Hz), 5.42 (1H, d, J = 1.9 Hz), 5.38 (1H, dd, J = 3.3 및 1.9 Hz), 5.20 (1H, s), 5.18 (1H, d, J = 1.8 Hz), 5.11 (2H, s), 4.69 (1H, dd, J = 9.7 및 3.5 Hz), 4.67 (1H, dd, J = 12.4 및 2.6 Hz), 4.62 (1H, dd, J = 12.2 및 2.4 Hz), 4.57 (1H, m), 4.48 (1H, dt, J = 10.1 및 2.8 Hz), 4.42-4.31 (3H, m), 4.22 (1H, dd, J = 10.8 및 6.3 Hz), 4.09 (1H, dt, J = 10.0 및 5.4 Hz), 3.83 (1H, d, J = 10.6 Hz), 3.78 (1H, m), 3.02 (2H, m), 2.73 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.37 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.71 (2H, m), 1.59 (2H, m), 1.40 (2H, m).
단계 C: 2-옥소에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드
아세톤 (30 mL) 및 물 (7.5 mL) 중 프로프-2-엔-1-일 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드 (1.34 g, 4.06 mmol)의 용액에 4-메틸모르폴린 4-옥시드 (950 mg, 8.11 mmol)를 첨가한 후에 tert-부탄올 중 2.5% OsO4 (2.04 mL, 0.162 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 16 hr 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 혼합물에 물 (15 mL) 중 NaIO4 (1.74 g, 8.11 mmol)의 용액을 첨가하였다. 추가의 4 hr 동안 교반한 후에, 침전물을 여과하고, 아세톤 (50 mL)으로 세척하였다. 여과물의 부피를 처음 부피의 대략 1/3로 감소시키고, 이어서 sat. NaHCO3 (100 mL)으로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc (3x50 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 0-80% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 120 g)에 의해 정제하여 표제 화합물 (660 mg, 49%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 9.72 (1H, s), 5.44 (1H, dd, J = 10.9 및 3.3 Hz), 5.35 (1H, dd, J = 3.4 및 1.8 Hz), 5.19 (1H, dd, J = 10.9 및 3.8 Hz), 5.13 (1H, d, J = 3.8 Hz), 4.26 (3H, m), 2.19 (3H, s), 2.15 (3H, s), 2.02 (3H, s), 1.17 (3H, d, J = 6.6 Hz).
단계 D: 벤질 6-{[{2-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)-옥시}에틸](2-{(2-{2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노실]-옥시}에틸)아미노}헥사노에이트
DCM (20 mL) 중 벤질 6-(2-{2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노실]-2-옥시에틸}아미노) 헥사노에이트 (1.3 g, 0.725 mmol) 및 2-옥소에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드 (651 mg, 1.96 mmol)의 용액에 아세트산 (0.042 mL, 0.725 mmol) 및 소듐 트리아세톡시 보로히드라이드 (307 mg, 1.45 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 EtOAc (60 mL) 및 sat. NaHCO3 (80 mL) 사이에 분배하고; 유기 층을 sat. NaHCO3 (80 mL), sat. NaCl (50 mL)의 추가의 부분으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 80g) (용리액: 10CV에 걸쳐 구배 20-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.5 g, 99%)을 백색 발포체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.34 (2H, dd, J 6.7 및 3.2 Hz), 8.15 (2H, m), 8.10 (4H, m), 8.07 (2H, dd, J = 8.0 및 1.4 Hz), 8.05 (2H, dd, J 8.1 및 1.5 Hz), 7.88 (4H, m), 7.78 (2H, dd, J = 8.0 및 1.4 Hz), 7.72 (2H, dd, J = 7.8 및 1.5 Hz), 7.62-7.55 (6H, m), 7.54-7.36 (14H, m), 7.34-7.29 (11H, m), 7.25 (2H, t, J = 7.7Hz), 6.14 (1H, t, J = 10.0 Hz), 6.07 (1H, m), 6.03 (2H, m), 5.83 (1H, dd, J = 3.3 및 1.8 Hz), 5.75 (2H, m), 5.41 (1H, m), 5.39 (2H, m), 5.35 (1H, d, J = 3.8 Hz), 5.33 (2H, m), 5.59 (1H, d, J = 3.7 Hz), 5.18 (3H, m), 5.16 (1H, d, J = 3.8 Hz), 5.13 (1H, t, J = 4.2 Hz), 5.10 (1H, d, J = 3.7 Hz), 5.06 (2H, s), 4.62 (2H, m), 4.54 (1H, m), 4.50 (2H, m), 4.57 (1H, m), 4.33 (3H, m), 4.25 (2H, m), 4.19 (2H, m), 3.80 (2H, m), 2.82 (2H, m), 2.60 (1H, t, J = 7.3 Hz), 2.32 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.20 (3H, s) 2.11 (3H, s) 2.02 (3H, s), 1.63 (2H, m), 1.51 (1H, m) 1.34 (1H, m) 1.18 (3H, d, J = 6.6 Hz).
단계 E: 메틸 6-{[{2-(-α-L-푸코피라노실)-옥시}에틸](2-{(2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]-옥시}에틸)아미노}헥사노에이트
DCM (5 mL) 및 MeOH (15 mL)의 혼합물 중 벤질 6-{[{2-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)-옥시}에틸](2-{(2-{2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노실]-옥시}에틸)아미노}헥사노에이트 (1.5 g, 0.71 mmol)의 용액에 소듐 메톡시드 (MeOH 중 0.5M 용액 0.284 mL, 0.142 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4일 동안 교반하였다. 혼합물을 ~ 4 mL의 부피로 증발시키고, 교반된 아세토니트릴 (80 mL)에 적가하여 백색 침전물을 수득하였다. 혼합물을 3500 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 고체를 아세토니트릴 (80 mL)에 재현탁시키고, 3500 rpm에서 추가 20 min 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 고체를 건조 질소의 스트림 하에 건조시켜 표제 화합물 (580 mg, 94%)을 백색 고체로서 수득하였다. UPLC 방법 B: C35H63NO23에 대한 계산치 865.38, 관찰치 m/e: 866.48 [M+1]; Rt = 1.71 min.
단계 F: 6-{[{2-(-α-L-푸코피라노실)-옥시}에틸](2-{(2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]-옥시}에틸)아미노}헥산산
물 (3 mL) 중 메틸 6-{[{2-(-α-L-푸코피라노실)-옥시}에틸](2-{(2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]-옥시}에틸)아미노}헥사노에이트 (580 mg, 0.67 mL)의 용액에 5N NaOH (0.161 mL, 0.804 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 아세트산 (0.039 mL, 0.683 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 동결건조시켜 표제 화합물 (620 mg, 100%)을 수득하였다. UPLC 방법 B: C34H61NO23에 대한 계산치 851.36, 관찰치 m/e: 852.48 [M+1]; Rt = 1.74 min.
단계 G: 2-(2-{([α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시)에틸}{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)에틸 α-L-푸코피라노시드
무수 DMF (2 mL) 중 6-{[{2-(-α-L-푸코피라노실)-옥시}에틸](2-{(2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]-옥시}에틸)아미노}헥산산 (100 mg, 0.117 mmol)의 현탁액에 휘니그 염기 (0.082 mL, 0.47 mmol) 및 1-(((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)(피롤리딘-1-일)메틸렌)피롤리딘-1-윰 헥사플루오로포스페이트(V) (58 mg, 0.141 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 30 min 동안 교반하였다. TFA (0.036 mL, 0.47 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 무수 아세토니트릴 (40 mL)에 적가하여 백색 침전물을 형성하였다. 혼합물을 3500 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고, 용매를 따라내고, 고체를 아세토니트릴 (40 mL)에 재현탁시키고, 3500 rpm에서 20 min 동안 원심분리하였다. 용매를 따라내고, 고체를 건소 질소 스트림 하에 건조시켜 표제 화합물 (84 mg, 75%)을 수득하였다. UPLC 방법 B: C38H64N2O25에 대한 계산치 948.38, 관찰치 m/e: 949.48 [M+1]; Rt = 3.64 min.
실시예 56
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-(2-{([α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시)에틸}{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}아미노)에틸 β-L-푸코피라노시드 (ML-56)의 합성이 기재된다.
Figure pct00315
단계 C에서의 프로프-2-엔-1-일 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드를 프로프-2-엔-1-일 2,3,4-트리-O-아세틸-β-L-푸코피라노시드로 대체한 ML-55에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 949.48 [M+1]; Rt = 3.70 min.
실시예 57
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 3-(2-{([α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시)에틸}{6-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-6-옥소헥실}아미노)프로필 α-L-푸코피라노시드 (ML-57)의 합성이 기재된다.
Figure pct00316
단계 A: 벤질 6-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필](2-[2-{2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노실}-옥시]에틸)아미노}헥사노에이트
벤질 6-(2-{2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노실]-2-옥시에틸}아미노) 헥사노에이트 [ML-XX 단계 B] 및 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로판알 [ML-36 단계 E]로부터 ML-XX 단계 D에 대해 개략된 절차에 따라 제조하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.35 (2H, dd, J = 6.4 및 2.9 Hz), 8.17 (2H, d, J = 7.7 Hz), 8.10 (4H, m), 8.06 (2H, dd, J = 7.1 및 1.5 Hz), 8.04 (2H, dd, J = 7.7 및 1.5 Hz), 7.89 (2H, m), 7.87 (2H, m), 7.80 (2H, dd, J = 7.9 및 1.4 Hz), 7.74 (2H, m), 7.61 (2H, m), 7.59-7.55 (4H, m), 7.49 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.45-7.35 (12H, m), 7.35-7.27 (26H, m), 7.23 (2H, m), 6.18 (1H, t, J = 9.9 Hz), 6.11-6.02 (3H, m), 5.85 (1H, dd, J = 3.3 및 1.8 Hz), 5.75 (2H, m), 5.37 (2H, m), 5.17 (2H, m), 5.06 (2H, s), 4.77 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.70 (2H, d, J = 8.3 Hz), 4.67-4.60 (5H, m), 4.56 (2H, d, J = 8.6 Hz), 4.55-4.47 (4H, m), 4.33 (3H, m), 4.19 (1H, dd, J = 11.0 및 4.8 Hz), 4.01 (1H, dd, J = 10.5 및 4.7 Hz), 3.86 (1H, m), 3.79 (1H, d, J = 11.2 Hz), 3.75 (2H, m), 3.62 (1H, m), 2.79 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.52 (4H, m), 2.32 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.65 (4H, m), 1.48 (2H, m), 1.30 (3H, m), 1.25 (3H, d, J = 6.6Hz).
단계 B: 메틸 6-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필](2-[2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실}-옥시]에틸)아미노}헥사노에이트
무수 DCM (5 mL) 및 무수 MeOH (15 mL)의 혼합물 중 벤질 6-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필](2-[2-{2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→3)-[2,3,4,6-펜타-O-벤조일-α-D-만노피라노실-(1→6)]-2,4-디-O-벤조일-α-D-만노피라노실}-옥시]에틸)아미노}헥사노에이트 (1.3 g, 0.577 mmol)의 용액에 소듐 메톡시드 (MeOH 중 0.5M 용액 1.16 mL, 0.577 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 혼합물을 ~5 mL의 부피로 증발시키고, 교반된 무수 아세토니트릴 (80 mL)에 적가하였다. 혼합물을 3500 rpm에서 30 min 동안 원심분리하고, 용매를 따라내고, 고체를 아세토니트릴 (80 mL)에 재현탁시켰다. 혼합물을 3500 rpm에서 30 min 동안 원심분리하고, 용매를 따라내고, 고체를 건조 질소 스트림 하에 공기 건조시켜 표제 화합물 (650 mg, 100%)을 수득하였다. UPLC 방법 B: C57H83NO22에 대한 계산치 1133.54, 관찰치 m/e: 1134.64 [M+1]; Rt = 2.08 min.
단계 C: 메틸 6-{[3-(-α-L-푸코피라노실)프로필](2-[2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실}-옥시]에틸)아미노}헥사노에이트 히드로클로라이드
메탄올 (5 mL) 중 메틸 6-{[3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필](2-[2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실}-옥시]에틸)아미노}헥사노에이트 (650 mg, 0.577 mmol)의 용액에 conc. HCl (0.142 mL, 1.73 mmol)을 첨가하고, 질소로 플러싱하고, 10% 탄소 상 팔라듐 (61 mg)을 첨가하고, 수소의 풍선 하에 3시간 동안 교반하였다. 0.4 마이크로미터 시린지 팁 필터를 통해 여과하고, 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 물 (4 mL)에 용해시키고, 동결건조시켜 표제 화합물 (531 mg, 100%)을 수득하였다. UPLC 방법 B: C39H66N2O24에 대한 계산치 863.40, 관찰치 m/e: 864.43 [M+1]; Rt = 1.64 min.
단계 D: 3-(2-{([α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시)에틸}{6-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-6-옥소헥실}아미노)프로필 α-L-푸코피라노시드
메틸 6-{[3-(-α-L-푸코피라노실)프로필](2-[2-{-α-D-만노피라노실-(1→3)-[-α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실}-옥시]에틸)아미노}헥사노에이트 히드로클로라이드로부터 ML-XX 단계 F 및 G에 대해 개략된 절차에 따라 제조하였다. UPLC 방법 B: C39H66N2O24에 대한 계산치 946.40, 관찰치 m/e: 947.51 [M+1]; Rt = 3.55 min.
실시예 58
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 4-(2-{([α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시)에틸}{6-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-6-옥소헥실}아미노)부틸 α-L-푸코피라노시드 (ML-58)의 합성이 기재된다.
Figure pct00317
단계 A: 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필 메탄술포네이트
무수 DCM (100 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로판올 [ML-36 단계 D] (10.6 g, 22.2 mmol) 및 휘니그 염기 (4.66 mL, 26.7 mmol)의 용액을 빙조에서 냉각시키고, 여기에 메탄술포닐 클로라이드 (1.9 mL, 24.5 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 완전히 첨가한 후에 빙조 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (100 mL), sat. NaCl (50 mL)로 세척하고; Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 표제 화합물 (12.6 g, 100%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.37 (15H, m), 4.80 (2H, m), 4.68 (2H, m), 4.63 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.53 (1H, J = 11.8 Hz), 4.22 (2H, m), 4.00 (1H, d, J = 9.8 Hz), 3.94 (1H, m), 2.99 (3H, s), 1.88 (1H, m), 1.75 (2H, m), 1.62 (1H, m), 1.31 (3H, d, J = 6.6 Hz).
단계 B: 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄니트릴
무수 DMF (30 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)프로필 메탄술포네이트 (3 g, 5.4 mmol)의 용액에 아지드화나트륨 (422 mg, 6.49 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 60℃에서 밤새 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 물 (100 mL)로 희석하고, Et2O (3 x 30 mL)로 추출하고; Et2O 층을 합하고, sat. NaCl (30 mL)로 세척하고; Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코; 120 g) (용리액: 구배 0-70% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물 (6 g, 76%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.29 (15H, m), 4.80 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.69 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.65 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.54 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.95 (2H, m), 3.79 (3H, m), 2.37 (2H, m), 1.80 (2H, m), 1.62 (2H, m), 1.31 (3H, d, J = 6.6 Hz).
단계 C: 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄산
에탄올 (100 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄니트릴 (6 g, 12.36 mmol)의 혼합물을 물 (100 mL) 및 5N NaOH (25 mL, 124 mmol)로 처리하고, 생성된 혼합물을 환류 온도에서 3일 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 에탄올을 증발에 의해 제거하고, 나머지 수성 물질을 conc. HCl을 첨가하여 산성화시키고, EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하고; EtOAc 층을 합하고, sat. NaCl (100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 표제 화합물 (5.2 g, 83%)을 담황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.40-7.30 (15H, m), 4.79 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.65 (2 H, m), 4.53 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.01 (1H, m), 3.92 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.78 (2H, m), 2.39 (2H, m), 1.75 (2H, m), 1.59 (2H, m), 1.30 (3H, d, J = 6.6 Hz).
단계 D: 4-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄-1-올
무수 THF (100 mL) 중 3-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄산 (5.2 g, 10.3 mmol)의 빙조 냉각된 용액에 보란-테트라히드로푸란 착물 (THF 중 1M 용액 12.3 mL, 12.3 mmol)을 천천히 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온으로 가온하고, 3일 동안 교반하였다. 혼합물을 메탄올 (5 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, sat. NaCl (200 mL)로 희석하고, EtOAc (2 x 150 mL)로 추출하고; EtOAc 층을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 120g) (용리액: 구배 0-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.73 g, 34%)을 투명한 오일로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.40-7.28 (15H, m), 4.79 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.66 (2 H, m), 4.54 (1H, d, J = 11.9 Hz), 3.99 (1H, m), 3.93 (1H, m), 3.80 (3H, m), 3.65 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.67 (2H, m), 1.60-1.41 (4H, m), 1.30 (3H, d, J = 6.6 Hz).
단계 E: 4-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄알
DCM (50 mL) 중 4-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄-1-올 (1.73 g, 3.53 mmol)의 용액에 데스-마르틴 시약 (2.24 g, 5.29 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 sat. NaHCO3 (100 mL)으로 세척하고; Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 80g) (용리액: 구배 0-80% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.24 g, 72%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 9.77 (1H, s), 7.40-7.28 (15H, m), 4.80 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.78 (1H, J = 12.0 Hz), 4.71 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.66 (2H, m), 4.54 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.98 (1H, m), 3.92 (1H, m), 3.83-3.76 (3H, m), 2.43 (2H, m), 1.80-1.63 (2H, m), 1.62-1.48 (2H, m), 1.30 (3H, d, J = 6.6 Hz).
단계 F: 4-(2-{([α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실]옥시)에틸}{6-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-6-옥소헥실}아미노)부틸 α-L-푸코피라노시드
4-(2,3,4-트리-O-벤질-α-L-푸코피라노실)부탄알로부터 ML-57에 대해 개략된 절차에 따라 제조하였다. UPLC 방법 B: C40H68N2O24에 대한 계산치 960.42, 관찰치 m/e: 961.48 [M+1]; Rt = 3.46 min.
실시예 59
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-L-푸코피라노실)프로필]아미노)에틸 α-D-만노피라노시드 (ML-59)의 합성이 기재된다.
Figure pct00318
단계 F에서의 2-아미노에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드를 2-아미노에틸 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C27H46N2O14에 대한 계산치 622.29, 관찰치 m/e = 623.3231 [M+1]; Rt = 1.16 min.
실시예 60
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-L-푸코피라노실)프로필]아미노)에틸 β-D-만노피라노시드 (ML-60)의 합성이 기재된다.
Figure pct00319
단계 A: 벤질 (2-((4,6-디-O-벤조일-β-D 갈락토피라노실)옥시)에틸)카르바메이트
벤질 (2-((4,6-디-O-벤조일-β-D 갈락토피라노실)옥시)에틸)카르바메이트 (9.4 g, 26.3 mmol)에 3 g의 4 Å 분말화된 분자체를 첨가하고, 혼합물을 무수 톨루엔 (100 mL)에 현탁시켰다. 이 혼합물에 디부틸주석 (IV) 옥시드 (14.21 g, 57.1 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 95℃에서 5시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후에, 빙조에서 냉각시키고, 벤조일 클로라이드 (6.66 mL, 57.3 mmol)를 적가하였다. 형성된 미세한 백색 침전물에, 무수 아세토니트릴 (15 mL)을 첨가하고, 실온에서 48 hr 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 실리카 겔 상 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 330 g) (용리액: 0-50% EtOAc/헥산 (8cv); 및 50% EtOAc/헥산 (10cv))에 의해 정제하여 표제 화합물 (11.56 g, 78 %)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (2H, d, J = 7.7 Hz), 8.04 (2H, dd, J = 7.9 및 1.4 Hz), 7.58 (2H, m), 7.45 (4H, m), 7.36-7.29 (5H, m), 5.53 (1H, m), 5.14 (1H, dd, J = 10.1 및 3.3 Hz), 5.06 (2H, s), 4.64 (1H, dd, J = 11.5 및 6.3 Hz), 4.55 (1H, dd, J = 11.5 및 6.6 Hz), 4.4 (1H, d, J = 7.7 Hz), 4.24 (1H, t, J = 4.2 Hz), 4.08 (1H, t, J = 8.8 Hz), 3.93 (2H, m), 3.76 (1H, m), 3.48 (1H, m), 3.37 (1H, m), 3.28 (1H, d, J = 3.3 Hz), 2.80 (1H, d, J = 5.3 Hz).
단계 B: 벤질 (2-((((3,5-비스(트리플루오로메틸)술포닐)옥시)-4,6-디-O-벤조일-β-D 갈락토피라노실)옥시)에틸)카르바메이트
DCM (200 mL) 중에 용해된 벤질 (2-((4,6-디-O-벤조일-β-D 갈락토피라노실)옥시)에틸)카르바메이트 (11.56 g, 20.44 mmol)의 용액을 -15℃로 냉각시키고, 여기에 피리딘 (21.5 mL, 266 mmol)을 첨가한 후에 트리플산 무수물 (10.36 mL, 61.3 mmol)을 천천히 첨가하고, 생성된 혼합물을 0℃로 3 시간에 걸쳐 가온시켰다. 혼합물을 추가의 DCM (200 mL)으로 희석하고, 빙냉 1N HCl (500 mL), 빙냉 sat. NaHCO3 (500 mL) 및 빙냉 sat. NaCl (500 mL)로 세척하고; Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 표제 화합물 (16.9 g, 100%)을 황색 발포체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.16 (2H, dd, J = 8.0 및 1.4 Hz), 8.04 (2H, dd, J = 8.1 및 1.4 Hz), 7.65 (2H, m),7.52 (2H, m), 7.50 (2H, m), 7.39 (4H, m), 7.33 (1H, m), 5.55 (1H, dd, J = 10.4 및 3.1 Hz), 5.50 (1H, d, J = 3.1 Hz), 5.35 (1H, t, J = 6.4 Hz), 5.14 (2H, s), 5.12 (1H, m), 4.77 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.73 (1H, m), 4.28 (2H, m), 4.06 (1H, m), 3.80 (1H, m), 3.55 (1H, m), 3.47 (1H, m).
단계 C: 벤질 (2-((3,5-디-O-아세틸-4,6-디-O-벤조일-β-D 만노피라노실)옥시)에틸)카르바메이트
무수 톨루엔 (100 mL) 중 벤질 (2-((((3,5-비스(트리플루오로메틸)술포닐)옥시)-4,6-디-O-벤조일-β-D 갈락토피라노실)옥시)에틸)카르바메이트 (16.9 g, 20.37 mmol)의 용액에 톨루엔 (150 mL) 및 DMF (4 mL)의 혼합물 중 테트라 부틸암모늄 아세테이트 (25 g, 82.9 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. CH2Cl2 (30 mL)로 희석하고, sat. NaCl (2 x 100mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: 330g) (용리액: 0-50% EtOAc/헥산 (10cv), 이어서 50% EtOAc/헥산 (5cv))에 의해 정제하여 표제 화합물 (8 g, 60.5%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.10 (2H, m), 7.98 (2H, dd, J = 8.1 및 1.4 Hz), 7.61 (2H, m), 7.48 (2H, t, J = 7.8 Hz), 7.46 (2H, t, J = 7.7 Hz), 7.37 (4H, m), 7.33 (1H, m), 5.70 (1H, d, J = 3.3 Hz), 5.61 (1H, t, J = 10.0 Hz), 5.29 (1H, dd, J = 10.0 및 3.3 Hz), 5.26 (1H, m), 5.10 (2H, s), 4.79 (1H, s), 4.64 (1H, dd, J = 12.1 및 2.7 Hz), 4.47 (1H, dd, J = 12.1 및 5.8 Hz), 3.94 (2H, m), 3.74 (1H, m), 3.48 (1H, m), 3.37 (1H, m), 2.15 (3H, s), 2.00 (3H, s).
단계 D: 2-아미노에틸 3,5-디-O-아세틸-4,6-디-O-벤조일-β-D 만노피라노시드
EtOAc (100 ml) 중 벤질 (2-((3,5-디-O-아세틸-4,6-디-O-벤조일-b-D 만노피라노실)옥시)에틸)카르바메이트 (8 g, 12.31 mmol)의 질소 플러싱된 용액에 10% 탄소 상 팔라듐 (1.31 g)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 수소의 풍선 하에 밤새 교반하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과물을 증발시켜 표제 화합물 (6.3 g, 99%)을 담황색 발포체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (2H, m), 7.90 (2H, m), 7.60 (2H, m), 7.47 (4H, m), 5.72 (1H, ddd, J = 9.2, 3.2 및 1.1 Hz), 5.59 (1H, t, J = 9.7 Hz), 5.33 (1H, ddd, J = 10.1, 4.8 및 3.3 Hz), 4.85 (1H, dd, J 16.0 및 1.1 Hz), 4.65 (1H, m), 4.45 (1H, ddd, J = 12.1, 5.7 및 2.0 Hz), 3.95 (2H, m), 3.73 (1H, m), 3.09 (2H, bs), 2.90 (1H, m), 2.15 (3H, s), 1.99 (3H, s).
단계 E: 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}[3-(α-L-푸코피라노실)프로필] 아미노)에틸 a-D-만노피라노시드
단계 F에서의 2-아미노에틸 3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드를 2-아미노에틸 3,5-디-O-아세틸-4,6-디-O-벤조일-β-D 만노피라노시드로 대체한 ML-36에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C27H46N2O14에 대한 계산치 622.29, 관찰치 m/e = 623.3536 [M+1]; Rt = 1.13 min.
실시예 61
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸)-α-D-만노피라노시드 (ML-61)의 합성이 기재된다.
Figure pct00320
단계 A: 2-{[2-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}에틸-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드
무수 DCM (20 mL) 중 2-옥소에틸 2,3,4,6 테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드 (1.3g, 3.33 mmol) 및 2-아미노에틸 2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노시드 (2.22 g, 6.7 mmol)의 혼합물에 TFA (0.257 mL, 3.3 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10 min 동안 교반하고, 이어서 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (1.41 g, 6.66 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 EtOAc (50mL) 및 sat. NaHCO3 (100 mL) 사이에 분배하고; 유기 층을 sat. NaCl (50 mL)로 세척하고; Na2SO4 상에서 건조시키고; 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 역상 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: C18 275g) (용리액: 구배 10-100% CH3CN/물)에 의해 정제하여 표제 화합물 (667 mg, 28%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 5.37 (1H, dd, J = 10.0 및 3.5 Hz), 5.32 (1H, d, J = 9.8 Hz), 5.29 (1H, dd, J = 3.4 및 1.9 Hz), 5.26 (1H, dd, J = 3.5 및 1.1 Hz), 5.20 (1H, dd J = 10.5 및 7.9 Hz), 5.04 (1H, dd, J 10.5 및 3.4 Hz), 4.87 (1H, d, J = 1.8 Hz), 4.50 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.32 (1H, dd, J = 12.3 및 2.5 Hz), 4.13 (1H, dd, J = 12.2 및 2.5 Hz), 4.04 (1H, m), 4.00 (1H, m), 3.86-3.79 (2H, m), 3.69 (1H, m), 3.59 (1H, m), 2.91-2.85 (4H, m), 2.19 (3H, s), 2.18 (3H, s), 2.13 (3H, s), 2.09 (3H, s), 2.07 (3H, s), 2.02 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.25 (3H, d, J = 6.4 Hz).
단계 B: 벤질 6-{[2-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)에틸](2-{[-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-a-D-만노피란]옥시}에틸)아미노}헥사노에이트
DCM (6 mL) 중 2-{[2-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}에틸-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-a-D-만노피라노시드 (667 mg, 0.943 mmol) 및 벤질 6-옥소헥사노에이트 (311 mg, 1.41 mmol)의 용액에 아세트산 (0.054 mL, 0.943 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10 min 동안 교반하고, 이어서 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (400 mg, 1.89 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. UPLC-MS는 완전한 전환을 보여주었다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 EtOAc (30 mL) 및 sat. NaHCO3 (40 mL) 사이에 분배하고; 유기 층을 sat. NaCl (20 mL)로 세척하고; Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 역상 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (텔레다인 이스코: C18 40g) (용리액: 구배 5-100% CH3CN/물)에 의해 정제하여 표제 화합물 (434 mg, 50%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.37 (5H, m), 5.35 (1H, dd, J = 9.9 및 3.1 Hz), 5.32 (1H, d, J = 9.2 Hz), 5.25 (2H, dd, J = 3.2 및 1.7 Hz), 5.19 (1H, dd, J = 10.5 및 7.9 Hz), 5.14 (2H, s), 5.04 (1H, dd, J = 10.4 및 3.5 Hz), 4.85 (1H, d, J = 1.7 Hz), 4.51 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.32 (1H, dd, J = 12.2 및 5.1 Hz), 4.12 (1H, dd, J = 12.2 및 2.5 Hz), 4.04 (1H, m), 3.93 (1H, dt, J = 9.9 및 5.9Hz), 3.85 (1H, m), 3.72 (1H, dt, J = 10.1 및 6.0 Hz), 3.59 (1H, dt, J = 9.9 및 6.6 Hz), 3.51 (1H, m), 2.74-2.71 (4H, m), 2.50 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.39 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.19 (3H, s), 2.18 (3H, s), 2.13 (3H, s), 2.07 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.01 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.70-1.66 (4H, m), 1.44 (2H, m), 1.32 (2H, m), 1.24 (3H, d, J = 6.4 Hz).
단계 C: 2-({6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸)-α-D-만노피라노시드
벤질 6-(비스{2-[(2,3,4-트리-O-벤조일-α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}아미노)헥사노에이트를 벤질 6-{[2-(2,3,4-트리-O-아세틸-α-L-푸코피라노실)에틸](2-{[-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-a-D-만노피란]옥시}에틸)아미노}헥사노에이트로 대체한 ML-35 단계 B에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: C26H44N2O15에 대한 계산치 624.27, 관찰치 m/e = 625.2990 [M+1]; Rt = 1.12.
실시예 62
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}피롤리딘-(2R,5R)--2,5-디카르복스아미드 (ML-62)의 합성이 기재된다.
Figure pct00321
단계 C에서의 2,2'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디아세트산을 (2R,5R)-피롤리딘-2,5-디카르복실산으로 대체한 ML-6에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 736.36 [M+1]; Rt = 2.22 min.
실시예 63
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}-1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}(피페리딘-4,4-디일)디아세트아미드 (ML-63)의 합성이 기재된다.
Figure pct00322
단계 C에서의 2,2'-{[6-(벤질옥시)-6-옥소헥사노일]이미노}디아세트산을 2,2'-(피페리딘-4,4-디일)디아세트산으로 대체한 ML-6에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 805.38 [M+1]; Rt = 2.35 min.
실시예 64
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥사노일}-N,N'-비스{2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}피페리딘-시스-3,4-디카르복스아미드 (ML-64)의 합성이 기재된다.
Figure pct00323
단계 A에서의 출발 물질로서 3,5-피리딘디카르복실산을 3,4-피리딘디카르복실산으로 대체한 ML-17에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 F: m/e = 777.3660 [M+1]; Rt = 2.15 min.
실시예 65
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-((3R,4R)-3,4-비스((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)카르바모일)피페리딘-1-일)헥사노에이트 (ML-65)의 합성이 기재된다.
Figure pct00324
단계 A: (3R,4R)-N3,N4-비스(2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)피페리딘-3,4-디카르복스아미드
단계 A에서의 출발 물질로서 3,5-피리딘디카르복실산을 3,4-피리딘디카르복실산으로 대체한 ML-17 단계 A 및 B에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 F: m/e = 552.2733 [M+1]; Rt = 1.37 min.
단계 B: 벤질 6-((3R,4R)-3,4-비스((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)카르바모일)피페리딘-1-일)헥사노에이트
(3R,4R)-N3,N4-비스(2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)피페리딘-3,4-디카르복스아미드 (118 mg, 0.214 mmol)를 THF (2 mL)에 용해시키고, 여기에 THF (0.5 mL) 중 벤질 6-옥소헥사노에이트 (70.7 mg, 0.321 mmol)를 첨가하고, 이어서 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (136 mg, 0.642 mmol) 및 아세트산 (3.67 μL, 0.064 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3 h 동안 교반하였다. 생성물을 0-30% AcN/물의 구배를 사용하는 C-18 칼럼 상 정제용 역상 크로마토그래피에 의해 단리하였다. UPLC 방법 F: m/e = 756.4241 [M+1]; Rt = 3.05 min
단계 C: 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-((3R,4R)-3,4-비스((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)카르바모일)피페리딘-1-일)헥사노에이트의 합성
단계 C에서의 벤질 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥사노에이트를 벤질 6-((3R,4R)-3,4-비스((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)카르바모일)피페리딘-1-일)헥사노에이트로 대체하고, 단계 D에서의 6-({2-[(α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)옥시]에틸}아미노)-6-옥소헥산산을 6-((3R,4R)-3,4-비스((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)카르바모일)피페리딘-1-일)헥산산으로 대체한 ML-1 단계 C 및 D에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다: UPLC 방법 F: m/e = 763.7796 [M+1]; Rt = 2.15 min.
실시예 66
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-((2R,5R)-2,5-비스((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)카르바모일)피페리딘-1-일)-6-옥소헥사노에이트 (ML-66)의 합성이 기재된다.
Figure pct00325
단계 A에서의 출발 물질로서 3,5-피리딘디카르복실산을 2,5-피리딘디카르복실산으로 대체한 ML-17에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 A: UPLC m/e = 777.0 [M+1]; Rt = 0.5 min.
실시예 67
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(((R)-1,4-디옥소-1-((2-(((2S,3S,4S,5S,6R)-3,4,5-트리히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)아미노)-4-((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-트리히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)아미노)부탄-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트 (ML-67)의 합성이 기재된다.
Figure pct00326
단계 A에서의 Z-ASP(OBZL)-OH를 Z-Glu-γ-Bn으로 대체하고, 2-아미노에틸 α-D-만노피라노시드를 2-아미노에틸 α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노시드로 대체한 ML-20에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 753.26 [M+1]; Rt = 1.59 min.
실시예 68
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 (ML-68)의 합성이 기재된다.
Figure pct00327
단계 A에서의 Z-ASP(OBZL)-OH를 Z-Glu-γ-Bn으로 대체한 ML-20에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 1077.52 [M+1]; Rt = 2.93 min.
실시예 69
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2-(비스(-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트 (ML-69)의 합성이 기재된다.
Figure pct00328
단계 A: 1,2,3,4-테트라키스(옥시)테트라키스(트리메틸실란) L-푸코스
DMF (25 mL) 중 L-푸코스 (4.0g, 24.37 mmol, 1.0 eq)의 용액에 0℃에서 TEA (17.32 mL, 124 mmol, 5.1 eq)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 TMS-Cl (15.88 mL, 125 mmol, 5.1 eq)을 적가하였다. 이어서 반응물을 실온으로 가온시키고, 실온에서 4 hr 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 및 헥산 혼합물 (100 mL, 1:1)에 부었다. 혼합물을 헥산 (100mL x 3)으로 추출하였다. 유기물을 물 (10 ml x 3)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 고진공 펌프 상에서 건조시켜 표제 화합물을 무색 오일 (8.7 g, 19.2 mmol, 79%)로서 수득하였다. 13C NMR (CDCl3, 125MHz) δ 94.5 (1C), 70.6 (1C), 69.6 (1C), 66.6 (1C), 39.6 (4C), 16.7 (Me), 0.67 (3Me), 0.43 (3Me), 0.29 (3Me), 0.16 (3Me); 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 5.0 (s, 1H), 4.0 (m, 1H), 3.8 (1H), 3.6 (1H), 1.0 (d, 3H), 0-0.2 (m, 36H).
단계 B: 벤질 6-(2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
DMF (10 mL) 중 2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트산 (500 mg, 3.06 mmol, 1.0 eq)의 용액에 0℃에서 TSTU (1107 mg, 3.68 mmol, 1.2 eq)에 이어 TEA (0.512 mL, 3.68 mmol, 1.2 eq)를 첨가하였다. 반응물을 rt로 가온시키고, 그 온도에서 2h 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 TEA (0.512 ml, 3.66 mmol)와 미리-혼합한 L-000503048-001W001 (1447 mg, 3.68 mmol, 1.2 eq)을 첨가하였다. 반응물을 rt에서 18 hr 동안 교반하였다. UPLC는 목적하는 생성물이 형성되었음을 나타내었다. DMF를 감압 하에 제거하였다. 조 물질을 C18 역상 크로마토그래피 (16 CV 내에 0-30%ACN/물로 용리)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축시키고, 동결건조시켜 표제 화합물을 무색 시럽으로 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 367.2356 [M+1]; Rt = 3.54 min.
단계 C: 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
DCM (10 mL) 중 벤질 6-(2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트 (210 mg, 0.573 mmo, 1.0 eq)의 용액에 0℃에서 TBAI (1820 mg, 4.93 mmol, 8.6 eq), DIPEA (0.500 ml, 2.87 mmol, 5.0 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 rt로 가온시키고, rt에서 30 min 동안 교반하였다. 상기 용액에 1,2,3,4-테트라키스(옥시)테트라키스(트리메틸실란) L-푸코스 (1557 mg, 3.44 mmol, 6.0 eq)와 DCM (10 ml) 중 아이오도트리메틸실란 (0.390 ml, 2.87 mmol, 5.0 eq)을 적가하였다. 혼합물을 rt에서 18 hr 동안 교반하였다. UPLC는 디스레드 생성물이 형성되었음을 나타내었다. DCM을 제거하고, MeOH (10 ml) 및 다우엑스 H+ 수지를 pH ~2까지 첨가하였다. rt에서 1h 동안 교반하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시키고, C18 역상 크로마토그래피 (16 CV 내에 0-30%ACN/물로 용리)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축시키고, 동결건조시켜 표제 화합물을 무색 시럽 (40 mg, 0.061 mmol, 10.6%)으로 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 659.3745 [M+1]; Rt = 3.36 min.
단계 D: 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥산산
물 (5 ml) 중 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트 (40 mg, 0.061 mmol)의 용액에 Pd/C (30.5 mg, 0.029 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 H2 풍선 하에 18 hr 동안 교반하였다. UPLC는 목적하는 생성물이 형성되었음을 나타내었다. 상기 용액을 MeOH (5 mL)로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축시키고, 동결건조시켜 표제 화합물을 무색 시럽 (20 mg, 6.1%)으로 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 569.3191 [M+1]; Rt = 1.93 min.
단계 E: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2-(비스(-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
DMF (1 mL) 중 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥산산 (20 mg, 0.037 mmol, 1.0 eq)의 용액에 TSTU (16.68 mg, 0.055 mmol, 1.5 eq)에 이어 휘니그 염기 (7.74 μl, 0.044 mmol, 1.2 eq)를 첨가하였다. 반응물을 rt에서 1h 동안 교반하였다. TLC(4/1/1/1 EtOAc/MeOH/ACN/물)은 출발 물질이 남아있지 않음을 나타내었다. UPLC는 pdt가 형성되었음을 나타내었다. DMF를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 정제하지 않고 사용하였다. UPLC 방법 B: m/e = 666.3351 [M+1]; Rt = 2.28 min.
실시예 70
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2-(비스(-[(α-L-푸코피라노실)옥시)프로필)아미노)아세트아미도)헥사노에이트 (ML-70)의 합성이 기재된다.
Figure pct00329
단계 A: 벤질 6-(비스(3-히드록시프로필)아미노)-6-옥소헥사노에이트
DMF (10 ml) 중 3,3'-아잔디일비스(프로판-1-올) (1000 mg, 7.51 mmol, 1.0 eq)의 용액에 벤질 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 아디페이트 (2503 mg, 7.51 mmol, 1.0 eq)에 이어 TEA (1.046 ml, 7.51 mmol, 1.0 eq)를 첨가하였다. 반응물을 25℃에서 18 hr 동안 교반하였다. UPLC는 목적하는 생성물이 형성되었음을 나타내었다. DMF 감압 하에 제거하였다. 조 물질을 C18 역상 크로마토그래피 (16 CV 내에 0-40% ACN/물로 용리)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축시켜 표제 화합물을 무색 오일 (1.55 g, 4.41 mmol, 58.7%)로서 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 352.2171 [M+1]; Rt = 3.47 min. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 7.3-7.5 (m, 5H), 5.15 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 3.40 (m, 5H), 2.66 (s, 3H), 2.45 (m, 3H), 2.29 (s, 1H), 1.84 (s, 1H), 1.70 (m, 7H).
단계 B: 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)프로필)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
단계 C에서의 벤질 6-(2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트를 벤질 6-(비스(3-히드록시프로필)아미노)-6-옥소헥사노에이트로 대체한 ML-YZ-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 644.3454 [M+1]; Rt = 3.28 min.
단계 C: 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)프로필)아미노)아세트아미도)헥산산
단계 D에서의 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트를 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)프로필)아미노)아세트아미도)헥사노에이트로 대체한 ML-YZ-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 554.3076 [M+1]; Rt = 2.13 min.
단계 E: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2-(비스(-[(α-L-푸코피라노실)옥시)프로필)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
단계 E에서의 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥산산을 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)프로필)아미노)아세트아미도)헥산산으로 대체한 ML-YZ-1에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 651.3166 [M+1]; Rt = 2.41 min.
실시예 71
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)부틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트 (ML-71)의 합성이 기재된다.
Figure pct00330
단계 A: 4-(벤질옥시)-N-(4-(벤질옥시)부틸)부탄아미드
DMF (5 ml) 중 4-(벤질옥시)부탄산 (1 g, 5.15 mmol, 1.0 eq)의 용액에 0℃에서 TSTU (1.627 g, 5.41 mmol, 1.05 eq)에 이어 TEA (0.718 ml, 5.15 mmol, 1.0 eq)를 첨가하였다. 반응물을 rt로 가온시키고, rt에서 2 hr 동안 교반하였다. 상기 반응물에 4-(벤질옥시)부탄-1-아민 (0.969 g, 5.41 mmol, 1.05 eq)에 이어 TEA (0.718 ml, 5.15 mmol, 1.0 eq)를 첨가하였다. 반응물을 rt에서 18 hr 동안 교반하였다. LC-MS는 또한 목적하는 생성물이 형성되었음을 보여주었다. DMF를 감압 하에 제거하였다. 조 물질을 실리카 겔 칼럼 (120 g, 16 CV 내에 0-15% MeOH/DCM으로 용리)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축시켜 표제 화합물 (1.65 g, 4.64 mmol, 90 % 수율)을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 356.70 [M+1]; Rt = 1.22 min. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 7.2-7.4 (m, 10H), 5.98 (s, 1H), 4.51 (m, 4H), 3.53 (m, 4H), 3.24 (m, 2H), 2.28 (m, 2H), 1.96 (m, 2H), 1.5-1.7 (m, 4H).
단계 B: 비스(4-(벤질옥시)부틸)아민
200 mL 둥근 바닥 플라스크에서, THF (5 ml) 중 4-(벤질옥시)-N-(4-(벤질옥시)부틸)부탄아미드 (1.65 g, 4.64 mmol)의 용액에 0℃에서 BH3.THF (13.93 ml, 13.93 mmol)를 적가하였다. 반응물을 rt로 가온시키고, rt에서 18 hr 동안 교반하였다. TLC는 pdt가 형성되고 출발 물질이 사라졌음을 보여주었다. 반응물을 수성 포화 NH4Cl로 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, EtOAc로 희석하고, 1 N HCl과 진탕시키고, 또한 비카르보네이트, 염수 및 물로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 341.00 [M+1]; Rt = 1.06 min.
단계 C: 4,4'-아잔디일비스(부탄-1-올)
디옥산 (5 ml)/물 (5 mL)의 혼합 용매 중 비스(4-(벤질옥시)부틸)아민 (300 mg, 0.879 mmol)의 용액에 PdOH2 (30.8 mg, 0.044 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 H2 하에 40 PSI에서 18 h 동안 교반하였다. LC-MS는 출발 물질이 없고, 목적하는 생성물이 형성되었음을 보여주었다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 디옥산/물 (10 mL, 1/1)로 세척하였다. 여과물을 농축시키고, 고진공 펌프 상에서 건조시켜 표제 화합물 (130 mg, 0.806 mmol, 92 % 수율)을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 162.01 [M+1]; Rt = 0.18 min.
단계 D:: 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)부틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
단계 C에서의 벤질 6-(2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트를 벤질 6-(비스(3-히드록시부틸)아미노)-6-옥소헥사노에이트로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 644.3454 [M+1]; Rt = 3.28 min.
단계 E: 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)프로필)아미노)아세트아미도)헥산산
단계 D에서의 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트를 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)부틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 554.3076 [M+1]; Rt = 2.13 min.
단계 F: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2-(비스(-[(α-L-푸코피라노실)옥시)부틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
단계 E에서의 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥산산을 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)부틸)아미노)아세트아미도)헥산산으로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 651.3166 [M+1]; Rt = 2.41 min.
단계 G: 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)부틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
단계 C에서의 벤질 6-(2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트를 벤질 6-(비스(3-히드록시부틸)아미노)-6-옥소헥사노에이트로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 644.3454 [M+1]; Rt = 3.28 min.
실시예 72
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,3-비스-2[2-(α-L-푸코피라노실)옥시에틸)카르바모일)시클로프로판카르복실산)아미노)아세트아미도))헥사노에이트 (ML-72)의 합성이 기재된다.
Figure pct00331
단계 A: 2,3-비스-2[2-(α-L-푸코피라노실)옥시에틸)카르바모일)시클로프로판카르복실산
DMF (10ml) 중 L-000719504-000X003 (353 mg, 2.027 mmol)의 용액에 EDC (816 mg, 4.26 mmol) 및 HOBT (93 mg, 0.608 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 30 min 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 AEF (882 mg, 4.26 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 18 hr 동안 교반하였다. UPLC는 목적하는 생성물이 형성되었음을 나타내었다. DMF를 감압 하에 제거하였다. 조 물질을 C18 역상 크로마토그래피 (37 min 내에 0-30% ACN/물 + 0.05% TFA로 용리)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 표제 화합물 (80 mg, 0.145 mmol, 7.14 % 수율)을 수득하였다. UPLC 방법 B: m/e = 553.2539 [M+1]; Rt = 2.63 min.
단계 B:: 벤질 6-(2,3-비스-2[2-(α-L-푸코피라노실)옥시에틸)카르바모일)시클로프로판카르복실산)아미노)아세트아미도)헥사노에이트
단계 B에서의 2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트산을 2,3-비스-2[2-(α-L-푸코피라노실)옥시에틸)카르바모일)시클로프로판카르복실산으로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 756.3689 [M+1]; Rt = 3.15 min.
단계 C: 6-(2,3-비스-2[2-(α-L-푸코피라노실)옥시에틸)카르바모일)시클로프로판카르복실산)아미노)아세트아미도)헥산산
단계 D에서의 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트를 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 666.3151 [M+1]; Rt = 1.23 min.
단계 D: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,3-비스-2[2-(α-L-푸코피라노실)옥시에틸)카르바모일)시클로프로판카르복실산)아미노)아세트아미도))헥사노에이트
단계 E에서의 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥산산을 6-(2,3-비스-2[2-(α-L-푸코피라노실)옥시에틸)카르바모일)시클로프로판카르복실산)아미노)아세트아미도)헥산산으로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 763.3411 [M+1]; Rt = 1.99 min.
실시예 73
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-y l6-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)헥사노에이트 (ML-73)의 합성이 기재된다.
Figure pct00332
단계 A: per-TMS D-만노스
단계 A에서의 L-푸코스를 D-만노스로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 4.9 (s, 1H), 3.5-3.9 (m, 6H), 0-0.3 (m, 45H).
단계 B: 2,3,4,6-테트라-O-트리메틸실란 D-만노피라노실
DCM (25 ml) 중 per-TMS D-만노스 (5.4 g, 9.98 mmol)의 용액에 0℃에서 아이오도트리메틸실란 (1.426 ml, 10.48 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 rt로 가온시키고, rt에서 1 hr 동안 교반하였다. DCM을 감압에 의해 제거하였다. 중간체를 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
단계 C: 3-아이오도프로폭실 알파-D-만노피라노시드 및 3-아이오도프로폭실 베타-D-만노피라노시드
DCM (10 ml) 중 2,3,4,6-테트라키스(트리메틸실란) D-만노피라노실 (2.89 g, 4.99 mmol)의 용액에 0℃에서 옥세탄 (0.488 ml, 7.49 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 rt로 가온시키고, rt에서 5 hr 동안 교반하였다. DCM을 회전증발기에 의해 제거하였다. 혼합물을 MeOH (10 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 다우엑스 H+ 수지를 pH ~2까지 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 1hr 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 생성물이 형성되었음을 나타내었다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축시키고, C8 역상 크로마토그래피 (25 min 내에 5-25% ACN/물 + 0.05% TFA로 용리)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 3-아이오도프로폭실 알파-D-만노피라노시드 (710 mg, 2.04 mmol, 40.8%) 및 3-아이오도프로폭실 베타-D-만노피라노시드 (420 mg, 1.21 mmol, 24.2%)를 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 696.96 [M+1]; Rt = 0.46 min 및 Rt = 0.53 min. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) 3-아이오도프로폭실 베타-D-만노피라노시드: δ 4.54 (d, J = 0.95 Hz, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.88-3.92 (m, 2H), 3.75 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.45 (m, 1H), 3.3-3.4 (m, 2H), 3.23 (m, 1H), 2.1 (m, 2H). 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) 3-아이오도프로폭실 알파-D-만노피라노시드: δ 4.81 (m, 1H), 3.8-3.9 (m, 3H), 3.6-3.8 (m, 3H), 3.5-3.6 (m, 2H), 3.3-3.4 (m, 2H), 2.1(m, 2H).
단계 D: α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}프로필 알파-D-만노피라노시드
DMF (5 mL) 중 3-아이오도프로폭실 알파-D-만노피라노시드 (220 mg, 0.632 mmol)의 용액에, AEF (131 mg, 0.632 mmol) 및 LiOH (15.13 mg, 0.632 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 24 hr 동안 교반하였다. UPLC는 pdt가 형성되었음을 나타내었다. DMF를 감압 하에 제거하였다. 조 물질을 정제하지 않고 다음 단계를 수행하였다. UPLC 방법 B: m/e = 428.2252 [M+1]; Rt = 1.02 min.
단계 E: 벤질 6-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)헥사노에이트
단계 A에서의 α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}프로필 알파-D-만노피라노시드를 α-L-푸코피라노실)에틸]아미노}프로필 알파-D-만노피라노시드로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 646.3233 [M+1]; Rt = 3.13 min.
단계 F: 6-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노) 헥산산
단계 D에서의 벤질 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥사노에이트를 벤질 6-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)헥사노에이트로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 556.2731 [M+1]; Rt = 1.77 min.
단계 G: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)헥사노에이트
단계 E에서의 6-(2-(비스(2-[(α-L-푸코피라노실)옥시)에틸)아미노)아세트아미도)헥산산을 6-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노) 헥산산으로 대체한 ML-69에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 653.3008 [M+1]; Rt = 2.09 min.
실시예 74
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-옥소-(6-((3-베타-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)헥사노에이트 (ML-74)의 합성이 기재된다.
Figure pct00333
단계 A-F에서의 알파-D-만노스를 베타-D-만노피라노스로 대체한 ML-73에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 653.3167 [M+1]; Rt = 2.07 min.
실시예 75
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 8-옥소-(6-((3-베타-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)옥탄디에이트 (ML-75)의 합성이 기재된다.
Figure pct00334
단계 A-F에서의 알파-D-만노스를 베타-D-만노피라노스로 대체하고, 벤질 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 아디페이트를 벤질 8-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥탄디에이트로 대체한 ML-73에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 681.3568 [M+1]; Rt = 2.44 min.
실시예 76
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 8-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)옥탄디에이트 (ML-76)의 합성이 기재된다.
Figure pct00335
벤질 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 아디페이트를 벤질 8-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥탄디에이트로 대체한 ML-73에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 681.3456 [M+1]; Rt = 2.21 min.
실시예 77
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 9-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노)노난디오에이트 (ML-77)의 합성이 기재된다.
Figure pct00336
벤질 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 아디페이트를 벤질 9-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 노난디오에이트로 대체한 ML-73에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 695.3532 [M+1]; Rt = 2.55 min.
실시예 78
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 10-옥소-(6-((3-알파-D-만노피라노실)프로필-α-L-푸코피라노실)에틸]아미노) 데칸디오에이트 (ML-78)의 합성이 기재된다.
Figure pct00337
벤질 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 아디페이트를 벤질 10-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 데칸디오에이트로 대체한 ML-73에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 709.3766 [M+1]; Rt = 2.79 min.
실시예 79
하기 구조를 갖는 올리고사카라이드 링커 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-만노피라노실]옥시}프로필)-6-옥소헥산아미드 (ML-79)의 합성이 기재된다.
Figure pct00338
단계 A: 3-아지도프로폭실 β-D-만노피라노시드
DMF (10 ml) 중 3-아이오도프로폭실 β-D-만노피라노시드 (2.0 g, 5.74 mmol)의 용액에 아지드화나트륨 (448 mg, 0.448 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 60℃로 가온시키고, 이 온도에서 12 hr 동안 N2 하에 교반하였다. LC-MS는 목적하는 생성물이 형성되었음을 나타내었다. DMF를 감압 하에 제거하였다. 조 물질을 C18 역상 크로마토그래피 (16 CV 내에 0-20%ACN/물, 이어서 100%ACN (2 CV), 0%ACN (2CV)으로 용리)에 의해 정제하였다. 목적하는 pdt를 함유하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 표제 화합물 (1.27 g, 4.82 mmol, 84 % 수율)을 수득하였다. LC-MS 방법 A: m/e = 264.16 [M+1]; Rt = 0.21. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 4.53 (m, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.97 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 3.56 (m, 1H), 3.48 (m, 3H), 3.22 (m, 1H), 1.92 (m, 2H).
단계 B: 2,4-벤조일 3-아지도프로폭실 β-D-만노피라노시드
아세토니트릴 (15 ml) 중 3-아지도프로폭실 β-D-만노피라노시드 (1030 mg, 3.91 mmol)의 용액에 트리에틸 오르토벤조에이트 (2.352 ml, 10.17 mmol)에 이어 TFA (0.030 ml, 0.391 mmol) 및 ACN (0.5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 회전증발기에 의해 ACN을 제거하였다. TFA (물 중 10%) (4.28 ml, 5.55 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 2시간 동안 교반하였다. 잔류물을 에테르/CH2Cl2로 용리하는 실리카 겔 상 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 상기 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.0 - 8.2 (m, 10H), 5.72 (dd, 1H, J = 3.4 Hz, J = 1.1 Hz), 5.44 (t, 1H, J = 9.6 Hz), 4.79 (d, 1H, J=1.1 Hz), 4.16 (dd, 1H, J = 3.4 Hz, J = 1.1 Hz), 4.00 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.66 (m, 2H), 3.31 (m, 2H), 1.82 (m, 2H).
단계 C: 2-아지도프로폭실 2,4-디-O-벤조일-3,6-O-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-만노피라노실)-β-D-만노피라노시드
단계 B에서의 2-아지도에틸 2,4-비스-O-벤조일-6-O-트리틸-α-D-만노피라노시드를 2,4-벤조일 3-아지도프로폭실 β-D-만노피라노시드로 대체한 ML-2에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.0- 8.3 (m, 50H), 6.2 (m, 2H), 5.95 (m, 2H), 5.85 (m, 2H), 5.70 (m, 1H), 5.35 (m, 2H), 5.22 (s, 1H), 3.0-5.0 (m, 15H), 1.90 (m, 2H).
단계 D: 6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-N-(2-{[α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-β-D-만노피라노실]옥시}프로필)-6-옥소헥산아미드
ML-2 단계 D-F에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여 표제 화합물을 제조하였다. UPLC 방법 B: m/e = 787.3816 [M+1]; Rt = 3.39 min.
실시예 80
A1 보호된 인슐린의 합성이 기재된다.
적절한 크기의 용기에서, 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 생성된 용액에 보호 시약, 예를 들어 에틸 트리플루오로아세테이트 또는 9-플루오레닐메틸 펜타플루오로페닐 카르보네이트를 그대로 또는 유기 용매, 예컨대 DMSO 또는 DMF의 용액으로 첨가하였다. UPLC 크로마토그램이 반응 혼합물의 상당한 부분이 A1-보호된 인슐린으로 전환되었음을 보여준 후에, 반응 혼합물을 직접 역상 HPLC 정제 (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 적용하거나, 또는 반응물을 냉각된 산성 H2O (20x, pH 약 3.0)로 0℃에서 조심스럽게 희석하여 켄칭할 수 있으며, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통하거나 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시킬 수 있다. 이어서, 농축된 용액을 역상 HPLC 정제 (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 적용하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 NA1 보호된 인슐린을 수득하였다.
실시예 81
NA1-트리플루오로아세틸 인슐린의 합성이 기재된다.
100 둥근 바닥 플라스크에 인슐린 (300 mg, 0.052 mmol)을 채우고, 여기에 8 mL DMSO에 이어 TEA (43.4 mg, 0.429 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 약 30 분 동안 투명한 용액을 수득할 때까지 부드럽게 교반하였다. 생성된 용액에 에틸 트리플루오로아세테이트 (35.2 mg, 0.248 mml)를 첨가하였다. rt에서 4 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 H2O (100 mL, pH=3.00)로 조심스럽게 희석하였다. 그의 부피를 10 MWCO 아미콘 울트라-15 원심분리 튜브를 사용하여 20 mL로 감소시킨 후에, 생성된 용액을 HPLC (크로마실® C8 10 μm, 100 Å, 210 nm에서 50x250 mm 칼럼, 85 mL/min의 유량, 0.05% TFA/AcCN/H2O, 26% AcCN - 37% AcCN/H2O, 20 min 램프)에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 합하고, 동결-건조시켜 NA1-트리플루오로아세틸 인슐린을 수득하였다. UPLC 방법 A: m/e = 1476.55 [(M+4)/4]; Rt = 3.62 min.
실시예 82
본 실시예는 IOC-143의 합성을 보여준다.
DMSO (1.2 mL) 중 NA1-트리플루오로아세틸 인간 인슐린 (77.7 mg, 0.013 mmol)의 용액에 rt에서 TEA (18 μL, 0.132 mmol) 및 DMSO (300 μL) 중 ML-11 (30.2 mg, 0.039 mmol)의 용액을 첨가하였다. rt에서 4시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 AcCN (40 mL)에 첨가하였다. 침전물을 원심분리를 통해 수집하였다. 수집된 고체를 물 (5 mL, pH = 3.00)에 용해시키고, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 여기에 NH4OH의 용액 (5 mL, 물 중 28%)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2 hr 동안 교반하고, 이어서 물 (20 mL, pH = 3.00)로 희석하였다. 생성된 용액의 부피를 10K MWCO 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 장치를 사용하여 5 mL로 감소시키고, 추가로 물 (100 mL, pH = 3.00)을 사용하여 약 7.5 mL의 최종 부피로 투석여과하고, 이를 HPLC에 의해 정제하여 IOC-143을 수득하였다. UPLC 방법 A: Rt = 3.58 min; m/e = 1801.906.
실시예 83
NA1-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐] 인간 인슐린 (N1-Fmoc 인슐린)의 합성이 기재된다.
인슐린 (1.5g, 0.258 mmol)을 20 ml 섬광 바이알에서 DMSO (6 mL)에 용해시켰다. 인슐린 용액에 DMSO (1 mL) 중 9-플루오레닐메틸 펜타플루오로페닐 카르보네이트 (0.105 g, 0.258 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반하였다.
생성물을 C-4 역상 칼럼 상에서 길슨 HPLC 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 목적하는 분획 (제1-용리 단량체)을 수집하고, 동결건조시켜 목적하는 NαA1-Fmoc 인슐린 생성물을 수득하였다. UPLC MS (C4, 5분): 4.47분에서 1508.37 (M+4/4).
실시예 84
A1,B29 보호된 인슐린 또는 A1,B28 보호된 인슐린 리스프로의 합성이 기재된다.
적절한 크기의 용기에서, 인슐린을 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 rt에서 유기 용매 또는 혼합된 aq/유기 용매, 예를 들어 DMSO 중에 현탁시켰다. 혼합물을 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 생성된 용액에 보호 시약, 예를 들어 에틸 트리플루오로아세테이트 또는 9-플루오레닐메틸 펜타플루오로페닐 카르보네이트를 그대로 또는 유기 용매, 예컨대 DMSO 또는 DMF의 용액으로 첨가하였다. UPLC 크로마토그램은 반응 혼합물의 상당한 부분이 A1,B29-보호된 인슐린 (A1,B28-보호된 인슐린 리스프로)으로 전환되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 직접 역상 HPLC 정제 (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 적용하거나, 또는 반응물을 냉각된 산성 H2O (20x, pH ~ 3.0)로 0℃에서 조심스럽게 희석하여 켄칭시킬 수 있으며, 그의 pH는 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시킬 수 있다. 이어서, 농축된 용액을 역상 HPLC 정제 (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 적용하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 85
NA1,NεB29-비스(트리플루오로아세틸)인간 인슐린의 합성이 기재된다.
100 둥근 바닥 플라스크에 인간 인슐린 (300 mg, 0.052 mmol)을 채우고, 여기에 AcCN (6.0 mL), 물 (6.0 mL), 및 DIPEA (1.5 mL, 8.59 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물에 0℃에서 에틸 트리플루오로아세테이트 (0.9 mL, 7.54 mml)를 첨가하였다. 0℃에서 2 hr 동안 교반한 후에, 혼합물을 HPLC (크로마실® C8 10 μm, 100 Å, 210 nm에서 50x250 mm 칼럼, 85 mL/min의 유량, 0.05% TFA/AcCN/H2O, 27% AcCN-37% AcCN/H2O, 20 min 램프)에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 합하고, 동결-건조시켜 NA1,NεB29-비스(트리플루오로아세틸)인간 인슐린을 수득하였다. UPLC 방법 A: m/e = 1500.677 [(M+4)/4]; Rt = 3.87 min.
실시예 86
NA1,NεB29-비스[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]인간 인슐린의 합성이 기재된다.
20 mL 섬광 바이알에서, 인간 인슐린 (1.19 g, 0.205 mmol) 및 TEA (257 μL, 1.844 mmol)를 DMSO (10 mL)에 용해시켰다. 이 인슐린 용액에 DMSO (2 mL) 중 1-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (207 mg, 0.615 mmol)을 첨가하였다. rt에서 30 min 동안 교반한 후에, 반응물을 HCl (1.84 mL, 1.844 mmol, 1.0 M)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 NA1,NεB29-비스[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]인간 인슐린을 수득하였다. UPLC 방법 A: m/e = 1564.04 [(M+4/4)]; Rt = 4.41 min.
실시예 87
인슐린의 NA1 및 NεB29상의 동일한 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성.
적절한 크기의 용기에서, 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 모든 비변형된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 A1,B29-접합된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올의 첨가에 의해 켄칭하였다. 반응 용액을 rt에서 30 min 동안 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 통상적으로 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크.(PolyLC Inc.), 250x21 mm, 5 m, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다. 목적하는 순도를 갖는 A1,B29-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 88
인슐린의 NA1상의 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성
적절한 크기의 용기에서, 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 대부분의 비변형된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 A1-접합된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올의 첨가에 의해 켄칭하였다. 반응 용액을 rt에서 30 min 동안 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 통상적으로 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다. 목적하는 순도를 갖는 A1-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 89
인슐린의 NB1 상의 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성
NB1 인슐린 접합체는 실시예 50에 따라 제조할 수 있다. 또는 기질로서 보호된 인슐린을 사용하여 제조할 수 있다:
적절한 크기의 용기에서, 보호된 인슐린, 예를 들어 NA1,NεB29-비스[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]- 또는 NA1,NεB29-비스(트리플루오로아세틸)인간 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 보호된 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 모든 비변형된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 B1-접합된 보호된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 저온에서 과량의 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올 또는 암모니아를 첨가하여 켄칭하였다. 반응 용액을 저온에서 UPLC 크로마토그램이 보호기의 완전한 제거를 나타낼 때까지 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 통상적으로 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다. 목적하는 순도를 갖는 B1-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 90
인슐린의 NεB29 상의 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성
적절한 크기의 용기에서, 인슐린을 rt에서 부드럽게 교반하면서 혼합 용매: 2:3 v/v 0.1 M Na2CO3:AcCN에 용해시켰다. 혼합물을 정화한 후에, pH를 알칼리성 용액, 예를 들어 0.1 N NaOH를 사용하여 10.5-10.8의 값으로 조정하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 대부분의 비변형된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 B29-접합된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올의 첨가에 의해 켄칭하였다. 반응 용액을 rt에서 30 min 동안 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 통상적으로 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다. 목적하는 순도를 갖는 B29-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/물; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 91
인슐린의 NB1 및 NεB29 상의 동일한 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성
적절한 크기의 용기에서, 보호된 인슐린, 예를 들어 NA1-(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐- 또는 NA1-(트리플루오로아세틸)인간 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 보호된 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 모든 비변형된 보호된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 B1,B29-접합된 보호된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 저온에서 과량의 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올 또는 암모니아를 첨가하여 켄칭하였다. 반응 용액을 저온에서 UPLC 크로마토그램이 보호기의 완전한 제거를 나타낼 때까지 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 통상적으로 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다. 목적하는 순도를 갖는 B1,B29-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 92
인슐린의 NA1, NB1, 및 NεB29 상의 동일한 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성
적절한 크기의 용기에서, 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 모든 비변형된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 A1-, B1-, 및 B29-접합된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올의 첨가에 의해 켄칭하였다. 반응 용액을 rt에서 30 min 동안 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 통상적으로 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다.
목적하는 순도를 갖는 A1, B1, B29-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 93
인슐린의 NA1 및 NεB29 상의 상이한 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성
적절한 크기의 용기에서, NεB29-접합된 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 모든 비변형된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 A1,B29-접합된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올의 첨가에 의해 켄칭하였다. 반응 용액을 rt에서 30 min 동안 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용할 수 있었다. 목적하는 순도를 갖는 A1,B29-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 94
인슐린의 NB1 및 NεB29 상의 동일한 링커-올리고사카라이드와의 접합체의 합성
적절한 크기의 용기에서, 보호된 인슐린, 예를 들어 NεB29-(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐- 또는 NA1-(트리플루오로아세틸)인간 인슐린을 rt에서 염기, 예를 들어 TEA의 존재 하에 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 현탁시켰다. 혼합물을 보호된 인슐린이 완전히 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 활성화된 에스테르 중간체를 rt에서 유기 용매, 예를 들어 DMSO에 용해시켰다. 활성화된 에스테르의 용액의 분취물을 UPLC 크로마토그램이 모든 비변형된 보호된 인슐린이 반응하였고, 반응 혼합물의 상당한 부분이 A1,B1-접합된 보호된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 소정의 기간 동안 인슐린을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 저온에서 과량의 아민 친핵체, 예를 들어 2-아미노에탄올 또는 암모니아를 첨가하여 켄칭하였다. 반응 용액을 UPLC 크로마토그램이 보호기의 완전한 제거를 나타낼 때까지 저온에서 교반하였다. 생성된 용액을 0℃에서 냉각된 H2O (20x)로 조심스럽게 희석하고, 그의 pH를 1 N HCl (및 필요한 경우에 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 용액을 우선 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 통해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 유닛 (1K, 3K 또는 10K MWCO 막 사용)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 용액은 통상적으로 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다. 목적하는 순도를 갖는 B1,B29-접합체를 함유하는 분획을 합하고, TFF 시스템 또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성된 용액을 역상 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 동결-건조시키거나 또는 TFF 시스템 및/또는 아미콘 울트라-15를 사용하여 완충제 교환하여 표제 생성물을 수득하였다.
실시예 95
NεB29-(트리플루오로아세틸)인간 인슐린의 합성이 기재된다.
100 둥근 바닥 플라스크에 인간 인슐린 (200 mg, 0.034 mmol)을 채우고, 여기에 AcCN (4.0 mL), 물 (4.0 mL), 및 TEA (0.5 mL, 3.44 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물에 0℃에서 에틸 트리플루오로아세테이트 (0.41 mL, 3.44mml)를 첨가하였다. 0℃에서 30 min 동안 교반한 후에, 혼합물을 물 (20 mL, pH ~ 3.0)로 희석하였다. 생성된 용액을 pH ~ 2.5까지 조심스럽게 산성화시킨 후에, 혼합물을 HPLC (델타 Pak C4 15 μm, 300 Å, 210 nm에서 50x250 mm 칼럼, 85 mL/min의 유량, 0.05% TFA/AcCN/H2O, 27% AcCN-37% AcCN/H2O, 20 min 램프)에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 합하고, 동결-건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. UPLC 방법 A: m/e = 1476.5012 [(M+4)/4]; Rt = 3.71 min.
실시예 96
링커 ML-7에 대해 B1 및 B29에서 접합된 인간 인슐린인 IOC-3의 합성.
NαA1-Tfa- 인슐린 (60 mg, 0.01 mmol)을 rt에서 1 ml DMSO에 용해시키고, 이 용액에 트리에틸아민 (10.3 mg, 0.102 mmol)을 첨가하고, ML-7 (18.2 mg, 0.023 mmol)을 100 uL DMSO에 용해시키고, 반응 혼합물에 첨가하였다. rt에서 4시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 40 ml AcCN에 첨가하였다. 침전물이 형성되었고, 원심분리에 의해 수집하였다. 수집된 고체를 5 mL PH=3.00 DI 수에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 이어서 5 mL NH4OH (물 중 28%)를 물 용액에 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하하고, 이어서 20 mL DI 수 PH=3.00으로 희석하였다. 혼합물을 10K 막 아미콘 원심분리 튜브를 사용하여 5 mL로 농축시키고, 100 mL PH=3.00 DI 수를 사용하여 약 7.5 mL의 최종 부피로 추가로 투석여과하고, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. HPLC 조건은 다음과 같으며: 크로마실® C8 10 μm, 100 Å, 210 nm에서 50x250 mm 칼럼, 85 mL/min의 유량, 0.05% TFA/AcCN/H2O, 26% AcCN-32% AcCN/H2O, 25 min 램프; 분획을 수집하고, 동결건조시켜 분말을 수득하였다. (38.8 mg, 수율 52.4%) 1784.76[M+4]/4, tR=3.435
실시예 97
본 실시예는 올리고사카라이드 링커 ML-11이 인간 인슐린의 위치 B1 및 B29에서 NH2 기에 연결된 인슐린 올리고사카라이드 접합체 (IOC-123)의 제조를 보여준다.
NαA1-Fmoc 인슐린 (80 mg, 0.014 mmol) 및 링커 ML-11 (100 mg, 0.068 mmol)을 30 min 동안 실온까지 가온시켰다. 20 mL 바이알에서 DMSO (1.00 mL) 중 NαA1-Fmoc 인슐린 (80 mg, 0.014 mmol)에 트리에틸아민 (18.95 μL, 0.136 mmol)을 첨가하였다. DMSO (0.90 mL) 중 ML-11 (100 mg, 0.068 mmol)을 반응 바이알에 3개의 동등한 부분으로 50분 간격으로 첨가하였다. 반응을 2-아미노에탄올 (103 μL, 1.700 mmol)을 첨가하여 켄칭하고, 혼합물을 실온에서 20 min 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃에서 H2O (10 mL)로 희석하였다. 반응 혼합물의 pH를 1 N HCl을 사용하여 약 2.5가 되도록 조정하였다.
조 생성물을 우선 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 아미콘 울트라 원심분리 필터를 사용하여 농축시키거나 또는 밤새 동결건조시키고, 이어서 역상 정제용 HPLC (길슨 C-4 칼럼)에 의해 추가로 정제하였다. 합한 목적하는 분획을 동결건조시켜 고체를 생성하였다. 이어서, 고체를 물에 용해시키고, pH를 0.1N NaOH 용액을 사용하여 7로 조정하여, IOC-123의 용액을 생성하였다.
실시예 98
본 실시예는 인간 인슐린의 A1 및 B1 위치가 ML-17에 접합된 IOC-113 (NA1, NβB29-비스{6-[시스-3,5-비스({2-[(α-L-푸코피라노실)옥시]에틸}카르바모일)피페리딘-1-일]-6-옥소헥사노일}인간 인슐린)의 합성을 설명한다.
인간 인슐린 (105 mg, 0.018 mmol)을 함유하는 20 mL 섬광 바이알에 실온에서 DMSO (1 mL) 및 DIPEA (35.1 mg, 0.271 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 인슐린이 용해될 때까지 부드럽게 교반하였다. 개별 바이알에서, 링커 ML-17 (35.1 mg, 0.045 mmol)을 실온에서 DMSO (0.9 mL)에 용해시켰다. 인간 인슐린을 함유하는 용액에 ML-17의 용액을 3개의 동등한 부분으로 50분 간격으로 첨가하였다. 반응을 2-아미노에탄올 (34 μL, 0.42 mmol)을 첨가하여 켄칭하였다. 실온에서 20 min 동안 교반한 후에, 생성된 혼합물을 0℃에서 냉각된 H2O (4 mL)로 조심스럽게 희석하였다. 생성된 혼합물의 pH를 1 N HCl (또는 0.1 N NaOH)을 사용하여 2.5의 최종 pH로 조정하였다. 혼합물을 우선 이온 교환 크로마토그래피 (폴리술포에틸 A 칼럼, 폴리LC 인크., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Å; 완충제 A: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN; 완충제 B: 0.1%(v/v)H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)에 적용하였다. 주요 생성물로서 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고, 약 7.0의 pH로 중화시킨 후에 아미콘-15 MWCO 3k 또는 10k 울트라 원심분리 필터를 사용하여 농축시키거나 또는 동결-건조시켰다. 이어서, 생성된 용액 또는 재구성된 접합체 용액을 역상 정제용 HPLC (워터스 C4 250x50 mm 칼럼, 10 μm, 1000 Å 칼럼 또는 크로마실 C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å 칼럼; 완충제 A: 0.05-0.1% TFA/탈이온수; 완충제 B: 0.05-0.1% TFA/AcCN)에 의해 추가로 정제하였다. > 95 % 표제 접합체를 함유하는 분획을 합하고 동결-건조시켜 표제 생성물을 수득하였다. UPLCMS (C4, 5분): 3.48 min에서 1948.66 (M+4/4).
실시예 99
본 실시예는 인간 인슐린의 A1 및 B1 잔기가 각각 링커 ML-4 및 ML-29에 접합된 IOC-52 (NA1-6-옥소-6-((2-(α-L-푸코피라노실옥시)에틸)아미노)헥사노일-NεB29 -6-((((2-옥소-2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)-2-옥시에틸)아미노)(2-옥소-2-((α-L-푸코피라노실옥시)-2-옥소에틸)아미노)에틸)아미노)아세트아미도)-6-옥소헥사노일 인간 인슐린)의 구축을 보여준다.
NεB29-6-((((2-옥소-2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)-2-옥시에틸)아미노)(2-옥소-2-((α-L-푸코피라노실옥시)-2-옥소에틸)아미노)에틸)아미노)아세트아미도)-6-옥소헥사노일 인간 인슐린 (IOC-58)의 합성
인간 인슐린 (1000 mg, 0.172 mmol)을 수성 Na2CO3 (8.6 mL, 0.1 M) 및 AcCN (5.7 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액의 pH를 10.5로 조정하고, 여기에 DMF (2.9 mL) 중 ML-29 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-((((2-옥소-2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)-2-옥시에틸)아미노)(2-옥소-2-((α-L-푸코피라노실옥시)-2-옥소에틸)아미노)에틸)아미노)아세트아미도)-6-옥소헥사노에이트) (289 mg, 0.258 mmol)의 용액을 부분으로 나누어 첨가하였다. 반응 진행을 UPLC-MS에 의해 모니터링하고, 반응을 에탄올아민 (52.1 μL, 0.861 mmol)을 첨가하여 켄칭하였다. 반응 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석하고, pH를 1.0 N HCl 용액을 사용하여 약 2.5로 조정하였다. 생성된 혼합물을 HPLC (이온 크로마토그래피, 폴리술포에틸 A, 9.4 x 250 mm, 구배 10-45%) (이동상 A: 0.1% (v/v) H3PO4 /25% 아세토니트릴/물, 이동상 B: 0.1% (v/v) H3PO4/25%아세토니트릴/0.5M NaCl/ 물) - 30 min, 유량 15 mL/분)에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 합하고, 울트라셀(Utracel) 10K를 사용하는 6 아미콘 울트라 원심분리 필터를 3500 rpm에서 사용하여 4℃에서 농축시키고, 동결-건조시켜 표제 화합물 (600 mg, 51% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. UPLC 방법 A: tR = 3.58분. [M+4H/4]+ = 1703.99.
NA1-6-옥소-6-((2-(α-L-푸코피라노실옥시)에틸)아미노)헥사노일-NεB29-6-((((2-옥소-2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)-2-옥시에틸)아미노)(2-옥소-2-((α-L-푸코피라노실옥시)-2-옥소에틸)아미노)에틸)아미노)아세트아미도)-6-옥소헥사노일 인간 인슐린의 합성
DMSO (1.5 mL) 중 NεB29-6-((((2-옥소-2-((α-D-만노피라노실-(1→3)-[α-D-만노피라노실-(1→6)]-α-D-만노피라노실)-2-옥시에틸)아미노)(2-옥소-2-((α-L-푸코피라노실옥시)-2-옥소에틸)아미노)에틸)아미노)아세트아미도)-6-옥소헥사노일 인간 인슐린 (150 mg, 0.022 mmol) 및 TEA (30.7 μL, 0.22 mmol)의 용액에 실온에서 DMSO (1.0 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-옥소-6-((2-(α-L-푸코피라노실옥시)에틸)아미노)헥사노에이트 (17 mg, 0.040 mmol) (ML-4)의 용액을 부분으로 나누어 첨가하였다. 반응을 에탄올아민 (13.32 μL, 0.22 mmol)을 첨가하여 켄칭하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석하고, pH를 1.0 N HCl 용액을 사용하여 약 2.5로 조정하였다. 생성된 혼합물을 HPLC (이온 크로마토그래피, 폴리술포에틸 A, 9.4 x 250 mm, 구배 10-40% ) (이동상 A: 0.1% (v/v) H3PO4 /25%아세토니트릴/물, 이동상 B: 0.1% (v/v) H3PO4/25%아세토니트릴/0.5M NaCl/물) - 30 min, 유량 15 mL/분)에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 합하고, 울트라셀 10K를 사용하는 2 아미콘 울트라 원심분리 필터를 3500 rpm에서 사용하여 4℃에서 농축시켰다. 생성된 혼합물을 HPLC (C4, 50x250 mm, 구배 25-30% AcCN/H2O + 0.1% TFA - 30 min, 유량 85 mL/분) 상에서 정제하였다. 목적하는 분획을 합하고, 동결-건조시켜 표제 화합물 (31mg, 19% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. UPLC 방법 A: tR = 3.79 min. [M+4H/4]+ = 1783.3.
실시예 100
링커 ML-6에 대해 B1 및 B29에 접합된 인간 인슐린인 IOC-10의 합성
A1 Fmoc 인슐린 (80 mg, 0.014 mmol) 및 링커 ML-6 (100 mg, 0.068 mmol)을 30 min 동안 실온까지 가온시켰다; 20 mL 바이알에서 DMSO (1.00 mL) 중 A1 Fmoc 인슐린 (80 mg, 0.014 mmol)에 트리에틸아민 (18.95 μL, 0.136 mmol)을 첨가하였다. DMSO (0.90 ml) 중 링커 ML-6 (100 mg, 0.068 mmol)를 반응 바이알에 3개의 동등한 부분으로 50분 간격으로 첨가하였다. 반응을 2-아미노에탄올 (103 μl, 1.700 mmol)을 첨가하여 켄칭하고, 혼합물을 실온에서 20 min 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃에서 H2O (10 mL)로 희석하였다. 반응 혼합물의 pH를 1 N HCl을 사용하여 약 2.5가 되도록 조정하였다.
조 생성물을 우선 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 아미콘 울트라 원심분리 필터를 사용하여 농축시키거나 또는 밤새 동결건조시키고, 이어서 역상 정제용 HPLC (길슨 C-4 칼럼)에 의해 추가로 정제하였다. 합한 목적하는 분획을 동결건조시켰다. 이어서, 고체를 물에 용해시키고, pH를 0.1N NaOH 용액을 사용하여 7로 조정하였다. 샘플의 농도를 람다 바이오+UV＼Vis 분광계 (λ 276에서)에 의해 측정하였다. UPLCMS (C4, 5분): 3.72분에서 1763.3 (M+4/4).
실시예 101
각각 링커 ML-31 및 ML-54에 대해 B1 및 B29에서 접합된 인간 인슐린인 IOC-226의 합성.
NαA1-Tfa-인슐린 (40 mg, 0.0067 mmol)을 rt에서 1 ml DMSO에 용해시키고, 이 용액에 DIPEA (0.038ml, 0.215 mmol)를 첨가하고, ML-54 (11.5 mg, 0.0078 mmol)를 115 uL DMSO에 용해시키고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 2h 동안 또는 UPLC 크로마토그램이 반응 혼합물의 상당한 부분이 B29-접합된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때가지 교반하였다. 이어서, 제2 활성화된 에스테르, ML-31 (16 mg, 0.014 mmol)을 160 uL DMSO에 용해시키고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 16h 동안 또는 UPLC 크로마토그램이 반응 혼합물의 광범위한 부분이 B1, B29-접합된 인슐린으로 전환되었음을 보여줄 때까지 교반하였다. 혼합물을 40 ml AcCN에 첨가하였다. 침전물이 형성되었고, 원심분리에 의해 수집하였다. 수집된 고체를 5 mL PH=3.00 DI 수에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 이어서 5 mL NH4OH (물 중 28%)를 물 용액에 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 20 mL DI 수 PH=3.00으로 희석하였다. 혼합물을 10K 막 아미콘 원심분리 튜브를 사용하여 3 mL로 농축시키고, 60 mL PH=3.00 DI 수를 사용하여 약 5 ml의 최종 부피로 추가로 투석여과하였다. 조 생성물을 우선 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 아미콘 울트라 원심분리 필터를 사용하여 농축시키고, 이어서 역상 정제용 HPLC에 의해 추가로 정제하였다. HPLC 조건은 다음과 같으며: 크로마실® C8 10 μm, 100 Å, 210 nm에서 50x250 mm 칼럼, 85 mL/min의 유량, 0.05% TFA/AcCN/H2O, 27% AcCN-33% AcCN/H2O, 25 min 램프; 분획을 수집하고, 동결건조시켜 분말을 수득하였다. 이어서, 고체를 물에 용해시키고, pH를 0.1N NaOH 용액을 사용하여 7로 조정하였다. 샘플의 농도를 람다 바이오+UV＼Vis 분광계 (λ 276에서)에 의해 측정하였다. (16.53 mg, 수율 29.2%) 1632.54[M+5]/5, tR=3.35
실시예 101
인슐린 수용체 결합 검정을 다음과 같이 수행하였다.
2가지 경쟁 결합 검정을 사용하여 내인성 리간드, 125[I]로 표지된 인슐린에 비한 인간 인슐린 수용체 유형 B (IR(B))에 대한 IOC 친화도를 결정하였다.
방법 E: IR 결합 검정은 인간 IR(B)를 과다발현하는 CHO 세포를 사용하는 전세포 결합 방법이었다. 세포를 10% FBS 및 항생제 (G418, 페니실린/스트렙타비딘)를 함유하는 F12 배지에서 성장시키고, 96-웰 조직 배양 플레이트에 적어도 8 hr 동안 40,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 이어서, 1% BSA (인슐린-무함유)를 함유하는 DMEM 배지로 밤새 교체하여 세포를 혈청 고갈시켰다. 세포를 1% BSA (인슐린-무함유)를 함유하는 냉각된 DMEM 배지로 2회 세척한 후에 90 μL의 동일한 배지 중 적절한 농도의 IOC 분자를 첨가하였다. 세포를 얼음 상에서 60 min 동안 인큐베이션하였다. 125[I]-인슐린 (10 μL)을 0.015 nM 최종 농도로 첨가하고, 얼음 상에서 4 hr 동안 인큐베이션하였다. 세포를 냉각된 배지로 3회 부드럽게 세척하고, 30 μL의 세포 신호전달 용해 완충제 (cat #9803)로 10 min 동안 실온에서 진탕시키면서 용해시켰다. 용해물을 섬광 액체에 첨가하고, 계수하여 IR에 대한 125[I]-인슐린 결합 및 이러한 상호작용에 대한 IOC 분자의 적정 효과를 결정하였다.
방법 D: IR 결합 검정을 10% FBS 및 항생제 (G418, 페니실린/스트렙타비딘)를 함유하는 F12 배지에서 성장시킨 인간 IR(B)을 과다발현하는 CHO 세포로부터 준비한 세포 막을 사용하여 384-웰 포맷의 섬광 근접 검정 (SPA)으로 실행하였다. 세포 막은 5 mM MgCl2를 함유하는 50 mM 트리스 완충제, pH 7.8 중에 준비하였다. 검정 완충제는 50 mM 트리스 완충제, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0.1% BSA 및 프로테아제 억제제 (컴플리트-미니-로슈)를 함유하였다. 세포 막을 WGA PVT PEI SPA 비드 (5 mg/ml 최종 농도)에 첨가한 후에 적절한 농도의 IOC 분자를 첨가하였다. 실온에서 5-15 min 인큐베이션한 후에, 125[I]-인슐린을 50 μL의 최종 총 부피에 대해 0.015 nM 최종 농도로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 내지 12시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션한 후에 섬광 계수하여 IR에 대한 125[I]-인슐린 결합 및 이러한 상호작용에 대한 IOC 분자의 적정 효과를 결정하였다.
실시예 102
인슐린 수용체 인산화 검정을 다음과 같이 수행하였다.
인슐린 수용체 인산화 검정을 상업적으로 입수가능한 메조 스케일 디스커버리 (MSD) pIR 검정 (참조: 메조 스케일 디스커버리, 메릴랜드주 게이더스버그 9238 게이더스 로드)을 사용하여 수행하였다. 인간 IR(B)을 안정하게 발현하는 CHO 세포를 10% FBS 및 항생제 (G418, 페니실린/스트렙타비딘)를 함유하는 F12 세포 배지 중에 적어도 8시간 동안 성장시키고, 이어서 밤새 성장 동안 FBS 대신 0.5% BSA (인슐린-무함유)를 함유하는 F12 배지로 교체하여 혈청 고갈시켰다. 세포를 수거하고, MSD pIR 검정에 사용하기 위해 분취하여 동결시켰다. 간략하게, 동결 세포를 96-웰 (40,000개 세포/웰, 방법 A 및 B) 또는 384-웰 (10,000개 세포/웰, 방법 C) 투명 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 회수하였다. 적절한 농도의 IOC 분자를 첨가하고, 세포를 8 min 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지를 흡인하고, 냉각된 MSD 세포 용해 완충제를 MSD 키트 설명서에 따라 첨가하였다. 세포를 얼음 상에서 40 min 동안 용해시킨 후에, 용해물을 10분 동안 실온에서 혼합하였다. 용해물을 MSD 키트 pIR 검출 플레이트로 전달하였다. 나머지 검정은 MSD 키트 권장 프로토콜에 따라 수행하였다.
실시예 103
인간 대식세포 만노스 수용체 1 (MRC1) 결합 검정을 다음과 같이 수행하였다.
MRC1에 대한 경쟁 결합 검정은 문헌에 보고된 바와 같이 리간드인, DELFIA Eu-N1-ITC 시약으로 표지된 만노실화-BSA를 사용하였다. 항-MRC1 항체 (2 ng/μl에서 25 μl)를 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 및 0.1% 트윈-20 (세척 완충제)을 함유하는 100 μl의 50 mM 트리스 완충제, pH 7.5로 3회 세척한 단백질 G 플레이트에 첨가하였다. 항체를 플레이트 중에서 1 hr 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 3-5회 세척한 후에 1% 안정화제 BSA를 함유하는 25 μl PBS 중 MRC1 (2 ng/μl 최종 농도)을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 hr 동안 부드럽게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하였다. 12.5 μl의 완충제 중 적절한 농도의 IOC 분자를 첨가하고, 이어서 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 및 0.2% 안정화제 BSA를 함유하는 50 mM 트리스, pH 7.5 중 12.5 μl의 Eu-만노실화-BSA (0.1 nM 최종 농도)를 첨가하였다. 플레이트를 2 hr 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션한 후에, 세척 완충제로 3회 세척하였다. 퍼킨 엘머 Eu-유도제 시약 (25 μl)을 첨가하고, 30 min 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 Eu 신호를 검출하였다 (여기 = 340 nm: 방출 = 615 nm). 검정을 96-웰 플레이트에서 수동 액체 분배 (방법 F) 또는 자동화 액체 분배 (방법 G)를 사용하거나 또는 384-웰 플레이트에서 자동화 분배 (방법 H)를 사용하여 수행하였다.
실시예 104
하기 표는 상기 기재된 일반적 방법 중 하나에 따라 적절한 중간체를 사용하여 제조된 접합체를 열거한다. 이들 접합체는 별표로 표시된 UPLC 방법 A 또는 UPLC 방법 D, 또는 #로 표시된 UPLC 방법 G를 사용하여 특성화하였으며, 특정 체류 시간 (Rt)에 모 화합물의 4 하전된, 즉 [(M+4)/4], (또는 5 하전된, 즉 [(M+5)/5]) 종을 나타낸다. 인슐린 수용체 (IR)에 대한 그의 시험관내 생물학적 활성을 하기와 같이 라벨링된, 상기 기재된 바와 같은 리간드 경쟁 검정 또는 기능적 인산화 검정에 의해 측정하였다: 방법 A: 수동 액체 분배를 사용하는 96-웰에 기초한 IR 인산화 검정; 방법 B: 자동화 액체 분배를 사용하는 96-웰에 기초한 IR 인산화 검정; 방법 C: 자동화 액체 분배를 사용하는 384-웰에 기초한 IR 인산화 검정; 방법 D: IR 결합 검정 방법 D; 방법 E: IR 결합 검정 방법 E; 방법 F: MRC1 검정은 수동 액체 분배를 사용하여 96-웰 플레이트에서 수행하였다; 방법 G: MRC1 검정은 자동돠 액체 분배를 사용하여 96-웰 플레이트에서 수행하였다; 방법 H: MRC1 검정은 자동화 분배를 사용하여 384-웰 플레이트에서 수행하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
<표 1>
Figure pct00339
Figure pct00340
Figure pct00341
Figure pct00342
Figure pct00343
Figure pct00344
Figure pct00345
Figure pct00346
실시예 105
비-당뇨병성 미니돼지에서 IOC의 PK 및 PD에 대한 메틸 α-D-만노피라노시드 (αMM)의 효과를 평가하였다.
2개의 경정맥 혈관 접근 포트 (VAP)가 장착된, 비-당뇨병성의 수컷 유카탄 소형 돼지를 이들 연구에 사용하였다. 동물을 연구 전에 밤새 금식시켰다. 연구 당일에, 동물을 슬링에 구속하고, 주입 및 샘플링을 위해 VAP를 접근시켰다. t=-60분에, PBS (n=3) 또는 21.2 % α-메틸 만노스 (αMM) (n=3)의 일정한 주입을 2.67 mL/kg/hr의 속도로 시작하였다. 이러한 주입은 연구 지속기간 동안 유지될 것이다. t=0 min에, 그리고 혈장 글루코스 측정을 위한 기준선 혈액 샘플 수집 후에, 동물에게 IOC를 단일 볼루스 IV로서 투여하였다. 샘플링을 혈장 글루코스 및 화합물 수준의 최종 판독물을 사용하여 90분 동안 계속하였다.
IOC는 염화나트륨 (87 mM), 페놀 (21 mM), 이염기성 인산나트륨 (26.5 mM) (오스몰랄농도 = 275 mOsm, pH = 7.4; QS + 주사용수) 중에서 17-69 nmol/mL로 제제화하였다.
샘플 수집 시점: -60 min, 0 min, 1 min, 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 45 min, 60 min, 및 90 min.
혈액을 10μg/ml 아프로티닌이 보충된 K3-EDTA 튜브에 수집하고, 수집 30분 내에 처리시까지 빙조에서 유지시켰다. 3000 rpm, 4℃에서 8 min 동안 원심분리한 후에, 혈장을 수집하고, 베크만 쿨터 AU480 화학 분석기를 사용하는 글루코스 측정 및 LC-MS에 의한 화합물 수준 측정을 위해 분취하였다.
글루코스 결과를 t=0분에서의 기준선 값에 비한 변화 %로 표현하고, IOC-2, IOC-3, IOC-8, IOC-9, IOC-16, IOC-22, IOC-23, IOC-46, IOC-48, IOC-52, IOC-56, IOC-60, IOC-75, IOC-75, 및 IOC-76에 대해 각각 도 1-14에서 보여준다.
도 1은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.69 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-2의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 2는 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-3의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 3은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-8의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 4는 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-9의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 5는 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-16의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 6은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-22의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 7은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-23의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 8은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-46의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 9는 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-48의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 10은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-52의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 11은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.69 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-56의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 12는 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.35 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-60의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 13은 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.69 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-75의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
도 14는 정맥내 (i.v.) 알파 메틸 만노스 (aMM) 용액 (2.67 mL/kg/hr의 일정한 속도로 21.2% w/v 주입) 또는 PBS를 주입하는 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에의 0.17 nmol/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후 IOC-76의 혈청 농도의 플롯을 보여준다.
IOC-2, IOC-3, IOC-16, IOC-22, IOC-23, IOC-52, IOC-56, 및 IOC-60에 대한 PK 결과를 각각 도 15-22에서 보여준다.
도 15는 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.69 nmol/kg에서의 접합체 IOC-2의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
도 16은 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.17 nmol/kg에서의 접합체 IOC-3의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
도 17은 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-16의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
도 18은 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-22의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
도 19는 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-23의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
도 20은 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-52의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
도 21은 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.69 nmol/kg에서의 접합체 IOC-56의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
도 22는 PBS 주입 또는 i.v. 알파 메틸 만노스 (aMM)의 주입 조건 하의 0.35 nmol/kg에서의 접합체 IOC-60의 i.v. 주사 후 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병성 수컷 유카탄 미니돼지 (연구당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선을 보여준다.
본 발명은 예시된 실시양태를 참조하여 본원에 기재되어 있으나, 본 발명이 이에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술을 갖고 본원에 교시에 따를 수 있는 자는 본 발명의 범위 내에서 추가의 변형 및 실시양태를 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 오직 본원에 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> Merck Sharp & Dohme Corp. Lin, Songnian Yan, Lin Kekec, Ahmet Zhu, Yuping Hunter, David N Huo, Pei Fen, Danquing Nargund, Ravi Moyes, Christopher R Zhao, Zinqiang pipik, Brenda Pissarnitski, Dmitri Duffy, Joseph L <120> GLUCOSE-RESPONSIVE INSULIN CONJUGATES <130> 23616 <150> 61/886,717 <151> 2013-10-04 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Insulin lispro B-chain <400> 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Insulin aspart B-chain <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Insulin glulisine B-chain <400> 5 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asn Lys Thr 20 25 30 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Insulin glargine A-chain <400> 6 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Insulin glargine B-chain <400> 7 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Analog of the insulin A chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is threonine or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is asparagine, glycine, alanine, glutamine, glutamate, threonine, or serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is asparagine, glycine, alanine, glutamine, glutamate, threonine, or serine <400> 8 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Analog of the insulin B chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is histidine or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is alanine, glycine or serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is histidine, aspartic acid, glutamic acid, homocysteic acid or cysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is histidine, aspartic acid, glutamic acid, homocysteic acid or cysteic acid <400> 9 Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly 1 5 10 15 Glu Arg Gly Phe Phe 20 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Analog of the insulin B chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is phenylalanine or desamino-phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is phenylalanine or desamino-phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is histidine and threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is alanine, glycine or serine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is histidine, aspartic acid, glutamic acid, homocysteic acid or cysteic acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is threonine or alanine <400> 10 Xaa Val Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa 20 25

Claims (78)

  1. 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하며, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스인 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 제2 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있는 아미노산에 공유 연결된 것인 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제2 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제3 사카라이드를 포함하는 제3 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제4 사카라이드를 포함하는 제4 리간드에 연결된 것인 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 제2 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된 것인 접합체.
  6. 제4항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제3 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제5 사카라이드를 포함하는 제5 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제6 사카라이드를 포함하는 제6 리간드에 연결된 것인 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 제3 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커 및 제2 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된 것인 접합체.
  8. 제4항 또는 제6항에 있어서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 사카라이드가 각각 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 접합체.
  9. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 사카라이드를 포함하는 리간드를 포함하는 선형 링커에 추가로 공유 연결된 것인 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 접합체.
  11. 제1항에 있어서, 인슐린 유사체가 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데테미르, 또는 인슐린 글루리신인 접합체.
  12. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 사카라이드 결합 분자의 부재 하에 투여되었을 때 혈청 사카라이드의 혈청 농도에 감수성인 약역학적 (PD) 또는 약동학적 (PK) 프로파일을 나타내는 것인 접합체.
  13. 제12항에 있어서, 혈청 사카라이드가 글루코스 또는 알파-메틸만노스인 접합체.
  14. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되었을 때 내인성 사카라이드 결합 분자에 60 mg/dL 이하의 혈청 글루코스 농도에서 결합하는 것인 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 내인성 사카라이드 결합 분자가 인간 만노스 수용체 1인 접합체.
  16. 제1항에 있어서, 하기 화학식 I을 갖고:
    <화학식 I>
    Figure pct00347

    상기 식에서
    (i) 각 경우의
    Figure pct00348
    는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
    (ii) 각 경우의
    Figure pct00349
    는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    (iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
    (iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
    (v) -B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이고, 각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vi) n은 1, 2, 또는 3이며,
    단 적어도 1개의 X는 푸코스인 접합체.
  17. 제1항에 있어서, 하기 화학식 II를 포함하고:
    <화학식 II>
    Figure pct00350

    상기 식에서
    (i) 각 경우의
    Figure pct00351
    는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
    (ii) 각 경우의
    Figure pct00352
    는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    (iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
    (iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
    (v) -B1은 -T-
    Figure pct00353
    -푸코스이고, 여기서
    Figure pct00354
    은 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vi) -B2는 -T-
    Figure pct00355
    -X이고, 여기서 X는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하는 리간드이고;
    Figure pct00356
    는 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vii) n은 1, 2, 또는 3인 접합체.
  18. 제1항에 있어서, 링커가 하기 화학식을 갖고:
    Figure pct00357

    Figure pct00358

    Figure pct00359

    Figure pct00360

    Figure pct00361

    Figure pct00362

    Figure pct00363

    여기서 파상선은 결합이 인슐린 또는 인슐린 유사체의 아미노산에 연결된다는 것을 나타내고, 각 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 푸코스를 포함하는 것인 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 각 X가 독립적으로
    Figure pct00364
    ,
    Figure pct00365

    일 수 있고,
    여기서 파상선은 결합이 두자리 링커를 구성하는 원자에 연결된다는 것을 나타내는 것인 접합체.
  20. IOC-1, 1OC-2, IOC-3, IOC-4, IOC-5, IOC-6, IOC-7, IOC-8, IOC-9, IOC-10, IOC-11, IOC-12, IOC-13, IOC-14, IOC-15, IOC-16, IOC-17, IOC-18, IOC-19, IOC-20, IOC-21, IOC-22, IOC-23, IOC-24, IOC-25, IOC-26, IOC-27, IOC-28, IOC-29, IOC-30, IOC-31, IOC-32, IOC-33, IOC-34, IOC-35, IOC-36, IOC-37, IOC-38, IOC-39, IOC-41, IOC-42, IOC-43, IOC-44, IOC-45, IOC-46, IOC-47, IOC-49, IOC-50, IOC-51, IOC-52, IOC-53, IOC-54, IOC-55, IOC-56, IOC-57, IOC-58, IOC-59, IOC-60, IOC-61, IOC-62, IOC-63, IOC-64, IOC-65, IOC-66, IOC-67, IOC-68, IOC-69, IOC-70, IOC-71, IOC-72, IOC-73, IOC-74, IOC-75, IOC-76, IOC-77, IOC-78, IOC-79, IOC-80, IOC-81, IOC-82, IOC-83, IOC-84, IOC-85, IOC-86, IOC-87, IOC-88, IOC-89, IOC-90, IOC-91, IOC-92, IOC-93, IOC-94, IOC-95, IOC-96, IOC-97, IOC-98, IOC-99, 또는 IOC-100에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체.
  21. IOC-101, 1OC-102, IOC-103, IOC-104, IOC-105, IOC-106, IOC-107, IOC-108, IOC-109, IOC-110, IOC-111, IOC-112, IOC-113, IOC-114, IOC-115, IOC-116, IOC-117, IOC-118, IOC-119, IOC-120, IOC-121, IOC-122, IOC-123, IOC-124, IOC-125, IOC-126, IOC-127, IOC-128, IOC-129, IOC-130, IOC-131, IOC-132, IOC-133, IOC-134, IOC-135, IOC-136, IOC-137, IOC-138, IOC-139, IOC-140, IOC-141, IOC-142, IOC-143, IOC-144, IOC-145, IOC-146, IOC-147, IOC-149, IOC-150, IOC-151, IOC-152, IOC-153, IOC-154, IOC-155, IOC-156, IOC-157, IOC-158, IOC-159, IOC-160, IOC-161, IOC-162, IOC-163, IOC-164, IOC-165, IOC-166, IOC-167, IOC-168, IOC-169, IOC-170, IOC-171, IOC-172, IOC-173, IOC-174, IOC-175, IOC-176, IOC-177, IOC-178, IOC-179, IOC-180, IOC-181, IOC-182, IOC-183, IOC-184, IOC-185, IOC-186, IOC-187, IOC-188, IOC-189, IOC-190, IOC-191, 또는 IOC-192에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체.
  22. IOC-193, 1OC-194, IOC-195, IOC-196, IOC-197, IOC-198, IOC-199, IOC-200, IOC-201, IOC-202, IOC-203, IOC-204, IOC-205, IOC-206, IOC-207, IOC-208, IOC-210, IOC-211, IOC-212, IOC-213, IOC-214, IOC-215, IOC-216, IOC-217, IOC-218, IOC-219, IOC-220, IOC-221, IOC-222, IOC-223, IOC-224, IOC-225, IOC-226, IOC-227, IOC-228, IOC-229, IOC-230, IOC-231, IOC-232, IOC-233, IOC-234, IOC-235, IOC-236, IOC-237, IOC-238, IOC-239, IOC-240, IOC-241, IOC-242, IOC-243, IOC-244, IOC-245, IOC-246, IOC-247, IOC-248, IOC-249, IOC-250, IOC-251, IOC-252, IOC-253, IOC-254, IOC-255, IOC-256, IOC-257, IOC-258, IOC-259, IOC-260, IOC-261, IOC-262, IOC-263, IOC-264, IOC-265, IOC-266, IOC-267, IOC-268, IOC-269, IOC-270, IOC-271, 또는 IOC-272에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체.
  23. 당뇨병을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 접합체의 용도.
  24. 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 글루코스 내성 장애, 또는 당뇨병전기를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 접합체의 용도.
  25. 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이며, 이에 따라 접합체가 제공되는 것인 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 제2 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있는 아미노산에 공유 연결된 것인 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제2 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제3 사카라이드를 포함하는 제3 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제4 사카라이드를 포함하는 제4 리간드에 연결된 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 제2 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된 것인 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제3 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제5 사카라이드를 포함하는 제5 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제6 사카라이드를 포함하는 제6 리간드에 연결된 것인 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 제3 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커 및 제2 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된 것인 조성물.
  32. 제28항 또는 제30항에 있어서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 사카라이드가 각각 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 조성물.
  33. 제25항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 사카라이드를 포함하는 리간드를 포함하는 선형 링커에 추가로 공유 연결된 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 조성물.
  35. 제25항에 있어서, 인슐린 유사체가 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데테미르, 또는 인슐린 글루리신인 조성물.
  36. 제25항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 사카라이드 결합 분자의 부재 하에 투여되었을 때 혈청 사카라이드의 혈청 농도에 감수성인 약역학적 (PD) 또는 약동학적 (PK) 프로파일을 나타내는 것인 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 혈청 사카라이드가 글루코스 또는 알파-메틸만노스인 조성물.
  38. 제25항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되었을 때 내인성 사카라이드 결합 분자에 60 mg/dL 이하의 혈청 글루코스 농도에서 결합하는 것인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 내인성 사카라이드 결합 분자가 인간 만노스 수용체 1인 조성물.
  40. 제25항에 있어서, 접합체가 하기 화학식 I을 갖고:
    <화학식 I>
    Figure pct00366

    상기 식에서
    (i) 각 경우의
    Figure pct00367
    는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
    (ii) 각 경우의
    Figure pct00368
    는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    (iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
    (iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
    (v) -B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이고, 각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vi) n은 1, 2, 또는 3이며,
    단 적어도 1개의 X는 푸코스인 조성물.
  41. 제25항에 있어서, 접합체가 하기 화학식 II를 포함하고:
    <화학식 II>
    Figure pct00369

    상기 식에서
    (i) 각 경우의
    Figure pct00370
    는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
    (ii) 각 경우의
    Figure pct00371
    는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    (iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
    (iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
    (v) -B1은 -T-
    Figure pct00372
    -푸코스이고, 여기서
    Figure pct00373
    은 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vi) -B2는 -T-
    Figure pct00374
    -X이고, 여기서 X는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하는 리간드이고;
    Figure pct00375
    는 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vii) n은 1, 2, 또는 3인 조성물.
  42. 제25항에 있어서, 링커가 하기 화학식을 갖고:
    Figure pct00376

    Figure pct00377

    Figure pct00378

    Figure pct00379

    Figure pct00380

    Figure pct00381

    Figure pct00382

    여기서 파상선은 결합이 인슐린 또는 인슐린 유사체의 아미노산에 연결된다는 것을 나타내고, 각 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 푸코스를 포함하는 것인 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 각 X가 독립적으로
    Figure pct00383
    ,
    Figure pct00384

    일 수 있고,
    여기서 파상선은 결합이 두자리 링커를 구성하는 원자에 연결된다는 것을 나타내는 것인 조성물.
  44. IOC-1, 1OC-2, IOC-3, IOC-4, IOC-5, IOC-6, IOC-7, IOC-8, IOC-9, IOC-10, IOC-11, IOC-12, IOC-13, IOC-14, IOC-15, IOC-16, IOC-17, IOC-18, IOC-19, IOC-20, IOC-21, IOC-22, IOC-23, IOC-24, IOC-25, IOC-26, IOC-27, IOC-28, IOC-29, IOC-30, IOC-31, IOC-32, IOC-33, IOC-34, IOC-35, IOC-36, IOC-37, IOC-38, IOC-39, IOC-41, IOC-42, IOC-43, IOC-44, IOC-45, IOC-46, IOC-47, IOC-49, IOC-50, IOC-51, IOC-52, IOC-53, IOC-54, IOC-55, IOC-56, IOC-57, IOC-58, IOC-59, IOC-60, IOC-61, IOC-62, IOC-63, IOC-64, IOC-65, IOC-66, IOC-67, IOC-68, IOC-69, IOC-70, IOC-71, IOC-72, IOC-73, IOC-74, IOC-75, IOC-76, IOC-77, IOC-78, IOC-79, IOC-80, IOC-81, IOC-82, IOC-83, IOC-84, IOC-85, IOC-86, IOC-87, IOC-88, IOC-89, IOC-90, IOC-91, IOC-92, IOC-93, IOC-94, IOC-95, IOC-96, IOC-97, IOC-98, IOC-99, 또는 IOC-100에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  45. IOC-101, 1OC-102, IOC-103, IOC-104, IOC-105, IOC-106, IOC-107, IOC-108, IOC-109, IOC-110, IOC-111, IOC-112, IOC-113, IOC-114, IOC-115, IOC-116, IOC-117, IOC-118, IOC-119, IOC-120, IOC-121, IOC-122, IOC-123, IOC-124, IOC-125, IOC-126, IOC-127, IOC-128, IOC-129, IOC-130, IOC-131, IOC-132, IOC-133, IOC-134, IOC-135, IOC-136, IOC-137, IOC-138, IOC-139, IOC-140, IOC-141, IOC-142, IOC-143, IOC-144, IOC-145, IOC-146, IOC-147, IOC-149, IOC-150, IOC-151, IOC-152, IOC-153, IOC-154, IOC-155, IOC-156, IOC-157, IOC-158, IOC-159, IOC-160, IOC-161, IOC-162, IOC-163, IOC-164, IOC-165, IOC-166, IOC-167, IOC-168, IOC-169, IOC-170, IOC-171, IOC-172, IOC-173, IOC-174, IOC-175, IOC-176, IOC-177, IOC-178, IOC-179, IOC-180, IOC-181, IOC-182, IOC-183, IOC-184, IOC-185, IOC-186, IOC-187, IOC-188, IOC-189, IOC-190, IOC-191, 또는 IOC-192에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  46. IOC-193, 1OC-194, IOC-195, IOC-196, IOC-197, IOC-198, IOC-199, IOC-200, IOC-201, IOC-202, IOC-203, IOC-204, IOC-205, IOC-206, IOC-207, IOC-208, IOC-210, IOC-211, IOC-212, IOC-213, IOC-214, IOC-215, IOC-216, IOC-217, IOC-218, IOC-219, IOC-220, IOC-221, IOC-222, IOC-223, IOC-224, IOC-225, IOC-226, IOC-227, IOC-228, IOC-229, IOC-230, IOC-231, IOC-232, IOC-233, IOC-234, IOC-235, IOC-236, IOC-237, IOC-238, IOC-239, IOC-240, IOC-241, IOC-242, IOC-243, IOC-244, IOC-245, IOC-246, IOC-247, IOC-248, IOC-249, IOC-250, IOC-251, IOC-252, IOC-253, IOC-254, IOC-255, IOC-256, IOC-257, IOC-258, IOC-259, IOC-260, IOC-261, IOC-262, IOC-263, IOC-264, IOC-265, IOC-266, IOC-267, IOC-268, IOC-269, IOC-270, IOC-271, 또는 IOC-272에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  47. 당뇨병의 치료를 위한, 제25항 내지 제46항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  48. 제47항에 있어서, 당뇨병이 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병인 용도.
  49. 당뇨병을 가진 대상체에게 당뇨병을 치료하기 위해 소정량의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스이고, 상기 투여는 당뇨병을 치료하는 것인, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 제2 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있는 아미노산에 공유 연결된 것인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제2 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제3 사카라이드를 포함하는 제3 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제4 사카라이드를 포함하는 제4 리간드에 연결된 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 제2 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된 것인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 제3 분지형 링커에 공유 부착되고, 여기서 제1 아암은 제5 사카라이드를 포함하는 제5 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제6 사카라이드를 포함하는 제6 리간드에 연결된 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 제3 분지형 링커가 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 A1; 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B1; 인슐린 또는 인슐린 분자의 위치 B29; 인슐린 유사체 분자의 위치 B28; 또는 인슐린 유사체 분자의 위치 B3에 있고 제1 분지형 링커 및 제2 분지형 링커가 점유하지 않은 아미노산에 공유 연결된 것인 방법.
  56. 제52항 또는 제54항에 있어서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 사카라이드가 각각 독립적으로 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 방법.
  57. 제49항, 제52항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유사체가 사카라이드를 포함하는 리간드를 포함하는 선형 링커에 추가로 공유 연결된 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 방법.
  59. 제49항에 있어서, 인슐린 유사체가 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데테미르, 또는 인슐린 글루리신인 방법.
  60. 제49항, 제52항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 그를 필요로 하는 대상체에게 외인성 사카라이드 결합 분자의 부재 하에 투여되었을 때 혈청 사카라이드의 혈청 농도에 감수성인 약역학적 (PD) 또는 약동학적 (PK) 프로파일을 나타내는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 혈청 사카라이드가 글루코스 또는 알파-메틸만노스인 방법.
  62. 제49항, 제52항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되었을 때 내인성 사카라이드 결합 분자에 60 mg/dL 이하의 혈청 글루코스 농도에서 결합하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 내인성 사카라이드 결합 분자가 인간 만노스 수용체 1인 방법.
  64. 제49항에 있어서, 접합체가 하기 화학식 I을 갖고:
    <화학식 I>
    Figure pct00385

    상기 식에서
    (i) 각 경우의
    Figure pct00386
    는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
    (ii) 각 경우의
    Figure pct00387
    는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    (iii) 각 경우의 T가 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
    (iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
    (v) -B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이고, 각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vi) n은 1, 2, 또는 3이며,
    단 적어도 1개의 X는 푸코스인 방법.
  65. 제49항에 있어서, 접합체가 하기 화학식 II를 포함하고:
    <화학식 II>
    Figure pct00388

    상기 식에서
    (i) 각 경우의
    Figure pct00389
    는 접합체의 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고;
    (ii) 각 경우의
    Figure pct00390
    는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    (iii) 각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합, 또는 2가, 직쇄형 또는 분지형, 포화 또는 불포화, 임의로 치환된 C1-30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 임의로 및 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기, 또는 헤테로아릴 기에 의해 대체되고;
    (iv) 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 모이어티, 아릴알킬 모이어티, 지방족 모이어티, 아릴 모이어티, 헤테로아릴 모이어티, 또는 헤테로지방족 모이어티이고;
    (v) -B1은 -T-
    Figure pct00391
    -푸코스이고, 여기서
    Figure pct00392
    은 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vi) -B2는 -T-
    Figure pct00393
    -X이고, 여기서 X는 푸코스, 만노스, 또는 글루코스일 수 있는 사카라이드를 포함하는 리간드이고;
    Figure pct00394
    는 공유 결합, 또는 T의 X와의 공유 접합으로부터 유래된 기이고;
    (vii) n은 1, 2, 또는 3인 방법.
  66. 제49항에 있어서, 링커가 하기 화학식을 갖고:
    Figure pct00395

    Figure pct00396

    Figure pct00397

    Figure pct00398

    Figure pct00399

    Figure pct00400

    Figure pct00401

    여기서 파상선은 결합이 인슐린 또는 인슐린 유사체의 아미노산에 연결된다는 것을 나타내고, 각 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이며, 단 인슐린 또는 인슐린 유사체에 접합된 적어도 1개의 두자리 링커는 두자리 링커의 적어도 1개의 아암 상에 푸코스를 포함하는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 각 X가 독립적으로
    Figure pct00402
    ,
    Figure pct00403

    일 수 있고;
    여기서 파상선은 결합이 두자리 링커를 구성하는 원자에 연결된다는 것을 나타내는 것인 방법.
  68. IOC-1, 1OC-2, IOC-3, IOC-4, IOC-5, IOC-6, IOC-7, IOC-8, IOC-9, IOC-10, IOC-11, IOC-12, IOC-13, IOC-14, IOC-15, IOC-16, IOC-17, IOC-18, IOC-19, IOC-20, IOC-21, IOC-22, IOC-23, IOC-24, IOC-25, IOC-26, IOC-27, IOC-28, IOC-29, IOC-30, IOC-31, IOC-32, IOC-33, IOC-34, IOC-35, IOC-36, IOC-37, IOC-38, IOC-39, IOC-41, IOC-42, IOC-43, IOC-44, IOC-45, IOC-46, IOC-47, IOC-49, IOC-50, IOC-51, IOC-52, IOC-53, IOC-54, IOC-55, IOC-56, IOC-57, IOC-58, IOC-59, IOC-60, IOC-61, IOC-62, IOC-63, IOC-64, IOC-65, IOC-66, IOC-67, IOC-68, IOC-69, IOC-70, IOC-71, IOC-72, IOC-73, IOC-74, IOC-75, IOC-76, IOC-77, IOC-78, IOC-79, IOC-80, IOC-81, IOC-82, IOC-83, IOC-84, IOC-85, IOC-86, IOC-87, IOC-88, IOC-89, IOC-90, IOC-91, IOC-92, IOC-93, IOC-94, IOC-95, IOC-96, IOC-97, IOC-98, IOC-99, 또는 IOC-100에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하여 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법.
  69. IOC-101, 1OC-102, IOC-103, IOC-104, IOC-105, IOC-106, IOC-107, IOC-108, IOC-109, IOC-110, IOC-111, IOC-112, IOC-113, IOC-114, IOC-115, IOC-116, IOC-117, IOC-118, IOC-119, IOC-120, IOC-121, IOC-122, IOC-123, IOC-124, IOC-125, IOC-126, IOC-127, IOC-128, IOC-129, IOC-130, IOC-131, IOC-132, IOC-133, IOC-134, IOC-135, IOC-136, IOC-137, IOC-138, IOC-139, IOC-140, IOC-141, IOC-142, IOC-143, IOC-144, IOC-145, IOC-146, IOC-147, IOC-149, IOC-150, IOC-151, IOC-152, IOC-153, IOC-154, IOC-155, IOC-156, IOC-157, IOC-158, IOC-159, IOC-160, IOC-161, IOC-162, IOC-163, IOC-164, IOC-165, IOC-166, IOC-167, IOC-168, IOC-169, IOC-170, IOC-171, IOC-172, IOC-173, IOC-174, IOC-175, IOC-176, IOC-177, IOC-178, IOC-179, IOC-180, IOC-181, IOC-182, IOC-183, IOC-184, IOC-185, IOC-186, IOC-187, IOC-188, IOC-189, IOC-190, IOC-191, 또는 IOC-192에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하여 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법.
  70. IOC-193, 1OC-194, IOC-195, IOC-196, IOC-197, IOC-198, IOC-199, IOC-200, IOC-201, IOC-202, IOC-203, IOC-204, IOC-205, IOC-206, IOC-207, IOC-208, IOC-210, IOC-211, IOC-212, IOC-213, IOC-214, IOC-215, IOC-216, IOC-217, IOC-218, IOC-219, IOC-220, IOC-221, IOC-222, IOC-223, IOC-224, IOC-225, IOC-226, IOC-227, IOC-228, IOC-229, IOC-230, IOC-231, IOC-232, IOC-233, IOC-234, IOC-235, IOC-236, IOC-237, IOC-238, IOC-239, IOC-240, IOC-241, IOC-242, IOC-243, IOC-244, IOC-245, IOC-246, IOC-247, IOC-248, IOC-249, IOC-250, IOC-251, IOC-252, IOC-253, IOC-254, IOC-255, IOC-256, IOC-257, IOC-258, IOC-259, IOC-260, IOC-261, IOC-262, IOC-263, IOC-264, IOC-265, IOC-266, IOC-267, IOC-268, IOC-269, IOC-270, IOC-271, 또는 IOC-272에 대해 제시된 바와 같은 화학식을 갖는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하여 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법.
  71. 제49항 및 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병이 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병인 방법.
  72. 적어도 1개의 푸코스 분자를 포함하며, 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 하는 인슐린 및 인슐린 유사체 접합체; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 접합체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스인 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 제2 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 접합체.
  75. 푸코스를 포함하며, 대식세포 만노스 수용체에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정된 바와 같은 IC50 또는 IP에 대한 기능적 인슐린 수용체 인산화 검정에 의해 결정된 바와 같은 EC50 또는 IP의 비가 약 0.5:1 내지 약 1:100; 약 1:1 내지 약 1:50; 약 1:1 내지 약 1:20; 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 것을 특징으로 하는 접합체; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 당뇨병을 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병을 가진 대상체를 치료하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 접합체가 제1 아암 및 제2 아암을 갖는 적어도 1개의 분지형 링커에 공유 부착된 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자를 포함하고, 여기서 제1 아암은 제1 사카라이드를 포함하는 제1 리간드에 연결되고, 제2 아암은 제2 사카라이드를 포함하는 제2 리간드에 연결되고, 제1 사카라이드는 푸코스인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 제2 사카라이드가 푸코스, 만노스, 글루코사민, 글루코스, 비사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 분지형 트리사카라이드, 비만노스, 트리만노스, 테트라만노스, 또는 분지형 트리만노스인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병이 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병인 방법.
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