KR20160057525A

KR20160057525A - 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160057525A
Application number: KR1020140157944A
Authority: KR
Inventors: 이상원; 김영옥; 김진성
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2016-05-24

Abstract

본 발명은 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 개선 및 예방용 조성물에 관한 것으로서, 파골 세포의 분화를 억제하는 효과, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 뼈의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타내며, 본 발명에 각각의 추출물을 단독으로 사용하였을 경우보다 이들을 혼합하여 사용함으로써 고농도 인삼 추출물이 가지는 세포 독성을 방어할 수 있는 조성물로서, 골다공증 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.

Description

우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물{composition for the prevention and treatment ofosteoporosis containing Acyranthes bidentata Blume and ginseng extract}

본 발명은 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물, 또는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것으로서, 파골 세포의 활성을 억제하는 효과, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 뼈의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타내며, 본 발명에 각각의 추출물을 단독으로 사용하였을 경우보다 이들을 혼합하여 사용함으로써 고농도 인삼 추출물이 가지는 세포 독성을 방어할 수 있는 조성물로서, 골다공증 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.

골(bone)은 근육과 연합되어 있는 석회화된 결체조직으로서, 표면은 두껍고 단단한 석회화 조직으로 신체균형을 이루는 지주역할을 하며, 장기를 보호한다. 골의 안쪽은 골수조직으로 칼슘대사의 중심이 되는 부위이다. 골은 콜라겐(collagen), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin) 등 유기질(organic substance)과 칼슘, 인, 불소 등의 무기질(inorganic substance) 및 수분으로 구성되어 있다. 생체에서는 항상 골형성(bone formation)과 골흡수(bone resorption)가 일어나고 있다. 골형성은 소량의 부갑상선 호르몬이나 안드로겐, 에스트로겐, 불소, 인 등에 의하여 촉진되며, 골흡수는 물리적 감압, 무중력상태, 다량의 부갑상선 호르몬, 부신피질 스테로이드 등에 의하여 촉진된다. 따라서 골대사에는 이들 사이의 균형(balance)이 중요하다.

골다공증(osteoporosis)은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 골형성보다 과다하게 골흡수가 진행되는데 기인한 질환으로, 골다공증은 골 조직의 석회가 감소되어 골의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 골이 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다.

골의 항상성은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다.

그러나, 파골 세포의 지나친 활성이나 조골세포 활성의 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골 세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골 세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 인지되고 있다.

파골세포는 조혈모세포의 단핵구로부터 유래되는 세포로서, 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 융합하여 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다(참조: Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003 May 15;423(6937):337-42). 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase),

MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수할 수 있다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜

MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다 (참조: Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30;305(2):211-4.). 특히, 파골세포의 생존 및 골 흡수 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달 분자로 밝혀진 ERK와 NF-κB에 의해 파골세포 분화에 특이적인 AP-1 또는 NFAT가 조절될 수 있다고 보고되어 있다[Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H, Saiura A, Isobe M, Yokochi T, Inoue J, Wagner EF, Mak TW, Kodama T, Taniguchi T. Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts. Dev Cell. 2002 Dec;3(6):889-901; Asagiri M, Sato K, Usami T, Ochi S, Nishina H, Yoshida H, Morita I, Wagner EF, Mak TW, Serfling E, Takayanagi H. Autoamplification of NFATc1 expression determines its essential role in bone homeostasis. J Exp Med. 2005 Nov 7;202(9):1261-9]. 따라서, RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.

조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성과 같은 무기질화는 골의 세기를 유지시켜 줄 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 조골세포의 분화에 의한 골 형성은 세포내에서 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호전달 체계의 상호작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화와 관련된 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)가 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화와 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 타입 I 콜라겐 등이 합성됨으로써 이루어진다고 알려져 있다. 이와같은 조골세포를 활성시키기 위한 촉진제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하며, 독성이 없는 조골세포 활성 약제 및 기능성 식품의 개발이 요구되고 있다.

골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다.

한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14 ~ 18세에 가장 높고 노후에는 1 년에 약 1 %씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30 세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.

이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.

또한, 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1,300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에, 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있고 현재 골흡수 억제제의 개발이 활발히 진행되고 있다.

골다공증과 관련하여 과거에는 주로 골의 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사이상을 중심으로 그 연구가 진행되어 왔으나, 이의 발병 기전 규명에는 큰 진전을 보지 못하였다.

현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 호르몬 제제(랄록시펜), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제, 칼슘 제제 등이 있다. 그러나, 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 떨어지며 복용방법이 까다롭고 식도염을 유발시키며, 호르몬 제제는 평생 복용하여야 하며 장기 투여할 경우 유방암, 자궁암, 담석 및 혈전증 등의 부작용이 나타나고, 비타민 D 제제는 고가이며 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 고가이며 투여방법이 어렵고, 칼슘제제는 부작용은 적지만 치료보다는 예방효과에 국한되는 단점이 있다.

골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이다. 따라서, 약물을 장기투여할 때에 상기와 같은 부작용이 없고 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 필요성이 요구되고 있다.

근래에는 이러한 부작용을 최소하기 위하여 독성이 적고, 일상생활에서 식용으로 섭취가능한 식품과 약용식물 등 천연물 소재를 이용하여 골 손실의 최소화와 더불어 골 형성을 촉진시킬 수 있는 골다공증 예방 또는 치료 물질 개발에 대한 응용 연구가 다양하게 시도되고 있다. 골 흡수 저하 관련 약용식물의 연구로써 두충, 노각나무, 삼백초, 작약 등이 RANKL로 유도된 파골세포 분화를 억제시켜 골흡수가 저하된다고 하였다(Kwak et al., 2008, Tsai et al., 2008).

이에, 본 발명의 발명자들은 부작용을 최소하기 위하여 독성이 적고, 일상생활에서 식용으로 섭취가능한 식품과 약용식물 등 천연물 소재에 대하여 연구하던 중 우슬 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하면, 각각의 생약 추출물을 단독으로 사용했을 경우에 비해 고농도 인삼 추출물이 가지는 세포 독성을 방어할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 조골세포와 파골세포의 분화에 영향을 미치는 우슬 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 파골 세포의 활성을 억제하는 효과, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 뼈의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타내며, 본 발명에 각각의 추출물을 단독으로 사용하였을 경우보다 이들을 혼합하여 사용함으로써 고농도 인삼 추출물이 가지는 세포 독성을 방어할 수 있는 효과를 가지는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

이를 위하여, 본 발명은 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 인삼 추출물에 의한 세포독성이 우슬 추출물을 통해 완화되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물 10 ~ 900 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도는 10 ~ 70 ㎍/㎖일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 파골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 15 % 향상되고, TRAP 활성이 미처리군에 비해 65 ~ 75 % 감소될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 10 % 향상되고, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 30 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 석회화결절이 미처리군에 비해 25 ~ 30 % 향상될 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 인삼 추출물에 의한 세포독성이 우슬 추출물을 통해 완화되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 10 % 향상되고, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 30 ㎍/㎖ 인 경우, 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 석회화결절이 미처리군에 비해 25 ~ 30 % 향상될 수 있다.

본 발명에 따르면 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 뼈의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타낸다. 특히, 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물 10 ~ 400 중량부를 포함하는 경우, 바람직하게는 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물 100 ~ 400 중량부를 포함하는 경우 각각의 생약 추출물을 단독으로 사용했을 경우에 비해 고농도 인삼 추출물이 가지는 세포 독성을 방어할 수 있으므로 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품 또는 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 MTT assay를 통한 세포 독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 TRAP 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 TRAP 양성세포를 관찰한 이미지이다.
도 4는 우슬추출물 및 인삼추출물의 특정 혼합비에 따른 둥근모양형태파골세포(ROC) 수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 우슬추출물 및 인삼추출물의 다양한 농도별 혼합비에 따른 세포생존율 및 TRAP 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 6은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 흡수단계에서의 유전인자 평가를 위한 이미지 및 그래프이다.
도 7은 우슬추출물 및 인삼추출물의 다양한 농도별 혼합비에 따른 조골세포주의 생존율을 평가한 그래프이다.
도 8은 MC3T3-E1 세포로부터 유도되는 조골세포의 세포 생존율과 석회화결절형성을 관찰한 그래프이다.

본 발명은 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 인삼 추출물에 의한 세포독성이 우슬 추출물을 통해 완화되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공함으로써, 약물을 장기 투여하여도 독성 및 부작용이 없고 우수한 약효를 갖는 천연물 소재인 우슬 및 인삼 추출물을 이용하여 골 손실의 최소화와 더불어 골 형성을 촉진시킬 수 있는 효과가 있다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 우슬(Achyranthes bidentata Blume, AB)은 비름과에 속한 다년생 초본의 뿌리로 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin), 올레아놀릭산(oleanolic acid), 리놀레산(linoleic acid), 세린(serin), 플라보노이드(flavonoid) 및 다량의 칼슘염이 함유되어 있어 진통, 항염, 항산화, 항암 및 골형성 촉진 효과가 있는 천연물로서, 통상적으로 수확 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 그 형태 또한 특별히 제한하지 않으나 우슬의 뿌리, 줄기 및 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.

이때, 상기 우슬 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 5의 알콜, 또는 이들의 혼합 용매를 추출용매로 사용하여 제조되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물을 추출용매로 사용하여 제조되는 것이 좋다.

또한, 상기 인삼(Panax ginseng C.A Meyer,PG)은 면역기능 강화, 항암, 성기능 강화 등을 비롯한 골다공증 예방효과에 이르기까지 다양한 효과를 가지며, 특히 사포닌계의 진세노사이드(ginsenoside) Rh2는 파골세포 분화를 억제하는 효과를 가지는 천연물로서, 통상적으로 수확 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 그 형태 또한 특별히 제한하지 않으나 인삼의 뿌리, 줄기 및 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 사용하는 것이 바람직하다..

이때, 상기 인삼 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 5의 알콜, 또는 이들의 혼합 용매를 추출용매로 사용하여 제조되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물을 추출용매로 사용하여 제조되는 것이 좋다.

본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물 10 ~ 900 중량부를 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물 100 ~ 400 중량부를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 인삼 추출물은 농도가 높을수록 파골세포 분화 억제능이 우수하여 골다공증을 예방 및 개선하는 효과를 가질 수 있지만, 고농도에서 세포독성을 나타내는 문제점이 있다. 따라서, 상기 인삼추출물과 우슬 추출물을 혼합하여 사용함으로써 우슬 추출물의 항염과 항산화 작용에 의한 세포 보호작용으로 인하여 인삼추출물의 세포독성을 저감시킬 수 있는 효과가 있다.

상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물이 10 중량부 미만으로 포함되는 경우 파골세포 분화를 억제하고 조골세포 분화 활성을 돕는 인삼 추출물의 함량이 적어 골다공증 개선효과가 저하되는 문제점이 있고, 900 중량부를 초과하여 포함되는 경우 인삼 추출물이 가지는 세포 독성이 증가하는 문제점이 있다.

즉, 상기 우슬 추출물에 대하여 포함되는 인삼 추출물의 함량이 높을수록 우수한 골다공증을 개선 및 예방하는 효과를 가질 수 있으나, 인삼 추출물의 함량이 높을수록 세포 생존율이 저하될 수 있으므로 적절한 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 인삼 추출물의 농도는 10 ~ 70 ㎍/㎖ 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10 ~ 50 ㎍/㎖ 인 것이 좋다. 상기 인삼 추출물의 농도가 높을수록 우수한 골다공증을 개선 및 예방하는 효과를 가질 수 있으나, 세포 생존율이 저하될 수 있다. 이때, 상기 조성물의 농도가 10 ㎍/㎖ 미만인 경우, 파골세포 분화 억제능 및 조골세포 분화 활성이 저하되는 문제점이 있고, 100 ㎍/㎖를 초과하는 경우 인삼 추출물이 포함하는 디아세틸렌(diacetylene) 유도체에 의한 세포 독성의 영향으로 세포 생존율이 저하되는 문제점이 있다.

이때, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50㎍/㎖ 인 경우, 상기 조성물로 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 파골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 15 % 향상되고, TRAP 활성이 미처리군에 비해 65 ~ 75 % 감소할 수 있다.

또한, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 10 % 향상되고, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 30 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 석회화결절이 미처리군에 비해 25 ~ 30 % 향상될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기의 골다골증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 포함하는 의약품을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 골다공증 예방 또는 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 혼합 추출물의 양을 기준으로 1 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 300 내지 700 ㎎/㎏이며, 가장 바람직하게는 150 내지 450 ㎎/㎏이며, 하루 1~6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 골다공증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물은 파골 세포의 분화를 효과적으로 억제하고, 조골 세포의 분화 활성을 증가시키므로 골다공증 예방 또는 개선에 효과적이며, 따라서, 본 발명은 상기의 골다골증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능성 식품을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 혼합 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ∼ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 우슬추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 사에 따른 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 포함하는 조성물은 파골 세포의 분화를 효과적으로 억제하고, 조골 세포의 분화 활성을 증가시키므로 골다공증 예방 또는 개선에 효과적이며, 따라서, 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 상기의 골다골증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능성 식품을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 혼합 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

제조예 1. 우슬 추출물의 제조

우슬은 한국생약협회(Korea Medicine Herbal Association)에서 구입한 것으로, 물로 깨끗이 세척한 후 건조한 우슬을 일정간격으로 절단하여 물 1 L당 100 g의 비율로 도입하여 6 시간 동안 85℃에서 3회 반복 추출하였고, 이를 실온에서 냉각 및 여과하였다. 상기 추출물을 회전감압농축기(Rotavapor RII, Buchi, Switzerland))로 농축하였고, 이를 동결 건조(Martin Christ,Osterode Germany)하여 분말의 형태로 제조한 것을 20℃에서 보관하였다. 이때, 최종수율(yield)은 우슬 24.8 %이었다.

제조예 2. 인삼 추출물의 제조

인삼은 한국생약협회(Korea Medicine Herbal Association)에서 구입한 것으로, 뇌두가 제거된 4년근 인삼 동체를 일정간격으로 절단하여 물 1 L 당 100 g의 비율로 도입하여 6 시간 동안 85℃에서 3회 반복 추출하였고, 이를 실온에서 냉각 및 여과하였다. 상기 추출물을 회전감압농축기(Rotavapor RII, Buchi, Switzerland))로 농축하였고, 이를 동결 건조(Martin Christ,Osterode Germany)하여 분말의 형태로 제조한 것을 20℃에서 보관하였다. 이때, 최종수율(yield)은 인삼 33.3 %이었다.

실시예 1 ~ 8. 골다공증 치료 및 예방용 조성물의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 우슬 추출물 및 제조예 2에서 제조한 인삼 추출물 을 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Daegu, Korea)에 100 mg/ml의 농도로 각각 용해한 후 하기 표 1과 같은 농도로 희석하여 본 발명에 따른 골다공증 치료 및 예방용 조성물을 제조하였다.

	실사용(1:1 혼합)
	우슬 추출물의 농도 (단위:㎍/ml)	인삼추출물의 농도 (단위:㎍/ml)	혼합 조성물의 농도 (단위:㎍/ml)
실시예 1	0	0	0
실시예 2	20	20	10
실시예 3	50	50	25
실시예 4	100	100	50
실시예 5	200	200	100
실시예 6	500	500	250
실시예 7	1000	1000	500
실시예 8	2000	2000	1000

실시예 9 ~ 17. 골다공증 치료 및 예방용 조성물의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 우슬 추출물 및 제조예 2에서 제조한 인삼 추출물을 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Daegu, Korea)에 100 ㎍/ml 농도로 용해한 후 하기 표 2와 같은 비율로 혼합하여 본 발명에 따른 골다공증 치료 및 예방용 조성물을 제조하였다.

	우슬 추출물 (단위:㎕)	인삼추출물 (단위: ㎕)	비율
실시예 9	900	100	9:1
실시예 10	800	200	8:2
실시예 11	700	300	7:3
실시예 12	600	400	6:4
실시예 13	500	500	5:5
실시예 14	400	600	4:6
실시예 15	300	700	3:7
실시예 16	200	800	2:8
실시예 17	100	900	1:9

비교예 1 ~ 16. 골다공증 치료 및 예방용 조성물의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 우슬 추출물 및 제조예 2에서 제조한 인삼 추출물을 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Daegu, Korea)에 100 mg/ml의 농도로 각각 용해한 후 하기 표 3과 같은 농도로 희석하여 본 발명에 따른 골다공증 치료 및 예방용 조성물을 제조하였다.

	우슬 추출물 농도 (단위:㎍/ml)	인삼추출물 농도 (단위:㎍/ml)
비교예 1	0	-
비교예 2	10	-
비교예 3	25	-
비교예 4	50	-
비교예 5	100	-
비교예 6	250	-
비교예 7	500	-
비교예 8	1000	-
비교예 9	-	0
비교예 10	-	10
비교예 11	-	25
비교예 12	-	50
비교예 13	-	100
비교예 14	-	250
비교예 15	-	500
비교예 16	-	1000

[ 실험예 ]

이하 하기 실험예에 기재된 모든 실험군은 3개 이상 수행하였으며 정량적 결과는 대조군에 대한 백분율로 평균± 표준편차로 나타냈다. 모든 실험은 3번 이상 반복하여 동일한 실험결과로 사용하였고, two-tailed Student's t test 로 통계적 유의성을 분석하여 p<0.05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험예 1. 파골세포 생존율 측정 및 독성평가

본 발명에 따른 조성물의 파골세포에 대한 생존 및 간접적 독성평가를 위하여 MTT assay를 시행하였다. 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well 농도로 분주하여 DMEM에 10 % FBS와 1% penicillin-streptomycin 조건으로 24 시간 동안 안정화시켰다. 파골세포 분화유도를 위하여 10% FBS(Gaithersburg, MD)와 1% penicillin-streptomycin이 함유된α-MEM(Gaithersburg, MD)에 RANKL(PeproTech EC (London, England)사) 50 ng/㎖을 첨가한 뒤 상기 실시예 1 ~ 8 및 비교예 1 ~ 16의 조성물로 처리하였다.

이때, 상기 조성물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 설정하였고, 배양 3 일 후 MTT 용액(2 ㎎) 첨가하여 5% CO₂, 37℃의 배양기(incubator, 기기명)에서 2 시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 formazan crystals을 DMSO로 용해하였다. ELISA reader (BIO-RAD 450, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 4 및 도 1에 나타내었다. 이때, 도 1의 a는 비교예 1 ~ 8이고, b는 비교예 9 ~ 16이고, c는 실시예 1 ~ 8을 의미한다.

농도 (㎍/ml)	0	10	25	50	100	250	500	1000
우슬 추출물(a)	100	99.90403	101.4395	97.12092	86.61228	82.58157	81.046007	77.30326
인삼 추출물(b)	100	107.9586	106.295	84.84712	52.29317	28.86691	24.32554	20.95324
혼합 추출물(c)	100	106.2073	112.6249	107.575	62.01999	33.40347	31.0363	25.6707

표 4 및 도 1에 따르면, 실시예 1 ~ 8 및 비교예 1 ~ 16의 처리군이 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서 대조군과 비교하여 현저하게 낮은 생존율을 보였다.

특히, 인삼의 경우 50 ㎍/㎖ 농도(비교예 12)에서 낮은 생존율(84.85 %)을 나타냈지만 통계적 유의성은 없었고, 100 ㎍/㎖ 이상의 농도(비교예 13 ~ 16)에서 52.93 % 이하로 현저하게 낮은 세포 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이는 인삼의 지용성 분획 중 항암물질로 알려진 panaxydol, panaxinol, panaxitiol및 acetyl panaxydol 등과 같은 diacetylene 유도체에 의한 세포 독성의 영향에 기인한 것으로 생각될 수도 있다.

한편, 우슬과 인삼추출물을 동량의 비율로 혼합처리한 실시예 1 ~ 8의 경우 중 100 ㎍/㎖ 농도(실시예 5)에서 62.02 %의 생존율로 유의한 세포독성을 보였고, 인삼 추출물 단독처리군(비교예 9 ~ 16)보다 세포 생존율이 높았고, 50 ㎍/㎖ 농도(실시예 4)에서는 인삼 추출물 단독처리군의 50 ㎍/㎖ 농도(비교예 12)보다 더욱 높은 생존율(107.58 %)을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 인삼은 100 ㎍/㎖ 이상의 고농도에서 세포독성을 가지는 것으로 판단되나, 실시예 4 내지 8의 조성물에서는 세포 생존률 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 혼합하는 경우 우슬 추출물의 항염과 항산화 작용에 의한 세포 보호작용으로 인하여 인삼추출물의 세포독성을 저감시킬 수 있음을 알 수 있다.

실험예 2. TRAP 염색을 통한 양성파골세포 분화 관찰 1

본 발명에 따른 실시예 1 ~ 8 및 비교예 1 ~ 16의 조성물로 처리한 파골세포의 TRAP 활성을 측정하기 위하여 TRAP solution assay를 수행하였다. 분화제와 시료처리 3일된 세포를 DPBS로 수세 후 cold lysis buffer (90 mM citrate, pH 4.8, 0.1% Triton X-100 containing 80 mM sodium tartrate)를 80 ㎕씩 분주하여 상온에서 10분간 처리하고, substrate solution (20 mM p-nitrophenyl phosphate)을 80 ㎕씩 첨가하여 5% CO₂, 37℃ 배양기(incubator)에서 20분간 반응시켰다. 40 ㎕의 0.5 N NaOH로 반응을 중지시킨 다음, ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 하기 도 2 및 표 5에 나타내었다. 이때, 도 2의 a는 비교예 1 ~ 8이고, b는 비교예 9 ~ 16이고, c는 실시예 1 ~ 8을 의미한다.

농도 (㎍/ml)	0	10	25	50	100	250	500	1000
우슬 추출물(a)	100	97.47936	91.3371	90.36651	68.82515	56.10604	4.09503	32.34825
인삼 추출물(b)	100	40.31504	32.59906	19.96062	10.91558	6.743785	6.091558	6.608417
혼합 추출물(c)	100	37.328	27.696	19.504	11.12	9.232	8.096	7.872

TRAP 효소는 ATP와 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate)가 존재할 때 높은 활성을 가지고, 골 흡수작용시 분비가 증가되기 때문에 그 활성도 측정하여 파골세포 분화정도를 확인하는 데 이용할 수 있다.

하기 도 2에 따르면, 우슬 추출물의 TRAP 활성도는 100 ㎍/㎖ 이하(비교예 1 ~ 4)에서는 농도와 관계없이 대조군과 유의한 차이가 없고, 100 ㎍/㎖ 이상(비교예 5 ~ 8)의 농도에서는 낮은 활성도를 보이는 것을 확인할 수 있다. 그러나, 이는 상기 실험예 1에서 확인한 바와 같이 감소된 세포 생존율에 기인한 것으로 판단된다.

한편, 인삼 추출물로 처리한 경우 세포 독성이 없는 10(비교예 10), 25(비교예 11)와 50(비교예 12) ㎍/㎖ 에서 각각 40.31%, 32.60%, 19.96 %로 TRAP 활성이 현저하게 감소되고, 우슬과 인삼의 혼합 조성물 역시 10 ㎍/㎖(실시예 2)(37.33%), 25(실시예 3) ㎍/㎖(27.70%)와 50(실시예 4) ㎍/㎖(19.51%)에서 농도 의존적으로 뚜렷하게 감소되는 것을 확인할 수 있다.

따라서, RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화과정 중에 우슬 추출물은 영향을 미치지 못하지만, 인삼 추출물은 농도 의존적으로 파골세포 분화억제에 직접적으로 관여한다는 것을 알 수 있다. 즉, 우슬 추출물은 파골세포 분화억제를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3. TRAP 염색을 통한 양성파골세포 분화 관찰 2

본 발명에 따른 실시예 3 ~ 4 및 비교예 3 ~ 4 및 11 ~ 12의 조성물로 처리한 양성파골세포의 분화를 관찰하기 위하여, 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포로부터 유도분화된 파골세포에서 TRAP (tartate resistant acid phosphate) 염색을 통하여 성숙한 파골세포 형태를 관찰하였다. 분화제와 시료처리 3 일된 세포는 PBS로 수세후 10 % 포르말린(formalin)으로 5 분간 고정하고, 정제수(DW)로 다시 수세하였다. 시그마 TRAP 염색(Sigma-Aldrich kit no. 387) 사용 설명에 따라 신선한 TRAP 용액으로 30 분간 처리하였다. 염색된 세포는 광학현미경(CKX41, Olympus, Japan)으로 관찰하고, 디지털영상 카메라(DIXI 3000, China)로 이미지를 영상화하였고, 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다. 이때, 본 발명에 따른 실시예 3 ~ 4, 비교예 3 ~ 4 및 11 ~ 12는 상기 실험예 1 및 2에서 확인된 바와 같이 우슬 추출물 및 인삼 추출물에 의한 세포치사 활성은 없고, 낮은 TRAP 활성을 보이는 25 와 50 ㎍/㎖의 농도를 가지는 조성물로 처리하여 3일간 배양한 후 TRAP 염색을 시행하였다.

한편, 하기 도 3의 a ~ i 는 하기 표 6과 같고, 화살표는 둥근모양 형태 파

골세포를 나타낸다.

a	b	c
대조군	비교예 3(우슬 25 ㎍/ml)	비교예4(우슬 50 ㎍/ml)
d	e	f
대조군	비교예11(인삼 25 ㎍/ml)	비교예 12(인삼 50 ㎍/ml)
g	h	i
대조군	실시예 3(동량혼합25 ㎍/ml)	실시예 4(동량혼합50 ㎍/ml)

하기 도 3에 따르면, 대조군에서 둥근모양형태 파골세포(ROC) 즉, 세포가 융합되면서 다핵의 성숙파골세포가 형성되어 골 표면에 부착한 후 골 흡수작용을 하는 TRAP 양성 다핵형 파골세포가 뚜렷하게 관찰되었다. 우슬 추출물 25 와 50 ㎍/㎖ 농도처리군(비교예 3, 4)에서는 대조군과 유사한 파골세포 분화형태를 보이는 반면, 인삼처리군과 우슬과 인삼혼합처리군의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 현저하게 감소된 ROC와 융합되지 않은 단핵의 전파골세포와 불규칙모양형태 파골세포(irregular shaped osteoclast, IOC)가 풍부하게 관찰되었다.

실험예 4. TRAP 염색을 통한 양성파골세포 분화 억제 3

본 발명에 따른 실시예 3, 4 및 비교예 3, 4, 11, 12의 조성물로 처리한 파골세포의 TRAP 활성을 평가하기 위하여, 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포로부터 유도분화된 파골세포에서 TRAP (tartate resistant acid phosphate) 염색을 통하여 성숙한 파골세포 형태를 관찰하였다. 분화제와 시료처리 3 일된 세포는 DPBS로 수세후 10 % formalin으로 5분간 고정하고, DW로 다시 수세하였다. 시그마 TRAP 염색(Sigma-Aldrich kit no. 387) 사용설명에 따라 신선한 TRAP 용액으로 30 분간 처리하였다. 염색된 세포는 광학현미경(CKX41, Olympus, Japan)으로 관찰하고, 디지털영상 카메라(DIXI 3000, China)로 이미지를 영상화하여 둥근 모양 형태의 파골세포(round-shaped osteoclast, ROC) 수를 측정하였고, 그 결과를 하기 도 4 및 표 7에 나타내었다.

농도(㎍/㎖)	0	25	50
우슬 추출물	100	106.2857	102.2857
인삼 추출물	100	42.51497	42.51497
혼합추출물	100	37.86982	27.21893

하기 도 4에 따르면, 둥근 모양 형태의 파골세포(round-shaped osteoclast, ROC) 수가 우슬 추출물에서는 농도에 따른 변화를 나타내지 않지만, 인삼 추출물을 포함하는 경우 25와 50 ㎍/㎖농도에서 그 수가 감소하는 것을 확인할 수 있고, 보다 높은 농도에서 그 감소 정도가 더 큰 것을 확인할 수 있으므로, 둥근 모양 형태의 파골세포의 수는 농도 의존적으로 유의하게 감소되는 것을 알 수 있다.

실험예 5. TRAP 염색을 통한 양성파골세포 분화 억제 3

본 발명에 따른 실시예 9 ~ 17의 조성물로 처리한 양성파골세포의 분화 및 TRAP 활성을 관찰하기 위하여, 상기 실험예 1 및 2와 같은 방법으로 세포독성 및 TRAP 활성을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 8 및 도 5에 나타내었다.

	대조군	실시예 9	실시예 10	실시예 11	실시예 12	실시예 13	실시예 14	실시예 15	실시예 16	실시예 17
세포 독성	100	117.459	109.8539	107.0716	109.599	106.6079	94.92233	88.361	85.880	80.66311
TRAP 활성	100	101.6581	83.70497	66.72384	55.3745	47.4271	45.82619	43.71069	37.10692	32.53288

하기 도 5에 따르면, 우슬 추출물과 인삼 추출물의 다양한 농도별 혼합처리에 따른 세포독성을 평가한 결과, 유의한 세포생존율 감소를 나타내지는 않았다. 이때, 인삼 추출물의 함량이 증가할수록 TRAP 활성도가 통계적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

한편, 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 동량으로 혼합하여 제조된 조성물(실시예 5)로 처리한 군에 비해서 TRAP 활성도의 감소율은 적은 것을 알 수 있다.

실험예 6. 역전사중합효소연쇄반응 ( RT - PCR ) 분석

본 발명에 따른 실시예 3, 4 및 비교예 3, 4, 11, 12의 조성물로 처리한 파골세포의 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor, Cal-R)와 TRAP의 발현을 관찰하기 위하여 TRIzol을 사용하여 total RNA를 추출하고, iScript cDNA synthesis kit으로 cDNA를 합성하였다. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 Emerald Taq을 이용하여 초기 번성과정을 95℃에서 10분간 시행한 후, 95℃ 1분, 51 ∼ 58℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 총 25 ∼ 32 주기를 시행한 후, 최종 증폭과정을 72℃에서 10분간 시행하였다. 이때 사용한 PCR primer 순서는 하기 표 9과 같다. 반응이 끝난 시료는 2 % 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동하고 Et-Br로 염색하여 UV 상에서 관찰하고 densitometric analysis를 이용하여 수치화하였고, 그 결과를 하기 도 6 및 표 10에 나타내었다.

Gene	Primer sequence (5’-3’)	Annealing Temp (℃)	Product size (bp)
Cal-R	F-ACCGACGAGCAACGCCTACGC	58	490
	R-GCCTTCACAGCCTTACAGGTAC
TRAP	F-AAATCACTCTTTAAGACCAG	51	317
	R-TTATTGAATAGCAGTGACAG
GAPDH	F-AACTTTGGCATTGTGGAAG	53	223
	R-ACACATTGGGGGTAGGAACA

	Cal-R			TRAP
농도(㎍/㎖)	0	25	50	0	25	50
우슬추출물	100	82.285	90.79786	100	99.05167	98.24505
인삼추출물	100	36.73364	15.23028	100	68.34427	58.75493
혼합추출물	100	49.04299	35.56758	100	96.28895	61.34352

파골세포는 다양한 사이토카인, 호르몬 및 유전인자 조절 등으로 시작, 분화, 다핵화 그리고 성숙화 등 복잡한 과정에 의해 형성되는데, 풍부한 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor, Cal-R)와 TRAP이 존재하며 실제적으로 골 흡수작용을 하는 산 생성이 활발하고, acting ring을 형성하여 골 기질을 흡수한다고 알려져 있다.

이에, 표 10 및 도 6에 따르면 성숙 파골세포의 골기질 흡수단계에서 Cal-R의 mRNA 발현양 변화를 분석한 결과, 우슬 추출물 처리군(비교예 3,4)은 모든 농도에서 대조군과 유의한 차이가 나타나지 않았다. 인삼 추출물 처리군의 Cal-R 발현양은 25 ㎍/㎖(비교예 11)와 50 ㎍/㎖(비교예 12) 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 각각 63.27 %, 84.77 %의 감소율을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 우슬 추출물과 인삼 추출물을 동량으로 혼합하여 제조한 조성물도 25 ㎍/㎖(실시예 3)와 50 ㎍/㎖(실시예 4)에서 50.96% 및 64.43%의 감소율을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 모든 농도에서 현저한 감소율과 25 ㎍/㎖에 비해 50 ㎍/㎖ 농도에서도 유의하게 감소된 발현양을 확인하였다.

또한, TRAP 발현양 변화를 분석한 결과, 대조군에 비해 인삼추출물 25 ㎍/㎖(비교예 11)와 50 ㎍/㎖(비교예 12)의 모든 농도에서 31.66 %, 41.25 %의 감소율을 나타내며 현저하게 감소하였다. 우슬 추출물과 인삼 추출물을 동량으로 혼합하여 제조한 조성물에서는 대조군과 비교하여 50 ㎍/㎖(실시예 4) 농도에서만 38.66 %의 감소를 나타내는 것을 확인할 수 있고, 25 ㎍/㎖ 농도(실시예 3)에 비해서도 34.95 %의 감소를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

따라서, RANKL에 의한 TRAP 효소활성의 억제와 마찬가지로 Cal-R와 TRAP의 mRNA 발현 역시 인삼추출물에 의해서 유의하게 억제된다는 것을 알 수 있었다. 이는, 인삼 추출물에 포함되는 진세노사이드 Rb1이 NF-kB과 MAPKs 경로조절을 하고, 진세노사이드Rh2가 NF-kB, NFATc1 그리고 c-Fos등을 조절하여 파골세포분화를 억제하는 것으로 판된될 수 있다. 그러므로, 인삼은 파골세포분화 전사인자인 NFATc1을 억제하여 Cal-R와 TRAP를 감소시켰을 것으로 예상되고, 이로인해 최종적으로 골기질흡수가 억제될 것으로 판단될 수 있다.

실험예 7. 조골세포 분화 효과

본 발명에 따른 조성물의 조골세포에 대한 생존 및 간접적 독성평가를 위하여 MC3T3-E1 세포를 96-well plate (8×10³ cells/well)에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된α-MEM 배지에 분주하여 24 시간 동안 세포를 안정시켰다. 동일한 배지에 조골세포 분화제를 첨가하였고, 본 발명에 따른 실시예 9 ~ 17 및 비교예 3, 4, 11, 12로 처리한 후 5 % CO₂, 37℃ 배양기(incubator)에서 24시간 배양 후 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 이때, 상기 조골세포 분화제는 OS, 1M 2-glycerophosphate, 50 mM ascorbic acid, and 10 mM dexamethasone을 포함한다.

			실시예9	실시예10	실시예11	실시예12	실시예13	실시예14	실시예15	실시예16	실시예17
우슬	0	100	90	80	70	60	50	40	30	20	10	0
인삼	0	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100
조골세포 생존율	100	100.5666	105.0992	104.3059	106.0623	101.6431	103.8527	99.2068	102.7762	100.4533	103.9093	103.6827

농도(㎍/㎖)	0	25	50
우슬추출물	100	104.828	98.72364
인삼추출물	100	98.02772	103.7846
혼합조성물	100	108.4437	102.3179

골조직에 존재하는 조골세포와 유사하여 골기질의 축적, 석회화와 성장요소대사변화 등의 연구에 이용되고 있는 MC3T3-E1 세포에 우슬과 인삼추출물을 처리하여 세포증식 및 세포생존율에 따른 세포독성평가를 통하여 조골세포 후기 분화 단계 활성을 확인하였고, 그 결과를 도 7, 도 8(a), 표 10 및 표 11에 나타내었다. 본 발명에 따른 실시예 9 ~ 17 및 비교예 3, 4, 11, 12의 우슬과 인삼의 다양한 농도별 혼합처리와 동량의 비율로 혼합 처리한 모든 실험군의 농도에서 24 시간 처리 후 세포생존율에는 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있다.

실험예 8. 석회화 결절 형성 측정

MC3T3-E1 세포로부터 분화된 조골세포의 석회화결절형성은 alizarin red-sulfate (AR-S)를 이용하여 측정하였다. 24-well plate (2×104 cells/well)에 10 % FBS와 1 % penicillin-streptomycin이 첨가된 혈청α-MEM 배지에 분주하여 24 시간 동안 세포를 안정시켰다. 조골세포 유도분화제 및 0, 25, 50 ㎍/㎖의 농도인 본 발명에 따른 실시예 3,4, 비교예 1, 3, 4, 9, 11, 12를 처리한 후 21일 동안 배양하였다. ice-cold 4% paraformaldehyde로 4℃에서 30분간 세포를 고정하고, 40 mM AR-S staining 용액으로 실온에서 10분 동안 염색하였다. 정제수(DW)로 수세하고 난 뒤 10% (w/v) cetylpyridinium chloride / 10 mM sodium phosphate (pH 7.0)로 15분간 반응시켜 염색제를 용해한 후 용액을 ELISA reader를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 하기 도 8(b) 및 표 13에 나타내었다.

농도(㎍/㎖)	0	25	50
우슬추출물	100	116.8399	106.237
인삼추출물	100	125.9594	106.3205
혼합조성물	100	126.4113	94.35484

도 8(b) 및 표 12에 따르면, 알리자린 레드(alizarin red)에 염색된 석회화 결절을 용해하여 흡광도를 측정한 결과 인삼 추출물 25 ㎍/㎖ (비교예 11), 우슬 추출물과 인삼 추출물의 혼합 조성물 25 ㎍/㎖ (실시예 3)에서 대조군과 비교하여25.96 % 및 26.41 %의 증가율을 나타내며 유의하게 증가하였다. 우슬 역시 증가의 경향을 보이지만 통계적으로 유의성을 나타내지 않았다.

따라서, 조골세포 분화활성의 증가는 인삼 추출물이 포함된 처리군에서 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는 인삼의 사포닌계 진세노사이드 성분이 영향을 미쳤을 것으로 사료된다.

Claims

우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 인삼 추출물에 의한 세포독성이 우슬 추출물을 통해 완화되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
　
제 1 항에 있어서, 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물 10 ~ 900 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
　
제 1 항에 있어서, 상기 인삼 추출물의 농도가 10 ~ 70 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
　
제 1 항에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 파골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 15 % 향상되고, TRAP 활성이 미처리군에 비해 65 ~ 75 % 감소되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
　
제 1 항에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 10 % 향상되고,
상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 30 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 석회화결절이 미처리군에 비해 25 ~ 30 % 향상되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
　
우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 인삼 추출물에 의한 세포독성이 우슬 추출물을 통해 완화되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물.
　
제 6 항에 있어서, 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물 10 ~ 900 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물.
　
제 6 항에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도는 10 ~ 70 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물.
　
제 6 항에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 파골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 10 % 향상되고, TRAP 활성이 미처리군에 비해 65 ~ 75 % 감소되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물.
　
제 6 항에 있어서, 상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 50 ㎍/㎖ 인 경우, 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 생존율이 미처리군에 비해 1 ~ 10 % 향상되고,
상기 인삼추출물의 농도가 25 ~ 30 ㎍/㎖ 인 경우, 상기 우슬 추출물 100 중량부에 대하여 인삼 추출물을 100 중량부를 포함하는 조성물로 처리한 조골세포의 석회화결절이 미처리군에 비해 25 ~ 30 % 향상되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물.