KR20160049859A - 신규 베타-만노시다제 및 이의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 효소인 베타-만노시다제, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물, 상기 베타-만노시다제를 포함하는 조성물, 상기 베타-만노시다제를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 베타-만노시다제를 이용하면 D-만노스를 주성분으로 하는 당류를 분해할 수 있으며, 이러한 방법에 따라 D-만노스를 제조할 수 있고, 또한 바이오매스에 상기 베타-만노시다제를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 등으로 산업적으로 활용할 수 있다.

Description

신규 베타-만노시다제 및 이의 생산방법{A novel β-Mannosidase and producing method thereof}

본 발명은 신규한 베타-만노시다제, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물, 상기 베타-만노시다제를 포함하는 조성물, 상기 베타-만노시다제를 제조하는 방법, 상기 베타-만노시다제를 이용하여 D-만노스를 주성분으로 하는 당류를 분해하는 방법, 상기 방법에 따라 D-만노스를 제조하는 방법, 또는 바이오매스에 상기 베타-만노시다제를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

만난(mannan) 다당류는 헤미셀룰로오스(hemicellullose)를 이루는 주요 구성물질이며, 아세틸기 및 갈락토실기를 포함하는 치환체를 가지는 상당히 분지된 베타-1,4-결합 D-만노스 폴리머이다. 만난을 완전히 분해하기 위해서는 엔도-베타-1,4-만난아제(endo-β-1,4-mannanase), 베타-만노시다제(β-mannosidase) 및 알파-갈락토시다제(α-galactosidase)의 작용이 필요하다. 이들 효소들 중, 엔도만난아제 및 베타-만노시다제는 만난 골격을 분해하는데 중요한 역할을 한다. 엔도만난아제는 만난 골격의 내부 만노시딕 결합(mannosidic linkages)을 공격해 만난을 만노올리고사카라이드(mannooligosaccharides)로 분해하고, 연속해서 베타-만노시다제는 만노비오스(mannobiose)를 포함하여 짧은 만노올리고사카라이드를 D-만노스로 가수분해한다.

최근, 만난아제는 수많은 미생물에서 생산되는 것으로 보고되고 있으나, 이에 반해 베타-만노시다제는 미생물에서 분리해 낸 이력이 거의 보고된 바 없다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 페니바실러스 균주에서 분리한 신규한 베타-만노시다제, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물, 상기 베타-만노시다제를 포함하는 조성물, 상기 베타-만노시다제를 제조하는 방법, 상기 베타-만노시다제를 이용하여 D-만노스를 주성분으로 하는 당류를 분해하는 방법, 상기 방법에 따라 D-만노스를 제조하는 방법, 또는 바이오매스에 상기 베타-만노시다제를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 일 양태로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 베타-만노시다제를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 페니바실러스 우송엔시스(기탁번호 KCTC 3953, 기탁일 20070502)로부터 신규한 베타-만노시다제 효소를 수득하였고, 상기 신규한 베타-만노시다제 효소는 파라-니트로페닐-베타-만노피라노사이드(para-nitrophenyl-β-mannopyranoside (pNPM)) 가수분해 촉매 활성을 포함하여 2개 이상의 기질의 가수분해 반응을 촉매하는 활성을 가지며, 동물의 장내와 가까운 환경인 중성 pH와 중온에서 높은 반응성을 나타낼 뿐만 아니라, 실온에서 열안정성을 보이고, 동시에 높은 반응율을 보여 효율적으로 가수분해물을 수득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "베타-만노시다제(β-mannosidase)"는 만노비오스, 만노트리오스, 만노테트라오스, 만노펜타오스 또는 만노헥사오스를 포함하여 짧은 만노올리고사카라이드를 만노스로 가수분해하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

본 발명에 따른 베타-만노시다제에는 자연적으로 유도될 수 있는 베타-만노시다제 뿐만 아니라, 본 발명의 구체적 실시예에 기재된 바와 같이 합성 베타-만노시다제도 포함될 수 있으며, 단 서열번호 1의 아미노산 서열과 상동성이 있어야 한다. 보다 구체적으로, 자연적으로 유도될 수 있는 베타-만노시다제는 바람직하게 페니바실러스 우송엔시스(P. woosongensis) 균주 (기탁번호 KCTC 3953)으로부터 수득할 수 있으며, 상기 균주로부터 당업계 공지된 통상의 방법에 따라 분리·정제하여 수득할 수 있으며, 예컨대 균주 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 세포외 분획을 수득하거나 상등액을 회수하고 남은 펠렛을 세척한 다음 재현탁하고 원심분리하여 펠렛결합-분획으로부터 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어, "균주"에는 생균, 사균, 건조균 또는 균주 배양액이 포함된다. 또한, 상기 용어, "배양액"은 상기 균주를 적합한 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 여액을 농축한 농축액, 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 라이소자임을 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등이 포함된다.

본 발명에 있어서, "베타-만노시다제"에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명에 따른 베타-만노시다제와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "상동성"이란 베타-만노시다제의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 핵산분자의 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 바람직하게는 85% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

"실질적으로 동질의 활성"이란 베타-만노시다제와 같은 기능적 특성이 있으며, 특히 효소의 기능적 특성을 가지는 것을 의미한다. 또한, 상기 기능적 동등물의 범위에는 베타-만노시다제의 기본 골격 및 이의 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예컨대, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합 단백질 등이 이에 포함된다. 또한, 단백질의 단편(fragment)으로서 베타-만노시다제와 실질적으로 대등한 활성을 갖는 폴리펩타이드는 베타-만노시다제의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 베타-만노시다제에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "활성"은 주어진 기질을 정량적으로 전환하는 것을 의미하고, 용어 "다기능 효소"는 하나의 효소가 2개 이상의 반응을 촉매하는 효소를 의미하는바, 2개 이상의 기질을 정량적으로 전환할 수 있는 효소를 지칭한다. 구체적 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 베타-만노시다제는 파라-니트로페닐-베타-만노피라노사이드(para-nitrophenyl-β-mannopyranoside, pNP-β-D-mannopyranoside (pNPM))에 대해 주(major) 가수분해 활성을 가지나, 동시에 pNP-α-L-아라비노피라노사이드(Arabinopyranoside), pNP-β-D-갈락토피라노사이드(galactopyranoside), pNP-α-D-갈락토피라노사이드(galactopyranoside), pNP-α-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside) 및 pNP-β-D-글루쿠로나이드(glucuronide)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 기질의 가수분해 반응을 촉매하는 활성도 함께 가지는바, 다기능 효소로서의 특징을 가진다.

바람직하게, 본 발명에 따른 베타-만노시다제는 하기와 같은 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

(a) 등전점 PI 4.5 내지 5.5, 더욱 바람직하게 4.5 내지 5;

(b) 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE) 측정 분자량 95 - 98 kDa, 더욱 바람직하게 96 - 97 kDa;

(c) 42 - 52℃ 에서 pNPM에 대한 최대 활성을 나타냄, 더욱 바람직하게, 45 - 50℃ 에서 pNPM에 대한 최대 활성을 나타냄;

(d) pH 5 - 6.5에서 pNPM에 대한 최대 활성을 나타냄, 더욱 바람직하게, pH 5.5에서 pNPM에 대한 최대 활성을 나타냄;

(e) 30℃ 이하에서 2 시간 동안 열안정성을 나타냄;

(f) pNPM에 대해 Km은 2.14 mM 및 Vmax는 2.21 U/mg를 나타냄;

(g) K⁺, Mg²⁺ 또는 Fe²⁺ 첨가시 효소 활성이 증가됨;

(h) Ni²⁺, Mn²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, EDTA, SDS, Hg²⁺, PMSF 또는 8-하이드록시 퀴놀린 첨가시 효소 활성이 감소됨; 또는

(i) 글루코스, 갈락토스, 리보스, 만노스 및 자일로스로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 당류 첨가시 효소 활성이 감소됨.

상기 (c) - (e) 특징을 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 베타-만노시다제는 중성 pH와 중온에서 높은 반응성을 나타내고, 실온에서 열안정성을 보이므로, 다양한 산업에 활용도가 높다.

또한, 상기 (a) - (i) 특징에 따라, 반응의 목적, 반응율/반응속도의 조절 등에 활용할 수 있으므로 산업상 이용 가치가 높다.

본 발명의 베타-만노시다제는, 이의 N- 또는 C- 말단에 외래 아미노산을 포함할 수 있으며, 상기 "외래 아미노산"은 천연(자연적으로 발생한) 베타-만노시다제에 존재하지 않는 아미노산, 바람직하게 약 1개 이상, 약 3개 이상, 약 5개 이상 약 6개 이상 또는 약 7개 이상의 인접 아미노산의 연장부(stretch)를 의미한다. 외래 아미노산의 바람직한 연장부는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 재조합적으로 생성된 베타-만노시다제의 정제를 용이하게 하는 "태그(tag)"을 포함할 수 있다. 이러한 태그의 예로는 예컨대, His₆ 태그, FLAG 태그, myc 태그 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

베타-만노시다제를 비롯한, 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 단리된 형태로 제공될 수 있고, 바람직하게는 균질하게 제공된다. 본원에서, "단리된"이라는 용어는 물질이 그의 고유한 환경(예컨대, 자연적으로 발생할 경우 자연환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예컨대, 살아있는 미생물에 존재하는 자연적으로 발생된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이 아니지만, 천연 시스템 중 일부 또는 모든 공존하는 물질로부터 분리된, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부 및/또는 조성물의 부분일 수 있고, 상기 벡터 또는 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니도록 단리될 수 있다. 단리된 폴리펩타이드는 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 더욱더 바람직하게 95% 이상, 가장 바람직하게 99% 이상 순수하다. 순도는 당 분야의 공지된 방법에 따라, 예컨대 SDS-PAGE 및 후속적인 단백질 염색에 의해 결정될 수 있고, 단백질 밴드는 밀도측정계에 의해 정량화 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 양태로, 본 발명은 베타-만노시다제를 코딩하는 핵산 분자 또는 이들의 분리 내지 정제된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "핵산 분자"는 cDNA, genomic DNA, 합성 DNA 또는 RNA, PNAS 또는 LNA 기원의 임의의 단일 또는 이중 나선 핵산 분자, 또는 이들의 혼합물을 의미한다. 상기 "핵산 분자"에는 본 발명에 따른 베타-만노시다제 및 이의 기능적 동등물을 암호화하는 a) 핵산 염기 서열, 또는 b) 이들 서열과 고긴축 조건(high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 또한, 상기 a) - b)의 핵산 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다. 또한, 상기 a) - b)의 임의의 핵산 분자의 단편 또는 보체(complement)가 포함될 수 있다.

본 발명의 베타-만노시다제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내는 베타-만노시다제를 코딩하는 염기 서열 및 이와 상동성을 가지는 염기 서열을 가질 수 있고, 보다 바람직하게 서열번호 2의 염기 서열 또는 이와 상동성을 가지는 염기 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 베타-만노시다제를 코딩하는 핵산 분자는 본 발명에서 개시한 서열 정보로부터 당 분야에 공지된 핵산 분자 구축 방법에 의해 수득될 수 있다. 예컨대, 출발물질로서의 핵산 분자는 페니바실러스 우송엔시스 균주로부터 단리될 수 있고 및/또는 본 발명에서 개시한 염기 서열을 기초로 하여 합성에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 베타-만노시다제를 코딩하는 핵산 분자는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 즉 이에 제한되는 것은 아니지만 다른 염색체 DNA 및 RNA, 및 염색체 외 DNA 및 RNA와 같은 다른 염기 서열이 실질적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 핵산 분자 정제 방법이 단리된 핵산 분자를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 본 발명의 핵산 분자는 프로모터, 박테리아 세포의 경우 필요에 따라 리보좀-결합 부위 및 종결자가 작동적으로 연결된 기능성 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

또 다른 양태로, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "플라스미드", "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되며, 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro) 발현을 위한 컨스트럭트를 의미한다. 이들 컨스트럭트는 숙주세포로 베타-만노시다제 인코딩 핵산 분자를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 이들 컨스트럭트에서 베타-만노시다제 인코딩 핵산 분자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결(operably linked)되며, 숙주세포로 삽입되면, 벡터는 숙주 게놈과는 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나 또는 일부 경우에 숙주 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 통상적으로 플라스미드 벡터는 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, 플라스미드 벡터로 삽입된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자, 및 외래 핵산 분자가 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 가진다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따라 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 핵산 분자를 용이하게 라이게이션시킬 수 있다.

상기 "작동가능하게 연결된"은 적절한 핵산 분자가 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다.

상기 "재조합"은 세포가 이종의 핵산 분자를 복제하거나, 상기 핵산 분자를 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 상기 "벡터"는 세포 내로 핵산 분자를 전달한다. 상기 "벡터"에는 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

숙주세포에서 발현하기 위해 사용될 수 있는 벡터는 당 분야에 공지되어 있고, 특히 대장균(E. coli)에서 발현하기 위해 사용될 수 있는 적합한 벡터 또한 당 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 벡터로 pET23a(+)을 사용하였으며, 도 1에 재조합 벡터 개열 지도를 구체적으로 개시하였으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "숙주세포"는 상술한 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 임의의 세포를 포함하며, 베타-만노시다제의 재조합 생산에 이용될 수 있다. 숙주세포는 통상적으로 핵산 분자의 도입 효율이 높고, 도입된 핵산 분자의 발현 효율이 높은 것이 사용된다. 숙주세포는 원핵 또는 진행 세포를 포함하며, 이러한 숙주세포를 포함하는 재조합 미생물로서, 예컨대 박테리아, 효소, 곰팡이 등이 이용될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 대장균(E. coli)이 이용되었으나, 이에 제한되지 않고, 본 발명에 따른 베타-만노시다제 변이체가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.

본 발명에 있어서, 핵산 분자를 숙주세포에 삽입하기 위해 통상적으로 알려진 조작방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 베타-만노시다제를 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 액상 내지 고상일 수 있다. 조성물에는 베타-만노시다제를 단독으로 포함할 수도 있고, 다른 단백질 또는 효소를 함께 포함할 수도 있으며, 조성물 내 베타-만노시다제, 다른 단백질, 또는 효소의 안정성 및/또는 활성을 보충할 추가 첨가제를 포함할 수도 있다. 예컨대, 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 염, 슈가, pH-버퍼, 보존제 및 카르보하이드레이트가 있으나, 이에 한정되지 않는다. 통상적으로 액상 조성물은 물 또는 오일 기반의 슬러리, 현탁액 또는 용매이다. 고상 조성물은 스프레이-건조, 동결건조(lyophilisation), 다운-드라우트 증기법(down-draught evaporation), 씬-레이어 증기법(thin-layer evaporation), 원심분리 증기법(centrifugal evaporation), 컨베이어 건조, 또는 이들의 조합에 의해 액상 조성물로부터 제조될 수 있다. 고상 조성물은 식품 또는 사료에 적용하기 적합한 크기로 과립화할 수 있다.

상기 조성물은 본 발명에 따른 베타-만노시다제의 특성을 기초로 다양한 산업 분야에서 이용될 수 있는바, 예컨대, 하기와 같은 분야에서 이용가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다:

- 만난 분해,

- 알콜 발효 또는 생산,

- 음식 또는 사료 가공,

- 커피 추출 또는 커피 폐기물 가공,

- 음식 또는 사료 보충제,

- 제지용 펄프 표백 보조,

- 직물 산업에서의 표백제 또는 풀빼는 처리제(desizing agent),

- 수압 파쇄에 의한 유정 또는 가스정 자극,

- 세정제,

- 생물학적 연료 생산용으로 의도되는 재생가능한 자원의 가공 또는 알곡 가공,

- 베이킹 성분,

- 바이오필름(biofilm) 제거,

- 전달 시스템,

- 바이오매스 자원 가공,

- 직물, 석유 시추, 세정, 세탁, 세제 및 셀룰로스 섬유 가공,

- 만노올리고사카라이드 분해, 또는

- D-만노스 생산 등.

본 발명에 따른 조성물에는 조성물의 용도에 따라 다양한 성분이 추가될 수 있고, 예컨대 효소가 추가될 수 있으며, 상기 효소에는 엔도만난아제, 알파-갈락토시다제, 셀로비오히드롤라제, 피타제, 그루코아밀라제, 알파 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제 및 이들의 혼합물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 베타-만노시다제를 산업상 활용하는 방법을 제공하는바, 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 베타-만노시다제를 첨가하여 만노스를 주성분으로 하는 당류를 분해하는 방법을 제공한다. 상기 만노스를 주성분으로 하는 당류는 바람직하게, 만노올리고사카라이드일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 베타-만노시다제를 첨가하고 만노스를 주성분으로 하는 당류를 분해하여, 만노스를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 바이오매스에 본 발명에 따른 베타-만노시다제를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "바이오매스(biomass)"는 헤미셀룰로오스, 특히 만난을 포함하는 대상 물체를 의미하며, 예컨대 식물의 씨, 낟알, 튜버, 옥수수(속대, 여물, 섬유 등 포함), 풀(인디안 그래스, 스위치그래스 등), 수수류, 사탕수수 바가스 등이 포함될 수 있으며, 식물 폐기물, 식품 가공 또는 산업적 가공의 부산물도 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상술한 방법들은 상술한 본 발명에 따른 조성물이 사용되는 산업 분야에서 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 재조합 미생물을 배양하여 베타-만노시다제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-만노시다제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-만노시다제 제조방법을 제공한다.

보다 바람직하게, 하기 방법에 따를 수 있다:

상기 베타-만노시다제는 C 말단에 6개의 히스티딘을 태깅한 융합 단백질로서 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL을 배양하여 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-만노시다제를 균체파쇄상등액으로부터 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

재조합 미생물의 (대량) 배양을 위해, 다양한 배양 방법이 적용될 수 있는데, 예컨대 재조합 미생물로부터 발현 또는 과발현된 유전자 산물의 대규모 제조는 회분(batch) 또는 연속 배양 방법에 의해 달성될 수 있다. 회분 및 유가(fed-batch) 배양 방법은 통상적인 것으로서 당분야에 공지되어 있다. 연속 배양 공정을 위한 영양분 및 성장 인자의 조절 방법, 뿐만 아니라 생성물 형성율을 최대로 하기 위한 기법은 미생물 산업 분야에 공지되어 있다. 또한, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미테랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게 탄소원으로 만난을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 당분야에 공지된 바에 따라 조성 구성할 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 베타-만노시다제 효소는 미생물로부터 분리가능하며, pNPM 가수분해 활성을 포함하여 2개 이상의 기질의 가수분해 반응을 촉매하는 활성을 가지고, 동물의 장내와 가까운 환경인 중성 pH와 중온에서 높은 반응성을 나타낼 뿐만 아니라, 실온에서 열안정성을 보이고, 동시에 높은 반응율을 보여 효율적으로 가수분해물을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-만노시다제를 이용하면 D-만노스를 주성분으로 하는 당류를 분해할 수 있으며, 이러한 방법에 따라 D-만노스를 제조할 수 있고, 또한 바이오매스에 상기 베타-만노시다제를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 등으로 효과적으로 다양한 산업 분야에서 활용할 수 있다.

도 1은 베타-만노시다제 유전자의 재조합 벡터 pYEM28N를 도시한 것이다.
도 2a - 도 2b 재조합 E. coli BL21(DE3) 또는 재조합 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL로부터 정제된 His-tagged 베타-만노시다제의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다. T: 균체파쇄액, S: 균체파쇄상등액 (수용성 단백질), P: 균체파쇄 침전물 (불용성 단백질)
도 3은 pNPM을 가수분해하기 위한 정제된 His-tagged 베타-만노시다제의 최적 온도 및 최적 pH를 도시한 것이다.
도 4는 정제된 His-tagged 베타-만노시다제의 열안정성을 도시한 것이다. x 축: 열처리 시간(incubation time (min)), y 축: 잔존 활성(%)
도 5는 pNPM에 대한 베타-만노시다제의 분해 활성에 금속 이온 또는 기타 제제가 미치는 영향을 도시한 것이다. 그래프의 y축은 상대 활성(%)을 나타냄.
A; 무첨가, B: KCl, C: NiCl₂ D: MgCl₂, E: MnCl₂, F: CaCl₂, G: CoCl, H: FeCl₂, I: FeCl₃, J: CuCl₂, K: EDTA, L: SDS, M: HgCl₂, N: PMSF, O: 8-hydroxy quinoline
도 6은 정제된 His-tagged 베타-만노시다제의 pNPM에 대한 역학 파라미터를 도시한 것이다.
도 7은 만노올리고사카라이드의 가수분해 산물을 도시한 것이다.
M1: 만노스, M2: 만노비오스, M3: 만노트리오스, M4: 만노테트라오스, M5: 만노펜타오스, M6: 만노헥사오스, E: 정제된 His-tagged 베타-만노시다제
도 8은 베타-만노시다제의 기질 특이성을 도시한 것이다.
도 9a 및 도 9b는 pNPM에 대한 베타-만노시다제의 분해 활성에 당 첨가가 미치는 영향을 도시한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실험 방법]

박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 배지

페니바실러스 우송엔시스(기탁번호 KCTC 3953, 기탁일 20070502)는 베타-만노시다제의 코딩 유전자 원천으로 사용하였고, E. coli DH5α는 재조합 플라스미드 주입용 숙주로 사용하였고, E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL은 E. coli 유전자 발현을 위한 숙주로 사용하였다. 이들 E. coli는 LB 브로스(10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl per liter, pH 7.0) 내 37 ℃에서 배양하였다. 암피실린(100 ㎍/ml) 및 클로람페니콜 (30 ㎍/ml)을 E. coli 형질전환체 선택 및 배양을 위해 사용하였다. 페니바실러스 우송엔시스는 크립틱 소이 브로스 (TSB; 17 g tryptone, 3 g soytone, 2.5 g dextrose, 5 g NaCl, 2.5 g K₂HPO₄ per liter, pH 7.2) 내 37 ℃에서 배양하였다. 플라스미드 pUC19는 클로닝 및 시퀀싱 실험을 위해 사용하였고, pET23a+는 베타-만노시다제 유전자의 발현 벡터로 사용되었다.

베타-만소시다제 유전자의 클로닝 및 시퀀싱

베타-만노시다제(서열번호 1)를 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 클로닝하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

페니바실러스 우송엔시스 KCTC 3953 세포에서 분리한 게놈 DNA를 분리하였다. 분리한 게놈 DNA를 Sau3AI를 이용해 부분적으로 분해하고, 1.5 - 10 kb 길이의 DNA 단편을 아가로스 젤에서 분리하였다. Sau3AI-처리 크로모좀 DNA 단편을 pUC19의 인산화된 BamHI site에 도입하였고, 라이게이션 혼합물을 E. coli DH5α 내에 형질전환하였다. 형질전환주 콜로니가 형성된 후에 0.2 mM 메팀 움벨리페릴 베타-만노피라노시드와 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 6.5)와 0.8% 한천을 포함한 용액을 평판배지에 중층하여 37℃에서 5시간 배양 후 콜로니에 자외선을 조사하여 형광을 띄는 콜로니를 선발함으로써 베타-만노시다제 유전자가 클로닝된 E. coli 형질전환주를 선발하였다. 베타-만노시다제 유전자가 클로닝된 형질전환주를 LB 액체 배지에서 하룻밤 배양한 후 플라스미드를 분리한 후, 클로닝된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 DNA 시퀀서(ABI Prism 377, Perkin Elmer Co., Foster, CA, U.S.A.)를 이용해 결정하였다.

베타-만소시다제 유전자의 고발현용 재조합 플라스미드 제조

E. coli 내에서 베타-만노시다제를 고발현할 재조합 플라스미드를 구성하기 위해, 상기 유전자를 pET23a(+) 내로 서브클로닝하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열에 따라 다음과 같이 설계하였다:

포워드 프라이머 (5'-GGAGACATATGAAAAGATTTGATTTAAACGACGC-3' : 서열번호 3) 및

리버스 프라이머 (5'-AATACTCGAGTCTGACCGAAGCAAATTTTAGCGC-3' : 서열번호 4)

적절한 제한효소 인지 영역을 각각 포워드 프라이머(NdeI site) 및 리버스 프라이머(XhoI site)에 추가하였다. 아울러, 리버스 프라이머는 pET23a(+)이 6-His tag과 융합된 유전자 산물을 포함하기 위해 C-말단에 스탑 코톤(stop codon)을 포함하지 않도록 설계하였다. PCR 증폭은 클론 유전자 (10 ng), 각 프라이머 40 pmol, 1.5 mM MgCl₂, 0.3 mM dNTPs, PCR 버퍼 및 2.5 U Pfu DNA 포함 반응 혼합물을 포함하는 총 50㎕의 반응물을 95℃에서 25초, 58℃에서 40초, 72℃에서 3분의 공정으로 30회 반복 수행하였다. NdeI 및 XhoI-처리된 DNA 단편의 PCR 산물을 pET23a(+)의 동일 구역에 도입하고, 결과 플라스미드를 pYEM28N으로 명명하였다(도 1).

E. coli 내 His-tagged 효소의 고발현 및 정제

플라스미드 pYEM28N을 함유하고 있는 재조합 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL 세포를 37℃, 항생제를 포함하는 LB 배양액 내에서 배양하였다. 배양물이 600 nm에서 0.6 광학 밀도에 다다르면, 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG를 첨가하였다. 25℃에서 5시간 동안 유도한 후, 세포를 걷어내고 세포 라이시스 버퍼(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0)에 현탁시켰고, 초음파 처리하여 분쇄하여 원심분리하여 균체파쇄상등액을 수득하였다. 균체파쇄상등액은 같은 버퍼를 이용해 평형화한 Ni-NTA에 첨가하였다. 세척용 버퍼(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH 8.0)를 이용해 비결합 내지 약하게 결합된 단백질을 제거한 후에, His-태그 효소를 250 mM 이미다졸 포함 추출 버퍼를 이용해 추출하였다. 활성 분획은 통합하고 10mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에서 투석하였다.

효소 분석 및 역학 분석

베타-만노시다제 활성은 pNPM에서의 para-nitrophenol (pNP) 방출양을 측정하여 결정하였다. 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.5) 내 1 mM 기질을 함유하는, 0.5 ml 반응 혼합물을 50℃에서 10분간 인큐베이팅하였다. 반응은 1M 소듐 카르보네이트 1ml를 첨가하여 종결시켰다. 흡수도는 405 nm에서 측정하였다. 정상상태(steady-state) 역학 측정은 기질의 농도(0.125 - 4 mM)를 바꿔가며 pNPM의 최적 온도 및 pHs에서 실시하였다. Km 및 Vmax 값은 최초 pNP 유리 비율로부터 계산하였다. 1 유닛 효소 활성은 분당 1 μmol의 pNP 또는 환원당을 생산한 효소의 양으로 정의하였다.

pH, 온도 및 다양한 제제가 효소 활성에 미치는 영향

pH가 반응율에 미치는 영향은 고정된 온도(45℃) 및 다양한 pHs 버퍼(50 mM의 소듐 시트레이트(sodium citrate) (pH 4.0 - 6.0), 소듐 포스페이트(sodium phosphate) (pH 6.0 - 8.0) 버퍼)에서 pNPM에 대한 효소 활성을 측정함으로써 결정하였다. 정제된 효소의 활성은 30 - 65℃ 범위 내의 다양한 온도에서 50 mM 소듐 시트레이트 버퍼 (pH 5.5) 에서 분석하였다. 화합물이 미치는 영향을 조사하기 위해, 베타-만노시다제는 표준 반응 혼합물 내 몇몇 시약 (5 mM)을 첨가함으로써 측정되었다. 효소 활성에 비치는 당의 효과를 시험하기 위해, 최종 농도가 25 mM - 400 mM가 되도록 표준 반응 혼합물에 단당류를 첨가한 후에 pNPM에 대한 가수분해 반응을 실시하였다.

[실험 결과]

페니바실러스 우송엔시스 베타-만노시다제 유전자의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열

페니바실러스 우송엔시스 게놈 DNA를 함유하는 E. coli 형질전환체를 하룻밤 배양을 위해 LB 아가 플레이트로 옮겼다. 베타-만노시다제 활성을 나타내는 E. coli를 스크리닝하기 위해, 0.2 mM 4-methylumbelliferyl β-D-mannopyranoside (MUM)를 소프트 아가를 플레이트 위에 도포하였다. 40 ℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한 후에, 360 nm에서 강한 형광물질 관찰을 통해 MUM을 가수분해하여, 4-methylumbelliferone 유리할 수 있는 콜로니 하나를 선택하였다. 재조합 플라스미드에서 페니바실러스 우송엔시스 게놈 DNA 전체 2,517 bp 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. BLAST 검색 프로그램을 이용해 페니바실러스 우송엔시스 베타-만노시다제의 아미노산 서열(서열번호 1)과 NCBI 데이터 베이스 내 다른 단백질 서열과의 서열 비교 결과, 신규한 단백질인 것으로 확인되었다.

E-coli 내에서 His-tagged 베타-만노시다제의 생산 및 정제

효소를 간단히 정제하기 위해, 재조합 E. coli를 통해 많은 융합 단백질을 만들어냈다. C 말단에 6개-히스티딘 꼬리를 가지는, His-tagged 베타-만노시다제를 제조했다. 융합 단백질은 E. coli BL21(DE3)보다는 레어(rare) tRNA 유전자를 가지도록 변형된 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL에서 IPTG에 의해서 고발현되었다. 상기 효소는 25℃ 에서 배양된 재조합 E. coli 세포뿐만 아니라 37℃에서 배양된 세포에서도 수용성 단백질 생산되었지만, 37℃ 에서 배양된 세포에서는 상당량이 불용성 단백질로 생산되었다(도 2a).

His-tagged 베타-만노시다제는 Ni-NTA 레진을 사용해 하나의 단계만으로 균체파쇄상등액으로부터 상기와 90% 상동성을 가지도록 정제되었다. 정제된 효소는 SDS-PAGE를 통해, 약 96.5 kDa 분자량에 대응하는 단일 단백질 밴드를 나타냈다. 정제된 효소의 분자량은 베타-만노시다제 유전자 뉴클레오티드 서열에 의해 예견된 His-tagged 베타-만노시다제의 분자량과 일치하였다(도 2b).

정제된 His-tagged 베타-만노시다제의 반응 특성

온도 및 pH가 효소 활성에 미치는 효소를 조사하기 위해 기질로서 pNPM를 사용하였다. 정제된 His-tagged 베타-만노시다제는 45℃, 5.5 pH에서 pNPM에 대해 최대 활성을 보였고, 42℃ - 52℃ 에서 80% 이상의 활성을 나타냈다 (도 3).

정제된 His-tagged 베타-만노시다제의 열안정성 및 pH 안정성을 확인하기 위해, 기질이 없는 상태에서 다양한 온도 (30 - 60℃) 또는 다양한 pHs (4.0 - 8.0)에서의 사전 인큐베이팅 후에 pNPM 가수분해에 대한 잔여 활성을 측정하였다. 그 결과, 인큐베이팅 2시간 동안 30℃에서 열안정성을 나타냈다(도 4).

His-tagged 베타-만노시다제는 pNPM에 현저한 활성을 나타냈으며, NP-α-L-아라비노피라노사이드(Arabinopyranoside), pNP-β-D-갈락토피라노사이드(galactopyranoside), pNP-α-D-갈락토피라노사이드(galactopyranoside), pNP-α-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside) 및 pNP-β-D-글루쿠로나이드(glucuronide)에 대해서도 미미하기만 활성을 나타냈다(도 7 - 8).

pNPM에 대한 His-tagged 베타-만노시다제의 역학(kinetic) 파라미터인, Km 및 Vmax는 정상 상태 역학 분석에 의해 확인하였다. pNPM에 대해 Km은 2.14 mM을 그리고, Vmax는 2.21 U/mg인 것으로 나타났다(도 6).

금속 이온 및 다른 제제가 효소 활성에 미치는 효과

금속 염, PMSF 및 8-하이드록시 퀴놀린을 포함한 다양한 제제가 His-tagged 베타-만노시다제 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 다양한 제제 존재 하에서, pNPM의 가수분해 정도를 측정하여 베타-만노시다제의 효소 활성을 측정하였고, 이러한 활성은 기질별로 다른 영향을 받는 것으로 나타났다. K⁺, Mg²⁺ 또는 Fe²⁺ 와 같은 금속 이온에 의해 효소 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 이에 반해, Ni²⁺, Mn²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, EDTA, SDS, Hg²⁺, PMSF 또는 8-하이드록시 퀴놀린은 효소의 가수분해 활성을 억제함을 확인할 수 있었다. 또한, Ca²⁺ 및 Co⁺는 가수분해 활성에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 5).

현재까지 연구된 대부분의 글리코시데이즈는 그들에 의해 촉매된 효소 반응의 결과 생성물인, 당 첨가에 의해 억제되는 것으로 보고되어 왔고, 다른 단당류에 의해서도 억제되는 것으로 보고되어 왔다. 효소 활성에 미치는 가수분해 반응의 결과 생성물의 효과를 조사하기 위하여, 글루코스, 갈락토스, 리보스, 만노스 및 자일로스의 다양한 농도의 존재하에서의 His-tagged 베타-만노시다제의 pNPM 가수분해 활성을 시험하였다. 글루코스, 갈락토스 및 만노스에 의해서는 pNPM에 대한 가수분해 활성이 미약하게 저해를 받았으며, 오탄당인 자일로스와 리보스에 의해서는 pNPM에 대한 가수분해 활성이 억제되었으며, 특히, 리보스의 농도를 50mM 이상으로 증가시키면 효소활성이 급격히 감소하였다(도 9a - 도 9b).

<110> CTC Bio. <120> A novel beta-Mannosidase and producing method thereof <130> P14-056 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 838 <212> PRT <213> Paenibacillus woosongensis <400> 1 Met Lys Arg Phe Asp Leu Asn Asp Ala Trp Leu Leu His Glu Ala Pro 1 5 10 15 Leu His Trp Gly Arg Asp Ser Leu Ala Ala Val Lys Ala Leu Lys Glu 20 25 30 Gly Trp Tyr Pro Cys Ala Leu Pro Thr Asp Val Arg Ile Pro Leu Ile 35 40 45 Glu His Gly Ile Ile Gln Glu Pro Leu Glu Ser Asp His Ala Leu Ala 50 55 60 Ser Glu Trp Ile Glu Gln Arg Ser Trp Trp Tyr Thr Lys Glu Phe Asp 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ile Asp Phe Asp Ser Asp Ile Ile Glu Leu Val Ile Glu 85 90 95 Thr Ile Asp Thr Asn Ser Asp Ile Phe Val Asn Asp Gln Tyr Val Gly 100 105 110 Ser His Arg Asn Val His Tyr Pro Phe Val Arg Asn Ile Lys Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Ala Gly Lys Asn Thr Leu Thr Val Arg Val Thr Thr Gly Leu 130 135 140 Glu Asp Val Thr Asp Ser Asp Leu Ser Glu Leu Asn Trp Ala Thr Cys 145 150 155 160 Arg Glu Tyr Asp Asn Gly Gly Lys Asp Arg Gly Asp Tyr Arg Arg Ser 165 170 175 Tyr Val Arg Arg Pro Gln Tyr Thr Val Gly Trp Asp Trp Gly Pro Arg 180 185 190 Val Val Thr Cys Gly Leu Gly Gly Asn Ala Tyr Leu Arg Cys Glu Lys 195 200 205 Glu Ile Ala Val Arg Glu Val Lys Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Gln 210 215 220 Thr Ala Arg Leu Lys Ala Thr Val Asn Ile Glu Asn Leu Asp Ile Ile 225 230 235 240 Gly Thr Ile Asn Cys Asp Leu Gln Ile Asp Ile Ser Tyr Asp Gly Gln 245 250 255 Ser Cys Val Thr Lys Lys Leu Glu Asn Leu Leu Leu Thr Ser Gly Thr 260 265 270 Asn Tyr Phe Asp Val Asp Leu Glu Val Glu Asn Ala Arg Leu Trp Trp 275 280 285 Pro Ala Gly His Gly Asp His Pro Leu Tyr Asp Val Arg Val Ser Ala 290 295 300 Thr Ser Ala Asn Ala Lys Thr Glu Tyr Pro Ala Phe Gln Phe Gly Ile 305 310 315 320 Arg Thr Val Glu Leu Asp Thr Ser Ile Leu Arg Gly Glu Glu Arg Asn 325 330 335 Phe Arg Leu Ile Val Asn Gly Val Pro Ile Phe Ser Lys Gly Gly Asn 340 345 350 Trp Val Pro Ala Asp Phe Ile His Ala Arg Val Thr Asp Glu Lys Tyr 355 360 365 Glu Thr Leu Ile Arg Glu Ala Val Glu Ala Asn Phe Asn Met Leu Arg 370 375 380 Val Trp Gly Gly Gly Leu Phe Glu Arg Asp Ile Phe Tyr Asp Leu Cys 385 390 395 400 Asp Arg Asn Gly Leu Leu Val Trp Gln Asp Phe Met Met Ala Cys Ser 405 410 415 Thr Tyr Pro Asp His Lys Arg Glu Phe Arg Asp Glu Met Arg Ala Glu 420 425 430 Met Asp Tyr Gln Thr Lys Arg Leu Arg Asn Arg Ala Ser Ile Ala Leu 435 440 445 Phe Cys Gly Thr Asn Glu Val His Trp Ile Phe Asn Lys Tyr Asp Asn 450 455 460 Pro Arg Trp Gln Ile Glu Phe Lys His Glu Lys Gln Tyr Gly Met Tyr 465 470 475 480 Ile Ala Asn Ile Leu Ala Lys Glu Ile Met Tyr Asn Asn Cys Ser His 485 490 495 Ile Pro Tyr Trp Asn Ser Ser Pro Tyr Gly Gly Ala Leu Pro Asn Asp 500 505 510 Asp Thr Val Gly Asp Val His Arg Trp His Asn Ala Phe Met Ser Leu 515 520 525 Asn Met Asp Glu Arg Ile Glu Pro Met Asp Phe Asp Thr Val Asn Ser 530 535 540 Lys Phe Val Ser Glu Tyr Gly Phe Val Gly Pro Cys Ser Leu Glu Ser 545 550 555 560 Thr Lys Lys Tyr Leu Gly Gly Glu Glu Ile Asp Phe Asp Ser Glu Val 565 570 575 Trp Gln Met His Cys Asn Val Phe Glu Lys Gly Thr Val Val Thr Gly 580 585 590 Ile Ala Lys Asn Tyr Leu Asp Arg Thr Asp Asn Leu Ser Ile Glu Asp 595 600 605 Tyr Leu Leu Tyr Gly Gly Met Val His Ser Leu Met Leu Glu Tyr Ser 610 615 620 Leu Glu Ala Ile Arg Phe Lys Glu Asp Cys Gly Gly Ala Leu Phe Trp 625 630 635 640 Met Tyr Asn Asp Ala Trp Gly Glu Val Gly Trp Thr Ile Ile Asp Tyr 645 650 655 Tyr Leu Ser Arg Lys Ile Pro Tyr Tyr Gly Val Lys Arg Ala Leu Ala 660 665 670 His Thr Lys Leu Ser Met Arg Val Val Asp Gly Asn Val Val Val Gln 675 680 685 Gly Met Asn Asp Thr Ala Glu Lys Val Ser Phe Gln Ala Glu Tyr Gly 690 695 700 Tyr Ile Ser Phe Asp Gly Thr Val Arg Gln Thr Arg Thr Leu Glu Ile 705 710 715 720 Ser Leu Glu Pro His Ser Arg Val Tyr Leu Leu Thr Glu Lys Leu Pro 725 730 735 Asp Gln Asp Tyr Thr Lys Gly Ser Met Met Leu Ile Pro Asp Ser Asp 740 745 750 Thr Val Asn Ser Ile Ser Leu Arg Thr Gly Asp Met Lys Thr Met Val 755 760 765 Phe Asp Pro Ser Pro Val Glu Ile Val Ser Asp Glu Gln Val Gly Ser 770 775 780 Asp Arg Lys Val Thr Leu Thr Ser Lys Gly Tyr Ala His Gly Val Tyr 785 790 795 800 Val Ala Gly Gly Tyr Asp Cys Ser Asp Leu Tyr Phe Asp Leu Leu Pro 805 810 815 Gly Glu Val Lys Thr Ile Thr Val Tyr Ser Ala Gly Ser Glu Ala Leu 820 825 830 Lys Phe Ala Ser Val Arg 835 <210> 2 <211> 2517 <212> DNA <213> Paenibacillus woosongensis <400> 2 atgaaaagat ttgatttaaa cgacgcatgg cttcttcacg aggcgccgct gcactggggc 60 agagacagcc tggcggctgt aaaggctttg aaggaaggct ggtatccctg cgcgcttcca 120 accgatgttc gtattcctct catcgagcat ggcattattc aggagccgct tgagtccgat 180 catgcgctcg ccagcgaatg gatcgaacag cgttcctggt ggtacaccaa ggaattcgat 240 ggcgcgggca tcgattttga cagtgacatt atcgagcttg tgatcgaaac gatcgacacg 300 aacagcgata ttttcgtcaa cgatcaatat gtcggcagcc atcgcaatgt gcattatcct 360 ttcgttcgca atatcaagga cattctgacc gccgggaaaa acacgcttac ggtgcgcgtc 420 actaccgggc tggaggacgt taccgatagc gacttgtcgg agctcaactg ggcgacctgc 480 cgtgaatacg ataacggcgg caaagaccgc ggcgactatc gccgttccta cgtaagacgt 540 ccgcaatata cggtgggctg ggactggggg ccgcgcgttg tcacctgcgg acttggcgga 600 aatgcatacc tgcgctgcga gaaagagatc gcggttcgcg aggtgaagct tgttaccgtt 660 agcgccgccc agacagcccg gcttaaagcg accgttaaca tcgagaacct ggacatcatc 720 gggacgatta actgcgatct gcagatcgac atttcctatg acgggcaatc ctgtgtgacg 780 aagaagctcg agaacctgct tctgacctcc ggcacgaact attttgacgt ggatctcgag 840 gtggagaatg cccggctgtg gtggcctgcg ggacatggcg atcatccgct gtacgatgtg 900 cgggtatctg caacgagtgc gaacgcgaag accgaatatc ctgcattcca atttggcatc 960 cggacggtcg agctggatac gtccatcctg cgcggcgaag agcgcaattt ccggctgatc 1020 gtcaacggcg ttcctatttt cagcaaaggg ggcaactggg ttccagccga tttcatccat 1080 gcccgcgtta ccgacgagaa gtatgaaacc ttgatccgcg aggcggtgga agcgaacttc 1140 aacatgctgc gcgtttgggg cggcggactg tttgagcggg atattttcta cgatctatgc 1200 gaccggaacg gtctgctggt gtggcaggat ttcatgatgg cctgctccac ttatcctgac 1260 cacaaacggg aattccgcga cgagatgcgg gccgagatgg actatcagac caagcgcctg 1320 cgcaaccggg catccattgc cttgttctgc ggaaccaacg aagtccactg gatctttaac 1380 aaatatgaca atccgagatg gcagatcgag tttaagcatg agaagcagta tggcatgtac 1440 atcgcgaata ttctcgccaa agagatcatg tacaacaact gttcccacat tccttactgg 1500 aacagctcgc catacggcgg ggcgcttccg aacgacgata cggtcggcga tgtccaccgc 1560 tggcataacg ccttcatgag cctcaatatg gacgagcgca tcgagccgat ggacttcgat 1620 acagtgaact ccaaattcgt gagcgaatac ggcttcgttg gcccgtgctc tctggagagc 1680 acgaagaagt atttgggcgg ggaagagatc gacttcgaca gcgaagtgtg gcaaatgcac 1740 tgcaacgtgt ttgagaaagg aaccgtcgtc acgggcatcg ctaaaaacta tcttgaccgc 1800 accgacaatt tatccatcga ggactatctg ctgtacggcg gcatggtaca ctcgctcatg 1860 ctggagtatt cgctggaagc gatccgattc aaggaagatt gcggcggcgc gctgttctgg 1920 atgtacaacg atgcctgggg cgaggtcggc tggacgatca tcgattatta tctgagccgc 1980 aaaatcccgt attatggcgt aaaacgcgca ttggctcata cgaagctgtc gatgcgcgtg 2040 gtggatggca acgtcgttgt tcaagggatg aacgatacgg cagagaaggt gagcttccag 2100 gcggaatacg gctatatttc gttcgacgga acagttcggc agacgagaac gctggagatt 2160 tcccttgagc cgcatagccg ggtttacctg cttacggaga agctgccgga tcaggactac 2220 accaaaggca gcatgatgct gattccagat tcggataccg tgaactccat atccctgcgg 2280 acaggcgata tgaagacgat ggtattcgat ccatcgccgg ttgaaatcgt aagcgatgag 2340 caggtcggat cggatcgcaa agttacgctg accagcaaag ggtatgcgca cggtgtgtat 2400 gttgcgggtg gttatgactg ctccgacctc tactttgatt tgctgccggg tgaggtgaag 2460 acgattaccg tctattccgc aggcagtgaa gcgctaaaat ttgcttcggt cagataa 2517 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 3 ggagacatat gaaaagattt gatttaaacg acgc 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 4 aatactcgag tctgaccgaa gcaaatttta gcgc 34

Claims (15)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 베타-만노시다제.
2. 제1항에 있어서, 상기 베타-만노시다제는 페니바실러스 우송엔시스 균주(기탁번호 KCTC 3953)에서 발현된 것을 특징으로 하는 베타-만노시다제.
3. 제1항에 있어서, 상기 베타-만노시다제는 pNP-β-D-만노피라노사이드(mannopyranoside), pNP-α-L-아라비노피라노사이드(Arabinopyranoside), pNP-β-D-갈락토피라노사이드(galactopyranoside), pNP-α-D-갈락토피라노사이드(galactopyranoside), pNP-α-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside) 및 pNP-β-D-글루쿠로나이드(glucuronide)로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 기질의 가수분해반응을 촉매하는 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 베타-만노시다제.
4. 제1항에 있어서, 상기 베타-만노시다제는 하기 (a) - (i)의 특징 중 1 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 베타-만노시다제:
   (a) 등전점 PI 4.5 내지 5.5;
   (b) 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE) 측정 분자량 94.5 - 96 kDa;
   (c) 40 - 52℃ 에서 pNPM에 대한 최대 활성을 나타냄;
   (d) pH 5 - 6.5에서 pNPM에 대한 최대 활성을 나타냄;
   (e) 30℃ 이하에서 2 시간 동안 열안정성을 나타냄;
   (f) pNPM에 대해 Km은 2.14 mM 및 Vmax는 2.21 U/mg를 나타냄;
   (g) K⁺, Mg²⁺ 또는 Fe²⁺ 첨가시 효소 활성이 증가됨;
   (h) Ni²⁺, Mn²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, EDTA, SDS, Hg²⁺, PMSF 또는 8-하이드록시 퀴놀린 첨가시 효소 활성이 감소됨; 또는
   (i) 글루코스, 갈락토스, 리보스, 만노스 및 자일로스로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 당류 첨가시 효소 활성이 감소됨.
5. 제1항의 베타-만노시다제를 코딩하는 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
7. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
8. 제5항의 핵산 분자 또는 제7항의 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
9. 제8항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-만노시다제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-만노시다제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-만노시다제 제조방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 베타-만노시다제는 C 말단에 6개의 히스티딘을 태깅한 융합 단백질로 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL을 배양하여 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-만노시다제를 균체파쇄상등액으로부터 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-만노시다제 제조방법.
11. 제1항의 베타-만노시다제를 포함하는 조성물.
12. 제1항의 베타-만노시다제를 첨가하여 만노스를 주성분으로 하는 당류를 분해하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 만노스를 주성분으로 하는 당류는 만노올리고사카라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제12항의 방법에 따라 만노스를 제조하는 방법.
15. 바이오매스에 제1항의 베타-만노시다제를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법.

Images