KR20160042283A

KR20160042283A - Composition for anticancer comprising Protaetia brebitarsis larva or its fraction as effective component

Info

Publication number: KR20160042283A
Application number: KR1020140135592A
Authority: KR
Inventors: 윤은영; 황재삼; 구태원; 강병헌; 이지은; 조다은; 이안중
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 울산과학기술원
Priority date: 2014-10-08
Filing date: 2014-10-08
Publication date: 2016-04-19

Abstract

본 발명은 흰점박이 꽃무지 유충 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항암효과를 갖는 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물의 제조방법은, 흰점박이 꽃무지 유충을 고압멸균한 한 후 이를 동결건조 한 다음, 이를 분쇄하는 제1단계, 상기 제1단계에서 분쇄된 흰점박이 꽃무지 유충분말과 에탄올을 혼합하여 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계에서 제조된 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는 제3단계를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 흰점박이 꽃무지 유충, 또는 이들의 분획물을 유효성분으로 포함하여, 항암용 조성물이 제공된다.The present invention relates to an anticancer composition comprising as an active ingredient a white spotted flower larva or a fraction thereof.
The present invention provides a method for preparing a white spotted flower larva-derived fraction having anticancer effect, comprising the steps of: high-pressure sterilization of white spotted flower larvae followed by lyophilization and then pulverizing the same; A second step for preparing a white spotted mugwort ethanol extract by mixing white spotted mugwort larvae and ethanol, and then extracting the white spotted mugwort ethanol extract prepared in the second step sequentially with hexane, ethyl acetate, butanol and water And a third step of obtaining a fraction.
According to the present invention, there is provided an anticancer composition comprising, as an effective ingredient, white spotted flower larva or fraction thereof.

Description

TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a composition for anticancer comprising a white spotted flower larva or fraction thereof as an active ingredient.

본 발명은 흰점박이 꽃무지 유충 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 흰점박이 꽃무지 유충을 암을 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로 사용할 수 있을 뿐 아니라 식품류 및 차 등의 식품조성물로서도 유용하게 사용가능하도록 한 흰점박이 꽃무지 유충 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to an anticancer composition comprising a white spotted flower larva or a fraction thereof as an active ingredient. More particularly, the present invention relates to a composition for preventing and treating cancer, The present invention also relates to an anticancer composition comprising the white spotted flower larva or the fraction thereof as an effective ingredient.

환경의 악화와 노년인구의 증가로 세계 암 발생률이 매년 5%이상 증가하고 있으며, 1997년 암을 원인으로 한 사망자가 600만 명으로 세계 사망률의 12%에 달했다. 국내에서도 매년 10만 명의 암환자가 새롭게 발생하고 5만여명이 매년 사망하고 있으며, 암환자 증가율도 10%에 이르고 있다. 1999년 국립암센터의 통계에 따르면 환자는 12만 명으로서 남자는 위암(24%), 간암(16%), 폐암(16%), 대장암(10%)의 순서이며, 여자는 위암(16%), 자궁경부암(12%), 유방암(15%), 대장암(10%)의 순서로 암 환자가 발생했다.The global cancer incidence is increasing by more than 5% annually due to the deterioration of the environment and the aging population. In 1997, the number of cancer deaths reached 6 million, or 12% of the global death rate. In Korea, 100,000 cancer patients develop annually, more than 50,000 people die each year, and the cancer patient growth rate reaches 10%. According to statistics of the National Cancer Center in 1999, the number of patients was 120,000, and the order of gastric cancer (24%), liver cancer (16%), lung cancer (16%) and colon cancer ), Cervical cancer (12%), breast cancer (15%) and colorectal cancer (10%).

이 중 간암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 6번째로 흔하게 진단되어지는 악성종양으로, 암으로 인한 사망률에서는 3번째에 랭크되어 있는 질환이다. 현재, HCC에 대한 주요한 치료기법으로는 외과적인 수술, 간이식, 부분절제 등이 일반적으로 사용되고 있으나, 많은 경우의 진행된 HCC에 대해서는 뚜렷한 치료법이 없는 상황이다. 더욱이, HCC를 치료하기 위해 활용할 수 있는 약효가 좋은 항암치료제가 없는 실정으로, 넥사바(sorafenib)가 HCC치료에 제한적인 약효임에도 불구하고 처방되고 있다.Hepatocellular carcinoma (HCC) is the sixth most commonly diagnosed malignancy, the third most common cancer-causing mortality. Currently, surgical treatment, liver transplantation, and partial resection are generally used as the main treatment modalities for HCC, but there is no clear treatment for advanced HCC in many cases. Moreover, since there is no effective chemotherapeutic agent available to treat HCC, sorafenib has been prescribed even though it has a limited effect on HCC treatment.

또한, 지금까지 항암제 연구는 암세포처럼 세포분열이 왕성한 조직에 대한 세포독성을 근거로 하여 행하여지기 때문에 세포분열이 빠른 피부, 점막, 골수 같은 정상조직 세포에도 독성을 나타내게 된다. 따라서 효과적인 항암제 개발을 위해서는 암세포에만 특이적으로 작용하고 정상세포에 대해서는 독성이 적은 항암 활성물질의 탐색이 이루어져야 한다. 현재 식물과 미생물 등에서 추출한 항암물질에 대한 연구가 많이 진행되고 있으나, 이들 대부분이 미생물의 2차 대사산물이거나 생약재에서 추출된 물질에 관한 연구가 주를 이루고 있다.In addition, up to now, anticancer drug research is based on the cytotoxicity of cancerous cells such as cancer cells, so that they are toxic to normal tissue cells such as skin, mucous membrane and bone marrow, which are rapidly dividing cells. Therefore, in order to develop an effective anticancer agent, it is necessary to search for an anticancer active substance which acts specifically on cancer cells and which is less toxic to normal cells. Currently, many researches on anticancer substances extracted from plants and microorganisms have been carried out, but most of them are mainly secondary metabolites of microorganisms or studies on the substances extracted from herbal medicines.

관련 선행기술로는 한국공개특허 10-2005-0051180호 "밀리타리스 동충하초 추출물을 함유하는 항암용 조성물"에 관한 것이 공개되어 있다.Related prior arts are disclosed in Korean Patent Laid-Open No. 10-2005-0051180 entitled " Anticancer composition containing Millitaredus Cordyceps extracts ".

그러나, 아직까지는 흰점박이 꽃무지 유충을 대상으로 유효성분을 추출해 내어 이를 포함하는 항암용 조성물에 대해서는 알려진 바가 없다.
However, it has not yet been known about the composition for extracting an effective ingredient from the white spotted moth larva and containing the same.

본 발명의 목적은 여러 곤충들 중 흰점박이 꽃무지를 대상으로 항암효능을 나타내는 성분을 함유하고 있는지를 확인한 후, 이를 통하여 상기 흰점박이 꽃무지의 다양한 유용성을 밝히는데 그 목적이 있다.It is an object of the present invention to find out the various usefulness of the white spotted flowers by confirming whether the white spotted flowers of various insects contain components exhibiting anticancer efficacy.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not intended to limit the invention to the particular embodiments that are described. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not restrictive of the invention, There will be.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항암용 약학적 조성물은 암예방 및 치료효과를 나타내는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 또는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 유래 분획물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.In order to achieve the above object, the anticancer pharmaceutical composition of the present invention comprises a fraction derived from a white spotted flower larva (Protaetia breitarsis larva) or a white spotted flower larva (Protaetia breitarsis larva) .

또한, 본 발명의 식품 조성물은 암예방 및 치료효과를 나타내는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 또는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 유래 분획물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.In addition, the food composition of the present invention is characterized by containing as an active ingredient a fraction derived from a white spotted flower larva (Protaetia breitarsis larva) or a white spotted flower larva (Protaetia breitarsis larva) showing the effect of preventing and treating cancer.

상기 분획물은 상기 흰점박이 꽃무지 유충을 에탄올로 추출한 후 이를 분획하여 얻은 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 중 어느 하나 이상으로 이루어진 것이 특징이다.The fraction is characterized in that it is composed of at least one of hexane fraction or ethyl acetate fraction obtained by extracting the white spotted spotted larva with ethanol and then fractionating it.

상기 암은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암 중 선택된 1종이상인 것이 특징이다.The cancer is characterized in that it is selected from the group consisting of prostate cancer, cervical cancer, liver cancer, rectal cancer, lung cancer, breast cancer, and ovarian cancer.

본 발명의 항암효과를 갖는 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물의 제조방법은, 흰점박이 꽃무지 유충을 고압멸균한 한 후 이를 동결건조 한 다음, 이를 분쇄하는 제1단계, 상기 제1단계에서 분쇄된 흰점박이 꽃무지 유충분말과 에탄올을 혼합하여 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계에서 제조된 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는 제3단계를 포함하는 것이 특징이다. The present invention provides a method for preparing a white spotted flower larva-derived fraction having anticancer effect, comprising the steps of: high-pressure sterilization of white spotted flower larvae followed by lyophilization and then pulverizing the same; A second step for preparing a white spotted mugwort ethanol extract by mixing white spotted mugwort larvae and ethanol, and then extracting the white spotted mugwort ethanol extract prepared in the second step sequentially with hexane, ethyl acetate, butanol and water And a third step of obtaining a fraction.

상기 제2단계의 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물은 상기 에탄올 12ℓ당 상기 분쇄된 흰점박이 꽃무지 유충분말 10~12kg을 혼합시키는 것이 특징이다.
The second step of the present invention is characterized in that 10 to 12 kg of the powdered white spotted spotted mushroom powder is mixed per 12 liters of the ethanol.

본 발명에 의해, 흰점박이 꽃무지 유충, 또는 이들의 분획물에서 항암활성이 실제로 존재함을 생화학적, 세포생물학적 분석방법으로 확인함으로써, 향후 항암활성을 가진 물질을 분리할 수 있는 가능성이 있게 된다.According to the present invention, it is possible to isolate a substance having an anticancer activity in the future by confirming that the anticancer activity actually exists in the white spotted moth larvae or fractions thereof by biochemical and cell biological analysis methods.

또한, 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물의 자가소화작용(autophagy) 유도 활성을 확인함으로써, 세포죽음조절 뿐만 아니라 세포보호 효과를 줄 수 있는 활성물질을 분리할 수 있는 가능성을 제시할 수 있게 된다.
In addition, by confirming the autophagy-inducing activity of the white spotted flower larva-derived fraction, it is possible to provide a possibility of isolating an active substance capable of providing cell protection as well as cell death control.

도 1A는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 마우스 몸무게 변화를 나타낸 도면이다.
: 50mg/kg DEN 또는 PBS는 복강투여로 일주일에 한번 수행하고 0.5g/kg PBL 분말 또는 saline은 설명한 것처럼 경구를 통한 위관영양법으로 주입하였다. 나타낸 몸무게 변화는 DEN 처리 전 몸무게와 비교하여 나타내었다.
도 1B, 1C, 1D는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 혈액분석결과를 나타낸 도면이다.
: DEN을 처리한 5주 또는 10주 마우스로부터 혈장 샘플을 수집하고 ALP, ALT, AST의 효소 활성을 측정하였다.
도 1E는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 간의 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해 나타낸 도면이다.
: PBL분말을 주입하거나 주입하지 않은 DEN을 처리한 지 13주된 마우스를 죽여 간을 분리하였다. 간 조직은 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다.
도 1F는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 간에서 관들의 수와 크기의 정량을 나타낸 도면이다.
: 50㎛보다 크거나 작은 관들의 수는 H&E 염색을 수행한 간 이미지를 현미경 하에 셈을 하였다.
도 2A는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 비대해진 간세포를 나타낸 도면이다.
: DEN과 PBL분말을 처리한 간 조직은 H&E 염색을 통해 나타내었다.
도 2B는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 간에서 지방 축적정도를 나타낸 도면이다.
: 간에서 지방축적은 H&E 염색으로 분석하였으며, 50μm 보다 큰 액포는 비정상적인 지방축적으로 간주하고 정량하였다.
도 2C는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 간 조직의 TUNEL 염색하여 나타낸 도면이다.
: 간 조직은 TUNEL 염색에 의해 분석하였으며, 현미경 필드당 TUNEL 양성반응을 나타내는 세포를 평균내었다.
도 2D는 실시예1의 PBL분말의 간보호효과를 확인하고자 Ki-67 염색하여 나타낸 도면이다.
: 간 조직은 Ki-67을 이용한 면역조직화학법에 의해 실험하였으며, 현미경 필드당 Ki-67 양성반응을 나타내는 세포를 평균내었다. 현미경 이미지는 최소한 4개의 다른 필드에서 분석하고 정량하였다.
도 3A는 HepG2에서 실시예2의 PBL분말 유래 분획물들의 세포독성효과를 나타낸 도면이다.
: HepG2 세포는 지시된 농도로 24시간 동안 분획물들을 처리하였으며, 세포생존능은 MTT에 의해 분석하였다.
도 3B는 정상적인 간세포에서의 세포독성을 나타낸 도면이다.
: 마우스 간으로부터 분리된 간세포는 지시된 농도로 24시간 동안 분획물들을 처리하였으며, 세포생존능은 MTT에 의해 분석하였다.
도 3C는 다양한 세포 형태에서의 세포독성을 나타낸 도면이다.
: 인간 전립선(PC3 and 22Rv1), 자궁근종(HeLa), 간(PLC/PRF5, HepG2, and Hep3B), 결장(HCT116), 폐(NCI-H460), 유방(MDA-MB-231), 그리고 난소(SK-OV3)로부터 유래한 암세포는 2mg/ml의 농도에서 24시간 동안 분획물들을 처리하고 MTT로 분석하였다.
도 4A는 SK-HEP-1과 HepG2의 FACS 분석결과를 나타낸 도면이다.
: 실시예 2의 PBL 분말 유래 헥산, 에틸아세테이트 그리고 부탄올 분획물 2mg/ml씩을 24시간 동안 처리하였으며, 세포들은 FLICA-DEVD-fmk와 propidium iodide로 표지하고 FACS로 분석하였다.
도 4B는 미토콘드리아 막 전위를 나타낸 도면이다.
: HepG2 세포는 TMRM으로 표지하고 실시예 2의 PBL 분말 유래 헥산, 에틸아세테이트 그리고 부탄올 분획물 2mg/ml로 처리하였다. 세포는 형광현미경으로 이미지 하였다.
도 4C는 막 전위의 정량을 나타낸 도면이다.
: TMRM으로 표지된 HepG2 세포의 형광이미지는 DMSO를 대조군으로 비교하여 분석하였다.
도 5A 및 도 5B는 자가포식소체(Autophagosome) 유도능을 나타낸 도면이다.
: LC3-GFP가 감염(transfect)된 세포는 실시예 2의 PBL 분말 유래 에틸아세테이트 (6시간), 헥산 (24시간), 부탄올(24시간) 분획물을 1mg/ml로 주어진 시간 동안 처리하고 형광현미경으로 분석하였다.
도 5C는 LC3 접합(conjugation)의 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 나타낸 도면이다.
: 세포는 24시간동안 1mg/ml로 처리하였고 western blotting으로 분석하였다.1A is a diagram showing mouse weight change in order to confirm the liver protecting effect of the PBL powder of Example 1. Fig.
: 50 mg / kg DEN or PBS was administered once a week for intraperitoneal administration and 0.5 g / kg PBL powder or saline was injected via oral gavage as described. The weight changes shown were compared with the weight before DEN treatment.
1B, 1C and 1D are graphs showing blood analysis results to confirm the liver protection effect of the PBL powder of Example 1. Fig.
: Plasma samples were collected from 5 or 10 week old mice treated with DEN and the enzymatic activities of ALP, ALT and AST were measured.
FIG. 1E is a diagram showing hematoxylin and eosin staining to confirm the liver protecting effect of the PBL powder of Example 1. FIG.
: 13 weeks old mice treated with PBL powder or uninjected DEN were killed and liver was isolated. Liver tissue was stained with hematoxylin and eosin.
1F is a graph showing the quantification of the number and size of the tubes in the liver to confirm the liver protection effect of the PBL powder of Example 1. Fig.
: The number of tubes larger than or smaller than 50 μm was counted under a microscope for liver images obtained by H & E staining.
2A is a diagram showing hepatocytes enlarged in order to confirm liver protection effect of the PBL powder of Example 1. Fig.
: The liver tissues treated with DEN and PBL powder were indicated by H & E staining.
FIG. 2B is a graph showing the degree of fat accumulation in the liver to confirm the liver protecting effect of the PBL powder of Example 1. FIG.
: Lipid accumulation in the liver was analyzed by H & E staining, and vacuoles larger than 50 μm were regarded as abnormal fat accumulation and quantified.
FIG. 2C is a diagram showing TUNEL staining of liver tissue to confirm the liver protecting effect of the PBL powder of Example 1. FIG.
: Liver tissue was analyzed by TUNEL staining and averaged TUNEL positive cells per microscope field.
2D is a diagram showing Ki-67 staining to confirm the liver protecting effect of the PBL powder of Example 1. Fig.
: Liver tissue was examined by immunohistochemistry using Ki-67 and averaged Ki-67 positive cells per microscope field. Microscopic images were analyzed and quantified in at least four different fields.
3A shows the cytotoxic effect of the PBL powder-derived fractions of Example 2 in HepG2.
: HepG2 cells were treated with the indicated concentrations for 24 hours and cell viability was assayed by MTT.
3B is a graph showing cytotoxicity in normal hepatocytes.
: Hepatocytes isolated from mouse liver were treated with the indicated concentrations for 24 hours and cell viability was assayed by MTT.
Figure 3C is a diagram showing cytotoxicity in various cell types.
: Human prostate (PC3 and 22Rv1), uterine myoma (HeLa), liver (PLC / PRF5, HepG2, and Hep3B), colon (HCT116), lung (NCI-H460) (SK-OV3), the fractions were treated for 24 hours at a concentration of 2 mg / ml and analyzed by MTT.
4A is a graph showing FACS analysis results of SK-HEP-1 and HepG2.
: 2 mg / ml of hexane, ethyl acetate and butanol fractions derived from PBL powder of Example 2 were treated for 24 hours. Cells were labeled with FLICA-DEVD-fmk and propidium iodide and analyzed by FACS.
4B is a diagram showing the mitochondrial membrane potential.
: HepG2 cells were labeled with TMRM and treated with 2 mg / ml of hexane, ethyl acetate and butanol fractions derived from PBL powder from Example 2. Cells were imaged by fluorescence microscopy.
4C is a view showing the quantification of the film potential.
: Fluorescence images of HepG2 cells labeled with TMRM were analyzed by comparing DMSO as a control.
5A and 5B are diagrams showing autophagosome inducing ability.
: Cells transfected with LC3-GFP were treated with PBL powder-derived ethyl acetate (6 hours), hexane (24 hours), and butanol (24 hours) fractions of Example 2 at 1 mg / ml for the given time, Respectively.
Figure 5C is a Western blot analysis of LC3 conjugation.
Cells were treated with 1 mg / ml for 24 h and analyzed by western blotting.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in detail, and a detailed description of known functions and configurations that may unnecessarily obscure the gist of the present invention will be omitted.

설치류에서 어떤 독성 화학물의 지속적인 투여는 인간의 간암 발달 과정을 모방한 지방간, 간의 염증, 간경변, 최종적으로는 암을 유도할 수 있다. DEN(diethylnitrosamine)은 인간간질환의 조직학적 유전학적 특성과 비슷한 간독성을 유도할 수 있는 유전독성물질이다. Continuous administration of certain toxic chemicals in rodents can lead to fatty liver, inflammation of the liver, liver cirrhosis, and finally cancer mimicking the development of human liver cancer. DEN (diethylnitrosamine) is a genotoxic substance that can induce hepatotoxicity similar to that of human liver disease.

주로 간에서 발현되는 시토크롬(cytochrome) P450은 간세포에서 약물을 활성화시키기 위해 DEN을 수산화시켜 활성산소종을 증가시키고 DNA를 손상시킨다. DEN을 처리한 설치류 모델은 생체 내에서 생물활성물질의 간보호와 항종양 활성을 실험하기 위해 널리 이용되고 있다.Cytochrome P450, mainly expressed in liver, hydroxylates DEN to activate the drug in hepatocytes, increasing reactive oxygen species and damaging DNA. DEN-treated rodent models are widely used in vivo to test liver protection and antitumor activity of biologically active substances.

대부분의 간암 환자들은 B, C 간염바이러스에 의한 바이러스 감염, 알코올성 간질환, 지방간과 같은 만성 간질환을 가지고 있다. 만성 간질환은 간암환자의 80% 이상이 간경변 상태에 있다고 고려되는데 간암의 중요한 위험인자 중 하나로서 간경변으로 진행할 가능성이 크다. 전신화학요법은 수술을통해 제거할 수 없는 진행된 간암세포를 가진 환자들을 치료하는데 효과적이지 않은 반면 간 수술은 간암환자를 치료할 수 있는 가장 효과적인 방법이다. 소분자멀티키나제로 알려진 Sorafenib은 간암환자에 대한 이로운 효과들을 제한하는 것으로 보여진다.Most patients with liver cancer have chronic liver disease such as viral infections caused by hepatitis B and C virus, alcoholic liver disease, and fatty liver. In chronic liver disease, more than 80% of patients with liver cancer are thought to be in the cirrhosis state, which is one of the important risk factors of liver cancer. While systemic chemotherapy is not effective in treating patients with advanced liver cancer cells that can not be removed surgically, liver surgery is the most effective way to treat patients with liver cancer. Sorafenib, known as small molecule multi-kinase, appears to limit beneficial effects on patients with liver cancer.

이에 본 발명에서는 상기 문제점을 해소하기 위해 여러 연구한 결과, 천연물질 중 특히 통상적으로 간질환에 효과가 있다고 알려진 흰점박이 꽃무지(Protaetia brebitarsis)가 항암활성을 나타내는지를 확인하고자 한다.Accordingly, in order to solve the above problems, the present invention has been made in order to find out whether Protaetia breitarsis, which is known to be effective for liver diseases, exhibits anticancer activity.

우선, 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva, 이하 PBL이라 명명함)의 동결건조분말과 이들의 분획물들을 준비하였다. PBL의 경구투여는 생체 내 마우스 모델에서 DEN이 유도하는 간 손상을 줄였다. PBL 분획물은 생체 외 실험에서 간 암세포 주에 대해 세포자살과 자식작용을 통한 세포독성활성을 보여준다.First, lyophilized powders of white spotted flower larvae (Protaetia brebitarsis larva, hereinafter referred to as PBL) and their fractions were prepared. Oral administration of PBL reduced DEN-induced liver damage in an in vivo mouse model. PBL fractions show cytotoxic activity through cell suicide and child action in liver cancer cell lines in vitro.

다시 말해 PBL이 만성적인 간 손상에서 간암으로 이어지는 것을 억제시키는 이로운 효과뿐 아니라 항암활성을 가지는 물질을 포함시킴을 알 수 있다.
In other words, it can be seen that PBL contains a substance having anticancer activity as well as a beneficial effect of inhibiting the progression from chronic liver damage to liver cancer.

이하, 본 발명인 항암 효과를 갖는 흰점박이 꽃무지의 분획물의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the method for producing the isolated white spotted flowers having anticancer effect according to the present invention will be described in detail.

1. 제 1단계; 흰점박이 꽃무지 유충 분쇄1. First step; White spotted flower larvae crushing

본 발명은 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)을 준비한다.The present invention provides white spotted larvae (Protaetia breitarsis larva).

설명하면, 상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brebitarsis)는 딱정벌레목 꽃무지과에 속하는 곤충으로, 한국, 일본, 러시아 등에 분포하며 성충은 늦봄부터 가을까지 볼 수 있으나 한여름에 많이 활동하며, 참나무의 진뿐만 아니라 자두나무, 살구나무, 포도나무 등에도 모이며 수박과 같은 과일에도 잘 모이는 것으로 알려져 있다. As described above, the white spotted flower (Protaetia brebitarsis) is an insect belonging to the beetle, and it is distributed in Korea, Japan, Russia, etc. Adults can be seen from late spring to autumn, Plum trees, apricot trees, vines, etc. It is also known to gather well in fruits such as watermelon.

흰점박이꽃무지의 몸 길이는 보통 17~22mm이며, 몸은 광택이 강한 녹갈색이나 구릿빛 또는 붉은빛을 띠는데 녹색, 남색, 흑남색, 흑자색 등의 변이도 있다.The white spotted flower is usually 17 ~ 22mm in length. The body is bright green, brown or red, with green, blue, black and purple.

이러한 상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brebitarsis)는 항암효과를 나타내는 유효성분이 최대로 함유되어 있는 흰점박이 꽃무지 유충을 사용하는 것이 좋다.Protaetia breitarsis is preferably a white spotted larva having an anticancer effect.

상기 준비된 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)은 고압멸균한 후 이를 동결건조 한 다음, 이를 분쇄하여 분말형태로 제조한다.The prepared white spotted flower larva (Protaetia brebitarsis larva) is sterilized by high pressure, lyophilized, and then pulverized to prepare a powdery form.

다시말해, 상기 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)에는 다량의 수분이 함유되어 있기 때문에 수분이 완전히 없는 상태로 만들기 위해서는 건조과정을 거쳐야 한다. 이때, 상기 흰점박이 꽃무지가 함유하고 있는 유효성분들의 변화를 최소화시키기 위해 동결건조를 통해 건조를 하는 것이 좋다.In other words, the white spotted flower larva (Protaetia brebitarsis larva) contains a large amount of water, and therefore, it must undergo a drying process in order to completely remove moisture. At this time, it is preferable to dry through the freeze-drying to minimize the change of the active ingredients contained in the white spotted flowers.

그 다음 하기 추출의 용이성을 위해 상기 건조된 흰점박이 꽃무지는 분쇄기를 이용하여 분말형태로 제조된다.
The dried white spotted flowers are then prepared in powder form using a pulverizer for ease of subsequent extraction.

2. 제 2단계; 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물 제조2. The second step; Manufacture of white spotted blossom plain ethanol extract

본 단계에서는 상기 제조한 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 분말을 에탄올과 혼합하여 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물을 제조한다.In this step, the above-prepared white spotted flower larvae (Protaetia breitarsis larva) powder is mixed with ethanol to prepare a white spotted flower ethanol extract.

이때, 상기 에탄올 12ℓ당 상기 분쇄된 흰점박이 꽃무지 유충분말 10~12kg을 혼합하는 것이 좋으며, 사용된 에탄올은 어떠한 것을 사용하여도 무관하나, 흰점박이 꽃무지 내에 함유된 유효성분을 가장 적절히 추출할 수 있도록 90~95%의 에탄올을 사용하는 것이 좋다.At this time, it is preferable to mix 10 to 12 kg of the above-ground white spotted spotted larvae powder per 12 liters of ethanol, and any ethanol may be used, but the most effective extraction of the active ingredients contained in the white spotted flower It is recommended to use 90 ~ 95% ethanol to make it.

상기 흰점박이 꽃무지 유충 분말은 에탄올에 완전히 침지시킨 다음 이를 상온(20~25℃)에서 5~10일 동안 추출한 후 진공증발기를 이용하여 용매를 제거하여 추출물을 제조할 시 단시간에 흰점박이 꽃무지의 유효성분이 다량 함유된 추출물을 제조하게 된다.
The white spotted moth larvae are completely immersed in ethanol and then extracted at room temperature (20 to 25 ° C) for 5 to 10 days. Then, the solvent is removed by using a vacuum evaporator to produce an extract, Of the extract of the present invention.

3. 제 3단계; 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물 제조3. The third step; Fractionation of white spider mite larvae

본 단계에서는 상기 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차적으로 분획하여 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물을 획득한다.In this step, the white spotted flower non-ethanol extract is sequentially fractionated with hexane, ethyl acetate, butanol, and water to obtain a white spotted flower larva-derived fraction.

이렇게 제조된 상기 흰점박이 꽃무지 유충분말 또는 이들의 분획물에는 항암활성을 나타내는 유효성분이 함유되게 되어 보다 경제적으로 항암효과를 나타내는 약학 또는 식품 조성물을 제공할 수 있게 된다.
The white spotted spotted broad bean powder or fractions thereof thus prepared contain an active ingredient exhibiting anticancer activity, thereby providing a pharmaceutical or food composition exhibiting more economical anti-cancer effects.

이하, 본 발명인 항암 효과를 나타내는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 및 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 또는 식품 조성물에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, a pharmaceutical composition or a food composition comprising the white spotted spider mite larvae (Protataetia brebitarsis larva) and fractions thereof showing the anticancer effect of the present invention as an active ingredient will be described in detail.

설명하면, 본 발명에는 상기 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva), 또는 이들의 분획물이 항암용 약학조성물의 유효성분으로 포함된다.In the present invention, the above-mentioned Protaetia breitarsis larva, or a fraction thereof, is contained as an active ingredient of the anticancer pharmaceutical composition.

이때, 상기 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 또는 이의 분획물은 상기 약학조성물 전체 중량을 기준으로 0.01~50중량% 함유되는 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 0.1~20중량%를 함유하는 것이 좋다. 이는 상기 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 또는 이의 분획물이 0.01 중량%미만으로 함유되는 경우 항암효과가 떨어져 본 발명이 목적하는 항암용으로 사용하기 적합하지 않으며, 50 중량%를 초과하여 함유되는 경우 오히려 사용되는 유기용제로 인한 악영향이 발생될 우려가 있다.At this time, the white spotted spotted larva or fraction thereof is preferably contained in an amount of 0.01 to 50% by weight, more preferably 0.1 to 20% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition. This is because when the white spotted flower larvae or fraction thereof is contained in an amount of less than 0.01% by weight, the anticancer effect is poor and the present invention is not suitable for use for the desired anticancer agent. When the content of the protaetia breitarsis larva is more than 50% There is a possibility that an adverse effect due to the organic solvent used may occur.

이러한 상기 본 발명의 약학 조성물은 암 예방 및 치료를 목적으로 항암효과를 갖는 천연물의약품에 함유될 수 있다. 이때 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. Such a pharmaceutical composition of the present invention can be contained in a natural medicine having anticancer effect for the purpose of prevention and treatment of cancer. In this case, according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs, the preparation is carried out in the form of a unit dose form by using a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, .

이때 제형은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다. 즉, 이는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 선정하여 이루어질 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 선택될 수 있음을 의미한다.The formulations may be in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids or rings, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents. That is, it can be selected without difficulty by those skilled in the art depending on the purpose of use, and the addition amount thereof can be selected within a range that does not impair the purpose and effect of the present invention.

상기 약학적으로 허용되는 담체로는 제제 할 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 또한, 약학적으로 허용되는 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Examples of the pharmaceutically acceptable carriers include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline Cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and also pharmaceutically acceptable excipients Include, but are not limited to, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives and the like.

또 다른 관점에서의 본 발명에서는 상기 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 또는 이의 분획물을 암 예방 및 개선용을 목적으로 식품 조성물의 유효성분으로 포함한다. 즉, 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 또는 이의 분획물을 식품 조성물의 유효성분으로 사용할 경우, 상기 그대로 사용하거나 다른 통상의 식품 조성물의 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품용 조성물 제조시에는 유효성분의 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다.In another aspect of the present invention, the above-mentioned white spotted flower larva (Protataetia brebitarsis larva) or a fraction thereof is included as an active ingredient of a food composition for the purpose of preventing and improving cancer. That is, when the white spotted larvae or fractions thereof are used as an active ingredient of a food composition, they can be used as they are or can be used together with components of other common food compositions and can be used appropriately according to a conventional method . The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, when the food composition is prepared, it is added in an amount of 0.01 to 10 parts by weight, preferably 0.05 to 1 part by weight, based on the raw material of the active ingredient.

그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.However, in the case of long-term consumption intended for health or hygiene purposes or for health control purposes, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount exceeding the above range.

이러한 상기 식품용 조성물은 암 예방 및 개선을 위한 목적으로 건강식품에 함유될 수 있으며 그 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.Such a food composition may be contained in a health food for the purpose of prevention and improvement of cancer, and the kind thereof is not particularly limited. Examples of the food to which the above substances can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include healthy foods in a conventional sense.

상기 외에 본 발명의 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육으로 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
In addition to the above, the food composition of the present invention may further contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the food composition of the present invention may be contained as pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drink and vegetable drink. These components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.

이하에서는 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예 및 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. However, these Examples and Experimental Examples are for illustrative purposes only and do not limit the scope of protection of the present invention.

<실시예 1> 본 발명의 항암 효과를 갖는 흰점박이 꽃무지 유충분말 제조 <Example 1> Production of white spotted moth larva powder having anticancer effect of the present invention

흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)은 한국 남양주에 위치해 있는 스머프곤충나라 농장에서 25℃, 75% 습도에서 키웠다. Protaetia brebitarsis larva grew at a temperature of 25 ℃ and 75% humidity on a smurf insect country farm located in Namyangju, Korea.

길이는 28~35 mm이고, 직경은 5~7 mm인 유충을 모아서 121℃, 1.3kgf/cm²에서 10분 동안 고온 고압 멸균하였다. The larvae of 28 to 35 mm in length and 5 to 7 mm in diameter were collected and autoclaved at 121 ° C and 1.3 kgf / cm ² for 10 minutes.

멸균된 유충은 -80℃ CLN-70CW 급속냉동 냉장고에서 얼린 다음 FD-1000 냉동건조기로 건조한 후 분쇄하여 본 발명의 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva, 이하, PBL이라고 명명함)의 분말을 제조하였다.
The sterilized larvae were frozen at -80 ° C in a CLN-70CW rapid freezing refrigerator, dried with an FD-1000 freeze drier and pulverized to prepare a powder of the white spotted flower larva of the present invention (hereinafter referred to as PBL) Respectively.

<실시예 2> 본 발명의 항암 효과를 갖는 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물 제조 <Example 2> Production of a fraction derived from a white spider mite larva having anticancer effect of the present invention

상기 실시예 1에서 제조된 PBL분말 12kg을 상온에서 7일동안 95%의 에탄올(EtOH) 12L로 2회 환류하였다. 추출물이 걸러진 후 진공증발기를 이용하여 용매를 제거하였다. 12 kg of the PBL powder prepared in Example 1 was refluxed twice with 12 L of 95% ethanol (EtOH) at room temperature for 7 days. After the extract was filtered, the solvent was removed using a vacuum evaporator.

결합된 에탄올 추출물은 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분할하였고 각각 313.90g, 1.20g, 24.90g, 39.03g으로 제공되었다.
The combined ethanol extracts were partitioned into hexane, ethyl acetate, butanol and water to give 313.90 g, 1.20 g, 24.90 g and 39.03 g, respectively.

<실시예 3> 본 발명의 항암 효과를 갖는 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물을 포함하는 정제 제조<Example 3> Preparation of tablets containing the fraction derived from white spotted moth larva having anticancer effect of the present invention

실시예 2의 흰점박이 꽃무지 유충 유래 헥산 분획물...........200 ㎎The hexane fraction derived from the white spotted moth larva of Example 2 ... 200 mg

유당........................................100 ㎎Lactose ........................................ 100 mg

전분........................................100 ㎎Starch ........................................ 100 mg

스테아린산 마그네슘 적량Magnesium stearate qs

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다
The above components are mixed and tablets are prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets

<실시예 4> 본 발명의 항암 효과를 갖는 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물을 포함하는 건강식품 제조<Example 4> Preparation of health food containing the fraction derived from white spotted moth larva having anticancer effect of the present invention

실시예 2의 흰점박이 꽃무지 유충 유래 에틸아세테이트 분획물...1000 ㎎The ethyl acetate fraction derived from the white spotted flower larva of Example 2 ... 1000 mg

비타민 혼합물..............................적량Vitamin mixture ..............................

비타민 A 아세테이트........................70 ㎍Vitamin A Acetate .................... 70 ㎍

비타민 E..................................1.0 ㎎Vitamin E .................................. 1.0 mg

비타민 B1.................................0.13 ㎎Vitamin B1 ................................. 0.13 mg

비타민 B2.................................0.15 ㎎Vitamin B2 ................................. 0.15 mg

비타민 B6.................................0.5 ㎎Vitamin B6 .................................. 0.5 mg

비타민 B12................................0.2 ㎍Vitamin B12 ........................ 0.2 ㎍

비타민 C..................................10 ㎎Vitamin C .................................. 10 mg

비오틴....................................10 ㎍Biotin .................................... 10 ㎍

니코틴산아미드...........................1.7 ㎎Nicotinic amide ........................... 1.7 mg

엽산......................................50 ㎍Folic acid ...................................... 50 ㎍

판토텐산 칼슘............................0.5 ㎎Calcium pantothenate ............................ 0.5 mg

무기질 혼합물............................적량Mineral mixture ............................

황산제1철...............................1.75 ㎎Ferrous sulfate ............................... 1.75 mg

산화아연................................0.82 ㎎Zinc oxide ................................ 0.82 mg

탄산마그네슘............................25.3 ㎎Magnesium carbonate ............................ 25.3 mg

제1인산칼륨..............................15 ㎎Potassium Phosphate .............................. 15 mg

제2인산칼슘..............................55 ㎎Secondary calcium phosphate .............................. 55 mg

구연산칼륨...............................90 ㎎Potassium citrate ............................... 90 mg

탄산칼슘................................100 ㎎Calcium carbonate ................................ 100 mg

염화마그네슘............................24.8 ㎎Magnesium chloride ............................ 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
Although the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixture is comparatively mixed with a composition suitable for health food as a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional method for producing healthy foods , Granules can be prepared and used in the manufacture of health food compositions according to conventional methods.

<실험예 1> 본 발명의 흰점박이 꽃무지 추출물 또는 이의 분획물에서의 항암활성 확인<Experimental Example 1> Confirmation of anticancer activity in the white spotted flower extract or its fractions of the present invention

1. 실험방법1. Experimental Method

1) 간 세포 분리1) Isolation of liver cells

간 세포는 BALB/c 8주령에서 분리하였다. Liver cells were isolated at 8 weeks of age in BALB / c.

설명하면, 마취된 마우스는 콜라겐분해효소용액으로 관류하고, 절개한 다음 100㎛ 여과망을 통해 걸러내었다. 세포는 M199/EBSS 배지로 원심분리와 재현탁 과정을 통해 여러 번 반복하여 씻어주었다. Percoll을 이용한 밀도구배 원심분리로 세포 찌꺼기와 유세포가 아닌 세포를 간 세포로부터 제거하였다. 몇 차례 씻어준 후 세포를 10% FBS가 포함된 M199/EBSS 배지에 재현탁하여 배양하였다.
To illustrate, anesthetized mice were perfused with collagenase solution, dissected, and filtered through a 100-μm filter mesh. Cells were washed several times through centrifugation and resuspension with M199 / EBSS medium. Cells were removed from hepatocytes by density gradient centrifugation using Percoll. After several washes, the cells were resuspended in M199 / EBSS medium containing 10% FBS and cultured.

2) 세포 생존능과 세포자살의 분석2) Analysis of cell viability and apoptosis

세포(5000개)는 96 웰 플레이트(well plate)에서 하룻밤 정도 배양하고 지시된 농도에서 24시간 동안 상기 실시예 2에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물들을 처리하였다. Cells (5000) were cultured in a 96-well plate overnight and treated with the white spotted flower larva-derived fractions prepared in Example 2 for 24 hours at the indicated concentrations.

세포생존능을 측정하기 위해 세포는 MTT에 노출하여 형성된 결정화된 포르마잔(formazan)을 마이크로플레이트 리더기(Infinity M200 microplate reader)를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. To measure cell viability, the cells were quantitated by measuring the absorbance at 595 nm using a microplate reader (Infinity M200 microplate reader) for crystallized formazan formed by exposure to MTT.

흡광도 데이터은 대조군과 비교하여 세포생존능을 퍼센트로 나타내었다. Absorbance data showed cell viability as a percentage of the control group.

세포자살분석은 상기 분획물들을 처리한 후에 세포의 DNA양(propidium iodide, 빨간색 형광)과 카스파제(caspase) 활성(DEVDase 활성, 녹색 형광)을 Millipore사의 CaspaTag in situ apoptosis detection kit를 사용하여 분석하였다. 표지된 세포는 FACS CaliburTM system으로 분석하였다. 데이터는 FlowJo software로 처리하였다.
Cellular suicide analysis was performed using the CaspaTag in situ apoptosis detection kit from Millipore, Inc., after treating the fractions with propidium iodide (red fluorescence) and caspase activity (DEVDase activity, green fluorescence). The labeled cells were analyzed with a FACS Calibur ™ system. Data were processed with FlowJo software.

3) TUNEL 염색(staining)3) TUNEL staining

파라핀이 포매된 조직에서 세포자살의 면역조직화학검출은 형광을 이용한 TUNEL assay를 이용하여 수행하였다. fluorescein-dUTP로 표지된 Terminal deoxynucleotidyltransferase는 제조사의 권고대로 실험하였다. Immunohistochemical detection of apoptosis in paraffin embedded tissues was performed using the fluorescence TUNEL assay. Terminal deoxynucleotidyltransferase labeled with fluorescein-dUTP was tested as recommended by the manufacturer.

설명하면, 간 조직을 30분 동안 투과시키고 TUNEL 반응 혼합물로 표지한 다음 파라필름으로 덮어 항온항습되는 용기에 넣고 37℃, 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 씻어준 다음 슬라이드는 DAPI가 포함된 용액으로 봉입하고 형광으로 확인하였다. 형광신호를 가지고 있는 세포들의 수를 세었고 퍼센트로 계산하였다.
Liver tissue was permeated for 30 minutes, labeled with a TUNEL reaction mixture, covered with parafilm, placed in a constant temperature and humidity container, and allowed to react at 37 ° C for 1 hour. After washing with PBS, the slide was sealed with a solution containing DAPI and confirmed by fluorescence. The number of cells with fluorescent signals was counted and calculated as a percentage.

4) Ki-67 면역조직화학염색(immunohistochemical staining)4) Ki-67 immunohistochemical staining

4㎛ 파라핀 조직은 자일렌과 단계적인 에탄올 처리로 탈파라핀화 하였고 항원 노출은 sodium citrate buffer(pH 6.0)에서 열을 가하였다. 항원노출 후 조직은 상온에서 20분 동안 blocking 용액을 처리하였다. 4 ㎛ paraffin tissues were deparaffinized by xylene and stepwise ethanol treatment and antigen exposure was performed in sodium citrate buffer (pH 6.0). After antigen exposure, the tissues were treated with blocking solution for 20 minutes at room temperature.

그 후 Ki67 일차 항체를 처리하여 항온 항습 용기에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 조직을 PBS로 씻어준 후 이차 항체를 처리하고 어둡게 한 다음 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. The Ki67 primary antibody was then treated and incubated overnight at 4 ° C in a constant temperature and humidity chamber. The tissues were washed with PBS, treated with secondary antibody, darkened, and reacted at room temperature for 2 hours.

조직을 PBS로 씻어준 다음 슬라이드는 DAPI가 포함된 용액으로 봉입하고 형광으로 확인하였다. 형광신호를 가지고 있는 세포들의 수를 세었고 퍼센트로 계산하였다.
The tissue was rinsed with PBS and the slides were sealed with a solution containing DAPI and confirmed by fluorescence. The number of cells with fluorescent signals was counted and calculated as a percentage.

2. 실험결과2. Experimental results

1) 실시예 1에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충분말의 간 보호효과 확인1) Confirmation of liver protective effect of white spotted moth larva powder prepared in Example 1

흰점박이 꽃무기 유충 섭취의 간 보호 효과의 주장을 확인하기 위해 마우스에 유전독성 발암물질인 DEN을 복강 투여하여 화학적으로 유도된 만성 간 손상 모델을 이용하였다. A chemically induced chronic liver injury model was used to induce hepatoprotective effects of white spotted flower larvae on mice by intraperitoneal injection of genotoxic carcinogen DEN.

그 결과 도 1A에 나타나 있듯이, DEN을 처리한 그룹은 PBS를 처리한 그룹과 비교했을 때 몸무게가 감소하였으며, 본 발명의 실시예1의 PBL분말을 먹였음에도 몸무게가 회복되지 않았다. As a result, as shown in FIG. 1A, the group treated with DEN decreased in weight when compared with the group treated with PBS, and the body weight was not recovered even though the PBL powder of Example 1 of the present invention was fed.

또한, 도 1B~도 1D에 나타나 있듯이, DEN을 5주 이상 처리하면 혈액순환에서 ALP, AST, ALT의 간 효소 활성이 현저하게 증가하였다. 이것은 DEN 처리가 간 독성을 유도한다는 것을 의미한다. In addition, as shown in FIG. 1B to FIG. 1D, liver enzymes activity of ALP, AST and ALT in blood circulation was significantly increased when DEN was treated for 5 weeks or more. This means that DEN treatment induces liver toxicity.

반면, 도 2B내지 도 2D에 나타나 있듯이, 간 보호 활성에서 이전에 보고된 것과 달리 본 발명의 실시예1의 PBL분말의 주입은 DEN을 10주 동안 처리한 후 혈청에서 효소 활성을 확인했을 때 미미한 감소를 나타낸 결과로 보아 간 손상의 감소를 보여주지 않았다. On the other hand, as shown in FIGS. 2B to 2D, the injection of the PBL powder of Example 1 of the present invention, unlike the previously reported for liver protective activity, showed little activity when enzyme activity was confirmed in serum after 10 weeks of DEN treatment , Indicating no reduction in liver damage.

이에, 본 발명의 실시예1의 PBL분말을 13주 동안 경구투여한 후 마우스를 죽여 간을 수집하여 조직학적으로 분석하였다. 그 결과 도 1E 및 도 1F에 나타나 있듯이, DEN을 처리한 마우스 간은 섬유증과 간암세포로 악화시킬 수 있는 극심하고 만성적인 간질환의 징후인 세관반응을 보여주는 반면에 본 발명의 실시예1의 PBL분말의 주입은 간 손상 반응을 현저하게 감소시켰다. Thus, after PBL powder of Example 1 of the present invention was orally administered for 13 weeks, mice were killed and liver was collected and histologically analyzed. As a result, as shown in Fig. 1E and Fig. 1F, the mice treated with DEN showed tubulointeraction, which is a symptom of severe and chronic liver disease that can be exacerbated by fibrosis and hepatocellular carcinoma cells, whereas PBL of Example 1 of the present invention Injection of the powder significantly reduced the liver injury response.

또한, 도 2A에 나타나 있듯이, DEN을 처리한 마우스로부터 분리한 간은 간 세포 손실 후에 간 재생에 의해 유발될 수 있는 확장된 간세포를 보여준다. 이에 반면, 본 발명의 실시예1의 PBL분말은 간세포의 확장을 억제시킨다. In addition, as shown in Fig. 2A, the liver isolated from a mouse treated with DEN shows expanded hepatocytes that can be induced by liver regeneration after liver cell loss. On the other hand, the PBL powder of Example 1 of the present invention inhibits expansion of hepatocytes.

게다가 도 2B에 나타나 있듯이, 본 발명의 실시예1의 PBL분말은 또한 DEN을 처리한 마우스의 지방증을 감소시킨다. 초과량의 지방 축적은 종종 염증 반응을 이끌고 간세포에 독성을 나타낸다. 그리고 섬유증과간경변을 유도할 수 있다. In addition, as shown in Figure 2B, the PBL powder of Example 1 of the present invention also reduces the steatosis of mice treated with DEN. Excess fat accumulation often leads to an inflammatory response and toxicity to hepatocytes. It can induce fibrosis and cirrhosis.

이에, 도 2D에 나타나 있듯이, 본 발명의 실시예1의 PBL분말을 주입한 마우스 간은 세포증식을 나타내는 Ki67 양성 세포가 saline을 주입한 마우스와 비교했을 때 비슷하게 나타났다. 2D, as shown in FIG. 2D, mice injected with the PBL powder of Example 1 of the present invention showed similar Ki67-positive cells showing cell proliferation as compared with mice injected with saline.

또한, 도 2C에 나타나 있듯이, TUNEL양성세포는 적은 것으로 보아 세포 죽음을 덜 유도한다는 것을 의미한다. 종합적으로 이 데이터는 본 발명의 실시예1의 PBL분말이 DEN에 의해 유도되는 간 손상을 감소시킨다는 것을 의미한다.
In addition, as shown in FIG. 2C, TUNEL-positive cells are less likely to induce cell death. Collectively, this data means that the PBL powder of Example 1 of the present invention reduces DEN-induced liver damage.

2) 실시예 2에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 유래 분획물의 암세포에 대한 세포독성물질 함유 여부확인2) Confirmation of cytotoxic substance content of cancer cell of the fraction derived from white spider mushroom larvae prepared in Example 2

간 보호뿐만 아니라 곤충 유충은 전통적으로 암 환자를 돕는 데 이용되어 왔다. 이에, 본 발명의 실시예1의 PBL분말 유래 분획물(실시예 2)들을 간암세포인 HepG2와 마우스 정상 간에서 분리한 간 세포에 처리하였다. In addition to liver protection, insect larvae have traditionally been used to help cancer patients. Thus, the fraction derived from the PBL powder of Example 1 of the present invention (Example 2) was treated with hepatocyte HepG2 and hepatic cells isolated from normal mouse liver.

그 결과 도 3A에 나타나 있듯이, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물은 HepG2에 대해 세포독성활성을 보여주지만 물 분획물은 세포독성활성을 보여주지 않았다.As a result, as shown in Fig. 3A, hexane, ethyl acetate, and butanol fractions showed cytotoxic activity against HepG2, but water fractions did not show cytotoxic activity.

도 3B에 나타나 있듯이, 암세포에 세포독성을 보여준 것과 대조적으로 헥산 분획물은 간세포에서 약하게 세포독성을 나타냈고 다른 분획물들은 어떤 독성도 보이지 않았다. 이 데이터는 실시예2의 PBL분말 유래 분획물이 암세포 특이적으로 세포독성활성을 보여준다는 것을 의미한다. As shown in FIG. 3B, the hexane fraction showed weak cytotoxicity in hepatocytes and the other fractions showed no toxicity in contrast to the cytotoxicity of cancer cells. This data means that the PBL powder-derived fraction of Example 2 shows cytotoxic activity specifically on cancer cells.

헥산, 에틸아세테이트, 그리고 부탄올 분획물은 전립선(PC3 and 22Rv1), 자궁근종(HeLa), 간(PLC/PRF5, HepG2, and Hep3B), 결장(HCT116), 폐(NCI-H460), 유방(MDA-MB-231), 난소(SK-OV3)에서 유래된 몇 가지 인간 암세포에 처리하였다. Hexane, ethyl acetate and butanol fractions were detected in the prostate (PC3 and 22Rv1), uterine myoma (HeLa), liver (PLC / PRF5, HepG2, and Hep3B), colon (HCT116), lung (NCI- MB-231), and ovary (SK-OV3).

그 결과, 도 3C에 나타나 있듯이, 암세포 종류에 의존적으로 분획물에 대한 반응이 이질적이지만 대부분의 암세포에서 분획물의 처리에 의해 죽고 그 중 헥산 분획물이 암세포에 가장 강력한 세포독성을 보여주었다.As a result, as shown in FIG. 3C, although the reaction to the fraction was heterogeneous depending on the type of cancer cells, most of the cancer cells died by treatment with the fraction, and the hexane fraction showed the most cytotoxic effect on the cancer cells.

3) 실시예 2에서 제조된 헥산 분획물의 다양한 암세포 대한 세포독성 활성확인3) Confirmation of the cytotoxic activity of the hexane fraction prepared in Example 2 on various cancer cells

암세포에 대한 세포독성활성의 메커니즘을 이해하기 위해 간암 세포 주인 SK-HEP-1 과 HepG2 암세포에 추출물을 처리하였고, 카스파제 활성(DEVDase activity)과 PI(propidium iodide)를 염색하여 분석하였다.To understand the mechanisms of cytotoxic activity against cancer cells, SK-HEP-1 and HepG2 cancer cells were treated with extracts and analyzed by DEVDase activity and PI (propidium iodide) staining.

그 결과 도 4A에 나타나 있듯이, 실시예 2에서 제조된 헥산 분획물은 PI 와 DEVDase양성을 나타내는 세포집단의 증가가 현저하게 나타나는 반면 다른 분획물들은 미미하게 증가하였다. 이 데이터는 도 3에서 헥산 분획물의 강력한 세포독성이 세포자살 유도에 의해 매개되어진다는 것을 의미한다. 일관적으로 이와 비슷한 결과는 Annexing V 염색에 의해 노출되는 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 측정으로부터 얻을 수 있었다.(도시되어 있지 않음). As a result, as shown in Fig. 4A, the hexane fraction prepared in Example 2 showed a marked increase in the cell population showing PI and DEVDase positivity, while the other fractions were slightly increased. This data means that the strong cytotoxicity of the hexane fraction in FIG. 3 is mediated by induction of cell suicide. Consistently, similar results were obtained from the measurement of phosphatidylserine exposed by Annexing V staining (not shown).

또한, 세포 죽음 메커니즘 분석을 더 하기 위해 미토콘드리아 막 전위를 분석하였다. 그 결과 도 4B 및 도 4C에 나타나 있듯이, 실시예 2에서 제조된 헥산 분획물은 1시간 내로 즉시 미토콘드리아 막 전위의 손실을 유도하였지만 다른 분획물들은 단지 미토콘드리아 막 전위에 약하게 영향을 주었다. 이 결과는 헥산 분획물이 미토콘드리아 막의 투과성에 영향을 줄 수 있고 세포자살로 유도된 세포 죽음에서 결정적인 역할을 한다는 것을 의미한다.
In addition, mitochondrial membrane potentials were analyzed to further analyze cell death mechanisms. As a result, as shown in FIGS. 4B and 4C, the hexane fraction prepared in Example 2 induced immediate loss of mitochondrial membrane potential within one hour, while the other fractions only weakly affected the mitochondrial membrane potential. This result implies that the hexane fraction may affect the permeability of the mitochondrial membrane and play a crucial role in apoptosis-induced cell death.

4) 세포죽음 유도에서 분획물들의 작용 메커니즘 확인4) Identification of mechanism of action of fractions in cell death induction

본 실험에서는 대개 일반적인 세포 죽음 메커니즘 중 또 다른 형태인 자가소화작용(autophagy)을 확인하였다. In this experiment, autophagy, another type of normal cell death mechanism, was identified.

설명하면, 실시예2의 PBL유래 분획물들을 처리한 후에 확인한 결과 도 5A 및 도 5B에 나타나 있듯이, 자가포식소체(autophagosome) 형성이 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에 의해 현저하게 증가하였다. As shown in FIGS. 5A and 5B, autophagosome formation was markedly increased by hexane, ethyl acetate, and butanol fractions after the PBL-derived fractions of Example 2 were treated.

또한, 미세소관(microtubule)과 관련된 단백질인 LC3발현을 실험한 결과 도 5C에 나타나 있듯이, 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물들과 비교했을 때 세포기질적 형태(cytosolic form)인 LC3-1에서 지질 복합형태(lipid conjugated form)인 LC3-2로 전환된 형태가 더 유도되었다. 이것은 실시예 2의 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물과 비교하여 강력한 자가소화작용(autophagy) 유도자임을 의미한다.
In addition, as shown in Fig. 5C, LC3 expression, a protein related to microtubule, was found in LC3-1, a cytosolic form as compared with other fractions, in the ethyl acetate fraction, (LC3-2), a lipid-conjugated form, was further induced. This means that the ethyl acetate fraction of Example 2 is a potent autophagy inducer as compared to the other fractions.

이와 같이 본 발명에서는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)이 세관반응, 지방증, 그리고 세포죽음의 감소를 보여주는 것으로 보아 DEN이 유도하는 간 독성에서 간 세포 보호 기능을 가진다는 것을 알 수 있다. Thus, in the present invention, it is evident that Protaetia breitarsis larva has reduced tubulointeraction, lipemia, and cell death, indicating that DEN-induced hepatotoxicity has liver cell protection function.

흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 유래 분획물들은 또한 다양한 암세포에서 세포자살과 자식작용을 유도함으로써 항암활성을 보여준다. Fractions derived from white spotted larvae (Protaetia brebitarsis larva) also show anticancer activity by inducing apoptosis and child action in various cancer cells.

따라서, 본 발명의 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 및 이들의 분획물들은 항암치료제를 개발하기 위해 이용할 수 있는 생물활성물질을 포함한다는 것을 알 수 있다. Thus, it can be seen that the white spotted larvae of the present invention and their fractions contain bioactive substances that can be used to develop anticancer drugs.

DEN은 DNA 손상 유도와 활성산소종의 증가를 통해 간 세포암을 유도하는 대표적인 발암물질이다. 만성적인 DEN의 주입은 간에서 인간의 간 질병 진행을 모방한 지방증, 섬유증, 간 경변 그리고 마지막으로 간암을 계속적으로 유도한다. DEN is a typical carcinogen that induces hepatocellular carcinoma by inducing DNA damage and increasing reactive oxygen species. Injection of chronic DEN continues to induce hepatic steatosis, fibrosis, liver cirrhosis, and finally liver cancer that mimics human liver disease progression in the liver.

본 발명에서 13주 동안 DEN을 처리한 마우스는 혈액에서 간 효소의 현저한 증가를 유도한 마우스에 대해 간 독성을 유도하였고 간에서 세관반응, 지방증, 세포 죽음을 증가시켰다.In the present invention, mice treated with DEN for 13 weeks induced hepatotoxicity in mice that induced a significant increase in liver enzymes in the blood, and increased tubulointeraction, lipemia, and cell death in the liver.

흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)은 DEN이 유도하는 세포독성을 완전하게 막지는 못하지만 생체 내 마우스 모델에서 확연하게 간 보호를 보여준다. 곤충은 항산화 효소와 소분자를 가지고 있다고 보고되어 있다. 왜냐하면 DEN은 cytochrome P450에 의존적인 메커니즘을 통해 ROS를 증가시킨다고 보고되어 있기 때문에 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)으로부터 유래된 항산화물질은 지방, 단백질 그리고 핵산을 산화로부터 유지할 수 있는 ROS제거자의 역할을 할지도 모른다. 따라서 간보호에 중요한 역할을 할 것이라 사료된다.Protaetia brebitarsis larva does not completely inhibit DEN-induced cytotoxicity, but it shows significant liver protection in vivo mouse models. Insects have been reported to have antioxidant enzymes and small molecules. Because DEN has been reported to increase ROS through mechanisms dependent on cytochrome P450, antioxidants derived from the white spider mite (Protaetia brebitarsis larva) play a role in the removal of ROS from fat, protein and nucleic acid . Therefore, it seems to play an important role in liver protection.

헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물을 이용하여 분리한 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)유래 분회물은 곤충유충을 분리하고 모았을 때 생물활성물질임을 보여주었다. 헥산, 에틸아세테이트 그리고 부탄올 분획물은 암세포에서 선택적으로 세포독성을 가지고 헥산 추출물은 가장 강력한 세포독성과 세포자살을 유도하였다. 항암제에 의해 이용되는 암세포의 자살 프로그램이 세포자살에 의한 세포죽음의 예이다. Protaetia brebitarsis larva-derived subspecies, which were isolated by using hexane, ethyl acetate, butanol and water, showed that they were biologically active substances when they isolated and collected insect larvae. Hexane, ethyl acetate and butanol fractions were selectively cytotoxic in cancer cells and hexane extract induced the most potent cytotoxicity and apoptosis. The suicide program of cancer cells used by anticancer drugs is an example of cell death by cell suicide.

마우스 간세포에서 약한 독성은 헥산 분획물이 암세포에 특이적일 것이라 생각된다. 이 데이터는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)으로부터 분리한 헥산 분획물이 정상세포가 아닌 암세포에 특이적으로 세포독성을 가지는 생물활성물질을 포함한다는 것을 의미한다. The weak toxicity of mouse hepatocyte is thought to be specific to cancer cells. This data implies that the hexane fraction isolated from the white spider mite larvae (Protaetia brebitarsis larva) contains a biologically active substance that is cytotoxic specifically to cancer cells other than normal cells.

이에 본 발명에서는 분획을 이용한 더 많은 분석이 암치료제를 개발할 수 있는 새로운 물질을 찾는데 필요할 것이라고 추정한다.Accordingly, the present invention estimates that further analysis using fractions will be necessary to find new substances capable of developing cancer therapeutic agents.

세포자살과 자식작용 유도는 물을 제외한 모든 분획물에서 나타났고 이것은 활성물질의 분리가 완벽하지 않거나 각 분획에서 여러 다른 분자들이 세포죽음경로에 영향을 줄 수 있음을 의미한다. 그래서 좀 더 분획을 하는 것이 이 문제를 해결하고 새로운 생물활성물질을 동정하는데 필요하다. 흥미롭게도 에틸아세테이트 분획물은 가장 강력한 자식작용 유도활성을 보여준다. 자식작용은 세포생리학에서 광범위하게 기능의 다양성을 보이고 암세포에서 세포보호와 세포독성을 모두 나타낸다. cytochrome P450에 의존적인 방식에서 DEN처리에 의한 ROS유도와 자식작용 유도에 의한 산화적 손상의 감소를 고려하면 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)의 경구투여에 의한 간 보호가 간 조직에서 자식작용 유도에 기여한 것일지도 모른다.Cellular suicide and induction of self-induction were present in all fractions except water, which means that the separation of the active substance is not perfect, or that different molecules in each fraction may affect the cell death pathway. Thus, further fractionation is necessary to solve this problem and to identify new bioactive substances. Interestingly, the ethyl acetate fraction shows the strongest induction activity. Child behavior has a wide range of functional diversity in cellular physiology and both cell protection and cytotoxicity in cancer cells. Considering the reduction of oxidative damage induced by REN induction and child action induced by DEN treatment in the cytochrome P450 dependent manner, the oral protection of the white spotted larva (Protaetia brebitarsis larva) It may have contributed to induction.

결론적으로 본 발명은 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva) 분말과 이들의 분획물로부터 잘 알려져 있는 간 보호와 항암활성을 확인하였다. 분획물들은 분리해서 세포자살과 자식작용의 활성을 높일 수 있다. 이 데이터는 흰점박이 꽃무지 유충(Protaetia brebitarsis larva)을 이용한 더 많은 분석이 간 질환을 치료하기 위한 새로운 생물활성물질의 동정을 이끌 수 있다는 것을 의미한다.
In conclusion, the present invention confirmed the well-known liver protection and anticancer activity from the white spotted flower larvae (Protaetia breitarsis larva) powder and fractions thereof. Fractions can be separated to increase the activity of cell suicide and child action. This data suggests that further analysis with white spotted larvae (Protaetia brebitarsis larva) may lead to the identification of new bioactive substances for the treatment of liver disease.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예 및 실험예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the inventions. Examples and experiments may be implemented. The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all differences within the scope of the claims are to be construed as being included in the present invention.

Claims

A protaetia breitarsis larva or a protaetia breitarsis larva as an active ingredient, which exhibit the effect of preventing and treating cancer,
A pharmaceutical composition for anti-cancer.

The method according to claim 1,
Wherein the fraction is at least one selected from the group consisting of a hexane fraction or an ethyl acetate fraction obtained by extracting the white spotted spotted larva with ethanol,
A pharmaceutical composition for anti-cancer.

The method according to claim 1,
Wherein the cancer is at least one selected from prostate cancer, cervical cancer, liver cancer, rectal cancer, lung cancer, breast cancer, and ovarian cancer.
A pharmaceutical composition for anti-cancer.

Which comprises a fraction derived from white spotted flower larvae (Protaetia breitarsis larva) or white spotted flower larvae (Protaetia breitarsis larva) showing an effect of preventing and improving cancer,
Food composition.

5. The method of claim 4,
Wherein the fraction comprises at least one of a hexane fraction or an ethyl acetate (EtOAc) fraction obtained by extracting the white spotted flower with ethanol and then fractionating the same.
Food composition.

5. The method of claim 4,
Wherein the cancer is at least one selected from prostate cancer, cervical cancer, liver cancer, rectal cancer, lung cancer, breast cancer, and ovarian cancer.
Food composition.

A first step of high pressure sterilization of white spotted spotted larvae, freeze-drying them, and pulverizing them;
A second step of preparing a white spotted mucilage ethanol extract by mixing the white spotted mucilaginous mushroom powder pulverized in the first step and ethanol;
And a third step of sequentially fractionating the white spotted spotless ethanol extract prepared in the second step with hexane, ethyl acetate, butanol, and water to obtain a fraction,
A method for producing a fraction derived from a white spider mushroom having an anticancer effect.

8. The method of claim 7,
Wherein the second step is a step of mixing 10 to 12 kg of the powdered white spotted spotted mushroom powder per 12 liters of the ethanol.
A method for producing a fraction derived from a white spider mushroom having an anticancer effect.

9. An anticancer composition comprising as an active ingredient a fraction derived from a white spotted moth, which is produced by the method of any one of claims 7 to 8.

The anticancer composition of claim 9 is a composition for prevention and improvement of at least one selected from prostate cancer, cervical cancer, liver cancer, rectal cancer, lung cancer, breast cancer and ovarian cancer, or a composition for prevention and improvement of prostate cancer, cervical cancer, liver cancer, rectal cancer, Cancer < RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI > cancer,
Method of using anticancer composition.