KR20160037667A

KR20160037667A - 폴리펩타이드, 이를 포함하는 항 VEGF 항체 및 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체

Info

Publication number: KR20160037667A
Application number: KR1020140130561A
Authority: KR
Inventors: 이승현; 정수연; 김보규; 오승자; 이지민
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-09-29
Also published as: US10246507B2; US20160090427A1; KR102390359B1

Abstract

폴리펩타이드, 이를 포함하는 항 VEGF 항체 및 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

Description

폴리펩타이드, 이를 포함하는 항 VEGF 항체 및 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체{Polypeptide, Anti-VEGF Antibody, and Anti-c-Met/Anti-VEGF Bispecific Antibodies Comprising the Same}

c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK (Receptor Tyrosine Kinase)로써 그 ligand인 HGF (Hepatocyte Growth Factor)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라, 암세포에 과발현되어 암 발생, 암 전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. c-Met은 많은 종류의 암에서 과 발현되고 있으며, 특히 c-Met의 과발현은 환자에서 암의 예후가 나쁜 (Poor prognosis) 원인과 관련되어 있는 경우가 대부분이다.

혈관 내피 세포 성장 인자 (Vascular Endothelial Cell Growth Factor: VEGF)는 정상세포에서도 존재하지만, 특히 암세포에서 분비되어 그 수용체인 VEGFR(VEGF Receptor)과 결합하여 혈관신생 (angiogenesis)를 일으키며, 암세포는 그 새로운 혈관을 통해 성장에 필요한 양분을 공급받는다.

그러므로, c-Met과 VEGF를 동시에 저해한다면 암세포의 성장을 보다 효과적으로 저해할 수 있을 것으로 기대되며, 이를 위하여 c-Met과 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 이중 특이 항체의 개발이 요구된다.　

일 예는 서열번호 109 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 항 VEGF 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)로서 사용될 수 있다.

다른 예는 서열번호 109 내지 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 114 내지 서열번호 121로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 122 내지 서열번호 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중쇄 상보성 결정 영역; 서열번호 130 내지 서열번호 137으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 138 내지 서열번호 145으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 146 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 경쇄 상보성 결정 영역; 또는 이들의 조합을 포함하는 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

다른 예는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 제공한다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

다른 예는 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 일 예는 신규한 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 항 VEGF 항체의 CDR로서의 기능을 갖는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 109 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 109 내지 서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 각각 다음의 표 1 및 표 2에 기재된 바와 같은 항 VEGF 항체의 CDR 기능을 가질 수 있다:

CDR-H1	CDR-H2	CDR-H3
GYAMS(서열번호 109)	SIYSSSGSKYYADSVKG(서열번호 114)	ASSTCTRTWCSYDDAMDV(서열번호 122)
DYAMS(서열번호 110)	SIYPGSGSKYYADSVKG(서열번호 115)	DAWFRGHNVFDY(서열번호 123)
NYDMS(서열번호 111)	GIYPNGGSKYYADSVKG(서열번호 116)	ALRQCQRYWCSYADGMDV(서열번호 124)
DYYMS(서열번호 112)	AIYSGGGSIYYADSVKG(서열번호 117)	DVQWNKAPRFDY(서열번호 125)
SYSMS(서열번호 113)	GISHGGGNKYYADSVKG(서열번호 118)	DLRANNDTGFDY(서열번호 126)
NYDMS(서열번호 111)	LISHGGGNIYYADSVKG(서열번호 119)	VPVMCTNHWCSYANGMDV(서열번호 127)
GYAMS(서열번호 109)	GISHDGGNTYYADSVKG(서열번호 120)	DRRKGPSTEFDY(서열번호 128)
DYAMS(서열번호 110	WIYPGDSSIYYADSVKG(서열번호 121)	LLSIDQAQLHYYYDAMDV(서열번호 129)

CDR-L1	CDR-L2	CDR-L3
TGSSSNIGNNAVT(서열번호 130)	DDSHRPS(서열번호 138)	GTWDYSLSGYV(서열번호 146)
TGSSSNIGSNNVT(서열번호 131)	SDSHRPS(서열번호 139)	GSWDYSLSAYV(서열번호 147)
TGSSSNIGSNYVS(서열번호 132)	ADSQRPS(서열번호 140)	GTWDYSLSGYV(서열번호 146)
SGSSSNIGSNDVS(서열번호 133)	ADSNRPS(서열번호 141)	GSWDYSLSGYV(서열번호 148)
TGSSSNIGSNAVT(서열번호 134)	DDNHRPS(서열번호 142)	GAWDYSLNAYV(서열번호 149)
SASSSNIGSNAVY(서열번호 135)	SDNQRPS(서열번호 143)	GSWDYSLSAYV(서열번호 147)
TGSSSNIGSNSVS(서열번호 136)	DDNNRPS(서열번호 144)	GAWDYSLSAYV(서열번호 150)
TGSSSNIGNYYVY(서열번호 137)	ANSHRPS(서열번호 145)	GSWDDSLSAYV(서열번호 151)

일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 2종 이상이 조합되어 항 VEGF 항체의 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역으로 사용될 수 있다.

예컨대, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 109 내지 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 114 내지 서열번호 121로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 122 내지 서열번호 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는, 예컨대, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 152 내지 159로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 항 VEGF 항체의 중쇄가변영역으로서 기능을 할 수 있다.

다른 예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 130 내지 서열번호 137으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 138 내지 서열번호 145으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 146 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는, 예컨대, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 160 내지 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 항 VEGF 항체의 경쇄가변영역으로서 기능을 할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 109 내지 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 114 내지 서열번호 121로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 122 내지 서열번호 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 130 내지 서열번호 137로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 138 내지 서열번호 145로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 146 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 폴리펩타이드의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 152 내지 159로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 160 내지 서열번호 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 조합일 수 있다;

중쇄가변부위	경쇄가변부위
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYSSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASSTCTRTWCSYDDAMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 152)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG(서열번호 160)
EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGSGSKYYADSVKGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWFRGHNVFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 153)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNNVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG(서열번호 161)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPNGGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALRQCQRYWCSYADGMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 154)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYADSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVLGGGTKLTVLG(서열번호 162)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAIYSGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVQWNKAPRFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 155)	QSVLTQPPSASGAPGQRVTISCSGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG(서열번호 163)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSGISHGGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRANNDTGFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 156)	QSVLTQPPSSSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLNAYVFGGGTKLTVLG(서열번호 164)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISHGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVPVMCTNHWCSYANGMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 157)	QSVLTQPPSASGTPGQRVIISCSASSSNIGSNAVYWYQQLPGTAPKLLIYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG(서열번호 165)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISHDGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRKGPSTEFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 158)	QSVLTQPPSLSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG(서열번호 166)
EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPGDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLLSIDQAQLHYYYDAMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 159)	QSVLTQPPSPSGTPGQRVTISCTGSSSNIGNYYVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSAYVFGGGTKLTVLG(서열번호 167)

또 다른 예에서, 예컨대, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 168 내지 175로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:

서열번호 168 (E1; 253a.a.)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYSSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASSTCTRTWCSYDDAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG

서열번호 169 (E2; (247 a.a.)

EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGSGSKYYADSVKGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWFRGHNVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNNVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG

서열번호 170 (E3; 253 a.a.)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPNGGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALRQCQRYWCSYADGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYADSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVLGGGTKLTVLG

서열번호 171 (E5; 247 a.a.)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAIYSGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVQWNKAPRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGAPGQRVTISCSGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG

서열번호 172 (E7; 247 a.a.)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSGISHGGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRANNDTGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGTQSVLTQPPSSSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLNAYVFGGGTKLTVLG

서열번호 173 (E10; 253 a.a.)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISHGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVPVMCTNHWCSYANGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVIISCSASSSNIGSNAVYWYQQLPGTAPKLLIYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG

서열번호 174 (E11; 247 a.a.)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISHDGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRKGPSTEFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSLSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG

서열번호 175 (E12; 253 a.a.)

EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPGDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLLSIDQAQLHYYYDAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSPSGTPGQRVTISCTGSSSNIGNYYVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSAYVFGGGTKLTVLG

(상기 서열번호 168 내지 175에서, 밑줄 그은 부분은 N 말단쪽부터 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 각각 나타낸다)

상기 폴리펩타이드는 자연적으로 존재하는 것이 아닐 수 있으며, 예컨대, 합성적 또는 재조합적으로 생성된 것일 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 항 VEGF 항체의 항원 결합 단편, 예컨대, scFv 단편으로 기능을 할 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 VEGF에 대한 길항제, 예컨대, 항 VEGF 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 항 VEGF 항체 유사체 (예컨대, 펩티바디, 나노바디, 등)의 전구체 또는 구성 부분으로서 역할을 할 수 있다.

따라서, 다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 VEGF에 대한 길항제를 제공한다. 상기 길항제는 VEGF의 기능을 저해하는 역할을 하는 것으로, 항 VEGF 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 항 VEGF 항체 유사체 (예컨대, 펩티바디, 나노바디, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 "VEGF(Human epidermal growth factor receptor 2)"는 ERBB2 유전자에 의하여 암호화되며, 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR/ErbB)의 일원이다. VEGF는 세포 증식 및 분화를 조절하는 데 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 세포 외 성장 인자가 결합하면 다른 HER 수용체와 함께 동형- 및/또는 이형이합체로 조립되는 강한 경향성을 갖고, 이는 다양한 형태의 신호 전달 경로 활성화를 초래하여, 세포자멸, 생존, 또는 세포 증식을 유도한다. 예컨대, 상기 VEGF 단백질은 인간 VEGF (예컨대, GenBank Accession Nos. NP_004439.2, NP_001005862, 등), 마우스 VEGF (예컨대, GenBank Accession No. NP_001003817) 등일 수 있으며, 이들은 각각 GenBank Accession Numbers NM 004448.2, NM NM_001005862.1, NM_001003817 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 것일 수 있다.

용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, VEGF)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, VEGF)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체를 의미한다. 길항제는 리간드(표적)에 대한 수용체에 결합하여, 수용체 인산화(phosphorylation)를 감소시키거나, 리간드에 의해 활성화되었던 세포를 무능력화시키거나, 또는 사멸시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 길항제는 수용체-리간드 사이의 상호 작용을 완전히 단절시키거나, 리간드와 경쟁적으로 수용체에 결합하거나, 수용체의 3차 구조의 변화 또는 하향 조절(down regulation)에 의해 상기 수용체-리간드 간 상호 작용을 실질적으로 감소시킬 수 있다.

용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 상기 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CER 또는 가변 영역)로서 작용하여, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다.

용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.

구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 항 VEGF 항체의 전구체 또는 구성 부분으로서 역할을 할 수 있다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 109 내지 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 114 내지 서열번호 121로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 122 내지 서열번호 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 130 내지 서열번호 137로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 138 내지 서열번호 145로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 146 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 152 내지 서열번호 159으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위, 서열번호 160 내지 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 168 내지 서열번호 175로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항 VEGF scFv일 수 있다.

상기 항 VEGF 항체의 항원 결합 단편, 예컨대, 항 VEGF scFv에 있어서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "항체"는 완전한 면역클로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, 등) 형태를 갖는 항체뿐 아니라 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포괄하는 의미로 사용된다. "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 scFv 단편을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.

상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VEGF에 특이적으로 결합하고 활성을 저해하므로, VEGF와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 일 예는 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함하는 VEGF 활성화 및/또는 과생성(과발현)과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 VEGF 활성화 및/또는 과생성(과발현)과 관련된 질병 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 조성물 및 방법에 있어서, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약학적 유효량으로 사용될 수 있다. 상기 VEGF 활성화 및/또는 과생성(과발현)과 관련된 질병은 암일 수 있으며, 암의 구체적인 내용은 하기하는 바와 같다.

상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VEGF에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 VEGF을 검출하거나, VEGF의 활성화 및/또는 과생성(과발현) 여부를 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 VEGF 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 생물 시료에 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응(결합) 여부를 확인하는 단계를 포함하는 VEGF 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에 있어서, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 생물 시료에 VEGF이 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 또 다른 예는 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VEGF 검출을 위한 용도를 제공한다. 상기 생물 시료는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등의 포유류로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 VEGF의 검출은 VEGF의 존재 여부, 발현 여부, 또는 VEGF의 존재 또는 발현 정도를 확인하는 것을 의미한다.

또 다른 예는 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 VEGF 활성화 및/또는 과생성 및/또는 VEGF 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는, VEGF의 활성화 및/또는 과생성, 또는 VEGF의 활성화 및/또는 과생성 관련 질병의 진단(판단)에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서, 상기 생물 시료에서의 항원-항체 반응의 정도가 정상 시료에서의 항원-항체 반응의 정도보다 높은 경우, 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 얻어진 상기 환자를 VEGF 활성화 및/또는 과생성 증상이 존재하거나, VEGF의 활성화 및/또는 과생성 관련 질병을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 정상 시료에 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VEGF 활성화 및/또는 과생성 및/또는 VEGF 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병의 진단을 위한 용도를 제공한다.

상기 생물 시료는 진단 대상 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청, 림프액, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 정상 시료는 VEGF 활성화 및/또는 과생성 및/또는 VEGF 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병을 갖지 않는 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청, 림프액 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택된 것일 수 있다.

상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 제공한다. 상기 항원결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

상기 "혈관 내피 세포 성장 인자(Vascular Endothelial Cell Growth Factor: VEGF)"는 정상세포에서도 존재하며, 특히 암세포에서 분비되어 그 수용체인 VEGFR(VEGF Receptor)과 결합하여 혈관신생을 일으키며 암세포는 그 새로운 혈관을 통해 성장에 필요한 양분을 공급받는다. VEGF의 과발현은 다양한 질병의 원인이되며, 특히 암의 발생뿐 아니라, 침습, 전이 등의 나쁜 예후에도 관여한다. 이러한 이유로, VEGF는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다.

상기 VEGF은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류에서 유래하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 VEGF 단백질은 GenBank Accession Number NM_001025366.2, NM_001025367.2, NM_001025368.2, NM_001025369.2, NM_001025370.2, NM_001033756.2, NM_001171622.1, NM_001171623.1, NM_001171624.1, NM_001171625.1, NM_001171626.1, NM_001171627.1, NM_001171628.1, NM_001171629.1, NM_001171630.1, NM_001204384.1, NM_001204385.1, NM_003376.5 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

일 예에서, 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 C 말단 또는 N 말단, 예컨대 C 말단에 연결된 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체는 c-Met 단백질이 세포 내로 이동하고 분해되는 것을 매개하는 역할을 하므로, 이러한 역할을 온전히 수행하기 위하여 완전한 항체 구조를 갖는 것이 유리할 수 있고, 항 VEGF 항체는 VEGF에 대한 특이적 인식 및 결합이 중요하므로, VEGF를 인식하는 항원 결합 단편을 포함하여도 무방할 수 있다. 따라서, 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met에 대한 완전한 항체 (예컨대 IgG형 항체) 및 상기 항체의 C 말단에 연결된 항 VEGF 항체의 항원 결합 단편(예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2)을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체의 중쇄 및 상기 항 c-Met 항체의 중쇄의 C 말단에 연결된 항 VEGF 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv 단편)을 포함하는 중쇄 및 항 c-Met 항체의 경쇄를 포함하는 경쇄를 포함하는 IgG 형태의 항체일 수 있다 (도 1 참조).

상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체 중의 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

상기 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, scFvFc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 앞서 설명한 바와 같을 수 있으며, 예컨대, 1 내지 100개, 예컨대 2 내지 50개 또는 5 내지 25개 아미노산 길이의 것일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

구체예에서, 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 항 VEGF 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 예컨대 scFv를 포함하는 것일 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 서열번호 152 내지 서열번호 159으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위, 서열번호 160 내지 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 서열번호 168 내지 서열번호 175로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항 VEGF scFv를 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 중의 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연적으로 생성된(non-naturally occurring) 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 합성적 또는 재조합적으로 생성된 것일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 부위, 예컨대, 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있으며, 예컨대 상기 서브타입 면역글로불린의 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 각각의 항원인 c-Met 및 VEGF에 대한 친화도 및 활성을 유지하면서 상승 효과를 발휘할 수 있다. 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체의 세포 내재화 (internalization) 및 분해 (degradation) 활성에 의하여, c-Met 및 VEGF의 활성 저해뿐 아니라 c-Met 및 VEGF를 분해시켜 총량을 감소시킴으로써 보다 근본적인 차단을 가능하게 한다. 또한, c-Met 및 VEGF에 대한 결합 활성이 체내 및/또는 체외에서 비교적 장시간 안정적으로 유지되는 장점을 갖는다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 또 다른 예는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 이를 투여하는 방법에 있어서, 상기 암은 c-Met 및/또는 VEGF의 과발현 및/또는 비정상적 활성화와 관련된 암일 수 있다. 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성암뿐 아니라 전이성암을 포함한다.

상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 암세포 증식, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성, 암전이, 세포자살 억제 등의 모든 발암 기작을 공유하는 c-Met과 VEGF를 동시에 인지함으로써, 보다 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있다. 상기 항암 효과는 암세포 증식 억제뿐 아니라, 암전이 및/또는 암침투에 대한 억제효과도 포함한다.

상기 약학적 조성물 또는 방법에 있어서, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 약학적 유효량은, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제와 함께 제공될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 약학적 조성물, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 용어 "약학적 유효량"은 상기 유효성분(즉, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체)이 소망하는 효과, 즉 암을 예방 및/또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

한편, 상기 약학적 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 대상 또는 상기 예방 및/또는 치료 방법의 투여 대상 환자는 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 또는 래트, 마우스 등의 설치류 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 기존의 항암제, 예컨대 상기 표적 세포막 단백질(예컨대, VEGF)에 대한 길항제에 대하여 내성이 생긴 암환자일 수 있다.

본 발명의 다른 예는 상기한 바와 같은 서열번호 109 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 152 내지 서열번호 159으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 160 내지 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이들의 조합을 암호화하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 168 내지 서열번호 175로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 176 내지 183으로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 수 있다. 또 다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pL^λ 프로모터, CMV promoter, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

또 다른 예는 상기 재조합 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩타이드 또는 항 VEGF 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 여기에 포함된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 또는 항 VEGF 항체의 제조 방법은 상기 발현시키는 단계 또는 배양하는 단계 이후에 폴리펩타이드 또는 항 VEGF 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 c-Met과 VEGF를 동시에 표적 및 억제하고, c-Met을 표적함으로써 암세포의 성장 자체를 저해함과 동시에, VEGF를 표적함으로써 신생혈관형성을 차단하여 암세포 성장에 필수적인 영양분의 공급을 차단하여, 암세포의 성장 저해에 있어서 상승 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 c-Met에 대한 분해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 Akt 인산화에 대한 저해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4 내지 7은 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 위암 세포주 MKN45에 대한 세포 증식 저해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 8은 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 인간 혈관 내피세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell; HUVEC) 이동 (migration) 저해 활성을 보여주는 그래프이다.

이하 하기의 실시예를 본 발명을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 항 c- Met 항체의 제작

1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산

1.1.1. 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.

1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 10⁸개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.

상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).

1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.

1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 참고예 1.1.4에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변 영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작

1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )

H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.

1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )

H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.

1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작

huAbF46 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.

이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.

1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 4와 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-H1	DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3	DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1	KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2	WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3	QQSYSAPLT(서열번호 12)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.

이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 5와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
H11-4	CDR-H1	PEYYMS(서열번호 22)
YC151	CDR-H1	PDYYMS(서열번호 23)
YC193	CDR-H1	SDYYMS(서열번호 24)
YC244	CDR-H2	RNNANGNT(서열번호 25)
YC321	CDR-H2	RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354	CDR-H3	DNWLSY(서열번호 27)
YC374	CDR-H3	DNWLTY(서열번호 28)
L1-1	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3	CDR-L1	KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4	CDR-L1	KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12	CDR-L1	KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9	CDR-L2	WASKRVS(서열번호 34)
L2-12	CDR-L2	WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16	CDR-L2	WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1	CDR-L3	QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2	CDR-L3	GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3	CDR-L3	AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5	CDR-L3	QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32	CDR-L3	QQSYSKPFT(서열번호 37)

1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환

선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변영역을 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.

1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조

상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.

huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.

상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2로 명명하였다.

실시예 1: 항 VEGF scFv 의 제작

VEGF에 결합하는 항 VEGF scFv는 중쇄 가변 영역 (표 8 참조)과 경쇄 가변 영역(표 8 참조) 사이에 (GGGGS)₃ 펩타이드 링커를 넣어서 제작하였다 (표 9 참조). 구체적으로, 자동화 유전자 합성(㈜바이오니아에 의뢰)으로 항 VEGF scFv 코딩 DNA 서열(표 9 참조)을 합성하였다.

상기 항 VEGF scFv 단편들의 각 구성부분의 아미노산 서열 및 코딩 DNA 서열을 아래의 표 6 내지 표 9에 나타내었다.

scFv	CDR-H1	CDR-H2	CDR-H3
E1	GYAMS(서열번호 109)	SIYSSSGSKYYADSVKG(서열번호 114)	ASSTCTRTWCSYDDAMDV(서열번호 122)
E2	DYAMS(서열번호 110)	SIYPGSGSKYYADSVKG(서열번호 115)	DAWFRGHNVFDY(서열번호 123)
E3	NYDMS(서열번호 111)	GIYPNGGSKYYADSVKG(서열번호 116)	ALRQCQRYWCSYADGMDV(서열번호 124)
E5	DYYMS(서열번호 112)	AIYSGGGSIYYADSVKG(서열번호 117)	DVQWNKAPRFDY(서열번호 125)
E7	SYSMS(서열번호 113)	GISHGGGNKYYADSVKG(서열번호 118)	DLRANNDTGFDY(서열번호 126)
E10	NYDMS(서열번호 111)	LISHGGGNIYYADSVKG(서열번호 119)	VPVMCTNHWCSYANGMDV(서열번호 127)
E11	GYAMS(서열번호 109)	GISHDGGNTYYADSVKG(서열번호 120)	DRRKGPSTEFDY(서열번호 128)
E12	DYAMS(서열번호 110	WIYPGDSSIYYADSVKG(서열번호 121)	LLSIDQAQLHYYYDAMDV(서열번호 129)

scFv	CDR-L1	CDR-L2	CDR-L3
E1	TGSSSNIGNNAVT(서열번호 130)	DDSHRPS(서열번호 138)	GTWDYSLSGYV(서열번호 146)
E2	TGSSSNIGSNNVT(서열번호 131)	SDSHRPS(서열번호 139)	GSWDYSLSAYV(서열번호 147)
E3	TGSSSNIGSNYVS(서열번호 132)	ADSQRPS(서열번호 140)	GTWDYSLSGYV(서열번호 146)
E5	SGSSSNIGSNDVS(서열번호 133)	ADSNRPS(서열번호 141)	GSWDYSLSGYV(서열번호 148)
E7	TGSSSNIGSNAVT(서열번호 134)	DDNHRPS(서열번호 142)	GAWDYSLNAYV(서열번호 149)
E10	SASSSNIGSNAVY(서열번호 135)	SDNQRPS(서열번호 143)	GSWDYSLSAYV(서열번호 147)
E11	TGSSSNIGSNSVS(서열번호 136)	DDNNRPS(서열번호 144)	GAWDYSLSAYV(서열번호 150)
E12	TGSSSNIGNYYVY(서열번호 137)	ANSHRPS(서열번호 145)	GSWDDSLSAYV(서열번호 151)

scFv	중쇄가변부위	경쇄가변부위
E1	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYSSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASSTCTRTWCSYDDAMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 152)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 160)
E2	EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGSGSKYYADSVKGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWFRGHNVFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 153)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNNVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 161)
E3	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPNGGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALRQCQRYWCSYADGMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 154)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYADSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVLGGGTKLTVLG (서열번호 162)
E5	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAIYSGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVQWNKAPRFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 155)	QSVLTQPPSASGAPGQRVTISCSGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 163)
E7	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSGISHGGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRANNDTGFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 156)	QSVLTQPPSSSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLNAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 164)
E10	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISHGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVPVMCTNHWCSYANGMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 157)	QSVLTQPPSASGTPGQRVIISCSASSSNIGSNAVYWYQQLPGTAPKLLIYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 165)
E11	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISHDGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRKGPSTEFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 158)	QSVLTQPPSLSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 166)
E12	EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPGDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLLSIDQAQLHYYYDAMDVWGQGTLVTVSS(서열번호 159)	QSVLTQPPSPSGTPGQRVTISCTGSSSNIGNYYVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 167)

scFv	scFv 아미노산 서열	scFv 코딩 염기서열
E1	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYSSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASSTCTRTWCSYDDAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG(서열번호 168)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCGGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATCTATTCTAGTAGTGGTAGTAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCTAGTAGTACGTGTACGCGGACGTGGTGTTCTTATGATGATGCTATGGACGTCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGCTGTCACCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATGATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATTATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 176)
E2	EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGSGSKYYADSVKGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWFRGHNVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNNVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 169)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGACTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCGATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATCTATCCTGGTAGTGGTAGTAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGCTTGGTTTCGGGGTCATAATGTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATAATGTCACCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTGATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 177)
E3	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPNGGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALRQCQRYWCSYADGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYADSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVLGGGTKLTVLG (서열번호 170)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATGATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCTAATGGTGGTAGTAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCTCTTCGTCAGTGTCAGCGTTATTGGTGTTCTTATGCTGATGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATTATGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTGATAGTCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGACGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATTATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTAGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 178)
E5	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAIYSGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVQWNKAPRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGAPGQRVTISCSGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 171)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCGATTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATCTATTCTGGTGGTGGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGTTCAGTGGAATAAGGCTCCTCGTTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGGCCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGATGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAGCTCCTCATCTATGCTGATAGTAATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGTACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 179)
E7	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSGISHGGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRANNDTGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGTQSVLTQPPSSSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYDDNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLNAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 172)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTATTCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTCTCATGGTGGTGGTAATAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTTAGGGCGAATAATGATACGGGTTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGAACGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCATCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCACCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATGATAATCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATTATAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 180)
E10	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISHGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVPVMCTNHWCSYANGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVIISCSASSSNIGSNAVYWYQQLPGTAPKLLIYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 173)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATTGATCTCTCATGGTGGTGGTAATATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGGGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTTCCTGTTATGTGTACTAATCATTGGTGTTCTTATGCTAATGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCTCCTGTAGTGCCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTGATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 181)
E11	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISHDGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRKGPSTEFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSLSGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 174)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCGGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTCTCATGATGGTGGTAATACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTAGGAAGGGTCCTTCGACTGAGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATTCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATGATAATAATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATTATAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 182)
E12	EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPGDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLLSIDQAQLHYYYDAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSPSGTPGQRVTISCTGSSSNIGNYYVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 175)	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGACTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCGATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTCTCATGGATCTATCCTGGTGATAGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTCTTAGTATTGATCAGGCTCAGTTGCATTATTATTATGATGCTATGGACGTCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATTATTATGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATGATAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC(서열번호 183)

실시예 2: 항 c- Met /항 VEGF 이중 특이 항체의 제작

상기 참고예 1에서 제작된 항 cMet 항체 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 실시예 1에서 준비된 8종의 항 VEGF scFv를 각각 융합하였다. 그 융합과정은 아래와 같다.

Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 참고예 1에서 제작된 항 cMet 항체 L3-1Y-IgG2의 중쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 66)을 갖는 DNA 절편을 삽입하고, pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 항 cMet 항체 L3-1Y-IgG2의 경쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 68)을 갖는 DNA 절편을 삽입하였다. 이후, pcDNA^TM3.3 에 삽입된 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 실시예 1에서 준비된 항 VEGF scFv 코딩 DNA를 (GGGGS)2로 이루어진 펩타이드 링커의 코딩 DNA 서열을 사용하여 융합함으로써 이중항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터를 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭하였으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=3:2 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 항 cMet/항 VEGF 이중 특이 항체를 정제하였다.

상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 c-말단에 항 VEGF scFv가 융합된 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 MV-15, MV-16, MV-17, MV-18, MV-19, MV-20, MV-21 및 MV-22로 각각 명명하였다. 상기 실시예 1에서 제작된 항 VEGF scFv 명칭과 이를 포함하는 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체 명칭을 아래의 표 10에 정리하였다:

항 VEGF scFv 명칭	항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체 명칭
E2	MV-15
E2	MV-16
E3	MV-17
E5	MV-18
E7	MV-19
E10	MV-20
E11	MV-21
E12	MV-22

비교예 : 항 c- Met 항체와 Ig2 도메인( VIG2 )이 융합된 융합 단백질 제조

상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체들을 기반으로 하여 중쇄 c-말단에 링커가 연결되도록 융합하였다. 이 후, 링커의 말단에 VEGF 수용체 1을 구성하는 아미노산 중 Ig2 도메인, 즉 129번부터 229번까지의 아미노산을 연속해서 융합하여 cMet과 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 항체들을 제작하였다:

VEGF 수용체 1(P17948.2; 서열번호 184)을 구성하는 1338개의 아미노산 중 VEGF 결합에 가장 중요하다고 알려진 Ig2 도메인을 구성하는 129번부터 229번까지 101개의 아미노산을 코딩하는 유전자 서열을 NCBI 데이터베이스로부터 확보하였다.

Ig2 도메인(VIG2) 아미노산 서열 (서열번호 185):

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTI

Ig2 도메인(VIG2) 염기서열 (서열번호 186):

AGTGATACAGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATC

상기 제작된 c-Met 항체의 중쇄와 Ig2 도메인(VIG2)을 연결하기 위하여, GGGGS가 반복되는 구조 중 'GGGGS'(G4S)(서열번호 187), 'GGGGSGGGGS'((G4S)2) (서열번호 188), 또는 'GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS'((G4S)4) (서열번호 189)의 3가지의 링커를 디자인하였고, 이를 c-Met 항체와 VEGF 수용체 1의 Ig2 도메인(VIG2) 사이에 위치하도록 하였으며, 디자인된 최종 유전자의 마지막에 stop codon (TGA)를 삽입한 유전자를 바이오니아에 합성 의뢰하였다. 이렇게 합성된 유전자를 pOptivec 벡터(Invitrogen)에 EcoRI/XhoI 클로닝 site를 이용하여 중쇄 발현벡터를 제작하였다. 경쇄발현 벡터는 상기 항 c-Met 항체 제작시에 사용된 벡터를 그대로 사용하였다.

구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(2.5 x 10⁷)에 2M CaCl₂를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂조건

하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 cMet과 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 항체들을 정제하였다.

이와 같이 제작된 항체를 MV10AY로 명명하고, 그 구성을 아래의 표 11에 정리하였다:

	명명	중쇄	힌지	불변부위	링커	경쇄	VEGF 결합 단편
이중표적 항체	MV10AY	서열번호 62	U6-HC7 (서열번호 101)	IgG1	(G4S)₂	서열번호 68	VIG2 (서열번호 185)
	MV10AY U3 HC9/ IgG1	서열번호 64	U3 HC9 (서열번호 102)	IgG1	(G4S)₂	서열번호 68	VIG2 (서열번호 185)
	MV10AY U3 HC9/ IgG2	서열번호 66	U3 HC9 (서열번호 102)	IgG2	(G4S)₂	서열번호 68	VIG2 (서열번호 185)

이 중에서 MV10AY U3 HC9/IgG2를 선택하여 아래의 실험에서 비교예로서 사용하였다.

실시예 3: 항 c- Met /항 VEGF 이중 특이 항체의 항 c- Met 항체 활성 유지 확인

3.1. c- Met 에 대한 친화도

Met에 대한 결합 친화도를 유지하는지 여부를 Biacore T100(GE)을 사용하여 시험하였다. 인간 Fab 결합제(GE Healthcare)를 CM5 칩(#BR-1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 상기 이중 항체를 각각 약 90~120 RU의 양으로 포획하고, 다양한 농도의 c-Met-Fc(#358-MT/CF, R&D Systems)를 상기 포획된 항체에 주입하였다. 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 2.1) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 표 12에 나타내었다.

c-Met에 대한 친화도

BsAb	MV-15	MV-16	MV-17	MV-18	MV-19	MV-20	MV-21	MV-22
KD(nM)	0.10	0.21	0.09	0.05	0.30	0.04	0.04	0.06

표 12에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2에서 제작된 8종의 이중 특이 항체는 모두 c-Met에 대하여 약 0.2nM 이하의 우수한 결합친화도를 가짐이 확인되었다.

3.2. c- Met 분해 활성

상기 실시예 2에서 제작된 8종의 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체가 c-Met에 대한 분해 활성을 유지하는지 여부를 ELISA를 통하여 MKN45 세포주에서 시험하였다. 항체가 c-Met에 결합하여 내재화를 일으켜 c-Met의 분해(degradation)가 일어나는 것을 이용하여 총 c-Met양의 증감을 파악함으로써 항체의 효능을 검사할 수 있다.

구체적으로, c-Met 양은 정량적 ELISA 방법으로 측정하였으며, human total HGF R/c-Met ELISA kit(R&D systems)을 사용하여 MKN45 위암 세포주(JCRB0254; Health Science Research Resource Bank (HSRRB, Shinjuku, Japan))에서 실험하였다. 200,000 cells/ml의 세포를 5ug/ml의 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체와 섞어 24시간 동안 배양(배지: RPMI with 10% Fetal Bovine Serum)한 후에 ELISA 실험을 진행하였다. 최종적으로 Super Aquablue (eBiosciences)를 사용하여 반응시켰으며 colorimetric signals은 450nm 파장에서의 OD값으로 측정하였다. 항체를 처리하지 않은 비교군(media)의 값을 100%으로 하여, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 처리한 후의 값을 상기 비교군에 대한 상대값으로 계산하였다.

비교를 위하여, 참고예에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2를 투여한 군과 비교예에서 제작된 MV10AY를 처리한군에 대하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2와 동등 이상의 c-Met 분해 활성을 보이는 것으로 나타났다.

3.3. Akt 인산화 저해 활성

상기 실시예 2에서 제작된 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체가 Akt 인산화에 대한 저해 활성을 유지하는지 여부를 Caki-1 세포주에서 시험하였다.

AKT의 인산화 되는 자리는 Ser 473이며 Cell signaling사의 PathScan phospho-AKT1 (Ser473) chemiluminescent Sandwich ELISA kit을 사용하였다. 하루 전날 200,000 cells/ml로 배양한 Caki-1 신장암 세포주(HTB-46; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA)에 무혈청 DMEM 배지 (GIBCO, Invitrogen)에 5ug/ml의 항체를 섞어 30분간 처리한 후 ELISA kit을 사용하여 실험하였다. 결과는 Perkins Elmer사 기계로 측정하여 얻었다. AKT의 인산화 정도를 계산할 때는 positive control인 5D5(American Type Culture Collection; ATCC Cat. # HB11895 하이브리도마 세포에서 분리 정제, Manassas, VA)에 의한 인산화 정도를 100%로 잡았으며, 그 값과 비교하여 다른 항 c-Met항체 및 이중표적 항체의 인산화 유도 정도를 표시하였다. 비교를 위하여, 항체를 처리하지 않은 군 (media), 참고예에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2를 투여한 군, 및 비교예에서 제작된 MV10AY를 처리한군에 대하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2에서 제작된 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 및 MV10AY와 동등 정도의 Akt 인산화 저해 활성을 유지하며, 5D5와 비교하여서는 현저하게 우수한 Akt 인산화 저해 활성을 보인다.

3.4. 위암세포 증식 저해 활성

상기 실시예 2에서 제작된 8종의 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 위암 세포주 MKN45에 대한 세포 증식 저해 활성을 시험하였다.

인간 위암세포주 MKN45 (JCRB0254)를 Health Science Research Resource Bank (HSRRB, Shinjuku, Japan)로부터 입수하였다. 상기 세포주를 10%(v/v) fetal bovine serum (FBS, GIBCO Cat. #16000-044)과 1%(v/v) penicillin/streptomycin (GIBCO, Cat. #15410-122)을 포함하는 RPMI1640 배지 (GIBCO, Cat. #11875-119)에서 배양하였다. 세포주를 5% CO₂를 포함하는 습윤 대기 하의 37℃에서 배양하였으며, confluence 전에 계대배양(subculture) 하였다. CEDEX Analyzer (Roche Diagnostics)를 사용하여 세포수를 측정하였다. 항체 처리(in vitro)에 따른 종양 세포 증식을 조사하기 위하여 Celltiter Glo (CTG: Promega 사) 발광분석법(luminescent assay)을 사용하였다.

상기 분석법은 제조자의 설명서에 따라서 수행하였다. 약술하면, FBS 10%(v/v) 함유 RPMI1640 배지 내의 MKN45 세포를 블랙 96-웰 플레이트(Corning Incorporated, Cat. #Costar 3603) 상에 각 웰당 1x10⁴ cells의 농도로 분주하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지를 이용, 최종 농도 0.008ug/mL, 0.04ug/mL, 0.2ug/mL, 1ug/mL로 희석된 항체로 처리하였다. 72시간 인큐베이팅 후 CTG 용액100 마이크로리터를 각 웰에 첨가한 후, 실온에서 30분간 인큐베이팅하였다. 상기 얻어진 발광 신호를 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)를 사용하여 기록하였다.

비교를 위하여, 참고예에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2를 투여한 군과 비교예에서 제작된 MV10AY를 투여한 군에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4 (MV-15 및 MV-16), 도 5 (MV-17 및 MV-18), 도 6 (MV-19 및 MV-20), 및 도 7 (MV-21 및 MV-22)에 각각 나타내었다. 도 4 내지 7에 나타난 바와 같이, 8종의 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체 모두 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 및 MV10AY와 비교하여 증진된 암세포 증식 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

실시예 4: 항 c- Met /항 VEGF 이중 특이 항체의 항 VEGF 항체 활성 유지 확인

4.1. VEGF 에 대한 친화도

상기 실시예 2에서 제작된 8종의 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체가 VEGF에 대한 결합 친화도를 유지하는지 여부를 Biacore T100(GE)을 사용하여 시험하였다. VEGF (R&D systems)를 CM5 칩(#BR-1005-30, GE)의 표면에 Amine coupling 방법으로 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 상기 이중 항체를 각각 약 90~120 RU의 양으로 포획하고, 다양한 농도의 각 이중항체를 상기 포획된 VEGF에 주입하였다. 여기에 1M NaCl, 5mM NaOH 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 표 13에 나타내었다.

VEGF에 대한 친화도

BsAb	MV-15	MV-16	MV-17	MV-18	MV-19	MV-20	MV-21	MV-22
KD(nM)	6.83	14.78	5.76	4.23	1.00	4.43	8.27	2.20

표 13에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2에서 제작된 8종의 이중 특이 항체는 모두 VEGF에 대하여 약 15nM 이하의 우수한 결합친화도를 가짐이 확인되었다.

4.2. 인간 혈관내피세포( HUVEC )의 전이능 ( migration ) 저해 시험

상기 실시예 2에서 제작된 8종의 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체가 항 VEGF 항체가 일반적으로 갖는 인간 혈관 내피세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell; HUVEC) 이동 (migration) 저해 활성을 갖는지 여부를 확인하였다. 항체 처리 (in vitro)에 따른 전이능 저해 능력 평가를 위해 다음과 같은 실험을 하였다. 세포의 이동은 암의 전이에 직접적으로 관여하므로 다음 분석법은 세포의 전이능을 평가하는 방법으로 범용되는 방법이다.

Oris 96-웰 플레이트(Platypus, OrisTM Cell migration assay) 방법을 수행하였다. 스토퍼(stopper)가 내장된 96-웰 플레이트의 각 웰에 HuVEC 세포 (ATCC)를 10000개씩 시딩하고 무혈청 배지(EBM, Lonza)에서 HGF(R&D systems) 0.4 ug/ml와 VEGF (R&D systems) 0.4 ug/ml를 처리하고 24시간 동안 배양 후 스토퍼를 제거하였다. 스토퍼는 원형의 고무물질로서 스토퍼가 있었던 자리에는 세포가 자라지 못하므로 24시간 후 스토퍼를 제거하면 그 자리만 원형의 공간이 생성되게 된다.

스토퍼 제거 후, 실시예 1에서 제조된 항체 (MV-19, MV-22), 항 c-Met 항체 L3-1Y, 및 MV10AY 항체를 각각 다양한 농도(0.05 내지 5 ug/ml)로 처리한 후, 24시간 후에 형광물질인 calcein AM(BD)으로 염색하면, 세포만 염색되고, 세포가 없는 부분은 공간으로 남아있게 된다. 따라서, 세포 이동이 저해될수록 염색되지 않은 공간의 크기가 크게 나타나며, 염색되지 않은 공간을 관찰함으로써 세포 이동 정도를 측정할 수 있다. 형광신호 세기는 multilabel reader(Perkin-Elmer, Envision)로 판독하였으며, 이에 의해 얻어진 값을 VEGF+HGF 처리군 (media)의 신호세기 100%로 하여 환산하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 바와 같이, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체의 HUVEC 이동 저해 효과는 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2와 비교하여 현저하였으며, MV10AY와 비교하여도 동등 정도를 보였다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00220

20091006

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Polypeptide, Anti-VEGF Antibody, and Anti-c-Met/Anti-VEGF Bispecific Antibodies Comprising the Same <130> DPP20143571KR <160> 189 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> 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linker <220> <221> misc_difference <222> (1008)..(1349) <223> huAbF46 VL <220> <221> misc_difference <222> (1350)..(1355) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (1356)..(1397) <223> V5 epitope <220> <221> misc_difference <222> (1398)..(1442) <223> (G4S)3 linker <220> <221> misc_difference <222> (1443)..(1649) <223> Aga2 <220> <221> misc_difference <222> (1650)..(1652) <223> TGA(stop codon) <220> <221> misc_difference <222> (1653)..(1660) <223> PmeI restriction site <400> 56 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 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tttcgctact tactactgtc aacaatctta ctctgctcca ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg 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tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 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U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 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ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser 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acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 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gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60 cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120 cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180 caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 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encoding polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 69 aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60 tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120 tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180 ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240 aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300 ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360 cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420 agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758 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tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 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gaaactctag atgctcagac ttttcacaca 660 agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc 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900 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299 <210> 84 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met <400> 84 gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60 ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120 ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180 aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240 ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300 gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 360 aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420 gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480 cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540 caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600 acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660 caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720 aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780 tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840 aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900 gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 85 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 86 Leu Thr 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Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845 Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys 850 855 860 Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys 900 905 910 Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940 Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val 945 950 955 960 Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser 965 970 975 Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990 Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg 995 1000 1005 Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile Cys Asp 1025 1030 1035 1040 Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr Val Arg Lys 1045 1050 1055 Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe 1060 1065 1070 Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu 1075 1080 1085 Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln 1090 1095 1100 Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg 1105 1110 1115 1120 Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys 1125 1130 1135 Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu 1140 1145 1150 Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp 1155 1160 1165 Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr 1170 1175 1180 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala 1185 1190 1195 1200 Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu 1220 1225 1230 Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys 1250 1255 1260 Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys Ser Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser 1285 1290 1295 Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn 1315 1320 1325 Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile 1330 1335 <210> 185 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig2 domain of VEGFR-1 (VIG2) <400> 185 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile 100 <210> 186 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding VIG2 <400> 186 agtgatacag gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300 atc 303 <210> 187 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 187 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 188 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 189 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 189 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims

서열번호 109 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 152 내지 서열번호 159으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 160 내지 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 168 내지 서열번호 175로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
서열번호 109 내지 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 114 내지 서열번호 121로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 122 내지 서열번호 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역;
서열번호 130 내지 서열번호 137로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 138 내지 서열번호 145로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 146 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역; 또는
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합
을 포함하는, 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서,
서열번호 152 내지 서열번호 159으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위,
서열번호 160 내지 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위, 또는
이들의 조합
을 포함하는, 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서, 서열번호 168 내지 서열번호 175로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항 VEGF scFv인, 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
상기 항 c-Met 항체는 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고,
상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 109 내지 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 114 내지 서열번호 121로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 122 내지 서열번호 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역; 서열번호 130 내지 서열번호 137로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 138 내지 서열번호 145로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 146 내지 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역; 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합을 포함하는 것인,
항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체.
제7항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것인,
항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체:
제7항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것인, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체.
제7항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것인, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체.
제7항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열, 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열, 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열, 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및
서열번호 68의 아미노산 서열, 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열, 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄
를 포함하는 것인, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체.
제7항에 있어서, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 152 내지 서열번호 159으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위,
서열번호 160 내지 167로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위, 또는
이들의 조합
을 포함하는 것인, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체.
제7항에 있어서, 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 168 내지 서열번호 175로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항 VEGF scFv 단편인, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체.
제7항에 있어서, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 항 VEGF 항체의 scFv 단편을 포함하는 형태인, 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항 VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.