KR20160033280A - 고본 추출물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 고본 추출물(Angelica tenuissima Nakai)을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 아밀로이드 베타 펩티드가 주입된 마우스 모델에서 고본 추출물을 투여한 후 미로 검사를 수행하였을 때, 변경 행동력(alternation behavior) 및 기억력을 증가시키고 BDNF, ERK, 및 CREB 발현량을 증가시킴을 확인함으로써, 고본 추출물을 단기기억형태의 순간 공간 인지력이 약화된 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

고본 추출물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of Alzheimer's disease comprising Angelica tenuissima Nakai as an active ingredient}

본 발명은 고본(Angelica tenuissima Nakai) 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경계 질환, 특히 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

알츠하이머는 치매 환자 본인에게는 물론 가족 및 사회에도 막대한 비용을 초래하는 질환이다. 고령화 사회에 들어서면서 노화에 대한 관심과 더불어 이에 관련된 질병, 뇌졸중, 알츠하이머 치매 등의 뇌신경질환들이 증가하고 있다. 다양한 뇌질환 중에서도 치매(dementia)는 가장 광범위한 세포 손상을 유발하는 질환으로 퇴행성 정신장애를 동반하며, 특히 기억력 장애, 판단력 상실 등의 주요증상이 잘 알려져 있다. 치매의 원인은 다양해서 뇌혈관의 협착이나 폐색으로 생기는 혈관성 치매(20-30%)와 베타아밀로이드 단백질이 뇌내에 축적되어 발병하는 것으로 알려진 알츠하이머성 치매(50%), 그리고 이들 두 가지 원인이 복합적으로 작용하여 생기는 혼합형 치매(15-20%)로 크게 나눌 수 있다. 내원하는 환자 중 가장 많은 비율을 차지하는 치매 유형은 알츠하이머성 치매이며, 최근 연구에 따르면 2050년에는 85명 중 1명의 비율로 이 질환을 가질 것이고, 이중 43%는 집중 치료를 받아야한다는 보고가 있다(Prabhulkar S, Piatyszek R, et al. J Neurochem., 2012, 122, 374-381).

치매의 가장 중요한 원인 질환인 알츠하이머병이라는 노인성 치매질환은 아직까지 발병원인이 정확하게 밝혀지지 않았지만 노화와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 노인인구가 급격히 증가하고 있는 현대사회에서 최대의 노화질환일 뿐만 아니라 21세기에 인류가 당면할 심각한 보건문제가 될 것으로 예상되고 있기 때문에 “21세기 질환”으로 명명되고 있다.

알츠하이머 병은 크게 유전성 알츠하이머 병(familiar Alzheimer's disease)과 산발성 알츠하이머 병(sporadic Alzheimer's disease, SAD)으로 분류된다. 유전성 알츠하이머 병은 전체 알츠하이머 병 환자의 5~10% 정도를 차지하며, 원인 유전인자로 알려진 프레세닐린 1(presenilin 1(PS1)), 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor 단백질(APP)) 및 프레세닐린 2(presenilin2(PS2))에 돌연변이가 일어났을 경우 100% 알츠하이머 병으로 발병하게 된다. 산발성 알츠하이머 병은 알츠하이머 병 환자의 대부분을 차지하며, 아포지단백질E(apolipo단백질 E(ApoE))나 알파-2 마크로글로불린(Alpha-2 macroglobulin( A2M))에 돌연변이가 일어났을 때 알츠하이머 병으로 진전할 확률이 높아지는 위험인자는 밝혀져 있으나, 현재까지 발병의 정확한 원인은 알려진 것이 없다.

알츠하이머 병의 병리학적 특징으로는 신경세포의 외부에 축적되어지는 노인반점(senile plaques), 신경세포의 세포체 내에 엉켜진 실뭉치처럼 보이는 신경섬유 덩어리(neurofibrilary tangles) 및 신경세포의 손실(neuronal loss) 등을 들 수 있다. 이러한 병리학적 특징은 유전성 알츠하이머 병 및 산발성 알츠하이머 병의 모든 경우에 나타나며, 이 중 노인반점의 주요 구성 요소로는 응집된 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid peptide, A)라는 독성단백질이 밝혀져 있다. 아밀로이드 베타 펩티드는 아밀로이드 전구단백질의 비정상적인 절단으로부터 생성된 40 내지 42개의 아미노산으로 이루어진 불용성 펩티드이다. 또한, 아밀로이드 베타 펩티드의 과다 축적은 유전성 알츠하이머 병 및 산발성 알츠하이머 병의 모든 경우에 공통적 현상으로 나타난다고 보고되어 있다. 따라서 아밀로이드 베타 펩티드는 알츠하이머 병의 주요 병원성 믈질(pathogenic material)로 간주되고 있다.

알츠하이머 병의 전반적인 발병과정은 프레세닐린 1, 2 유전자(PS 1, 2)의 돌연변이가 발생하면 베타-세크레타제(-secretase)에 의해 아밀로이드 전구단백질이 비정상적으로 절단되고 아밀로이드 베타 펩티드가 생성된다. 생성된 아밀로이드 베타 펩티드에 의해 뇌신경세포의 괴사가 일어나며, 이로 인해 알츠하이머 병이 발병하게 된다고 알려져 있다.

뇌염증세포인 대식세포(macrophage)와 뇌신경교세포(microglia)로부터 분비되는 염증물질, 이로 인한 신경세포사멸이 중요하며 특히 신경교세포의 활성조절과 신경세포보호는 치매의 예방, 조절 및 치료법 개발의 핵심표적이다. 활성화된 교세포는 세포독성을 유발할 수 있는 TNF-알파, 인터루킨 등과 같은 염증 유발 인자인 사이토카인의 생성을 증가시켜 신경세포와 교세포에 대해 독성을 증가시키므로(Hewett, S.J. et al., Neuron, 13:487-494, 1994; Hewett, S.J. et al., Stroke, 27:1586-1591, 1996), 알츠하이머 질환에서의 염증 반응은 새로운 알츠하이머 치매 치료제의 목표가 될 것으로 보인다. 따라서, 이와 관련된 치료제로서 세포독성 물질들의 유리에 관여하는 효소들을 억제하거나 호중구(neutrophil)의 침착을 억제하는 약물이 개발될 수 있다(Dirnagl, U. et al; TINS., 22 , pp391-397, 1999).

현재까지 치매의 원인과 치료법에 대한 광범위하고 다양한 연구가 진행되어 왔으나, 원인규명이 미비하고 효과적인 치료법의 개발이 아직 미진한 수준이다. 비록 알츠하이머 치매의 치료제로서 타크린(tacrine), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 도네페질(donepezil), 메만틴(memantine)가 FDA로부터 인가되었지만 현재 사용되는 치매 치료제는 대부분 퇴행성 치매의 증상을 완화시키는 정신퇴행 완화 물질에 불과하며, 이들 중 대부분은 소염작용을 하는 약물로서 간독성과 소화기관의 점막을 손상시키는 등의 부작용이 있으며, 궁극적인 원인치료라기보다는 대증적인 요법에 국한되어 있다는 한계가 있다. 아세틸콜린성 신경전달물질은 뇌 인지기능의 향상을 유도하는 약물인데 치매 증상의 진행이나 증세를 일시적으로 경감시켜 주는 것에 불과하다. 더욱이 신경세포의 사멸이 진행될수록 약물의 효과는 저하되며, 중증치매의 경우 그 효과는 없다.

현재까지 연구된 약물들은 글루타민산 수용체 길항제, 항산화제, 칼슘 혹은 나트륨, 등의 이온체널 차단제 등을 이용한 것이 대부분이며 아직까지 효과적인 약물이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 획기적인 아이디어 전환과 새로운 신개념의 치료제 발굴이 요구되고 있다.

식물에는 알츠하이머 치매 예방 활성물질의 존재 가능성이 크고, 한방에서는 예로부터 수종식물을 치매 예방에 사용해 오고 있어, 이를 알츠하이머 치매 예방 및 치료용 약물 또는 건강기능식품으로 개발할 필요가 있다.

고본(Angelica tenuissima Nakai)은 산형과에 속하는 다년생 초본으로서, 전국의 깊은 산골에서 자생하는 식물이다. 상기 고본은 지신, 울향, 산채, 미경, 귀경, 고발이라고 부르기도 하며 고본 초장은 40 내지 80°정도로 곧게 자라며 향기가 강한 약초이다. 또한 고본 잎은 뿌리잎 및 4 회 깃털잎으로 가늘게 갈라지며, 꽃은 백색으로 8 내지 9월에 피고, 종자는 10월에 맺는다. 고본의 맛은 맵고 따뜻하며, 매운맛은 발산작용이 강하여 외감성으로 인한 두통, 발열, 해수, 가래, 콧물에 사용하고, 풍한습이 원인이 되어 발병한 사지 마비 관절동통에 강활, 방풍, 위령선과 배합하여 사용한다. 또한 머리가 아픈 두정통을 멈추게 하는 효과를 가지고 있다. 상기 고본은 휘발성 정유를 함유하고 있는데, 정유 성분은 진정, 진통, 해열, 항염증 작용을 나타내고 장관과 자궁평활근을 억제시키고 백선균에 강한 억제작용을 나타내며, 신경성 피부염, 가려움증, 피부의 발진을 소실효과를 가지는 약용식물 중 하나이다.

상기 고본의 뿌리는 한약재로 사용되는데 그 구성성분으로는 뿌리줄기에 약 0.5 %의 정유, 3-부틸리데네프탈리드(3-butylidenephthalide senkyunolid), 스니딜리드(cnidilide), 리거스틸리드(ligustilide) 등이 알려져 있으며 또한 종자에는 β-시토스테롤(β-sitosterol), 프란골라린(prangolarin) 등이 알려져 있다. 이 밖에도 고본과 관련하여 항산화 및 소염제 효과 등 다양한 효과들이 연구되고 있으나. 아직까지 알츠하이머 치매와 관련된 질환에 대한 효과가 보고된 바는 없다.

이에, 본 발명자들은 알츠하이머 질환을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 고본(Angelica tenuissima Nakai) 추출물이 아밀로이드 베타 펩티드의 축적로 인한 치매에 예방효과가 있고, 알츠하이머 치매 마우스 모델에서 Y자 미로형과 모리스 수중미로 행동검사에서 유의한 효과가 있음을 확인함으로써, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고본(Angelica tenuissima Nakai) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 고본 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고본 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 고본 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 고본 추출물(Angelica tenuissima Nakai)을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 아밀로이드 베타 펩티드가 주입된 마우스 모델에서 고본 추출물을 투여한 후 미로 검사를 수행하였을 때, 변경 행동력(alternation behavior) 및 기억력을 증가시키고 알츠하이머 모델에서 감소하는 BDNF, ERK, 및 CREB 발현량을 증가됨을 확인함으로써, 고본 추출물을 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 STD(standard)는 프룰산, 데쿠르신/데쿠르시놀 혼합물의 HPLC 데이타를 나타내고, 고본 30% 에탄올 추출물의 HPLC 데이타를 나타낸 그래프이다.
도 2는 아밀로이드 베타 펩티드 주입 동물모델을 이용한 Y자 미로형 검사에서 각 구역으로 들어가는 총 횟수를 나타내는 총 진입(total number of entry) 수 및 마우스의 자발적인 변경(spontaneous alternation)이 활동성(%)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 아밀로이드 베타 펩티드 주입 동물모델을 이용한 모리스 수중 미로 검사에서 분원에 머무는 시간 및 거리를 측정한 그래프이다.
도 4는 각각의 군에서 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 발현량을 상대적 강도로 나타낸 그래프이다.
도 5는 각각의 군에서 NeuN(neuronal nuclearantigen) 발현량을 상대적 강도로 나타낸 그래프이다.
도 6은 각각의 군에서 BDNF(Brain-derived neurotrophic factor) 발현량을 상대적 강도로 나타낸 그래프이다.
도 7은 각각의 군에서 p-CREB/CREB(cAMP response element-binding protein) 발현량의 상대적 강도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 각각의 군에서 p-ERK/ERK 발현량의 상대적 강도를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고본(Angelica tenuissima Nakai) 추출물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 고본 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 추출물은 추출용매로 추출하거나 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조할 수 있다.

상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 한다.

상기 추출용매는 물 및 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 80%의 에탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 알코올 수용액, 더욱 바람직하게는 40 내지 70% 에탄올 수용액일 수 있다.

상기 분획물은 고본 추출물을 물, n-헥산, 에틸아세테이트로 순차 또는 각각 분획하여 얻은 n-헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로는 불순물을 제거한 고본에 추출용매를 가하고 추출과정을 수행하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 추출 과정은 냉침추출법, 온침추출법, 가압추출법 또는 초음파 분쇄 추출법일 수 있다. 또한, 상기 추출법으로 제조한 추출물 즉, 조추출액에 분획용매를 가한 후에, 예를 들어 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 순서로 가한 후에 층분리한 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 수득하는 것이 바람직하다. 추출온도는 30 내지 100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 내지 48시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 2 내지 5회인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 추출물은 추출 또는 분획과정을 수행한 이후, 감압 여과 과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 상기 농축 및 건조는 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 수득한 고본 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있다.

상기 고본 추출물 또는 이의 분획물은 페룰산(ferulic accid), 데쿠르신(decursin) 및 데쿠시놀(decusinol)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 알츠하이머 질환은 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 한다.

상기 알츠하이머 질환은 예방 또는 치료용 조성물은 혈관성 치매의 치료 또는 예방하기 위한 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 열수추출법(물 또는 물과 알코올 혼합용매)를 이용하여 고본 추출물의 제조하고, 이의 추출물을 이용하여 고본 활성 분획물을 제조하여 HPLC로 분석하였다. 아밀로이드 베타 펩티드(Amyloid beta peptide) 주입에 의한 알츠하이머 마우스 모델을 제작한 후, Y자 미로형 검사 및 모리스 수중 미로 검사를 수행한 결과, 각 구역으로 들어가는 총 횟수를 나타내는 총 진입(total number of entry)에서는 변화가 없는 것으로 나타나므로 자발적인 변경(spontaneous alternation)이 마우스의 활동성 변화에 의해 나타난 것이 아님을 확인하였고, 고본 추출물은 알츠하이머 질환인 학습 및 기억력의 감소를 회복시켜 치매를 완화시킬 수 있음을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 또한, 상기 아밀로이드 베타 펩티드(Amyloid beta peptide) 주입에 의한 알츠하이머 마우스의 단백질 발현량을 분석을 수행한 결과, 고본 추출물이 NeuN, GFAP 및 BDNF의 단백질량을 증가시킴을 확인하였다(도 4, 도 5, 도 6 및 도 6 참조). 또한, MAPK 경로에 관련된 단백질인 ERK와 CREB의 발현량을 고본 추출물이 증가시킴을 확인하였다(도 7).

따라서, 본 발명의 고본 추출물 및 이의 분획물은 아밀로이드 베타 펩티드(Amyloid beta peptide) 주입에 의한 알츠하이머 마우스의 학습 및 기억력의 감소를 회복시키고 NeuN, GFAP 및 BDNF의 단백질량을 증가시킴을 확인함으로써, 고본 추출물을 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물 및 이의 분획물을 함유하는 약학적 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 흰색 고본 추출물을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 담체, 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 본 발명의 치료용 조성물은 당해기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물은 고본 추출물의 양을 기준으로 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.02 내지 200mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량과 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 치료용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 고본 추출물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 고본 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 알츠하이머 질환 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물은 고본 추출물 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 조성물에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 고본 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.

본 발명은 고본 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물이 상기와 같은 알츠하이머 질환 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.

본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.

상기 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의도이다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 고본 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

또한, 알츠하이머 질환의 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 고본 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 알츠하이머 질환 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 알츠하이머 질환 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 고본 추출물 및 이의 분획물은 아밀로이드 베타 펩티드(Amyloid beta peptide) 주입에 의한 알츠하이머 마우스의 학습 및 기억력의 감소를 회복시키고 NeuN, GFAP 및 BDNF의 단백질량을 증가시킴을 확인함으로써, 고본 추출물을 알츠하이머 질환 예방 및 개선용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발병을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예1 > 고본 추출물의 제조

<1-1> 물 용매를 이용한 열수추출법

경상북도 봉화에서 수확한 고본을 건조시켜 실험에 사용하였다. 분쇄한 상태의 고본 100 g을 1 ℓ의 증류수에 첨가하여 잘 교반한 다음, 90 내지 95℃를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였고 55 내지 65℃로 생약추출물을 감압농축한 후, 동결 건조시켜 생약조성물 분말 엑스 21.2 g을 얻었다.

<1-2> 물과 알코올 혼합용매를 이용한 열수추출법

상기 실시예 <1-1>의 동일한 방법으로 분쇄된 고본 450 g에 3 ℓ의 30% 에틸알코올을 첨가하여 잘 교반한 다음, 열을 가해 80 내지 90℃를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였고 55~65℃에서 생약추출물을 감압농축한 후, 동결 건조시켜 생약조성물 분말 엑스 28.02 g을 얻었다.

<1-3> 고본 활성 분획물의 제조

상기 고본 추출물을 약 1 ｇ을 달아 에테르로 속시렛 추출을 4 시간 동안 하고, 에테르를 농축한 후 최종볼륨을 메탄올 2 ㎖로 맞춘 후, 각각 하기와 같은 조건의 HPLC로 분석하였다.

컬럼: Nucleosil C18

이동상: A; 0.1% AcOH, B; ACN (0.1% AcOH)

0 min 19% B, 10 min; 80% B, 25 min; 85% B, 30 min 100% B

유속: 0.7 ml/min

파장: 320 nm

컬럼온도: 30 ℃

표준: 페룰산(Ferulic acid), 데쿠르신/데쿠시놀 혼합물(decursin/decursinol Mixture)

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 고본 30% 에탄올은 각각 0.003%, 0.005%를 나타냈다.

0.005는 %를 의미한다. 즉, 고본 100g에 0.005g(5 ㎎)을 의미한다.

< 실험예 1> 아밀로이드 베타 펩티드( Amyloid beta peptide ) 주입에 의한 알츠하이머 마우스 모델 제작

아밀로이드 베타 펩티드 주입 동물모델(Amyloid beta_{1 -42} infused mouse model)을 제조하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, C57BL/6 마우스를 조레틸(Zoletil)과 럼푼(Rompun)이 2:1로 혼합된 마취약으로 마취한 후, 뇌의 해마 CA1 지역에 아밀로이드 베타(Amyloid beta_1-42) 펩티드를 주입하여(coordinates: -2.3 mm anterior/posterior, 1.8 mm medial/lateral and -1.75mm dorsal/ventral from Bregma) 알츠하이머 모델 마우스를 제조하였다.

< 실험예 2> 아밀로이드 베타 펩티드 주입 동물모델을 이용한 Y자 미로형 검사

단기 기억 형태로서 순간 공간 인지력을 평가하기 위하여, 아밀로이드 베타 펩티드 주입 동물모델을 이용한 Y자 미로형 검사(Y-maze test)를 수행하였다.

구체적으로, Y자 미로형 검사에 이용되는 기구는 세 개의 가지(arm)으로 구성되어 있고, 각각의 가지(arm)의 길이는 42 cm, 넓이는 3 cm, 높이는 12 cm이고, 세 가지가 접하는 각도는 120°이다. 모든 실험 장치는 검정색의 폴리비닐 플라스틱(polyvinyl plastic)으로 구성되어 있으며, 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 이때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하여 들어갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우(ABC, CAB, BCA; 실제 변경(actual alternation))에 1점씩을 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 3가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 하기의 수학식에 의해 계산하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 아밀로이드 베타 펩티드를 마우스의 뇌에 직접 주입(1.2/mouse, i.c.v)하여 유발된 음성 대조군의 변경 행동력은 주입하지 않은 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 감소하였음을 확인하였다 (p<0.05). 그러나 고본(Angelica tenuissima Nakai) 투여군(50mg/kg, 200mg/kg, 16일 동안 0.2 ㎖씩 구강투여)에 의한 자발적인 변경(spontaneous alternation)은 음성대조군에 비해 유의성 있게 증가하였다(P<0.05). 자발적인 변경(Spontaneous alternation)이 증가한다는 것은 학습 및 기억력이 회복되었다는 것을 의미한다. 또한, 각 구역으로 들어가는 총 횟수를 나타내는 총 진입(total number of entry)에서는 변화가 없는 것으로 나타나므로 자발적인 변경(spontaneous alternation)이 마우스의 활동성 변화에 의해 나타난 것이 아님을 확인하였다(도 2).

< 실험예 4> 모리스 수중 미로 검사

아밀로이드 베타 펩티드 주입 동물모델을 이용하여 설치류의 공간학습 및 기억력(spatial learning and memory)을 측정하는 방법의 일종인 수동 회피 검사를 수행하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 하기 실험은 기존의 모리스(Morris)의 방법을 응용하여 시행하였다. 먼저, 실험 시작 1시간 전에 마우스를 행동 관찰실로 옮기고 안정시켰다. 미로(maze)의 제원은 지름 90 cm, 높이 32.5 cm이며 플랫폼(white platform)의 지름은 5 cm로 구성되어 있다. 수중미로의 주변은 비디오카메라와 연결된 컴퓨터 시스템과 수온조절용 장치 등 공간단서들을 항상 일정하게 유지시켰다. 그런 다음, 미로(maze)에 물을 채우고 마우스가 플랫폼을 볼 수 없도록 물 높이의 1cm 밑에 설치하였다. 상기 미로에 4개의 마커를 사용하여 4분원이 되도록 나누어서 북동(NE), 북서(NW), 남동(SE), 남서(SW)로 구분하였고, 미로의 하나 4분원에 플랫폼을 설치하였다. 모리스 수중미로 검사(Morris water maze test)는 6일 동안 진행하였고, 첫째 날에는 각 마우스들이 물에 대하여 적응을 할 수 있도록 1분간 미로 내에서 자유로이 수영하도록 하였고, 이때 플랫폼은 설치하지 않았다. 두 번째 날부터 5일째 되는 날까지는 하루에 각각의 마우스가 1일 4회씩 10분 간격으로 1분 동안 미로에서 수영하도록 하였다. 두 번째 되는 날부터 5일째가 되는 4일 동안 1회의 실험방법은 이미 미로 내에 설치한 플랫폼에 1분 이내에 10초간 올라가 있는 마우스는 실험을 마치고 1분 이내에 플랫폼을 찾지 못하거나 플랫폼에 10초간 올라가 있지 않은 마우스는 실험종료 후 인위적으로 10초간 플랫폼에 올려둔 후 실험을 종료하며, 이때 플랫폼의 위치는 같은 자리에 고정시켰다. 6일째 되는 날에는 플랫폼을 미로에서 제거한 후 플랫폼이 있던 분원에 마우스가 머문 시간을 측정하였다. 모리스 수중 미로 학습에서 마지막 날인 5일째 기억검사를 시행하기 위하여, 플랫폼을 제거한 후 60초간 자유 수영을 실시하고 이를 스마트 프로그램(Smart program)을 통하여 총시간 중 플랫폼에 있었던 4분원에 머무는 시간을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 각 군의 기억력 측정결과로서 대조군(sham)은 23.6529 ± 3.1039초, 아밀로이드 베타 펩티드 투여군은 14.5863 ±2.109초, 아밀로이드베타 펩티드 + 고본 50mg/kg 투여군은 24.1278 ± 2.0607초, 및 아밀로이드베타 펩티드 + 고본 200mg/kg 투여군은 26.1925 ± 3.0323초를 나타냈고, 집단간 유의성있는 차이를 나타냈다(P < 0.05)(도 3). 이는 알츠하이머 질환이 유발되는 경우 발생할 수 있는 학습 및 기억력의 감소를 고본 추출물이 증가시켜 치매를 완화시킬 수 있음을 확인함으로써, 고본 추출물이 치매 예방 및 치료 효과가 있음을 확인하였다.

군	Aβ주입(Aβ infusion)	표적 4분원에서 머문 시간 (s)
대조군(Sham) 음성 Exp. A Exp. B	○ ○ ○	23.6529 ± 3.1039 14.5863 ± 2.109# 24.1278 ± 2.0607* 26.1925 ± 3.0323*

각각의 값은 평균 S.E.M. #p< 0.05를 나타낸다. 대조군(sham)과 비교하여 #p< 0.05, Aβ-주입된 군과 비교하여 *p< 0.05를 나타낸다.

< 실험예 5> 단백질 발현량 분석 검사

상기 아밀로이드 베타 펩티드 주입 동물모델을 이용하여 동물 행동 검사가 끝난 후, 단백질 발현량을 분석을 수행하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 마우스를 CO₂로 안락사시킨 후, 뇌를 적출하여 전전두엽과 해마에서의 단백질 발현량을 분석하기 위한 정량법으로서 전기영동을 통한 단백질-항체반응(western blot)법을 시도하였다. 웨스턴 블랏은 여러 단백질의 혼합물로부터 특정 단백질을 찾아내는 기법으로서 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 단백질의 존재 여부를 밝혀내는 기법으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)상에서 전기영동을 수행하였다. 이후 전기영동을 마친 겔 내의 단백질을 폴리비닐리덴플루오라이드(Polyvinylidene fluoride)지에 이동시킨 후, NeuN(neuronal nuclearantigen)과 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)을 항체로서 반응하여 발색하여서 해당 단백질량을 측정하였다. 대조군으로는 액틴(actin)을 사용하였다.

그 결과, 도 4 내지 도 7에 나타낸 바와 같이 GFAP의 발현량 결과로부터 알 수 있듯이, 알츠하이머 질환 모델에 비하여 고본 추출물을 처리한 실험군의 발현량이 감소하는 경향성을 나타내므로 이는 항염 작용에 관여함을 확인하였다(도 4). 또한, 알츠하이머 치매 모델(음성(negative))에서의 NeuN 발현량이 감소함을 확인할 수 있었고, 이에 비해 고본 추출물은 해마에서의 NeuN의 발현량을 증가시킴을 확인하였다(도 5). BDNF(Brain-derived neurotrophic factor)의 발현량 결과에서, 알츠하이머 치매 모델에서는 상기 BDNF 발현량이 감소한 반면, 고본 추출물은 상기 발현량을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 6). 신경성장인자의 발현 증가시 나타나는 MAPK 경로의 변화도 확인할 수 있었으며 이는 치매 유발모델에서는 MAPK 경로에 관련된 단백질인 ERK와 CREB의 발현량이 감소한 반면, 고본 추출물은 이를 증가시킴을 확인하였다(도 7). 이는 고본 추출물이 기억력을 회복시키는데 영향을 주며 이는 아밀로이드 베타 펩티드의 축적을 감소시키고 이에 따른 염증반응에 관련된 단백질의 발현량을 변화시킴으로서 나타남을 확인할 수 있다.

Claims (8)

1. 고본(Angelica tenuissima Nakai) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 고본 추출물을 물, n-헥산, 에틸아세테이트로 순차 또는 각각 분획하여 얻은 n-헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 고본 추출물 또는 이의 분획물은 페룰산(ferulic accid), 데쿠르신(decursin) 및 데쿠시놀(decusinol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머 질환은 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
7. 고본 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 알츠하이머 질환은 알츠하이머성 치매인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
   

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