KR20160032310A - 회향 열매 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부염 개선 또는 치료 효과를 나타내는 회향(Foeniculum vulgare) 열매 추출물의 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride) 분획물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 전-염증성 사이토카인과 전-염증 매개인자의 발현을 저해하는 효과 및 NF-κB p65의 핵 전위를 억제하는 효과가 우수하며, 피부염 동물 모델의 염증 치료 효과가 탁월한 회향 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 포함하는 약학적 조성물 및 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 식용 식물인 회향을 이용함으로써 세포에 독성을 나타내지 않아 안전하게 사용가능한 장점이 있다.

Description

회향 열매 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 치료용 약학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING DERMATITIS COMPRISING FRACTION OF FOENICULUM VULGARE EXTRACT}

본 발명은 피부염 개선 또는 치료 효과를 나타내는 회향 (Foeniculum vulgare) 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 (Methylene Chloride) 분획물에 관한 것이다.

피부는 인간의 가장 큰 기관이며, 기계적 영향, 미생물, 감염성 물질 (infectious agents), 및 반응성 산소종 (reactive oxygen species)에 대해 보호장벽을 제공한다.

피부 면역체계에서 대식세포는 다양한 자극에 대한 숙주 면역 반응에서 중요한 역할을 하는데, 대식세포는 염증 위치 쪽으로 이동하여, NO (nitric oxide), PGE2 (prostaglandins E2), IL (interleukin)-1β, IL-6, 및 TNF (tumor necrosis factor)-α와 같은 염증매개인자를 생성한다. 또한, 대식세포에서 이러한 염증성 사이토카인의 과생성은 건선, 만성 접촉성 피부염 등의 여러 염증성 피부 질환과 많이 관련되어 있다.

NF-κB (Nuclear factor-kappa B)는 IκB 키나제 α/β (IKKα/β)에 의한 IκB (NF-κB의 저해제)의 빠른 인산화를 통해 염증 반응에 관여하는 중요한 조절자로, NF-κB 경로를 저해하는 화합물은 염증성 피부 질환의 치료를 위한 가능성 있는 잠재적인 치료제이다.

또한, 반응성 산소종 (reactive oxygen species, ROS), 예를 들어, 초과산화물 음이온 (superoxide anion), 히드록실 라디칼, 및 퍼옥시니트라이트 (peroxynitrite)의 높은 수치도 피부 염증성 질환의 병인에 기여하는 것으로 알려져 있으며, 대식세포에 의한 과도한 ROS 생성은 핵산, 단백질, 및 막 지질을 손상시킬 수 있고, 이로 인해 조직손상이 일어나며, 결국 염증 상태를 증가시키는 것으로 알려져 있다(Lee HJ et al. J Ethnopharmacol 2006; 103: 208-216, Kumar D. J Pharmacol Pharmacother 2011; 2: 200-202, Choi EM et al. Fitoterapia 2004; 75: 557-565).

그러나, 아직까지 피부 염증성 질환에 대한 회향의 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 천연물질인 회향으로부터 분리한 화합물 임페라토린이 피부 염증성 질환에 우수한 치료 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 회향 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 회향 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 회향 (Foeniculum vulgare) 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 회향 (Foeniculum vulgare) 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것일 수 있다.

[화학식 Ⅰ]

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부염으로 인한 발적, 부종, 열감, 또는 동통을 치료 또는 개선하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 연고, 겔, 크림, 패취 및 분무제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 및 바디 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제품에 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 전-염증성 사이토카인과 전-염증 매개인자의 발현을 저해하는 효과 및 NF-κB p65의 핵 전위를 억제하는 효과가 우수하며, 피부염 동물 모델에서 염증을 치료하는 효과가 탁월한 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 식용 식물인 회향을 이용함으로써 세포에 독성을 나타내지 않아 안전하게 사용가능한 효과가 있다.

도 1은 회향으로부터 분리된 쿠마린의 화학적 구조를 나타낸 것이다: (a) 스코폴레틴; (b) 8-메톡시프소랄렌; (c) 베르갑텐; (d) 임페라토린.
도 2는 회향으로부터 분리된 쿠마린이 RAW264.7 대식세포 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다(막대: 평균±SD (n=3), S: 스코폴레틴, M: 8-메톡시프소랄렌, B: 베르갑텐, I: 임페라토린).
도 3은 회향으로부터 분리된 4개의 쿠마린이 LPS-유도된 염증 반응에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것으로, (a) NO 및 PGE2 수준은 시판되는 검출 키트를 이용하여 배양 상등액에서 측정한 결과; (b) iNOS와 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현을 각각 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 측정한 결과; (c) ELISA로 배양 상등액 내 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 수준을 측정한 결과; (d) RT-PCR로 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α mRNA의 발현을 측정한 결과이며, 3개의 독립적인 실험으로부터 대표적인 데이터를 나타내었다(RT-PCR 대조군: GAPDH, 웨스턴 블롯 대조군: β-액틴, 막대: 평균±SD (n=3), *p<0.05 대 LPS 단독, S: 스코폴레틴, M: 8-메톡시프소랄렌, B: 베르갑텐, I: 임페라토린).
도 4는 회향으로부터 분리된 4개의 쿠마린이 NF-κB 신호 경로에 미치는 영향을 세포질(a) 및 핵(b) 단백질에서 웨스턴블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, 3개의 독립적인 실험으로부터 대표적인 데이터를 나타내었다(대조군: β-액틴 및 TBP, S: 스코폴레틴, M: 8-메톡시프소랄렌, B: 베르갑텐, I: 임페라토린).
도 5는 회향으로부터 분리된 4개 쿠마린의 자유 라디칼 소거 효과를 나타낸 것으로, (a) DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과; (b) ABTS 라디칼 소거 활성측정결과이며, A.A(아스코르브산, 1mg/ml) 및 BHA(부틸레이티드 히드록시아니솔, 1mg/ml)를 기준으로 사용하였다(막대: 평균±SD (n=3), S: 스코폴레틴, M: 8-메톡시프소랄렌, B: 베르갑텐, I: 임페라토린).
도 6은 회향으로부터 분리된 4개의 쿠마린이 TPA-유도된 염증 반응에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것으로, (a) 마우스 귀 무게 측정 결과 및 (b) 마우스 귀 두께 측정 결과(막대: 평균±SD (n=4), * p<0.05 대 TPA 단독); (c) 조직학적 분석을 위한 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과(배율: X 40); (d) IL-1β, IL-6, TNF-α 및 COX-2의 발현을 RT-PCR로 측정한 결과(대조군: GAPDH)이다(S: 스코폴레틴, M: 8-메톡시프소랄렌, B: 베르갑텐, I: 임페라토린).

본 발명은 회향 (Foeniculum vulgare) 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부염 치료용 약학적 조성물 또는 피부염 개선용 피부 외용제 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서는 피부염을 치료 또는 개선하는 효과가 우수한 조성물을 제공하기 위한 주원료로서 회향 식물의 열매 추출물 및 상기 추출물의 분획물을 사용하였는데, 본 발명에서 사용할 수 있는 회향 식물의 열매는 자연에서 채취하거나 상업적 판매소 등에서 구입하여 사용할 수 있고, 원산지에 상관없이 시중에서 구할 수 있는 것이라면 모두 사용가능하다.

바람직하게, 본 발명의 분획물은 종래의 물질을 추출 및 분획하는 방법을 사용하여 회향 열매로부터 수득될 수 있다. 이때, 상기 회향 열매는 추출물을 획득하기 위해 적절히 탈수하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 자연 건조한 후 분쇄하여 분말화 된 것을 사용할 수 있다. 보다 상세하게는, 먼저, 회향의 열매를 상기 기술한 바와 같이 건조하여 분쇄한 후, 분말화된 건조 중량에 대해 약 1배 내지 10배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배의 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매를 첨가한 후 당업계에 공지된 용매 추출 방법을 통해 회향 열매의 조 추출물 (crude extract)을 수득할 수 있다. 이때 상기 저급 알콜은 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 n-부탄올 등을 사용할 수 있으며, 상기 용매 추출 방법으로는 이에 제한되지는 않으나, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법 또는 초음파 추출법 등을 1회 또는 수회 반복하여 추출할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 메탄올을 사용한 열수 추출법으로 회향 열매의 조 추출물을 수득하였다.

이후, 상기 수득한 조 추출물은 감압, 여과 및 농축 과정을 거쳐 각종 용매에 용해될 수 있도록 농축된 형태로 제조될 수 있으며, 상기 농축된 조 추출물을 비극성 용매들을 이용한 용매 추출방법을 통해 분획물로 수득할 수 있다. 가장 바람직하게 상기 비극성 용매는 메틸렌클로라이드 (methylene chloride; MC)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 헥산 (hexane), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), n-부탄올 (n-butanol), 아세톤 (acetone), 에테르 (ether), 벤젠 (benzene), 클로로포름 (chloroform), 디클로로메탄 (dichloromethane) 및 시클로헥산 (cyclohexane) 등을 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 기술된 방법으로 수득한 회향 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 실리카겔 (silica gel) 또는 활성 알루미나 (alumina) 등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography), 또는 고속액체크로마토그래피 (HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행함으로써 분리 및 정제함으로써 활성 성분인 화합물을 분리할 수 있다.

상기와 같이 수득한 회향 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물은 천연물로써 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 특징이 있으므로 의약품, 화장품, 식품 등의 다양한 분야에 폭넓게 적용되어 활용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 회향 열매의 분획물로부터 4개의 쿠마린, 즉, 스코폴레틴 (scopoletin), 8-메톡시프소랄렌 (8-methoxypsoralen), 베르갑텐 (bergapten), 및 임페라토린 (imperatorin)을 분리하고, 이들의 활성을 분석한 결과, LPS에 의해 염증이 유도된 대식세포에서 PGE2 (prostaglandin E2), IL (interleukin)-1β, IL-6, TNF (tumor necrosis factor)-α 생성과 NF-κB (nuclear factor-κB)의 핵 전위(nuclear translocation)를 저해하는 효과 (도 3 및 도 4 참조) 및 TPA에 의해 피부염이 유도된 동물 모델에서 병변 부위의 부종 및 염증 관련 인자들의 발현을 저해하는 효과 (도 6 참조)가 우수함을 확인하였다.

따라서 본 발명은 회향 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부염 치료용 약학적 조성물 또는 피부염 개선용 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 분획물은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.

[화학식 Ⅰ]

상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하며, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물 개선 또는 치료할 수 있는 증상은 피부염으로 인한 병변 부위의 발적, 부종, 열감, 또는 동통일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 “치료” 및 “개선”은 본 발명의 조성물을 투여함으로써 피부염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조욀 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명에 따른 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 국소 적용을 위해 연고, 겔, 크림, 패취, 또는 분무제 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 체내에 안전한 천연물질인 회향 열매 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공함으로써, 가장 바람직하게 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있으며, 화장료 조성물로 이용되어 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물로 사용시, 화장료의 제형에 맞게 물질을 더 첨가할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 또한 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 바람직하게는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으며, 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[재료 및 실험예 ]

1. 재료

iNOS, COX-2 (cyclooxygenase-2), TBP (TATA binding protein), 및 HRP-표지된 항-토끼 및 항-마우스 IgG에 대한 일차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, NF-κB p65, IκB-α, 인산화된 IκB-α (p-IκB-α), 및 인산화된 IκB 키나제α/β (p-IKKα/β)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, 마우스 단일클론 항-β-액틴은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 핵 및 세포질 단백질 추출 시약과 First Strand cDNA Synthesis Kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였고, TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide) 및 NO 검출 키트는 각각 Roche Applied Science (Mannheim, Germany) 및 iNtRON Biotechnology (Seongnam-si, Korea)에서 구입하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 PGE2 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) 키트는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, LPS (E. coli 026:B6), DPPH, ABTS, 아스코르브산 (A.A), 및 BHA (butylated hydroxyanisole)는 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 회향 (F. vulgare)의 열매는 경주의 약국에서 구입하였다. 기타 모든 화합물 및 시약은 시판되는 가장 높은 분석용 등급을 사용하였다.

2. 구성 성분의 추출 및 분리

자연 건조시키고 분쇄한 회향의 열매 (1.0 kg)를 3시간 동안 뜨거운 메탄올로 추출하여, 조 추출물 (92.5 g)을 얻었다. 얻은 조 추출물의 일부 (90 g)를 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트, 및 n-부탄올로 연속적으로 분배하여 각각 47.8 g, 1.4 g, 1.6 g, 및 5.5 g의 상응하는 분획을 얻었다. 구성 성분을 분리하기 위해, 식물 재료인 회향의 열매 (5.0 kg)를 3시간 동안 뜨거운 메탄올로 추출하고, 활성 메틸렌클로라이드 분획을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 4개의 쿠마린 화합물을 얻었으며, 스펙트럼 데이터 비교를 통해 도 1에 나타낸 바와 같이, 스코폴레틴, 8-메톡시프소랄렌, 베르갑텐, 임페라토린으로 동정하였다. 그리고 이들을 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시켜 스코폴레틴, 8-메톡시프소랄렌, 베르갑텐 및 임페라토린의 저장 용액을 각각 제조하였다. 배양 배지 내 DMSO의 최종 농도는 0.1% 이하로 유지하였다.

3. 세포 배양

American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구입한 RAW264.7 세포 (마우스 대식세포주)를 5% CO₂ 습한 대기 하에 37℃에서 10% 열-불활성화된 우태아혈청, 100 units/ml 페니실린, 및 100 lg/ml 스트렙토마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 함유하는 고포도당 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 배양하는 동안 2일마다 배지를 교체하였으며, 세포가 70-80% confluence로 성장한 후 굶겨 활동이 없게 하고, 실험 시약으로 처리하였다. 이후 세포를 30 μM의 각 화합물과 함께 또는 화합물 없이 1시간동안 전-배양한 다음, 100 ng/ml의 LPS와 함께 또는 LPS 없이 표시된 시간 동안 자극시켰다.

4. 세포 생존율 ( XTT 어세이 )

비색분석법 시스템 (XTT Cell Proliferation Kit)을 이용하여 세포 증식을 평가하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 Raw264.7 세포 (2 × 10⁴ cells/well)를 플레이트하고, 5% CO₂/95% 습한 공기 대기 하에 37℃에서 24시간 동안 배양하여 부착된 세포를 24시간 동안 30μM의 각 쿠마린 화합물로 처리하였다. 24시간 후, 50 μl의 XTT 용액을 각 웰에 가하고, 추가로 4시간 동안 더 배양한 다음 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm (reference wavelength at 670 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

5. NO 생성의 어세이

배양 배지 내 니트라이트(Nitrite) 축적은 NO 생성의 대용물로서 사용되었다. 니트라이트 수준은 NO 검출 키트를 이용하여 배양 배지에서 측정하였다. 즉, 시료 (100 μl)를 N1 완충액 (50 μl)과 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양한 후, N2 완충액 (50 μl)을 가하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 흡광도를 520 nm에서 측정하였고, 1mM 표준 니트라이트 용액을 이용하여 니트라이트 수준을 측정하였다.

6. 마우스 IL -1β, IL -6, TNF -α, 및 PGE2 의 면역분석

배양 배지에 분비된 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α) 및 PGE2의 양은 ELISA 어세이 키트를 이용하여 측정하였다. 즉, 자동 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm 내지 550 nm에서 전개 플레이트(Developed plates)를 읽었으며, 시료 내 표적 사이토카인의 농도는 표준 곡선을 이용하여 삽입함으로써 측정되었다.

7. 웨스턴 블롯 분석

320 mM 수크로오스, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM 디티오트레이톨, 및 프로테아제 저해제 [류펩틴 (10 μg/ml), 트립신 (10 μg/ml), 아프로티닌 (2 μg/ml), 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (100 μg/ml)]를 함유하는 완충액에서 세포를 균질화시키고, 균질화액을 10,000g에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 모아 세포 용해액을 제조하였다. 세포를 핵 또는 세포질 추출 시약으로 용해하여 핵 및 세포질 분획을 얻었으며, 단백질 양은 Bradford 단백질 분석 시약 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 시료의 총 단백질 (20-40 μg)은 7.5% SDS-PAGE 겔에서 전기영동시키고, PVDF (polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겨 특이적 일차 항체와 함께 탐지시킨 다음, HRP(horseradish peroxidase)-결합된 항-IgG 이차 항체와 함께 배양하였다. 모든 밴드는 ECL(enhanced chemiluminescence; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)로 탐지하였다. 동일한 단백질 로딩을 확증하기 위하여, 막을 각각 항-β-액틴 (시토졸 분획에 대해) 또는 항-TBP (핵 분획에 대해) 항체로 탐지하였다.

8. RT - PCR ( Reverse transcription - polymerase chain reaction )

총 RNA는 TRI Reagent (Fermentas, MD, USA)를 이용하여 Raw264.7 세포 및 귀 생검 시료로부터 분리하였다. 프라이머로 올리고(dT) 헥사머 및 M-MuLV 역전사효소 (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA)를 이용하여 cDNA 합성을 위해 총 RNA (1 μg)를 사용하였다. cDNA (1 μL)를 사용하여 mRNA 발현을 측정하였다. 모든 PCR 프라이머는 Primer3 (Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research)를 이용하여 설계하였고, Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하였다. PCR은 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, iNOS, 및 GAPDH에 대해 하기 표 1과 같은 선택적 프라이머를 이용하여 수행하였으며, 10초 동안 95℃ (변성), 30초 동안 57.5℃ (어닐링), 및 1분 동안 72℃ (신장)을 1 사이클로 총 27 사이클을 수행하였다. PCR 산물은 100 V에서 1% 아가로오스 겔에서 전기영동시키고, 자외선 발산기 (ultraviolet transilluminator) 및 디지털 캡쳐 시스템 (digital capture system; DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel)을 이용하여 사진을 찍었다. mRNA 수준은 인산 글리세롤 탈수소효소 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA에 대해 표준화하였다.

서열명	서열(5`→3`)	서열번호
IL-1b sense primer	aggacacgac tgctttcttc	1
IL-1b antisense primer	gcaccgcagt agggaagtgt	2
IL-6 sense primer	ggcttttaag tggggctgtc	3
IL-6 antisense primer	cccaagatcc actgcaaatg	4
TNF-a sense primer	gagaggaaca cgttctggct cc	5
TNF-a antisense primer	tgctggaggc tgaggcatcc	6
COX-2 sense primer	tgggtgaagt gctgggcaaa	7
COX-2 antisense primer	tgagcccacc ccaaacaca	8
iNOS sense primer	gacaagctgc atgtgacatc	9
iNOS antisense primer	gctggtaggt tcctgttgtt	10
GAPDH sense primer	ccatggagaa ggctgggg	11
GAPDH antisense primer	caaagttgtc atggatgacc	12

9. DPPH 라디칼 소거 어세이

DPPH 라디칼 용액 (50 μl, 1 mM)을 DMSO에 용해된 시료 (50 μl)와 혼합하였다. 혼합물을 10분 동안 실온에서 유지시키고, 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아스코르브산 (A.A, 1mg/ml), 및 BHA (butylated hydroxyanisole, 1mg/ml)를 양성대조군으로 사용하였고, DPPH 저해율은 다음 식을 이용하여 계산하였다.

식: 저해율 % = (1 - D/D0) × 100

이때, D0는 단지 DPPH의 517 nm에서의 흡광도이고, D는 DPPH와 시료를 함유한 반응 혼합물의 517 nm에서의 흡광도이다.

10. ABTS 라디칼 소거 어세이

실온의 암실에서 16시간 동안 ABTS 저장 용액 (7 mM)과 과산화이황산칼륨 (potassium peroxodisulfate, 2.45 mM)을 반응시켜 ABTS 라디칼 양이온 용액을 제조하였다. 얻어진 용액은 734 nm에서 1.000의 흡광도 (microplate reader: Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 나타내도록 증류수로 희석시켰다. ABTS 소거 활성을 측정하기 위하여, 50 μl의 ABTS 라디칼 용액 (1.5 mM)을 시료 (50 μl)와 혼합하고, 실온에서 10분 동안 유지시켰다. 남아있는 ABTS의 양을 734 nm에서 측정하고, 라디칼 소거 활성은 다음 식을 이용하여 계산하였다.

식: 저해율 % = (1 - A/A0) × 100

여기서 A0는 단지 ABTS 의 734 nm에서의 흡광도이고, A는 ABTS와 시료를 함유한 반응 혼합물의 734 nm에서의 흡광도이다. AA (아스코르브산) 및 BHA (부틸레이티드 히드록시아니솔)는 양성대조군으로 사용되었다.

11. TPA -유도된 피부 염증

수컷 7-주령 ICR 마우스는 SAMTAKO (Osan-si, Korea)에서 구입하였다. 모든 마우스는 12 h 명/12 h 암 주기 하에 통제 조건 (온도: 21±2℃, 습도: 50-60%)에서 수용되었으며, 먹이와 물을 무제한으로 제공하였고, 실험 전 적어도 일주일 동안 이러한 조건에 적응시켰다. 모든 동물 실험 과정은 동국대학교의 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)를 국소 처리하여 마우스의 양쪽 귀에 피부 염증을 유도하였다. 즉, 20 μl의 아세톤/올리브유의 1:4 혼합물에 용해된 TPA (1.0 μg)를 3일 동안 24시간 마다 귀의 표면에 처리하였다. 각 TPA 처리 후, 10 μl의 각각의 4개의 쿠마린 (200 μg/ml)을 마우스의 귀에 1시간 동안 국소 처리하였다. 첫 번째 TPA 적용 후 4일째에 마우스를 희생시켰다. 귀 생검 (직경 5 mm) 시료는 펀치 (Kai Industries, Gifu, Japan)를 이용하여 얻었으며, 두께는 디지털 두께 게이지 (Mitutoyo Corporation, Toyko, Japan)를 이용하여 측정하였다. 얻어진 생검 시료는 분석용 전자저울 (analytical balance; Mettler Toledo AB204-S; Mettler Toledo, Barcelona, Spain)을 이용하여 무게를 측정하였다. 동물은 무작위로 6개의 실험군 (군 당 n = 4)으로 나누었다: 대조군 (무처리), TPA 군 (임의의 약물 처리 없이 단지 TPA만 처리), TPA-S 군 (스코폴레틴 처리와 함께TPA), TPA-M 군 (8-메톡시프소랄렌 처리와 함께 TPA), TPA-B군 (베르갑텐 처리와 함께 TPA), TPA-I 군 (임페라토린 처리와 함께 TPA).

12. 병리조직학적 시험 ( Histopathological examination )

병리조직학적 시험을 위해, 귀 생검을 4℃에서 24시간 동안 10% 프로말린에서 고정시켰다. 생검 시료를 파라핀에 끼워넣고, 4 μm의 두께로 연속적으로 절단한 다음, 헤마톡실린 및 에오신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 염색하였다. DIXI 영상 용액 2.89 software (DIXI Optics, Daejeon, South Korea)를 이용하여 병리조직학적 영상을 포착하기 위해, 위상차 현미경 (phase contrast microscope; Olympus CK40-32PH, Japan)에 장착된 디지털 카메라 (Olympus UC30, Japan)를 사용하였다.

13. 통계적 분석

모든 결과는 적어도 3번 수행된 실험의 평균±SD로 나타내었다. 데이터는 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)에 이어 GraphPad Prism 4.0 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용한 던칸의 다중 범위 검정 (Duncan's multiple range test)으로 분석하였다. 통계적 유의성은 p 값 < 0.05 으로 인정되었다.

[ 실시예 ]

1. 회향 추출물로부터 분리한 화합물들이 Raw264 .7 대식세포의 생존율에 미치는 영향

회향 열매 추출물로부터 분리한 화합물들인 4개의 쿠마린 (스코폴레틴, 8-메톡시프소랄렌, 베르갑텐, 또는 임페라토린)을 30 μM로 각각 Raw 264.7 세포에 24시간 동안 처리하고, 세포 생존율을 XTT 어세이를 이용하여 평가하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 30 μM의 각 화합물은 세포 생존율(각각 96.61%, 93.88%, 98.57%, 및 94.40%)에 대해 부정적 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

2. 회향 추출물로부터 분리한 화합물들이 LPS -유도된 염증 반응에 미치는 영향

회향 열매 추출물로부터 분리한 화합물들인 4개의 쿠마린이 RAW264.7 대식세포에서 NO 생성을 조절할 수 있는지 측정한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, LPS 자극 후 NO 생성은 증가하였으나, 8-메톡시프소랄렌, 베르갑텐, 또는 임페라토린을 처리한 경우 NO 생성이 유의하게 저해되는 것을 알 수 있었다.

이에, 상기 저해가 관련 효소의 조절 때문인지 알아보기 위해, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 방법으로 iNOS mRNA 및 단백질 수준을 관찰한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 8-메톡시프소랄렌, 베르갑텐, 및 임페라토린이 iNOS 수준을 감소시키는 것으로 나타났다.

다음으로, 다른 잘 알려진 전-염증 매개인자인 PGE2의 생성에 대한 4개의 쿠마린의 저해 효과를 분석한 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 스코폴레틴 및 임페라토린이 PGE2 생성 및 유도성 효소 COX-2 mRNA/단백질 발현을 차단함을 알 수 있었다.

또한, 4개의 쿠마린이 전-염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리시 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α가 많이 유도되지만, 임페라토린과 함께 처리하면 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 생성을 유의하게 저해하며, 8-메톡시프소랄렌 및 베르갑텐은 IL-1 β 생성을 유의하게 저해하였다. 뿐만 아니라, 도 3d에 나타낸 바와 같이, RAW264.7 세포에서 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 LPS-유도된 발현이 임페라토린과 함께 처리하면 저해됨을 알 수 있다.

3. 회향 추출물로부터 분리한 화합물들이 NF -κB 활성화에 미치는 영향

NF-κB는 염증 및 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 중요한 전사 인자로, 염증성 사이토카인에 대한 쿠마린의 저해 효과를 고려하여, 이의 상류 신호 분자인 NF-κB 및 IKKα/β의 활성에 회향 열매 추출물로부터 분리한 화합물들이 영향을 미치는지를 조사하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 베르갑텐 및 임페라토린은 IKKα/β 및 IκB-α의 인산화를 강하게 억제하고, IκB-α 분해를 차단하였으며, 이로써 NF-κB p65의 핵 전위를 억제함을 알 수 있다.

4. 회향 추출물로부터 분리한 화합물들의 자유 라디칼 소거 효과

쿠마린이 DPPH 및 ABTS 자유 라디칼 소거 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 각각 30 μM 농도의 쿠마린의 저해율 값을 측정한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 참조 기준 (1 mg/ml)인 A.A 및 BHA는 각각 80.82% 및 93.47%의 저해율을 나타낸 반면 스코폴레틴, 8-메톡시프소랄렌, 베르갑텐, 및 임페라토린은 각각 48.34%, 51.57%, 49.89%, 및 50.73%로 DPPH 자유 라디칼 형성을 유의하게 저해하였다. ABTS 자유 라디칼 소거 활성 저해율은, 도 5b에 나타낸 바와 같이, A.A 및 BHA는 1 mg/ml에서 76.63% 및 93.09%의 저해율을 나타낸 반면, 8-메톡시프소랄렌, 베르갑텐, 및 임페라토린은 각각 47.05 %, 50.53 %, 50.44 %, 및 50.27 % 으로 저해 활성이 우수하였다.

5. 회향 추출물로부터 분리한 화합물들이 마우스의 TPA -유도된 피부 염증에 미치는 영향

동물 모델인 마우스에서 TPA-유도된 피부 염증에 대한 쿠마린의 항-염증 효과를 시험한 결과, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, TPA 적용 3일 후 귀 무게 및 두께는 TPA 처리된 마우스에서 유의하게 더 컸다. 또한, 헤마톡실린-에오신 염색을 통한 조직학적 분석 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, TPA 적용이 표피 (epidermis) 및 진피 (dermis)에서 심각한 부종을 유도하지만, 임페라토린의 처리는 귀 무게 및 두께의 증가를 저해함을 알 수 있었다. RT-PCR을 이용하여 쿠마린이 전-염증 매개인자의 발현을 억제하는지를 측정한 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, TPA 처리된 귀 피부에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 cox-2 mRNA의 발현이 증가되나, 임페라토린과 함께 처리하면 이러한 증가가 감소됨을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> Dongguk University Gyeongju Campus Industry-Academy Cooperation Foundation <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING DERMATITIS COMPRISING FRACTION OF FOENICULUM VULGARE EXTRACT <130> PB14-12219 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b sense primer <400> 1 aggacacgac tgctttcttc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b antisense primer <400> 2 gcaccgcagt agggaagtgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 sense primer <400> 3 ggcttttaag tggggctgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 antisense primer <400> 4 cccaagatcc actgcaaatg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a sense primer <400> 5 gagaggaaca cgttctggct cc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a antisense primer <400> 6 tgctggaggc tgaggcatcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 sense primer <400> 7 tgggtgaagt gctgggcaaa 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 antisense primer <400> 8 tgagcccacc ccaaacaca 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS sense primer <400> 9 gacaagctgc atgtgacatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS antisense primer <400> 10 gctggtaggt tcctgttgtt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 11 ccatggagaa ggctgggg 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 12 caaagttgtc atggatgacc 20

Claims (8)

1. 회향 (Foeniculum vulgare) 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 분획물은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   [화학식 Ⅰ]
   

   

   
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 피부염으로 인한 발적, 부종, 열감, 또는 동통을 치료하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 연고, 겔, 크림, 패취 및 분무제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 회향 (Foeniculum vulgare) 열매 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염 개선용 피부 외용제 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 분획물은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   [화학식 Ⅰ]
   

   

   
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 조성물은 피부염으로 인한 발적, 부종, 열감, 또는 동통을 개선하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 및 바디 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제품에 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   

Images