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KR20160030301A - 세포 배양 배지 - Google Patents

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KR20160030301A
KR20160030301A KR1020167003556A KR20167003556A KR20160030301A KR 20160030301 A KR20160030301 A KR 20160030301A KR 1020167003556 A KR1020167003556 A KR 1020167003556A KR 20167003556 A KR20167003556 A KR 20167003556A KR 20160030301 A KR20160030301 A KR 20160030301A
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component
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마이클 하워드 레이너-브렌즈
하겐 외르크 폰
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메르크 파텐트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 중합체 포매된 성분을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 일부 성분은 건조 분말 세포 배양 배지 중에서 불량한 안정성을 나타내는 반면, 다른 성분은 흡습성을 나타낸다. 이러한 성분은 중합체에 포매되어 안정성을 증가시키고 응집성을 감소시킬 수 있다.

Description

세포 배양 배지 {CELL CULTURE MEDIA}
본 발명은 중합체 포매된 성분을 포함하는 건조 세포 배양 배지에 관한 것이다. 일부 성분은 건조 분말 세포 배양 배지 중에서 불량한 안정성을 나타내는 반면, 다른 성분은 흡습성을 나타낸다. 일부 성분은 완전히 용해하는데 오랜 시간이 걸린다. 이러한 성분은 중합체에 포매되어 안정성을 증가시키고 응집성을 감소시킬 수 있다.
수용액 중 세포 배양 배지는 세포의 성장을 지지하고 유지시키고/시키거나 특정 산물의 표적화된 생성에 유리한 필요 생리학적 세포 조건을 유지시키는 환경을 제공할 수 있다.
성장 및/또는 표적 생리학적 상태가 지지되어야 하는 유기체의 유형에 따라, 세포 배양 배지는 성분들, 때때로 백 가지가 넘는 상이한 성분들의 복합 혼합물로 구성된다.
포유류, 곤충 또는 식물 세포의 증식에 요구되는 세포 배양 배지는 전형적으로 박테리아, 효모 또는 진균의 성장을 지지하는 배지보다 훨씬 더 복합적이다.
개발된 첫번째 세포 배양 배지는 매우 불량하게 화학 한정되고, 불량하게 분석되었으며 일정한 품질로 제조하기에 어려운 성분의 다양한 혼합물, 예컨대 혈장, 혈청, 배아 추출물 및/또는 기타 생물학적 추출물 또는 펩톤으로 이루어지는 복합 배지였다. 따라서 화학 한정 배지의 개발로 주요한 진전이 이루어졌다. 화학 한정 배지는 종종 아미노산, 비타민, 당, 금속 염, 항산화제, 킬레이터, 성장 인자, 완충제, 호르몬, 및 당업자에게 알려진 더욱 많은 물질로 구성되나 이에 대해서만 제한되는 것은 아니다.
일부 세포 배양 배지는 멸균 수성 액체로서 제공된다. 액체 세포 배양 배지의 단점은 감소된 유통기한 및 운송 및 저장의 어려움이다. 그 결과, 많은 세포 배양 배지가 현재 미세하게 밀링된 건조 분말 (dry powder) 혼합물로서 제공된다. 이들은 물 및/또는 수용액에 용해시킬 목적으로 제조되고, 용해된 상태에서, 종종 기타 보충물과 함께, 세포에 성장을 위한 실질적 영양소 베이스를 공급하고/거나 상기 세포로부터 생물약제를 생산하도록 디자인되고/되거나 특정 영양소가 제한되는 경우 세포에 공급하는 공급물로서 사용된다.
건조 분말로부터의 세포 배양 배지의 제조 및 사용에 대한 제한 인자는, 건조 분말 배지의 저장 동안 분해되고/되거나 산화하는 경향이 있는 일부 성분의 불량한 안정성이다. 일부 성분은 그의 산업적 적용(들) 을 제한하는 안정성 및/또는 기타 품질 문제를 초래하는 배지의 응집을 종종 초래하는 흡습성을 갖는다. 또한 흡습성 화합물에 의해 유도된 수분이 미생물 성장 뿐 아니라 주변 성분의 분해를 증가시킬 수 있다.
결과적으로, 민감한 배지 성분의 안정성을 향상시키고 흡습성 성분의 부정적 영향을 감소시키기 위한 방법을 발견하는 것이 요구된다.
민감성 및/또는 흡습성 배지 성분이 이를 중합체 매트릭스 내에 포매함으로써 안정화될 수 있다는 것이 발견된 바 있다. 흡습성 성분에 의한 수분 유도는 감소되며 산화 또는 분해에 민감한 성분은 이를 포매하고/하거나 코팅하고/하거나, 불안정성 및/또는 품질 저하가 반 데르 발스 및/또는 정전기력으로 인한 산화 및/또는 흡습 및/또는 응집에 의해 유도되는지 여부에 따라 이를 상기 성분의 안정성을 증가시키는 다른 성분과 접촉시키고, 그에 따라 이러한 산화 및/또는 습윤성/습한/끈적한 성분이 주변 성분에 대해 가질 수 있는 영향을 또한 감소시킴으로써, 안정성의 증가를 나타낸다.
따라서 본 발명은 하나 이상의 중합체 포매된 성분을 포함하는 건조 분말 세포 배양 배지에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 중합체는 폴록사머 (poloxamer) 이다.
또 다른 바람직한 구현예에서 성분은 L-글루타민, 탄산수소나트륨, 염화칼슘 x 2 H2O, 염화콜린, 질산제2철 x 9 H20, 황산제1철 x 7 H20, 인산나트륨 또는 또는 모노나트륨 인산염 (NaH2PO4) 모노히드레이트이다.
한 구현예에서, 세포 배양 배지는 둘 이상의 중합체 포매된 성분을 포함한다.
한 구현예에서, 중합체 포매된 성분은 핫 멜트 압출에 의해 제조된다.
또 다른 구현예에서 중합체 포매된 성분은 습식 과립화에 의해 제조된다.
한 구현예에서 세포 배양 배지는 포유류 세포 배양 배지이다.
또 다른 구현예에서, 세포 배양 배지는 화학 한정 세포 배양 배지이다.
본 발명은 또한 하기에 의해 본 발명에 따른 세포 배양 배지를 제조하는 방법에 관한 것이다:
a) 하나 이상의 중합체 포매된 성분을 제공하고,
b) 세포 배양 배지의 기타 성분을 제공하고, 이를 혼합하고 밀링하고,
c) 단계 a) 의 중합체 포매된 성분을 단계 b) 에서 생성된 밀링 혼합물에 첨가함.
바람직한 구현예에서 단계 b) 는 볼 밀 (ball mill), 핀 밀 (pin mill), 피츠 밀 (fitz mill) 또는 제트 밀 (jet mill) 에서 수행되며, 가장 바람직하게는 핀 밀, 피츠 밀 또는 제트 밀에서 수행된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 a) 로부터의 혼합물을, 밀링 전에 0℃ 미만의 온도로 냉각시킨다.
본 발명은 또한 하기에 의해 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다:
a) 생물반응기 (bioreactor) 를 제공하고,
b) 본 발명에 따른 세포 배양 배지를 물 또는 수성 완충제에 용해하고, 이와 함께 배양할 세포를 혼합하고,
c) 단계 b) 의 혼합물을 인큐베이션함.
도 1 및 2 는 CHO S 성능 시험을 나타낸다. 추가의 세부 사항은 실시예 2 에서 발견될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 세포의 시험관내 (in vitro) 성장을 유지 및/또는 지지하고/하거나 특정 생리학적 상태를 지지하는 성분의 임의의 혼합물이다. 이는 복합 배지 또는 화학 한정 배지일 수 있다. 세포 배양 배지는 세포의 시험관내 성장을 유지 및/또는 지지하는데 필요한 모든 성분을 포함할 수 있거나, 오직 일부 성분을 포함하여 추가의 성분이 별도로 첨가된다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 예는 세포의 시험관내 성장을 유지 및/또는 지지하는데 필요한 모든 성분 뿐 아니라 배지 보충물 또는 공급물 (feed) 을 포함하는 완전 배지이다. 바람직한 구현예에서 세포 배양 배지는 완전 배지 또는 몇몇 성분이 결핍된 배지이다.
통상, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 생물반응기 내에서의 세포의 성장을 유지 및/또는 지지하고/하거나 생물반응기에서의 특정 생리학적 상태를 지지하는데 사용된다.
포유류 세포 배양 배지는 포유류 세포의 시험관내 성장을 유지 및/또는 지지하는 성분의 혼합물이다. 포유류 세포의 예는 인간 또는 동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포, COS 세포, I VERO 세포, BHK 세포, AK-1 세포, SP2/0 세포, L5.1 세포, 하이브리도마 세포 또는 인간 세포이다.
화학 한정 세포 배양 배지는 어떠한 화학적으로 한정되지 않은 물질도 포함하지 않는 세포 배양 배지이다. 이는 배지에서 사용되는 모든 화학물질의 화학 조성이 알려져 있음을 의미한다. 화학 한정 배지는 임의의 효모, 동물 또는 식물 조직을 포함하지 않고; 피더 세포, 혈청, 추출물 또는 소화물 또는 배지에 화학적으로 불량하게 한정된 단백질 및/또는 펩티드 및/또는 가수분해물을 공급할 수 있는 기타 성분을 포함하지 않는다. 화학적으로 한정되지 않거나 불량하게 한정된 화학 성분은 그것의 화학 조성 및 구조가 잘 알려지지 않은 것이고, 불량하게 한정되고 다양한 조성으로 존재하거나 오직 막대한 실험적 노력으로만 한정될 수 있다 - 단백질 예컨대 알부민 또는 카제인의 화학 조성 및 구조의 평가와 비슷함.
분말화된 세포 배양 배지 또는 건조 분말 배지는 전형적으로 밀링 과정 또는 동결건조 과정으로부터 초래되는 세포 배양 배지이다. 이는 분말화된 세포 배양 배지가 과립, 미립자 배지이고 - 액체 배지가 아님을 의미한다. 용어 "건조 분말" 은 용어 "분말" 과 상호교환가능하게 사용될 수 있으나; 본원에서 사용되는 "건조 분말" 은 단순히 과립화된 물질의 육안 외관을 나타내고, 다르게 명시되지 않는 한, 상기 물질에 복합 또는 응집 용매가 완전히 포함되지 않음을 의미하는 것으로 의도되지는 않는다.
본 발명에 따른 배지로 배양될 세포는 원핵 세포 예컨대 박테리아 세포 또는 진핵 세포 예컨대 효모, 진균, 식물 또는 동물 세포일 수 있다. 세포는 정상 세포, 불멸화 세포, 질병에 걸린 세포, 형질전환된 세포, 돌연변이 세포, 체세포, 생식 세포, 줄기 세포, 전구 세포 또는 배아 세포일 수 있으며, 이들 중 임의의 것이 확립 또는 형질전환된 세포주이거나 또는 자연적 공급원으로부터 수득될 수 있다.
입자의 크기는 입자의 평균 직경을 의미한다. 입자 직경은 실리콘 오일에서 레이저 광 산란에 의해 측정된다.
불활성 분위기는 각각의 용기 또는 장치를 불활성 기체로 채움으로써 생성된다. 적합한 불활성 기체는 비활성 기체 예컨대 아르곤 또는 바람직하게는 질소이다. 이들 불활성 기체는 최소-반응성이고, 바람직하지 않은 화학 반응이 일어나는 것을 방지한다. 본 발명에 따른 방법에서, 불활성 분위기의 생성은 예를 들어 액체 질소 또는 질소 기체의 도입에 의해 산소의 농도가 10% (v/v) 절대값 미만으로 감소되는 것을 의미한다.
상이한 유형의 밀링기가 당업자에게 알려져 있다.
원심 임팩트 밀 (centrifugal impact mill) 로도 불리는 핀 밀은 고체를 가루화하며, 여기에서 고속 회전 디스크 위의 돌출 핀이 파단 에너지를 제공한다. 핀 밀은 예를 들어 Munson Machinery (미국), Premium Pulman (인도) 또는 Sturtevant (미국) 에 의해 판매된다.
제트 밀은 압축된 기체를 사용하여 입자를 가속시켜, 공정 챔버 내에서 서로 충격을 가하도록 한다. 제트 밀은 예를 들어 Sturtevant (미국) 또는 PMT (오스트리아) 에 의해 판매된다.
Fitzpatrick (미국) 에 의해 시판되는 피츠 밀은 밀링을 위한 블레이드를 갖는 로터를 사용한다.
연속식으로 실행되는 공정은 회분식으로 실행되지 않는 공정이다. 밀링 공정이 연속식으로 실행되는 경우, 이는 배지 성분이 특정 시간에 걸쳐 영구적이고 지속적으로 밀링기에 공급되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 통상 하나 이상의 당류 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 하나 이상의 염, 하나 이상의 완충제 성분, 하나 이상의 보조인자 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함한다.
배지는 또한 나트륨 피루베이트, 인슐린, 식물성 단백질, 소화물 또는 추출물, 지방산 및/또는 지방산 유도체 및/또는 플루론산 산물 성분 (에틸렌 산화물 및 프로필렌 산화물 기재의 블록 공중합체) 특히 때때로 Pluronic F 68 또는 Kolliphor P 188 또는 Lutrol F 68 로 불리는 Poloxamer 188 및/또는 계면 활성 성분 예컨대 화학적으로 제조된 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 적합한 비-이온성 계면활성제의 한 예는 예를 들어 BASF (독일) 로부터 상품명 pluronic® 으로 시판되는 폴록사머로도 불리는 1 차 히드록실 기로 종료되는 이관능성 블록 공중합체 계면활성제이다.
당류 성분은 모든 단- 또는 이-당류, 예컨대 글루코오스, 갈락토오스, 리보오스 또는 프룩토오스 (단당류의 예) 또는 수크로오스, 락토오스 또는 말토오스 (이당류의 예) 이다. 당류 성분은 또한 올리고당류 또는 다당류일 수 있다.
본 발명에 따른 아미노산의 예는 티로신, 단백질생성 아미노산, 특히 필수 아미노산, 류신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린 뿐 아니라 비-단백질생성 아미노산 예컨대 D-아미노산이다.
티로신은 L- 또는 D- 티로신, 바람직하게는 L-티로신을 의미한다.
시스테인은 L- 또는 D-시스테인, 바람직하게는 L-시스테인을 의미한다.
비타민의 예는 비타민 A (레티놀, 레티날, 각종 레티노이드 및 4 가지 카로테노이드), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신, 니아신아미드), 비타민 B5 (판토텐산), 비타민 B6 (피리독신, 피리독사민, 피리독살), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B9 (엽산, 폴린산), 비타민 B12 (시아노코발라민, 히드록시코발라민, 메틸코발라민), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (에르고칼시페롤, 콜레칼시페롤), 비타민 E (토코페롤, 토코트리에놀) 및 비타민 K (필로퀴논, 메나퀴논) 이다. 비타민 전구체 및 유사체가 또한 포함된다.
염의 예는 무기 이온 예컨대 중탄산염, 칼슘, 염화물, 마그네슘, 포스페이트, 칼륨 및 나트륨 또는 미량 원소 예컨대 Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V 및 Zn 을 포함하는 성분이다. 예는 구리(II) 술페이트 펜타히드레이트 (CuSO4·5H2O), 염화나트륨 (NaCl), 염화칼슘 (CaCl2·2H2O), 염화칼륨 (KCl), 철(II)술페이트, 인산나트륨 일염기성 무수물 (NaH2PO4), 황산마그네슘 무수물 (MgSO4), 인산나트륨 이염기성 무수물 (Na2HPO4), 염화마그네슘 헥사히드레이트 (MgCl2·6H2O), 황산아연 헵타히드레이트이다.
완충제의 예는 CO2/HCO3 (카르보네이트), 포스페이트, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS 및 TRIS 이다.
보조인자의 예는 티아민 유도체, 비오틴, 비타민 C, NAD/NADP, 코발라민, 비타민 B12, 플라빈 모노뉴클레오티드 및 유도체, 글루타티온, 헴, 뉴클레오티드 포스페이트 및 유도체이다.
본 발명에 따른 핵산 성분은 핵염기, 예컨대 시토신, 구아닌, 아데닌, 티민 또는 우라실, 뉴클레오시드 예컨대 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 티미딘, 및 뉴클레오티드 예컨대 아데노신 모노포스페이트 또는 아데노신 디포스페이트 또는 아데노신 트리포스페이트이다.
본 발명에 따른 동결은 0℃ 미만의 온도로 냉각하는 것을 의미한다.
본 발명의 요지는 성분의 응집 또는 분해 없이 용이하게 처리될 수 있고 저장에 안정한 분말화 세포 배양 배지를 제공하는 것이다. 분말 및 용매를 혼합하여 건조 분말 배지가 적합한 용매 중에 용해되는 경우, 분말은 용해되며 완전 배지, 배지 보충물, 배지 하위군 또는 원하고 균질한 농도의 배지 성분을 갖는 공급물과 같은 액체 세포 배양 배지를 생성시킨다.
원칙적으로, 모든 세포 배양 배지 성분은 중합체 내에 포매될 수 있다. 통상, 분해 또는 산화 또는 기타 화학적 개질에 민감한 성분, 그의 용해도가 향상될 성분 및/또는 흡습성 성분은 중합체 내에 포매된다. 이러한 배지 성분의 예는 L-글루타민, 탄산수소나트륨, 염화칼슘 x 2 H2O, 염화콜린, 질산제2철 x 9 H20, 황산제1철 x 7 H20, 인산나트륨 또는 모노나트륨 인산염 (NaH2PO4) 모노히드레이트이다.
표 1 은 DMEM F12 배지 성분의 목록을 나타낸다. 모든 성분에 대해서 중합체 포매의 영향이 나타난다.
표 1 에서, "Solu" 는 성분이 본 발명에 따라 포매되고 그의 포매 형태로 배지 조성물 중 사용되는 경우, 상기 성분의 용해도가 비-포매된 형태에 비해 향상되는 것을 의미한다.
표 1 에서, "Stab" 는 성분이 본 발명에 따라 포매되고 그의 포매 형태로 배지 조성물 중 사용되는 경우, 상기 성분의 안정성이 비-포매된 형태에 비해 향상되는 것을 의미한다.
표 1 에서, "Oxid" 는 성분이 본 발명에 따라 포매되고 그의 포매 형태로 배지 조성물 중 사용되는 경우, 상기 성분의 산화에 대한 안정성이 비-포매된 형태에 비해 향상되는 것을 의미한다.
표 1 에서, "Hygros" 는 성분이 본 발명에 따라 포매되고 그의 포매 형태로 배지 조성물 중 사용되는 경우, 주변 환경으로부터 물 분자를 유도하고 보유하는 상기 물질의 능력이 비-포매된 형태에 비해 감소되는 것을 의미한다. 즉, 포매된 성분은 더 적은 흡습성을 갖는다.
표 1 에서, "NA" 는 "해당 사항 없음" 을 의미한다. 이는 표가 NA 를 나타내는 성분에 대해 본 발명에 따른 포매가 어떠한 명백한 영향도 초래하지 않는다는 것을 의미한다.
중합체 중 포매된 것은 성분이 중합체에 의해 부분적으로 또는 완전히 코팅되거나 중합체 매트릭스에 분산되는 것을 의미한다. 상기 성분은 입자로서 또는 분자 수준으로 중합체 매트릭스에 분산될 수 있으며, 따라서 고체 용액을 형성한다.
본 발명에 따른 포매 성분에 적합한 중합체는 수용성 중합체이다.
적합한 중합체의 예는 가용성 셀룰루오스 유도체 예컨대 에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스; 폴리(비닐 알코올), 부분 가수분해된 폴리비닐 알코올, 셀룰로오스 아세테이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 (예를 들어 폴록사머 (TM)), 카르보머, 폴리카르보필, 키토산; 천연 고무 예컨대 구아 검, 아카시아 검, 트래거캔스 검 또는 잔탄 검 및 포비돈; 왁스 예컨대 폴리에틸렌 글리콜; 또는 메타크릴산 중합체 예컨대 유드라지트 (Eudragit) (R) RL 및 유드라지트(R) RS; 또는 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리포스파진, 폴리옥사졸리딘, 폴리(히드록시알킬카르복실산), 카라지네이트 알기네이트, 카르보머, 암모늄 알기네이트, 나트륨 알기네이트, 또는 이의 혼합물이다.
바람직한 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 블록 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리비닐 카프로락탐 - 폴리비닐 아세테이트 - 폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체이다.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 블록 공중합체는 폴록사머로도 지칭된다. 본 발명에 따른 중합체로서 바람직하게 사용되는 CAS 번호 9003-11-6 인 폴록사머는 하기 일반식 I 을 갖는다:
Figure pct00001
[여기서, x 및 z 는 바람직하게는 독립적으로 2 내지 130 이고, y 는 바람직하게는 15 내지 67 임].
이들은 시판된다 (Pluronics® 또는 Lutrole®, 예를 들어 Pluronic(R) 용액, 겔 또는 고체, 예컨대 Pluronic(R) F-127). 대안적으로, 폴록사머는 당해 기술 분야에 알려져 있는 방법에 따라 원료 물질로부터 제조될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 3,579,465 및 3,740,421 참조).
폴록사머에 대한 추가 정보가 [Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, volume 9 "Stoffe P-Z", 1994, p. 282 ~ 284] 에서 발견될 수 있다.
폴리비닐피롤리돈 중합체는 BASF, Germany 로부터 Kollidon® 으로서 시판된다.
폴리비닐 카프로락탐 - 폴리비닐 아세테이트 - 폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체는 BASF, Germany 로부터 Soluplus® 로서 시판된다.
중합체 내 배지 성분의 포매는 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.
중합체가 코팅의 형태로 적용될 경우, 코팅은 안정화제와 같은 추가적 성분의 존재 또는 부재 하에, 종래의 코팅 팬 또는 유동층 프로세서에서의 분무 코팅, 딥 코팅 또는 압축 코팅과 같은 당업계에 공지된 임의의 종래 코팅 기법을 사용하여 용액/현탁액으로서 필름-형성 중합체(들) 를 적용하여 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 배지 성분은 중합체에 의해 형성된 매트릭스에 분산된다.
이러한 분산액은 핫 멜트 압출, 분무 건조, 고체 분산, 유동층 과립화, 고체 분산 또는 동시동결건조와 같은 절차에 의해 제조될 수 있다.
압출은 온도, 혼합, 공급속도 및 압력과 같은 제어된 조건 하에 오리피스 또는 다이를 통과시킴으로써 새로운 물질 (압출물) 을 형성시키는 과정으로서 간단히 정의될 수 있다. 핫 멜트 압출에서, 중합체는 용융 상태의 것이다. 압출 후, 핫 멜트 압출물은 중합체 및 분산된 배지 성분을 포함하는 고체이다.
성분이 핫 멜트 압출에 의해 중합체 내에 포매되는 경우, 중합체는 200℃ 미만의 용융점을 가져야 한다. 바람직하게는, 중합체는 150℃ 미만, 가장 바람직하게는 75℃ 미만의 용융점을 갖는다.
Poloxamer 188 (Lutrol F68) 과 같은 폴록사머를 중합체로서 사용하는 경우 핫 멜트 압출 (HME) 접근방식이 적합하게 적용될 수 있다는 것이 발견되었다.
동시동결건조를 위해서, 제 1 단계에서, 동시동결건조되는 모든 성분은 용매에 분산된다.
상기 성분은 하나의 용매에 가용화될 수 있다. 대안적으로는, 각각의 성분은 별개의 용매에 용해될 수 있으며 상이한 성분의 생성된 2 개 이상의 용액이 혼합될 수 있다. 통상, 혼합되는 모든 용액은 동일한 용매를 갖는다.
적합한 용매는 모든 성분이 상기 용매 중에서 가용성인 것들이다. 적합한 용매의 예는 유기 용매 또는 물 또는 이의 혼합물이다. 바람직한 것은 물이다.
용매가 선택되고 성분이 용해되고 나면, 생성된 혼합물은 냉동되고 동결건조되어 건조상태가 된다. 때때로 추가적인 용매가 혼합물에 첨가되어 동결건조를 촉진시킨다. 통상 동결건조는 -20℃ 미만, 바람직하게는 대략 -80℃ 의 온도에서 수행된다. 액체는 통상 감압을 적용하여 제거된다.
분무 건조를 위해서, 배지 성분 및 중합체는 용매에 용해된다. 적합한 용매의 예는 유기 용매 또는 물 또는 이의 혼합물이다. 바람직한 것은 물이다. 분말이 형성될 때까지, 제어된 온도 및 습도와 같은 분말 생성에 적합한 조건 하에 용액을 장치 내 챔버에 분무하여, 용액이 이의 상응하는 분말로 변환되도록 용액을 분무 건조 장치에 넣는다.
통상의 분무 건조 접근방식에서, 용액을 장치 내로 흡입시키고 회전형 또는 노즐형 분사기를 사용하여 분무로 미립화한다. 생성된 미립화된 액체 분무를 이후 기체 (예를 들어 질소 또는 보다 바람직하게는 공기) 와 혼합하고 분말화 생성물의 제조를 촉진시키기에 충분한 조건 하에 건조 챔버에 분무한다.
고체 분산을 위해, 적어도 중합체가 용융되도록 배지 성분 및 중합체를 혼합하고 가열한다. 충분히 혼합한 후, 혼합물을 다시 냉각하여 중합체 및 배지 성분을 포함하는 고체를 수득한다.
핫 멜트 압출, 동결건조, 분무 건조, 고체 분산, 유동층 과립화 또는 기타 포매 절차 이후 수득한 고체를 바람직하게는, 예를 들어 볼 밀에서 밀링하여, 균질한 크기의 입자를 생성시킨다. 중합체 내에 포매된 하나 이상의 배지 성분을 포함하는 생성 입자는 통상 200 ㎛ 미만의 입자 크기를 갖는다. 바람직한 입자 크기는 100 ㎛ 미만이다. 유리한 입자 크기는 15 ㎛ 내지 100 ㎛ 이다.
중합체 포매된 성분이 단일 유형의 성분 또는 둘 이상 성분의 혼합물일 수 있다는 것이 이해된다. 중합체 포매된 성분의 중합체가 단일 유형의 중합체 또는 둘 이상 중합체의 혼합물일 수 있다는 것이 추가로 이해된다. 바람직한 구현예에서, 각각의 중합체 포매된 성분은 오직 하나의 배지 성분 및 하나의 중합체를 함유한다. 중합체 포매된 성분은 안정화제 또는 가소제를 추가로 포함할 수 있으나 바람직한 구현예에서는 중합체 포매된 성분은 오직 배지 성분 및 중합체를 함유한다.
통상 중합체 포매된 성분은 0.01 내지 99 중량% 의 배지 성분 및 99.99 내지 1 중량% 의 중합체를 포함한다. 바람직하게는 이들은 10 내지 90 중량% 의 배지 성분 및 90 내지 10 중량% 의 중합체를 포함한다.
본 발명의 분말화된 세포 배양 배지는 바람직하게는, 중합체 포매된 성분 외의 모든 성분을 혼합하고 이들을 밀링함으로써 제조된다. 성분의 혼합은 밀링에 의해 건조 분말화 세포 배양 배지를 제조하는 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 모든 성분을 밀링 전에 충분히 혼합하여 혼합물의 모든 부분이 거의 동일한 조성을 갖게 한다. 조성의 균일성이 높을수록, 생성된 배지의 균질한 세포 성장에 대한 품질이 더 양호해진다. 특히 중합체 포매된 성분이 코팅된 성분인 경우, 중합체 포매된 성분은 바람직하게는 밀링 후 혼합물에 첨가된다. 성분이 중합체 매트릭스에 분산되는 경우, 이는 또한 밀링 전에 다른 성분과 혼합될 수 있으며 이들과 밀링된다.
밀링은 분말화된 세포 배양 배지 제조에 적합한 임의 유형의 밀링기로 수행될 수 있다. 통상의 예는 볼 밀, 핀 밀, 피츠 밀 또는 제트 밀이다. 바람직한 것은 핀 밀, 피츠 밀 또는 제트 밀이고, 매우 바람직한 것은 핀 밀이다.
당업자는 이러한 밀링기를 가동하는 방법을 알고 있다.
약 40 cm 의 디스크 직경을 갖는 대규모 장치 밀링기는 예를 들어 통상 핀 밀의 경우 분당 1-6500 회전수, 바람직하게는 분당 1-3000 회전수로 가동된다.
밀링은 10 내지 300 ㎛, 가장 바람직하게는 25 내지 100 ㎛ 의 입자 크기를 갖는 분말을 초래하는 표준 밀링 조건 하에 수행될 수 있다.
바람직하게는, 밀링 처리되는 혼합물의 모든 성분은 건조 형태이다. 이는, 이들이 물을 포함하는 경우, 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 가장 바람직하게는 2 중량% 이하의 미결합 또는 미배위 물 분자의 결정화 수만을 포함한다는 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 밀링을 불활성 분위기 하에 수행한다. 바람직한 불활성 보호 기체는 질소이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 혼합물의 모든 성분은 밀링 전에 동결된다. 밀링 전의 성분의 동결은 0℃ 미만, 가장 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도로 성분의 냉각을 보장하는 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서 동결은 액체 질소로 수행된다. 이는, 예를 들어 성분이 밀링기에 도입되기 전에 저장되는 용기 내로 액체 질소를 부음으로써, 성분이 액체 질소로 처리되는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 용기는 공급기 (feeder) 이다. 용기가 공급기인 경우에 액체 질소는 바람직하게는 성분이 도입되는 공급기의 면에 또는 그 근처에 도입된다.
통상, 성분은 액체 질소로 2 내지 20 초에 걸쳐 처리된다.
바람직하게는 성분의 냉각은 밀링기에 들어가는 모든 성분이 0℃ 미만, 가장 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도가 되게 하는 방식으로 수행된다.
바람직한 구현예에서, 모든 성분은 용기에 넣어지고, 그 용기로부터 혼합물은 공급기, 가장 바람직하게는 계량 스크류 공급기 (metering screw feeder) 에 옮겨진다. 공급기에서 성분은 때때로 추가로 혼합되고 - 공급기의 유형에 따라 - 부가적으로 냉각된다. 동결된 혼합물은 그 후 공급기로부터 밀링기로 옮겨져, 밀링기에서 밀링되는 혼합물은 바람직하게는 0℃ 미만, 보다 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도를 갖는다.
통상 공급기에서의 성분의 혼합물의 체류 시간을 의미하는 배합 시간은 1 분 초과, 바람직하게는 15 내지 60 분이다.
도세지 스네일 (dosage snail) 로도 지칭되는 계량 스크류 공급기는 통상 분 당 10 내지 200 회전수의 속도로 가동되고, 바람직하게는 분당 40 내지 60 회전수로 가동된다.
통상, 밀링기의 온도는 -50 내지 +30℃ 로 유지된다. 바람직한 구현예에서, 온도는 대략 10℃ 에서 유지된다.
밀링 동안 산소 수준은 바람직하게는 10% (v/v) 미만이다.
공정은 예를 들어 회분식 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 일정한 시간에 걸쳐, 성분의 혼합물을 냉각을 위해 공급기 내에 영구적으로 채우고 냉각된 혼합물을 공급기로부터 밀링기 내로 영구적으로 채움으로써 연속식으로 수행된다.
밀링된 분말화된 배지를 사용하는 경우에 용매, 바람직하게는 물 (가장 특히 증류수 및/또는 탈이온수 또는 정제수 또는 주사용수) 또는 수성 완충제가 배지에 첨가되고, 배지가 용매에 완전히 용해될 때까지 성분이 혼합된다.
물 또는 수성 완충제는 또한 염수, 적합한 pH 범위 (통상 pH 1.0 내지 pH 10.0 범위) 를 제공하는 가용성 산 또는 염기 이온, 안정화제, 계면활성제, 보존제, 및 알코올 또는 기타 극성 유기 용매를 포함할 수 있다.
추가의 물질 예컨대 pH 조정을 위한 완충 물질, 소 태아 혈청, 당 등을, 세포 배양 배지 및 용매의 혼합물에 또한 첨가할 수 있다. 생성된 액체 세포 배양 배지는 그 후 성장 또는 유지될 세포와 접촉된다.
본 발명은 또한 하기에 의해 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다:
a) 생물반응기를 제공하고,
b) 물 또는 수성 완충제에 용해된 본 발명에 따른 세포 배양 배지와 배양할 세포를 혼합하고,
c) 단계 b) 의 혼합물을 인큐베이션함.
생물반응기는 세포가 배양될 수 있는 용기, 그릇 또는 탱크와 같은 세포 배양에 적합한 임의의 단위이다. 생물반응기는 통상 사용 전 멸균된다. 인큐베이션은 통상 적합한 온도 등과 같은 적합한 조건 하에 수행된다. 당업자는 세포의 성장/배양을 지지하거나 유지시키는데 적합한 인큐베이션 조건을 알고 있다.
하나 이상의 중합체 포매된 성분을 포함하는 본 발명의 세포 배양 배지는 저장하는 경우 표준 배지에 비해 더 양호한 안정성을 나타낸다.
또한, 하나 이상의 중합체 포매된 성분을 포함하는 본 발명의 세포 배양 배지의 유동 특성은 흡습성 성분이 차폐됨에 따라 비슷한 표준 배지의 특성보다 더 양호하다.
본 발명을 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 및 하기 인용된 모든 출원, 특허 및 공개물 및 상응하는 EP 출원 13003514.0 (2013년 7월 11일 출원) 의 전체 개시물은 본원에 참조로 포함된다.
표 1
Figure pct00002
Figure pct00003
도 1 및 2 는 CHO S 성능 시험을 나타낸다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실제 적용을 나타낸다.
1. 폴록사머에 포매된 탄산수소나트륨의 제조
폴록사머 포매된 탄산수소나트륨을 Unilab H00533 Hotmelt 를 사용하여 핫 멜트 압출에 의해 제조한다.
유리체:
약 100 내지 200 ㎛ 의 입자 형태의 2500 g 의 탄산수소나트륨.
분무 액체로서의 용융물 형태의 1000 g 의 폴록사머 (BASF, Germany).
세부사양:
2 Huttlin-3 성분 노즐, 1.2 mm 직경
4x1 mm 테플론 튜브
분무 에어 플랩 (air flap): 2.3 mm
미기후: 지속적으로 40℃
튜브: 100℃
용기: 130℃
분무 공기: 130℃
2. 폴록사머에 포매된 L-글루타민 및 탄산수소나트륨의 CHO S 성능 시험
폴록사머 포매된 성분을 실시예 1 의 절차에 따라 제조한다.
CHO S 세포를 선천적 및 포매된 탄산수소나트륨 및 L-글루타민과 함께 Cellvento CHO 100 (EMD Millipore, US) 에서 시딩하고 4 주에 걸쳐 4℃ 에서 저장한다.
도 1 및 2 는 CHO S 성능 시험을 나타낸다.

Claims (13)

  1. 하나 이상의 중합체 포매된 성분을 포함하는 건조 분말 세포 배양 배지.
  2. 제 1 항에 있어서, 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 블록 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리비닐 카프로락탐 - 폴리비닐 아세테이트 - 폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 중합체가 폴록사머 (poloxamer) 인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 성분이 L-글루타민, 탄산수소나트륨, 염화칼슘 x 2 H2O, 염화콜린, 질산제2철 x 9 H20, 황산제1철 x 7 H20, 인산나트륨 또는 모노나트륨 인산염 (NaH2PO4) 모노히드레이트인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 둘 이상의 중합체 포매된 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 포유류 세포 배양 배지인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 화학 한정 세포 배양 배지인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 포매된 성분이 핫 멜트 압출에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 포매된 성분이 습식 과립화에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  10. 하기에 의해 세포 배양 배지를 제조하는 방법:
    a) 하나 이상의 중합체 포매된 성분을 제공하고,
    b) 세포 배양 배지의 기타 성분을 제공하고, 이를 혼합하고 밀링하고,
    c) 중합체 포매된 성분을 단계 b) 의 밀링 혼합물과 혼합함.
  11. 제 10 항에 있어서, 단계 b) 가 볼 밀 (ball mill), 핀 밀 (pin mill), 피츠 밀 (fitz mill) 또는 제트 밀 (jet mill) 에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 단계 a) 로부터의 혼합물을 밀링 전에 0℃ 미만의 온도로 냉각시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 하기에 의해 세포를 배양하는 방법:
    a) 생물반응기 (bioreactor) 를 제공하고,
    b) 제 1 항에 따른 세포 배양 배지를 물 또는 수성 완충제에 용해하고,
    c) 단계 b) 로부터 생성된 배지와 배양할 세포를 혼합하고,
    d) 단계 c) 의 혼합물을 인큐베이션함.
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