KR20160021196A

KR20160021196A - 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖｆ 폴리펩타이드

Info

Publication number: KR20160021196A
Application number: KR1020167000649A
Authority: KR
Inventors: 요한 페트루스 마리아 랜게드디크; 안드레아 크라루프
Original assignee: 크루셀 홀란드 비.브이.
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2034-06-17
Also published as: AU2014283334A1; HK1223949A1; JP6679475B2; CN105408348A; PH12015502735A1; PH12015502735B1; US10294279B2; CN105408348B; KR102313153B1; BR112015031509A2; AP2015008893A0; IL243053B; EA034653B1; EP3010931A1; CA2914792A1; SG11201510216RA; NZ714594A; PE20160045A1; EP3010931B1; MY171210A

Abstract

본 발명은 안정한 예비융합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물, 및 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

안정화된 가용성 예비융합 ＲＳＶＦ 폴리펩타이드{STABILIZED SOLUBLE PRE-FUSION RSV F POLYPEPTIDES}

본 발명은 의학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 재조합 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 및 예를 들어, 면역원성 조성물에서 이의 용도에 관한 것이다.

호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncitial virus; RSV)는 파라믹소비리대 과(family Paramyxoviridae), 뉴모바이러스 속(genus Pneumovirus)에 속하는, 외피를 가진 비-절편화된 음성-가닥의 RNA 바이러스이다. 전 세계적으로, 매년 6,400만 건의 RSV 감염이 발생하고 있으며, 160,000명이 사망하는 것으로 추정된다(2009년 9월에 업데이트된 WHO 급성 호흡기 감염). 가장 중증인 질병은 특히, 조산아, 노인 및 면역저하된 대상에서 발생한다. 2세 미만의 어린이에서, RSV는 가장 흔한 기도(respiratory tract) 병원체로서, 호흡기 감염으로 인한 입원의 대략 50%를 차지하며, 입원의 정점은 2개월 내지 4개월 된 영아에게서 발생한다. 2세까지 거의 모든 어린이들은 RSV에 감염된 적이 있는 것으로 보고된 바 있다. 일생 동안 반복된 감염은 비효과적인 자연 면역 때문이다. 노인에서 RSV 질병 부담, 사망률 및 이환율의 수준은 비-대유행(non-pandemic) 인플루엔자 A 감염에 의해 유발되는 것 다음으로 높다.

숙주 세포를 감염시키기 위해, RSV는, 인플루엔자 바이러스 및 HIV와 같은 다른 외피형 바이러스와 마찬가지로, 바이러스 막과 숙주 세포막의 융합을 필요로 한다. RSV의 경우, 보존된 융합 단백질(RSV F 단백질)은 바이러스의 막을 숙주 세포의 세포막과 융합한다. 파라믹소바이러스 연구를 토대로 하는 현재의 모델에서, RSV F 단백질은 처음에 "예비융합" 형태(conformation)로 폴딩(folding)된다. 준안정한 구조는 최근, 안정화 중화 항체 Fab 단편과의 복합체에서 해결된 바 있다(문헌[McLellan et al., Science 340(6136):1113-7, 2013]). 세포 유입 동안, 예비융합 형태는 리폴딩(refolding)되고, "융합후" 형태로 형태 변화를 수행한다(문헌[McLellan, J. Virol 85(15):7788-96, 2010; Swanson, PNAS 108(23):9619-24, 2011]). 따라서, RSV F 단백질은, 처음에 준안정한 형태(예비융합 형태)로 폴딩된 다음, 후속해서 보다 낮은 에너지 형태(융합후 형태)로 개별적인/단계적인 형태 변화를 수행함으로써, 비가역적인 단백질 리폴딩을 막 병치와 커플링함으로써, 막 융합을 유도하는 준안정한 단백질이다.

이들 관찰은, 예비융합 RSV F 단백질 및 융합후 RSV F 단백질이 항원적으로 별개임을 제시한다(문헌[Calder, L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)]).

RSV 감염에 대한 백신은 현재 이용가능하지 않지만, 요망되고 있다. RSV F 단백질을 토대로 하는 백신 후보는 예를 들어, 안정성, 순도, 재현가능성 및 효능과 관련된 문제점들로 인해 실패하였다. 전술한 바와 같이, 결정 구조는 예비융합 상태와 융합후 상태 간의 큰 형태 변화를 보여주었다. 재배열의 규모는, RSV-F의 융합후 형태에 대한 항체의 일부만이 바이러스 표면상의 예비융합 스파이크(spike)의 고유 형태와 교차반응할 수 있을 것임을 제시하였다. 따라서, RSV에 대한 백신을 제조하려는 노력은 예비융합 형태의 RSV F 단백질을 함유하는 백신을 개발하는 데 초점을 맞춰왔다(예를 들어, WO20101149745, WO2010/1149743, WO2009/1079796, WO2012/158613을 참조). 그러나, 이들 노력은 아직까지, 인간에서 시험할 후보로서 사용될 수 있는 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 제공하지 못하였다.

본 발명은, 안정한, 재조합, 예비융합의 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 융합(F) 폴리펩타이드, 즉, 예비융합 형태에서 안정화된 재조합 RSV F 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 RSV F 폴리펩타이드는 예비융합 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 가용성이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물, 바람직하게는 면역원성 조성물, 및 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 있어서 이의 용도, 특히 백신으로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 대상에서 항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 상기 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 유도되는 면역 반응은 RSV에 대한 중화 항체 및/또는 RSV에 대한 보호성 면역을 특징으로 한다. 특정한 측면에서, 본 발명은 대상에서 중화성 항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 단백질 항체를 유도하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 상기 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 융합 단백질(F)은, 감염에 필요한, 바이러스 막과 숙주 세포막의 융합에 관여한다. RSV F mRNA는, 소포체에서 신호 펩티다제에 의해 제거되는 신호 펩타이드 서열(예, SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 1 내지 26)을 N-말단에 함유하는, F0로 지정되는 574개 아미노산 전구체 단백질로 번역된다. F0는, 세포의 프로테아제(특히 퓨린 또는 퓨린-유사)에 의해 (아미노산 잔기 109/110과 136/137 사이에서) 2개의 부위에서 절단되어, 아미노산 잔기 110 내지 136을 포함하는 길이가 짧은 글리코실화된 개입 서열(p27 영역으로도 지칭됨)을 제거하고, F1 및 F2로 지정되는 2개의 도메인 또는 하위단위를 생성한다. F1 도메인(아미노산 잔기 137 내지 574)은 이의 N-말단에 소수성 융합 펩타이드를 함유하며, C-말단은 막관통(TM)(아미노산 잔기 530 내지 550) 영역 및 세포질 영역(아미노산 잔기 551 내지 574)을 함유한다. F2 도메인(아미노산 잔기 27 내지 109)은 2개의 이황화 결합에 의해 F1에 공유 연결된다. F1-F2 이종이합체는 비리온에서 동종삼량체로서 조립된다.

RSV 감염에 대한 백신은 현재 이용가능하지 않지만, 요망되고 있다. 백신 제조를 위한 하나의 잠재적인 접근법은 정제된 RSV F 단백질을 토대로 하는 하위단위 백신이다. 그러나, 이러한 접근법의 경우, 정제된 RSV F 단백질은 예비융합 상태의 RSV F 단백질의 형태와 유사한 형태이며, 즉, 시간이 지남에 따라 안정하며, 충분한 양으로 제조될 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 하위단위-기재의 백신의 경우, RSV F 단백질은 막관통(TM) 영역 및 세포질 영역의 결실에 의해 절단되어, 가용성 분비형 F 단백질(sF)을 생성해야 한다. TM 영역은 막 앵커링 및 삼량체화에 관여하기 때문에, 무앵커(anchorless) 가용성 F 단백질은 전장 단백질보다 상당히 더 불안정하며, 융합후 최종 상태로 쉽게 리폴딩될 것이다. 높은 발현 수준 및 높은 안정성을 보여주는 안정한 예비융합 형태의 가용성 F 단백질을 수득하기 위해, 따라서, 예비융합 형태는 안정화될 필요가 있다.

또 다른 파라믹소바이러스 F 단백질의 예비융합 형태에서의 안정화는 파라인플루엔자 5형(PIV5)의 경우 성공적으로 달성된 바 있다. 따라서, Yin 등(문헌[Nature 439: 38-44 (2006)])은, F0에서 F1 및 F2로의 가공을 차단한 퓨린 절단 부위의 돌연변이에 의해 PIV-5 F 단백질의 예비융합 구조를 안정화시켰다. 더욱이, 막관통(TM) 도메인 및 세포질 도메인은 잘 공지된 나선형 삼량체화 도메인: GCN4pII로 대체되었다. 이 도메인은 삼량체형의 나선형으로 꼬인 코일 구조를 형성하며, 천연 이량체형의 나선형으로 꼬인 코일 펩타이드 GCN4의 변형이다(문헌[O'Shea et al., Science 243: 538-542 (1989)]). GCN4 류신 지퍼의 아미노산 서열이 헵타드(heptad)의 모든 a 및 d 위치들에서 이소류신 잔기로 치환된 GCN4-pII 펩타이드는, 삼중 가닥의 평행한 알파-나선형으로 꼬인 코일을 형성하는 것으로 나타났다(문헌[Harbury et al., Science 262: 1401-1407 (1993)]).

RSV F의 예비융합 형태에서의 안정화를 위해, 동일한 전략, 즉, 퓨린 절단 부위의 돌연변이, 및 RSV-F 엑토도메인과 GCN4pII 삼량체화 도메인의 융합(예를 들어, WO2010/149743, WO2010/149745, WO2009/079796, WO2012/158613에 개시된 바와 같음) 또는 RSV-F 엑토도메인과 피브리틴 삼량체화 도메인의 융합(문헌[McLellan et al., Nature Struct. Biol.17: 2-248-250 (2010); McLellan et al., Science 340(6136):1113-7 (2013)])이 시도된 바 있다. 이러한 피브리틴 도메인 또는 '폴돈(Foldon)'은 T4 피브리틴으로부터 유래되며, 이전에 인공적인 천연 삼량체화 도메인으로서 기술되었다(문헌[Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993)]; 문헌[S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)]). 그러나, 이들 노력은 안정한 예비융합 RSV-F 단백질을 제공하지 못하였다. 더욱이, 이들 노력은 아직까지, 인간에서 시험하기에 적합한 후보를 제공하지 못하였다.

이제, 본 발명은 재조합의 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 즉, 예비융합 형태에서 안정화된 RSV F 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명을 이끈 연구에서, 상기 안정한 가용성 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 수득하기 위해, 몇몇 변형 단계들이 도입되고/되거나 조합되었다. 본 발명의 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 예비융합 형태로 존재하는데, 즉, 이들은 예비융합 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함(제시)한다. 예비융합 형태 F 단백질에 특이적인 에피토프는, 융합후 형태에는 존재하지 않는 에피토프이다. 임의의 특정한 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, RSV F 단백질의 예비융합 형태는, 천연 RSV 비리온 상에서 발현되는 RSV F 단백질과 동일한 에피토프를 함유할 수 있으며, 따라서, 보호성의 중화 항체를 유도하는 데 있어서 이점을 제공할 수 있는 것으로 여겨진다.

도 1: RSV 예비융합 DM = 이중 돌연변이체(N67I+S215P = SEQ ID NO:21) 및 DM+CC = 이중 돌연변이체 + DE486CC = SEQ ID NO:94)를 이용한 환원 SDS-PAGE 및 비-환원 SDS-PAGE를 도시한 것이다.
도 2: 레인 2: DM = 이중 돌연변이체 (N67I+S215P = SEQ ID NO 21) 및 레인 1: DM+CC = 이중 돌연변이체 + DE486CC = SEQ ID NO: 94) 유래의 상층액의 NativePAGE 분석을 도시한 것이다.
도 3: a) 이온-교환 컬럼으로부터 용출물 PreF N67I E161P S215P, RSV A2, 피브리틴 (SEQ ID NO: 91)의 Superdex200 겔 여과 크로마토그램을 도시한 것이다. b) 환원성 조건하에 SEC 크로마토그램으로부터의 피크를 함유하는 예비융합 F 단백질의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. c) 정제된 RSV 예비융합 F 이중 돌연변이체(SEQ ID NO: 21, 레인 1)와 비교하여, 정제된 RSV 예비융합 F 단백질(SEQID NO: 91, 레인 2)의 NativePAGE 분석을 도시한 것이다.
도 4: 표 14에 따른 면역원 및 용량을 사용하여 0주 및 4주째에 프라임 부스트 후, 6주째에 마우스의 VNA 타이터를 도시한 것이다.
도 5: 표 15에 따른 면역원 및 용량을 사용하여 0주 및 4주째에 프라임 부스트 후, 7주째에 코튼랫의 VNA 타이터를 도시한 것이다.
도 6: i.n. RSV 시도 후, 5일째에 폐 및 코에서 바이러스 부하(viral load)를 도시한 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 54의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 55의 중쇄 CDR2 영역, SEQ ID NO: 56의 중쇄 CDR3 영역 및 SEQ ID NO: 62의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 63의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 64의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 예비융합 특이적인 모노클로날 항체(이하, CR9501로 지칭됨) 및/또는 SEQ ID NO: 58의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 59의 중쇄 CDR2 영역, SEQ ID NO: 60의 중쇄 CDR3 영역 및 SEQ ID NO: 66의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 67의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 68의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 예비융합 특이적인 모노클로날 항체(CR9502로 지칭됨)에 의해 인지되는 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. CR9501 및 CR9502는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 따라서, 각각, 예비융합 형태의 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하지만 융합후 형태의 RSV F 단백질에는 결합하지 않는 것으로 이미 나타난 항체 58C5 및 30D8의 결합 특이성을 포함한다(WO2012/006596 참조).

특정 구현예에서, 재조합 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는, 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 예비융합 특이적인 모노클로날 항체에 의해 인지되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하며, 삼량체이다.

본 발명에 따른 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 F1 도메인 및 F2 도메인을 포함하며, 여기서, 폴리펩타이드는 야생형 F1 도메인 및 F2 도메인과 비교하여, 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다:

(a) 161번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(b) 182번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(c) 173번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이; 및

(d) 489번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 C로의 돌연변이(D489C) 또는 487번째 위치에서 아미노산 잔기 E의 C로의 돌연변이(E487C)와 조합된, 486번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 C로의 돌연변이(D486C).

특정 구현예에서, 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 F1 도메인 및 F2 도메인을 포함하며, 여기서, 폴리펩타이드는 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다:

(a) 161번째 위치에서 아미노산 잔기 E의 P, Q 또는 G로의 돌연변이(E161P, E161Q 또는 E161G);

(b) 182번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이(S182P);

(c) 173번째 위치에서 아미노산 잔기 S, T 또는 N의 P로의 돌연변이(S173P); 및

특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 67번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 더 포함한다.

따라서, 특정 구현예에서, 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 F1 도메인 및 F2 도메인을 포함하며, 여기서, 폴리펩타이드는 67번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이, 및 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 포함한다:

(a) 161번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(b) 182번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(c) 173번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이; 및

특정 구현예에서, 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 F1 도메인 및 F2 도메인을 포함하며, 여기서, 폴리펩타이드는 67번째 위치에서 아미노산 잔기 N 또는 T의 돌연변이 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 돌연변이를 포함하며, 폴리펩타이드는 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 추가로 포함한다:

특정 구현예에서, 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 F1 도메인을 F2 도메인에 연결하는, 1개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 연결 서열을 포함한다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는, F1 도메인 및 F2 도메인, 및 상기 F1 도메인을 상기 F2 도메인에 연결하는 1개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 연결 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다:

특정 구현예에서, 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 67번째 위치에서 아미노산 잔기 N 또는 T의 돌연변이 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 67번째 위치에서 아미노산 잔기 N 또는 T의 I로의 돌연변이(N/T67I) 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이(S215P)를 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 절단된(truncated) F1 도메인을 포함한다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는, 절단된 F1 도메인 및 F2 도메인, 및 선택적으로 상기 절단된 F1 도메인을 상기 F2 도메인에 연결하는 1개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 연결 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 포함한다:

특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 67번째 위치에서 아미노산 잔기 N 또는 T의 돌연변이 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 67번째 위치에서 아미노산 잔기 N 또는 T의 I로의 돌연변이(N/T67I) 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이(S215P)를 추가로 포함한다.

따라서, 본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 야생형 RSV F 단백질 내의 RSV F1 및/또는 F2 도메인과 비교하여, F1 및/또는 F2 도메인에 적어도 하나의 안정화 돌연변이를 포함한다. RSV는 2개의 항원성 하위그룹인 A 및 B를 가진 단일 혈청형으로서 존재하는 것으로 공지되어 있다. 2개의 그룹의 성숙한 가공된 F 단백질의 아미노산 서열은 약 93% 동일하다. 본 출원 전체에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 위치는 A2 균주 유래의 RSV F 단백질의 서열(SEQ ID NO: 1)을 참조로 주어진다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "RSV F 단백질의 "x"번째 위치에서의 아미노산"은, 아미노산이 SEQ ID NO: 1의 RSV A2 균주 유래의 RSV F 단백질에서 "x"번째 위치의 아미노산에 상응함을 의미한다. 본 출원 전체에서 사용되는 넘버링 시스템에서, 1은 미성숙 F0 단백질(SEQ ID NO: 1)의 N-말단 아미노산을 지칭함에 주목한다. A2 균주가 아닌 RSV 균주가 사용되는 경우, F 단백질의 아미노산 위치는, 다른 RSV 균주의 서열을 SEQ ID NO: 1의 F 단백질과 필요에 따라 갭을 삽입하면서 정렬시킴으로써, SEQ ID NO: 1의 A2 균주의 F 단백질의 넘버링을 참조로 넘버링되어야 한다. 서열 정렬은 예를 들어, CLUSTALW, Bioedit 또는 CLC Workbench에 의해 당해 기술분야에 잘 공지된 방법들을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 아미노산은, 20개의 자연적으로 존재하는 아미노산(또는 '표준' 아미노산) 또는 이들의 변이체, 예컨대 D-아미노산(키랄 중심을 가진 아미노산의 D-거울상이성질체) 또는 노르류신과 같이 단백질에 자연적으로 발견되지 않는 임의의 변이체들 중 임의의 것일 수 있다. 표준 아미노산은 이들의 특성을 토대로 몇몇 그룹으로 나뉠 수 있다. 중요한 인자들은 전하, 친수성 또는 소수성, 크기 및 관능기이다. 이들 특성은 단백질 구조 및 단백질-단백질 상호작용에 중요하다. 일부 아미노산들은 특수한 특성을 가지는데, 예컨대, 시스테인은 다른 시스테인 잔기에 공유 이황화 결합(또는 이황화 연결)을 형성할 수 있으며, 프롤린은 폴리펩타이드 백본의 턴을 유도하며, 글리신은 다른 아미노산보다 더 유연성이 있다. 표 17은 표준 아미노산의 약어 및 특성을 나타낸 것이다.

당업자는, 일상적인 분자생물학 절차에 의해 단백질에 돌연변이를 가할 수 있음을 알게 될 것이다. 본 발명에 따른 돌연변이는 바람직하게는, 이들 돌연변이(들)를 포함하지 않는 RSV F 폴리펩타이드와 비교하여, 발현 수준을 증가시키고/거나 예비융합 RSV F 폴리펩타이드의 안정화를 증가시킨다.

특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 전장(full length)이다.

특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 가용성이다.

특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 상기 절단된 F1 도메인에 연결되는 이종성 삼량체화 도메인을 추가로 포함한다. 본 발명에 따르면, 이종성 삼량체화 도메인을 절단된 F1 도메인의 C-말단 아미노산 잔기에, 선택적으로, F1 도메인을 F2 도메인과 연결하는 연결 서열 및 안정화 돌연변이(들)와 조합하여, 연결함으로써, 높은 발현을 나타내며 예비융합-특이적인 항체에 결합하는 RSV F 폴리펩타이드가 제공되며, 이는 폴리펩타이드가 예비융합 형태로 존재함을 가리키는 것으로 나타났다. 또한, RSV F 폴리펩타이드는 예비융합 형태에서 안정화되는데, 즉, 폴리펩타이드의 가공 후에라도, 이들은 예비융합 특이적인 항체 CR9501 및/또는 CR9502에 여전히 결합하며, 이는 예비융합 특이적인 에피토프가 유지됨을 가리킨다.

추가적인 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 (야생형 RSV F 단백질과 비교하여) 하기의 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 돌연변이를 포함한다:

(a) 46번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(b) 77번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(c) 80번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(d) 92번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(e) 184번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(f) 185번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(g) 201번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(h) 209번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(i) 421번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(j) 426번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(k) 465번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(l) 486번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;

(m) 487번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이; 및

(n) 508번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이.

바람직한 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 돌연변이는 하기의 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) 46번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 G로의 돌연변이(S46G);

(b) 77번째 위치에서 아미노산 잔기 K의 E로의 돌연변이(K77E);

(c) 80번째 위치에서 아미노산 잔기 K의 E로의 돌연변이(K80E);

(d) 92번째 위치에서 아미노산 잔기 E의 D로의 돌연변이(E92D);

(e) 184번째 위치에서 아미노산 잔기 G의 N으로의 돌연변이(G184N);

(f) 185번째 위치에서 아미노산 잔기 V의 N으로의 돌연변이(V185N);

(g) 201번째 위치에서 아미노산 잔기 K의 Q로의 돌연변이(K201Q);

(h) 209번째 위치에서 아미노산 잔기 K의 Q로의 돌연변이(K209Q);

(i) 421번째 위치에서 아미노산 잔기 K의 N으로의 돌연변이(K421N);

(j) 426번째 위치에서 아미노산 잔기 N의 S로의 돌연변이(N426S);

(k) 465번째 위치에서 아미노산 잔기 K의 E 또는 Q로의 돌연변이(K465Q);

(l) 486번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 N으로의 돌연변이(D486N);

(m) 487번째 위치에서 아미노산 잔기 E의 Q, N 또는 I로의 돌연변이(E487Q/N/I); 및

(n) 508번째 위치에서 아미노산 잔기 K의 E로의 돌연변이(K508E).

상기 기술된 바와 같이, 특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는, D489C 또는 E487C와 조합된, 486번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 C로의 돌연변이(D486C)를 포함한다. 2개의 엑스트라 시스테인 잔기에 대한 이들 이중 돌연변이로 인해, F1 단백질들 사이에서 하위단위간(inter-subunit) 이황화 결합이 형성되어, 기본단위체(protomer)들 간에 공유 결합이 구축되고, 예비융합 RSV F가 안정화된다.

다시, 아미노산 잔기의 위치에 대해서는 SEQ ID NO: 1을 참조로 함에 주목한다. 당업자는 다른 RSV 균주의 F 단백질에서 상응하는 아미노산 잔기를 확인할 수 있을 것이다.

특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 (야생형 RV F 단백질과 비교하여) 적어도 2개의 돌연변이를 포함한다.

특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 적어도 3개의 돌연변이를 포함한다.

특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 적어도 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이를 포함한다.

특정 구현예에서, 이종성 삼량체화 도메인은 아미노산 서열 EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(SEQ ID NO: 3)를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 이종성 삼량체화 도메인은 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 4)을 포함한다.

상기 기술된 바와 같이, 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 절단된 F1 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "절단된" F1 도메인은 전장 F1 도메인이 아닌 F1 도메인을 지칭하는데, 즉, 여기서, N-말단 또는 C-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되었다. 본 발명에 따르면, 적어도 막관통 도메인 및 세포질 꼬리는, 가용성 엑토도메인으로서 발현될 수 있도록 결실되어 있다.

다른 특정 구현예에서, F1 도메인은 RSV F 단백질(SEQ ID NO: 1로 지칭됨)의 아미노산 잔기 495 뒤에서 절단되는데, 즉, 아미노산 잔기 496(SEQ ID NO: 1로 지칭됨)으로부터 출발하는 F1 도메인의 C-말단 부분이 결실된다. 다른 특정 구현예에서, F1 도메인은 RSV F 단백질의 아미노산 잔기 513 뒤에서 절단된다. 특정 구현예에서, F1 도메인은 아미노산 잔기 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 또는 525 뒤에서 절단된다.

특정 구현예에서, 삼량체화 도메인은 RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 495에 연결된다. 특정 구현예에서, 삼량체화 도메인은 SEQ ID NO: 4를 포함하며, RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 495에 연결된다.

다른 특정 구현예에서, 삼량체화 도메인은 RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 513에 연결된다. 특정 구현예에서, 삼량체화 도메인은 SEQ ID NO: 3를 포함하며, RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 513에 연결된다.

상기 기술된 바와 같이, 특정 구현예에서, 선택적으로 절단된 F1 도메인 및 F2 도메인은, F2 도메인의 C-말단 아미노산을 (선택적으로 절단된) F2 도메인의 N-말단 아미노산에 연결하는 연결 서열에 의해 연결된다. 특정 구현예에서, 연결 서열(또는 링커)를 1개 내지 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 2개 내지 9개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 3개 내지 8개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 4개 내지 7개의 아미노산 잔기를 포함하며, 보다 바람직하게는 링커는 5개 또는 6개의 아미노산 잔기를 포함한다. 예비융합 RVS F 폴리펩타이드의 형태를 방해하지 않으면서 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다수의 형태적으로 중성인 링커들이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 GSGSG(SEQ ID NO: 5)를 포함한다.

특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F 도메인은 RSV A 균주로부터 유래된다. 특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F2 도메인은 SEQ ID NO: 1의 RSV A2 균주로부터 유래된다.

특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F2 도메인은 SEQ ID NO: 69의 RSV A2 균주로부터 유래된다.

특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F 도메인은 RSV B 균주로부터 유래된다. 특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F2 도메인은 SEQ ID NO: 2의 RSV B 균주로부터 유래된다.

특정 구현예에서, F1 도메인 및 F2 도메인은 동일한 RSV 균주로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 키메라 폴리펩타이드, 즉, 상이한 RSV 균주로부터 유래되는 F1 도메인 및 F2 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 예비융합 RSV F 폴리펩타이드의 발현 수준은 돌연변이(들)를 포함하지 않는 전장 야생형 RSV F 폴리펩타이드 또는 야생형 엑토도메인(즉, 막관통 영역 및 세포질 영역을 포함하지 않음)과 비교하여, 증가된다. 특정 구현예에서, 발현 수준은 적어도 5배, 바람직하게는 10배까지 증가된다. 특정 구현예에서, 발현 수준은 10배 넘게 증가된다.

본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 안정한데, 즉, 정제, 동결-해동 주기, 및/또는 보관 등과 같은 폴리펩타이드의 가공 시, 융합후 형태로 쉽게 변하지 않는다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 돌연변이(들)를 포함하지 않는 RSV F 폴리펩타이드와 비교하여, 4℃에서 보관 시, 증가된 안정성을 가진다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 4℃에서 보관 시 적어도 30일, 바람직하게는 적어도 60일, 바람직하게는 적어도 6개월, 보다 더 바람직하게는 적어도 1년 동안 안정하다. "보관 시 안정한"이란, 예를 들어, 실시예 8 또는 10에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 확인되는 바와 같이, 폴리펩타이드를 용액(예, 배양 배지) 내에서 4℃에서 적어도 30일 동안 보관 시, 폴리펩타이드가 예비융합 특이적인 항체(예, CR9501)에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 여전히 제시함을 의미한다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 4℃에서 예비융합 RSV F 폴리펩타이드의 보관 시, 적어도 6개월, 바람직하게는 적어도 1년 동안 적어도 하나의 예비융합 특이적인 에피토프를 제시한다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 상기 돌연변이(들)를 포함하지 않는 RSV F 폴리펩타이드와 비교하여, 열처리 시, 증가된 안정성을 가진다. 특정 구현예에서, 예비융합 REV F 폴리펩타이드는 55℃, 바람직하게는 58℃, 보다 바람직하게는 60℃의 온도에서 적어도 30분 동안 열에 안정하다. "열에 안정한"이란, 예를 들어, 실시예 9에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 확인되는 바와 같이, 폴리펩타이드가 증가된 온도(즉, 55℃ 이상의 온도)로 적어도 30분 동안 처리된 후, 적어도 하나의 예비융합 특이적인 에피토프를 여전히 제시함을 의미한다.

특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 적절한 제형 완충제에서 1회 내지 6회의 동결-해동 주기로 처리된 후에도, 적어도 하나의 예비융합 특이적인 에피토프를 제시한다.

바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 90 내지 94로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 90 내지 94로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다.

본 출원 전체에서 사용되는 바와 같이, 당해 기술분야에서 통상적인 대로, 뉴클레오타이드 서열은 5'에서 3' 방향으로 제공되며, 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 제공된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 인코딩된 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 69의 아미노산 1 내지 26에 상응하는 신호 서열 또는 신호 펩타이드로도 지칭되는 리더 서열을 추가로 포함한다. 이는, 분비 경로로 정해진 대부분의 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 길이가 짧은(전형적으로 길이가 5개 내지 30개 아미노산임) 펩타이드이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 리더 서열을 포함하지 않는다.

특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 HIS-태그를 포함한다. His-태그 또는 폴리히스티딘-태그는, 종종 단백질의 N-말단 또는 C-말단에서 적어도 5개의 히스티딘(H) 잔기로 구성된, 단백질 내의 아미노산 모티프이며, 일반적으로 정제를 목적으로 사용된다.

특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 HIS-태그를 포함하지 않는다. 본 발명에 따르면, 놀랍게도, HIS-태그가 결실된 경우, 발현 수준 및 안정성이 HIS-태그를 포함하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가되는 것으로 나타났다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포에서 발현되도록 코돈-최적화된다. 코돈-최적화 방법을 공지되어 있으며, 이전에 기술된 바 있다(예, WO 96/09378). 서열은, 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 바람직하지 않은 코돈이 보다 바람직한 코돈으로 대체되는 경우, 코돈-최적화된 것으로 간주된다. 본원에서, 바람직하지 않은 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하는 또 다른 코돈보다 유기체에서 더 낮은 빈도로 사용되는 코돈이며, 보다 바람직한 코돈은 바람직하지 않은 코돈보다 유기체에서 더 높은 빈도로 사용되는 코돈이다. 특이적인 유기체에 대한 코돈 사용의 빈도는 코돈 빈도 표, 예컨대 http://www.kazusa.or.jp/codons에서 확인할 수 있다. 바람직하게는 1개 초과의 바람직하지 않은 코돈, 바람직하게는 대부분의 또는 모든 바람직하지 않은 코돈들이 보다 바람직한 코돈으로 대체된다. 바람직하게는, 유기체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈이 코돈-최적화된 서열에 사용된다. 바람직한 코돈으로 대체되면, 일반적으로 발현이 더 높아진다.

당업자는, 다수의 상이한 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 분자들이 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자는, 폴리펩타이드가 발현되어야 하는 임의의 특정한 숙주 유기체의 코돈 사용빈도를 반영하기 위해, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 치환을 일상적인 기술을 사용하여 수행할 수 있음을 이해한다. 따라서, 다르게 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은, 서로의 버전을 축퇴시키며 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.

핵산 서열은 일상적인 분자생물학 기술을 사용하여 클로닝될 수 있거나, DNA 합성 및/또는 분자 클로닝 분야의 사업을 가진 서비스 회사(예, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins)에 의한 일상적인 절차를 사용하여 수행될 수 있는 DNA 합성에 의해 드 노브(de novo)에서 생성될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법들에 의해 쉽게 조작될 수 있으며, 예를 들어, 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에서 복제될 수 있도록 설계될 수 있다. 또한, 다수의 벡터들은 진핵 세포의 형질전환에 사용될 수 있으며, 전체적으로 또는 부분적으로 이러한 세포의 게놈 내에 통합되어, 이들의 게놈 내에 원하는 핵산을 포함하는 안정한 숙주 세포를 제조할 것이다. 사용되는 벡터는 DNA 클로닝에 적합하며, 관심 핵산의 전사에 사용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 벡터는 예를 들어, 아데노벡터, 예컨대 Ad26 또는 Ad35, 알파바이러스, 파라믹소바이러스, 백시나 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등이다. 당업자는 적합한 발현 벡터를 선택하고, 본 발명의 핵산 서열을 기능적인 방식으로 삽입할 수 있다.

예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포 또한, 본 발명의 일부를 형성한다. 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 숙주 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 종양세포주, BHK 세포, 인간세포주, 예컨대 HEK293 세포, PER.C6 세포, 또는 효모, 균류, 곤충 세포 등, 또는 유전자이식 동물이나 식물에서 분자의 발현을 수반하는 재조합 DNA 기술을 통해 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 다세포성 유기체로부터 유래되며, 특정 구현예에서, 이들은 척추동물 또는 무척추동물 기원이다. 특정 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일반적으로, 숙주 세포에서 본 발명의 예비융합 RSV F 폴리펩타이드와 같은 재조합 단백질의 제조는, 발현가능한 포맷의 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종성 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입시키는 단계, 핵산 분자의 발현을 촉진하는 조건하에 세포를 배양하는 단계, 및 폴리펩타이드가 상기 세포에서 발현되도록 하는 단계를 포함한다. 발현가능한 포맷의 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 발현 카세트 형태일 수 있으며, 통상 핵산의 발현을 유도할 수 있는 서열, 예컨대 인핸서(들), 프로모터, 폴리아데닐화 신호 등을 필요로 한다. 당업자는, 다양한 프로모터들을 사용하여 숙주 세포에서 유전자의 발현을 수득할 수 있음을 알고 있다. 프로모터는 구성적이거나 조절적일 수 있으며, 바이러스, 원핵 공급원 혹은 진핵 공급원, 또는 인공적으로 설계된 공급원을 비롯한 다양한 공급원들로부터 수득될 수 있다.

세포 배양 배지는 다양한 판매회사들로부터 입수가능하며, 적합한 배지는 관심 단백질, 본원에서는 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 숙주 세포에 맞게 일상적으로 선택될 수 있다. 적합한 배지는 혈청을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다.

"이종성 핵산 분자"(본원에서, '이식유전자'로도 지칭됨)는 숙주 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산 분자이다. 이 핵산 분자는 예를 들어, 표준 분자생물학 기술에 의해 벡터 내에 도입된다. 이식유전자는 일반적으로, 발현 대조군 서열에 작동적으로 연결된다. 이는 예를 들어, 이식유전자(들)를 인코딩하는 핵산을 프로모터의 조절하에 위치시킴으로써 수행될 수 있다. 나아가, 조절 서열이 첨가될 수 있다. 다수의 프로모터들은 이식유전자(들)의 발현에 사용될 수 있으며, 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 이들은 바이러스 프로모터, 포유류 프로모터, 합성 프로모터 등을 포함할 수 있다. 진핵 세포에서 발현을 수득하는데 적합한 프로모터의 비제한적인 예는, CMV-프로모터(US 5,385,839), 예를 들어 CMV 전초기(immediate early) 프로모터, 예컨대 CMV 전초기 유전자 인핸서/프로모터로부터 -735 내지 +95의 뉴클레오타이드를 포함하는 프로모터이다. 소 성장 호르몬 폴리A 신호(US 5,122,458)와 같은 폴리아데닐화 신호는 이식유전자(들) 뒤쪽에 존재할 수 있다. 다른 예로, 몇몇 광범위하게 사용되는 발현 벡터는 당해 기술분야에서, Invitrogen사의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, BD Sciences사의 pMSCV 및 pTK-Hyg, Stratagene사의 pCMV-Script 등과 같이 상업적인 공급원으로부터 입수가능하며, 관심 단백질을 재조합에 의해 발현시키는 데 사용될 수 있거나, 적합한 프로모터 및/또는 전사 종결자 서열, 폴리A 서열 등을 수득하기 위해 사용될 수 있다.

세포 배양물은, 예를 들어, 배양 용기 또는 미립담체의 표면에 부착되는 세포와 같은 부착성 세포 배양물뿐만 아니라 현탁 배양물을 비롯하여 임의의 유형의 세포 배양물일 수 있다. 가장 대규모의 현탁 배양물은, 운용 및 규모 확대가 가장 간단하기 때문에, 회분식 또는 유가식 공정으로서 운용된다. 현재, 관류 원리를 토대로 하는 연속식 공정이 보다 보편화되고 있으며, 적합하기도 하다. 적합한 배양 배지 또한, 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일반적으로 상업적인 공급원으로부터 대량으로 수득될 수 있거나, 표준 프로토콜에 따라 맞춤-제조될 수 있다. 배양은 예를 들어, 접시, 회전병 또는 생물반응기에서 회분식, 유가식, 연속식 시스템 등을 사용하여 수행될 수 있다. 세포 배양에 적합한 조건은 공지되어 있다(예, 문헌[Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)] 및 문헌[R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition(Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)] 참조).

본 발명은 추가로, 상기 기술된 바와 같은 예비융합 RSV F 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은, RSV F 단백질의 예비융합 형태에는 존재하지만 융합후 형태에는 존재하지 않는 에피토프를 제시하는 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로, 상기 기술된 바와 같은 예비융합 RSV F 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 있어서, 본 발명에 따른 안정화된 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 및/또는 벡터의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 및/또는 벡터를 제공한다. 본 발명은 추가로, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터는 RSV 감염의 방지(예방) 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 방지 및/또는 치료는 RSV 감염에 취약한 환자군에서 표적화될 수 있다. 이러한 환자군은, 노인(예, 50세 이상, 60세 이상, 바람직하게는 65세 이상), 영아(예, 5세 이하, 1세 이하), 입원 환자, 및 항바이러스 화합물로 치료를 받은 적이 있으나 부적절한 항바이러스 반응을 나타낸 환자를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 및/또는 벡터는 RSV에 의해 유발되는 질병 또는 질환의 독립적인 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있거나, (기존의 또는 향후) 백신, 항바이러스제 및/또는 모노클로날 항체와 같은 다른 예방적 및/또는 치료적 치료와 조합하여, 사용될 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 및/또는 벡터를 사용하여 대상에서 RSV 감염을 방지 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 대상에서 RSV 감염을 방지 및/또는 치료하는 방법은, 상기 기술된 바와 같은 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 및/또는 벡터를 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료적 유효량은, RSV 감염에 의한 질병 또는 질환을 방지, 완화 및/또는 치료하는 데 효과적인, 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터의 양을 지칭한다. 방지는 RSV의 확산을 저해하거나 방지하는 것, 또는 RSV 감염과 연관된 하나 이상의 증상의 개시, 발병 또는 진행을 저해하거나 감소시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 완화는 RSV 감염의 가시적 또는 인지가능한 질병 증상, 바이러스혈증 또는 임의의 다른 측정가능한 징후의 감소를 지칭할 수 있다.

인간과 같은 대상에 투여하기 위해, 본 발명은 본원에 기술되는 바와 같은 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 핵산 분자 및/또는 벡터, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 이용할 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"이란, 담체 또는 부형제는 이용되는 투여량 및 농도에서 임의의 원하지 않는 효과 또는 유해 효과를, 이들이 투여되는 대상에서 유발하지 않을 것임을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체 및 부형제는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; 문헌[Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]] 참조). RSV F 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는 바람직하게는 멸균 용액으로서 제형화 및 투여되지만, 동결된 조제물을 이용하는 것 또한 가능할 수 있다. 멸균 용액은 멸균 여과 또는 당해 기술분야에 그 자체로 공지된 다른 방법에 의해 제조된다. 그런 다음, 용액은 동결되거나, 약제학적 투약 용기에 충진된다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 pH 9.5, 예를 들어 pH 5.0 내지 pH 7.5 범위이다. RSV F 폴리펩타이드는 전형적으로, 적합한 약제학적으로 허용가능한 완충제를 가진 용액에 존재하며, 조성물은 또한, 염을 함유할 수 있다. 선택적으로, 알부민과 같은 안정화제가 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 세제가 첨가된다. 특정 구현예에서, RSV F 폴리펩타이드는 주사용 조제물로 제형화될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 추가로, 하나 이상의 보강제를 포함한다. 보강제는 당해 기술분야에서, 적용되는 항원결정기에 대한 면역 반응을 추가로 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 용어 "보강제" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호호환적으로 사용되며, 면역계의 자극을 유발하는 하나 이상의 성분으로서 정의된다. 이러한 맥락에서, 보강제는 본 발명의 RSV F 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 사용된다. 적합한 보강제의 예로는, 알루미늄 하이드록사이드 및/또는 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 염; 스쿠알렌-물 에멀젼, 예컨대 MF59(예, WO 90/14837 참조)를 비롯한 오일 에멀젼 조성물(또는 수-중-유 조성물); QS21 및 면역자극 복합체(ISCOMS)(예, US 5,057,540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620 참조)와 같은 사포닌 제형; 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3-O-데아실화된 MPL(3dMPL), CpG-모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드, ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이체, 예컨대 E. coli 이열성(heat labile) 엔테로톡신 LT, 콜레라 독소 CT 등이 그 예인, 박테리아 유도체 또는 미생물 유도체; 수여자의 세포와 상호작용 시 면역 반응을 자극하는, 진핵 단백질(예, 항체 또는 이의 단편(예, 항원 자체 또는 CD1a, CD3, CD7, CD80에 대한 항체 또는 이의 단편)) 및 수용체에 대한 리간드(예, CD40L, GMCSF, GCSF 등)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 알루미늄, 예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 포타슘 포스페이트 또는 이들의 조합의 형태의 알루미늄을 보강제로서 포함하는데, 용량 당 알루미늄 함량이 0.05 mg 내지 5 mg, 예를 들어, 0.075 mg 내지 1.0 mg인 농도로 포함한다.

예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 또한, 폴리머, 리포좀, 비로좀(virosome), 바이러스-유사 입자와 같은 나노입자와 조합되거나 이에 공액되어 투여될 수 있다. 예비융합 F 폴리펩타이드는 보강제를 포함하거나 포함하지 않은 채, 나노입자와 조합, 나노입자에 피막화(encapsidation) 또는 나노입자에 공액될 수 있다. 리포좀 내에서의 캡슐화는 예를 들어, US 4,235,877에 기술되어 있다. 거대분자에의 공액은 예를 들어 US 4,372,945 또는 US 4,474,757에 개시되어 있다.

다른 구현예에서, 조성물은 보강제를 포함하지 않는다.

특정 구현예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 백신을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은, 본 발명에 따른 조성물을 제공하는 단계, 및 이 조성물을 약제학적으로 허용가능한 조성물로 제형화하는 단계를 포함한다. 용어 "백신"은, 소정의 병원체 또는 질병에 대한 소정의 정도의 면역성을 대상에서 유도하여, 병원체 또는 질병에 의한 감염과 연관된 증상의 중증도, 기간 또는 다른 징후들을 적어도 (완전한 부재까지) 감소시킬, 효과적인 활성 성분을 함유하는 제제 또는 조성물을 지칭한다. 본 발명에서, 백신은 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 및/또는 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 유효량으로 포함하며, RSV의 F 단백질에 대한 면역 반응을 초래한다. 이는, 입원을 초래하는 중증의 하기도 질병을 예방하고, 대상에서 RSV 감염 및 복제로 인한 폐렴 및 기관지염과 같은 합병증의 빈도를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 용어 "백신"은, 백신이 약제학적 조성물이며, 따라서 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함함을 시사한다. 백신은 추가적인 활성 성분을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 구현예에서, 백신은, 면역 반응, 예를 들어, RSV의 다른 단백질에 대한 면역 반응 및/또는 다른 감염제에 대한 면역 반응을 유도하는 다른 성분들을 추가로 포함하는 조합 백신일 수 있다. 추가적인 활성 성분의 투여는 예를 들어, 본 발명의 백신 및 추가적인 활성 성분의 개별 투여에 의해 또는 조합 생성물의 투여에 의해 수행될 수 있다.

조성물은 대상, 예를 들어, 인간 대상에 투여될 수 있다. 단일 투여용 조성물에서 RSV F 폴리펩타이드의 총 용량은 예를 들어 약 0.01 ㎍ 내지 약 10 mg, 예를 들어 1 ㎍ 내지 1 mg, 예를 들어 10 ㎍ 내지 100 ㎍일 수 있다. 권고 용량의 결정은 실험에 의해 수행될 것이며, 당업자에게 일상적인 것이다.

본 발명에 따른 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 비제한적인 구현예로는, 비경구 투여, 예컨대 피내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여 또는 점막 투여, 예를 들어, 비내 투여, 경구 투여 등을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 근육내 주사에 의해 투여된다. 당업자는, 백신에서 항원(들)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해, 백신과 같은 조성물을 투여하는 다양한 가능성들을 알고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 대상은 바람직하게는 포유류, 예컨대, 마우스, 코튼랫과 같은 설치류, 또는 비인간-영장류, 또는 인간이다. 바람직하게는, 대상은 인간 대상이다.

폴리펩타이드, 핵산 분자, 벡터 및/또는 조성물은 또한, 상동성 또는 이종성 프라임-부스트 치료계획에서 프라임으로서 또는 부스트로서 투여될 수 있다. 부스팅 백신접종이 수행되는 경우, 전형적으로 이러한 부스팅 백신접종은, 대상에게 처음 조성물을 투여한 후(이러한 경우, '프라이밍 백신접종'으로 지칭됨), 1주 내지 1년 사이에, 바람직하게는 2주 내지 4개월 사이에 동일한 대상에게 투여될 것이다. 특정 구현예에서, 투여는 프라임 투여 및 적어도 1회의 부스터 투여를 포함한다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체가 개체의 혈청에 존재하는지 구축함으로써 이러한 개체의 면역 상태를 시험하기 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자에서 RSV 감염의 존재를 검출하는 시험관 내 진단 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, a) 상기 환자로부터 수득된 생물학적 검체를 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 b) 항체-폴리펩타이드 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가로, 야생형 RSV F1 도메인과 비교하여 RSV F1 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 도입시키는 단계를 포함하는, RSV F 폴리펩타이드의 예비융합 형태를 안정화시키는 방법을 제공하며, 여기서, 하나 이상의 돌연변이는 하기의 (a) 내지 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) 융합후 F에서 하나의 큰 꼬인 코일로 형질전환되는 예비융합 F에서 2차 구조 요소들 사이의 HRA 영역에서의 안정화 돌연변이; 및

(b) 예비융합 RSV-F 헤드 N-말단의 하단부에서 3-배 축에 근접한 2개의 시스테인 잔기들의, 삼량체에서 F1 하위단위를 공유 가교하는 예비융합 줄기(잔기 493 내지 525), HRB의 N-말단)로의 도입.

특정 구현예에서, HRA 영역에서의 돌연변이는 161번째 위치에서이다.

특정 구현예에서, HRA 영역에서의 돌연변이는 173번째 위치에서이다.

특정 구현예에서, HRA 영역에서의 돌연변이는 182번째 위치에서이다.

특정 구현예에서, 2개의 시스테인 잔기의 도입은 486번째 및 489번째 위치에서이다.

특정 구현예에서, 2개의 시스테인 잔기의 도입은 486번째 및 487번째 위치에서이다.

이러한 방법에 의해 수득가능하고/하거나 수득되는 안정화된 예비융합 RSV F 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이 본 발명의 일부뿐만 아니라 이의 용도를 형성한다.

본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 설명된다. 실시예는 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하지 않는다. 이들은 단지 본 발명을 명료하게 하는 작용을 한다.

실시예

실시예 1

안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드 - 링커 및 삼량체화 도메인의 제조

동시 계류중인 특허 출원 PCT/EP2014/058353에서, 가용성 예비융합 F 단백질(sF)의 안정화된 변이체는 리폴딩을 개시하는 2개의 주요한 영역들을 안정화시킴으로써 설계되었다. 처음 전략은 융합 펩타이드를 이의 위치에 고정하고, F1-F2 도메인을 길이가 짧은 루프에 의해 고정하고 접합시킴으로써 펩타이드가 헤드 영역으로부터 방출되지 못하게 하는 것이다. 융합 펩타이드의 방출은 F1의 N-말단의 F2의 C-말단에의 공유 연결을 재구축함으로써 방지될 수 있다. 이 실시예에 나타낸 바와 같이, 몇몇 상이한 링커들을 시도하였다. F1과 F2 사이에 5개 아미노산의 루프, 특히 아미노산 서열 GSGSG(SEQ ID NO: 5)를 포함하는 루프를 삽입하는 것이 가장 성공적이었다.

다른 불안정 영역은, 예비융합 F 단백질에서 삼량체형의 나선형 줄기 영역을 형성하는 제2의 헵타드 반복(HRB) 영역이다. 가용성 F 단백질에서 막관통 도메인(TM)의 결실은 이 영역을 더 불안정화시키며, 이는 상이한 이종성 삼량체화 도메인의 첨가에 의해 보상되었다. 완전히 가공된 성숙한 RSV-F 엑토도메인을 상이한 위치에서 상이한 삼량체화 도메인에 C-말단에 의해 융합하였다(즉, F1 도메인을 상이한 아미노산 잔기에서 절단하였음).

몇몇 구축물들을 RSV A2 균주 또는 B1 균주를 토대로 제작하였다. 상이한 삼량체화 도메인을, 상이한 위치에서 절단한 RSV F1 도메인에 연결하였다. 시험한 삼량체화 도메인은 피브리틴 모티프(아미노산 서열: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 4)를 포함함), 및 이의 천연 나선형 영역을 포함하며 N-말단이 연장된 더 긴 피브리틴 도메인인 "길이가 더 긴 피브리틴" 모티프(아미노산 서열: SSLQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 6)를 포함함)를 포함하였으며, 이는 HRB 영역의 추정된 헵타드 반복체를 포함하는 프레임 내에서(레지스터 내에서) RSV F1 도메인에 첨가되었다.

제작된 추가적인 구축물은, 헵타드 이상적인 나선형 삼량체형의 꼬인 나선, 또는 아미노산 서열: IEAIEKK(SEQ ID NO: 7)를 포함하는 이소류신 지퍼 도메인 (IZ)(문헌[Suzuki et al., Protein Engineering 11: 1051-1055 (1998)])을 포함하였다. 본 발명에 따르면, 아미노산 서열: (I)EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 이소류신 지퍼(L), 및 아미노산 서열 EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(SEQ ID NO: 3)를 포함하는 이소류신 지퍼(S)로 지칭되는 상이한 IZ 도메인을 사용하였다.

이들 IZ 도메인은 구조 면에서 GCN4와 유사하나, IZ 도메인은 천연 서열이 아니지만 최적의 삼량체화 도메인이며 따라서 보다 안정한 것으로 설계된다.

추가적인 구축물을 다른 공지된 삼량체화 도메인을 사용하여 제작하였다:

하기의 구축물을 제작하였다:

구축물 F18은 F1 도메인의 아미노산 잔기 513에 연결된 피브리틴 삼량체화 도메인(SEQ ID NO: 4)을 포함하였다.

구축물 F19는 F1 도메인의 아미노산 잔기 499에 연결된 피브리틴 삼량체화 도메인(SEQ ID NO: 4)을 포함하였다.

구축물 F20은, F1 도메인의 아미노산 잔기 516에 연결되며, 헵타드 위치의 소수성 성질을 최적화하고 IZ 도메인과의 인-플레임 융합을 촉진하기 위해 HRB에 부가적인 변형을 포함하는, 이소류신 지퍼(L) 도메인(SEQ ID NO: 8)을 포함하였다.

구축물 F21은 또한, F1 도메인의 아미노산 잔기 501에 연결되며, HRB 영역에 부가적인 변형을 포함하지 않는, 이소류신 지퍼(L) 도메인(SEQ ID NO: 8)을 포함하였다.

구축물 F22는, F1 도메인의 아미노산 잔기 495에 연결되고 HRB 영역에 부가적인 변형을 포함하는, 이소류신 지퍼(L) 도메인(SEQ ID NO: 8)을 포함하였다.

구축물 F23은 아미노산 잔기 495에 연결된 이소류신 지퍼(S) 도메인(SEQ ID NO: 3)을 포함하였다.

구축물 F46은 또한, 이소류신 지퍼(S) 도메인(SEQ ID NO: 3)을 포함하지만, 더 긴 RSV-F 엑토도메인에 연결되었는데, 즉, F1 도메인은 아미노산 잔기 513 뒤에서 절단되었다.

모든 구축물들은 HIS-태그를 포함하였다.

구축물을, 항체 CR9501의 발현 수준, 보관 안정성 및 항체 결합에 대해 시험하였다. 이 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 하기에 제공한다. CR9501은 WO2012/006596에서 58C5로 지칭되는 항체의 결합 영역을 포함하였다.

구축물을 Gene Art(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 Life Technologies)에서 합성하고 코돈-최적화하였다. 구축물을, pCDNA2004 내로 클로닝하거나, 부위-특이적인 돌연변이화 및 PCR을 수반하는 기술분야에서 광범위하게 공지된 표준 방법에 의해 제조하고, 서열화하였다. 사용된 발현 플랫폼은 293Freestyle 세포(Life Technologies)였다. 세포를, 293Fectin(Life Technologies)를 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 일시적으로 형질감염시키고, 37℃ 및 10% CO2에서 5일 동안 배양하였다. 배양 상층액을 수집하고, 300 g에서 5분 동안 회전시켜, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 후속해서, 회전된 상층액을 0.22 um 진공 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.

제5일째의 상층액을, RSV F 항체 모타비주맙(Motavizumab)(CR9503으로 지칭됨)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 CR9503을 사용한 웨스턴 블롯에 의해 F 단백질 발현에 대해 평가하였다. 예비융합 RSV F 단백질 구축물의 적절한 발현 수준을, CR9503, 항-인간 IR-염료가 공액된 이차 항체(미국 네브라스카 링컨 소재의 Li-Cor) 또는 HRP가 공액된 마우스 항-인간 IgG(미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 평가하였다. 그런 다음, 단백질 양을, 정제된 RSV 표준 단백질의 희석 시리즈를 사용하여, 눈으로 또는 Odyssey CLx 적외선 영상 시스템에 의해 추정하였다. 구축물의 안정성을 평가하고, 도입된 삼량체화 모티프의 양성 또는 음성 안정화 효과를 확인하기 위해, CR9501에 결합할 수 있는 구축물을 45℃ 내지 65℃의 온도 범위에서 30분 동안 처리하여, CR9501 에피토프의 안정성을 시험하였다. 이 절차는 실시예 9에 상세히 기술되어 있다. 그 결과를 표 1에 요약한다.

표 1에서 알 수 있듯이, 발현된 유일한 구축물은 피브리틴 변이체(F18) 및 F23이었다. F18이 삼량체이며 발현을 나타내긴 하였지만, 4℃에서 보관 시 불안정하였다. 이와는 달리, F23은 4℃에서 안정하였으며, 예비융합-특이적인 항체에 결합하지만, 단량체인 것으로 보였다. 따라서, 변이체 F18 및 F23 둘 다를 사용하여, 안정성 및 삼량체화 둘 다에 대해 최적화하였다.

다음, F1의 N-말단에서 융합 펩타이드를 F2 도메인의 C-말단에 융합시킴으로써 고정한 몇몇 구축물들을 제작하였다. 모든 구축물들은 HIS-태그를 포함하였다. 2개의 퓨린 절단 부위 모두에서 돌연변이화되어, p27 펩타이드를 여전히 함유하는 가용성 F 단백질(즉, F12, F15.1 및 F17)을 제조하는 구축물들을 비롯하여 몇몇 구축물들을 제작하였다. 다른 구축물들에서, RSV-F의 영역을, 성공적으로 제조되고 결정화된 예비융합 F 단백질(F25)인 PIV-5 F의 '상동성' 영역으로 대체함으로써, 또는 해당 영역을 F2 및 F1(F24)의 말단을 가교할 최소의 (GS)n 루프로 대체함으로써, 또는 해당 영역을 RSV-G(F26)의 중심의 보존된 영역으로 대체함으로써, 전구체 F0로부터 절단되는 27개의 잔기 영역(P27 루프)을 다른 밀폐형 루프로 대체하였다. PIV-5를 토대로 하는 RSV-F의 상동성 모델링 및 인 실리코(in silico) 측정을 통해, 잔기 108과 잔기 136 사이의 5개 아미노산 잔기의 최소 루프를 선택하였다. 링커로서, 유연성이 있으며 극성이고 적응력(F24)이 높은 Gly(G) 및 Ser(S) 잔기를 선택하였다. 부가적으로, F137을, 루프에 의해 유발되는 국소 변형이 소수성 F를 대체할 수 있으며 불안정화를 유발할 수 있기 때문에, S로 돌연변이화하였다. 이는 하기에 나타나 있다. 또한, R106을 Q로 돌연변이화하고, 27개의 잔기(109 내지 135)를 GSGSG로 대체한다.

표 2에서 나타난 바와 같이, 야생형 RSV F 구축물, 즉, 상기 링커(F11)를 포함하지 않는 유사한 구축물과 비교하여, 훨씬 더 높은 발현(44 ㎍/ml)을 나타낸 길이가 더 짧은 GSGSG 루프(F24)를 포함하는 변이체를 제외하고는, 모든 변이체들은 발현을 전혀 나타내지 않거나 또는 매우 낮게 나타내었다. 그러나, 삼량체인 F24는, C-말단 피브리틴 삼량체화 모티프를 포함하는 다른 모든 변이체들과 마찬가지로 보관 시 불안정하였다. 모든 변이체들은 HIS-태그를 포함하였다.

다음, 가장 유리한 변형을 조합하여, 최적의 예비융합 F 폴리펩타이드를 발견하였다. 조합체들은, GSGSG 루프를 포함하는 변이체, F1의 C-말단 절단, 및 피브리틴(SEQ ID NO: 4) 또는 이소류신 지퍼(S) 모티프(SEQ ID NO: 3)의 첨가를 이용하여 제작하였다(표 3 참조).

GSGSG-루프의 첨가는 항상, 기능성 구축물의 발현뿐만 아니라 단백질의 열 안정성을 증가시켰다. GSGSG-루프와 절단된 F 및 이소류신 지퍼(S) 모티프(F43, F47)의 조합은 양호한 발현, 열 안정성, 및 4℃에서 보관 시 양호한 안정성을 보여주었다. 그러나, 이들 변이체는 여전히 단량체형이었다. 이소류신 지퍼(S) 삼량체화 모티프는 495번째 위치에서 C-말단이 절단된 F인 F 변이체와 함께 더 높은 발현을 나타내었다(F43을 F56과 비교하고 F23을 F46과 비교함). 이와는 달리, 피브리틴 삼량체화 도메인을 포함하는 변이체의 경우, 513번째 위치에서의 절단은 발현을 나타내지 않은 495번째 위치에서의 절단과 비교하여 높은 발현을 나타내었다(F24를 F44와 비교함).

HIS-태그는 삼량체의 고유한 폴딩을 방해할 수 있기 때문에, 피브리틴 및 이소류신 지퍼(S) 변이체의 경우 HIS-태그를 포함하지 않는 변이체를 제작하였다(표 4).

놀랍게도, HIS-태그의 결실은 F47에서 발현을 증가시켰다. 더욱이, F47의 경우, HIS-태그의 결실은 삼량체 함량을 약간 증가시켰으며, F24의 경우, 발현 수준만 적당히 증가시켰다.

다음, 몇몇 다른 삼량체화 도메인 및 절단을 GSGSG-루프 안정화된 F 변이체(F47)와 조합하여 시험하였다(표 5 참조). 모든 변이체들은 GSGSG-루프를 가지며, HIS-태그를 함유한다.

잠재적으로 내부 삼량체형 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기와 함께 C-말단 부분 및 N-말단 지퍼 도메인 둘 다 함유하는 마트릴린(마트릴린) 1 도메인(문헌[Dames-SA et. al., Nat. Struc. Biol., 5(8), 1998])은 F47보다 더 높은 수준으로 발현시킬 수 있는 것으로 확인되었다(표 5, 길이가 더 긴 마트릴린). 더욱이, 길이가 더 긴 마트릴린 삼량체화 모티프를 포함하는 변이체는 삼량체 F 단백질을 나타낸다. 그러나, 생성물은 예비융합 특이적인 Mab CR9501에 결합하지 않았으며, 또한, 마트릴린 1 삼량체화 도메인을 삼량체 고유의 F 단백질의 제조에 적합하지 않게 하는 육량체형 화학종을 나타내었다. 마트릴린-기재의 지퍼 모티프 또는 GCN4II-기재의 지퍼 모티프 둘 중 어느 것도 F47에 대해 증가된 발현 또는 안정성을 나타내지 않았다(표 5, 길이가 더 짧은 마트릴린, 최적화된 GCN4II). 또한, 495번째에서의 절단은 발현 수준을 더 높였다. 최적화된 유도 서열을 함유한 GCN4 모티프를 첨가하면, 발현이 나타나지 않았다.

GCN4 II는, 파라인플루엔자 5형의 예비융합 삼량체의 안정화에 성공적으로 사용되는 삼량체화 도메인(문헌[Yin et al., Nature 439:38-44, 2006])이며, RSV 예비융합 F를 안정화시키기 위해 다른 것들에 의해서도 시도된 바 있다(예를 들어, WO2010/149743, WO2010/14975, WO2009/079796, WO2010/158613에 개시된 바와 같음). GCN4II 삼량체화 도메인을 평가하고, 이소류신 지퍼(S) 도메인(SEQ ID NO: 3) 또는 피브리틴(SEQ ID NO: 4) 도메인을 함유하는 구축물과 비교하였다(결과는 표 6에 나타나 있음). 이들 변이체를 또한 다른 변형, 즉, L512K 돌연변이 및 단일 라이신을 기재로 하는 길이가 짧은 링커와 비교하였다. 모든 변이체들은 HIS-태그를 함유하였다.

F1과 F2 사이의 짧은 연결은 GSGSG 루프와 유사하게 나타난다. GCN4II 모티프를 첨가하면, 시험된 구축물들 중 임의의 구축물에서 임의의 F 단백질 발현을 나타내지 않는다(즉, WO2010/149743 또는 WO2010/149745에 기술된 RSV A2 F 서열, 본 발명에 따라 사용되는 RSV A2 F 서열, 또는 RSV B1 F 서열도 아님).

이들 2가지 유형의 변형의 도입, 즉, 연결 서열 및 이종성 삼량체화 도메인의 도입은 안정한 삼량체 예비융합 F 단백질을 발현시킬 수 있기에는 불충분한 것으로 나타났다. 상기 기술된 바와 같이, 안정화된 불안정성의 2가지 주요 영역, 즉, HRB 및 융합 펩타이드와는 별도로, 예비융합 F 단백질 내의 다른 영역들은 융합 후 F로의 급격한 리폴딩에 기여하고/하거나 제공하며, 서열 내의 더 많은 위치들은 예비융합 F 단백질이 리폴딩되지 않도록 최적화될 수 있다. 따라서, HRA 도메인과 HRB 도메인, 및 예비융합 F 내의 이들 영역과 접촉하는 모든 도메인들에서, 예비융합 구조 안정성을 증가시키기 위해, 상이한 아미노산 잔기를 하기의 실시예에서 기술된 바와 같이 돌연변이화시켰다.

실시예 2

안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드의 제조 - 안정화 돌연변이

삼량체 함량(구축물 F47의 경우) 및 보관 안정성(구축물 F24의 경우)은 최적이지 않았기 때문에, 발현 수준, 안정성 및 고유의 삼량체형 구조를 증가시키기 위해 점 돌연변이를 함유한 추가적인 변이체를 제작하였다. 그 결과를 표 7 및 표 8에 나타낸다.

야생형 서열(SEQ ID NO: 1)을 토대로 한 돌연변이의 명명법.

모든 구축물들은 F47-의 변이체였다: A2형, 이소류신 지퍼(S) 모티프(SEQ ID NO: 3), GSGSG 링커; 종결점 495, HIS-태그 무함유(SEQ ID NO: 16). 표 7에 나타낸 바와 같이, 많은 돌연변이들은 F47-의 발현을 증가시켰으나, 변이체 F47_S46G만이 높은 발현 외에도 보다 높은 수준의 삼량체를 또한 나타내었다.

표 8은 F24 변이체의 발현 및 안정성의 결과를 보여준다. 모든 변이체들은, RSV A2형, 피브리틴 모티프, GSGSG 링커; 종결점 513, HIS-태그 무포함이었다.

많은 돌연변이들은 A2_F24-의 발현을 증가시켰다. 대부분의 돌연변이의 경우, F47- 백그라운드(표 7)에서의 발현 향상과 A2_F24- 백그라운드(표 8)에서의 발현 향상 사이에 분명한 상관관계가 있었다. N67I는 A2_F24- 백그라운드에서 F 발현에 보다 긍정적인 영향을 미쳤다. 가장 두드러진 발현 증가는 단일 점 돌연변이를 가진 경우 수득되었다: S46G, S215P, N67I, K80E, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, K77E, K201Q, N426S 및 K465Q. 종점 안정성 분석법을 사용한 초기의 스크리닝(실시예 8)에서, 가장 발현율이 높은 변이체는 마찬가지로 보관 시에도 가장 양호한 안정성을 나타내었다(E92D, K465Q, K465E, N426S, S46G, S215P 및 N67I). 이들 돌연변이가 사실상 예비융합 형태를 안정화시켰는지 평가하기 위해, 배양 상층액을 정량적 웨스턴 결과를 토대로 5 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml로 희석시키고, 이들을 4℃에서 33일까지 보관하였다. 단일 점 돌연변이체로서, 오로지 N67I 및 S215P만 시간이 지남에 따라 완전히 안정하였다(실시예 10 참조).

후속해서, 예비융합 형태의 높은 발현 및 양호한 안정성을 나타낸 몇몇 돌연변이들을 조합하여, 안정화가 상가작용성인지 또는 가능성 있는 상승작용 효과를 가졌는지 평가하였다(표 9).

모든 변이체들은 F24-의 변이체였다: A2형, 피브리틴 모티프, GSGSG 링커; 종결점 513, 모든 Mab에 결합함, HIS-태그 무함유(SEQ ID NO: 19).

이전에 확인된 점 돌연변이들을 조합한 경우, 가장 강력한 것으로서 N67I를 포함하는 조합들을 이용한 경우 매우 흥미로운 상승작용 효과가 특히, 발현 수준의 면에서 관찰될 수 있었다. N67I 또는 S215P를 포함하는 제조된 모든 이중 돌연변이체들은 4℃에서 30일 넘게 보관한 후에도 안정하였다(실시예 10). 놀랍게도, 돌연변이 N67I는 이중 돌연변이체에서 포함된 경우, 예비융합 F의 발현 수준에 가장 강력한 효과를 가지는 것으로 확인되었다. 다음, S215P 돌연변이와의 조합은 합당한 발현을 유도하였다. N67I와 S215P의 조합은 매우 높은 발현 수준을 초래하고, 두 점 돌연변이 모두 보관 시 안정하기 때문에, 선택하였다. 부가적으로, 단일 돌연변이가 불안정하기 때문에, N67I 및 S215P 둘 다 돌연변이체들 중 일부를 안정화시키는 능력을 가지고 있는 것으로 관찰되었으며, 이는, 이들 2개의 돌연변이가 발견되는 영역은, 단백질이 융합후 형태로 전환되는 동안 겪게 되는 형태 변화의 가장 중요함을 가리킨다.

따라서, 적어도 일부 돌연변이들은 예비융합 RSV 단백질의 발현 수준을 증가시키고 안정화를 증가시킨 것으로 나타났다. 이들 현상은 연결되어 있는 것으로 예상된다. 이 실시예에서 기술된 돌연변이들은 모두 예비융합 F 폴리펩타이드의 제조를 증가시켰다. 이들 폴리펩타이드를 선택한 것만이 장기간 보관 시 안정하게 유지되었다(실시예 10 참조). 사용한 안정성 분석법은, 결합 분석법에서 예비융합 F 단백질의 최상부에 있는 예비융합 특이적인 CR9501 에피토프의 손실을 토대로 하며, 전체 단백질의 안정성에 대한 모든 기여사항을 측정할 정도로 충분히 민감하지는 않을 수 있다. 따라서, 유일하게 증가된 발현이 관찰된 돌연변이는, 다른 안정화 돌연변이와 조합되어 높은 안정성 및 높은 발현 수준을 가진 예비융합 F 구축물을 수득할 수 있는 잠재적인 (안정화 경향이 매우 높은) 돌연변이이다.

다음, 단일 돌연변이체는 사용한 범주를 토대로 불안정한 것으로 여겨졌기 때문에, N67I - S215P 이중 돌연변이가 단일 돌연변이와 마찬가지로 점 돌연변이를 안정화시킬 수 있는지 입증하였다. 여분의 돌연변이는 표 8에 따른 유리한 발현 수준 및 안정성을 토대로 선택하였다. 삼중 돌연변이체 RSV-F 변이체들을 구축하고, 발현 수준 및 안정성에 대해 시험하였다(표 10).

모든 변이체들은 A2_F24_N67I +S215P A2형, 피브리틴 모티프, GSGSG 링커; 종결점 513, 모든 Mab에의 결합, HIS-태그 무함유(SEQ ID NO: 21)의 변이체였다.

*안정성은 실시예 10에 예시된 연관 상 분석을 지칭한다.

+는 5일 후 CR9501 결합의 손실이 10% 미만임을 의미하며; ++는 5일 후 CR9501 결합의 손실이 5% 미만임을 의미하며; +++는 5일 후 CR9501 결합의 손실이 0%임을 의미한다.

다시, 발현 수준에 대한 상가 효과를 관찰하였다. 예상되는 바와 같이, D479N 및 E487R 삼중 돌연변이체는, 단일 돌연변이체가 선택된 돌연변이 중 가장 낮은 것들이었기 때문에, 다소 더 낮은 수준으로 발현한다(표 8). N67I+S215P 돌연변이의 안정화 효과때문에, 단일 돌연변이체로서 불안정한 부가적인 돌연변이는, A2_F24 N67I+S215P 백그라운드에 첨가되는 경우 안정한 예비융합 F 변이체를 제조하였다. 일부 매우 예시적인 예들은 부가적인 V185N, G184N 또는 E487N을 포함하는 삼중 돌연변이체로서, 단일 돌연변이체(표 8)와 같이 높은 발현을 나타내지만 낮은 안정성을 나타내며, 그러나, A2_F24 N67I+S215P 백그라운드에 첨가되는 경우 훨씬 더 높은 발현을 나타내고 매우 안정하였다.

안정화 돌연변이는 다른 균주 유래의 RSV-F 단백질을 안정화시키고, 또한 가공된 F 변이체에 존재한다.

예비융합 형태의 높은 발현 및 양호한 안정성을 나타낸 몇몇 돌연변이들을 다른 균주의 RSV F 단백질에 적용하고, 퓨린 절단 부위 돌연변이를 포함하지 않는 RSV A2 F 변이체(F18: SEQ ID NO 71)에 적용하여, RSV 예비융합 F를 안정화시키기 위한 만능 용액인지 평가하였다(표 11).

이전에 확인된 점 돌연변이를 A2_F18(SEQ ID No. 71)에 도입한 경우, 안정성 및 발현 수준은, F1과 F2 사이에 길이가 짧은 루프를 함유하는 단일 사슬 F24(SEQ ID No. 21) 변이체와 비교하여 매우 유사하였다. 또한, N67I 또는 이중 돌연변이 N67I, S215P를 함유하는 변이체에 돌연변이를 첨가한 경우, 더 높은 발현 및 안정성을 나타내는 상승작용이 관찰되었다. 이중 점 돌연변이 N67I, S215P는 A2 균주의 예비융합 F를 안정화시켰을 뿐만 아니라, B1 균주 및 CL57-v224 균주의 예비융합을 안정화시켰다(표 11).

안정화 돌연변이는 또한, 전장 RSV-F 단백질을 안정화시킨다.

엑토도메인에 상응하는 가용성 버전의 RSV-F에서 예비융합 형태의 높은 발현 및 양호한 안정성을 나타낸 몇몇 돌연변이들을 전장 RSV-F 단백질에 적용하였다. 돌연변이를, 퓨린 절단 부위 돌연변이를 포함하는 전장 RSV-F 또는 포함하지 않는 전장 RSV-F에 도입하였다. 삼량체화 도메인은 이들 변이체에 융합시키지 않았다(표 12).

이전에 확인된 안정화 점 돌연변이는 또한, 전장 F 단백질에서 안정화하였다. 발현 수준의 증가는 그다지 우세하지 않았지만, 동일한 경향을 나타내었다. 이는, 돌연변이가 도입된 상이한 백그라운드에 의해 유발될 수 있지만, 상이한 정량화 방법(FACS 대 웨스턴 블롯), 및 표면 단백질의 재순환으로 인한 발현의 생물학적 최대에 의해 유발될 수 있다. 연결 서열(또는 길이가 짧은 루프)을 도입하면, 발현 및 안정성을 증가시켰으며, 점 돌연변이 또한 마찬가지였다. 점 돌연변이는 길이가 짧은 루프와 상승작용이 없거나 또는 거의 없었다(가용성 단백질에서 확인한 것과 유사함)(표 9 내지 표 11).

67번째 위치에서의 점 돌연변이는 발현 수준 및 안정성에 이러한 긍정적인 효과를 미치기 때문에, 모든 아미노산 치환들을 이 위치에서 시험하여, 가장 최적인 것을 선택했는지 또는 이들 위치가 향상될 수 있는지 연구하였다(표 13).

표 13에서 보여지는 바와 같이, 주로 소수성 잔기, 특히 67번째 위치에서 Ile, Leu 및 Met은 발현 및 안정성을 증가시킬 수 있었다. Ile은 발현 및 안정성을 가장 증가시킨 잔기이다. 잔기 Glu 및 Gln, 가장 작은 잔기 Gly 및 양전하성 잔기 Arg 및 Lys은 예비융합 형태에서 67번째 위치에서 가장 불안정화시키는 효과를 가졌다.

실시예 3

본 발명에 따른 안정한 예비융합 RSV F 폴리펩타이드의 제조

본 발명을 이끈 연구에서, 리폴딩을 개시하는 2개의 주요 영역을 안정화시킴으로써, 가용성 예비융합 F 단백질(sF)의 추가적인 안정화된 변이체를 설계하였다. 제1 전략은, HRA 영역을 꼬인 코일로 리폴딩하는 것을 방지하는 것이었다. 제2 전략은, HRA 꼬인 코일 상에 위치시킴(docking)으로써 6개의 나선 묶음(bundle)을 형성하기 위해, HRB의 재위치화를 방지하고자 HRB에 대한 N-말단에 이황화 결합을 구축하는 것이었다.

구축물을, 발현 수준, 보관 안정성 및 항체 CR9501과의 항체 결합에 대해 시험하였다. 이 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열은 하기에 주어진다. CR9501은 WO2012/006596에서 58C5로서 지칭된 항체의 결합 영역을 포함한다.

구축물을 합성하고, Gene Art(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Life Technologies)에서 코돈-최적화하였다. 부위-특이적 돌연변이화(site-directed mutagenesis) 및 PCR을 비롯하여 해당 분야에서 광범위하게 공지된 표준 방법에 의해, 구축물을 pCDNA2004 내로 클로닝하거나, 생성 및 서열화하였다. 사용된 발현 플랫폼은 293Freestyle 세포(Life Technologies)였다. 세포는, 293Fectin(Life Technologies)을 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 일시적으로 형질감염시키고, 37℃ 및 10% CO2에서 5일 동안 배양하였다. 배양 상층액을 수집하고, 300 g에서 5분 동안 회전시켜, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 후속해서, 회전시킨 상층액을 0.22 ㎛ 진공 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 사용 시까지 4℃에서 보관하였다.

제5일째의 상층액을, RSV F 항체 모타비주맙(CR9503으로서 지칭됨)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 CR9503을 사용한 웨스턴 블롯에 의해 F 단백질 발현에 대해 평가하였다. 예비융합 RSV F 단백질 구축물의 적절한 발현 수준을, CR9503, 항-인간 IR-염료가 공액된 2차 항체(미국 네브라스카 링컨 소재의 Li-Cor) 또는 HRP가 공액된 마우스 항-인간 IgG(미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 평가하였다. 그런 다음, 단백질 양을, 정제된 RSV 표준 단백질의 희석 시리즈를 사용하여, 눈으로 또는 Odyssey CLx 적외선 영상 시스템에 의해 추정하였다. 구축물의 안정성을 평가하고, 도입된 삼량체화 모티프의 양성 또는 음성 안정화 효과를 확인하기 위해, 구축물을 4℃에서 5일, 14일 또는 30일 동안 보관한 후, 예비융합-특이적 항체에의 결합에 대해 시험하였다. 이 절차는 실시예 10에 상세히 기술되어 있다.

다음, 최적의 예비융합 F 폴리펩타이드를 찾기 위해, 가장 선호적인 변형들을 조합하였다. 조합들은, GSGSG 루프를 가진 변이체, F1의 C-말단 절단을 가진 변이체 및 피브리틴(SEQ ID NO: 4)의 첨가를 가진 변이체를 사용하여 제조하였다. 발현 수준, 안정성 및 고유의 삼량체 구조를 증가시키기 위해 점 돌연변이를 함유한 변이체들을 제조하였다. 모든 변이체들은 RSV 유형 A2였으며, 피브리틴 모티프, GSGSG 링커; 종결점 5I3을 가졌으며, HIS-태그는 가지지 않았다.

본 발명에 따르면, RSV F 단백질의 예비융합 형태를 안정화시키는 아미노산 돌연변이를, 형태를 상이한 방식으로 안정화시키는 상이한 범주로 나눌 수 있다.

아미노산 잔기 I6I, I73, I74, I82 및 214

예비융합 형태로부터 융합후 형태로 리폴딩되기 위해, 잔기 160과 잔기 215 사이의 영역은 나선, 루프 및 가닥의 조립으로부터 긴 연속적인 나선까지 변환되어야 했다. 이 영역은 가장 급격한 구조 전환을 나타낸다. 이 영역의 일부는 사실상 가장 높은 알파-나선 예측을 가진다. 예비융합 결정 구조에서 실제의 나선형 구조는 하기에서 회색으로 강조되어 있다. 이 전 영역은, 융합후 형태로 리폴딩될 때, 하나의 큰 나선으로 변환된다. 하단의 서열에서, 잔기는 회색으로 강조되어 있으며, 가장 높은 나선 예측은 Agadir(http://agadir.crg.es/)를 토대로 한다. 이 비교를 통해, 예비융합 형태(잔기 187 내지 202)에서 베타-헤어핀, 연결 루프 및 나선으로 유지되는 C-말단 부분은 알파-나선을 형성하는 경향이 높음이 명확해진다.

밑줄 친 잔기들은 Ramachandran-플롯에 따라 비뚜름한 각도(bad angle)를 가진다.

RSV-F의 잔기 150 내지 212의 서열은 상기에 나타나 있다. 두번째 줄에서, 상단의 줄의 이차 구조는 결정 구조를 토대로 h(나선의 경우) 및 s(가닥의 경우)로 표시되어 있다. 나선들은 회색 음영으로 강조되어 있다. 하단의 줄은, 나선이 서열의 나선 경향을 토대로 회색 음영으로 표시되어 있는 동일한 서열이다.

최적화를 필요로 하는 영역은, 예비융합 RSV-F의 불안정한 HRA에서 2차 구조 요소들(나선 및 가닥) 사이의 루프 영역이다.

RSV-F의 예비융합 형태를 안정화시키기 위한 최적화를 필요로 하는 HRA에서의 위치들 중 하나는, 나선 α2(잔기 148 내지 157)와 α3(잔기 163 내지 172) 사이의 턴에서 161번째 위치이다. 이 위치의 최적화가 이 영역의 안정성을 증가시킬 수 있는 이유로는 몇 가지가 있다:

- 턴은 Glu161의 음전하를 Glu163의 음전하에 근접시킴으로써, 음전하 반발을 불안정화시킨다;

- Ramachandran 플롯은, 잔기 161이 불량한/바람직하지 못한 이면각(dihydral angle)을 가짐을 보여준다;

- 잔기 161은 높은 이동성을 반영하는(및 불안정성을 제시하는) 높은 B-인자를 가진다;

- 잔기 160 내지 172는 높은 나선 경향을 나타낸다.

이 실시예에서, 음전하 반발을 감소시키며 턴을 안정화시키고 턴이 리폴딩되지 않도록 방지하기 위해 잔기 Glu161을 Pro으로 대체하였거나, 음전하 반발을 감소시키깅 위해 잔기 Glu161을 Gln으로 대체하였거나, Gly은 보다 넓은 이면각 범위를 허용하기 때문에 잔기 Glu161을 Gly으로 대체하였다.

α2 - 턴 - α3(잔기 153 내지 168)의 영역의 경우, 바람직하지 못한 Glu161을 대체할 수 있는 잔기를 찾기 위해, 리폴딩되지 않는 안정한 단백질 유래의 구조적으로 상동성인 나선-턴-나선에 대해 Brookhaven 데이터베이스를 검색하였다. 높은 구조적 상동성은 상동성 161 위치에서 프롤린을 가졌던 몇몇 단백질들의 나선-턴-나선에서 턴과 함께 발견되었다(PDB는 2hgs, 3kal, 2o2z, 2zk3 및 2zqp를 코딩함). 하기에 나타낸 정렬에 따라, Glu161의 Pro으로의 치환은 이 턴을 안정화시키고 턴이 리폴딩되지 않도록 방지하기 위한 양호한 구조적 해결방안이다.

특정 구현예에서, 턴을 안정화시키고 턴이 리폴딩되지 않도록 방지하기 위해 잔기 Ser173을 Pro으로 대체하였다. 특정 구현예에서, 턴을 안정화시키고 턴이 리폴딩되지 않도록 방지하기 위해 잔기 Thr174를 Pro으로 대체하였다.

Ramachandran 플롯은, β3 와 β4 사이의 턴에 있는 아미노산 잔기 182가 또한 불량한/바람직하지 못한 이면각을 가짐을 보여준다. 이 위치의 최적화는 턴의 안정성을 증가시키고, β-헤어핀을 안정화시킬 수 있었다.

β3 - 턴 - β4(잔기 177 내지 189)의 영역의 경우, 바람직하지 못한 Ser182를 대체할 수 있는 잔기를 찾기 위해, 리폴딩되지 않는 안정한 단백질 유래의 구조적으로 상동성인 β-헤어핀에 대해 Brookhaven 데이터베이스를 검색하였다. 높은 구조적 상동성은 상동성 182 위치에서 프롤린을 가졌던 추정상의(putative) 전자 전달 단백질의 β-헤어핀에서 턴과 함께 관찰되었다(PDB는 3me8을 코딩함). 하기에 나타낸 정렬에 따라, 이 턴을 안정화시키고 턴이 리폴딩되지 않도록 방지하기 위해, Ser182를 Pro으로 치환하는 것이 양호한 구조적 해결방안이다.

잔기 486, 487, 489 사이의 헤드 영역의 하단부에서의 시스틴 가교 형성

음전하성 아미노산 잔기 486, 487 및 489는 예비융합 RSV-F 구조와 융합후 RSV-F 구조 사이의 전이를 조절하는 스위치 메커니즘의 일부이다. Glu487의 Gln으로의 돌연변이는 이 스위치를 손상시키며, 삼량체에서 기본단위체들 간의 접촉을 안정화시킬 것이다. 이들 동일한 잔기 위치는 또한, 기본단위체들 간의 이황화 결합을 조작하는 데 사용될 수도 있다. 상기 기술된 바와 같이, 시스테인에 의한 2개 잔기의 돌연변이는 음전하 반발을 감소시키고 이황화 결합을 허용할 것이며, 이는 예비융합 삼량체를 추가로 안정화시킬 것이다.

예비융합 형태의 안정성 및 발현 수준을 증가시키기 위해, RSV-F 예비융합 단백질의 HRA 영역에 있는 2차 구조 요소들 간의 턴을 안정화시키는 점 돌연변이를 함유한 변이체를 제조하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.

단일 점 돌연변이 중에서, 173, 182, 특히 161번째 위치의 프롤린으로의 치환에 의해 발현 수준 및 안정성은 더 높아졌다. 잔기 161의 전하 제거는 단백질을 안정화시켰지만, 발현 수준을 증가시키지는 않았다. 동일한 점 돌연변이는, 부가적인 안정화 N671 및 S215P 돌연변이를 함유한 안정화된 예비융합 F 서열에서 유사한 효과를 가졌다. 잔기 182, 173, 특히 161의 프롤린으로의 돌연변이는 안정성 및 발현 수준의 최고 증가를 보여주었다.

예비융합 형태의 높은 발현 및 양호한 안정성을 보인 E161P 돌연변이를 또한, 퓨린(furin) 절단 부위 돌연변이(F18: SEQ ID NO 71)를 가지지 않는 가용성 RSV A2 F 엑토도메인 변이체에 적용하여, 변형이 RSV 예비융합 F를 안정화시키기 위한 보편적인 해결방안인지 평가하였다(표 15).

E161P 돌연변이 또한, 가공된 RSV-F 단백질에서 발현 수준의 높은 증가를 보여주었다. 예를 들어, 67, 215 및 487번째 위치에서 안정화 점 돌연변이와 조합되는 경우, E161P 돌연변이는 높은 발현 수준 및 높은 안정성을 가진 예비융합 F 변이체를 생성하였다.

음전하성 아미노산 잔기 486, 487 및 489는 예비융합 RSV-F 구조와 융합후 RSV-F 구조 사이의 전위를 조절하는 스위치 메커니즘의 일부이다. Glu487의 Gln으로의 돌연변이는 이 스위치를 손상시키며, 삼량체에서 기본단위체들 간의 접촉을 안정화시킬 것이다(이전의 특허 P00). 이들 동일한 잔기 위치는 또한, 기본단위체들 간의 이황화 결합을 조작하는 데 사용될 수도 있다. 시스테인에 의한 2개 잔기(이 중 하나는 음전하성 잔기 486, 486 또는 489임)의 돌연변이는 음전하 반발을 감소시키고 이황화 결합을 허용할 것이며, 이는 예비융합 삼량체를 추가로 안정화시킬 것이다. 이러한 변이체들 중 몇몇을, 예비융합 형태의 발현 수준 및 안정성에 대해 시험하였다(표 16).

준안정한 F24 백그라운드(SEQ ID NO: 19)에서, 잔기 486과 잔기 487 사이의 이황화 결합만이 적당한 발현 및 안정성을 가진 예비융합 단백질을 생성하였다. 기본단위체간(inter-protomeric) 이황화는 반대쪽 측쇄의 올바른 정렬을 필요로 하기 때문에, 이황화 연결성은 준안정한 F24 변이체와 비교하여, 보다 안정한 F 단백질에서 더 성공적일 수 있다. 따라서, 이황화 중 몇몇을 또한, 2개의 안정화 돌연변이 N67I 및 S215P를 함유한 F24 변이체에서 조작하였다. 사실상, 안정화된 백그라운드에서, 조작된 이황화를 가진 단백질은 훨씬 더 높은 수준으로 발현되었다. 또한, 486 및 487번째 위치에 시스테인 돌연변이를 가진 변이체는 최고 수준으로 발현되었으며, 발현 수준은 N67I 및 S215P 돌연변이를 갖지 않는 불안정화된 변이체와 비교하여 14배 높았다. 상층액에서의 단백질의 안정성은 적당하게 여전히 예비융합 형태를 79% 함유하였다. 단백질이 정제되는 경우, 보다 높은 안정성에 도달될 수 있다. 실시예 4 및 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 시스테인의 100% 모두가 기본단위체간 결합되지 않기 때문에, 안정성은 100%에 도달되지 않을 수 있다.

실시예 4

웨스턴 블로팅

배양 상층액을 4-12%(w/v) Bis-Tris NuPAGE 겔(Life Technology) 상에서 환원 진행시키고, iBlot 기술(Life Technology)을 이용하여 블로팅하였다. 블롯을 CR9503(하기 표 18에 주어진 서열)으로 프로브화하고, 공액된 마우스 항-인간 IgG(미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 Jackson ImmunoResearch) 또는IRDye800CW가 공액된 친화성 정제된 항-인간 IgG(토끼)(미국 펜실베니아주 길버츠빌 소재의 Rockland Immunochemicals)를 사용하여 발색시켰다. 도 1에서, DM = 이중 돌연변이체(N671+S215P = SEQID 21) 및 DM+CC = 이중 돌연변이체 + DE486CC = SEQID 94)의 발현이 확인될 수 있다. 2개의 단백질들 간의 분명한 차이는, 환원 및 비환원된 상태로 분석한 경우, 관찰될 수 있었다. 환원된 단백질 둘 다는 약 55 kDa의 단량체성 화학종으로서 이동한다. DM 중 비환원된 대부분은 여전히 단량체로서 발견되며, 한편 DM+CC 주요 화학종은 훨씬 더 높으며 주로 삼량체이다. 이는, 잔기 486 및 487의 시스테인으로의 치환이, 주로 기본단위체간 이황화 결합을 가진 삼량체를 생성함을 입증한다.

실시예 5

NativePAGE

본 발명에 따른 예비융합 F 폴리펩타이드의 멀티머 상태의 초기 확인을 위해, 일시적으로 형질감염된 세포 유래의 배양 상층액을 NativePAGE Bis-Tris 겔 시스템(Life Technologies)에서 분석하였다. 후속해서, 겔을, 제조업체(Life Technologies)의 지시사항에 따라 iBlot 기술을 사용하여 블로팅하였다. RSV F 단백질 특이적인 항체 CR9503(하기 표 18에서 주어진 서열)을 예비융합 RSV F 단백질 검출용 일차 프로브로서 사용하였으며, 이어서, HRP가 공액된 마우스 항-인간 IgG(미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 Jackson ImmunoResearch) 또는 IRDye800CW가 공액된 친화성 정제된 항-인간 IgG(토끼)(미국 펜실베니아주 길버츠빌 소재의 Rockland Immunochemicals)를 사용하였다. 블롯을 표준 필름(Codak) 또는 Odyssey CLx 적외선 영상 시스템을 사용하여 발색시켰다. 도 2는 레인 2: DM = 이중 돌연변이체 (N67I+S215P = SEQID 21) 및 레인 1: DM+CC = 이중 돌연변이체 + DE486CC = SEQID 5A) 유래의 상층액의 NativePAGE 분석을 도시한 것이다. DM 및 DM+CC 둘 다는 고유의 페이지에서 주로 삼량체이며, 이는 이황화의 도입이 삼량체간 가교를 초래하지 않을 수 있음을 보여준다. DM+CC는 DM보다 잘 발현되지 않기 때문에, 손실되는(missing) 단량체(화살표)는, 이것이 검출 한계보다 아래에 있는 사실로 인한 것일 수 있다.

실시예 6

예비융합 F 단백질의 발현

재조합 예비융합 RSV F 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드를, 부위-특이적인 돌연변이화 및 PCR을 수반하는 당해 기술분야에 광범위하게 공지된 표준 방법에 의해 제조하였다. 사용된 발현 플랫폼은 293Freestyle 세포(Life Technologies)였다. 세포를, 293Fectin(영국 렌프루셔주 소재의 Life Technologies)를 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 일시적으로 형질감염시키고, 37℃ 및 10% CO2에서 5일 동안 배양하였다. 배양 상층액을 수집하고, 300 g에서 5분 동안 회전시켜, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 후속해서, 회전된 상층액을 0.22 um 진공 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.

실시예 7

예비융합 RSV F 단백질의 정제

재조합 폴리펩타이드를, 초기 정제용 양이온 교환 컬럼과, 후속해서, 연마(polishing) 단계용 superdex200 컬럼을 적용하는 2-단계 정제 프로토콜에 의해 정제하여, 잔류하는 오염물들을 제거하였다. 초기 이온 교환 단계에서, 배양 상층액을 2부피의 50 mM NaOAc pH 5.0으로 희석시키고, 5 ml HiTrap Capto S 컬럼에 5 ml/분의 속도로 통과시켰다. 후속해서, 컬럼을 10 컬럼 부피(CV)의 20 mM NaOAc, 50 mM NaCl, 0.01%(v/v) tween20, pH 5로 세정하고, 2 CV의 20 mM NaOAc, 1 M NaCl, 0.01%(v/v) tween20, pH 5를 사용하여 용출시켰다. 용출액을 회전 농축기를 사용하여 농축시키고, 40 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.01%(v/v) tween20, pH 7.4를 러닝 완충제로서 사용하여 superdex200 컬럼을 사용하여 추가로 정제하였다. 도 3a에서, 겔 여과 컬럼의 크로마토그램이 도시되어 있으며, 주 정점은 예비융합 RSV F 단백질을 함유한다. 이 정점을 함유하는 분획을 다시 풀링하고, 단백질 농도를 OD280을 사용하여 확인한 다음, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다. 도 3b에서, 최종 단백질 조제물의 환원된 SDS-PAGE 분석이 도시되어 있으며, 확인되는 바와 같이, 순도는 95% 초과였다. 밴드의 확인은 웨스턴 블로팅 및 단백질 F 특이적인 항체를 사용하여 입증하였다(도시되지 않음). 다음, 정제된 단백질을 고유의 PAGE에서 시험하고, 참조의 안정한 삼량체 예비융합 F 단백질(SEQID NO: 21)과 비교하였다(도 3c).

실시예 8

종점 안정성 분석법

본 발명에 따른 발현된 폴리펩타이드의 예비융합 형태의 입증은, 예비융합 특이적인 항체 CR9501 또는 CR9502, 또는 상업적으로 입수가능한 항체 모타비주맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 비형태 특이적인 항체 CR9503를 사용하여 옥텟 기술에 의해 수행하였다. 항체를 표준 프로토콜에 의해 비오티닐화하고, 스트렙타비딘 바이오센서(영국 포츠머쓰 소재의 ForteBio) 상에 고정하였다. 절차는 하기와 같았다. 카이네틱 완충제(ForteBio)에서 센서를 60초 동안 평형화시킨 후, 칩을, 5 ug/ml의 원하는 항체를 포함하는 PBS에 옮겼다. 로딩을 250초 동안 수행하였다. 후속해서, 또 다른 평형화 단계를 카이네틱 완충제에서 200초 동안 포함시켰다. 마지막으로, 칩을 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 함유하는 발현 배양 상층액에 옮기고, 1200초 후 총 결합 신호를 기록하였다. 이 상(phase)을 연관 상으로 지칭한다. 이는 수집 즉시(제1일), 그리고 5일 후(제5일)에 수행하였으며, CR9501 결합 차이를, 예비융합 형태를 안정화시킬 수 있는 돌연변이를 확인하기 위한 스크리닝 도구로서 사용하였다. 제5일에 20% 미만의 결합 손실이 관찰되면 구축물은 안정한 것으로 간주되었고, 그렇지 않은 경우 구축물은 불안정한 것으로 간주되었다. 그런 다음, 안정한 구축물은 필요에 따라 보다 엄격한 안정성 시험을 받을 수 있었다. ForteBio Data 분석 6.4 소프트웨어(ForteBio)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

실시예 9

열 안정성 분석법

RSV F 폴리펩타이드 내에 도입된 특징의 안정화 잠재성을 열 스트레스에 의해 평가하였다. 이를 위해, 일시적으로 형질감염된 세포 유래의 배양 상층액 또는 정제된 단백질을 광범위한 온도를 사용하여 가열하였다. 후속해서, 검체를 얼음 상에서 냉각시켜, 추가적인 열이 형태 변화를 유도하지 못하도록 하였으며, 실시예 11에 기술된 바와 같이 옥텟 기술 플랫폼 상에서 CR9501 항체를 사용하여 프로브화하였다. 상이한 온도에서 연관 상의 종료 시에 수득한 반응을 온도의 함수로서 그래프를 그리고, Prism 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀에 의해 적합(fitting)화하였다. 이로써, 항체 결합 수준이 최대 50%인 온도를 추정할 수 있었으며, 이 값은 상이한 구축물들을 예비융합 열 안정성의 면에서 비교하는 데 사용할 수 있었다.

실시예 10

연관 상 안정성 분석법

다양한 점 돌연변이들의 안정성을 평가하기 위해, 연관 상 분석에 의해 옥텟 결합 분석법을 개발하였다. CR9501 항체 또는 CR9502 항체를 RSV F 단백질의 예비융합 형태용 프로브로서 사용하였다. 종점 분석법의 잠재적인 농도 편향을 감소시키기 위해, 실험의 전체 연관 상으로부터의 데이터 포인트를 사용하였다. 데이터를 칩 상의 결합된 항체의 양에 대해 보상하였다. 제1일, 제5일 및 제33일에 측정을 수행하고, 3일의 곡선의 형상을 비교하였다. 동일한 곡선이 수득되는 경우, 구축물은 안정한 것으로 간주되었으며, 그렇지 않은 경우 불안정한 것으로 간주되었다.

실시예 11

정량적 옥텟

세포 배양 상층액에서 예비융합 RSV F 단백질의 농도를 측정하기 위해, 정량적 옥텟-기재의 방법을 이용하였다. CR9501 항체 및 CR9503 항체를 표준 프로토콜에 의해 비오티닐화하고, 스트렙타비딘 바이오센서(영국 포츠머쓰 소재의 ForteBio) 상에 고정하였다. 이후, 코팅된 바이오센서를 모크(mock) 세포 배양 상층액에서 차단하였다. 정량적 실험을 하기와 같이 수행하였다: 온도 30℃, 진탕 속도(shaking speed) 1000 rpm, 분석 시간 300초. 세포 배양 상층액 내의 단백질의 농도를 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 모크 세포 배양 상층액 내에 희석시킨 A2_F24_N67I+S215P(SEQ ID# 21) 단백질을 사용하여 각각의 코팅된 항체에 대해 표준 곡선을 제작하였다. 상층액 수집일(제1일), 및 상층액을 4℃에서 5일 이상 보관한 후, 측정을 수행하였다. CR9501 또는 CR9502를 사용하여 확인한 농도의 차이를, 예비융합 형태를 안정화시킬 수 있는 돌연변이를 확인하기 위한 스크리닝 도구로서 사용하였다. 20% 미만의 측정 농도 감소가 제5일에 관찰된 경우, 구축물은 안정한 것으로 간주되었다. ForteBio Data 분석 6.4 소프트웨어(ForteBio)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

실시예 12

예비융합 F 면역원성의 예비임상 평가

안정화된 예비융합 RSV F(A2F24,N67I, S215P)(SEQ ID NO: 21)의 면역원성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 표 19에 따라, 마우스를 0주째 내지 4주째에 프라임 -부스트 치료계획에서 0.5 ug 또는 5 ug을 사용하여 면역화하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 예비융합 F로 면역화된 마우스는 융합후 RSV F로 면역화된 마우스보다 더 높은 VNA 타이터를 나타내었다.

다음, 코튼랫을 2개의 상이한 용량의 융합후 형태 또는 예비융합 형태(표 20)의 RSV-F를 사용하여 면역화하였다. 동물을 0주째 및 4주째에 근육내로 면역화하였다. 도 5는 시도일(제7주)에서 높은 중화 항체 타이터를 보여준다.

시도 후 5일째에, 폐 및 코의 바이러스 부하를 측정하였다(도 6 참조).

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 예비융합 F 폴리펩타이드는, 폐와 심지어 코에서 바이러스 부하를 감소시킨 강한 보호성 면역 반응을 유도할 수 있다.

예비융합 RSV F 구축물 중 몇몇의 아미노산 서열은 하기에 주어진다. 본원에 기술된 상이한 구축물들에서 아미노산 넘버링은 야생형 서열(SEQ ID NO: 1)을 토대로 하며, 이는 예비융합 구축물의 1번째 위치부터 108번째 위치까지 1번째 위치와 108번째 위치를 포함하는 위치들에서의 모든 아미노산들은 야생형 서열의 1번째 위치 내지 108번째 위치의 아미노산에 상응하는 반면, 138번째 위치부터 끝 위치까지의 아미노산의 넘버링은 22개 아미노산이 시프트되어 있는데, 즉, 야생형 서열(SEQ ID NO: 1)의 L138은 모든 예비융합 구축물들에서 L116에 상응함을 의미한다. 이는, 예비융합 구축물에 결실, 즉, 즉, GSGSG 링커의 삽입이 이루어져서, F1에서 실제적인 넘버링은 구축물들 사이에 동일하지 않다는 사실로 인한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 특이적인 돌연변이, 예를 들어 S215P에 대해 사용된 넘버링은 야생형 서열에서 아미노산의 위치를 지칭한다.

SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides <130> 0234 WO 00 ORD <150> EP13172256 <151> 2013-06-17 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F protein A2 full length sequence <400> 1 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ile Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Val Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F protein B1 full length sequence <400> 2 Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser 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Leu 145 150 155 160 Pro Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Gln Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540 <210> 91 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreF N67I E161P S215P, RSV A2, fibritin <400> 91 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ile Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Pro Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540 <210> 92 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreF N67I S173P S215P, RSV A2, fibritin <400> 92 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ile Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Pro Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540 <210> 93 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreF N67I S182P S215P, RSV A2, fibritin <400> 93 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ile Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Pro Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540 <210> 94 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreF N67I S215P D486C E487C, RSV A2, fibritin <400> 94 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ile Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Cys Cys Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540

Claims

예비융합 형태(conformation) F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함하는, 재조합 예비융합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 융합(F) 폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 에피토프는, SEQ ID NO: 54의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 55의 중쇄 CDR2 영역, SEQ ID NO: 56의 중쇄 CDR3 영역 및 SEQ ID NO: 62의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 63의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 64의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 예비융합 특이적인 모노클로날 항체, 및/또는 SEQ ID NO: 58의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 59의 중쇄 CDR2 영역, SEQ ID NO: 60의 중쇄 CDR3 영역 및 SEQ ID NO: 66의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 67의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 68의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 예비융합 특이적인 모노클로날 항체에 의해 인지되며, 폴리펩타이드는 F1 도메인 및 F2 도메인을 포함하며, 여기서, 폴리펩타이드는 야생형 F1 도메인 및 F2 도메인과 비교하여, 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 재조합 예비융합 호흡기 세포융합 바이러스 융합 폴리펩타이드:
(a) 161번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;
(b) 182번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이;
(c) 173번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이; 및
(d) 489번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 C로의 돌연변이(D489C) 또는 487번째 위치에서 아미노산 잔기 E의 C로의 돌연변이(E487C)와 조합된, 486번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 C로의 돌연변이(D486C).
제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 삼량체인, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기의 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드:
(a) 161번째 위치에서 아미노산 잔기 E의 P, Q 또는 G로의 돌연변이(E161P, E161Q 또는 E161G);
(b) 182번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이(S182P);
(c) 173번째 위치에서 아미노산 잔기 S, T 또는 N의 P로의 돌연변이(S173P); 및
(d) 489번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 C로의 돌연변이(D489C) 또는 487번째 위치에서 아미노산 잔기 E의 C로의 돌연변이(E487C)와 조합된, 486번째 위치에서 아미노산 잔기 D의 C로의 돌연변이(D486C).
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 67번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 추가로 포함하는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제4항에 있어서, 폴리펩타이드가 67번째 위치에서 아미노산 잔기 N 또는 T의 돌연변이 및/또는 215번째 위치에서 아미노산 잔기 S의 돌연변이를 포함하는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가, F1 도메인 및 F2 도메인을 연결하는 1개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 연결 서열을 포함하는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 절단된(truncated) F1 도메인을 포함하는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제7항에 있어서, 폴리펩타이드가, 상기 절단된 F1 도메인에 연결되는 이종성 삼량체화 도메인을 포함하는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제8항에 있어서, 이종성 삼량체화 도메인이 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 4)을 포함하는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제12항에 있어서, 삼량체화 도메인이 RSV F 단백질의 아미노산 잔기 513에 연결되는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, F1 도메인 및/또는 F2 도메인이 RSV A 균주로부터 유래되는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, F1 도메인 및/또는 F2 도메인이 RSV B 균주로부터 유래되는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 90 내지 SEQ ID NO: 94로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 예비융합 RSV F 폴리펩타이드.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자.
제14항에 있어서, 핵산 분자가 포유류 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 핵산 분자.
제14항 또는 제15항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 제14항 또는 제15항에 따른 핵산 분자, 및/또는 제16항에 따른 벡터를 포함하는 조성물.
RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 제14항 또는 제15항에 따른 핵산 분자 및/또는 제16항에 따른 벡터.
백신으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 제14항 또는 제15항에 따른 핵산 분자 및/또는 제16항에 따른 벡터.
RSV 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 예비융합 RSV F 폴리펩타이드, 제14항 또는 제15항에 따른 핵산 분자 및/또는 제16항에 따른 벡터.