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KR20160011176A - 발광을 이용한 생체분자의 검출을 위한 방법 및 시약 - Google Patents

발광을 이용한 생체분자의 검출을 위한 방법 및 시약 Download PDF

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KR20160011176A
KR20160011176A KR1020157018667A KR20157018667A KR20160011176A KR 20160011176 A KR20160011176 A KR 20160011176A KR 1020157018667 A KR1020157018667 A KR 1020157018667A KR 20157018667 A KR20157018667 A KR 20157018667A KR 20160011176 A KR20160011176 A KR 20160011176A
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KR
South Korea
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aqc
biotin
biomolecule
complex
binding
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020157018667A
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English (en)
Inventor
마누엘 아르투로 로페즈 킨텔라
페르난도 도밍게스 푸엔테
호세 엠ª 지메노 도나케
Original Assignee
나노갭 서브-엔엠-파우더, 쏘시에다드 아노니마
판가에아 바이오테크 에스.엘.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 나노갭 서브-엔엠-파우더, 쏘시에다드 아노니마, 판가에아 바이오테크 에스.엘. filed Critical 나노갭 서브-엔엠-파우더, 쏘시에다드 아노니마
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Abstract

본 발명은 적어도 2개의 상이한 크기의 금속 원자 양자 클러스터 (AQC) 및 비오틴 결합 분자, 바람직하게는 스트렙타비딘을 포함하는 발광 복합체, 및 비오틴화 화합물의 검출을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 AQC의 전하이동 복합체 및 생체분자를 포함하는 복합체의 용도, 및 AQC 나노시스템의 발광 측성을 기본으로 하는 시료에서 생체분자의 결합 파트너의 검출을 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

발광을 이용한 생체분자의 검출을 위한 방법 및 시약 {METHODS AND REAGENTS FOR THE DETECTION OF BIOMOLECULES USING LUMINESCENCE}
본 발명은 금속원자 양자 클러스터(AQC)의 전하이동 복합체에 결합된 목적한 생체분자에 대한 결합 파트너를 이용하여 생체분자를 검출하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 본 발명은 또한 금속원자 양자 클러스터의 전하이동 복합체 및 비오틴화 분자를 이용한 경쟁 결합 분석에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드, 단백질, 지질 등의 생체분자에 형광염료의 접합(conjugation)은 생체 분자의 검출, 분리 및/또는 식별을 위해 유용할 수 있다. 이 접합체는 일반적으로 염료와 소정의 표적 또는 결합 파트너에 결합할 수 있는 시약을 결합하는 것으로부터 유래한다. 단백질 또는 핵산을 검출하기 위한 마커로서 사용하기 위해 의도된 염료에 바람직할 수 있는 다양한 특성들이 있다. 이들은 그것을 둘러싸는 매트릭스에 영향을 미치지 않고 여기할 수 있는 능력, 용이한 검출, 매체에 적합한, 높은 양자 수율, 안정성, 긴 평균수명, 비독성, 경시 발광 파라미터의 재현성, 뉴클레오티드 또는 다른 바람직한 표적에 염료의 부착을 허용하는 반응성기의 존재를 포함한다.
오늘날, 200nm 이상의 큰 스토크스 시프트 (huge Stokes shifts) 및 마이크로 초 이상의 느린 감쇠시간을 갖는 공지의 유일한 형광시스템은 희토류 이온을 기반으로 한다. 그러나, 그들은 다수의 단점들을 나타낸다. 예를 들면 그들의 형광특성, 각각의 희토류에 대응하는 고정된 특별한 여기, 방출 및 스토크스 시프트 특성을 상실하지 않도록 매트릭스에 이들을 도입하는데 어려움이 있고; 따라서 이들은 변화되는 것에 민감하지 않고 고가이며 희귀한 재료이다. 이들 시스템의 예는 Sardar, D.K. et al., Biophotonics, January 2008; Resch-Genger, U., Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology II Springer Series on Fluorescence, 2010, Volume 9, Part 1, 3-40; Harma H. et al., Analytical Chemistry, 2005, 77, 2643-2648; US7465747B2; US 2010/0224831 A1 및 US4283382에 기술되어 있다.
따라서 발광 프로브로서 사용되며 또한 희토류 원소를 기반으로 염료 함유 접합체의 이러한 단점들을 극복하는 생체분자에 형광염료를 접합할 필요가 있을 것이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도, AQC의 전하이동 복합체가 스트렙타비딘과 상호작용하여 이들의 형광발광 강도의 증가를 초래하고 또한 이러한 효과는 비오틴 또는 비오틴 결합분자의 존재하에 역전할 수 있다는 것을 발견하였다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, AQC의 전하이동 복합체와 스트렙타비딘과의 상호작용은 AQC의 입체구조의 변화를 초래하고, 이것은 강도 증가를 초래하며 또한 AQC의 전하이동 복합체는 비오틴 결합 포켓을 통하여 스트렙타비딘과 상호작용하며, 그 결과 상기 상호작용이 스트렙타비딘에 대한 비오틴의 더 높은 친화성 때문에 비오틴 또는 비오틴 결합 분자의 존재하에 역전된다고 생각된다.
상기 AQC는 금속전이 원소를 포함하기 때문에, 이들은 매우 낮은 농도로 존재하는 경우 독성이 없는 것들, 예를 들어 Au 또는 Ag로부터 선택할 수 있다. 더욱이, 이들 원소가 자연적으로 풍부하기 때문에, 상기 방법은 완전히 지속가능한 방법이 된다. 그 외에, AQC 및 상기 AQC를 함유하는 복합체는 다음과 같은 이점을 나타낸다:
- 자연광 및 실온하에 저장된 적어도 1년의 기간에 걸쳐 이들의 특성을 상실하지 않고 안정하다.
- 3 내지 10의 pH 범위에서 안정하다.
- 건조 형태에서도 이들의 형광 특성을 상실하지 않고 건조 때까지 농축할 수 있다.
- 이들의 형광특성을 잃지 않고 일단 건조되면 재용해될 수 있다.
- 희토류 원소 기반 발광 시스템에서 사용되는 것보다 낮은 농도로 사용된다.
이러한 관찰은 스트렙타비딘, 비오틴을 검출하기 위한 비오틴 결합 분자, 또는 비오틴화 분자의 존재하에 AQC의 전하이동 복합체의 사용을 가능하게 한다.
따라서 첫 번째 양상에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 적어도 2개의 상이한 크기 금속 원자 양자 클러스터 (AQC)인 Mn 및 M'n'의 전하이동 복합체 및 비오틴 결합 분자를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
Figure pct00001
상기 식에서,
금속 AQC의 금속 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며,
Mn은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며,
M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며,
Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며,
n 및 n'는 각각 M 및 M'의 금속원자의 수이며, 또한
n은 n'보다 작으며,
여기서 비오틴 결합 분자 및 전하이동 복합체는 공유적으로 결합되지 않는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기 (i) 및 (ii)를 함께 또는 별도로 함유하는 부품 키트에 관한 것이다:
(i) 적어도 2개의 상이한 크기 금속원자 양자 클러스터(AQC), Mn 및 M'n'의 전하이동 복합체 (여기서 상기 전하이동 복합체는 특허청구범위 제1항에서 정의된 바와 같은 화학식(I)을 가지며, 또한 금속 AQC의 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며, Mn 은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며, M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며, Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며, n 및 n'는 각각 금속원자의 수이다) 및
(ii) 비오틴 결합 분자.
또 다른 양상에서, 본 발명은 시료에서 비오틴화분자의 검출방법으로서,
(i) 비오틴화 분자가 상기 복합체 중의 비오틴 결합분자에 결합하기에 적합한 조건하에 상기 시료를 본 발명에 따는 복합체와 접촉시키는 단계, 및
(ii) CTC의 여기파장에서 상기 시료의 여기에 대한 반응에 따른, 단계(i)의 접촉 후에 CTC에 의한 형광발광의 강도 변화를 검출하는 단계
를 포함하며, 여기서 접촉 단계 후에 CTC에 의해 발광된 형광강도의 감소는 시료에 비오틴화 분자가 존재함을 나타내는 것인 검출방법에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 적어도 2개의 상이한 크기 금속 AQC인 Mn 및 M'n'의 전하이동 복합체 및 생체분자를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
Figure pct00002
상기 식에서,
금속 AQC의 금속 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며,
Mn은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며,
M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며,
Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며,
n 및 n'는 각각 M 및 M'의 금속원자의 수이며, 또한
n은 n'보다 작으며,
여기서 상기 접합체는 원자 양자 클러스터인 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산 리간드를 추가로 포함하며, 상기 생체분자는 ω-하이드록시산 및/또는 ω-메르캅토산 리간드에 부착된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 시료의 생체분자를 검출하기 위한 또는 세포내 성분을 검출하기 위한 본 발명의 결합체에 관한 것이다.
도 1은 스트렙타비딘의 존재하에 및 (A) 비오틴화 올리고뉴클레오티드의 조부재하에, (B) 0.1mmol의 비오틴화 올리고뉴클레오티드의 존재하에 및 (C) 0.5mmol의 존재하에 AQC-CTC의 발광 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 스트렙타비딘 및 HABA의 존재하에 및 (A) 비오틴화 올리고뉴클레오티드의 부재하에 및 (B) 비오틴화 올리고뉴클레오티드의 존재하에 AQC-CTC의 발광 스펙트럼을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 ("과 면역반응하는") 항원 결합부분을 함유하는 부분를 함유하는 분자를 일컫는다. 비제한적인 예는 항체, 항체 단편, 재조합 항체, 비인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체를 포함한다. 구조적으로, 가장 간단한 천연 발생 항체(예를 들면, IgG)는 4개의 폴리펩티드쇄, 즉 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄를 포함한다. 면역글로불린은 IgD, IgG, IgA, IgM과 IgE와 같은 여러 유형의 분자를 포함하는 분자들의 큰 패미리를 나타낸다. 용어 "면역글로불린 분자"는 예를 들어 하이브리드 항체, 또는 변화된 항체 및 그의 단편을 포함한다. 항체의 항원결합 기능은 자연 발생 항체의 단편에 의해 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 이들 단편은 총칭하여 "항원결합 단위"라고 칭한다. 항원결합 단위는 일반적으로 이들의 분자구조를 기반으로 "단일쇄"("Sc") 및 "비-단일 쇄"("Nsc")의 유형으로 나눌 수 있다. 또한 용어 "항체"에는 무척추 동물과 척추동물을 포함한 다양한 종기원의 면역글로불린 분자가 포함된다. 항체 또는 항원 결합 단위에 적용되는 용어 "인간"은 인간 유전자 또는 그의 단편에 의해 발현되는 면역 글로불린 분자를 의미한다. 비인간 (예를 들어, 설치류 또는 영장류) 항체에 적용되는 용어 "인간화"는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소서열을 포함하는 하이브리드 면역글로불린, 면역글로불린쇄 또는 그의 단편이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정영역(CDR)으로부터 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 영장류와 같은 비인간종(공여체 항체)의 CDR으로부터 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부의 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체에서도 발견되지 않고 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 인체내에 도입된 경우 항체의 성능을 더욱 개선하고 최적화하고 또한 면역원성을 최소화하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 두개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 CDR영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역 글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 정상영역(Fc)의 적이도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 지정된 값으로부터 약간의 변화, 바람직하게는 지정된 값의 10% 이내의 변화를 의미한다. 그러나 용어 "약"은 예를 들어, 사용된 실험기술에 따라 더 큰 변동 허용치를 의미할 수 있다. 당업자는 지정된 값의 상기 변동을 이해하며 이들은 본 발명의 범위내에 있다. 또한, 더 정확한 설명을 제공하기 위해, 본 명세서에서 제공되는 양적 표현의 일부는 용어 "약"과 함께 기술되지 않는다. 용어 "약"은 명시적으로 사용되거나, 그렇지 않으면, 본 문서에서 주어진 각각의 양은 실제 소정의 값을 참조하려고 시도하고, 또한 당해 분야에서 통상의 지식을 기반으로 합리적으로 추정되는 이러한 소정의 값의 근사치, 예를 들면 이러한 소정의 값에 대한 측정으로부터 및/또는 실험 조건에 기인하는 동등치 및 근사치를 언급한다.
용어 "원자 양자 클러스터"(Automic Quantum Cluster)는 AQC로 약칭되며, 본 명세서에서는 금속 원자 양자 클러스터로서 이해된다. 금속 원자 양자 클러스터는 독점적으로 제로 산화상태에 의해, 본 발명에서 바람직하게는 309 또는 그 미만의 금속원자 (Mn, n<309)와 함께 형성된다. AQC는 경시적으로 안정하다. 바람직하게는 본 발명의 AQC는 약 0.3 내지 2.2 nm, 바람직하게는 약 0.3 내지 2 nm, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 1.8 nm을 포함하는 크기를 갖는다. 이들 금속 AQC는 더 이상 "금속"처럼 작용하지 않으며 이들의 작용은 분자 같이 된다. 따라서 대량으로 나노입자, 마이크로입자 또는 금속 재료에서 관찰되지 않는 새로운 특성들이 이들 클러스터에서 나타난다. 따라서 AQC의 물리 화학적 특성은 단순히 나노/마이크로 입자의 것으로부터 추정할 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아비딘"은 조류, 파충류 및 양서류의 알 흰자 및 조직에서 발견되는 당단백질을 언급하며 또한 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 등의 아비딘 결합 분자의 임의의 발현된 또는 조작된 형태는 물론 높은 친화성을 갖는 아비딘에 결합하는 능력을 갖는다. 이 용어는 Gallus gallus (NCBI 수탁번호 NM_205320.1 / GL45384353en)의 알에서뿐만 아니라 다른 종에서 상기 단백질의 오르토로그(orthologue)에서 자연적으로 발견되는 아비딘을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "결합 파트너"는 결합 파트너 또는 여기에 결합하는표적분자에 대해 결합 선택성을 나타내는 분자를 일컫는다. 결합제는 생체분자 예를 들어 항체 또는 단백질 등의 폴리펩티드, 폴리펩티드계 독소, 아미노산, 뉴클레오티드, DNA 및 RNA를 포함한 폴리뉴클로오티드, 지질, 및 탄수화물, 또는 그의 조합일 수 있다. 결합제는 또한 헵텐, 약물, 금속 킬레이트제 등의 이온착화제, 마이크로입자, 합성 또는 천연 중합체, 세포, 바이러스, 또는 본 발명에 따른 염료분자를 포함하는 다른 형광분자일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"는 생물학적 기원의 임의 시료를 일컫으며, 예를 들면, 제한되지 않지만, 배양중인 세포, 골수; 혈액; 혈액세포 (예를 들어, 백혈구, 적혈구 등); 복수; 조직 또는 미세 바늘 생검 시료; 세포 함유 체액; 자유 부유 핵산; 가래; 뇨; 뇌척수액, 복막액; 흉수; 예를 들어, 세정액 또는 세척액 예를 들어 유관 세정액이나 기관지 폐포 세정액; 흡인액; 스크레이핑; 골수 표본; 조직생검 표본; 수술 표본; 다른 체액, 분비물 및/또는 배설물; 및/또는 그로부터 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 환자로부터 얻어진 세포를 포함한다. 세포는 예를 들면 혈액, 골수 및/또는 고형기관 유래 조직, 예를 들면 뇌, 비장, 뼈, 심장, 혈관, 폐, 신장, 간, 뇌하수체, 내분비선, 림프절, 분산된 일차 세포, 종양 세포로부터 유래할 수 있다. 생물학적 시료는 조직의 부분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 이에 제한되지 않지만, 조직학적 목적을 위해 취한 냉동 또는 고정 부분를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 체액일 수 있으며, 예를 들면, 이에 제한되지 않지만, 혈액, 림프, 복수액, 부인과 체액, 및 뇨를 포함한다. 시료는 당업계에 알려진 광범위한 방법에 의해 대상체로부터 얻어질 수 있으며, 예를 들면, 이에 제한되지 않지만, 한정 생검 (예를 들어, 미세 바늘 흡인 또는 조직 생검), 수술 및 체액 (예를 들어, 혈액, 림프액 등)의 수집을 포함한다. 생물학적 시료는 또한 상기 시료 중의 임의의 것을 처리하여 유도되는 임의의 재료를 포함한다. 유도된 시료는 예를 들어 생물학적 시료로부터 추출되거나 또는 mRNA의 증폭 또는 역전사, 또는 특정 성분의 분리 및/또는 정제와 같은 기술로 상기 시료를 처리하여 얻어진 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "생체분자"는 당해 분야의 숙련된 전문가에게 알려진 것으로 본 명세서에서 사용되며, 또한 살아있는 유기체에 의해 생산되는 임의의 유기분자를 일컫거나 또는 이러한 화합물의 임의의 인공적으로 생산된 유도체를 일컫으며, 예를 들면 단백질, 다당류, 탄수화물, 지질, 핵산 및 올리고뉴클레오티드와 같은 큰 중합체 분자는 물론 일차 대사물, 이차 대사물, 및 천연 생성물과 같은 작은 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비오틴 결합분자"는 비오틴 또는 임의의 비오틴 화합물에 견고하게 그러나 비공유적으로 결합할 수 있는 임의의 화합물을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "비오틴화 분자"는 변형된 비오틴 또는 비오틴 유사체를 생체 분자 등의 또 다른 부분, 예를 들면 핵산분자 (단일 또는 이중 가닥 DNA, RNA, DNA/RNA 키메라 분자, 핵산유사체 및 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 펩티드 핵산(PNA) 또는 그의 임의의 변형을 함유하거나 혼입하는 임의의 분자를 포함한다), 단백질 (당단백질, 효소, 펩티드 라이브러리 또는 디스플레이 생성물 및 항체 또는 그의 유도체를 포함한다), 펩티드 탄수화물 또는 다당류, 지질 등과의 결합제로서 이해되며, 여기서 상기 다른 부분은 변형된 비오틴 또는 비오틴 유사체에 공유적으로 결합된다. 많은 비오틴화 리간드는 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 표준 방법에 의해 제조할 수 있다. 생체분자, 예를 들면 핵산분자 또는 단백질 분자를 비오틴에 결합시키는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다 (Bayer and Wilchek, Methods in Molec. Biology 10, 143. 1992).
CT 복합체로도 명명되는 용어 "전하이동 복합체" 또는 전자 공여체-수용체 복합체는 본 명세서에서 적어도 2개의 AQC의 결합으로 이해되며, 여기서 전하, 즉 전자의 분획은 AQC 사이에 이동되어 AQC의 하나의 산화 형태 및 다른 AQC의 환원형태의 형성을 초래한다. 얻어진 정전기 상호작용, 즉 정전기적 인력은 분자 복합체에 안정력을 제공한다. 전하가 이동되는 소스 AQC는 전자 공여체라 부르며, 받는 AQC는 전자 수용체라고 부른다. 본 발명에서:
- Mn은 복합체 내에 작은 AQC인 전자 공여체이고, 또한
- M'n'는 복합체 내에 큰 AQC인 전자 수용체이다.
CTC는 나노좀(nanosome)을 분해함으로써 형성된다. 나노좀을 분해하는 단계는 미리 합성된 나노좀의 탈에스테르화 공정이다. 이 단계는 상이한 메커니즘을 통해 달성할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 나노좀을 분해하거나 나노좀을 불안정화하는 단계는 초원심분리를 이용하여 수행되지만, 본 기술분야에서 공지된 임의의 다른 수단도 또한 열처리 또는 pH 변동과 같은 나노좀을 분해하는데 유용할 수 있다. 전하이동 메카니즘은 나노좀을 분해하는 단계 중에 일어난다. 따라서 나노좀은 불안정화하고 일반식(I)의 전하이동 복합체가 형성된다.
본 발명에서 사용하기 위한 CTC를 얻는 상이한 방법들이 존재한다.
한가지 방법은 AQC인 Mn 및 M'n'의 수용액을 제조하는 단계를 포함한다. 바람직하게 두 가지 용액은 대략 동일한 농도의 AQC를 가지며, 즉 두 가지 용액은 등몰 또는 대략 등몰이다. 추가의 단계에서 두 가지 용액을 혼합하고 함께 교반하여 전하 이동 메카니즘을 발생시킨다. 바람직한 실시형태에서, 반응 온도는 20℃ 내지 80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 반응시간은 5분 내지 3시간이다.
본 발명에서 사용하기 위한 전하이동 복합체, 특히 유기 리간드를 추가로 포함하는 전하이동 복합체를 얻는 또 다른 방법은 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하며, 여기서 상기 유기 리간드는 원자 양자 클러스터Mn 및 M'n'에 부착되는 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산 등의 양친매성 분자이다.
a) 수성 매체중 염기의 존재하에 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산를 혼합시켜 나노좀을 제조하는 단계,
b) 단계 a)에서 제조된 혼합물에 적어도 하나의 금속염을 첨가하는 단계,
c) 단계 b)에서 얻어진 혼합물을 환원시키는 단계, 및
d) 단계 c)에서 얻어진 혼합물에 존재하는 나노좀을 분해하는 단계.
본 명세서에서 용어 "나노좀"(nanosome)은 인공적으로 제조된 나노미터 크기의 소포에 관한 것이다. 따라서 용어 "나노좀"은 지방족 -(CH2)n- 쇄의 각 말단에서 또는 지방족 CH3-(CH2)n-쇄의 끝에서 세번째χ, 끝에서 두번째 Ψ 위치에서 서로 결합된 두개의 친수성기를 갖는 양친매성 분자(예를 들면, 지질)의 한 층에 의해 형성된 구형 나노미터 초분자구조를 언급한다.
본 발명의 나노좀에서 상기 모노층을 형성하는 양친매성 분자는 다음을 포함한다:
- 예를 들면, 지방족 쇄의 한 말단에서 소포의 외부 표면상에 있는, 카르복실 (COOH), 카르복실레이트(COO-) 또는 포스페이트(PO4 -)기와 같은 친수성기; 및
- 지방족 CH3-(CH2)n- 쇄의 끝에서 세번째χ, 끝에서 두번째 Ψ 위치에서 또는 지방족 -(CH2)n-쇄의 마지막 ω 위치에서 예를 들면 -OH, -SH, -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, 또는 -NR- 등의 기로 치환되고, 여기서 R은 친수성기에 대하여 지방족 쇄의 다른 말단에서 또는 상기 지방족 쇄의 최종 위치에서 소포의 내측으로 위치하는 나노좀을 형성할 수 있는, 짧은 탄화수소 C1-C4의 유기기를 나타내며, 상기 기들은 10 nm 또는 그 미만, 바람직하게는 약 5 nm 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 4 nm의 내부직경을 갖는 나노캐비티를 형성한다. 특정의 실시형태에서, 나노캐비티의 내부 직경은 약 1.5 내지 1.8 nm이다.
바람직한 실시형태에서 용어 "나노좀"은 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산에 의해 형성된 구형 나노미터 초분자 구조를 언급한다. 이러한 특정의 실시형태에서, 나노좀은 상기 정의한 바와 같이 ω-하이드록시산 (HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH)를 포함한다. 나노좀에 존재하는 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산은 나노시스템, 즉 나노좀의 외부 표면을 지향하는 산기 -COOH (또는 -COO-, 상응하는 산의 염이 사용되는 경우) 또는 나노좀에서 내부 캐비티를 형성하는 내측을 지향하는 -OH 및 -SH기를 갖는 구형 단층을 형성하며, 따라서 두 개의 대략 동심 구체가 형성되거나 또는 문헌에서 인용된 바와 같이 지방산 "볼라"(bola) 형태이다. 이러한 구형 단일층은 약 2 내지 10 nm, 바람직하게는 약 5 nm의 두께를 가질 수 있다.
나노좀의 내부 캐비티는 폐쇄된다. 상기 내부 캐비티의 내부 직경은 10 nm 또는 그 미만, 바람직하게는 약 5 nm 또는 그 미만이며, 더욱 바람직하게 상기 내부 캐비티의 내부 직경은 약 0.8 내지4 nm이다. 특정의 실시형태에서 이러한 내부 나노캐비티의 직경은 약 1.5 내지 1.8 nm이다. 나노좀의 이러한 특정의 실시형태에서, 상기 캐비티는 하이드록실, -OH, 및 메르캅토, -SH기에 의해 형성된다. 그러나 이들 작용기를 -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, -NR-(여기서 R은 나노좀을 형성할 수 있는 짧은 탄화수소 C1-C4의 유기기를 나타냄)과 상호작용하는 다른 것들로 교체하는 것이 가능한다.
테트라부틸암모늄 하이드록사이드, 테트라옥틸암모늄 하이드록사이드, 트리에틸벤질암모늄 하이드록사이드, 트리-n-옥틸메틸암모늄 하이드록사이드, 트리메틸데실암모늄 하이드록사이드, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드, 테트라에틸암모늄 하이드록사이드 또는 반대이온 등의 부피가 큰 기를 갖는 임의의 다른 하이드록사이드, 바람직하게는 테트라부틸암모늄 하이드록사이드는 ω-하이드록시산 및 ω-메캅토산을 혼합하여 나노좀을 제조하는 단계 a)에서 염기로서 사용할 수 있다.
단계 b)에서 전이금속의 금속염들 또는 이의 조합이 사용될 수 있다. 금속염의 비제한적인 예는 전이금속의 질산염, 황산염, 아황산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 인산염, 수산화물, 시안산염, 카르복실산염, 티오말레산염, 티오글루코산염이다. 단일 금속염으로서 또는 다른 금속염과 조합하여 사용되는 이들 금속염의 예들은 AgNO3, CH3COOAg, Ag3AsO4, AgBrO3, AgBr, Ag2CO3, AgClO3, AgCl, AgCrO4, AgOCN, AgIO3, AgI, Ag2O, AgClO4, Ag3PO4, Ag2SO4, Ag2S, Ag2SO3, CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuI2, Cu2S, CuSCN, CuCN, CuCO3, Cu2O, Cu(OH)2, Cu(NO3)2, Cu(ClO4)2, Cu(HCO2)2 또는 Cu(CO2CH3)2이다. 조합형태로 사용되는 금 금속염의 비제한적인 예는HAuCl4, AuCl, AuCl3, HAuCl4, HAuCl4·aq, KAuCl4, LiAuCl4,(CH3)2SAuCl, C3H9AuClP, C6H15AuClP, C18H15AuClP, C8H11AuClP, C5H5AuCl3N, (C4H9)3PAuCl, C27H36AuClN2, C21H12AuClF9P, C20H27AuClP, C33H49AuClP, C42H63AuClO3P, C21H24AuClN2, C35H49AuF6NO4PS2 또는 (C20H15AuF6NO4PS2)·2C7H8이다.
단계 c)에서 얻어진 혼합물을 환원시키기 위한 단계 c)에서 사용된 환원 시스템 또는 환원제의 비제한적인 예는 NaBH4, DIBAH, LiAlH4, N2H4 또는 SnCl2일 수 있으며, 또한 더 온화한 환원제는 예를 들어 차아인산 나트륨, 아민, 당, 유기산, 폴리비닐피롤리딘 등의 중합체, UV-VIS 조사, 초음파 및 광환원일 수 있다.
본 발명의 단계 b) 및 c) 이후에, "AQC를 포함하는 나노좀"이 형성된다. 이들 "AQC를 포함하는 나노좀"은 이들의 내부 캐비티 내측에 즉 캡슐화된 내측에 적어도 2개의 상이한 크기의 AQC 즉 Mn 및 M'n'를 포함한다.
이들 "ACQ를 포함하는 나노좀"의 특정한 예는 C., Journal of Colloid and Interface Science, 2209, 337, 2, 610-613에 기술되어 있으며, 이 문헌은 이들 나노시스템 내측에 금 입자 합성을 기술한다.
나노좀을 분해하는 단계는 이전에 합성된 나노좀의 탈에스테르화 공정이다. 이 단계는 상이한 메카니즘에 의해 수행할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 나노좀을 분해하거나 또는 나노좀을 불안정화하는 단계는 초원심분리를 사용하여 수행되지만, 당해 분야에 공지된 임의의 다른 수단도 또한 열처리 또는 pH 변동 등 나노좀을 분해하는데 유용할 수 있다. 전하이동 메카니즘은 나노좀을 분해하는 단계 중에 발생한다. 따라서 나노좀은 불안정화되며 또한 화학식(I)의 전하이동 복합체가 형성된다.
또한 적어도 2개의 상이한 크기의 내부 캐비티 AQC 즉 Mn 및 M'n'를 포함하는 나노좀 이외의 다른 나노시스템을 분해함으로써 본 발명에서 사용되는 전하이동 복합체를 얻을 수 있다.
용어 "나노시스템"은 양친매성 분자의 하나 또는 2개의 층으로 형성되는 구상 나노미터 초분자 구조를 언급하며, 여기서 상기 양친매성 분자는 나노시스템의 내측에서 나노캐비티를 형성한다. 특히 나노시스템은 약 20nm 또는 그 미만, 바람직하게는 18 nm 또는 그 미만 및 더욱 바람직하게는 15 nm 또는 그 미만의 외부 직경을 갖는다. 나노시스템의 내측은 10 nm 또는 그 미만, 바람직하게는 약 5 nm 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 4 nm를 포함한다. 특정의 실시형태에서, 나노캐비티의 내부 직경은 약 1.5 내지 1.8 nm이다. 나노시스템의 비제한적인 예는 나노좀 뿐만 아니라 미셀, 역 미셀, 나노에멀젼 또는 마이크로에멀젼이다. 바람직한 실시형태에서, 나노시스템은 나노좀이다.
표현 "구형"은 형태가 구체에 유사한 입체기하학 형상을 가진다는 것을 의미한다.
나노좀을 형성하는 양친매성 분자는 동일 또는 상이한, 바람작히게는 두 개의 상이한 유형의 분자일 수 있으며, 각각의 분자는 친수성 및 친유성 특성을 둘 다 갖는다.
친유성 특성은 전형적으로 탄화수소 부분, 예를 들면, 30>n>2, 바람직하게는 20>n>10인 형태 CH3-(CH2)n- 또는 -(CH2)n-의 기에 의해 제공된다.
친수성 특성은 친수성 기에 의해 제공된다. 친수성기는 전하기 또는 극성 비전하기일 수 있다. 전하기는 음이온기로부터 선택되며, 바람직하게는 카르복실산염, 황산염, 설폰산염 및 인산염에 의해 형성된 그룹으로부터 선택된다. 극성비전하기는 -OH, -SH, -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR 및 -NR-에 의해 형성된 그룹으로부터 선택되며, 여기서 R은 짧은 탄화수소쇄 C1-C4의 유기 알킬기, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필기를 나타낸다.
양친매성 분자는 하나의 지방족 CH3-(CH2)n- 쇄 및 그것에 결합된 하나의 친수성기 또는 지방족 -(CH2)n- 쇄의 각각에 서로 결합된 두 개의 친수성기를 가질 수 있다.
용어 "미셀"은 양친매성 분자 응집물을 언급한다. 수성 매체에서, 분자 응집물의 친유성 도메인은 미셀의 내측으로 배열되며 또한 친수성 도메인은 매체와 접촉된다. "역 미셀"에서, 분자는 친유성 영역이 외측에 노출되고 친수성 영역이 내측에 노출되도록 구성된다. 당 분야의 상태에서 용어 "마이크로에멀젼"은 또한 "역 미셀"을 언급하는데 사용되며, 즉 "마이크로에멀젼"은 "역 미셀"의 특정한 실시형태이다. 용어 "마이크로에멀젼"은 나노미터 크기의 소적에 의해 형성되는 적어도 세 가지 성분 (물, 오일- 및 양친매성 화합물로 통상 알려진 유기용매), 단상 및 열역학적으로 안정한 시스템을 의미한다. 제한적이지 않지만, 물 소적이 유기매체에 분산되는 유중수형 마이크로에멀젼의 사용은 본 발명에 특히 중요하다. 이러한 유중수형 마이크로에멀션 중에서, 예를 들면 라디칼 광개시제와 같은 일부 개시제를 도입하여 중합되는 물 소적 내측에 아크릴 단량체, 예를 들면 아크릴아미드 또는 1,6-헥산디올 디아크릴레이트를 함유하는 마이크로에멀젼에 관한 중합된 마이크로에멀젼의 사용이 또한 그의 안정성 때문에 흥미있다. 따라서 마이크로 에멀젼 소적은 더욱 내성이 될 수 있다.
용어 "나노에멀젼"은 이상 및 열역학적으로 불안정하지만 화학적 또는 물리적 공정에 의해 임시적으로 안정하고 나모미터 소적으로 형성되는 적어도 세 가지 성분 (물, 유기 용매 및 안정화 화합물)의 시스템을 언급한다. 나노미터 소적의 형성은 당해 기술분야에 알려진 에멀젼과 나노에멀젼을 구별하는 것이다. 따라서 용어 "나노에멀젼"은 일반적으로 소적이 나노미터 크기인 에멀젼을 언급한다.
특정의 실시형태에서, 나노시스템은 나노좀, 미셀 및 역 미셀에 의해 형성된 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 나노시스템은 나노좀이다.
나노시스템이 역 미셀인 특정의 실시형태에서, 역 미셀은 적어도 두 개의 상이한 계면활성제를 포함하며, 여기서 적어도 하나는 그의 극성기로서 티올 또는 티오에테르기를 포함한다. 더욱 특정의 실시형태에서, 상기 적어도 두 개의 계면활성제는 알코올 에톡실레이트 및 ω-메르캅토산이다.
나노시스템의 내부 캐비티는 폐쇄된다. 상기 언급한 바와 같이, 상기 내부 캐비티의 내부 직경은 10 nm 또는 그 미만, 바람직하게는 약 5 nm 또는 그 미만이며, 더욱 바람직하게는 상기 내부 캐비티의 내부 직경은 약 0.8 내지 4 nm이다. 특정의 실시형태에서 이러한 내부 나노캐비티의 내부직경은 약 1.5 내지 1.8 nm이다.
클러스터 여기 및 발광 파장의 대략적인 추정은 Jellium 모델을 이용하여 근사치로 결정할 수있다 (참조, 예를 들면 J. Calvo et al., Encyclopedia of Nanotechnology, Ed. by B. Bhushan, Springer Verlag, 2011). 이 모델은 클러스터의 금지된 에너지 밴드갭을 매우 근사한 방식으로 예측하며, 따라서 그의 발광 밴드갭을 예측한다. 결국 클러스터의 여기 밴드갭은 특정한 크기의 클러스터에서 스토크스 시프트가 50 내지 100nm임을 고려하면 발광 밴드갭로부터 예측할 수 있다. 다음의 표, 즉 표 1은 이 모델에 따른 Au 또는 Ag의 AQC에 대한 이론적 데이터를 나타내며, 즉 근사여기 λexc 및 발광 λem 파장은 상기 Jellium 모델을 사용하여 Au 또는 Ag의 AQC에서 ±50nm의 오차로 계산하였다: Eem = EF/N1/3; 여기서 Eem = 발광 에너지; N= AQC에서 원자의 번호; 및 EF = 금 및 은에 대해 동일한 약 5.5 eV인 Fermi 수준.
Figure pct00003

이들 값은 또한 나노시스템이 반응하여 나노좀의 내부 캐비티에서 OH 및 SH기를 다른 리간드로 교환하는 경우 실제로 변할 수 있다. 제한되지 않지만, 교환되는 리간드는 -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, -NR-로부터 선택될 수 있으며, 여기서 R은 나노좀을 형성할 수 있는 짧은 쇄 유기기를 나타낸다.
다시 말해서, 특정의 여기 및 발광 파장을 얻기 위해 사용되는 클러스터의 유형은 상기 표로부터 결정할 수 있다. 따라서 예를 들면 여기 파장 300nm, 발광파장 600nm 및 스토크스 시프트 300 nm를 갖는 시스템을 얻기 위하여 다음과 같은 클러스트 크기가 선택되어야 한다:
- 여기 클러스터 ("공여체", Mn): M3/M5,
- 발광 클러스터 ("수용체", M'n'): M'12/M'20.
본 발명의 범위에서, 용어 "전이금속의 조합"은 적어도 두 개의 상이한 전이금속의 원자들을 갖는 AQC는 물론, 상이한 크기의 적어도 두 개의 상이한 AQC가 동일한 전이금속을 갖는 AQC, 상이한 전이금속을 갖는 AQC, 또는 동일 또는 상이한 바이메탈 조합을 갖는 AQC일 수 있도록 첫번째와 상이한 또 다른 전이금속의 AQC의 존재하에 단일 전이금속의 AQC의 존재를 언급한다.
용어 "검출하다", "검출하는" 등은 정량적 및 정성적 측정을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "형광성 인 사이투 하이브리드화" 또는 "FISH"는 염색체에 대한 특이적 DNA 서열로 하이브리화 하는 표지핵산 프로브의 사용을 통하여 염색체에 대한 특이적 DNA 서열을 검출하거나 국재화하는 방법을 언급한다.
"고정화된"은 공유결합 또는 비공유결합 (예를 들면, 수소결합, 이온 상호작용, 반데르발스 힘, 또는 소수성 상호작용)에 의한 부착을 포함하는, 표면, 예를 들면 장치에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 것을 의미한다. "번역후 변형"(posttranslational modification)은 그의 번역 후 단백질의 화학적 변형을 의미한다. 이것은, 이들로 제한되지 않지만, 작용기의 부가 (예를 들면, 포스포릴화, 글리코실화, 아세틸화, 알킬화, 메틸화, 포르밀화, 산화 또는 비오틴화), 단백질 또는 펩티드의 부가 (예를 들면, 유비퀴틴화), 아미노산의 화학적 성질 변화 (예를 들면, 탈아민화 또는 탈메틸화), 및 구조적 변화 (예를 들면, 디설파이드 가교 또는 단백질 분해 절단)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역조직화학(IHC)"은 또한 "면역세포화학(ICC)"으로도 알려져 있으며, 세포에 적용되는 경우, 진단 병리학에서 도구(tool)를 언급하며, 여기서 모노클로날 항체의 패널은 (예를 들면, 림프종, 암종 및 육종을 분별하기 위해) 미분화 신생물의 분별 진단에서 사용되어 특정의 종양 유형 및 다른 질환에 특이적인 마커를 밝혀내고, 표현형 악성 림프종을 진단하고 또한 바이러스 항원, 종양성 단백질, 호르몬 수용체, 및 증식관련 핵단백질을 증명할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "키트"는 이들의 수송 및 저장을 허용하도록 포장된 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 상이한 시약을 함유하는 제품을 언급한다. 키트의 성분들을 포장하는데 적합한 재료는 결정, 플라스틱 (예를 들면, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트), 병, 바이얼, 종이, 또는 엔벨로프를 포함한다.
부호 "n" 및 "n"은 각각의 AQC의 전이금속원자의 수를 언급한다. 상기 코멘트한 바와 같이, n은 n'보다 더 작다 (n<n'). 바람직하게, n과 n' 사이의 최소 차이는 5개의 금속원자이다. 바람직한 실시형태에서, n과 n' 사이의 차이는 5 내지 50개의 원자이다. 특정의 실시형태에서 n과 n'사이의 차이는 5 내지 25개의 원자이며 또한 또 다른 실시형태에서, n과 n'사이의 차이는 5 내지 15이다.
전하이동 복합체에 부착될 수 있는 "유기 리간드"는 적어도 2개의 상이한 유형의 유기 리간드이며, 바람직하게는 상기 적어도 2개의 상이한 유형의 유기 리간드는 ω-하이드록시산(HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산(HS-(CH2)p-COOH) 리간드로부터 선택되며, 여기서 m 및 p은 2 내지 30의 35 값을 가지며, 바람직하게 m 및 p는 10 내지 20의 값을 갖는다. 특정의 실시형태에서 m 및 p는 15의 값을 갖는다. 또 하나의 특정 실시형태에서 m 및 p는 11의 값을 갖는다.
m 및 p의 값은 상이하거나 동일할 수 있다. m 및 p가 상이한 경우에, 이들 사이의 차이는 6개 미만의 탄소이고, 바람직하게 m과 5 p의 값들의 차이는 1 내지 4 이다. 바람직한 실시형태에서 m 및 p는 동일하다. 여기서 상기 적어도 2개의 상이한 유형의 유기 리간드는 ω-하이드록시산(HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산(HS-(CH2)p-COOH) 리간드로부터 선택되며, 상기 산기, -COOH, (또는 -COO-, 상응하는 산의 염이 사용되는 경우)는 나노화합물의 외부 표면을 지향하는 10이고, -OH 및 -SH 기는 내측을 지향하여, 즉 이들에 결합되고, 부착되거나 배위된 이온화 AQC인 Mn + 및 M'n' -를 지향한다.
또 다른 실시형태에서 전하이동 복합체에 부착된 15일 수 있는 "유기 리간드"는 하이드록실, -OH, 또는 메르캅토 이외의 다른 작용기, -SH 기, 예를 들어 -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, -NR-를 가지며, 여기서 R은 AQC 또는 이온화 AQC인 Mn + 및 M'n' -를 결합하거나, 부착하거나 배위할 수 있는 짧은 탄화수소 C1-C4의 유기기를 나타낸다. 또한 ω-하이드록시산 (HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH) 리간드의 하이드록실, -OH, 또는 메르캅토를 AQC의 금속들과 상호작용하는 상기 언급된 이들 다른 산과 교환하는 것이 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산 프로브"는 염색체 상에 특이적 DNA 서열로 인식하고 하이브리드화 하는 핵산 (예를 들어 DNA, RNA, PNA 등) 서열을 언급한다.
용어 "스페이스기" 또는 "스페이서"는 2개의 하위구조를 연결하는 화학구조의 일부를 언급한다. 이들 스페이서기는 본 출원에서 이후에 열거될 것이다. 스페이스기의 원자 및 스페이스기 내에 쇄의 원자는 그 자체로 화학결합에 의해 연결된다. 바람직한 스페이서 중에는 직선형 또는 분지형, 포화형 또는 불포화형 탄소사슬이 있다. 이들 탄소 사슬은 또한 사슬 내에 또는 사슬의 말단에서 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로원자"는 산소, 질소 및 황으로 이루어진 그룹으로터 선택된 탄소 이외의 원자를 의미한다. 스페이스기는 또한 사슬의 일부로서 또는 사슬중에 원자의 하나에 대한 치환으로서 사이클릭 또는 방향족 기를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 게놈 DNA, cDNA, 분리된 핵산 분자, 벡터 DNA, 및 염색체 DNA 등, 당해 분야에서 이해되는 바와 같은 그의 다양한 형태의 데옥시리보핵산을 의미하며, 이들과 상호 교환적으로 사용된다. "핵산"는 임의 형태의 DNA 또는 RNA를 언급한다. 분리된 핵산 분자의 예는, 이들로 제한되지 않지만, 벡터내에 함유된 재조합 DNA 분자, 이종 숙주세포에 유지된 재조합 DNA 분자, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 핵산 분자, 및 합성 DNA 분자를 포함한다. 일반적으로, "분리된" 핵산은 핵산이 유도되는 유기체의 게놈 DNA에 자연적으로 인접하는 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)을 함유하지 않는다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자는 일반적으로 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 다른 세포 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않거나 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 함유하지 않는다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의 길이의 아미노산의 중합체를 언급하기 위해 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 중합체는 선형, 환형 또는 분지형일 수 있다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며 또한 이것은 비아미노산에 의해 차단될 수 있다. 이 용어는 또한 설폰화, 글리코실화, 지질 화, 아세틸화, 인산화, 요오드화, 메틸화, 산화, 단백질 분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노닐화, 단백질에 아미노산의 전사 RNA 아미노 매개성 첨가, 예를 들어 아르기닐화, 유비퀴틴화, 또는 임의의 다른 조작, 예를 들어 표지성분과 의 결합를 통하여 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학이성체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 아미노산 펩티드모방체를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보호기"는 분자 마스크중의 반응성기에 부착되었을 때 반응성을 감소하거나 또는 방지하는 원지의 그룹을 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "반응성기"는 또 다른 화학기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 기를 언급하며, 즉 적절한 반응 조건하에 공유적으로 반응성이며, 또한 일반적으로 또 다른 물질의 부착점을 나타낸다. 반응성기는 일반적으로 친핵체, 친전자체 및 광활성화 기를 포함한다. 예시적인 반응성기는, 이들로 제한되지 않지만, 올레핀, 아세틸렌, 알코올, 페놀, 에테르, 산화물, 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 아민, 하이드라진, 히도라존, 하이드라지드, 디아조, 디아조늄, 니트르, 니트릴, 메르캅탄, 설파이드, 디설파이드, 설폭사이드, 설폰, 설폰산, 황산, 아세탈, 케탈, 무수물, 설페이트, 설펜산, 이소니트릴, 아미딘, 이미드, 이미데이트, 니토론, 하이드록실아민, 옥심, 히도록삼산, 티오하이드록삼산, 알렌, 오르토 에스테르, 아황산염, 엔아민, 인아민, 우레아, 슈도우레아, 세미카르바지드, 카르보이미드, 카르바메이트, 이민, 아지드, 아조 화합물, 오족시 화합물, 및 니트로소 화합물을 포함한다. 반응성 작용기는 또한 바이오결합체, 예를 들면 N-하이드록시석신이미드 에스테르, 말레이미드 등을 제조하는데 사용되는 것들을 포함한다. 이들 관능기의 각각을 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 또한 특정의 목적에 적용 또는 이를 위한 변형은 당업자의 능력의 범위 내이다(참조, 예를 들면 Sandler and Karo, eds., Organic Functional Group Preparations. Academic Press, San Diego, 1989).
본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"는 그의 가장 넓은 의미로 사용되며 또한 검출하고자 하는 생체분자를 함유하는 시료를 언급한다. 일부 실시형태에서, 시료는 토양, 물 또는 공기 등의 환경 시료이거나 또는 폐기물 흐름, 물 공급원, 공급 라인 또는 제조 로트로부터 취한 것과 같은 산업 공급원으로부터 유래한다. 다른 실시형태에서 시료는 생물 시료이다.
본 발명에서 사용되는 표현 "특이적 결합"이라 함은 비특이적 결합보다 실질적으로 더 높은 친화성을 갖는 두 개의 분자의 3차원 구조 사이에 상보성의 존재에 의해 제1 분자를 제2 분자에 특이적으로 결합하며, 따라서 상기 제1 및 제2 분자 사이의 결합이 바람직하게는 반응 혼합물 중에 존재하는 다른 분자에 대하여 상기 분자의 어느 것의 결합 전에 발생하는 능력을 언급한다. 상기 결합으로부터 얻어진 복합체는 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 10-12 M 미만, 10-13 M 미만, 10--14 M 미만 또는 10-15 M 미만의 해리상수(KD를 가질 때 두 분자의 결합에서 높은 친화력이 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "스트렙타비딘"은 Streptomyces avidinii (GenBank에서 수탁번호 CAA00084.1)로부터 단백질은 물론 아비딘과 동일한 방식으로 정의된 스트렙타비딘의 이종, 동종 단편에 상응한다.
본 명세서에서 정의되는 "스트린전트 조건" 또는 "높은 스트린전트 조건"은 일반적으로 (1) 세척을 위해 낮은 이온강도 및 높은 온도, 예를 들면 50℃에서0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1% 도데실황산나트륨을 사용하고; (2) 하이브리드화 도중에 포름아미드와 같은 변성제, 예를 들어 42℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨과 함께 pH 6.5에서 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액과 50% (v/v) 포름아미드를 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산 나트륨, 5x 덴드하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를, 0.2xSSC (염화나트륨/시트르산 나트륨) 및 50% 포름아미드 중에 42℃에서 세정액, 다음에 55℃에서 0.1xSSC 함유 EDTA로 이루어진 높은 스트린전시 세정액을 사용한다. 중정도의 스트린전트 조건은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 기술된 바와 같이 확인할 수 있으며 또한 상기 기술된 것보다 덜 스트린전트한 하이브리드화 조건 (예를 들면, 온도, 이온 강도 및 %SDS) 및 세정용액의 사용을 포함한다. 중정도의 스트린전트 조건의 일예는 20% 포름아미드, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/ml 변성된 절단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액중에 37℃에서 하룻밤 인큐베이션, 다음에 약 37 내지 50℃에서 1xSSC중에 필터를 세정한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자들을 수용하기 위하여 필요에 따라 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 생체분자의 검출용 결합 파트너로서 사용되는 뉴클레오티드는 임의의 길이, 예를 들면 길이 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 150, 적어도 200 등의 뉴클레오티드일 수 있다. 핵산은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산 (RNA), 펩티드 핵산(PNA), 전술한 것 중 임의의 것의 유도체 및 전술한 핵산의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 조성에 상관없이, DNA 또는 RNA 염기와 균등한 올리고뉴클레오티드의 각 단위는 "뉴클레오티드"로 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "태크"(tag)는 특이적 결합분자를 이용하여 상기 태그를 갖는 임의의 폴리펩티드의 검출/정제를 허용하는 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ω-하이드록시산"은 일반식 HO-(CH2)m-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 가짐)을 갖는 화합물을 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ω-메르캅토산"은 일반식 HS-(CH2)p-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 가짐)을 갖는 화합물을 언급한다.
발명의 상세한 설명
AQC - CTC 및 비오틴 결합분자의 비공유 복합체
본 발명의 발명자들은 스트렙타비딘이 AQC-CTC와 상호작용하여 이들의 형광 강도의 증가를 유도하고 또한 이러한 결합이 비오틴 또는 비오틴화 분자의 존재하에 역전되어 AQC-CTC 및 스트렙타비딘을 포함하는 복합체의 형광강도의 감소를 초래할 수 있다는 것을 관찰하였다.
따라서 제1 태양에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 적어도 2개의 상이한 크기 금속 원자 양자 클러스터(AQC), Mn 및 M'n'의 전하이동 복합체 및 비오틴 결합 분자를 포함하는 복합체에 관한 것이다:
Figure pct00004
상기 식에서,
금속 AQC의 금속 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며,
Mn은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며,
M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며,
Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며,
n 및 n'는 각각 M 및 M'의 금속원자의 수이며, 또한
n은 n'보작 작으며,
여기서 상기 비오틴 결합 분자 및 전하이동 복합체는 공유적으로 결합되지 않는다.
적어도 2개의 상이한 크기 금속 원자 양자 클러스터(AQC)의 전하이동 복합체, 특히 유기 리간드를 추가로 포함하는 전하이동 복합체는 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하며, 여기서 상기 리간드는 원자 양자 클러스터 Mn 및 M'n'에 부착되는 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산 등의 양친매성 분자이다:
a) 수성 매체중 염기의 존재하에 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산를 혼합시켜 나노좀을 제조하는 단계,
b) 단계 a)에서 제조된 혼합물에 적어도 하나의 금속염을 첨가하는 단계,
c) 단계 b)에서 얻어진 혼합물을 환원시키는 단계, 및
d) 단계 c)에서 얻어진 혼합물에 존재하는 나노좀을 분해하는 단계.
본 발명의 범위에서 용어 "나노좀"(nanosome)은 인공적으로 제조된 나노미터 크기의 소포에 관한 것이다. 따라서 용어 "나노좀"은 지방족 -(CH2)n- 쇄의 각 말단에서 또는 지방족 CH3-(CH2)n-쇄의 끝에서 세번째χ, 끝에서 두번째 Ψ 위치에서 서로 결합된 2개의 친수성기를 갖는 양친매성 분자의 한 층에 의해 형성된 구형 나노미터 초분자구조를 언급한다.
본 발명의 나노좀에서 상기 모노층을 형성하는 양친매성 분자는 다음을 포함한다:
- 예를 들면, 지방족 쇄의 한 말단에서 소포의 외부 표면상에 있는, 카르복실 (COOH), 카르복실레이트(COO-) 또는 포스페이트(PO4 -)기와 같은 친수성기; 및
- 지방족 CH3-(CH2)n- 쇄의 끝에서 세번째χ, 끝에서 두번째 Ψ위치에서 또는 지방족-(CH2)n-쇄의 마지막 ω 위치에서 예를 들면 -OH, -SH, -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, 또는 -NR- 등의 기로 치환되고, 여기서 R은 친수성기에 대하여 지방족 쇄의 다른 말단에서 또는 상기 지방족 쇄의 최종 위치에서 소포의 내측을 향하여 위치하는 나노좀을 형성할 수 있는, 짧은 탄화수소 C1-C4의 유기기를 나타내며, 상기 기들은 10 nm 또는 그 미만, 바람직하게는 약 5 nm 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 4 nm의 내부직경을 갖는 나노캐비티를 형성한다. 특정의 실시형태에서, 나노캐비티의 내부 직경은 약 1.5 내지 1.8 nm이다.
바람직한 실시형태에서 용어 "나노좀"은 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산에 의해 형성된 구형 나노미터 초분자 구조를 언급한다. 특정의 실시형태에서, 나노좀은 상기 정의한 바와 같이 ω-하이드록시산 (HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH)를 포함한다. 나노좀에 존재하는 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산은 나노시스템, 즉 나노좀의 외부표면을 지향하는 산기 -COOH (또는 -COO-, 상응하는 산의 염이 사용되는 경우) 또는 나노좀에서 내부 캐비티를 형성하는 내측을 지향하는 -OH 및 -SH기를 갖는 구형 단층을 형성하며, 따라서 두 개의 대략 동심 구체가 형성되거나 또는 문헌에서 인용된 바와 같이 지방산 "볼라"(bola) 형태이다. 이러한 구형 단일층은 약 2 내지 10 nm, 바람직하게는 약 5 nm의 두께를 가질 수 있다.
나노좀의 내부 캐비티는 폐쇄된다. 상기 내부 캐비티의 내부 직경은 10 nm 또는 그 미만, 바람직하게는 약 5 nm 또는 그 미만이며, 더욱 바람직하게 상기 내부 캐비티의 내부 직경은 약 0.8 내지 4 nm이다. 특정의 실시형태에서 이러한 내부 나노캐비티의 직경은 약 1.5 내지 1.8 nm이다. 나노좀의 이러한 특정의 실시형태에서, 상기 캐비티는 하이드록실, -OH, 및 메르캅토, -SH기에 의해 형성된다. 그러나 이들 작용기를 -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, -NR-(여기서 R은 나노좀을 형성할 수 있는 짧은 탄화수소 C1-C4의 유기기를 나타냄)과 상호작용하는 다른 것들로 교체하는 것이 가능한다.
테트라부틸암모늄 하이드록사이드, 테트라옥틸암모늄 하이드록사이드, 트리에틸벤질암모늄 하이드록사이드, 트리-n-옥틸메틸암모늄 하이드록사이드, 트리메틸데실암모늄 하이드록사이드, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드, 테트라에틸암모늄 하이드록사이드 또는 반대이온 등의 부피가 큰 기를 갖는 임의의 다른 하이드록사이드는, 바람직하게는 테트라부틸암모늄 하이드록사이드는 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산을 혼합하여 나노좀을 제조하는 단계 a)에서 염기로서 사용할 수 있다.
단계 b)에서 전이금속의 금속염들 또는 이의 조합이 사용될 수 있다. 금속염의 비제한적인 예는 전이금속의 질산염, 황산염, 아황산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 인산염, 수산화물, 시안산염, 카르복실산염, 티오말레산염, 티오글루코산염이다. 단일 금속염으로서 또는 다른 금속염과 조합하여 사용되는 이들 금속염의 예들은 AgNO3, CH3COOAg, Ag3AsO4, AgBrO3, AgBr, Ag2CO3, AgClO3, AgCl, AgCrO4, AgOCN, AgIO3, AgI, Ag2O, AgClO4, Ag3PO4, Ag2SO4, Ag2S, Ag2SO3, CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuI2, Cu2S, CuSCN, CuCN, CuCO3, Cu2O, Cu(OH)2, Cu(NO3)2, Cu(ClO4)2, Cu(HCO2)2 또는 Cu(CO2CH3)2이다. 조합형태로 사용되는 금 금속염의 비제한적인 예는HAuCl4, AuCl, AuCl3, HAuCl4, HAuCl4·aq, KAuCl4, LiAuCl4,(CH3)2SAuCl, C3H9AuClP, C6H15AuClP, C18H15AuClP, C8H11AuClP, C5H5AuCl3N, (C4H9)3PAuCl, C27H36AuClN2, C21H12AuClF9P, C20H27AuClP, C33H49AuClP, C42H63AuClO3P, C21H24AuClN2, C35H49AuF6NO4PS2 또는 (C20H15AuF6NO4PS2)·2C7H8이다.
단계 c)에서 얻어진 혼합물을 환원시키기 위한 단계 c)에서 사용된 환원 시스템 또는 환원제의 비제한적인 예는 NaBH4, DIBAH, LiAlH4, N2H4 또는 SnCl2일 수 있으며, 또한 더 온화한 환원제는 예를 들어 차아인산 나트륨, 아민, 당, 유기산, 폴리비닐피롤리돈 등의 중합체, UV-VIS 조사, 초음파 및 광환원일 수 있다.
본 발명의 단계 b) 및 c) 이후에, "AQC를 포함하는 나노좀"이 형성된다. 이들 "AQC를 포함하는 나노좀"은 이들의 내부 캐비티 내측에 즉 캡슐화된 내측에 적어도 2개의 상이한 크기의 AQC 즉 Mn 및 M'n'를 포함한다.
이들 "AQC를 포함하는 나노좀"의 특정한 예는 C., Journal of Colloid and Interface Science, 2209, Vol. 337, 2, 610-613에 기술되어 있으며, 이 문헌은 이들 나노시스템 내측에 금 입자 합성을 기술한다.
나노좀을 분해하는 단계는 이전에 합성된 나노좀의 탈에스테르화 공정이다. 이 단계는 상이한 메카니즘에 의해 수행할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 나노좀을 분해하거나 또는 나노좀을 불안정화하는 단계는 초원심분리를 사용하여 수행되지만, 당해 분야에 공지된 임의의 다른 수단도 또한 열처리 또는 pH 변동 등 나노좀을 분해하는데 유용할 수 있다. 전하이동 메카니즘은 나노좀을 분해하는 단계 중에 발생한다. 따라서 나노좀은 불안정화되며 또한 화학식(I)의 전하이동 복합체가 형성된다.
하나의 실시형태에서 금속성 AQC의 금속 즉 M 및 M'는 전이금속 또는 이의 조합으로부터 선택되며, 바람직하게는 전이금속은 Au, Ag, Co, Cu, Pt, Fe, Cr, Pd, Ni, Rh 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 이들은 Au, Ag, Cu 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 또한 더욱 바람직하게는 전이금속은 Au, Ag 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
형광의 여기 및 발광 파장은 AQC의 크기에 의존하기 때문에 필요한 크기의 AQC의 형성을 유도하여 여기 및 발광 파장을 선택할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 단지 하나의 전자는 적어도 두 개의 AQC 즉 Mn 및 M'n' 사이에 전송되며, 따라서 이온형태 Mn +, 즉 Mn 및 M'n'의 산화형태, M'n'의 환원형태를 수득하며, 여기서 "+"는 양전하이고 "-"는 음전하이다.
일부 실시형태에서, n 및 n'는 2 내지 309, 2 내지 102, 2 내지 55, 또는 2 내지 25개의 금속원자이다. 일부 실시형태에서 n과 n'사이의 차이는 5 내지 50개의 원자이다.
추가의 실시형태에서 n과 n'사이의 차이는 5 내지 50개의 원자 또는 5 내지 25개의 원자이다.
일부 실시형태에서 CTC는 원자 양자 클러스터 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서 비오틴 결합 분자는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 그의 임의 변이체이며, 이는 비오틴 결합 능력을 실질적으로 보존하며 또한 AQC-CTC의 형광 발광의 파라미터중 적어도 하나의 변화를 유도하는 방식으로 AQC-CTC와 상호작용한다. 아비딘 또는 스트렙타비딘 유사체 또는 변이체가 이들의 비오틴 결합 능력을 보유하고 있는지 여부를 검출하는 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들면 BioLayer Interferometry (BLI)를 기반으로 하는 WO2012058635에 기재된 방법을 포함하며, 여기서 광섬유의 선단에 결합된 분자층은 분자층으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 일으킨다. 광섬유의 선단에 결합된 분자의 수의 변화는 측정될 수 있는 간섭 패턴의 이동을 초래한다. 파장 시프트는 분자층의 두께의 직접적인 척도이다. 추가로, 시프트는 실시간으로 측정할 수 있기 때문에, 결합 및 해리 속도는 지체없이 결정할 수 있다.
소정의 아비딘 또는 스트렙토아비딘 변이체가 AQC-CTC의 형광발광의 파라미터중 적어도 하나의 변화를 유도하는 방식으로 AQC-CTC와 상호작용하는지 여부를 결정하는데 적합한 방법은 당업자에게 이용가능하며 또한 예를 들면 본 출원의 실시예 1에 기술된 방법을 포함하며, 여기서 AQC-CTC는 스트렙토아비딘 변이체와 접촉하며 형광강도의 변화 (증가)가 결정된다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합분자는 비오틴의 실질적 결합활성을 보유하는 스트렙타비딘 또는 아비딘이며, 예를 들면 천연 스트렙타비딘 또는 아비딘의 적어도 50% 또는 그 이상이 각각 사용될 수 있다. 바람직하게 비오틴을 위한 아비딘 변이체의 친화성은 적어도 1015 M-1, 1014 M-1, 1013 M-1, 1012 M-1, 1010 M-1 또는 109 M-1이다.
편의상, 본 설명에 있어서, 본 발명에서 사용되는 용어 "아비딘" 및 "스트렙타비딘"은 이러한 결합 쌍 멤버들의 비오틴 결합 단편, 돌연변이체 및 코어 형태를 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 비오틴 결합능력 및 AQC-CTC에 의한 형광 발광에 대한 효과는 실질적으로 보유된다. 아비딘 및 스트렙타비딘은 상업적 공급업체로부터 입수가능하다. 더욱이, 스트렙타비딘 및 아비딘을 인코딩하는 핵산서열 및 스트렙타비딘 및 아비딘 아미노산 서열은 예를 들면 GenBank 수탁번호 X65082; X03591; NM --205320; X05343; Z21611; 및 Z21554에서 발견할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 아비딘 및 스트렙타비딘은, 한정되지 않지만, 다음을 포함한다:
- 스트렙타비딘 잔기 13-138, 14-138, 13-139 및 14-139를 포함할 수 있는 전장 스트렙타비단 폴리펩티드의 절단형인 "코어 스트렙타비딘", 참조, 예를 들면 Pahler et al., (J Biol Chem 1987:262:13933-37).
- 비오틴에 강력한 결합을 보유하는 스트렙타비딘 및 아비딘의 절단형 (참조, 예를 들면 Sano et al., (J Biol Chem 1995;270:28204-09) (코어 스트렙타비딘 변이체 16-133 및 14-138를 기술한다) (미국특허 제6,022,951호).
- 실질적인 비오틴 결합활성 또는 증가된 비오틴 결합활성을 유지하는 스트렙타비딘의 돌연변이체 및 스트렙타비딘의 코어형태. 참조, Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(5):1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol 1996;14(8):1007-1011.
- 잠재적 T 세포 에피토프 또는 림프구 에피토프를 제거하기 위해 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 변형된 돌연변이체와 같은 감소된 면역원성을 갖는 돌연변이체. 참조, Meyer et al., Protein Sci 2001;10:491-503.
- 실질적인 비오틴 결합활성 또는 증가된 비오틴 결합활성을 유지하는 아비딘의 코어 형태 및 아비딘의 돌연변이체가 사용될 수 있다. 참조, Hiller et al., J Biochem 1991;278:573-85; Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5076-80.
- 글리코실화의 전체적 또는 부분적인 변형으로부터 얻어지는 것과 같은 아비딘의 화학적 변형에 의한 변이체 및 그의 단편은 물론 뉴트라비딘으로 알려진 완전히 탈글리코실화된 아비딘 변이체.
- 국제공개 WO05047317A1에 기술된 바와 같은 아비딘 돌연변이체.
- 국제공개 WO06045891에 기술된 바와 같은 아비딘 유사 단백질.
- 국제공개 WO0198349에 기술된 바와 같이 재조합 아비딘.
- 국제공개 WO0027814에 기술된 바와 같은 아비딘 변이체.
- 국제공개 WO06084388에 기술된 바와 같은 단량체 스트렙타비딘.
- 국제공개 WO06058226에 기술된 것과 같은 변형 스트렙타비딘 이량체.
- 국제공개 WO04018509에 기술된 바와 같은 비오틴 결합 능력을 갖는 단백질.
- 국제공개 WO9840396에 기술된 바와 같은 비오틴의 높은 친화성을 갖는 스트렙타비딘.
- 국제공개 WO9640761에 기술된 바와 같은 변형된 스트렙타비딘 및 아비딘 분자.
- 국제공개 WO9711183에 기술된 바와 같은 스트렙타비딘 돌연변이체.
- 국제공개 WO9624606에 기술된 바와 같은 변형된 친화성을 갖는 스트렙타비딘.
상이한 아비딘 변이체는 Extravidin (Sigma-Aldrich), NeutrAvidin (Thermo Scientific), NeutrAvidin (Invitrogen) 및 NeutraLite (Belovo)등 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합 분자는 스트렙타비딘의 기능적으로 동등한 변이체이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "스트렙타비딘의 기능적으로 동등한 변이체"는 스트렙타비딘의 비오틴 결합능력을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드로 이해된다. 스트렙타비딘V의 기능적으로 동등한 변이체는 이들의 전장에 걸쳐 스트렙타비딘과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%의 유사성 또는 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비공유적으로 결합된"은 비오틴 결합 분자 및 전하이동 복합체가 CTC-AQC의 원자와 비오틴 결합 분자의 원자 사이의 공유결합에 관여하지 않는 분자간 힘에 의해 상호작용한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, CTC-AQC과 비오틴 결합 분자는 수소결합, 소수성 상호작용, 이온결합 또는 그의 조합에 의해 연결된다.
일부 실시형태에서, CTC는 여기에 부착된 유기 리간드를 추가로 포함한다. CTC에 부착할 수 있는 "유기 리간드"는 적어도 2개의 상이한 유형의 리간드이며, 바람직하게는 적어도 2개의 상이한 유형의 유기 리간드는 ω-하이드록시산(HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH) 리간드로부터 선택되며, 여기서 m 및 p는 2 내지 30의 값을 가지며, 바람직하게는 m 및 p는 10 내지 20의 값을 갖는다. 특정의 실시형태에서, m 및 p는 15의 값을 갖는다. 또 다른 특정의 실시형태에서, m 및 p는 11의 값을 갖는다. m 및 p의 값은 상이하거나 동일할 수 있다. m 및 p가 상이한 경우에, 이들 사이의 차이는 6개 미만의 탄소이고, 바람직하게 m 및 p의 값들 사이의 차이는 1 내지 4이다. 바람직한 실시형태에서 m 및 p는 동일하다. 여기서 적어도 2개의 상이한 유형의 유기 리간드는 ω-하이드록시산(HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH) 리간드로부터 선택되며, 산기 -COOH, (또는 -COO-, 상응하는 산의 염이 사용되는 경우)는 나노화합물의 외부 표면을 지향하며 또한 -OH 및 -SH 기는 내측을 지향하며, 즉 이들에 결합되거나, 부착되거나 또는 배위되는 이온화 AQC인 Mn + 및 M'n' -를 지향한다.
다른 실시형태에서, 전하이동 복합체에 부착될 수 있는 "유기 리간드"는 하이드록실, -OH, 또는 메르캅토 이외의 작용기, -SH 기, 예를 들어 -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, -NR-를 가지며, 여기서 R은 AQC 또는 이온화 AQC, 즉 Mn + 및 M'n' -에 결합, 부착 또는 배위될 수 있는 짧은 탄화수소쇄, C1-C4의 유기기를 나타낸다. 또한 ω-하이드록시산(HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH) 리간드의 하이드록실, -OH 또는 메르캅토를 AQC의 금속과 상호작용하는 상기 언급된 다른 것들과 교체하는 것이 가능하다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합 분자가 스트렙타비딘인 경우, 본 발명에 따른 복합체는 4개의 스트렙타비딘 단량체를 함유하며 가변수의 CTC-AQC를 갖는 호모테트라머이다. 일부 실시형태에서, 복합체는 복합체당 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 8, 적어도 12, 적어도 16, 적어도 20 또는 그 이상의 CTC-AQC 및 스트렙타비딘의 호모테트라머에 의해 형성된다.
AQC-CTC 및 비오틴 결합 분자를 포함하는 부품 키트
또 하나의 실시형태에서, 본 발명은 하기 (i) 및 (ii)를 함께 또는 별도로 함유하는 부품 키트에 관한 것이다:
(i) 적어도 2개의 상이한 크기 금속원자 양자 클러스터 (AQC) Mn 및 M'n'의 전하 이동 복합체 (여기서 상기 전하 이동 복합체는 청구항 1항에서 정의된 바와 같은 화학식(I)을 가지며, 또한 금속 AQC의 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며, Mn 은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 적은 AQC이며, M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며, Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며, n 및 n'는 각각 금속원자의 수이다) 및
(ii) 비오틴 결합 분자.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합분자는 본 발명의 복합체과 관련하여 언급되는 스트렙타비딘 또는 임의의 비오틴 결합분자이다.
일부 실시형태에서, 금속 원자 양자 클러스터의 금속 M 및 M'는 독립적으로 전이금속 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 금속 원자 양자 클러스터의 금속 M 및 M'는 독립적으로 전이금속 Au, Ag, Cu 및 이의 조합 및 바람직하게는 Au, Ag 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, n 및 n'는 2 내지 309, 2 내지 102, 2 내지 55, 또는 2 내지 25 금속원자의 값을 갖는다. 일부 실시형태에서, n과 n' 사이의 차이는 5 내지 50개의 원소이다. 일부 실시형태에서, 전하이동 복합체는 일반식 HO-(CH2)m-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 갖는다) 또는 HS-(CH2)p-COOH (여기서 m은 2 내지 3의 값을 갖는다)를 갖는 원자 양자 클러스터 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산을 추가로 포함하며, 여기서 m 및 p의 값에 관한 상이한 실시형태 및 상기 값들 사이의 차이는 본 발명의 복합체와 관련하여 기술된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 키트의 부품들은 별개의 용기에서 발견된다.
키트의 부품을 포장하는데 적합한 물질은 결정, 플라스틱 (폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트 등), 병, 바이알, 종이, 엔벨로프 등을 포함한다. 추가적으로, 본 발명의 키트는 키트 내에 있는 동시적, 연속적 또는 개별적 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 인쇄 재료 형태 또는 대상에 의해 해독될 수 있도록 설명서를 저장할 수 있는 전자 지지체, 예를 들면 전자 저장 매체 (자기 디스크, 테이프 등), 광학 매체 (CD-ROM, DVD)등의 형태일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 설명서를 제공하는 인터넷 주소를 포함할 수 있다.
AQC-CTC를 이용한 비오틴화 분자의 검출을 위한 경쟁분석
본 발명의 발명자들은 AQC-CTC의 형광강도가 스트렙타비딘의 존재하에 증가되며 또한 형광에서 이러한 증가가 비오틴 또는 비오틴화 분자의 존재하에 역전하며, 따라서 AQC-CTC의 형광강도의 변화를 측정함으로써 시료에서 비오틴 또는 비오틴화 분자의 검출을 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 임의의 이론에 의해 구속되지 않지만, AQC-CTC는 AQC-CTC에 의해 발광된 형광강도의 증가를 초래하는 방식으로 비오틴 결합 분자와 상호작용할 수 있다. 이러한 결합은 비오틴 또는 비오틴 유사체의 존재하에 역전되며, 이것은 AQC-CTC의 방출 및 이들의 형광의 감소를 유도한다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 시료에서 비오틴화 분자의 검출방법으로서,
(i) 비오틴화 분자가 상기 복합체 중의 비오틴 결합분자에 결합하기에 적합한 조건하에 상기 시료를 청구항 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따는 복합체와 접촉시키는 단계, 및
(ii) AQC의 여기파장에서 시료의 여기에 대한 반응에 따른, 단계(i)의 접촉 후에 AQC에 의한 형광발광의 강도 변화를 검출하는 단계를
포함하며, 여기서 접촉 단계 후에 AQC에 의해 발광된 형광강도의 감소는 시료에 비오틴화 분자가 존재함을 나타내는 것인 검출방법에 관한 것이다.
제1 단계에서, 비오틴화 분자를 함유하는 것으로 생각되는 시료는 비오틴 결합 분자 및 CTC-AQC를 함유하는 조성물과 접촉된다.
일부 실시형태에서, 금속 원자 양자 클러스터의 금속 M 및 M'는 독립적으로 전이금속 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, M 및 M'는 독립적으로 전이금속 Au, Ag, Cu 및 이의 조합, 및 더욱 바람직하게는 Au, Ag 및 이의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, n 및 n'는 2 내지 309, 2 내지 102, 2 내지 55, 또는 2 내지 25개의 금속원자이다. 일부 실시형태에서, n과 n' 사이의 차이는 5 내지 50개의 원자이다.
일부 실시형태에서, AQC-CTC는 원자 양자 클러스터 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 원자 양자 클러스터 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산은 일반식 HO-(CH2)m-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 갖는다) 또는 HS-(CH2)p-COOH (여기서 m은 2 내지 3의 값을 갖는다)를 가지며, 여기서 m과 p의 값들에 관한 상이한 실시형태 및 상기 값들 사이의 차이는 본 발명의 복합체와 관련하여 기술된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합분자는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이의 임의 변이체이며, 이는 비오틴 결합능력을 실질적으로 보유하며 또한 AQC-CTC의 형광 발광의 파라미터중 적어도 하나의 변화를 유도하는 방식으로 AQC-CTC와 상호작용한다. 아비딘 또는 스트렙토아비딘 유사체가 이들의 비오틴 결합 능력을 보유하고 있는지 여부를 검출하는 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들면 BioLayer Interferometry (BLI)를 기반으로 하는 WO2012058635에 기재된 방법을 포함하며, 여기서 광섬유의 선단에 결합된 분자층은 분자층으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 일으킨다. 광섬유의 선단에 결합된 분자의 수의 변화는 측정될 수 있는 간섭 패턴의 이동을 초래한다. 파장 시프트는 분자 층의 두께의 직접적인 척도이다. 추가로, 시프트는 실시간으로 측정할 수 있기 때문에, 결합 및 해리 속도는 지체없이 결정할 수 있다.
소정의 아비딘 또는 스트렙토아비딘 변이체가 AQC-CTC의 형광발광의 파라미터중 적어도 하나의 변화를 유도하는 방식으로 AQC-CTC와 상호작용하는지 여부를 결정하는데 적합한 방법은 당업자에게 이용가능하며 또한 예를 들면 본 출원의 실시예 1에 기술된 방법을 포함하며, 여기서 AQC-CTC는 스트렙타비딘 변이체와 접촉하며 형광강도의 변화 (증가)가 결정된다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합분자는 비오틴의 실질적 결합활성을 보유하는 스트렙타비딘 또는 아비딘이며, 예를 들면 천연 스트렙타비딘 또는 아비딘의 적어도 50% 또는 그 이상이 각각 사용될 수 있다. 바람직하게 비오틴을 위한 아비딘 변이체의 친화성은 적어도 1015 M-1, 1014 M-1, 1013 M-1, 1012 M-1, 1010 M-1 또는 109 M-1이다.
일부 실시형태에서, "비오틴 결합 분자"는 AQC-CTC의 비공유결합 복합체 및 비오틴 결합 분자과 관련하여 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 아비딘 및 스트렙타비딘은, 한정되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 스트렙타비딘 및 아비딘의 절단형태인 코어 스트렙타비딘 (참조, Sano et al., (J Biol Chem 1995;270:28204-09) (코어 스트렙타비딘 변이체 16-133 및 14-138를 기술한다) (미국특허 제6,022,951호), 실질적인 비오틴 결합활성 또는 증가된 비오틴 결합활성을 유지하는 스트렙타비딘의 코어형태 및 스트렙타비딘의 돌연변이체. 참조, Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(5):1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol 1996;14(8):1007-1011. 잠재적 T 세포 에피토프 또는 림프구 에피토프를 제거하기 위해 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 변형된 돌연변이체와 같은 감소된 면역원성을 갖는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘의 코어 형태의 돌연변이체. 참조, Meyer et al ., Protein Sci 2001;10:491-503. 실질적인 비오틴 결합활성 또는 증가된 비오틴 결합활성을 유지하는 아비딘의 코어 형태 및 아비딘의 돌연변이체가 사용될 수 있다. 참조, Hiller et al., J Biochem 1991;278:573-85; Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5076-80. 글리코실화의 전체적 또는 부분적인 변형으로부터 얻어지는 것과 같은 아비딘의 화학적 변형에 의한 변이체 및 그의 단편은 물론 뉴트라비딘으로 알려진 완전히 탈글리코실화된 아비딘 변이체, 국제공개 WO05047317A1에 기술된 바와 같은 아비딘 돌연변이체, 국제공개 WOO6045891에 기술된 바와 같은 아비딘 유사 단백질, 국제공개 WO200198349에 기술된 바와 같은 재조합 아비딘, 국제공개 WO0027814에 기술된 바와 같은 아비딘 변이체, 국제공개 WO06084388에 기술된 바와 같은 단량체 스트렙타비딘, 국제공개 WO06058226에 기술된 것과 같은 변형 스트렙타비딘 이량체, 국제공개 WO04018509에 기술된 바와 같은 비오틴 결합 능력을 갖는 단백질, 국제공개 WO9840396에 기술된 바와 같은 비오틴의 높은 친화성을 갖는 스트렙타비딘, 국제공개 WO9640761에 기술된 바와 같은 변형된 스트렙타비딘 및 아비딘 분자, 국제공개 WO9711183에 기술된 바와 같은 스트렙타비딘 돌연변이체, 국제공개 WO9624606에 기술된 바와 같은 변형된 친화성을 갖는 스트렙타비딘, 상이한 아비딘 변이체는 Extravidin (Sigma-Aldrich), NeutrAvidin (Thermo Scientific), NeutrAvidin (Invitrogen) 및 NeutraLite (Belovo)등 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합 분자는 아미노산, 펩티드, 단백질, 티라민, 다당류, 이온착체생성 모이어티, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 헵텐, 프소랄렌, 약물, 호르몬, 지질, 지질 집합체, 중합체, 중합체 마이크로입자, 생물세포 또는 바이러스이다. 더욱 전형적으로, 기질은 펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이다.
하나의 실시형태에서, 비오틴화 분자는 아미노산 (보호되거나 또는 인산염, 포스폰산염, 또는 C1 내지 C25 카르복실산에 의해 치환된 것을 포함한다)이거나, 또는 펩티드 또는 단백질과 같은 아미노산의 중합체이다. 펩티드의 바람직한 결합체는 적어도 5개의 아미노산, 더욱 바람직하게 5 내지 36개의 아미노산을 포함한다. 바람직한 펩티드는, 이들로 제한되지 않지만, 뉴로펩티드, 사이토카인, 독소, 프로테아제 기질 및 단백질 키나제 기질을 포함한다. 바람직한 단백질 결합체는 효소, 항체, 렉틴, 글리코단백질, 히스톤, 알부민, 리포단백질, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 피코빌리 단백질 및 다른 형광 단백질, 호르몬, 독소, 케모카인 및 성장인자를 포함한다. 하나의 바람직한 양상에서, 복합 단백질 피코빌리단백질, 예를 들면 알로피코시아닌, 피코시아닌, 피코에리트린, 알로피코시아닌 B, B-피코에리트린, 및 피코에리트로시아닌이다 (예를 들면, 미국특허 5,714,386 (Roederer) (1998) 참조).
하나의 실시형태에서, 생체분자는 항체 (무손상 항체, 항체단편, 및 항체 혈청을 포함한다), 아미노산, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘, 비오틴 (예를 들면, 아미도비오틴, 비오시틴, 데스티오비오틴 등), 혈액성분 단백질(예를 들면, 알부민, 피브리노겐, 플라스미노겐 등), 덱스트란, 효소, 효소 억제제, IgG-결합 단백질 (예를 들면, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 등), 형광 단백질 (예를 들면, 피코빌리단백질, 애쿠오린, 녹색 형광 단백질 등), 성장인자, 호르몬, 렉틴 (예를 들면, 소맥배아 응집소, 콘코나발린 A 등), 리포 다당류, 금속결합 단백질 (예를 들면, 칼모듈린 등), 미생물 또는 그의 단백질 (예를 들면, 박테리아, 바이러스, 효모 등), 뉴로펩티드 및 다른 생물학적 활성인자(예를 들면, 더모르핀, 델트로핀, 엔도모르핀, 엔도르핀, 종양괴사인자 등), 비생물학적 마이크로입자(예를 들면, 강자성 유체, 금, 폴리스티렌 등), 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 독소 (예를 들면, 아파민, 붕아로톡신, 팔로이딘 등), 인지질 결합 단백질 (예를 들면, 아넥신 등), 소분자 약물 (예를 들면, 메토트렉세이트 등), 구조 단백질(예를 들면, 악틴, 피브로넥틴, 라미닌, 미소관 결합 단백질, 튜블린 등), 또는 티라미드이다.
다른 실시형태에서, 생체분자는 핵산염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 핵산 중합체이다. 바람직한 핵산 중합체는 단일 또는 다중 가닥, 천연 또는 합성 DNA 또는 RNA, DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드, 또는 DNA/RNA 하이브리드이거나 또는 모르폴린 유도체화 인산염 등의 이상 링커, 또는 N-(2-아미노에틸)글리신 단위 등의 펩티드핵산을 도입한다. 핵산이 합성 올리고뉴클레오티드인 경우, 전형적으로 50개 이하의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로 25개 이하의 뉴클레오티드를 함유한다.
또 다른 실시형태에서, 생체분자는 전형적으로 다당류, 예를 들어 덱스트란, 헤파린, 글리코겐, 아밀로펙틴, 만난, 이눌린, 전분, 아가로스, 및 셀룰로오스인 탄수화물이다. 대안적으로, 탄수화물은 리포다당류인 다당류이다. 바람직한 다당류접합체는 덱스트란 또는 리포다당류 접합체이다.
일부 실시형태에서, 비오틴결합 분자는, 비오틴 결합분자에 대한 친화성이 비오틴 보다 낮은 비오틴 유사체와의 복합체로서 제공된다. 이들 비오틴 유사체는 비오틴의 부재하에 비오틴 결합 분자에 결합할 수 있다. 시료가 비오틴화 분자를 함유하는 경우, 비오틴은 비오틴 결합 모이어티에 대한 그의 높은 친화성 때문에 비오틴 결합분자로부터 유사체를 교체하며, 이것은 올리고-비오틴과 스트렙타비딘 사이의 상호작용 때문에 발광 최대강도의 감소를 초래한다.
적절한 비오틴 유사체는 1 x 10-13M 이상의 KD를 갖는 비오틴 결합 분자를 결합하는 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴 유사체는 1 x 10-13 M 내지 1 x 10-8 M, 1 x 10-12 M 내지 1 x 10-9 M, 또는 1 x 10-11 M 내지 1 x 10-9 M, 10-13 M 내지 10-4 M, 10-12 M 내지 l0-4, 10-11 M 내지 10-4 M, 10-10 M 내지 10-4 M, 10-9 M 내지 10-4 M, 10-8 M 내지 10-4 M, 10-7 M 내지 10-4 M, 또는 10-6 M 내지 10-4 M의 KD를 갖는 비오틴 결합 분자를 결합하는 화합물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 비오틴 유사체는, 제한되지 않지만, HABA (4-하이드록시아조벤젠-2-카르복실산), 2-아지도비오틴, 2-아지도비오티닐 아데닐레이트, 2-프로파길 (2-프로피닐)비오틴, 스트렙-태그 II 펩티드 서열(Trp-Ser-His-Pro-Glu-Phe-Glu-Lys) (서열번호:1) (Schmidt TGM and Skerra A, Nature Prot. 2007, 2, 1528-1535), 2-이미노비오틴, 비오시틴(-비오티노일-L-라이신), 비오틴 에틸렌디아민, 비오틴 카다베린, 비오틴-X 카다베린, DSB-X 데스티오비오시틴 (-데스티오비오티오닐-L-라이신) 및 DSB-X 비오틴 에틸렌디아민 및 클로로아세틸화 비오틴 유도체(CABI) 또는 WO2012058635에 기술된 비오틴 유사체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합 분자는 고체 지지체에 결합된다. 비제한적인 예시적 고체 지지체는 중합체 (예를 들면 아가로스, 세파로스, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 알기네이트, 테프론, 라텍스, 아크릴아미드, 나일론, 플라스틱, 폴리스티렌, 실리콘 등), 유리, 실리카, 세라믹 및 금속을 포함한다. 이러한 고체 지지체는 임의의 형태, 예를 들면 입자 (마이크로입자를 포함한다), 시이트, 딥-스틱, 겔, 필터, 멤브레인, 마이크로섬유 스트립, 튜브, 웰, 플레이트 (예를 들어, 6-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 등을 포함하는 마이크로플레이트), 섬유, 모세관, 빗(comb), 피펫 팁, 마이크로어레이 칩 등를 취할 수 있다. 일부 실시형형태에서, 비오틴 결합 모이어티는 고체 지지체의 표면과 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체의 표면은 불규칙한 표면, 예를 들면, 다공성, 입상, 섬유상, 웹상 도는 소결된 표면을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이 칩 및 마이크로입자로부터 선택된다. 일부 실시형태에서 고체 지지체는 적어도 부분적으로는 중합체로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 마이크로입자 고체 지지체는 단분산 또는 다분산 구형 비드를 포함한다. 단분산 마이크로입자는 실질적으로 균일한 크기이며 (즉 이들은 5% 미만의 직경 표준편차를 가지며), 반면 다분산 마이크로입자는 크기가 변한다. 일부 실시형태에서, 마이크로입자는 전체에 걸쳐 동일 중합체로 이루어지거나, 또는 코어-쉘 중합체이며, 여기서 마이크로입자의 코어는 하나의 중합체로 이루어지며, 또한 외부 층 (또는 "쉘")은 다른 중합체로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 마이크로입자는 자성이 있다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합 모이어티은 비오틴결합 부분의 아미노 또는 설프하이드릴을 통하여 고체 지지체에 부착된다. 일부 이러한 실시형태에서, 고체 지지체의 표면은 자유 아민 또는 설프하이드릴기와 반응할 수 있는 기를 포함한다. 비제한적 예시적인 이러한 기는 카르복시, 활성 할로겐, 활성화 2-치환된 에틸설포닐, 활성화 2-치환된 에틸 카르보닐, 활성 에스테르, 비닐설포닐, 비닐카르보닐, 알데하이드, 에폭시 등을 포함한다. 일부 이러한 기는 자유 아민 또는 설프하이드릴기와 반응할 수 있는 기를 제공하기 위하여 추가적인 반응물의 사용을 필요로 할 수 있다. 비제한적 예시적인 추가 반응물은 시안화 브롬, 카르보닐디이미다졸, 글루타르알데하이드, 하이드록실숙신이미드, 염화토실 등을 포함한다.
많은 고체 지지체는 당해 분야에 알려져 있으며 또한 당업자는 의도한 용도에 따라 적절한 고체 지지체를 선택할 수 있다. 유사하게, 고체 지지체가 그의 표면에 부착된 비오틴 결합 모이어티와 상업적으로 이용할 수 없는 경우, 당업자는 고체 표면에 비오틴결합 부분을 부착할 수 있는 적절한 방법을 선택할 수 있다. 예시적인 이러한 방법은 미국출원 공개 2008/022004 Al에 기술되어 있다.
접촉단계 (i)은 비오틴화 분자가 비오틴 결합분자에 결합하기에 적합한 조건하에 수행된다.
용어 "결합에 적합한 조건"은 비오틴화 분자가 비오틴 결합 분자에 결합할 수 있는 예를 들면 온도, 염농도, pH 및 단백질 농도의 조건을 언급한다. 정확한 결합 조건은 분석의 성질에 따라 변할 것이다. 비오틴화 분자 및 비오틴 결합 분자의 결합은 100%로 결합할 필요는 없는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 본질적으로 100%가 결합되며, 즉 적어도 50%가 적어도 결합되고, 적어도 75%가 결합되고, 적어도 80%가 결합되고, 적어도 85%가 결합되거나 또는 적어도 95%가 결합된다. 결합을 위한 온도는 15℃ 내지 37℃로 변할 수 있지만, 바림작하게는 실온 내지 약 30℃일 것이다. 비오틴 결합 분자의 농도 또는 결합 반응에서 비오틴결합 분자 및 AQC-CTS를 함유하는 복합체의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 농도는 변할 것이지만, 바람직하게는 약 10 pM 내지 10 nM일 것이다.
본 발명에 따른 경쟁분석을 이용한 비오틴화 분자의 결정방법의 제2 단계에서, 단계(i)의 접촉 결과로서 AQC-CTC에 의한 형광발광의 강도에서의 변화가 결정된다. 상기 강도는 비오틴화 분자의 존재하에 변화되는 형광발광의 유일한 파라미터인 것으로 당업자에게 이해될 것이다. 따라서 일부 실시형태에서, 단계 (ii)에서 결정은 발광파장의 결정, 형광의 평균수명의 결정 또는 전하이동 복합체의 비등방성의 결정을 포함하지 않는다.
본 발명의 방법의 제2 단계를 수행하기 위하여, 접촉단계 (i)를 수행한 후에 얻어진 시료는 검출가능한 광학 반응을 제공하기 위해 선택된 광의 파장으로 조명되며 또한 광학 반응을 검출하기 위한 수단으로 관찰된다.
당업자는 AQC-CTC로부터 형광발광을 얻기 위해 필요한 여기파장이 본 방법에서 사용된 CTC의 정확한 성질에 의존하는 것으로 이해할 것이다. 여기파장은 통상의 기술에 의해 당업자에 의해 결정될 수 이다. 예를 들면, 클러스터 여기 및 발광 파장의 근사 평가는 Jellium 모델 (참조, 예를 들면 J.Calvo et al., Encyclopedia of Nanotechnology, Ed. by B. Bhushan, Springer Verlag, 2011)을 사용하여 결정할 수 있다. 이 모델은 매우 근사한 방법으로 클러스터의 금지된 에너지 밴드갭 및 따라서 그의 발광 밴드갭의 위치를 예측한다. 결국 클러스터의 여기 밴드갭은 특정의 크기의 클러스터에서 스트로크스 시프트가 약 50 내지 100nm인 것을 고려하여 발광 밴드갭을 예측할 수 있다. 다음 표, 즉 표 1은 이 모델에 따른 Au 또는 Ag의 이론적 데이터를 나타내며, 즉 근사여기 λexc 및 발광 λem 파장은 상기 Jellium 모델을 사용하여 Au 또는 Ag의 AQC에서 ±50nm의 오차로 계산하였다: Eem = EF/N1/3; 여기서 Eem = 발광 에너지; N= AQC에서 원자의 번호; 및 EF = 금 및 은에 대해 동일한 약 5.5 eV인 EF = Fermi 수준.
클러스터 λexc.(nm) λem (nm)
A2 200-250 300
A3 240-290 340
A4 270-320 370
A5 300-350 400
A6 325-375 425
A7 350-400 450
A10 400-450 500
A12 440-490 540
A15 475-525 575
A20 535-585 635
A25 580-630 680
A30 630-680 730
A40 700-750 800
본 발명의 염료 화합물을 조명하는데 유용한 장치는, 이들로 제한되지 않지만, 핸드 헬드 자외선 램프, 수은 아크램프, 제논 램프, 레이저 및 레이저 다이오드를 포함한다. 아들 조명광원은 레이저 스캐너, 형광 마이크로플레이트 리더, 표준 또는 미니플루오로미터, 또는 크로마토그래피용 검출기로 선택적으로 통합된다.
시료 중에 비오틴 또는 비오틴화 분자의 존재는 블랭크 시료, 즉 임의의 비오틴 또는 비오틴화 분자를 결여한 시료의 존재하에 CTC의 형광에 대하여, 또는 시료와 접촉하기 전에 형광에 대하여, CTC가 방출되는 형광 강도의 감소를 초래한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광의 감소"는 형광강도의 감소를 의미한다. 일부 실시형태에서, 비오틴화 생체분자 또는 비오틴의 존재하에 시료에서의 형광은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100% 감소하며, 즉 형광은 비오틴화 분자의 부재하에 형광에 대하여 (즉 임의의 비오틴 또는 비오틴화 분자를 함유하지 않는 시료에서의 형광에 대하여) 또는 시료의 첨가 전에 형광 발광에 대하여 검출할 수 없다.
광학반응은 시각검사에 의해, 또는 다음 장치들: CCD 카메라, 비데오 카메라, 사진 필름, 레이저 스캐닝 장치, 형광광도계, 포토다이오드, 퀀텀 카운터, 에피형광 현미경, 스캐닝 현미경, 플로우 사이토미터, 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 또는 광전자 증배관과 같은 신호를 증폭하는 장치에 의해 선택적으로 검출된다. 시료가 플로우 사이토미터를 사용하여 조사하는 경우, 시료의 조사는 이들의 형광 반응에 따라 시료의 분류 부분을 선택적으로 포함한다.
AQC-CTC 및 생체분자를 포함하는 접합체
상술한 CTC-AQC는 일반식 HO-(CH2)m-COOH를 갖는 ω-하이드록시산 리간드 또는 일반식 HS-(CH2)p-COOH)을 갖는 ω-메르캅토산의 존재에 의해 추가로 변형될 수 있다. 유기 리간드의 하이드록실 및 메르캅토기는 AQC의 금속원자와 상호작용한다. 유기 리간드의 양친매성 때문에, 카르복실기는 복합체 외측으로 노출되고, 따라서 단백질, 핵산 및 다른 생체분자와 접합에 이용가능하다. 이들 접합체는 형광 프로브, 바이오마커 또는 조영제로서 특히 적합한다. 이들 나노시스템은 시험관 내 및 생체 내에서 생물 시스템에서 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 적어도 2개의 상이한 크기 금속 AQC인 Mn 및 M'n'의 전하이동 복합체 및 생체분자를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
Figure pct00005
상기 식에서,
금속 AQC의 금속 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며,
Mn은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며,
M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며,
Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며,
n 및 n'는 각각 M 및 M'의 금속원자의 수이며, 또한
n은 n'보다 작으며,
여기서 상기 접합체는 원자양자 클러스터 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산 리간드를 추가로 포함하며 또한 상기 생체분자는 ω-하이드록시산 및/또는 ω-메르캅토산 리간드에 부착된다.
일부 실시형태에서, 금속성 AQC의 금속 M 및 M'는 전이금속 또는 이의 조합으로부터 선택되며, 바람직하게는 전이금속은 Au, Ag, Co, Cu, Pt, Fe,Cr, Pd, Ni, Rh 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 이들은 Au, Ag, Cu 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 전이금속은 Au, Ag 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
형광의 여기 및 발광 파장은 AQC의 크기에 의존하기 때문에, 필요한 크기의 AQC를 유도함으로서 여기 및 발광 파장을 선택할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 단지 하나의 전자가 적어도 2개의 AQC 즉 Mn 및 M'n' 사이에 이동되며, 따라서 이온형태 Mn +, Mn 및 M'n'의 산화형태, M'n'의 환원형태를 수득하며, 여기서 "+"는 양전하이고 "-"는 음전하이다.
일부 실시형태에서, n 및 n'는 2 내지 309, 2 내지 102, 2 내지 55, 또는 2 내지 25개의 금속원자이다. 일부 실시형태에서 n과 n' 사이의 차이는 5 내지 50개의 원자이다.
추가의 실시형태에서 n과 n'사이의 차이는 5 내지 50개의 원자 또는 5 내지 25개의 원자이다.
일부 실시형태에서 ω-하이드록시산은 일반식 HO-(CH2)m-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 갖는다)를 가진다.
일부 실시형태에서,ω-메르캅토산은 일반식 HS-(CH2)p-COOH (여기서 p는 2 내지 30의 값을 갖는다)을 갖는다.
일부 실시형태에서, m 및 p는 10 내지 20의 값을 갖는다. 특정의 실시형태에서 m 및 p는 15의 값을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, m 및 p는 11의 값을 갖는다. m 및 p의 값은 상이하거나 동일할 수 있다. m 및 p가 상이한 경우에, 이들 사이의 차이는 6개 미만의 탄소이며, 바람직하게는 m 및 p의 값들의 차이는 1 내지 4이다. 바람직한 실시형태에서, m 및 p는 동일하다. 여기서 적어도 2개의 상이한 유형의 유기 리간드는 ω-하이드록시산 HO-(CH2)m-COOH 및 ω-메르캅토산 HS-(CH2)p-COOH) 리간드로부터 선택되며, 산기 -COOH, (또는 COO-, 상응하는 산의 염이 사용되는 경우)는 나노화합물의 외부 표면을 지향하며 또한 -OH 및 -SH 기는 내측을 지향하며, 즉 이들에 결합되고, 부착되거나 또는 배위되는 이온화 AQC, 즉 Mn + 및 M'n' -을 지향한다.
다른 실시형태에서, 전하이동 복합체에 부착될 수 있는 "유기 리간드"는 하이드록실, -OH, 또는 메르캅토 이외의 작용기, -SH 기, 예를 들어 -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, -NR-를 가지며, 여기서 R은 AQC 또는 이온화 AQC, 즉 Mn + 및 M'n' -에 결합, 부착 또는 배위될 수 있는 짧은 탄화수소쇄, C1-C4의 유기기를 나타낸다. 또한 ω-하이드록시산(HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH) 리간드의 하이드록실, -OH 또는 메르캅토를 AQC의 금속과 상호작용하는 상기 언급된 다른 것들과 교체하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 접합체에 도입될 수 있는 적절한 생체분자는 AQC-CTC를 사용하여 비오틴화 분자의 검출을 위한 경재분석과 관련하여 상기에 언급된 생체분자의 임의의 것을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 생체분자는 핵산, 다당류 및 폴리펩티드로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 바람직하게 생체분자는 항체이다.
CTC-AQC로 검출가능하게 표지된 결합 파트너를 사용하여 생체분자를 검출하는 방법
생체분자 및 CTC-AQC를 포함하는 접합체는 생체분자와 결합 파트너 사이에 형성된 CTC-AQC의 형광 발광 후에 생체분자의 임의의 결합 파트너의 검출을 위해 사용할 수 있다. 따라서 다른 양상에서, 본 발명은 시료에서 표적분자의 검출방법으로서,
(i) 상기 시료를 본 발명에 따른 접합체와 접촉시키고, 여기서 상기 접합체의 생체분자가 상기 결합 파트너와 상기 생체분자의 결합에 적절한 조건하에 상기 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단계,
(ii) 상기 생체분자와 상기 표적분자 사이에 복합체 형성을 검출하는 단계를
포함하는 검출방법에 관한 것이다.
상기 방법은 제1 단계에서 상기 표적 분자를 함유하는 것으로 생각되는 시료를, AQC의 전하이동 복합체 및 상기 표적분자를 위한 결합 파트너인 생체분자를 포함하는 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 접촉 단계는 상기 생체분자에 특이적으로 결합하는 모이어티에 생체분자의 결합에 적합한 조건하에 수행한다.
일부 실시형태에서 금속성 AQC의 금속 M 및 M'는 전이금속 또는 이의 조합으로부터 선택되며, 바람직하게는 전이금속은 Au, Ag, Co, Cu, Pt, Fe, Cr, Pd, Ni, Rh 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 이들은 Au, Ag, Cu 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 전이금속은 Au, Ag 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
형광의 여기 및 발광 파장은 AQC의 크기에 의존하기 때문에, 필요한 크기의 AQC의 형성을 유도함으로써 여기 및 발광 파장을 선택할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 단지 하나의 전자는 적어도 2개의 AQC 즉 Mn 및 M'n' 사이에 이동되며, 따라서 이온형태 Mn +, 즉 Mn 및 M'n'의 산화형태, M'n'의 환원형태를 수득하며, 여기서 "+"는 양전하이고 "-"는 음전하이다.
일부 실시형태에서, n 및 n'는 2 내지 309, 2 내지 102, 2 내지 55, 또는 2 내지 25개의 금속원자이다. 일부 실시형태에서 n과 n'사이의 차이는 5 내지 50개의 원자이다.
추가의 실시형태에서 n과 n'사이의 차이는 5 내지 50개의 원자 또는 5 내지 25개의 원자이다.
일부 실시형태에서 ω-하이드록시산은 일반식 HO-(CH2)m-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 갖는다)를 가진다.
일부 실시형태에서, ω-메르캅토산은 일반식 HS-(CH2)p-COOH (여기서 p는 2 내지 30의 값을 갖는다)을 갖는다.
일부 실시형태에서, m 및 p는 10 내지 20의 값을 갖는다. 특정의 실시형태에서 m 및 p는 15의 값을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, m 및 p는 11의 값을 갖는다. m 및 p의 값은 상이하거나 동일할 수 있다. m 및 p가 상이한 경우에, 이들 사이의 차이는 6개 미만의 탄소이며, 바람직하게는 m 및 p의 값들의 차이는 1 내지 4이다. 바람직한 실시형태에서, m 및 p는 동일하다. 여기서 적어도 2개의 상이한 유형의 유기 리간드는 ω-하이드록시산 HO-(CH2)m-COOH 및 ω-메르캅토산 HS-(CH2)p-COOH)으로부터 선택되며, 산기 -COOH, (또는 COO-, 상응하는 산의 염이 사용되는 경우)는 나노화합물의 외부 표면을 지향하며 또한 -OH 및 -SH 기는 내측을 지향하며, 즉 이들에 결합되고, 부착되거나 또는 배위되는 이온화 AQC, 즉 Mn + 및 M'n' -을 지향한다.
다른 실시형태에서, 전하이동 복합체에 부착될 수 있는 "유기 리간드"는 하이드록실, -OH, 또는 메르캅토 이외의 작용기, -SH 기, 예를 들어 -NH2, -NH-, -Cl, -PH3, -SR, -OR, -NR2, -NHR, -NR-를 가지며, 여기서 R은 AQC 또는 이온화 AQC, 즉 Mn + 및 M'n' -에 결합, 부착 또는 배위될 수 있는 짧은 탄화수소쇄, C1-C4의 유기기를 나타낸다. 또한 ω-하이드록시산(HO-(CH2)m-COOH) 및 ω-메르캅토산 (HS-(CH2)p-COOH) 리간드의 하이드록실, -OH 또는 메르캅토를 AQC의 금속과 상호작용하는 상기 언급된 다른 것들과 교체하는 것이 가능하다.
생체분자 및 표적 분자에 적합한 쌍은 표 2에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 방법에서 사용되는 대표적인 결합쌍. IgG는 면역글로불린이고; cDNA 및 cRNA는 하이브리드화에 사용되는 안티센스(상보적) 가닥이다.
항원/헵텐 항체
비오틴 비오틴 결합 분자 (스트렙타비딘, 아비딘, 항-비오틴 항체)
IgG 단백질A 또는 단백질 G
엽산 엽산 결합 단백질
독소 독소 수용체
탄수화물 렉틴 또는 탄수화물 수용체
펩티드 펩티드 수용체
단백질 단백질 수용체 또는 앱타머
효소 기질 효소
DNA(RNA) cDNA(cRNA)
호르몬 호르몬 수용체
이온 킬레이트제
검출할 표적분자가 좌측 칼럼에 언급된 분자 중 어느 것인 경우 CTC-AQC로 검출 가능하게 표지되는 생체분자는 우측 칼럼에 정의된 바와 같는 것으로 인식될 것이다. 역으로, 검출할 표적분자가 우측 칼럼에 언급된 분자 중의 어느 것인 경우, AQC의 전하이동 복합체로 검출 가능하게 표지된 생체분자는 좌측 칼럼에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 생체분자는 표적분자에 공유적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 생체분자는 표적 분자에 비공유적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 검출될 표적분자는 항원 또는 헵탄이며, 이 경우에 AQC의 전하이동 복합체로 검출가능하게 표지된 생체분자는 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. 다른 실시형태에서, 검출될 표적 분자는 항체이며, 이 경우에 AQC의 전하이동 복합체로 검출가능하게 표지된 생체분자는 상기 항체에 의해 인식되는 항원이다.
일부 실시형태에서, 검출될 표적분자는 핵산이며, 이 경우에 AQC의 전하 이동 복합체로 검출가능하게 표지된 생체분자는 상기 핵산에 특이적으로 하이브리드화 하는 핵산이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 하이브리드화"는 높은 스트린전트 조건하에 또는 중정도의 스트린전트 조건하에 2개의 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화를 허용하는 조건을 언급한다. 하이브리드화 반응의 "스트린전시"(stringency)는 당해 분야에서 통상의 기술자에 의해 용이하게 구별할 수 있으며 또한 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 따르는 경험적 계산이다. 일반적으로, 더 긴 프로브는 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도를 필요로 하며, 반면 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 하이브리드화는 일반적으로 상보적 가닥이 이들의 용융온도 이하의 환경에서 존재하는 경우 변성된 DNA를 다시 어닐링할 능력에 의존한다. 프로브와 하이브리드화 서열 사이의 원하는 상동성이 더 높으면, 사용될 수 있는 상대온도가 더 높다. 그 결과, 더 높은 상대온도는 반응조건을 더욱 스트린전트 하게 만드는 경향이 있는 반면, 더 낮은 온도는 덜 스트린전트하게 만들 것이다. 하이브리드화 반응의 스트린전시의 추가 상세 및 설명에 대해서는, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)을 참조한다.
시료에서 결합 파트너에 생체분자의 결합을 촉진하는데 적합한 조건은 본 명세서에서 교시내용 및 이하 제공되는 실시예를 기초하여 당업자에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, 항원-항체 결합은 흔히 소수성 상호작용 (소위 소수성 결합)에 의존하며, 따라서 몰 범위에서와 같은 높은 염농도는 비특이적 조건을 감소시키고 특이적 항원-항체 결합을 증가시키는데 사용할 수 있다.
생물학적 적용에 있어서, 시료 및 표적 생체분자를 위한 결합 파트너의 접촉 단계는 당해 분야에 일반적으로 알려진 방법에 따라 제조된 수성, 거의 수성 또는 수성 혼화성 용액중에서 수행한다. 검출가능한 표지 결합 파트너의 정확한 농도는 실험조건 및 원하는 결과에 의존하지만, 전형적으로 약 1 나노몰 내지 1 밀리몰 또는 그 이상 범위이다. 최적 농도는 최소 배경 형광을 갖는 만족스런 결과가 달성될 때까지 계통적 변동에 의해 결정된다.
제2 단계에서, 본 발명에 따른 접합체를 사용하여 표적 분자를 검출하는 방법은 표적 분자 및 AQC의 전하이동 복합체로 검출가능하게 표지된 생체 분자 사이에 복합체 형성을 검출함을 포함한다.
복합체 형성의 검출은 적절한 파장에서 여기시 AQC의 전하이동 복합체에 의해 방출된 형광을 검출함으로써 수행할 수 있다.
전형적으로, 복합체의 검출은 시료 중에 아직 존재하는 임의의 비결합된 검출가능한 표지 생체분자로부터 복합체를 분리한 후에 수행한다. 상이한 방법은 시료중에 아직 존재하는 임의의 비결합된 검출가능한 표지 생체분자에 이용가능하다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 지지체 중에 고정되며, 이는 시료로부터 지지체를 분리함으로써 검출가능하게 표지된 생체분자와 함께 형성된 복합체의 회수를 가능하게 한다. 결합 파트너의 고정화를 위해 사용될 수 있는 적절한 지지체는, 제한되지 않지만, 본 발명에 따른 경쟁분석과 관련하여 상기 정의된 것중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 임의의 비결합된 검출가능한 표지 결합 파트너로부터 복합체의 분리는 표적분자에 대한 제2 결합 파트너를 사용하여 수행되며, 이는 CTC-AQC로 검출가능하게 표지된 생체분자와 다르다. 이것은 검출가능한 표지 생체분자, 표적분자 및 제2 결합 파트너를 포함하는 삼성분 복합체의 회수를 가능하게 한다. 예를 들면, 검출될 표적분자가 폴리펩티드이고 검출가능한 표지 생체분자가 항체인 경우, 폴리펩티드와 검출가능한 표지 생체분자 사이의 복합체는 표적분자에 특이적인 제2항체를 사용하여 분리할 수 있으며, 이것은 표적 분자의 상이한 영역을 인지하여 표적분자에 제2 항체의 결합이 입체 장애에 의해 방지되는 것을 피한다. 일부 실시형태에서, 표적분자는 태그(tag)를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적절한 태그는, 제한되지 않지만, 펩티드계 태크를 포함한다. 이 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각 항체는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 그의 예는 폴리-히스티딘(폴리-히스) 또는 폴리-히스티딘-글리신(폴리-히스-글리) 태그; 플루 HA 태크 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (Field et al., Mol Cell Biol, 1988;8:2159-2165); c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 1985;5:3610-3616); 단수 헤르페스 바이러스 글리코단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (Paborsky et al., Protein Engineering 1990;3:547-553)를 포함한다. 다른 태크 폴리펩티드는 플래그-펩티드 (Hopp et al., BioTechnology 1988;6:1204-1210); KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science 1993;255:192-194); 튜불린 에피토프 펩티드 (Skinner et al., J Biol Chem 1991;266:15163-15166); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (Lutz-Freyermuth et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990,;87:6393-6397)를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 정제용 태그는 폴리히스티딘 태그이다. 더더욱 바람직한 실시형태에서, 정제용 태크는 헥사히스티딘 태그이다.
일부 실시형태에서, 복합체가 임의의 비결합된 검출가능한 표지 생체분자로부터 분리된 후에, 복합체는 과량의 표지 생체분자를 제거하기 위하여 적어도 한 번 세척된다. 세척 단계는 생체분자 및 결합 파트너에 따라 적절한 방법으로 수행할 수 있다. 시료는 임의의 적절한 매체, 예를 들면 PBS 등의 완충액으로 세척할 수 있다. 매체는 트윈 20 등의 세정제를 포함할 수 있다. 이것은 각 세척을 위해 임의의 적절한 시간 동안, 예를 들면 1 내지 30분 또는 3 내지 10분 동안 세척할 수 있다. 세척은 상기 세포의 담체의 온화한 셰이킹 또는 로킹(rocking)을 포함할 수 있다. 세척 온도는 세포가 생존할 수 있고 결합이 파괴되지 않도록 하는 정도이다. 예를 들면, 이것은 20 내지 45℃ 또는 30 내지 40℃일 수 있다. 전형적으로, 이것은 약 37℃ 또는 실온이다. 생체분자 및 결합 파트너의 복합체를 세척하기 위한 적절한 프로토콜은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
검출가능한 표지 생체분자 및 표적 분자 사이의 복합체의 검출은 표적 분자에 결합된 AQC-CTC의 형광 발광을 검출하는 것을 포함한다. 형광 발광이 검출되는 경우, 이것은 검출가능한 량의 생체분자가 단계 (ii)에서 표적분자와 함께 회수되었으며, 따라서 시료가 표적분자를 함유하였다는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 표적분자의 검출은 웨스턴 블롯에 의해 수행할 수 있으며, 이 경우에 표적 분자는 겔 전기영동에 의해 분리되고 블롯팅 막으로 이동되어 검출가능한 표지 생체분자와 접촉된다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 표적 분자는 생체분자와 접촉한 다음, 생체분자와 표적분자의 상호작용이 보존되는 조건하에 분리된다. 다음에 복합체는 복합체의 분리를 위해 사용된 지지체 내에서 형광을 측정함으로써 검출할 수 있다. 분리는 전기영동 또는 크로마토그래피와 같은 임의의 적절한 수단에 의해 수행할 수 있다. 일부 적절한 실시형태에서, 복합체의 분리는 겔 전기영동에 의해 수행되며, 이 경우에 상기 검출은 겔내 형광 검출에 의해 수행된다.
AQC의 전하이동 복합체를 여기하기 위한 적절한 수단 및 조건은 물론 AQC의 전하이동 복합체의 형광발광을 검출하기 위한 수단 및 조건은 본 발명에 따른 경쟁 방법과 관련하여 기술되었으며 또한 본 발명의 방법에 동일하게 적용할 수 있다.
생체분자 및 AQC의 전하이동 복합체를 포함하는 접합체의 제조방법
또 다른 양상에서, 본 발명은 생체분자 및 AQC의 전하이동 복합체를 포함하는 접합체의 제조방법에 관한 것이다. AQC의 전하이동 복합체는 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산 리간드에 의해 안정화되며, 여기서 상기 AQC는 유기 리간드의 ω-하이드록시 및 ω-메르캅토 기에 결합되며, 다음에 목적한 분자와 커플링을 위해 이용가능한 노출된 카르복시기를 남긴다.
따라서 또 다른 양상에서, 본 발명은 제1 반응성기로 그의 표면상에 작용화된 AQC의 전하이동 복합체를 상기 제1 반응성기와 반응할 수 있는 AQC의 전하이동 복합체와 반응시킴을 포함하는 본 발명에 따른 전하이동 복합체 및 생체분자의 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
AQC의 전하이동 복합체는 AQC의 외측을 향하여 노출된 카르복실기를 함유하는 유기산을 포함한다. 따라서 일부 실시형태에서, 생체분자에서 상응하는 반응성기와 반응할 수 있는 반응성기를 도입하기 위하여 카르복실기를 직접 활성화할 수 있다. AQC의 전하이동 복합체의 유기산 내에 도입될 수 있는 대표적인 반응성기는, 제한되지 않지만, 카르복실산기, 카르복실산 활성 에스테르 (예를 들면, N-하이드록시숙신이미드 에스테르), 말레이미드 기, 반응성 카르바메이트 및 티오카르바메-이트기, 및 α-할로아세트아미드기(-NH-C(-O)-CH2-X)를 포함한다. 다른 적절한 사이클로 부가 (예를 들면, 4+2 사이클로부가 생성물을 제공하기 위해 디엔 및 디에노필, 및 아세틸렌 및 아지드 (클릭 화학))을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 반응성기는 카르복실산기(-CO2H) 또는 그의 활성에스테르 (예를 들면, N-하이드록시숙신이미드 에스테르)이다.
카르복실산 기 및 카르복실산 활성 에스테르는 단백질 및 펩티드에서 라이신 잔기의 아미노기를 포함하는 아미노기, 및 올리고뉴클레오티드 프로브 (-C(-O)-NH- 결합)에 도입된 일차 아미노기에 대하여 반응성이다. 말레이미드기는 단백질, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 (-N[C(-O)CH2CHC(-O)]-S-결합)에 고유한 또는 이에 도입된 설프하이드릴기에 반응성이다. 반응성 카르바메이트 및 티오카르바메이트기는 우레아(-NH-C(-O)-NH-) 및 티오우레아(-NH-C(-S)-NH-) 결합을 제공하기 위해 아미노기에 대해 반응성이다. α-할로아세트아미드기는 -NH-C(-O)-CH2-S-를 제공하기 위해 티올기에 대해 반응성이다. 사이클로부가를 통해 결합가능한 작용기는 반응하여 4+2 사이클로부가 결합을 형성하는 디엔 (예를 들면, 푸란) 및 디에노필(예를 들면, 알켄 및 알킨)를 포함한다. 링커 암 (linker arm)은 상보적 반응성 물질 (예를 들면, 생체분자)에 고유한 또는 이에 도입된 디에노필 및 디엔에 대해 각각 반응성인 디엔 또는 디에노필을 포함하도록 변형된다. 클릭 화학은 또한 접합을 위해 이용할 수 있다. 이 링커암은 상보적 반응성 물질 (예를 들면, 생체분자)에 고유한 또는 이에 도입된 아지드 또는 아세틸렌에 대해 각각 반응성인 적절한 아세틸렌 (예를 들면, H-C=C-R) 또는 아지드 (예를 들면, R'-N-N+-N-)를 포함하도록 변형할 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합은 유기산에서 자연적으로 발생하는 카르복실기 또는 그의 활성 에스테르를 생체분자에서 발견되는 아미노기와 반응시켜 수행한다. 활성화 에스테르의 예는, 이로 제한되지 않지만, N-하이드록시 숙신이미딜 에스테르, N-하이드록시 설포숙신이미딜 에스테르, p-설포-테트라플루오로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 2,4-디니트로페닐 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 3-하이드록시-3,4-디하이드로-4-옥소-l,2,3-벤조트리아진(HODhbt), 공통 카르보디이미드 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 디이소프로필카르보디이미드(DIPCDI), N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), l-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 사용하여 활성화된 카르복실산; 우로늄염 또는 포스포늄염, 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 0-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), O-(벤조트리아졸-l-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 2-(6-클로로-lH-벤조트리아졸-l-일-l, 1,3,3-테트라메틸아민늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU), (2-(6-클로로-lH-벤조트리아졸-l-일)-l, 1,3,3-테트라메틸아민늄 테트라플루오로보레이트) (TCTU), 2-(lH-7-아자벤조트리아졸-l-일)-l,l,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), l-벤조트리아졸리옥시트리스-(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP) 벤조트리아졸-l-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PYBOP)로 활성화된 카르복실산; 또는 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서 카르복실산은 카르보디이미드, 바람직하게는 EDC를 사용하여 활성화된다.
여기서 생체분자는 폴리펩티드이며, 반응성 아미노기는 라이신 잔기에서 자연적으로 나타나며, 따라서 추가의 변형 없이 생체분자의 결합을 허용한다. 여기에서 생체분자는 폴리뉴클레오티드이며, 하나의 실시형태에서, 생체분자는 아미노기의 도입에 의해 변형할 수 있다. 이것은 통상 아미노 변형 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리뉴클레오티드의 합성 중에 수행된다. 선택된 폴리뉴클레오티드내에 아미노기를 도입하는 방법은 예를 들면 국제공개 WO2011131693, Kojima N. and Komatsu Y., (Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2012 Mar; Chapter 4:Unit 4.48.1-23. doi: 10.1002/0471142700.nc0448s48) 및 Vasilyeva SV et al. (Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2011; 30: 753-67)에 기술되어 있다. 생체분자가 올리고뉴클레오티드 또는 다당류이며, 아미노기는 예를 들면 US5306492 및 Porro et al., (Mol. Immunol., 1985, 22:907-919)에 기술된 바와 같이 환원성 아민화에 의해 삽입할 수 있다.
AQC의 전하이동 복합체에서 반응성기는 유기산 중에 카르복시기에 직접 결합될 수 있거나 또는 대안적으로 AQC에서 및 생체분자에서 반응성기들 사이의 반응이 입체 장애에 의해 방지되는 것을 피하기 위하여 스페이스 기 또는 링커기에 의해 이 그룹에 연결된다. 유사하게, 반응성기와 결합할 수 있는 생체분자는 또한 반응을 방지하기 위하여 생체분자의 골격 사이에 스페이스기를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체분자에 부착된 반응성기 및 유기산에 의해 AQC에 부착된 상응하는 반응성기는 링커기를 함유한다. 적절한 링커 모이어티는 탄소, 질소, 산소, 수소 및 할로겐으로부터 선택된 1 내지 약 50개의 원자를 포함한다. 대표적인 기는 알킬렌기(예를 들면, -(CH1)n-, 여기서 n은 1-12이다), 페닐렌기(예를 들면, o-, m-, 및 p-C6H4-), 및 알킬렌옥사이드기(예를 들면, 에틸렌옥사이드, -(CH2CH2O)m-, 여기서 m은 1 내지 5이다)을 포함한다. 다른 적절한 기는 -C(=A1)-L1-, -C(=A1)NH-L1-, -C(=A1)NH-L1-NH-을 포함하며, 여기서 A1은 O 및 S로부터 선택되며, 또한 L1 은 상기 링커기중 임의의 것일 수 있다.
AQC의 활성화 전하이동 복합체는 보호기를 사용하여 보호형태로서 제공될 수 있다. 보호기의 예는 T. W. Greene and P. G. Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY, (Wiley, 2nd ed. 1991), Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48:2223-2311 (1992), and Harrison and Harrison et al., COMPENDIUM OF SYNTHETIC ORGANIC METHODS, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons. 1971-1996)에서 발견할 수 있다. 대표적인 아미노 보호기는 포르밀, 아세틸, 트리플루오로아세틸, 벤질, 벤질옥시카르보닐(CBZ), tert-부톡시카르보닐(Boc), 트리메틸 실릴(TMS), 2-트리메틸실릴-에탄설포닐(SES), 트리틸 및 치환된 트리틸 기, 알릴옥시카르보닐, 9-플루오로메틸옥시카르보닐(FMOC), 니트로-베라트릴옥시카르보닐(NVOC) 등을 포함한다 (참조, Boyle, A. L. (Editor), CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000). 대표적인 하이드록시 보호기는 하이드록시기가 벤질 및 트리틸 에테르는 물론 알킬에테르, 테트라하이드록시피란일 에테르, 트리알킬실릴 에테르 및 알릴에테르 등의 아실화 또는 알킬화된 것들을 포함한다. 추가로, 하이드록시기는 a-메틸-6-니트로피페론일옥시카르보닐 등의 광제거 가능한 기에 의해 보호될 수 있다 (McGall, G. H. and Fidanza, J. A., Photolithographic synthesis of high-density olignucleotide arrays, in DNA ARRAYS METHODS AND PROTOCOLS, Edited by Rampal J. B., METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 170:71-101 (2001), Humana Press, Inc., NY; Boyle, Ann L. (Editor), Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000).
세포내 구성분을 표지하는 방법
다른 실시형태에서, 본 발명은 세포내 성분을 생체내에서 표지하는 방법으로서, AQC-CTC 및 상기 세포내 성분에 특이적으로 결합하는 생체분자를 포함하는 접합체와 하나 이상의 세포내 성분들을 접촉시켜, 현미경에 의해 하나 이상의 세포내 성분들을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
하나의 실시형태에서, 생체분자는 하나 이상의 세포내 분획에서 발현된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이며, 이 경우에 본 발명에 따른 AQC-CTC를 포함하는 접합체는 면역조직화학을 위해 사용할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 생체분자는 목적한 핵산 서열과 특이적으로 하이브리드화 하는 핵산이며, 이 경우에 본 발명에 따른 AQC-CTC를 포함하는 접합체는 형광 인사이투 하이브리드화(FISH)를 위해 사용할 수 있다. 전형적으로, FISH 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 지지체 (예를 들면, 글래스 슬라이드 또는 마이크로티터 웰의 벽)에 대한 조사중에 조직 또는 다른 생물학적 물질을 고정시키는 단계, (b) 표적 핵산에 FISH 프로브의 접근성을 증가시키기 위한 조직 또는 물질의 처리 단계, (c) 표적 핵산을 함유하는 조직 또는 물질을 프로브와 접촉시켜 특이적 하이브리드화 복합체를 형성하는 단계, (d) 복합체의 하이브리드화 후 세척하여 표적에 특이적으로 하이브리드화되지 않는 프로브를 선택적으로 제거하는 단계, 및 (e) 형성된 하이브리드화 복합체를 갖는 프로브를 표적 핵산 분자로 검출하는 단계. 이러한 방법들은 Gall and Pardue, (1981) Methods of Enzymology 21:470-480; Henderson, (1982) International Review of Cytology, 76: 1-46; and Angerer, et al., (1985) in Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow and Hollaender, Eds.) vol. 7, pp. 43-65, Plenum Press, New York를 포함하는 다수의 출처에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 생체분자는 폴리펩티드 및 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 더욱 바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드는 항체이다.
접합체는 염료 화합물과 목적한 시료 화합물 사이의 접촉을 촉진하는 방식으로 시료와 접촉된다. 전형적으로 접합체 또는 접합체를 함유하는 용액은 시료에 단순히 첨가된다. 본 발명의 특정한 결합 파트너는 생물학적 세포의 막에 불투과성인 경향이 있으며, 일단 내측 생존세포는 일반적으로 잘 보유된다. 형질막을 투과하는 처리, 예를 들면 전기천공법, 쇼크 요법 또는 높은 세포외 ATP는 결합 파트너를 세포내에 도입하는데 사용할 수 있다. 대안적으로, 결합 파트너는 예를 들면 압력미량 주사, 스크레이프 로딩(scrape loading), 패치 클램프법, 또는 식세포 작용에 의해 세포내에 물리적으로 삽입할 수 있다.
대상으로부터 임의의 조직 시료가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 조직시료의 예는, 이로 제한되지 않지만, 유방, 전립선, 난소, 결장, 폐, 자궁내막, 위, 침샘 또는 췌장을 포함한다. 조직시료는 다양한 절차, 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 외과용 절제, 흡인 또는 생검에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 조직 시료는 고정되고 파라핀 등에 매립할 수 있다. 조직 시료는 통상적인 방법으로 고정 (또는 보유)할 수 있다 [참조, 예를 들면, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.]. 예로써, 중성 완충 포르말린, 보우인(Bouin) 또는 파라포름알데하이드가 조직 시료를 고정하는데 사용할 수 있다.
세포성분에 관련된 CTC-AQC의 검출은 다음과 같은 장치: CCD 카메라, 비디오 카메라, 사진 필름, 레이저 스캐닝 장치, 형광 광도계, 포토다이오드, 양자 카운터, 에피형광 현미경, 스캐닝 현미경, 플로우 사이토미터, 형광 마이크로플레이트 리더 중의 어느 하나를 사용하여, 또는 광전자 증배관 등 신호를 증폭하는 장치에 의해 수행할 수 있다. 플로우 사이토미터를 사용하여 시료를 검사하는 경우, 시료의 검사는 선택적으로 이들의 형광반응에 따른 시료의 일부를 분류하는 것을 포함한다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 기술되며, 이들은 단지 예시적인 것이지 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
시약
스트렙타비딘(Streptomyces avidinii로부터 유래, 정제 친화성, ≥13U/mg) 및 올리고-비오틴 (36bp 올리고뉴클레오티드-비오틴),
AACACCGCAGCATGTCAAGATCACACATTTTGGGCG[bTNtG]) (서열번호:2)
은 시그마-올드리치로부터 구입하고 추가의 정제 없이 사용하고, 문헌 및 제조업자가 권장하는 바와 같이 저장 용액을 제조함: 물 중 스트렙타비딘 0.5 mg/ml 및 TE 완충액 (트리스-EDTA 완충용액, pH=8.0, Fluka)중 올리고-비오틴 1nM.
AQC-CTC는 표준 프로토콜로 합성하였다. 16-하이드록시팔미트산의 수용액 (98%, 알드리치) (2 ml, 10 mg/ml)은 기본 평균 (basic mean)을 생산할 때까지 5.4 ml의 물 및 필요한 용적의 테트라부틸암모늄 하이드록사이드(물 중 40%, Fluka) 중에 격렬히 교반하면서 16-메르캅토팔미트산의 수용액 (90%, 알드리치)와 혼합하였다. 400μL 용적의 HAuCl4.3H2O (Au(III) 클로하이드 수화물, 99.999%에서 금속염기, 알드리치) (5.8 mg/ml) 용액을 수득된 나노좀의 용액에 첨가한 다음 400μL의 NaBH4 (96%, 알드리치) 용액 (0.05 M)을 첨가하여 환원시켰다. 이 용액은 35℃에서 1시간 동안 교반하였다. AQC-CTC를 얻기 위하여, 이 용액은 Beckman Airfuge® 공기구동 초원심분리기에서 90,000 rpm로 1시간 동안 초원심분리하여, 분리의 상청으로서 AQC-CTC를 얻었다. 이러한 초원심분리 단계는 이전에 합성된 나노좀을 분해하는 데스 안정화(desestabilization) 공정이다. 상기 단계는 상이한 크기의 AQC-CTC를 얻는데 필요하다.
실시예 1. AQC-CTC의 스트렙타비딘 형광증대에 의한 비오틴화 올리고뉴클레오티드 검출
표 1은 15μL의 AQC-CTC (150 mg/l), 55μL의 스트렙타비딘 용액 (물 중 0.5 mg/ml) 및 증가량의 올리고-비오틴 용액 (TE 완충액중 1 nM)을 함유하는, 제조된 3개의 상이한 용액을 나타낸다. 1시간 후에 각 시료의 인큐베이션 형광을 측정하였다.
용액 VAQC/μL Voligo/μL mmol 올리고 Vstrep/μL
A 0.15 0 0 55
B 0.15 0.10 0.1 55
C 0.15 0.15 0.5 55
도 1은 상이한 용액의 250nm의 여기에서 발광 스펙트럼(3x3 mm의 광경로 및 45μL의 용적의 석영셀에서 Cary Eclipse Varian 형광 분광계로 측정)을 나타낸다: (A) 스트렙타비딘에 의한 AQC-CTC, (B) 스트렙타비딘 및 0.1 mmol의 올리고-비오틴에 의한 AQC-CTC 및 (C) 스트렙타비딘 및 0.5 mmol의 올리고-비오틴의 AQC-CTC. 이 스펙트럼은 600 nm에서 발광 최대를 나타내며, 이는 올리고-비오틴의 첨가에 따라 감소하며, 올리고-비오틴의 량이 증가함에 따라 발광 최대가 더 낮아진다.
실시예 2. AQC-CTC의 스트렙타비딘/HABA 형광증대/퀀칭에 의한 비오틴화 올리고뉴클레오티드 검출
표 2는 소정 용적의 스트렙타비딘 용액 (물 중 0.5 mg/ml)위에 0.25μL의 HABA 용액 (10mM) 및 0.5μL의 AQC-CTC 용액 (약 150 mg/l)을 첨가하여 제조하였다. 이어서 0.5μL의 올리고-비오틴 용액 (1nM)을 용액 B에 첨가하고 두 가지 시료를 30분 동안 인큐베이션 하였다.
용액 Vstrept/μL VHABA/μL VOligo/μL VAQC/μL
A 49.26 0.25 0 0.5
B 48.76 0.25 0.5 0.5
도 2는 상이한 용액의 250nm의 여기에서 발광 스펙트럼(3x3 mm의 광경로 및 45μL의 용적의 석영 셀에서 Cary Eclipse Varian 형광 분광계로 측정)을 나타낸다: (A) HABA 및 스트렙타비딘에 의한 AQC-CTC, 및 (B) HABA, 스트렙타비딘 및 0.5 μL의 올리고-비오틴에 의한 AQC-CTC. 도 2에 도시된 바와 같이, 올리고-비오틴의 첨가는 올리고-비오틴과 스트렙타비딘 사이의 상호작용 때문에 발광 최대 강도에 대한 감소를 초래한다.
실시예 3. 나노좀에 단백질 분자를 결합하는 방법
N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)의 새로 제조된 수용액을 pH 9 붕산염 완충액 중 나노좀의 용액에 첨가하였다. 5분간 적당한 교반 후에, pH 9 붕산염 완충액 중 단백질 용액을 첨가하였다. 교반은 2 시간 동안 계속하고 최종 단백질 나노좀 접합체를 원심 한외여과에 의해 정제하였다.

Claims (34)

  1. 하기 화학식(I)의 적어도 2개의 상이한 크기 금속원자 양자 클러스터 (AQC)인 Mn 및 M'n'의 전하이동 복합체 (CTC) 및 비오틴 결합 분자를 포함하는 복합체.
    Figure pct00006

    상기 식에서,
    금속 AQC의 금속 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며,
    Mn은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며,
    M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며,
    Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며,
    n 및 n'는 각각 M 및 M'의 금속원자의 수이며, 또한
    n은 n'보다 작으며,
    여기서 상기 비오틴 결합 분자 및 전하이동 복합체는 공유적으로 결합되지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비오틴 결합 분자가 스트렙타비딘 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체인 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 금속 M 및 M'가 독립적으로 전이금속 또는 이의 조합으로부터 선택되는 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 금속 M 및 M'가 독립적으로 전이금속 Au, Ag, Cu 및 이의 조합, 및 더욱 바람직하게는 Au, Ag 및 이의 조합으로부터 선택되는 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, n 및 n'가 2 내지 309, 2 내지 102, 2 내지 55, 또는 2 내지 25개의 금속 원자인 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, n과 n' 사이의 차이가 5 내지 50 개의 원자인 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전하이동 복합체가 원자 양자 클러스터 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시산 및 ω-메르캅토산 리간드를 추가로 포함하는 복합체.
  8. 제7항에 있어서, ω-하이드록시산이 일반식 HO-(CH2)m-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 갖는다)를 가지며, 및/또는 ω-메르캅토산은 일반식 HS-(CH2)p-COOH (여기서 p는 2 내지 30의 값을 갖는다)을 갖는 복합체.
  9. 하기 (i) 및 (ii)를 함께 또는 별도로 함유하는 부품 키트:
    (i) 적어도 2개의 상이한 크기 금속원자 양자 클러스터 (AQC) Mn 및 M'n'의 전하 이동 복합체 (여기서 상기 전하 이동 복합체는 제1항에서 정의된 바와 같은 화학식(I)을 가지며, 또한 금속 AQC의 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며, Mn 은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며, M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며, Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며, n 및 n'는 각각 금속원자의 수이다) 및
    (ii) 비오틴 결합 분자.
  10. 시료에서 비오틴화분자의 검출방법으로서,
    (i) 비오틴화 분자가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 복합체 중의 비오틴 결합분자에 결합하기에 적합한 조건하에 상기 시료를 상기 복합체와 접촉시키는 단계, 및
    (ii) AQC의 여기파장에서 시료의 여기에 대한 반응에 따른, 단계(i)의 접촉 후에 AQC에 의한 형광발광의 강도 변화를 검출하는 단계를
    포함하며, 여기서 접촉 단계 후에 AQC에 의해 발광된 형광강도의 감소는 시료에 비오틴화 분자가 존재함을 나타내는 것인 검출방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비오틴화 분자가 핵산, 폴리펩티드 또는 다당류인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 비오틴 결합 분자가, 비오틴 결합 분자에 대한 친화성이 비오틴 보다 낮은 비오틴 유사체와의 복합체로서 제공되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비오틴 유사체가 4-하이드록시아조벤젠-2-카르복실산 (HABA)인 방법.
  14. 하기 화학식(I)의 적어도 2개의 상이한 크기 금속 AQC인 Mn 및 M'n'의 전하이동 복합체 및 생체 분자를 포함하는 접합체.
    Figure pct00007

    상기 식에서,
    금속 AQC의 금속 M 및 M'는 동일하거나 상이한 금속이며,
    Mn은 그의 산화형태 Mn +로 존재하는 작은 AQC이며,
    M'n'은 그의 환원형태 M'n' -로 존재하는 큰 AQC이며,
    Mn + 및 M'n' -은 정전기 상호작용에 의해 결합되며,
    n 및 n'는 각각 M 및 M'의 금속원자의 수이며, 또한
    n은 n'보다 작으며,
    여기서 상기 접합체는 원자 양자 클러스터인 Mn 및 M'n'에 부착된 ω-하이드록시 산 및 ω-메르캅토산 리간드를 포함하며, 상기 생체분자는 ω-하이드록시산 및/또는 ω-메르캅토산 리간드에 공유적으로 부착된다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 생체분자가 핵산, 폴리펩티드 및 다당류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드 생체분자가 항체인 접합체.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 M 및 M'가 독립적으로 전이금속 또는 이의 조합으로부터 선택되는 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 전이금속이 Au, Ag 및 Cu로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 항에 있어서, n 및 n'이 2 내지 309, 2 내지 102, 2 내지 55, 또는 2 내지 25개의 금속원자인 접합체.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 항에 있어서, n과 n'사이의 차이가 5 내지 50개의 원자인 접합체.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 항에 있어서, ω-하이드록시산이 일반식 HO-(CH2)m-COOH (여기서 m은 2 내지 30의 값을 갖는다)를 가지며, 및/또는 ω-메르캅토산은 일반식 HS-(CH2)p-COOH (여기서 p는 2 내지 30의 값을 갖는다)을 갖는 접합체.
  22. 제1 반응성기로 그의 표면상에 작용화된 AQC의 전하이동 복합체를 상기 제1 반응성기와 반응할 수 있는 기를 함유한 생체분자와 반응시킴을 포함하는 제14항 내지 제20항 중 어느 항에 따른 접합체의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 생체분자에서 기는 반응단계 전에 생체분자 쌍의 예비-작용화에 의해 도입되는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 제1 반응기가 활성화 카르복실기인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 반응성기와 반응할 수 있는 생체분자에서 기는 활성화 하이드록실기 또는 활성화 아미노기인 방법.
  26. 시료에서 표적분자의 검출방법으로서,
    (i) 상기 시료를 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 접합체와 접촉시키고, 여기서 상기 접합체의 생체분자가 상기 표적분자와 상기 생체분자의 결합에 적절한 조건하에 상기 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단계,
    (ii) 상기 생체분자와 상기 표적분자 사이에 복합체 형성을 검출하는 단계를
    포함하는 검출방법.
  27. 제27항에 있어서, 표적분자가 제1 폴리펩티드인 경우, 접합체의 생체분자 형성 부분은 제2 폴리펩티드 및 앱타머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  28. 제28항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드가 항체인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 표적분자가 제1 핵산인 경우, 접합체의 생체분자 형성 부분은 제1 핵산에 특이적으로 하이브리드화 하는 제2 핵산인 방법.
  30. 제19항에 있어서, 표적분자가 다당류인 경우, 접합체의 생체분자 형성 부분은 렉틴이거나 또는 표적분자가 렉틴인 경우 결합 파트너는 다당류인 방법.
  31. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 표적분자가 세포, 박테리아, 바이러스 또는 효모 세포에 존재하거나, 또는 중합체, 중합체막 또는 중합체 입자상에 고정되는 방법.
  32. 하나 이상의 세포내 성분들을 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 AQC-CTC를 포함하는 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 생체분자는 상기 세포내 성분에 특이적으로 결합함으로써, 현미경에 의해 하나 이상의 세포내 성분의 검출을 가능하게 하는 것인, 세포내 성분의 검출방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 결합 파트너가 폴리펩티드 및 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체인 방법.

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