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KR20160006701A - 전혈 샘플에 대해 혈장 중 분석물의 농도를 직접 측정하는 방법 - Google Patents

전혈 샘플에 대해 혈장 중 분석물의 농도를 직접 측정하는 방법 Download PDF

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KR20160006701A
KR20160006701A KR1020157032263A KR20157032263A KR20160006701A KR 20160006701 A KR20160006701 A KR 20160006701A KR 1020157032263 A KR1020157032263 A KR 1020157032263A KR 20157032263 A KR20157032263 A KR 20157032263A KR 20160006701 A KR20160006701 A KR 20160006701A
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rti
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로흐 마히예
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비오메리으
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Abstract

본 발명은 전혈 샘플에서 분석물 양을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
■ 전혈 샘플의 헤마토크리트 수준을 측정하는 단계;
■ 상기 전혈 샘플에서 분석물 양을 직접 측정하는 단계; 및
■ 하기 관계:
Figure pct00278

로서, 여기서,
Figure pct00279
는 분석물 양의 보정값이고,　
Figure pct00280
는 분석물 양의 측정값이고,
Figure pct00281
는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
Figure pct00282
는 불확정 값으로서 분석물 양의 측정값
Figure pct00283
및 헤마토크리트 수준의 측정값
Figure pct00284
을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식인 것인 관계에 따라 분석물 양의 보정값을 계산하는 단계
를 포함한다.

Description

전혈 샘플에 대해 혈장 중 분석물의 농도를 직접 측정하는 방법 {METHOD FOR MEASURING THE PLASMA CONCENTRATION OF AN ANALYTE DIRECTLY ON A WHOLE BLOOD SAMPLE}
본 발명은 생물학적 샘플의 분석, 보다 구체적으로는 혈액 샘플에서 분석물의 농도 또는 양의 측정에 관한 것이다. 본 발명은 특히 ELISA, ELFA 또는 면역포획 타입 (immunocapture type) 의 면역검정 측정에서의 적용을 발견한다.
통상적으로, 관심 대상의 분석물 및 상기 관심 대상의 분석물을 함유할 가능성이 있는 전혈 샘플에서 이의 농도에 대한 연구는 먼저 특히 원심분리에 의해 혈장을 적혈구와 분리하는 단계 및 이후에 혈장에서 분석물 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
"전혈" 은 이의 성분 모두를 가지는 혈액 및 따라서 특히 혈장 및 적혈구를 포함하는 생물학적 샘플에 해당한다. 이것은, 예를 들면, 어떠한 변형도 없이 사람 또는 동물로부터 샘플 채취된 혈액, 또는 아쥬반트, 예를 들면, 항응고제가 첨가된 동일한 혈액일 수 있다.
농도 측정 방법 중에서, 혈액 샘플에서 분석물의 수량에 따라 측정가능한 특성, 예를 들면, 광학, 전기적, 화학적, pH 또는 효소 특성을 개질하는 단계를 포함하는 기술, 특히 소위 직접적, 간접적 및 경쟁적 ELISA ("Enzyme-Linked ImmnoSorbent Assay"), ELFA ("Enzyme-Linked Fluorescence Assay") 및 면역포획 기술이 공지되어 있다.
도 1 은, 분석물에 결합하기 위한 2개의 파트너를 포함하고, 여기서, 예를 들면, 상기 분석물은 항원이고, 상기 2개의 결합 파트너는 항체이고, 상기 항체 각각은 서로 상이한 부위 또는 에피토프를 포함하고, 각각은 상보적 부위가 제공된 상기 항원에 결합할 수 있기 때문에 "샌드위치" ELISA 로도 또한 호칭되는 직접적 ELISA 측정의 주요 단계를 개략적으로 도시한 것이다. ELISA 측정은 이의 가장 간단한 버전에서 하기를 포함한다:
■ 웰 (well) 과 같은 고체 지지체의 표면을, 예를 들면, 측정하기에 바람직한 농도 또는 측정하기에 바람직한 분석물의 제1 결합 파트너의 층으로 코팅하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 결합 파트너는 분석물에 상보적인 부위를 나타내는 것인 단계 (도 1a 참조);
■ 전혈 샘플의 원심분리로부터 유래하는 혈장과 같은 혈액 샘플을 상기 웰에 도입하여 (도 1b 참조), 혈장에 존재하는 분석물이 웰 벽에 고정된 제1 결합 파트너와 접합하는 단계 (도 1c 참조);
■ 상기 웰의 제1 세척을 수행하여 진행중인 분석 동안 관심 대상이 아닌 요소, 예를 들면, 연구하려고 하는 것이 아닌 항체 및 항원을 제거하는 단계 (도 1d 참조);
■ 분석물을 위한 제2 결합 파트너를 상기 웰에 도입하는 단계로서, 여기서, 각각은 (i) 상기 제1 결합 파트너에 의해 고정된 분석물의 자유로운 부위 중 하나에 상보적이고 상기 제1 결합 파트너의 상보적인 부위와 상이한 부위가 제공되고, (ii) 촉매된 수소의 수량에 따라 색을 변화시키는 기질의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소 기능을 가지는 성분이 제공되는 것인 단계 (도 1e 참조). 효소 기능을 함유하는 이러한 제2 결합 파트너는 "접합체 (conjugates)" 로서 호칭된다;
■ 상기 웰의 제2 세척을 수행하여 과량의 접합체를 제거하는 단계 (도 1f 참조);
■ 상기 접합체의 효소 기능에 의해 분해가능한 기질을 상기 웰에 첨가하고 분광광도법에 의해 상기 웰에 함유된 매질의 색차 또는 광학 밀도를 측정하는 단계 (도 1g 참조).
색차는 고체 지지체의 벽에 고정된 제1 결합 파트너에 의해 고정된 분석물의 수량 또는 양에 직접 의존하기 때문에, 이러한 광학 특성의 측정은 혈장 샘플에 존재하는 분석물의 총 수량의 간접적 측정이고, 이에 따라 샘플의 용적, 내부의 분석물 농도를 알게 된다. 이어서, 측정된 색차는 소정의 수학적 모델에 의해 양 및/또는 농도 값으로 변환된다. "양"이란, 샘플에서 분석물의 수량을 의미한다. "농도"란, 측정이 수행되는 샘플의 용적으로 나누어진 양을 의미한다.
"경쟁적인" ELISA는 분석물을 위한 단일 결합 파트너를 포함하고, 이것은 검정하고자 하는 분석물과 경쟁하는 화합물 뿐만 아니라, 분석물의 부위 중 하나에 상보적인 부위를 나타낸다. 이때, 이들 2개의 요소 중 하나는 촉매된 가수분해의 수량에 따라 색을 변화시키는 기질의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소 기능을 가진다. 양 및 따라서 농도는 판독된 색차에 반비례한다.
ELFA 측정은 효소 기능에 의해 촉매된 기질이 예를 들면 형광광도계에 의해 측정된 형광을 생성한다는 사실 이외에는 ELISA 측정과 유사하다.
이들 측정 기술 모두는 측정하기에 바람직한 농도를 가지는 분석물을 단지 고정하는 요소를 제공한다. 비록 후자만이 구체적으로 고정되지만, 특히 반응 시간이 진단 관련 시간 제약으로 인해 감소할 때, 샘플의 성질이 양 측정에 실질적으로 영향을 미치는 것을 관찰할 수 있다. 따라서, 측정이 전혈 샘플에 대해 직접 수행될 때, 양의 측정값은 특히 매트릭스 효과를 가지는 헤마토크리트 (haematocrit) 의 존재로 인해 혈장 샘플에 대해 직접 측정되는 값보다 더 작다.
그 자체로 공지된 바와 같이, 헤마토크리트 수준 (haematocrit level) 또는 헤마토크리트는 전혈 용적에 대한 적혈구에 의해 점유되는 상대 용적에 해당한다. 진단용 샘플로서 혈장 샘플 대신에 전혈 샘플을 사용하는 면역검정 기기의 특정 제조사는 하기 식:
Figure pct00001
(1)
로서, 여기서,
Figure pct00002
는 분석물 양의 보정값이고, 　
Figure pct00003
는 전혈 샘플에 대해 직접 측정된 분석물 양이고,
Figure pct00004
는 전혈 샘플의 헤마토크리트 수준의 측정값인 것인 식에 따라 전혈 샘플에서 측정된 분석물 양을 보정하는 것을 제공하였다. 관계 (1) 은 또한 상응하는 양 대신에 분석물 농도의 측정값 및 보정값을 준용할 수 있다는 것을 유의해야 한다. 그러나, 3개의 간단한 규칙과 유사한 이러한 보정은 양호한 결과를 제공하지 않는다.
따라서, 지금까지, 분석물의 양 및 이에 따라 이의 농도는 혈장에 대해 주로 측정되며, 이러한 측정은 신뢰가능하고 재현가능한 것으로 고려되는 유일한 것이다. 또한, 이러한 측정은 피험자 마다 가변적인 헤마토크리트 수준과 독립적인 이점을 가진다.
현재, 혈장의 수득은 종래의 원심분리 단계를 필요로 하고, 따라서 시간 및 특정 장비를 필요로 한다. 시간은 의료 진단의 경우에 특히 피험자의 생명에 대한 위협이 있을 때 중요한 파라미터일 수 있을 뿐만 아니라, 이것은 다수의 분석을 담당하고 있는 실험실에서 다량의 원심분리기를 추가로 상정한다.
본 발명은 충분한 수준의 정확성으로 전혈 샘플에 대해 분석물의 양 및 따라서 농도를 직접 측정함으로써 특히 헤마토크리트 수준과 독립적인 측정을 제공하면서 종래의 원심분리 단계를 회피할 수 있도록 하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이러한 목적을 위해, 본 발명은 전혈 샘플에서 분석물의 양을 측정하는 방법을 목적으로 하며, 상기 방법은
■ 전혈 샘플의 헤마토크리트 수준을 측정하는 단계;
■ 상기 전혈 샘플에서 분석물 양을 직접 측정하는 단계; 및
■ 하기 관계:
Figure pct00005
로서, 여기서,
Figure pct00006
는 분석물 양의 보정값이고,
Figure pct00007
는 분석물 양의 측정값이고,
Figure pct00008
는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
Figure pct00009
는 불확정 값으로서 분석물 양의 측정값
Figure pct00010
및 헤마토크리트 수준의 측정값
Figure pct00011
을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식 (non-constant polynomial)인 것인 관계에 따라 분석물 양의 보정값을 계산하는 단계
를 포함한다.
일단 분석물 양이 측정되면, 후자는 통상적으로, 예를 들면, 측정 기기에 의해, 샘플에 존재하는 분석물의 농도로 직접 번역되는데, 이는 샘플 용적이 고정되어 있고 알려져 있기 때문이다. 농도 값은 특히 농도 측정값을 미리 정의된 기준 농도 값, 진단의 특징과 비교함으로써 시험관 내 진단을 실시하는데 사용되기 때문에, 본 발명은 또한 전혈 샘플에서 분석물 농도를 측정하는 방법을 목적으로 하며, 상기 방법은
■ 전혈 샘플의 헤마토크리트 수준을 측정하는 단계;
■ 상기 전혈 샘플에서 분석물 양을 직접 측정하고, 이것을 시험된 샘플의 용적에 기초하여 농도로 변환시키는 단계; 및
■ 하기 관계:
Figure pct00012
로서, 여기서,
Figure pct00013
는 분석물 농도의 보정값이고,　
Figure pct00014
는 상기 양의 측정값 및 샘플 용적으로부터 계산된 분석물 농도이고,
Figure pct00015
헤마토크리트 수준의 측정값이고,
Figure pct00016
는 불확정 값으로서 상기 양의 측정값으로부터 수득된 분석물 농도
Figure pct00017
및 헤마토크리트 수준의 측정값
Figure pct00018
을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식인 것인 관계에 따라 분석물 농도의 보정값을 계산하는 단계
를 포함한다.
환언하면, 본 발명자들은 특히 미지의 불확정 값 또는 변수로서 전혈 샘플에서 측정된 헤마토크리트 수준 및 양/농도를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식에 의해 전혈 샘플에 대해 직접 측정된 양/농도에 대한 오차를 실질적으로 보정하는 것이 가능한 것을 밝혀냈다. 본 발명에 따른 보정은 특히 광범위한 양/농도에 대해 +/- 10% 이내로 함유되고 종종 포함된 혈장 샘플에 대해 통상적으로 직접 수행된 측정과 관련하여 상대 측정 오차를 수득할 수 있게 해준다. 따라서, 혈장 샘플에 대해 측정을 직접 수행함으로써 수득된 값에 충분히 근접한 값을 가지는 양/농도의 보정값이, 예를 들면, 종래의 원심분리 단계를 수행하기 위해 더 이상 필요하지 않도록 시험관 내 진단을 수행하는데 사용될 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 다항식의
Figure pct00019
는 분석물 양의 측정값
Figure pct00020
과 헤마토크리트 수준의 측정값
Figure pct00021
의 곱
Figure pct00022
, 또는 분석물 농도의 측정값
Figure pct00023
과 헤마토크리트 수준의 측정값
Figure pct00024
의 곱
Figure pct00025
을 포함한다.
보다 특히, 분석물 양의 보정값은 하기 관계:
Figure pct00026
로서, 여기서,
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
및
Figure pct00030
는 상기 분석물에 의존하는 소정의 계수인 것인 관계에 따라 계산된다.
환언하면, 용어 D ST 와 D H 사이의 상호작용을 포함하는 다항식, 즉, 일차 용어
Figure pct00031
는 특히 ELISA, ELFA　및 면역포획 타입 면역검정 기술에 잘 적합화되어 있다.
물론, 계수
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
Figure pct00034
및
Figure pct00035
는 또한 측정 시스템 (분석물 및 헤마토크리트) 에 의존한다.
유사하게, 분석물 농도의 보정값은 하기 관계:
Figure pct00036
로서, 여기서,
Figure pct00037
,
Figure pct00038
,
Figure pct00039
및
Figure pct00040
는 상기 분석물에 의존하는 소정의 계수인 것인 관계에 따라 계산된다.
환언하면, 용어 C ST 와 D H 사이의 상호작용을 포함하는 다항식, 즉, 일차 용어
Figure pct00041
는 특히 ELISA, ELFA　및 면역포획 타입 면역검정 기술에 잘 적합화되어 있다.
물론, 계수
Figure pct00042
,
Figure pct00043
,
Figure pct00044
및
Figure pct00045
는 또한 측정 시스템 (분석물 및 헤마토크리트) 에 의존한다.
특히, 분석물이 45　ng/ml 내지 1,000　ng/ml 의 농도 측정 범위의 D-다이머인 경우, 계수는 하기 관계에 의해 제공된다:
■
Figure pct00046
는
Figure pct00047
내지
Figure pct00048
의 범위이고;
■
Figure pct00049
는
Figure pct00050
내지
Figure pct00051
의 범위이고;
■
Figure pct00052
는
Figure pct00053
내지
Figure pct00054
의 범위이고;
■
Figure pct00055
는
Figure pct00056
내지
Figure pct00057
의 범위이다.
보다 특히:
■
Figure pct00058
;
■
Figure pct00059
;
■
Figure pct00060
; 및
■
Figure pct00061
.
특히, 분석물이 0.01 μg/l 내지 1.6 μg/l 의 농도 측정 범위의 트로포닌, 예를 들면, 심장 트로포닌 I 인 경우, 계수는 하기 관계에 의해 제공된다:
■
Figure pct00062
는
Figure pct00063
내지
Figure pct00064
의 범위이고;
■
Figure pct00065
는
Figure pct00066
내지
Figure pct00067
의 범위이고;
■
Figure pct00068
는
Figure pct00069
내지
Figure pct00070
의 범위이고;
■
Figure pct00071
는
Figure pct00072
내지
Figure pct00073
의 범위이다.
보다 특히:
■
Figure pct00074
;
■
Figure pct00075
;
■
Figure pct00076
; 및
■
Figure pct00077
.
일 실시형태에 따르면, 분석물의 양의 측정 및 따라서 농도의 측정은 ELISA 타입 또는 ELFA 타입 또는 면역포획 타입 기술에 의해 수행된다. 환언하면, 사용된 측정 기술은 혈장에 대해 직접 수행된 측정 기술과 관련하여 변형되지 않는다. 따라서, 종래 기술의 면역검정 기기를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 전혈 샘플에서 혈장 중 분석물의 양을 측정하기 위한 장치를 목적으로 하며, 상기 장치는
■ 전혈 샘플을 수용하기 위한 수단;
■ 상기 전혈 샘플에서 총 분석물 양을 측정하기 위한 수단;
■ 하기 관계:
Figure pct00078
로서, 여기서,
Figure pct00079
는 분석물 양의 보정값이고,
Figure pct00080
는 분석물 양의 측정값이고,
Figure pct00081
는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
Figure pct00082
는 불확정 값으로서 분석물 양의 측정값
Figure pct00083
및 헤마토크리트 수준의 측정값
Figure pct00084
을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식인 것인 관계에 따라 분석물 양의 보정값을 계산하기 위한 수단
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 전혈 샘플에서 혈장 중 분석물의 농도를 측정하기 위한 장치를 목적으로 하며, 상기 장치는
■ 전혈 샘플을 수용하기 위한 수단;
■ 상기 전혈 샘플에서 총 분석물 양을 측정하기 위한 수단;
■ 상기 분석물 양을 농도로 변환시키기 위한 수단;
■ 상기 전혈 샘플에서 헤마토크리트 수준을 입력하거나 측정하기 위한 수단; 및
■ 하기 관계:
Figure pct00085
로서, 여기서,
Figure pct00086
는 분석물 농도의 보정값이고,
Figure pct00087
는 상기 양의 측정값으로부터 수득된 분석물 농도이고, 는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
Figure pct00089
는 불확정 값으로서 분석물 농도의 측정값
Figure pct00090
및 헤마토크리트 수준의 측정값
Figure pct00091
을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식인 것인 관계에 따라 분석물 농도의 보정값을 계산하기 위한 수단
을 포함한다.
본 발명은 첨부되는 도면과 관련해서만 예로서 제공된 하기 설명의 정독시에 더 잘 이해될 것이며, 여기서,
■ 도 1a 내지 1g 는 ELISA 또는 ELFA 타입의 종래 기술 "샌드위치" 분석물 농도 측정을 도시하는 단순도이고;
■ 도 2 는 본 발명에 다른 방법을 도시하는 흐름도이고;
■ 도 3 은 D-다이머에 적용된 다항식 보정 모델을 결정하고 검증하는데 사용된 샘플의 농도 및 헤마토크리트 수준 동질성을 도시하는 플롯이고;
■ 도 4 는 혈장의 D-다이머 농도의 측정치에 따라, 본 발명에 따른 보정 없이 전혈에서 측정된 D-다이머 농도를 도시하는 플롯이고;
■ 도 5 는 혈장에서 측정된 D-다이머 농도에 따라, 본 발명 및 종래 기술의 보정에 따라 수득된 상대 보정 오차의 검증 세트의 샘플에 대한 플롯이고;
■ 도 6 은 혈장에서 측정된 D-다이머 농도에 따라, 본 발명에 따라 보정된 D-다이머 농도의 검증 세트의 샘플에 대한 플롯이고;
■ 도 7 은 혈장에서 측정된 D-다이머 농도에 따라, 종래 기술에 따라 보정된 D-다이머 농도의 플롯이고;
■ 도 8 은 심장 트로포닌 I (TnI) 의 정량화의 맥락에서 적용된 다항식 보정 모델을 결정하는데 사용된 샘플의 농도 및 헤마토크리트 수준 동질성을 도시하는 결정 및 검증 세트의 샘플에 대한 플롯이고;
■ 도 9 는 혈장 샘플에서 측정된 TnI 농도에 따라, 본 발명에 따른 보정 없이 전혈 샘플에서 측정된 TnI 농도를 도시하는 플롯이고;
■ 도 10 은 혈장에서 측정된 TnI 농도에 따라, 본 발명 및 종래 기술의 보정에 따라 수득된 상대 보정 오차의 검증 세트의 샘플에 대한 플롯이고;
■ 도 11 은 혈장에서 측정된 TnI 농도에 따라, 본 발명에 따라 보정된 TnI 농도의 플롯이고;
■ 도 12 는 혈장에서 측정된 TnI 농도에 따라, 종래 기술에 따라 보정된 TnI 농도의 플롯이다.
도 2의 흐름도를 참조하여, 특정 분석물에 적용된 본 발명에 따른 방법을 지금부터 설명할 것이다.
본 발명의 방법은 전혈 샘플에 대해 분석물 양/농도의 측정을 보정하는 수학적 모델을 결정하는 단계 (10) 및 단계 (10) 에서 결정된 수학적 모델을 사용하여 환자 또는 동물로부터 샘플 채취된 총 혈액 샘플에서 알려지지 않은 분석물 양/농도의 보정값을 추론하는 단계 (12)를 포함한다.
모델의 결정 (10) 은 동일한 배치 (batch) 로부터, 예를 들면, 동일한 환자 또는 동물로부터 유래하는 전혈과 혈장 샘플의 쌍의 세트의 형성, 가변적인 헤마토크리트 수준 및 가변적인 분석물 속도 (variable analyte rate) 와 함께 (14) 에서 시작한다. 샘플은 수학적 모델을 결정하고 검증하는데 사용될 것이다. 유리하게, 이들 샘플에 사용된 헤마토크리트 변화는 혈액을 제공받은 사람 또는 동물에 대해 관찰된 범위 보다 더 크고, 바람직하게는 피험자에 대한 관찰된 헤마토크리트 평균 또는 이에 근접한 값으로 집중된다. 예를 들면, 남성에 대한 정상적인 헤마토크리트 값은 40 % 내지 54 %, 평균적으로는 45　% 이고, 여성에 대해서는 37 % 내지 47 %, 평균적으로는 42 % 이고, 수학적 모델을 결정하고 검증하는데 사용된 헤마토크리트 수준 범위는 26　% 내지 68　% 의 범위이다. 전혈에서의 분석물 농도는 건강한 피험자의 낮은 값 특징과 전혈 샘플의 용적에 최대 10 % 로 과적함으로써 제조된 높은 값 사이에서 변하도록 선택된다.
예를 들면, 전혈 샘플 용적의 세트가 형성되고, 각각의 용적은 2개로 나누어지고, 전혈 샘플을 형성하는 제1 하위 용적 및 제2 하위 용적은 혈장 샘플을 수득하기 위해 원심분리된다. 전혈 용적은 단일 피험자로부터 유래하거나, 상이한 피험자로부터 샘플 채취된 복수의 전혈의 혼합물로부터 유래할 수 있으며, 이것은 분석물 농도를 설정하도록 분석물로 과적될 수 있고/있거나, 혈장의 일부가 원심분리에 의해 제거되거나 원심분리로부터 수득된 혈장이 헤마토크리트 수준을 설정하도록 첨가된 제1 용적으로부터 유래할 수 있다.
이어서, 본 발명의 방법은 전혈 샘플에서의 분석물 양 또는 농도 및 헤마토크리트 수준의 측정에 의해 및 상응하는 혈장 샘플에서의 분석물 양 또는 농도의 측정에 의해 각각의 샘플 쌍에 대해 (16) 에서 수행된다. 그 양은, 예를 들면, 종래 기술의 ELISA, ELFA 또는 면역포획 타입의 기술에 의해 측정된다. 따라서, 트리플렛 (DST(i), DP(i), DH(i)) 의 세트가 수득되며, 각각은 전혈에서의 분석물의 양 DST(i), 혈장에서의 분석물의 양 DP(i), 및 전혈에서의 헤마토크리트 수준 DH(i) 을 포함한다. 물론, 이것은 분석물 양을 분석물 농도로 대체함으로써 농도 측정에 용이하게 적용될 수 있다.
유리하게는, 이어서 비정상적인 값을 가지는 트리플렛, 특히 전혈에서 측정된 양 DST(i) 이 혈장에서 측정된 DP(i) 보다 큰 것들을 버린다.
이어서, 수득된 샘플 쌍의 세트는 동일하거나 상이한 번호를 함유하는 2개의 하위 세트로 나누어지며, 제1 하위 세트는 수학적 모델을 결정하기 위해 사용되며, 제2 하위 세트는 결정된 수학적 모델을 검증하기 위해 사용된다. 수학적 모델을 결정하기 위해 사용된 샘플은 알려져 있고
Figure pct00092
, 수학적 모델을 검증하기 위해 사용된 샘플은 알려져 있다
Figure pct00093
. 예를 들면, 샘플 쌍의 2/3는 수학적 모델을 결정하기 위해 사용되며, 샘플 쌍의 1/3은 이의 검증을 위해 사용된다.
그 자체로 공지된 바와 같이, 사용된 측정 기술은 분석물을 고정하기 위해 사용된 특정 결합 파트너로 인해, 예를 들면, 고체 표면, 특히 콘 (cone) 의 표면에서의 고정화로 인해, 관련된 분석물에 좌우된다.
양 및 농도의 측정은 하나 또는 복수의 면역분석기, 예를 들면, BioMerieux's VIDAS® 오토마톤에 의해 실시된다. 그 자체로 공지된 바와 같이, 면역분석기는 각각 하나 또는 복수의 테스트 스트립을 수용할 수 있는 하나 또는 복수의 테스트 섹션을 포함한다. 각각의 스트립은 복수의 웰을 포함하며, 하나의 웰은 분석하고자 하는 샘플을 수용하고, 나머지 웰은 각각 측정 동안 사용되는 시약, 특히 희석제, 세정 용액, 접합체를 포함하는 용액, 및 효소 기질을 함유하는 용액을 함유한다. 오토마톤은 분석물에 특이적인 결합 파트너의 층을 함유하는 이의 표면을 가지는 콘 아래의 스트립을 대신하기 위한 메커니즘을 추가로 포함한다. 이어서, 콘은 사용된 측정 기술에 특이적인 흡수, 배출 및 항온처리 메커니즘을 실시하면서, 상이한 매질이 내부에 존재하는 특정 순서로 각각의 웰 및 피펫 위에 위치된다. 오토마톤은 이러한 기술에서 암시되는 특성을 측정하기 위한 장치를 마지막으로 포함한다. 예를 들면, VIDAS® 오토마톤은, 효소 기능에 의해 촉매된 기질이 형광을 생성하는 점에서 상기에서 기재된 직접적인 ELISA 기술과 상이한 ELFA- 타입 기술을 적용하고, 이것은 일단 최종 세척 단계가 수행되면 최종 큐벳 (cuvette) 에 함유된 용액의 형광을 측정할 수 있게 하는 형광광도계를 포함한다.
헤마토크리트 수준은 임의의 적절한 공지 기술에 의해, 예를 들면, 소위 본 실시형태에서 사용된 마이크로헤마토크리트 기술, Coulter 기술에 의해, 레이저 측정에 의해 또는 전도도 측정에 의해 측정된다.
본 발명의 방법의 다음 단계 (18) 에서, 계산은 예를 들면 결정 트리플렛
Figure pct00094
에 따라 실시되어, 전혈 샘플로부터 직접 측정된 분석물 양을 보정하기 위한 수학적 모델, 보다 특히 하기 관계:
Figure pct00095
(2)
로서, 여기서,
Figure pct00096
는 분석물 양의 보정값이고,
Figure pct00097
는 전혈 샘플에 대해 직접 측정된 분석물 양이고,
Figure pct00098
는 전혈 샘플의 헤마토크리트 수준이고,
Figure pct00099
,
Figure pct00100
,
Figure pct00101
및
Figure pct00102
는 수학적 모델의 계수 측정값인 것인 관계에 따른 모델의 파라미터를 계산한다.
유리하게는, 다항식 계수 계산 알고리즘을 적용하기 전에, 관계 (2) 에 따른 다항식의 변수
Figure pct00103
및
Figure pct00104
는 -1 과 1 사이에서 정규화된다. 특히, 전혈에서의 분석물 양이 최소값으로서
Figure pct00105
을 가지고 최대값으로서
Figure pct00106
을 가지는 경우, 변수
Figure pct00107
는 하기 변수:
Figure pct00108
로 변환되며, 여기서,
Figure pct00109
및
Figure pct00110
. 유사하게는, 헤마토크리트 수준이 최소값으로서
Figure pct00111
을 가지고 최대값으로서
Figure pct00112
를 가지는 경우, 변수
Figure pct00113
는 변수
Figure pct00114
(여기서,
Figure pct00115
및
Figure pct00116
) 로 변환된다.
관계 (2) 에 다른 모델은 하기 관계:
Figure pct00117
(3)
로서, 여기서, 계수
Figure pct00118
,
Figure pct00119
,
Figure pct00120
및
Figure pct00121
는 비용 함수
Figure pct00122
를 최소화함으로써 최소 자승법에 따라 결정된다. 계수
Figure pct00123
,
Figure pct00124
,
Figure pct00125
및
Figure pct00126
는 계수
Figure pct00127
,
Figure pct00128
,
Figure pct00129
및
Figure pct00130
로부터 용이하게 추론될 수 있다.
변수의 변환은 계산 알고리즘과 독립적이고 각각의 변수를 동일한 스케일로 표현하고, 따라서 상이한 계수
Figure pct00131
,
Figure pct00132
및
Figure pct00133
를 비교할 수 있다.
여기서 다시, 상기는 분석물 양을 분석물 농도로 대체함으로써 농도 측정에 적용가능하다. 따라서, 변형으로서, 전혈 샘플에서 측정된 분석물 양은 상기 양의 측정값을 전혈 샘플의 용적으로 나눈 후, 수학적 농도 보정 모델, 특히 하기 관계:
Figure pct00134
(2bis)
로서, 여기서,
Figure pct00135
는 분석물 농도의 보정값이고,
Figure pct00136
는 상기 양의 측정값 및 샘플 용적으로부터 계산된 분석물 농도이고,
Figure pct00137
,
Figure pct00138
,
Figure pct00139
및
Figure pct00140
는 상기 분석물에 의존하는 소정의 계수이고, 이들 계수는 예를 들면 최소 자승법에 의해 계산되는 관계에 따른 모델이 계산됨으로써 분석물 농도로 변환된다. 분석물 농도는 상기 양으로부터 추론되기 때문에, 다항식에서 분석물 농도에 연결된 계수, 즉, 계수
Figure pct00141
및
Figure pct00142
는 양 및 농도로 표현된 2개의 모델에 대해 동일하다. 그러나, 나머지 계수, 즉,
Figure pct00143
및
Figure pct00144
는 상이하다.
유사하게는, 하기 관계:
Figure pct00145
(3bis)
로서, 여기서,
Figure pct00146
,
Figure pct00147
,
Figure pct00148
,
Figure pct00149
는 농도 C ST 의 최소값이고,
Figure pct00150
는 농도 C ST 의 최대값이고, 다항식 계수는 관계 (2bis) 의 다항식 계수로부터 용이하게 추론될 수 있는 계수인 것인 관계에 따른 수학적 모델을 계산함으로써, 관계 (3) 의 정규화와 유사한 관계 (2bis) 의 다항식의 변수의 정규화에 적용하는 것이 가능하다.
이어서, 본 발명의 방법은 양 모델에 대해 검증 트리플렛의 세트, 예를 들면,
Figure pct00151
를 사용함으로써 결정된 모델의 검증과 함께 (20) 에서 수행된다.
보다 구체적으로, 결정된 모델은 유리하게는 하기 기준 중 하나 이상에 기초하여 검증된다:
■ 수학적 모델, 즉,
Figure pct00152
에 의해 보정된 양
Figure pct00153
과 혈장에서 측정된 양
Figure pct00154
사이의 상대 오차
Figure pct00155
. 보다 구체적으로, 상대 오차가 0　% 에 집중되고 -10　% 내지 +10　% 인지 검증된다;
■ 예를 들면, 소위 "Passing and Bablok" 선형 회귀
Figure pct00156
에 따라 수득된 1차 방정식의 파라미터; 및
■ 상기에서 기재된 "Passing and Bablok" 방정식을 사용함으로써 혈장에서 상이한 분석물 양에 대해 계산된 바이어스 (biases).
여기서 다시, 상기는 분석물 양을 분석물 농도로 대체함으로써 농도 측정에 용이하게 적용될 수 있다.
일단 결정된 모델이 승인되면, 본 발명의 방법은 전혈 샘플에 대해 직접 수행된 분석물 양/농도 측정을 위한 상기 모델의 취렴 (exploitation) 과 함께 (12) 에서 수행된다.
예를 들면, 상기 모델은 헤마토크리트 수준 값을 수용하거나 계산할 수 있도록 추가로 변형될 수 있는 시판되는 면역분석기의 데이터 처리 유닛에 적재된다. 다르게는, 상기 모델은, 면역분석기, 예를 들면, 개인 컴퓨터와 독립적인 처리 유닛에서 실시된다. 이러한 변형에서, 오퍼레이터는 전혈 샘플에 대해 면역분석기에 의해 측정된 분석물 양/농도 값 및 상기 샘플에 대해 측정된 헤마토크리트 수준의 값을 유닛에 입력하고 분석물 양/농도의 보정값을 차례로 수득한다.
따라서, 분석물의 양 및 상기 모든 농도가 알려지기를 바라는 공지의 용적의 전혈 샘플의 경우, 취렴 단계 (12) 는 샘플의 헤마토크리트 수준
Figure pct00157
의 측정과 함께 (22) 에서 시작하고, 수학적 모델을 결정하고 검증하기 위해 사용된 것과 동일한 면역분석기 모델에 의해 수행된 동일한 측정 기술에 의해 전혈 샘플에서 분석물 양/농도의 직접 측정과 함께 (24) 에서 수행된다.
이어서, 분석물 양의 보정값
Figure pct00158
는 모델 (10) 의 결정시에 계산된
Figure pct00159
,
Figure pct00160
,
Figure pct00161
및
Figure pct00162
, 또는 관계 (3) 에 다른 모델의 등가 계수
Figure pct00163
,
Figure pct00164
,
Figure pct00165
및
Figure pct00166
를 가지는 관계 (2) 에 따라 (26) 에서 계산된다. 분석물 농도의 보정값은 관계 (2bis) 또는 관계 (3bis) 에 따라 동일한 방법으로 계산된다.
(28) 에서, 농도는 계산되고, 이어서 예를 들면 스크린 상에 출력, 표시되고/되거나 컴퓨터 메모리에 기록된다. 임의로, 양의 보정값도 또한 출력될 수 있다.
양 또는 농도의 측정값이 수학적 모델에 의해 보정되는 본 발명에 따른 방법을 기재하였다.
상기에서 기재된 바와 같이, 측정 기술은 분석된 샘플에 존재하는 분석물 양에 따라 이의 값을 가지는 특성, 예를 들면, 광학, 전기적, 화학적, pH 또는 효소 결합 특성에 근거한다. 따라서, 면역분석기는 이러한 특성을 측정하고 이러한 측정에 상응하는 신호를 출력하는 장치를 포함한다. 종래 기술에 따르면, 신호는 이어서 신호를 양 및/또는 농도 값으로 변환시키는 소정의 수학적 모델에 의해 처리된다.
변형으로서, 상기 방법은 이의 변환 전에 실제 신호에 적용된다. 특히, 전혈 샘플에 대해 측정된 신호는 하기 관계:
Figure pct00167
(4)
에 따라 보정되며, 여기서,
Figure pct00168
는 신호의 보정값이고,
Figure pct00169
는 전혈 샘플에 대한 측정으로부터 유래하는 신호이다. 신호 보정에 적용된 방법은 당업자의 능력 내에서 약간의 변형을 가하는 경우에 상기에서 기재된 방법과 유사하다. 관계 (3) 과 유사한 정규화 변수에 의한 수학적 모델의 계산도 또한 가능하다.
2개의 본 발명의 적용예, 각각 D-다이머 농도의 측정에 대한 적용 및 심장 트로포닌 I 농도의 측정에 대한 적용을 지금부터 기재할 것이다.
D-다이머 농도의 측정
D-다이머는 혈액 응고 가교결합 피브린 또는 "XIIIa" 인자를 담당하는 효소에 의해 공유 결합된 2개의 연속 피브린 모노머에 의해 형성된 에피토프 D-D 를 모두 가지는 이종 피브린 생성물이다. D-다이머의 검정은 주로 정맥 혈전 질환, 특히 깊은 정맥 혈전증 및 폐 색전증의 배제의 진단, 항응고제 치료의 중단 후 이러한 질환의 재발 위험의 평가, 파종 정맥내 응고의 진단에서 나타난다.
D-다이머와 연관된 수학적 모델을 결정하고 검증하기 위해서, 혈액은 항응고제로서 시트르산 나트륨에 대해 186명의 건강한 피험자로부터 샘플 채취되었다. 보다 구체적으로, 혈액은 0.129 M 의 시트르산 삼나트륨을 함유하는 진공 하의 4.5 mL 의 튜브에 수집하였다.
다양한 헤마토크리트 수준을 가지는 전혈 샘플을 가지기 위해서, 수집된 샘플을 가벼운 원심분리 후 자신의 혈장으로 희석하여 26　% 내지 61　% 의 범위인 헤마토크리트 수준을 수득하였다. 헤마토크리트 수준을 마이크로헤마토크리트 기술에 의해 측정한다. 먼저 마이크로헤마토크리트를 10,000 rpm 에서 7 분 동안 모세관의 원심분리에 의해 획득한 후, 헤마토크리트 수준의 값을 종래 기술에서 그 자체로 공지된 차트에 의해 추론한다.
다양한 D-다이머 농도를 가지는 전혈 및 혈장 샘플을 가지기 위해서, 다양한 헤마토크리트 수준을 가지기 전 또는 후에 전혈 샘플을 D-다이머로 과적하였다. 샘플을 과적하기 위해서, 검정하고자 하는 강한 D-다이머 농도를 가지는 bioMerieux's 국내 혈청 은행 (Marcy L'Etoile, France) 으로부터의 혈장을 사용하여 45　ng/mL-1,000　ng/mL 범위에서 전혈 중 D-다이머 농도의 분포를 가지게 하였다. 전혈 샘플을 특히 300 ng/mL, 500 ng/mL 및 1,000 ng/mL 로 과적하고, 최초 혈액 매트릭스를 변형하는 것을 회피하도록 전혈 샘플의 용적의 10 % 를 초과하지 않도록, 즉, 1,000　ng/mL 를 초과하지 않도록 과적하였다. 샘플 분포는 도 3에서 도시된 바와 같이 전혈에서 측정된 양으로부터 수득된 D-다이머 농도 범위에서 및 헤마토크리트 수준 범위에서 균일하며, 이는 모델 결정 트리플렛 (점 모양) 및 모델 검증 트리플렛 (별 모양) 에 대한 쌍 (전혈에서 측정된 양으로부터 유래하는 농도, 헤마토크리트 수준) 을 나타낸다. 혈장 샘플은 3,000 rpm 에서 10분 동안 각각의 전혈의 일부의 원심분리에 의해 더 수득된다.
수치 예로서, 샘플의 제조 후, 전혈에서의 D-다이머 농도는 46.78　ng/mL 내지 982.81　ng/mL 의 범위에서 분포되고, 헤마토크리트 수준은 26　% 내지 61　% 의 범위에서 분포되고, 혈장에서의 D-다이머 농도는 96.86　ng/mL 내지 1,419.58　ng/mL 의 범위에서 분포된다.
전혈 및 혈장 샘플에서의 D-다이머 농도의 측정은 ELFA-타입 기술, 특히 bioMerieux SA 의 참조번호 30　455로 지정된 "VIDAS D-dimere Exclusion II" 키트를 가지는 VIDAS® 오토마톤에 의해 실시된 인간 혈장 피브린 분해 생성물 (fibrin degradation products: PDF) 의 효소 면역검정을 포함한다. 따라서, 이러한 측정은 2 단계의 샌드위치-타입 효소 면역검정법을 최종 형광 검측 (ELFA) 과 연관시킨다. 제1 단계에서, 항원이 콘 상에 고정된 항-FbDP 항체 ("피브리노겐 분해 생성물" 에 대한 FbDP) 에 결합할 수 있도록 샘플을 여러 번 샘플 채취하고, 흡인하고, 배출하였다. 제2 단계에서, ALP (알칼리성 포스페이트) 로 표지된 모노클로날 항-FbDP 항체는 샌드위치를 형성하기 위해 콘상에 이미 고정된 항원에 결합한다. 세척 단계는 고정되지 않거나 과량의 화합물을 제거한다. 이어서, 발전 단계가 수행된다. 4MUP 기질 (4-메틸-움벨리페릴-포스페이트) 을 콘에 흡수시킨 후 배출시키고, ALP 는 기질의 형광성 4MU (4-메틸-움벨리페론) 으로의 가수분해를 촉매한다, 방출 형광을 450 nm에서 측정한다. 형광 신호의 값은 샘플에서의 항원 양에 비례한다.
도 4 는 각각의 혈장 샘플에서 측정된 양 Cp(i) 로부터 수득된 D-다이머 농도에 따라 전혈 샘플에서 측정된 농도 CST(i) 로부터 수득된 D-다이머 농도를 도시한다. 2개의 양 사이의 "Passing and Bablok" - 타입 선형 회귀
Figure pct00170
는 특히
Figure pct00171
및
Figure pct00172
를 제공한다.
전혈에서 측정된 농도가 혈장에서 측정된 농도보다 큰 트리플렛은 폐기한다.
103개의 트리플렛
Figure pct00173
을 사용하여 수학적 모델을 결정하였다.
따라서, 하기 계수가 수득된다:
■
Figure pct00174
;
■ 표준 편차가 11.917 인
Figure pct00175
;
■ 표준 편차가 12.389 인
Figure pct00176
; 및
■ 표준 편차가 25.909 인
Figure pct00177
,
또는, 등가적으로 정규화하지 않음:
■
Figure pct00178
;
■
Figure pct00179
;
■
Figure pct00180
; 및
■
Figure pct00181
.
50개의 검증 트리플렛
Figure pct00182
을 추가로 사용하여 수학적 모델을 검증하였다.
도 5 는 다이아몬드형으로 표시된, 검증 샘플에 적용된 관계 (2bis) 또는 (3bis) 에 따른 보정
Figure pct00183
과, 사각형으로 표시된, 검증 샘플에 적용된 관계 (1) 에 따라 수행된 종래 기술의 보정
Figure pct00184
둘 다에 대해 혈장에서 측정된 양으로부터 수득된 D-다이머 농도에 따른 상대 오차
Figure pct00185
를 도시한다. 알 수 있는 바와 같이, 종래 기술의 보정과 반대로, 본 발명에 의해 수득된 상대 오차는 0 에 집중되고, 주로 -10　% 내지 10　% 의 범위이다.
도 6 및 도 7 은 관계 (2bis) 또는 관계 (3bis) 의 보정에 따라 및 관계 (1) 의 보정에 따라 각각 혈장에 대해 측정되고 검증 샘플에 적용된 농도에 따른 농도의 보정값을 도시한다. 각각의 보정에 대한 선형 회귀 "Passing and Bablok" 타입에 의해 수득된 선을 추가로 계산하고 플롯팅한다. 종래 기술의 보정에 상응하는 선은 1.18 의 기울기를 가진다. 본 발명에 상응하는 선은 1.03 의 기울기를 가지는 동일성에 가깝다.
마지막으로, 전혈에서의 3개의 D-다이머 농도, 즉, 250 ng/mL, 500　ng/mL 및 1,000 ng/mL 에 대한 바이어스를 계산하고, 본 발명에 따른 보정에 대해 각각 -3.4　%, -0.4　% 및 +1.1　% 이며, 종래 기술의 보정에 대해 각각 +6.7　%, +12.5　% 및 +15.4　% 이다.
따라서, 혈장에 대해 직접 수행된 측정에 의해 수득된 것들과 유사한 본 발명에 따라 보정된 농도를 관찰할 수 있다.
샘플에 대해 측정된 신호에 대해 보정을 수행할 때, 유사한 결과를 관찰할 수 있다.
심장 트로포닌 I 농도의 측정
트로포닌 (Tn) 은 가로무늬 근육의 단백질이다. 가로무늬 근육은 미오신으로 이루어진 두꺼운 필라멘트와 액틴, 트로포미오신 및/또는 트로포닌 복합체로 이루어진 얇은 필라멘트로 형성된다. 이러한 복합체는 그 자체로 3개의 하위 유닛, 즉 소위 "C", "I" 및 "T" 트로포닌으로 형성된다. 이들 트로포닌의 각각은 골격 및 심장 이소형을 가진다. 심장 트로포닌은 심근 괴사의 검출을 위한 선택 마커이고, 이의 검정은 심근 경색을 진단할 수 있게 해준다. 심장 트로포닌의 검정은 또한 혈전용해 치료의 후속 조치를 위해 및 심근 괴사의 크기를 평가하기 위해 사용될 뿐만 아니라, 급성 관상동맥 증후군의 진단에서 사용된다. TnI 로 알려진 트로포닌 "I" 의 검정은 또한 다른 병변, 특히 신부전, 갑상선 기능 저하증, 아교질증, 근육병증 또는 폐 색전증의 맥락에서 심장 손상을 강조할 수 있다.
TnI 와 관련된 수학적 모델을 결정하고 검증하기 위해서, 혈액은 항응고제로서의 리튬 헤파리네이트에 대해 186명의 건강한 환자로부터 샘플 채취되었다. 보다 구체적으로, 혈액은 17 UI/mL 의 리튬 헤파리네이트를 함유하는 4 mL 의 튜브에서 수집되었다.
헤마토크리트 수준 및 TnI 농도를 가지는 전혈 샘플의 수득 및 전혈 샘플로부터의 혈장 샘플의 수득은 D-다이머의 복용량과 관련하여 기재된 것들과 유사하다.
전혈 및 혈장 샘플에서의 TnI 농도의 측정은 ELFA-타입 기술에 의한, 특히 bioMerieux 의 참조번호 30 448 로 지정된 "VIDAS Troponine I Ultra" 키트를 가지는 VIDAS® 오토마톤에 의해 실시된 인간 혈장에서 트로포닌의 효소 면역검정을 포함한다. 단일 단계에서, 샘플을 샘플 채취하고, ALP 로 표지된 항-TNI 심장 항체인 접합체를 함유하는 웰에 옮긴다. 샘플/접합체 혼합물은 콘에 의해 여러 번 흡입된 후 배출된다. 이것은 한편으로는 TnI 가 접합체에 결합하여 샌드위치를 형성하는 것을 가능하게 한다. 세척 단계는 고정되지 않거나 과량의 화합물을 제거한다. ALP 는 VIDAS® 스트립의 마지막 웰에 함유된 기질의 형광성 4MU 로의 가수분해를 촉매한다. 방출된 형광을 450 nm 에서 측정한다. 형광 신호의 값은 샘플에서의 항원 농도에 비례한다. 테스트의 종료시에, 결과들은 2개의 발전 단계에 상응하는 2개의 보정 곡선으로부터 계산된다. 임계 신호는 각각의 샘플에 사용되는 보정 곡선의 선택을 처리한다.
전혈 샘플에서의 TnI 농도는 0.01　μg/L 내지 1.4　μg/L 이고, 헤마토크리트 수준은 22　% 내지 73　% 이고, 따라서, 혈장에서의 TnI 농도는 0.01　μg/l 내지 1.6　μg/l 이다.
샘플 분포는, 도 8 에서 도시된 바와 같이, 전혈 샘플에서 측정된 TnI 농도 범위 및 헤마토크리트 수준 범위에서 균일한데, 이는 모델 결정 트리플렛 (점 모양) 및 모델 검증 트리플렛 (별 모양) 에 대한 (전혈에서 측정된 농도, 헤마토크리트 수준) 쌍을 나타낸다.
도 9 는 각각의 혈장 샘플에서 측정된 TnI 농도 Cp(i) 에 따라 전혈 샘플에서 측정된 농도로부터 수득된 TnI 농도 CST(i) 를 도시한다. 2개의 농도 사이의 "Passing and Bablok"-타입 선형 회귀
Figure pct00186
는 특히
Figure pct00187
및
Figure pct00188
를 제공한다.
총 187개의 샘플을 제조하고, 교환 알고리즘, 예를 들면, Fedorov 알고리즘을, 예를 들면, LPRAI Sarl 의 소프트웨어 NEMRODWⓒ 에 의해 실시하였다. Fedorov 알고리즘은 수학적 모델을 결정하기 위한 N 개의 최상 샘플, 예를 들면, 수학적 모델의 파라미터를 계산하기 위한 모든 샘플 중에서 20개의 최상 샘플을 선택할 수 있는 이점을 가지는 반복 알고리즘이다.
하기 계수는 20개의 선택된 샘플에 의해 수득된다:
■
Figure pct00189
;
■
Figure pct00190
;
■
Figure pct00191
; 및
■
Figure pct00192
.
또는 등가적으로:
■
Figure pct00193
;
■
Figure pct00194
;
■
Figure pct00195
; 및
■
Figure pct00196
.
167개의 검증 트리플렛
Figure pct00197
은 수학적 모델 을 검증하는데 추가로 사용된다.
도 10 은 다이아몬드형으로 표시된, 검증 샘플에 적용된 관계 (2bis) 또는 (3bis) 에 따른 보정
Figure pct00198
과, 사각형으로 표시된, 검증 샘플에 적용된 관계 (1) 에 따라 수행된 종래 기술의 보정
Figure pct00199
둘 다에 대해 혈장에서 측정된 양으로부터 수득된 TnI 농도에 따른 상대 오차
Figure pct00200
를 도시한다. 알 수 있는 바와 같이, 종래 기술의 보정과 반대로, 상대 오차는 0 에 집중되고, 주로 -10　% 내지 10　% 의 범위이다. TnI 농도가 검측 한계에 가까운 샘플 범위에서 -/+10　% 외의 몇몇 결과를 관찰할 수 있다.
도 11 및 도 12 는 관계 (2bis) 또는 관계 (3bis) 의 보정 및 관계 (1) 의 보정에 따라 각각 혈장에 대해 측정되고 검증 샘플에 적용된 농도에 따른 TnI 농도의 보정값을 도시한다. 각각의 보정에 대한 "Passing and Bablok" 타입의 선형 회귀에 의해 수득된 선을 추가로 계산하고 플롯팅한다. 종래 기술의 보정에 상응하는 선은 1.48 의 기울기를 가진다. 본 발명에 상응하는 선은 1.02 의 기울기를 가지는 동일성에 가깝다.
마지막으로, 전혈에서의 3개의 TnI 농도, 즉, 0.1　μg/L, 0.5　μg/L 및 1　μg/L 에 대한 바이어스를 계산하고, 본 발명에 따른 보정에 대해 각각 3.1　%, 2.0　% 및 +1.9　% 이며, 종래 기술의 보정에 대해 각각 +43.3　%, +46.7　% 및 +47.1　% 이다.
D-다이머에 대해 수득된 것들과 동일한 결과, 즉, 혈장에 대해 직접 수행된 측정에 의해 수득된 것들과 유사한 농도의 보정값도 또한 관찰할 수 있다.
샘플에 대해 측정된 신호에 대해 보정을 수행할 때, 유사한 결과를 관찰할 수 있다.
관계 (2bis) 또는 관계 (3bis) 에 따른 1차 다항식이 사용된 실시형태를 설명하였다. 전혈에서 측정된 헤마토크리트 수준의 제곱 및/또는 분석물 양/농도의 제곱을 포함하는 2차 다항식도 또한 사용할 수 있다. 유사하게, 더 높은 차수의 다항식을 사용할 수 있다.
특히, 하기 절차는 사용된 다항식을 확인하기 위해 사용될 수 있다:
a) 다항식의 차수를 1로 설정하는 단계;
b) 상기에서 설명한 바와 같이, 예를 들면, 최소 자승법에 의해 다항식의 파라미터를 계산하는 단계;
c) 다항식의 예측 오차가 만족스러운 것으로 간주되면, 이 다항식을 선택하는 단계. 예를 들면, 예측 오차를 계산하고, 이것이 임계치 보다 낮고, 유리하게는 10　% 인 경우, 다항식을 선택한다; 및
d) 유리하게는 검증 데이터의 세트에 대해 계산된 예측 오차가 만족스러운 것으로 간주되지 않는 경우, 예측 오차가 만족스러운 것으로 간주될 때까지 하나의 단위씩 다항식의 차수를 증가시키고 단계 b), 단계 c) 및 단계 d) 를 반복하는 단계. 변형으로서, 이들 단계는 차수가 10 이하, 바람직하게는 5 이하인 한 반복된다.
물론, 다항식의 계산 및/또는 최종 선택의 다른 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 종래 기술에서 그 자체로 공지된 바와 같이, 비선형 회귀에 의해 차수를 또한 계산할 수도 있다. 유사하게, 복수의 다항식을 계산할 때, 예를 들면, 베이지안-타입 기준 (bayesian-type criterion), 예를 들면, BIC ("bayesian information criterion") 를 사용하여 최종 다항식을 선택할 수 있다.
양/농도 측정이 수학적 모델에서 변수의 변환 없이 사용되는 실시형태를 설명하였다. 변형으로서, 양/농도 범위의 측정값이 유의미한 경우, 측정 공간의 변환, 예를 들면, 로그 변환을 실시할 수 있다. 따라서, 용어 "측정" 이란, 본 발명의 의미에서 직접 또는 변환된 측정을 의미한다.
유사하게, 유의미한 양/농도 범위에 대해 계산된 다항식 계수를 설명하였다. 변형으로서, 양/농도의 범위를 복수의 간격으로 나눌 수 있고, 수학적 모델을 이들 간격의 각각에 대해 결정할 수 있다. 따라서, 모델의 계수는, 이들이 계산되는 양/농도 간격에 좌우될 수 있다.

Claims (13)

  1. 전혈 샘플에서 분석물의 양을 측정하는 방법으로서,
    상기 방법은
    ■ 전혈 샘플의 헤마토크리트 수준 (haematocrit level) 을 측정하는 단계;
    ■ 상기 전혈 샘플에서 분석물 양을 직접 측정하는 단계; 및
    ■ 하기 관계:
    Figure pct00201

    로서, 여기서,
    Figure pct00202
    는 분석물 양의 보정값이고,
    Figure pct00203
    는 분석물 양의 측정값이고,
    Figure pct00204
    는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
    Figure pct00205
    는 불확정 값으로서 분석물 양의 측정값
    Figure pct00206
    및 헤마토크리트 수준의 측정값
    Figure pct00207
    을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식 (non-constant polynomial) 인 것인 관계에 따라 분석물 양의 보정값을 계산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 전혈 샘플에서 분석물의 농도를 측정하는 방법으로서,
    상기 방법은
    ■ 전혈 샘플의 헤마토크리트 수준을 측정하는 단계;
    ■ 상기 전혈 샘플에서 분석물 양을 직접 측정하고, 상기 양의 측정값을 상기 샘플의 용적으로 나눔으로써 상기 양의 측정값을 농도로 변환시키는 단계; 및
    ■ 하기 관계:
    Figure pct00208

    로서, 여기서,
    Figure pct00209
    는 분석물 양의 보정값이고,　
    Figure pct00210
    는 분석물 양의 측정값이고,
    Figure pct00211
    는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
    Figure pct00212
    는 불확정 값으로서 분석물 농도의 측정값
    Figure pct00213
    및 헤마토크리트 수준의 측정값
    Figure pct00214
    을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식인 것인 관계에 따라 분석물 농도의 보정값을 계산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 다항식
    Figure pct00215
    는 분석물 양의 측정값
    Figure pct00216
    과 헤마토크리트 수준의 측정값
    Figure pct00217
    의 곱
    Figure pct00218
    , 또는 분석물 농도의 측정값
    Figure pct00219
    과 헤마토크리트 수준의 측정값
    Figure pct00220
    의 곱
    Figure pct00221
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 4에 있어서, 상기 분석물 양의 보정값은 하기 관계:
    Figure pct00222

    로서, 여기서,
    Figure pct00223
    ,
    Figure pct00224
    ,
    Figure pct00225
    및
    Figure pct00226
    는 상기 분석물에 의존하는 소정의 계수인 것인 관계에 따라 계산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 분석물 농도의 보정값은 하기 관계:
    Figure pct00227

    로서, 여기서,
    Figure pct00228
    ,
    Figure pct00229
    ,
    Figure pct00230
    및
    Figure pct00231
    는 상기 분석물에 의존하는 소정의 계수인 것인 관계에 따라 계산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 분석물은 D-다이머이고,
    ■
    Figure pct00232
    는
    Figure pct00233
    내지
    Figure pct00234
    의 범위이고;
    ■
    Figure pct00235
    는
    Figure pct00236
    내지
    Figure pct00237
    의 범위이고;
    ■
    Figure pct00238
    는
    Figure pct00239
    내지
    Figure pct00240
    의 범위이고;
    ■
    Figure pct00241
    는
    Figure pct00242
    내지
    Figure pct00243
    의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 5에 있어서,
    ■
    Figure pct00244
    ;
    ■
    Figure pct00245
    ;
    ■
    Figure pct00246
    ; 및
    ■
    Figure pct00247

    인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 분석물은 심장 트로포닌 I 이고,
    ■
    Figure pct00248
    는
    Figure pct00249
    내지
    Figure pct00250
    의 범위이고;
    ■
    Figure pct00251
    는
    Figure pct00252
    내지
    Figure pct00253
    의 범위이고;
    ■
    Figure pct00254
    는
    Figure pct00255
    내지
    Figure pct00256
    의 범위이고;
    ■
    Figure pct00257
    는
    Figure pct00258
    내지
    Figure pct00259
    의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    ■
    Figure pct00260
    ;
    ■
    Figure pct00261
    ;
    ■
    Figure pct00262
    ; 및
    ■
    Figure pct00263

    인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물 양/농도는 ELISA 타입, ELFA 타입 또는 면역포획 타입 (immunocapture type) 의 면역검정 기술에 따라 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 전혈 샘플에서 혈장 중 분석물의 양을 측정하기 위한 장치로서,
    상기 장치는
    ■ 전혈 샘플을 수용하기 위한 수단;
    ■ 상기 전혈 샘플에서 총 분석물 양을 측정하기 위한 수단;
    ■ 하기 관계:
    Figure pct00264

    로서, 여기서,
    Figure pct00265
    는 분석물 양의 보정값이고,
    Figure pct00266
    는 분석물 양의 측정값이고,
    Figure pct00267
    는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
    Figure pct00268
    는 불확정 값으로서 분석물 양의 측정값
    Figure pct00269
    및 헤마토크리트 수준의 측정값 을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식인 것인 관계에 따라 분석물 양의 보정값을 계산하기 위한 수단
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 전혈 샘플에서 혈장 중 분석물의 농도를 측정하기 위한 장치로서,
    상기 장치는
    ■ 전혈 샘플을 수용하기 위한 수단;
    ■ 상기 전혈 샘플에서 총 분석물 양을 측정하기 위한 수단;
    ■ 상기 분석물 양을 농도로 변환시키기 위한 수단;
    ■ 전혈 샘플에서의 헤마토크리트 수준을 입력하거나 측정하기 위한 수단;
    ■ 하기 관계:
    Figure pct00271

    로서, 여기서,
    Figure pct00272
    는 분석물 농도의 보정값이고,
    Figure pct00273
    는 상기 양의 측정값 및 샘플 용적으로부터 계산된 분석물 농도이고,
    Figure pct00274
    는 헤마토크리트 수준의 측정값이고,
    Figure pct00275
    는 불확정 값으로서 상기 양의 측정값으로부터 수득된 분석물 농도
    Figure pct00276
    및 헤마토크리트 수준의 측정값
    Figure pct00277
    을 가지고 상기 분석물에 의존하는 이의 다항식 계수를 가지는 1차 이상의 비상수 다항식인 것인 관계에 따라 분석물 농도의 보정값을 계산하기 위한 수단
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 청구항에 있어서, 상기 장치는 청구항 3 내지 청구항 10 중 어느 한 항의 방법을 실시할 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
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