KR20160003354A

KR20160003354A - 단백질분해효소 반응을 이용한 표적 물질 검출용 바이오 센서

Info

Publication number: KR20160003354A
Application number: KR1020140080757A
Authority: KR
Inventors: 안유민; 황승용; 서인재; 안국기
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-01-11

Abstract

본 발명은 기준전극 및 상기 기준전극과 소정간격 이격되어 형성되며, 표적단백질분해효소와 결합하는 표적단백질분해효소의 기질이 고정화될 수 있는 작업전극을 포함하는 전극부; 상기 전극부가 형성된 하부기판; 상기 전극부는 적어도 두 개를 포함하며, 상기 전극부의 상부에 형성된 미세채널; 상기 하부기판과 대향하며, 상기 미세채널 상에 혼합부가 형성된 상부기판; 을 포함하며, 상기 표적단백질분해효소의 결합 전 및 후의 상기 작업전극과 상기 기준전극의 임피던스 차이를 측정하는 바이오 센서에 관한 것이다.

Description

단백질분해효소 반응을 이용한 표적 물질 검출용 바이오 센서{Biosensor for detecting target materials using protease reaction}

본 발명은 단백질분해효소 반응을 이용한 표적 물질 검출용 바이오 센서에 관한 것이다.

현대에 이르러 과학과 기술의 발달로 삶의 질이 계속해서 향상되고 있고, 다양한 분야에서 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있다. 그 중에서 특히나 인간의 원초적인 욕구인 수명연장에 대한 관심이 크다. 특히, 정보화 시대를 맞아 네트워크 혁신적인 발전을 이뤄 언제 어디서나 다양한 분야의 정보를 손쉽게 얻을 수 있게 되면서부터 자가진단의 범위가 넓어지고 있다. 여기에 융합기술의 발달로 학문간의 벽이 무너지면서 다양한 시도가 이어지고 있고 저비용의 언제 어디서든 손쉽게 구할 수 있고 사용할 수 있는 다양한 자가진단기의 대한 연구가 활발하다. 그 중에서 바이오센서는 저렴한 비용과 짧은 검사시간, 검사장비의 소형화로 인한 휴대성 그리고 소량의 샘플로도 검사가 가능하다는 장점이 있어 각광을 받고 있다.

인간의 다양한 질병 중 생명과 직결된 사망원인 1위인 암은 아직까지 정확한 발병원인을 찾지 못했고, 그 치료방법도 완전하게 알려진 것은 아니다. 이에, 암 진단을 위해서는 상당한 시간과 복잡한 과정을 거쳐야 하는 기존의 방법 대신에 신속하고 간단한 조기진단 방법이 다양하게 연구되고 있는 중이다. 그러한 연구 중에 최근에는 바이오마커(biomarker)를 이용한 암 진단 바이오센서에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

종래의 바이오마커에 의한 암의 진단은 단백질을 이용한 연구가 대부분이다. 이러한 단백질 바이오마커의 대부분은 특정 질병이 발병했을 때 새롭게 생기거나 그 수치가 급격하게 증가하는 단백질들을 사용하고 있다. 그러나 이러한 단백질의 경우 기준점에 대한 문제가 발생할 수 있다.

이에 대하여, 최근에는 암이 발병하거나 전이될 때 중요한 역할을 하는 단백질 분해효소를 이용하면 정밀한 검출이 가능하다는 점을 이용하여 단백질분해효소 분석을 수행하는 바이오센서에 관한 연구가 보고되고 있다. 이는 단백질 화학에 있어서, 단백질의 아미노산 배열 결정에 중요한 역할을 하는 특징을 이용한다는 데에 또 다른 의의가 있다. 단백질분해효소는 다양한 기관에 존재하여 생체내 중요한 대사 조절 및 생리적 반응에 관여를 하고 있다. 이처럼 단백질분해효소는 생체리듬에 따라 양의 변화가 생기기도 하면서 활성도의 변화도 생기기 때문에 질병을 진단하는 바이오마커로서의 장점을 가진다.

그러나, 이러한 단백질분해효소(protease)를 검출하여 암을 진단하는 기술들은 실험 과정이 복잡하고, 고가의 장비와 비용이 요구되며, 소요되는 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.

KR 10-2010-0008260 (공개번호)

이에 따라 본 발명은 단백질분해효소를 이용하여 짧은 시간 안에 암을 진단할 수 있는 바이오센서를 개발하고자 한다.

본 발명은 기준전극 및 상기 기준전극과 소정간격 이격되어 형성되며, 표적단백질분해효소와 결합하는 표적단백질분해효소의 기질이 고정화될 수 있는 작업전극을 포함하는 전극부; 상기 전극부가 형성된 하부기판; 상기 전극부는 적어도 두 개를 포함하며, 상기 전극부의 상부에 형성된 미세채널; 상기 하부기판과 대향하며, 상기 미세채널 상에 혼합부가 형성된 상부기판; 을 포함하며, 상기 표적단백질분해효소의 결합 전 및 후의 상기 작업전극과 상기 기준전극의 임피던스 차이를 측정하는 바이오 센서를 제공한다.

본 발명은 전극부상에 미세채널을 포함하는 바이오 센서를 이용한 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법에 있어서, (a) 제1시료 출입구에 표적단백질분해효소의 기질이 포함된 시료를 주입하여, 상기 제1시료 출입구의 전극부에 상기 표적단백질분해효소의 기질을 고정하는 단계; (b) 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 전해질을 주입하여 임피던스를 측정한 후에 상기 제1시료 출입구를 통해 전해질을 제거하는 단계; (c) 상기 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 표적단백질분해효소를 포함하는 시료를 주입하는 단계; (d) 상기 미세채널에서 주입된 시료를 전극부에 고정된 표적단백질분해효소의 기질과 접촉하여 반응시키는 단계; 및 (e) 상기 반응에 의한 작업 전극 및 기준 전극의 전기화학적 신호를 측정하여 임피던스를 측정하는 단계; 를 포함하는 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오 센서는 전극부의 상부에 미세채널을 포함함으로써, 반응물질과의 반응면적을 증가시킴으로써 짧은 시간안에 암을 진단할 수 있다.

또한, 단백질분해효소를 이용하며, 임피던스 검출 방법을 통한 차별화된 검출 방법을 이용하여, 정확한 진단을 통해 환자의 결과를 개선할 수 있고, 누구나 접근하기 쉽고 편리하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오 센서를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 MMP-2와 7의 효소의 농도를 임피던스 변화를 통해 정량적으로 구하여 난소암과 대장암을 진단하고자 하는 본 발명의 바이오 칩에서 일어나는 반응 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합부를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 이용하여 나이퀴스트 선도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 혼합된 효소의 농도(enzyme concentration)에 따른 각 미세채널 별로 관련된 임피던스 값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 베어(bare) 상태와 고정(immobilization) 상태의 각챔버별로 재현가능성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 기준전극 및 상기 기준전극과 소정간격 이격되어 형성되며, 표적단백질분해효소와 결합하는 표적단백질분해효소의 기질이 고정화될 수 있는 작업전극을 포함하는 적어도 두개를 포함하는 전극부, 상기 전극부가 형성된 하부기판, 상기 전극부의 상부에 형성된 미세채널, 상기 하부기판과 대향하며, 상기 미세채널 상에 혼합부가 형성된 상부기판; 를 포함하며, 상기 표적단백질분해효소의 결합 전 및 후의 상기 작업전극과 상기 기준전극의 임피던스 차이를 측정하는 바이오 센서에 관한 것이다.

이때, 상기 기준전극은 Pt를 포함하여 형성되며, 상기 작업전극은 Au를 포함하여 형성된다.

또한, 상기 혼합부는 유체 동압을 발생시키기 위한 헤링본 형상의 제1, 2 동압 그루브가 상기 미세채널을 따라 형성되며, 상기 혼합부는 중심축을 기준으로 상기 제1동압 그루브의 폭이 제2동압 그루브의 폭이 상이한 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 혼합부는 소정 간격마다 동압 발생홈이 형성될 수 있다.

이에 더하여, 상기 적어도 두개의 전극부 상에 형성된 미세채널은 일단에 제1, 2시료 출입구를 포함하며, 타단은 서로 연통될 수 있다.

특정 양태로서, 상기 표적단백질분해효소는 기질 금속 담백질분해효소(matrix metalloproteinases; MMP)일 수 있으며, 상기 기질단백질분해효소는 MMP-2 및/또는 MMP-7 일 수 있다.

또한, 상기 하부기판은 유리 기판(glass substrate) 으로 이루어질 수 있으며, 상기 상부기판은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 으로 이루어질 수 있다.

이에 더하여, 본 발명은 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법에 관한 것으로, 전극부상에 미세채널을 포함하는 바이오 센서를 이용한 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법에 있어서, (a) 제1시료 출입구에 표적단백질분해효소의 기질이 포함된 시료를 주입하여, 상기 1시료 출입구의 전극부에 상기 표적단백질분해효소의 기질을 고정하는 단계, (b) 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 전해질을 주입하여 임피던스를 측정한 후에 상기 제1시료 출입구를 통해 전해질을 제거하는 단계, (c) 상기 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 표적단백질분해효소를 포함하는 시료를 주입하는 단계, (d) 상기 미세채널에서 주입된 시료를 전극부에 고정된 표적단백질분해효소의 기질과 접촉하여 반응시키는 단계 및 (e) 상기 반응에 의한 작업 전극 및 기준 전극의 전기화학적 신호를 측정하여 임피던스를 측정하는 단계; 를 포함한다.

특히, 상기 표적단백질분해효소의 기질을 고정하는 단계는 상기 제1시료 출입구를 통해 전해질을 미세채널로 주입하여 임피던스를 측정하는 단계 및 상기 전해질을 제거하고 상기 제1시료 출입구에 표적단백질분해효소의 기질이 포함된 시료를 주입하는 단계를 포함한다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 나타낸 모식도, 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오 센서를 나타낸 모식도, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 MMP-2와 7의 효소의 농도를 임피던스 변화를 통해 정량적으로 구하여 난소암과 대장암을 진단하고자 하는 본 발명의 바이오 칩에서 일어나는 반응 메커니즘을 나타낸 도면, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합부를 나타낸 도면, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 이용하여 나이퀴스트 선도를 측정하여 나타낸 그래프, 도 6은 혼합된 효소의 농도(enzyme concentration)에 따른 각 미세채널 별로 관련된 임피던스 값을 나타낸 그래프, 도 7은 베어(bare) 상태와 고정(immobilization) 상태의 각 챔버별로 재현가능성을 나타낸 그래프이다. 이하, 도 1 내지 도 7과 실시예를 통해서 본 발명의 바이오 센서와 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법을 상세히 설명한다.

도 1과 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서는 기준전극 및 상기 기준전극과 소정간격 이격되어 형성되며, 표적단백질분해효소와 결합하는 표적단백질분해효소의 기질이 고정화될 수 있는 작업전극을 포함하는 전극부, 상기 전극부가 형성된 하부기판, 상기 전극부는 적어도 두 개를 포함하며, 상기 전극부의 상부에 형성된 미세채널, 상기 하부기판과 대향하며, 상기 미세채널 상에 혼합부가 형성된 상부기판을 포함하여 형성되며, 상기 표적단백질분해효소의 결합 전 및 후의 상기 작업전극과 상기 기준전극의 임피던스 차이를 측정하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 기준전극이라 함은 전기화학에 작용전극의 전극 전위를 측정하는 경우에 또 하나의 별도 전극을 전극 전위의 기준으로 준비하여 하나의 전지를 구성하고, 그 개회로 전압을 전극 전위의 상대값으로 정하는 방법이 취해지는데 이 때의 기준이 되는 전극을 의미하며, 백금(Pt) 으로 도포되어 있는 것이 바람직 하나, 어떠한 금속에 한정되지 않는다.

또한, 작업전극이라 함은 전극 반응을 일으킬 때 시료 중에 전류를 흐르게 할 목적으로 사용하는 2개의 전극 중 목적하는 반응을 일으키기 위해 사용되는 전극을 의미하며, 금(Au) 으로 도포되어 있는 것이 바람직 하나, 어떠한 금속에 한정되지 않는다.

특히, 본 발명에 따른 바이오 센서는 전극부의 상부에 미세채널을 포함함으로써, 반응물질과의 반응면적을 증가시킴으로써 짧은 시간안에 암을 진단할 수 있다.

이 때, 상기 표적단백질분해효소는 기질 금속 담백질분해효소(matrix metalloproteinases; MMP)인 것이 바람직하고, 특히 난소암과 대장암의 효과적인 바이오마커로 알려져 있는 MMP-2 및/또는 MMP-7 인 것이 더욱 바람직하나 상기 단백질분해효소에 한정되지 않는다. 이에 더하여, 표적단백질분해효소의 기질이라 함은 본 발명에서는 표적단백질분해효소의 펩타이드를 의미하며, MMP-2 peptide 및/또는 MMP-7 peptide 일 수 있다.

여기서, MMPs 는 단백질 분해효소(protease)의 한 종류로 이는 아미노산으로 이루어진 단백질의 결합을 제거 및 분해하여 새로운 생리적 활성을 부여 및 제거하는 효소의 일종을 의미한다. 보다 구체적으로, Matrix metalloproteinase (MMP) 에는 안쪽에 아연이나 망간과 같은 금속 성분이 들어 있기 때문에 metallo- 라는 접두어가 붙어 단어처럼 사용되며 proteinase 라는 단어는 단백질을 분해하는 효소의 의미로 합성된 단어가 MMP 이다. 즉, MMP 는 기질을 구성하는 단백질을 녹이는 효소 중에 화학 구조상 금속 성분을 포함하고 있는 효소를 의미하는 것이다.

일 실시예에 따라 MMP-2와 7의 효소의 농도를 임피던스 변화를 통해 정량적으로 구하여 난소암과 대장암을 진단하고자 하는 본 발명의 바이오 칩에서 일어나는 반응 메커니즘은 도 3에 나타난 바와 같다.

보다 구체적으로 도 3을 참조하여 설명하면, MMP-2와 7의 효소에 특이적으로 반응하여 일부분이 분해되는 MMP-2, 7 펩타이드를 채널에 흘려 전극(Au electrode)와 황-금(sulfur-gold) 반응을 하여 고정화 시킨다. 이렇게 펩타이드가 고정되어 있는 전극에 MMP 효소를 흘려 반응을 시킨다. MMP 효소는 특이적으로 반응하게끔 합성되어 있는 MMP 펩타이드를 인식하고 일부분을 분해시켜 펩타이드를 절단한다. 그리고 나면 전극위에는 절단되어 짧아진 펩타이드가 남게된다.

이에 더하여, 본 발명의 바이오 센서는 혼합부를 추가함으로써, 짧은 시간안에 표적단백질분해효소를 검출할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 혼합부는 유체 동압을 방생시키기 위한 이중 헤링본 형상의 제1, 2 동압 그루브가 상기 미세채널을 따라 형성될 수 있다.

여기서, 유체동압이라 함은 관이나 덕트내의 유체는 정압외에 흐름의 방향에 직각인 면에 작용하며, 유속에 의해기는 압력을 갖으며, 이때의 압력을 유체동압이라 한다.

또한, 헤링본 형상이라 함은 물고기의 뼈 모양 혹은 화살의 오늬 같은 모양을 여러 개 짜 맞춘 무늬를 의미하며, 본 발명에서는 'V' 자 형상의 헤링본 무늬가 복수개 나열될 수 있으며, 이중 헤링본 형상으로, 'W' 형상이 복수개 나열된 것을 의미할 수 있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합부를 나타낸 도면으로, 도 3을 참조하여 설명하면, 본 발명의 혼합부는 'W' 가 복수개로 미세채널을 따라 나열된다.

이에 더하여, 상기 혼합부는 중심축을 기준으로 상기 제1동압 그루브의 폭이 제2동압 그루브를 포함하고, 상기 제1동압 그루브와 제2동압 그루브는 중심축을 기준으로 폭의 길이가 상이한 것을 특징으로 한다.

일 예로, 상기 혼합부의 폭은 1.5mm 로 형성될 수 있으며, 이때, 제1동압 그루브의 폭은 0.6mm 일 수 있고, 제2동압 그루브의 폭은 0.9mm 로 형성될 수 있다. 반대로, 제1동압 그루브의 폭이 0.9 mm 일 수 있고, 제2동압 그루브의 폭이 0.6mm 로 형성될 수 있다. 보다 구체적으로, 제1동압 그루브의 폭이 0.6mm 이고, 제2동압 그루브의 폭이 0.9mm일 때, 제1동압 그루브의 'V'자 형태의 일면과 타면이 0.3mm로 형성될 수 있고, 제2동압 그루브는 'V'자 형태의 일면이 0.3mm, 타면은 0.6mm 로 형성될 수 있다.

특히, 상기 혼합부는 소정 간격마다 동압 발생홈을 형성함으로써, 유체가 미세채널을 통과할 때, 난류가 발생되어 시료가 보다 용이하게 혼합될 수 있다. 이 때의 동압 발생홈은 도 4에 나타난 바와 같이, 제1동압 그루브와 제2동압 그루브의 폭에 변화를 줌으로써 형성될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 모식도를 나타낸 것으로, 상기 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 바이오 센서에서 적어도 두개의 미세채널은 일단에 제1, 2시료 출입구를 포함하며, 타단은 서로 연통되는 것을 특징으로 한다.

이 때의 미세채널은 본 발명의 전극부의 개수와 동일하게 형성될 수 있으며, 2개의 전극부가 형성될 때는 2개의 미세채널이 형성될 수 있다.

또한, 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오 센서의 모식도를 나타낸 것으로, 3개의 전극부가 형성될 때는 3개의 미세채널이 형성될 수 있으며, 이는 어느 하나에 한정하지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 3개의 미세채널을 포함할 수 있다. 특히, 미세채널의 개수가 많아지면, 동시에 복수개의 표적단백질분해효소를 검출할 수 있다.

본 발명에서 하부기판은 유리(glass), 석영(quartz) 또는 실리콘(Si) 과 같은 재질로 형성될 수 있으며, 일 예로 유리 기판(glass substrate)으로 이루어질 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

다음으로, 상기 하부기판과 대향되는 상부기판은 절연성 재료로 제작될 수 있으며, 이러한 절연성 재료로는 전기화확적 바이오 센서를 동시에 대량으로 제조하기 위한 몰딩 등의 제조방법에 적합한 유연성과 지지체로서의 장점을 지니는 것이면 어느 것이든 가능하다. 바람직하게, 상부기판은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 으로 형성될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바이오 센서를 이용하여, 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법을 제공하는 것을 특징으로 하며, 보다 구체적으로, (a) 제1시료 출입구에 표적단백질분해효소의 기질이 포함된 시료를 주입하여, 상기 제1시료 출입구의 전극부에 상기 표적단백질분해효소의 기질을 고정하는 단계; (b) 상기 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 전해질을 주입하여 임피던스를 측정한 후에 상기 제1시료 출입구를 통해 전해질을 제거하는 단계; (c) 상기 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 표적단백질분해효소를 포함하는 시료를 주입하는 단계; (d) 상기 미세채널에서 주입된 시료를 전극부에 고정된 표적단백질분해효소의 기질과 접촉하여 반응시키는 단계; 및 (e) 상기 반응에 의한 작업 전극 및 기준 전극의 전기화학적 신호를 측정하여 임피던스를 측정하는 단계; 를 포함한다. 구체적인 임피던스의 측정 방법은 공지된 방법을 이용하였다.(Electrochemistry Communications 10 (2008) 1533-1536; Sensors and Actuations B114 (2006) 433-437; Sensors and Actuators B129 (2008) 372-379; 및 Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 2525-2531).

이에 더하여, 상기 표적단백질분해효소의 기질을 고정하는 단계는 상기 제1시료 출입구를 통해 전해질을 미세채널로 주입하여 임피던스를 측정하는 단계 및 상기 전해질을 제거하고 상기 제1시료 출입구에 표적단백질분해효소의 기질이 포함된 시료를 주입하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서는 임피던스 측정 방법의 기본 원리를 이용하고, 분석에 있어 기준전극과의 반응성 비교 분석 방법을 이용할 수 있다. 구체적으로, 전기화학적 측정방법을 이용하여 효소의 활성화 정도를 검출한 후, 이를 분석 가능한 신호로 변환하여 임피던스를 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 검출 방법을 이용하면, 표적 단백질분해효소를 MMP-2 및 MMP-7으로 적용하여 측정함으로써, 난소암 및 대장암을 진단할 수 있다. 한편, 두가지 이상의 전기화학적 측정방법을 이용하여 신호를 측정하고 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 검출 방법은 고정된 표적 물질의 농도를 일정하게 유지하고 반응 물질의 효소를 이용한 암 조기 진단 바이오 마커의 농도에 따른 활성도를 측정하여 임피던스 값 최고치를 비교하여 암을 조기 진단하는데 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

실시예 1. 실험 재료

1-1. 시약 및 장비

본 발명의 실시예에서 사용된 주요 재료 및 시약과 장비의 구입처 및 특징을 하기 표 1에 나타내었다.

재료 및 시약명	제조회사	용도 및 세부 특징
MMP-2 peptide	Peptron	Cysteamide-IPVSLRSG (Ile-Pro-Val-Ser-Leu-Arg-Ser-Gly)
MMP-2 enzyme	Calbiochem	△A405≥/hour/μg/protein≥7
MMP-7 peptied	Peptron	Cysteamide-KSRWLALPR (Lys-Ser-Arg-Trp-Leu-Ala-Leu-Pro-Arg)
MMP-7 enzyme	Calbiochem	>3000 units/mg protein
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	10mM HEPES (5mM CaCl₂, 150mM NaCl, pH 7.4) for enzyme dilution 25mM HEPES buffer (pH 7.4) for peptide dilution and washing
Electrolyte	Amersco Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich	160mM Potassium chloride 80mM Potassium ferrocyanide(Ⅲ) 80mM Potassium hexacyanoferrate(Ⅱ)
Sylgard 184	Dow corning	PDMS layer
Curing agent	Dow corning	Sylgard 184 curing
Si wafer	D.S, semicon	SU-8 mold
Glass wafer	Marienfeld	Biosensor substrate
SU-8	Micro chem	Negative photoresist
SU-8 developer	Micro chem	Developer
HMDS		Wafer coating
AZ5214	켐파크	Positive photoresist
AZ300		Developer
Piranha solution	동우화인켐	Biochip의 electrode 및 channel의 Chemical washing 70% H₂SO₄ : 30% H₂O₂ = 3:1
	Sigma Aldrich	Cleaning
Ethanol	Sigma Aldrich	Cleaning
I-VIUM	I-VIUM technologies	전기화학측정장비
Cute	Femto science	Plasma bonding
Oven	성찬과학	PDMS baking
Socket	HRS Korea	Biosensor와 전기화학측정장비 연결
Micro pipet	HTL	Sample과 시약을 micro channel에 주입할 때 사용

1-2. MMPs 반응 확인용 펩타이드 서열

본 발명의 실시예에서 MMP-2와 7 효소에 특이적으로 반응하는 펩타이드를 작업전극(Au electrode)에 고정시키고 펩타이드와 효소간의 반응을 통해 임피던스 변화를 측정하기 위한 MMP-2와 7에 특이적으로 반응하는 펩타이드의 서열은 다음과 같으며 Peptron(Daejeon, Korea)이라는 회사를 통해 합성 하였다.

펩타이드	서열
MMP-2	HS(Cysteamide)-Ile(I)-Pro(P)-Val(V)-Ser(S)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)-Gly(G)
MMP-7	HS(Cysteamide)-Lys (K)-Ser (S)-Arg (R)-Trp (W)-Leu (L)-Ala(A)-Leu (L)-Pro(P)-Arg (R)
※ HS 는 펩타이드가 전극(Au electrode)에 황-금(sulfur-gold) 반응으로 인해 고정화될 때 전극(Au-electrode)과 반응하는 황(sulfur) 부분으로 합성된 펩타이드에 cysteamine(시스테아민, HS-CH2CH2NH2)이라는 시약을 처리하여 생기는 것임.

1-3. MMP -2, 7, 9, 13 효소( enzyme )

MMP 효소(Enzyme)는 Calbiochem (Darmstadt, Germany)이라는 회사의 MMP-2, 7, 9, 13을 준비하였다. MMP-2와 7 enzym은 난소암과 대장암 검출을 위한 것이고 MMP-9와 13은 본 발명의 바이오센서의 선택성(selectivity) 실험에 쓰이는 효소(enzyme)이다. 선택성(Sensitivity) 실험에서 효소의 농도 (enzyme concentration)는 정상인일 때와 환자일 때의 농도(concentration) 범위를 모두 수용할 수 있도록 MMP-2 효소의 경우 0.5pg/mL, 50pg/mL, 5ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL, 200ng/mL, 400ng/mL로, MMP-7의 경우 0.5pg/mL, 5pg/mL, 50pg/mL, 0.5ng/mL, 5ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL로 준비하였다. MMP-2와 7을 혼합하였을 때 위의 농도가 되도록 하고 순서대로 조합하여 7개의 효소(enzyme)를 만들었다. 선택성(Selectivity) 실험에서는 정상인 일 때의 MMP-9과 13 농도(concentration)인 70ng/mL 가 되도록 MMP-9과 13 두개의 효소만 혼합한 것과 MMP-2, 7을 위의 농도가 되도록 하면서 MMP-9과 13이 70ng/mL로 포함되도록 혼합한 것 2가지를 만들어서 실험에 사용하였다. 아래 표 3은 정상인 일 때와 환자 일 때의 MMP-2, 7, 9, 13 효소 농도의 범위를 정리한 것이고 표 4는 혼합된 효소별로 포함하고 있는 효소 농도(enzyme concentration)를 나타낸 것이다.

효소(Enzyme)	농도(Concentration, ng/mL)
효소(Enzyme)	정상인	환자
MMP-2	279.12±73 0~2.62(median 0.21) 83.0	227.51±9.91 0~2.97(median 0.35) 1169.0(SD 83.0)
MMP-7	4.2±2.2 3.29±1.64 7.21~13.98(median 10.60)	13.5±17.1 10.24±1.35 7.56~21.65(median 14.60)
MMP-9	72.99±2.57	472.95±69.48
MMP-13	73.2±11.5	54.0±18.7

Use and number		MMP enzyme concentration(ng/mL)
Use and number		MMP-2	MMP-7	MMP-9	MMP-13
감도(sensitivity)	1	5e^-4	5e^-4	-	-
	2	5e^-2	5e^-3	-	-
	3	5	5e^-2	-	-
	4	50	5e^-1	-	-
	5	100	5	-	-
	6	200	50	-	-
	7	400	100	-	-
선택성 (Selectivity)	1	-	-	70	70
선택성 (Selectivity)	2	200	5	70	70

실시예 2. 표적 단백질분해효소 검출용 바이오센서 제조방법

2-1. 기판 제조공정

2-1-1. 기판 세척공정( Substrate cleaning process )

본 발명에서 하부기판인 전극 기판(Electrode substrate)으로 사용될 글라스 웨이퍼(glass wafer) 표면에 있는 불순물을 제거하기 위해 상기 글라스 웨이퍼를 피라나 용액(piranha solution, HSSO₄ : H₂O₂ = 4 : 1)에 약 10분 동안 세정하였다. 불순물이 웨이퍼 위에 남게 되면 포토 레지스트(PR, Photo Resist)와 웨이퍼간의 접착력이 떨어지고 도포된 막이 불균일하게 되어 원하는 전극(electrode)이 잘 형성 안 될 수도 있다. 따라서, 기판의 세정이 끝난 후 디아이 워터(D.I, Deionized water)로 씻어 내고 N₂ gas로 물기를 제거하였다. 이후 웨이퍼에 남아 있을 물기를 제거하기 위해 건조기로 200℃에서 3분간 건조 시켰다.

2-1-2. 글라스 웨이퍼( Glass wafer )에 포토레지스트를 코팅( AZ5214 coating and soft bake )

본 실시예에서는 글라스 웨이퍼에 포토레지스트를 코팅시켰다. 보다 구체적으로, 글라스 웨이퍼에 포토레지스트를 코팅하기 전에 포토레지스트와 웨이퍼간의 접착력을 높여주기 위해 웨이퍼의 표면을 소수성으로 바꿔주는 HMDS(Hexamethyldisilazane)을 먼저 코팅하고 그 위에 Positive PR인 AZ5214를 코팅하였다. 그런 다음 소프트 베이크(soft bake)를 하였다. 이때, 공정조건은 다음 표 5와 같다.

포토레지스트(Photoresist)	AZ5214 (positive PR)
Hexamethyldisilazane (HMDS) coating	Low Speed, 500rpm, acc-300rpm/s, 5sec High Speed, 2500rpm, acc-300rpm/s, 7sec
Coating condition	Low Speed, 500rpm, acc-300rpm/s, 5sec High Speed, 4000rpm, acc-300rpm/s, 35sec
Soft baking	105?, 1min on Hot plate
Target thickness	1.2㎛

2-1-3. 전극부의 제조 ( Exposure and Development )

글라스 웨이퍼에AZ 5214를 코팅한 후에 Au 또는 Pt 전극의 형상을 패터닝(patterning)하기 위해 필름 마스크(film mask)와 MA-6 aligner를 이용하여 포토리소그래피(photolithography) 공정을 실시하였다. 전극부의 제조시 조건은 다음 표 6과 같다.

Exposure condition	Hard contact mode, 10mW Align gap - 30㎛ Exposure time -12sec
Development	AZ300MIF developer : DW = 6 : 1 Development time - 120sec

2-1-4. 증착 및 박리( Deposition and Lift - off )

상기 AZ5214라는 PR을 패터닝한 후 한국나노기술원(경기도 수원시)에 의뢰하여 금속(Au or Pt)을 상기 패터닝된 PR에 증착시켰다. 보다 구체적으로, 글라스 웨이퍼에 AZ 5214라는 PR 을 코팅하고, 만들고자 하는 전극부 모양을 형성하였다. 그리고, 그 위에 Ti/Au thin 필름을 열증착을 이용하여 증착시킨 다음, 아세톤을 이용하여 PR 을 제거해주었다. 그 후 PR 위에 있던 Ti/Au는 제거되고, PR 이 없던 곳, 즉 만들고자 하는 전극부 모양으로만 Ti/Au 가 남게되었다. 이와 같은 방법으로 Ti/Pt 전극부를 만들었다.

2-3. 채널 형성

Pt와 Au 전극이 형성된 글라스 웨이퍼 위에 SU-8을 코팅하고 얼라이너(aligner) 를 이용해 마이크로 채널을 형성하였다. 이때의 공정조건은 다음 표 7과 같다.

Photoresist	SU-8 3035 (negative PR)
Coating condition	Low Speed, 500rpm, acc-300rpm/s, 15sec High Speed, 1100rpm, acc-300rpm/s, 30sec
Soft baking	95℃, 45min on Hot plate
Target thickness	100㎛
Exposure condition	Hard contact mode, 10mW Align gap - 30㎛ Exposure time - 26sec 210mj/cm² UV radiation below 350nm
Post expose bake	95℃, 5min on Hot plate
Development	15min in SU-8 developer

2-4. 상부기판의 제조

상부 기판을 제작하기 위하여 PDMS(Sygard 184 silicone elastomer, DOW Corning, USA)와 경화제(curing agent, DOW Corning, USA)를 10:1 비율로 혼합하고, 진공 챔버에 넣어 기포를 제거하였다. 그 다음 SU-8 mold 를 형틀에 넣고 기포가 제거된 PDMS 를 부었다. 그 후 오븐에서 65℃의 온도로 4시간 동안 가열하여 경화시킨 뒤 형틀에서 꺼내어 몰드와 분리하였고, 크기에 맞게 절단하고 환펀치를 이용하여 시료 출입부 부분을 뚫어 PDMS 기판을 완성하였다.

2-5. 전극부와 폴리디메틸실론산 ( PDMS , polydimethylsiloxane ) 의 부착

하부기판과 상부기판의 접착공정은 O₂ 플라즈마 처리하여 접착하였다. 보다 구체적으로, 붙이고자하는 PDMS 를 O₂ 로 플라즈마 처리한 뒤에 하부기판위에 형성되어 있는 SU-8 마이크로 채널에 접착하였다. 그 후에 오븐에 넣어 1시간 동안 가열하여 바이오 센서를 제조하였다. 이때, 접착공정은 다음 표 8과 같다.

Pressure	100mtorr
O₂ flow	50sccm
Power	100w
Vacuum time	2min
O₂ plasma time	180sec
Bake	100℃, 60

< 실험예 >

실험예 1. 바이오 센서를 이용한 MMP 측정

본 발명의 바이오 센서를 이용하여 MMP 를 측정하는 실험예에서는 3개의 출입부를 포함하는 바이오 센서를 이용하여 MMP 를 측정하였다. 이때, 미세채널은 3개를 포함하며, 상기 3개의 출입부는 편의상 제1시료 출입부, 제2시료 출입부, 제3시료 출입부라 지칭하고, 상기 4개의 미세채널은 제1미세채널, 제2미세채널, 제3미세채널이라 지칭한다.

먼저, 전기화학장비(I-vium, IVIUM technologies, Eindhoven, Netherlands)를 컴퓨터에 연결하고 소켓(PCC1-10SG-4E, HIROSE KOREA, Gyeonggi-do, Korea)과 연결된 바이오 센서를 전기화학장비에 있는 측정 전선부에 연결해서 장비를 모두 연결하였다. 그 다음 컴퓨터와 전기화학측정장비의 전원을 켠 뒤, 컴퓨터 상의 측정제어 프로그램을 실행시켰다.

먼저, 아무런 물질도 없는 바이오 센서의 제2시료 출입부로 전해질용액(electrolyte)을 주입하여 제1, 2, 3미세채널에 모두 채운 뒤 베어(bare) 상태의 임피던스를 측정하였다. 그 후 마이크로 파이펫으로 채널 상에 있는 전해질용액을 제2시료 출입부를 통해 흡입(suction)하여 제거하고, 제1시료 출입부과 제3시료 출입부로 각각 MMP-2, 7 펩타이드 를 주입하여 제1미세채널과 제3미세채널의 전극부(제1전극부, 제3전극부)에 MMP-2, 7 펩타이드를 고정화하였다. 이때, 제1시료 출입부와 제3시료 출입부로 주입한 펩타이드가 음성대조군(negative control)인 제2시료 출입부로 넘어가지 않도록 주의하여야 한다.

고정화 후에 워싱 버퍼를 제2시료 출입부로 모든 챔버에 주입하여 세정하고 다시 제2시료 출입부로 전해질용액을 주입하여 '고정' 상태의 임피던스를 측정한다. 고정신호를 측정 후에 펩타이드가 제2미세채널에 고정화 되는 것을 방지하기 위하여, 제1시료 출입부와 제3시료 출입부로 흡입하여 전해질을 제거하였다. 전해질의 제거 후에 제2시료 출입부로 MMP-2와 7 enzyme 이 혼합된 샘플을 모든 챔버에 주입하였다. 30분의 반응 시간 중 15분이 지났을 때, 효소의 반응효율을 높이기 위해 마이크로 파이펫을 이용하여 교반을 하였다. 제2시료 출입부에 마이크로 파이펫을 꼽고 5번의 교반을 해주었다. 이때 너무 많은 교반(agitation)은 전극에 고정되어 있는 펩타이드를 강제로 탈착시킬 수 있으므로 5번 이상의 교반은 하지 않도록 전해질을 주입하고 '반응' 상태의 임피던스를 측정하였다. 다음 표 9는 실험순서를 나타낸 것이고, 표 10은 총 실험시간과 실험에 필요한 펩타이드와 효소의 양을 나타낸 것이다.

Step	Inlet/Outlet(gate)	Sample	Volume(㎕)	Time(min)
1. Electrolyte injection	2/1,3	Electrolyte	200	0.1
2. 'bare' measurement	-	-	-	7
3. Electrolyte remove	2	-	-	0.1
4. Peptide injection	1,3	MMP-2/7 peptide	5/5	15
5. Washing buffer injection	2	HEPES	100	1
6. Electrolyte injection	2/1,3	Electrolyte	200	0.1
7. 'Immobilzation' 'measurement	-	-	-	7
8. Electrolyte remove	1,3	-	-	0.1
9. Enzyme injection	2	MMP enzyme	20	30
10. Agitation	-	Only 5times when reaction 15min
11. Electrolyte injection	2/1,3	Electrolyte	200	0.1
12. 'Reaction' 'measurement	-	-	-	7

Total experimental time	Total peptide volume	Total enzyme volume
67min 30s	10㎕(each 5㎕)	20㎕

실험예 2. 바이오 센서의 민감성( sensitivity )

MMP 효소의 농도(MMP enzyme concentration)에 따른 임피던스(impedance) 값의 차이를 확인하기 위해 샘플 준비과정에서 언급한 6개의 농도(concentration)로 MMP-2, 7 enzyme을 혼합한 혼합 효소(enzyme)를 이용해 각 농도별 미세채널의 임피던스(impedance)를 측정하였다. 아래의 도 5는 1pg/ml의 MMP-7 enzyme을 주입하여 반응시켰을 때 측정된 데이터를 나이퀴스트 선도(nyquist plot)로 나타낸 것이다. 베어(Bare) 상태 일 때 나이퀴스트 선도(nyquist plot)의 x-축 인터셉트 임피던스(x-intercept impedance)가 가장 작은 절대값을 갖고, 고정(Immobilization)된 상태 일 때 가장 크며 반응(Reaction) 상태 일 때는 고정(Immobilization)된 상태일 때의 값에서 감소하여 베어(Bare)와 고정 상태(Immobilization)의 중간에 위치하는 값을 나타냈다. 펩타이드(Peptide)가 작업전극(Au electrode)에 고정(immobilization)되어 작업전극(Au electrode)의 반응면적(reaction area)을 감소시켜 임피던스(impedance)가 증가하였고, 펩타이드 (peptide)와 효소(enzyme)의 반응(reaction)에 의해 고정(immobilization)되어 있는 펩타이드(peptide)가 분해, 절단되어 작업전극(Au electrode)의 표면을 덮고 있던 펩타이드(peptide)의 면적이 줄어들어 임피던스(impedance)가 감소한 것으로 보인다.

도 6은 혼합된 효소의 농도(enzyme concentration)에 따른 각 미세채널 별로 관련된 임피던스(Related impedance) 값을 나타낸 것이다. 이때, Related impedance는 (Immobilization impedance-Reaction impedance)/(Immobilization impedance)*100으로 작업전극(Au electrode)에 고정(immobilization)된 MMP 펩타이드(MMP peptide)가 MMP 효소(MMP enzyme)에 반응하기 전과 후의 나이퀴스트 선도(nyquist plot)의 x-축 인셉트 임피던스(x-intercept impedance) 변화량을 나타낸 것이다. x축을 log scale로 나타냈으며, origin으로 nonlinear curve fitting하여 R-squared(결정계수)와 회귀식(regression equation)을 구하였다. 제1미세채널 (MMP-2)과 제3미세채널(MMP-7)의 관련된 임피던스(Related impedance)는 효소의 농도(enzyme concentration)가 증가할수록 증가하는 경향을 보였고 음성 대조군(negative control)인 제2미세채널은 일정한 값을 나타냈다. 여기서 효소(enzyme)의 농도(concentration)가 증가할수록 관련된 임피던스(related impedance)가 증가하는 이유는 효소의 농도(enzyme concentration)가 증가할수록 펩타이드와 더 활발하게 반응이 발생하여 고정되어 있는 펩타이드가 분해, 절단되어 작업전극(Au electrode)의 표면을 덮고 있던 펩타이드의 면적이 줄어들어 임피던스가 감소하기 때문인 것으로 보인다. 이때, MMP-2 효소의 측정 가능 최소 농도는 10pg/mL이고 MMP-7 enzyme은 1pg/mL이다.

실험예 2. 바이오 센서의 재현가능성

같은 실험조건 하에 동일한 임피던스가 측정되는지 확인하기 위해 여러 개의 웨이퍼에서 무작위로 바이오 센서를 선택하고 실험을 진행하여 재현가능성을 확인하였다. 총 20개의 바이오 센서에서 실험을 진행하였고, 베어(Bare) 상태와와 고정된(immobilization) 상태의 임피던스(impedance)를 측정하였다. 그 결과는 도 6과 같고 베어 (bare, 제1, 2, 3 미세채널) 상태 일 때의 CV(Coefficient of Variation, 변동계수)는 0.16 이고, 고정(immobilization, 제1, 2, 3 미세채널) 일 때는 0.19로 재현가능성이 높다고 볼 수 있다.

즉, 바이오 센서의 재현가능성 실험을 통해 베어(bare) 상태와 고정(immobilization) 상태의 임피던스 값이 거의 일정하게 나와 바이오 센서에 대한 신뢰도를 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 검량선(calibration curve)을 구했고, 이를 이용한다면, 해당 농도 범위 안에서 이용자의 효소 농도를 구하여 난소암과 대장암의 발병여부를 동시에 진단할 근거를 얻을 수 있을 것으로 판단할 수 있다.

10: 바이오 센서
100: 하부기판 110: 전극부
111: 기준전극 112: 작업전극
200: 미세채널
300: 혼합부 310: 제1동압그루브
320: 제2동압그루브 330: 동압발생홈
400: 시료출입구 410: 제1시료출입구
420: 제2시료출입구

Claims

기준전극 및 상기 기준전극과 소정간격 이격되어 형성되며, 표적단백질분해효소와 결합하는 표적단백질분해효소의 기질이 고정화될 수 있는 작업전극을 포함하는 전극부;
상기 전극부가 형성된 하부기판;
상기 전극부는 적어도 두 개를 포함하며, 상기 전극부의 상부에 형성된 미세채널;
상기 하부기판과 대향하며, 상기 미세채널 상에 혼합부가 형성된 상부기판; 을 포함하며,
상기 표적단백질분해효소의 결합 전 및 후의 상기 작업전극과 상기 기준전극의 임피던스 차이를 측정하는 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 기준전극은 Pt를 포함하여 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 작업전극은 Au를 포함하여 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 혼합부는 유체 동압을 발생시키기 위한 헤링본 형상의 제1, 2 동압 그루브가 상기 미세채널을 따라 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제4항에 있어서,
상기 혼합부는 중심축을 기준으로 상기 제1동압 그루브의 폭이 제2동압 그루브의 폭이 상이한 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제4항에 있어서,
상기 혼합부는 소정 간격마다 동압 발생홈이 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 적어도 두개의 전극부 상에 형성된 미세채널은 일단에 제1, 2시료 출입구를 포함하며, 타단은 서로 연통되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 표적단백질분해효소는 기질 금속 담백질분해효소(matrix metalloproteinases; MMP)인 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제8항에 있어서,
상기 기질단백질분해효소는 MMP-2 및/또는 MMP-7 인 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 하부기판은 유리 기판(glass substrate) 으로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 상부기판은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 으로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
전극부상에 미세채널을 포함하는 바이오 센서를 이용한 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법에 있어서,
(a) 제1시료 출입구에 표적단백질분해효소의 기질이 포함된 시료를 주입하여, 상기 제1시료 출입구의 전극부에 상기 표적단백질분해효소의 기질을 고정하는 단계;
(b) 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 전해질을 주입하여 임피던스를 측정한 후에 상기 제1시료 출입구를 통해 전해질을 제거하는 단계;
(c) 상기 제2시료 출입구를 통해 상기 미세채널에 표적단백질분해효소를 포함하는 시료를 주입하는 단계;
(d) 상기 미세채널에서 주입된 시료를 전극부에 고정된 표적단백질분해효소의 기질과 접촉하여 반응시키는 단계; 및
(e) 상기 반응에 의한 작업 전극 및 기준 전극의 전기화학적 신호를 측정하여 임피던스를 측정하는 단계; 를 포함하는 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법.
제12항에 있어서,
상기 표적단백질분해효소의 기질을 고정하는 단계는
상기 제1시료 출입구를 통해 전해질을 미세채널로 주입하여 임피던스를 측정하는 단계; 및
상기 전해질을 제거하고 상기 제1시료 출입구에 표적단백질분해효소의 기질이 포함된 시료를 주입하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료내 표적단백질분해효소의 검출방법.