KR20150114844A

KR20150114844A - 이노신 함유 변형 프라이머를 이용한 바이설파이트 처리에 의해 변환된 dna의 메틸화 검출방법

Info

Publication number: KR20150114844A
Application number: KR1020140039570A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 오태정
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2015-10-13
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: KR101561034B1

Abstract

본 발명은 이노신(inosine) 함유 프라이머를 이용한 메틸화 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이노신 잔기를 함유하는 메틸화 특이적 프라이머를 이용할 경우, 기존의 메틸화 특이적 프라이머를 이용할 경우보다 타겟 서열에 대한 특이도가 높고 민감도에 손실이 없어 극미량의 메틸화 DNA도 효율적으로 검출할 수 있다.

Description

이노신 함유 변형 프라이머를 이용한 바이설파이트 처리에 의해 변환된 DNA의 메틸화 검출방법{Method for Methylation Detection of Converted DNA by Bisulfite-Treatment Using Inosine-containing Modified Primers}

본 발명은 바이설파이트 처리하여 변환된 DNA의 메틸화를 이노신(inosine) 함유 변형 프라이머를 이용하여 검출하는 방법 및 상기 프라이머를 함유하는 메틸화 검출용 키트에 관한 것이다.

시토신(cytosine)의 메틸화는 정상적인 유전자의 발현에 영향을 미치는 후성유전적 변화로 염기서열의 변화없이 DNA상에서 일어나는 화학적 변화이다. 특정 유전자의 프로모터 또는 5' 비번역 부위 (untranslated region)를 포함하는 전사조절 부위 (transcriptional regulatory region)에 CpG 섬(island)이라고 하는 CG 디뉴클레오티드가 고밀도로 모여있는 염기 군(cluster)이 존재하고, CpG 섬의 시토신(C)은, DNA 합성 이후에 DNA 메틸화효소(DNA methyltransferase)에 의해 5번 탄소 위치에서 메틸화되어 5-메틸시토신으로 변환된다. 이러한 메틸화 현상은 암을 포함한 다양한 질병의 원인으로 알려져 있으며, CpG섬의 메틸화에 의해 해당하는 유전자의 발현이 억제된다고 알려져 있다. 특히, 종양 억제 유전자의 CpG섬이 메틸화되어 발현이 차단됨으로써 암이 발생하는 것으로 알려져 있다. DNA 메틸화 현상은 암 발생의 가장 초기에 일어나는 대표적인 현상이기 때문에 암 조기진단을 위한 최적의 도구로 인식되고 있다. 최근에는, 암 조기진단 및 스크리닝을 위해서 특정 유전자의 메틸화 현상을 바이오마커로 이용한 진단기술의 개발이 활발히 연구되고 있다. 이러한 바이오마커 유전자와 연관된 CpG섬 메틸화를 검출하기 위하여 메틸화 특이적 PCR (이후, MSP라고 함) 또는 자동 DNA 시퀀싱과 같은 방법들이 적극적으로 시도되고 있다.

특정 유전자의 메틸화를 이용하여 암 진단의 정확성을 극대화하고, 각 단계에 따른 암의 발달을 분석하고, 암과 노화에 따른 변화를 구별하기 위하여, 암 진단과 관련된 CpG 섬의 모든 시토신 염기의 메틸화를 정확하게 분석할 수 있는 방법이 필요하다. 정통적인 방법은 CpG 섬을 포함하는 유전자 부위를 메틸화 특이적 PCR(MSP)에 의하여 증폭하는 것과 염기서열 분석 방법(바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법)을 함께 사용한다. 그러나 진단, 초기 진단 또는 임상 실험에서의 다양한 암의 각 단계를 평가하는데 사용할 수 있는, 많은 유전자의 프로모터 메틸화의 다양한 변화를 정확하고, 신속하게 자동화 방식으로 분석할 수 있는 방법은 아직 없다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 가장 효과적인 방법이다. PCR에는 여러 종류가 있지만, 본 발명의 기본이 되는 "메틸화 특이적 PCR(MSP)"은 CpG 섬의 하이퍼-메틸화 검출에 가장 널리 이용되는 방법으로, DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리한 후 PCR을 통해 메틸화된 DNA를 증폭시키는 방법이다 (도 1A).

PCR 전 단계에서 타겟 DNA에 바이설파이트를 처리하지 않을 경우, 그 DNA에 존재하는 5-메틸시토신의 위치는 시퀀싱에 의해서 동정될 수 없는데, 이는 5-메틸시토신이 시토신과 동일한 염기쌍 형성 행동을 갖기 때문이다. 게다가 PCR 증폭의 경우 5-메틸시토신이 보유하던 후성적(epigenetic) 정보는 완전히 소실된다는 문제점이 있다. 반면, 바이설파이트를 DNA에 처리하게 되면 CpG섬의 메틸화된 시토신은 그대로 시토신으로 남아있고, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변하게 된다. 이에 PCR에 필요한 프라이머 쌍은 메틸화된 시토신에만 상보적으로 결합될 수 있도록 디자인되는데, 적어도 두 개의 CpG 디뉴클레오티드와 상보적이어서 많은 메틸화 패턴 중 특정한 메틸화 패턴을 민감하게 검출할 수 있다. 따라서 이러한 프라이머 쌍을 첨가했을 때, 메틸화된 시토신이 주형 DNA에 존재하는 경우에만 증폭이 일어나고, 메틸화된 시토신이 없는 경우에는 증폭이 일어나지 않는다. 이와 반대로, 오직 메틸화되지 않은 DNA만을 증폭하는 프라이머를 사용하는 것도 가능하다. MSP 방식은 형광 물질 프로브 또는 형광염료를 이용하는 실시간 PCR(real-time PCR) 분석에도 적용되어, 정량적인 분석이 가능하면서도 처리율이 높은 메틸화의 검출을 가능하게 하고, 그 후 메틸화된 DNA서열에 대한 시퀀싱도 가능하다.

그러나, MSP에 쓰이는 프라이머가 특정 메틸화 패턴을 인식하고 해당 DNA를 증폭시킬 수 있다 하더라도, 타겟 서열이 아닌 다른 위치에 있는 비슷한 염기서열에도 결합(annealing)하여 증폭시키는 경우가 비일비재하다. 이를 비특이적 증폭이라고 하는데, 비특이적 증폭이 일어날 경우 메틸화되지 않은 DNA의 경우에도 PCR산물이 생성될 수 있어 메틸화 검출의 특이도가 떨어지게 된다는 문제점이 있다. 지금까지 일반적인 PCR시 비특이적 증폭을 감소시키기 위한 방법으로 PCR 사이클 수 조절, 프라이머 농도 조절, 어닐링 온도가 높은 프라이머 사용, 그리고 프라이머 서열 염기의 일부를 생물체 내의 tRNA 안티코돈에서 발견되는 이노신(I; inosine) 염기로 치환시킨 프라이머를 사용하는 방법 등이 널리 사용되어 왔다 (Ben-Dov E. et al., Appl and Environ Microbiol, 2006). 이노신은 어떠한 염기(A, G, C, T, U)와도 상보적으로 결합(base pairing) 가능하며, 그 결합력이 실제 뉴클레오티드(nucleotide)가 상보적으로 결합할 때에 비해 약하다는 특징이 있고, 아울러, 프라이머의 염기 중 일부를 이노신으로 치환할 경우, 타겟 DNA에 대한 프라이머의 특이도가 높아질 수 있다고 알려져 왔다. 그러나 아직까지 바이설파이트 처리 후 변환된 DNA의 메틸화 검출을 위한 MSP에 이노신 함유 변형 프라이머를 사용한 경우는 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 이노신의 특징을 PCR 또는 시퀀싱에 적용하여, 메틸화 특이적 프라이머의 염기서열 중 일부의 뉴클레오티드를 이노신(I)으로 치환시킨 이노신 함유 변형 프라이머를 이용할 경우 (도 1B), 바이설파이트 처리 후 변환된 메틸화 DNA를 민감도의 손실 없이 높은 특이도로 검출할 수 있다는 것을 최종적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은, 민감도 손실 없이 특이도가 증가된 DNA의 메틸화 검출방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하는 단계; 및 상기 바이설파이트 처리에 의해 변환된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 DNA 중합효소를 이용하여 상기 변환된 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 DNA의 메틸화 검출방법에 있어서, 상기 프라이머는 상기 변환된 DNA의 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 이노신을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 바이설파이트 처리후 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬에 존재하는 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.

본 발명은 또한, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하는 단계; 및 상기 바이설파이트 처리에 의해 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬을 증폭시킬 수 있는 서열번호 2 및 서열번호 3에서 1~5개 염기가 이노신으로 치환되어 있는 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 이용하여 상기 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬을 증폭시키는 단계를 포함하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 바이설파이트 처리에 의해 변환된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 DNA 중합효소를 포함하는 DNA 메틸화 검출용 키트에 있어서, 상기 프라이머는 상기 변환된 DNA의 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 이노신을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 바이설파이트 처리후 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬에 존재하는 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 포함하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 이노신 잔기를 함유하는 변형된 메틸화 특이적 프라이머를 이용할 경우, 기존의 메틸화 특이적 프라이머를 이용하는 경우에 비해 타겟 서열에 대한 특이도가 높고 민감도에 손실이 없어 메틸화 DNA를 효과적으로 검출할 수 있다.

도 1은 일반 프라이머를 사용한 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR)(A)과 이노신 프라이머를 사용한 메틸화 특이 PCR(B)의 원리를 비교한 것이다.
도 2는 신데칸2(syndecan2; SDC2) 유전자의 5' UTR(untranslated region)에 해당하는 +261~+610 bp의 염기서열에 해당하는 비메틸화 DNA를 10⁹copies 부터 1 copy 까지 연속 희석한 후 SDC2 유전자의 메틸화 특이적 일반 프라이머(A) 및 이노신 함유 프라이머(B)를 이용하여 PCR 증폭한 결과이다.
도 3은 메틸화 특이적 일반 프라이머와 이노신 프라이머의 메틸화 DNA에 대한 검출민감도를 real time PCR 방법으로 비교한 것이다.
도 4는 메틸화 특이적 일반 프라이머와 이노신 프라이머의 메틸화 DNA에 대한 real time PCR 결과를 평균 Ct(cycle threshold)로 비교한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 바이설파이트(bisulfite)는 중아황산염을 의미하며, 이아황산염(disulfite) 또는 수소아황산염(hydrogen sulfite)과 동일한 물질을 의미한다.

본 발명에서는, 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출 특이도 테스트와 실시간 PCR을 이용한 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출 민감도 테스트를 수행하였다. 그 결과, 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머가 이노신을 함유하지 않은 메틸화 특이적 프라이머보다 메틸화 검출에 있어서 특이도가 매우 우수하고 민감도에도 손실이 없다는 점을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하는 단계; 및 상기 바이설파이트 처리에 의해 변환된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 DNA 중합효소를 이용하여 상기 변환된 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 DNA의 메틸화 검출방법에 있어서, 상기 프라이머는 상기 변환된 DNA의 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 이노신을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는, 이노신 함유 변형 프라이머가 메틸화된 DNA만 특이적으로 검출하는지 확인하기 위해 다음의 단계를 포함하여 상기 메틸화 특이 PCR(MSP)을 수행하였다: (a) 특정 DNA의 CpG섬에 대하여 바이설파이트(bisulfite)를 처리하여 비메틸화 시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 비메틸화된 염기서열을 유전자 합성 방법으로 제작하여 플라스미드 벡터에 클로닝하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 특정 DNA와 어닐링(annealing) 가능한 메틸화 특이적 증폭용 프라이머를 설계 및 합성하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 프라이머의 서열 중 한 개 이상의 뉴클레오티드를 이노신으로 치환하여 합성하는 단계; 및 (e) PCR 장비를 이용하여 메틸화된 DNA를 증폭한 후 전기영동하여 PCR산물을 확인하는 단계.

위의 실시예에서, 1개의 뉴클레오티드만 이노신으로 치환하였으나, 이에 제한되지 않고, 1개 이상의 뉴클레오티드를 공지된 이노신 치환 방법으로 치환 가능하다. 위의 실시예에서, 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머가 기존의 메틸화 특이적 프라이머에 비해 특이도가 뛰어난지 비교하기 위해 바이설파이트 처리 후 비메틸화된 SDC2 유전자 서열과의 교차반응 유무를 비교하였다. 바이설파이트를 DNA에 처리하게 되면 CpG섬의 메틸화된 시토신은 그대로 시토신으로 남아있고, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변하게 된다. 교차반응 유무 비교 결과, 기존 프라이머는 타겟 DNA의 CpG 섬에 시토신이 없는데도 불구하고 비특이적 증폭이 일어나 PCR산물이 생성된 반면, 이노신 함유 변형 프라이머는 비특이적 증폭이 거의 일어나지 않아 메틸화 검출에 있어서 특이도가 매우 우수함을 보여주었다.

본 발명에 있어서, 상기 검출방법은 PCR, DNA 시퀀싱, 프라이머신장법(primer extension)으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 바람직하게는, 상기 PCR은 실시간 PCR (real time PCR)인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 실시간 PCR은 형광 리포터가 표지된 프로브 또는 비특이적 형광염료를 사용하는 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, PCR에는 일반적인 PCR, 메틸화 특이 PCR, 실시간 PCR을 포함하는 정량 PCR, 디지털 PCR 등이 있고, DNA 시퀀싱에는 바이설파이트 시퀀싱, 파이로시퀀싱, Sanger 시퀀싱, 혼성화에 의한 시퀀싱 등 프라이머가 사용되는 시퀀싱 방법 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 PCR 또는 DNA 시퀀싱은 이 기술분야에서 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출 민감도를 확인하기 위해 다음의 단계를 포함하여 상기 실시간 PCR (real time PCR)을 수행하였다: (a) 메틸화된 특정 DNA에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 합성하는 단계; (b) 특정 DNA와 어닐링(annealing) 가능한 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 증폭용 프라이머를 설계 및 합성하는 단계; (c) 상기 (a)의 프로브와 상기 (b)의 프라이머를 이용하여 메틸화된 DNA를 실시간 PCR 하여 증폭시키는 단계; 및 (c) PCR산물의 cycle threshold (Ct) 값을 측정하는 단계.

위의 실시간 PCR은 quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 이라고도 불리는데, 타겟 유전자를 증폭시킴과 동시에 정량 분석하는 것이 가능하다. 원리는 일반적인 PCR과 같으나, 반응이 진행되는 동안 실시간으로 증폭된 DNA가 검출될 수 있다.

실시간 PCR에서 자주 쓰이는 두 가지 방법이 있다. 첫번째는, Sybergreen 등의 비특이적인 형광염료(dye)를 이중가닥 DNA에 처리하여 침투하게 만드는 것이고, 두번째는, 특정 서열에 특이적으로 혼성화(hybridization)할 수 있는 올리고뉴클레오티드 DNA 프로브를 처리하는 방법이다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(10-100bp의 짧은 단일가닥 DNA 또는 RNA)로, 5' 말단에 표지 인자 역할을 하는 방사성 물질이나 형광 리포터 등이 부착되어있고, DNA 증폭 단계에서 Taq polymerase와 같은 엑소뉴클라아제에 의해 형광 물질이 잘려 나가게 되면 형광을 방출하게 된다. DNA에 침투되거나 프로브에 표지된 형광 물질의 종류에 따라 X-ray, 자외선, 공유초점 현미경, 또는 항체에 의해 검출된다. 상기 두 방법 모두 증폭된 DNA의 양을 실시간으로 측정하는 것을 가능하게 한다.

상기 비특이적 형광염료는 Sybergreen, Evagreen, Cy3, Cy5, 비오틴 결합물질, 알렉사 647(Alexa 647), 알렉사 555(Alexa 555), (5-(2-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광염료는 이 기술분야에서 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 표지된 형광 리포터(형광물질)가 6-carboxyfluorescein (FAM)인 TaqMan probe를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였고, 이노신을 함유하지 않은 프라이머를 사용한 음성 대조군과 비교하였을 때, 이노신을 함유하는 메틸화 특이적 프라이머의 검출 민감도가 더 우수함을 보여주었다. 표지될 수 있는 형광물질(fluorophores)로는 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(TMR), Cy3, Cy5, 텍사스 레드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광리포터는 이 기술분야에서 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 바이설파이트 처리후 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬에 존재하는 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 서열번호 2 및 서열번호 3에서 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, "이와 연관된 CpG섬"이란, SDC2 유전자의 발현에 필요한 프로모터 및 5'-UTR(untranslated region)을 포함하는 부위에 존재하는 CpG섬을 의미한다.

SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬를 증폭시키는 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3에서 어느 위치의 염기든 이노신 잔기로 1~5개 치환된 모든 서열을 포함한다. 서열번호 4 및 서열번호 5의 서열을 가지는 프라이머는 각각 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열을 가지는 프라이머의 3' 말단으로부터 4번째 염기가 이노신(I)으로 치환된 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하는 단계; 및 상기 바이설파이트 처리에 의해 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬을 증폭시킬 수 있는 서열번호 2 및 서열번호 3에서 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있거나 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 이용하여 상기 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬을 증폭시키는 단계를 포함하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출방법에 관한 것이다.

증폭되는 변환된 DNA는 인간 SDC2 유전자를 포함하며, 바이설파이트 처리 후에 서열번호 1과 같은 염기서열을 갖는다. SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬을 증폭시키는 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3에서 어느 위치의 염기든 이노신 잔기로 1~5개 치환된 모든 서열을 포함한다. 서열번호 4 및 서열번호 5의 서열을 가지는 프라이머는 각각 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열을 가지는 프라이머의 3' 말단으로부터 4번째 염기가 이노신(I)으로 치환된 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 검출방법은 PCR, DNA 시퀀싱, 프라이머신장법(primer extension)으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PCR은 실시간 PCR(real time PCR)인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 실시간 PCR은 형광 리포터가 표지된 서열번호 6의 프로브 또는 비특이적 형광염료를 사용하는 것임을 특징으로 할 수 있다. 서열번호 6의 프로브는 SDC2 유전자에 특이적으로 혼성화(hybridization) 가능한 서열을 갖는 프로브이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 바이설파이트 처리에 의해 변환된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 DNA 중합효소를 포함하는 DNA의 메틸화 검출용 키트에 관한 것으로, 상기 프라이머는 상기 변환된 DNA의 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 이노신을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 바이설파이트 처리후 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 포함하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 키트에 관한 것이다. 바람직하게는 서열번호 2 및 서열번호 3에서 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 포함하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 키트인 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않으며 메틸화된 CpG섬을 포함하는 DNA를 증폭시킬 수 있는 이노신 함유 변형 프라이머 쌍이면 본 발명의 메틸화 검출용 키트를 위하여 제공될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 주형 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 처리할 수 있는 첫번째 용기, 샘플을 증폭하기 위한 5'-CpG-3' 염기서열 부위에 상보적인 프라이머쌍을 함유하는 두번째 용기, 및 증폭된 산물을 검출하기 위한 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.

캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

메틸화 검출 방법

메틸화 특이 PCR ( methylation specific PCR )

지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR ( real time methylation specific PCR )

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TaqMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.

키트( Kit )

본 발명에 의하면, DNA의 메틸화를 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 주형 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 처리할 수 있는 첫번째 용기, 샘플을 증폭하기 위한 5'-CpG-3' 염기서열 부위에 상보적인 프라이머쌍을 함유하는 두번째 용기, 및 증폭된 산물을 검출하기 위한 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1: 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출 특이도 테스트

이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출특이도를 확인하기 위하여 인간 유전자 SDC2의 5'UTR (전사개시점 (+1)으로부터 +261 ~ +610 bp에 해당) 부위에 대하여 바이설파이트 (bisulfite) 처리 후 비메틸화된 상태에 해당하는 염기서열을 유전자 합성 방법으로 제작하여 TOPO pCR2.1 플라스미드 벡터 (Life Technologies)에 클로닝 하였다 (㈜바이오니아).

염기서열 1: +261 ~ +610 bp

5'-aaattagaaa ttgaattttg gtatgggaaa ggagtttgtg gaggagtaaa attatagtag agtaagaaga gttttagaga gtagtttttt tggagtatta attttgtgtt gggagtgtag aaattaataa gtgagagggt gttgtgtttt tggggtgtag ttgtgggtgg tgggagtagg tgtaggagga ggaagtgagt gtttttgagt tttgagtttg agtttttgag tttgagttgt aattgttgtg gtattttgtt ttggatttgt gtgtgtgggt tgtgttgagt gttgggtagg aggttttgtt ttgttttggt tgtaagtagt ggttgggagt agttggtttt-3’ (서열번호 1)

SDC2 유전자의 메틸화 특이적 증폭용 프라이머는 MethPrimer 프로그램 (http://www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)을 이용하여 설계하여 ㈜바이오니아에서 합성하였다.

SDC2-F: 5'-GTAGAAATTAATAAGTGAGAGGGC-3' (서열번호 2)

SDC2-R: 5'-ACGACTCAAACTCGAAAACTCG-3' (서열번호 3)

이노신 함유 SDC2 유전자 메틸화 특이적 프라이머는 상기 프라이머 서열중의 한 개씩의 뉴클레오타이드 (nucleotide)를 이노신 (I)으로 치환하여 ㈜바이오니아에서 합성하였다.

SDC2-FIP: 5'-GTAGAAATTAATAAGTGAGAIGGC-3' (서열번호 4)

SDC2-RIP: 5'-ACGACTCAAACTCGAAAAITCG-3' (서열번호 5)

또한 real time PCR에서 증폭산물의 검출을 위한 TaqMan probe를 ㈜바이오니아에서 합성하였다.

SDC2-probe: 5'-FAM-TTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGG-3' (서열번호 6)

이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머와 일반 메틸화 특이적 프라이머와의 검출특이도를 비교하기 위하여 바이설파이트 처리 후 비메틸화된 SDC2 유전자 서열과의 교차반응 유무를 비교하였다 (도 2). 이를 위하여 합성한 비메틸화 SDC2 플라스미드 DNA를 10⁹ copies부터 1 copy까지 연속적으로 10배수 희석하였다. 희석된 이들 플라스미드들을 주형으로 사용하여 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머와 일반 메틸화 특이적 프라이머로 Rotor-Gene Q PCR 장비 (Qiagen)를 이용하여 증폭하였다. PCR 반응 용액 (주형 DNA, 2 ㎕; 5X AptaTaq DNA Master (Roche Diagnostics), 4 ㎕; PCR 프라이머, 2 ㎕(2 pmole/㎕), D.W. 12 ㎕)을 준비하고 PCR 조건은 95^oC, 5분 처리한 후 95^oC에서 15초, 61^oC에서 1분으로 총 40회 수행하였다. PCR 산물을 1% 아가로즈겔 (agarose gel)에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였다.

그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 일반 메틸화 특이적 프라이머는 10⁵ copies 이상의 비메틸화 DNA가 존재할 때 PCR 산물이 만들어지는 비특이적 증폭이 일어난 반면, 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머를 이용하여 증폭하였을 경우에는 10⁹ copies의 비메틸화 DNA가 존재하더라도 비특이적 증폭이 관찰되지 않았다 (도 2B). 이 결과로부터 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머가 메틸화 검출에 있어서 특이도가 매우 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: Real time PCR 을 이용한 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출 민감도 테스트

이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출 민감도를 일반 메틸화 특이적 프라이머와 비교하기 위하여 real time PCR을 수행하였다. 이를 위하여 실시예 1에서 합성한 메틸화된 SDC2 유전자에 특이적으로 혼성화 할 수 있는 프로브 (서열번호 6)를 사용하였다.

비메틸화된 사람의 백혈구세포 게놈 DNA (BioChain, Cat. No. D1234148) 20 ng에 SDC2 유전자가 완전히 메틸화된 대장암 세포주 HCT116 (한국세포주은행 KCLB No. 10247)의 게놈 DNA를 20 ng부터 50 pg 까지 연속적으로 희석하여 혼합하였다. 상기 게놈 DNA에 EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 10 ㎕로 용출하여 메틸화 특이적 실시간 PCR (qMSP; Methylation-Specific real time PCR)에 사용하였다. 이를 주형으로 하여 실시예 1에서 합성한 일반 메틸화 특이적 프라이머 (서열번호 2 및 서열번호 3)와 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머 (서열번호 4 및 서열번호 5)를 사용하여 real time PCR을 수행하였다. Real time PCR은 Rotor-Gene Q PCR 장비 (Qiagen)를 이용하였다. PCR 반응 용액 (주형 DNA, 2 ㎕; 5X AptaTaq DNA Master (Roche Diagnostics), 4 ㎕; PCR 프라이머, 2 ㎕ (2 pmole/㎕), Taqman probe, 2 ㎕ (2 pmole/㎕); D.W. 10 ㎕)을 준비하고 PCR 조건은 95^oC, 5분 처리한 후 95^oC에서 15초, 61^oC에서 1분으로 총 40회 수행하였다. PCR 산물의 증폭여부는 cycle threshold (Ct) 값을 측정하여 확인하였다. 각 희석농도당 real time PCR은 9회 내지 24회 반복 실험하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 연속적으로 희석한 HCT116의 검출률을 보면 200 pg 이상의 농도에서는 프라이머에 상관없이 메틸화 검출이 100% 되었지만, 100 pg과 50 pg에서는 이노신 함유 변형 프라이머는 100% 검출률 (24회중 24회)을 보였으나, 일반 메틸화 특이적 프라이머는 각각 95.8% (24회중 23회 검출), 79.2% (24회중 19회 검출)로 낮은 검출률을 나타내었다 (도 3). PCR 산물을 1% 아가로즈겔 (agarose gel)에 전기영동하여 PCR 산물을 확인한 결과, 이노신 함유 변형 메틸화 특이적 프라이머의 검출 민감도가 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.

도 4는 상기 실험에서 측정된 Ct 값들의 평균을 나타낸 것이다. 시험된 모든 농도에서 이노신 함유 변형 프라이머를 이용한 real time PCR Ct 값이 일반 프라이머를 사용한 경우보다 낮게 측정됨으로써 이노신 함유 변형 프라이머의 증폭성능이 더 우수함을 알 수 있었다. 이러한 Ct 값의 차이는 메틸화 DNA의 농도가 낮을수록 더 크게 나타나는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Genomictree, Inc. <120> Method for Methylation Detection of Converted DNA by Bisulfite-Treatment Using Inosine-containing Modified Primers <130> P14-B091 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 350 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 aaattagaaa ttgaattttg gtatgggaaa ggagtttgtg gaggagtaaa attatagtag 60 agtaagaaga gttttagaga gtagtttttt tggagtatta attttgtgtt gggagtgtag 120 aaattaataa gtgagagggt gttgtgtttt tggggtgtag ttgtgggtgg tgggagtagg 180 tgtaggagga ggaagtgagt gtttttgagt tttgagtttg agtttttgag tttgagttgt 240 aattgttgtg gtattttgtt ttggatttgt gtgtgtgggt tgtgttgagt gttgggtagg 300 aggttttgtt ttgttttggt tgtaagtagt ggttgggagt agttggtttt 350 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2-F <400> 2 gtagaaatta ataagtgaga gggc 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2-R <400> 3 acgactcaaa ctcgaaaact cg 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2-FIP <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n denotes i (inosine) <400> 4 gtagaaatta ataagtgaga nggc 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2-RIP <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n denotes i (inosine) <400> 5 acgactcaaa ctcgaaaant cg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2-probe <400> 6 ttcggggcgt agttgcgggc gg 22

Claims

DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하는 단계; 및 상기 바이설파이트 처리에 의해 변환된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 DNA 중합효소를 이용하여 상기 변환된 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 DNA의 메틸화 검출방법에 있어서, 상기 프라이머는 상기 변환된 DNA의 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 이노신을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 검출방법은 PCR, DNA 시퀀싱, 프라이머신장법(primer extension)으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출방법.
제2항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR (real time PCR)인 것을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출방법.
제3항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 형광 리포터가 표지된 프로브 또는 비특이적 형광염료를 사용하는 것임을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출방법.
바이설파이트 처리후 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬에 존재하는 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍.
제5항에 있어서, 서열번호 2 및 서열번호 3에서 1~5개의 염기가 이노신으로 치환되어 있는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍.
제6항에 있어서, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는, SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 프라이머 쌍.
SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하는 단계; 및 상기 바이설파이트 처리에 의해 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬을 증폭시킬 수 있는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 이용하여 상기 변환된 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬을 증폭시키는 단계를 포함하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출방법.
제8항에 있어서, 상기 검출방법은 PCR, DNA 시퀀싱, 프라이머신장법(primer extension)으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출방법.
제9항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR(real time PCR)인 것을 특징으로 하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출방법.
제10항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 형광 리포터가 표지된 서열번호 6의 프로브 또는 비특이적 형광염료를 사용하는 것임을 특징으로 하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출방법.
바이설파이트 처리에 의해 변환된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 DNA 중합효소를 포함하는 DNA 메틸화 검출용 키트에 있어서, 상기 프라이머는 상기 변환된 DNA의 메틸화된 시토신을 포함하는 서열부위와 상보적이고, 1~5개의 이노신을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA의 메틸화 검출용 키트.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 포함하는 SDC2 유전자 또는 이와 연관된 CpG섬의 메틸화 검출용 키트.