KR20150095108A - 히알루로니다제의 생체 내 활성 모니터링을 위한 나노하이드로젤 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체내 안정성이 매우 우수하고, 히알루로니다제의 활성에 따라 특이적으로 형광을 나타낼 수 있는 인도시아닌그린이 봉입되어 히알루로니다제의 생체내 활성 모니터링을 위하여 이용될 수 있는 히알루론산 중합체 나노하이드로젤 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 자가 교차결합된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 사용하면, 기존의 히알루로니다제 검출 방법이 혈청 존재 하에서 측정이 힘들고, 시간이 수 시간 이상으로 오래 걸린다는 단점을 극복할 수 있으며, 형광 신호를 기반으로 생체내의 혹은 혈청 존재 하에서 히알루로니다제 효소만 선택적으로 수 분 내로 빠르게 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

히알루로니다제의 생체 내 활성 모니터링을 위한 나노하이드로젤 및 그 제조 방법{Nanohydrogel for in vivo Monitoring Hyaluronidase Activity and Preparing Method thereof}

본 발명은 히알루로니다제(Hyaluronidase)의 생체 내 활성 모니터링을 위해 사용될 수 있는 나노하이드로젤 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 생체적합성 고분자인 히알루론산에 인도시아닌그린(Indocyanine green, ICG)를 접합시켜 수용액 상에서 인도시아닌 그린이 봉입된 히알루론산 나노하이드로젤을 개선한 자가 교차결합 형태의 히알루론산 나노하이드로젤 및 그 제조방법에 관한 것이다.

히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성되어 있고 상기 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액 및 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 히알루론산은 우수한 생체적합성과 점탄성으로 인해 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 의료 및 의료 용구나, 화장품 용도 등으로 널리 사용되고 있다.

한편, 히알루론산은 악성 유방암과 전이성 림프노드에서 과발현되는 특징이 있으며, 6가지 종류의 히알루로니다제(Hyaluronidase)가 광범위하게 발현되며, 이는 종양의 전이에 밀접하게 관련이 있다. 이러한 히알루로니다제는 in vitro 와 in vivo에서 이미지 타켓팅과 약물전달을 위한 시그널로 사용될 수 있다. 그리고 히알루론산은 생체적합성이 우수하여 나노하이드로젤로 제조하기 좋으며, 히알루로니다제에 의해 분해되는 성질을 가지고 있다.

그런데 나노하이드로젤을 형성하는 히알루론산의 중합체는 그 자체만으로는 생체 내(in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 제한적이다. 따라서 구조적으로 안정한 히알루론산 유도체를 개발하기 위한 노력이 널리 진행되어 왔다(Laurent, T.C. "The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives" Portland Press Ltd., London, 1998). 특히 이러한 단점을 극복하기 위해, 효소 및/또는 박테리아 공격, 온도 또는 자유 라디칼과 같은 다양한 분해 인자들로부터 덜 민감하게 만들며, 생체 내에서의 분해에 대한 저항성을 증가시켜 결과적으로 작용 기간을 늘릴 수 있는 교차결합(Crosslinked)된 히알루론산 중합체의 다양한 제조방법이 개발되어 왔다. 이러한 제조방법은 자연적인 히알루론산의 하이드록실 및/또는 산 작용기를 특히 에테르화, 에스테르화 또는 아미드화하는 방법과 관련이 있다.

한편 인도시아닌그린(Indocyanine green, ICG)은 근적외선 형광(NIR) 염료(dye)로서 미국 FDA(Food and Drug Administration)에서 림프계뿐만 아니라 심장, 간 혈관 시스템의 진단에 사용허가를 받은 물질이다. 특히, 인도시아닌그린은 유방암의 조기 진단을 위한 전이성 림프노드의 이미징 및 센티넬 림프노드(sentinel lymph node)의 맵핑에 우수한 프로브(probe)로 알려져 있다.

반면에 인도시아닌그린은 친수성이 낮고, 광안정성이 낮으며, 광자 수율이 낮고, 감도가 떨어지는 단점을 가지고 있다. 또한 인도시아닌그린은 비특이적 응집에 취학하고, 외부 광, 용매 및 온도변화에 의해 화학적으로 분해되는 단점이 있으며, 낮은 분자량과 소수성 특징 때문에, 혈청 단백질로 잘 흡수되어 신장을 거쳐 제거된다. 혈액 내의 인도시아닌그린의 반감기는 대략 2~4분 정도이기 때문에, 진단 효율을 높이기 위하여, 혈액 내에서 반감기가 긴 인도시아닌그린 기반 프로브의 개발이 필요하게 되었다. 반감기 외의 문제로 인도시아닌그린은 쉽게 확산되어 버리기 때문에, 인도시아닌그린 이미징을 이용한 센티넬 림프 노드의 절개 시술은 30분 내에 수행되어야 하였으며, 깊은 림프 노드는 찾을 수 없었던 단점이 있었다.

이러한 단점들을 극복하고자, 나노물질 기반 인도시아닌그린 프로브, 예를 들면, 나노입자, 리포솜, 마이셀 등을 이용한 나노물질 기반 인도시아닌그린 프로브에 대한 연구가 진행되어, 나노파티클에 인도시아닌그린을 포집하거나, 폴리머, 인지질 및 칼슘 포스페이트로 구성된 마이셀 등을 이용하여, 인도시아닌그린의 in vivo 및 in vitro에서의 안정성을 증가시킨 연구가 있어왔다(A.K. Kirchherr et al., Mol Pharm. 6:480, 2009, V.B. Rodriguez et al., J Biomed Opt. 13:14, 2008; E.I. Altinoglu et al, Nano. 2:2075, 2008). 인도시아닌그린을 히알루로산 나노하이드로젤에 접합시키는 방법을 사용하는 대한민국 공개특허 10-2013-0095522호의 방법으로 제조된 '수용액 상에서 인도시아닌그린이 봉입된 히알루로산 나노하이드로젤'은 인도시아닌그린 프로브를 임상 진단에 적용하는 데 있어서, 이미징을 하고자 원하는 부위로 타겟팅을 하는 부위 특이성은 가지고 있지만 물리화학적 안정성 및 생체내 안정성을 충분히 증가시키지 못한 문제점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 히알루로니다제의 생체내 활성 모니터링을 수월하게 할 수 있도록, 생체적합성 고분자인 히알루론산에 인도시아닌그린을 접합시켜서 생체내 검출이 가능하도록 한 후에, 디티오비스 술포숙신이미딜 프로피온산 (3, 3'-dithio-bis(sulfosuccinimidylproprionate), DTSSP)과 반응시켜 자가 교차결합을 다수 형성시킨 형태의 히알루론산 나노하이드로젤 유도체를 제조하여 프로브인 인도시아닌그린의 생체내 안정성을 월등히 높이고 in vivo에서 히알루로니다제의 활성을 안정적이고 빠르게 측정하여 히알루로니다제의 과발현을 표지로 하는 질환 진단에 사용할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 생체내 안정성이 매우 우수하고, 히알루로니다제의 활성에 따라 특이적으로 형광을 나타낼 수 있는 인도시아닌그린이 봉입되어 히알루로니다제의 생체내 활성 모니터링을 위하여 이용될 수 있는 히알루론산 중합체 나노하이드로젤 및 그의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인도시아닌그린(Indocyanine Green: ICG)이 히알루론산 중합체에 접합되어 봉입되어 있고 자가 교차결합된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합은 상기 히알루론산 중합체의 아민기와 상기 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)가 접합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인도시아닌그린은 히알루론산 중합체의 1차 아민기 하나당 0.1 ~ 1개로 접합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노하이드로젤의 입자 크기는 50 ~ 1000nm일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노하이드로젤을 함유하는 히알루로니다제 활성 진단용 이미징 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 히알루론산 중합체의 카르복시기를 아민기로 치환하는 단계; (b) 상기 치환된 히알루론산 중합체의 아민기와 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)를 접합시켜 인도시아닌그린이 봉입되어 있는 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤에 교차결합제를 이용하여 자가 교차결합시켜 인도시아닌그린이 봉입된 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는 나노하이드로젤의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, (a)단계의 아민기로의 치환은 H2 N -R 1 -NH2 , H2 N -R 2 -OH 및 H2 N -R 3 -CHO(여기서, R 1 , R 2 및 R 3은 각각 독립적으로 C1-10 인 포화탄화수소류, 불포화탄화수소류 또는 방향족 유기기이다)로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 처리할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, (b)단계의 히알루론산 중합체의 아민기와 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)를 접합시키는 것은 인도시아닌그린-N-히드록시숙신이미드-에스테르(Indocyanine green-N-hydroxysuccinimide ester: ICG-OSu)를 (a)단계 후의 용액에 처리하여 결합시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, (c)단계의 교차결합제는 디티오비스 술포숙신이미딜 프로피온산(3, 3'-dithio-bis(sulfosuccinimidylproprionate): DTSSP), 비스엔 숙신이미딜 에틸렌글리콜 에스터(Bis-N-succinimidyl(ethyleneglycol)ester: BS(PEG)n), 디티오비스 숙신이미딜 프로피온산(dithiobis(succinimidyl propionate: DSP)으로 구성된 군에서 선택되는 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, (c)단계에서 첨가하는 교차결합제는 히알루론산 중합체 고분자 1 단위체 당 0.1 ~ 1몰로 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 자가 교차결합된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 사용하면, 기존의 히알루로니다제 검출 방법이 혈청 존재 하에서 측정이 힘들고, 시간이 수 시간 이상으로 오래 걸린다는 단점을 극복할 수 있으며, 형광 신호를 기반으로 생체내의 혹은 혈청 존재 하에서 히알루로니다제 효소만 선택적으로 수 분 내로 빠르게 검출할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 히알루론산 중합체에 인도시아닌그린을 접합시키고 자가 교차결합 형태로 히알루론산 중합체 나노하이드로젤을 최종적으로 형성하는 단계를 순차적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 히알루론산 중합체에 인도시아닌그린을 접합시켜 자가집합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계및 자가집합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤에 교차결합제를 이용하여 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계를 순차적으로 나타낸 과정도이다.
도 3은 본 발명에 따른 히알루로니다제의 생체내 활성 모니터링을 위한 나노하이드로젤의 제조과정 중 히알루론산 중합체의 아민기와 교차결합제인 DTSSP를 반응시켜 자가 교차결합을 형성하는 과정에서 교차결합제와 아민기의 비율을 변화시키면서 남는 아민기의 양을 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 히알루로니다제의 생체내 활성 모니터링을 위한 자가 교차결합 형태의 나노하이드로젤의 사이즈를 자가집합 형태의 나노하이드로젤과 비교한 DLS 측정 결과이다.
도 5는 PBS 용액에 녹인 인도시아닌그린, 자가 집합 나노하이드로젤 및 자가 교차결합 나노하이드로젤에 대한 UV 스펙트럼 흡수 결과이다.
도 6은 물상에 녹인 인도시아닌그린, 자가 집합 나노하이드로젤 및 자가 교차결합 나노하이드로젤에 대해 상온에서 빛을 조사한 후 조사한 시간에 따른 방출량의 변화를 나타낸 결과이다.
도 7은 조건을 변화시켜 가면서 인도시아닌그린, 자가 집합 나노하이드로젤 및 자가 교차결합 나노하이드로젤에 대해 IVIS를 이용해 Fluorescence dye를 촬영한 결과이다.
도 8은 인도시아닌그린, 자가 집합 나노하이드로젤 및 자가 교차결합 나노하이드로젤 프로브를 마우스 발에 주입하여 Fluorescence 신호로 이미징한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 관점에서, 본 발명은 인도시아닌그린(Indocyanine Green: ICG)이 히알루론산 중합체에 접합되어 봉입되어 있고 자가 교차결합된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤에 관한 것이다.

본 발명의 자가 교차결합된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤 구조는 봉입된 인도시아닌을 외부 환경으로부터 차단시켜 생체 내 광안정성을 높여주며, 나노하이드로젤을 형성하는 히알루론산은 히알루로니다제에 의해 분해되어 인도시아닌을 해리 시키므로, 생체 내 히알루로니다제 발현여부를 특이적으로 이미징 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 인도시아닌그린(Indocyanine Green: ICG)이 히알루론산 중합체에 접합되어 봉입되어 있고 자가 교차결합된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 함유하는 히알루로니다제 활성 진단용 이미징 프로브에 관한 것이다.

인도시아닌그린을 포함하는 히알루론산 나노하이드로젤은 in vitro에서 히알루로니다제를 과발현하는 유방암세포, 전립선 암세포를 포함하는 특정 암세포에 대해 타겟 이미징을 할 수 있다는 것을 확인하였으며, 자가 교차결합(self-crosslinked)된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤(shell crosslinked nanohydrogel : SC-GEL, 일부도면에서는 sc-nanogel로 표시함)이 동물모델에서 피하 주사 후 자가집합체(self-assembled) 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤(self assembled nanohydrogel : SA-GEL, 일부도면에서는 sa-nanogel로 표시함) 보다 배경이 되는 형광 신호(background fluorescence signal)가 없이 긴 시간동안 안정하다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 프로브는 생체내에서 히알루로니다제 과발현 여부를 안정적이고 빠르게 확인할 수 있는 이미징 프로브로 이용될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 도 1에서 그림으로 순차적으로 나타낸 바와 같이 (a) 히알루론산 중합체의 카르복시기를 아민기로 치환하는 단계; (b) 상기 치환된 히알루론산 중합체의 아민기와 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)를 접합시켜 인도시아닌그린이 봉입되어 있는 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤에 교차결합제를 이용하여 자가 교차결합시켜 인도시아닌그린이 봉입된 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는 나노하이드로젤의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명 (a) 단계에 있어서, 아민기로의 치환은 H2 N -R 1 -NH2 , H2 N -R 2 -OH 및 H2 N -R 3 -CHO로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 처리함으로써 수행할 수 있는데, 여기서, R 1 , R 2 및 R 3은 각각 독립적으로 C1-10 인 포화 탄화수소류, 불포화탄화수소류 또는 방향족 유기기이며, 바람직하게는 에틸, 에틸렌, 부틸, 부틸렌, 펜틸, 아밀렌, 벤질 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에틸렌 디아민을 처리하여 아민기 치환을 할 수 있다.

본 발명 (b) 단계에 있어서, 히알루론산 중합체의 아민기와 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)를 접합시키는 것은 인도시아닌그린-N-히드록시숙신이미드-에스테르(Indocyanine green-N-hydroxysuccinimide ester: ICG-OSu)를 상기 (a)단계 후의 용액에 처리함으로써 수행할 수 있다.

본 발명 (c) 단계에 있어서, 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 자가 교차결합시키기 위해 처리하는 교차결합제는 디티오비스 술포숙신이미딜 프로피온산(3, 3'-dithio-bis(sulfosuccinimidylproprionate): DTSSP), 비스엔 숙신이미딜 에틸렌글리콜 에스터(Bis-N-succinimidyl(ethyleneglycol)ester: BS(PEG)n), 디티오비스 숙신이미딜 프로피온산(dithiobis(succinimidyl propionate: DSP)으로 구성된 군에서 선택되는 화합물로 하여 상기 (b)단계 후의 용액에 처리함으로써 수행할 수 있다.

인도시아닌그린(Indocianin green, ICG) 은 미국 FDA에서 유일한 형광 조영제로서 승인된 물질로, 생체 내에서 전이성 림프노드(lymph node) 및 암의 검진을 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다.

본 발명에서는 생체내 히알루노니다제 활성 이미징을 위해 근적외선 프로브인 ICG를 포함하는 반경 150nm 이하 크기의 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 제조하였다.

본 발명의 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤에서, 인도시아닌그린(ICG)의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)는 히알루론산(HA)의 아민기와 접합되어, 용액 상에서 분자 간 소극성 및 인도시아닌그린 간의 π-π 스택킹 상호작용에 의하여 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤(SA-GEL)을 형성하고 교차결합제에 의해 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤(SC-GEL)을 형성한다.

자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤은 용액 상에서 균일하게 잘 분산되며, 히알루론산 나노하이드로젤 내에서 인도시아닌그린은 화학적 안정성이 현저하게 증가한다. 히알루론산 나노하이드로젤 내의 인도시아닌그린의 형광 시그널은 하이드로젤 자체로 인하여 퀀칭(quenching)되며, 히알루로니다제(Hyaluronidase)의 작용에 의해서만 다시 형광을 나타내게 된다.

본 발명에 있어서, 아민기로 치환된 히알루론산과 인도시아닌그린은 아미드결합으로 접합할 수 있으며, 결합을 촉진하기 위한 커플링제로서 HAMDU ( O -(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,3-dimethyl-1,3-dimethyleneuronium hexafluorphosphate), DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide), HAPyU ( O -(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1:3,3-bis(tetramethylene)uronium hexafluorphosphate), HATU ( O -(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1:3,3-tetramethyluronium hexafluorphosphate), HBMDU ( O -(benzotriazol-1-yl)-1,3-dimethyl-1,3-dimethyleneuronium hexafluorphosphate ), HBTU ( O -(benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 등을, 베이스(base)로서 DIEA (diisopropylethylamine), TMP (2,4,6-trimethylpyridine), NMI ( N -methylimidazole) 등을 사용할 수 있다. 물을 용매로 사용할 경우에는 커플링제로서 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylamini-propyl) arbodiimide hydrochloride)를 사용하고, 커플링제의 보조제로서 NHS ( N -hydroxysuccinimide), NHSS (N-hydroxysulfosuccinimide) 등을 사용 하는 것이 바람직하다.

상기 커플링제는 -COOH 작용기와 -NH 2 작용기가 아미드 결합(-CONH-)을 형성하는 역할을 하며, 상기 베이스와 보조제는 커플링제가 아미드 결합을 형성할 때 효율을 높일 수 있도록 도와주는 역할을 한다.

본 발명에 있어서, 인도시아닌그린을 봉입하고 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체(SA-GEL)는 교차결합제에 의하여 자가 교차결합을 이루어 하이드로나노젤의 크기가 작고 안정된 형태(SC-GEL)로 만들어 질 수 있으며, 교차결합을 촉진하기 위한 교차결합제로서 디티오비스 술포숙신이미딜 프로피온산(3, 3'-dithio-bis(sulfosuccinimidylproprionate): DTSSP), 비스엔 숙신이미딜 에틸렌글리콜에스터(Bis-N-succinimidyl(ethyleneglycol)ester: BS(PEG)n), 디티오비스숙신이미딜 프로피온산(dithiobis(succinimidyl propionate: DSP) 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 생체내의 혹은 혈청 존재 하에서 히알루로니다제 효소를 수 분 내로 빠르게 검출하기 위한 선택적인 이미징을 위하여 히알루론산과 인도시아닌그린을 접합시키고 히알루론산 중합체 내부에 자가 교차결합을 형성하여 인도시아닌그린이 균일하게 잘 분산되어 봉입되었으며, 자가집합체 형태의 히알루론산 나노하이드로젤보다 더욱 작고 안정된 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체 나노하이드로젤을 개발하고, 상기 나노하이드로젤을 DLS(dynamic light scattering)분석 등을 통하여 크기와 형태를 분석하였다.

자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체 나노하이드로젤의 광학적 특징은 UV 스펙트로스코피와 형광분석기로 측정하였다. 광학적 안정성은 외부광의 존재하에 자가 교차결합 형태의 나노하이드로젤 (SC-GEL)과 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL), 나노하이드로젤에 봉입되지 않은 인도시아닌그린와 비교하여 측정하였다. 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체 나노하이드로젤의 생체 이미징은 마우스 발(paw) 부위에 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체 나노하이드로젤(SC-GEL)을 주사하여, 히알루로니다제에 의하여 향상되는 형광을 in vivo에서 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 자가집합체 형태 히알루론산 나노하이드로젤(SA-GEL) 제조

인도시아닌그린을 히알루론산에 접합시켜 인도시아닌그린이 봉입된 자가집합체 형태 히알루론산 나노하이드로젤(SA-GEL)을 제조하는 과정을 도 2의 a에 나타내었다.

먼저, 히알루론산(Hyaluronic acid: HA)의 카르복시기를 활성화시키기 위하여, 히알루론산(MW 3~10kDa, Hanson biotech, 한국 10μmole 히알루론산, 527μmole 카르복시 그룹) 200mg을 5mL의 인산버퍼(pH 8.0)에 용해시키고, EDC((1-ethyl-3-(3-dimethylamini-propyl) arbodiimide hydrochloride, 527μmole) 500mg 및 NHS(N-hydroxysuccinimide, 527μmole) 300mg 과 함께 1시간 동안 반응시키고, 316mg의 DMSO에 용해된 에틸렌디아민과 24시간 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 반응물을 2일동안 10K 멤브레인을 써서 증류수에서 투석하여 에틸렌디아민을 제거하고, 동결 건조시켰다. 히알루론산(HA-NH2)에서의 아민 치환 정도를 fluorescamine assay를 이용하여 측정하였다.

히알루론산의 아민기 (0.212mg)를 190㎕ 인산버퍼(pH 8.0)과 10㎕의 DMSO에 용해된 ICG-Osu(2- {7-[1,1-dimethyl-3-(4-sulfonatobutyl)-2H-benzo[e]indol-2-ylidene]-1,3,5-heptatrienyl]-1,1-dimethyl-3-[5-(3-sulfosuccinimidyl) oxycarbonylpentyl-1H-benzo[e]indolium)(0.1mg)과 실온에서 하룻밤 반응시켰다. ICG-OSU (Dojindo, model # I254-10) 는 아민기에 대하여 활성을 갖는 -NHS 기가 도입된 인도시아닌그린 화합물로서 인도시아닌그린이 접합된 히알루론산 중합체를 제조하기 위해서 사용하였다. 하룻밤 반응 후 반응물을 desalting 칼럼(MW cut-off:5000, Pierce, USA)을 통과시켜 잔여 ICG-Osu를 제거하였다. 각 분획은 1.3% 트리톤 X-100이 녹아있는 9.5 x PBS 용액으로 각각 희석하여, excitation 과 emission의 파장이 780nm, 815nm에서 fluorospectrophotometer 로 히알루론산 중합체에 접합된 인도시아닌그린(HA-ICG)의 양을 측정하였다. 또한 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL)에 남은 아민기는 1.3% 트리톤 X-100이 녹아있는 9.5 x PBS 용액으로 각각 희석하여 fluorescamine assay를 이용하여 측정하였다.

실시예 2. 자가 교차결합 형태의 히알루론산 나노하이드로젤(SC-GEL) 제조

자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤에 교차결합제를 이용하여 자가 교차결합시켜 인도시아닌그린이 봉입된 히알루론산 나노하이드로젤의 자가 교차결합 형태를 제조하는 과정을 도 2의 b에 나타내었다.

인도시아닌그린과 결합하지 않은 상태의 아민기를 가진 자가집합 형태의 히알루론산 중합체를, DMSO용액에 용해된 다양한 양의 DTSSP(3, 3'-dithio-bis(sulfosuccinimidylproprionate))(0, 10, 50, 100, 200, 400nmol)와 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응물을 desalting 칼럼(MW cut-off:3500, Pierce, USA)을 통과시켜 잔여 DTSSP를 제거하였다. 잔여 아민은 fluorescamine assay를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 히알루론산 중합체의 아민기와 교차결합제인 DTSSP를 반응시켜 자가 교차결합을 형성하는 과정에서 교차결합제와 아민기의 비율을 변화시키면서 남는 아민기의 양을 비교하면, 아민기와 교차결합제의 몰 비율이 1:100인 경우 아민기의 약 80%가 교차결합된 것을 확인하였다. 이는 히알루론산 당 30%가 자가 교차결합된 것으로 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체가 형성된 것을 확인하였다.

실시예 3. 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤의 물리화학적 안정성 확인

자가집합 형태의 나노하이드로젤과 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤의 사이즈를 비교하기 위해 DLS (ZEN 3690, Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL)의 사이즈는 372.2 ± 24.5nm인데 비해서, 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)의 사이즈는 293.0 ± 4.2 nm인 것으로 확인하였다. 도 4를 보면 알 수 있듯이, 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤의 사이즈만 작아진 것이 아니라 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL) 사이즈의 분포가, 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL) 사이즈 분포보다 더 밀집된 상태라는 것을 확인하였다. 이것은 나노하이드로젤의 크기도 작아지고 더 밀집된 상태로 안정하게 만들어진 것을 의미한다.

인도시아닌그린(ICG), 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL) 및 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)은 최종농도 1㎍/mL로 1 x PBS에 희석하였으며, 파장 400nm에서 900nm까지 UV 스펙트로형광포토메터를 이용하여 흡광도를 측정하였다. (Beckman coulter DU® 730, USA)

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 흡광도 레벨이 히알루론산과 결합하지 않은 인도시아닌그린(ICG)에서 가장 높고, 자가집합 형태의 인도시아닌그린 봉입한 나노하이드로젤(SA-GEL)이 중간 정도이고, 자가 교차결합 형태의 인도시아닌그린 봉입한 나노하이드로젤(SC-GEL)이 가장 낮은 것을 확인하였다. 이것은 나노하이드로젤의 내부에 인도시아닌그린이 접합되어 자가집합 형태가 되었고, 자가 교차결합형태의 나노하이드로젤(SC-GEL)에서 낮은 흡광도 레벨을 보이므로 화학적으로 교차결합이 성공적으로 이루어진 것을 확인하였다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 시간이 경과함에 따른 외부 빛에 대한 형광의 변화를 측정하여 나노하이드로젤의 안정성을 살펴보았는데, 인도시아닌그린(ICG), 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL) 및 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL) 3종류의 시간 경과에 따른 형광의 변화를 보면, 6시간 동안 빛을 쪼여준 경우 인도시아닌그린(ICG)만 있는 경우에는 초기값보다 32%까지 줄어들지만, 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)에 인도시아닌그린이 봉입된 경우에는 6시간 동안 빛을 쪼여준 경우에도 별 차이가 없는 것을 확인하였다.

따라서 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)이 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL) 보다 안정성이 높으며, 장시간 이미징을 하기 위해서는 화학적 교차결합으로 안정된 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)이 더 적합하다는 것을 확인하였다.

실시예 4. 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤에 히알루로니다제 효소처리

80%FBS에 용해된 인도시아닌그린(ICG), 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL) 및 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL) 3종류(각 5μM)에 히알루로니다제(1.4㎍/㎕)를 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 대조군으로 동일한 농도의 인도시아닌그린(ICG), 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL) 및 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL) 3종류(각 5μM)를 80%FBS, 트리톤 X-100 용액(1 %), High salt with detergent에 용해시킨 것을 선정하였다.

반응 결과를 가시화하기 위하여, 반응물은 96웰 플레이트에 로드하여, IVIS　 Lumina imaging system(Caliper Life Sciences Lumina II, 미국)을 사용하여 분석하였으며, 각 샘플의 정량분석은 interests(ROIs)를 그리고, 총 플럭스(photon/sec)를 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL)은 나노하이드로젤에 봉입되지 않은 인도시아닌그린(ICG)보다는 낫지만 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)보다는 쉽게 풀려서 중간 정도의 형광강도를 보인다. 이것은 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL)은 소수성(hydrophobic) 응집력만으로 나노하이드로젤을 형성하지만, 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)은 일단 소수성(hydrophobic) 응집력으로 나노하이드로젤을 형성한 후 한번 더 자가 교차결합(crosslinking)으로 더 치밀한 나노하이드로젤을 형성하였기 때문에 형광강도에 차이를 보이는 것이다.

자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)은 트리톤 X-100 용액(1 %)에서 형광강도가 완전히 회복되지 않는데, 그 이유는 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)이 화학적 자가 교차결합으로 인해 껍질 층(shell layer)을 형성하고 있기 때문이다. 따라서 염과 계면활성제(detergent)를 처리하면 완전히 형광강도가 회복되는 것을 확인하였다.

자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL)과 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)에 히알루로니다제를 처리할 경우, 히알루론산의 분해에 의하여 포집되어 있던 인도시아닌그린이 방출되면서 형광을 나타내게 되어 형광강도가 모두 회복되는 것을 보인다. 따라서 히알루로니다제 존재 여부에 따라 형광강도가 민감하게 달라져서 프로브로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 5. 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤의 동물모델에서의 이미징

모든 동물실험은 KRIBB(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 의 동물보호위원회(Animal Care Committees)에 의해 승인된 실험 과정으로 수행하였다. 80%FBS에 용해된 인도시아닌그린(ICG), 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL) 및 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL) 3종류(각 2㎍)를 마취된 6-7 주령 암컷 BALB/c 마우스 (중앙실험동물, 한국)의 앞발에 각각 피하 주입하였다. 일정기간 반응시킨 후, 앞발의 인도시아닌그린 형광을 인도시아닌그린 필터 셋으로 IVIS　Lumina imaging system(Caliper Life Sciences Lumina II, 미국)을 사용하여 이미징하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 인도시아닌그린(ICG)과 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL)의 경우 강한 형광강도를 보이며 이미징이 되는 것을 확인하였으나, 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)의 경우 형광강도 신호가 보이지 않는 것을 확인하였다. 그러나, 히알루로니다제가 처리된 자가 교차결합 형태 나노하이드로젤(SC-GEL)의 경우, 인도시아닌그린(ICG)이나 자가집합 형태의 나노하이드로젤(SA-GEL)과 마찬가지로 sentinel lymph node가 강하게 형광강도를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 히알루로니다제에 의해서만 구조가 풀리는 나노하이드로젤이라는 것을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 인도시아닌그린(Indocyanine Green: ICG)이 히알루론산 중합체에 접합되어 봉입되어 있고 자가 교차결합(self-crosslinked)된 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 접합은 상기 히알루론산 중합체의 아민기와 상기 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)가 접합하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 인도시아닌그린은 히알루론산 중합체의 1차 아민기 하나당 0.1 ~ 1개로 접합되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 나노하이드로젤의 입자 크기는 50 ~ 1000nm인 것을 특징으로 하는 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤.
   
5. 제1항의 나노하이드로젤을 함유하는 히알루로니다제 활성 진단용 이미징 프로브.
   
6. (a) 히알루론산 중합체의 카르복시기를 아민기로 치환하는 단계;
   (b) 상기 치환된 히알루론산 중합체의 아민기와 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)를 접합시켜 인도시아닌그린이 봉입되어 있는 자가집합체(self-assembled) 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계; 및
   (c) 상기 자가집합체 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤에 교차결합제를 이용하여 자가 교차결합(self-crosslinked)시켜 인도시아닌그린이 봉입된 자가 교차결합 형태의 히알루론산 중합체로 이루어진 나노하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는 나노하이드로젤의 제조방법.
   
7. 제6항 (a)단계에 있어서, 아민기로의 치환은 H2 N -R 1 -NH2 , H2 N -R 2 -OH 및 H2 N -R 3 -CHO(여기서, R 1 , R 2 및 R 3은 각각 독립적으로 C1-10 인 포화탄화수소류, 불포화탄화수소류 또는 방향족 유기기이다)로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 처리하는 것을 특징으로 하는 나노하이드로젤의 제조방법.
   
8. 제6항 (b)단계에 있어서, 히알루론산 중합체의 아민기와 인도시아닌그린의 술포나토부틸기(sulfonatobutyl)를 접합시키는 것은 인도시아닌그린-N-히드록시숙신이미드-에스테르(Indocyanine green-N-hydroxysuccinimide ester: ICG-OSu)를 제6항 (a)단계 후의 용액에 처리하여 접합시키는 것을 특징으로 하는 나노하이드로젤의 제조방법.
   
9. 제6항 (c)단계에 있어서, 교차결합제는 디티오비스 술포숙신이미딜 프로피온산(3, 3'-dithio-bis(sulfosuccinimidylproprionate): DTSSP), 비스엔 숙신이미딜 에틸렌글리콜 에스터(Bis-N-succinimidyl(ethyleneglycol)ester: BS(PEG)n), 디티오비스 숙신이미딜 프로피온산(dithiobis(succinimidyl propionate: DSP)으로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 처리하는 것을 특징으로 하는 나노하이드로젤의 제조방법.
   
10. 제6항 (c)단계에 있어서, 히알루론산 중합체 고분자 1 단위체 당 교차결합제를 0.1 ~ 1몰로 첨가하는 것을 특징으로 하는 나노하이드로젤의 제조방법.
    

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