KR20140056501A - Novel biomarker indicative of inflammatory arthritis and its uses - Google Patents
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Abstract
본 발명은 염증성 관절염의 진단 또는 예후 분석용 키트, 염증성 관절염 마커를 검출하는 방법, 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법, 및 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 염증성 관절염의 진단 및 예후분석; 염증성 관절염치료제의 스크리닝; 및 염증성 관절염 치료를 위하여 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a kit for the diagnosis or prognosis of inflammatory arthritis, a method for detecting an inflammatory arthritis marker, a method for screening a substance for preventing or treating inflammatory arthritis, and a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory arthritis. The present invention relates to the diagnosis and prognosis analysis of inflammatory arthritis; Screening of inflammatory arthritis remedies; And for the treatment of inflammatory arthritis.
Description
본 발명은 염증성 관절염의 진단 또는 예후 분석용 키트, 염증성 관절염 마커를 검출하는 방법, 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법, 및 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a kit for the diagnosis or prognosis of inflammatory arthritis, a method for detecting an inflammatory arthritis marker, a method for screening a substance for preventing or treating inflammatory arthritis, and a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory arthritis.
염증성 관절염은 유전, 환경, 호르몬 등 다양한 요인에 의하여 인체 면역체계에 이상이 발생함으로써 관절에 염증이 생기는 자가면역질환으로서, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 등이 이에 해당된다. 반면, 골관절염등과 같은 퇴행성관절염은 노화, 외상 등으로 인해 발병하는 비염증성 관절염으로 분류되며, 염증성 관절염과는 증상은 물론 발병기전에 있어 확연한 차이가 있다.Inflammatory arthritis is an autoimmune disease that causes inflammation of the joints due to abnormalities in the human immune system due to various factors such as hereditary, environmental, and hormonal factors, including rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, and ankylosing spondylitis. On the other hand, degenerative arthritis such as osteoarthritis is classified as noninflammatory arthritis which is caused by aging and trauma, and there is a marked difference in symptoms as well as symptoms of inflammatory arthritis.
류마티스 관절염(Rheumatis Arthritis, RA)은 우리나라 전체 인구 중 대략 1%가 환자군으로 추정되고 있는 대표적인 만성질환이다. 류마티스 관절염을 일으키는 병인은 세균 감염, 바이러스 감염 등으로 인한 외인성, 또는 제2형 콜라겐, 류마티스 인자, MHC 유전자 중 HLA-DR4 등의 내인성으로 인한 발병 등이 제시되어지고 있지만, 정확한 발병기전은 아직 불분명하다. 류마티스 관절염에 의한 관절의 기능 손실은 개인적으로는 일상생활의 장애와 사회적 노동력 상실, 의료비 지출 증대 등 사회적, 경제적으로 막대한 손실을 끼칠 뿐 아니라, 질병의 진행과정에서 수명의 단축 및 만성 합병증 등의 심각한 문제를 일으킬 수 있다.Rheumatoid Arthritis (RA) is a chronic disease that is estimated to be approximately 1% of the total population in Korea. The pathogenesis of rheumatoid arthritis is presumed to be extrinsic due to bacterial infection, viral infection, or
류마티스 관절염의 치료는 통상 병태의 병상의 진행 과정에 따라 선택해야 할 치료 수단이 상이하다. 일반적으로, 확정 진단이 내려지지 않은 초기에서는 비스테로이드 항염증약(NSAID)을 투여하고, 확정 진단이 내려진 경우는 NSAID에 더하여 질환수식성 류마티스약((Disease-Modifying anti Rheumatic Drug, DMARD)을 투여한다. 특히, RA 발증의 초기에는 확정 진단을 하는 것은 곤란하고, 현재 상황에서는 NSAID를 투여하고, 경과를 신중히 관찰하면서 교원성 질환을 포함하는 기타 류마티스 질환과의 감별을 동시에 행하고 있다. 또한, 증상이 진행된 경우는 스테로이드약의 투여를 행하는 경우도 있고, 동통을 위한 약물요법과 동시에 관절 기능의 유지ㆍ회복에 대해서 이학요법ㆍ재활보조도구요법을 행한다.The treatment of rheumatoid arthritis is usually different from the treatment of choice depending on the course of the illness. Generally, nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are given at the early stage of diagnosis, and Disease-Modifying anti-rheumatic drugs (DMARD) are administered in addition to the NSAID if a definitive diagnosis is made. In particular, it is difficult to make a definite diagnosis at the initial stage of RA onset, and in the current situation, NSAID is administered and the progress is discriminated from other rheumatic diseases including collagen diseases while observing the course carefully. In some cases, a steroid drug is administered. In addition to drug therapy for pain, physical therapy and rehabilitation aids are performed for maintenance and recovery of joint function.
현재, 메토트렉세이트를 포함한 DMARD에 대한 반응이 적절하지 않은 성인의 활동성 류마티스 관절염, 건선성 관절염의 치료를 위하여 TNF 차단제인 엔브렐, 휴미라, 레미캐이드 등의 항체 의약품이 사용되고 있으나, TNF에 저항성을 가지고 있는 환자에게 사용되지 못하는 단점이 있으며, 기회감염이나 림프종의 발생과 같은 심각한 부작용의 소지를 가지고 있어 사용이 제한된다. 따라서, 기전이 다른 염증 경로(pathway) 억제제는 기존에 사용되는 관절염 치료용 항체 의약품을 보완할 수 있어 염증성 관절염의 신규한 치료 타겟이 필요한 실정이다.Currently, antibody drugs such as Enbrel, Humira, and Remicade, TNF blocking agents are used for the treatment of active rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis in adults who do not respond properly to DMARD including methotrexate, but they are resistant to TNF There are disadvantages that can not be used in patients, and there are possibilities of serious side effects such as opportunistic infection or the development of lymphoma, so their use is limited. Therefore, other pathway inhibitors with different mechanisms can complement the existing antihypertensive medicines for treating arthritis, thus requiring a new therapeutic target of inflammatory arthritis.
한편, 현재까지 류마티스 관절염에 대한 진단은 미국 관절염 학회의 진단 기준을 따르고 있으며, 객관적인 지표로서의 류마티스 인자의 존재는 그 양성율이 3개월 이내에서 33%, 12개월 이상에 있어서도 88% 정도일 뿐, 확실하게 진단하는 데는 이르지 못하고 있다. 상술한 류마티스 관절염의 치료방법은 뛰어난 효과에도 불구하고 관절변형이 지속될 수 있고, 약제 부작용으로 적절한 치료가 어려운 경우도 있으며, 신약개발 비용에 따른 약가상승으로 많은 비용이 드는 단점이 있기 때문에 류마티스 관절염의 예후 및 중증도를 신속ㅇ정확하게 진단 및 예측할 수 있는 방법의 개발이 시급한 실정이다.
To date, the diagnosis of rheumatoid arthritis is based on the American College of Rheumatology criteria, and the presence of rheumatoid factor as an objective index is only 33% within 3 months and 88% over 12 months. I have not been able to diagnose it. Although the above-mentioned treatment method for rheumatoid arthritis is capable of continuing the joint deformation despite its excellent effect, it may be difficult to appropriately treat due to the side effect of the drug, and since the drug cost is increased due to the development cost of the new drug, It is imperative to develop a method for quickly and accurately diagnosing and predicting prognosis and severity.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 염증성 관절염의 정확한 진단 및 효과적인 치료를 위한 신규한 타겟을 찾기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 염증성 관절염 환자에서 TL1A (TNF-like ligand 1A)의 발현이 비염증성 관절염 환자에 비하여 현저히 증가되어 있으며, 활막세포에 TL1A를 처리하는 경우 주요한 염증인자인 IL-6의 생성이 현저히 증가됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have sought to find a novel target for accurate diagnosis and effective treatment of inflammatory arthritis. As a result, the expression of TL1A (TNF-like ligand 1A) was significantly increased in inflammatory arthritis patients compared with those of non-inflammatory arthritis, and the production of IL-6, a major inflammatory factor in TL1A treatment, Thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 염증성 관절염의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a kit for the diagnosis or prognosis of inflammatory arthritis.
본 발명의 다른 목적은 염증성 관절염의 진단 또는 예후분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 염증성 관절염 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for detecting inflammatory arthritis markers in order to provide information necessary for diagnosis or prognosis analysis of inflammatory arthritis.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for screening a substance for preventing or treating inflammatory arthritis.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory arthritis.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 TL1A (TNF-like ligand 1A)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩타이드 앱타머를 포함하는 염증성 관절염의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a kit for the diagnosis or prognosis of inflammatory arthritis, which comprises an antibody or a peptide aptamer that specifically binds to TL1A (TNF-like ligand 1A).
본 발명자들은 염증성 관절염의 정확한 진단 및 효과적인 치료를 위한 신규한 타겟을 찾기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 염증성 관절염 환자에서 TL1A (TNF-like ligand 1A)의 발현이 비염증성 관절염 환자에 비하여 현저히 증가되어 있으며, 활막세포에 TL1A를 처리하는 경우 주요한 염증인자인 IL-6의 생성이 현저히 증가됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have sought to find a novel target for accurate diagnosis and effective treatment of inflammatory arthritis. As a result, the expression of TL1A (TNF-like ligand 1A) was significantly increased in inflammatory arthritis patients compared with those of non-inflammatory arthritis, and the production of IL-6, a major inflammatory factor in TL1A treatment, Thereby completing the present invention.
본 발명은 염증성 관절염에서 발현이 특이적으로 증가된 단백질을 동정하여 규명된 신규한 염증성 관절염 마커로서, 상기 질환을 정확하게 진단 및 예후분석 할 수 있는 특징을 가진다.The present invention is a novel inflammatory arthritis marker identified by identification of a protein specifically expressed in inflammatory arthritis, which is capable of accurately diagnosing and prognosing the disease.
본 명세서에서 표현, "염증성 관절염의 진단 또는 예후 분석용 키트"는 염증성 관절염의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현은 "염증성 관절염의 진단 또는 예후 분석용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.As used herein, the expression "kit for the diagnosis or prognosis of inflammatory arthritis" refers to a kit containing a composition for the diagnosis or prognosis analysis of inflammatory arthritis. Therefore, the above expression can be used interchangeably or in combination with "composition for the diagnosis or prognosis analysis of inflammatory arthritis ".
본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 염증성 관절염의 단계 결정 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.As used herein, the term "diagnosing" is intended to include determining the susceptibility of an object to a particular disease or disorder, determining whether an object currently has a particular disease or disorder, Determining the prognosis of an affected entity (e.g., determining the stage of inflammatory arthritis or determining the responsiveness of the disease to treatment), or evaluating therametrics (e.g., to provide information about therapeutic efficacy) And monitoring the status of the object).
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 염증성 관절염은 류마티스 관절염, 건선성 관절염 또는 강직성 척추염이이며, 바람직하게는 류마티스 관절염이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the inflammatory arthritis is rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis or ankylosing spondylitis, preferably rheumatoid arthritis.
본 명세서에서 사용된 용어, "류마티스 관절염"은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 만성 염증성 질환으로서, 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 된다. 관절뿐만 아니라 관절 외 증상으로 빈혈, 건조증후군, 피하 결절, 폐섬유화증, 혈관염, 피부 궤양 등 전신을 침범할 수 있는 질환이다.As used herein, the term "rheumatoid arthritis" is a chronic inflammatory disease of unknown origin characterized by multiple arthritis. Initially, inflammation of the synovial membrane surrounding the joint gradually develops into inflammation of the surrounding cartilage and bones, And deformation. It is a disease that can invade whole body including anemia, dry syndrome, subcutaneous nodule, pulmonary fibrosis, vasculitis and skin ulcer due to joints as well as external joint symptoms.
본 명세서에서 사용된 용어, "건선성 관절염"은 건선증에 관절염이 합병된 질환으로서 손가락의 관절이나 족지의 관절에서 시작되고 관절병변은 다양한 것으로 알려져 있다. 뚜렷한 관절의 골 파괴, 골단의 흡수를 일으키고 파괴성 관절염의 상태를 나타내는 수도 있으며, 이 형에서는 선장(仙腸) 관절염이나 척추염을 수반하기 쉽다.As used herein, the term "psoriatic arthritis" is a disease in which arthritis is associated with psoriasis and is known to originate in the joints of the fingers or in the toes and various joint lesions. It may cause bone destruction of the joints, absorptions of the peaks, and may indicate a state of destructive arthritis. This type of joint may be accompanied by arthritis or spondylitis.
본 명세서에서 사용된 용어, "강직성 척추염(Ankylosing Spondylitis, AS)"은 척추와 천장관절의 골성 강직을 주요 병변으로 하는 염증성 관절염으로서 HLA-B27 유전자가 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 5% 정도는 다른 원인일 가능성이 있다. 장내세균, 클라미디아 등의 감염에 의한 발병이 원인으로 제시되고 있지만, 류마티스 관절염과 마찬가지로 발병 원인이 아직 불분명한 상태이다.As used herein, the term " Ankylosing Spondylitis (AS) "is an inflammatory arthritis with major lesions of the osteoid stiffness of the vertebrae and the cephalad joint, and the HLA-B27 gene is known to play the most important role. There may be other causes. Intestinal bacteria, chlamydia and the like caused by infection, but the cause of rheumatoid arthritis, as well as the cause of the disease is still unclear.
본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 염증성 관절염의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.The inventors of the present invention confirmed that the use of the marker of the present invention can provide high sensitivity and reliability for the incidence of inflammatory arthritis from an individual.
본 명세서에서 사용된 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커"란 염증성 관절염을 정상 상태 또는 비염증성 관절염과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 상태 또는 비염증성 관절염에 비하여 증가된 발현양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 염증성 관절염 진단 마커는 TL1A이다. 이러한 마커는 단백질뿐만 아니라, 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA도 포함한다.As used herein, the term "diagnostic marker, marker for diagnostic or diagnostic marker" refers to a substance capable of distinguishing inflammatory arthritis from steady-state or noninflammatory arthritis, and exhibits an increased expression pattern compared to steady- Organic biomolecules such as visible polypeptides or nucleic acids (e.g., mRNA), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and the like), and the like. For purposes of the present invention, the inflammatory arthritic diagnostic marker is TL1A. Such markers include not only proteins, but also DNA or RNA encoding proteins.
본 발명에서 염증성 관절염 진단에 있어서 사용되는 표현 "단백질 발현수준 측정"은 생물학적 시료에서 상기 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체또는 펩타이드 앱타머를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미하며, 보다 바람직하게는 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA, Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.The expression "measurement of protein expression level" used in the diagnosis of inflammatory arthritis in the present invention is a process for confirming the presence and the degree of expression of the marker protein in a biological sample. Preferably, the antibody specifically binds to the marker protein Or peptide aptamer to identify the amount of the protein. More preferably, the amount of the protein is determined by using an antibody that specifically binds to the marker protein. Methods for analysis include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis (Immunoprecipitation Assay), Complement Fixation Assay (FACS), Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), and Protein Chip, and the like. The method of analysis is not limited.
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 새로운 염증성 관절염 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.In the present invention, "antibody" means a specific protein molecule directed against an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker protein and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies. Since the new inflammatory arthritis marker protein has been identified as described above, the production of the antibody using the novel inflammatory arthritis marker protein can be easily performed using techniques well known in the art.
다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for obtaining serum containing antibodies by injecting the marker protein antigen described above into an animal and collecting it from the animal. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.Monoclonal antibodies can be obtained from the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Jounal of Immunology 6: 511-519) or the phage antibody library (Clackson et al, Nature , 352: 624- 628, 1991; Marks et al . , J. Mol. Biol. , 222: 58, 1-597, 1991). The antibody prepared by the above method can be isolated and purified by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like. In addition, the antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
본 발명에서 TL1A에 결합하는 앱타머는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.In the present invention, the aptamer binding to TL1A is a peptide molecule, and the general contents of aptamers are described in Bock LC et al., Nature 355 (6360): 5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78 (8): 42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95 (24): 142727 (1998).
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 바람직하게는 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the kit of the present invention is a kit for immunoassay, and preferably the immunoassay kit is a luminex assay kit, a protein microarray kit or an ELISA kit.
본 발명의 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.The luminex assay kit, protein microarray kit and ELISA kit of the present invention include a polyclonal antibody and a monoclonal antibody against the marker protein and a secondary antibody against the polyclonal antibody and the monoclonal antibody to which the labeling substance is bound .
본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include essential elements necessary for performing ELISA. ELISA kits contain antibodies specific for the marker protein. An antibody is a monoclonal antibody, polyclonal antibody or recombinant antibody, which has high specificity and affinity for the marker protein and little cross-reactivity to other proteins. In addition, ELISA kits can contain antibodies specific for the control protein. Other ELISA kits can be used to detect antibodies that can bind a reagent capable of detecting the bound antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) Other materials, and the like.
본 발명의 키트는 여러 가지 시료를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 염증성 관절염 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.The kit of the present invention may further include essential elements necessary for performing a protein microarray to simultaneously analyze various samples. Microarray kits contain antibodies specific for the marker protein bound to the solid phase. Protein microarray kits may comprise reagents capable of detecting bound antibodies, such as a labeled secondary antibody, a chromophore, an enzyme (e.g., fused with an antibody) and other substrates capable of binding to the substrate or antibody, . A method of analyzing a sample using a protein microarray is a method of separating a protein from a sample, hybridizing the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, reading the protein, It can provide the information needed to diagnose inflammatory arthritis.
루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간 내에 정량이 가능하여(3-4시간) 기존의 ELISA나 ELISPOT을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이는 96-웰 플레이트에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트(multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두 개의 레이저를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저는 비드를 감지하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서, 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 ㎕ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다. 본 발명의 루미넥스 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스 또는 콜로이드성 금 입자일 수 있다.Luminex Assay is a high-throughput quantitative assay that can simultaneously measure up to 100 different analyte without pretreatment small (10-20 μl) patient samples (Pg unit) and can be quantified in a short time (3-4 hours), which is an analytical method that can replace the existing ELISA or ELISPOT. The Luminex Assay is a multiplexed fluorescent microplate assay capable of simultaneously analyzing over 100 biological samples in each well in a 96-well plate using two types of laser detectors in real time Polystyrene beads of more than 100 different color groups are identified and quantified by progressing signal transduction. Each bead has an antibody attached to the protein to be analyzed, so that the protein can be quantitated by the immunoassay using the antibody. This sample is analyzed using two lasers, one laser detects the bead's unique number and the other laser detects the protein in the sample reacted with the antibody attached to the bead. Therefore, 100 in vivo protein analysis is possible simultaneously in one well. This assay has the advantage of being detectable with as little as 15 μl of sample. Luminex kits capable of carrying out the lumenx assays of the invention include antibodies specific for the marker protein. An antibody is a monoclonal antibody, polyclonal antibody or recombinant antibody, which has high specificity and affinity for the marker protein and little cross-reactivity to other proteins. In addition, luminex kits may contain antibodies specific for the control protein. Other luminex kits may also include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated to antibodies) and other substrates capable of binding to the substrate or antibody . ≪ / RTI > The antibody may be a conjugated antibody conjugated with microparticles, and the microparticles may be colored latex or colloidal gold particles.
본 발명에서는 대조군(예컨대, 비염증성 관절염 환자의 시료)에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 검사대상 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, TL1A 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 염증성 관절염 의심 환자의 실제 염증성 관절염 발병 여부를 진단할 수 있다.In the present invention, it is possible to compare the amount of antigen-antibody complex formed in the control group (for example, a sample of non-inflammatory arthritis patients) and the amount of antigen-antibody complex formed in the subject to be examined and whether or not the expression of TL1A protein is significantly increased It is possible to diagnose the actual inflammatory arthritis of patients with suspected inflammatory arthritis.
본 발명에서 사용된 용어, "항원-항체 복합체"란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며, 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 등이 포함되며, 이로 제한되지 않는다.The term " antigen-antibody complex "as used herein refers to a combination of a marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed can be quantitatively measured through the magnitude of the signal of the detection label. Such detection labels can be selected from the group consisting of enzymes, minerals, ligands, emitters, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited thereto. When an enzyme is used as the detection label, available enzymes include? -Glucuronidase,? -D-glucosidase,? -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholine Glucoamylase, terazo, glucose oxidase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructoketase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphoenolpyruvate decar ≪ / RTI > beta-lactamase, and the like. The minerals include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, picocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyde, fluororescamine and the like. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. Emitters include, but are not limited to, acridinium esters, luciferin, luciferase, and the like. Fine particles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like. Examples of the redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K4 W (CN) 8, [Os (bpy) [RU (bpy) 3] 2+, [MO (CN) 8] 4-, and the like. Radiation isotopes include, but are not limited to, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I and 186Re.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 단백질 발현수준의 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 염증성 관절염의 발병 여부를 확인할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, measurement of protein expression level is by ELISA. ELISAs include direct ELISA using labeled antibodies that recognize the antigen attached to the solid support, indirect ELISA using labeled antibodies that recognize the capture antibody in a complex of antibodies recognizing the antigen attached to the solid support, A direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes an antigen in the complex of antibody and antigen, a method of reacting with another antibody recognizing an antigen in a complex of an antibody and an antigen attached to a solid support, Indirect sandwich ELISA using a secondary antibody, and various ELISA methods. More preferably, the antibody is attached to a solid support, the sample is reacted, and the labeled antibody recognizing the antigen of the antigen-antibody complex is adhered to produce an enzyme, or an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex Is detected by a sandwich ELISA method in which a labeled secondary antibody is attached and the enzyme is developed. Identification of the complex formation of the marker protein and antibody can be used to confirm the onset of inflammatory arthritis.
본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 단백질 발현수준의 측정은 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 마커 단백질의 양을 확인하여 염증성 관절염의 발병 여부를 확인할 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the measurement of the protein expression level is performed using Western blot. The whole protein is separated from the sample, and the protein is separated according to the size by electrophoresis, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the marker protein can be confirmed by confirming the amount of the generated antigen-antibody complex using the labeled antibody, thereby confirming the onset of inflammatory arthritis.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 단백질 발현수준의 측정은 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 검사대상 조직 및 대조군 조직(예컨대, 비염증성 관절염 환자 유래 조직)을 채취 및 고정한 후 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.According to another preferred embodiment of the present invention, measurement of protein expression level is performed by immunohistochemical staining. After collecting and fixing the tissue to be examined and the control tissue (for example, tissue derived from non-inflammatory arthritis patients), paraffin-embedded blocks are prepared by methods well known in the art. These are cut into pieces of several μm thick and attached to a glass slide, and then reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. Thereafter, the unreacted antibody is washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels, and the labeling of the antibody is read on a microscope.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 단백질 발현수준의 측정은 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용한 분석방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화 시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 염증성 관절염의 발병 여부를 확인할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the measurement of the protein expression level is performed using a protein chip. An analysis method using a protein chip is a method of separating a protein from a sample, hybridizing the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, and detecting the presence or the expression level of the protein to determine whether inflammatory arthritis .
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨이고, 바람직하게는 혈액, 혈청, 활막조직, 활막액 또는 활막세포이며, 보다 바람직하게는 활막액이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the biological sample is tissue, cell, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine, preferably blood, serum, synovial tissue, synovial fluid or synovium It is synovial fluid.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 염증성 관절염의 진단 또는 예후분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 TL1A (TNF-like ligand 1A) 단백질의 발현을 검출하는 방법을 통해 염증성 관절염 마커를 검출하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting the expression of TL1A (TNF-like ligand 1A) protein in a human biological sample to provide information necessary for diagnosis or prognosis analysis of inflammatory arthritis, A method for detecting a marker is provided.
염증성 관절염 마커를 검출하는 본 발명의 방법은 인간으로부터 채취한 생물학적 시료로부터 마커 단백질의 발현수준을 측정하고, 측정된 발현수준을 대조군 시료의 발현수준과 비교하는 방법으로 수행된다.The method of the present invention for detecting inflammatory arthritis markers is performed by measuring the expression level of the marker protein from a biological sample taken from a human and comparing the measured expression level with the expression level of the control sample.
본 발명의 염증성 관절염 마커를 검출하는 방법을 염증성 관절염 환자의 생물학적 시료를 가지고 수행하는 경우, 시료를 채취한 환자의 염증성 관절염 예후를 판단할 수 있게 된다.When the method of detecting the inflammatory arthritic markers of the present invention is carried out with a biological sample of an inflammatory arthritis patient, it is possible to determine the prognosis of inflammatory arthritis in a patient sample.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 대조군 시료란 염증성 관절염이 발병하지 않은 인간으로부터 채취한 생물학적 시료 또는 비염증성 관절염 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 포함한다. 대조군 시료에서의 마커 단백질의 발현량과 검사대상 시료에서의 마커 단백질의 발현량을 비교하여 대조군 시료보다 발현수준이 증가된 경우, 염증성 관절염으로 진단할 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the control sample includes a biological sample collected from a human who has not developed inflammatory arthritis or a biological sample collected from a patient with non-inflammatory arthritis. When the expression level of the marker protein in the control sample is compared with the expression level of the marker protein in the test sample and the expression level is higher than that of the control sample, inflammatory arthritis can be diagnosed.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a substance for the prophylactic or therapeutic treatment of inflammatory arthritis comprising the steps of:
(a) TL1A (TNF-like ligand 1A) 단백질을 발현하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및(a) contacting a sample to be analyzed with a cell or tissue expressing a TL1A (TNF-like ligand 1A) protein; And
(b) 상기 TL1A 단백질의 발현량을 측정하는 단계로서, TL1A의 고발현을 감소시키는 경우에 시료를 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 물질로 판정한다.(b) measuring the expression level of the TL1A protein, wherein the sample is judged to be a substance for the prophylaxis or treatment of inflammatory arthritis when the expression of TL1A is reduced.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 마커 단백질을 발현하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다.According to the method of the present invention, a cell or tissue expressing the marker protein of the present invention is first brought into contact with a sample to be analyzed.
바람직하게는, 본 발명의 마커 단백질을 발현하는 세포는 활막세포이며, 조직은 활막조직이다.Preferably, the cell expressing the marker protein of the present invention is a synovial cell, and the tissue is a synovial tissue.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어, "시료"는 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 항체, 펩타이드, 소분자 물질 및 앱타머를 포함하며, 바람직하게는 항체이다.The term "sample" used in reference to the screening method of the present invention means an unknown substance used in screening to check whether the expression level of the marker of the present invention is affected. The sample includes a chemical substance, an antibody, a peptide, a small molecule substance, and an aptamer, and is preferably an antibody.
이어, 시료가 처리된 세포에서 본 발명의 마커의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과 본 발명의 마커 단백질의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, TL1A 처리에 따라 염증성 사이토카인의 생성이 현저히 증가하므로 TL1A의 고발현을 억제하는 물질을 염증성 관절염의 예방 및 치료제로서 사용할 수 있는 것이다.
Next, the expression level of the marker of the present invention is measured in the sample-treated cells. Measurement of the expression level can be carried out as described above. When the result of measurement shows that the high-specificity of the marker protein of the present invention is inhibited, the sample can be judged to be a substance for preventing or treating inflammatory arthritis. As demonstrated in the following examples, the production of inflammatory cytokines is markedly increased by treatment with TL1A, so that a substance that inhibits high expression of TL1A can be used as a prophylactic and therapeutic agent for inflammatory arthritis.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (i) TL1A (TNF-like ligand 1A) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 앱타머, 화합물 및 DcR3 (Decoy Receptor 3)로 구성된 군으로부터 선택된 TL1A 활성 억제제, 또는 (ii) TL1A 단백질 코딩 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 핵산 앱타머, siRNA (small interference RNA) 및 shRNA (short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 TL1A 발현 억제제의 약제학적 유효량; 및According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for the treatment of a disease comprising: (a) a population consisting of (i) an antibody, a peptide aptamer, a compound and DcR3 (Decoy Receptor 3) specifically binding to a TL1A (Ii) a TL1A expression inhibitor selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, nucleic acid aptamers, small interference RNA (siRNA) and shRNA (short hairpin RNA) comprising a sequence complementary to a TL1A protein coding nucleotide ≪ / RTI > And
(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.(b) a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of inflammatory arthritis comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명에서 이용되는 TL1A 활성 억제제인 DcR3는 TNFRSF6B 유전자에 의해 코딩되는 수용성 수용체로서 TL1A와 결합하여 TL1A를 중화시키는 역할을 한다.The TL1A activity inhibitor used in the present invention, DcR3, is a water-soluble receptor encoded by the TNFRSF6B gene and binds to TL1A to neutralize TL1A.
본 발명에서 이용되는 TL1A 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 핵산 앱타머, siRNA 및 shRNA를 포함한다.The TL1A expression inhibitor used in the present invention includes antisense oligonucleotides, nucleic acid aptamers, siRNA and shRNA.
본 명세서에서 사용된 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 TL1A mRNA에 상보적이고 TL1A mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, TL1A mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.As used herein, the term "antisense oligonucleotide" refers to DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, and refers to a complementary sequence in mRNA, It acts to inhibit translation. Antisense sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to TL1A mRNA and capable of binding to TL1A mRNA and has an essential activity for TL1A mRNA translation, translocation into the cytoplasm, maturation, or any other overall biological function . ≪ / RTI > The length of the antisense nucleic acid is 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases.
본 명세서에서 사용된 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다. 본 발명의 siRNA 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다.As used herein, the term "siRNA" refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99 / 07409 and WO 00/44914). Since siRNA can inhibit the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knockdown method or as a gene therapy method. The siRNA molecule of the present invention may have a structure in which the sense strand and the antisense strand are located on opposite sides to form a double strand. Also, according to another embodiment, the siRNA molecules of the invention may have a single stranded structure with self-complementary sense and antisense strands. The siRNA is not limited to a complete pair of double-stranded RNA portions that are paired with each other, but is paired by a mismatch (the corresponding base is not complementary), a bulge (no base corresponding to one chain) May be included. The total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, more preferably 20 to 70 bases. SiRNA molecules of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence (e.g., about 5-15 nt) is inserted between the self-complementary sense and antisense strands, in which case the siRNA molecule formed by the expression of the nucleotide sequence The hairpin structure is formed by hybridization, and the stem-and-loop structure as a whole is formed.
본 명세서에서 사용된 용어, "shRNA"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.As used herein, the term "shRNA" refers to a short hairpin RNA in which the sense and antisense sequences of the siRNA target sequence are located between loops of 5-9 bases. shRNA is used to overcome the disadvantages of high cost biosynthesis cost of siRNA, short time maintenance of RNA interference effect due to low cell transfection efficiency, and the like by using adenovirus, lentivirus and plasmid expression vector system from RNA polymerase III promoter It is widely known that siRNA is converted into an siRNA having a correct structure by siRNA processing enzyme (Dicer or Rnase III) present in the cell to induce silencing of the target gene.
본 명세서에서 사용된 용어, "약제학적 유효량"은 본 발명의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to achieve efficacy or activity of the activity inhibitor or expression inhibitor of the present invention.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally. In the case of parenteral administration, the pharmaceutical composition may be administered by intravenous infusion, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, have.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . The oral dosage amount of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.0001-1000 mg / kg (body weight) per day.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(i) 본 발명은 염증성 관절염에 대한 신규한 분자 마커 및 이의 용도(키트, 마커 검출 방법, 스크리닝 방법 및 약제학적 조성물)를 제공한다.(i) The present invention provides novel molecular markers for inflammatory arthritis and uses thereof (kits, marker detection methods, screening methods and pharmaceutical compositions).
(ii) 본 발명의 마커 TL1A는 류마티스 관절염과 같은 염증성 관절염 환자에게서 발현이 증가되어 있으며, 발현이 증가된 TL1A에 의하여 염증성 사이토카인의 생성이 증가되어 염증성 관절염의 발병, 진행 및 악화가 일어난다.(ii) The marker TL1A of the present invention has an increased expression in patients with inflammatory arthritis such as rheumatoid arthritis, and the expression of TL1A increases the production of inflammatory cytokines, resulting in the development, progression and worsening of inflammatory arthritis.
(iii) 본 발명의 TL1A 전달경로 차단물질은 종양궤사인자 분비 이전 경로를 차단하여 종양궤사인자 억제제(예컨대, 엔브렐)에서 나타나는 감염이나 악성종양과 같은 부작용의 가능성을 줄일 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 새로운 경로 차단을 통하여 기존의 종양궤사인자 억제제에 반응을 보이지 않은 환자의 치료를 위하여 사용될 수 있고, 종양궤사인자 억제제와의 병합요법 시 상승효과도 기대할 수 있다.(iii) The TL1A delivery pathway blocking agent of the present invention is expected to block the pathway prior to tumor angiogenic factor secretion, thereby reducing the likelihood of side effects such as infection or malignant tumors appearing in a tumor angiogenesis inhibitor (e.g., Enbrel). In addition, the new pathway can be used for the treatment of patients who have not responded to existing tumor angiogenesis inhibitors, and a synergistic effect can be expected in the combination therapy with tumor angiogenesis inhibitors.
(iv) 따라서, 본 발명은 염증성 관절염의 진단 및 예후분석; 염증성 관절염치료제의 스크리닝; 및 염증성 관절염 치료를 위하여 유용하게 이용될 수 있다.
(iv) Thus, the present invention provides a diagnostic and prognostic analysis of inflammatory arthritis; Screening of inflammatory arthritis remedies; And for the treatment of inflammatory arthritis.
도 1은 류마티스 관절염 환자(a) 및 퇴행성 관절염 환자(b)의 활막조직에서의 TL1A의 발현수준을 보여주는 면역화학염색 결과 사진이다.
도 2는 류마티스 관절염 환자(a) 및 퇴행성 관절염 환자(b)의 혈청(serum) 및 활막액(SF)에서 측정된 TL1A의 발현수준을 보여주는 그래프이다.
도 3은 TL1A 처리된 류마티스 관절염 활막세포에서 생성된 IL-6의 양을 보여주는 그래프이다.1 is a photograph of immunochemical staining showing the level of TL1A expression in synovial tissues of rheumatoid arthritis patient (a) and degenerative arthritis patient (b).
Figure 2 is a graph showing the levels of TL1A expression measured in serum and synovial fluid (SF) of rheumatoid arthritis patient (a) and degenerative arthritis patient (b).
Figure 3 is a graph showing the amount of IL-6 produced in TL1A-treated rheumatoid arthritis synovial cells.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실시예 1. 염증성 관절염과 비염증성 관절염의 활막조직에서 TL1A의 발현수준 비교Example 1. Comparison of TL1A expression levels in synovial tissues of inflammatory arthritis and noninflammatory arthritis
본 발명자들은 대표적인 염증성 관절염인 류마티스 관절염과 대표적인 비염증성 관절염인 퇴행성 관절염 환자의 활막조직에서 TL1A의 발현 차이가 있는지 여부를 확인하기 위하여 면역화학염색을 실시하였다. 면역화학염색은 Abcam(미국) 시약을 사용하여 제조사의 지시에 따라 실시하였다. 실험결과는 도 1에 나타내었다.The present inventors performed immunochemical staining to determine whether there is a difference in expression of TL1A in a synovial tissue of a representative inflammatory arthritis, ie, rheumatoid arthritis and a representative non-inflammatory arthritis, ie, degenerative arthritis patients. Immunochemical staining was performed using Abcam (USA) reagent according to the manufacturer's instructions. The experimental results are shown in Fig.
도 1에 나타난 바와 같이, 퇴행성 관절염 환자의 활막 증식부위에 비하여 류마티스 관절염 환자의 활막 증식부위에서 TL1A의 발현이 현저하게 증가되어 있었다(도 1).
As shown in Fig. 1, the expression of TL1A was significantly increased in synovial proliferation sites in patients with rheumatoid arthritis, compared with synovial growth sites in patients with degenerative arthritis (Fig. 1).
실시예 2. 류마티스 관절염 환자의 혈액 및 활막액에서의 TL1A의 발현수준 분석Example 2. Analysis of TL1A expression level in blood and synovial fluid of rheumatoid arthritis patients
37명의 류마티스 관절염 환자와 27명의 퇴행성 관절염 환자에게서 혈청과 활막액을 동시에 채취하고, 발현된 TL1A의 양을 ELISA 방법으로 정량하였다. 혈청 및 활막액의 TL1A 측정은 Peprotech(영국)에서 구입한 1차 및 2차 항-TL1A 항체를 사용하여 실시하였다. 각 샘플의 값은 세 번의 단계 희석을 통하여 얻은 표준 곡선을 이용하여 구하였다. 실험결과는 도 2에 나타내었다.Serum and synovial fluid were sampled simultaneously in 37 patients with rheumatoid arthritis and 27 patients with degenerative arthritis, and the amount of TL1A expressed was quantitated by ELISA. TL1A assays for serum and synovial fluid were performed using primary and secondary anti-TL1A antibodies purchased from Peprotech (UK). The values of each sample were determined using a standard curve obtained through three step dilutions. The experimental results are shown in Fig.
도 2에 나타난 바와 같이, 염증성 관절염인 류마티스 관절염 환자의 TLIA 단백질의 양은 비염증성 관절염인 퇴행성 관절염 환자에 비하여, 혈청에서는 약 3배, 활막액에서는 약 4-5배 증가되어 있었다. 또한, 혈청보다는 활막액에서 TL1A 단백질의 발현이 증가되어 있었다(도 2).
As shown in FIG. 2, the amount of TLIA protein in patients with inflammatory arthritis, rheumatoid arthritis, was increased by about 3-fold in sera and 4-5-fold in synovial fluid compared with patients with degenerative arthritis, which is a non-inflammatory arthritis. In addition, TL1A protein expression was increased in synovial fluid rather than in serum (Fig. 2).
실시예 3. TL1A에 의한 활막세포에서의 염증반응 유도 확인Example 3: TL1A induced induction of inflammatory response in synovial cells
실제 염증성 관절염 환자의 활막 내에서 TL1A와 연관되는 염증성 사이토카인의 변화를 살펴보기 위하여 류마티스 관절염 활막세포(RA-FLS)에 TL1A 자극을 농도별(0, 40, 200 ng/㎖)로 24, 48 및 72시간 동안 처리한 다음 세포배양 상층액을 얻어 IL-6의 양을 측정하였다. Pro-inflammatory 사이토카인의 측정은 milliplex human cytokine magnetic bead panel; HCYTOMAG-60K (Millipore Corp., 미국)를 이용하여 실시하였다. 검사 방법은 키트 제조회사의 검사법을 준수하여 시행하였으며, 모든 시료는 희석하지 않고 수행하였고, 모든 과정은 빛이 차단된 실온 상태에서 시행하였다. 반응 결과는 Luminex 200 시스템을 통하여 측정하였고, 이 측정값 MFI (Median Fluorescent Intensity)는 MasterPlex QT™ software programs (MiraiBio, 캐나다)으로 각 사이토카인별 최적의 표준곡선을 구한 다음 이를 기준으로 측정 시료들의 농도를 계산하였다. 실험결과는 도 3에 나타내었다.To investigate the changes of TL1A-associated inflammatory cytokines in the synovial membrane of patients with true inflammatory arthritis, TL1A stimulation was induced in rheumatoid arthritis synoviocytes (RA-FLS) at concentrations of 0, 40, 200 ng / And 72 hours, and the amount of IL-6 was measured by obtaining a cell culture supernatant. Pro-inflammatory cytokines were measured using the milliplex human cytokine magnetic bead panel; HCYTOMAG-60K (Millipore Corp., USA). The test method was carried out in compliance with the test method of the kit manufacturer. All the samples were performed without dilution, and all the procedures were performed at room temperature where light was blocked. The reaction results were measured using a Luminex 200 system. Median Fluorescent Intensity (MFI) was calculated using the MasterPlex QT ™ software programs (MiraiBio, Canada) and the optimal standard curve for each cytokine was determined. Respectively. The experimental results are shown in Fig.
도 3에 나타난 바와 같이, 류마티스 관절염 활막세포에서 TL1A의 처리 농도에 비례하여 IL-6의 생성이 증가되었다(도 3). 이러한 결과는, TL1A가 류마티스 관절염을 비롯한 염증성 관절염의 진단 및 치료적 타겟임을 나타낸다.
As shown in FIG. 3, IL-6 production was increased in proportion to the treatment concentration of TL1A in rheumatoid arthritis synoviocytes (FIG. 3). These results indicate that TL1A is a diagnostic and therapeutic target for inflammatory arthritis, including rheumatoid arthritis.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (9)
A kit for the diagnosis or prognosis of inflammatory arthritis, comprising an antibody or a peptide aptamer that specifically binds to TL1A (TNF-like ligand 1A).
The kit according to claim 1, wherein the kit is an immunoassay kit.
3. The kit according to claim 2, wherein the immunoassay kit is a luminex assay kit, a protein microarray or an ELISA kit.
The kit according to claim 1, wherein the inflammatory arthritis is rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis or ankylosing spondylitis.
A method of detecting an inflammatory arthritis marker by detecting the expression of a TL1A (TNF-like ligand 1A) protein in a biological sample of a human to provide information necessary for diagnosis or prognosis analysis of inflammatory arthritis.
6. The method of claim 5, wherein the biological sample is blood, serum, synovial tissue, synovial fluid, or synovial cell.
(a) TL1A (TNF-like ligand 1A) 단백질을 발현하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 TL1A 단백질의 발현량을 측정하는 단계로서, TL1A의 고발현을 감소시키는 경우에 시료를 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 물질로 판정한다.
A method for screening a substance for the prophylactic or therapeutic treatment of inflammatory arthritis comprising the steps of:
(a) contacting a sample to be analyzed with a cell or tissue expressing a TL1A (TNF-like ligand 1A) protein; And
(b) measuring the expression level of the TL1A protein, wherein the sample is judged to be a substance for the prophylaxis or treatment of inflammatory arthritis when the expression of TL1A is reduced.
8. The method according to claim 7, wherein the cells are synovial cells, and the tissue is a synovial tissue.
(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증성 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.(a) a TL1A activity inhibitor selected from the group consisting of (i) an antibody, a peptide aptamer, a compound and DcR3 (Decoy Receptor 3) that specifically binds to a TL1A (TNF-like ligand 1A) A pharmaceutically effective amount of a TL1A expression inhibitor selected from the group consisting of an antisense oligonucleotide comprising a sequence complementary to a coding nucleotide, a nucleic acid aptamer, a small interference RNA (siRNA) and a shRNA (short hairpin RNA); And
(b) a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of inflammatory arthritis comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20121026 |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20171026 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20121026 Comment text: Patent Application |
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20190211 Patent event code: PE09021S01D |
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| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20190418 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20190211 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |