KR20130130674A - 신규 면역아쥬반트 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역아쥬반트로서 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸 화합물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 신규 아쥬반트 화합물은 특히 신규 계열의 수지상 세포 활성화 분자를 나타낸다.

Description

신규 면역아쥬반트 화합물 및 이의 용도{NOVEL IMMUNOADJUVANT COMPOUNDS AND USES THEREOF}

본 발명은 면역아쥬반트로서 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸 화합물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

안전하고 효과적인 백신의 개발은 세계적 공중 위생의 중요한 목표로 남아 있다.

대부분의 현 백신은 2개의 주성분: (i) 치료 관심의 표적 항원 및 (ii) 상기 항원에 대항하는 면역원성을 자극 및/또는 유도하는 면역아쥬반트(들)로 구성된다.

공지된 면역아쥬반트의 특성은 매우 다양하나, 특히 광유, 박테리아 추출물, 살아있고 약독화된 유기체 및 수산화알루미늄 금속의 현탁액이 포함된다.

면역아쥬반트가 향상된 면역 반응을 제공하더라도, 이들의 사용은 특히 이들의 투여된 경로의 작용인 부작용을 도출할 수도 있다. 따라서, 인간에서 승인되고 효과적인 면역아쥬반트의 수는 비교적 제한적이다. 이에 따라, 내독성 부작용과 같은 부작용을 유발하지 않으면서 면역아쥬반트로서 사용될 수 있는 신규 화합물에 대한 요구가 있다.

박테리아 감염에 대한 면역 반응은 선천적 및 후천적 면역계 모두의 조합된 작용에 따른다. 수지상 세포(DC)는 가장 효율적인 전문적인 항원-제시 세포(antigen-presenting cell) APC이며, 이는 면역 반응의 개시 및 조절에 중요한 역할을 한다. DC는 침입 박테리아 및 바이러스와 같은 항원을 검출하고, 포획하고 프로세싱하며, 말초 조직에서 일차 T 세포 반응을 도출하는 이차 림프구 기관으로 이동시키는 능력을 갖는 중요한 감시병이다. 미생물적 자극에 노출될 때, DC는 MHC-펩티드 복합체의 형성 증가, 공-자극 분자들(CD86, CD40 및 CD80)의 상향조절 및 사이토카인 생성을 특징으로 하는 성숙 과정을 겪는다. 게다가, DC 성숙 과정의 다른 특징은 지역적 림프절(CCR7) 내로의 이동을 용이하게 하는 케모카인 수용체의 유도 및 T 세포를 활성화시키는 능력 증가이다.

DC는 고도로 보존된 수용체 패턴-인지 수용체(PRR)에 의해 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)라고도 불리우는 미생물 자극을 인지한다. PRR의 가장 잘 알려지고 특징화된 계열은 Toll-유사 수용체(TLR) 및 C-유형 렉틴 수용체(CLR)이다. 예를 들어, 지단백질 및 펩티도글리칸은 TLR2에 의해, dsRNA는 TLR3에 의해, LPS는 TLR4에 의해, CpG는 TLR9에 의해, 플라겔린은 TLR5에 의해, ssRNA는 TLR7/8에 의해, CpG는 TLR9에 의해, 만노오스-함유 분자는 DC-SIGN에 의해, 그리고 선형 β-글루칸은 Dectin-1에 의해 인지된다. 상기 수용체가 유발되는 경우, 다운스트림 신호 캐스캐이드는 염증 반응 유도에 대해 활성화된다. TLR 관여 후 활성화되는 신호화 경로는 MyD88의 모집 등에 따라 달라질 수 있다. TLR3 및 TLR4에 독특한 MyD88-의존성 경로는 인터페론 조절 인자 3의 발현을 야기하는 반면, TLR3 외의 모든 TLR 상에 존재하는 MyD88-의존성 신호화 경로는 결국 이들의 생물학적 효과를 발휘하는 MAPK 및 NF-κB 유도에 집중된다.

삼투조절 주변세포질 글루칸(OPG)은 그람-음성 박테리아 외피의 주변세포질 공간의 일반적인 구성성분이다(22). 이들은 시험된 모든 프로테오박테리아에서 발견되었다. OPG는 다양한 종에서 꽤 상이한 구조를 나타내나, 이들은 여러 공통의 특징을 공유한다: (i) 이들은 제한된 수의 단위(5 내지 24개)로 만들어진 올리고당이고; (ii) D-글루코오스가 유일한 구성 당이고; (iii) 글루코오스 단위는 적어도 부분적으로 β-글리코시드 결합에 의해 연결되고; (iv) 주변세포질 내 글루칸 농도는 주변환경 삼투압의 감소에 반응하여 증가한다. OPG 합성 결핍 돌연변이가 고도의 다면발현성 표현형을 나타내기 때문에, OPG는 중요한 생물학적 기능을 가진 것으로 여겨진다(예, 주화성, 운동성, 감소된 외부 막 안정성 및 엑소다당류의 합성 뿐만 아니라 저삼투 배지에서의 결핍 성장)(22). 게다가, 이들은 진핵 숙주와의 성공적인 병원체성 또는 공생성 연합을 달성하는 것이 불가능하다(1).

브루셀라(Brucella)는 인간을 비롯한 포유류의 허용적 세포 내 병원균으로서 간주되는 α-프로테오박테리아이다. 브루셀라증(brucellosis)이라고 불리는 산출된 동물원성감염증(zoonosis)의 발병은 대부분, 전문적인 및 비-전문적인 식세포 숙주 세포 모두에서, 브루셀라가 생존하고 세포내에서 복제하는 능력과 연관된다. 브루셀라 종에서, 시클릭 베타 글루칸(CβG)은 17 내지 25 범위의 중합도를 가진 시클릭 백본으로 이루어지는데, 모든 글루코오스 단위는 β-1,2 연결(브루셀라 CβG)에 의해 연결된다(2). 시클릭 글루칸의 존재가 완전한 B. 아보르투스(B. abortus) 병독성에 필요하다는 것이 개시되어 있다(1). 게다가, Arellano-Reynoso 등(3)은 지질 마이크로도메인 조직을 조절하는 브루셀라 CβG가 라이소좀 융합을 방해하여 브루셀라가 증식 틈새에 도달하게 하는데 필수적이었다는 것을 밝혔다. CβG는 박테리아 건조 중량의 1-5%에 이르는 다량으로 발현된다(ref). 따라서, 단일 박테리아의 내용물이 브루셀라-함유 액포 내로 방출되는 경우를 고려하면, 이의 부피는 약 10 펨토리터이고, 액포 내의 CβG의 농도는 mM 범위일 것이다. 이것은 수천 개의 박테리아가 세포사멸 세포 죽음으로부터 방출되는 경우, 외부 매질에서 방출된 CβG가 μM 범위로 추정될 수 있고 이것이 면역계에서 일부 중요한 결과를 가질 수 있다는 것을 의미한다.

숙주-병원균 상호작용에 관여하는 중요한 PAMP로서 글루칸, 특히 선형 베타 글루칸의 역할(4, 5)은 광범위하게 개시되어 있다. 놀랍게도, 선형 (1---3) β-글루칸은 이들이 항종양(6) 및 박테리아(7), 바이러스(8), 진균류(9) 및 원생동물(10) 감염에 대항하는 항-감염 특성을 소유하는 것으로 제시되었기 때문에, 이들의 면역조절 특성에 대해 인지된다. 그러나 지금까지 면역계 조절제로서 시클릭 β-글루칸의 특성에 대한 보고는 없다.

본 출원인은 본원 실시예에 예시된 바와 같이 브루셀라 시클릭 베타 글루칸(CβG)이 면역아쥬반트 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다.

또한, 상기 신규 아쥬반트 화합물이 특히 신규 계열의 수지상 세포 활성화 분자를 나타낸다는 것이 본 발명에 따라 제시된다. 본 출원인은 최초로 브루셀라 CβG가 수지상 세포 성숙, 전-염증성 사이토카인 분비 및 CD4 및 CD8 T 세포 모두의 활성화 및 증식을 유도할 수 있으므로, 마우스 및 인간 DC의 강력한 활성화제 및 TLR4 아고니스트인 것을 입증하였다.

따라서, 본 발명의 상기 신규 시클릭 베타 글루칸 화합물은 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키기 위한 면역아쥬반트로서 특히 유용하다.

따라서, 본 발명은 하나 이상의 시클릭 베타 글루칸 화합물을 포함하는 면역아쥬반트 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 면역아쥬반트 화합물, 하나 이상의 항원, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (특히 아쥬반트 활성을 유도 및/또는 향상시키기 위한) 약제로서 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 면역아쥬반트 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 특히 하나 이상의 항원에 대항하여 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키기 위한 백신 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 면역아쥬반트 화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 예를 들어, 병원균에 대항하여 보호적 면역 반응을 유도하거나, 또는 감염에 대항하여 대상체 또는 동물을 효과적으로 보호하기 위한 동시적, 개별적 또는 연속적 사용을 위한 조합 제제로서, 하기를 함유하는 키트에 관한 것이다:

- 본 발명에 따른 면역아쥬반트 화합물,

- 하나 이상의 항원.

본 발명의 추가의 주제는 필요로 하는 대상체에서 수지상 세포(DC)의 성숙을 유도하기 위한 치료 방법에 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 추가의 주제는 면역아쥬반트로서 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸 화합물에 관한 것으로서, 상기 화합물은 필요로 하는 대상체에서 수지상 세포(DC)의 성숙을 유도하기 위해 사용된다.

본 출원인은 인간 및 마우스 DC 모두에서 사이토카인의 생성, MHC-II 및 동시-자극성 분자의 표면 발현, 유전자 발현, 독성 및 항체 반응에 있어, DC 성숙에 대한 브루셀라 시클릭 베타 글루칸(CβG) 및 기타 시클릭 글루칸들의 영향을 연구하였다. 본 출원인은 브루셀라 CβG가 마우스 및 인간 DC의 강력한 활성화제라는 것을 입증하였다. 게다가, 상이한 구조를 갖는 시클릭 글루칸은 동일한 활성화 반응을 유도하지 않으며, 이는 상이한 구조를 갖는 CβG는 상이한 활성화 특성을 가질 수 있다는 것을 보여준다. 본 출원인은 또한 CβG가 신규 계열의 TLR4 아고니스트를 나타낸다는 것을 입증하였다. 게다가 상기 시클릭 베타 글루칸이 생체 내 전-염증성 효과를 가진 TLR4-매개 아쥬반트 특성을 갖지만, 전신적 주사 후에 임의의 유의한 전신적 내독성 부작용을 보이지 않는다는 것을 입증하였다. 본원의 실시예에 기재된 결과는 상기 시클릭 베타 글루칸이 유의적인 고유의 항원 효과를 보이지 않는다는 점, 즉 관심대상의 분자는 시클릭 베타 글루칸 항체를 특히 혈청 내로 유발하는 잠재력을 방지하거나 약화시킨다는 점을 보여준다. 따라서, 본 출원인은 CβG가 차세대 계열의 면역아쥬반트를 나타낼 수 있을 것임을 입증한다.

따라서, 본 발명의 제 1 양상은 하나 이상의 시클릭 베타 글루칸(CβG) 화합물을 포함하는 면역아쥬반트 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 면역아쥬반트로서 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸 화합물에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "면역아쥬반트"는 대상체 또는 동물에 투여되는 경우 항원에 대항하는 면역 반응을 유도 및/또는 향상시킬 수 있는 화합물을 말한다. 또한, 일반적으로 특이적 항원에 대한 특이적 면역 반응의 품질을 가속화시키고, 연장시키고 또는 향상시키는 작용을 하는 성분을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "면역아쥬반트"는 선천적 면역 반응의 일시적 반응에 영향을 줌으로써 선천적 면역 반응 및 항원-제시 세포(APC), 특히 수지상 세포(DC)의 활성화 및 성숙에 의해 후천적 면역 반응의 더욱 연장된 효과 모두를 향상시키는 화합물을 의미한다.

따라서, 본 발명의 추가 목적은 필요로 하는 대상체에서 수지상 세포(DC)의 성숙을 유도하기 위한 치료 방법에 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 추가 목적은 면역아쥬반트로서 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸 화합물에 관한 것으로서, 상기 화합물은 필요로 하는 대상체에서 수지상 세포(DC)의 성숙을 유도하기 위해 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "항원"은 항체에 의해 또는 MHC 분자에 의해 프로세싱되고 제시되는 경우 T 세포 수용체(TCR)에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 말한다. 본원에서 사용되는 용어 "항원"은 또한 T-세포 에피토프를 포함한다. 항원은 부가적으로는 면역계에 의해 인지될 수 있는 및/또는 B- 및/또는 T-림프구의 활성화를 야기하는 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프 또는 항원 부위(B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "시클릭 베타 글루칸 화합물" 또는 "CβG 화합물"은 베타-(1,2) 글리코시드 결합에 의해 단독으로 연결된 17 내지 25개의 헥소오스 잔기를 포함하는 시클릭 백본을 갖는 저-분자량 세포 표면 탄수화물을 말한다. 헥소오스 잔기는 자연 발생적 헥소오스 단위 및 비-자연 발생적 헥소오스, 헥소오스 유사체 및 모방체가 도입된 구조적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 어떤 구조가 기능적으로 동등한 헥소오스 유사체 및 헥소오스 모방체를 구성하는지를 알고 있거나 또는 결정할 수 있다. 바람직하게는, 자연 발생적 헥소오스 단위는 알로오스, 알트로오스, 갈락토오스, 글루코오스, 굴로스, 이도오스, 만노오스 및 탈로오스와 같은 시클릭 구조를 형성할 수 있는 알도헥소오스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 자연 발생적 헥소오스 단위는 글루코오스이다.

일부 구현예에서, 다양한 분자는 헥소오스 단위 상에 위치한 자유 히드록실기를 사용하여 공유적으로 및/또는 분자를 허용하는 약 10Å의 틈새를 나타내는 도넛-유사 고리의 형태에 의해 만들어진 전하 상호작용에 의해 비-공유적으로, 본 발명의 시클릭 베타 글루칸 화합물에 부착될 수 있다(11). 분자는 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산 또는 지질(예컨대 콜레스테롤)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 헥소오스 잔기는 하나 이상의 천연 치환 잔기로 치환될 수 있다. 용어 "천연 치환 잔기"는 숙시닐(Suc) 잔기(예컨대, 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) CβG 및 시노리조븀 멜리토티(Sinorhizobium melitoti) CβG), 포스포글리세롤 잔기(P-Gro)(예컨대 E. 콜라이(E. coli) CβG 및 시노리조븀 멜리토티(Sinorhizobium melitoti) CβG); 포스포에탄올아민(P-Etn) 잔기(예컨대 E. 콜라이(E. coli) CβG); 포스포콜린 잔기(P-Cho)(예컨대 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum) CβG); 아세틸(Ace) 잔기(예컨대 R. 스파에로이데스(R. sphaeroides) CβG); 메틸말로닐(MeMal) 잔기(예컨대 S. 멜릴로티(S. meliloti) CβG)를 의미할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 천연 치환 잔기는 숙시닐 잔기이다. 이러한 치환은 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus)와 같은 다른 박테리아 종의 시클릭 베타 글루칸에서 자연적으로 발생된다(O-숙시닐 잔기). 다른 치환이 CβG의 면역아쥬반트 활성을 변경시키지 않는 위치에 도입될 수 있다. 통상적으로, 시클릭 베타 글루칸 화합물 상의 치환기 연결은 바람직하게는 헥소오스의 히드록실기 상의 O-에스테르 연결로 만들어진다. 일부 구현예에서, 천연 치환 잔기의 수는 0 내지 25개이다. 바람직한 구현예에서 천연 치환 잔기의 수는 0 내지 3개이다.

당업자는 화합물이 IL-12p 및 TNF-알파 생성과 같은 사이토카인 생성 및 CD80, CD40 및 CD86과 같은 수지상 세포 상의 표면 마커의 발현을 측정함으로써 수지상 세포의 성숙을 유도하는지의 여부를 시험함으로써 본 발명에 따른 면역아쥬반트 특성을 갖는 CβG 화합물을 쉽게 평가할 수 있다. 제 2 단계에서, CD8+T 세포 증식 및 활성화의 유도가 또한 시험될 수 있다. 대안적으로는 TLR4 아고니스트 활성이 또한 시험될 수 있다. 통상적으로, CβG 화합물의 면역아쥬반트 활성을 시험하는데 사용될 수 있는 시험이 실시예에 기재된다.

본 발명의 시클릭 베타 글루칸 화합물은 박테리아, 더욱 바람직하게는 브루셀라 박테리아의 정제에 의해 수득되거나, 또는 당업자에게 잘 알려진 화학적 또는 올리고당 합성 방법 중 임의의 것에 의해 수득될 수 있다.

예를 들어 관심대상의 시클릭 베타 글루칸 화합물은 배양 배지로부터 또는 박테리아 세포 용리물로부터 회수될 수 있다. 통상적으로는, 본 발명의 CβG 화합물은 브루셀라로부터 단리된다. 예를 들어, 본 발명의 CβG 화합물은 야생형 브루셀라 세포로부터 단리되거나, 또는 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis) 16M(American Type Culture Collection 23456; 독성 균주, 생물형 1), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 2308과 같은 브루셀라 균주로부터 단리될 수 있다(12). 관심대상의 시클릭 베타 글루칸의 제조에 사용되는 박테리아는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 사이클링, 초음파분쇄, 기계적 파괴, 또는 세포-용리제에 의해 파괴될 수 있다.

박테리아로부터 관심대상의 시클릭 베타 글루칸을 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 실시예에 기재된 절차들은 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis) 또는 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus)의 상청액으로부터 CbG의 정제를 위해 적합한 절차의 예시이다.

하기 절차는 시클릭 베타 글루칸 화합물의 적합한 정제 절차의 예시이다: 이온-교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전(실시예에서 사용된 바와 같음); 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄 술페이트 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용하는 겔 여과; 오염물을 제거하기 위한 단백질 A Sepharose 컬럼; 및 관심대상의 시클릭 베타 글루칸의 에피토프-태그 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 컬럼에 의한 정제. 다양한 올리고당 정제 방법이 사용될 수 있고, 트리클로르아세트산 처리 및 겔 투과 크로마토그래피와 같은 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 (21)에 기재되어 있다.

선택된 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 제조 공정 및 제조된 특정 시클릭 베타 글루칸 화합물의 특성에 따라 다를 것이다.

박테리아(아그로박테리움(Agrobacterium) 또는 리조븀(Rhizobium))의 배양, 및 배양액으로부터의 표제 화합물의 수집을 통한, 특히 β-1,2 연결을 가진, 시클릭 베타 글루칸 화합물의 제제 및 제조가 또한 JP 61040799 및 JP61070994에 기재되어 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 시클릭 베타 글루칸 화합물은 화학 합성의 통상의 기술을 통해 합성될 수 있다. 예를 들어 국제 특허 출원 WO 0216384는 고상 입자 상에 부동화된 말단 서브유닛에 대해 서브유닛 첨가에 의해 형성된, 고체 지지체 상의 올리고당의 효과적인 합성을 위한 올리고당의 자동화된 합성을 위한 장치 및 방법을 개시한다. 본 발명의 시클릭 베타 글루칸 화합물은 또한 라미나리나아제 16A 글리코신타아제를 사용하여 합성될 수 있다(23).

본 발명의 추가 목적은 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 면역아쥬반트로서 본 발명에 따른 CβG 화합물을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 항원과 함께, 상기 정의된 바와 같은 면역아쥬반트 화합물을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

"백신 조성물"은 일단 대상체 또는 동물에 투여되면, 본원에 포함된 상기 하나 이상의 항원(들)에 대항하는 보호적 면역 반응을 도출한다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물은 일단 대상체 또는 동물에 투여되면 예를 들어 미생물에 대항하는 보호벅 면역 반응, 또는 대상체 또는 동물을 감염에 대항하여 효과적으로 보호하기 위한 보호적 면역 반응을 유도한다.

다양한 성분들이 면역원성 또는 백신 유형의 화합물 또는 제형에서 항원으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 약화된 및 비활성화된 바이러스 및 박테리아 병원체, 정제된 거대분자, 다당류, 톡소이드, 재조합 항원, 병원체 유래의 외래 유전자를 함유하는 유기체, 합성 펩티드, 폴리핵산, 항체 및 종양 세포는 (i) 개체에서 면역 반응을 유도하는데 유용한 면역원성 조성물 또는 (ii) 병리학적 상태를 치료하는데 유용한 백신을 제조하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 시클릭 베타 글루칸 화합물은 개체에서 면역 반응을 유도하는데 유용한 백신 조성물을 제조하기 위해 매우 다양한 항원과 조합될 수 있다.

당업자는 특정 병리학적 상태를 치료하는데 적합한 항원을 선택할 수 있을 것이고, 단리된 항원이 특정 백신 제형에서 선호되는지를 측정하기 위한 방법을 알 것이다.

당업자는 또한 본 발명의 면역아쥬반트를 상기 하나 이상의 항원에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결시키는 것이 바람직한지를 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 추가 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 항원에 연결된 본 발명에 따른 시클릭 베타 글루칸 화합물에 관한 것이다.

단리된 항원은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 임의의 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1992) 및 Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1998)에 기재된 재조합 방법을 사용하여 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충, 파충류 또는 포유류 세포에서 단리되고 클로닝될 수 있다. 바이러스, 박테리아 및 원생동물 병원체 유래의 표면 항원을 코딩하는 다수의 유전자가 백신 개발을 위한 항원으로서 성공적으로 클로닝되고, 발현되고, 사용되었다. 예를 들어, B형 간염 바이러스의 주 표면 항원, HbsAg, 콜레라독소의 P 서브유닛, E. 콜라이의 장독소, 말라리아 기생충의 포자소체, 및 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 유래의 당단백질 막 항원 뿐만 아니라, 종양 세포 항원이 다양한 잘 공지된 벡터/숙주 시스템에서 발현되고, 정제되고 백신에 사용된다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 사용될 수 있는 병리학적 이상 세포는 또한 병리학적 상태를 가진 1 이상의 개체 또는 산출된 백신으로 치료하고자 하는 특정 개체를 비롯하여 1 이상의 이러한 개체로부터 수득된 생체 외 또는 시험관 내에서 배양된 세포와 같은 임의의 기원으로부터 수득될 수 있다.

특정 구현예에서, 백신 조성물의 항원은 "종양 연관 항원(tumor associated antigen)"일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 연관 항원"은 종양 조직의 특징적인 항원을 말한다. 종양 조직에 의해 발현되는 종양 연관 항원의 예는 항원 전립선산 포스파타아제(WO 2004026238 참조) 또는 MART 펩티드 T(흑색종 항원)일 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 하나 이상의 다른 면역아쥬반트를 함유할 수 있다. 다양한 면역아쥬반트는 개체에서 면역 반응을 변형시키는데 적합할 수 있다. 바람직한 변형 유형은 본 발명의 상기 시클릭 베타 글루칸 화합물과 조합되도록 선택된 면역아쥬반트의 유형을 결정할 것이다. 예를 들어, 선천적 면역 반응을 향상시키기 위해, 본 발명의 백신 조성물은 선천적 면역 반응을 촉진하는 또다른 면역아쥬반트, 예컨대 선천적 면역 반응을 유도하는 것으로 공지된 또는 유도하기 쉬운 보존된 영역 또는 기타 PAMP를 포함할 수 있다. 다양한 PAMP는 수용체의 toll-유사 계열의 상이한 것들의 활성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 이러한 PAMP는 유익한 사이토카인 프로파일을 유도하는 toll-유사 수용체의 특정 조합을 자극하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들어, PAMP는 Th1 또는 Th2 면역 반응을 유도하는 사이토카인 프로파일을 자극하기 위해 조합될 수 있다. 체액성 또는 세포-매개 면역 반응을 촉진하는 다른 유형의 면역아쥬반트는 본 발명의 시클릭 베타 글루칸 화합물과 조합될 수 있다. 예를 들어, 사이토카인은 Th1 및 Th2 면역 반응의 균형을 변형시키기 위해 투여될 수 있다. 당업자는 특정 병리학적 상태를 위해 면역 반응에서 유익한 변형을 수득하는데 유용한 적합한 사이토카인을 결정하는 방법을 알고 있을 것이다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 백신 조성물은, 계면활성제, 흡수 촉진제, 물 흡수 중합체, 효소 분해를 억제하는 성분, 알코올, 유기 용매, 오일, pH 조절제, 방부제, 삼투압 조절제, 추진제, 물 및 이의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 담체의 양은 다른 성분에 대해 선택되는 양, 항원의 바람직한 농도, 투여 경로 선택, 경구 또는 비경구 등에 따라 다를 것이다. 담체는 임의의 편리한 시간에 백신에 첨가될 수 있다. 동결건조 백신의 경우, 담체는 예를 들어, 투여 직전에 첨가될 수 있다. 대안적으로는, 최종 생성물은 담체로 제조될 수 있다.

적합한 담체의 예에는 멸균수, 식염수, 완충액, 인산염-완충 식염수, 완충 염화나트륨, 식물성 오일, 최소 필수 배지(MEM), HEPES 완충액이 있는 MEM이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

임의적으로, 본 발명의 백신 조성물은 아쥬반트 및 바람직한 결과에 따라 양을 달리하며 통상의 이차 아쥬반트를 함유할 수 있다. 통상의 양은 다른 성분 및 원하는 효과에 따라 약 0.02중량% 내지 약 20중량%의 범위이다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 아쥬반트는 본원에서 항원 성분에 대한 체액성 면역 반응을 유의하게 증가시키기 위해 항원 성분과 조합으로 이의 효과를 위해 백신 조성물 내의 필수 성분인 상기 기재된 면역아쥬반트 화합물과 단지 대조적으로 "이차"로서 확인된다. 이차 아쥬반트는 특정 아쥬반트가 어느 정도 면역학적 향상 특성을 소유하고 이중 목적을 가짐에도 불구하고 프로세싱 보조제로서 백신 제형에 일차적으로 포함된다.

적합한 이차 아쥬반트의 예에는 안정화제; 유화제; 수산화알루미늄; 알루미늄 포스페이트; pH 조절제, 예컨대 수산화나트륨, 염산, 등; 계면활성제, 예컨대 Tween.RTM. 80(폴리소르베이트 80, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.에서 시판됨); 리포좀; 이스콤 아쥬반트; 합성 당펩티드, 예컨대 뮤라밀 디펩티드; 증량제, 예컨대 덱스트란 또는 예를 들어 알루미늄 포스페이트와의 덱스트란 조합물; 카르복시폴리메틸렌; 박테리아 세포벽, 예컨대 마이코박테리아 세포벽 추출물; 이들의 유도체, 예컨대 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum); 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne); 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 예를 들어 BCG(Bovine Calmette Guerin); 백시니아 또는 동물 폭스바이러스 단백질; 서브바이러스 입자 아쥬반트, 예컨대 오르비바이러스; 콜레라 독소; N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸)-프로판디아민(피리딘); 모노포스포릴 지질 A; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA, Kodak, Rochester, N.Y.에서 시판됨); 이의 합성체 및 혼합물이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 수산화알루미늄을 다른 이차 아쥬반트 또는 면역아쥬반트, 예컨대 Quil A와 혼합시킨다.

적합한 안정화제의 예에는 수크로오스, 젤라틴, 펩톤, 소화된 단백질 추출물, 예컨대 NZ-Amine 또는 NZ-Amine AS가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 유화제의 예에는 광유, 식물성 오일, 땅콩유 및 주사용 또는 비강용 백신 조성물에 유용한 다른 표준의, 대사가능한 무독성 오일이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

통상의 방부제는 백신 조성물에 약 0.0001중량% 내지 약 0.1중량%의 범위의 유효량으로 첨가될 수 있다. 제형에 사용되는 방부제에 따라, 상기 범위 미만 또는 초과의 양이 유용할 수 있다. 통상적인 방부제에는 예를 들어, 칼륨 소르베이트, 나트륨 메타비술파이트, 페놀, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 티메로살 등이 포함된다.

본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 매질과 함께 용액 또는 현탁액으로서 제형화될 수 있다.

이러한 약학적으로 허용가능한 매질은 예를 들어, 물, 인산염 완충 식염수, 표준 식염수 또는 다른 생리학적 완충 식염수, 또는 다른 용매 또는 비히클, 예컨대 글리콜, 글리세롤 및 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 주사가능 유기 에스테르일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 매질은 또한 리포좀 또는 마이셀을 함유할 수 있고, 폴리펩티드 또는 펩티드 항원과 세제 및 글리코시드, 예컨대 Quil A를 혼합하여 제조된 면역자극 복합체를 함유할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 경구 투여 용의 액체 투여 형태에는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르가 포함된다. 유효 성분(들) 외에, 액체 투여 형태는 당업계에 통상 사용되는 비활성 희석제, 예컨대 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물을 함유할 수 있다.

비활성 희석제 외에도, 경구 조성물은 또한 아쥬반트, 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 풍미제, 착색제, 향제 및 방부제를 포함할 수 있다.

현탁액은 유효 성분(들) 외에, 예를 들어, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트래거캔스 고무, 및 이의 혼합물과 같은 현탁화제를 함유할 수 있다.

직장 또는 질내 투여를 위한 본 발명의 백신 조성물의 제형은 유효 성분(들)과 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 실온에서 고체이나 체온에서 액체이므로 직장 또는 질내 강 내에서 녹아 유효 성분(들)을 방출할 것인 좌약으로서 제시될 수 있다. 질내 투여에 적합한 본 발명의 제형은 또한 당업계에 적합한 것으로 알려진 그러한 담체를 함유하는 패서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼 또는 분무 제형을 포함한다.

비경구 투여에 적합한 본 발명의 백신 조성물은 항산화제, 완충제, 제형이 의도되는 수여자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질 또는 현탁화제 또는 호제를 함유할 수 있는, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 멸균 등장성 수용액 또는 비-수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합으로 유효 성분(들)을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 포함된다. 적합한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

상기 조성물은 또한 아쥬반트, 예컨대 습윤제, 유화제 및 분산화제를 함유할 수 있다. 또한 조성물에 등장성제, 예컨대 당, 염화나트륨, 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 부가적으로, 주사가능 약학 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제의 혼입에 의해 야기될 수 있다.

주사가능 디팟 형태는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 중의 유효 성분(들)의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 유효 성분(들) 대 중합체의 비, 및 사용된 특정 중합체의 특성에 따라, 유효 성분(들)의 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 디팟 주사가능 제형은 또한 유효 성분(들)을 신체 조직과 부합가능한 리포좀 또는 마이크로에멀젼 내에 포획시킴으로써 제조될 수 있다. 주사가능 물질은 예를 들어, 박테리아-고정 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다.

제형은 단위-투여 또는 다중-투여 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알로 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수를 첨가하기만 하면 되는 동결건조된 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 상기 기재된 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 중의 항원 및 면역아쥬반트 화합물의 양은 특정 항원, 특정 동물 또는 환자의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여, 약학 업계의 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 측정된다.

백신 조성물의 투여량은 특히 항원, 백신화되는 또는 백신접종되는 숙주의 종 등에 따라 다르지만, 백신 조성물의 약물학적 유효량의 투여량은 통상 투여량 당 본 발명의 면역아쥬반트 화합물 약 0.01㎍ 내지 약 500㎍(특히 50㎍ 내지 약 500㎍)의 범위일 것이다.

조합 내의 특정 항원 성분의 양이 면역 반응을 개선하는데 필요한 본 발명에 따른 면역아쥬반트 화합물의 양에 영향을 줄지라도, 전문의는 특정 상황을 충족시키기 위한 정규적인 시험을 통해 면역아쥬반트 화합물의 효과적인 투여량을 쉽게 조절할 수 있는 것으로 고려된다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 당업계에 잘 알려진 다양한 전임상 독성학 및 안정성 연구로 시험될 수 있다.

예를 들어, 이러한 백신 조성물은 항원이 면역원성인 것으로 발견되고 인간 임상 시험에 대해 제안된 동일한 경로에 의해 재현성있게 면역화될 수 있는 동물 모델에서 평가될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 백신 조성물은 미국 생물학 평가 및 연구 센터/식약청 및 국립 알러지 및 감염질환 기관[Center for Biologics Evaluation and Research/Food and Drug Administration and National Institute of Allergy and Infectious Diseases]에서 언급된 접근법에 의해 시험될 수 있다(13).

당업자는 특정 백신 조성물, 적합한 항원 적재량, 면역화 경로, 투여 용량, 항원의 순도, 및 특정 동물 종에서 특정 병리학적 상태를 치료하는데 유용한 백신화 섭생에 대해 어떻게 결정할지를 알 것이다.

백신화 프로토콜에서, 백신은 유리하게는 프라임/부스트 방식에 따라 단일 투여량 또는 바람직하게는, 주 또는 개월 간격으로 수 회, 예를 들어, 2회, 3회 또는 4회로서 투여될 수 있다. 적합한 투여량은 다양한 파라미터에 따라 다르다.

일반적인 규칙으로서, 본 발명의 백신 조성물은 편리하게는 경구로, 비경구로(피하로, 근육내로, 정맥내로, 피내로 또는 복강내로), 구강내로, 비강내로 또는 경피로, 림프관내로, 종양내로, 방광내로, 복강내로 및 뇌내로 투여된다. 본 발명에 의해 계획되는 투여 경로는 항원에 따라 다를 것이다.

본 발명은 상기 정의된 바와 같은 면역아쥬반트 화합물(즉, 본 발명에 따른 CβG 화합물) 및 하나 이상의 항원을 포함하는 키트에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 예를 들어 병원균에 대항하여 보호적 면역 반응을 유도하거나 또는 감염에 대항하여 대상체 또는 동물을 효과적으로 보호하기 위하여, 동시적, 개별적 또는 연속적 사용을 위한 조합 제제로서, 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다:

- 상기 정의된 바와 같은 면역아쥬반트 화합물,

- 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 항원.

CβG 화합물은 예를 들어, 병원균에 대항하여 보호적 면역 반응을 유도하거나, 또는 감염에 대항하여 대상체 또는 동물을 효과적으로 보호하기 위해 대상체에게 하나 이상의 항원의 투여 전에, 이와 동시에, 또는 이에 후속하여 투여될 수 있다. CβG 화합물 및 항원은, CβG 화합물이 다르게 투여되는 경우보다 상기 항원에 대항하는 증가된 면역 반응을 제공하기 위해 항원과 함께 작용할 수 있는 방식으로 시간 간격 내에 그리고 일련으로 대상체에게 투여된다. 바람직하게는, CβG 화합물 및 항원은 대상체에게 동시에 투여된다. 또한 바람직하게는, 분자는 상기 환자에게 동시에 그리고 매일 투여된다.

본 발명의 추가 양상은 약물학적 유효량의 항원 및 약물학적 유효량의 본 발명에 따른 면역아쥬반트 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 백신화 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 포유류, 예컨대 설치류, 고양이류, 개류 및 영장류를 나타낸다. 바람직하게는 본 발명에 따른 대상체는 인간이다.

약물학적 유효량의 본 발명에 따른 면역아쥬반트 화합물은 예를 들어 경구로, 비경구로 또는 다르게는 항원의 면역원성을 강화시키거나, 가속화하거나 확장하기 위해 항원의 투여와 동시에, 이에 연속하여 또는 투여 직후 제공될 수 있다.

백신 조성물의 투여량은 특히 선택된 항원, 투여 경로, 종 및 다른 표준 인자에 따라 다를 것이다. 당업자는 효과적인 면역화 양 및 투여 방법을 달성하기 위해 각각의 항원에 대한 면역원성 반응에 적합한 투여량을 쉽고 편리하게 적정할 수 있다는 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 CβG 화합물로 이루어진 TLR4 아고니스트에 관한 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이, TLR4 아고니스트는 TLR4 생물학적 활성 또는 TLR4 수용체 활성화 또는 신호화를 상당히 유도하거나, 촉진하거나 향상시킬 수 있는 작용제를 말한다.

본 발명의 추가의 목적은 약물학적 유효량의 본 발명에 따른 면역아쥬반트 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 수지상 세포(DC)의 성숙을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나, 상기 실시예 및 도면이 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

도 1: mDC 성숙의 유도는 시클릭 글루칸의 구조에 따라 다르다. 마우스 DC를 8h 및 24h 동안 배지(음성: neg), E. 콜라이(E. coli) LPS 또는 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CßG, B. 아보르투스(B. abortus) CßG, 랄스토니아(Ralstonia) CßG 및 MβCD로 0.25mM의 당량 농도에서 자극시켰다. MHC-II, CD80, CD40 및 CD86의 표면 수준을 유세포측정에 의해 측정하고, 배양 상청액 중의 IL-12 및 TNF-알파 수준을 ELISA에 의해 측정하였다(B). 데이터는 3회 이상의 독립적 실험의 대표값이다.* p < 0.05, 음성과 비교하였다.
도 2: B. 멜리텐시스 ( B. melitensis ) CβG 인간 DC 는 CD4 + 및 CD8 + T 세포 반응을 향상시킨다.
A) 인간-단핵구-유래 DC를 24h 동안 배지(음성), 10ng/ml의 E. 콜라이(E. coli) LPS 및 0.2μM, 2μM 및 20μM의 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG 및 HLA-DR로 자극시키고, HLA-ABC, CD80, CD40, CD83 및 CD86 표면 수준을 FACS에 의해 분석하였다. B) 혈액 mDC를 20mg/ml CβG로 24h 동안 자극시켰다. 배양 상청액 중의 사이토카인을 Luminex에 의해 측정하였다.
도 3: B. 멜리텐시스 ( B. melitensis ) CβG에 의해 유도된 IL -12 생성 및 CD80, CD40 및 CD86 표면 발현은 TLR4 에 의존적이다.
WT(A, B 및 C), MyD88KO(A), TRIFKO(A), TLR2KO(B) 및 TLR4KO(B 및 C) 마우스로부터의 DC를 24h 동안 배지(음성), CpG, PolyI:C, Pam2CSK4 및 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG로 자극시켰다. A 및 B) 배양 상청액 중의 IL-12 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. C) CD80, CD40 및 CD86의 표면 수준을 유세포측정에 의해 측정하였다. 양성 대조군으로서: Pam2CSK4(100ng/ml), LPS(100ng/ml), CpG(1μM) 및 Poly I:C(1mg/ml). 데이터는 3회 이상의 독립적 실험의 대표값이다 *p < 0.05, WT 마우스와 비교하였다.
도 4: 보트롭스 아스페르( Bothrops asper )의 독에 대항하는 B. 아보르투스( B. abortus ) CβG의 아쥬반트 활성.
A: 혼합물 독+칼슘 알기네이트+CβG에서 (**)는 칼슘 알기네이트의 혼합물 중에 단독으로 주사된 독에 대한 p<0.001의 값을 나타낸다.
B: 면역화 21일 후 보트롭스 아스페르(Bothrops asper)의 독에 대항하는 CβG의 아쥬반트 활성. 그룹 당 10마리의 마우스(총 30 마리)의 혈청 모집물. SD는 5%미만이다.

실시예 1: 박테리아 β 1,2 시클릭 글루칸은 신규한 수지상 세포 활성화제이다.

재료 및 방법:

항체 및 시약

CD8, CD45.2, CD44, CD25 및 CD62L에 대항하는 플루오르크롬-공액 항체를 BD Biosciences 또는 eBiosciences에서 구입하였다.

순도>98% 및 내독소 농도<1EU/mg인 난백알부민(OVA)을 EndoGrade에서 구입하였다.

카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)를 Invitrogen에서 주문하였다.

405n 여기를 위한 Aqua Dead Cell Stain(Invitrogen)를 유세포측정 실험에 대해 사멸 세포를 검출하기 위해 사용하였다.

SIINFEKL 펩티드를 Schafer-N에서 구입하였다.

시클릭 글루칸 추출, 정제 및 특징화

시클릭 글루칸 분자를 B. 멜리텐시스(B. melitensis) 16M(American Type Culture Collection 23456; 독성 균주, 생물형 1), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 2308 (12) 및 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)(랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)으로부터 정제된 CβG는 Dr. JP Bohin으로부터의 선물임, CNRS UMR8576, Lille, France)으로부터 수득하였다. 브루셀라 균주의 경우 생물학적 안정성 레벨 3 공간에 36℃ 및 35% O2 포화도의 발효기에서 성장시키고(14), 페놀(0.5%, 36℃ 및 48h 동안)로 비활성화시켰다. 박테리아를 증류수(100ml 중의 20g 습윤 중량)에 재현탁시키고, 120℃에서 30분 동안 가열하였다. 세포 잔재를 제거하고(4℃에서 30분 동안 8,000g), 추출물을 3부피의 에탄올로 -20℃에서 밤새 침전시켰다. 침전물을 제거하고(10분 동안 5,000g), 상청액을 2부피의 에탄올과 혼합하였다. 신규한 침전물을 수집하고(10분 동안 5,000g), 175 mM NaCl, 0.05% NaN3 및 0.1 M Tris-HCl, pH 7.0에 재현탁하고, 18h 동안 37℃에서 뉴클레아제(1ml 당 50mg의 DNase-II 유형 V 및 RNase-A(Sigma-Aldrich))로 먼저, 그 다음 1h 동안 55℃에서 이후 24h 동안 25℃에서 프로테이나아제 K(50mg/ml; Merck)로 소화시켰다. 유체를 30분 동안 70℃에서 다량의 페놀로 추출한 다음, 혼합물을 냉각시키고 원심분리하고(0℃에서 15분 동안 8,000g) 수상을 수집하고, 동일한 조건을 사용하여 페놀로 다시 재-추출하였다. 수상을 투석하고, 간략한 원심분리에 의해 정화시키고 동결건조하였다. 시클릭 글루칸의 정체는 Aragon 및 공동작업자에 의해 기재된 바와 같이 13C-핵 자기 공명 분광분석, 고성능 액체 크로마토그래피 및 고성능 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 확인되었다. 다당류 및 리포다당류 또는 다른 오염물의 부재는 자외선 분광광도측정, SDS-PAGE, 겔 면역침전 및 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산 측정에 의해 입증되었다(14).

마우스 및 세포

HEK 293 세포를 10% FCS가 보충된 DMEM에서 유지하였다.

야생형 C57BL/6 마우스 및 TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/- 녹아웃(KO) 마우스를 Centre d’Immunologie Marseille-Luminy(CIML), Marseille, France에서 유지하였다. 이중(MyD88/TRIF-/-) KO 세포는 Caetano Reis y Souza laboratory, London, UK에서 제공되었다.

마우스 골수-유래 DC를 이전에 기재된 바와 같은 7~8 주령 암컷 C57BL/6 마우스 또는 TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/- 녹아웃(KO) 마우스로부터 준비하였다(15). 간략하게는, 마우스의 대퇴골 및 경골을 제거하고 근육과 힘줄을 없앴다. 뼈를 70% 에탄올 내에 2분 동안 두고 후속하여 PBS로 세정하였다. 두개의 뼈 말단들을 절단하고, 골수를 RPMI 1640 배지로 헹궈냈다. 세포를 마우스 GM-CSF(mGM-CSF)가 보충된 완전 RPMI 1640(5% FCS 및 50μM β-메르캅토에탄올)이 있는 24웰 플레이트에 파종하였다. 제3일에 배지를 교환하고, 제6일에 실험을 실시하였다.

마우스 골수-유래 대식세포를 골수-유래 DC와 동일한 방식으로, 7~8주령 암컷 C57BL/6 마우스의 대퇴골로부터 준비하였다. 세포를 M-CSF가 보충된 완전 DMEM(2Mm L-글루타민, 10% FCS) 내에 파종하였다. 제5일 및 제6일에 배지를 교환하고 제7일에 실험을 실시하였다.

인간-단핵구-유래 DC를 건강한 자원자로부터의 Ficoll-분리 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성시켰다(16). 단핵구는 부착에 의해 풍부화되었고, 완전 RPMI 배지(과립구-단핵구 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 IL-4로 6일 동안 또는 GM-CSF 및 IFN으로 3일 동안 보충된 것)에 배양하였다. 혈액 골수성 DC(mDC: HLA-DR+CD11c+CD123-Lin-)를 FACS aria(BD Biosciences, CA)를 사용하는 PBMC로부터 분류하였다. 나이브 CD4+ 및 CD8+ T 세포(CD45RA+CD45RO-)(순도>99.2%)를 FACS-분류법에 의해 정제하였다.

Jackson Laboratory로부터의 C57Bl/6 Ly5.1 마우스 및 CIML 동물 설비에서 사육된 C57Bl/6 백그라운드 상의 OT-I TCR 이식유전자 Ly5.2 마우스를 실험에 사용하였다.

면역형광 현미경 및 유세포측정

면역형광 현미경을 위해, 자극된 DC를 3% 파라포름알데히드에 37℃에서 15분 동안 고정시키고, 이전에 기재된 바와 같이 면역형광 표지법을 시행하였다(17).

쥣과 I-A에 대항하는 토끼 리볼리(rivoli) 항체(18) 및 마우스 항체 FK2(Biomol)를 일차 항체로서 사용하였다. 염색 후, 이미지 습득을 위해 샘플을 Leica DMRBE 에피형광 현미경 또는 Zeiss LSM 510 레이저 주사 공초점 현미경 상에서 시험하였다. 이후 102431024 픽셀의 이미지를 Adobe Photoshop 7.0을 사용하여 취합하였다. 분석된 총 400개 이상의 숙주 세포에 대해 4회의 독립적 실험에서 100개 이상의 세포를 계수함으로써, 정량화를 항상 수행하였다.

유세포측정을 위해, 자극된 DC를 수집하고 염색하였다. CD80 및 CD40에 대한 FITC-공액 항체, CD83 및 IA-IE에 대한 PE-공액 항체(MHC 계열 II) 및 CD11c에 대한 APC-공액 항체를 Pharmingen으로부터 입수하였다. 적합화된 이소형 항체를 대조군으로서 사용하였다. 염색 후, 세포를 PBS로 세정하고 3%의 파라포름알데히드로 고정한 후, FACScalibur 세포측정기(Becton Dickinson) 상에서 분석하였다. 세포는 분석을 위해 CD11c 항상 게이트를 통과시키고 10,000회의 게이트통과 사건을 각각의 샘플에 대해 수집하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 이로부터 막대그래프를 그리고, 형광 강도 중앙값(median)을 게이트통과 집단에서 측정하였다. CFSE-표지된 T 세포의 증식 및 활성화에 이어, 면역화 3일 후에 배수 슬와 림프절(DLN)을 수집하고 콜라겐분해효소 유형 I 소화에 적용하였다. 상이한 플루오르크롬-공액 항체를 사용하는 유세포측정에 의한 분석을 위해 세포를 염색하였다. 100,000회 이상의 사건을 FACSCanto II(BDBiosciences) 상에서 수집하였다. 유세포측정 분석을 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

사이토카인 농도의 측정

총 마우스 IL-12 및 TNF-알파를 제조자의 지침(Abcys)에 따라 샌드위치 효소-연결 면역흡착 어세이(ELISA)에 의해 자극된 DC의 배양 상청액에서 정량화하였다. IL-1b, TNFa, 및 IL-12p40을 포함하는 인간 사이토카인 및 케모카인을 제조자의 프로토콜에 따라 BeadLyte 사이토카인 어세이 키트(Upstate, MA)에 사용하였다.

인간 CD4 + 및 CD8 + T 세포 반응

5x103 혈액 mDC를 CFSE-표지된 동종이형 나이브 CD4+ T 세포(1-2x105)와 공동배양하였다. 세포 증식을 제6일에 CFSE-희석을 측정함으로써 시험하였다. CD8+ T 세포는 IL-2(20단위/ml)의 존재하에 8-10일 동안. HLA-A0201+ 건강한 기증자의 5x103 혈액 mDC에 0.2 m.o.i.(감염 다중도) 열-비활성화 인플루엔자 바이러스(PR8)를 2h 동안 37℃에서 적재하였다. 자가 CD8+ T 세포(1-2x105)를 혼합하고 20단위/ml IL-2의 존재하에 7일 동안 배양하였다. 이후 세포를 항-CD8 항체 및 4량체(HLA-A*0201-Flu M158-66)로 염색하였다. MART-1-특이적 CD8+ T 세포 반응을 10 mM MART-126-35(27L) 펩티드가 적재된 mDC와의 공동-배양 후에 측정하였다.

OT -I T 세포의 입양 전달(adoptive transfer) 및 면역화

OVA로부터의 H-2Db 제약 CD8+ T 세포 에피토프에 특이적인 TCR을 발현하는 OT-I 유전자이식 세포를 사용하였다. 림프절 OT-I Ly5.2 마우스를 수확하고, 콜라겐분해효소 유형 I(Sigma)로 37℃에서 30분 동안 소화시켰다. 그 후, CD8+ T 세포를 마우스 CD8 음성 단리 키트(Dynal)를 사용하여 음성적으로 분류하였다. 통상, 산출된 세포는 > 90%였다. CD8 백분율을 유세포측정에 의해 측정하였다. CD8+ T 세포를 10μM CFSE로 37℃에서 10분 동안 표지하였다.

CD8+ Ly5.2 CFSE+ T 세포를 나이브 유사유전자 C57Bl/6 Ly5.1 수여자 마우스(200 000 세포/마우스) 내에 정맥내로(i.v.) 양자 전달하였다. OT-I 양자 전달 24h 후, 수여자 마우스를 무-내독소 PBS 중의 30㎍ OVA 단독으로 또는 200㎍의 시클릭 글루칸과 혼합된 30㎍ OVA로 또는 50㎍ 폴리 I/C와 혼합된 30㎍ OVA 또는 IFA(부피/부피)로 에멀젼화된 30㎍ OVA로 피하로(s.c.) 면역화하였다.

T 세포 증식 및 활성화

살아있는 세포는 항상 CD8+CD45.2+ 집단 상에서 게이트를 통과하였고, 본 출원인은 세포 분열과 연관된 CFSE 표지화의 감소를 분석하였다. 세포 활성화 수준을 연구하기 위해, 본 출원인은 CD25, CD44 및 CD62L과 같은 활성화 마커의 발현을 주시하였다.

HEK 293 세포 루시퍼라아제 리포터 어세이

HEK 293 세포 리포터 어세이를 표시된 플라스미드를 사용하여 이전에 개시된 바와 같이 수행하였다. 마우스 TLR, MD2 및 CD14 cDNA를 골수-유래 대식세포로부터 준비된 총 RNA로부터 역전사효소 PCR에 의해 증폭하였고 pCDNA3.1 발현 벡터(Promega)에 서브클로닝하였다. HEK 293 세포를 50ng의 수용체 플라스미드, 200ng의 pBIIXLuc 리포터 플라스미드, 5ng의 대조군 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제(pRL-null, Promega)로 이루어진 총 0.4㎍의 DNA에 대해, 제조자의 지침에 따라 Fugene(Roche)를 사용하여 일시적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 24h 후, 세포를 기재된 아고니스트로 6h 동안 자극시킨 다음, 세포를 용해하고, Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega)을 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

결과:

브루셀라 CβG는 마우스 DC 성숙의 조절제이다.

마우스 DC의 성숙은 많은 형태기능적 변화 그 중에서도, 세포 표면에서 동시-자극성 및 MHC 계열 II 분자의 상향-조절, 형태학 변화 및 결손된 새롭게 합성된 유비퀴틴화 단백질로 제조되고 DALIS라고 불리우는 큰 세포질 수지상 세포 아그레솜-유사 유도 구조의 형성을 특징으로 한다. B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG가 마우스 DC의 성숙의 활성화제였는지를 처음으로 확정하기 위해, 세포를 상이한 농도의 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG로 인큐베이션하였다. 8 및 24h 후, 표면 발현 MHC 계열 II 분자 및 DALIS의 형성을 공초점 현미경에 의해 분석하였다. DC 활성화의 대조군으로서, 0.25 mM의 E. 콜라이(E. coli) LPS를 사용하였다. B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG 또는 E. 콜라이(E. coli) LPS로 처리되었으나 루셀라 LPS로 처리되지 않은 마우스 DC는 성숙을 겪었으며, 그 이유는 이들이 MHC II 표면 국부화 및 DALIS 형성을 나타내기 때문이다. 그러나, 미처리된 DC 및 브루셀라 LPS로 처리된 DC에서, MHC II 분자는 대부분 세포 내에 남아있고 DALIS는 관찰되지 않았다. 각각의 자극에 의한 인큐베이션 8h 및 24h 후 DALIS가 있는 DC의 백분율. E. 콜라이(E. coli) LPS의 경우, 8h 후 80%의 세포에는 크고 많은 DALIS가 함유되는 반면, 미처리된 세포의 오직 20%에만 DALIS가 함유되었다. B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG는 0.025μM에서 이미 45%의 세포에서 DALIS의 형성을 유도하였고, 0.25μM 및 2.5μM에서 세포의 수는 각각 79% 및 72%까지 증가하여 0.25μM E. 콜라이(E. coli) LPS로 수득된 수준에 도달하였다. 24h에, DALIS의 수는 감소하기 시작했으며, DC 성숙 과정 중의 DALIS 발현은 일시적인 사건이므로 이것은 이전에 관찰된 것과 일치한다.

DC 성숙 과정에서 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG의 효과에 대한 추가의 통찰력을 얻기 위해, 본 출원인은 다음 CD11c-양성 마우스 DC에서의 유세포측정에 의해 고전적 성숙 마커(CD80, CD86, CD40 및 MHC 계열 II 분자)의 표면 발현을 분석하였다. 형광 중앙값(median)의 분석은 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG에 의한 모든 공동-자극 및 MHC 계열 II 분자의 명확한 용량 의존적 유도를 보였다. 이것은 높은 비율의 MHC 계열 II 분자가 세포 표면 상에 존재하는 현미경 관찰과 일치한다.

상기 관찰은 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG가 DC 성숙을 촉진한다는 것을 시사한다. 본 출원인은 마우스 DC에 의한 사이토카인의 분비가 또한 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG 자극 후 유도되는지를 연구하였다. 자극된 마우스 DC의 상청액 중의 IL-12 및 TNF-알파의 수준을 측정하였다. 결과는 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG가 두 사이토카인의 분비를 용량 의존적 방식으로 유도하였음을 보여주었다. 상기 효과는 자극 후 8h 뿐만 아니라 24h에서 관찰되었고, 두 시점 사이에 유의적인 차이는 없었다. 이와 함께, 상기 데이터는 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG가 마우스 DC의 강력한 활성화 분자라는 것을 확인시켜주었다.

마우스 DC 성숙은 상이한 시클릭 글루칸 구조에 의해 조절된다.

이후 본 출원인은 DC를 기원이 상이한 다양한 CβG와 인큐베이션함으로써 시클릭 글루칸 구조와 DC 활성화 사이의 가능한 관련성을 연구하였다. B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG는 β-1,2 연결에 의해 연결된 17~25개의 글루코오스 잔기를 함유하는 시클릭 백본으로 이루어진다(22). B. 아보르투스(B. abortus) CβG의 경우, 시클릭 β-1,2-글루칸의 분획은 O-숙시닐 잔기로 치환된다(19). 랄스토니아(Ralstonia) CßG는 13개의 글루코오스를 가진 시클릭 백본으로 구성된다. 하나의 연결은 α-1,6인 반면, 다른 모든 글루코오스 잔기들은 β-1,2에 의해 연결된다(22). 합성 메틸-시클로덱스트린(MβCD)은 β-1,4-연결에 의해 연결되고 O-메틸 치환을 가진 7개의 글루코오스 시클릭 백본으로 이루어지며, 이것은 또한 생물학자에게 막 콜레스테롤을 추출하는 이의 특성을 이용하는 지질 래프트 파괴제라고 알려져 있다(22).

첫째로 본 출원인은 성숙 마커의 표면 발현을 분석하였고, E. 콜라이(E. coli) LPS, B. 멜리텐시스(B. melitensis) 및 B. 아보르투스(B. abortus) CβG는 CD80, CD86, CD40 및 MHC 계열 II 분자의 강력한 발현을 유도하였으나, B. 아보르투스(B. abortus) CβG로 인큐베이션된 세포에서는 약간 더 적은 수준으로 유도되었다. 반대로, 랄스토니아(Ralstonia) CßG 및 MβCD는 DC를 유의적으로 활성화시키는데 실패하였다.

사이토카인 분비 분석은 표면 마커 발현을 입증하였다. B. 멜리텐시스(B. melitensis) 및 B. 아보르투스(B. abortus) CβG는 TNF-알파 및 IL-12 분비를 유도하였다. 랄스토니아(Ralstonia) CαG에 반응하여, DC는 TNF-알파 및 IL-12를 거의 생성하지 않았으며, MβCD에 반응하여 사이토카인 중 어느 것도 분비되지 않았다.

상기 데이터는 첫째로 시클릭 글루칸-의존성 DC 활성화가 분자 구조에 크게 의존적이며, 둘째로 콜레스테롤 추출이 DC에서 면역계 반응에 어떠한 효과를 갖지 않는다는 것을 입증하였다.

CβG에 의한 DC -활성화는 TLR4 , MyD88 및 TRIF 를 필요로 하지만, CD14 에 독립적이다.

CβG의 인지에 대한 TLR 및 어댑터의 기여를 분석하였다. MyD88 및 TRIF는 TLR 신호화에 관여하는 어댑터 분자이다. MyD88은 TLR1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, IL-1R 및 IL-18R 경로에 관여하는 반면, TRIF는 TLR3 및 TLR4에 독특하다. TLR4, TLR2, MyD88, TRIF, TRIF/MyD88 및 CD14 KO 마우스로부터 유래된 BMDC를 CβG로 처리하였다. 공동-자극 분자의 표면 발현 및 IL-12, IL-6 및 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토카인의 분비를 측정함으로써 나타난 바와 같이, E. 콜라이(E. coli) LPS 및 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG에 의해 자극된 TLR4, Myd88, Myd88/TRIF 및 TRIF KO 마우스-유래 BMDC에서 활성화가 관찰될 수 없었다(도 2 및 B). 상기 결과는 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG가 TLR4 경로의 활성화를 통해 DC 성숙을 유도한다는 것을 보여준다. B. 멜리텐시스(B. melitensis)에 의해 유도된 DC 성숙에 관여하는 경로를 설명하기 위해, CβG 활성화를 MyD88KO, TRIFKO 및 이중 MyD88/TRIFKO 마우스로부터 유래된 BMDC에서 시험하였다. E. 콜라이(E. coli) LPS와 유사하게, B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG에 의한 IL-12의 유도는 MyD88-KO 및 TRIF-KO 마우스로부터 유래된 BMDC에서 저지되었고, 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis) 유래의 선형 α-1,3 글루칸인 커드란(curdlan)으로 처리된 DC와 반대로, 세포를 브루셀라 CβG로 인큐베이션하였을 때 IL-12 분비가 이중 MyD88/TRIF KO에서 관찰되지 않았다. 커드란은 MyD88/TRIF-독립적 방식으로 핵심 β-글루칸 수용체 Dectin-1과 상호작용하는 것으로 알려져 있다.

LPS 인지에는 LPS-결합 단백질(LBP), CD14 및 TLR4/MD2 복합체가 관여한다. 전-염증성 사이토카인, 예컨대 IL-12의 분비는 E. 콜라이(E. coli) LPS-처리된 CD14 KO BMDC 뿐만 아니라 동시-자극성 분자, MHC-II의 세포 표면 발현에서 완전히 소멸되었다. 반대로, CβG-처리된 BMDC의 활성화는 CD14에 독립적이었다. CβG가 TLR4 경로를 활성화시키기 위해 CD14를 필요로 하지 않는다는 사실은 LPS외의 상이한 인지 메카니즘을 강조한다. 이와 함께, 상기 결과는 CβG가 신규 TLR4 아고니스트라는 것을 입증한다.

LPS와 같은 강력한 생물학적 유도제는 높은 독성 및 면역원성, 아쥬반트로서 상기 분자의 용도를 방해하는 특성을 나타낸다. 따라서, 정제된 브루셀라 CβG 제제에서 상기 특성을 탐구하는 것이 적절하였다. E. 콜라이(E. coli) LPS와는 반대로, 브루셀라 CβG는 세포 배양물 또는 동물에 대해 독성이 없었고(표 1), 마우스, 토끼 또는 자연적으로 감염된 소에서 항체 생성을 유도하지 않았다(제시되지 않음). 상기 결과는 세포 배양물에서, CβG가 매우 고농도(10mM)에서도 독성이 없음을 보여주는 이전 결과를 입증한다. 따라서, CβG는 LPS의 독성을 나타내지 않는 TLR4 아고니스트이다.

브루셀라 CβG는 생체 내에서 CD8 반응을 유도한다.

본 출원인은 외생 자유 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 시클릭 글루칸의 능력을 연구하였다. 본 출원인은 CD8+ Ly5.2 CFSE+ OT-I T 세포를 C57Bl/6 Ly5.1 마우스 내로 전달한 다음, 이것을 PBS 단독(그룹 1), OVA 단독(그룹 2), OVA와 시클릭 글루칸(그룹 3) 또는 OVA와 Poly I/C와 같은 공지된 아쥬반트(그룹 4) 또는 IFA(그룹 5)로 면역화(s.c.)하였다. 면역화 3일 후에 본 출원인은 PBS로 면역화된 대조군을 제외한 모든 그룹의 마우스의 배수 림프절에서 OT-I T 세포 증식을 관찰할 수 있었다. 이후 CD8+ CD45.2+ 집단 내의 활성화 마커의 표면 발현을 탐구하였다. 본 출원인은 유세포측정에 의해 CD25의 상향 조절, CD44 발현 및 CD62L의 하향 조절을 분석하였고, 이것은 림프절에서 감염 부위로의 T 세포 이동과 일치한다. PBS 단독으로 또는 PBS와 OVA로 면역화된 마우스에서는 세포 활성화가 없었다. 그러나 OVA 및 시클릭 글루칸으로 면역화된 그룹에서, 본 출원인은 CD25 및 CD44 상향 조절 뿐만 아니라 CD62L 발현의 강한 하향 조절을 관찰할 수 있었고, Poly:IC와 같은 공지된 아쥬반트로 면역화된 그룹에서보다 높았다.

상기 데이터는 CβG가 생체 내에서 CD8+T 세포 증식 및 활성화를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

브루셀라 CβG는 인간 DC 의 성숙을 유도한다.

본 출원인은 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG가 또한 인간 단핵구-유래 DC에 대한 자극원인지를 연구하였다. 인간 DC는 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 6일 동안 또는 GM-CSF 및 IFN의 존재하에 3일 동안 인간 말초 혈액으로부터 수득된 단핵구에서 분화되었다. 따라서, 본 출원인은 DC 성숙에 대한 다양한 농도의 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG의 효과를 시험하였다. IFN-분화된 DC에서, 세포 표면상의 CD80, CD83, CD40, HLA-DR, HLA-ABC 및 CD86의 상향 조절은 B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG의 24h 동안 처리 후 용량 의존적인 방식으로 검출되었다(도 2A). 마우스 DC에서와 같이, 사용된 저 농도(0.2μM)로는 상기 DC 표현형을 유도할 수 없었다. 동일한 결과가 IL-4-분화된 인간 DC에 대해 제시되었다. 본 출원인은 CβG가 인간 혈액 mDC를 효과적으로 활성화시켜, 마우스 DC에서 관찰되는 바와 같이 상당한 양의 IL-1b, TNFα 및 IL-12를 산출한다는 것을 추가로 입증하였다. 특히, CβG가 혈액 mDC로부터 IL-1b의 유도에 대해 E. 콜라이(E. coli) LPS보다 더욱 강력하였다(도 2B).

CβG에 의한 mDC 활성화는 증가된 동종이형 나이브 CD4+ T 세포 증식을 산출하였다. 이는 또한 향상된 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포 반응 뿐만 아니라 MART-1 특이적 CD8+ T 세포 반응을 산출하였다. CβG가 CD4+ T 세포 증식에 대해 E. 콜라이(E. coli) LPS보다 더욱 효과적이었지만, CβG 및 E. 콜라이(E. coli) LPS 모두는 교차-제시 어세이에서 보여진 바와 같이 유사한 수준의 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포 반응을 산출하였다.

이를 함께 고려하면, 상기 결과는 브루셀라 CβG가 DC 및 대식세포의 pan-활성화제(pan-activator)라는 것을 나타낸다.

브루셀라 CβG는 생체 내 및 시험관 내에서 내독성이 아니다.

CβG가 강한 활성화를 유발할 수 있었고, 매개된 활성화는 TLR4 경로에 의존적인 것으로 여겨졌기 때문에, 본 출원인은 시험관 내 및 생체 내에서 발생되는 가능한 내독성을 조사하였다. 다양한 어세이, 특히 리뮬러스 아모에보사이트(Limulus amoebocyte) 용리액 어세이, 다양한 아고니스트가 주사된 스위스 마우스에서의 DL50 및 크롬 방출에 의해 측정된 바와 같은 대식세포 내의 독성이 사용되었다. 표 1은 CβG가 E. 콜라이(E. coli) LPS 및 브루셀라 LPS와 비교하여 독성이 전혀 없다는 것을 보여준다. 예상대로, 브루셀라 LPS와 비교하면, E. 콜라이(E. coli) LPS는 매우 저 농도에서도 내독성 쇼크를 유도할 수 있었다.

B. 멜리텐시스(B. melitensis) CβG에는 내독성 특성이 없다.

	리뮬러스 아모에보사이트 용리액	마우스의 LD50	대식세포에서의 독성
E. 콜라이 LPS	0.1ng/ml	65㎍	25㎍
B. 멜리텐시스 LPS	0.1ng/ml	>250㎍	>50㎍
B. 멜리텐시스 CβG	>105ng/ml	>500㎍	>100㎍

리뮬러스 아모에보사이트(Limulus amoebocyte) 용리액은 Pyrogent MA Bio products Inc. Walkersville USA 사제이다. 매뉴얼 지침에 따라 방법을 수행하였다.

LD50을 0.1ml의 적합한 LPS 농도로 스위스 마우스(20 내지 22g)에서 측정하였다. 12, 24, 48 및 72h에 사망이 기록되었고, 50% 치명적 투여량을 프로빗 방법(The probit Method(20))에 의해 측정하였다. 복막 대식세포에 대한 독성을 크롬 방출 방법을 사용하여 수행하였다.

실시예 2: 브루셀라 CBG 의 아쥬반트 활성

방법:

뱀독에 대항하는 항체의 유도를 위한 CβG의 아쥬반트 활성을 (24)에서 제안된 방법에 따라 평가하였다. 간략하게는, PBS에 희석된 보트롭스 아스페르(Bothrops asper)의 독을 칼슘 알기네이트 또는 PBS(대조군)와 혼합하고, 혼합물을 유화시켰다. 이후 CD-1 마우스에 혼합물을 피하 주사하여, 50μl/마우스의 부피 내 20㎍의 독 당량을 제공하였다. 또다른 그룹의 마우스에게 칼슘 알기네이트와 독의 동일한 혼합물(그러나, 또한 마우스 당 100㎍의 B. 아보르투스 CβG를 포함함)을 동일한 경로를 통해 주사하였다. 마지막으로 한 마우스 그룹에게 PBS에 희석된 독만을 주입하였다. 면역화된 마우스를 "0"일에서 제30일까지 출혈시키고, B 아스페르(B. asper)의 독에 대항하는 항체를 공액체로서 항-마우스 Ig-호스래디쉬 퍼옥시다아제 및 전체 독 항원으로 코팅된 플레이트를 사용하는 간접 ELISA에 의해 측정하였다(24). 상이한 그룹의 마우스의 독립된 값을 평가하고, 차이를 단방향 ANOVA 분석(http://www.uv.es/~lejarza/anova/anova.html) 후, Fisher 유의성(PLSD) 분석(http://www.graphpad.com/faq/viewfaq.cfm?faq=176)에 의해 평가하였다.

결과:

칼슘 알기네이트는 독에 대항하여 면역학적 반응을 유도하는데 고전적으로 사용되는 면역아쥬반트이다. 도 4에 나타난 바와 같이, CβG는 21일 및 28일 후 항-독 면역글로불린의 생성을 위해 칼슘 알기네이트와 상승작용을 한다(도 4A). 따라서, 항체 생성의 키네틱은 가속화되고, 아쥬반트 활성은 칼슘 알기네이트 단독으로 관찰된 것보다 더 높다(도 4B).

참조문헌:

본 출원을 통틀어, 다양한 참조문헌이 본 출원이 속하는 당업계의 상태를 기재한다. 상기 참조문헌의 기재가 본 출원에 참조로서 인용된다.

Claims (10)

1. 하나 이상의 시클릭 베타 글루칸(CβG) 화합물을 포함하는 면역아쥬반트 화합물.
2. 제1항에 있어서,
   하나 이상의 CβG가 하나 이상의 천연 치환 잔기로 치환될 수 있는 면역아쥬반트 화합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   하나 이상의 천연 치환 잔기가 숙시닐 잔기인 면역아쥬반트 화합물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   천연 치환 잔기의 수가 0 내지 25, 바람직하게는 0 내지 3인 면역아쥬반트 화합물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   하나 이상의 CβG가 B. 멜리텐시스(B. melitensis) 및/또는 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus)로부터 수득된 CβG인 면역아쥬반트 화합물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 면역아쥬반트 화합물을 하나 이상의 항원과 함께 포함하는 백신 조성물.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   약제로서 사용하기 위한 면역아쥬반트 화합물.
8. 백신 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 면역아쥬반트 화합물의 용도.
9. 하기를 포함하는 키트:
   - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 면역아쥬반트 화합물,
   - 하나 이상의 항원.
10. 대상체에서 수지상 세포(DC: dendritic cell)의 성숙을 유도하는 치료방법에 사용하기 위한 시클릭 베타 글루칸(CβG) 화합물.

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