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KR20130119955A - 항원 차폐제로서의 사용을 위한 인간 락토페린 유래 펩티드 - Google Patents

항원 차폐제로서의 사용을 위한 인간 락토페린 유래 펩티드 Download PDF

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KR20130119955A
KR20130119955A KR1020137016498A KR20137016498A KR20130119955A KR 20130119955 A KR20130119955 A KR 20130119955A KR 1020137016498 A KR1020137016498 A KR 1020137016498A KR 20137016498 A KR20137016498 A KR 20137016498A KR 20130119955 A KR20130119955 A KR 20130119955A
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베네디크트 하르트비크
후안 또메 알깔데
노르베르트 빈트하프
마리아 델 삘라 안수아떼기 빤싸노
마띠아스 하비에르 바라 까레라
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에보니크 룀 게엠베하
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Abstract

본 발명은 포유동물 유기체에서 포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질을 전달하기 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 항원 차폐제로 사용하기 위한 인간 락토페린 유래 펩티드로써, 상기 제약 조성물은 생물학적 활성 물질과 인간 락토페린 유래 펩티드의 초분자 응집체를 포함하고, 포유동물 유기체에게 제약 조성물의 전달 후 생물학적 활성 물질에 대한 원치 않는 면역 반응의 유도가 없거나 감소된 유도만이 존재하는 효과를 가지는, 인간 락토페린 유래 펩티드에 관한 것이다.

Description

항원 차폐제로서의 사용을 위한 인간 락토페린 유래 펩티드 {HUMAN LACTOFERRIN DERIVED PEPTIDE FOR USE AS AN ANTIGEN MASKING AGENT}
이뮤노글로불린 G에 관한 일반 지식: 이뮤노글로불린 G (IgG)는 항체 분자이다. IgG는 가장 풍부한 이뮤노글로불린으로써, 혈액과 조직액 중에 대략 균등하게 분포되어 있으며, 포유동물 및 인간 혈청 이뮤노글로불린의 주요 부분을 구성한다. IgG 분자는 혈장 B 세포에 의해 합성 및 분비된다.
IgG 항체는 주로 2차 면역 반응에 관여한다. 특정 IgG의 존재는 일반적으로 항체 반응의 성숙에 상응한다. IgG는 인간 태반을 통과함으로써 자궁의 태아에 보호를 제공할 수 있는 유일한 항체 이소형이다. 모유에서 분비되는 IgA와 함께, 태반을 통하여 흡수된 잔류 IgG는 그 자신의 면역계가 발달되기 전의 신생아에게 체액성 면역을 제공한다.
IgG는 많은 종류의 병원체, 예를 들어 바이러스, 박테리아 및 진균에 결합할 수 있으며, 응집 및 고정, 보체 활성화 (고전적 경로), 포식작용을 위한 옵소닌화(opsonization) 및/또는 독소의 중화에 의해 상기 병원체로부터 신체를 보호한다. 그것은 또한 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)에서 중요한 역할을 한다.
포유동물 IgG 생성 면역 반응은 다른 면역 반응 연속단계 및 신호전달 경로와 강하게 연결되어 있다. 따라서, 포유동물 개체에서, 합텐 또는 면역원 모티프 및 수용체들, 그리고 수용체 족들은 많은 공지 및 미지의 방식으로 개별적으로 상관되어 조절된다.
그것이 치료제로서 도입된 임의의 생물학적으로 활성인 작용제가 많은 개별 투여 후에도 원하는 것에 더하여 원치않는 것으로써의 면역 반응을 도입할 수도 있는 이유이다.
WO 2007/048599호는 생물학적 장벽을 통한 수송을 위한 1종 이상의 신호 물질, 및 1종 이상의 활성 성분이 포함되며, 담체, 신호 물질 및 활성 성분이 서로와의 공유 결합을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 중합체성 담체 기재의 미립자 약물 전달 시스템에 대해 기술하고 있다. 상기 신호 물질은 락토페린 또는 락토페린으로부터 유래하는 펩티드이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 신호 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 가지는 펩티드들의 군에서 선택된다:
Figure pct00001
또는 이들의 유도체.
바람직한 실시양태에서, WO 2007/048599호의 세포-침투 펩티드는 WO 2007/048599호의 서열 3, 서열 4, 서열 29 또는 서열 30에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열, 또는 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상의 동일성, 특히 바람직하게는 75% 초과, 더 우수하게는 90% 초과의 동일성을 가지는 상응 서열을 포함한다.
WO 2007/076904A1호는 인간 락토페린 단백질 또는 소 락토페린 단백질의 8개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가지고 있어 세포-침투 펩티드로서 작용하는 데에 적합한 펩티드에 대해 기술하고 있다. WO 2007/076904A1호 및 WO 2007/048599호에 언급되어 있는 펩티드들 중 많은 것이 동일하다.
WO 2007/076904A1호에서 실시예 중 최고의 효과를 가지는 가장 유망한 세포-침투 펩티드는 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (WO 2007/076904A1호의 서열 3, 본원의 서열 1)이다.
상기 락토페린 유래 세포-침투 펩티드는 백신용의 DNA, RNA, 펩티드 또는 항원과 같은 활성의 제약 성분인 적재물 분자의 수송을 가능케 하기 위한 것으로써, 경구로 섭취되어 생물학적 막을 통과함으로써, 인간 또는 동물 유기체에서 이들 분자의 효율적인 흡수를 가능케 할 수 있다.
질환을 치유하기 위하여 포유동물 유기체에 전달되는 생물학적 활성 물질이 원치 않는 면역 반응을 유도하는 경우, 이는 나중에 그 특정 유기체에 다시 한번 동일한 생물학적 활성 물질이 전달되어야 할 때 심각한 문제가 될 수 있다.
본 발명의 목적은 포유동물 유기체에서 포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질을 전달하기 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 아주반트 또는 부형제로서 사용될 수 있으며, 포유동물 유기체에게 제약 조성물의 전달 후 생물학적 활성 물질에 대한 원치 않는 면역 반응의 유도가 없거나 감소된 유도만이 존재하는 효과를 가지는, 항원 차폐제(antigen masking agent)를 발견하는 것이었다.
상기 문제는, 포유동물 유기체에서 포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질을 전달하기 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 항원 차폐제로 사용하기 위한 인간 락토페린 유래 펩티드로써, 상기 제약 조성물은 생물학적 활성 물질과 인간 락토페린 유래 펩티드의 초분자 응집체를 포함하고, 포유동물 유기체에게 제약 조성물의 전달 후 생물학적 활성 물질에 대한 원치 않는 면역 반응의 유도가 없거나 감소된 유도만이 존재하는 효과를 가지는, 인간 락토페린 유래 펩티드에 의해 해결된다.
본 발명은 포유동물 유기체에서 포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질을 전달하기 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 항원 차폐제로 사용하기 위한 인간 락토페린 유래 펩티드로써, 상기 제약 조성물은 생물학적 활성 물질과 인간 락토페린 유래 펩티드의 응집체를 포함하고, 포유동물 유기체에게 제약 조성물의 전달 후 생물학적 활성 물질에 대한 원치 않는 면역 반응의 유도가 없거나 감소된 유도만이 존재하는 효과를 가지는, 인간 락토페린 유래 펩티드에 관한 것이다.
상기 인간 락토페린 유래 펩티드는 인간 락토페린으로부터 유래하기 때문에, 인간 면역원성 시스템에 대하여 면역원성이지 않다. 놀랍게도, 서열이 유전적으로 보존되어 있지는 않지만, 상기 인간 락토페린 유래 펩티드는 포유동물, 바람직하게는 예를 들어 약물의 개발에서 모델 종으로 사용되는 돼지, 양, 소 또는 개와 같은 생산용 동물(production animal) 또는 가축 동물의 면역원성 시스템에 대하여 면역원성이 아니거나 낮은 정도로만 면역원성이다. 따라서, 본 발명의 이익은 사람에서의 적용으로 제한되는 것이 아니라, 수의과 적용분야 및 동물 모델을 사용한 인간 요법의 개발에도 적용될 수 있다.
인간 락토페린 유래 펩티드
상기 인간 락토페린 유래 펩티드는 19 내지 30개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
상기 인간 락토페린 유래 펩티드는 19 내지 30개 아미노산의 길이를 가질 수 있으며, 서열 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 서열 1의 서열과 90, 95 또는 98% 이상 상동성인 서열을 포함할 수 있다.
상기 인간 락토페린 유래 펩티드는 바람직하게는 서열 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 90, 95 또는 98% 이상 상동성인 서열을 가지는 펩티드이다.
가장 바람직하게는, 상기 인간 락토페린 유래 펩티드는 서열 1의 서열과 90, 95 또는 98% 이상 상동성이며, 위치 2 및 19에 시스테인 잔기가 존재한다. 바람직하게는, 상기 시스테인 잔기들은 내부 Cys-Cys-가교를 형성하면서 산화된 형태로 존재한다.
펩티드 GMP-합성에 사용되는 임의의 추가적인 표준 화학적 변형, 예컨대 N-아세틸화, 아실화, 메틸화, 벤질화, C-아미드화, 에스테르화, C-말단-벌크에스테르, 등입체성(isosteric) 아미노산 변형 및 비-자연 아미노산 예컨대 티오페닐-알라닌 또는 시클로프롤린-알라닌 또는 아미드-, 에스테르-, 또는 에테르-백본을 가지는 임의의 다른 아미노산 치환이 포함될 수 있다.
그러나, 내부 Cys-Cys-가교의 형성 이외에는, 상기 인간 락토페린 유래 펩티드는 추가적인 화학적 변형을 나타내지 않게 되는 것이 바람직하다.
포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질
제약 형태 또는 제약 제제에는 보통 포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질이 포함 또는 함유되어 있다.
포유동물 유기체에 의한 원하는 면역 반응을 유도하는 데에 사용되는 것을 목적으로 하는 생물학적 활성 물질, 예를 들어 대부분의 백신은 "원치 않는 면역 반응"의 정의 영역에 속하지 않는다.
포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질은 바람직하게는 생물학적 활성 단백질 또는 생물학적 활성 펩티드, 항혈청, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 군에서 선택될 수 있다. 역시 거명되는 것은 다른 "가용성 수용체" 또는 "가용성 수용체 결합제"를 제공하는 재조합 단백질, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-화된 것과 같은 변형된 재조합 단백질은 물론, 항생제, 펩티드-약물 및 펩티드-모방체와 같이 해당 위험성이 알려져 있거나 잠재적으로 관련되어 있는 소형 분자를 포함한, 원치 않는 부작용과 같은 면역원성의 위험성을 가지는 치료제들이다.
원치 않는 IgG 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질은 포유동물 유기체에 수혈되는 혈액의 샘플 중에 포함되어 있을 수도 있다.
원치 않는 IgG 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질은 포유동물 유기체에 이식되는 기관의 표면에 또는 표면상에 포함되어 있다.
원치 않는 면역 반응
포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응은 면역 반응과 상이하거나 면역 반응이 원치 않는 부작용인, 원하는 유익한 치료 효과를 부여하기 위하여 포유동물 유기체에 전달되는 생물학적 활성 물질에 대한 항체의 생성에 의한 면역계의 반응이다.
원치 않는 면역 반응은 (주로) IgG 면역 반응일 수 있다.
원치 않는 면역 반응은 (주로) IgE 면역 반응일 수 있다.
원치 않는 면역 반응이 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질을 포함 또는 함유하는 해당 제약 형태 또는 제약 제제의 첫 번째 전달시에는 원치 않는 부작용을 야기하지 않을 수 있다 할지라도, 원치 않는 (IgG 또는 IgE) 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질을 포함 또는 함유하는 제약 제제가 두 번째로, 또는 다른 번째로, 또는 수회 또는 일정 시간 기간에 걸쳐 전달되거나 전달되어야 하는 경우에는 원치 않는 면역 반응이 원치 않는 부작용을 야기할 수 있다. 이와 같은 경우, 예를 들어 혈장 중에 존재하는 IgG-농도가 생물학적 활성 물질을 부분적으로 또는 완전히 불활성화함으로써 그의 원하는 치료 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 경우, 생물학적 활성 물질의 부분적이거나 완전한 불활성화는 자극, 열 또는 기타 원치 않는 부작용을 함께 동반할 수도 있다. 이러한 부작용들은 생물학적 활성 물질과의 IgG-항체 응집체 또는 침전물의 존재에 의해 비특이적으로 유도될 수 있다.
포유동물 유기체에 의한 원치 않는 IgG 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질의 전형적인 예는 예를 들어 독성 동물, 예컨대 뱀, 곤충, 거미 또는 특정 해파리 종의 독에 대한 항-독-항혈청으로써, 여기서 상기 항-혈청은 동물, 보통은 말에 의해 생성되는데, 상기 독과 접촉된 인간을 치료하는 것을 목적으로 한다. 항-혈청의 첫 번째 전달 후, 개체인 인간은 보통 말 단백질, 주로 상기 항-혈청에 포함되어 있는 말 IgG-항체에 대한 원치 않는 우세한 IgG 면역 반응을 발생시킨다.
잘 알려져 있는 것은 말에 의해 생성되는 특이적 항-뱀-독 항혈청의 경우로써, 그것이 뱀 독의 심각한 효과를 치료하기 위하여 특정 뱀 종에 물린 인간에게 전달되는 경우이다. 항-뱀-독 항혈청의 첫 번째 전달 후, 개체인 사람은 독의 불활성화에 의해 치료될 수 있으나, 말 단백질, 주로 상기 혈청에 포함되어 있는 말 IgG-항체에 대한 원치 않는 IgG 면역 반응을 발생시킬 수도 있다. 동일한 사람이 나중에 동일하거나 또 다른 뱀에 의해 물릴 경우, 다시 말 항-뱀-독 항혈청을 사용하여 그를 치료하는 것은 위험할 수 있는데, 말 혈청 단백질에 대하여 발생되는 IgG 항체의 현재 농도 때문이다.
항-림프구/항흉선-림프구 글로불린이 사용되는 인간 저-위험 골수형성이상 증후군의 면역조절 요법에 대해서도 알려져 있다. 이 요법에서는, 인간 면역원성 세포에 대하여 야기되는 항체를 가지며 토끼 또는 말에서 제조되는 글로불린이 특정 시간 기간에 걸쳐 인간 환자에게 전달된다. 이 경우에도, 상기 글로불린 분획에 포함되어 있는 토끼 또는 말 단백질, 주로 말 IgG 항체에 대한 원치 않는 IgG 면역 반응의 위험성이 존재한다. 이와 같은 원치 않는 IgG 면역 반응은 현재 또는 반복되는 요법에 부정적으로 영향을 줄 수 있다.
역시 알려져 있는 것은 암 세포상 에피토프에 대하여 생성된 모노클로날 항체를 포함 또는 함유하는 제약 제제의 적용이다.
본 발명의 의미에서의 원치 않는 IgG 면역 반응의 억제가 유익할 수 있는 다른 경우는 원치 않는 IgG 면역 반응이라는 의미에서 수혈된 혈액과 환자 면역계 사이의 불화합이 발생할 수 있는 혈액 이전 분야일 수 있다.
본 발명의 의미에서의 원치 않는 IgG 면역 반응의 억제가 유익할 수 있는 또 다른 경우는 원치 않는 IgG 면역 반응이라는 의미에서 이전된 기관 (여러 예들 중에서도 특히 신장, 간, 폐 또는 심장일 수 있음)과 환자 면역계 사이의 불화합이 발생할 수 있으며, 그에 따라 적어도 부분적으로 반발 또는 거부 반응을 촉진할 수 있는 기관 이전 분야일 수 있다.
포유동물 유기체에 의한 원치 않는 IgG 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질은 따라서 약리학적 또는 생물학적 활성의 단백질 또는 펩티드, 특히 그것이 전달되는 포유동물 유기체에 대하여 선천적이 아닌 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다.
선천적이 아니라는 것은 생물학적 활성의 단백질 또는 펩티드가 그것이 전달되는 종과 비교할 때 또 다른 종, 바람직하게는 또 다른 포유동물 종, 또는 반 합성 기원의 동일한 종 중 어느 하나로부터 기원한다는 것을 의미할 수 있다.
선천적이 아니라는 것은 생물학적 활성의 단백질 또는 펩티드가 그것이 전달되려고 하는 포유동물 유기체의 IgG-면역 반응에 의해 검출가능하게 되는 방식으로 변형되었다는 것을 의미할 수 있다.
원치 않는 IgG-면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질이 전달될 수 있는 바람직한 포유동물 유기체는 호모 사피엔스이다.
예를 들어, 특정 포유동물 유기체로부터 기원하는 단백질은 그것이 재조합 미생물 유기체에 의해 제조된 경우, 상기 포유동물 유기체의 IgG-면역 반응에 의해 검출가능하게 될 수 있다.
예를 들어, 진핵 공급원 유기체로부터 기원하는 글리코실화된 단백질은 그것이 재조합 원핵 유기체에서 제조되는 경우 보통 글리코실화가 결핍되게 된다. 따라서, 상기 재조합 단백질은 제약 제제의 형태로 다시 해당 유기체로 전달되는 경우, 그 원래의 공급원인 포유동물 유기체의 IgG-반응에 의해 검출가능하게 될 수 있다.
원치 않는 IgE 면역 반응과 관련된 부작용은 예를 들어 알레르기, 과민증 또는 심지어는 과민성 쇼크와 같이 잘 알려져 있다.
포유동물 유기체에 의한 원치 않는 IgG 또는 IgE 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질은 항혈청, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 다른 "가용성 수용체" 또는 "가용성 수용체 결합제"를 제공하는 재조합 단백질, 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-화, 말단절단 또는 유전적으로 변형된 것과 같은 변형된 재조합 단백질은 물론, 항생제, 마취제와 같이 해당 위험성이 알려져 있는 소형 분자를 포함한, 원치 않거나 중대하거나 치명적인 부작용 예컨대 과민증 및 과민성 쇼크와 같은 면역원성의 위험성을 가지는 치료제들은 물론, 펩티드-약물 및 펩티드-모방체, 성장- 또는 괴사 인자, 또는 체액 분획 예컨대 인간 혈액 또는 세포 배양액으로부터의 혈액 인자와 같은 혼합물을 포함한, 면역원성이 잠재적으로 관련되어 있는 임의의 생물학적으로 활성인 화합물을 포함하거나 이들로 이루어진 제제를 포함할 수 있다.
한편, 인간 락토페린 단편의 면역조절 효과는 알레르기 분야에서 잠재적 면역 반응 유도 작용제를 조작하기 위한 항원 차폐 효과를 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 화분, 잔디-화분, 우유 단백질, 멜리틴(mellitine), 계란 단백질 등과의 인간 락토페린 단편의 결합은 이들 에피토프 및 항원에 대한 인간 유기체의 알레르기 반응을 조작할 수 있다.
제약 조성물
인간 락토페린 유래 펩티드는 포유동물 유기체에서 생물학적 활성 물질을 전달하기 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 항원 차폐제로서 사용될 수 있다.
제약 조성물은 바람직하게는 펠렛, 과립, 미니정제, 정제 또는 캡슐, 또는 기타 제약 형태에서 선택되는 제약 형태 또는 바람직하게는 다미립자형 제약 형태일 수 있다. 제약 조성물에는 수의과용의 제약 조성물이 포함될 수도 있다.
인간 락토페린 유래 펩티드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 제약 조성물은 제약 형태의 제제화에 유용한 것으로 숙련자에게 알려져 있는 추가적인 부형제들을 포함할 수 있다. 통상적인 부형제는 항산화제, 증백제, 결합제, 희석제, 충전재, 향미제, 유동 조제, 방향제, 활택제, 침투-촉진제, 색소, 가소제, 중합체, 세공-형성제, 용매 또는 안정화제이다.
제약 조성물은 임의의 제약 부형제, 예를 들어 제약 형태의 제제화에 유용한 것으로 숙련자에게 알려져 있는 추가 부형제를 80 중량% 이하, 50 중량% 이하, 25 중량% 이하, 10 중량% 이하로 포함할 수 있거나, 본질적으로 포함할 수 있거나, 함유할 수 있다.
초분자 응집체
가장 바람직하게는, 인간 락토페린 유래 펩티드 및 생물학적 활성 물질은, 복합체 또는 접합체로도 지칭될 수 있으며 인간 락토페린 유래 펩티드 및 생물학적 활성 물질이 서로 공유 결합되어 있지 않은 초분자 응집체를 형성한다. 이와 같은 경우에서, 초분자 응집체는 예를 들어 이온력 또는 반-데르-발스력에 의해 함께 유지된다.
이러한 초분자 응집체는 수성 또는 공정 매체 용액 또는 현탁액 중 생물학적 활성 화합물에 인간 락토페린 유래 펩티드를 첨가하는 것에 의해 매우 유리하게 제조될 수 있다. 이와 같은 용액은 짧은 시간, 바람직하게는 2분 이하 동안 약하게 혼합되거나, 또는 1시간 이하, 2시간 이하 또는 그 초과로 인큐베이션되어야 한다.
인간 락토페린 유래 펩티드 및 생물학적 활성 물질 이외에도, 초분자 응집체는 추가적으로 담체, 예를 들어 수지상 중합체와 같은 담체 중합체를 포함 또는 함유할 수 있다.
덜 바람직하나 역시 가능하게는, 인간 락토페린 유래 펩티드 및 생물학적 활성 물질은 인간 락토페린 유래 펩티드와 생물학적 활성 물질이 서로 공유 결합되어 있는 초분자 응집체를 형성한다. 이와 같은 경우, 초분자 응집체는 인간 락토페린 유래 펩티드의 반응성 기와 생물학적 활성 물질의 반응성 기와의 화학적 반응에 의해 형성될 수 있다. 대안적인 추가 화학 반응성 링커 분자가 분자들을 연결하는 데에 사용될 수도 있다.
바람직하게는, 초분자 응집체는 20 중량% 이상, 50 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상 또는 100 중량%의 인간 락토페린 유래 펩티드 및 생물학적 활성 물질을 포함할 수 있거나, 본질적으로 포함할 수 있거나, 함유할 수 있다. 초분자 응집체는 추가적인 부형제들을 포함할 수 있는 제약 조성물의 일부일 수 있다.
바람직하게는, 제약 조성물은 20 중량% 이상, 50 중량% 이상, 75 중량% 이상, 90 중량% 이상 또는 100 중량%의 초분자 응집체를 포함할 수 있거나, 본질적으로 포함할 수 있거나, 함유할 수 있다.
제약 조성물의 제조 방법
본 발명은 천연 조건하에서 인간 락토페린 유래 펩티드와 생물학적으로 활성인 작용제를 혼합하고, 상기 혼합물을 인큐베이션함으로써 초분자 응집체의 (공유 또는 비공유) 형성을 가능케 하고, 상기 혼합물을 제약 조성물에 첨가하는 것에 의한, 본원에서 정의되는 바와 같은 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이기도 하다.
가장 단순한 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 혼합물과 동일할 수 있는데, 이는 최종 제약 조성물이 본질적으로 인간 락토페린 유래 펩티드와 생물학적으로 활성인 작용제만을 함유한다는 것을 의미한다. 그러나, 많은 경우에서는, 추가적인 제약 부형제들을 첨가함으로써 (최종) 제약 조성물을 형성시키는 것이 유리하거나 적절할 수 있다.
천연 조건은 인간 락토페린 유래 펩티드 및 생물학적으로 활성인 작용제의 생물학적 활성이 유지되는 조건을 의미할 수 있다. 천연 조건은 예를 들어 인간 락토페린 유래 펩티드와 생물학적으로 활성인 작용제를 수성 완충 용액 예를 들어 pH 7.4의 포스페이트 완충 염수, 또는 생리 염화나트륨 용액 중에서 혼합하는 것일 수 있다.
혼합물을 인큐베이션하여 초분자 응집체의 형성을 가능케 하는 것은 인간 락토페린 유래 펩티드와 생물학적으로 활성인 작용제의 응집을 가능케 하는 데에 충분한 시간을 의미할 수 있다. 보통 실온에서 2분 이하 동안의 혼합 및 인큐베이션이면 충분할 수 있다. 그러나, 1시간 이하, 2시간 이하 또는 그 초과 동안의 인큐베이션 역시 적합할 수 있다. 초분자 응집체의 형성을 위한 적합한 온도는 0 내지 37℃, 바람직하게는 4 내지 30℃의 범위일 수 있는데, 18 내지 28℃ 부근의 실온이면 적합할 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간 락토페린 단편 (hLf)의 박테리아 용해물과의 비-공유 커플링
재료: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 박테리아 용해물, 인간 락토페린 단편, 서열 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR, 포스페이트 완충 염수, pH=7.4 (Ph. Eur.): 5.97 g의 디나트륨 수소 포스페이트 2수화물 (4.76 g의 디나트륨 수소 포스페이트에 해당), 0.38 g의 칼륨 2수소 포스페이트 및 16 g의 염화나트륨을 1.8 l의 증류수에 용해시켰다. 이후, 제조된 투명 용액을 2 l 용량 플라스크에 넣고, 검량 표시까지 증류수를 채운 후, 이어서 균질화하였다. 다음에, 23.2℃에서 3 ml의 HCl 1 N을 사용하여 pH를 7.43으로 조정한 후, 최종 용액을 PE 병에 채웠다.
장치: 말베른 제타사이저 나노(Malvern Zetasizer Nano) ZS90; 크기 파라미터:
재료: 단백질 RI: 1.45 흡수: 0.00, 분산제: 물 25℃: 0.8872cP RI: 1.330; 37℃: 0.6864cP RI: 1.330, 셀: DTS 1060C: 투명 일회용 제타 셀
측정: 자동 3 전개, 포지셔닝(positioning) 방법: 최적 위치 탐색, 자동 어텐션(attention) 선택, 분석 모델: 일반 목적의 제타 파라미터: 유전 상수: 25℃에서 78.5 및 37℃에서 74.4
모델: 스몰루초우스키 F(KA) 값: 1.5, 측정: 자동 3 전개 자동 어텐션 선택
샘플 제조
펩티드 산화: 펩티드를 포스페이트 완충 염수 (PBS), pH 7.4 (Ph. Eur.) 중에 1 mM (2.75 mg/mL) 미만 농도로, 예컨대 10 mL 중 5 mg (= 0.5 mg/mL)로 용해시켰다. 37℃에서 5분 동안 순수 산소로 용액을 퍼징하였다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 박테리아 용해물 희석을 위하여, 1 mL의 박테리아 세포 용해물을 PBS pH 7.4 (Ph. Eur.)로 10 mL까지 희석하였다.
0.097714286 mg hLF와 함께 1 ml의 박테리아 용해물 (= 1.2 mg 이. 콜라이)을 첨가함으로써, 용해물 입자에 대한 결합을 달성하였다.
20 μL의 0.5 mg/mL 펩티드 용액을 1 mL의 미리 희석된 백신 (0.12 mg/mL)에 첨가하고, 4℃에서 100-150 rpm으로 느리게 교반하여 임의의 거품 형성을 방지하면서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
Figure pct00002
결과
제타 전위 (도 1)
이. 콜라이 용해물은 음으로 하전된 표면 입자로 이루어진 현탁액인 것으로 나타났다. 응집체의 형성이 관찰되기는 하지만, hLF 펩티드 단편은 전체적으로 양의 전하를 나타내며, 첫 번째 것에 대한 두 번째 것의 첨가는 용해물 표면 특성의 변화를 초래한다.
입자 크기 (도 2)
도면의 "입자 크기"는 평균을 나타낸다.
입자 크기 데이터는 하기의 결과를 나타낸다:
* 하기의 모든 경우에서 응집이 발생하는 경향이 있음: 백신 단독, hLF 단편 단독, 및 이들의 조합.
* 이러한 응집 현상은 더 큰 입자 크기로 이어짐.
* 응집 및 침강이 발생할 수 있음, 초음파처리 및/또는 적합한 교반에 의해 역전됨.
실시예 2: 항원, 인간 락토페린 단편, 및 항원과 인간 락토페린 단편의 조합을 사용한 처리에 의한 래트 면역계의 면역조절
재료: 박테리아 용해물: 클렙시엘라 뉴모니아에 ( Klebsiella pneumoniae ) CECT 141; 12,000,000 박테리아/mL (최종 농도의 10배), 표준 비-글리세린화 배합물, 페놀 없음, hLF 단편, 동결건조 생성물로서의 서열 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR 산화 형태; 25 mL 바이알 중 각각 50 mg을 바이알에 투여, 검정 내내 원액으로서 재구성 및 사용됨, 일단 재구성된 후에는 냉장 유지 (4℃), 포스페이트 완충 염수 (PBS), 완성 후 즉시 사용되지 않는 경우에는 임의의 적합한 절차에 의해 멸균되어 적합한 용기 중에 저장됨. 4℃에서는 그것이 긴 시간 기간에 걸쳐 저장될 것으로 생각됨.
절차: 바이알에서 20 mL의 PBS의 첨가에 의한 50 mg의 hLF 단편의 재구성에 의해 hLF 원액의 재구성을 수행하였다. 투명하고 균질한 무-입자 용액으로의 완전하고 적정한 재구성을 확인하였다. 밀폐된 바이알의 반복 역전에 의해 바이알을 약하게 진탕하였다. 결과는 시험용 hLF-원액이었다: 공칭 농도 2.5 mg/mL.
동물 시험용 hLF 희석을 매일 수행하였다. 이를 위하여, 1 mL의 재구성된 hLF 원액을 새로운 25 mL 바이알로 옮긴 후, 이어서 21.5 mL의 PBS를 첨가하고, 밀폐된 바이알의 반복 역전에 의해 조심스럽게 혼합함으로써 거품 형성을 방지하였다. 결과는 공칭 농도 0.1 mg/mL의 당일용 원액 희석액이었다.
"A+B" 제제
4.5 ml의 당일 hLf 희석액을 적합한 바이알 (5 ml 용량 또는 더 큰 것)로 옮긴 후, 이어서 0.5 ml의 12,000,000,000 박테리아/mL 박테리아 용해물을 첨가하고, 밀폐된 바이알의 반복 역전에 의해 조심스럽게 혼합함으로써 거품 형성을 방지하였다. 결과는 12:1의 비가 확인된 1,200,000,000 박테리아/mL, 0.1 mg hLf 단편/ml의 A+B 백신 5 ml이었다.
"B" 제제
4.5 ml의 당일 hLf 희석액을 적합한 바이알 (5 ml 용량 또는 더 큰 것)로 옮긴 후, 이어서 0.5 ml의 PBS를 첨가하고, 밀폐된 바이알의 반복 역전에 의해 조심스럽게 혼합함으로써 거품 형성을 방지하였다. 결과는 5 ml의 0.1 mg/ml hLf 단편 용액이었다.
"A" 제제
0.5 ml의 박테리아 용해물 (12,000,000,000 박테리아/ml)를 적합한 바이알 (5 ml 용량 또는 더 큰 것)로 옮긴 후, 이어서 4.5 ml의 PBS를 첨가하고, 밀폐된 바이알의 반복 역전에 의해 조심스럽게 혼합함으로써 거품 형성을 방지하였다. 결과는 1,200,000,000 박테리아/mL의 박테리아 용해물 5 ml이었다 ("A" 박테리아 용해물).
투여량 및 치료제의 투여
"A+B" 투여
A+B 군에 속하는 3마리의 래트 각각에 대하여 "A+B" 0.5 mL 적용 (i.p.).
α+β 군에 속하는 3마리의 래트 각각에 대하여 "A+B" 0.5 mL 적용 (위내로).
"B" 투여
B 군에 속하는 래트에 대하여 B 0.5 mL 적용 (i.p.).
β 군에 속하는 3마리에 대하여 B 0.5 mL 적용 (위내로).
"A" 투여
A 군에 속하는 3마리의 래트에 대하여 백신 A 0.5 mL 적용.
α 군에 속하는 3마리의 래트에 대하여 백신 A 0.5 mL 적용.
동물 처리
클렙시엘라 뉴모니아에 CECT 141의 경구용 용해물을, 위내 또는 복강내로 투여할 경우 모델 유기체로서의 래트에서 IgG 면역 반응을 유도하는 접종용 모델로 사용하였다. 서열 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR의 아미노산 서열을 가지는 인간 락토페린 유래 펩티드를 사용하여 하기의 방식으로 클렙시엘라 뉴모니아에 CECT 141 용해물과의 접합체를 형성시켰다:
3마리 래트의 하기 6개 군을 사용하였다:
a. 군 A: 박테리아 용해물 (제제 "A")이 복강내로 투여될 것임.
b. 군 B: hLf 단편 (제제 "B")이 복강내로 투여될 것임.
c. 군 C: 접합체 (제제 "A+B")가 복강내로 투여될 것임.
d. 군 α: 제제 "A"가 위내로 투여될 것임.
e. 군 β: 제제 "B"가 위내로 투여될 것임.
f. 군 δ: 제제 "A+B"가 위내로 투여될 것임
시험 기간: 4주 (28일)
생성물 적용 패턴
Figure pct00003
파라미터 및 샘플링 일정
측정될 파라미터는 총 IgG이다. 방법은 ELISA에 의해 수행될 것이다. 전체 군에 대한 샘플링 일정은 하기와 같을 것이다 (표 3):
Figure pct00004
결과
시간에 따른 IgG 농도의 변화
대조군 (도 3)
대조군의 동물에서, IgG 농도는 조사된 여러 시점 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 관찰되지 않고 시간에 따라 일정하게 유지되게 된다.
인간 락토페린 ( hLf , "B"-제제)을 포함하는 군 (도 4):
인간 락토페린을 사용한 처리는 투여 양식에 관계없이 어떠한 조사 시점에서도 hLf 처리를 받는 래트의 IgG 농도 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 관찰되지 않음으로써, 시간에 따라 IgG 농도에 대한 어떠한 효과도 유도하는 것으로 보이지 않는다.
박테리아 추출물 ("A"-제제)를 사용하여 처리된 군 (도 5):
박테리아 추출물을 사용한 복강내 처리를 받는 동물에서, 시간이 지나면서 IgG 농도가 상당히 증가하는 경향이 있다는 것이 관찰되었다. 또한, 박테리아 추출물의 투여 수에 따라 IgG 농도가 증가한다는 것에 주목해야 하는데, 이는 이와 같은 처리의 효과가 누적적임을 의미하는 것이어서, 시간에 따른 IgG 농도의 증가를 설명해준다. 동일한 거동이 박테리아 추출물을 사용하여 위내로 처리된 동물에서 관찰된다. 이러한 결과는 매우 중요한데, 그것이 IgG 농도에 대한 박테리아 추출물의 효과가 투여 양식에 무관하다는 것을 나타내기 때문이다.
박테리아 추출물 + hLf 를 사용하여 처리된 군 (도 6)
박테리아 추출물 + hLf를 사용한 처리를 받는 동물과 관련하여서는, 두 가지 기본적 사실에 주목해야 한다. 무엇보다도, 사용된 투여 양식에 관계없이 IgG가 대조군에서 검출된 농도에서 크게 변화하지 않는다는 것을 관찰할 수 있다. 다른 한편으로, 모든 조사 시점에 검출된 IgG 농도는 복강내 또는 위내 투여 중 어느 하나를 사용한 박테리아 추출물의 효과를 바탕으로 예상되는 농도에 미치지 못한다.
여러 군들 사이의 IgG 농도의 비교 분석
복강내 투여
대조군 대 박테리아 추출물 군:
대조군의 IgG 농도를 박테리아 추출물을 사용한 처리를 받은 군에서 발견된 것과 비교한 결과, 박테리아 용해물의 1차 투여 후 6일차에서 시작하여 후자 군에서 통계적으로 유의성 있는 증가가 발견된다 (p<0.001). 이러한 차이는 27일차의 연구 완료시까지 내내 유지된다.
대조군 대 hLf 군:
복강내 투여의 경우, 어떠한 조사 시점에서도 hLF를 사용한 처리를 받은 래트의 IgG 농도와 대조군에서 발견된 것 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이는 발견되지 않았다 (p>0.05).
대조군 대 hLf + 박테리아 추출물 군:
어떠한 조사 시점에서도 hLF + 박테리아 용해물을 사용한 접합 처리를 받은 래트의 IgG 농도와 대조군에서 발견된 것 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이는 발견되지 않았다 (p>0.05).
박테리아 추출물 군 대 hLf 군:
첫 번째 날 (6d)부터 1차 투여 후 27일차의 연구 종료시까지, 박테리아 추출물 단독을 사용한 처리를 받은 래트에서 발견되는 IgG 농도가 hLF 단독을 사용한 처리를 받은 동물에서 발견되는 IgG 농도보다 상당히 더 높다 (p<0.001).
박테리아 추출물 군 대 hLf + 박테리아 추출물 군:
1차 투여 후 모든 조사 시점에서, 박테리아 추출물 단독을 사용한 처리를 받은 래트에서 발견되는 IgG 농도가 hLF 및 박테리아 추출물을 사용한 조합 처리를 받은 동물에서 발견되는 IgG 농도보다 상당히 더 높다 (p<0.001).
hLf 군 대 hLf + 박테리아 추출물 군:
hLf를 사용한 처리를 받은 래트의 IgG 농도와 hLf + 박테리아 추출물을 사용한 조합 처리를 받은 동물에서 검출되는 것 사이에서는 통계적으로 유의성 있는 차이가 발견되지 않았다 (p>0.005). 이는 박테리아 추출물을 사용한 처리의 효과를 차폐하는 hLf의 보호 효과가 있었음에 틀림없음을 암시한다.
위내 투여
상기 여러 처리들이 위내로 투여되는 경우, 결과는 복강내 투여에서 기술된 것과 유사하나; 양 투여 양식 사이에서 소수의 작은 차이가 발견되었다. 이 경우에서는, 박테리아 추출물을 사용하여 처리된 동물과 나머지 군들 (대조, hLf, hLf + 추출물)에서 검출되는 IgG 농도와 관련된 차이가 복강내 투여 양식이 사용되었을 때 이루어졌던 바와 같은 6일차 대신 처리 개시 후 13일차부터 시작하여 통계적으로 유의성을 가지기 시작하였는데 (p<0.001), 다시 말하자면 위내 투여에서 면역 반응에 약간의 지연이 있는 것으로 보였다. 다른 한편으로는, hLf를 사용한 처리를 받는 동물의 군과 hLf + 추출물을 사용한 처리를 받는 동물의 군 사이에서 연구 6일차에 상당한 차이가 발견되었는데, hLf 군에서 IgG 농도가 훨씬 더 높았다.
실시예 2
3가지 상이한 종류의 세포-배양물 및 혈액 유래 자연 글리코실화 단백질들을 천연의, 즉 표에 나타낸 농도와 생리학적으로 유사한 표준 전해질 완충제 중에서 상기한 인간 락토페린 펩티드의 동일한 22량체와 (서열 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR의 서열 사용) 함께 혼합하였다.
형광 표지를 사용하는 표준 시간-상관-공초점 현미경 장비를 사용한 확산 동역학 변화의 즉석 측정은, 낮은 농도 (HBS 중 hLf 94 nM, 0.1% BSA, 130 nM IgG1)에서도, 실시예 1의 화합물 종류를 포함한 치료용 단백질 종류의 예들에 대한 단편의 비특이적 중간 결합에 의한 전체 3종 화합물 종류에 있어서의 제제화의 용이성을 보여주었다.
컬럼 f1은 실험의 최적화 없이 hLf-단편의 채널에 축적되는 겉보기 확산 동역학의 변화를 보여준다. 단백질 I은 그의 재조합 인간 버젼 또는 혈액-생성물로서 알려져 있는 알부민 혈액 단백질 분획이며, 단백질 II는 선택적 IgG 항체이다. 모두 시중 공급원 유래의 것이다. 참조로서의 hLf는 현미경 초점 중 부피 요소에서 "자유로운" 것처럼 이동하는 반면, 각각 약 4% 또는 15%의 단편은 비특이적으로 결합되어 더 느리게 이동한다. hLf-단편의 초분자 응집체가 샘플 제제에서 실현된다는 것을 나타낸다.
Figure pct00005
도면 목록
도 1: 제타사이저를 사용하여 측정된 입자의 직경
도 2: 제타사이저를 사용하여 측정된 입자의 제타 전위
도 3: 대조군에서의 IgG-농도
도 4: "B"-제제 (hLf)를 사용하여 처리된 군에서의 IgG-농도
도 5: "A"-제제 (박테리아 용해물)를 사용하여 처리된 군에서의 IgG-농도
도 6: "A+B"-제제 (박테리아 용해물 + hLf)를 사용하여 처리된 군에서의 IgG-농도
SEQUENCE LISTING <110> Evonik R?m GmbH <120> Human lactoferrin derived peptide for use as an antigen masking agent <130> 201000285 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro 1 5 10 15 Val Ser Cys Ile Lys Arg 20

Claims (11)

  1. 포유동물 유기체에서 포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질을 전달하기 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 항원 차폐제로 사용하기 위한 인간 락토페린 유래 펩티드이며, 상기 제약 조성물은 생물학적 활성 물질과 인간 락토페린 유래 펩티드의 초분자 응집체를 포함하고, 포유동물 유기체에게 제약 조성물의 전달 후 생물학적 활성 물질에 대한 원치 않는 면역 반응의 유도가 없거나 감소된 유도만이 존재하는 효과를 가지는, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 90% 이상 상동성인 서열을 가지는 인간 락토페린 유래 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 서열이 서열 1의 서열과 90% 이상 상동성이며, 위치 2 및 19에 시스테인 잔기가 존재하는 것인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 원치 않는 면역 반응이 IgG 면역 반응인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 원치 않는 면역 반응이 IgE 면역 반응인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 유기체에 의한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질이 생물학적 활성 단백질 또는 생물학적 활성 펩티드, 항혈청, 또는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 군에서 선택되는 것인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질이 포유동물 유기체에 수혈되는 혈액의 샘플 중에 포함되어 있는 것인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 물질이 포유동물 유기체에 이식되는 기관의 표면에 또는 표면상에 포함되어 있는 것인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 물질과 인간 락토페린 유래 펩티드가 초분자 응집체에서 서로 공유 결합되어 있지 않은 것인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 물질과 인간 락토페린 유래 펩티드가 초분자 응집체에서 서로 공유 결합되어 있는 것인, 인간 락토페린 유래 펩티드.
  11. 천연 조건하에서 인간 락토페린 유래 펩티드와 생물학적으로 활성인 작용제를 혼합하고, 혼합물을 인큐베이션하여 초분자 응집체를 형성하고, 혼합물을 최종 제약 조성물에 첨가하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 조성물의 제조 방법.
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