KR20130119933A

KR20130119933A - 다중특이성 포착 시약 및 칵테일형 검출 시약을 이용한 췌장 환자에서의 순환 종양 세포의 검출을 위한 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20130119933A
Application number: KR1020137012278A
Authority: KR
Inventors: 갤러 찬드라 라오; 마크 칼 코넬리
Original assignee: 베리덱스, 엘엘씨
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2013-11-01
Also published as: JP5960146B2; JP2013539868A; CN103154740B; EP2628008B1; TWI577389B; MX347964B; US20120094275A1; BR112013009008A2; IL225646A0; ES2634220T3; EP2628008A1; CA2814528A1; CN103154740A; MX2013004172A; TW201225978A; WO2012051390A1

Abstract

혈액 중 암종 세포의 검출, 계수 및 특성화를 위하여 면역자기 풍부화를 다중파라미터의 유세포 분석법 또는 이미지 세포 분석법과 조합한 고도로 민감한 분석법이 개시된다. 본 발명은 동일한 자성유체에 상이한 항체들을 콘쥬게이션시키는 것을 포함한다. 이는 자성유체를, 자성유체가 결합하는 항원에 대하여 다중특이성으로 만드는 효과를 갖는다. 동일 자성유체 상에 존재하는 다수의 항체는 서로를 차단하거나 또는 달리 서로를 간섭하는 것으로 보이지 않는다. 그러한 자성유체는 하나 초과의 유형의 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 고도로 바람직한 효과를 갖는다. 본 분석법은 낮은 EpCAM 발현을 갖는, 그러나 다른 종양 마커의 높은 발현을 갖는 CTC의 포착을 가능하게 하는 데 특히 유용하다. 따라서, 본 분석법은 암종 세포의 생물학적 특성화 및 병기 설정을 용이하게 한다.

Description

다중특이성 포착 시약 및 칵테일형 검출 시약을 이용한 췌장 환자에서의 순환 종양 세포의 검출을 위한 방법 및 키트{METHODS AND KITS FOR THE DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS IN PANCREATIC PATIENTS USING POLYSPECIFIC CAPTURE AND COCKTAIL DETECTION REAGENTS}

관련 출원

본 출원은 2010년 10월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/393,036호의 우선권 상의 이익을 청구하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은 종양학 및 진단 검사 분야에 관한 것이다. 본 발명은 암의 스크리닝, 병기 설정(staging), 화학요법 치료 반응, 암 재발의 모니터링 등에 유용하다. 더 구체적으로, 본 발명은 종양 세포, 또는 생물학적 샘플로부터 단리된 다른 희귀 세포의 분석 및 계수를 용이하게 하는 시약, 방법 및 검사 키트를 제공한다.

셀서치(CellSearch) CTC 분석법을 이용하여 전이성 유방암, 전립선암 및 결장암에 걸린 환자에 있어서 순환 종양 세포(circulating tumor cell; CTC)를 계수하면 환자 생존성이 예측되고 치료 반응의 모니터링이 가능해진다. 부가적으로, CTC는 다양한 분자 마커에 대하여 특성화될 수 있으며, 이는 환자에 있어서 종양 생물학을 동력학적으로 연구하는 방법으로 제안되어 왔다. 그러나, 췌장암에 걸린 환자에 있어서 CTC의 검출에 관련된 연구는 거의 없었으며, 예비 연구에 의하면 상기 원래의 분석법의 구성이 이들 세포의 검출에 최적이지 않을 수 있음이 시사되었다 (참고로 포함된 미국 특허 제7,332,288호 참조). 원래의 셀서치 CTC 분석법에서는 CTC를 포착하기 위하여 상자성 나노입자(EpCAM 자성유체(ferrofluid))에 콘쥬게이션된(conjugated) 항-EpCAM이 이용된다. EpCAM 자성유체에 의해 포착된 CTC는 CTC를 검출하기 위하여 피코에리트린에 콘쥬게이션된 항-사이토케라틴 항체(CK8, 18 및 19)로 염색된다.

유방암, 전립선암 또는 결장직장암의 것과는 상이한 종양 항원을 발현할 수 있는 상이한 암들로부터의 세포의 문제점에 더하여, 원발 종양 내에서의 세포의 이질성을 설명하는 문헌이 증가하고 있다. 최근의 진보에 의하면, 종양 전구 세포(tumor progenitor cell; TPC)는 일부 암이 화학요법 후 되돌아오는 이유를 설명하는 데 있어서 결정적으로 중요할 수 있음이 밝혀졌다. 이들 TPC는 많은 전통적인 치료법에 대하여 고도로 내성인 것으로 보이며, 미래에 언젠가는 종양을 재확립할 수 있다. 최근에, 전이 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 상피 중간엽 이행 세포(Epithelial Mesenchymal Transition Cell; EMT)가 또한 상기 문헌에서 확인되었다. TPC 및 EMT 둘 모두는 CTC의 것과는 상이한 항원을 발현하는 것으로 생각된다. CTC 포착은 CTC 상에서의 EpCAM의 발현에 의존적이며; 그 이유는 CTC 포착이 단일 포착 항원에 한정되었기 때문이다. CTC 상의 EpCAM의 생물학적 특성은 잘 이해되어 있지 않으며, EpCAM 항원은 일부 CTC에서 하향 조절되거나 또는 음성일 수 있음이 가능하다. 그러한 경우, CTC는 EpCAM 자성유체에 의해 포착되지 않을 것이며, 당해 분석법에서 0의 CTC로 이어질 것이다. 다른 가능성으로는 CTC가 포착되더라도 CTC는 당해 분석법에서 사용되는 사이토케라틴 마커의 부재로 인하여 검출되지는 않는다는 것이 있다. 그 결과, 많은 CTC가 현재의 기술에 의해 성공적으로 포착되고 검출되지만, 현재의 분석법에서 사용되는 마커를 발현하지 못하기 때문에 검출되지 않는 CTC가 암환자의 혈액에 존재하는 것이 가능하다. 마지막으로, TPC 및 EMT가 혈액에서 순환하고 이들이 검출될 수 있는지는 공지되어 있지 않다. 그러나, 현재의 포착 및 검출 기술이 하나의 항원 또는 항원 부류의 표적화에 한정되었다는 사실은 TPC 또는 EMT가 현재의 기술에 의해 검출될 가능성이 없음을 의미한다.

상기한 것을 기반으로 하면, 이차성 종양의 확립 이전에 순환계에서 이들 세포를 확인하는 방법이 특히 암에 있어서 초기에 고도로 바람직함이 명백하다. 많은 실험실 절차 및 임상 절차에서는 희귀 세포를 생물학적 샘플로부터 단리하기 위하여 생체특이성 친화성 반응이 이용된다. 그러한 반응은 일반적으로 진단 검사에서, 또는 넓은 범위의 표적 물질, 특히 생물학적 엔티티(entity), 예를 들어 세포, 단백질, 세균, 바이러스, 핵산 서열 등의 분리에 이용된다.

관심대상의 물질과, 표적 물질이 특이적으로 결합하는 다른 물질 사이의 복합체 형성을 기반으로 하여 상기에 언급된 표적 물질을 분석하거나 또는 분리하는 다양한 방법이 이용가능하다. 미결합 물질로부터의 복합체의 분리는 중력에 의해, 예를 들어 침강에 의해, 또는 대안적으로 표적 물질에 커플링된 미분화 입자 또는 비드의 원심분리에 의해 달성될 수 있다. 원할 경우, 그러한 입자 또는 비드는 결합/자유 분리 단계를 용이하게 하기 위하여 자성으로 만들어질 수 있다. 자기 입자는 면역 반응 및 다른 생체특이성 친화성 반응에서의 그의 사용이 그러한 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,554,088호 및 문헌[Immunoassays for Clinical Chemistry, pp. 147-162, Hunter et al. eds., Churchill Livingston, Edinburgh (1983)]을 참조하라. 일반적으로, 자기 분리 또는 중력 분리를 용이하게 하는 임의의 물질이 이 목적에 이용될 수 있다. 그러나, 자기 분리 수단이 선택되는 방법임이 명확해졌다.

자기 입자는 크기를 기준으로 큰 것(1.5 내지 약 50 마이크로미터), 작은 것(0.7-1.5 마이크로미터), 또는 나노입자로도 칭해지는 콜로이드성인 것(<200 ㎚)으로 분류될 수 있다. 자성유체 또는 자성유체 유사 물질로 또한 공지되어 있으며 고전적인 자성유체의 특성들 중 많은 것을 갖는 후자의 것은 때때로 본 명세서에서 콜로이드성 초상자성 입자로 칭해진다.

상기에 기재된 유형의 작은 자기 입자는 생체특이성 친화성 반응을 수반하는 분석법에서 상당히 유용하며, 그 이유는 상기 입자가 생체기능성 중합체 (예를 들어, 단백질)로 편리하게 코팅되고, 매우 큰 표면적을 제공하며 합리적인 반응 동력학적 특성을 제공하기 때문이다. 0.7-1.5 마이크로미터 범위의 자기 입자는 예로서 미국 특허 제3,970,518호; 미국 특허 제4,018,886호; 미국 특허 제4,230,685호; 미국 특허 제4,267,234호; 미국 특허 제4,452,773호; 미국 특허 제4,554,088호; 및 미국 특허 제4,659,678호를 비롯한 특허 문헌에 기재되었었다. 이들 입자 중 어떤 것은 면역학적 시약을 위한 유용한 고형 지지체인 것으로 개시되어 있다.

상기에 언급된 작은 자기 입자와 같이, 큰 자기 입자(> 1.5 마이크로미터 내지 약 50 마이크로미터)가 초상자성 거동을 또한 나타낼 수 있다. 전형적인 그러한 물질로는 우겔스타드(Ugelstad)에 의해 미국 특허 제4,654267호에 기재되어 있고 다이날(Dynal; 노르웨이 오슬로 소재)에 의해 제조된 것이 있다. 우겔스타드 공정은 팽윤이 야기되는 중합체 입자의 합성을 수반하며, 자철석 결정은 팽윤된 입자 내에 매립된다. 분산된 자철석 결정의 존재 하에 상기 중합체 입자를 합성함으로써 동일 크기 범위의 다른 물질이 제조된다. 이것에 의해 자철석 결정은 중합체 매트릭스 내에 포획되고 그에 따라 생성된 물질은 자성으로 된다. 둘 모두의 경우, 생성된 입자는 초상자성 거동을 갖는데, 상기 거동은 자기장의 제거시에 쉽게 분산되는 능력으로 나타난다. 이전에 언급되고 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 자기 콜로이드 또는 나노입자와는 달리, 이들 물질과, 작은 자기 입자는 입자당 자기 물질의 질량 때문에 단순한 실험실용 자성재료(magnetics)에 의해 쉽게 분리된다. 따라서, 분리는 몇백 가우스/cm만큼 낮은 구배로부터 약 1.5 킬로가우스/cm까지의 구배에서 행해진다. 반면에, 콜로이드성 자기 입자(대략 200 ㎚ 미만)는 그의 확산 에너지, 입자당 작은 자기 질량(magnetic mass) 및 스토크스 항력(Stokes drag) 때문에 사실상 더 높은 자기 구배(magnetic gradient)를 필요로 한다.

오웬(Owen) 등의 미국 특허 제4,795,698호는 중합체의 존재 하에서의 Fe⁺²/Fe⁺³ 염으로부터의 자철석의 형성에 의해 생성되는, 중합체 코팅된 콜로이드성 초상자성 입자에 관한 것이다. 몰데이(Molday)의 미국 특허 제4,452,773호에는 오웬 등의 상기 특허에 개시된 것과 특성 면에서 유사한 물질이 개시되어 있으며, 이는 매우 높은 농도의 덱스트란의 존재 하에 염기 부가를 통하여 Fe⁺²/Fe⁺³으로부터 자철석 및 다른 철 산화물을 형성함으로써 제조된다. 둘 모두의 절차로부터의 생성된 입자는 수개월만큼 긴 관찰 기간 동안 수성 현탁물로부터 침강하지 않는 감지가능한 경향을 나타낸다. 그렇게 제조된 물질은 콜로이드 특성을 가지며, 세포 분리에 매우 유용한 것으로 입증되었다. 몰데이 기술은 독일 베르기슈 글라드바흐 소재의 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec) 및 캐나다 밴쿠버 소재의 테리 토마스(Terry Thomas)에 의해 상용화되었다.

초상자성, 콜로이드성 입자를 제조하는 다른 방법이 미국 특허 제5,597,531호에 개시되어 있다. 오웬 등의 특허 또는 몰데이의 특허에 개시된 입자와는 대조적으로, 이들 후자의 입자는 고출력 음파 에너지에 의해 25 내지 120 ㎚의 범위의 준안정성 결정성 클러스터(cluster)로 분산된, 예비형성된 초상자성 결정 상에 생체기능성 중합체를 직접적으로 코팅함으로써 제조된다. 본 명세서에서 직접적 코팅 입자로 칭해지는 상기 생성된 입자는 몰데이의 특허 또는 오웬 등의 특허에 개시된 것과 같이 동일한 전체 크기의 콜로이드성 입자보다 유의하게 더 큰 자기 모멘트(magnetic moment)를 나타낸다.

자기 분리 기술이 공지되어 있으며, 여기서 강자성체를 유체 매질로부터 분리하기 위하여 자기장을 유체 매질에 가한다. 이와는 대조적으로, 콜로이드성, 초상자성 입자가 현탁액 상태로 남아 있으려는 경향은, 그의 상대적으로 약한 자기 응답성과 함께, 그러한 입자를 그가 현탁된 비자기 유체 매질로부터 분리하기 위하여 고구배 자기 분리(high-gradient magnetic separation; HGMS) 기술의 사용을 필요로 한다. HGMS 시스템에서, 자기장의 구배, 즉 공간 도함수는 주어진 지점에서의 자기장의 강도에 의해 발휘되는 것보다 더 큰 영향을 현탁 입자의 거동에 대하여 발휘한다.

HGMS 시스템은 넓은 두 카테고리로 나뉘어질 수 있다. 하나의 그러한 카테고리는 분리 챔버 또는 용기 외부에 전적으로 위치하는 자기 회로를 이용하는 자기 분리 시스템을 포함한다. 그러한 외부형 분리 장치의 예가 리버티(Liberti) 등의 미국 특허 제5,186,827호에 기재되어 있다. 이 특허에 기재되어 있는 몇몇의 실시 형태에서, 필요한 자기장 구배는 자석들의 유사 극들이 자기장-대향 구성(field-opposing configuration)으로 존재하도록 영구 자석들을 비자기 컨테이너의 주변부 주위에 배치함으로써 생성된다. 그러한 시스템에서 얻어질 수 있는 검사 매질 내에서의 자기장 구배의 정도는 자석의 강도와 자석들 사이의 분리 거리에 의해 한정된다. 따라서, 외부형 구배 시스템에 의해 얻어질 수 있는 구배에 대한 유한한 한정이 있다.

다른 유형의 HGMS 분리 장치는, 1) 가해진 자기장을 강화시키고, 2) 검사 매질 내에서 자기장 구배를 생성하기 위하여 검사 매질 내에 배치된 강자성 수집 구조체를 이용한다. 하나의 공지된 유형의 내부형 HGMS 시스템에 있어서, 미세 스틸 울(steel wool) 또는 거즈가 자석에 인접하게 위치되는 컬럼 내에 패킹된다. 가해진 자기장은 스틸 와이어(steel wire) 부근에 집중되어서, 현탁된 자기 입자가 상기 와이어의 표면 쪽으로 끌어당겨져서 상기 표면에 부착되게 될 것이다. 그러한 와이어 상에 생성된 구배는 와이어 직경에 반비례하여서, 자기 범위(magnetic reach)는 직경이 증가함에 따라 감소한다. 따라서, 매우 높은 구배가 생성될 수 있다.

내부형 구배 시스템의 하나의 결점은 스틸 울, 거즈 물질, 또는 스틸 미세비드의 사용이 교차 와이어 부근에서 또는 교차 와이어들 사이의 간격 내에서 모세관 작용에 의해 검사 매질의 비자기 구성요소를 포획할 수 있다는 것이다. 다양한 코팅 절차가 그러한 내부형 구배 컬럼에 적용되었지만 (예를 들어, 밀테니이(Miltenyi)의 미국 특허 제5,693,539호 및 크로니크(Kronick)의 미국 특허 제4,375,407호 참조), 그러한 시스템에서의 큰 표면적은 흡착으로 인하여 회수 상의 우려를 여전히 생성한다. 따라서, 내부형 구배 시스템은, 특히 매우 낮은 주파수로 포착되는 엔티티(entity)의 회수가 분리의 목표일 때에는, 바람직하지 않다. 더욱이, 상기 시스템은 자동화가 어려워지게 하고, 비용이 많이 들게 한다. 오웬(Owen) 등, 및 몰데이(Molday)에 의해 기재된 물질들 둘 모두는 그러한 높은 구배 컬럼의 사용을 필요로 한다.

이와는 대조적으로, 세포 분리에 있어서 외부형 구배를 이용하는 HGMS 접근법은 다수의 편리함을 제공한다. 첫째, 단순 실험실 컨테이너, 예를 들어 시험관, 원심분리 튜브 또는 심지어 진공 채혈기(채혈에 사용됨)가 이용될 수 있다. 위에서 언급된 미국 특허 제5,186,827호의 사중극자/육중극자 장치(quadrupole/hexapole device) 또는 리버티 등의 미국 특허 제5,466,574호에 기재되어 있는 대향 쌍극자 배열체의 경우에서와 같이, 외부형 구배가 분리 세포의 단층을 생성하는 종류의 것일 때, 세포의 세척 또는 후속 조작이 용이해지게 된다. 또한, 튜브 또는 유사 컨테이너로부터의 세포의 회수는 단순한 그리고 효율적인 공정이다. 이는 특히 고 구배 컬럼으로부터의 회수와 비교할 때 그러하다. 그러한 분리 용기는 또한 다른 중요한 특징을 제공하는데, 상기 특징은 샘플 부피를 감소시키는 능력이다. 예를 들어, 특정 인간 혈액 세포 하위 세트 (예를 들어, 자기 표지된 CD 34⁺ 세포)가, 점도가 감소되도록 완충제로 50%로 희석된 10 ml의 혈액 샘플로부터 단리될 경우, 15 ml의 원추형 시험관이 적절한 사중극자 자기 장치에서의 분리 용기로서 이용될 수 있다. 15 ml의 용액으로 시작하여, 제1 분리를 수행하며, 회수된 세포는 3 ml로 재현탁시킨다. 그 후 제2 세척/분리를 수행하며, 단리된 세포는 200 ul의 최종 부피로 재현탁시킨다. 세척 및/또는 분리 및 재현탁하여 비결합 세포를 제거한 후, CD 34⁺ 세포는 200 ㎕의 부피로 효과적으로 재현탁될 수 있다. 이들 분리 장치용으로 최적화된 직접 코팅 자성유체를 사용하여 적절하게 처리된 용기에서 주의깊게 행해질 때, 세포 회수율은 항원 밀도에 따라 40-90% 범위로 꽤 효율적이다. 그러한 기술 및 시약은 상기에 언급된 암 검사 종류에 필요한 민감도를 달성하는 데 필수적이다.

자기 분리가 행해질 수 있는 효율과, 자기 표지된 세포의 회수율 및 순도는 많은 인자에 의존적일 것이다. 이들은 분리되는 세포의 개수, 그러한 세포의 수용체 밀도, 세포당 자기 로드(load), 자기 물질의 비특이적 결합(non-specific binding; NSB), 이용되는 기술, 용기의 성질, 용기 표면의 성질, 매질의 점도 및 이용되는 자기 분리 장치와 같은 고려사항을 포함한다. 일반적으로 그러한 바와 같이 시스템의 비특이적 결합의 수준이 사실상 일정하다면, 표적 집단이 감소함에 따라 순도도 그러할 것이다. 일례로서, 원래 혼합물 중 0.25%로 있는 집단 중 80%가 회수되는 0.8% NSB의 시스템은 순도가 25%일 것이다. 반면에, 초기 집단이 0.01% (10⁶개의 방관 세포 중 하나의 표적 세포)로 존재한다면, 그리고 NSB가 0.001%라면, 순도는 8%일 것이다. 순도가 더 클수록 분석이 더 용이해지고 더 우수해진다. 따라서, 극도로 낮은 비특이적 결합이 유의미한 희귀 세포 분석의 수행에 필요함이 명백하다.

표적화 세포의 집단이 더 작을수록 자기 표지 및 회수가 더욱 어려워질 것이라는 사실은 덜 명확하다. 더욱이, 표지 및 회수는 이용되는 자기 입자의 성질에 현저하게 의존적일 것이다. 예를 들어, 세포를 큰 자기 입자, 예를 들어 다이날 비드와 함께 인큐베이션할 때, 세포는 이 시스템의 혼합에 의해 생성되는 충돌을 통하여 표지되며, 그 이유는 상기 비드가 너무 커서 효과적으로 확산될 수 없기 때문이다. 따라서, 매우 초기의 암에서 종양 세포가 그러할 수 있는 바와 같이, 세포가 혈액 1 ml당 1개의 세포의 빈도로 또는 그보다 더욱 더 적은 빈도로 집단 중에 존재한다면, 표적 세포를 표지할 확률은 상기 시스템에 첨가되는 자기 입자의 개수 및 혼합 시간 길이에 관련될 것이다. 세포를 상당한 시간 동안 그러한 입자와 혼합하는 것은 해로울 것이기 때문에, 가능한 한 입자 농도를 증가시키는 것이 필요해진다. 그러나, 첨가될 수 있는 자기 입자의 양에 대한 제한이 있으며, 그 이유는 분리시에 다량의 자기 입자와 혼합된 희귀 세포에 있어서 다른 혈액 세포와 혼합된 희귀 세포를 치환할 수 있기 때문이다. 후자의 조건은 관심대상의 세포를 계수하거나 또는 상기 세포를 조사하는 능력을 두드러지게 개선시키지 않는다.

희귀한 빈도의 세포(혈액 1 ml당 1 내지 50개의 세포)를 단리하기 위하여 큰 입자를 사용하는 것의 다른 결점이 있다. 큰 자기 입자는 매우 단순한 디자인 및 상대적으로 낮은 자기 구배의 외부형 구배의 사용을 허용함에도 불구하고, 큰 입자는 세포 주위에서 케이지 유사 방식으로 클러스터링하여 세포를 보거나 분석하는 것이 어려워지게 하는 경향이 있다. 따라서, 자기 입자는 분석 전에 표적 세포로부터 방출되어야 하며, 입자의 방출은 다른 문제를 명백하게 도입한다.

전술한 것에 기초하면, 고도로 자성인, 낮은 비특이적 결합성의 콜로이드성 자기 입자를 이용하는 외부형 자기장 장치를 이용한 고 구배 자기 분리법은, 진핵 세포의 혼합 집단으로부터 관심대상의 세포 하위 세트를 분리하기 위한 선택된 방법으로서, 이는 특히 관심대상의 상기 하위 세트가 전체 집단의 단지 작은 분율로 포함될 경우 그러하다. 그러한 물질은, 그의 확산 특성 때문에, 희귀 이벤트, 예를 들어 혈액 중 종양 세포를 쉽게 찾아내서 자기 표지한다. 일반적으로 그러한 분리는 관심대상의 특정 세포 하위 세트에 특유한 세포 표면 항원의 확인에 의존적이며, 이는, 종양 세포의 경우 종양 항원일 수 있는데, 적절한 단클론 항체 콘쥬게이션(conjugated) 자성유체가 상기 항원에 표적화될 수 있다. 대안적으로, 혈액 샘플을 조사할 때, 혈액에서는 보통 발견되지 않는, 상피 세포와 같은 세포 부류 상의 결정자는, 적절한 수용체를 제공할 수 있다.

그러한 분리를 위하여 콜로이드성 자기 물질을 이용하는 다른 타당한 이유가 있는데, 이는 적절한 자기 로딩의 제공이 성취될 수 있다. 적절한 로딩을 이용하면, 심지어 중간 정도로 희석된 전혈의 점도만큼 점성을 갖는 매질에서도 단리가 성취될 수 있도록 하기에 충분한 힘이 세포에 가해진다. 나타낸 바와 같이, 약 200 나노미터 미만의 콜로이드성 자기 물질은 브라운 운동(Brownian motion)을 나타낼 것이며, 이는 상기 물질이 희귀 세포와 충돌하여 희귀 세포를 자기 표지하는 능력을 두드러지게 향상시킨다. 이는 미국 특허 제5,541,072호에서 입증되며, 여기서 매우 효율적인 종양 세포 퍼징(purging) 실험의 결과가 기재되어 있는데, 이는 평균 직경이 100 ㎚인 콜로이드성 자기 입자 또는 자성유체를 이용한다. 이와 똑같이 중요하게, 이 크기 범위의 또는 그 미만의 입자 크기를 갖는 콜로이드성 물질은 일반적으로 세포의 조사를 간섭하지 않는다. 그렇게 되찾아진 세포는 유세포 분석법, 레이저 스캐닝 현미경법, 또는 가시광 또는 형광 기술을 이용한 현미경법에 의해 조사될 수 있다.

본 발명은 종양 세포뿐만 아니라 희귀 세포의 특성화를 위한, 또는 생물학적 샘플 유래의 다른 생물학적 엔티티의 특성화를 위한 신속하고 효율적인 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 관심대상의 엔티티의 효율적인 풍부화를 가능하게 하는 고도로 민감한 분석 기술을 제공한다. 분석 전에 상당량의 잔사 및 다른 간섭 물질을 제거하면서 표적 바이오엔티티(bioentity)의 풍부화를 보장하는 이 2단계 방법은 샘플 크기의 조사를 허용하는데, 이는 달리 비현실적일 것이다. 본 명세서에 개시된 방법에서는 특유한 방식으로 면역자기 풍부화의 요소들이, 다중파라미터 유세포 분석, 현미경 분석 및 면역세포화학적 분석과 조합된다. 적절한 표지에 의한 표적 세포 밀도의 변경 또는 밀도 구배 원심분리 또는 패닝(panning) 과 같은 다른 풍부화 수단이 또한 이용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 따르면, 본 발명의 방법은 암의 병기 설정, 모니터링 및 스크리닝에 대하여 전혈을 분석하는 것을 가능하게 한다. 상기 분석의 민감한 성질은 잔존 질환의 탐지를 용이하게 하고, 그에 따라 암 재발에 대한 모니터링을 가능해지게 한다.

본 발명은 동일한 자성유체에 상이한 항체들을 콘쥬게이션시키는 방법을 포함한다. 이는 자성유체를, 자성유체가 결합하는 항원에 대하여 2특이성, 3특이성 또는 다중특이성으로 만드는 효과를 갖는다. 동일 자성유체 상에 존재하는 다수의 항체는 서로를 차단하거나 또는 달리 서로를 간섭하는 것으로 보이지 않는다. 그러한 자성유체는 하나 초과의 유형의 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 고도로 바람직한 효과를 가져서, 저 EpCAM 발현을 갖지만 고 발현의 다른 종양 마커를 갖는 CTC를 포획하는 능력을 가능하게 한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 관심대상의 희귀 세포를 함유할 것으로 의심되는 혼합 세포 집단을 포함하는 생물학적 시편을 환자로부터 얻는다. 그 후, 면역자기 샘플은 생물학적 시편을 (i) 다른 샘플 성분들을 상당히 제외하고서, 희귀 세포 결정자, 또는 혈액 세포 상에서 발견되는 것과는 상이한 결정자 부류와의 특이적 반응성을 갖는 2특이성 리간드에 커플링된 자기 입자와, 그리고 (ii) 희귀 세포를 표지하는 적어도 하나의 생체특이성 시약과 혼합함으로써 제조된다. 생성된 면역자기 샘플에는, 샘플을 비표지 분획과, 만약 있다면, 시편에 존재하는 관심 대상의 희귀 세포를 포함하는 표지된 자기 분획으로 분리하는 데 효과적인 자기장이 가해진다. 그 후, 이렇게 단리된 세포 집단을 분석하여 희귀 세포의 존재 및 개수를 결정한다. 바람직한 실시 형태에서, 이 방법에서 사용되는 입자는 콜로이드성 나노입자이다.

본 발명은 췌장암 환자에 있어서의 CTC의 개선된 탐지를 허용한다. 단지 항-EpCAM의 시약 대신에 다중특이성 포착 및 검출 시약을 사용하면, CTC 상의 상이한 항원들을 인식하는 몇몇 다른 항체와 함께 대조군으로서 사용되는 항-EpCAM과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 다중특이성 시약은, 환자의 혈액에서 이전에 검출되지 않은 순환 암세포를 검출하는 데 사용된다. 포착 시약은 이것이 몇몇 항원들을 인식하기 때문에 다중특이성 포착 시약으로 칭해진다. 그 결과, CTC 포착은 EpCAM 항원 단독에 의존적이지 않게 되며, CTC는, 포착을 위하여 선택된 다른 항원이 CTC에 존재할 경우 심지어 EpCAM 항원이 발현되지 않는 경우에도 포착된다. 항체들의 적절하게 특이적인 검출 칵테일의 사용과 함께, 항체의 충분한 결합 능력, 낮은 비특이적 결합성을 가지며, 항체의 교차 차단성은 갖지 않는 다중특이성 자성유체를 생성하는 능력은 모든 다양한 유형의 CTC의 포착을 가능하게 한다. 본 발명에서, 단일 항체 대신에 CTC에 특이적인 항체들의 칵테일을 포착을 위하여 자성유체에 콘쥬게이션시켜 단일 표적에 의존적인 CTC 포착을 최소화한다. 게다가, 검출을 위한 추가의 항체를 사용하여 더 넓은 범위의 항원을 커버한다. 본 발명은 순환 종양 세포 분야를 다루지만, 혈액 중 다른 형태의 희귀 세포의 분석이 고려된다.

<도 1>
도 1a는 4가지의 세포주의 염색 강도를 세포 표면 상에서의 표적 항원 발현의 함수로서 나타낸다. 모든 항체를 2 ug/ml에서 시험하였다 (n=2). 도 1b는 표적 항원 발현에 있어서 4가지 세포주의 양성 집단의 평균 백분율을 나타낸다.
<도 2>
도 2a는 4가지 세포주의 염색 강도를 세포내 표적 항원 발현의 함수로서 나타낸다. 도 2b는 표적 항원 발현에 있어서 4가지 세포주의 양성 집단의 평균 백분율을 나타낸다.
<도 3>
도 3a는 상이한 키트 구성들을 이용한 스파이크된(spiked) CAPAN1 종양 세포의 회수성을 나타낸다. 도 3b는 상이한 키트 구성들을 이용한 스파이크된 BxPC3 종양 세포의 회수성을 나타낸다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 본 발명은 다중특이성 자성유체를 이용하여 생물학적 샘플로부터 희귀 표적 바이오엔티티를 신속하고 효율적으로 단리하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 개시된 본 방법은 혈액 샘플에 존재하는 종양 세포를 효과적으로 단리하고 특성화하며 이와 동시에 비특이적으로 결합된 세포의 선발은 최소화하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 다수의 포착 및 검출 시약을 사용하면, 희귀 세포 분석은 이전에 단일 표적 분자를 사용할 때의 것에 의한 것보다 추가로 개선된다. 이 변경은 췌장 CTC와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 희귀 세포의 포착 및 검출을 향상시킨다. 게다가, 비상피 마커, 예를 들어 중간엽 마커(n-카드헤린)를 상피 마커와 함께 사용하여 상피 종양 세포 및 중간엽 종양 세포 둘 모두를 포착할 수 있다. 본 발명은 상이한 희귀 세포, 예를 들어 CTC의 집단들 및 상이한 종양 세포의 집단들의 동시 검출을 가능하게 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 바이오엔티티"는 관심대상의 매우 다양한 생물학적 또는 의학적 물질을 말한다. 예에는 세포, 바이러스, 세균 등과 같은 바이오입자를 포함하는, 생물학적 기원의 호르몬, 단백질, 펩티드, 렉틴, 올리고뉴클레오티드, 약물, 화학 물질, 핵산 분자 (예를 들어, RNA 및/또는 DNA) 및 미립자가 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 희귀 세포, 예를 들어 산모 순환계 중 태아 세포, 또는 순환 암세포는 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 비표적 세포 및/또는 다른 바이오엔티티로부터 효율적으로 단리될 수 있다. 용어 "생물학적 시편"은 제한 없이, 인간 대상으로부터 얻어질 수 있는 희귀 세포의 임의의 다른 공급원, 유관액(nipple aspirate), 조직 균질액(tissue homogenate), 말초 혈액 및 세포 함유 체액을 포함한다. 예시적인 조직 균질액은 유방암 환자에 있어서 전초 림프절(sentinel node)로부터 얻어질 수 있다. 전술한 표적 바이오엔티티들 중 임의의 것과 관련하여 사용될 때, 용어 "결정자"는 생체특이성 리간드 또는 생체특이성 시약이 특이적으로 결합될 수 있으며, 특이적 결합 물질에의 선택적 결합에 연루되고 상기 선택적 결합에 책임이 있는 표적 바이오엔티티의 부분을 말하는데, 이의 존재는 선택적 결합이 일어나는 데 필요하다. 근본적인 용어들에 있어서, 결정자는 특이적 결합 쌍 반응에 있어서 수용체가 인식하는 표적 바이오엔티티 상의 분자적 접촉 영역이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합 쌍"은 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작동제-길항제, 렉틴-탄수화물, 핵산(RNA 또는 DNA) 혼성화 서열, Fc 수용체 또는 생쥐 IgG-단백질 A, 아비딘-바이오틴, 스트렙타비딘-바이오틴 및 바이러스-수용체 상호작용을 포함한다. 다양한 다른 결정자특이적 결합 물질 조합들은 당업자에게 명백한 바와 같이 본 발명의 방법의 실시에서의 사용용으로 고려된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린, 단클론 또는 다클론 항체, 면역반응성 면역글로불린 단편, 및 단쇄 항체를 포함한다. 전통적으로 생성되는 항체와 유사한 특이성을 갖는, 결정자를 특이적으로 인식하는 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조합이 본 발명에서의 사용용으로 또한 고려된다. 본 명세서에서 용어 "검출가능하게 표지하다"는 직접적으로 또는 간접적으로 물리적 또는 화학적 수단에 의한 검출 또는 측정이 검사 샘플 중 표적 바이오엔티티의 존재를 나타내는 임의의 물질을 말하기 위하여 사용된다. 유용한 검출가능 표지체의 대표적인 예에는 하기가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다: 흡광, 형광, 반사, 광 산란, 인광 또는 발광 특성을 기반으로 하여 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 분자 또는 이온; 방사능 특성에 의해 검출가능한 분자 또는 이온; 핵자기 공명 또는 상자성 특성에 의해 검출가능한 분자 또는 이온. 적절한 기질이 예를 들어 광 비흡수 분자로부터 광 흡수 분자로 전환되게 하거나, 또는 비형광 분자로부터 형광 분자로 전환되게 하는 다양한 효소가, 광 흡수 또는 형광을 기반으로 하여 간접적으로 검출가능한 분자 군 중에 포함된다. "상당히 제외하고서"라는 어구는 생체특이성 리간드 또는 생체특이성 시약과 그의 상응하는 표적 결정자 사이의 결합 반응의 특이성을 말한다. 생체특이성 리간드 및 시약은 그의 표적 결정자에 대하여 특이적 결합 활성을 갖지만, 다른 샘플 성분들에 대하여 낮은 수준의 비특이적 결합을 또한 나타낼 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "초기암"은 기관 국한된 것으로 임상적으로 결정된 암을 말한다. 유방암 환자의 경우 유방 X선 촬영법(mammography), 또는 폐암 환자의 경우 X선과 같은 통상적인 방법에 의해 검출되기에는 너무 작은 종양이 또한 포함된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "풍부화"는 생물학적 샘플로부터의 단핵 세포의 풍부화를 말한다. 말초 혈액이 출발 물질로 사용되는 경우, 풍부화 정도를 평가할 때 적혈구 세포는 계수되지 않는다. 본 발명을 실시하는 데 사용하기에 바람직한 자기 입자는 콜로이드로서 거동하는 입자이다. 그러한 입자는 일반적으로 약 200 나노미터(㎚)(0.20 마이크로미터) 미만인 그의 마이크로미터 미만의(sub-micron) 입자 크기와, 장기간 동안의 용액으로부터의 중력에 의한 분리에 대한 그의 안정성을 특징으로 한다. 많은 다른 이점에 더하여, 이 크기 범위는 세포 분석에 일반적으로 적용되는 분석 기술로는 상기 입자가 본질적으로 보이지 않게 한다. 90-150 ㎚ 범위 내의 그리고 70-90%의 자기 질량을 갖는 입자가 본 발명에서의 사용용으로 고려된다. 적합한 자기 입자는 초상자성 물질의 결정성 코어가, 자기 코어에 결합된, 예를 들어 자기 코어에 물리적으로 흡수되거나 또는 자기 코어에 공유 부착된, 그리고 콜로이드 특성의 안정화를 부여하는 분자에 의해 둘러싸인 것으로 구성된다. 코팅 물질은 바람직하게는 샘플에서 발견되는 생물학적 거대분자와 자기 코어 사이의 비특이적 상호작용을 방지하는 데 효과적인 양으로 적용되어야 한다. 그러한 생물학적 거대분자는 비표적 세포의 표면 상의 시알산 잔기, 렉틴, 당단백질 및 다른 막 성분을 포함할 수 있다. 게다가, 상기 물질은 가능한 한 많은 자기 질량/나노입자를 함유하여야 한다. 코어를 포함하는 자기 결정의 크기는 충분히 작아서 상기 결정은 전 자기 도메인을 함유하는 것은 아니다. 나노입자의 크기는 충분히 작아서 그의 브라운 에너지는 그의 자기 모멘트를 초과한다. 그 결과, 이들 콜로이드성 자기 입자의 N극, S극 정렬 및 후속적인 상호 인력/척력은 심지어 중간 정도로 강한 자기장에서도 나타나지 않으며, 이는 그의 용액 안정성에 기여한다. 마지막으로, 자기 입자는 높은 자기 구배의 외부형 자기장 분리 장치에서 분리가능하여야 한다. 상기 특징은 샘플 취급을 용이하게 하며, 강자성 비드 또는 스틸 울이 로딩된 더 복잡한 내부 구배 컬럼에 비하여 경제적 이점을 제공한다. 상기에 기재된 특성을 갖는 자기 입자는 미국 특허 제4,795,698호, 미국 특허 제5,597,531호 및 미국 특허 제5,698,271호에 기재된 베이스 물질들의 변경에 의해 제조될 수 있다. 상기 베이스 물질들로부터의 자기 입자의 제조는 하기에 기재되어 있다.

다수의 상이한 세포 분석 플랫폼들을 이용하여 풍부화된 샘플을 확인 및 계수할 수 있음을 주목해야 한다. 그러한 분석 플랫폼들의 예로는 세포의 수동 관찰용 자기 세포 고정 장치인 셀스포터(CellSpotter) 시스템, 및 자동 광 스캐닝 자기 세포 고정 장치인 셀트랙스(CellTracks) 시스템이 있으며, 이들은 각각 미국 특허 출원 제08/931,067호 및 미국 특허 출원 제08/867,009호에 기재되어 있다. 전술한 미국 특허들 둘 모두는 정량적 및 정성적 수동 또는 자동 세포 분석을 위한 각각의 장치 및 방법을 개시하는 것으로서 본 명세서에 참고로 포함된다.

다른 분석 플랫폼은 레이저스캐닝 혈구 계산법(Laserscanning Cytometry; 컴퓨사이트(Compucyte)), 명시야 기반의 이미지 분석법(크로마비전(Chromavision)), 및 모세관 부피 측정법(Capillary volumetry; 바이오메트릭 이미징(Biometric imaging))을 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 혈액 중 순환 상피 세포의 계수는 혈액 세포로부터의 상피 세포의 면역자기 선발(풍부화), 이어서 다중파라미터 유세포 분석법에 의한 샘플의 분석에 의해 성취된다. 면역자기 샘플 제조는 샘플 부피의 감소와, 표적(상피) 세포의 10⁴배 풍부화의 수득에 중요하다. 다중파라미터 유세포 분석법에 사용되는 시약은 표적 세포가 2개의 광산란 및 3개의 형광 파라미터의 리스트모드 획득에 의해 생성되는 다차원 공간에서 특유한 위치에 위치되도록 최적화된다. 이들은 1) 범백혈구 항원, 백혈구를 확인하는 CD45(비종양 세포)에 대한 항체; 잔류 적혈구 세포, 혈소판 및 다른 비핵화 이벤트의 배제를 허용하는 세포 유형 특이적 염색제 또는 핵산 염색제; 및 3) 생체특이성 시약 또는 사이토케라틴에 대하여 유도된 항체 또는 세포를 면역자기적으로 선발하는 데 사용되는 것과는 상이한, EpCAM 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 항체를 포함한다.

포착 표적:

포착에 사용되는 항체는 조직 배양된 종양 세포를 이용한 초기 검사를 기반으로 하여 선택하였다. 전략은 다양한 분화 상태를 나타내는 세포주의 크로스섹션(cross section)을 선택하는 것이었으며, 그 이유는 발현 수준이 분화 상태에 따라 변화하기 때문이다. 데이터는 대부분의 원발 부위 세포주는 불량하게 분화되는 반면, 복수 및 전이 유래된 세포주는 중간 정도 내지 잘 분화됨을 시사한다. 따라서, BxPC3 (중간 정도로 분화), Panc-1 (불량하게 분화), 카판(CAPAN)-1 (잘 분화) 및 카판-2 (잘 분화) 종양 세포를 분화 상태를 기반으로 한 항체 평가용으로 선발하였다. EpCAM., 뮤신(Mucin)1, 메소텔린(Mesothelin), 클라우딘(Claudin)-4, EGFR1 및 CEACAM6은 포착 항원을 위한 표적인 것으로 결정되었다. 유세포 분석 전략을 이용하여 항원 발현 수준 및 양성 세포 집단수의 백분율을 결정하였다. 이 연구에서 사용한 모든 항체는 일차 항체였으며, 염색은 형광 염색제에 콘쥬게이션된 항생쥐 이차 항체를 사용하여 모니터링하였다. 도 1a는 다양한 마커를 포함하는 세포의 염색 강도를 나타내며, 이는 발현 수준을 나타낸다. 도 1b는 마커를 포함하는 양성 세포의 백분율을 나타낸다.

도 1의 데이터는 스크리닝한 모든 표적이 각각에 있어서 다양한 발현 수준으로 세포주에 존재하였으며 발현 수준은 시험한 모든 세포주에 있어서 일관적인 것은 아님을 나타낸다. 상기 데이터는 항원 발현이 세포주 전체에 걸쳐 다양하며 이는 항원이 조직 배양 종양 세포와 유사하게 CTC에서 또한 다양할 수 있음을 나타냄을 시사한다. 상기 분석은 EpCAM, 클라우딘-4, EGFR1 및 어느 정도는 뮤신-1이 모든 세포주에 걸쳐 편재적으로 발현됨을 나타냈다. 상기 항원들은 평균적으로 세포 집단의 65% 내지 100%에서 발현되었다. 따라서, 다수의 포착 표적들을 이용하여 넓은 범위의 종양 세포를 커버하는 것은 효과적인 포착에 중요하다. 또한 이들 마커는 종양 세포에 특이적이어야 하며, 백혈구 세포 상에는 존재하지 않아야 한다. 후보 포착 항체를 백혈구 세포를 이용하여 시험하였다. 과립구와, 더욱 적은 정도로는 단구에서 고도로 만연된 것으로 나타난 CEACAM6을 제외하고는 대부분의 마커는 백혈구 세포 상에서 낮은 수준으로 발현된다. 이 결과는 이 분석에 있어서 포착 표적으로서 CECAM6을 사용하는 것을 배제시킬 것이다. 상기 데이터를 기반으로 하면, EpCAM, 뮤신1, 메소텔린, 클라우딘-4 및 EGFR 항원은 종양 세포의 포착용으로 우수한 표적이다.

검출 표적:

다양한 마커에 대한 항체를 종양 세포의 검출을 위하여 시험하였다. 시험한 마커는 사이토케라틴 7, 8, 17, 18, 19 및 c-Src였다. 이들 마커를 유세포 분석법에 의해 그리고 모든 4가지의 세포주 전체에 걸쳐 2 ug/ml의 농도로 시험하였다. 도 2a 및 도 2b에 이들 결과가 요약되어 있다. 사이토케라틴 패밀리는 모든 세포주에서 편재적으로 발현되었다(집단의 79% 내지 100%가 상기 표적들 중 적어도 하나에 대하여 양성이었다). c-Src 패밀리가 다양한 발현 수준으로 시험한 모든 세포주에서 또한 발현되었다 (66% 내지 100%의 양성 집단). 전반적으로, 모든 사이토케라틴 항체는 비견되는 염색 패턴 및 결과로 동일하게 잘 작용하였다. 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터의 c-Src는 약한 결합자이고 매우 밝은 것은 아닌 것으로 나타나지만, 이는 검출제로서 사용한 FITC-콘쥬게이션된 이차 물질로 인한 것일 수 있다. 그러나, 항-사이토케라틴 17 및 항-c-Src는 백혈구 세포(단구 및 과립구) 상에서 양성이었다. 이 데이터를 기반으로 하여, 사이토케라틴 7, 8, 18, 및 19를 칵테일형 검출 항체로서 사용하기 위하여 선택하였다.

포착 표적의 자성유체에의 콘쥬게이션 :

췌장 조직 배양 종양 세포주를 이용한 초기 평가를 기반으로 하여, 항-EpCAM, 항-EGFR1, 항-Muc1 및 항-클라우딘4를 포착을 위하여 선택하였다. 최대 3가지의 항체를 베리덱스를 이용하여 몇몇 조합으로 자성유체에 콘쥬게이션시켰다. LLC 콘쥬게이션 화학 및 그 조합은 다음과 같다:

A. 항-EpCAM/EGFR1/Muc1 다중특이성 자성유체

B. 항-EpCAM/EGFR1/클라우딘4 다중특이성 자성유체

C. 항-EpCAM/Muc1/클라우딘4 다중특이성 자성유체

항-EpCAM 항체를 모든 조합에서 이용하였다.

검출 표적의 피코에리트린( Phycoerythrin ; PE )에의 콘쥬게이션 :

항-사이토케라틴(사이토케라틴 8 및 18을 인식하는 C11 항체), 항-사이토케라틴 7, 항-사이토케라틴 18 및 항-사이토케라틴 19를 베리덱스 엘엘씨(Veridex LLC) 표준 콘쥬게이션 화학을 이용하여 PE에 콘쥬게이션시켰다. PE에 콘쥬게이션된 모든 사이토케라틴 항체를 항-CD45-APC와 조합하여 칵테일형 염색 시약을 생성하였다.

당업자라면 풍부화된 종양 세포 집단의 분석 방법이 본 발명의 사용 의도에 의존적일 것임을 인지할 것이다. 예를 들어, 이하에 기재되는 바와 같이 질환의 재발의 모니터링 또는 암의 스크리닝에서, 순환 상피 세포의 개수는 매우 낮을 수 있다. 이 경우, 현미경법 기반의 분석법이 가장 정확한 것으로 입증될 수 있다. 그러한 조사는 또한 형태의 조사, 공지된 종양 마커 및/또는 발암유전자의 확인을 포함할 수 있다. 대안적으로, 순환 상피 세포의 개수가 정상 집단에서 관찰되는 것을 훨씬 초과하는 질환 상태에서, 그러한 세포를 계수하는 통계적 방법이 충분하여야 한다. 본 명세서에 설명된 방법에 따른 환자 상태의 결정은 정상 집단에 존재하는 순환 희귀 세포의 개수의 통계적 평균치를 기반으로 하여 이루어진다. 또한 초기 병기의 암환자에서 그리고 공격적 전이암에 걸린 환자에서 순환 상피 세포의 수준을 본 명세서에 개시된 바와 같이 통계적으로 결정할 수 있다.

상기에 설명한 바와 같이, 키트는 전혈로부터의 종양 세포의 풍부화를 위한 시약, 장치 및 방법으로 시작한다. 키트는 혈액 샘플 중 유방암 세포에 대하여 검사하는 시약을 함유할 것인데, 이는 6가지의 인자 또는 지시자를 평가할 것이다. 분석 플랫폼은 리포터 분자 DAPI, CY2, CY3, CY3.5, CY5, 및 CY5.5가 적절한 여기 및 방출 필터에 의해 구별되도록 구성할 필요가 있다. 이 예에서의 분석 플랫폼은 이용되는 검출 표지체의 파장을 평가하기 위한 적절한 필터 세트 및 수은 아크 램프를 갖춘 형광 현미경을 사용한다. 모든 마커는 이 방법에서 한꺼번에 도입한다.

본 발명은 셀서치(CellSearch) 상피 세포 키트 (베리덱스, 엘엘씨(Veridex, LLC))를 능가한다. 다중특이성 자성유체 및 칵테일형 검출 시약의 몇몇 조합을 본 발명에 포함시켜 다양한 키트 구성을 생성한다. 주요 개선을 포착 및 검출 시약 성분에 포함시킨다. 상이한 키트 구성들은 다음과 같다:

1 - 키트 1번: 대조군으로서 셀서치 상피 세포 키트: 포착을 위한 EpCAM; 검출을 위한 C11 (CK8, 18) 및 CK19.

2 - 키트 2번: 다중 포착 및 칵테일 검출: 포착을 위한 EpCAM/EGFR/Muc-1 (E29); 검출을 위한 C11 (CK8, 18) + CK19 + CD7 + CD18.

3 - 키트 3번: 다중 포착 및 칵테일 검출: 포착을 위한 EpCAM/EGFR/Claudin4; 검출을 위한 C11 (CK8, 18) + CK19 +CK7 +CK18.

4 - 다중 포착 및 칵테일 검출: 포착을 위한 EpCAM/Muc-1 (E29)/Claudin4; 검출을 위한 C11 (CK8, 18) + CK19 + CK7 + CK18.

상이한 키트 구성들의 평가

상기 키트 구성들을 먼저 조직 배양 췌장 종양 세포로 스파이크된 정상 혈액 샘플로 평가하여 그 성능을 점검하였다. 췌장 종양 세포 (BxPC3 및 카판(CAPAN)-1 세포주)를 7.5 ml의 셀세이브 공여체 혈액 (n=2) 내로 스파이크하였다. 샘플을 셀트랙스 오토프렙에서 프로세싱하고, 셀트랙스 분석기 II에서 분석하였다.

변경된 키트를 이용한 스파이크된 카판-1 세포의 회수율은 표준 상피 세포 키트 (대략 60%)의 것과 유사하였지만, 2가지 버전의 변경 키트를 이용한 BxPC3 세포의 회수율은 일관적으로 더 높았다 (대략 90%) (도 3a 및 3b).

4가지의 키트 구성을 정상적인 건강한 공여체 및 전이성 췌장암 환자 유래의 혈액 샘플을 이용하여 평가하였다. 이 평가로부터의 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다. 예비 데이터는, CTC 회수율이 표준 상피 세포 키트 1과 비교하여 변경된 키트의 모든 버전을 이용하면 임상 샘플에서 더 높았음을 나타낸다 (표 1). CTC는 변경된 키트를 사용하면 정상적인 건강한 공여체 샘플로부터 검출되지 않았다 (표 2).

본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 이용하여 검출될 수 있는 상이한 유형의 암의 예에는 아푸도마, 분리종, 새종(branchioma), 악성 카르시노이드 증후군, 카르시노이드 심장병, 암종, 예를 들어 워커(Walker) 암종, 기저 세포 암종, 기저편평 암종, 브라운-피어스(Brown-Pearce) 암종, 관암종, 에르릿히(Ehrlich) 종양, 상피내암종, 크렙스(Krebs) 2 암종, 메르켈(merkel) 세포 암종, 점액암종, 비소세포폐암종, 귀리 세포 암종, 유두암종, 경성암종, 세기관지성 암종, 기관지원성 암종, 편평상피 세포 및 이행 세포 세망내피증, 흑색종, 연골모세포종, 연골종, 연골육종, 섬유종, 섬유육종, 거대 세포 종양, 조직구종, 지방종, 지방육종, 중피종, 점액종, 점액육종, 골종, 골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 활막종, 선섬유종, 선림프종, 암육종, 척색종, 간엽종, 중신종, 근육종, 에나멜 모세포종, 치조 골막종, 치아종, 기형종, 융모성 종양, 선암종, 선종, 담관종, 담지종, 원주종, 낭선암, 낭선종, 과립막 세포 종양, 남녀성세포함유종, 간암, 한선종, 췌도 세포 종양, 라이디히 세포(leydig cell) 종양, 유두종, 세르톨리 세포(sertoli cell) 종양, 난포막 세포 종양, 평활근종, 평활근육종, 근육모세포종, 근종, 근육종, 횡문근종, 횡문근육종, 상의종, 신경절신경종, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경초종, 신경모세포종, 신경상피종, 신경섬유종, 신경종, 부신경절종, 비크롬친화세포 부신경절종(paraganglioma nonchromaffin), 혈관각화종(antiokeratoma), 경화성 혈관종, 혈관종증, 사구맥관종, 혈관내피종, 혈관종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 림프관종, 림프관근종, 림프관육종, 송과체종, 암육종, 연골육종, 엽상 낭육종, 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 백혈구육종, 지방 육종, 림프관육종, 근육종, 점액육종, 난소 암종, 횡문근육종, 육종 (카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 및 비만 세포 육종), 신생물 (예를 들어, 뼈, 소화기 계통, 결장직장, 간, 췌장, 뇌하수체, 고환, 안와, 두경부, 중추 신경계, 청신경, 골반, 기도, 및 비뇨생식기 신생물), 신경섬유종증, 및 자궁경부 이형성증이 포함된다.

본 발명은 순환 상피 세포만의 검출에 한정되지 않는다. 내피 세포가 심근 경색에 걸린 환자의 혈액에서 관찰되었다. 내피 세포, 심근 세포, 및 바이러스 감염 세포, 예를 들어 상피 세포가 이용가능한 단클론 항체에 의해 인식되는 세포 유형 특이적 결정자를 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 그러한 순환 내피 세포의 검출을 위하여 개조될 수 있다. 부가적으로, 본 발명은 감염성 질환에 걸린 환자의 말초 혈액에서의 세균 세포 로드의 검출을 허용하는데, 상기 환자는 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 이용하여 또한 평가할 수 있다.

저널 논문, 미국 특허 및 미국 특허 출원에 대한 다수의 인용이 상기에 제공된다. 전술한 인용 각각의 내용은 마치 본 명세서에 전체적으로 개시되는 것처럼 본 발명의 명세서 내에 참고로 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시 형태 중 일부는 상기에 기재되었고 구체적으로 예시되었지만, 본 발명은 상기 실시 형태에 제한되는 것이 아니다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 본 발명에 대하여 이루어질 수 있는데, 본 발명의 전체 범주는 하기 특허청구범위에 서술되어 있다.

Claims

혼합 세포 집단에서 희귀 세포를 검출 및 계수하는 방법으로서,
상기 집단 중 상기 희귀 세포의 존재는 질환 상태를 나타내는 것이며, 상기 방법은
a) 상기 희귀 세포를 함유할 것으로 의심되는 혼합 세포 집단을 포함하는 생물학적 시편을 검사 대상으로부터 얻는 단계;
b) 다른 샘플 성분들이 실질적으로 배제되도록 면역자기(immunomagnetic) 샘플을 제조하는 단계로서, 상기 단계에서는 상기 생물학적 시편을 상기 희귀 세포와 특이적으로 반응하는 다중특이성 리간드에 커플링된 자기 입자와 혼합하는, 상기 단계;
c) 상기 면역자기 샘플을 상기 희귀 세포를 표지하는 적어도 하나의 다중특이성 시약과 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 표지된 희귀 세포를 분석하여 상기 면역자기 샘플 중 임의의 희귀 세포의 존재 및 개수를 결정하는 단계로서, 상기 단계에서는 상기 샘플에 존재하는 희귀 세포의 개수가 많을수록 상기 질환 상태의 중증도가 더 커지게 되는, 상기 단계를 포함하는, 혼합 세포 집단에서 희귀 세포를 검출 및 계수하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 면역자기 샘플의 제조 단계와 상기 면역자기 샘플을 상기 적어도 하나의 다중특이성 시약과 접촉시키는 단계 사이의 중간 단계로서, 상기 면역자기 샘플에 자기장을 가하여 희귀 세포 풍부 세포 현탁물을 상기 면역자기 샘플로서 생성하는, 혼합 세포 집단에서 희귀 세포를 검출 및 계수하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 풍부 희귀 세포를 함유하는 상기 면역자기 샘플의 부피를 감소시키는, 혼합 세포 집단에서 희귀 세포를 검출 및 계수하는 방법.
제1항에 있어서, 분석 전에 상기 면역자기 샘플을 표지 희귀 세포 함유 분획 및 비표지 분획으로 분리하는, 혼합 세포 집단에서 희귀 세포를 검출 및 계수하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 자기 입자는 콜로이드성이며, 상기 면역자기 샘플에 경사 자계(magnetic gradient field)를 가함으로써 상기 분리가 달성되는, 혼합 세포 집단에서 희귀 세포를 검출 및 계수하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 희귀 세포는 내피 세포, 산모 순환계 중 태아 세포, 세균 세포, 심근 세포, 상피 세포 및 바이러스 감염 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 혼합 세포 집단에서 희귀 세포를 검출 및 계수하는 방법.
혼합 세포 집단에서 암세포를 검출 및 계수하는 방법으로서,
a) 상기 암세포를 함유할 것으로 의심되는 혼합 세포 집단을 포함하는 생물학적 시편을 검사 대상으로부터 얻는 단계;
b) 다른 샘플 성분들이 실질적으로 배제되도록 면역자기 샘플을 제조하는 단계로서, 상기 단계에서는 상기 생물학적 시편을 상기 암세포와 특이적으로 반응하는 다중특이성 리간드에 커플링된 자기 입자와 혼합하는, 상기 단계;
c) 상기 면역자기 샘플을 상기 암세포를 표지하는 적어도 하나의 다중특이성 시약과 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 표지된 암세포를 분석하여 상기 면역자기 샘플 중 임의의 암세포의 존재 및 개수를 결정하는 단계로서, 상기 단계에서는 상기 샘플에 존재하는 암세포의 개수가 많을수록 상기 암의 중증도가 더 커지게 되는, 상기 단계를 포함하는, 혼합 세포 집단에서 암세포를 검출 및 계수하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 자기 입자는 콜로이드성이며, 분석 전에 상기 면역자기 샘플을 표지 암세포 함유 분획과 비표지 분획으로 분리하는, 혼합 세포 집단에서 암세포를 검출 및 계수하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 콜로이드성 자기 입자 및 상기 적어도 하나의 다중특이성 시약을 상기 생물학적 시편과 순차적으로 혼합하고, 중간 단계로서 상기 면역자기 샘플에 자기장을 가하여 암세포 풍부 세포 현탁물을 면역자기 샘플로서 생성하는, 혼합 세포 집단에서 암세포를 검출 및 계수하는 방법.
제9항에 있어서, 분석 전에 상기 면역자기 샘플을 표지 암세포 함유 분획 및 비표지 분획으로 분리하는, 혼합 세포 집단에서 암세포를 검출 및 계수하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 표지 암세포 함유 분획을 다중파라미터 유세포 분석법(multiparameter flow cytometry), 면역형광 현미경법(immunofluorescent microscopy), 레이저 스캐닝 세포 분석법(laser scanning cytometry), 명시야 베이스 이미지 분석법(bright field base image analysis), 모세관 부피 측정법(capillary volumetry), 스펙트럼 이미지화 분석법(spectral imaging analysis), 수동 세포 분석법(manual cell analysis) 및 자동 세포 분석법(automated cell analysis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 분석하는, 혼합 세포 집단에서 암세포를 검출 및 계수하는 방법.
순환 희귀 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 검사 키트로서,
a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 각각의 항체가 상기 희귀 세포의 특징적인 결정자에 특이적으로 결합하며 상기 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 하나 초과의 유형의 항체를 포함하는 코팅된 자기 나노입자;
b) 상기 희귀 세포의 제2의 특징적인 결정자에 대하여 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체; 및
c) 분석으로부터 상기 희귀 세포 이외의 샘플 성분들을 배제시키는 세포 특이적 염색제를 포함하는, 순환 희귀 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 검사 키트.
제12항에 있어서, 상기 키트는 비표적 세포에 대한 결합 친화성을 갖는 항체, 생물학적 완충제, 투과화 완충제, 프로토콜 및 선택적으로 정보 시트를 추가로 함유하는, 순환 희귀 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 검사 키트.
제12항에 있어서, 상기 희귀 세포는 내피 세포, 산모 순환계 중 태아 세포, 세균 세포, 심근 세포, 상피 세포 및 바이러스 감염 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 순환 희귀 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 검사 키트.
순환 종양 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 키트로서,
a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 상기 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 다수의 유형의 상피 세포 특이적 항체를 포함하는 코팅된 자기 나노입자;
b) 암세포 결정자에 대하여 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체; 및
c) 분석으로부터 상기 종양 세포 이외의 샘플 성분들을 배제시키는 세포 특이적 염색제를 포함하는, 순환 종양 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 키트.
제15항에 있어서, 상기 키트는 비종양 세포에 대한 결합 친화성을 갖는 항체, 생물학적 완충제, 투과화 완충제, 프로토콜 및 선택적으로 정보 시트를 추가로 함유하는, 순환 종양 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 키트.
제15항에 있어서, 암세포 결정자에 대하여 결합 특이성을 갖는 상기 적어도 하나의 항체는 유방암세포 결정자에 특이적으로 결합하며, 상기 결정자는 MUC-1, 에스트로겐, 프로게스테론 수용체, 카텝신 D, p53, 유로키나아제형 플라스미노겐 활성자, 표피 성장 인자, 표피 성장 인자 수용체, BRCA1, BRCA2, CA27.29, CA15.5, 전립선 특이적 항원, 플라스미노겐 활성자 저해자 및 Her2-neu로 이루어진 결정자들의 군으로부터 선택되는, 유방암에 대하여 환자를 스크리닝하는 키트.
제15항에 있어서, 암세포 결정자에 대하여 결합 특이성을 갖는 상기 적어도 하나의 항체는 전립선암세포 결정자에 특이적으로 결합하며, 상기 결정자는 전립선 특이적 항원, 전립선 산 포스파타아제, 티모신 b-15, p53, HPC1 기본 전립선 유전자, 크레아틴 키나아제 및 전립선 특이적 막 항원으로 이루어진 결정자들의 군으로부터 선택되는, 전립선암에 대하여 환자를 스크리닝하는 키트.
제15항에 있어서, 암세포 결정자에 대하여 결합 특이성을 갖는 상기 적어도 하나의 항체는 결장암세포 결정자에 특이적으로 결합하며, 상기 결정자는 암종배아 항원, C 단백질, APC 유전자, p53 및 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinase; MMP-9)로 이루어진 결정자들의 군으로부터 선택되는, 결장암에 대하여 환자를 스크리닝하는 키트.
제15항에 있어서, 암세포 결정자에 대하여 결합 특이성을 갖는 상기 적어도 하나의 항체는 방광암세포 결정자에 특이적으로 결합하며, 상기 결정자는 핵 매트릭스 단백질(nuclear matrix protein; NMP22), 바드 방광 종양 항원(Bard Bladder tumor antigen; BTA), 및 피브린 분해 생성물(fibrin degradation product; FDP)로 이루어진 결정자들의 군으로부터 선택되는, 방광암에 걸린 환자를 스크리닝하는 키트.
제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항체는 항체들의 패널을 포함하고 항체들 각각은 상이한 암세포 특징적 결정자에 대하여 결합 특이성을 갖는, 순환 종양 세포의 존재에 대하여 환자 샘플을 스크리닝하는 키트.