KR20130112862A

KR20130112862A - 투석된 혈청이 있는 심근세포 배지

Info

Publication number: KR20130112862A
Application number: KR1020137000906A
Authority: KR
Inventors: 나단 메이어; 브래드 스완슨.; 스티브 피너
Original assignee: 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2013-10-14
Anticipated expiration: 2031-06-20
Also published as: EP2582792A4; US20110312090A1; JP2016052336A; WO2011160128A2; CA2802525C; AU2014203392A1; KR101861171B1; AU2011268056B2; AU2011268056A1; WO2011160128A3; EP2582792B1; IL223614B; EP2582792A2; US9365826B2; JP6039551B2; CA2802525A1; JP2013528401A; AU2014203392B2

Abstract

심근세포의 유지를 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 예를 들어, 임의의 양태에서, 방법은 본질적으로 혈청이 없는 배지 또는 투석된 혈청을 포함하는 배지 중에서 심근세포를 배양하여 장기간 순도를 유지하는 단계를 포함한다. 추가의 양태에서, 심근세포의 조절을 위한 방법이 제공될 수 있다.

Description

투석된 혈청이 있는 심근세포 배지{CARDIOMYOCYTE MEDIUM WITH DIALYZED SERUM}

본 출원은 2010년 6월 18일자로 출원된 미국 출원 제61/356,136호 및 2010년 6월 21일자로 출원된 미국 출원 제61/356,916호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 개시 내용은 권리 포기 없이 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 세포 배양 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 심근세포의 유지 및 조절에 관한 것이다.

재생 의학에 있어서 연구에 대한 중심적인 난제는 심장 기능의 재구성에 도움이 될 수 있는 세포 조성물을 개발하는 것이다. 5명의 남성 및 여성 중 거의 1명이 일부 형태의 심혈관계 질환을 가지는 것으로 추산된다(National Health and Nutrition Examination Survey lil, 1988-94, Center of Disease Control and the American Heart Association). 광범위한 병태는 관동맥성 심장병(인구의 5%), 선천성 심혈관계 결함(0.5%), 및 울혈성 심부전(3%)을 포함한다. 약학 분야는 심장 질환의 결과로서 일어나는 손상의 제한에 도움이 될 수 있는 소분자 약물 및 생물학적 화합물을 생산하였지만, 손상된 조직의 재생에 도움이 되는 상업적으로 이용가능한 것은 없다.

심장 재생이 가능한 세포 집단을 개발하는 목표와 함께, 연구는 기능성 심근세포의 사용을 포함하여, 여러 가지 상이한 영역에 대하여 수행되어 왔다. 심장 질환을 치료하기 위한 재생 세포의 잠재적인 공급원은 시험관내에서 다양한 종류의 만능 줄기 세포, 특히 유도 만능 줄기 세포로부터 유도된 심근세포이다. 그러나, 다수의 장애물이 배양물에서 심근세포 계통 세포의 균질성을 유지하기 위한 패러다임을 개발하는 것을 방해하여 왔다.

시험관내 약물 선별 분석 및/또는 재생 의학에서의 사용을 위한 이러한 기술의 상용화는 확장 및 분화 프로토콜에서 추가의 개선으로부터 이익을 얻어 세포 균질성 및 수율을 개선할 것이다.

본 발명의 양태는, 특히 균질성의 면에서 심근세포 집단의 순도를 유지하기 위한 방법을 제공함으로써 당업계에서의 주요한 결함을 극복한다. 임의의 실시형태에서, 하기 기술된 사용된 배지에서 정제된 심근세포의 집단을 배양하며, 상기 집단은 적어도 1주 내지 7개월 동안 배양되고 심근세포의 순도를 유지하는 단계를 포함하는, 정제된 심근세포의 집단의 순도를 유지하기 위한 방법이 제공된다.

또한 하기 기술된 배지에서 심근세포의 집단을 배양하며, 상기 심근세포 배양물의 박동수는 저분자량 분자를 제거하도록 처리되지 않은 혈청을 포함하는 배지에 관하여 안정성을 향상시키는 단계를 포함하는, 심근세포의 전기적 활성을 조절하기 위한 방법이 제공될 수 있다.

이러한 배지는 본질적으로 혈청이 없을 수 있거나; 또는 혈청을 포함하는데, 상기 혈청 또는 배지는 저분자량 분자(저분자량 성장 인자를 포함함)를 제거하도록 처리된다. 예를 들어, 혈청 또는 배지는 본질적으로 저분자량 성장 인자가 없을 수 있거나 본질적으로 저분자량 분자가 없을 수 있다. 저분자량 분자 또는 성장 인자는 분자량이 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30kD 또는 임의의 중간 크기 또는 크기 범위일 수 있다. 예를 들어, 배지는 투석된 혈청을 포함할 수 있다. 특히, 혈청은 분자량 컷오프가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30kD 또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위인 막을 이용하여 투석될 수 있다.

본 발명의 임의의 양태는 또한 심근세포의 세포 집단 및 배지를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다. 배지는 혈청을 포함할 수 있으며, 상기 혈청 또는 배지, 예를 들어 투석된 혈청은 저분자량 분자를 제거하도록 처리된다. 배지는 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% 이하의 투석된 혈청 또는 임의의 중간 범위 또는 수치를 포함할 수 있다. 대안적으로, 배지는 본질적으로 혈청 또는 혈청 성분이 없을 수 있다.

세포 집단은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%의 심근세포 또는 임의의 중간 범위 또는 수치를 가질 수 있다. 특정 양태에서, 집단은 적어도 90% 또는 95%의 심근세포를 포함할 수 있다. 집단은 본질적으로 섬유아세포 또는 미분화된 만능 줄기 세포와 같은 오염 세포(contaminating cell)가 없을 수 있다. 분리를 용이하게 하기 위하여, 심근세포는 심근세포 특이적 프로모터의 제어 하에서 적어도 하나의 선택가능 또는 선별가능 전이유전자(transgene)를 발현할 수 있다. 추가의 양태에서, 심근세포는 마우스 또는 인간 심근세포이다. 특정 양태에서, 심근세포는 냉동보관된(cryopreserved) 심근세포일 수 있다.

배지는 당을 포함할 수 있거나 본질적으로 당이 없을 수 있다. 배지는 글루코오스를 포함할 수 있거나 본질적으로 글루코오스가 없을 수 있다. 특정 양태에서, 배지는 갈락토오스를, 예를 들어 약 1 내지 20mM 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위로 포함할 수 있다. 배지는 피루브산염 또는 피루브산을, 예를 들어 약 0.1 내지 10mM의 피루브산염 또는 피루브산을 추가로 포함할 수 있다. 심근세포를 배양하는 것의 양태에서, 배지는 보존 배지일 수 있다. 예를 들어, 보존 배지는 갈락토오스, 피루브산염, 및 투석된 혈청, 예를 들어 10mM 갈락토오스, 1mM 피루브산염 및 10% 투석된 혈청을 포함할 수 있다.

바람직하게, 본 명세서에 사용된 심근세포는 미리 정제될 수 있다. 심근세포의 정제된 집단은 본질적으로 심근세포가 아닌 세포가 없을 수 있다. 심근세포가 아닌 세포가 "본질적으로 없는" 세포 집단은 약 1%, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1, 0.01% 이하 또는 미만(또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위)의 심근세포가 아닌 세포를 포함하는 세포 집단을 지칭하며, 이는 100%의 심근세포를 가지는 세포 집단을 포함한다. 임의의 추가의 실시형태에서, 본 발명은 최대 또는 약 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1%(또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위)의 심근세포가 아닌 세포를 포함하는 심근세포의 세포 집단을 수반한다. 순수한 심근세포 집단을 오염시키는 경향이 있는 예시적인 심근세포가 아닌 세포는 섬유아세포, 미분화 세포 및 기타 다른 심근세포가 아닌 세포를 포함한다.

본 명세서에 기술된 바와 같이 배지 중에서 심근세포를 배양하는 것은 심근세포의 순도를 유지하며; 이는 본 명세서에 기술된 바와 같이 심근세포가 적어도 또는 약 2, 3, 4, 5, 6일, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11개월, 1, 2, 3, 4, 5년 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위 동안 배지 중에서 배양될 수 있다는 이러한 장점을 달성하는 것으로 고려된다. 구체적으로, 심근세포의 집단은 적어도 7개월 동안 순도를 유지할 수 있다.

심근세포 집단의 순도를 유지하기 위하여, a) 적어도 90%의 심근세포의 세포 집단 및 혈청을 함유할 수 있는 배지를 포함하는 제1조성물(여기에서, 상기 혈청 또는 배지는 저분자량의 분자를 제거하도록 처리됨), 또는 적어도 90%의 심근세포의 제2세포 집단 및 본질적으로 혈청이 없는 배지를 포함하는 제2조성물을 획득하는 단계; 및 b) 상기 제1 또는 제2조성물을 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공될 수 있다. 배양은 적어도 8시간, 16시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 또는 임의의 중간 수치 동안 지속될 수 있다. 특정 양태에서, 제1 또는 제2조성물은 배양에서 심근세포의 순도를 유지한다.

방법은 제1 또는 제2조성물 중 심근세포를 화합물과 접촉시키는 단계 및 심근세포의 심박 빈도(beating frequency) 및/또는 포텐셜 장 지속기간(field potential duration)을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 화합물은 이온 채널 활성, 심근세포의 심박 빈도 및/또는 포텐셜 장 지속기간을 조절할 수 있다. 예를 들어, 심박 빈도를 조절하는 화합물은 테트로도톡신(옥타하이드로-12-(하이드록시메틸)-2-이미노-5,9:7,10a-디메타노-10aH-[1,3]디옥소시노[6,5-d]피리미딘-4,7,10,11,12-펜톨) 또는 아이소프로테레놀일 수 있고; 포텐셜 장 지속기간을 조절하는 화합물은 E-4031((1-[2-(6-메틸-2-피리딜)에틸]-4-(4-메틸설포닐-아미노벤조일)피페리딘)) 또는 테르페나딘((RS)-1-(4-tert-부틸페닐)-4-{4-[하이드록시(다이페닐)메틸]피페리딘-1-일}-부탄-1-올)일 수 있다. 방법은 또한 배양 전에 제1 또는 제2조성물 중에서 심근세포를 냉동보관하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 또한 줄기 세포로부터 분화된 심근세포 또는 시험관내에서 심근세포가 아닌 세포로부터 이행분화된(trans-differentiated) 심근세포를 정제하여 제1 또는 제2조성물 중 심근세포를 획득 하는 단계를 포함할 수 있다.

심근세포 순도를 "유지하는 것"은 심근세포의 순도가 시간의 경과에 따라 상당히 감소하지 않는 것을 지칭하며, 바람직하게는 세포 순도 또는 심근세포 집단의 균질성에서 최대 또는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1%의 감소, 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위로 감소하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 심근세포의 "순도"는 주어진 배양 조건 중 심근세포의 백분율을 지칭한다. 이는 심근세포 특이적 프로모터의 제어 하에서 내인성 심근세포 마커 또는 형질전환(transgenic) 유전자의 발현을 기초로 하여 심근세포의 검출에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같이, 순도는, 심근세포 특이적 프로모터에 의해 구동되는 RFP를 발현하는 iPS 세포주로부터 유도된 심근세포 배양물 중 RFP 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 또는 심근세포 배양물 중 심장 트로포닌 T 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 측정될 수 있다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 배지 제형 중에서 심근세포의 배양이 심박 빈도 및 심박수 진동에 상당하고 재현가능한 영향을 미치며, 정말로 심박수에서의 증가 및 심박수 진동에서의 부수적인 감소(심장 박동수에서의 변동 또는 변화 감소)를 초래한다는 것을 추가로 관찰하였다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 배지 중에서 심근세포 집단을 배양함으로써 심장 박동수를 증가시키는 방법뿐만 아니라 심박수 진동을 감소(즉, 심박수 안정성을 향상)시키는 방법을 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 추가의 양태에서, a) 심근세포를 화합물과 접촉시키며, 심근세포는 (i) 본질적으로 혈청이 없거나; 또는 (ii) 혈청을 포함하는 배지 중에서 배양되는 단계(혈청 또는 배지는 저분자량 분자(저분자량 성장 인자를 포함함)를 제거하도록 처리됨); 및 b) 심근세포의 심박 빈도 및/또는 포텐셜 장 지속기간을 측정하는 단계를 포함하는, 심근세포에 대한 화합물의 영향을 시험하기 위한 방법이 제공될 수 있다. 측정하는 방법은 다중전극 어레이(multi-electrode array, MEA)의 사용을 포함할 수 있다.

심장 활성을 조절할 수 있는 화합물의 영향을 향상시키기 위하여, 본 명세서에 기술된 심근세포는 본 명세서에 기술된 배지 중에서 세포 생존력 또는 기능을 조절하는 화합물과 접촉될 수 있다. 이러한 화합물은 이온 채널 활성, 예를 들어 칼륨 채널 또는 나트륨 채널을 조절할 수 있다. 특히, 테트로도톡신 또는 아이소프로테레놀과 같은 화합물은 심박 빈도를 조절할 수 있거나, E-4031 또는 테르페나딘과 같은 화합물은 포텐셜 장 지속기간을 조절할 수 있다.

임의의 양태에서, 심근세포의 집단 및 배지를 포함하는 조성물이 제공될 수 있다. 심근세포의 집단은 심근세포가 아닌 세포, 예를 들어 섬유아세포 또는 미분화된 세포를 포함할 수 있다. 배지는 갈락토오스, 피루브산염을 포함할 수 있으며, 본질적으로 혈청이 없을 수 있다. 다른 양태에서, 배지는 갈락토오스, 피루브산염 및 투석된 혈청을 포함할 수 있다. 배지는 글루코오스를 포함할 수 있거나 본질적으로 글루코오스가 없을 수 있다. 심근세포는 미리 정제될 수 있으며; 예를 들어, 심근세포는 심근세포가 아닌 세포를 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 이하 또는 임의의 범위로 포함하거나 본질적으로 심근세포가 아닌 세포가 없다.

심근세포 집단은 정제,분리 또는 농후화될 수 있다. 정제, 분리 또는 농후화는 심근세포에서 특이적으로 발현되는 내인성 또는 외인성 마커의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 심근세포는 하나 이상의 선택가능 또는 선별가능한 전이유전자를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 전이유전자는 심근세포 특이적 프로모터, 예를 들어 MYH6(알파 미오신 중쇄(alpha myosin heavy chain)) 유전자의 프로모터 하에서 선택가능 또는 선별가능한 마커일 수 있다. 이러한 마커는 항원식(antigenic) 에피토프, 형광 단백질 암호화 유전자 또는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 임의의 양태에서, 심근세포의 집단은 전이유전자의 발현을 기초로 하여 분리될 수 있다. 심근세포 집단의 분리는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 형광 분류 또는 자기 분류일 수 있다. 심근세포의 순도는 심근세포에서 특이적으로 발현하는 전이유전자의 발현에 기초할 수 있다.

임의의 양태에서, 심근세포의 집단은 상기 기술된 배지 중에서 배양 전에 보존될 수 있다. 심근세포는 인간 심근세포 또는 상이한 공급원, 예를 들어 영장류, 개, 고양이, 또는 마우스와 같은 임의의 기타 다른 포유동물로부터의 심근세포를 포함할 수 있다. 심근세포는 개체로부터 직접적으로 분리될 수 있거나 줄기 세포로부터 분화되거나 또는 시험관내에서 심근세포가 아닌 세포로부터 이행분화될 수 있다. 이러한 줄기 세포는 만능 줄기 세포 또는 조직 줄기 세포, 예를 들어 심장 줄기 세포 또는 심장 계통(cardiac lineage)이 아닌 줄기 세포 또는 전구세포(progenitor cell)일 수 있다. 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 또는 체세포 핵 이식에 의해 유도된 만능 줄기 세포를 포함할 수 있다.

임의의 양태에서, 배지는 본질적으로 혈청이 없을 수 있거나, 보다 특히 화학적으로 규명된 것일 수 있다. 다른 양태에서, 배지는 혈청을 포함하지만, 혈청 또는 배지는 저분자량 분자, 특히 혈청 내 저분자량 성장 인자를 제거하기 위하여 처리된다. 특히, 배지 또는 혈청은 본질적으로 저분자량 분자가 없을 수 있거나, 본질적으로 저분자량 혈청 성장 인자 및 기타 다른 성분이 없을 수 있다.

추가의 양태에서, 배지는 글루코오스를 포함할 수 있다. 배지 중 글루코오스는 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900μM 또는 1, 2, 3, 4, 5, 5.5, 6, 7, 8, 9, 10mM일 수 있다.

다른 양태에서, 배지는 본질적으로 글루코오스가 없을 수 있다. 글루코오스 이외의 에너지 공급원을 제공하기 위하여, 배지는 고에너지 인산 결합을 형성할 수 있는 화합물, 아실기 담체 분자, 또는 심근세포 칼슘 채널 조절제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 배지는 크레아틴, 카르니틴, 또는 타우린을 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 배지는 인슐린을 포함할 수 있다.

글루코오스 이외의 탄소 및/또는 에너지 공급원을 제공하기 위하여, 배지는 갈락토오스, 프럭토오스, 만노오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 투라노오스(turanose), 피루브산염, 피루브산, 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산염, 아스파르트산, 락트산염, 락트산, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 배지는 갈락토오스를 포함할 수 있다. 배지 중 갈락토오스는 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50mM 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.

배지는 또한 피루브산염 또는 피루브산을 포함할 수 있다. 배지 중 피루브산염 또는 피루브산은 적어도 또는 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10mM 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.

본 발명의 방법 및/또는 조성물의 내용에서 논의된 실시형태는 본 명세서에 기술된 임의의 기타 다른 방법 또는 조성물에 대하여 이용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관계되는 실시형태는 또한 본 발명의 기타 다른 방법 및 조성물에 적용될 수 있다.

본 명세서에 사용된, 핵산과 관련된 용어 "암호화하다" 또는 "암호화하는"은 본 발명을 당업자에 의하여 용이하게 이해가능하도록 사용되지만; 그러나 이들 용어는 각각 "포함하다" 또는 "포함하는"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원 명세서에 사용된, 단수("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 본원 청구항(들)에 사용된, 단수("a" 또는 "an")의 단어는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.

개시 내용이 오직 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 한정을 뒷받침하더라도, 대안만을 지칭하는 것으로 명백하게 나타내거나 대안이 상호 배타적이지 않다면, 청구항에서 용어 "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에 사용된, "다른"은 적어도 제2의 것 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본 출원 전체에 걸쳐서, 용어 "약"은 장치, 값을 측정하는데 이용되는 방법, 또는 연구 개체 사이에 존재하는 변이성에 대한 오차의 고유 변동을 포함하는 값을 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명의 기타 다른 목표, 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나 본 발명의 사상 및 범주 내에서 다양한 변경 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이므로, 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내지만, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예시로서 주어진 것임이 이해되어야 한다.

다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 임의의 양태를 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 구체적인 실시형태의 상세한 설명과 함께 이들 하나 이상의 도면을 참고함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1b: 무혈청 무글루코오스 배지는 시험관내에서 심근세포 순도를 유지함을 나타냄. 도 1a. 대조 배지(심장 보존 배지: CMM) 또는 무혈청 무글루코오스(SFGF) 배지 중에서 배양된 심근세포는 14일 동안 배양될 때 유사한 심근세포 생존력을 유지한다. 도 1b. CMM 중에서 배양된 정제된 심근세포는 14일 후에 순도의 손실(<90%)을 나타낸다. SFGF 배지 중에서 배양된 심근세포는 더 높은 순도(>99%)를 유지한다.
도 2a 내지 도 2c: DS - CMM 배지는 시험관내에서 심근세포 순도를 유지함을 나타냄. 도 2a. CMM 중에서 또는 투석된 혈청, 피루브산나트륨, 및 갈락토오스가 보충된 무글루코오스 배지(DS-CMM) 중에서 배양된 심근세포는 14일 동안 배양될 때 유사한 심근세포 생존력을 유지한다. 도 2b. CMM 중에서 배양된 정제된 심근세포는 14일 후에 순도의 손실(<90%)을 나타낸다. DS-CMM 배지 중에서 배양된 심근세포는 더 높은 순도(>99%)를 유지한다. 도 2c. 냉동보관된 심근세포는 210일 동안 DS-CMM 중에서 배양하였다. 해동시, 7일째 및 210일째에 순도에 있어서 유의한 변화없이 순도를 분석하였다.
도 3. iCMM 대 SFGF 대 CMM 을 나타냄. 세포를 CMM에 파종하고, 24시간 후에 실험 배지로 옮겼다. 세포 수 및 순도를 7일째에 분석하였다. SFGF 배지 및 iCMM은 배양에서 7일 후에 더 높은 심근세포 생존 및 순도를 촉진시킨다.
도 4. 투석된 혈청은 오염 세포의 부산물을 억제함을 나타냄. 심근세포는 DMEM, 정상 혈청; DMEM - 글루코오스, 정상 혈청; DMEM , 투석된 혈청; 또는 DS -CMM(iCMM으로도 불림) 중에서 배양하였다. 투석된 혈청으로 제조된 2가지 DMEM 조건(DMEM, 투석된 혈청 및 DS-CMM)은, DMEM 배지를 포함하는 정상 혈청과 비교할 때 더 높은 심근세포 순도를 유지하였다.
도 5a 내지 도 5b. 글루코오스 농도는 더 낮은 정도로 심근세포 순도에 영향을 미침을 나타냄. 도 5a. 투석된 혈청을 포함하지만 글루코오스는 없는 DMEM 배양 배지(iCMM, DS-CMM으로도 알려짐)는 배양물이 투석된 혈청을 포함하는 글루코오스 포함 DMEM 배양 배지와 비교하여 상당히 더 높은 심근세포 순도를 갖게 한다. 도 5b. 정상 혈청 포함 DMEM 배지에서 글루코오스의 결핍은 세포 배양물의 심근세포 순도를 증가시킨다.
도 6. 무혈청 무글루코오스 ( SFGF ) 배지는 혈청 포함 배지보다 더 빠르게 박동하는 단일층을 생성함을 나타냄. SFGF 배지 중에서 배양된 심근세포 단일층은 FBS를 포함하는 SFGF 배지 중에서 배양된 단일층보다 더 빠른 심박수를 나타내었다.(N=24 단일층).

I. 도입

본 발명은 부분적으로 무혈청 또는 투석된 혈청을 포함하는 배지가 건강한 심근세포 집단을 유지하면서 심근세포 집단 중에서 심근세포가 아닌 세포의 성장을 늦추도록 고안될 수 있다는 결과를 기초로 한다. 실질적으로 순수한 심근세포 집단 내 조차도, 낮은 비율의 오염 세포가 존재할 수 있다. 표준 혈청 함유 배양 조건 하에서, 오염 세포의 일부 부분은 심근세포보다 더 빠른 속도로 증식할 수 있고 전체 세포 집단을 압도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 배지 조건은 또한 심근세포의 일부 기능적 특성을 개선시킬 수 있다.

심근세포 세포 집단의 배양에 있어서 추가의 장점은 또한 하기 기술되어 있다. 본 개시 내용에 따라서 유지된 세포의 현저한 균일성 및 기능적 특성은 심장 질환의 치료에 있어서 심장 조직의 재생을 위한 시험관내 심장 조직의 연구, 및 새로운 치료적 양상의 개발을 위하여 상기 세포를 가치있게 만든다.

II . 정의

"전분화능(pluripotency)"은 하나 이상의 조직 또는 기관을 구성하는 모든 세포, 예를 들어 3가지 배엽, 즉 내배엽(내부 위벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽(표피 조직 및 신경계) 중 임의의 것으로 분화될 잠재력을 가지는 줄기 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "만능 줄기 세포"는 3가지 배엽 중 임의의 것으로부터 유도된 세포, 예를 들어 전분화 세포(totipotent cell) 또는 유도 만능 줄기 세포의 자손으로 분화될 수 있는 세포를 지칭한다.

"유도 만능 줄기 세포"(일반적으로 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭됨)는 재프로그래밍 인자를 도입 또는 접촉시킴으로써 만능 세포가 아닌 세포, 전형적으로 성인 체세포, 또는 마지막으로 분화된 세포, 예를 들어 섬유아세포, 조혈 세포, 근세포, 뉴런, 표피 세포 등으로부터 인위적으로 제조되는 만능 줄기 세포의 유형을 지칭한다.

"배아 줄기(ES) 세포"는 초기 배아로부터 유도된 만능 줄기 세포이다.

"심근세포"는 일반적으로 임의의 심근세포 계통 세포를 지칭하며, 달리 명시되지 않는다면 임의의 제한 없이 심근세포 개체발생(ontogeny)의 임의의 단계에서 세포에 적용되도록 취해질 수 있다. 예를 들어, 심근세포는 심근세포 전구 세포 및 성숙한 심근세포 모두를 포함할 수 있다.

특정 단백질을 "암호화"하는 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "암호 영역", "서열", "분절", 또는 "절편"은, 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓여질 때 시험관내 또는 생체내에서 전사되고 선택적으로는 또한 유전자 산물, 예컨대 폴리펩티드로 번역되는 핵산 분자이다. 암호 영역은 cDNA, 유전체 DNA, 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 핵산 분자는 단일 가닥(즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 암호 영역의 경계는 5' (아미노) 말단에서의 시작 코돈 및 3' (카복시) 말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 이에 제한되는 것은 아니지만, 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA로부터의 유전체 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 보통 유전자 서열에 대하여 3'에 위치할 것이다.

용어 "전이유전자"는 인위적 또는 자연적 수단에 의해 세포 또는 유기체 내로 도입된 유전자, 핵산, 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 외인성 핵산을 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터의 것일 수 있거나, 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가적인 복사체일 수 있다. 비제한적인 예로서, 외인성 핵산은 자연적인 세포와는 상이한 염색체상의 위치에 있거나, 다르게는 자연적으로 발견되는 것과 상이한 핵산 서열의 측면에 위치한다.

용어 "프로모터"는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 지칭하는 보통의 의미로 본 명세서에서 사용되며, 상기 조절 서열은 RNA 중합효소가 결합할 수 있고 하류(3' 방향) 암호 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유도된다.

하기는 도면 및 본 명세서의 다른 부분에서 언급되는 배지 유형에 대한 약어 및 일반 기술이다. 배지 조성 및 이의 제조에 대한 보다 상세한 설명은 구체적인 실시형태에 있다.

배지 유형에 대한 참조 표

III . 심근세포 배양

본 발명의 임의의 양태에 따른 배양 조건은 사용되는 배지에 따라서 적절하게 규명될 수 있다. 배지는 기본 배지(basal medium)로서 동물 세포를 배양하는데 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기본 배지로서, TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640, 및 피셔 배지(Fischer's media)뿐만 아니라 이의 임의의 조합 중 임의의 것이 사용될 수 있지만, 배지는 동물 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 한 이에 특히 제한되는 것은 아니다.

배지는 혈청 포함 또는 무혈청 배지일 수 있다. 무혈청 배지는 본질적으로 혈청이 없거나 혈청 유래 성분이 없는 배지를 지칭한다. 무혈청 배지는 또한 본질적으로 혈액 유래 성분 또는 동물 조직 유래 성분(예를 들어 동물 조직 유래 성장 인자), 특히 분자량이 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30kD 이하 또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위인 성장 인자 또는 혈청 성분이 없을 수 있다.

배양에 있어서 성장한 대부분의 세포는 증식 능력을 유지하기 위하여 성장 배지의 혈청 성분을 필요로 한다. 전체 혈청이 일상적인 목적을 위하여 허용되지만, 표지된 물질의 포함 또는 영양학적 파라미터를 수반하는 연구는 연구에 따라 성분이 혈청으로부터 제거될 필요가 있다. 이러한 성분의 제거에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 전체 혈장의 투석이다. 정용여과(diafiltration)에 의한 투석을 위하여, 혈청은 농축법에 의해 중공 섬유(hollow-fiber)를 통하여 혈청을 순환시킨다. 그러나, 여과액은 생리 식염수의 첨가에 의해 혈청으로 대체된다. 예를 들어, 투석은 소태아혈청(FBS)으로부터 많은 소분자, 예를 들어 글루코오스, 염 및 일부 단백질이 아닌 결합된 혈청 분자를 제거한다. 이러한 과정은 혈청이 결합된 호르몬은 제거할 수 없지만 일부 세포 유형에 있어서 성장 촉진 능력은 감소시킬 수 있다. 투석 과정은 분자량 컷오프 막이 10,000인 한외여과(ultra filtration)에 의해 수행될 수 있다.

배지는 혈청에 대한 임의의 대안물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대안물은 적절하게 알부민(예를 들어, 지질-풍부 알부민, 재조합 알부민과 같은 알부민 대체물, 식물 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해물), 트랜스페린(또는 기타 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이에 대한 등가물을 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대안물은 예를 들어 국제 출원 공개 제98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 보다 편리하게 하기 위하여 임의의 상업적으로 이용가능한 물질이 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 물질은 녹아웃된 혈청 대체제(knockout Serum Replacement, KSR), 화학적으로 규명된 지질 농축물(Gibco), Glutamax(Gibco)를 포함한다.

바람직하게, 배지는 화학적으로 규명될 수 있으며, 이는 본질적으로 동물 유래의 성분이 없는 배지를 지칭한다. 예를 들어, 배지는 재조합 성장 인자 또는 단백질, 예를 들어 재조합 알부민을 포함할 수 있다.

배지는 또한 지방산 또는 지질, 아미노산(예를 들어 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토카인, 항산화 물질, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 및 무기염을 포함할 수 있다. 2-머캅토에탄올의 농도는 예를 들어 약 0.05 내지 1.0mM, 특히 약 0.1 내지 0.5mM일 수 있으나, 농도는 세포(들)를 배양하기에 적절한 한 특히 이에 제한되지 않는다.

심근세포를 배양하는데 사용되는 배양 용기는 특히 이에 제한되는 것은 아니지만, 심근세포를 배양할 수 있는 한, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시(multi dish), 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK^® 챔버, 배양 백, 및 회전 병을 포함할 수 있다. 심근세포는 배양의 필요에 따라서 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50ml, 100ml, 150ml, 200ml, 250ml, 300ml, 350ml, 400ml, 450ml, 500ml, 550ml, 600ml, 800ml, 1000ml, 1500ml, 2000ml 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위의 부피 중에서 배양될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 배양 용기는 생물반응기(bioreactor)일 수 있으며, 이는 생물학적으로 활성인 환경을 지지하는 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있다. 생물반응기는 부피가 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15㎥, 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.

배양 용기는 세포 점착성 또는 비점착성일 수 있으며, 목적에 따라서 선택될 수 있다. 세포 점착성 배양 용기는 세포외 기질(ECM)과 같은 세포 점착을 위한 기질 중 임의의 것으로 코팅되어 세포에 대한 용기 표면의 점착성을 개선시킬 수 있다. 세포 점착을 위한 기질은 (만약 사용된다면) 줄기 세포 또는 배양보조 세포(feeder cell)를 부착시키고자 하는 임의의 물질일 수 있다. 세포 점착을 위한 기질은 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴 및 이의 혼합물, 예를 들어 Matrigel(상표명) 및 용해된 세포 막 제조물(Klimanskaya et al., 2005)을 포함한다.

기타 다른 배양 조건은 적절하게 규명될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있으나 특히 이에 제한되는 것은 아니다. CO₂ 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어 약 2 내지 5%, 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도 또는 약 1, 5, 8, 10, 20%, 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.

IV . 심근세포 제조물

본 발명의 임의의 양태에서 심근세포는 줄기 세포, 예를 들어 유도 만능 줄기 세포 또는 심장 줄기 세포의 분화, 또는 기타 다른 조직 줄기 세포를 포함한 심장 세포가 아닌 세포의 이행분화에 의해 제조될 수 있다. 만능 줄기 세포의 분화는 다양한 방식으로, 예를 들어 부착된 콜로니에서 또는 세포 응집체(cell aggregate)의 형성에 의해, 예컨대 낮은 접착 환경에서 유도될 수 있으며, 이러한 응집체는 배상체(embryoid body, EB)로서 언급된다. EB 내 분자 및 세포 형성 신호(morphogenic signal) 및 사건은 발생중인 배아에서 이러한 세포의 자연적 개체발생(ontogeny)의 많은 양태를 모의한다.

대안적으로, 심근세포는 만능 줄기 세포의 직접 분화에 의해 제조될 수 있다. "직접 분화"는 중간체로서 배상체(세포 응집체)를 형성하지 않고 특정 조직 유형의 세포에 대하여 농후화된 자손(progeny)으로 만능 줄기 세포를 분화시키기 위한 과정을 지칭한다. 이는 명백하게 명시되어 있지 않다면 도말(plating)이 반드시 필요한 것은 아니지만, 세포가 고체 기질 상에 도말될 때 수행될 수 있다. 직접 분화는 현탁액 중 또는 용기 벽에서 배지 성분, 가용성 인자, 불용성 인자, 및 원하는 조직 유형으로 세포를 지시하는 목적을 달성하는 기타 다른 성분의 성장 환경에서 배양함으로써 달성될 수 있다.

배상체(EB)는 만능 줄기 세포, 예를 들어 ES 세포 또는 iPS 세포로부터 유도된 세포의 응집체이며, 마우스 배아 줄기 세포를 이용하여 다년간 연구되어 왔다. 생체내 분화에 대하여 내재하는 신호의 일부를 반복하기 위하여, 본 발명의 임의의 양태는 중간 단계로서 3차원 응집체(즉, 배상체)를 이용할 수 있다. 응집시, 분화가 개시되고 세포는 제한된 정도로 배아 발생을 반복하기 시작한다. 세포가 영양외배엽 조직(태반을 포함함)을 형성할 수 없더라도, 유기체에 존재하는 거의 모든 기타 다른 유형의 세포는 발생할 수 있다. 본 발명은 응집체 형성 후에 심장 분화를 추가로 촉진시킬 수 있다.

세포 응집체는 비조직 배양 처리된 플레이트 또는 스피너 플라스크 상에 현적(hanging drop), 도말에 의해 부과될 수 있으며; 어느 하나의 방법은 세포가 표면에 부착하는 것을 방지하여 전형적인 콜로니 성장을 형성한다. 만능 줄기 세포는세포 배양의 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 응집 촉진 배지로 파종될 수 있다. 예를 들어, 만능 줄기 세포는 단일 콜로니 또는 클론 그룹으로서 응집 촉진 배지로 파종될 수 있고, 또한 만능 줄기 세포는 본질적으로 개별적인 세포로서 파종될 수 있다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 당업계에 공지된 기계적 또는 효소 방법을 사용하여 본질적으로 개별적인 세포로 분리된다. 비제한적인 예로서, 만능 줄기 세포는 세포와 배양 표면 사이의 연결 및 세포 자신들 사이의 연결을 방해하는 단백질 분해 효소에 노출될 수 있다. 응집체 형성 및 분화를 위해 만능 줄기 세포를 개별화하는데 사용될 수 있는 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만 다양한 상업적 제형으로 트립신, 예를 들어 TrypLE, 또는 Accutase(등록상표)와 같은 효소의 혼합물을 포함할 수 있다.

임의의 실시형태에서, 만능 세포는 배양 표면에서 배양 형성 동안 본질적으로 개별적인(또는 분산된) 세포로서 배양 배지로 첨가되거나 파종될 수 있다. 세포가 파종되는 배양 배지는 TeSR 배지 또는 mTeSR 배지 및 생존 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분산된 만능 세포는 약 10⁴ 세포수/㎖ 내지 약 10¹⁰ 세포수/㎖의 밀도로 배양 배지로 파종된다. 보다 특히, 만능 세포는 약 10⁵ 세포수/㎖ 내지 약 10⁷ 세포수/㎖, 또는 약 0.5x10⁶ 세포수/㎖ 내지 약 3x10⁶ 세포수/㎖의 밀도로 파종된다. 이러한 실시형태에서, 배양 표면은 당업계의 표준 무균 세포 배양 방법과 양립가능한 본질적으로 임의의 물질, 예를 들어 비부착 표면으로 이루어질 수 있다. 배양 표면은 본 명세서에 기술된 바와 같은 기질 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 기질 성분은 표면이 세포 및 배지와 접촉하기 전에 배양 표면으로 적용될 수 있다.

심근세포 계통 세포는 (원하는 세포의 성장에 의해, 또는 기타 다른 세포 유형의 억제 또는 사멸에 의해) 원하는 표현형을 가진 세포에 대하여 농후화된 특수한 성장 환경에서 배양 또는 분화함으로써 무분화 줄기 세포로부터 획득될 수 있다.

임의의 양태에서, iPS 세포는 개시된 방법을 포함하여 심장 세포로 분화될 수 있다. 분화는 상기 기술된 바와 같이 배상체 또는 응집체를 형성함으로써, 예를 들어 만능 줄기 세포 배양물의 성장, 또는 EB 형성을 가능하게 하는 저부착 특성을 가지는 기질이 있는 배양 용기 내 현탁액 중에서 만능 줄기 세포를 배양함으로써 개시될 수 있다. 만능 줄기 세포는 클러스터로 분리되는 단기간의 콜라게나제 분해에 의해 수확되고, 비부착 세포 배양 플레이트에 도말될 수 있다(WO 제01/51616호; 미국 특허 제6,602,711호, 참조로 포함됨). 선택적으로, EB는 알긴산염 또는 기타 다른 적합한 영양 투과성 기질에서 캡슐화되어 생성될 수 있으며, 이는 EB 직경의 균일성 및 생성된 세포의 일관성을 개선하는데 도움이 될 수 있다(WO 제03/004626호, Zandstra et al., 참조로 포함됨). 과정이 EB 형성을 수반하든 하지 않든 혈청 또는 혈청 동등물을 포함하는 배지, 예를 들어 RPMI와 같은 적합한 성장 배지에서 약 20% 소태아혈청, 또는 B27 또는 N2와 같은 혈청 보충물을 사용하는 것은 심근세포 계통의 세포를 수축시키는 중심을 촉진시킨다. 심장 분화의 보다 많은 예시적인 방법은 배상체(EB) 방법(Zhang et al., 2009, 이는 참조로 포함되어 있음), OP9 스트로마 세포 방법(Narazaki, et al., 2008, 이는 참조로 포함되어 있음), 또는 성장 인자/화학적 방법(미국 특허 공개 제20080038820호, 제20080226558호, 제20080254003호 및 제20090047739호 참조, 모두 본 명세서에 전문이 참조로 포함되어 있음)을 포함할 수 있다.

심근세포 표현형을 촉진하기 위하여, 세포는 심근세포 유형 세포의 증식 또는 생존을 향상시키거나 기타 다른 세포 유형의 성장을 억제하는 인자 및 인자 조합과 함께 배양될 수 있다. 그 영향은 세포 자체에 대한 직접적인 영향에 기인하거나, 다른 세포 유형에 대한 영향에 기인할 수 있으며, 이는 결국 심근세포 형성을 향상시킨다. 예를 들어, 배반엽하증 또는 배반엽상층의 형성을 유도하거나, 세포가 그 자체의 심장 촉진 요소를 생성하도록 하는 인자, 이 모두는 강심 인자(cardiotropic factor)의 설명(rubric) 범위에 들어간다.

예를 들어, 심장 분화를 위한 유도 배지는 이에 제한되는 것은 아니지만 전심장(precardiac) 외식편, 전심장 중배엽 조정 배지, 및 HGF와 같은 중배엽 분비 성장 인자를 포함할 수 있다.

중배엽 층의 세포로 만능 줄기 세포의 분화를 유도 또는 심근세포 계통 세포로 추가 분화를 용이하게 하는 것으로 여겨지는 추가적인 인자는 다음을 포함한다:

형질전환 성장 인자 베타-관련 리간드(예를 들어 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 및 하기 예시된 TGF-β 상과(superfamily)의 기타 다른 구성원). 리간드는 TGF-β 수용체에 결합하고, 제1 유형 및 제2 유형 세린 키나아제를 활성화시키며, SMAD 효과기(effector)의 인산화를 야기한다.

액티빈 A 및 액티빈 B(TGF-β 상과의 구성원)와 같은 형태형성물질(morphogen).

인슐린 유사 성장 인자(예를 들어 IGF I 및 IGF II).

골 형성 단백질(TGF-β 상과의 구성원, 예를 들어 BMP-2 및 BMP-4).

섬유아세포 성장 인자(예를 들어, bFGF, FGF-4, 및 FGF-8), 세포질 키나아제 raf-1 및 마이토겐 활성 단백질 키나아제(MAPK), 및 표피 성장 인자(EGF)와 같은 기타 다른 마이토겐을 활성화시키는 기타 다른 리간드.

심근세포 관련 유전자의 DNA 메틸화 및 발현을 변경시키는 것에 영향을 미치는 뉴클레오티드 유사체(예컨대, 5-아자-데옥시-시티딘).

뇌하수체 호르몬 옥시토신, 또는 일산화질소(NO).

동일한 수용체에 대하여 작용제 활성을 가지는 특이적인 항체 또는 합성 화합물.

강심 제제(cardiotropic agent)의 예시적인 효과적인 조합은 액티빈 A와 같은 형태형성물질 및 복수의 성장 인자, 예를 들어 초기 관련 단계 동안 TGF-β 및 IGF 과(family)에 포함되고, 선택적으로 추가적인 카디오트로핀, 예를 들어 하나 이상의 섬유아세포 성장 인자, 골 형성 단백질, 및 혈소판 유래 성장 인자가 보충된 것의 사용을 포함한다.

시험관내 분화의 최종 단계로부터 누락한 인자, 예를 들어 인슐린 유사 성장 인자 II(IGF II) 및 관련 분자는 실제로 심장 유전자 발현의 수준을 증가시키는 것으로 발견되었다. 비관련 연구에서, IGF II는 섬유아세포에서 GSK3β의 수준을 감소시키는 것으로 발견되었다(Scalia et al., 2001). 그러므로 IGF II는 배양 배지에 존재하거나 세포에 의해 분비되는 Wnt 단백질의 효과를 강력하게 할 수 있다. Wnt 단백질은 세포질 분자인 β-카테닌의 핵 전좌를 정상적으로 안정화시키고 야기하며, β-카테닌은 전사 인자 TCF의 부분을 포함한다. 이는 동의유전자(multiple gene)의 전사 활성을 변경시킨다. Wnt의 부재시, β-카테닌은 키나아제 GSK3β에 의해 인산화되며, 키나아제 GSK3β는 β-카테닌을 불안정화시키고 이를 세포질에 유지시킨다.

IGF II와 같은 Wnt 활성제는 분명히 심근세포 분화를 제한하므로, 본 발명의 임의의 양태는 Wnt 길항제와 함께 배양하여 만능 줄기 세포의 심근세포 분화의 정도 또는 비율을 증가시키는 단계를 포함할 수 있다. Wnt 신호전달은 DKK-1 또는 Crescent(Wnt에 결합하여 불활성화시키는 분비 단백질)를 암호화하는 합성 mRNA의 주입에 의해(Schneider et al., 2001), 또는 레트로바이러스 암호화 DKK-1을 이용한 감염에 의해(Marvin et al., 2001) 억제될 수 있다. 대안적으로, Wnt 경로는 키나아제 GSK3β의 활성을 증가시킴으로써, 예를 들어 IL-6 또는 글루코코르티코이드와 같은 인자와 함께 세포를 배양함으로써 억제될 수 있다.

임의의 실시형태에서, FGF 또는 FGF 및 HGF의 조합이 만능 줄기 세포, 세포 응집체, 또는 분화된 줄기 세포를 배양하는데 사용되며, 이는 줄기 세포의 심장 유도를 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, FGF는 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 180, 200, 250ng/ml 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위의 농도로 추가할 수 있다. 선택적으로 간세포 성장 인자(HGF)는 또한 예를 들어 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 180, 200, 250ng/ml 또는 여기에서 추론가능한 임의의 범위의 농도로 포함될 수 있다.

V. 만능 줄기 세포의 공급원

본 발명의 임의의 양태에서, 심근세포는 시험관내에서 만능 줄기 세포로부터 유도될 수 있다.

용어 "만능 줄기 세포"는 모든 3가지 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포가 생기게 할 수 있는 세포를 지칭한다. 이론상으로 만능 줄기 세포는 신체의 임의의 세포로 분화할 수 있지만, 전분화능의 실험적 측정은 전형적으로 각각의 배엽의 몇몇 가지 세포 유형으로의 만능 세포의 분화를 기초로 한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 배반포의 내세포괴(inner cell mass)로부터 유도된 배아 줄기(ES) 세포이다. 다른 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 재프로그래밍 체세포에 의해 유도된 유도 만능 줄기 세포이다. 임의의 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 체세포 핵 이식에 의해 유도된 배아 줄기 세포이다.

A. 배아 줄기 세포

배아 줄기(ES) 세포는 배반포의 내세포괴로부터 유도된 만능 세포이다. ES 세포는 발생중인 배아의 외부 영양외배엽 층을 제거한 다음, 비성장 세포의 배양보조 세포층(feeder layer) 상에서 내세포괴를 배양함으로써 분리될 수 있다. 적절한 조건 하에서, 증식하는 미분화된 ES 세포의 콜로니가 생성된다. 콜로니를 제거하고 개별적인 세포로 분리한 다음, 신선한 배양보조 세포층 상에 재도말할 수 있다. 재도말된 세포는 계속 증식하여, 미분화된 ES 세포의 새로운 콜로니를 생성할 수 있다. 그 다음 새로운 콜로니를 제거하고, 분리하며, 다시 재도말하여 성장하게 할 수 있다. 이러한 미분화된 ES 세포를 "계대배양(subculturing 또는 passaging)"하는 과정을 다수 회 반복하여 미분화된 ES 세포를 포함하는 세포주를 생성할 수 있다(미국 특허 제5,843,780호; 제6,200,806호; 제7,029,913호). "초대 세포 배양물"은 배반포의 내세포괴와 같은 조직으로부터 직접적으로 획득한 세포의 배양물이다. "계대배양물"은 초대 세포 배양물로부터 유도된 임의의 배양물이다.

마우스 ES 세포를 획득하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 하나의 방법에서, 마우스의 129 주(strain)로부터의 착상 전 배반포는 마우스 항혈청으로 처리하여 영양외배엽을 제거하고, 내세포괴는 소태아혈청을 포함하는 배지에서 화학적으로 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조 세포층 상에서 배양한다. 발생하는 미분화된 ES 세포의 콜로니는 소태아혈청의 존재하에서 마우스 배아 섬유아세포 배양보조 세포층 상에서 계대배양되어 ES 세포의 집단을 생성한다. 일부 방법에서, 마우스 ES 세포는 사이토카인인 백혈병 억제 인자(LIF)를 혈청을 포함하는 배양 배지에 첨가함으로써 배양보조 세포층의 부재하에서 성장할 수 있다(Smith, 2000). 다른 방법에서, 마우스 ES 세포는 골 형성 단백질 및 LIF의 존재하에서 무혈청 배지에서 성장할 수 있다(Ying et al., 2003).

인간 ES 세포는 이미 기술된 방법을 사용하여 배반포로부터 획득할 수 있다(Thomson et al., 1995; Thomson 및 Marshall, 1998; Reubinoff et al, 2000). 하나의 방법에서, 5일째 인간 배반포는 토끼 항인간 비장 세포 항혈청에 노출된 다음, 기니아 피크 보체의 1:5 희석물에 노출되어 영양외배엽 세포를 용해한다. 온전한 내세포괴로부터 용해된 영양외배엽을 제거한 후, 내세포괴는 감마-불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조 세포층 상에서 그리고 소태아혈청의 존재하에서 배양된다. 9일 내지 15일 후, 내세포괴로부터 유도된 세포의 단괴(clump)는 화학적으로(즉, 트립신에 노출됨) 또는 기계적으로 분리되고 소태아혈청 및 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조 세포층을 포함하는 신선한 배지에 재도말될 수 있다. 추가 증식시, 미분화된 형태를 가지는 콜로니는 마이크로피펫에 의해 선택되고, 단괴로 기계적으로 분리되며, 재도말된다(미국 특허 제6,833,269호 참조). ES-유사 형태는 명백하게 높은 핵 대 세포질 비율 및 현저한 인(nucleolus)을 가지는 치밀한 콜로니로서 특징지어진다. 생성된 ES 세포는 단기간의 트립신 처리에 의해 또는 마이크로피펫에 의해 개별적인 콜로니의 선택에 의해 일상적으로 계대배양될 수 있다. 일부 방법에서, 인간 ES 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자의 존재하에서 섬유아세포의 배양보조 세포층 상에서 ES 세포를 배양함으로써 혈청없이 성장할 수 있다(Amit et al., 2000). 기타 다른 방법에서, 인간 ES 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 "조정" 배지의 존재하에서 단백질 기질, 예를 들어 Matrigel™ 또는 라미닌 상에서 세포를 배양함으로써 배양보조 세포층없이 성장할 수 있다(Xu et al., 2001). 배지는 섬유아세포와 함께 공배양(coculturing)함으로써 미리 조정된다.

붉은털 원숭이(rhesus monkey) 및 코먼마모셋(common marmoset) ES 세포의 분리를 위한 방법이 또한 공지되어 있다(Thomson 및 Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson 및 Odorico, 2000).

ES 세포의 다른 공급원은 확립된 ES 세포주이다. 다양한 마우스 세포주 및 인간 ES 세포주는 공지되어 있으며 이들의 성장 및 증식을 위한 조건이 규명되었다. 예를 들어, 마우스 CGR8 세포주는 마우스 주 129 배아의 내세포괴로부터 확립되었고, CGR8 세포의 배양물은 LIF의 존재하에서 배양보조 세포층 없이 성장할 수 있다. 추가 예로서, 인간 ES 세포주 H1, H7, H9, H13 및 H14는 문헌[Thompson et al.]에 의해 확립되었다. 추가적으로, H9 계통의 서브클론 H9.1 및 H9.2가 개발되었다. 당업계에 공지된 사실상 임의의 ES 또는 줄기 세포주, 예컨대 문헌[Yu 및 Thompson, 2008](이는 본 명세서에 참조로 포함되어 있음)에 기술된 것이 본 발명과 함께 사용될 수 있음이 예상된다.

본 발명과 관련되어 사용하기 위한 ES 세포의 공급원은 배반포, 배반포의 내세포괴를 배양한 것으로부터 유도된 세포, 확립된 세포주의 배양물로부터 획득한 세포일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "ES 세포"는 배반포의 내세포괴 세포, 내세포괴의 배양물로부터 획득한 ES 세포, 및 ES 세포주의 배양물로부터 획득한 ES 세포를 지칭할 수 있다.

B. 유도 만능 줄기 세포

유도 만능 줄기(iPS) 세포는 ES 세포의 특징을 가지지만 분화된 체세포의 재프로그래밍에 의해 획득한 세포이다. 유도 만능 줄기 세포는 다양한 방법에 의해 획득할 수 있다. 하나의 방법에서, 성인 인간 진피 섬유아세포는 레트로바이러스 형질도입(transduction)을 사용하여 전사 인자 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4로 형질감염된다(Takahashi et al., 2007). 형질감염된 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)로 보충된 배지 중에서 SNL 배양보조 세포층(LIF를 생성하는 마우스 세포 섬유아세포 세포주) 상에 도말된다. 대략 25일 후에, 인간 ES 세포 콜로니와 유사한 콜로니가 배양물 중에서 나타난다. ES 세포-유사 콜로니를 선택하고 bFGF의 존재하에서 배양보조 세포 상에 펼친다.

세포 특징을 기초로 하여, ES 세포-유사 콜로니의 세포는 만능 줄기 세포로 유도된다. 유도 만능 줄기 세포는 인간 ES 세포와 형태상으로 유사하며, 다양한 인간 ES 세포 마커를 발현한다. 또한, 인간 ES 세포의 분화를 초래하는 것으로 공지된 조건 하에서 성장할 때, 따라서 유도 만능 줄기 세포는 분화한다. 예를 들어, 유도 만능 줄기 세포는 뉴런 구조 및 뉴런 마커를 가지는 세포로 분화될 수 있다. 사실상 임의의 iPS 세포 또는 세포주, 예컨대 문헌[Yu 및 Thompson, 2008]에 기술된 것은 본 발명과 함께 사용될 수 있음이 예상된다.

다른 방법에서, 인간 태아 또는 신생아 섬유아세포는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 4가지 유전자, 즉 Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28로 형질감염된다(Yu et al., 2007). 감염 후 12 내지 20일 후에, 인간 ES 세포 형태를 가지는 콜로니는 가시적이 된다. 콜로니를 선택하고 펼친다. 콜로니를 구성하는 유도 만능 줄기 세포는 인간 ES 세포와 형태상으로 유사하고, 다양한 인간 ES세포 마커를 발현하며, 마우스로 주입 후에 뉴런 조직, 연골 및 소화관 상피를 가지는 기형종(teratoma)을 형성한다.

마우스로부터의 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 방법이 또한 공지되어 있다(Takahashi 및 Yamanaka, 2006). iPS 세포의 유도는 전형적으로 Sox 과로부터의 적어도 하나의 구성원 및 Oct 과로부터의 적어도 하나의 구성원의 발현 또는 이에의 노출을 필요로 한다. Sox 및 Oct는 ES 세포 정체성(identity)을 명시하는 전사 조절 체계(hierarchy)에 대하여 중심이 되는 것으로 여겨진다. 예를 들어, Sox는 Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15, 또는 Sox-18일 수 있고; Oct는 Oct-4일 수 있다. Nanog, Lin28, Klf4, 또는 c-Myc와 같은 추가적인 인자는 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있으며; 재프로그래밍 인자의 구체적인 세트는 Sox-2, Oct-4, Nanog 및 선택적으로 Lin-28을 포함하는 세트; 또는 Sox-2, Oct4, Klf 및 선택적으로 c-Myc를 포함하는 세트일 수 있다.

ES 세포와 같은 IPS 세포는 SSEA-1, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 항체(Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.), 및 TRA-1-60 및 TRA-1-81에 대한 항체(Andrews et al ., 1987)를 사용하여, 면역조직화학 또는 유세포분석에 의해 식별하거나 확인할 수 있는 특징적인 항원을 가진다. 배아 줄기 세포의 전분화능은 8~12주령의 수컷 SCID 마우스의 뒷다리 근육에 대략 0.5~10 X 10⁶ 세포를 주입함으로써 확인할 수 있다. 3가지 배엽 각각의 적어도 하나의 세포 유형을 설명하는 기형종이 발생한다.

본 발명의 임의의 양태에서, iPS 세포는 상기 기술된 바와 같은 Klf 또는 Nanog과 조합하여 Oct 과 구성원 및 Sox 과 구성원, 예를 들어 Oct4 및 Sox2를 포함하는 재프로그래밍 인자를 사용하여 재프로그래밍 체세포로부터 만들어진다. 본 발명에서 체세포는 전분화능으로 유도될 수 있는 임의의 체세포, 예를 들어 섬유아세포, 각질형성세포, 조혈 세포, 간충직 세포, 간 세포, 위 세포, 또는 β 세포일 수 있다. 임의의 양태에서, T 세포는 또한 재프로그래밍을 위한 체세포의 공급원으로서 사용될 수 있다(미국 출원 제61/184,546호 참조, 본 명세서에 참조로 포함됨).

재프로그래밍 인자는 하나 이상의 벡터, 예를 들어 통합 벡터(integrating vector) 또는 에피솜 벡터, 예를 들어 EBV 요소-기반 시스템에 포함되는 발현 카세트로부터 발현될 수 있다(미국 출원 제12/478,154호 참조, 본 명세서에 참조로 포함됨; 문헌[Yu et al ., 2009]). 추가의 양태에서, 재프로그래밍 단백질은 단백질 형질도입(미국 출원 제12/723,063호 참조, 본 명세서에 참조로 포함됨) 또는 RNA 형질감염(미국 출원 제12/735,060호 참조)에 의해 체세포로 직접적으로 도입될 수 있다.

C. 체세포 핵 이식에 의해 유도된 배아 줄기 세포

만능 줄기 세포는 체세포 핵 이식에 의해 제조될 수 있으며, 여기에서 공여핵(donor nucleus)은 방추사가 없는 난모세포로 이식된다. 핵 이식에 의해 생성된 줄기 세포는 공여핵과 유전적으로 동일하다. 하나의 방법에서, 레서스 원숭이(rhesus macaque)의 피부 섬유아세포로부터의 공여 피부아세포 핵은 전기세포융합에 의해 방추사가 없고, 성숙한 중기 II의 레서스 원숭이 난모세포의 세포질로 도입된다(Byrne et al., 2007). 융합된 난모세포는 이오노마이신에의 노출에 의해 활성화된 다음, 배반포 단계까지 배양된다. 그 다음 선택된 배반포의 내세포괴는 배양되어 배아 줄기 세포주를 생성한다. 배아 줄기 세포주는 정상적인 ES 세포 형태를 나타내고, 다양한 ES 세포 마커를 발현하며, 시험관내 및 생체내 모두에서 다양한 세포 유형으로 분화한다. 본원에 사용된 용어 "ES 세포"는 수정된 핵을 포함하는 배아로부터 유도된 배아 줄기 세포를 지칭한다. ES 세포는 핵 이식에 의해 생성된 배아 줄기 세포와 구별되며, 이는 "체세포 핵 이식에 의해 유도된 배아 줄기 세포"로서 언급된다.

VI . 심근세포의 특성화

심근세포는 다수의 표현형 기준에 따라서 특징지어질 수 있으며, 예를 들어 심근세포는 정제 또는 분리될 수 있거나, 대안적으로 배양물에서 심근세포의 순도는 배양물에서 심근세포의 검출을 기초로 하여 측정될 수 있다. 줄기 세포로부터 유도된 심근세포, 예를 들어 만능 줄기 세포는 기타 다른 공급원으로부터의 심근세포의 형태학적 특징을 가진다. 상기 특징은 방추사형, 둥근형, 삼각형 또는 다각형일 수 있고, 이는 면역염색에 의해 검출가능한 근절 구조의 줄무늬 특징을 나타낼 수 있다. 이는 세포의 평평한 시트, 또는 기질에 부착된 채로 있거나 현탁액에 부유하는 응집체를 형성할 수 있으며, 이는 전자 현미경에 의해 검사될 때 전형적인 근절 및 심방 과립을 나타낸다.

예를 들어, 심근세포의 순도는 심근세포 특이적 마커의 프로모터의 제어하에서 외인성 마커 유전자를 발현하거나 내인성 심근세포 특이적 마커를 발현하는 심근세포를 검출하는 것에 의하여 측정될 수 있다. 추가의 양태에서, 이러한 검출은 본 발명의 임의의 양태에 기술된 배지 중 장기간의 저장에 대하여 심근세포를 분리 또는 정제하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 심근세포 특이적 마커는 다음을 포함할 수 있다:

심장 트로포닌 I(cTnI), 줄무늬 근육 수축의 조절을 위한 칼슘 민감성 분자 스위치를 제공하는 트로포닌 복합체의 서브유닛.

심장 트로포닌 T(cTnT).

Nkx2.5, 초기 마우스 배아 발생 동안 심장 중배엽에서 발현되는 심장 전사 인자, 이는 발생중인 심장에서 계속됨.

심방 나트륨 이뇨 인자(ANF), 발생중인 심장 및 태아 심근세포에서 발현되지만 성인에서는 하향조절되는 호르몬. 심장 세포에서는 매우 특이적인 방식으로 발현되지만 골격 근세포에서는 그렇지 않기 때문에 심근세포에 대하여 우수한 마커로 간주된다.

미오신 중쇄(MHC), 특히 심장 특이적인 β 사슬

티틴, 트로포미오신, α-근절 액티닌 및 데스민

GATA-4, 심장 중배엽에서 크게 발현되고 발생중인 심장에서 계속되는 전사 인자. 이는 많은 심장 유전자를 조절하고 심장발생에서 역할을 한다.

MEF-2A, MEF-2B, MEF-2C, MEF-2D; 심장 중배엽에서 발현되고 발생중인 심장에서 계속되는 전사 인자

N-카데린, 이는 심장 세포 사이에서 부착을 매개함

코넥신 43, 이는 심근세포 사이에서 간극연접을 형성함.

β1-아드레날린수용체(β1-AR)

크레아틴 키나아제 MB(CK-MB) 및 미오글로빈, 이는 심근 경색증 후 혈청에서 상승됨

α-심장 액틴, 초기 성장 반응-I, 및 사이클린 D2.

심근세포 특이적 마커는 임의의 적합한 면역학적 기술, 예를 들어 유동 면역세포분석(flow immunocytometry) 또는 세포-표면 마커에 대한 친화 흡착, 세포내 또는 세포-표면 마커에 대한 면역세포화학(예를 들어, 고정된 세포 또는 조직 부분), 세포 추출물의 웨스턴 블럿 분석, 및 배지로 분비된 세포 추출물 또는 산물에 대한 효소 결합 면역분석을 사용하여 검출될 수 있다. cTnI 및 cTnT와 같은 심장 마커를 기타 다른 아형(isoform)과 구별하는 항체는 Sigma 및 Spectral Diagnostics와 같은 공급자로부터 상업적으로 이용가능하다. 세포에 의한 항체의 발현은, 선택적으로 세포의 고정 후, 그리고 선택적으로 표지된 2차 항체를 사용하여, 항체의 상당히 검출가능한 양이 표준 면역세포화학 또는 유세포 분석에서 항원에 결합할 것이라면 검출가능한 항체라고 한다.

심근세포 특이적 유전자 산물의 발현은 또한 노던 블럿 분석, 점-블럿 혼성화 분석에 의하여, 또는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 사용하여, 공적으로 이용가능한 서열 데이터(GenBank)를 사용하여 역전사효소 개시 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의하여 mRNA 수준으로 검출될 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군 세포, 예를 들어 미분화된 만능 줄기 세포 또는 기타 다른 비관련 세포 유형의 적어도 또는 약 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 또는 9-배, 보다 특히 대조군 세포의 10-, 20-, 30-, 40-, 또는 50-배 초과라면, 단백질 또는 mRNA 수준으로 검출된 조직 특이적 마커의 발현은 양성인 것으로 간주된다.

일단 마커가 원하는 표현형의 세포의 표면상에서 확인되면, 이는 면역패닝법(immunopanning) 또는 항체 매개 형광 활성화 세포 분류와 같은 기술에 의해 집단을 추가로 농후화하는 면역학적선택에 사용될 수 있다.

적절한 상황하에서, 만능 줄기 세포 유도 심근세포는 종종 자발적인 주기적 수축 활성을 나타낸다. 이는 상기 심근세포가 적절한 Ca² ⁺ 농도 및 전해질 균형을 이용하여 적합한 조직 배양 환경에서 배양될 때, 세포는 임의의 추가적인 성분을 배양 배지에 추가하지 않고 세포의 하나의 축을 걸치는 수축, 및 그 다음 수축으로부터 해제됨이 관찰될 수 있다. 수축은 주기적이며, 이는 수축이 정상적인 완충제 중에서 분당 약 6 내지 200번 수축, 그리고 종종 분당 약 20 내지 약 90회 수축의 빈도로 규칙적인 또는 불규칙적인 기준으로 반복함을 의미한다. 개별적인 세포는 그 자체에 대하여 자발적인 주기적 수축 활성을 나타낼 수 있거나, 조직, 세포 응집체, 또는 배양된 세포 집단에서 이웃하는 세포와 협력하여 자발적인 주기적 수축 활성을 나타낼 수 있다.

세포의 수축 활성은 수축의 성질 및 빈도에 대한 배양 조건의 영향에 따라서 특징지어질 수 있다. 이용가능한 Ca² ⁺ 농도를 감소시키거나 다르게는 Ca² ⁺의 막 운반을 방해하는 화합물은 종종 수축 활성에 영향을 미친다. 예를 들어, L-유형 칼슘 채널 차단제인 딜티아젬은 용량 의존적 방식으로 수축 활성을 억제한다. 다른 한편으로, 아이소프레날린 및 페닐에프린과 같은 아드레날린수용체 작용제는 양성 변시성 효과를 가진다. 세포의 기능적 특성의 추가 특성화는 Na⁺, K⁺, 및 Ca² ⁺에 대한 채널을 특성화하는 것을 수반할 수 있다. 전기생리학은 활동 전위와 같은 심근세포에 대한 패치 클램프(patch clamp) 분석에 의해 연구될 수 있다.

기능적 속성은 시험관내에서 세포 및 이의 전구체를 특성화하는 방식을 제공하지만, 본 개시 내용에서 말하여지는 용도 중 일부에 대하여 필수적이지 않을 수 있다. 예를 들어, 기능적 또는 전기생리학 특성의 전부는 아니지만, 상기 열거된 마커의 일부를 보유하는 세포에 대하여 농후화된 혼합 세포 집단은, 손상된 심장 조직에 대하여 이식할 수 있고, 생체내에서 심장 기능을 보충하는데 필요한 기능적 특성을 달성할 수 있다면, 상당한 치료적 이익을 가질 수 있다.

VII . 세포의 유전적 변형

임의의 양태에서, 본 발명의 세포는 분화 전 또는 후에 세포의 유전 조작에 의하여 하나 이상의 유전적 변형을 포함하도록 제조될 수 있다(미국 제2002/0168766호). 세포는 폴리뉴클레오티드가 인위적 조작의 임의의 적합한 수단에 의해 세포로 이식될 때, 또는 세포가 폴리뉴클레오티드를 이어받은 원래 변형된 세포의 자손인 경우 "유전적으로 변형된" 또는 "형질전환"된 것으로 말한다. 예를 들어, 세포는, 세포가 제한된 발달중인 계열 세포 또는 마지막으로 분화되는 세포로 진행하기 전 또는 후에, 세포를 유전적으로 변형시킴으로써 복제 포텐셜을 증가시키도록 가공되어 텔로머라아제 역전사를 발현시킬 수 있다(미국 제2003/0022367호).

본 발명의 세포는 또한 조직 재생에 수반되는 세포의 능력을 향상시키기 위하여, 또는 투여 부위에 치료적 유전자를 운반하기 위하여 유전적으로 변형될 수 있다. 벡터는, 분화된 세포 유형에서 범특이적(pan-specific) 또는 특이적으로 활성인 프로모터와 작동적으로 연결된, 원하는 유전자에 대하여 공지된 암호화 서열을 사용하여 고안된다. 특히 관심이 있는 것은, FGF와 같은 다양한 유형의 하나 이상의 성장 인자, 심방 나트륨 이뇨 인자와 같은 강심 인자, 크립토(cripto), 및 GATA-4, Nkx2.5, 및 MEF2-C와 같은 심장 전사 조절 인자를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포이다. 투여 부위에서 이러한 인자의 생성은 기능적 표현형의 채택을 용이하게 하거나, 투여된 세포의 유리한 영향을 향상시키거나, 처치 부위와 인접하는 숙주 세포의 증식 또는 활성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 임의의 실시형태에서, 본 발명의 핵산 작제를 포함하는 세포는 발현 벡터 내에 마커, 예를 들어 선택가능 또는 선별가능한 마커를 포함시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 식별될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 포함하는 세포의 용이한 식별을 가능하게 하는 식별가능한 변경을 세포에 부여하거나, 심근세포 특이적 프로모터, 예를 들어 심장 트로포닌 I(cTnI), 심장 트로포닌 T(cTnT), α-미오신 중쇄(MYH6), 미오신 경쇄-2v(MLC-2v), GATA-4, Nkx2.5, N-카데린, β1-아드레날린수용체, 전사 인자의 MEF-2 과(family), 크레아틴 키나아제 MB(CK-MB), 미오글로빈, 또는 심방 나트륨 이뇨 인자(ANF)를 사용하여 분화된 심장 세포를 농후화 또는 식별하는데 도움이 될 것이다.

일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 반면, 음성 선택 마커는 이의 존재가 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.

보통 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체(transformant)의 클로닝 및 식별에 도움이 되며, 예를 들어 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘, DHFR, GPT, 제오신(zeocin) 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여한 유전자가 유용한 선택 마커이다.

조건의 이행을 기초로 하여 형질전환체의 차별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커에 추가적으로, 기타 다른 유형의 마커, 예를 들어 GFP(이의 기반은 비색분석임)와 같은 선별가능한 마커가 또한 고려된다.

이러한 선별가능한 것의 예는 세포 표면 단백질(예컨대, CD4, HA 에피토프), 형광 단백질, 항원 결정기 및 효소(예컨대, β-갈락토시다아제)를 암호화하는 유전자를 포함한다. 벡터를 포함하는 세포는 예컨대 효소가 암호화된 벡터에 의해 형광 산물로 전환될 수 있는 세포 표면 단백질 또는 기질에 대한 형광이 부착된 항체를 사용한 FACS에 의하여 분리될 수 있다.

구체적인 실시형태에서, 선별가능한 마커는 형광 단백질을 암호화한다. 거의 전체 가시광선 스펙트럼에 걸쳐서 형광 방출 스펙트럼 프로파일을 특징으로 하는 광범위한 형광 단백질 유전적 변이체가 개발되어 왔다(비제한적 예에 대하여 표 1 참조). 원래 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 해파리 녹색 형광 단백질에서 돌연변이유발의 노력은 색상이 파랑색부터 노랑색까지에 이르는 새로운 형광 프로브를 초래하였으며, 생물학적 연구에서 가장 널리 사용된 생체내 리포터 분자 중 일부이다. 오렌지색과 빨강색 스펙트럼 영역에서 방출하는 더 긴 파장의 형광 단백질은 해양 아네모네(marine anemone), 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata), 산호충강(class Anthozoa)에 속하는 초산화로부터 개발되었다.

대안적으로, 클로람페니콜 아세틸전달효소(CAT)와 같은 선별가능한 효소가 이용될 수 있다. 당업자는 또한 아마도 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 이용하는 방법을 알 것이다. 핵산이 암호화하는 유전자 산물과 동시에 발현될 수 있는 한, 사용된 마커는 중요하지 않은 것으로 여겨진다. 선택가능 및 선별가능한 마커의 추가의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.

VIII . 배양된 심근세포의 용도

본 발명의 임의의 양태는 심근세포 계열의 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명의 배양 방법 또는 배지는 심근세포의 기능적 특성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 배양 배지는 심박수를 용이하게 하거나 심박수의 진동의 발생을 감소시킬 수 있다. 이러한 배양된 심근세포는 다수의 중요한 연구, 개발, 및 상업적 목적을 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 심근세포는 이러한 세포 및 다양한 자손의 특징, 예를 들어 심박 빈도 또는 심박수 진동에 영향을 주는 인자(예를 들어 용매, 소분자 약물, 펩티드, 올리고뉴클레오티드) 또는 환경 조건(예를 들어 배양 조건 또는 조작)에 대하여 선별하는데 상업적으로 사용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같은 배양 배지는 심박 빈도를 증가시키고 심박수 진동의 발생을 감소시킴으로써 심박 빈도 기록의 안정성을 증가시킬 수 있다.

임의의 양태에서, 심근세포는 a) 심근세포의 정상적인 심박 빈도; b) 박동하는 심근세포의 정상적인 포텐셜 장 지속기간; c) 심박 빈도에 영향을 줄 수 있는 화합물로 처리된 심근세포의 심박 빈도; 또는 d) 포텐셜 장 지속기간에 영향을 줄 수 있는 화합물로 처리된 심근세포의 포텐셜 장 지속기간을 용이하게 하는 상기 기술된 바와 같이 배지에서 배양될 수 있다.

심근세포의 심박 (수축) 빈도는 배양 배지 pH, 온도, 또는 조절제 약물에 의해 조절될 수 있다. 예시적 비제한적인 조절제 약물은 카테콜아민, 칼슘 채널 차단제 또는 칼륨을 포함한다.

심근세포뿐만 아니라, 이의 임의의 발달, 성숙 또는 분화 단계의 농후화 또는 선택된 심근세포를 포함하여 심근세포의 집단은 심장계 작용 제제(cardioactive agent)를 선별하거나 식별하는데 사용될 수 있다. 다양한 비제한적인 실시형태에서, 선별 또는 식별 방법에 사용되는 심근세포 집단은 결절(nodal), 동방(sino-atrial) 또는 박동조율 세포(pacemaker cell), 성숙한 수축성 심근세포, 미성숙 심근세포(위심세포), 또는 이의 혼합 집단을 포함한다.

세포 기능의 영향은 세포 배양물 중 또는 생체내에서 심근세포의 표현형 또는 활성을 관찰하는 임의의 표준 분석, 예를 들어 마커 발현, 수용체 결합,수축 활성, 또는 전기생리학을 사용하여 평가될 수 있다. 약학적 후보는 또한 수축 활성에 대한 영향, 예를 들어 수축의 정도 또는 빈도를 증가 또는 감소시키는지 여부에 대하여 시험될 수 있다. 영향이 관찰되는 경우, 화합물의 농도는 적정하여 평균 유효량(ED₅₀)을 결정할 수 있다.

임의의 양태에서, 본 발명의 임의의 양태에 따른 배지에서 배양된 심근세포는 심근세포의 기능적 특성, 특히 심장 특이적 전기적 활성, 예를 들어 심박 빈도 또는 포텐셜 장을 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 세포 및 조직의 심장 특이적 전기적 활성의 탐지는 다중전극 어레이를 통하여 전기적 활성을 모니터링함으로써 달성할 수 있다. 적합한 다중전극 어레이는 Multi Channel Systems(독일 로이틀링겐 소재)로부터 획득할 수 있다. 예를 들어, 다중전극 어레이는 100μm 이하로 떨어지게 위치한 60개 이상의 전극을 포함하는 2차원 직교 어레이일 수 있다. 임의의 양태에서, 다중전극 어레이는 1~25kHz로부터 선잭된 범위보다 큰 빈도로 심장 특이적 전기적 활성을 특징짓는 데이터를 얻도록 배열된다.

본 발명의 세포 및 조직에서 전기 활성을 모니터링하는 것은 본 발명의 세포 및 조직의 전기적 활성에 대하여 많은 다양한 유형의 중요하고 새로운 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 이러한 모니터링은 각각의 전극에서 개별적으로 전기적 활성을 모니터링하는데 사용될 수 있거나, 보다 유리하게 이러한 모니터링은 전기적 활성 전파 지도(또한 본 명세서에서 "활성 지도"라고도 불림)를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이는 각각의 전극에서 국소적 활성 시간의 함수로서, 예를 들어 색코드 변화(color-coded gradient)의 형태로 전기적 활성을 나타낸다. 이러한 지도는 다중전극 어레이의 영역에 걸쳐서 전기적 활성 전파의, 바람직하게는 전도 속도 벡터의 형태로 전파하는 전기적 활성의 전도 속도 및 전도 방향성을 나타내는데 사용될 수 있다.

본 발명의 임의의 양태에 따라서, 심장계 작용 제제를 선별 및 식별하는 방법이 또한 제공된다. 하나의 실시형태에서, 방법은 시험 제제로 심근세포를 수축시키는 단계; 및 시험 제제가 집단 내에서 심근세포의 활성 또는 기능을 조절하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 집단 내에서 심근세포의 활성 또는 기능을 조절하는 시험 제제는 심장계 작용 제제로서 시험 제제를 식별한다. 조절될 수 있는 예시적인 활성 또는 기능은 수축 또는 박동, 또는 대사 산물의 생성(예컨대, 우레아, 크레아틴 또는 CO₂ 중 하나 이상의 생성), 또는 세포내 효소(예컨대, 락트산 탈수소효소, 크레아틴 포스포키나아제(CPK), 크레아틴 키나아제(CK) 또는 트로포닌 중 하나 이상), 또는 세포 아폽토시스, 괴사, 사멸; 또는 탈분화, 성숙, 또는 분열을 포함한다.

심장계 작용 제제를 선별 및 식별하는 방법은 고속대량 스크리닝(high throughput screening)에 적합한 것을 포함하며, 이는 선택적으로 소정의 위치 또는 주소에 배치 또는 놓여진 심근세포의 어레이(예컨대, 마이크로어레이)를 포함한다. 고속대량의 로봇 또는 수동 방법은 단기간에 많은 유전자의 화학적 상호작용을 탐지하고 이의 발현 수준을 측정할 수 있다. 분자 신호(예컨대, 형광단) 및 매우 빠른 속도로 정보를 처리하는 자동화 분석을 이용하는 기술은 발달되어 왔다(예컨대, 문헌[Pinhasov et al ., 2004]을 참조). 예를 들어, 마이크로어레이 기술은 한번에 수천개 유전자의 상호작용을 탐지하는데 광범위하게 이용되어 왔으며, 한편 특정 유전자에 대한 정보를 제공한다(예컨대, 문헌[Mocellin 및 Rossi, 2007]을 참조).

이러한 고속대량 스크리닝 방법은 심장계 작용 제제를 식별할 수 있다. 예를 들어, 선택적으로 한정된 위치에서, 잠재적으로 치료 분자의 식별을 위하여 심근세포(예컨대, 심근아세포, 심근세포 또는 동방결절 세포)는 배양 접시, 튜브, 플라스크, 회전 병 또는 플레이트(예컨대, 8, 16, 32, 64, 96, 384 및 1536 멀티웰 플레이트 또는 접시와 같은 단일 멀티웰 플레이트 또는 접시) 상에 배치 또는 놓여질 수 있다. 선별될 수 있는 라이브러리는 예를 들어 소분자 라이브러리, siRNA 라이브러리, 및 아데노바이러스 형질감염 벡터를 포함한다.

그러므로 이러한 고속대량 방법은 예언적 독성학에 적용가능하다. 선택적으로 한정된 위치에서, 마이크로어레이 접근법을 기초로 하여 소분자 라이브러리, siRNA 라이브러리, 및 아데노바이러스 형질감염 벡터, 및 유전자를 사용하는 고속대량 또는 고함량 선별을 위하여, 배양 접시, 튜브, 플라스크, 회전 병 또는 플레이트(예컨대, 8, 16, 32, 64, 96, 384 및 1536 멀티웰 플레이트 또는 접시와 같은 단일 멀티웰 플레이트 또는 접시) 상에 배치 또는 놓여지는(선파종(pre-seeded)) 심근세포(예컨대, 심근아세포, 심근세포 또는 동방결절 세포)의 사용은 다양한 치료 및 심장 책임(cardiac liability) 표적을 식별할 수 있다. 이러한 기술은 또한 살아있는 세포에서 세포의 건강 및 형태학적 표현형, 형광 리포터 단백질의 발현, 다양한 FRET 접근법 및 전기생리학적 전류의 직접적인 측정에 대하여 형광 리포터 염료 및 바이오마커에 의한 심장 중재 전략의 직접적인 고속대량 측정을 가능하게 한다.

IX . 실시예

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 설명하기 위해 포함된다. 다음의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에 있어서 잘 작용하는 것으로 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내는 것이며, 따라서 본 발명의 실시에 대한 바람직한 형태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시 내용을 고려하여 개시된 구체적인 실시형태에서 많은 변경이 이루어질 수 있으며 또한 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 동등하거나 유사한 결과를 획득할 수 있음을 인식하여야 한다.

실시예 1 - 배지 제형 및 제조

시험관내에서 성장한 심근세포의 생존을 유지하도록 규명된 무혈청, 무글루코오스(SFGF) 배지를 고안하였다. 또한 시험관내에서 성장한 심근세포의 순도를 유지하도록 배지를 고안하였다. 표준 수준의 글루코스 및 정상적인 혈청이 있는 배양 배지는 심근세포가 아닌 집단의 성장을 유도한다. 이러한 배지는 적어도 2주 동안 배양물의 심근세포 순도를 유지한다.

무혈청 무글루코오스(SFGF) 배지는 다음을 포함한다:

98.4% DMEM(글루코오스 없음) Invitrogen - 11966-025

10mM 갈락토오스 - Sigma G5388

1mM 피루브산나트륨 - Sigma P4562

5mM 크레아틴 - Sigma 27890

2mM 카르니틴 - Sigma C0283

5mM 타우린 - Sigma T8691

2.5μM 인슐린 - Sigma I9278

0.2% 소혈청 알부민 - Sigma A9576

1mM L-글루타민 - Invitrogen 21051

1% DPBS - Invitrogen 14190

0.1mM L-글루타민 - Invitrogen 21051

7㎕ β-머캅토에탄올 - Sigma M7522

SFGF 배지 제조:

크레아틴 모액 ( stock solution ): Sigma Cat. 27890-100G

100mL DMEM - 글루코오스 - 피루브산염 중 50mM 크레아틴을 제조한다.

0.656g 크레아틴을 90ml DMEM - 글루코오스 - 피루브산염에 첨가하고, 100ml까지 더 첨가한다.

카르니틴 모액: Sigma Cat. C0283-25G

25ml DMEM - 글루코오스 - 피루브산염 중 500mM 카르니틴을 제조한다. 20ml DMEM - 글루코오스 - 피루브산염에 2.471g 크레아틴을 첨가하고 25ml까지 더 첨가한다.

타우린 모액: Sigma Cat. T8691-100G

50ml DMEM - 글루코오스 - 피루브산염 중 250mM 타우린을 제조한다.

45ml DMEM - 글루코오스 - 피루브산염에 1.564g 크레아틴을 첨가하고 50ml까지 더 첨가한다.

인슐린 모액: Sigma Cat. I9278-5ML, 10mg/ml(또는 25mM) 모액; 즉시 사용가능함

BSA 모액: Sigma Cat. A9576-50ml, DPBS 중 30%; 즉시 사용가능함

DMEM - 글루코오스 - 피루브산염: Invitrogen Cat. 11966-024

L-글루타민 모액: 다음을 기준으로 사용시마다 제조함

0.146g L-글루타민 - Invitrogen 21051

10ml 무Ca/Mg PBS - Invitrogen 14190

7㎕β-머캅토에탄올 - Sigma M7522

SFGF 배지는 원래 글루코오스가 거의 없거나 전혀 없고, 에너지 공급원으로서 갈락토오스를 포함하는 배지를 요청한 제3자에 의한 사용을 위하여 본 발명자에 의해 고안되었다. 본 발명자들은 본 명세서에 기술된 기타 다른 고안 양태를 사용하여 이러한 배지를 제조하였으며, 놀랍게도 심근세포의 세포 균질성뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 기타 다른 원하는 속성을 유지하는 상기 배지의 능력을 발견하였다.

아이셀(iCell) 심장 보존 배지(iCMM)는 또한 DS-CMM(투석된 혈청 심장 보존 배지)로서 공지되어 있다. DS-CMM은 글루코스 또는 피루브산나트륨이 업는 DMEMㅇ; 이용되는 기본 배지이고, 투석된 혈청, 갈락토오스 및 피루브산나트륨이 첨가되는 것을 제외하고는 CMM과 동일한 제형을 가진다.

DS-CMM은 심근세포 배양물의 순도를 유지하도록 고안된 저글루코스를 포함하는 배지이다. 이는 정제 과정, 및 심근세포는 배양에서 분열 또는 증식하지 않는 반면 오염 세포는 분열 또는 증식한다는 사실때문에 필요하다.

이러한 혈청을 포함하는 배지는 시험관내에서 성장한 심근세포의 생존을 유지하도록 고안된다. 배지는 또한 시험관내에서 성장한 심근세포의 순도를 유지하도록 고안된다. 표준 수준의 글루코오스 및 정상적인 혈청이 있는 배양 배지는 심근세포가 아닌 집단의 성장을 유도한다. 이러한 배지는 적어도 2주 동안 배양물의 심근세포 순도를 유지한다.

배지(DS-CMM)는 다음을 포함한다:

90% DMEM(글루코오스 없음) Invitrogen - 11966-025

10% 투석된 소태아혈청 - Millipore SH30079

10mM 갈락토오스 - Sigma G5388

1mM 피루브산나트륨 - Sigma P4562

DS-CMM(iCMM) 배지 제조:

DMEM - 글루코오스 - 피루브산염: Invitrogen Cat. 11966-025

갈락토오스 모액: 500mM 용액. 4.5g 갈락토오스를 칭량, DMEM - 글루코오스 - 피루브산염의 부피를 50mL까지로 한다.

피루브산나트륨 모액: 100mM 용액. 550mg 칭량, DMEM - 글루코오스 - 피루브산염의 부피를 50mL까지로 한다.

투석된 혈청: HyClone SH30079

대조군으로서, CMM(심장 보존 배지)를 사용할 수 있다. 이러한 CMM 배지는 분화 과정 동안 사용되고, 후에 냉동보관되는 세포에 대한 도말 실험을 위하여 디폴트(대조군) 배지로서 사용하였다. 이러한 배지는 DMEM(Gibco 10567) 및 소태아혈청(Hyclone SH30396)을 포함한다.

실시예를 위한 기질 및 정의

"파종 밀도"는 배양 용기에 첨가된 심근세포의 수를 지칭한다. 세포 수 및 순도에 의해 계산된다.

"도말 밀도"는 48시간 후에 배양 용기에 부착된 심근세포의 수를 지칭한다. 세포 수 및 순도에 의해 계산된다.

"도말 효율"은 배양 용기에 부착된 심근세포의 백분율(도말 밀도/파종 밀도)을 지칭한다. 세포 수 및 순도에 의해 계산된다.

"순도"는 주어진 배양 조건에서 심근세포의 백분율을 지칭한다. 이는 심근세포 특이적 프로모터에 의해 구동되는 RFP를 발현하는 iPS 세포주로부터 유도된 심근세포 배양물 중 RFP 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 또는 심근세포 배양물 중 심장 트로포닌 T 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 측정될 수 있다.

실시예 2 - 심근세포 순도를 유지하는 배지

본 실시예에 사용된 아이셀 심근세포는 인간 유도 만능 줄기(iPS) 세포 유도 심근세포의 정제된 집단이다. iPS 출발 물질은 제조 과정 동안 정제에 사용되는 적색 형광 단백질(RFP) 및 블라스티시딘 내성 유전자를 발현하는 MYH6(알파 미오신 중쇄) 유전자의 심근세포 특이적 프로모터에 의해 구동되는 유전자 변형을 가진다. 심근세포는 배양에서 증식하지 않으므로, 순도가 매우 중요하다. 존재하는 임의의 심근세포가 아닌 세포는 배양에서 계속 분열할 수 있어서, 심근세포의 순도는 시간이 지남에 따라서 지속적으로 감소한다.

세포는 냉동보관 및 궁극적인 사용 전에 유세포분석에 의해 측정된 95% 초과의 RFP 양성으로 정제하였다. 그 다음 세포를 해동하고, 배양 용기로 파종하며, 48시간 동안 회수할 수 있도록 한 후 실험에 사용가능한 것으로 간주하였다.

달리 명시되지 않는다면 심장 보존 배지(CMM)을 아이셀 심근세포에 대한 디폴트 해동/도말 및 배양 배지로서 사용하였다. 제조 과정 동안 CMM을 사용한다. CMM은 10% 소태아혈청(FBS) 및 DMEM 배양 배지로 제조한다.

무혈청 무글루코오스 배지( SFGF )는 시험관내에서 심근세포 순도를 유지한다 - 10% 소태아혈청 및 5.5mM 글루코오스를 포함하는 표준 조건에서 배양할 때, 매우 정제된(>99%) 심근세포는 오염 세포의 성장으로 인하여 빠르게 순도를 상실할 것이다. 이와 비교하여, 글루코스 또는 혈청이 없이 제조된 배지는 동등한 심근세포 생존을 지지하는 한편(도 1a), 오염 세포의 성장을 억제하는 것은 배양물 순도를 효과적으로 유지한다(도 1b).

DS - CMM 배지(iCMM)는 시험관내에서 심근세포 순도를 유지한다 - 심근세포에 대한 일부 의도된 사용은, 혈청이 존재하지만, 심근세포 순도는 또한 유지되는 것을 필요로 할 수 있다. 본 명세서에 10% 투석된 혈청(10,000MW 컷오프)으로 이루어지고, 갈락토오스 및 피루브산나트륨이 보충된 무글루코오스 DMEM 배지(DS-CMM)은 대조군 조건(CMM)과 동등한 심근세포 생존을 유지하는 것이 나타내어져 있다(도 2a). DS-CMM 배지는 또한 오염 세포의 성장을 억제하며, 이는 배양물이 높은 심근세포 순도를 가지도록 유지한다(도 2b). DS-CMM은 장기간 동안 배양물에서 심근세포의 순도를 유지한다. 심장 트로포닌 T 유세포분석에 의해 측정된 바와 같이 순도의 손실이 거의 없거나 손실없이, 심근세포는 DS-CMM 중에서 7개월(210일) 이하 동안 배양되었다(도 2c).

iCMM 대 SFGF 대 CMM - CMM으로 세포를 파종하고 24시간째에 실험 배지로 옮겼다(도 3). 세포 수 및 순도를 7일째에 분석하였다. 이 실험은 SFGF 배지 및 iCMM이 배양에서 7일 후 더 높은 심근세포 생존 및 순도를 촉진함을 보여준다.

투석된 혈청은 오염 세포의 성장을 억제한다 - 오염 세포의 성장을 억제하는 주요 성분을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 투석된 혈청의 역할 및 배양 배지 중 글루코오스의 역할을 조사하였고, 투석된 혈청은 오염 세포의 성장을 억제함을 발견하였다(도 4). 글루코오스 농도를 변화시키고, 정상적인 소태아혈청 또는 투석된 소태아혈청이 첨가된 4가지 배지 유형을 제조하였다. 2가지 실험 배지로 심근세포를 도말하고, 2일 및 7일 후에 심근세포 순도에 대하여 분석하였다. 4가지 배지 유형은 다음과 같다: 1. DMEM, 정상적인 혈청(또한 CMM으로서 알려짐) - 5.5mM 글루코오스; 2. DMEM - 글루코오스, 정상적인 혈청 - 0.55mM 글루코오스; 3. DMEM, 투석된 혈청 - 4.95mM 글루코오스; 4. DMEM - 글루코오스, 투석된 혈청(DS-CMM; 또한 iCMM으로서 알려짐) - 약 0mM 글루코오스.

글루코오스 농도는 더 낮은 정도로 심근세포 순도를 달성한다 - 동일한 유형의 혈청으로 제조한 조건을 비교할 때, 데이터는 글루코오스 농도가 더 낮은 조건은 더 높은 순도를 유지하지만, 글루코스 농도의 영향은 투석된 혈청의 영향과 비교하여 아주 적음을 보여준다. DMEM 및 투석된 혈청(본질적으로 글루코스를 포함하지 않거나[iCMM] 또는 4.95mM 글루코오스를 포함함[DMEM-투석된 혈청])으로 제조한 배지에서 배양된 세포의 심근세포 순도와 비교할 때, 본질적으로 글루코오스가 없는 조건(iCMM)은 상당히 더 높은 심근세포 순도를 유지하였다(p = 0.004)(도 5a). 정상적인 혈청이 있고 글루코오스의 수준을 변화시키면서 이루어진 처치와 비교할 때, 글루코오스 농도가 더 낮은 조건(DMEM - 글루코오스, 정상적인 혈청; [글루코오스] = 0.55mM)은 더 높은 농도의 글루코오스를 포함하는 배지보다 더 높은 심근세포 배양물 순도(DMEM, 정상적인 혈청; [글루코오스] = 5.5mM)(도 5b)를 유지한다.

무혈청 무글루코오스 배지는 혈청을 포함하는 배지보다 더 빠르게 박동하는 단일층을 생성한다 - 무혈청 무글루코오스(SFGF) 배지에서 배양된 단일층은 FBS를 함유하는 배지에서 배양된 단일층보다 더 빠르게 박동한다. SFGF에서 배양된 단일층이 평균 빈도가 0.56Hz인 것과 비교하여 FBS를 함유하는 배지에서 배양된 단일층은 평균 빈초 0.34Hz로 박동한다(도 6). 소태아혈청을 함유하는 배지 또는 SFGF 중에서 조직 배양 플라스크에 3일 동안 심근세포를 도말 전처리(pre-plated)하였다. 그 다음 이들 배양물을 트립신처리하고, 3일 동안 소태아혈청을 함유하는 배지 또는 SFGF 배지 중에서 6웰 다중전극 어레이(MEA) 플레이트 상에서 웰당 30,000 세포 수로 도말하였다. 심박수(심박 빈도)는 5분 기간에 걸쳐서 측정되었다. 이러한 데이터는 SFGF 배지에서 배양된 MEA 단일층은 더 빠르세 박동함을 나타낸다. 증가된 박동 빈도는 MEA 심근세포 박동 빈도 분석에서 일어날 수 있는 박동수 진동의 발생을 감소시킴으로써, MEA가 매개된 박동 빈도 기록의 안정성을 증가시킨다.

* * *

본 명세서에 개시되고 요구되는 모든 방법은 본 개시 내용을 고려하여 과도한 실험없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시형태의 관점에서 기술되어 있지만, 변형이 본 발명의 개념, 사상 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에 기술된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 적용될 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 생리학적으로 관련된 임의의 제제는 본 명세서에 기술된 제제를 대체할 수 있는 한편, 동일 또는 유사한 결과가 달성될 것임이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 한정된 바와 같이 본 발명의 사상, 범주 및 개념 내인 것으로 여겨진다.

Claims

적어도 90%의 심근세포의 세포 집단 및 혈청을 포함하는 배지를 포함하는 조성물로서, 상기 혈청 또는 배지는 저분자량의 분자를 제거하도록 처리된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배지는 투석된 혈청을 포함하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지는 약 10% 내지 약 75%의 범위로 투석된 혈청을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 적어도 25%의 투석된 혈청을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 적어도 25%의 투석된 혈청을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 55%의 투석된 혈청을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 또는 배지는 분자량이 최대 10kD인 저분자량의 분자를 제거하도록 처리된 것인 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 또는 배지는 본질적으로 분자량이 최대 10kD인 저분자량의 분자가 없는 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 글루코오스를 포함하지 않는 것인 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 1 내지 20mM의 갈락토오스를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 0.1 내지 10mM의 피루브산염 또는 피루브산을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 95%의 심근세포의 세포 집단을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포는 심근세포 특이적 프로모터의 제어 하에서 적어도 하나의 선택가능 또는 선별가능한 전이유전자를 발현하는 것인 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단은 본질적으로 섬유아세포 또는 미분화된 만능 줄기 세포가 없는 것인 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포는 인간 심근세포인 것인 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포는 냉동보관된 심근세포인 것인 조성물.
심근세포 집단의 순도를 유지하는 방법으로서, 상기 방법은
a) 제항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 제1조성물 또는 적어도 90% 심근세포의 제2세포 집단 및 본질적으로 혈청이 없는 배지를 포함하는 제2조성물을 획득하는 단계; 및
b) 적어도 7일 동안 상기 제1 또는 제2조성물을 배양하며, 상기 제1 또는 제2조성물은 상기 배양에서 심근세포의 순도를 유지하는 단계를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 제1 또는 제2조성물 중에서 심근세포를 화합물과 접촉시키는 단계 및 심근세포의 심박 빈도 및/또는 포텐셜 장 지속기간(field potential duration)을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 화합물은 심근세포의 이온 채널 활성, 심박 빈도 및/또는 포텐셜 장 지속기간을 조절하는 것인 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 심박 빈도를 조절하는 상기 화합물은 테트로도톡신 또는 아이소프로테레놀인 것인 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 포텐셜 장 지속기간을 조절하는 상기 화합물은 E4031 또는 테르페나딘인 것인 방법.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 전에 상기 제1 또는 제2조성물 중 심근세포를 냉동보관하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포로부터 분화된 심근세포 또는 시험관내에서 심근세포가 아닌 세포로부터 이행분화된 심근세포를 정제하여 상기 제1 또는 제2조성물 중 심근세포를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
정제된 심근세포의 집단의 순도를 유지하는 방법으로서, 상기 방법은
a) 정제된 심근세포의 집단을 획득하는 단계; 및
b) (i) 본질적으로 혈청이 없거나
(ii) 혈청을 포함하는
배지 중에서 상기 집단을 배양하는 단계를 포함하되,
상기 혈청 또는 배지는 저분자량의 분자를 제거하도록 처리되어 있고,
상기 집단은 적어도 1주 동안 배양되고, 심근세포의 순도를 유지하는 것인 방법.
심근세포의 전기적 활성을 조절하기 위한 방법으로서, (i) 본질적으로 헐청이 없거나; (ii) 혈청을 포함하는 배지 중에서 심근세포를 배양하는 단계를 포함하되, 상기 혈청 또는 배지는 저분자량의 분자를 제거하도록 처리되어 있고, 상기 배지는 심근세포의 심박 빈도를 증가시키고/증가시키거나 심박수 진동을 감소시키는 것인 방법.
심근세포에 대한 화합물의 영향을 시험하는 방법으로서, a) 심근세포를 화합물과 접촉시키는 단계로서, 상기 심근세포는 (i) 본질적으로 혈청이 없거나; (ii) 혈청을 포함하는 배지 중에서 배양되는 단계; 및 b) 심근세포의 심박수 및/또는 포텐셜 장 지속기간을 측정하는 단계를 포함하되, 상기 혈청 또는 배지는 저분자량의 분자를 제거하도록 처리된 것인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 본질적으로 혈청이 없는 것인 방법.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 화학적으로 규명된 것인 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 고에너지 인산 결합을 형성할 수 있는 화합물, 아실기 담체 분자, 또는 심근세포 칼슘 채널 조절제를 추가로 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 크레아틴, 카르니틴 또는 타우린을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 인슐린을 추가로 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 혈청을 포함하되, 상기 혈청 또는 배지는 저분자량의 분자를 제거하도록 처리된 것인 방법.
제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 또는 배지는 본질적으로 저분자량의 혈청 성장 인자가 없는 것인 방법.
제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 투석된 혈청을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 혈청을 포함하고, 상기 혈청 또는 배지는 분자량이 최대 10kD인 분자를 제거하도록 처리된 것인 방법.
제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 글루코오스를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 최대 5.5mM의 글루코오스를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 적어도 20μM의 글루코오스를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 본질적으로 글루코오스가 없는 것이 방법.
제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 글루코오스가 아닌 에너지 공급원을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 갈락토오스, 프럭토오스, 만노오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 투라노오스, 피루브산염, 피루브산, 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산염, 아스파르트산, 락트산염, 락트산, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 피루브산염 또는 피루브산을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 0.1 내지 10mM의 피루브산염 또는 피루브산을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 갈락토오스를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 1 내지 20mM의 갈락토오스를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 심근세포는 적어도 하나의 선택가능 또는 선별가능한 전이유전자를 발현하는 것인 방법.
제46항에 있어서, 상기 전이유전자는 심근세포 특이적 프로모터의 제어 하에서 선택가능 또는 선별가능한 마커를 포함하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 심근세포 특이적 프로모터는 MYH6(알파 미오신 중쇄) 유전자의 프로모터인 것인 방법.
제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 심근세포의 집단은 전이유전자의 발현을 기초로 하여 정제되는 것인 방법.
제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단 중 정제된 심근세포의 순도는 전이유전자의 발현을 기초로 하는 것인 방법.
제24항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포의 집단은 상기 배양 전에 보존되는 것인 방법.
제24항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포는 인간 심근세포인 것인 방법.
제24항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포는 줄기 세포로부터 분화되거나 시험관내에서 심근세포가 아닌 세포로부터 이행분화된 것인 방법.
제53항에 있어서, 상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포인 것인 방법.
제54항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 또는 체세포 핵 이식에 의해 유도된 만능 줄기 세포인 것인 방법.
제24항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단은 최대 10%의 심근세포가 아닌 세포를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단은 최대 5%의 심근세포가 아닌 세포를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단은 본질적으로 심근세포가 아닌 세포가 없는 방법.
제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포가 아닌 세포는 섬유아세포 또는 미분화된 세포를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 심근세포가 아닌 세포의 성장을 억제하는 것인 방법.
제24항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 적어도 또는 약 6주 동안 배양 중 집단에서 심근세포의 순도를 유지하는 것인 방법.
제24항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 적어도 또는 약 7개월 동안 배양 중 집단에서 심근세포의 순도를 유지하는 것인 방법.
제24항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포는 세포 생존력 또는 기능을 조절하는 화합물과 접촉되는 것인 방법.
제63항에 있어서, 상기 화합물은 세포 이온 채널 활성을 조절하는 것인 방법.
제64항에 있어서, 상기 화합물은 심박 빈도 및/또는 포텐셜 장 지속기간을 조절하는 것인 방법.
제65항에 있어서, 상기 심근세포는 심박 빈도를 조절하는 화합물과 접촉되는 것인 방법.
제66항에 있어서, 상기 화합물은 테트로도톡신 또는 아이소프로테레놀인것인 방법.
제65항에 있어서, 상기 심근세포는 포텐셜 장 지속기간을 조절하는 화합물과 접촉되는 것인 방법.
제68항에 있어서, 상기 화합물은 E4031 또는 테르페나딘인 것인 방법.
심근세포의 집단, 및 갈락토오스, 피루브산염을 포함하고 본질적으로 혈청이 없는 배지를 포함하는 조성물.
심근세포의 집단, 및 갈락토오스, 피루브산염 및 투석된 혈청을 포함하는 배지를 포함하는 조성물.
제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 배지는 글루코오스를 포함하는 것인 조성물.
제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 배지는 본질적으로 글루코오스가 없는 것인 조성물.
제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포의 집단은 10% 미만의 심근세포가 아닌 세포를 포함하는 것인 조성물.
제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포의 집단은 본질적으로 심근세포가 아닌 세포가 없는 것인 조성물.
제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포의 집단은 정제된 심근세포를 포함하는 것인 조성물.