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KR20130100897A - 나노입자의 약제학적 조성물 - Google Patents

나노입자의 약제학적 조성물 Download PDF

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KR20130100897A
KR20130100897A KR1020127030280A KR20127030280A KR20130100897A KR 20130100897 A KR20130100897 A KR 20130100897A KR 1020127030280 A KR1020127030280 A KR 1020127030280A KR 20127030280 A KR20127030280 A KR 20127030280A KR 20130100897 A KR20130100897 A KR 20130100897A
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South Korea
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nanoparticles
pga
chitosan
pharmaceutical composition
insulin
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KR1020127030280A
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English (en)
Inventor
호쉥 투
싱-웬 성
Original Assignee
나노메가 메디컬 코포레이션
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Priority claimed from US12/800,848 external-priority patent/US7879313B1/en
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Abstract

본 발명은 키토산, 효소 저항성 PGA-컴플렉손 및 생리활성 약제로 구성되는 생리활성 나노입자의 경구 전달용 약제학적 조성물을 개시한다. 본 키토산-베이스의 나노입자는 경구 약물 전달을 위해 GIT에서 양의 표면 전하, 증진된 투과성, 그리고 효소 저항성을 특징으로 한다.

Description

나노입자의 약제학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF NANOPARTICLES}
본 발명은 적어도 하나의 생리활성 약제를 갖는 음으로 하전된 기질 및 키토산의 조성물을 갖는 나노입자의 일반적인 용도, 그리고 경구 전달을 위한 이들의 증진된 투과성 및 효소-저항 특성에 관한 것이다.
구강 경로는 환자 또는 동물 대상에게 약물을 투여하는 가장 편리한 방식이다. 그럼에도 불구하고, 장 상피는 펩티드 및 단백질과 같은 친수성 약물의 흡수에 주된 장벽이 되고 있다. 이는 친수성 약물이 지질-이중막 세포 멤브레인을 통해 세포로 용이하게 확산될 수 없기 때문이다. 세포주위 경로를 통한 친수성 분자의 수송은 인접 상피세포의 관강내 측면에 위치하는 밀착연접(tight junction)의 존재에 의해 크게 제한된다. 이들 밀착연접은 친수성 분자의 세포간 확산을 제한하는 장벽을 형성한다.
세포들을 위장관의 상피세포와 같은 층으로 함께 결합시키는 밀착연접을 통한 세포간 용질의 이동은 세포주위 수송으로 호칭된다. 밀착연접은 세포층의 정단 및 기저측면 액체 구획을 분리하는 세포간 장벽을 형성한다. 세포주위 수송은 수동적이고 정단에서 기저측면 구획으로 밀착연접을 통한 용질의 이동은 그 용질에 대한 밀착연접의 투과성에 따라 좌우된다.
폴리머 나노입자는 약물 전달에서 담체로 광범위하게 연구되어왔다. 폴리-ε-카프로락톤 및 폴리락타이드와 같은 합성 생분해성 폴리머로 만들어진 나노입자는 그 생체적합성으로 인해 많은 주목을 받아왔다. 그러나, 이들 나노입자는 이들의 소수성으로 인해 친수성 약물에 대한 이상적인 담체는 아니다.
경구 약물 전달 경로를 따라서, 단백질 약물은 위 내에서 위장 매질의 낮은 pH에 의해 용이하게 분해된다. 경구 투여에 따른 단백질 약물의 흡수는 이들의 고분자량, 친수성, 그리고 효소 불활성화에 대한 감수성으로 인해 어려워진다. 위장관(GIT; gastrointestinal tract)에서의 효소적 장벽을 극복하기 위하여, 경구 펩티드 약물은 프로테아제 저해제와 공동-투여된다. 비록 많은 효소 저해제가 단기간 최소 세포독성과 관련된다 하더라도, 장기간 투여는 영양 단백질의 소화를 방해하여 판크레아제의 비대 또는 프로테아제 분비 자극을 유발하는 것으로 보인다. 펩티드 약물 분자와 효소 저해제 사이의 거리는 최상의 시나리오에서 GIP 내 대략 수 마이크로미터이다. 공동-투여 중 펩티드 약물 분자가 GIP에서 프로테아제를 만났을 때, 효소 저해제가 보호를 위해 근접할 수 없으며, 이는 효소 저해제의 감소된 효소 저항 효능으로 이어진다.
키토산(CS; chitosan)은 양이온 다당류로 비독성이고 연조직 적합성이다. 또한, 키토산은 점막 표면에 대한 부착 특성(즉, 점막-부착성)을 가져 상피세포 사이의 밀착연접을 일시적으로 개방하고, 유상하중을 경감시키기 위한 생리적 범위에 근접한 pH 값에서 양호한 용해도를 갖는 것으로 알려져 있다. 생리적 pH 범위에서 약물 전달 기구의 펩티드 또는 단백질 약물의 하중(유상하중)은 이들의 생리활성을 보존할 것이다.
Thanou 등은 키토산과 그 유도체를 장내 흡수 증진제로 보고하였다. 키토산은 산성 pH에서 양성자화될 때 점막 상피를 가로지르는 펩티드 약물의 세포주위 투과성을 증진시킬 수 있다. 키토산 또는 N-트리메틸 키토산과 펩티드 약물의 공동-투여는 키토산 성분의 증진된 흡수가 없는 투여와 비교하여 동물에서 펩티드의 생리활성을 실질적으로 증가시키는 것이 발견되었다.
음이온 펩티드인 γ-PGA는 바실러스(Bacillus) 속의 일군에 의해 점액으로서 또는 캡슐 물질로서 생산되는 천연 화합물이다. γ-PGA는 아미드 결합을 통해 서로 연결된 천연적으로 존재하는 L-글루탐산으로 구성된다는 점에서 독특하다. 이처럼 천연적으로 존재하는 γ-PGA는 수용성, 생분해성, 그리고 비독성 폴리머인 것으로 보고된다. 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산과 같은 폴리아미노 카복실산(컴플렉손, complexone)은 효소 저항 특성을 나타낸다. 경구 약물 전달을 위한 증진된 흡수 성능과 감소된 효소 효과를 위해, 나노입자 제형에 음으로 하전된 기질로서의 PGA-컴플렉손 복합체를 양으로 하전된 기질로서의 키토산과 함께 사용하도록 도입하는 것은 임상적으로 유익하다.
미국 특허 6,383,478 B1(2002. 05. 07.) 미국 특허 6,649,192 B2(2003. 11. 18.) 미국 특허출원 공개 2006/0051423 A1(2006. 03. 09.)
LIN YH et al. "Preparation and characterization of nanoparticles shelled with chitosan for oral insulin delivery" Biomacromolecules 2007;8: 146-152 LIN YH et al. "Novel nanoparticles for oral insulin delivery via the paracellular pathway" Nanotechnology 2007; 18: 1-1 1 van der LUBBEN IM et al. "Chitosan and its derivatives in mucosal drug and vaccine delivery" Euro J Pharma Sci 2001; 14:201 -207 HOSNY EA et al. "Oral delivery of insulin from enteric-coated capsules containing sodium salicylate" Int J Pharmaceutics 2002;237:71-76 THANOU M et al. "Chitosan and its derivatives as intestinal absorption enhancers" Adv. Drug Deliv. Rev. 2001;50:S91-S 101 SMITH J et al. "Effect of chitosan on epithelial cell tight junctions" Pharmaceutical Research 2004;21:43-49 MI FL et al. "Oral delivery of peptide drugs using nanoparticles self-assembled by poly(r-glutamic acid) and a chitosan derivative functionalized by trimethylation" Bioconjugate Chem 2008;19:1248-1255
경구 투여된 펩티드 약물이 흡수되기 위해서는 위장관(GIT, gastrointestinal tract)을 따라 수송되고 점막/당질층을 통과하여 문맥으로 장관 상피를 횡단하여 최종적으로 일반 혈액순환으로 들어가야 할 것이다. 대부분의 펩티드 약물은 위장관액 및 점막/당질층에 존재하는 소화 효소에 의해 분해되기 쉽다. 일반적으로, 위장관에서 흡수 과정 중 효소적 공격에 저항할 수 있는 펩티드 약물은 거의 없다. 동물 대상에 효소-저항성 화합물(예를 들어, 프로테아제 저해제)과 생리활성 약물(예를 들어, 펩티드 약물)의 공동-투여는 두 물질을 인캡슐화하는 캡슐을 통해 달성될 수 있다. 그러나, 접근 제한으로 인해(효소-저항성 화합물과 생리활성 약물은 GIT 내 효소의 존재 중 수 마이크로미터나 밀리미터 떨어져 있을 수 있다), 효소 저해 효과는 엄격히 절충될 것이다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 GIT 내에서 효소 공격으로부터 약물을 보호하기 위해 목적하는 약물에 가까이 접근한 효소-저항성 화합물을 갖는 경구 약물 전달 시스템을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 몇몇 태양은 나노입자의 약제학적 조성물을 제공하는데, 본 나노입자는 양으로 하전된 키토산이 우세한 쉘 부분, 양으로 하전된 키토산, 하나의 음으로 하전된 PGA-컴플렉손 복합체의 기질을 포함하는 코어 부분, 나노입자 내에 적재된 적어도 하나의 생리활성 약제, 및 선택적으로 제로-전하의 화합물로 구성된다. 일 실시예에서, 가까이 접근하는 것은 나노미터 거리 이내로서 정의되며, 이는 1 마이크로미터 미만이다. 다른 실시예에서, 음으로 하전된 PGA-컴플렉손 복합체의 기질은 본 나노입자 시스템의 효소-저항성 화합물이다.
본 발명의 하나의 태양은 키토산 용액으로 폴리-γ-글루탐산(γ-PGA) 용액(또는 PGA-컴플렉손 복합체와 같은 다른 음으로 하전된 성분)의 부가 시 간단하고 약한 이온-겔화 방법을 사용하여, 동물 대상에 단백질/펩티드 약물 또는 생리활성 약제 전달을 위한 신규의 독특한 나노입자 시스템을 제공한다. 일 실시예에서, 채용되는 키토산은 N-트리메틸 키토산(TMC), 저분자량-키토산, EDTA-키토산, 키토산 유도체 및/또는 이들의 조합이다. 일 실시예에서, 본 발명의 CS의 분자량은 단백질 및 펩티드 약물의 생리활성을 유지하는 pH에서 적절한 용해도를 위해 조절되어 약 80 kDa 또는 이보다 적다. 저분자량 키토산 입자는 신장 불활성으로 규정된다. 제조된 나노입자의 입자 크기 및 제타 포텐셜 값은 이들의 구성 조성물에 의해 제어된다. TEM(transmission electron microscopy, 투과형 전자 현미경) 및 AFM(atomic force microscopy, 원자간력 현미경) 검사에 의해 얻어진 결과는 제조된 나노입자가 일반적으로 구형 또는 타원형 형태인 것을 보여주었다.
나노입자를 투여하는 것은 경비 흡수, 경피 주사 또는 혈관 주사와 같은 비경구 투여 및 경구 투여를 통할 수 있다. 일 실시예에서, 키토산은 나노입자의 표면에서 쉘 기질로서 우세하고 나노입자 표면의 상당한 부분은 양의 하전을 특징으로 한다. 코어 부분에서는, 음으로 하전된 γ-PGA 또는 PGA- 컴플렉손 복합체와 같은 다른 적절한 음으로 하전된 성분이 양으로 하전된 키토산과 정전기적으로 상호작용한다. 일 실시예에서는, 실질적으로 모든 음으로 하전된 코어 기질이 코어 부분에서 양으로 하전된 기질의 일부와 결합하거나 정전기적으로 상호작용하여 실질적으로 제로-전하의(중성의) 코어를 유지한다.
다른 실시예에서, 나노입자는 약 50 내지 400 나노미터 사이, 바람직하게는 약 100 내지 300 나노미터 사이, 가장 바람직하게는 약 100 내지 200 나노미터 사이의 평균 입자 크기를 갖는다. 효소 저항성 PGA-컴플렉손 및 생리활성 약제는 둘 다 나노입자 내에서 캡슐화되기 때문에, 이들의 거리는 항상 나노미터 범위 내에 있다.
일 실시예에서, 생리활성 약제-함유 나노입자는 추가로 적어도 하나의 침투 증진제를 포함하는데, 여기에서 침투 증진제는 나노입자의 기본 제형에 포함되지 않고 나노입자 구조의 정전기 네트워크 형성에 포함되지도 않는다. 침투 증진제는 킬레이트제, 담즙염, 음이온 계면활성제, 중간-사슬 지방산, 인산염 에스테르 등으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 나노입자 및 침투 증진제는 캡슐에 공동-적재되거나 공동-투여를 위한 2 세트의 캡슐 내에 별개로 캡슐화된다.
일 실시예에서, 알츠하이머병의 치료 방법은 1일 약 10 ㎎ 내지 40 ㎎으로 1 개월 내지 1 년 또는 그 이상의 기간 동안 환자에게 알츠하이머병 치료를 위한 적어도 하나의 생리활성 약제의 유효량과 함께 나노입자를 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서는, 쉘 기질의 적어도 일부가, 바람직하게 약 50% 미만, 또는 가장 바람직하게 약 1% 내지 20%의 가교도로 가교된다.
본 발명의 하나의 태양은 나노입자의 약제학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 나노입자는 고형의 건조된 나노입자를 형성하도록 동결-건조될 수 있다. 건조된 나노입자는 캡슐, 정제, 환제, 저작형 제제, 또는 어떠한 편리한 약물 전달 수송체에 적재될 수 있는데, 이 캡슐은 동물 대상에 경구 투여하기 위해 추가로 장용피 처리될 수 있다. 동결-건조된 나노입자는 용액 중에서 또는 체액과 접촉하여 재수화되어 동결건조-전의 나노입자와 실질적으로 동일한 물리적 및 생화학적 특성을 갖는 양의 표면 전하를 갖는 습윤 나노입자로 되돌아갈 수 있다. 일 실시예에서, 나노입자는 동결-건조 공정에서 트레할로스 또는 헥산-1,2,3,4,5,6-헥솔과 혼합될 수 있다. 일 실시예에서, 캡슐의 내부 표면은 지질친화성 또는 소수성으로 처리된다. 다른 실시예에서, 캡슐의 외부 표면은 장용피 코팅되거나 장용피 코팅 폴리머로 처리된다.
본 발명의 몇몇 태양은 동물 대상에 경구 투여하기 위한 효소-저항성 나노입자의 약제학적 조성물을 제공하는데, 나노입자는 양으로 하전된 키토산이 우세한 쉘 부분, 음으로 하전된 기질이 코어 부분에서 양으로 하전된 키토산의 일부로 적어도 부분적으로 중화된, 음으로 하전된 PGA-컴플렉손 복합체 기질을 포함하는 코어 부분, 및 나노입자 내에 적재된 적어도 하나의 생리활성 약제를 포함한다. 일 실시예에서, PGA-컴플렉손은 효소-저항 특성을 갖는다.
일 실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 나노입자 표면은 양의 표면 전하를 특징으로 하는데, 여기에서 나노입자는 약 +5 ㎷ 내지 약 +75 ㎷, 바람직하게는 약 +15 ㎷ 내지 약 +50 ㎷의 표면 전하를 갖는다. 다른 실시예에서, 나노입자는 동결-건조된 분말 형태이다. 일 실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 나노입자는 철, 아연, 칼슘, 황산마그네슘 및 TPP를 더 포함한다.
본 발명의 몇몇 태양은 동물 대상에서 종양 괴사 인자로 야기된 염증 반응을 감소시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 TNF 저해제, 키토산 및 PGA-컴플렉손 복합체의 코어 기질로 구성된 나노입자를 경구 투여하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, TNF 저해제는 단클론 항체이다. 다른 실시예에서, TNF 저해제는 인플릭시맙(infliximab) 또는 아달리무맙(adalimumab)이다. 일 실시예에서, TNF 저해제는 순환하는 수용체 융합 단백질이다. 다른 실시예에서, TNF 저해제는 에타너셉트(etanercept)이다.
본 발명의 몇몇 태양은 생리활성 나노입자 내부에서 생리활성 약제와 결합하여 증진된 효소 저항성을 갖는 생리활성 나노입자를 대상에게 투여하는 것을 제공하는데, 여기에서 나노입자는 양으로 하전된 키토산이 우세한 쉘 부분, 적어도 하나의 효소-저항성 약제 및 음으로 하전된 기질을 포함하는 코어 부분을 포함하는데, 여기에서 음으로 하전된 기질은 적어도 부분적으로 양으로 하전된 키토산의 일부로 중화된다. 일 실시예에서, 효소-저항성 약제는 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)과 같은 컴플렉손으로, 나노입자의 제조에서 키토산 기질 또는 PGA 기질과 결합할 수 있다.
본 발명의 몇몇 태양은 나노입자의 약제학적 조성물을 제공하는데, 나노입자는 양으로 하전된 키토산이 우세한 쉘 부분, 하나의 음으로 하전된 기질을 포함하는 코어 부분, 그리고 나노입자 내에 적재된 적어도 하나의 생리활성 약제를 포함하며, 여기서 기질은 PGA-컴플렉손 복합체이고 음으로 하전된 기질은 코어 부분에서 적어도 부분적으로 양으로 하전된 키토산의 일부로 중화된다. 일 실시예에서, 나노입자의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 다른 불활성 첨가제를 더 포함한다.
일 실시예에서, 나노입자는 캡슐 내에 캡슐화되는데, 여기에서 캡슐은 적어도 가용화제, 기포제, 유화제, 약전 부형제 또는 적어도 하나의 침투 증진제를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 나노입자는 동결-건조되며, 이에 의해 나노입자는 분말 형태이다.
본 발명의 나노입자는 동물 대상에 효소-저항성 화합물(예를 들어, PGA-컴플렉손 복합체) 및 생리활성 약물(예를 들어, 펩티드 약물)의 공동-투여를 위한 유리한 수단을 제공하는데, 여기에서 PGA-컴플렉손 복합체는 효소가 가득 찬 GIT에서 그의 효소-저항성 보호를 제공하기 위해 생리활성 약제와 대체로 나노미터 거리 내에 존재한다.
본 발명의 추가의 목적 및 특징은 첨부된 도면을 참고하여 읽는 경우 다음 실시예들의 설명으로부터 더욱 명확해지고 기재 자체가 가장 잘 이해될 것이다.
도 1은 (a) 제조된 CS-γ-PGA 나노입자(0.10% γ-PGA:0.20% CS)의 TEM 현미경사진 및 (b) 제조된 CS-γ-PGA 나노입자(0.01% γ-PGA:0.01% CS)의 AFM 현미경사진을 보여준다.
도 2는 제조된 CS-γ-PGA 나노입자의 Caco-2 세포 단층의 TEER 값에 대한 효과를 보여준다.
도 3은 양의 표면 전하를 갖는 FITC-라벨된 키토산을 갖는 fCS-γ-PGA 나노입자를 보여준다.
도 4는 당뇨병 래트에서 경구 투여된 인슐린-적재된 나노입자의 시간 대비 혈장 인슐린 함량을 보여주는데, 여기에서 동결-건조된 나노입자는 전달시 장용피 코팅된 캡슐에 적재된다.
도 5는 (γ-PGA)-DTPA 복합체를 사용한 효소 저해 연구에서의 실험 데이터를 보여준다.
이하에서 설명되는 본 발명의 바람직한 실시예들은 특히 키토산/PGA-복합체/인슐린으로 구성되는 나노입자의 제조, 그리고 상피세포 사이의 밀착연접을 개방시키는 것에 의해 장 또는 혈액 뇌 세포주위 침투를 증진시키기 위한 이들의 투과성과 관련된다. 본 설명은 다양한 구체적인 실시예를 상세히 기술하지만, 본 설명은 단지 예시적인 것이고 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 분야의 당업자에게 떠오를 수 있는 본 발명의 다양한 응용, 그리고 이의 변형은 또한 이하에서 설명되는 일반적인 개념에 포함된다.
본원에서 “생리활성 약제(bioactive agent)”는 투여된 후 수여자(동물 대상)에게 물리적으로, 생리적으로, 정신적으로, 생화학적으로, 생물학적으로, 또는 다른 신체 기능에 양성적 또는 음성적인 방식으로 영향을 줄 수 있는 어떠한 약제라도 포함하는 것을 의미한다. ‘생리활성 약제’는 약물, 단백질, 펩티드, siRNA, 효소, 보조 영양제, 비타민, 다른 활성 약제를 포함할 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 생리활성 약제는 단백질, 펩티드, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 항바이러스제, 항암제, 항생제, 산소-강화제, 산소-함유제, 항전간제 및 항염증 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 항전간제는 뉴론틴(Neurontin)(감마-아미노부티르산 유사체인 가바펜틴(gabapentin)), 라믹탈(Lamictal)(뉴런 멤브레인을 안정화시키고 흥분성 신경 전달 물질의 분비를 저해하여 전압-감응성 나트륨 채널에 작용하는 것으로 보이는 라모트리진(lamorigine)), 페바톨(Febatol)(GABA 수용체 결합 부위에서 약한 저해 효과를 갖는 것으로 보이는 펠바메이트(felbamate)), 토파맥스(Topamax)(전압-감응성 나트륨 채널을 차단하고, 억제성 신경 전달 물질인 GABA의 활성을 증진시키고, 흥분성 신경 전달 물질인 글루타메이트의 작용을 차단하는 D-프럭토스로부터 유래된 신규의 화학 구조를 갖는 토피라메이트(topiramate)), 및/또는 세레빅스(Cerebyx)(비경구 투여 후 신속하게 전환되는 페니토인 전구물질 포스페니토인(fosphenytoin))을 포함할 수 있다.
또한, 생리활성 약제는 칼시토닌, 사이클로스포린, 인슐린, 옥시토신, 타이로신, 엔케팔린, 타이로트로핀 분비 호르몬, 난포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 바소프레신 및 바소프레신 유사체, 카탈라제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 인터류킨-11, 인터페론, 집락 자극 인자, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 저해제 및 멜라닌세포-자극 호르몬으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 인터류킨 11(IL-11)은 조혈모 세포 및 거핵구 전구 세포의 증식을 직접적으로 자극하고 거핵구 성숙을 유도하여 증가된 혈소판 생산을 야기하는 혈소판신생 성장 인자이다(Oprelvekin®). 하나의 바람직한 실시예에서, 생리활성 약제는 알츠하이머 길항제 또는 백신이다. 알츠하이머 병을 치료하기 위한 생리활성 약제는 메만틴 염산염(memantine hydrochloride, Merz Pharmaceuticals의 Axura®), 도네페질 염산염(donepezil hydrochloride, Eisai Co. Ltd.의 Aricept®), 리바스티그민 주석산염(rivastigmine tartrate, Novatis의 Exelon®), 갈란타민 염산염(galantamine hydrochloride, Johnson & Johnson의 Reminyl®), 또는 타크린 염산염(tacrine hydrochloride, Parke Davis의 Cognex®)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서 생리활성 약제는 약제학적으로 유효량을 갖는 콘드로이틴 황산염, 히알루론산, 성장 인자 및 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 적어도 하나의 생리활성 약제는 인슐린 또는 인슐린 유사체이다. 또 다른 실시예에서, 적어도 하나의 생리활성 약제는 인슐린 증감제, 인슐린 분비촉진제, GLP-1 유사체, GLP-2, GLP-2 유사체, 디펩티딜 펩티다제 4의 저해제(DPP-4 저해제), 엑세나티드(exenatide), 리라글루티드(liraglutide), 알비글루티드(albiglutide), 또는 타스포글루티드(taspoglutide), 알파-글루코시다제 저해제, 아밀린 유사체, 소디움-글루코스 코-트랜스포터 타입 2(SGLT2, sodium-glucose co-transporter type 2) 저해제, 벤플루오렉스(benfluorex), 및 톨레스타트(tolrestat)로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 인슐린-함유 나노입자는 미량의 아연 또는 칼슘을 포함하거나, 장용피 처리된다. 일 실시예에서, 생리활성 약제는 비-인슐린 엑세나티드, 비-인슐린 프람린티드(pramlintide), 인슐린, 인슐린 유사체, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 생리활성 약제는 또한 옥시토신, 바소프레신, 부신피질자극 호르몬, 프롤락틴, 루리베린(luliberin) 또는 황체형성 호르몬 분비 호르몬, 성장 호르몬, 성장 호르몬 분비 인자, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터페론, 가스트린, 테트라가스티린, 펜타가스트린, 유로가스트로인, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도르핀, 안지오텐신, 레닌, 브라디키닌, 바시트라신, 폴리믹신, 콜리스틴, 타이로시딘, 그라미시딘, 및 이들의 합성 유사체, 변형체 및 약물학적 활성 단편, 단클론 항체 및 가용성 백신으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 성장 호르몬(GH)은 인간 또는 다른 동물에서 성장 및 세포 재생산을 자극하는 펩티드 호르몬이다. 이것은 뇌하수체 전엽의 측면 날개부위 내에서 성장자극 세포에 의해 합성, 저장 및 분비되는 191-아미노산의 단일 사슬 폴리펩티드 호르몬이다. 소마토트로핀은 동물에서 천연적으로 생산되는 성장 호르몬을 의미하는데, 소마토트로핀이라는 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 성장 호르몬을 의미하며 인간에서는 “rhGH”로 약칭된다.
다른 실시예에서, 생리활성 약제는 단백질, 펩티드, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 항바이러스제, 항암제, 항생제, 항전간 약물, 및 항염증 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 생리활성 약제는 칼시토닌, 사이클로스포린, 인슐린, 옥시토신, 타이로신, 엔케팔린, 타이로트로핀 분비 호르몬(TRH), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 바소프레신 및 바소프레신 유사체, 카탈라제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 인터류킨-Ⅱ(IL2), 인터류킨-11(IL-11), 인터페론, 집락 자극 인자(CSF), 종양 괴사 인자(TNF) 및 멜라닌세포-자극 호르몬으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시예에서, 생리활성 약제는 알츠하이머 길항제이다. 일 실시예에서, 항전간 약물은 뉴론틴(가바펜틴), 라믹탈(라모트리진), 페바톨(펠바메이트), 토파맥스(토피라메이트), 세레빅스(포스페니토인), 딜란틴(페니토인), 데파켄(발프로인산), 테그레톨(카바마제핀), 카바마제핀 에폭사이드, 빔파트(라코사미드) 및 페노바르비탈을 포함할 수 있다. 포스페니토인(Parke-Davis의 세레빅스; Pfizer Holding France의 프로딜란틴)은 비경구 전달을 통한 간질 발작의 치료용으로 병원에서만 사용되는 수용성 페니토인 전구약물이다, 포스페니토인은 (2,5-디옥소-4,4-디페닐-이미다졸리딘-1-일)메톡시포스폰산의 체계적(IUPAC) 명칭을 갖는다. 이것은 분자 질량 362.274 g/mol의 C16H15N2O6P의 화학식을 갖는다.
실시예 1
CS-γ-PGA 나노입자의 재료 및 제조
비교적 저분자량(약 80 kDa 또는 그 미만)을 갖는 키토산은 pH 6.0에서 수용액 중에 쉽게 용해될 수 있으며, 해중합 전에는 pH 값 약 4.0의 아세트산 중에 용해될 필요가 있다. 하나의 실시예로서, 0.10% γ-PGA 수용액을 저-MW CS 용액(점도 1.29 ± 0.02 cp)에 가하여 다분산도 0.3의 평균 입자 크기 218.1 ± 4.1 ㎚를 갖는 나노입자를 형성하였다(n=5).
나노입자는 피펫(0.5~5 ㎖, PLASTIBRAND®, BrandTech Scientific Inc., Germany)을 사용하여 γ-PGA 수용액(pH 7.4, 2 ㎖)을 실온에서 자석식 교반 하에 다양한 농도(0.01% w/v), 0.05% w/v), 0.10% w/v), 0.15% w/v), 또는 0.20% w/v)로 저-MW CS 수용액(pH 6.0, 10 ㎖)에 가하여 얻어졌다. 38,000 rpm으로 1 시간 동안 초고속원심분리하여 나노입자를 수집하였다. 상등액은 버리고 다음 연구를 위해 나노입자를 탈이온수에 재현탁하였다. 여기에 기재된 이처럼 간단하고 약한 이온-겔화 방법을 통해 얻어진 나노입자는 약 50 내지 400 ㎚ 사이의 입자 크기, 양의 표면 전하 및 좁은 다분산도를 갖는 타원체 구조의 전형적인 특성을 보인다. 여기에 기재된 바와 같이, 나노입자 제형의 γ-PGA는 PGA-컴플렉손으로 대체될 수 있다.
다양한 농도의 γ-PGA 및 CS로 제조된 CS-γ-PGA 나노입자의 입자 크기와 제타 포텐셜 값을 측정하였으며, 결과를 표 1a 및 1b에 나타낸다. 제조된 나노입자의 입자 크기와 제타 포텐셜 값은 싱크 용액 중 CS의 주위 농도에 대하여 첨가된 용액 중 γ-PGA의 국소적 농도의 상대적 양에 의해 주로 결정된다는 것을 알아내었다. 고정된 CS의 농도에서 γ-PGA 농도의 증가는 γ-PGA 분자가 더 많은 CS 분자와 상호작용하도록 허용하였고, 따라서 보다 큰 크기의 나노입자를 형성하였다(표 1a, p<0.05). CS 분자의 양이 국소적 γ-PGA 분자의 양을 초과할 때, 과잉의 CS 분자의 일부는 CS-γ-PGA 나노입자의 표면으로 걸렸다.
따라서, 결과적으로 형성된 나노입자는 양으로 하전된 CS 쉘에 의해 둘러싸인 중성의 다중전해질-복합체 코어의 구조를 나타낼 수 있어(표 1b) 콜로이드성 안정화를 보장한다. 대조적으로, 국소적 γ-PGA 분자의 양이 주변의 CS 분자의 양을 충분히 초과하면, 형성된 나노입자는 표면에 노출된 γ-PGA를 갖고 따라서 음의 전하의 제타 포텐셜을 가졌다. 따라서, 제조된 CS-γ-PGA 나노입자의 입자 크기와 제타 포텐셜 값은 이들의 구성 조성물에 의해 제어될 수 있다. TEM 및 AFM 검사에 의해 얻어진 결과는 제조된 나노입자의 형태가 매끄러운 표면을 갖는 구형인 것을 보여주었다(도 1a 및 1b). 나노입자의 형태는 2.5 내지 6.6 사이의 어떤 pH에서도 매끄러운 표면을 갖는 구형이다. 일 실시예에서, 약 2.5 근처의 낮은 pH에서 본 발명의 나노입자의 안정성은, 위에서 산성 매질에 노출되었을 때 나노입자가 온전하게 할 수 있다.
다른 연구에서, 수성 γ-PGA를 실온에서 자석식 교반 하에 수성 TMC(N-트리메틸 키토산)으로 첨가할 때 TMC/γ-PGA 중량비 6:1을 갖는 NPs가 즉각적으로 자가-조립되었다. 키토산과 N-트리메틸 키토산의 화학 구조는 다음에 나타낸다:
Figure pct00001
양으로 하전된 TMC의 양은 음으로 하전된 γ-PGA의 양을 유의성 있게 초과하였고; 과잉의 TMC 분자의 일부는 NPs의 표면으로 걸려서 양의 표면 전하를 나타내었다(표 2). TMC에서의 4기화도(degree of quaternization)는 NPs의 평균 입자 크기와 제타 포텐셜에 거의 영향을 주지 않았다.
[표 1a]
제조된 CS-γ-PGA 나노입자의 입자 크기에 대한 γ-PGA 및 CS의 농도의 영향
Figure pct00002
a) CS의 농도(w/v)
b) γ-PGA의 농도(w/v)
▲ 응집체의 침전이 관찰됨
[표 1b]
제조된 CS-γ-PGA 나노입자의 제타 포텐셜 값에 대한 γ-PGA 및 CS의 농도의 영향
제타 포텐셜(mV, n=5)
Figure pct00003
a) CS의 농도(w/v)
b) γ-PGA의 농도(w/v)
▲ 응집체의 침전이 관찰됨
[표 2]
다른 4기화도를 갖는 TMC 폴리머와 γ-PGA에 의해 자가-조립된 나노입자(NPs)의 평균 입자 크기, 제타 포텐셜값 및 다분산도(n=5 배치). TMC: N-트리메틸 키토산; CS: 키토산; γ-PGA: 폴리(γ-글루탐산).
Figure pct00004
실시예 2
Caco-2 세포 배양 및 TEER 측정
Caco-2 세포를 코스타 트랜스웰 6 웰/플레이트(Corning costar Corp., NY)의 조직-배양-처리된 폴리카보네이트 필터(직경 24.5 ㎜, 성장 면적 4.7 ㎠)에 3×105 세포/인서트의 접종 밀도로 접종하였다. 20% FBS, 1% NEAA 및 40 ㎍/㎖ 항생제-겐타마이신이 보충된 MEM(pH 7.4)를 배양 배지로 사용하고 공여 및 수여 구획에 첨가하였다. 배지를 첫 6일 동안은 매 48 시간마다, 이후에는 매 24 시간마다 교체하였다. 배양은 37℃에서 95% 공기와 5% CO2의 환경을 유지하였고, 세포주위 수송 실험을 위해 접종 18 내지 21일 후 사용하였다(600 내지 800 Ω㎠ 범위에서의 TEER 값).
세포간 밀착연접은 대형분자의 세포주위 수송에 대한 주된 장벽의 하나이다. 상피-통과 이온 수송은 세포 사이의 연접 밀착도의 좋은 지표로 생각되고, 이에 따라 본 연구에서 Caco-2 세포 단층의 TEER을 측정하는 것에 의해 평가되었다. TEER의 측정은 친수성 분자의 세포주위 수송을 예측하는 데 사용될 수 있는 것으로 보고되었다(Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004;58:225-235). 밀착연접이 개방될 때, TEER 값은 세포주위 경로를 통한 물과 이온 통과로 인해 감소된다. Caco-2 세포 단층은 대형 분자의 장내 세포주위 투과성을 평가하기 위한 in vitro 모델로서 널리 사용되고 있다.
Caco-2 세포 단층의 TEER 값에 대한 제조된 CS-γ-PGA 나노입자의 효과는 도 2에 나타낸다. 도시된 바와 같이, 양의 표면 전하를 갖는 제조된 나노입자(표면상 CS 우세, 0.01% γ-PGA:0.05% CS, 0.10% γ-PGA:0.2% CS, 및 0.20% γ-PGA:0.20% CS)는 Caco-2 세포 단층의 TEER 값을 유의성 있게 감소시킬 수 있었다(p<0.05). 이들 나노입자와 2-시간 배양 후, Caco-2 세포 단층의 TEER 값은 대조군(수송 매질에 나노입자의 첨가가 없는 것)과 비교하여 초기값의 약 50%로 감소되었다. 이는 표면상 CS 우세한 나노입자가 Caco-2 세포 사이의 밀착연접을 효과적으로 개방 또는 느슨하게 할 수 있어 TEER 값의 감소를 야기한 것을 나타낸다. CS의 양으로 하전된 아미노 그룹과 세포 표면 및 밀착연접의 음으로 하전된 부위 간의 상호작용은 F-액틴과 밀착연접 단백질 ZO-1의 재배치를 유도하여 증가된 세포주위 투과성을 수반하는 것이 보고되었다. 키토산과 밀착연접 단백질 ZO-1 사이의 상호작용은 세포골격의 위치변경을 유도하는 것으로 제안된다.
배양된 나노입자의 제거 후, TEER 값의 점진적인 증가가 관찰되었다. 이 현상은 Caco-2 세포 단층의 세포간 밀착연접이 점차 회복되기 시작한 것을 의미한다; 그러나 TEER 값은 그 초기 값으로 회복되지는 않았다(도 2). 배양된 세포의 손상 없이 CS-유도된 폴리머를 완전한 제거하는 것은 CS의 높은 접착 특성으로 인해 어렵다(Pharm. Res. 1997;14:1197-1202). 이는 TEER 값이 초기 값으로 회복되지 않는 이유가 될 수 있다. 반면, 음의 표면 전하를 갖는 나노입자(표면에 γ-PGA가 우세하고, 0.10% γ-PGA:0.01% CS 및 0.20% γ-PGA:0.01% CS, 도 2)와 함께 배양된 Caco-2 세포 단층의 TEER 값은 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이를 보이지 않았다(p>0.05). 이는 γ-PGA가 세포간 밀착연접의 개방에 어떠한 영향도 미치지 않는 것을 나타내었다.
TJ에서 세포 표면의 ZO-1 단백질의 음으로 하전된 부위와 양으로 하전된 CS 사이의 정전기적 상호작용은 ZO-1의 세포골격으로의 전좌 뿐 아니라 세포 F-액틴의 재배치를 유도하여, 투과성 증가를 야기한다는 것이 제시되었다. 십이지장의 점막층으로의 부착 및 침투 이후, 경구 투여된 나노입자는 장액의 특정 소화 효소의 존재로 인해 분해될 수 있다. 추가로, 나노입자가 점막층으로 침투하고 장내 상피 세포로 접근하는 동안, pH 환경은 중성이 될 수 있다. 이는 또한 노출된 pH 환경의 변화로 인한 나노입자의 붕괴를 유도한다. 분해된/붕괴된 나노입자로부터 분리된 CS는 다음에 상피 세포 사이의 ZO-1 단백질의 기능과 상호 작용하고 조절할 수 있다. ZO-1 단백질은 TJ에서 세포-세포 접촉의 재배열에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 오클루딘(occludin)과 F-액틴 세포골격 사이의 연결 분자로 생각된다.
두 가지 인슐린 농도를 갖는 나노입자를 키토산과 γ-PGA 비율 0.75 ㎎/㎖ 내지 0.167 ㎎/㎖로 제조한다. 이들의 입자 크기 및 제타 포텐셜은 아래 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00005
(*) 인슐린 없는 대조군
CS-γ-PGA 나노입자에 대한 API 로딩 효율(LE 40~55%) 및 API 로딩량(LC 5.0~14.0%)은 CS 용액으로 γ-PGA 용액과 혼합된 모델 API(이 경우 인슐린)를 첨가하여 이온-겔화 방법을 사용하고, 이어서 자석식 교반에 의해 나노입자를 분리하여 얻어졌다. 본 발명의 어떤 태양은 본 발명의 나노입자의 코어 기질로서 음으로 하전된 글리코사미노글리칸(GAGs)과 관련된다. GAGs는 약물-담체 나노입자를 형성하기 위한 저분자량 키토산과 복합체를 형성할 수 있다. GAGs는 또한 여기에 개시된 바와 같이 나노입자에서 코어 기질의 결합 효율을 증진시키기 위해 단백질 약물과 복합체를 형성할 수도 있다. 특히, 본 발명의 나노입자의 음으로 하전된 코어 기질(GAGs, 헤파린, PGA, 알기네이트 등과 같은)은 콘드로이틴 황산염, 히알루론산, PDGF-BB, BSA, EGF, MK, VEGF, KGF, bFGF, aFGF, MK, PTN 등과 복합체를 형성할 수 있다.
다른 실시예에서, 캡슐은 가용화제, 기포제, 유화제, 또는 일반적으로 안전한 것으로 인식되는(GRAS, Generally Recognized as Safe) 다른 약전 부형제를 포함할 수 있다. GRAS는 식품에 첨가되는 화학물질 또는 물질이 숙련자에 의해 안전한 것으로 여겨지고, 따라서 통상의 연방 식품, 약물 및 화장품법(FFDCA, Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) 식품 첨가물 허용 제한으로부터 면제되도록 미국 식품의약국(FDA, Food and Drug Administration)에서 지정하는 것이다. 기포제는 캡슐을 터뜨리거나 캡슐 내용물과 캡슐 외부의 주위 물질의 밀접한 접촉을 촉진시키기 위한 목적으로 액체와 접촉할 때 이산화탄소 기체를 발생시키는 약제이다. 예를 들어, 중탄산나트륨과 산의 반응은 염과 카본산을 형성하고, 이는 용이하게 이산화탄소와 물로 분해된다. 기포제는 중탄산나트륨/구연산 혼합물, Ac-Di-Sol 등을 포함할 수 있다. 화학물질 Ac-Di-Sol은 아세트산, 2,3,4,5,6-펜타하이드록실헥사날, 소디움의 IUPAC 명칭 및 C8H16NaO8의 화학식을 갖는다. 유화제는 운동 안정성을 증가시키는 것에 의해 유제를 안정화시키는 물질이다. 유화제의 한 계열은 표면 활성 물질, 또는 계면활성제로 알려져 있다. 세제는 다른 계열의 표면 유화제이고, 오일 및 물 둘다와 물리적으로 상호작용하여 현탁액에서 오일 또는 물 방울 사이의 계면을 안정화시킬 것이다. 가장 유명한 유화제는 비이온성인데 이들이 낮은 독성을 갖기 때문이다. 양이온성 유화제는 항미생물 특성 때문에 또한 여기에 사용될 수 있다.
따라서, 편리하고 효과적인 경구 투여를 위해, 본 발명의 나노입자의 약제학적 유효량이 하나 또는 더 많은 부형제와 함께 정제화되거나, 겔 캡슐과 같은 캡슐에 충전되거나, 또는 액체 용액 등으로 현탁될 수 있다. 나노입자는 비경구 투여(예를 들어, 비강내 스프레이, 피하 주사 또는 정맥 주사)를 위해 탈이온화된 용액 또는 유사한 용액 중에 현탁될 수 있다. 나노입자는 통상의 기술에 의해 섭취용의 패킹된 제제 또는 저작형 제제로 형성될 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 공지의 캡술화 공정 및 재료를 사용하여 “경질-충전된 캡슐” 또는 “연질-탄성 캡슐”로서 캡슐화될 수 있다. 캡슐화 재료는 캡슐이 섭취된 후 입자가 위에서 신속하게 분산되도록 위액에서 매우 잘 녹아야 한다. 각각의 단위 용량은, 캡슐이든 정제이든, 바람직하게는 약제학적 유효량의 나노입자를 제공하는 적절한 크기 및 용량의 나노입자를 포함한다. 캡슐의 적용 가능한 형태 및 크기는 0.75 ㎜ 내지 80 ㎜ 또는 이보다 큰 크기를 갖는 구형, 난형, 타원형, 튜브 또는 좌약형을 포함할 수 있다. 캡슐의 용량은 0.05 cc로부터 5 cc 보다 클 수 있다. 일 실시예에서, 캡슐의 내부는 소수성 또는 지질친화성으로 처리된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 나노입자는 뇌혈관 장벽 및/또는 위장관 장벽을 통과하는 생리활성 약제의 흡수를 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 양의 표면 전하를 보이는 외부층에 키토산이 우세한 나노입자는 생리활성 약제 및 나노입자가 경구 투여될 때 투여된 생리활성 약제의 약물(생리활성 약제) 침투를 증진시키는 증진제로서 작용한다.
실시예 3
상피 침투 및 증진제
키토산 및 이의 유도체는 상피 흡수 증진제로서 작용할 수 있다. 키토산은 산성 pH에서 양성자화될 때 점막 상피를 통한 펩티드 약물의 투과성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 어떤 태양은 본 발명의 나노입자와 적어도 하나의 침투 증진제(비-나노입자 형태 또는 나노입자 형태로)의 공동-투여를 제공한다. 일 실시예에서, 나노입자는 다른 성분의 선택적인 첨가와 함께, 적어도 하나의 침투 증진제 및 적어도 하나의 생리활성 약제의 공동-캡슐화에 의해 제형화될 수 있다. 일 실시예에서, 나노입자는 침투 증진제를 더 포함한다. 침투 증진제는 킬레이트제(예를 들어 Ca2+ 킬레이트제), 담즙염, 음이온 계면활성제, 중간-사슬 지방산, 인산염 에스테르, 및 키토산 또는 키토산 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 나노입자는, 또는 적어도 하나의 투과성 증진제와 함께 연질 겔, 환제, 정제, 저작형 제제, 또는 캡슐에 적재되거나, 연질 겔, 환제, 정제, 저작형 제제, 또는 캡슐의 장용피 코팅된 대응되는 것들에 적재된다. 증진제 및 나노입자는 밀착연접의 개방을 일시적으로 증진시키도록 대략 동시에 밀착연접에 도달할 것이다. 다른 실시예에서, 적어도 하나의 침투 증진제는 본 발명의 나노입자 내에 공동-첨부된다. 따라서, 나노입자가 상피 층의 밀착연접을 개방시키는 것을 돕도록 일부 파손된 나노입자 또는 단편이 증진제를 유리할 것이다. 대안적인 실시예에서는, 적어도 하나의 증진제가 양의 표면 전하를 갖는 제 2 나노입자, 특히 키토산-타입 나노입자 내에 첨부되는데, 여기에서 제 2 나노입자는 어떠한 생리활성 약제도 없이 또는 제 1 나노입자의 생리활성 약제와는 다른 생리활성 약제와 함께 제형화된다. 본 발명의 약물-함유 제 1 나노입자가 상기 제 2 나노입자와 함께 경구로 공동-투여될 때, 제 2 나노입자 내의 증진제는 위장관에서 유리되어 약물-함유 제 1 나노입자가 밀착연접을 개방하여 통과하는 것을 돕거나 증진된 약물 흡수 및 수송을 용이하게 한다.
키토산에 EDTA, 메틸, N-트리메틸, 알킬(예를 들어, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸 등), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 또는 헤파린(저분자량 헤파린, 평균 분자량 헤파린, 및 유전학적으로 변형된 헤파린을 포함하는)을 융합시키는 것과 같은, 전하 특성을 변경시키기 위한 키토산 구조의 변형에 의해, CS- γ-PGA 나노입자의 표면 전하 밀도(제타 포텐셜)는 보다 더 pH 저항성 또는 친수성으로 될 수 있다. 일 실시예에서, 키토산은 폴리아크릴산과 융합된다. 일 실시예에서, 채용되는 키토산은 N-트리메틸 키토산(TMC), 저MW-키토산, EDTA-키토산, 키토산 유도체, 및/또는 이들의 조합이다. EDTA-키토산의 하나의 예시적인 화학 구조는 다음과 같다:
Figure pct00006
예시적으로, 트리메틸 키토산 클로라이드는 2.5 보다 낮은 pH에서, 바람직하게는 1.0만큼 낮은 pH에서 구형의 생물학적 안정성을 유지시키기 위해 CS/PGA-컴플렉손 나노입자를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 어떤 태양은 2.5 보다 낮은 pH에서, 바람직하게는 1.0만큼 낮은 pH 내에서 생물학적 안정성을 증진시키기 위한 생체적합성 약물 담체로서 게니핀(genipin) 또는 다른 가교제와 가교된 약물-적재된 키토산-함유 생물학적 물질을 제공한다.
CS(아민 그룹) 및 γ-PGA(카복실 그룹)의 pKa 값은 각각 6.5 및 2.9로 알려져 있다. NPs는 DI 물(pH 6.0)에서 제조되었다. pH 6.0에서 CS(TMC25) 및 γ-PGA는 이온화되었다. 이온화된 CS(TMC25) 및 γ-PGA는 다중전해질 복합체를 형성할 수 있으며, 이는 구형의 매트릭스 구조를 야기한다. pH 1.2 내지 2.0에서, γ-PGA 상의 대부분의 카복실 그룹은 -COOH 형태였다. 그러므로, CS(TMC25)와 γ-PGA 사이의 정전기적 상호작용은 거의 없으며; 따라서 나노입자(NP)는 붕해되었다(표 4). 유사하게, 6.6 보다 높은 pH에서, CS(TMC25) 상의 유리 아민 그룹은 탈양성자화되고; 따라서 NP의 붕해를 유도하였다. 이는 소장에서 약물 전달 및 흡수의 효능을 제한할 수 있다.
TMC(TMC 40 및 TMC55) 상의 4기화도가 증가될 때, pH 범위 6.6-7.4에서 NP의 안정성은 유의성 있게 증가하였다. 그러나, pH 7.4에서 TMC55/γ-PGA NP의 팽창은 (고도로 4기화된 TMC55로 인해) 최소이고, 이는 적재된 약물의 유리를 제한할 수 있다. 대조적으로, TMC40/γ-PGA NP은 pH 값의 증가와 함께 유의성 있게 팽창하였다. TMC40/γ-PGA NP(붕괴된 NP 또는 단편)는 pH 7.4에서 제타 포텐셜값 17.3 ㎷로 양의 표면 전하를 여전히 유지하였다.
따라서, TMC40/γ-PGA/약물 NP는 CS/γ-PGA/약물 NP와 비교하여 더 넓은 pH 범위에서 우수한 안정성을 갖는다. 일 실시예에서는, 약 7.4의 체액 pH 주위에서 본 발명의 생리활성 나노입자가 키토산-쉘을 갖는 단편 또는 키토산-함유 단편의 구조인 것으로 나타날 수 있다. 본 발명의 생리활성 나노입자로부터의 키토산-쉘을 갖는 단편 또는 키토산-함유 단편 표면의 적어도 일부는 양의 제타 포텐셜 특성을 나타낸다.
표면-우세한 TMC40을 갖는 TMC40/γ-PGA/약물 단편은 혈액-뇌 장벽의 상피 멤브레인 점막에 부착하고 침투하여, 이어서 장세포 사이의 밀착연접을 일시적으로 개방시키는 것을 촉발할 것이다. 표 4는 특정 pH 환경에서 다른 4기화도를 갖는 TMC 폴리머 및 γ-PGA에 의해 자가-조립된 나노입자(NPs)의 평균 입자 크기, 제타 포텐셜 값 및 다분산도를 보여준다(n= 5 배치). 표 4에서 보듯이, TMC40/γ-PGA NP은 pH 7.4에서 제타 포텐셜값 17.3 ㎷으로 양의 표면 전하를 여전히 유지하였다.
동결-건조된 나노입자
입자 상에 보호층을 형성하는 몇 가지 통상적인 코팅 화합물이 동결-건조 공정 전에 나노입자를 물리적으로 코팅하거나 혼합하도록 사용된다. 코팅 화합물은 트레할로스, 만니톨, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 트레할로스는 마이코스로도 알려진 것으로, 자연적으로 광범위하지만 풍부하지는 않게 발견되는 알파-결합된(이당류) 당이다. 이것은 진균, 식물 및 무척추 동물에 의해 합성될 수 있다. 이것은 탈수가사(anhydrobiosis) - 장시간의 건조에 견디는 식물 및 동물의 능력 - 와 관련된다. 재수화는 중요한, 보통 치명적인 손상 없이 정상적인 세포 활동이 재개되도록 허용하는데, 이는 보통 탈수/재수화 사이클로 이어질 것이다. 트레할로스는 항산화제라는 추가의 장점을 갖는다. 트레할로스는 C12H22O11·2H2O의 화학 구조식을 갖는다. 이것은 CAS no. 99-20-7 및 PubChem 7427로 수록되어 있다.
각각의 나노입자를(2.5% 농도로) 4 가지 타입의 액체 용액과 1:1 용적비로약 30 분 동안 충분히 분산될 때까지 혼합하였다. 혼합된 입자-액체는 다음에 동결건조 조건 하에서, 예를 들어 약 -80℃ 및 <25 mmHg 압력에서 약 6 시간 동안 동결-건조하였다. 선택된 동결건조 조건의 변수는 상기 치수로부터 약간 변경될 수 있다. 실험에 사용된 4 가지 타입의 액체는 다음을 포함한다: (A) DI 물; (B) 트레할로스; (C) 만니톨; 및 (D) 글리세롤. 여기에서 용액 중 액체 (A) 내지 액체 (C)의 농도는 2.5%, 5% 및 10%로 세팅되었다. 동결-건조 공정 이후, 혼합된 입자-액체는 각 타입의 액체에서 나노입자의 통합성을 평가하기 위해 1:5 용적비로 DI 물로 재수화되었다. 입자 크기, 다분산도, 및 제타 포텐셜 데이터를 비교하는 것에 의해, 동결-건조된 입자-트레할로스 운행으로부터의 나노입자는(2.5%, 5% 및 10% 농도 수준에서) 동결건조-전 나노입자에 비해 비슷한 특성을 보인다. 동일한 데이터 분석 하에서, 동결-건조된 입자-만니톨 운행으로부터의 나노입자는(2.5% 및 5% 농도 수준에서) 동결건조-전 나노입자에 비해 어느 정도 비슷한 특성을 보인다.
실시예 4
동물 평가에서 동결-건조된 나노입자
인슐린의 경구 전달을 위해 동결-건조된 NPs가 적재된 장용피 캡슐을 래트 모델에서 시험한다. 기본 개념은 장용피 캡슐이 위의 높은 산성 환경에서는 손상되지 않지만 소장의 중성(또는 약간 염기성) 환경에서는 신속하게 용해된다는 것이다. 결과적으로, 이러한 캡슐은 위에서 NPs의 붕해를 방지할 수 있고 결과적으로 소장의 근위부에 전달되는 온전한 NPs의 양을 증가시킨다. 당뇨병 래트를 실험 전에 12 시간 동안 금식시키고 실험 중 금식을 유지하였으나, 물은 임의로 섭취하도록 허용하였다. 당뇨병 래트에 3 가지 제형을 투여하였다: (a) 유리-형의 인슐린(30 IU/㎏) 및 트레할로스로 충전된 경구 Eudragit® L100-55-코팅된 캡슐; (b) 동결-건조된 NPs(30.0 I.U./㎏)로 충전된 경구 Eudragit® L100-55-코팅된 캡슐; 및 (c) 유리-형의 인슐린 용액의 피하(SC) 주사(5.0 IU/㎏, 각 연구 그룹에서 n=5). 약물 투여 전과 복용 후 다른 시간 간격으로 래트의 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 상응하는 혈장 인슐린 농도-시간 프로파일을 도 4에 나타낸다. 도시된 바와 같이, 유리-형의 인슐린 용액으로 피하 투여된 래트는 투여 1 시간 후에 최대 혈장 농도를 야기한 반면, 인슐린-적재된 NPs로 충전된 Eudragit® L100-55-코팅된 캡슐의 경구 투여는 투여 5 시간 후에 최대 혈장 농도를 보였다. 대조적으로, 유리-형의 인슐린으로 충전된 Eudragit® L100-55-코팅된 캡슐로 경구 투여된 래트에서는 검출 가능한 혈장 인슐린(소 인슐린)이 발견되지 않았다.
[표 4]
4기화도가 다른 TMC 폴리머에 의해 자가-조립된 나노입자(NPs)의 변수
Figure pct00007
N/A: 응집체의 침전이 관찰되지 않음.
일 실시예에서, 본 발명의 나노입자 위로 적재되는 생리활성 약제는 종양 괴사 인자(TNF) 저해제로, 여기에서 TNF는 염증 반응을 촉진하여 류마티스성 관절염, 강직성 척수염, 크론병, 건선 및 불응성 천식과 같은 자가면역 질환과 관련된 많은 임상적 문제를 야기한다. 이러한 질환은 종종 TNF 저해제를 사용하여 치료한다. 이러한 저해는 인플릭시맙(infliximab, Remicade) 또는 아달리무맙(adalimumab, Humira)와 같은 단클론 항체와 함께, 또는 에타너셉트(etanercept, Enbrel)와 같은 순환하는 수용체 융합 단백질과 함께 달성될 수 있다. 다른 예로는 펜톡시필린(pentoxifylline)이 있다.
실시예 5
DTPA와 함께 적재된 나노입자
본 발명의 어떤 태양은 키토산, PGA-컴플렉손 복합체 및 생리활성 약제를 포함하는 나노입자의 약제학적 조성물과 관련된다. 일 실시예에서, PGA-컴플렉손 복합체는 광범위하게 γ-PGA, α-PGA와 같은 PGA 유도체와의 복합체, PGA의 유도체 또는 PGA의 염을 포함할 수 있는데, 여기에서 컴플렉손은 DTPA(디에틸렌 트리아민 펜타아세트산), EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세테이트), IDA(이미노디아세트산), NTA(니트릴로트리아세트산), EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), BAPTA(1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N’,N’-테트라아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N’,N,N’-테트라아세트산), NOTA(2,2’,2”-(1,4,7-트리아조난-1,4,7-트리일)트리아세트산) 등일 수 있다. 폴리아미노카복실산(컴플렉손)은 탄소 원자를 통해 하나 또는 이보다 많은 카복실 그룹에 연결된 하나 또는 이보다 많은 질소 원자를 포함하는 화합물이다.
디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA)은 5 개의 카복시메틸 그룹으로 변형된 디에틸렌트리아민 골격으로 구성되는 폴리아미노 카복실산이다. 이 분자는 EDTA의 확장된 버전으로서 보일 수 있다. DTPA는 종종 정의되지 않은 그의 복합체 염기로서 사용되는데, 이는 금속 양이온에 대한 높은 친화성을 갖는다. 예를 들어, 란타니드 및 악티니드 이온과 복합체를 형성하면, DTPA는 펜타음이온, 즉 5 개의 모든 카복실산 그룹이 탈양성자화된 형태로서 존재한다. DTPA는 분자량 393.358 g/몰의 분자식 C14H23N3O10 과 다음 화학식을 갖는다:
Figure pct00008
현재, DTPA는 3 개의 방사성 물질: 플루토늄, 아메리슘 및 큐리움의 킬레이트된 것으로서 미국 식품의약국(FDA) 승인을 받았다. DTPA는 옥타덴테이트 리간드의 모산(parent acid), 디에틸렌 트리아민 펜타아세테이트이다. 어떤 상황에서는, 5개의 아세테이트 가지 모두가 금속이온과 결합하지는 않는다. 본 발명의 어떤 태양에서, DTPA는 아래에 나타낸 바와 같이 헥산디아민을 통해 γ-PGA와 복합체를 형성한다((γ-PGA)-DTPA):
Figure pct00009
본 발명의 하나의 태양에서, (γ-PGA)-DTPA는 현재의 약제학적 나노입자 조성물에 사용되는 PGA-컴플렉손 복합체의 한 종류이다. (γ-PGA)-DTPA 복합체에서 DTPA의 전체 치환도는 일반적으로 약 1내지 70%의 범위, 바람직하게는 약 5 내지 40%의 범위, 가장 바람직하게는 약 10 내지 30%의 범위에 있다. DTPA는 체내에 축적되거나 장기간 건강에 영향을 주지 않는다.
여기에 기술된 간단하고 약한 이온-겔화 공정을 사용한 키토산, PGA-컴플렉손 복합체 및 적어도 하나의 생리활성 약제를 포함하는 나노입자는 Caco-2 세포 배양 모델에서 TEER 측정시 원하는 세포주위 수송 효능을 나타낸다.
실시예 6
(γ-PGA)-DTPA 복합체에서의 효소 저해 연구
브러시 보더(brush border) 멤브레인 결합된 효소를 공여 구획 바닥에서 접촉하는 멤브레인을 시뮬레이트하기 위해 사용하였는데, 여기에서 공여 구획의 인슐린-적재된 매질(크렙스-링거 완충액)이 제로 타임에서 출발 물질로 사용되었다. 시간에 따른 브러시 보더 멤브레인 결합된 효소에 의한 인슐린의 효소적 분해를 평가하기 위한 이 효소 저해 연구에 3 가지 요소가 사용되었다. 이들은 (a) 대조군으로서 인슐린 1 ㎎/㎖; (b) DTPA 5 ㎎/㎖; 및 (c) (γ-PGA)-DTPA 5 ㎎/㎖였다. 도 5에서 보듯이, DTPA와 (γ-PGA)-DTPA 둘 다 2 시간 까지 실험 기간에 걸쳐 실질적으로 인슐린 활성 또는 활성 내용물을 보호 또는 유지한다. 본 발명의 어떤 태양은 나노입자의 약제학적 조성물을 제공하는데, 나노입자는 양으로 하전된 키토산이 우세한 쉘 부분, 컴플렉손과 하나의 음으로 하전된 기질을 포함하는 코어 부분으로서, 여기에서 기질은 PGA이고 음으로 하전된 기질은 코어 부분에서 양으로 하전된 키토산의 일부로 적어도 부분적으로 중화된 코어 부분, 및 나노입자 내에 적재된 적어도 하나의 생리활성 약제를 포함한다. 일 실시예에서, PGA는 나노입자 내에서 컴플렉손과 결합하여 PGA-컴플렉손 복합체를 형성한다.
본 발명의 어떤 태양은 생리활성 약제를 나노입자에 캡슐화시키는 것에 의해 경구 투여에서 생리활성 약제의 효소 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는데, 여기에서 나노입자는 본 설명 및 청구범위에서 기술된 약제학적 제형 및/또는 조성물을 갖는다. 일 실시예에서, 나노입자는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 추가적으로 정제, 환제, 캡슐, 저작형 제제 등에 적재된다.
본 발명의 어떤 태양은 나노입자의 약제학적 조성물과 관련되는데, 나노입자는 양으로 하전된 키토산이 우세한 쉘 부분, 하나의 음으로 하전된 PGA-컴플렉손 복합체 기질을 포함하는 코어 부분으로서, 여기에서 음으로 하전된 기질은 코어 부분에서 양으로 하전된 키토산의 일부로 적어도 부분적으로 중화된 코어 부분, 및 나노입자 내에 적재된 적어도 하나의 생리활성 약제를 포함한다. 일 실시예에서, 나노입자는 아연, 황산마그네슘 또는 소디움 트리폴리포스페이트(TPP)를 더 포함한다. 다른 태양에서, 나노입자는 장용피 처리된다.
비록 본 발명은 이의 어떤 실시예의 특정 세부사항을 참고로 기술되었지만, 이러한 세부사항이 본 발명의 범위를 첨부된 청구범위에 포함된 정도까지 및 이로써 한정하는 것으로 간주되는 것은 의도하지 않는다. 상기 개시에 비추어 많은 변형과 변경이 가능하다.
[산업상 이용가능성]
적어도 하나의 생리활성 약제가 적재된 나노입자의 약제학적 조성물은 GIT에서 생리활성 약제가 효소 공격에서 생존하는 한 경구 약물 전달을 위한 편리하고 번거롭지 않은 방식이다. 본 발명은 동물 대상에서 생리활성 약제의 생체이용성과 효능을 증진시키도록 나노입자 내에 생리활성 약제에 근접하여 효소-저항성 PGA-컴플렉손을 적재한 신규 나노입자 제형을 개시한다.

Claims (20)

  1. 나노입자의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 나노입자는 양으로 하전된 키토산이 우세한 쉘 부분, 하나의 음으로 하전된 PGA-컴플렉손 복합체의 기질을 포함하는 코어 부분으로서, 상기 음으로 하전된 기질은 코어 부분에서 상기 양으로 하전된 키토산의 일부로 적어도 부분적으로 중화된 코어 부분, 및 상기 나노입자 내에 적재된 적어도 하나의 생리활성 약제를 포함하는 나노입자의 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 약 50 내지 400 나노미터 사이의 평균 입자 크기를 갖는약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 키토산은 N-트리메틸 키토산, EDTA-키토산, 저분자량 키토산, 키토산 유도체, 또는 이들의 조합인 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 간단하고 약한 이온-겔화 공정을 통해 형성되는 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 정제, 환제 또는 저작형 제제 구조로 제형화되는 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 정제 또는 환제는 장용피 처리되는 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 캡슐 내에 캡슐화되는 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 캡슐은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 캡슐은 적어도 가용화제, 기포제, 또는 유화제를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 캡슐은 장용피 처리되는 약제학적 조성물.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 캡슐은 적어도 하나의 침투 증진제를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 침투 증진제는 킬레이트제, 담즙염, 음이온 계면활성제, 중간-사슬 지방산, 인산염 에스테르, 키토산, 및 키토산 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 컴플렉손은 DTPA(디에틸렌 트리아민 펜타아세트산), EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세테이트), IDA(이미노디아세트산), NTA(니트릴로트리아세트산), EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), BAPTA(1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N’,N’-테트라아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N’,N,N’-테트라아세트산), 및 NOTA(2,2’,2”-(1,4,7-트리아조난-1,4,7-트리일)트리아세트산)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 생리활성 약제는 단백질, 펩티드, 인슐린, 인슐린 유사체, GLP-1, GLP-1 유사체, 인슐린 증감제, 인슐린 분비촉진제, GLP-2, GLP-2 유사체, 디펩티딜 펩티다제 4의 저해제(DPP-4 저해제), 엑세나티드(exenatide), 리라글루티드(liraglutide), 알비글루티드(albiglutide), 타스포글루티드(taspoglutide), 알파-글루코시다제 저해제, 아밀린 유사체, 소디움-글루코스 코-트랜스포터 타입 2(SGLT2) 저해제, 벤플루오렉스(benfluorex), 및 톨레스타트(tolrestat)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 동결-건조되고, 이에 의해 상기 나노입자가 분말 형태인 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 트레할로스와 혼합된 다음 동결-건조되고, 이에 의해 상기 나노입자가 분말 형태인 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 아연, 황산마그네슘, 또는 소디움 트리폴리포스페이트(TPP)를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 장용피 처리되는 약제학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서,
    PGA-컴플렉손 복합체에서 상기 PGA는 γ-PGA, α-PGA, PGA의 유도체, 또는PGA의 염인 약제학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 적어도 하나의 침투 증진제를 더 포함하는 약제학적 조성물.
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