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KR20130099736A - Pharmaceutical compositions for preventing or treating corneal dystrophies associated with tgfbi gene mutation and screening methods using the same - Google Patents

Pharmaceutical compositions for preventing or treating corneal dystrophies associated with tgfbi gene mutation and screening methods using the same Download PDF

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KR20130099736A
KR20130099736A KR1020120021463A KR20120021463A KR20130099736A KR 20130099736 A KR20130099736 A KR 20130099736A KR 1020120021463 A KR1020120021463 A KR 1020120021463A KR 20120021463 A KR20120021463 A KR 20120021463A KR 20130099736 A KR20130099736 A KR 20130099736A
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vitamin
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한경은
최승일
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방 또는 억제할 수 있으므로 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising TGFBI The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating genetic mutation keratoderma. The pharmaceutical composition of the present invention inhibits the expression of TGFBIp in normal cells and GCD2 cells (preferably, corneal fibroblasts or corneal epithelial cells) at a mRNA or protein level through vitamin D receptor (VDR) My accumulated mutations can efficiently prevent or suppress the accumulation of TGFBI protein, so that TGFBI It is very effective in the prevention and treatment of genetic mutation corneal dystrophy.

Description

ＴＧＦＢＩ 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Corneal Dystrophies Associated with TGFBI Gene Mutation and Screening Methods Using the Same}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating TGFBI gene mutated corneal dystrophy and a method for screening the same,

본 발명은 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising TGFBI To a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of genetic mutation keratoderma and a screening method thereof.

제2형 과립형 각막이상증(Granular Corneal dystrophy type 2, GCD2)은 형질전환 성장인자--유도된 유전자(transforming growth factor-beta-induced gene, TGFBI)의 돌연변이(아르기닌의 히스티딘으로의 돌연변이; R124H 돌연변이)를 유전시키는 상염색체 우성 질환이다. TGFBI 유전자는 축적된 단백질인, 과립형 침착(granular deposits) 내 히알린 및 격자형 침착(lattic deposits) 내 아밀로이드로 구성된 각막 침착(corneal deposits)의 주요 구성성분인 돌연변이 형질전환--유도된 유전자 단백질(TGFBIp)을 인코딩한다1. 사람이 나이듦에 따라, 각막 침착은 시력(visual acuity)의 심각한 장애를 초래하고 PTK(phototherapeutic keratectomy), DALK(deep anterior lamellar keratoplasty) 및 PKP(penetrating keratoplasty)을 포함하는 많은 수술들2이 혼탁(opacity)을 해결하기 위해 개발되어 왔다. 하지만, 상술한 외과 과정들이 우수한 시력 교정을 달성하였을 지라도, GCD2는 유전 질환이기 때문에 각막은 결과적으로 수년 또는 수십년 후에 재발한다. 따라서, 이미 존재하는 각막 침착의 진행 및 새로이 형성된 각막 침착의 형성(synthesis)을 예방하기 위한 연구들은 상기 유전성 각막이상증들(corneal dystrophies)을 치료하기 위한 가장 중요한 단계이다.Type 2 granular corneal dystrophy type 2 (GCD2) is a mutation of the transforming growth factor-beta-induced gene (TGFBI) (a mutation of arginine to histidine; a mutation of R124H ) Is an autosomal dominant disease. The TGFBI gene is a mutagenic transduction-induced gene protein that is a major component of corneal deposits composed of amyloid in hyaline and lattic deposits in the accumulated protein, granular deposits. It encodes the (TGFBIp) 1. As people get older, corneal deposition causes severe impairment of visual acuity and many surgeries 2 , including phototherapeutic keratectomy (PTK), deep anterior lamellar keratoplasty (DALK), and penetrating keratoplasty (PKP) ) Have been developed to solve the problem. However, although the surgical procedures described above have achieved excellent vision correction, the cornea recurs after years or even decades as GCD2 is a genetic disease. Therefore, studies to prevent the progression of existing corneal deposition and the synthesis of newly formed corneal deposition are the most important steps for treating corneal dystrophies.

비타민 D3는 지방-용해성 스테로이드 호르몬의 하나로, 주로 피부로부터 합성되고, 일부는 음식물로부터 섭취된다. 비타민 D3의 활성 형태인 1,25(OH)2D3(1,25-dihydroxyvitamin D3)는 인체 내에 대부분의 곳에서(ubiquitously) 존재하는 핵내 스테로이드 수용체인 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 생리학적 기능을 수행한다. 비타민 D3가 VDR에 결합한 후, VDR은 레티노이드-x 수용체-(RXR-)와 호모다이머 또는 헤테로 다이머를 형성하고 상기 복합체는 목표 유전자의 전사 레벨을 조절한다3 , 4. 인간의 정상 눈에서 VDR에 대한 면역조직화학적 염색 분석을 통해, VDR이 모양체(ciliary body), 망막(retina), 수정체(lens) 뿐 아니라 각막 상피세포 및 각막 내피세포에서 정상적으로 발현된다는 것이 확인되었다5. 최근에, Yin 등은 비타민 D3 전구체인 25(OH)D3(25-hydrioxyvitamin D) 또는 1,25(OH)2D3, 그리고 상기 분자들의 전환 효소인 1-하이드록실라제를 가토 눈의 전방(anterior chamber)에서 동정하였음을 보고하였다6.Vitamin D3 is a fat-soluble steroid hormone that is synthesized primarily from the skin and partly taken from food. Of 1,25 (OH) 2 D 3 active form of vitamin D3 (1,25-dihydroxyvitamin D3) is a vitamin D receptor (vitamin D receptor, VDR) a nuclear steroid receptors that are present in most places (ubiquitously) in the body To perform physiological functions. After vitamin D3 binds to VDR, VDR forms a homodimer or heterodimer with the retinoid-x receptor- (RXR-) and the complex modulates the transcription level of the target gene 3 , 4 . Immunohistochemical staining for VDR in normal human eyes has confirmed that VDR is normally expressed in corneal epithelial cells and corneal endothelial cells as well as in the ciliary body, retina, and lens [ 5] . Recently, Yin et al. Have reported that vitamin D3 precursor 25 (OH) D3 (25-hydrioxyvitamin D) or 1,25 (OH) 2 D 3 and 1-hydroxylase, It reported that they have identified in (anterior chamber) 6.

비타민 D3는 건강한 눈을 위해 다양한 기능을 수행한다. 비타민 D3는 슈도모나스 애루지노사가 콜로니화된 인간 각막상피세포에서 전-염증성 사이토카인인 인터루이킨(IL)-1, IL-6 및 IL-8의 레벨을 감소시켰으며7, 상피투과 저항성(transepithelial resistance)의 증가를 통한 상피 장벽 기능(epithelial barrier function)을 향상시켰다. 또한, 비타민 D3는 인간 각막상피세포에서 이눌린 투과성(inuline permeability)을 감소시켰고, 오클루딘(occludin) 레벨을 증가시켰다6. 생체 내 연구에서도, 비타민 D3는 각막 봉합(corneal suture)에 의해 유도된 랑게르한스 세포 이동의 감소8, 형질전환 쥐의 레티노블라스토마에서 신생혈관형성(anti-neovascularization) 억제 효과9 및 노화된 (aged) 마우스에서 추체(cone)-매개 망막 기능의 향상된 효과10를 나타냈다. 하지만, TGFBI-관계된 각막이상증에 대한 비타민 D3의 잠재적인 치료 효과는 아직까지 확립되지 않았다.
Vitamin D3 performs a variety of functions for healthy eyes. Vitamin D3 reduced the levels of interleukin (IL) -1, IL-6 and IL-8, which are pro-inflammatory cytokines in colony-bound human corneal epithelial cells, and 7 , epithelial permeability transepithelial resistance) to improve the epithelial barrier function. Vitamin D3 also reduced inuline permeability and increased occludin levels in human corneal epithelial cells 6 . In vivo studies, vitamin D3 has also been shown to reduce corneal suture-induced Langerhans cell migration 8 , to inhibit anti-neovascularization 9 and aged in retinoblastoma of transgenic mice, Mice showed an enhanced effect of cone-mediated retinal function 10 . However, the potential therapeutic effect of vitamin D3 on TGFBI-associated corneal dystrophy has not yet been established.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 유전성 난치성 질환인 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 비타민 D3를 투여한 경우, 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have found that a hereditary refractory disease, TGFBI And to develop a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of genetic mutation corneal dystrophy. As a result, when vitamin D3 was administered, expression of TGFBIp in normal cells and GCD2 cells (preferably, corneal fibroblasts or corneal epithelial cells) via vitamin D receptor (VDR) And the accumulation of mutated TGFBI protein accumulated in the cells can be effectively prevented. Thus, the present invention has been completed.

따라서 본 발명의 목적은 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising TGFB1 And a pharmaceutical composition for preventing or treating genetic mutation corneal dystrophy.

본 발명의 다른 목적은 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting TGFB1 And a method for screening for a therapeutic or therapeutic agent for genetic mutation keratoderma.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 TGFBI(TGF-β-induced gene) 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of TGF-beta-induced gene (GIF) mutant corneal dystrophy comprising vitamin D3 as an active ingredient.

본 발명자들은 유전성 난치성 질환인 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 비타민 D3를 투여한 경우, 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방할 수 있다는 것을 발견하였다.The present inventors have found that a hereditary refractory disease, TGFBI And to develop a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of genetic mutation corneal dystrophy. As a result, when vitamin D3 was administered, expression of TGFBIp in normal cells and GCD2 cells (preferably, corneal fibroblasts or corneal epithelial cells) via vitamin D receptor (VDR) And that the accumulation of mutant TGFBI protein accumulated in the cells can be effectively prevented.

TGFBI 유전자는, 분비 신호 및 인테그린의 리간드 인식 부위로서 작용하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 모티브를 포함하는 683개의 아미노산으로 구성된 단백질을 인코딩하는 유전자인데, 이 유전자에 변이가 생겨 변이 TGFBI 단백질이 생성되는 경우 다양한 타입의 각막이상증이 발병하게 된다. TGFBI 단백질은 인테그린과 상호작용하여 세포 부착 및 이동을 매개하는 세포 외 기질(ECM) 요소이다. TGFBI The gene is a gene encoding a protein consisting of 683 amino acids including an Arg-Gly-Asp (RGD) motif that acts as a secretory signal and a ligand recognition site for integrins. Mutation causes a mutation in the TGFBI protein There are various types of corneal dystrophies. TGFBI protein is an extracellular matrix (ECM) element that interacts with integrins to mediate cell attachment and migration.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되어 발생한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the TGFBI Genetic mutation keratopathy occurs when mutated TGFBI protein accumulates in the cornea.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 TGFBI 유전자 변이로 인한 각막이상증은 유전자 변이 종류/위치에 따라 아벨리노(Avellino type) 각막이상증, 라이스-뷔클러(Reis-Bucklers type) 각막이상증, 격자(lattice type) 각막이상증, 과립(granular type) 각막이상증, 티엘-벵케(Thiel-Behnke type) 각막이상증, 상피기저막(epithelial basement membrane) 각막이상증 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 아벨리노(Avellino type) 각막이상증이다.According to a preferred embodiment of the present invention, TGFBI Corneal dystrophy caused by genetic mutation may be caused by various types of genetic mutation such as Avellino type corneal dystrophy, Reis-Bucklers type corneal dystrophy, lattice type corneal dystrophy, granular type cornea Thiel-Behnke type corneal dystrophy, epithelial basement membrane corneal dystrophy, and the like, but are not limited thereto. Most preferably, the TGFBI Gene variant corneal dystrophy is Avellino type corneal dystrophy.

상술한 각막이상증들은 TGFBI 단백질의 아미노산 서열 중 변이가 생긴 위치에 따라 다양한 표현형을 나타내는 관계로 상기와 같이 분류된 것이지만, 단백질의 형태(conformation) 변화로 인해 변이 TGFBI 단백질이 정상적으로 분비 또는 분해되지 못하여 각막에 축적되어 발생하는 질병이라는 점에서 그 발병 원인이 동일하다.The corneal dystrophies described above are classified as described above because they exhibit various phenotypes depending on the position of the mutation in the amino acid sequence of the TGFBI protein. However, since the mutated TGFBI protein is not normally secreted or degraded due to the change in protein conformation, And the cause of the disease is the same.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, TGFBI 유전자 변이 각막 이상증을 일으키는 상기 변이 TGFBI 단백질은 정상 TGFBI 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 R124H, R124C, R555W, R555Q, I522N, N544S, M619K, F547S, A546D, V625D, G623D, V505D, P551Q, L558P, V624M, H626P, L173P, H572R, T538P, H572del, L527R, L569R, H626R, R124L, T125del, E126del 및 R124S로 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 아미노산 변이에 있어서, 상기 R124H는 정상 TGFBI 단백질을 구성하는 아미노산 중 124번째 아르기닌이 히스티딘으로 변이가 일어난 것을 의미하고, 상기 R124C는 124번째 아르기닌이 시스티딘으로 변이가 일어난 것을 말하며, 상기 R555W는 555번째 아르기닌이 트립토판으로 변이된 것을 말한다. 나머지도 상기 설명한 것과 동일한 규칙으로 각 아미노산의 변이를 나타낸다. 또한, 상기 H572del는 572번째 히스티딘이 결여된 것을, 상기 T125del는 125번째 트레오닌이 결여된 것을 의미한다. 상기 아미노산의 변이 이외에도 지금까지 총 38개의 다른 TGFBI 유전자 변이가 보고되고 있으며, 이들 모두는 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되는 유전적 소인의 안과적 난치성 질환이라는 점에서 발병원인이 공통된다.According to a preferred embodiment of the present invention, TGFBI The mutant TGFBI protein causing the mutated corneal dystrophy is a protein having the amino acid sequence of R124H, R124C, R555W, R555Q, I522N, N544S, M619K, F547S, A546D, V625D, G623D, V505D, P551Q, L558P, V624M, But are not limited to, one or more amino acid mutations selected from H626P, L173P, H572R, T538P, H572del, L527R, L569R, H626R, R124L, T125del, E126del and R124S. In the amino acid mutation, R124H means that the 124th arginine of the amino acid constituting the normal TGFBI protein is mutated to histidine, R124C means that the 124th arginine is mutated to cystidine, and R555W means 555 Arginine is converted to tryptophan. The remainder also show the mutation of each amino acid by the same rule as described above. In addition, the H572del lacks the 572th histidine, and the T125del indicates that the 125th threonine is absent. In addition to the above amino acid mutations, a total of 38 different TGFBI Genetic mutations have been reported, and all of them are common causes of the disease in that the mutant TGFBI protein is an ophthalmologic refractory disease of genetic predisposition accumulated in the cornea.

본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 전사 레벨(mRNA)에서 효과적으로 억제하여, 단백질 레벨도 효과적으로 억제함으로써 TGFBI 유전자 변이 각막이상증을 예방 또는 치료한다는 점에 그 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은, TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 표현형 또는 유전자 내 변이가 발생한 위치를 불문하고, 변이형 TGFBI 단백질이 발현되고 각막에 축적되어 발병하는 것이라면 제한 없이 그 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 지금까지 보고된 총 38개의 TGFBI 유전자 변이 이외에 장래에 보고될 새로운 TGFBI 유전자 변이로 인한 각막이상증이라고 하여도, 그것이 변이 TGFBI 단백질이 발현되고 각막에 축적되어 발병하는 것인 한, 본 발명의 대상 질병의 범위에 속한다고 할 것이다.The TGFBI The pharmaceutical composition for the prevention or treatment of genetic mutation corneal dystrophy effectively inhibits the expression of the mutant TGFBI protein at the transcription level (mRNA) and effectively inhibits the protein level, thereby inhibiting TGFBI It is characterized by the prevention or treatment of genetic mutation corneal dystrophy. Accordingly, the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition comprising TGFBI Regardless of the phenotype of gene mutation corneal dystrophy or where the mutation occurs in the gene, the mutated TGFBI protein can be used for prevention or treatment without limitation, if it is expressed and accumulated in the cornea. Similarly, in addition to a total of 38 TGFBI gene mutations reported so far, new TGFBI Even if corneal dystrophy due to gene mutation, it is said that it belongs to the scope of the disease of the present invention as long as the mutant TGFBI protein is expressed and accumulated in the cornea.

본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 비타민 D3는 전사 수준에서의 조절을 통하여 TGFBIp 발현을 억제하는 기능을 가진다. 본 발명자들은 비타민 D3가 정상세포 및 각막이상증 환자(바람직하게는, GCD2 환자)의 세포에서 TGFBIp의 발현을 mRNA 및 단백질 발현 레벨에서 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다(참고: 도 1).The vitamin D3 used as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention has a function of inhibiting TGFBIp expression through regulation at the transcription level. The present inventors have confirmed that vitamin D3 effectively inhibits the expression of TGFBIp in mRNA and protein expression levels in cells of normal cells and corneal dystrophy patients (preferably, GCD2 patients) (see FIG. 1).

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 비타민 D3는 돌연변이 형질전환--유도된 단백질(TGFBIp)의 발현을 mRNA 레벨 및 단백질 레벨에서 하향-조절(down-regulation)한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the vitamin D3 of the present invention down-regulates the expression of a mutant transforming-induced protein (TGFBIp) at mRNA and protein levels.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에 의한 TGFBIp의 하향-조절은 비타민 D 수용체(VDR)를 통해 이루어진다. 본 발명자들은 비타민 D3에 의한 TGFBIp의 하향-조절에 있어서 VDR의 존재가 필수적으로 필요하다는 사실을 발견하였다(참고: 도 3). VDR을 억제하는 경우(바람직하게는, VDR shRNA), 비타민 D3를 처리하여도 TGFBIp의 발현을 억제하지 못하였다. 따라서, 비타민 D3의 활성을 위해 VDR의 발현이 필수적으로 필요하며, 사람의 각막섬유아세포와 각막상피세포에는 VDR이 발현된다. According to a preferred embodiment of the invention, the down-regulation of TGFBIp by the pharmaceutical composition of the invention is via the vitamin D receptor (VDR). The inventors have found that the presence of VDR is essential in the down-regulation of TGFBIp by vitamin D3 (see Figure 3). Inhibition of VDR (preferably, VDR shRNA) did not inhibit the expression of TGFBIp by treatment with vitamin D3. Therefore, expression of VDR is essential for the activity of vitamin D3, and VDR is expressed in human corneal fibroblasts and corneal epithelial cells.

본 발명에서 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 억제시키는 데 이용될 수 있다. 통상적으로, shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다. 또한, shRNA는 식물 및 다른 시스템에서도 이용될 수 있으며 U6 프로모터가 반드시 필요한 것은 아니다. 식물의 경우에는 매우 강력한 연속적인 발현 능력을 보유한 전통적인 프로모터인 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터가 이용될 수 있다.As used herein, the term "shRNA (small hairpin RNA or short hairpin RNA)" refers to a sequence of RNA that makes a firm hairpin turn, which can be used to inhibit gene expression through RNA interference. Typically, shRNA uses a vector for cell introduction and mainly uses a U6 promoter capable of expressing shRNA. These vectors are always transferred to daughter cells, allowing genetic silencing to be inherited. The shRNA hairpin structure is degraded into an intracellular machinery siRNA and bound to an RNA-induced silencing complex. The above-described complex binds to and degrades mRNA matched to the siRNA bound thereto. shRNAs are transcribed by RNA polymerase III, and production of shRNAs in mammalian cells may cause interferon responses as cells recognize shRNA as a viral attack and find defensive means. In addition, shRNAs can also be used in plants and other systems, and the U6 promoter is not necessary. In the case of plants, the CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S promoter, which is a conventional promoter having a very strong continuous expression ability, can be used.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention is one that is commonly used in the present invention and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and preparations are described in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다. 바람직하게는, 안구에 직접 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and parenteral administration includes intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and the like. Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered directly to the eye.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 병용되는 약물, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 비타민 D3를 기준으로 1일 당 0.0001 ng/kg(체중) 내지 10 mg/kg(체중)이다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention include formulation methods, mode of administration, age, body weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate, drugs used in combination It can be prescribed in various ways, such as factors such as excretion rate and response sensitivity. Preferably, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001 ng / kg (body weight) to 10 mg / kg (body weight) per day based on vitamin D3.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 각막세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 세포 내 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR) 및 TGFBIp의 발현을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 비타민 D 수용체를 통해 TGFBIp의 발현을 억제시키면 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제로 판단한다.According to another aspect of the invention, the invention comprises the following stepsTGFBI A method for screening a genetically modified corneal dystrophy prophylactic or therapeutic agent is provided: (a) treating a test substance with corneal cells; And (b) analyzing the expression of vitamin D receptor (VDR) and TGFBIp in the cell, wherein the test substance inhibits the expression of TGFBIp through the vitamin D receptor.TGFBI Genetic mutations are considered a preventive or therapeutic agent for corneal dystrophy.

본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법은 상술한 약제학적 조성물과 대상 질병을 공통으로 하기 때문에, 상기 약제학적 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.The TGFBI The method of screening for a preventive or therapeutic agent for a genetically modified corneal dystrophy is common to the above-mentioned pharmaceutical composition and the target disease, so that the contents common to the pharmaceutical composition are omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification .

본 발명자들은 TGFBIp의 발현을 억제하는 활성성분으로서, 비타민 D3가 비타민 D 수용체를 통해 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 각막 혼탁을 유발하는 주요 구성성분인 TGFBIp의 발현을 강력하게 억제한다는 사실을 최초로 밝혀내었다. 또한, 비타민 D3의 처리는 TGF- 시그널링에 중요한 Smad3의 인산화를 현저하게 억제하였는데(참고: 도 2 및 도 5), 이는 비타민 D3가 TGF- 신호 경로의 억제를 유도하여 TGFBIp의 발현을 감소시킨다는 것을 의미한다. 따라서, 비타민 D3가 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 후보물질로서의 가능성이 있으며, 이의 활성에 중요한 비타민 D 수용체를 통해 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 후보물질 스크리닝 방법으로의 적용 가능성을 제안한다.The present inventors have for the first time discovered that vitamin D3 strongly inhibits the expression of TGFBIp, which is a major component of corneal opacity of TGFBI- mutant corneal dystrophy, through the vitamin D receptor as an active ingredient that inhibits the expression of TGFBIp. In addition, the treatment of vitamin D3 markedly inhibited the phosphorylation of Smad3, which is important for TGF-signaling (see Figures 2 and 5), suggesting that vitamin D3 induces inhibition of the TGF-signal pathway and reduces expression of TGFBIp it means. Thus, when vitamin D3 is a TGFBI It has potential as a candidate substance for the prevention or treatment of genetic mutation corneal dystrophy and it is possible to use TGFBI Suggesting the possibility of application to screening candidate substances for the prevention or treatment of genetic mutation corneal dystrophy.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 비타민 D 수용체의 양 또는 활성(예를 들어, 비타민 D3와의 결합 친화도 증가)을 분석하고 이의 결과로서 TGFBIp의 발현을 분석하는 단계로, 세포 내 VDR의 양 또는 활성 분석은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예컨대 분광분석법, 색도분석법, MTT 분석법, 커플 분석법, 형광분석법, 열량측정법, 화학발광법, 웨스턴 블롯팅, 광산란법, 방사능 분석법 및 크로마토그래피 분석법 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
In the screening method of the present invention, the step (b) is a step of analyzing the amount or activity of the vitamin D receptor (for example, increasing the binding affinity with vitamin D3) and analyzing the expression of TGFBIp as a result thereof. The amount or activity of the VDR can be analyzed by various methods known in the art and can be performed by various methods known in the art such as spectroscopic analysis, chromaticity analysis, MTT analysis, couple analysis, fluorescence analysis, calorimetry, chemiluminescence, Western blotting, Methods, methods of radioactivity and chromatographic methods, and the like.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.(a) the present invention TGFBI containing vitamin D3 as an active ingredient The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating genetic mutation keratoderma.

(b) 본 발명의 약제학적 조성물은 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 및 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방 또는 억제할 수 있으므로 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.
(b) The pharmaceutical composition of the present invention inhibits the expression of TGFBIp in normal cells and GCD2 cells (preferably corneal fibroblasts or corneal epithelial cells) through vitamin D receptors (VDR) at mRNA and protein levels The TGFBI gene mutation is highly effective in the prevention and treatment of corneal dystrophy since it can efficiently prevent or suppress the accumulation of accumulated mutant TGFBI protein in the cell.

도 1은 정상 HCF 및 GCD2 HCF에서 형질전환 성장인자 β-유도된 유전자 단백질(TGFBIp)의 발현 상에 비타민 D3의 농도- 및 시간-의존적 억제 효과를 보여주는 결과이다. 세포에 비타민 D3를 지정된 농도로 12시간 동안 처리하거나(도 1A 및 도 1B) 또는 다양한 시간 동안 10-7 M 또는 10-8 M의 비타민 D3를 처리하였다(도 1C 및 도 1D). TGFBIp의 발현은 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. TGFBI mRNA 레벨은 RT-PCR로 분석하였다(도 1E). 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다. *대조군과 비교하여 p < 0.05; 및 **대조군과 비교하여 p < 0.01.
도 2는 정상 각막 섬유아세포에서 TGF-β-유도된 형질전환 성장인자 β-유도된 단백질(TGFBIp) 및 Smad3 인산화 상에 비타민 D3의 억제 효과를 보여주는 결과이다. 세포에 지정된 농도의 비타민 D3를 12시간 동안 전처리하고 이후 TGF-1(2 ng/ml)을 6시간 동안 처리하였다. TGFBIp의 발현 및 Smad3 인산화를 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다(도 2B 및 도 2C). *TGF-β1과 비교하여 p < 0.05.
도 3은 비타민 D3가 비타민 D 수용체를 통해 TGFBIp의 발현을 억제한다는 것을 보여주는 결과이다. 도 3A는 정상 인간 각막 섬유아세포(HCF) 및 GCD2 HCF에서 비타민 D 수용체(VDR)의 공초점 현미경의 면역형광이미지를 보여준다. 세포가 고정된 후 항-VDR 항체로 면역염색되었다. 도 3B는 VDR 넉-다운이 비타민 D3-유도된 TGFBIp의 하향-조절을 약화시킨다는 것을 나타내는 결과이다. 도 3C는 VDR의 넉-다운을 확인한 결과이다. 정상 HCF에 VDR shRNA 및 shRNA 대조군을 트랜스펙션시켰다. 도 3D는 상기 형질전환된 세포에 비타민 D3를 12시간 동안 처리하거나 또는 처리하지 않고 반응시킨 후 TGFBIp의 발현을 조사한 결과이다. 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다(도 3D). *대조군과 비교하여 p < 0.05.
도 4는 비타민 D3가 세포 증식을 억제하지 않는다는 것을 보여주는 결과이다(각 실험 회수; n=3). 세포 증식 연구는 다양한 농도의 비타민 D3가 48시간 동안 처리된 인간 각막 섬유아세포주(HCF) 및 동형 제2형 과립형 각막이상증(GCD2) HCF에서 실시하였다. 세포 생존율은 대조군 시료의 세포 생존율에 대한 백분율로 표시된다. 모든 p값은 대조군과 비교하여 > 0.05였다.
도 5는 인간 각막 상피세포주에서 TGFBIp의 발현 상에 비타민 D3의 억제 효과를 보여주는 결과이다. 세포가 지정된 농도의 비타민 D3와 12시간 동안 반응되었으며(도 5A 및 도 5B), 비타민 D3는 TGFBIp의 발현을 농도-의존적으로 억제하였다(도 5C). TGFBI mRNA 레벨은 RT-PCR로 분석하였다. 도 5D, 세포에 지정된 농도의 비타민 D3를 12시간 동안 전처리한 후, TGF-β1(2 ng/ml)을 6시간 동안 처리하였다. TGFBIp의 발현 및 Smad3 인산화는 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다(도 5B). *TGF-β1 단독과 비교하여 p < 0.05.Figure 1 shows the concentration- and time-dependent inhibitory effect of vitamin D3 on the expression of the transforming growth factor beta -induced gene protein (TGFBIp) in normal HCF and GCD2 HCF. Cells were treated with vitamin D3 at the indicated concentrations for 12 hours (FIGS. 1A and 1B) or 10 -7 M or 10 -8 M vitamin D3 for various times (FIG. 1C and FIG. 1D). Expression of TGFBIp was analyzed by Western blotting. TGFBI mRNA levels were analyzed by RT-PCR (Fig. 1E). The results (mean ± SD) are representative of three independent repeat experiments in each experiment. * P < 0.05 compared to control group; And ** p < 0.01 compared to control.
Figure 2 shows the inhibitory effect of vitamin D3 on TGF-? -Induced transforming growth factor? -Induced protein (TGFBIp) and Smad3 phosphorylation in normal corneal fibroblasts. Cells were pretreated with the indicated concentrations of vitamin D3 for 12 h and then treated with TGF-1 (2 ng / ml) for 6 h. Expression of TGFBIp and Smad3 phosphorylation were analyzed by western blotting. Results (mean ± SD) are representative of three independent iterative experiments in each experiment (Figure 2B and Figure 2C). * P <0.05 compared to TGF-β1.
Figure 3 shows that vitamin D3 inhibits the expression of TGFBIp through the vitamin D receptor. Figure 3A shows an immunofluorescence image of a confocal microscope of the vitamin D receptor (VDR) in normal human corneal fibroblasts (HCF) and GCD2 HCF. The cells were immobilized and immunostained with anti-VDR antibody. Figure 3B shows that VDR knockdown attenuates down-regulation of vitamin D3-induced TGFBIp. FIG. 3C shows the result of checking the knockdown of the VDR. Normal HCF was transfected with VDR shRNA and shRNA control. FIG. 3D shows the result of TGFBIp expression after the transformed cells were treated with or without vitamin D3 treatment for 12 hours. The results (mean ± SD) are representative of three independent iterative experiments in each experiment (Figure 3D). * P <0.05 compared to control.
Figure 4 shows that vitamin D3 does not inhibit cell proliferation (number of experiments; n = 3). Cell proliferation studies were performed on human corneal fibroblast cell line (HCF) and type 2 granulosa corneal dystrophy (GCD2) HCF treated with various concentrations of vitamin D3 for 48 hours. Cell viability is expressed as a percentage of the cell survival rate of the control sample. All p values were> 0.05 compared to the control.
Figure 5 shows the inhibitory effect of vitamin D3 on the expression of TGFBIp in human corneal epithelial cell lines. Cells were reacted with a designated concentration of vitamin D3 for 12 hours (Figs. 5A and 5B), and vitamin D3 inhibited the expression of TGFBIp in a concentration-dependent manner (Fig. 5C). TGFBI mRNA levels were analyzed by RT-PCR. 5D, cells were pretreated with vitamin D3 at a designated concentration for 12 hours and treated with TGF-beta 1 (2 ng / ml) for 6 hours. Expression of TGFBIp and Smad3 phosphorylation were analyzed by western blotting. Results (mean ± SD) are representative of three independent iterative experiments in each experiment (Figure 5B). * P <0.05 compared to TGF-β1 alone.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시 예Example

실험방법Experimental Method

시약reagent

비타민 D3, 1α,25-디하이드록시비타민 D3(1,25(OH)2D3)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO)로부터 구매하여 100% 에탄올에 용해시켰다. 배지 내 에탄올의 최종 농도는 0.1%였으며, 0.1% 에탄올이 운반체 대조군(vehicle control)으로서 사용되었다. 비타민 D3 저장 용액은 80에 저장하고 사용 전에 다양한 농도(10-11 M부터 10-7 M까지)의 비타민 D3가 각 실험시에 매번 희석되었다. 재조합 TGF-β1은 R&D Systems(Minneapolis, MI)로부터 구매하였다.
Vitamin D3, 1?, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25 (OH) 2 D 3 ) was purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO) and dissolved in 100% ethanol. The final concentration of ethanol in the medium was 0.1%, and 0.1% ethanol was used as the vehicle control. Vitamin D3 stock solution was stored at 80 and vitamin D3 at various concentrations (10 -11 M to 10 -7 M) was diluted each time before each use. Recombinant TGF-β1 was purchased from R & D Systems (Minneapolis, MI).

세포주 및 배양Cell line and culture

세포는 10% 우태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)에서 95% 공기 및 5% CO2를 포함하는 습도 유진된 배양기에서 37℃로 배양되었다. 인간 각막 섬유아세포주는 James V. Jester 박사(University of California, Irvine, CA)에 의해 제공되었다11. SV40-불멸화된 인간 각막 상피세포주(HCE)12는 교토부립의과대학(Kyoto Prefectural University of Medicine; Kamigyo, Kyoto, Japan)의 Shigeru Kinoshita 박사에 의해 제공되었다. GCD2 동형접합자(homozygous) 각막 섬유아세포는 공지된 방법13을 이용하여 얻었다. 간략하게는, 각막이식술(keratoplasty)을 위한 각막 이식편(corneal button)의 제거 후 GCD2 환자의 원형절제된(trephined) 각막 이식편을 수거하여 초기 패시지 세포(패시지 2)가 세포주를 위해 구축되었다. GCD2 각막 섬유아세포주는 인간 텔로머라제(hTERT)의 활성 서브유니트를 인코딩하는 자가-불활성화된 렌티 바이러스 컨스트럭트(LVP105; GenTarget)를 이용하여 제조하였다. GCD2는 TGFBI 유전자의 R124H 돌연변이 확인용 DNA 분석을 통해 진단되었다. 공여자 비밀성(donor confidentiality)은 헬싱키 선언에 부합하도록 유지되었으며 본 연구의 수행은 연세대학교 세브란스 임상연구심의위원회(Severance Hospital IRB Committee (4-2010-0013), Yonsei University)에 의해 승인되었다.
Cells were incubated at 37 ° C in a humidified incubator containing 95% air and 5% CO 2 in Dulbeccos modified Eagles medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin. Human corneal fibroblasts were provided by Dr. James V. Jester (University of California, Irvine, Calif.) 11 . SV40-immortalized human corneal epithelial cell line (HCE) 12 was provided by Dr. Shigeru Kinoshita of the Kyoto Prefectural University of Medicine (Kamigyo, Kyoto, Japan). GCD2 homozygous corneal fibroblasts were obtained using known method 13 . Briefly, after removal of the corneal button for keratoplasty, the first passaged cell (passage 2) was constructed for the cell line by collecting the trephined keratoplasty of the GCD2 patient. GCD2 corneal fibroblast cells were prepared using a self-inactivated lentiviral construct (LVP105; GenTarget) encoding the active subunit of human telomerase (hTERT). GCD2 was diagnosed by DNA analysis for the R124H mutation confirmation of the TGFBI gene. The donor confidentiality was maintained in accordance with the Helsinki Declaration and the conduct of this study was approved by the Severance Hospital IRB Committee (4-2010-0013), Yonsei University.

렌티 바이러스 입자의 감염Infection of lentiviral particles

제조사의 프로토콜에 따라 VDR shRNA(Cat. No. sc-106692-V; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) 또는 대조군 shRNA(Cat. No. sc-108065, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)을 타겟팅하는 shRNA을 발현하는 렌티 바이러스를 정상 각막 섬유아세포에 감염시켰다. 안정적인 세포주는 3 ㎍/ml의 퓨로마이신(Invitrogen, San Diego, CA)에 의해 선택되었으며 배지는 2일에 한번씩 신선하게 교체하였다. VDR의 감소(knockdown)는 웨스턴 블랏 분석을 통해 모니터링되었다.
Targeted VDR shRNA (Cat. No. sc-106692-V; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) or control shRNA (Cat. No. sc-108065, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) according to the manufacturer's protocol The lentiviruses expressing shRNAs were infected with normal corneal fibroblasts. The stable cell line was selected by 3 ug / ml of puromycin (Invitrogen, San Diego, CA) and the medium was freshly replaced every 2 days. The knockdown of VDR was monitored by Western blot analysis.

단백질 추출 및 면역블롯팅 분석Protein extraction and immunoblotting analysis

세포는 50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜레이트(deoxycholate) 및 0.1% SDS를 포함하는 RIPA 완충액(방사성면역침전어세이 완충액), 프로테아제 억제제 칵테일(Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Cat. no. 1836170; Roche, Indianapolis, IN) 및 포스파타제 억제제들(PhosSTOP, Cat. no. 04906845001; Roche, Indianapolis, IN)로 용해시켰다. 세포내 단백질을 4-12% Tris-글라이신 SDS 폴리아크릴아마이드 젤(Cat. No. KG75105; Komabiotech, Seoul, Korea)에서 전기영동시켜 PVDF(Immobilon polyvinylidine difluoride) 막(Millipore Corp., Bedford, MA)으로 옮겼다. 0.1% Tween-20을 포함하는 Tris-완충화된 염 용액(TBS-T) 내 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 블랏킹시킨 후, TBS-T로 세 번에 걸쳐서 세척하고 단일클론 항-TGFBIp(1:300 희석; 김인산 교수, 경북대, 한국), β-액틴(1:5000 희석; Cat. No. A-5441; Sigma-Aldrich), Smad3 및 pSmad3(1:1000 희석; Cat. No. # 9312, # 9320; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 및 VDR(1:500 희석; Cat. No. C-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후 TBS-T로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, HRP-컨쥬게이션된 2차 항체[항-마우스 IgG(1:5000 희석; Cat. No. NA931V) 또는 항-래빗 IgG(1:5000 희석; Cat. No. NA934V, Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드들의 강도는 상응하는 β-액틴 단백질 밴드들에 대한 강도와 비교하여 정량하여 표준화시켰다.
Cells were resuspended in RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer) containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate and 0.1% SDS, (PhosSTOP, Cat. No. 04906845001; Roche, Indianapolis, Ind.) In a cocktail (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Cat. No. 1836170; Roche, Indianapolis, IN) The intracellular proteins were electrophoresed on 4-12% Tris-Glycine SDS polyacrylamide gel (Cat. No. KG75105; Komabiotech, Seoul, Korea) and immobilized on Immobilon polyvinylidine difluoride (PVDF) membrane (Millipore Corp., Bedford, MA) I moved. After blocking for 1 hour at room temperature with 5% skim milk in a Tris-buffered saline solution (TBS-T) containing 0.1% Tween-20, the cells were washed three times with TBS-T and incubated with monoclonal anti-TGFBIp Actin (1: 5000 dilution; Cat. No. A-5441; Sigma-Aldrich), Smad3 and pSmad3 (1: 1000 dilution; Cat. No. # (1: 500 dilution; Cat. No. C-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) overnight at 4 ° C. Mouse IgG (1: 5000 dilution; Cat. No. NA931V) or anti-rabbit IgG (1: 5000 dilution; Cat: Cat. No. NA931V), followed by three washes with TBS-T and then with HRP- conjugated secondary antibody , No. NA934V, Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ) at room temperature for 1 hour. The intensities of the protein bands were standardized by quantitative comparison with the intensity for the corresponding [beta] -actin protein bands.

역-전사 Reverse-warrior PCRPCR (( ReverseReverse -- transcriptasepolymerasetranscriptaseolymerase chainchain reactionreaction ) 분석) analysis

총 RNA는 TRIZOL 시약(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용하여 정제하였다. mRNAs(2 )과 올리고-dT 프라이머를 이용하여 cDNA를 제조한 후, 2 ㎕의 합성된 cDNA가 PCR 반응을 위한 템플레이트로 이용되었다. 인간 TGFBI 및 -액틴을 증폭하기 위한 PCR 프라이머들이 이용되었다14.Total RNA was purified using TRIZOL reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.). After cDNA was prepared using mRNAs (2) and oligo-dT primers, 2 μl of the synthesized cDNA was used as a template for PCR reaction. PCR primers were used to amplify human TGFBI and - actin 14 .

DNA 증폭은 RT-PCR 시스템(2X FR premix, Biomedic Technologies, Seoul, Korea)을 이용하여 실시하였다. PCR은 다음과 같이 실시하였다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 5분; (b) 30 사이클의 증폭 단계로, 한 사이클 당 (i) 변성 단계, 95℃에서 30초, (ii) 어닐링 단계, 57℃에서 30초 및 (iii) 연장 단계, 72℃에서 30초; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 5분. RT-PCR 산물들은 EtBr(ethidium bromide)을 포함하는 1.0% 아가로오스 젤에서 전기영동되어 시각화시켰다.
DNA amplification was performed using an RT-PCR system (2X FR premix, Biomedic Technologies, Seoul, Korea). PCR was carried out as follows: (a) denaturation step, 5 min at 95 &lt; 0 &gt;C; (b) 30 cycles of amplification step (i) denaturation step, 95 ° C for 30 seconds per cycle, (ii) annealing step, 30 seconds at 57 ° C, and (iii) extension step, 72 ° C for 30 seconds; And (c) final extension step, 5 minutes at 72 &lt; 0 &gt; C. RT-PCR products were visualized by electrophoresis on a 1.0% agarose gel containing EtBr (ethidium bromide).

면역형광Immunofluorescence 및  And 공초점Confocal 현미경 microscope

글래스 커버슬립에서 배양된 세포를 PBS로 10분 동안 세척하였다. 이후 세포를 투과화시켜 메탄올로 20에서 5분 동안 고정화시켰다. 고정된 세포를 PBS에 녹여진 10% 소혈청 알부민으로 30분 동안 블랏킹시킨 후, 블랏킹 완충액에 포함된 항-VDR 항체(1:200 희석; Cat. No. C-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, 상기 세포를 Dylight-488(green)-표지된 항-래빗 IgG(1:200 희석; Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 세포를 PBS로 세 번에 걸쳐서 세척하고 Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 마운팅시켰다. VDR 이미지는 Leica TCS SP5 공초점 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 얻었다.
Cells cultured on a glass cover slip were washed with PBS for 10 minutes. The cells were then permeabilized and immobilized with methanol for 20 to 5 minutes. The immobilized cells were blocked with 10% bovine serum albumin dissolved in PBS for 30 minutes, and the anti-VDR antibody (1: 200 dilution; Cat. No. C-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) for 1 hour at room temperature. After washing three times with PBS, the cells were reacted with Dylight-488 (green) -labeled anti-rabbit IgG (1: 200 dilution; Vector Laboratories, Burlingame, Calif.) For 1 hour at room temperature. Cells were then washed three times with PBS and mounted with Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). VDR images were obtained with a Leica TCS SP5 confocal microscope (Leica, Wetzlar, Germany).

세포생존율 Cell survival rate 어세이Assay

세포 생존율(Cell viability)은 MTT 어세이로 측정하였다. 다양한 농도의 비타민 D3와 48시간 동안 반응시킨 후, 5 mg/ml MTT(thiazolyl blue tetrazolium bromide; Cat. No. M5655; Sigma-Aldrich) 저장 용액을 0.5 mg/ml의 농도가 되도록 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. 이후 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 세포는 100% DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. ELISA 판독기(VERSAmax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
Cell viability was measured by MTT assay. After incubation with various concentrations of vitamin D3 for 48 h, 5 mg / ml MTT (thiazolyl blue tetrazolium bromide; Cat. No. M5655; Sigma-Aldrich) stock solution was added to a 96-well plate Was added to each well. After incubation at 37 ° C for 2 hours, the cells were dissolved in 100% DMSO (dimethyl sulfoxide). Absorbance at 570 nm was measured using an ELISA reader (VERSAmax; Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.).

통계 분석Statistical analysis

통계 분석은 Graph Pad Prism version 4.0(Graph Pad Software Inc, San Diego, CA)로 실시하였다. 시료의 평균값들을 일원배치분산분석(one-way analysis of variance)으로 비교한 후 본페로니 다중비교분석(Bonferroni multiple comparison test)을 실시하였다. P값(< 0.05)이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
Statistical analysis was performed with Graph Pad Prism version 4.0 (Graph Pad Software Inc, San Diego, Calif.). The Bonferroni multiple comparison test was performed after comparing the mean values of the samples with one-way analysis of variance. P value (<0.05) was considered statistically significant.

실험결과Experiment result

비타민 vitamin D3D3 는 각막 섬유아세포에서 In corneal fibroblasts TGFBITGFBI 단백질 및  Protein and mRNAmRNA 발현을 억제한다 Suppress expression

비타민 D3가 TGFBI 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 비타민 D3 처리된 정상인 섬유아세포 및 GCD2 섬유아세포로부터 얻어진 세포 용해물을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 비타민 D3는 농도-의존적(도 1A 및 도 1B) 및 시간-의존적(도 1C 및 도 1D)으로 TGFBIp의 발현을 감소시켰다. 다음으로, 본 발명자들은 비타민 D3의 상기 억제 효과가 TGFBI mRNA 발현 상에 어떠한 영향을 미치는 지 조사하였다. RT-PCR 분석 결과, 본 발명자들은 비타민 D3의 12시간 처리는 농도-의존적으로 TGFBI mRNA 발현을 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 1E). 상술한 결과들은 비타민 D3의 억제 효과가 전사 레벨에서 기능한다는 것을 의미한다.
To investigate the effect of vitamin D3 on the expression of TGFBI protein, we performed Western blot analysis using cell lysate obtained from vitamin D3-treated normal fibroblasts and GCD2 fibroblasts. Vitamin D3 reduced the expression of TGFBIp in a concentration-dependent manner (FIGS. 1A and 1B) and time-dependent (FIG. 1C and FIG. 1D). Next, the present inventors investigated how the inhibitory effect of vitamin D3 affects the expression of TGFBI mRNA. As a result of RT-PCR analysis, the present inventors confirmed that treatment with vitamin D3 for 12 hours decreased TGFBI mRNA expression in a concentration-dependent manner (FIG. 1E). The above results indicate that the inhibitory effect of vitamin D3 functions at transcriptional level.

각막 섬유아세포에서 In corneal fibroblasts TGFTGF -1-유도된 -1-induced TGFBIpTGFBIp 발현 및  Expression and Smad3Smad3 인산화에 대한 비타민  Vitamins for phosphorylation D3D3 의 억제 효과The inhibitory effect of

본 발명자들은 이전에 TGF-β 처리된 정상 1차 인간 각막 섬유아세포에서 TGFBIp 발현을 상향-조절시킨다는 것을 보고14하였기 때문에, HCF 세포에 TGF-β1(2 ng/ml)의 6시간 처리는 대조군과 비교하여 TGFBIp의 발현을 현저하게 증가시켰으며, 비타민 D3의 12시간 전처리는 상기 증가 효과를 농도-의존적으로 차단하였다(도 2A 및 도 2B; 10-7 M 처리구에서 최대 억제 효과를 나타냄).The present inventors have found that up to TGFBIp expressed in human corneal fibroblasts before TGF-β-treated normal primary on-6-time processing of because report 14 that sikindaneun control, TGF-β1 (2 ng / ml) in HCF cell control group and the And 12 hours pretreatment of vitamin D3 blocked the increase effect in a concentration-dependent manner (Figs. 2A and 2B, showing the maximal inhibitory effect at 10 -7 M treatment).

TGFBIp는 Smad 시그널링 경로 내 다운스트림 조절자의 인산화를 통해 생물학적 기능을 나타내기 때문에15, 본 발명자들은 6시간 동안 TGF-β1(2 ng/ml)-처리된 정상 HCF 세포에서 Smad3의 인산화를 측정하였다. 웨스턴 블랏 분석 결과, Smad3 인산화는 TGF-1 처리에 의해 현저하게 유도되었다(도 2C). 한편, 비타민 D3의 12시간 전처리는 총 Smad3 레벨의 변화 없이 Smad3 인산화를 농도-의존적으로 차단하였다(도 2A 및 도 2C).
TGFBIp is because it represents the biological function via phosphorylation party within the downstream control Smad signaling path 15, the inventors have found that TGF-β1 (2 ng / ml ) for 6 hours, was measured the phosphorylation of Smad3 in the treated normal HCF cells. Western blot analysis revealed that Smad3 phosphorylation was significantly induced by TGF-1 treatment (Fig. 2C). On the other hand, pretreatment with vitamin D3 for 12 hours blocked Smad3 phosphorylation in a concentration-dependent manner without changing the total Smad3 level (Fig. 2A and Fig. 2C).

비타민 D 수용체는 각막 섬유아세포에 존재하고 비타민 Vitamin D receptors are present in corneal fibroblasts, D3D3 는 비타민 D 수용체를 통해 Through the vitamin D receptor TGFBIpTGFBIp 의 발현을 하향-조절한다Down-regulation of the expression of &lt; RTI ID = 0.0 &gt;

각막 기질(corneal stroma)에 VDR의 존재 여부에 대한 어떠한 보고도 없었기 때문에, 본 발명자들은 면역세포화학 염색을 이용하여 VDR이 정상 HCF에 존재하는 지 여부를 우선적으로 조사하였다. 공초점 현미경 이미지들을 분석한 결과, 본 발명자들은 VDR이 정상 및 GCD2 HCF에서 정상적으로 발현한다는 것을 확인하였다(도 3A). 다음으로, 본 발명자들은 VDR이 비타민 D3의 억제 효과에 필요한지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 VDR에 대한 shRNA(ShVDR) 및 대조군 ShRNA에 대한 바이러스 발현 컨스트럭트로 HCF 세포를 감염시킨 후, 상기 세포에 10-7 M 비타민 D3를 12시간 동안 처리하여 VDR 및 TGFBIp의 발현을 비교하였다. 웨스턴 블랏 분석을 통해, ShVDR 감염이 임의적 올리고를 발현하는 바이러스로 감염된 세포에서 보여지는 VDR 단백질 레벨과 비교하여 VDR 단백질 레벨을 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 3B 및 도 3C). 비타민 D3를 처리했을 때, VDR 넉-다운 세포에서는 정상 HCF 세포에 처리된 경우와 비교하여 비타민 D3에 의한 TGFBIp의 감소 효과가 약화되었음을 확인하였다(도 3D). 상술한 결과들은 비타민 D3의 억제 효과가 VDR을 통해 이루어진다는 것을 의미한다.
Since there was no report on the presence of VDR in the corneal stroma, we first used immunocytochemistry to determine whether VDR is present in normal HCF. Analysis of confocal microscopy images showed that the VDR was normal and expressed normally in GCD2 HCF (Figure 3A). Next, the present inventors investigated whether VDR is necessary for the inhibitory effect of vitamin D3. After infecting HCF cells with a virus expression construct for shRNA (ShVDR) and control ShRNA against VDR, the cells were treated with 10 -7 M vitamin D3 for 12 hours to compare the expression of VDR and TGFBIp . Western blot analysis confirmed that ShVDR infection reduced VDR protein levels compared to VDR protein levels seen in infected cells with virus expressing arbitrary oligos (FIG. 3B and FIG. 3C). When vitamin D3 was treated, it was confirmed that the effect of reducing vitamin D3-induced TGFBIp was weakened in VDR knockdown cells as compared with the case of treatment with normal HCF cells (FIG. 3D). The above results indicate that the inhibitory effect of vitamin D3 is mediated through VDR.

비타민 vitamin D3D3 는 각막 섬유아세포의 세포 증식에 영향을 미치지 않는다Do not affect cell proliferation of corneal fibroblasts

비타민 D3는 다양한 암세포에서 보고된 바와 같이 강력한 세포증식 억제제로 알려져 있기 때문에16 -18, 본 발명자들은 정상 HCF 및 GCD2 HCF세포에서의 상기 억제 효과가 비타민 D3의 항-증식 효과에 의한 결과인지 여부를 조사하였다. 각기 다른 농도의 비타민 D3(10-11 M부터 10-6 M까지)과 48시간 동안 반응시킨 결과, 정상 HCF 및 GCD2 HCF 세포의 생존율은 전혀 변화가 없었다(도 4). 동일한 농도의 비타민 D3의 보다 짧은 반응시간(6시간 및 12시간)에도 세포 증식은 유의한 차이를 나타내지 않았다(결과를 보이지 않음). 또한, 비타민 D3의 48시간 처리 후 각 세포의 형태는 최대 농도의 처리구(10-7 M)에서 조차 대조군과 비교하여 변함이 없었다(결과를 보이지 않음). 종합해 보면, 비타민 D3의 억제 효과는 세포 증식의 억제로부터 초래되지 않아 상기 결과들은 TGFBI-변이 각막이상증의 치료 시의 비타민 D3가 세포 독성 없이 치료할 수 있는 가능성을 내포한다.
Since vitamin D3 is known to be a potent cell proliferation inhibitor as reported in various cancer cells, 16 -18 , we have investigated whether the inhibitory effect in normal HCF and GCD2 HCF cells is the result of the anti-proliferative effect of vitamin D3 Respectively. As a result of reacting with different concentrations of vitamin D3 (10 -11 M to 10 -6 M) for 48 hours, the survival rates of normal HCF and GCD2 HCF cells were not changed at all (FIG. 4). Cell proliferation did not show any significant difference (results not shown) even at shorter reaction times (6 hours and 12 hours) of the same concentration of vitamin D3. In addition, the morphology of each cell after treatment with vitamin D3 for 48 hours did not change even at the highest concentration (10 -7 M) compared to the control (no results). Taken together, the inhibitory effect of vitamin D3 does not result from the inhibition of cell proliferation, and the above results suggest the possibility that vitamin D3 can be treated without cytotoxicity in the treatment of TGFB1-mutant corneal dystrophy.

비타민 vitamin D3D3 는 인간 각막 상피세포의 Of human corneal epithelial cells TGFBITGFBI 단백질 및  Protein and mRNAmRNA 의 발현도 억제한다Lt; / RTI &gt;

TGFBIp는 각막 상피세포 또는 섬유아세포에서 기원하며, 아직까지는 TGFBIp의 주요 기원이 어느 세포인지가 불명확하기 때문에19 -21, 본 발명자들은 비타민 D3가 인간 각막 상피세포에서도 TGFBIp 발현에 영향을 미치는 지 여부를 조사하였다. 다양한 농도의 비타민 D3의 12시간 처리 후 TGFBIp 및 mRNA 발현을 조사한 결과, 비타민 D3는 각막 상피세포에서 TGFBI의 mRNA 및 단백질 레벨도 농도-의존적으로 감소시켰다(도 5A 내지 도 5C). 또한, HCF 세포의 결과와 동일하게도 비타민 D3는 TGF-β-유도된 TGFBIp 및 Smad3 인산화를 농도-의존적으로 감소시켰다(도 5D). 비타민 D3의 6시간, 12시간 및 48시간 처리에 따른 세포 증식은 대조군의 세포 증식과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다(결과를 보이지 않음). 상술한 결과들은 비타민 D3가 각막 섬유아세포 뿐 아니라 각막 상피세포에서 TGFBI mRNA 및 단백질 레벨 모두를 억제한다는 것을 의미한다.
TGFBIp is whether 19 to 21, the present inventors affecting the vitamin D3 TGFBIp expressed in human corneal epithelial cells due to unclear whether the epithelial cells or fibroblasts originated in and still are the main origin of any cells by TGFBIp Respectively. Investigation of TGFBIp and mRNA expression after treatment with various concentrations of vitamin D3 for 12 hours resulted in a concentration-dependent decrease in TGFBI mRNA and protein levels in corneal epithelial cells in a concentration-dependent manner (Figures 5A-5C). In addition, as with HCF cells, vitamin D3 reduced TGF-? -Induced TGFBIp and Smad3 phosphorylation in a concentration-dependent manner (FIG. 5D). Cell proliferation following treatment with vitamin D3 at 6 hours, 12 hours, and 48 hours did not show any significant difference compared to control cell proliferation (results not shown). The above results indicate that vitamin D3 inhibits both TGFBI mRNA and protein levels in corneal fibroblasts as well as corneal epithelial cells.

추가논의사항Additional discussion

외과적인 수술이 각막 혼탁(corneal opacity)의 재발을 방지할 수는 없기 때문에, GCD2를 포함하는 유전성 TGFBI-변이 각막이상증의 치료에는 예방적인 치료방법을 강구하는 것이 매우 중요하다. 본 발명자들은 비타민 D3가 정상 HCF 세포 및 상피세포 뿐 아니라 GCD2 HCF 세포에서 TGFBI 단백질 또는 mRNA의 발현을 억제한다는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 VDR이 정상 및 GCD2 HCF 세포에서 정상적으로 발현되고 비타민 D3의 억제 효과가 VDR을 통해 이루어진다는 것을 최초로 증명하였다. 비타민 D3가 TGF--유도된 TGFBIp 및 Smad3 인산화를 억제하기 때문에, 본 연구는 비타민 D3의 억제 효과가 정상 HCF 세포 및 상피세포에서 TGF-β 시그널링에 영향을 미침으로써 이루어진다는 것을 증명하였다.Because surgical surgery can not prevent the recurrence of corneal opacity, it is very important to take prophylactic treatment for hereditary TGFBI-mutated corneal dystrophy, including GCD2. The present inventors have observed that vitamin D3 inhibits the expression of TGFBI protein or mRNA in GCD2 HCF cells as well as normal HCF cells and epithelial cells. The inventors first demonstrated that VDR is normally expressed in normal and GCD2 HCF cells and that the inhibitory effect of vitamin D3 is mediated through VDR. Because vitamin D3 inhibits TGF-induced TGFBIp and Smad3 phosphorylation, this study demonstrated that the inhibitory effect of vitamin D3 is mediated by affecting TGF-β signaling in normal HCF and epithelial cells.

비타민 D3는 칼슘 및 뼈 항상성(bone homeostasis)을 유지하는 전통적인 기능24 외에도 연골세포 성장(cartilage chondrocyte growth)의 조절22, 피부의 각질세포의 성장 및 분화 조절23을 포함하는 다양한 생물학적 기능을 수행한다. 또한, 여러 연구에서 비타민 D3가 단독 또는 다른 화학요법제(chemotherapy agents)와의 조합(conjunction) 처리를 통해 전립선암, 유방암 및 대장암을 포함하는 다양한 암에서 항암 효과를 나타낸다는 것을 보고하고 있다. 상술한 효과들은 세포 주기에서 초기 복제 단계인 G0/1기 어레스트에 의한 종양세포 증식의 억제를 통해 나타났다25 -27. 조혈계 암(hematopoietic cancers)에서, 비타민 D3는 종래의 화학요법제에 잘 반응하지 않는 미성숙 종양세포를 분화시킴으로써 보조요법(adjuvant therapy)으로서의 가능성을 보여줬다28 , 29. 하지만, MTT 어세이에서 세포 증식률이 가장 높은 처리 농도(10-6 M)의 비타민 D3에서 조차 90% 이상이었기 때문에, 본 발명자들의 연구에서 비타민 D3의 TGFBIp 발현 억제 효과는 비타민 D3가 세포 증식 중지를 유도하기 때문이 아니었다. 그리고 가장 높은 처리 농도(10-7 M)의 비타민 D3 처리 후 에도 세포의 형태적인 변화들이 전혀 관찰되지 않았다(결과를 보이지 않음). 상술한 결과들은 비타민 D3의 TGFBIp 발현 억제 효과는 비타민 D3의 항-증식 또는 분화 유도 효과, 세포 독성으로부터 야기된 것이 아니라는 것을 의미한다.Vitamin D3 in addition to the traditional function to keep the calcium and bone homeostasis (bone homeostasis) 24 performs a variety of biological functions, including cartilage cell growth regulation 22, the growth and differentiation regulation of skin keratinocytes 23 (cartilage chondrocyte growth). In addition, several studies have reported that vitamin D3 exerts anticancer effects in various cancers including prostate cancer, breast cancer, and colorectal cancer, alone or in conjunction with other chemotherapy agents. The above-described effects are found within the first cloning step in G0 / 1 group inhibition of tumor cell proliferation by eoreseuteu in cell cycle 25-27. In hematopoietic cancers (hematopoietic cancers), vitamin D3 showed a potential as adjuvant therapy (adjuvant therapy) by differentiation of immature tumor cells that do not respond well to conventional chemotherapeutics 28,29. However, since the cell proliferation rate of MTT assay was more than 90% even at the highest concentration (10 -6 M) of vitamin D3, the present inventors' study showed that vitamin D3 inhibited TGFBIp expression, Not to induce. And no morphological changes of the cells were observed after treatment with vitamin D3 at the highest treatment concentration (10 -7 M) (no results). The above results indicate that the inhibitory effect of vitamin D3 on TGFBIp expression is not caused by anti-proliferation or differentiation-inducing effect of vitamin D3 or cytotoxicity.

TGFBIp는 세포 증식, 분화 및 세포외 매트릭스 리모델링을 포함하는 다양한 정상 생리학적 기능들을 조절하는 분비성 세포외 매트릭스 단백질이다30. TGFBIp의 발현 저하는 여러 암의 발생과 관련되어 있는 반면에31 , 32, TGFBIp의 과다발현은 Alb-high3 트랜스제닉 마우스 모델에서 각막 혼탁을 유도하였다33. GCD2 및 다른 TGFBI-연관 각막이상증에서 보여지는 각막 침착은 많은 단백질들의 비정상적 응집 복합체로, 주요 구성성분(compartment)은 돌연변이 TGFBIp이다34. 따라서, TGFBIp 발현을 담당하는 TGF-β 시그널링 경로의 억제는 돌연변이 TGFBIp의 생산을 감소시키는 효과적인 방법일 것이다.TGFBIp is a secreted extracellular matrix proteins that regulate a variety of normal physiological functions including cell proliferation, differentiation and extracellular matrix remodeling 30. Decrease in expression TGFBIp is on the other hand, which is associated with the development of various cancers. 31, 32, and over expression of TGFBIp induced corneal haze in the Alb-high3 transgenic mouse models 33. GCD2 and corneal deposits shown in the other TGFBI- corneal dystrophy is associated with abnormal coagulation complex of many proteins, the main constituent (compartment) is a mutant TGFBIp 34. Thus, inhibition of the TGF-beta signaling pathway responsible for TGFBIp expression would be an effective way to reduce the production of mutant TGFBIp.

Smad 단백질을 통한 TGF-β 시그널링 트랜스덕션 경로의 기작은 잘 알려져 있다3 5 , 36. TGF-β는 제I형 및 제II형 막통과(transmembrane) 세린/트레오닌 수용체들의 어셈블리를 유도하고, 이후 제II형 키나제가 제I형 수용체를 인산화시킨다. 타이로신 키나제 I은 세포내(intracellular) Smad2 및 Smad3을 인산화시키고 세포질에서 핵으로의 이동(translocation) 후에 서로 어셈블리된다. 이후, Smad4와 복합체를 형성하여 TGFBI 또는 타겟 유전자에 결합하여 유전자 발현을 조절한다. Smad3 인산화는 TGF-β 처리에 의해 현저하게 증가되고 Smad3 인산화의 증가는 각막 섬유아세포 및 상피세포 모두에서 비타민 D3 처리에 의해 농도-의존적으로 억제되었다(도 2A, 도 2C 및 도 5D). 상술한 결과들은 인간 자궁 근종(uterine leiomyoma) 세포에서 보고된 이전의 결과들37과 유사하다. 비타민 D3는 인간 자궁 근종의 섬유화와 관계되어 있는 파이브로넥틴, 제1형 콜라겐 및 플라스미노겐 활성인자 억제제-1의 발현을 농도-의존적으로 억제하였고 비타민 D3는 TGF-3-유도된 Smad2 및 Smad3의 핵 내 이동, Smad2의 인산화 및 Smad4 복합체의 형성을 억제하였다. Smad 시그널링 경로는 TGF-β 시그널링 경로의 중요한 전달인자(transductor)이기 때문에, 본 발명자들의 결과는 각막 침착 형성과 관련된 TGF-β-유도된 전사 활성의 조절 상에 비타민 D3가 중요한 기능을 함을 확인시켜 주었다.The mechanism of TGF-β signaling transport production path through the Smad proteins are well known 35, 36. TGF- [beta] induces assembly of Type I and Type II transmembrane serine / threonine receptors, which in turn phosphorylate type I receptors. Tyrosine kinase I phosphorylates intracellular Smad2 and Smad3 and assembles with each other after translocation from the cytoplasm to the nucleus. Then, it forms a complex with Smad4 and binds to TGFBI or a target gene to regulate gene expression. Smad3 phosphorylation was significantly increased by TGF- [beta] treatment and the increase in Smad3 phosphorylation was inhibited by vitamin D3 treatment in both corneal fibroblasts and epithelial cells in a concentration-dependent manner (Figs. 2A, 2C and 5D). The above results are similar to previous results 37 reported in human uterine leiomyoma cells. Vitamin D3 dose-dependently inhibited the expression of fibronectin, type 1 collagen and plasminogen activator inhibitor-1 associated with fibrosis of human uterine myoma, while vitamin D3 inhibited TGF-3 induced Smad2 and Smad3 , The phosphorylation of Smad2 and the formation of Smad4 complex. Since the Smad signaling pathway is an important transducer of the TGF- [beta] signaling pathway, our results confirm that vitamin D3 plays an important role in the regulation of TGF- [beta] -induced transcriptional activity associated with corneal deposition formation .

면역세포화학 염색 및 웨스턴 블롯 분석 결과는 VDR이 정상 및 GCD2 HCF 세포의 핵에서 정상적으로 발현된다는 것을 보여줬다(도 3A 및 도 3B). 비타민 D3가 몇몇 세포에서 VDR-독립적 경로를 통해 기능한다는 몇몇 보고가 있었으나18 , 38, 비타민 D3는 주로 VDR을 통해 생리학적 기능을 수행한다. 본 발명자들은 VDR 넉-다운 세포를 이용하여, 비타민 D3이 인간 각막 섬유아세포에서 VDR을 통해 TGF-β 시그널링 경로에 영향을 줌을 확인하였다. Immunocytochemical staining and western blot analysis showed that VDR was expressed normally in the nuclei of normal and GCD2 HCF cells (Figures 3A and 3B). There have been several reports of vitamin D3 functioning through VDR-independent pathways in some cells, 18 , 38 , vitamin D3, which mainly functions physiologically through VDR. We have used VDR knockdown cells to confirm that vitamin D3 affects the TGF-β signaling pathway through VDR in human corneal fibroblasts.

전방에서 비타민 D3의 활성 농도는 래빗 눈에서 유리체강(vitreous cavity)의 농도보다 더 낮다6. 래빗은 유의한 양의 자외선에 노출되지 않기 때문에 저자들은 대부분의 비타민 D3가 피부로부터 합성되는 것이 아니라 섭취로부터 얻어져 혈관으로부터 특정 트랜스포터에 의해 확산 또는 전달된다고 추론하였다. 아직까지 인간 눈에서 비타민 D3의 소스가 알려지지는 않았지만, 이전 연구 및 본 발명자들의 결과는 비타민 D3의 사용이 GCD2 환자 및 TGFBI-연관 각막이상증 환자에서 TGFBIp의 생산을 예방하기 위한 치료 형태로서의 가능성을 가진다는 것을 보여준다.
In the forward active concentration of vitamin D3 is lower than the density of the vitreous cavity (vitreous cavity) in the rabbit eye 6. Since rabbits are not exposed to significant amounts of ultraviolet light, the authors speculated that most of the vitamin D3 was derived from ingestion rather than synthesized from the skin, diffusing or transferring from a blood vessel by a specific transporter. Although the source of vitamin D3 is not yet known in human eyes, previous studies and our results show that use of vitamin D3 has potential as a therapeutic form to prevent the production of TGFBIp in patients with GCD2 and TGFBI-associated corneal dystrophy .

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

참조문헌References

1. Holland EJ, Daya SM, Stone EM, et al. Avellino corneal dystrophy. Clinical manifestations and natural history. Ophthalmology. Oct 1992;99(10):1564-1568.1. Holland EJ, Daya SM, Stone EM, et al. Avellino corneal dystrophy. Clinical manifestations and natural history. Ophthalmology. Oct 1992; 99 (10): 1564-1568.

2. Kim TI, Hong JP, Ha BJ, Stulting RD, Kim EK. Determination of treatment strategies for granular corneal dystrophy type 2 using Fourier-domain optical coherence tomography. The British journal of ophthalmology. Mar 2010;94(3):341-345.2. Kim TI, Hong JP, Ha BJ, Stulting RD, Kim EK. Determination of treatment strategies for granular corneal dystrophy type 2 using Fourier-domain optical coherence tomography. The British journal of ophthalmology. Mar 2010; 94 (3): 341-345.

3. Carlberg C, Bendik I, Wyss A, et al. Two nuclear signalling pathways for vitamin D. Nature. Feb 18 1993;361(6413):657-660.3. Carlberg C, Bendik I, Wysse, et al. Two nuclear signaling pathways for vitamin D. Nature. Feb 18 1993; 361 (6413): 657-660.

4. Humeniuk-Polaczek R, Marcinkowska E. Impaired nuclear localization of vitamin D receptor in leukemia cells resistant to calcitriol-induced differentiation. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. Apr 2004;88(4-5):361-366.4. Humeniuk-Polaczek R, Marcinkowska E. Impaired nuclear localization of vitamin D receptor in leukemia cells resistant to calcitriol-induced differentiation. &Lt; / RTI &gt; The Journal of Steroid biochemistry and molecular biology. Apr 2004; 88 (4-5): 361-366.

5. Johnson JA, Grande JP, Roche PC, Campbell RJ, Kumar R. Immunolocalization of calcitriol receptor, plasma membrane calcium pump and calbindin-D28k in the cornea and ciliary body of the rat eye. Ophthalmic research. 1995;27(1):42-47.5. Johnson JA, Grande JP, Roche PC, Campbell RJ, Kumar R. Immunolocalization of calcitriol receptor, plasma membrane calcium pump and calbindin-D28k in the cornea and ciliary body of the rat eye. Ophthalmic research. 1995; 27 (1): 42-47.

6. Yin Z, Pintea V, Lin Y, Hammock BD, Watsky MA. Vitamin D enhances corneal epithelial barrier function. Invest Ophthalmol Vis Sci. Sep 2011;52(10):7359-7364.6. Yin Z, Pintea V, Lin Y, Hammock BD, Watsky MA. Vitamin D enhances corneal epithelial barrier function. Invest Ophthalmol Vis Sci. Sep 2011; 52 (10): 7359-7364.

7. Xue ML, Zhu H, Thakur A, Willcox M. 1 alpha,25-Dihydroxyvitamin D3 inhibits pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human corneal epithelial cells colonized with Pseudomonas aeruginosa. Immunology and cell biology. Aug 2002;80(4):340-345.7. Xue ML, Zhu H, Thakura, Willcox M. 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 inhibits pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human corneal epithelial cells colonized with Pseudomonas aeruginosa. Immunology and cell biology. Aug 2002; 80 (4): 340-345.

8. Suzuki T, Sano Y, Kinoshita S. Effects of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 on Langerhans cell migration and corneal neovascularization in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. Jan 2000;41(1):154-158.8. Suzuki T, Sano Y, Kinoshita S. Effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 on Langerhans cell migration and corneal neovascularization in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. Jan 2000; 41 (1): 154-158.

9. Shokravi MT, Marcus DM, Alroy J, Egan K, Saornil MA, Albert DM. Vitamin D inhibits angiogenesis in transgenic murine retinoblastoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. Jan 1995;36(1):83-87.9. Shokravi MT, Marcus DM, Alroy J, Egan K, Saornil MA, Albert DM. Vitamin D inhibits angiogenesis in transgenic murine retinoblastoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. Jan 1995; 36 (1): 83-87.

10. Lee V, Rekhi E, Kam JH, Jeffery G. Vitamin D rejuvenates aging eyes by reducing inflammation, clearing amyloid beta and improving visual function. Neurobiology of aging. Jan 2 2012.10. Lee V, Rekhi E, Kam JH, Jeffery G. Vitamin D rejuvenates aging eyes by reducing inflammation, clearing amyloid beta and improving visual function. Neurobiology of aging. Jan 2 2012.

11. Jester JV, Huang J, Fisher S, et al. Myofibroblast differentiation of normal human keratocytes and hTERT, extended-life human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. May 2003;44(5):1850-1858.11. Jester JV, Huang J, Fisher S, et al. Myofibroblast differentiation of normal human keratocytes and hTERT, extended-life human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. May 2003; 44 (5): 1850-1858.

12. Yamasaki K, Kawasaki S, Young RD, et al. Genomic aberrations and cellular heterogeneity in SV40-immortalized human corneal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. Feb 2009;50(2):604-613.12. Yamasaki K, Kawasaki S, Young RD, et al. Genomic aberrations and cellular heterogeneity in SV40-immortalized human corneal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. Feb 2009; 50 (2): 604-613.

13. Choi SI, Kim TI, Kim KS, et al. Decreased catalase expression and increased susceptibility to oxidative stress in primary cultured corneal fibroblasts from patients with granular corneal dystrophy type II. Am J Pathol. Jul 2009;175(1):248-261.13. Choi SI, Kim TI, Kim KS, et al. Decreased catalase expression and increased susceptibility to oxidative stress in primary cultured corneal fibroblasts from patients with granular corneal dystrophy type II. Am J Pathol. Jul 2009; 175 (1): 248-261.

14. Choi SI, Kim BY, Dadakhujaev S, et al. Inhibition of TGFBIp expression by lithium: implications for TGFBI-linked corneal dystrophy therapy. Invest Ophthalmol Vis Sci. May 2011;52(6):3293-3300.14. Choi SI, Kim BY, Dadakhujaev S, et al. Inhibition of TGFBIp expression by lithium: implications for TGFBI-linked corneal dystrophy therapy. Invest Ophthalmol Vis Sci. May 2011; 52 (6): 3293-3300.

15. Attisano L, Wrana JL. Smads as transcriptional co-modulators. Curr Opin Cell Biol. Apr 2000;12(2):235-243.15. Attisano L, Wrana JL. Smads as transcriptional co-modulators. Curr Opin Cell Biol. Apr 2000; 12 (2): 235-243.

16. Munker R, Norman A, Koeffler HP. Vitamin D compounds. Effect on clonal proliferation and differentiation of human myeloid cells. The Journal of clinical investigation. Aug 1986;78(2):424-430.16. Munker R, Normana, Koeffler HP. Vitamin D compounds. Effect on clonal proliferation and differentiation of human myeloid cells. The Journal of clinical investigation. Aug 1986; 78 (2): 424-430.

17. Bortman P, Folgueira MA, Katayama ML, Snitcovsky IM, Brentani MM. Antiproliferative effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on breast cells: a mini review. Braz J Med Biol Res. Jan 2002;35(1):1-9.17. Bortman P, Folgueira MA, Katayama ML, Snitcovsky IM, Brentani MM. Antiproliferative effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on breast cells: a mini review. Braz J Med Biol Res. Jan 2002; 35 (1): 1-9.

18. Tang JY, Xiao TZ, Oda Y, et al. Vitamin D3 inhibits hedgehog signaling and proliferation in murine Basal cell carcinomas. Cancer prevention research (Philadelphia, Pa.). May 2011;4(5):744-751.18. Tang JY, Xiao TZ, Chamber Y, et al. Vitamin D3 inhibits hedgehog signaling and proliferation in murine Basal cell carcinomas. Cancer prevention research (Philadelphia, Pa.). May 2011; 4 (5): 744-751.

19. Rawe IM, Zhan Q, Burrows R, Bennett K, Cintron C. Beta-ig. Molecular cloning and in situ hybridization in corneal tissues. Invest Ophthalmol Vis Sci. Apr 1997;38(5):893-900.19. Rawe IM, Zhan Q, Burrows R, Bennett K, Cintron C. Beta-ig. Molecular cloning and in situ hybridization in corneal tissues. Invest Ophthalmol Vis Sci. Apr 1997; 38 (5): 893-900.

20. Akhtar S, Meek KM, Ridgway AE, Bonshek RE, Bron AJ. Deposits and proteoglycan changes in primary and recurrent granular dystrophy of the cornea. Arch Ophthalmol. Mar 1999;117(3):310-321.20. Akhtar S, Meek KM, Ridgway AE, Bonshek RE, Bron AJ. Deposits and proteoglycan changes in primary and recurrent granular dystrophies of the cornea. Arch Ophthalmol. Mar 1999; 117 (3): 310-321.

21. Dunaief JL, Ng EW, Goldberg MF. Corneal dystrophies of epithelial genesis: the possible therapeutic use of limbal stem cell transplantation. Arch Ophthalmol. Jan 2001;119(1):120-122.21. Dunaief JL, Ng EW, Goldberg MF. Corneal dystrophies of epithelial genesis: the possible therapeutic use of limbal stem cell transplantation. Arch Ophthalmol. Jan 2001; 119 (1): 120-122.

22. Schwartz Z, Ehland H, Sylvia VL, et al. 1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3) and 24R,25-dihydroxyvitamin D(3) modulate growth plate chondrocyte physiology via protein kinase C-dependent phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 mitogen-activated protein kinase. Endocrinology. Jul 2002;143(7):2775-2786.22. Schwartz Z, Ehland H, Sylvia VL, et al. 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D (3) and 24R, 25-dihydroxyvitamin D (3) modulate growth plate chondrocyte physiology via protein kinase C-dependent phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 mitogen-activated protein kinase. Endocrinology. Jul 2002; 143 (7): 2775-2786.

23. Gniadecki R. Activation of Raf-mitogen-activated protein kinase signaling pathway by 1,25-dihydroxyvitamin D3 in normal human keratinocytes. The Journal of investigative dermatology. Jun 1996;106(6):1212-1217.23. Gniadecki R. Activation of Raf-mitogen-activated protein kinase signaling pathway by 1,25-dihydroxyvitamin D3 in normal human keratinocytes. The Journal of investigative dermatology. Jun 1996; 106 (6): 1212-1217.

24. Nemere I, Yoshimoto Y, Norman AW. Calcium transport in perfused duodena from normal chicks: enhancement within fourteen minutes of exposure to 1,25-dihydroxyvitamin D3. Endocrinology. Oct 1984;115(4):1476-1483.24. Nemere I, Yoshimoto Y, Norman AW. Calcium transport in perfused duodena from normal chicks: enhancement within fourteen minutes of exposure to 1,25-dihydroxyvitamin D3. Endocrinology. Oct 1984; 115 (4): 1476-1483.

25. Studzinski GP, Bhandal AK, Brelvi ZS. Cell cycle sensitivity of HL-60 cells to the differentiation-inducing effects of 1-alpha,25-dihydroxyvitamin D3. Cancer research. Aug 1985;45(8):3898-3905.25. Studzinski GP, Bhandal AK, Brelvi ZS. Cell cycle sensitivity of HL-60 cells to the differentiation-inducing effects of 1-alpha, 25-dihydroxyvitamin D3. Cancer research. Aug 1985; 45 (8): 3898-3905.

26. Drivdahl RH, Loop SM, Andress DL, Ostenson RC. IGF-binding proteins in human prostate tumor cells: expression and regulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3. The Prostate. Feb 1995;26(2):72-79.26. Drivdahl RH, Loop SM, Andress DL, Ostenson RC. IGF-binding proteins in human prostate tumor cells: expression and regulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3. The Prostate. Feb 1995; 26 (2): 72-79.

27. Campbell MJ, Elstner E, Holden S, Uskokovic M, Koeffler HP. Inhibition of proliferation of prostate cancer cells by a 19-nor-hexafluoride vitamin D3 analogue involves the induction of p21waf1, p27kip1 and E-cadherin. Journal of molecular endocrinology. Aug 1997;19(1):15-27.27. Campbell MJ, Elstner E, Holden S, Uskokovic M, Koeffler HP. Inhibition of proliferation of prostate cancer cells by a 19-nor-hexafluoride vitamin D3 analogue involving the induction of p21waf1, p27kip1 and E-cadherin. Journal of molecular endocrinology. Aug 1997; 19 (1): 15-27.

28. Mangelsdorf DJ, Koeffler HP, Donaldson CA, Pike JW, Haussler MR. 1,25-Dihydroxyvitamin D3-induced differentiation in a human promyelocytic leukemia cell line (HL-60): receptor-mediated maturation to macrophage-like cells. The Journal of cell biology. Feb 1984;98(2):391-398.28. Mangelsdorf DJ, Koeffler HP, Donaldsonce, Pike JW, Haussler MR. 1,25-Dihydroxyvitamin D3-induced differentiation in a human promyelocytic leukemia cell line (HL-60): receptor-mediated maturation to macrophage-like cells. The Journal of cell biology. Feb 1984; 98 (2): 391-398.

29. Miyaura C, Abe E, Kuribayashi T, et al. 1 alpha,25-Dihydroxyvitamin D3 induces differentiation of human myeloid leukemia cells. Biochem Biophys Res Commun. Oct 15 1981;102(3):937-943.29. Miyaura C, Abe E, Kuribayashi T, et al. 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 induces differentiation of human myeloid leukemia cells. Biochem Biophys Res Commun. Oct 15 1981; 102 (3): 937-943.

30. Skonier J, Neubauer M, Madisen L, Bennett K, Plowman GD, Purchio AF. cDNA cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta. DNA and cell biology. Sep 1992;11(7):511-522.30. Skonier J, Neubauer M, Madisen L, Bennett K, Plowman G D, Purchio AF. cDNA cloning and sequence analysis of beta-ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta. DNA and cell biology. Sep 1992; 11 (7): 511-522.

31. Zhang Y, Wen G, Shao G, et al. TGFBI deficiency predisposes mice to spontaneous tumor development. Cancer research. Jan 1 2009;69(1):37-44.31. Zhang Y, Wen G, Shao G, et al. TGFBI deficiency predisposes mice to spontaneous tumor development. Cancer research. Jan 1 2009; 69 (1): 37-44.

32. Zhao YL, Piao CQ, Hei TK. Downregulation of Betaig-h3 gene is causally linked to tumorigenic phenotype in asbestos treated immortalized human bronchial epithelial cells. Oncogene. Oct 24 2002;21(49):7471-7477.32. Zhao YL, Piao CQ, Hei TK. Downregulation of Betaig-h3 gene is causally linked to tumorigenic phenotype in asbestos treated immortalized human bronchial epithelial cells. Oncogene. Oct 24 2002; 21 (49): 7471-7477.

33. Kim JE, Han MS, Bae YC, et al. Anterior segment dysgenesis after overexpression of transforming growth factor-beta-induced gene, beta igh3, in the mouse eye. Mol Vis. 2007;13:1942-1952.33. Kim JE, Han MS, Bae YC, et al. Anterior segment dysgenesis after overexpression of transforming growth factor-beta-induced gene, beta 3, in mouse eye. Mol Vis. 2007; 13: 1942-1952.

34. Karring H, Runager K, Thogersen IB, Klintworth GK, Hojrup P, Enghild JJ. Composition and proteolytic processing of corneal deposits associated with mutations in the TGFBI gene. Experimental eye research. 2011;E pub ahead of print.34. Karring H, Runager K, Thogersen IB, Klintworth GK, Hojrup P, Enghild JJ. Composition and proteolytic processing of corneal deposits associated with mutations in the TGFBI gene. Experimental eye research. 2011; E pub ahead of print.

35. Blobe GC, Schiemann WP, Lodish HF. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. May 4 2000;342(18):1350-1358.35. Blobe GC, Schiemann WP, Lodish HF. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England Journal of Medicine. May 4, 2000; 342 (18): 1350-1358.

36. Zimmerman CM, Padgett RW. Transforming growth factor beta signaling mediators and modulators. Gene. May 16 2000;249(1-2):17-30.36. Zimmerman CM, Padgett RW. Transforming growth factor beta signaling mediators and modulators. Gene. May 16 2000; 249 (1-2): 17-30.

37. Halder SK, Goodwin JS, Al-Hendy A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 reduces TGF-beta3-induced fibrosis-related gene expression in human uterine leiomyoma cells. J Clin Endocrinol Metab. Apr 2011;96(4):E754-762.37. Halder SK, Goodwin JS, Al-Hendy A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 reduces TGF-beta3-induced fibrosis-related gene expression in human uterine leiomyoma cells. J Clin Endocrinol Metab. Apr 2011; 96 (4): E754-762.

38. Brown AJ, Dusso A, Slatopolsky E. Vitamin D. The American journal of physiology. Aug 1999;277(2 Pt 2):F157-175.
38. Brown AJ, Dusso A, Slatopolsky E. Vitamin D. The American journal of physiology. Aug 1999; 277 (2 Pt 2): F157-175.

Claims (8)

비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 TGFBI(TGF-β induced) 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of TGFBI (TGF-β induced) gene mutation corneal dystrophy comprising vitamin D3 as an active ingredient.
제 1 항에 있어서, 상기 비타민 D3는 돌연변이 형질전환-β-유도된 유전자 단백질(TGFBIp)의 발현을 mRNA 레벨 또는 단백질 레벨에서 하향-조절(down-regulation)하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the vitamin D3 down-regulates the expression of a mutant transgenic-β-induced gene protein (TGFBIp) at an mRNA level or a protein level.
제 2 항에 있어서, 상기 하향-조절은 비타민 D 수용체(VDR)를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
3. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein said down-regulation is via vitamin D receptor (VDR).
제 1 항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되어 발생하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the mutant corneal dystrophy is caused by accumulation of mutant TGFBI protein in the cornea.
제 1 항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 아벨리노(Avellino type) 각막이상증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the TGFBI genetically modified corneal dystrophy is Avellino type corneal dystrophy.
다음의 단계를 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법:
(a) 각막세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(b) 세포 내 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR) 및 TGFBIp의 발현을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 비타민 D 수용체를 통해 TGFBIp의 발현을 억제시키면 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제로 판단한다.
Screening method for preventing or treating TGFBI genetically modified corneal dystrophy comprising the following steps:
(a) treating the test substance with the corneal cells; And
(b) analyzing the expression of vitamin D receptor (VDR) and TGFBIp in the cell, and if the test substance inhibits the expression of TGFBIp through the vitamin D receptor, it is determined that the TGFBI gene mutation prevents or treats corneal dystrophy. .
제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 TGFBIp의 발현은 mRNA 레벨 또는 단백질 레벨에서 하향-조절(down-regulation)하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
The screening method according to claim 6, wherein the expression of TGFBIp is down-regulated at an mRNA level or a protein level in the step (b).
제 6 항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 아벨리노(Avellino type) 각막이상증인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The method according to claim 6, wherein the TGFBI gene mutation corneal dystrophy is Avellino (Avellino type) corneal dysplasia.
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